JP6706813B2 - 膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法、空気入りタイヤの製造方法、及びゴム製品の製造方法に関する。

これまで膜結合蛋白質の調製には、膜結合蛋白質を過剰発現させた細胞（大腸菌や酵母など）を大量に培養し、界面活性剤によって膜結合蛋白質を抽出し、精製する必要があった。しかしながら、膜結合蛋白質を抽出するために最適な界面活性剤は蛋白質ごとに異なり、どれだけ適当な界面活性剤を選択できるかが膜結合蛋白質を調製する際の重要なポイントとなっていた。
また、膜結合蛋白質は、その疎水的性質ゆえに精製自体が困難なばかりか、一度界面活性剤で可溶化させると構造が変化してしまうことから、再度膜上に結合させても本来の構造をとっているとは限らないものであった。

膜結合蛋白質の真の機能・活性を明らかにするためには正しい構造をとった蛋白質を膜に結合させた状態で機能評価を行う必要があるが、上述のような理由から、技術的に難しいとされてきた。

最近になって、生物学的機能を担持した（ｎａｔｉｖｅ状態の）膜タンパク質の合成、回収を行うために、培養細胞に膜結合蛋白質を作らせるのではなく、無細胞蛋白合成法を使って膜結合蛋白質を作製し、細胞膜の代わりにリポソーム（人工的に作製した膜）を共存させる試みが報告されてきた（例えば、特許文献１参照）。また、無細胞蛋白合成法により膜蛋白質を合成し、生成した膜蛋白質を基板上に固定化された脂質二分子膜中に埋め込んで固定化する方法や、無細胞蛋白合成法を膜小胞の存在下に行うことで膜結合蛋白質の高収率合成が達成されることが開示されている（例えば、特許文献２、３参照）。

特開２００５−２２５７９６号公報 特開２０１０−１３２５９４号公報 特許第５３８３１９７号公報

上述のように、膜結合蛋白質の無細胞蛋白合成をリポソームや、脂質二分子膜、膜小胞との共存下で行うことが検討されている。ここで、リポソームはリン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロール等から構成される脂質二重膜として人工的に製造される。そのため、製造されたリポソームの表面には蛋白質は結合していない。
他方、ゴム産生植物のラテックスから採取されるゴム粒子も脂質膜で覆われた粒子であるが、その膜は天然由来の膜であるため、その表面には植物体内で合成された蛋白質が既に結合している。また、一般的にゴム粒子の脂質膜は一重膜といわれている。
このような状況下、膜結合蛋白質の無細胞蛋白合成をゴム粒子の共存下で行うことは、いまだ試みられていない。

本発明は、前記課題を解決し、無細胞蛋白合成法を用いて、膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子を製造する方法を提供することを目的とする。

本発明は、膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程を含む膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法に関する。

上記無細胞蛋白合成溶液は、胚芽抽出物を含むことが好ましい。

上記胚芽抽出物は、小麦由来であることが好ましい。

上記無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、５〜５０ｇ／Ｌであることが好ましい。

上記ゴム粒子は、前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に、界面活性剤で洗浄されたものであることが好ましい。

上記界面活性剤は、両性界面活性剤であり、上記ゴム粒子を洗浄する際の該界面活性剤の濃度は、臨界ミセル濃度の３倍以内であることが好ましい。

上記界面活性剤は、ＣＨＡＰＳであることが好ましい。

上記蛋白質合成は、透析法により行われることが好ましい。

上記蛋白質合成反応中に、前記膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを更に加えることが好ましい。

本発明はまた、上記ゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、上記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。

本発明はまた、上記ゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、上記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。

本発明によれば、膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程を含む膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法であるので、無細胞蛋白合成法を用いて、膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子を製造することができ、ゴム粒子に膜結合蛋白質を本来の構造のまま結合させることができるため、ゴム粒子の性能を改変することができる。

本発明の空気入りタイヤの製造方法は、本発明のゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、上記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、ゴム粒子製造時にゴム粒子の性能を改変できる手法で得られたゴム粒子から得られるゴムから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して空気入りタイヤを製造することができる。

本発明のゴム製品の製造方法は、本発明のゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、上記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、ゴム粒子製造時にゴム粒子の性能を改変できる手法で得られたゴム粒子から得られるゴムからゴム製品を製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮してゴム製品を製造することができる。

実施例において透析法を行っている様子を示す概略図である。 実施例１〜３、比較例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの試験結果を示す泳動写真である。 比較例２におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの試験結果を示す泳動写真である。

本発明の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法は、膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程を含む。すなわち、膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて（より具体的には、膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを混合して）蛋白質合成を行うことで、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させることができる。
上述したように、リポソームはリン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロール等から構成される脂質二重膜として人工的に製造されるため、製造されたリポソームの表面には蛋白質は結合していないのに対して、ゴム産生植物のラテックスから採取されるゴム粒子も脂質膜で覆われた粒子であるが、その膜は天然由来の膜であるため、その表面には植物体内で合成された蛋白質が既に結合している。このことから、蛋白質が結合していないリポソームなどに比べて、既に蛋白質が結合しており、蛋白質で覆われた状態にあるゴム粒子に更に蛋白質を結合させるのは困難であることが予想される。また、ゴム粒子に既に結合している蛋白質が無細胞蛋白合成を阻害することも懸念される。
以上のような点から、ゴム粒子共存下での無細胞蛋白合成は実現が困難であると考えられてきた。このような状況下、本発明者らは、これまでに試みられていなかった、膜結合蛋白質の無細胞蛋白合成をゴム粒子の共存下で行うことを検討したところ、ゴム粒子の共存下で無細胞蛋白合成を行うことで膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子を製造することができることを初めて見出した。これにより、ゴム粒子に膜結合蛋白質を本来の構造のまま結合させることができるため、ゴム粒子の性能を改変することが可能となる。
なお、本発明の製造方法は、上記工程を含む限りその他の工程を含んでいてもよく、また、各工程は１回行われてもよいし、複数回繰り返し行われてもよい。
また、本発明において、ゴム粒子に結合する膜結合蛋白質の量は特に限定されない。

