BR112016015820B1

BR112016015820B1 - Transformante para expressar cis-preniltransferase e receptor nogo b

Info

Publication number: BR112016015820B1
Application number: BR112016015820-2A
Authority: BR
Inventors: Haruhiko Yamaguchi
Original assignee: Sumitomo Rubber Industries, Ltd
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2015-01-06
Publication date: 2023-05-02
Also published as: MY183219A; JP2015136296A; BR112016015820A2; WO2015107920A1; US20170009259A1; AU2015207265B2; RU2016130093A3; EP3097775B1; AU2015207265A1; US10000774B2; JP6448194B2; EP3097775A1; EP3097775A4; RU2016130093A; RU2682047C2

Abstract

TRANSFORMANTE PARA EXPRESSAR CIS-PRENILTRANSFERASE E RECEPTOR NOGO B. A presente invenção fornece um transformante produzido através da introdução de um gene que codifica para um cis-prenil-transferase e um gene que codifica para um receptor Nogo-B, os quais são considerados para ser envolvidos na biossíntese do poliisoprenóide dentro de um hospedeiro para permitir que o hospedeiro expresse a sequência cis-prenil-transferase e o receptor Nogo-B, e um método para a produção de um poliisoprenóide utilizando o transformante. A presente invenção refere- se a um transformante produzido através da introdução de um gene que codifica para um cis- preniltransferase e um gene que codifica para um receptor Nogo-B num hospedeiro para permitir que o hospedeiro expresse a sequência cis-preniltransferase e o receptor Nogo-B.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a um transformante produzido através da introdução de um gene que codifica para um cis-preniltransferase e um gene que codifica para um receptor Nogo-B dentro de um hospedeiro para permitir que o hospedeiro expresse a sequência cis-preniltransferase e o receptor Nogo-B, e um método para produzir um poli- isoprenóide utilizando o transformante.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Hoje em dia, borracha natural (um exemplo de poli-isoprenóides) para uso em produtos de borracha industriais são colhidos a partir de plantas produtoras de isoprenóides, tais como seringueira (Hevea brasiliensis) , pertencente à familia Euphorbiaceae, ou árvore de borracha indiana (Ficus elastica) pertencentes à familia Moraceae.

[0003] Atualmente, Hevea brasiliensis é praticamente a única fonte para a borracha natural utilizada em produtos de borracha industriais. Hevea brasiliensis é uma planta que só pode ser cultivada em certas regiões, incluindo o Sudeste da Ásia e América do Sul. Além disso, as árvores Hevea brasiliensis levam cerca de sete anos desde o plantio até crescimento maduro o suficiente para produzir borracha e produz borracha natural apenas por um periodo de 20 a 30 anos. A demanda por borracha natural deverá crescer no futuro, especialmente, nos paises em desenvolvimento, mas para as razões discutidas acima, é dificil aumentar significativamente a produção de borracha natural a partir de Hevea brasiliensis. Existe, portanto, a preocupação de que as fontes de borracha natural devem secar, e existem necessidades para desenvolver outras fontes do que as árvores de Hevea brasiliensis maduras como fontes de borracha natural, estável e para melhorar a produtividade da borracha natural da Hevea brasiliensis.

[0004] A borracha natural tem uma estrutura cis-1,4- poliisopreno, com uma unidade difosfato isopentenil (IPP), e a natureza desta estrutura sugere que a cis-preniltransferase (CPT) esteja envolvida na biossintese de borracha natural. Por exemplo, vários CPTs são encontradas em Hevea brasiliensis, incluindo Hevea Rubber Transferase 1 (HRT1) e Hevea Rubber transferase 2 (HRT2) (ver, por exemplo, Literaturas não patentárias 1 e 2). Sabe-se também que a síntese da borracha pode ser reduzida na espécie de dente de leão Taraxacum brevicorniculatum suprimindo a expressão da CPT (ver, por exemplo, Literatura não patentária 3).

[0005] Estudos anteriores de proteínas associadas com a biossíntese de borracha natural tem sido focado sobre o fator de alongamento da borracha (REF) e a proteína de partícula pequena de borracha (CPSR) (ver, por exemplo, Literatura não patentária 4 e 5). No entanto, as associações entre estas proteínas e CPT não estão completamente compreendidos.

[0006] Também tem sido sugerido que o receptor Nogo-B (NgBr) esteja envolvido na biossíntese de dolicol por uma CPT humana (ver, por exemplo, Literatura não patentária 6).

LISTA DE CITAÇÕES LITERATURA NÃO PATENTÁRIA

[0007] Literatura não patentária 1: Rahaman et al., BMC Genomics, 2013, vol. 14

[0008] Literatura não patentária 2: Asawatreratanakul et al, European Journal of Biochemistry, 2003, vol. 270, pp. 4671-4680

[0009] Literatura não patentária 3: Post et al.,Plant Physiology, 2012, vol. 158, pp. 1406-1417

[0010] Literatura não patentária 4: Hillebrand et al., PLoS ONE, 2012, vol. 7

[0011] Literatura não patentária 5: Priya et al., Plant Cell Reports, 2007, vol. 26, pp. 1833-1838

[0012] Literatura não patentária 6: K.D.Harrison et al., The EMBO Journal, 2011, vol. 30, pp. 2490-2500

SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[0013] Como discutido acima, existem necessidades para desenvolver outras fontes sem ser árvores de Hevea brasiliensis maduras como fontes de borracha natural, estável e para melhorar a produtividade da borracha natural da Hevea brasiliensis. Atualmente, no entanto, o mecanismo de biossintese de borracha natural, e, em particular, o mecanismo de regulação permanece em grande parte obscuro, e ainda há muito espaço para melhorias para aumentar significativamente a produção de borracha natural. Neste contexto, uma possivel abordagem para resolver estes problemas é o de estabilizar e aumentar a atividade de CPT na biossintese de borracha natural, a fim de aumentar a produção de borracha natural.

[0014] Tendo em vista estas circunstâncias, a presente invenção tem como objetivo proporcionar um transformante produzido através da introdução de um gene que codifica para um cis-preniltransferase e um gene que codifica para um receptor Nogo-B, que são considerados para serem envolvidos na biossintese de poli-isoprenóide, num hospedeiro para permitir que o hospedeiro expresse a sequência cis- preniltransferase e o receptor Nogo-B, e um método para a produção de um poli-isoprenóide utilizando o transformante.

SOLUÇÃO PARA 0 PROBLEMA

[0015] A presente invenção se refere a um transformante produzido através da introdução de um gene que codifica para um cis-preniltransferase e um gene que codifica para um receptor Nogo-B num hospedeiro para permitir que o hospedeiro expresse a sequência cis-preniltransferase e o receptor Nogo-B.

[0016] De um modo preferido, pelo menos, um do gene que codifica para um cis-preniltransferase ou o gene que codifica para um receptor Nogo-B é derivado de uma planta.

[0017] De um modo preferido, pelo menos, um do gene que codifica para um cis-preniltransferase ou o gene que codifica para um receptor Nogo-B é derivado de uma planta de produção de isoprenóides.

[0018] De um modo preferido, pelo menos, um do gene que codifica para um cis-preniltransferase ou o gene que codifica para um receptor Nogo-B é derivado de Hevea brasiliensis.

[0019] De preferência, o gene que codifica para um receptor Nogo-B é um dos seguintes DNAs: [3] um DNA possuindo a sequência nucleotidica da SEQ ID NO: 5; e [4] um DNA capaz de hibridizar com um DNA possuindo uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 5 sob condições rigorosas.

