JP6448194B2 - シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び、ＮｏｇｏＢｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、シス型プレニルトランスフェラーゼ及びＮｏｇｏＢｒｅｃｅｐｔｏｒを発現させた形質転換体、並びに該形質転換体を用いたポリイソプレノイドの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び、Ｎｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、シス型プレニルトランスフェラーゼ及びＮｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒを発現させた形質転換体、並びに該形質転換体を用いたポリイソプレノイドの製造方法に関する。

現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）などのイソプレノイド産生植物より採取することにより得られる。

現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年に限られる。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。そのため、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源やパラゴムノキにおける天然ゴムの生産効率の改善が望まれている。

天然ゴムは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を基本単位とし、シス−１，４−ポリイソプレン構造をとっており、天然ゴムの生合成にはその構造からシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）が関係していると考えられている。例えば、パラゴムノキでは複数のＣＰＴの存在が確認されており、Ｈｅｖｅａ Ｒｕｂｂｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ＨＲＴ１）、Ｈｅｖｅａ Ｒｕｂｂｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＨＲＴ２）などが知られている（例えば、非特許文献１、２参照。）。また、タンポポの一種であるゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ）ではＣＰＴの発現量を抑えることにより、ゴムの合成量が低下することが知られている（例えば、非特許文献３参照。）。

また、これまでに天然ゴムの生合成に関わるタンパク質の研究として、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）が注目されてきた（例えば、非特許文献４、５参照。）。しかしながら、これらのタンパク質とＣＰＴとの関係は解明されていない。
他方、ヒトＣＰＴにおけるドリコール生合成において、Ｎｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢｒ）が関与していることが示唆されている（例えば、非特許文献６参照。）。

Ｒａｈａｍａｎ他、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１３年、第１４巻 Ａｓａｗａｔｒｅｒａｔａｎａｋｕｌ他、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第２７０巻、４６７１〜４６８０ページ Ｐｏｓｔ他、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１２年、第１５８巻、１４０６〜１４１７ページ Ｈｉｌｌｅｂｒａｎｄ他、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２０１２年、第７巻 Ｐｒｉｙａ他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２００７年、第２６巻、１８３３〜１８３８ページ Ｋ.Ｄ.Ｈａｒｒｉｓｏｎ他、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１１年、第３０巻、２４９０〜２５００ページ

上述のように、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源の開発やパラゴムノキにおける天然ゴムの生産効率の改善が望まれているが、現状、天然ゴムの生合成機構、特にその調節機構には未解明の部分が多く、天然ゴムの大幅な増産のためにはまだまだ多くの工夫の余地がある。そのような中で、上記課題を解決するための一つのアプローチとして、天然ゴムの生合成においてＣＰＴの活性の安定化及び増強を図ることにより天然ゴムの増産を目指す方法が考えられる。

本発明は、上記現状に鑑みてなされたものであり、ポリイソプレノイドの生合成に関与していると見られているシス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び、Ｎｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、シス型プレニルトランスフェラーゼ及びＮｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒを発現させた形質転換体、並びに該形質転換体を用いたポリイソプレノイドの製造方法を提供することを目的とする。

本発明は、シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び、Ｎｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、シス型プレニルトランスフェラーゼ及びＮｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒを発現させた形質転換体に関する。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及び／又はＮｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子が、植物由来であることが好ましい。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及び／又はＮｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子が、イソプレノイド産生植物由来であることが好ましい。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及び／又はＮｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子が、パラゴムノキ由来であることが好ましい。

上記Ｎｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子が、以下の［３］又は［４］に記載のＤＮＡであることが好ましい。
［３］配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［４］配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ

上記シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、以下の［１］又は［２］に記載のＤＮＡであることが好ましい。
［１］配列番号１、３のいずれかの配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号１、３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ

上記シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、以下の［１−１］又は［２−１］に記載のＤＮＡであることが好ましい。
［１−１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２−１］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ

前記宿主が、イソプレノイド産生植物であることが好ましい。

本発明はまた、上記形質転換体を用いたポリイソプレノイドの製造方法に関する。

本発明の形質転換体は、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）をコードする遺伝子、及び、Ｎｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢｒ）をコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、ＣＰＴ及びＮｇＢｒを発現させた形質転換体であるので、宿主内においてＣＰＴとＮｇＢｒとが共発現することから、ＣＰＴの活性が安定化、増強されることが予想される。従って、該形質転換体では、ＣＰＴの触媒する反応の生成物の生合成量、ひいては、ポリイソプレノイドの生産性が向上するために、該形質転換体を用いてポリイソプレノイドの製造を行うことで、ポリイソプレノイドの製造量を増大できることが期待される。