ここで、本明細書において、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子との共存下、蛋白質合成を行うことで、ゴム粒子に膜結合蛋白質が結合するとは、当該蛋白質合成により合成された膜結合蛋白質の全部又は一部がゴム粒子中に取り込まれる又はゴム粒子の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、ゴム粒子表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、上述のようにゴム粒子に結合している膜結合蛋白質と複合体を形成し、複合体としてゴム粒子上に存在する蛋白質もゴム粒子に結合している膜結合蛋白質の概念範囲に含まれる。

上記ゴム粒子の由来は特に限定されず、例えば、パラゴムノキ、ロシアンタンポポ、グアユール、ノゲシ、インドゴムノキなどのゴム産生植物のラテックス由来であればよい。

また、上記ゴム粒子の粒子径も特に限定されず、所定の粒子径のものを分取して用いてもよいし、様々な粒子径のものが含まれた状態のものを使用してもよく、所定の粒子径のものを分取して用いる場合であっても、用いられるゴム粒子としては、粒子径の小さいＳｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＳＲＰ）を用いてもよいし、粒子径の大きいＬａｒｇｅ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＲＰ）を用いてもよい。

上記所定の粒子径のゴム粒子を分取する方法としては、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、遠心分離処理、より好ましくは多段階の遠心分離処理、を行う方法などが挙げられる。具体的には、５００〜１５００×ｇでの遠心分離処理、１７００〜２５００×ｇでの遠心分離処理、７０００〜９０００×ｇでの遠心分離処理、１５０００〜２５０００×ｇでの遠心分離処理、４００００〜６００００×ｇでの遠心分離処理を順に行う方法が挙げられる。なお、各遠心分離処理の処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。また、各遠心分離処理の処理温度としては、０〜１０℃が好ましく、２〜８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。

上記膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡは、翻訳されて当該膜結合蛋白質を合成しうる翻訳鋳型であるが、本発明の製造方法においては、１種類の膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを用いてもよいし、２種類以上の膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡの混合物を用いてもよい。すなわち、本発明においては、ゴム粒子に結合させる膜結合蛋白質は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。

上記膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡは、翻訳されて当該膜結合蛋白質を合成しうる翻訳鋳型であればその調製方法は特に制限されないが、例えば、生物由来の組織等からホットフェノール法などによりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、目的とする膜結合蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報を元に作製したプライマーを用いて目的とする膜結合蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片を取得して、該ＤＮＡ断片を元に通常行われるインビトロでの転写反応を行うことなどにより調製することができる。

上記膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡの由来は特に制限されないが、植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。

上記植物としては、特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ ｆ． ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｇｉｇａｎｔｅａ Ａｉｔ． ｖａｒ． ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｖｅｎｕｓｔｕｍ Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ ｐｕｍｉｌａ Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ａｍｐｅｌａｓ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｉｒｉｓａｎａ Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｓｅｐｔｉｃａ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。

上記膜結合蛋白質としては、生物体内においてもともと膜に結合する性質を有する蛋白質である限り特に制限されず、ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質であってもよいし、自然界ではゴム粒子上には存在しない蛋白質であってもよいが、ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質が好ましい。また、当該膜結合蛋白質の膜への結合様式も特に限定されず、大きく膜表面に結合する膜結合蛋白質であってもよいし、膜に挿入されるように結合する膜結合蛋白質であってもよいし、上記膜結合蛋白質と複合体を形成して膜表面上に存在することになる蛋白質であってもよい。

上記ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する膜結合蛋白質としては、例えば、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）、β−１，３−グルカナーゼ、Ｈｅｖｅｉｎなどが挙げられる。

上記膜結合蛋白質は、結合様式の観点から、脂質膜に埋め込まれている１つ又は複数の部位を有する内在性膜結合蛋白質と、脂質膜表面のみに結合する表在性膜結合蛋白質とに大別され、ほとんどの内在性膜結合蛋白質は脂質膜全体を貫通する膜貫通ドメインを１つ又は複数有している。

上記内在性膜結合蛋白質としては、例えば、Ｇタンパク質共役型受容体などの受容体として機能する蛋白質、イオンチャネルなどのチャネルとして機能する蛋白質などが挙げられ、具体的には、チトクロムｂ５６１及びムスカリン性アセチルコリン受容体（数回膜貫通型）、Ｐ４５０−レダクターゼ（Ｎ末一回膜貫通型）などが挙げられる。
他方、上記表在性膜結合蛋白質としては、具体的には、チトクロムｂ５（Ｃ末アンカー型）などが挙げられる。

上記膜結合蛋白質としては、中でも、ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在し、ゴム合成に関与する蛋白質であることが好ましい。このようなゴム合成に関与する蛋白質をゴム粒子に結合させることで、ゴム粒子のゴム合成能力を増強し、より効率的に反応槽（試験管、プラントなど）内でゴムを生産することが可能となる。
具体的には、ＣＰＴ、ＮｇＢＲ、ＲＥＦ、及びＳＲＰＰからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましく、ＣＰＴ、ＮｇＢＲ、及びＲＥＦからなる群より選択される少なくとも１種であることが更に好ましく、ＣＰＴ及び／又はＮｇＢＲが特に好ましい。