[0020] De preferência, o gene que codifica para uma cis-preniltransferase é um dos seguintes DNAs: [1] um DNA possuindo a sequência nucleotidica da SEQ ID NO: 1 ou 3; e [2] um DNA capaz de hibridizar com um DNA possuindo uma sequência de nucleotideos complementar à sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 1 ou 3 sob condições rigorosas, e que codifica para uma proteína possuindo uma atividade de enzima que catalisa uma reação de alongamento de cadeia-cis de um composto isoprenóide.

[0021] De preferência, o gene que codifica para uma cis-preniltransferase é um dos seguintes DNAs: [1-1] um DNA possuindo a sequência nucleotidica da SEQ ID NO: 1; e [2-1] um DNA capaz de hibridizar com um DNA possuindo uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 sob condições rigorosas, e que codifica para uma proteína possuindo uma atividade de enzima que catalisa uma reação de alongamento de cadeia-cis de um composto isoprenóide.

[0022] O hospedeiro é, preferencialmente, uma planta produtora de isoprenóide.

[0023] A presente invenção também se refere a um método para a produção de um poli-isoprenóide utilizando o transformante acima descrito.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[0024] O transformante da presente invenção é produzido através da introdução de um gene que codifica para uma cis-preniltransferase (CPT) e um gene que codifica para um receptor Nogo-B (NgBr) num hospedeiro, para permitir que o hospedeiro expresse o CPT e NgBr. Uma vez que a CPT e NgBR são co-expressos no hospedeiro, a atividade da CPT é esperada para ser estabilizada e melhorada. Por conseguinte, espera-se que no transformante, a quantidade dos produtos biossintetizados através das reações catalisadas pela CPT e, por conseguinte, a produção de poli-isoprenóide seja aumentada, e, assim, o uso do tal transformante na produção de poli-isoprenóide possa resultar no aumento do rendimento de poli-isoprenóide.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] A FIG. 1 mostra fotografias que ilustram os resultados das análises de levedura duplo-hibrida.

DESCRIÇÃO DE DETALHADA DA INVENÇÃO

[0026] O inventor da presente invenção fizeram vários estudos para melhorar a produtividade de poli-isoprenóide. Nos estudos, eles concentraram-se na cis-preniltransferase (CPT), porque foi considerada ser uma das enzimas que desempenham um papel chave na biossintese dos poli- isoprenóide. De acordo com um relatório (Literatura não patentária 6), o receptor Nogo-B (NgBr) interage com CPT em seres humanos para melhorar a estabilidade da proteina CPT, e assim, estabilizando e aumentando a atividade de biossintese de dolicol. Isto sugere o possível envolvimento de NgBr na atividade da CPT em organismos em geral. Em vista do acima exposto, o presente inventor prepararam um transformante modificado para expressar CPT e NgBr. No tal transformante, devido à coexistência de CPT e NgBr, a atividade da CPT é esperada para ser estabilizada e melhorada. Por conseguinte, espera-se que a quantidade dos produtos biossintetizados através das reações catalisadas pela CPT e, por conseguinte, a produção de poli-isoprenóide seja aumentada, resultando no aumento de rendimento de poli-isoprenóide.

[0027] O transformante da presente invenção é produzido através da introdução de um gene que codifica para um cis-preniltransferase (CPT) e um gene que codifica para um receptor Nogo-B (NgBr) num hospedeiro, para permitir que o hospedeiro expresse o CPT e NgBr.

[0028] O gene que codifica para um CPT e / ou o gene que codifica para um NgBr podem ser de qualquer origem, e, é preferencialmente, derivado de uma planta, mais preferivelmente, uma planta de produção de isoprenóides. Os genes são ainda, mais preferivelmente, ambos derivados a partir de pelo menos uma planta de produção de isoprenóides selecionado a partir do grupo que consiste de Hevea brasiliensis, Sonchus oleraceus, Parthenium argentatum, e Taraxacum kok-saghyz, de modo particularmente preferido, Hevea brasiliensis, entre outros.

(Sequência de aminoácidos de cis-preniltransferase (CPT))

[0029] A proteina seguinte [1] é um exemplo especifico da CPT:

[0030] [1] uma proteina possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 4.

[0031] Sabe-se que as proteínas possuindo uma ou mais substituições, deleções, inserções ou adições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos original pode ter a função inerente. Considerando este fato, um outro exemplo especifico da CPT é a seguinte proteina [2]: [2] uma proteina possuindo uma sequência de aminoácidos que contém uma ou mais substituições, deleções, inserções e / ou adições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 4, e tendo a função a elas inerentes. A função intrínseca da proteina da SEQ ID NO: 2 ou 4 se refere aqui à função inerente de CPT, que é, uma atividade da enzima que catalisa uma reação de alongamento de cadeia-cis de um composto isoprenóide.

[0032] A fim de manter a atividade da enzima, a sequência de aminoácidos contém, preferencialmente, uma ou mais, mais preferencialmente, 1-58, ainda mais preferencialmente, 1-44, ainda mais preferencialmente, 1-29, particularmente preferencial, 1-15, mais preferivelmente, 16, ainda mais preferivelmente, 1-3 substituições, deleções, inserções e / ou adições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID nO: 2.

[0033] Além disso, a fim de manter a atividade da enzima, a sequência de aminoácido contém, preferencialmente, uma ou mais, mais preferencialmente, 1-57, ainda mais preferencialmente, 1-43, ainda mais preferencialmente 1-29, particularmente preferencial 1-15, mais preferivelmente 1-6 , ainda mais preferencialmente 1-3 substituições, deleções, inserções e / ou adições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

[0034] Entre outras substituições de aminoácidos, substituições conservativas são as preferidas. Exemplos especificos incluem substituições dentro de cada um dos seguintes grupos entre parênteses: (glicina, alanina), (valina, isoleucina, leucina), (ácido aspártico, ácido glutâmico), (asparagina, glutamina), (serina, treonina), (lisina , arginina), (fenilalanina, tirosina), e semelhantes,

[0035] Sabe-se também que as proteínas com sequências de aminoácidos possuindo elevada identidade de sequência com a sequência de aminoácidos original também podem ter uma função semelhante. Considerando este fato, um outro exemplo específico da CPT é a seguinte proteína [3]: [3] uma proteina possuindo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 4, e tendo a função a elas inerentes.

[0036] A fim de manter a função inerente, isto é, a atividade da enzima acima descrita, a identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 4 é, de preferência, pelo menos 85%, mais preferencialmente, pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95%, de modo particularmente preferido, pelo menos 98%, mais preferencialmente, pelo menos 99%.

[0037] A identidade de sequência entre as sequências de aminoácidos ou de sequências de nucleotídeos pode ser determinada utilizando o algoritmo BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. EUA, 90, 5873 (1993)] desenvolvido por Karlin e Altschul ou FASTA [Methods Enzymol., 183, 63 (1990)].

[0038] Se é uma proteína possuindo a atividade enzimática acima, esta pode ser determinada por técnicas convencionais, tais como por expressão de uma proteina alvo em um transformante preparado através da introdução de um gene que codifica para a proteina alvo dentro de Escherichia coli ou outros organismos hospedeiros, e se determinar a presença ou ausência da função da proteina alvo com o método de medição da atividade correspondente.