酵母ツーハイブリット実験の結果を示す写真である。

本発明者は、ポリイソプレノイドの生産性の向上を目指して、種々の検討を行った。その中で、ポリイソプレノイド生合成において重要な役割を果たす酵素の一つと考えられるという理由から、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）に着目した。ここで、ヒトにおいて、Ｎｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢｒ）がＣＰＴと相互作用してＣＰＴの蛋白安定性を向上させ、ドリコール生合成活性を安定、増強化させている、という報告がなされている（非特許文献６）。このことから生物一般において、ＣＰＴの活性にＮｇＢｒが関与している可能性が考えられる。そこで本発明者は、ＣＰＴ及びＮｇＢｒを発現させた形質転換体を作製した。そのような形質転換体ではＣＰＴとＮｇＢｒとが共存することによって、ＣＰＴの活性が安定化、増強されることが予想され、ＣＰＴの触媒する反応の生成物の生合成量、ひいては、ポリイソプレノイドの生産性が向上して、ポリイソプレノイドの製造量を増大できることが期待できる。

本発明の形質転換体は、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）をコードする遺伝子、及び、Ｎｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢｒ）をコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、ＣＰＴ及びＮｇＢｒを発現させた形質転換体である。

上記ＣＰＴをコードする遺伝子及び／又はＮｇＢｒをコードする遺伝子は、その由来は特に制限されないが、植物由来であることが好ましく、イソプレノイド産生植物由来であることがより好ましい。中でも、共にパラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種のイソプレノイド産生植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、共にパラゴムノキ由来であることである。

（シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）のアミノ酸配列）
ＣＰＴの具体例としては、下記［１］が挙げられる。
［１］配列番号２、４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質

また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＣＰＴの具体例としては、下記［２］も挙げられる。
［２］配列番号２、４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ本来持つ機能を有する蛋白質
ここで、本明細書において、配列番号２、４のいずれかで表される蛋白質が本来持つ機能とは、ＣＰＴが本来持つ機能、すなわち、イソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素活性である。

なお、上記酵素活性を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜５８個のアミノ酸、更に好ましくは１〜４４個のアミノ酸、更により好ましくは１〜２９個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜６個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。

また、上記酵素活性を維持するためには、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜５７個のアミノ酸、更に好ましくは１〜４３個のアミノ酸、更により好ましくは１〜２９個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜６個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。

アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。

また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＣＰＴの具体例としては、下記［３］も挙げられる。
［３］配列番号２、４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ本来持つ機能を有する蛋白質

なお、本来持つ機能、すなわち上記酵素活性を維持するためには、配列番号２、４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。

アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３ （１９９０）］を用いて決定することができる。

上記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。

なお、上記ＣＰＴとしては、
［１−１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２−１］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ本来持つ機能を有する蛋白質
［３−１］配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ本来持つ機能を有する蛋白質
のいずれかであることが好ましい。上記ＣＰＴがこのような蛋白質であると、ＮｇＢｒと相互作用することを本発明者は見出し、これによりＣＰＴの活性がより安定化、増強されると予想される。

（Ｎｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢｒ）のアミノ酸配列）
ＮｇＢｒの具体例としては、下記［４］が挙げられる。
［４］配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質

また、上述したように、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られているので、上記ＮｇＢｒの具体例としては、下記［５］も挙げられる。
［５］配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ本来持つ機能を有する蛋白質
ここで、本明細書において、配列番号６で表される蛋白質が本来持つ機能とは、ＮｇＢｒが本来持つ機能、すなわち、Ｎ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能である。ただし、神経細胞中でのＮｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒの機能として、ミエリン阻害性蛋白質（例えば、Ｎｏｇｏ Ａなど）等と相互作用することでニューロンの成長円錐の虚脱及び神経突起伸長の阻害をもたらすシグナル伝達に関与することが知られているが、本明細書においては、当該シグナル伝達に関与する相互作用については上記配列番号６で表される蛋白質が本来持つ機能に含めないこととする。

なお、本来持つ機能、すなわち上記ＮｇＢｒとしての機能を維持するためには、配列番号６で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜５２個のアミノ酸、更に好ましくは１〜３９個のアミノ酸、更により好ましくは１〜２６個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１３個のアミノ酸、最も好ましくは１〜６個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。