本発明においては、ゴム粒子の共存下で膜結合蛋白質の無細胞蛋白合成が行われるが、本発明における無細胞蛋白合成溶液を用いて、従来と同様の方法で行うことができる。用いられる無細胞蛋白合成系としては、通常用いられる無細胞蛋白質合成手段を採用することができる。例えば、Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＲＴＳ５００（Ｒｏｓｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）やＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：５５９−５６４（２０００）、特開２０００−２３６８９６号公報、特開２００２−１２５６９３号公報、特開２００２−２０４６８９号公報に従って調製された小麦胚芽抽出液及びその無細胞蛋白質合成系（特開２００２−２０４６８９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４６５２−１４６５７（２００２））を使用することができる。中でも、胚芽抽出物を用いる系が好ましい。すなわち、上記無細胞蛋白合成溶液が、胚芽抽出物を含むこともまた、本発明の好適な実施形態の１つである。

上記胚芽抽出物の由来は特に限定されないが、翻訳効率の観点からは、植物の膜結合蛋白質を無細胞蛋白合成法で合成する場合には植物由来の胚芽抽出物を用いることが好ましい。特に好ましくは小麦由来の胚芽抽出物を用いることである。すなわち、上記胚芽抽出物が小麦由来であることもまた、本発明の好適な実施形態の１つである。

上記胚芽抽出物の調製方法としては特に制限されず、通常の胚芽抽出物調製方法を採用することができるが、例えば、特開２００５−２１８３５７号公報に記載された方法を採用すればよい。

本発明において用いられる無細胞蛋白合成溶液は、更にサイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体又はその塩（以降、単に「活性増強物質」とも称する。）を含むことが好ましい。該活性増強物質を含有することにより、蛋白質合成活性を更に増強させることができる。

上記サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体又はその塩としては、無細胞蛋白合成活性を増強しうるものであれば特に制限されず、例えば、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、アデノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、アデノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、グアノシン−３’,５’サイクリック一リン酸及びその塩、グアノシン−３’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、グアノシン−３’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、８−ブロモアデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸（ブロモｃＡＭＰ）及びその塩、８−（４−クロロフェニルチオ）アデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸（クロロフェニルチオｃＡＭＰ）及びその塩、５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルべンジミダゾルアデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸（ジクロロリボフラノシルべンジミダゾルｃＡＭＰ）及びその塩、アデノシン−２’,５’サイクリック一リン酸及びその塩、アデノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、アデノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、グアノシン−２’,５’サイクリック一リン酸及びその塩、グアノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、グアノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩等が挙げられる。

上記サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体との塩を形成する塩基としては、生化学的に許容しうるもので、当該誘導体と塩を形成するものであれば特に制限されないが、中でも好ましいものとしては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属原子、トリスヒドロキシアミノメタン等の有機塩基が挙げられる。

上記活性増強物質としては、中でも、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸ナトリウムが特に好ましい。また、これら活性増強物質は、単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。

上記活性増強物質は、あらかじめ本発明における無細胞蛋白合成溶液に加えておいてもよいが、当該溶液中で不安定である場合には、無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成反応を行う際に加えるのが好ましい。

上記活性増強物質の添加量としては、本発明における無細胞蛋白合成溶液による蛋白質合成反応が活性化（増加）しうる濃度であれば特に制限されない。具体的には、反応系中の最終濃度として、通常０．１ミリモル／リットル以上であればよい。濃度の下限は、好ましくは０．２ミリモル／リットル、より好ましくは０．４ミリモル／リットル、特に好ましくは０．８ミリモル／リットルである。他方、濃度の上限は、好ましくは２４ミリモル／リットル、より好ましくは６．４ミリモル／リットル、特に好ましくは３．２ミリモル／リットルである。

上記活性増強物質を本発明における無細胞蛋白合成溶液に加える際の無細胞蛋白合成溶液の温度としては特に限定されないが、０〜３０℃が好ましく、１０〜２６℃がより好ましい。

本発明における無細胞蛋白合成溶液は、膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡ（翻訳鋳型）に加え、蛋白質合成に必須の成分であるＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオン等を含有し、更には必要に応じて活性増強物質を含むものであり、このような無細胞蛋白合成溶液を用いることにより無細胞蛋白合成反応系とすることができる。
なお、上記特開２００５−２１８３５７号公報に記載された方法で調製された胚芽抽出物には蛋白質合成反応に必要とされる量のｔＲＮＡが含まれているため、当該方法により調製された胚芽抽出物を無細胞蛋白合成溶液に用いる場合には、別途調製したｔＲＮＡを追加することは必須要件ではない。すなわち、無細胞蛋白合成溶液には、必要に応じてｔＲＮＡを追加すればよい。

本発明においては、膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行うものであるが、具体的には蛋白質の合成前又は合成後の適当な時期に、好ましくは蛋白質合成前に、上記無細胞蛋白合成溶液にゴム粒子を加えることにより行うことができる。
また、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、５〜５０ｇ／Ｌであることが好ましい。すなわち、無細胞蛋白合成溶液１Ｌに対してゴム粒子を５〜５０ｇ共存させることが好ましい。無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が５ｇ／Ｌ未満であると、合成された膜結合蛋白質が結合したゴム粒子を回収するために、超遠心分離等による分離処理を行った際に、ゴム層が形成されず、合成された膜結合蛋白質が結合したゴム粒子を回収することが困難になる場合がある。一方、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が５０ｇ／Ｌを超えると、ゴム粒子同士が凝集し、合成された膜結合蛋白質がうまくゴム粒子に結合できなくなるおそれがある。上記ゴム粒子の濃度としてより好ましくは１０〜４０ｇ／Ｌ、更に好ましくは１５〜３５ｇ／Ｌ、特に好ましくは１５〜３０ｇ／Ｌである。