[0039] A CPT é, preferencialmente, qualquer uma das seguintes proteínas: [1-1] uma proteína possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; [2-1] uma proteína possuindo uma sequência de aminoácidos que contém uma ou mais substituições, deleções, inserções, e / ou adições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, e possuindo a função inerente dos mesmos; e [3-1] uma proteína possuindo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, e possuindo a função a elas inerentes. O presente inventor descobriu que, quando o CPT é qualquer uma das proteínas acima, ele interage com NgBr. Neste caso, a atividade da CPT é esperado para ser ainda mais estabilizada e melhorada.

(Sequência de aminoácidos do receptor Nogo-B (NgBr))

[0040] A proteína [4] que se segue é um exemplo específico da NgBr: (4] uma proteína possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 .

[0041] Tal como descrito acima, sabe-se que as proteínas possuindo uma ou mais substituições, deleções, inserções ou adições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos original pode ter a função inerente. Assim, um outro exemplo específico de NgBr é a seguinte proteína [5]: (5] uma proteína possuindo uma sequência de aminoácidos que contém uma ou mais substituições, deleções, inserções e / ou adições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, e possuindo a função a elas inerentes.

[0041] A função intrínseca da proteína da SEQ ID NO: 6 se refere aqui à função inerente NgBr, isto é, as funções de ligação a uma membrana por meio de um ou mais dominios transmembranares no lado N-terminal da proteína, e interagindo com uma outra proteina do lado C-terminal dos mesmos. Como uma função do receptor Nogo-B em neurônios, NgBr é conhecido por interagir com uma proteína inibidora da mielina (por exemplo, Nogo-A) ou semelhante, sendo assim envolvido na sinalização que conduz ao colapso de crescimento de cone neuronal e a inibição do crescimento de neurites. Aqui, no entanto, a interação envolvida na sinalização acima não está incluída na função inerente da proteína da SEQ ID NO: 6 .

[0042] A fim de manter a função inerente, isto é, a função de NgBr, a sequência de aminoácidos contém, preferencialmente, uma ou mais, mais preferivelmente, de 1 a 52, ainda mais preferencialmente, 1 a 39, ainda mais preferencialmente, 1 a 26, particularmente de preferência 1 a 13, mais preferivelmente, 1 a 6, ainda mais preferencialmente 1 a 3 substituições, deleções, inserções e/ou adições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID nO: 6 .

[0043] De modo semelhante ao acima, entre outras substituições de aminoácidos, substituições conservativas as são preferidas. Exemplos específicos incluem substituições dentro de cada um dos seguintes grupos entre parênteses: (glicina, alanina), (valina, isoleucina, leucina), (ácido aspártico, ácido glutâmico), (asparagina, glutamina), (serina, treonina), (lisina , arginina), (fenilalanina, tirosina) e semelhantes.

[0044] Tal como descrito acima, sabe-se também que as proteínas com sequências de aminoácidos possuindo elevada identidade de sequência com a sequência de aminoácidos original também podem ter uma função semelhante. Assim, um outro exemplo específico de NgBr é a seguinte proteína [6]: (6] uma proteína possuindo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, e possuindo a função a elas inerentes.

[0045] A fim de manter a função inerente, isto é, a função de NqBr, a identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 é, de preferência, pelo menos 85%, mais preferencialmente, pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 95%, um modo particularmente preferido, pelo menos 98%, mais preferencialmente, pelo menos 99%.

[0046] Como se trata de uma proteina que possui uma estrutura de NqBr, esta pode ser determinada por técnicas convencionais, tais como, por expressão de uma proteína alvo em um transformante preparado através da introdução de um gene que codifica para a proteína alvo dentro de Escherichia coli ou outros organismos hospedeiros, a compressão do transformante seguido pela separação em frações por centrifugação, e depois observando a forte expressão na fração de membrana por análise de western blot utilizando um anticorpo comercial receptor anti-Nogo (por exemplo, Millipore, GeneTex).

(DNA que codifica para a cis-preniltransferase (CPT))

[0047] O DNA que codifica para um CPT pode ser qualquer um dos seguintes DNAs: (7] um DNA possuindo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 1 ou 3; e (8] um DNA capaz de hibridizar com um DNA possuindo uma sequência de nucleotideos complementar à sequência de nucleotideos das SEQ ID NO: 1 ou 3 sob condições rigorosas, e que codifica para uma proteina com a função a elas inerentes. A função intrínseca da proteína codificada pelo DNA tendo a sequência de nucleotideos das SEQ ID NO: 1 ou 3 aqui é a mesma que a função inerente da proteína das SEQ ID NO: 2 ou 4.

[0048] Tal como aqui utilizado, o termo "hibridização" significa um processo no qual um DNA que hibridiza com um DNA possuindo uma sequência de nucleotideos específica ou uma parte do DNA. Consequentemente, o DNA que possui uma sequência de nucleotideos específica ou parte do DNA pode ter uma sequência de nucleotideos de comprimento suficiente para ser utilizável como sonda em análise por Northern blot ou Southern blot, ou como um primer oligonucleotídeo na análise de reação em cadeia da polimerase (PCR). O DNA utilizado como uma sonda pode ter um comprimento de pelo menos 100 bases, de preferência, pelo menos de 200 bases, mais preferencialmente, pelo menos de 500 bases, embora possa ser um DNA de pelo menos 10 bases, de preferência, de pelo menos 15 bases de comprimento.

[0049] Técnicas para realizar experimentos de hibridização de DNA são bem conhecidas. As condições de hibridização em que os experimentos são realizadas podem ser determinadas de acordo com, por exemplo, Molecular Cloning, 2nd ed. e 3rd ed. (2001), Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press (1994), Immunology methods manual, Academic press (Molecular), e muitos outros livros textos padrões.

[0050] As condições rigorosas podem incluir, por exemplo, uma incubação durante a noite a 42 ° C de um filtro de DNA-imobilizado e uma sonda de DNA em uma solução que contenha 50% de formamida, 5 x SSC (cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5 x solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, e 20 mg / L de DNA de esperma de salmão desnaturado, seguido de lavagem do filtro, por exemplo, em uma solução de 0,2 X de SSC a aproximadamente 65° C. Condições menos rigorosas podem também ser utilizadas. As alterações no rigor pode ser conseguida através da manipulação da concentração de formamida (menores percentagens de formamida resulta em baixa estringência), concentrações salinas ou temperatura. Por exemplo, baixas condições rigorosas incluem incubação durante a noite a 37 ° C em uma solução contendo 6 x SSCE (20 x SSCE: 3 mol / 1 de cloreto de sódio, 0,2 mol / L de di- hidrogenofosfato de sódio, 0,02 mol / 1 de EDTA, pH 7,4), 0,5% de SDS, 30% de formamida, e 100 μg / L de DNA de esperma de salmão desnaturado, seguido de lavagem em uma solução de 1 X de SSC contendo SDS a 0,1% a 50° C. Além disso, para conseguir ainda mais baixa estringência, lavagens realizadas após a hibridização pode ser realizada a concentrações de sal mais elevadas (por exemplo, 5 x SSC) nas baxixas condições rigorosas acima mencionadas.

[0051] Variações nas várias condições acima pode ser conseguida através da inclusão ou substituição dos reagentes de bloqueio usados para suprimir a prática em experimentos de hibridização. A inclusão de reagentes de bloqueio pode exigir a modificação das condições de hibridização para a compatibilidade.

[0052] O DNA capaz de hibridizar sob condições rigorosas, tal como descrito acima pode ter uma sequência de nucleotideos que tem pelo menos 80%, de preferência, pelo menos 90%, mais preferencialmente, pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 98%, de modo particularmente preferido, pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de nucleotideos das SEQ ID nO: 1 ou 3 como calculado utilizando um programa, tal como BLAST ou FASTA com os parâmetros mencionados acima.