アミノ酸置換の例としては、上記同様、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。

また、上述したように、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＮｇＢｒの具体例としては、下記［６］も挙げられる。
［６］配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ本来持つ機能を有する蛋白質

なお、本来持つ機能、すなわち上記ＮｇＢｒとしての機能を維持するためには、配列番号６で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。

ＮｇＢｒとしての構造を有する蛋白質であることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、形質転換体を粉砕し、遠心分離により画分に分離した後、市販のＡｎｔｉ Ｎｏｇｏ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ抗体（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧｅｎｅＴｅｘなど）を用いてウェスタンブロッティング法を行い、膜画分において強い発現を確認する方法などが挙げられる。

（シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）をコードするＤＮＡ）
また、ＣＰＴをコードするＤＮＡとしては、下記［１］又は［２］が挙げられる。
［１］配列番号１、３のいずれかの配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号１、３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本来持つ機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
ここで、本明細書において、配列番号１、３のいずれかの配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡがコードする蛋白質が本来持つ機能とは、上述の配列番号２、４のいずれかで表される蛋白質が本来持つ機能と同様である。

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。

上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。

上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１、３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。

上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。

なお、ＣＰＴをコードするＤＮＡとしては、
［１−１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２−１］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本来持つ機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
のいずれかであることが好ましい。上記ＣＰＴをコードするＤＮＡがこのような配列のＤＮＡであると、発現するＣＰＴがＮｇＢｒと相互作用することを本発明者は見出し、これによりＣＰＴの活性がより安定化、増強されると予想される。

（Ｎｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢｒ）をコードするＤＮＡ）
また、ＮｇＢｒをコードするＤＮＡとしては、下記［３］又は［４］が挙げられる。
［３］配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［４］配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本来持つ機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
ここで、本明細書において、配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡがコードする蛋白質が本来持つ機能とは、上述の配列番号６で表される蛋白質が本来持つ機能と同様である。

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号５で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。

上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の構造を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、形質転換体を粉砕し、遠心分離により画分に分離した後、市販のＡｎｔｉ Ｎｏｇｏ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ抗体（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧｅｎｅＴｅｘなど）を用いてウェスタンブロッティング法を行い、膜画分において強い発現を確認する方法などが挙げられる。

また、上記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、上記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、上記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。

（形質転換体）
ＣＰＴをコードする遺伝子、及び、ＮｇＢｒをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、ＣＰＴ及びＮｇＢｒを発現するように形質転換された生物体（形質転換体）が得られる。そして、当該形質転換体では、ＣＰＴ及びＮｇＢｒが共発現することとなるため、ＣＰＴの活性が安定化、増強されると予想される。その結果、形質転換体においてＣＰＴの触媒する反応の生成物の生合成量、ひいては、ポリイソプレノイドの生産性が向上して、ポリイソプレノイドの製造量を好適に増大できるものと期待される。

次に、上記ＣＰＴ及びＮｇＢｒを発現するように形質転換された生物体（形質転換体）の作製方法について簡単に説明するが、このような形質転換体は従来公知の方法により作製することができる。

上記形質転換体の作製方法として、具体的には、例えば、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に、配列番号１、３のいずれかの配列番号で表される塩基配列を含むＤＮＡ及び配列番号５で表される塩基配列を含むＤＮＡを適当な制限酵素等を用いて挿入し、組換え体ＤＮＡを作製する。そして、該組換え体ＤＮＡを該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得ることができる。あるいは、プロモーターの下流に配列番号１、３のいずれかの配列番号で表される塩基配列を含むＤＮＡを適当な制限酵素等を用いて挿入された発現ベクター、及び、プロモーターの下流に配列番号５で表される塩基配列を含むＤＮＡを適当な制限酵素等を用いて挿入された発現ベクターを用いて組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得ることもできる。

上記宿主（宿主細胞）としては、特に限定されず真核生物が好ましいが、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。中でも、イソプレノイドを生合成できる生物でＣＰＴ及びＮｇＢｒを発現させることにより、ポリイソプレノイドの生産性の向上、ポリイソプレノイドの製造量の増大が特に期待できることから、宿主としては植物（より好ましくは、イソプレノイド産生植物）が好ましく、宿主細胞としては植物細胞（より好ましくは、イソプレノイド産生植物の植物細胞）が好ましい。このように、宿主が、イソプレノイド産生植物であることもまた、本発明の好適な実施形態の１つである。