また、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子との共存下での蛋白質合成は、その反応の進展に伴い、適宜ゴム粒子を追加していってもよい。ゴム粒子を上記無細胞蛋白合成溶液に加えてから例えば３〜４８時間（好ましくは３〜３０時間、より好ましくは３〜２４時間）など無細胞蛋白合成系が活性な間、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とが共存するようにしておくことが好ましい。

上記ゴム粒子は、前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に前処理等の特段の処理を行う必要はない。ただし、ゴム粒子上に存在する膜結合蛋白質の内、本発明の方法により結合させたい膜結合蛋白質の割合を高めるために、予め界面活性剤によりゴム粒子から膜結合蛋白質を除去してもよい。このように、本発明において用いられるゴム粒子が、前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に、界面活性剤で洗浄されたものであることもまた、本発明の好適な実施形態の１つである。

上記界面活性剤としては特に限定されず、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などが挙げられる。これらの中でも、膜上の蛋白質の変性作用が小さい点で、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が好適に用いられ、両性界面活性剤が特に好適に用いられる。すなわち、上記界面活性剤が、両性界面活性剤であることもまた、本発明の好適な実施形態の１つである。
これら界面活性剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。

上記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンエーテル系、ポリオキシアルキレンエステル系、多価アルコール脂肪酸エステル系、糖脂肪酸エステル系、アルキルポリグリコシド系、ポリオキシアルキレンポリグルコシド系の非イオン性界面活性剤や、ポリオキシアルキレンアルキルアミン、アルキルアルカノールアミド等が挙げられる。
これらの中でも、ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤、多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が好ましい。

上記ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンポリオールアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンモノ、ジ、又はトリスチリルフェニルエーテル等が挙げられる。これらの中でも、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテルが好適に使用される。なお、前記ポリオールとしては、炭素数２〜１２の多価アルコールが好ましく、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、グルコース、スクロース、ペンタエリトリトール、ソルビタン等が挙げられる。

上記ポリオキシアルキレンエステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルロジン酸エステル等が挙げられる。
上記多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、炭素数２〜１２の多価アルコールの脂肪酸エステル又はポリオキシアルキレン多価アルコールの脂肪酸エステル等が挙げられる。より具体的には、例えば、ソルビトール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル等が挙げられる。また、これらのポリアルキレンオキサイド付加物（例えば、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレングリセリン脂肪酸エステル等）も使用可能である。これらの中でも、ソルビタン脂肪酸エステルが好適に使用される。
上記糖脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ショ糖、グルコース、マルトース、フルクトース、多糖類の脂肪酸エステル等が挙げられ、これらのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
上記アルキルポリグリコシド系の非イオン性界面活性剤としては、グリコシドとしてグルコース、マルトース、フルクトース、ショ糖などが挙げられ、例えば、アルキルグルコシド、アルキルポリグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルポリグルコシドなどが挙げられ、これらの脂肪酸エステル類も挙げられる。また、これらすべてのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。

これら非イオン性界面活性剤におけるアルキル基としては、例えば、炭素数４〜３０の直鎖又は分岐した飽和若しくは不飽和のアルキル基が挙げられる。また、ポリオキシアルキレン基としては、炭素数２〜４のアルキレン基を有するものが挙げられ、例えば、酸化エチレンの付加モル数が１〜５０モル程度のものが挙げられる。また、前記脂肪酸としては、例えば、炭素数４〜３０の直鎖又は分岐した飽和若しくは不飽和の脂肪酸が挙げられる。

上記非イオン性界面活性剤としては、中でも、ゴム粒子の膜を安定化させた状態で、かつ蛋白質の変性作用が小さい状態で、適度に膜結合蛋白質を除去できるという理由から、ポリオキシエチレンエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）が特に好ましい。

上記両性界面活性剤としては、例えば、四級アンモニウム塩基／スルホン酸基（−ＳＯ_３Ｈ）タイプ、四級アンモニウム塩基／リン酸酸基タイプ（水に可溶）、四級アンモニウム塩基／リン酸酸基タイプ（水に不溶）、四級アンモニウム塩基／カルボキシル基タイプなどの両性イオン界面活性剤が挙げられる。なお、前記の酸基は塩であってもよい。
特に、前記の両性イオン界面活性剤が一分子中に＋と−の両電荷を有することが好ましく、前記の酸基の酸解離定数（ｐＫａ）が、５以下であることが好ましく、４以下であることがより好ましく、３以下であることが更に好ましい。

上記両性界面活性剤としては、具体的には、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコナミドプロピル）−コラミド、ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸｛Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）−３−１４｝、ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸等のアンモニウムスルホベタイン類、ｎ−オクチルホスホコリン、ｎ−ノニルホスホコリン、ｎ−デシルホスホコリン、ｎ−ドデシルホスホコリン、ｎ−テトラデシルホスホコリン、ｎ−ヘキサデシルホスホコリン等のホスホコリン類、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン類が挙げられる。これらの中でも、ゴム粒子の膜を安定化させた状態で適度に膜結合蛋白質を除去できるという理由から、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）が特に好ましい。

上記界面活性剤の処理濃度は、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の３倍以内であることが好ましい。臨界ミセル濃度の３倍を超える濃度の界面活性剤で処理するとゴム粒子の膜安定性が低下するおそれがある。より好ましくは２．５倍以内であり、更に好ましくは２．０倍以内である。また下限としては、０．０５倍以上であることが好ましく、０．１倍以上であることがより好ましく、０．３倍以上であることが更に好ましい。

本発明における蛋白質合成のための反応システムまたは装置としては、バッチ（回分）法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭ Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｒｅ ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。その他、蛋白質合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法等も用いることができる。