[0053] Se o DNA capaz de hibridizar com o DNA acima mencionada sob os códigos de condições rigorosas para uma proteína com uma atividade enzimática pré-determinada, este pode ser determinado por técnicas convencionais, tais como por expressão de uma proteina alvo em um transf ormante preparado através da introdução de um gene que codifica para a proteina alvo em Escherichia coli ou outros organismos hospedeiros, e se determinar a presença ou ausência da função da proteína alvo com o método de medição de atividade correspondente.

[0054] O DNA que codifica para um CPT é, de preferência, um dos seguintes DNAs: [1-1] um DNA possuindo a sequência nucleotídica das SEQ ID NO: 1; e [2-1] um DNA capaz de hibridizar com um DNA possuindo uma sequência de nucleotideos complementar à sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 1 sob condições rigorosas, e que codifica para uma proteína com a função a elas inerentes. O presente inventor descobriu que, quando o DNA que codifica para um CPT é um dos DNAs com sequências acima, o CPT expressado interage com NgBr. Neste caso, a atividade da CPT é esperado para ser ainda mais estabilizada e melhorada.

(DNA que codifica para o receptor Nogo-B (NgBr))

[0055] O DNA que codifica para um NgBr pode ser qualquer um dos seguintes DNAs: (9] um DNA possuindo a sequência nucleotidica da SEQ ID NO: 5; e (10] um DNA capaz de hibridizar com um DNA possuindo uma sequência de nucleotideos complementar à sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 5 em condições rigorosas, e que codifica para uma proteina com a função a elas inerentes. Nisto, a função inerente da proteina codificada pelo DNA tendo a sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 5 é a mesma que a função inerente da proteina da SEQ ID NO: 6.

[0056] O termo "hibridização" aqui é como descrito acima. Além disso, as condições rigorosas são como descritos acima.

[0057] O DNA capaz de hibridizar sob condições rigorosas, tal como descrito acima pode ter uma sequência de nucleotideos que tem pelo menos 80%, de preferência, pelo menos 90%, mais preferencialmente, pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 98%, de modo particularmente preferido, pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 5, como calculado utilizando um programa tal como BLAST ou FASTA com os parâmetros mencionados acima.

[0058] O DNA capaz de hibridizar com o DNA acima mencionada sob os códigos de condições rigorosas para uma proteina possuindo uma estrutura pré-determinada pode ser determinado por técnicas convencionais, tais como, por expressão de uma proteina alvo em um transformante preparado através da introdução de um gene que codifica para a proteína alvo em Escherichia coli ou outros organismos hospedeiros, comprimindo o transformante seguido de separação em frações por centrifugação, e, em seguida, observando a forte expressão na fração de membrana por análise de western blot utilizando um anticorpo comercial receptor anti-Nogo (por exemplo, Millipore, GeneTex).

[0059] As técnicas convencionais podem ser empregadas para identificar a sequência de aminoácidos ou a sequência de nucleotídeos das proteínas. Por exemplo, o RNA total é extraído de uma planta que cresce, o RNAm é opcionalmente purificado, e um DNAc é sintetizado por uma reação de transcrição reversa. Subsequentemente, os primeres degenerados foram concebidos com base na sequência de aminoácidos de uma proteína conhecida correspondente à proteína-alvo, um fragmento de DNA é parcialmente amplificado por RT-PCR, e a sequência é parcialmente identificada. Em seguida, o método de RACE ou semelhante, é efetuado para identificar a sequência de nucleotídeos de comprimento completo ou sequência de aminoácidos. O método de RACE (método de amplificação rápida de extremidades de DNAc) se refere a um método no qual, quando a sequência de nucleotideos de um cDNA é parcialmente conhecida, a PCR é realizada com base na informação da sequência de nucleotideos de uma região deste tipo conhecida para clonar uma região desconhecida que se estende para o terminal de DNAc, e é capaz de clonar o DNAc de comprimento completo por PCR sem a preparação de uma biblioteca de DNAc.

[0060] Os primeres degenerados podem ser cada um de um modo preferido preparados a partir de uma sequência derivada de plantas tendo uma parte de sequência muito semelhante à proteina alvo.

[0061] Se a sequência de nucleotideos que codifica para a proteina é conhecida, é possivel identificar a sequência de nucleotideos de comprimento completo ou de aminoácidos através da concepção de um primer que possua um códon de iniciação e um primer que possua um códon de terminação utilizando a sequência de nucleotideos conhecida, seguido por realização de RT-PCR utilizando um DNAc sintetizado como um modelo.

(Transformante)

[0062] O gene que codifica para um CPT e o gene que codifica para um NgBr são introduzidos num hospedeiro para produzir um organismo (transformante) que foi transformado para expressar o CPT e o NgBr. Uma vez que a CPT e NgBr são co-expressos no transformante, a atividade da CPT é esperado para ser estabilizada e melhorada. Por conseguinte, espera-se que no transformante, a quantidade dos produtos biossintetizados através das reações catalisadas pela CPT e, por conseguinte, a produção de poli-isoprenóide seja melhorado, vantajosamente, resultando em um aumento do rendimento de poli-isoprenóide.

[0063] O seguinte brevemente descreve o modo para preparar o organismo (transformante) transformado para expressar o CPT e NgBr. Tal transformante pode ser preparado por métodos conhecidos convencionalmente.

[0064] Especificamente, por exemplo, o transformante pode ser preparado como se segue: Um DNA contendo a sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 1 ou 3, e um DNA que contém a sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 5 são inseridos a jusante do promotor de um vetor de expressão adequado com as enzimas de restrição adequadas e semelhantes para preparar um DNA recombinante. Este DNA recombinante pode então ser introduzido nas células hospedeiras que são compatíveis com o vetor de expressão para a obtenção de células transformadas. Alternativamente, um vetor de expressão no qual um DNA que contém a sequência de nucleotideos das SEQ ID NO: 1 ou 3, é inserido a jusante do promotor com as enzimas de restrição adequadas e semelhantes, e um vetor de expressão no qual um DNA que contém a sequência de nucleotideos da SEQ ID nO: 5 é inserido a jusante do promotor com as enzimas de restrição adequadas e outros semelhantes são utilizados para preparar os DNA recombinantes, e estes DNAs recombinantes podem então ser introduzidos em células hospedeiras que são compatíveis com os vetores de expressão para a obtenção de células transformadas.

[0065] Qualquer hospedeiro (células hospedeiras) capaz de expressar os genes de interesse pode ser utilizado, tais como microrganismos, leveduras, células animais, células de insetos, células de plantas e outros organismos, de preferência, eucariotas. Uma vez que a melhoria da produtividade de poli-isoprenóide e um maior rendimento de poli-isoprenóide pode ser esperado, especialmente, quando o CPT e NgBR são expressos em organismos capazes da biossíntese de poli-isoprenóide, o hospedeiro é, de preferência, uma planta, mais preferivelmente, uma planta de produção de isoprenóides, entre outros, e as células hospedeiras são, de preferência, células de plantas, mais preferencialmente, células de uma planta de produção de isoprenóides. Assim, em uma outra concretização apropriada da presente invenção, o hospedeiro é uma planta de produção de isoprenóides.