上記イソプレノイド産生植物としては、イソプレノイドを産生可能な植物であれば特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ ｆ． ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｇｉｇａｎｔｅａ Ａｉｔ． ｖａｒ． ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｖｅｎｕｓｔｕｍ Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ ｐｕｍｉｌａ Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ａｍｐｅｌａｓ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｉｒｉｓａｎａ Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｓｅｐｔｉｃａ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましく、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール、及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。

発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、上記組換え体ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものを使用できる。

植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクター、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、タバコモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、イネ由来アクチン遺伝子プロモーター等をあげることができる。

なお、イソプレノイド化合物が生合成される組織、例えば乳管に特異的に発現するプロモーターを持った発現ベクターを使用することが好ましい。イソプレノイドが生合成される組織に特異的に発現させることにより、植物の生長遅延などの弊害を抑制することが出来る。

組換えベクターの導入方法としては、宿主細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５号公報、特開昭６０−７００８０号公報、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等をあげることができる。

以上の方法等により、上記形質転換体（形質転換植物細胞）が得られる。

本発明はまた、ＣＰＴをコードする遺伝子及びＮｇＢｒをコードする遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物を提供するものでもある。該イソプレノイド産生植物は、形質転換植物細胞を有するイソプレノイド産生植物であれば特に限定されず、例えば、上述の方法で得られた形質転換植物細胞のみならず、その子孫又はクローン、さらにそれらを継代させて得られる子孫植物の全てを含む概念である。一旦、ゲノム内に上記ＤＮＡやベクターが導入された形質転換植物細胞が得られれば、該形質転換植物細胞から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫又はクローンを得ることが可能である。また、該形質転換植物細胞やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該イソプレノイド産生植物を量産することも可能である。

形質転換植物細胞から植物体を再生する方法は、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特願平１１−１２７０２５号公報）、イネではＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５）， Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４−）、トウモロコシではＳｈｉｌｌｉｔｏらの方法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９）， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１−）、ジャガイモではＶｉｓｓｅｒらの方法（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９）， Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９−）、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２）， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７−）が知られており、当業者であれば、これらを参照して形質転換植物細胞から植物体を再生できる。

再生した植物体において、周知の手法を用いることで、目的の蛋白質遺伝子の発現を確認することが出来る。例えば、目的の蛋白質の発現をウエスタンブロット解析すればよい。

上記形質転換植物体から種子を得る方法としては、例えば、形質転換植物体を適当な培地において発根させ、その発根体を水分含有の土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させ、最終的に種子を形成させて、該種子を得る。また、種子から植物体を得る方法としては、例えば、前記のようにして得られた形質転換植物体由来の種子を、水分含有の土に播種し、適当な栽培条件下で生育させることにより植物体を得ることができる。

本発明では、ＣＰＴをコードする遺伝子及びＮｇＢｒをコードする遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物を使用してポリイソプレノイドの製造を行うことにより、ポリイソプレノイドの生産性を向上できることが期待される。具体的には、上述の方法で得られた形質転換植物細胞、形質転換植物細胞から得られたカルス、該カルスから再分化した細胞等を適当な培地で培養したり、形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体、該形質転換植物体から得られた種子から得られた植物体等を適当な栽培条件下で生育させたりすることにより、ポリイソプレノイドを製造することができる。本発明の形質転換体は、導入された蛋白質によりＣＰＴの活性が安定化、増強されるものと予想され、ＣＰＴの触媒する反応の生成物の生合成量、ひいては、ポリイソプレノイドの生産性が向上して、ポリイソプレノイドの製造量を増大できることが期待される。

なお、本明細書において、ポリイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ_５Ｈ_８）で構成された重合体の総称である。ポリイソプレノイドとしては、例えばモノテルペン（Ｃ_１０）、セスキテルペン（Ｃ_１５）、ジテルペン（Ｃ_２０）、セスタテルペン（Ｃ_２５）、トリテルペン（Ｃ_３０）、テトラテルペン（Ｃ_４０）、天然ゴムなどの重合体が挙げられる。また、本明細書において、イソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ_５Ｈ_８）を有する化合物を意味し、ポリイソプレノイドをも含む概念である。

以上の説明の通り、本発明では、ＣＰＴ及びＮｇＢｒを共発現させることになることから、ＣＰＴの活性が安定化、増強されるものと予想され、その結果、形質転換体においてＣＰＴの触媒する反応の生成物の生合成量、ひいては、ポリイソプレノイドの生産性が向上して、ポリイソプレノイドの製造量を好適に増大できることが期待できる。このように、ＣＰＴをコードする遺伝子、及び、ＮｇＢｒをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、ＣＰＴ及びＮｇＢｒを発現させた形質転換体を用いたポリイソプレノイドの製造方法もまた、本発明の１つである。