中でも、重層法は操作が簡便であるという利点はあるものの反応溶液中でゴム粒子が分散してしまい、合成される膜結合蛋白質をゴム粒子に効率よく結合させることが困難であるのに対して、透析法では、合成される膜結合蛋白質の原料となるアミノ酸は透析膜を透過できるがゴム粒子は透過しないため、ゴム粒子の分散を防ぐことができ、効率的にゴム粒子に合成される膜結合蛋白質を結合させることができることから、透析法が好ましい。

なお、上記透析法とは、本発明における蛋白質合成の合成反応液を透析内液とし、透析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、蛋白質合成を行う方法である。具体的には、例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な透析容器に入れ反応内液とする。透析容器としては、底部に透析膜が付加されている容器（第一化学社製の透析カップ１２，０００等）や、透析用チューブ（三光純薬社製の１２，０００等）が挙げられる。透析膜は、１０，０００ダルトン以上の分子量限界を有するものが用いられるが、１２，０００ダルトン程度の分子量限界を有するものが好ましい。

上記透析外液としては、アミノ酸を含む緩衝液が用いられる。透析外液は反応速度が低下した時点で、新鮮なものと交換することにより透析効率を上昇させることができる。反応温度及び時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、例えば、小麦由来の胚芽抽出物を用いた系においては、通常１０〜４０℃、好ましくは１８〜３０℃、より好ましくは２０〜２６℃で、１０分〜４８時間（好ましくは１０分〜３０時間、より好ましくは１０分〜２４時間）行うことができる。

また、本発明における無細胞蛋白合成溶液に含まれる膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡは、分解されやすいことから、上記蛋白質合成反応中に適宜当該ｍＲＮＡを追加することで、蛋白質の合成をより効率的に行うことができる。すなわち、上記蛋白質合成反応中に、上記膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを更に加えることもまた、本発明の好適な実施形態の１つである。
なお、上記ｍＲＮＡの添加時間、添加回数、添加量等は特に制限されず、適宜設定することができる。

本発明の製造方法においては、膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程を行った後、必要に応じてゴム粒子を回収する工程を行ってもよい。

上記ゴム粒子回収工程は、ゴム粒子を回収することができればその手法は特に制限されず、ゴム粒子を回収する通常行われる方法により行うことができる。具体的には、例えば、遠心分離により行う方法などが挙げられる。当該遠心分離によりゴム粒子を回収する場合、その遠心力や、遠心分離処理時間、遠心分離処理温度はゴム粒子を回収できるよう適宜設定することができるが、例えば、遠心分離処理の遠心力としては、１５０００×ｇ以上が好ましく、２００００×ｇ以上がより好ましく、２５０００×ｇ以上が更に好ましい。一方、遠心力は大きくしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心力の上限としては、５００００×ｇ以下が好ましく、４５０００×ｇ以下がより好ましい。遠心分離処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、遠心分離処理時間を長くしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心分離処理時間の上限としては、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。
また、遠心分離処理温度としては、ゴム粒子に結合した膜結合蛋白質のタンパク活性を維持するという観点から、０〜１０℃が好ましく、２〜８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。

上記遠心分離処理を行うと、ゴム粒子が上層に、無細胞蛋白合成溶液が下層に分離される。その後、下層の無細胞蛋白合成溶液を除去することで、膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子を回収することができる。回収したゴム粒子はｐＨが中性の適当な緩衝液に再懸濁することで保存することができる。

このように、本発明によれば、膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行うことで、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させることができる。すなわち、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる方法であって、該方法は、膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程を含むゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる方法もまた、本発明の１つである。
なお、膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程については、上述したとおりである。

（ゴム製品の製造方法）
本発明のゴム製品の製造方法は、上記ゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、上記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。

ゴム製品としては、ゴム（好ましくは天然ゴム）を使用して製造できるゴム製品であれば特に限定されず、例えば、空気入りタイヤ、ゴムローラ、ゴム防舷材、手袋、医療用ゴムチューブ等が挙げられる。

ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、本発明のゴム製品の製造方法が本発明の空気入りタイヤの製造方法の場合、上記生ゴム製品成形工程は、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、上記加硫工程は、上記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、本発明の空気入りタイヤの製造方法は、上記ゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、上記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。

＜合成工程＞
合成工程では、上記ゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する。ゴム粒子を用いてゴムを合成するには、例えば、反応槽（試験管、プラントなど）内などでゴム粒子とゴムの原料となる基質とを混合するなどして従来公知の方法で行うことができる。

＜混練工程＞
混練工程では、上記合成工程で得られるゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る。

上記合成工程で得られるゴムは、上記合成工程後のゴム粒子を以下の固化工程に供することにより得られる。

＜固化工程＞
上記合成工程後のゴム粒子は、固化工程に供される。固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のポリイソプレノイド（天然ゴム）を溶解しない溶媒にゴム粒子を添加する方法やゴム粒子に酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ゴム粒子からゴム（天然ゴム）を固形分として回収できる。得られたゴム（天然ゴム）は、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。

添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、上記ゴム粒子から得られたゴム以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。

混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。

＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品（タイヤの場合は生タイヤ）を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ（未加硫タイヤ）を成形すればよい。

＜加硫工程＞
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ（未加硫タイヤ）を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。

実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

（実施例１）
〔ＨｅｖｅａラテックスからのＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出〕
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ラテックス６ｍＬに１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液６ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬを添加し、さらに６５℃で予温しておいた水飽和フェノールを１２ｍＬ添加した。６５℃で５分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール：クロロホルム（１：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１．２ｍＬとイソプロパノール１３ｍＬを添加し、ボルテックスで撹拌した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを沈殿させるために、−２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取除くことでＴｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿を回収した。回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡは７０％エタノールで２度洗浄したのち、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅの水で溶解させた。