[0066] A planta produtora de isoprenóides não é particularmente limitada, desde que seja capaz de produzir um isoprenóide. Exemplos incluem plantas do gênero Hevea, tal como, Hevea brasiliensis; plantas do gênero Sonchus, tal como Sonchus oleraceus, Sonchus asper, e Sonchus brachyotus; plantas do gênero Solidago, tal como Solidago altissima, Solidago virgaurea subsp. asiatica, Solidago virgaurea subsp. leipcarpa, Solidago virgaurea subsp. leipcarpa f. paludosa, Solidago virgaurea subsp. gigantea, e Solidago gigantea Ait. var. leiophylla Fernald; plantas do gênero Helianthus, tal como Helianthus annuus, Helianthus argophyllus, Helianthus atrorubens, Helianthus debilis, Helianthus decapetalus, e Helianthus giganteus; plantas do gênero Taraxacum, tal como dandelion (Taraxacum), Taraxacum venustum H. Koidz, Taraxacum hondoense Nakai, Taraxacum platycarpum Dahlst, Taraxacum japonicum, Taraxacum officinale Weber, e Taraxacum kok- saghyz; plantas do gênero Ficus, tal como Ficus carica, Ficus elastica, Ficus pumila L., Ficus erecta Thumb., Ficus ampelas Burm. f., Ficus benguetensis Merr., Ficus irisana Elm., Ficus microcarpa L.f., Ficus septica Burm. f., e Ficus benghalensis; plantas do gênero Parthenium, tai como Parthenium argentatum, Parthenium hysterophorus, e Ambrosia artemisiifolia (Parthenium hysterophorus); lettuce (Lactuca sativa) (Lactuca serriola), e Ficus benghalensis. A planta produtora de isoprenóide é, de preferência, pelo menos, uma selecionada a partir do grupo que consiste em plantas dos gêneros Hevea, Sonchus, Taraxacum e Parhenium, mais preferencialmente, pelo menos, uma selecionada a partir do grupo que consiste de Hevea brasiliensis, Sonchus oleraceus, Parthenium argentatum e Taraxacum kok-saghyz, entre outros.

[0067] O vetor de expressão pode ser um vetor que é capaz de replicação autônoma em células hospedeiras ou de ser incorporado no cromossoma da mesma, e contém um promotor em uma posição que permita a transcrição do DNA recombinante.

[0068] No caso em que as células vegetais são usadas como células hospedeiras, um vetor pBI, um vetor pUC, um vetor plasmideo Ti ou um vetor do virus do mosaico do tabaco, por exemplo, pode ser usado como um vetor de expressão. Qualquer promotor que funciona em células vegetais pode ser usado. Exemplos incluem o promotor 35S do virus do mosaico da couve-flor (CaMV), promotor de atina-1 de arroz, promotor do gene da nopalina sintetase, o promotor 35S do virus do mosaico do tabaco e promotor do gene da actina do arroz.

[0069] Os preferidos são os vetores de expressão com os promotores que são especificamente expressos em tecidos, em que os compostos de isoprenóides são biossintetizados, tais como Laticiferos. O retardamento do crescimento da planta e outros efeitos adversos podem ser reduzidos, através da expressão especificamente em um tecido no qual um isoprenóide é biossintetizado.

[0070] O vetor recombinante pode ser introduzido através de qualquer método que permita que o DNA seja introduzido nas células hospedeiras. Exemplos incluem métodos usando Agrobacterium (JP S59-140885 A, JP S60-70080 A, WO94 / 00977), eletroporação (JP S60-251887 A), e métodos que utilizam partículas de armas (armas de genes) (JP 2606856 B, JP 2517813 B).

[0071] O transformante (células de plantas transgênicas) pode ser preparado pelos métodos acima ou outros.

[0072] A presente invenção também proporciona uma planta de produção de isoprenóides, em que foi introduzido um gene que codifica para um CPT e um gene que codifica para um NgBr. A planta produtora de isoprenóide não está particularmente limitada, contanto que seja uma planta produtora de isoprenóide que contém as células de plantas transgênicas. A planta produtora de isoprenóide conceitualmente inclui não apenas as células de plantas transgênicas preparadas pelos métodos descritos acima, mas também, por exemplo, toda a sua descendência ou seus clones e as plantas da progénie obtida mesmo por passagem destas células. Uma vez que as células de plantas transgênicas em que foi introduzido o DNA ou vetor no genoma são obtidos, descendência ou clones podem ser obtidos a partir das células de plantas transgênicas por reprodução sexuada ou assexuada, cultura de tecido, cultura de células, fusão de células ou outras técnicas. Além disso, as células vegetais transgênicas, ou da sua descendência ou clones podem ser usados para obter materiais de reprodução (por exemplo, sementes, frutos, estacas, tubérculos do caule, tubérculos, raízes, rebentos, botões adventícios, embriões adventícios, calos, protoplastos) , o qual pode então ser usado para produzir a planta produtora de isoprenóide em grande escala.

[0073] Técnicas para regenerar plantas a partir de células de plantas transgênicas são já conhecidas; por exemplo, Doi et al., descrevem técnicas para eucalyptus (JP Hll-127025 A), Fujimura et al. descrevem técnicas para arroz (Fujimura et al., (1995), Plant Tissue Culture Lett., vol. 2: p. 74-), Shillito et al. descrevem técnicas para milho (Shillito et al., (1989), Bio/Technology, vol. 7: p. 581-), Visser et al. descrevem técnicas para batata (Visser et al., (1989), Theor. Appl. Genet., vol. 78: p. 589-), e Akama et al. descrevem técnicas para Arabidopsis thaliana (Akama et al., (1992), Plant Cell Rep., vol. 12: p. 7-). Os técnicos versado no assunto podem regenerar plantas a partir das células de plantas transgênicas, de acordo com estes documentos.

[0074] Se um gene de proteína alvo é expresso em uma planta regenerada, este pode ser determinado por métodos bem conhecidos. Por exemplo, a análise de Western blot pode ser utilizado para avaliar a expressão de uma proteina alvo.

[0075] As sementes podem ser obtidas a partir da planta transgênica, por exemplo, como se segue: a planta transgênica está enraizada num meio apropriado, transplantada para o solo contendo água em um recipiente, e cultivada sob condições de cultura adequadas, a fim de finalmente produzir sementes, que são então colhidas. Além disso, as plantas podem ser cultivadas a partir de sementes, por exemplo, como se segue: sementes obtidas a partir da planta transgênica, tal como descrito acima são semeadas em solo contendo água, e cultivadas sob condições de cultura adequadas para plantas.

[0076] De acordo com a presente invenção, espera-se que a planta produtora de isoprenóide, em que foi introduzido um gene que codifica para um CPT e um gene que codifica para um NgBr possa ser utilizada na produção de poli-isoprenóide para melhorar a produtividade de poli-isoprenóide. Especificamente, a produção de poli-isoprenóide pode ser realizada por cultura de células vegetais transgênicas preparadas como descrito acima, calos obtidos a partir de tais células de plantas transgênicas, células re- diferenciadas a partir de tais calos, ou semelhantes, num meio apropriado, ou por cultivo de plantas transgênicas regeneradas a partir das células da planta transgênica, as plantas cultivadas a partir de sementes coletadas de tais plantas transgênicas, ou semelhantes, sob condições de cultivo adequadas. O transformante da presente invenção, espera-se ter estabilizado e atividade melhorada de CPT devido às proteinas nele introduzido. Por conseguinte, espera-se que a quantidade dos produtos biossintetizados através das reações catalisadas pela CPT e, por conseguinte, a produção de poli-isoprenóide seja aumentada, resultando no aumento de rendimento de poli-isoprenóide.