なお、ＣＰＴとＮｇＢｒとを共存させてポリイソプレノイドの増産を図る方法としては、上述のような生体内でＣＰＴとＮｇＢｒとを発現させた形質転換体を用いる方法の他に、細胞内から粗酵素を抽出して、ＣＰＴ、ＮｇＢｒを精製した後、試験管内で共存させる、といった生体外で共存させる方法も考えられる。

上記生体外でＣＰＴとＮｇＢｒとを共存させる方法においてＣＰＴ、ＮｇＢｒは、例えば、適当なベクターにＣＰＴをコードする遺伝子及び／又はＮｇＢｒをコードする遺伝子を挿入した後、形質転換を行った大腸菌、酵母、植物体や無細胞系蛋白質発現システム等を利用して製造することができる。

上記生体外でＣＰＴとＮｇＢｒとを共存させる方法において利用するＣＰＴの由来は特に限定されないが、真核生物由来であることが好ましく、植物由来であることがより好ましく、イソプレノイド産生植物由来であることが更に好ましい。またその修飾状態も限定されず、リン酸化、メチル化、アセチル化、パルミトイル化、ミリストイル化、ファルネシル化、糖鎖付加、ユビキチン化などの酵素への修飾基の付加、またはジスルフィド基の酸化・還元やプロテアーゼによる構造変化を起こしたＣＰＴであってもよい。

上記生体外でＣＰＴとＮｇＢｒとを共存させる方法において利用するＮｇＢｒの由来は特に限定されないが、真核生物由来であることが好ましく、植物由来であることがより好ましく、イソプレノイド産生植物由来であることが更に好ましい。またその修飾状態も限定されず、リン酸化、メチル化、アセチル化、パルミトイル化、ミリストイル化、ファルネシル化、糖鎖付加、ユビキチン化などの酵素への修飾基の付加、またはジスルフィド基の酸化・還元やプロテアーゼによる構造変化を起こしたＮｇＢｒであってもよい。

ここで、上述したように、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、又は、配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本来持つ機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡによってコードされているＣＰＴが、ＮｇＢｒと相互作用する、ということを本発明者は見出したが、ＮｇＢｒは更に当該ＣＰＴ以外の第３の蛋白質とも相互作用することが考えられる。そのような相互作用の形態としては、例えば、次の２通りの形態などが考えられる。
（１）ＮｇＢｒを介して上記ＣＰＴ及び上記第３の蛋白質が相互作用する、すなわち、ＮｇＢｒ、上記ＣＰＴ及び上記第３の蛋白質が同時に相互作用する。
（２）ＮｇＢｒと上記ＣＰＴとの相互作用、及び、ＮｇＢｒと上記第３の蛋白質との相互作用が個別に起こる。
なお、上記第３の蛋白質としては、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）、Ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＦＰＰ）ｓｙｎｔｈａｓｅなどが挙げられるが、これらに限らない。

上記生体外でＣＰＴとＮｇＢｒとを共存させる方法においては、ＣＰＴ、ＮｇＢｒに加えて、更に、他の酵素を追加して共存させてもよい。該酵素としては、ラテックス中に含まれる酵素として知られるＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）、Ｓｍａｌｌ ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｅｖｅｉｎ、β−１，３−Ｇｌｕｃａｎａｓｅ、Ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＦＰＰ）ｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎなどが挙げられる。中でも特に、ＮｇＢｒと相互作用するＲＥＦ等の酵素が好ましい。

上記生体外でＣＰＴとＮｇＢｒとを共存させる方法において、ＣＰＴ、ＮｇＢｒに加えて、更に、追加して共存させることができるものとしては、酵素に限らず、反応後の生成物を取り込む役割を果たす膜であってもよい。膜の種類は特に限定されず、細胞膜やＳｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅのような天然由来のものであってもよいし、リポソームのような人工的なものであってもよい。

上記膜を形成する脂質としては、脂質二分子膜を構成しうる脂質が使用でき、例えば、公知のグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール及びリン脂質等が挙げられる。

上記グリセロ糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、及びグリコシルジグリセリド等が挙げられる。また、上記スフィンゴ糖脂質としては、例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、及びガングリオシド等が挙げられる。

上記リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、及び水素添加リン脂質等の天然または合成のリン脂質が挙げられる。