〔Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕
回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）の説明書に従って行った。

〔ｃＤＮＡからＣＰＴ遺伝子の取得〕
作製した１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１：５’−ｔｔｔｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ−３’
プライマー２：５’−ｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｃ−３’
を使用した。

上述の方法により、ＣＰＴの遺伝子（ＨＲＴ１）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＨＲＴ１の塩基配列を配列番号３に示した。また、ＨＲＴ１のアミノ酸配列を配列番号４に示した。

〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ−ＨＲＴ１を作製した。

〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、青／白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。

〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。
回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。

〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ−ＨＲＴ１を制限酵素Ｂａｍ ＨＩとＮｏｔ Ｉで処理したのち、同様にＢａｍ ＨＩとＮｏｔ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＨＲＴ１を作製した。

〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーＰＣＲによって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。

〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。

〔ゴム粒子の調製〕
ゴム粒子は、５段階の遠心分離によってＨｅｖｅａラテックスから調製した。Ｈｅｖｅａラテックス９００ｍＬに、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬを添加し、ラテックス溶液を調製した。得られたラテックス溶液を、１０００×ｇ、２０００×ｇ、８０００×ｇ、２００００×ｇ、５００００×ｇの異なる遠心速度で段階的に遠心分離した。遠心分離はいずれも４℃、４５分で行った。５００００×ｇでの遠心分離で残ったゴム粒子層に、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）を終濃度０．１〜２．０×ＣＭＣ（臨界ミセル濃度ＣＭＣの０．１〜２．０倍）になるように加え、ゴム粒子を洗浄した。洗浄処理後、洗浄されたゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１ ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＨＲＴ１を鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。

〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２ 透析法による蛋白合成）〕
透析カップ（ＭＷＣＯ １２０００）（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｋ社製）中に、以下の量をそれぞれ添加した。ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って全量６０μＬで反応溶液を調整した。反応溶液にゴム粒子を１〜２ｍｇ添加した。さらに、ＰＰ容器Ｎｏ．２（マルエム容器）にＳＵＢ−ＡＭＩＸ ６５０μＬを添加した。
透析カップをＰＰ容器Ｎｏ．２にはめ、２６℃で蛋白合成反応を開始した。反応開始から２度のｍＲＮＡの追加と透析外液（ＳＵＢ−ＡＭＩＸ）の交換を行った。
反応は２４時間行った。透析法を行っている様子の概略図を図１に示す。

〔反応後のゴム粒子の回収〕
透析カップの溶液を新しい１．５μＬチューブに移し、反応後のゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔ゴム粒子へのＣＰＴの結合の確認〕
ゴム粒子へのＣＰＴの結合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。蛋白質の染色はＣＢＢ染色で行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは日本エイドー社製のミニスラブゲル電気泳動槽を用いて行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分離ゲルは１５％アクリルアミドゲルを使用し、泳動条件は一般的な方法で行った。マーカーとしてＸＬ−ｌａｄｄｅｒ（Ｂｒｏａｄ）（株式会社アプロサイエンス製）を使用した。
なお、無細胞蛋白合成反応後の透析カップの溶液（蛋白合成溶液分離前）、及び、反応後のゴム粒子を回収するための超遠心分離を行った後の上清（分離後上清）を少量採取しておき、合わせてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。

実施例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動写真を図２に示す（レーン４〜６）。図２より、矢印部分で示した反応直後の無細胞蛋白合成溶液（蛋白合成溶液分離前）で発現が確認されたＣＰＴがゴム粒子回収のための分離後の上清（分離後上清）には見られず、反応後のゴム粒子側にのみ確認できることが見て取れる。そのため、発現したＣＰＴがゴム粒子に結合したことが証明された。

（実施例２）
〔ＨｅｖｅａラテックスからのＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出〕
実施例１と同様にして行った。

〔Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕
実施例１と同様にして行った。

〔ｃＤＮＡからＮｇＢＲ遺伝子の取得〕
作製した１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型にＮｇＢＲ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＮｇＢＲ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー３：５’−ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇ −３’
プライマー４：５’−ｔｔｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｇｔａｃｃａｔａａｔｔｔｔｇｃｔｇｃａｃ −３’
を使用した。

上述の方法により、ＮｇＢＲ遺伝子（ＨＲＴＢＰ）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＨＲＴＢＰの塩基配列を配列番号７に示した。また、ＨＲＴＢＰのアミノ酸配列を配列番号８に示した。

〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ−ＨＲＴＢＰを作製した。

〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。

〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。

〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ−ＨＲＴＢＰを制限酵素Ｘｈｏ Ｉで処理したのち、同様にＸｈｏ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳ−ＴＥＶ−Ｈｉｓ−Ｃ１に挿入し、ｐＥＵ−Ｃ１−ＨＲＴＢＰを作製した。

〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。

〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。

〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１ ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したｐＥＵ−Ｃ１−ＨＲＴＢＰと実施例１における〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＨＲＴ１を鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。

〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２ 透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。

〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔ゴム粒子へのＣＰＴ及びＮｇＢＲの結合の確認〕
ゴム粒子へのＣＰＴ及びＮｇＢＲの結合は、実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
なお、無細胞蛋白合成反応後の透析カップの溶液（蛋白合成溶液分離前）、及び、反応後のゴム粒子を回収するための超遠心分離を行った後の上清（分離後上清）を少量採取しておき、合わせてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。

実施例２におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動写真を図２に示す（レーン７〜９）。図２より、矢印部分で示した反応直後の無細胞蛋白合成溶液（蛋白合成溶液分離前）で発現が確認されたＣＰＴ及びＮｇＢＲがゴム粒子回収のための分離後の上清（分離後上清）には見られず、反応後のゴム粒子側にのみ確認できることが見て取れる。そのため、発現したＣＰＴ及びＮｇＢＲがゴム粒子に結合したことが証明された。