[0077] O termo "poli-isoprenóide", tal como aqui usado é um termo genérico utilizado para referir-se a polímeros possuindo unidades de isopreno (CsHs) . Exemplos de poli-isoprenóides incluem polímeros, tais como monoterpenos (Cio) , sesquiterpenos (C15) , diterpenos (C20) , Sesterterpenos (C25) , triterpenos (C30) , tetraterpenos (C40) e borracha natural. O termo "isoprenóide", tal como aqui utilizado se refere a um composto que tem unidades de isopreno (C5H8) , e conceitualmente inclui poli-isoprenóides.

[0078] Como descrito acima, uma vez que a CPT e NgBr são co-expressos na presente invenção, a atividade da CPT é esperada para ser estabilizada e melhorada. Por conseguinte, espera-se que a quantidade dos produtos biossintetizados através das reações catalisadas pela CPT e, por conseguinte, a produção de poli-isoprenóide seja melhorada no transformants, resultando em um aumento do rendimento de poli-isoprenóide. Assim, um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para a produção de um poli- isoprenóide usando um transformante produzido através da introdução de um gene que codifica para um CPT e um gene que codifica para um NgBr num hospedeiro, para permitir que o hospedeiro expresse a CPT e o NgBr.

[0079] Métodos possiveis para aumentar o rendimento de poli-isoprenóide na presença de ambos CPT e NgBr incluem, em adição ao método de utilização de um transformante modificado para expressar tanto da CPT e NgBr in vivo como descrito acima, um método que envolve a presença de ambos CPT e NgBr in vitro, por exemplo, por extração de enzimas brutas a partir de células, purificando o CPT e NgBr, e permitindo- lhes estar presentes em conjunto num tubo de ensaio.

[0080] No método envolvendo a presença de ambos CPT e NgBr in vitro, a CPT e NgBr podem ser produzidos, por exemplo, através da inserção de um gene que codifica a CPT e / ou um gene que codifica para a NgBr num vetor apropriado, e utilizando Escherichia coli, leveduras, plantas transformada, ou sistemas de expressão de proteina sem células, ou outros meios.

[0081] A origem da CPT utilizada no método que envolve a presença de ambos CPT e NgBr in vitro não é particularmente limitada, e o CPT é, de preferência, derivada de um eucariota, mais preferencialmente, uma planta, ainda mais preferivelmente, uma planta de produção de isoprenóides. A CPT pode também ser modificada por qualquer método, tal como por adição de um qrupo de modificação para a enzima (por exemplo, fosforilação, metilação, acetilação, palmitoilação, miristoilação, farnesilação, cadeia de adição de açúcar, ou ubiquitinação), ou por oxidação / redução do qrupo dissulfeto ou por modificação estrutural com protease.

[0082] A origem do NgBr utilizados no método envolvendo a presença de ambos CPT e NgBr in vitro não é particularmente limitada, e o NgBr é, de preferência, derivado de um eucariota, mais preferencialmente, uma planta, ainda mais preferivelmente uma planta de produção de isoprenóides. O NgBr também pode ser modificado por qualquer método, tal como por adição de um grupo de modificação para a enzima (por exemplo, fosforilação, metilação, acetilação, palmitoilação, miristoilação, farnesilação, cadeia de adição de açúcar, ou ubiquitinação), ou por oxidação / redução do grupo dissulfeto ou por modificação estrutural com protease.

[0083] Como descrito acima, o presente inventor descobriu que a CPT codificada pelo DNA tendo a sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 1 ou a DNA capaz de hibridizar com um DNA possuindo uma sequência de nucleotideos complementar à sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 1 sob condições rigorosas, e que codifica para uma proteina com a função inerente dos mesmos, interage com NgBr. Além disso para o CPT, NgBr também é considerado a interagir com uma terceira proteina. Exemplos do modo de tal interação incluem os dois seguintes modos:(11] A CPT interage com a terceira proteina através de NgBr, ou em outras palavras, NgBr, CPT, e a terceira proteina interagem simultaneamente com o outro.(12] A interação entre NgBr e o CPT e a interacção entre NgBr e a terceira proteina ocorre individualmente. Exemplos não limitativos da terceira proteina incluem o fator de alongamento da borracha (REF), proteina de pequena partícula de borracha (CPSR) e difosfato farnesil sintase (FPP).

[0084] No método envolvendo a presença de ambos CPT e NgBr in vitro, em adição ao CPT e NgBr, outra enzima pode ainda ser adicionada de modo a estar presentes em conjunto. Exemplos da enzima incluem as enzimas que se sabe estar presente no látex, tal como o fator de alongamento da borracha (REF), proteina de pequena partícula de borracha (CPSR), proteína de pequena ligação ao GTP, heveína, β-1,3- glucanase, proteínas difosfato de farnesilo sintase (FPP) e inibidores da protease. Entre estas, enzimas de interação com NgBr, tais como REF, são especialmente preferidas.

[0085] No método envolvendo a presença de ambos CPT e NgBr in vitro, componentes adicionais que podem ser adicionados, de modo a estar presentes em conjunto, para além do CPT e NgBr não se limitam a enzimas e podem incluir membranas que servem para incorporar produtos de reação. O tipo de membrana não é particularmente limitado, e pode ser uma membrana natural, tal como uma membrana celular ou pequenas partículas de borracha ou uma membrana artificial, tal como lipossomas.

[0086] O lipideo formador da membrana pode ser um lipideo que pode formar uma membrana de bicamada lipidica, e como exemplos se refere a gliceroglicolipfdeos, esfingoglicolipideos, colesterol e fosfolipideos conhecidos.

[0087] Exemplos dos gliceroglicolipideos incluem sulfoxiribosilglicideos, diglicosildiglicideos, digalactosildiglicideos, galactosildiglicideos, e glicosildiglicideos. Exemplos dos esfingoglicolipideos incluem galactosilcerebrosideos, lactosylcerebrosideos, e gangliosideos.

[0088] Exemplos de fosfolipideos incluem fosfolipideos naturais ou sintéticos, tais como fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, ácidos fosfatidicos, fosfatidilserinas, fosfatidilinositóis, fosfatidilgliceróis, lisofosfatidilcolinas, esfingomielinas, lecitina de gema de ovo, lecitina de soja e fosfolipfdeos hidrogenados.

[0089] Exemplos dos fosfatidilcolinas incluem fosfatidilcolina de soja, fosfatidilcolina da gema de ovo, dilauroilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, e diestearoilfosfatidilcolina. Exemplos de fosfatidiletanolaminas incluem dioleoilfosfatidiletanolamina, dilauroilfosfatidiletanolamina, dimiristoilfosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidiletanolamina e distearoilfosfatidiletanolamina. Exemplos de fosfatidilserinas incluem dilauroilfosfatidilserina, dimyristoilfosfatidilserina, dipalmitoilfosfatidilserina, e distearoilfosfatidilserina. Exemplos de fosfatidilgliceróis incluem dilauroilfosfatidiIglicerol, dimiristoilfosfatidiIglicerol, dipalmitoilfosfatidilglicerol e distearoilfosfatidilglicerol. Exemplos de fosfatidilinositóis incluem dilauroilfosfatidi1inositol, dimiristoilfosfatidi1inositol, dipalmitoilfosfatidilinositol, e distearoilfosfatidilinositol.

EXEMPLOS

[0090] A presente invenção é explicada especificamente com referência aos exemplos, mas a presente invenção não está limitada a estes exemplos.