上記ホスファチジルコリンとしては、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルフォスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられる。
上記ホスファチジルエタノールアミンとしては、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
上記ホスファチジルセリンとしては、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、及びジステアロイルホスファチジルセリン等が挙げられる。
上記ホスファチジルグリセロールとしては、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、及びジステアロイルホスファチジルグリセロール等が挙げられる。
上記ホスファチジルイノシトールとしては、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、及びジステアロイルホスファチジルイノシトール等が挙げられる。

実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

〔クローニング〕
（目的蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列の同定）
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ラテックス６ｍＬに１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液６ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬを添加し、さらに６５℃で予温しておいた水飽和フェノールを１２ｍＬ添加した。６５℃で５分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール：クロロホルム（１：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１．２ｍＬとイソプロパノール１３ｍＬを添加し、ボルテックスで撹拌した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを沈殿させるために、−２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取除くことでＴｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿を回収した。回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡは７０％エタノールで２度洗浄したのち、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅの水で溶解させた。

回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）の説明書に従って行った。

作製した１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴおよびＮｇＢｒの遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴの遺伝子取得はプライマーとして、
プライマー１：５′−ｔｔｔｇｇｃｃａｔｔａｃｇｇｃｃａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ−３′
と、
プライマー２：５′−ｔｔｔｇｇｃｃｇａｇｇｃｇｇｃｃｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃ−３′
を使用した。
また、ＮｇＢｒの遺伝子取得はプライマーとして、
プライマー３：５′−ｔｔｔｇｇｃｃａｔｔａｃｇｇｃｃａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇａｇ−３′
と、
プライマー４：５′−ｔｔｔｇｇｃｃｇａｇｇｃｇｇｃｃｔｃａｔｇｔａｃｃａｔａａｔｔｔｔｇｃｔｇｃａｃ−３′
を使用した。

上述の方法により、ＣＰＴの遺伝子が２種類（ＨＲＴ１、ＨＲＴ２）、ＮｇＢｒの遺伝子が１種類（ＮｇＢｒ）得られた。得られた３種類の遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＨＲＴ１の塩基配列を配列番号１に、ＨＲＴ２の塩基配列を配列番号３に、ＮｇＢｒの塩基配列を配列番号５に示した。また、ＨＲＴ１のアミノ酸配列を配列番号２に、ＨＲＴ２のアミノ酸配列を配列番号４に、ＮｇＢｒのアミノ酸配列を配列番号６に示した。

（ベクターの構築）
上記計３種類の増幅、取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ−ＨＲＴ１、ｐＧＥＭ−ＨＲＴ２、ｐＧＥＭ−ＮｇＢｒを作製した。

（大腸菌の形質転換）
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、青／白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。

目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。
回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。

〔ＣＰＴをコードする遺伝子及びＮｇＢｒをコードする遺伝子を発現させた形質転換酵母の作製〕
上記（ベクターの構築）で作成したベクターを鋳型としたＰＣＲによって、酵母発現用ベクターに挿入するためのＨＲＴ１遺伝子、ＨＲＴ２遺伝子、ＮｇＢｒ遺伝子を獲得した。
ＨＲＴ１及びＨＲＴ２の遺伝子取得はプライマーとして、
プライマー５：５′−ｇａｃｇｃｃｃｇｇｇａｇｇｃｃａｔｇａａ−３′
と、
プライマー６：５′−ｃａｇｃｔｔｃｃｔｃｃｃｇｇｇｃｔｔｔｇ−３′
を使用した。
また、ＮｇＢｒの遺伝子取得はプライマーとして、
プライマー７：５′−ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇ−３′
と、
プライマー８：５′−ｔｔｔｃｔｃｇａｇｔｇｔａｃｃａｔａａｔｔｔｔｇｃｔｇｃａｃ−３′
を使用した。

上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ−ＨＲＴ１ ＹＥ、ｐＧＥＭ−ＨＲＴ２ ＹＥ、ｐＧＥＭ−ＮｇＢｒ ＹＥを作製した。

上記（大腸菌の形質転換）に記載した方法と同様にして、上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌の形質転換、プラスミドの回収、塩基配列の確認を行った。そして、塩基配列に変異のないことが確認されたｐＧＥＭ−ＨＲＴ１ ＹＥ、ｐＧＥＭ−ＨＲＴ２ ＹＥを制限酵素ＳｍａＩで処理し、同様にＳｍａＩで処理したｐＧＫ４２６に挿入して、ｐＧＫ−ＨＲＴ１、ｐＧＫ−ＨＲＴ２を作製した。
同様に、塩基配列に変異のないことが確認されたｐＧＥＭ−ＮｇＢｒ ＹＥを制限酵素ＸｂａＩで処理し、同様にＸｂａＩで処理したｐＧＫ４２５に挿入して、ｐＧＫ−ＮｇＢｒを作製した。