（比較例１）
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１ ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。無細胞発現用ベクターｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２を鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。

〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２ 透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。

〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔ＳＤＳ−ＰＡＧＥ〕
反応後のゴム粒子を実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
なお、無細胞蛋白合成反応後の透析カップの溶液（蛋白合成溶液分離前）、及び、反応後のゴム粒子を回収するための超遠心分離を行った後の上清（分離後上清）を少量採取しておき、合わせてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。

比較例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動写真を図２に示す（レーン１〜３）。比較例１は、ベクターに発現対象遺伝子を導入していない対照実験であり、図２に示される蛋白質のバンドは主に無細胞蛋白合成反応に試薬に予め含まれる蛋白質である。比較例１と実施例１〜３との比較により、発現蛋白質が実施例１〜３に新たに検出される蛋白質のバンドとして確認された。

（実施例３）
〔ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出〕
シロイヌナズナからホットフェノール法によりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。実生を液体窒素で凍結後、乳鉢で破砕した後、８０℃の水飽和フェノール、８０℃のＲＮＡ抽出バッファー（１００ｍＭ ＬｉＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）をそれぞれ４００μＬずつ加え３０秒間ボルテックスした。さらにクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を４００μＬ加え３０秒間ボルテックスした。４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上層を回収した。４Ｍ ＬｉＣｌを５００μＬ加え混合し、−８０℃で１時間静置した。４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を４００μＬのＤＥＰＣ処理水に溶解した。エタノールを８８０μＬ、３Ｍ ＮａＯＡｃを４０μＬ加え混合した。４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を３００μＬの７０％エタノールで洗浄した。４℃、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を３０μＬのＤＥＰＣ処理水に溶解した。抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡから混入したゲノムＤＮＡを除去するため、ＤＮａｓｅ処理を行った。ＤＮａｓｅ処理にはＤＮａｓｅ Ｉ（ＴａＫａＲａ社製）もしくはＤＮａｓｅ Ｉ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。いずれの場合もメーカー推奨の条件に従い５０μＬの反応溶液を調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応後にＤＥＰＣ処理水を３５０μＬとフェノールを４００μＬ加え混合し、室温、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上層を回収し、エタノールを８８０μＬ、３Ｍ ＮａＯＡｃを４０μＬ加え混合した。４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を３００μＬの７０％エタノールで洗浄した。４℃、１５，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を５０μＬのＤＥＰＣ処理水に溶解した。

〔Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕
実施例１と同様にして行った。

〔ｃＤＮＡからＣＰＴ遺伝子の取得〕
作製した１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー５：５‘−ｇｇａｔｃｃｇａｔｇｔｔｇｔｃｔａｔｔｃｔｃｔｃｔｔｃ −３’
プライマー６：５‘−ａｃｔａｇｔｔｃａａａｃｃｃｇａｃａｇｃｃａａａｔｃｇ −３’
を使用した。

上述の方法により、ＣＰＴの遺伝子が１種類（ＡｔＣＰＴ５）得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＡｔＣＰＴ５の塩基配列を配列番号１１に示した。また、ＡｔＣＰＴ５のアミノ酸配列を配列番号１２に示した。

〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ−ＡｔＣＰＴ５を作製した。

〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。

〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。

〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ−ＡｔＣＰＴ５を制限酵素Ｂａｍ ＨＩとＳｐｅ Ｉで処理したのち、同様にＢａｍ ＨＩとＳｐｅ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＡｔＣＰＴ５を作製した。

〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。

〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。

〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１ ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＡｔＣＰＴ５を鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。

〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２ 透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。

〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔ゴム粒子へのＡｔＣＰＴ５の結合の確認〕
ゴム粒子へのＡｔＣＰＴ５の結合は、実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
なお、無細胞蛋白合成反応後の透析カップの溶液（蛋白合成溶液分離前）、及び、反応後のゴム粒子を回収するための超遠心分離を行った後の上清（分離後上清）を少量採取しておき、合わせてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。

実施例３におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動写真を図２に示す（レーン１０〜１２）。図２より、矢印部分で示した反応直後の無細胞蛋白合成溶液（蛋白合成溶液分離前）で発現が確認されたＡｔＣＰＴ５がゴム粒子回収のための分離後の上清（分離後上清）には見られず、反応後のゴム粒子側にのみ確認できることが見て取れる。そのため、発現したＡｔＣＰＴ５がゴム粒子に結合したことが証明された。

〔ゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
また、実施例１及び比較例１で回収された反応後のゴム粒子について、ゴム合成活性を以下の方法により測定した。
まず、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１５μＭ ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、１００μＭ １−１４Ｃイソペンテニル二リン酸（［１−１４Ｃ］ＩＰＰ）（比活性：５Ｃｉ／ｍｏｌ）、１０μＬ ゴム粒子溶液を混合した反応溶液（Ｔｏｔａｌ １００μＬ）を調製し、３０℃で１６時間反応させた。
反応後、飽和ＮａＣｌを２００μＬ加え、１ｍＬのジエチルエーテルでイソペンテノールなどを抽出した。次に、水相のポリプレニル二リン酸を１ｍＬの食塩水飽和ＢｕＯＨで抽出し、その後さらに、水相の超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）を１ｍＬのトルエン／ヘキサン（１：１）で抽出し、放射活性を計測した。各層の放射活性は液体シンチレーションカウンターで１４Ｃのカウントを計測した。放射活性（ｄｐｍ）が高いほど、天然ゴムが多く生産されており、ゴム合成活性が高いことを示す。