[Clonagem] (Identificação da sequência de aminoácidos e sequência de nucleotideos da proteína alvo)

[0090] O RNA total foi extraído a partir do látex de Hevea brasiliensis pelo método de fenol quente. A 6 mL de látex foram adicionados 6 mL de tampão de acetato de sódio 100 mM e 1 mL de uma solução de SDS a 10%, e, em seguida, 12 ml de fenol saturado com água pré-aquecida a 65°C. A mistura foi incubada durante 5 minutos a 65°C, agitada utilizando um misturador de vórtice e centrifugada durante 10 minutos à temperatura ambiente a 7000 rpm. Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo, 12 mL de um fenol:clorofórmio (1:1) foi adicionado, e a mistura foi agitada por agitação durante 2 minutos. Após a agitação, a mistura resultante foi novamente centrifugada durante 10 minutos à temperatura ambiente a 7000 rpm, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo, 12 mL de uma mistura de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) foi adicionado a solução, e a mistura foi agitada por agitação durante 2 minutos. Após a agitação, a mistura resultante foi novamente centrifugada durante 10 minutos à temperatura ambiente a 7000 rpm, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo, 1,2 mL de uma solução de acetato de sódio 3M e foram adicionados 13 mL de isopropanol, e a mistura foi agitada utilizando um misturador de vórtice. A mistura resultante foi incubada durante 30 minutos a -20°C para precipitar o RNA total. A mistura incubada foi centrifugada durante 10 minutos a 15000 rpm a 4°C, e o sobrenadante foi removido para coletar um precipitado de RNA total. 0 RNA total coletado foi lavado duas vezes com etanol a 70%, e, em seguida, dissolvido em água isenta de RNase.

[0091] O DNAc foi sintetizado a partir do ARN total coletado. A sintese de cDNA foi realizada usando um kit de sintese de cDNA de primeira fita PrimeScript II (Takara), de acordo com o manual.

[0092] Os genes CPT e NgBr foram obtidos utilizando o primeiro filamento de cDNA preparado como um modelo. A PCR foi realizada utilizando um KOD-plus-Neo (Toyobo Co., Ltd.), de acordo com o manual. A reação de PCR envolveu 35 ciclos com cada ciclo consistindo de 10 segundos a 98°C, 30 segundos a 58°C, e 1 minuto a 68°C.

[0093] O gene da CPT foi obtido utilizando os seguintes primeres: Primer 1: 5'-tttggccattacggccatggaattatacaacggtgagagg-3', Primer 2: 5'-tttggccgaggcggccttattttaagtattccttatgtttc-3'.

[0094] O gene NgBr foi obtido usando os seguintes primeres: Primer 3: 5'-tttggccattacggccatggatttgaaacctggag-3’, Primer 4: 5'-tttggccgaggcggcctcatgtaccataattttgctgcac-3'.

[0095] Dois tipos de genes de CPT (HRT1 e HRT2) e um tipo de gene de NgBr (NgBr) foram obtidos como descrito acima. Os três tipos de genes foram sequenciados para identificar a sequência de nucleotideos de comprimento completo e a sequência de aminoácidos. A sequência de nucleotideos HRT1 é dada pela SEQ ID NO: 1, a sequência de nucleotideos de HRT2 é dada pela SEQ ID NO: 3, e a sequência de nucleotideos de NgBr é dada pela SEQ ID NO: 5. A sequência de aminoácidos de HRT1 é dada pela SEQ ID NO: 2, a sequência de aminoácidos de HRT2 é dada pela SEQ ID NO: 4, e a sequência de aminoácidos de NgBr é dada pela SEQ ID NO: 6. (Construção do Vetor)

[0096] Os três tipos de fragmentos de DNA amplificados resultantes foram sunmetidos a adição dA e, em seguida, inseridos em vetores pGEM-T Easy, utilizando um Sistema de Vetor Easy pGEM-T (Promega) para preparar pGEM- HRT1, pGEM-HRT2, e pGEM-NgBr.

(Transformação de E. coll)

[0097] Escherichia coli DH5α foi transformada com os vetores preparados, o transformante foi cultivado em meio de agar LB contendo ampicilina e X-gal, e as células de E. coli que transportam os genes alvo introduzidas foram selecionadas por seleção azul / branco.

[0098] As células de E. coli transformadas com os plasmideos com os genes-alvo foram cultivadas durante a noite a 37°C em meio liquido LB. Após a cultura, as células foram coletadas, e os plasmideos foram recolhidos. Um kit mini FastGene plasmideo (Nippon Genética Co., Ltd.) foi utilizado para a coleta de plasmideo. Foi confirmado por análise da sequência que não houve mutações nas sequências de nucleotideos dos genes inseridos nos plasmideos coletados. [Preparação de levedura transformada para expressar gene que codifica para a CPT e gene que codifica para NgBr]

[0099] Os genes HRT1, HRT2 e NgBr a serem inseridos em vetores de expressão de levedura foram obtidos por PCR utilizando os vetores preparados na "Construção do Vetor" acima como moldes.

[0100] Os genes HRT1 e HRT2 foram obtidos utilizando os seguintes primeres:Primer 5: 5'-gacgcccgggaggccatgaa-3’,Primer 6: 5'-cagcttcctcccgggctttg-3’.

[0101] O gene NgBr foi obtido usando os seguintes primeres: Primer 7: 5 '-tttctcgagatggatttgaaacctggagctg-3’, Primer 8: 5'-tttctcgagtgtaccataattttgctgcac-3’.

[0102] Os fragmentos de DNA obtidos foram submetidos a adição dA e, em seguida, inseridos em vetores pGEM-T Easy, utilizando um Sistema de Vetor Easy pGEM-T (Promega) para preparar pGEM-HRTl YE, pGEM-HRT2 YE e pGEM-NgBr YE.

[0103] Transformação de E. coli, coleção de plasmideos, e confirmação da sequência de nucleotideos foram realizados como descrito em "Transformação de E. coli" acima, mas utilizando os vetores preparados. O pGEM-HRTl YE e pGEM- HRT2 YE, que foram confirmados como não tendo mutações na sequência de nucleotideos, foram tratados com a enzima de restrição Smal e inseridos no pGK426 tratados de modo semelhante com Smal, para preparar PGK-HRT1 e PGK-HRT2. Da mesma forma, o pGEM-NgBr YE, o que foi confirmado ter mutações na sequência de nucleotideos, foi tratado com a enzima de restrição Xbal e inserido no pGK425 tratado de modo semelhante com Xbal, para preparar PGK-NgBr.

[0104] A cepa de levedura SNH23-7D foi transformada com os plasmideos preparados. O método PEG foi utilizado para a dupla transformação da levedura. As células transformantes foram cultivadas a 23 0 C durante três dias em meio SD deficiente de Leu- e Ura- para a seleção. Os pares utilizados na preparação de transformantes duplos de levedura são como se segue: (13] SNH23-7D/pGK426, pGK425 (sem nenhum gene introduzido) (14] SNH23-7D/pGK-HRTl, pGK425 (HRT1 sozinho expressando a cepa) (15] SNH23-7D/pGK-HRT2, pGK425 (HRT2 sozinho expressando a cepa) (16] SNH23-7D/pGK-HRTl, pGK-NgBr (HRTl/NgBr co- expressando a cepa) (17] SNH23-7D/pGK-HRT2, pGK-NgBr (HRT2/NgBr co-expressing strain)

[0105] Nenhum SNH23-7D/pGK426, pGK-NgBr transformante (NgBr sozinho expressando a cepa) foi obtido.