上記作製したプラスミドを使用して、酵母ＳＮＨ２３−７Ｄ株の形質転換を行った。酵母の二重形質転換はＰＥＧ法を用いて行った。形質転換体はＬｅｕ、Ｕｒａを抜いたＳＤ培地上で２３℃で３日間培養することによって選別を行った。酵母の二重形質転換体は以下の組み合わせで作製した。
（１）ＳＮＨ２３−７Ｄ／ｐＧＫ４２６、ｐＧＫ４２５（遺伝子挿入なし）
（２）ＳＮＨ２３−７Ｄ／ｐＧＫ−ＨＲＴ１、ｐＧＫ４２５（ＨＲＴ１単独発現株）
（３）ＳＮＨ２３−７Ｄ／ｐＧＫ−ＨＲＴ２、ｐＧＫ４２５（ＨＲＴ２単独発現株）
（４）ＳＮＨ２３−７Ｄ／ｐＧＫ−ＨＲＴ１、ｐＧＫ−ＮｇＢｒ（ＨＲＴ１及びＮｇＢｒの共発現株）
（５）ＳＮＨ２３−７Ｄ／ｐＧＫ−ＨＲＴ２、ｐＧＫ−ＮｇＢｒ（ＨＲＴ２及びＮｇＢｒの共発現株）
なお、ＳＮＨ２３−７Ｄ／ｐＧＫ４２６、ｐＧＫ−ＮｇＢｒ（ＮｇＢｒ単独発現株）の形質転換体は得られなかった。

〔酵母ツーハイブリット法〕
上記〔クローニング〕で回収したプラスミドに挿入された目的遺伝子を酵母ツーハイブリット法用のプラスミドに挿入させるため、制限酵素ＳｆｉＩで処理し、目的遺伝子の切り出しを行った。

（ベクターの構築）
上記切り出した遺伝子を酵母ツーハイブリット用のプラスミドにＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を利用して挿入した。酵母ツーハイブリット用のプラスミドはＢａｉｔ用にｐＢＴ３−ＳＵＣ ｂａｉｔ ｖｅｃｔｏｒを使用し、Ｐｒｅｙ用にｐＰＲ３−Ｎ ｐｒｅｙ ｖｅｃｔｏｒを使用した。Ｐｒｅｙ側にはＨＲＴ１又はＨＲＴ２を挿入し（ｐＰＲ−ＨＲＴ１、ｐＰＲ−ＨＲＴ２）、Ｂａｉｔ側にはＨＲＴ１、ＨＲＴ２又はＮｇＢｒを挿入した（ｐＢＴ−ＨＲＴ１、ｐＢＴ−ＨＲＴ２、ｐＢＴ−ＮｇＢｒ）。

（大腸菌の形質転換）
上記酵母ツーハイブリット用に作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。

上記目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。

（酵母の二重形質転換）
上記回収したプラスミドを使用して、酵母ＮＭＹ−５１株の形質転換を行った。酵母の二重形質転換はＰＥＧ法を用いて行った。形質転換体はＴｒｐ、Ｌｅｕを抜いたＳＤ培地上で３０℃で三日間培養することによって選別を行った。酵母の二重形質転換体は下記表１に記載の組合せで行った。

上記酵母の二重形質転換体は、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ａｄｅ、Ｈｉｓを抜いたＳＤ培地上で３０℃で三日間培養することにより、酵母ツーハイブリット法によって酵素間相互作用を確認した。この実験では、Ｂａｉｔ用プラスミドに導入された遺伝子にコードされる蛋白質と、Ｐｒｅｙ用プラスミドに導入された遺伝子にコードされる蛋白質との間に相互作用がある場合にのみ、酵母が選択培地上で育つことができるものである。

酵母ツーハイブリット法の評価結果は図１の通りである。図１（ａ）は、ＨＲＴ１と、ＨＲＴ２、ＮｇＢｒとの相互作用の有無を確認した結果であり、図１（ｂ）は、ＨＲＴ２と、ＨＲＴ１、ＮｇＢｒとの相互作用の有無を確認した結果である。図１（ａ）においては、右上の画分から時計回りに上記表１における組み合わせＮｏ．１、４、５、６、３に相当する結果を示しており、図１（ｂ）においては、右上の画分から時計回りに上記表１における組み合わせＮｏ．１、７、８、９、２に相当する結果を示している。