比較例１で回収された反応後のゴム粒子のゴム合成活性を１００％としたときの、実施例１で回収された反応後のゴム粒子のゴム合成活性は、２００％であった。
この結果から、ＣＰＴ結合後のゴム粒子は、ＣＰＴが結合していないゴム粒子と比較して、ゴム粒子のゴム合成活性が上昇していることが分かる。このことからも実施例１において、ＣＰＴがゴム粒子に結合していることが証明された。

（比較例２）
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
無細胞蛋白合成法用ベクターには、特開２００５−２１８３５７号公報に記載されるＧＦＰ遺伝子を含むプラスミドＧＦＰ／ｐＥＵ（国際公開０１／２７２６０号公報）を使用した。

〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１ ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したＧＦＰ／ｐＥＵを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。

〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２ 透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。

〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔ゴム粒子へのＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の結合の確認〕
ゴム粒子へのＧＦＰの結合は、実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
なお、無細胞蛋白合成反応後の透析カップの溶液（蛋白合成溶液分離前）、及び、反応後のゴム粒子を回収するための超遠心分離を行った後の上清（分離後上清）を少量採取しておき、合わせてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。

比較例２におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動写真を図３に示す（レーン１〜３）。図３より、矢印部分で示した反応直後の無細胞蛋白合成溶液（蛋白合成溶液分離前）で発現が確認されたＧＦＰがゴム粒子回収のための分離後の上清（分離後上清）にしか見られず、反応後のゴム粒子側に確認できないことが見て取れる。そのため、発現した非膜結合型のＧＦＰはゴム粒子に結合しなかったことが証明された。

（比較例３）
〔ゴム粒子の調製〕
ゴム粒子は、５段階の遠心分離によってＨｅｖｅａラテックスから調製した。Ｈｅｖｅａラテックス９００ｍＬに、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬを添加し、ラテックス溶液を調製した。得られたラテックス溶液を、１０００×ｇ、２０００×ｇ、８０００×ｇ、２００００×ｇ、５００００×ｇの異なる遠心速度で段階的に遠心分離した。遠心分離はいずれも４℃、４５分で行った。５００００×ｇでの遠心分離で残ったゴム粒子層に、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）を終濃度１．０〜２．０×ＣＭＣ（臨界ミセル濃度ＣＭＣの１．０〜２．０倍）になるように加え、ゴム粒子を洗浄した。洗浄処理後、洗浄されたゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔ゴム粒子からの蛋白質の引きはがし〕
ゴム粒子を１０×ＣＭＣ（臨界ミセル濃度ＣＭＣの１０倍）の濃度のＣＨＡＰＳで４℃で一晩処理することで蛋白質の引きはがしを行った。処理後、超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって洗浄済みゴム粒子と剥がれた蛋白質を含む水層に分離した。

〔透析法によるゴム粒子への蛋白質の再結合〕
得られた洗浄済みゴム粒子に蛋白質を再結合させるために、洗浄済みゴム粒子と剥がれた蛋白質を含む水層を再度混合し、透析膜で包んだ。透析膜は内溶液の１０００倍量の外液（２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５））中に沈め、透析を行った。外液は２時間ごとに新しいものに変え、計８時間透析を行い、界面活性剤を除去した。

〔ゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
上記透析によりゴム粒子に蛋白質が再結合していれば、ゴム粒子のゴム合成活性は透析前より回復しているはずである。そのため、ゴム粒子のゴム合成活性を透析前と透析後で比較した。ゴム粒子のゴム合成活性の測定は、上記と同様にして行った。
そして、上記〔ゴム粒子の調製〕で回収されたゴム粒子（無処理ゴム粒子）のゴム合成活性を１００％としたときの、ゴム合成活性量を百分率表示した。
結果を表１に示す。

表１より、ゴム粒子のゴム合成活性は、透析前後で回復していないことが分かる。このことから、ゴム粒子と蛋白質を混合しただけではゴム粒子に蛋白質を結合させることはできない、ということが示された。

（配列表フリーテキスト）
配列番号１：プライマー１
配列番号２：プライマー２
配列番号３：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号４：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号５：プライマー３
配列番号６：プライマー４
配列番号７：パラゴムノキ由来のＨＲＴＢＰをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号８：パラゴムノキ由来のＨＲＴＢＰのアミノ酸配列
配列番号９：プライマー５
配列番号１０：プライマー６
配列番号１１：アラビドプシス由来のＡｔＣＰＴ５をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１２：アラビドプシス由来のＡｔＣＰＴ５のアミノ酸配列

Claims (11)

1. 膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程を含む膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
2. 前記無細胞蛋白合成溶液が、胚芽抽出物を含む請求項１記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
3. 前記胚芽抽出物が、小麦由来である請求項２記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
4. 前記無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が、５〜５０ｇ／Ｌである請求項１〜３のいずれかに記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
5. 前記ゴム粒子は、前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に、界面活性剤で洗浄されたものである請求項１〜４のいずれかに記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
6. 前記界面活性剤が、両性界面活性剤であり、
   前記ゴム粒子を洗浄する際の該界面活性剤の濃度が、臨界ミセル濃度の３倍以内である請求項５記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
7. 前記界面活性剤が、ＣＨＡＰＳである請求項５又は６記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
8. 前記蛋白質合成が、透析法により行われる請求項１〜７のいずれかに記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
9. 前記蛋白質合成反応中に、前記膜結合蛋白質をコードするｍＲＮＡを更に加える請求項１〜８のいずれかに記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
10. 請求項１〜９のいずれかに記載のゴム粒子の製造方法によりゴム粒子を製造する工程、前記ゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、前記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
11. 請求項１〜９のいずれかに記載のゴム粒子の製造方法によりゴム粒子を製造する工程、前記ゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、前記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。