[Seleção de Levedura duplo-híbrida]

[0106] Os genes alvo inseridos nos plasmideos recolhidos na "Clonagem" acima foram clivados por tratamento com a enzima de restrição Sfil, a fim de inserir os genes alvo de levedura em plasmideos para a seleção de dois híbridos.

(Construção do Vetor)

[0107] Os genes clivados foram inseridos em plasmídios de levedura de dois híbridos por alta ligação ver.2 (Toyobo). 0 plasmídeo de levedura de dois híbridos utilizado foi o vetor de levedura pBT3-SUC bait, e o plasmídeo de levedura de dois híbridos utilizado foi o vetor pPR3-N bait. HRT1 ou HRT2 foram inseridos no vetor (PPR-HRT1, PPR-HRT2) e HRT1, HRT2 ou NgBr foi inserido no vetor (PBT- HRT1, PBT-HRT2, PBT-NgBr).

(Transformação de E. coli)

[0108] Escherichia coli DH5a foi transformada com os vetores de levedura de dois híbridos preparados como acima. As células transformantes foram cultivadas em meio de agar LB contendo ampicilina, e células de E. coli que transportam os genes alvos introduzidos foram selecionadas.

[0109] As células de E. coli transformadas com os plasmídeos com os genes-alvo foram cultivadas durante a noite a 37°C em meio líquido LB. Após a cultura, as células foram coletadas, e os plasmídeos foram coletados. O kit mini FastGene plasmídeo (Nippon Genética Co., Ltd.) foi utilizado para a coleta de plasmídeo.

(Dupla Transformação de levedura)

[0110] A cepa de levedura NMy-51 foi transformada com os plasmídeos coletados. O método PEG foi utilizado para a dupla transformação da levedura. As células transformantes foram cultivadas a 30 0 C durante três dias em meio SD deficiente de Trp- e Leu- para a seleção. A Tabela 1 mostra os pares utilizados na preparação de duplos transformantes de levedura.Tabela 1

[0111] Foram observados os transformantes duplos da levedura para as interações entre as enzimas através de seleção de dois hibridos de levedura por cultura em meio SD deficiente em Trp-, Leu-, His e Ade- por três dias a 30 ° C. Neste experimento, a levedura pode crescer em meio seletivo apenas quando a proteina codificada pelo gene introduzido no plasmideo bait interage com uma proteina codificada pelo gene introduzido no plasmideo bait.

[0112] Os resultados das análises de seleção de dois- hibridos de levedura são mostrados na Fig. 1. A Fig. 1 (a) mostra os resultados demonstrando se ou não HRT1 interagiu com HRT2 ou NgBr. A FIG. 1 (b) mostra os resultados demonstrando se ou não HRT2 interagiu com HRT1 ou NgBr. Na Fig. 1 (a), as seções no sentido horário a partir da parte superior direita correspondem aos resultados dos pares Nos. 1, 4, 5, 6, e 3, respectivamente, na Tabela 1. Na Fig. 1 (b), as seções no sentido horário a partir da parte superior direita correspondem aos resultados dos pares Nos. 1, 7, 8, 9, e 2, respectivamente, na Tabela 1.

[0113] Como mostrado na Fig. 1, apenas os resultados do par N° 5 na Tabela 1, isto é, o par de HRT1 e NgBr, na Fig. 1 (a) exibiu interação. Isto indicou que NgBr interage com HRT1, o qual é um tipo de CPT presente no látex, mas não interage com HRT2. Assim demonstrado-se que NgBr não interage com todos os tipos de CPT, mas interage com um CPT especifica.

[0114] A partir destes resultados, considera-se que a atividade de HRT1 pode ser ainda mais estabilizada e aumentada quando HRT1 for combinada com NgBr. LISTA DE SINAIS DE REFERÊNCIA 1: um par de plasmidio pPR3N prey e plasmidio pBT3-SUC bait 2: um par de plasmidio pPR3N prey e plasmidio pBT-HRTl bait 3: um par de plasmidio pPR3N prey e plasmidio pBT-HRT2 bait 4: um par de plasmidio pPR-HRTl prey e plasmidio pBT3-SUC bait 5: um par de plasmidio pPR-HRTl prey e plasmidio pBT-NgBr bait 6: um par de plasmidio pPR-HRTl prey e plasmidio pBT-HRT2 bait 7: um par de plasmidio PR-HRT2 prey e plasmidio pBT3-SUC bait 8: um par de plasmidio PR-HRT2 prey e plasmidio pBT-HRTl bait 9: um par de plasmidio PR-HRT2 prey e plasmidio pBT-NgBr bait (Texto de Listagem de sequências) SEQ ID NO: 1: sequência de nucleotideos do gene que codifica para HRT1 de Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 2: sequência de aminoácidos de HRT1 de Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 3: sequência de nucleotideos do gene que codifica para HRT2 de Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 4: sequência de aminoácidos de HRT2 de Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 5: sequência de nucleotideos do gene que codifica para NgBr de Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 6: sequência de aminoácidos de NgBr de Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 7: Primer 1 SEQ ID NO: 8: Primer 2 SEQ ID NO: 9: Primer 3 SEQ ID NO: 10: Primer 4 SEQ ID NO: 11: Primer 5 SEQ ID NO: 12: Primer 6 SEQ ID NO: 13: Primer 7 SEQ ID NO: 14: Primer 8.

Claims

1. Método para a produção de um poliisoprenóide utilizando o transformante caracterizado pelo fato de que é produzido através da introdução de um gene que codifica para uma cis-preniltransferase e um gene que codifica para um receptor Nogo-B dentro de um hospedeiro para permitir que o hospedeiro expresse a sequência cis-prenil- transferase e o receptor Nogo-B, em que pelo menos um do gene que codifica para uma cis-preniltransferase ou do gene que codifica para um receptor Nogo-B é introduzido na forma de um vetor no hospedeiro, e em que o gene que codifica para uma cis- preniltransferase é um dos seguintes DNAs: [1] um DNA que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; e [2] um DNA que compreende sequências de nucleotídeos degeneradas da SEQ ID NO:1 que codifica uma proteína de SEQ ID NO: 2, e que codifica para uma proteína que possui uma atividade de enzima que cataliza uma reação de enlongamento de cadeia-cis de um composto isoprenóide, em que o vetor contém um promotor na posição que permite a transcrição do DNA recombinante e em que o promotor é um dentre um promotor 35S do vírus mosaico de couve flor (CaMV), promotor de actina-1 de arroz, promotor do gene da nopalina sintetase, promotor 35S do vírus mosaico do tabaco e promotor do gene da actina do arroz, em que o hospedeiro é uma planta produtora de isoprenóide selecionada do grupo que consiste de plantas do gênero Hevea, Sonchus, Solidago, Helianthus, Taraxacum, Ficus e Parthenium.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um gene que codifica para uma cis-prenil-transferase ou o gene que codifica para um receptor Nogo-B é derivado de uma planta.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um gene que codifica para uma cis-preniltransferase ou o gene que codifica para um receptor Nogo-B é derivado de uma planta produtora de isoprenóides.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um gene que codifica para uma cis-preniltransferase ou o gene que codifica para um receptor Nogo-B é derivado de Hevea brasiliensis.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica para um receptor Nogo-B é um dos seguintes DNAs: [3] um DNA que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5; e [4] um DNA que compreende sequências de nucleotídeos degeneradas da SEQ ID NO: 5 que codificam uma proteína de SEQ ID NO: 6.