図１の評価結果から、図１（ａ）の上記表１における組み合わせＮｏ．５の場合、すなわち、ＨＲＴ１とＮｇＢｒとの組み合わせ、においてのみ相互作用が認められ、このことから、ＮｇＢｒはラテックスに含まれるＣＰＴの一つであるＨＲＴ１とは相互作用するが、ＨＲＴ２とは相互作用しないことが分かった。このことからＮｇＢｒは全てのＣＰＴと相互作用するわけではなく、特定のＣＰＴと相互作用することがわかる。
この結果からＮｇＢｒとＨＲＴ１を組み合わせることによりＨＲＴ１の活性をより安定化・増強することができると考えられる。

１：ｐＰＲ３ＮのＰｒｅｙ用プラスミドと、ｐＢＴ３−ＳＵＣのＢａｉｔ用プラスミドとの組み合わせ
２：ｐＰＲ３ＮのＰｒｅｙ用プラスミドと、ｐＢＴ−ＨＲＴ１のＢａｉｔ用プラスミドとの組み合わせ
３：ｐＰＲ３ＮのＰｒｅｙ用プラスミドと、ｐＢＴ−ＨＲＴ２のＢａｉｔ用プラスミドとの組み合わせ
４：ｐＰＲ−ＨＲＴ１のＰｒｅｙ用プラスミドと、ｐＢＴ３−ＳＵＣのＢａｉｔ用プラスミドとの組み合わせ
５：ｐＰＲ−ＨＲＴ１のＰｒｅｙ用プラスミドと、ｐＢＴ−ＮｇＢｒのＢａｉｔ用プラスミドとの組み合わせ
６：ｐＰＲ−ＨＲＴ１のＰｒｅｙ用プラスミドと、ｐＢＴ−ＨＲＴ２のＢａｉｔ用プラスミドとの組み合わせ
７：ｐＰＲ−ＨＲＴ２のＰｒｅｙ用プラスミドと、ｐＢＴ３−ＳＵＣのＢａｉｔ用プラスミドとの組み合わせ
８：ｐＰＲ−ＨＲＴ２のＰｒｅｙ用プラスミドと、ｐＢＴ−ＨＲＴ１のＢａｉｔ用プラスミドとの組み合わせ
９：ｐＰＲ−ＨＲＴ２のＰｒｅｙ用プラスミドと、ｐＢＴ−ＮｇＢｒのＢａｉｔ用プラスミドとの組み合わせ

（配列表フリーテキスト）
配列番号１：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号３：パラゴムノキ由来のＨＲＴ２をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号４：パラゴムノキ由来のＨＲＴ２のアミノ酸配列
配列番号５：パラゴムノキ由来のＮｇＢｒをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号６：パラゴムノキ由来のＮｇＢｒのアミノ酸配列
配列番号７：プライマー１
配列番号８：プライマー２
配列番号９：プライマー３
配列番号１０：プライマー４
配列番号１１：プライマー５
配列番号１２：プライマー６
配列番号１３：プライマー７
配列番号１４：プライマー８

Claims (8)

1. シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び、Ｎｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、シス型プレニルトランスフェラーゼ及びＮｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒを発現させ、
   前記宿主が、イソプレノイド産生植物である
   形質転換体。
2. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及び／又はＮｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子が、植物由来である請求項１記載の形質転換体。
3. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及び／又はＮｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子が、イソプレノイド産生植物由来である請求項２記載の形質転換体。
4. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及び／又はＮｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子が、パラゴムノキ由来である請求項３記載の形質転換体。
5. 前記Ｎｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子が、以下の［３］又は［４］に記載のＤＮＡである請求項１、２、３、又は４に記載の形質転換体。
   ［３］配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
   ［４］配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
6. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、以下の［１］又は［２］に記載のＤＮＡである請求項１、２、３、４、又は５に記載の形質転換体。
   ［１］配列番号１、３のいずれかの配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡ
   ［２］配列番号１、３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
7. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、以下の［１−１］又は［２−１］に記載のＤＮＡである請求項６記載の形質転換体。
   ［１−１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
   ［２−１］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
8. 請求項１、２、３、４、５、６、又は７に記載の形質転換体を用いたポリイソプレノイドの製造方法。