WO2015008644A1 - ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現をｂＺＩＰ型転写因子により調整する方法、ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物、及び該イソプレノイド産生植物を用いたポリイソプレノイドの製造方法 - Google Patents

ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現をｂＺＩＰ型転写因子により調整する方法、ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物、及び該イソプレノイド産生植物を用いたポリイソプレノイドの製造方法 Download PDF

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山口　晴彦
ゆき乃 井之上
智 黒田
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    • C12Y101/01034—Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (NADPH) (1.1.1.34)

Definitions

  • the present invention relates to a method for regulating the expression of hydroxymethylglutaryl CoA reductase using a bZIP transcription factor, an isoprenoid production plant into which a gene encoding a bZIP transcription factor has been introduced, and production of a polyisoprenoid using the isoprenoid production plant Regarding the method.
  • Natural rubber (a type of polyisoprenoid) currently used in industrial rubber products should be collected from rubber-producing plants such as Hevea brasiliensis and Mulberry plant Indian rubber tree (Ficus elastica). Is obtained.
  • Para rubber tree is a plant that can grow only in limited areas such as Southeast Asia and South America. Furthermore, it takes about 7 years for para rubber trees to become an adult tree from which rubber can be collected, and the period during which natural rubber can be collected is limited to 20-30 years. In the future, demand for natural rubber is expected to increase mainly in developing countries. However, for the reasons described above, it is difficult to significantly increase the production of natural rubber using para rubber tree. For this reason, there is a concern about the depletion of natural rubber resources, and there is a demand for improving the natural rubber production efficiency in Para rubber tree, as well as a stable natural rubber supply source other than Para rubber tree.
  • Examples of a method for improving the production efficiency of natural rubber in Para rubber tree include a method of collecting a larger amount of latex in order to obtain a larger amount of natural rubber. Specifically, for example, the method of applying stimulation to the trunk of rubber tree with ethylene or ether (2-chloroethylphosphonic acid), lanolin containing jasmonic acid or the linolenic acid of jasmonic acid precursor, etc. There is a method of promoting (for example, Non-Patent Document 1).
  • ethylene stimulation is a method that makes the latex outflow from the milk duct more smooth, and does not improve the latex production capacity of the tree itself. .
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to provide a method for enhancing the biosynthetic pathway of polyisoprenoid. It is another object of the present invention to provide an isoprenoid-producing plant with enhanced polyisoprenoid biosynthetic pathway and a method for producing polyisoprenoid using the isoprenoid-producing plant.
  • the present invention relates to a method for regulating the expression of hydroxymethylglutaryl CoA reductase by a bZIP type transcription factor.
  • the gene is preferably a DNA described in [1] or [2] below.
  • DNA comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 and 3
  • DNA encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 and 3 and has transcription factor activity.
  • the method is a method for enhancing the expression of hydroxymethylglutaryl CoA reductase.
  • the bZIP transcription factor is preferably a protein according to any one of [1] to [3] below.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 2 and 4
  • a protein comprising a sequence containing amino acid substitutions, deletions, insertions and / or additions and having transcription factor activity
  • the host is preferably an isoprenoid-producing plant.
  • the present invention also relates to an isoprenoid-producing plant into which a gene encoding a bZIP type transcription factor has been introduced.
  • the gene is preferably a DNA described in [1] or [2] below.
  • DNA comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 and 3
  • DNA encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 and 3 and has transcription factor activity.
  • the present invention also relates to a method for producing a polyisoprenoid using the above isoprenoid-producing plant.
  • the method of the present invention is a method in which the expression of hydroxymethylglutaryl CoA reductase, which is the rate-limiting step of the mevalonate (MVA) pathway located upstream of the biosynthetic pathway of polyisoprenoids, is regulated by bZIP type transcription factor.
  • the biosynthetic pathway of polyisoprenoids can be suitably enhanced by enhancing the rate-limiting site when isopentenyl diphosphate (IPP) is biosynthesized by the pathway.
  • the isoprenoid-producing plant of the present invention is an isoprenoid-producing plant into which a gene encoding a bZIP transcription factor has been introduced, the biosynthetic pathway of polyisoprenoid is suitably enhanced, and the isoprenoid-producing plant is used.
  • the production amount of polyisoprenoid can be increased.
  • the present inventors conducted various studies in order to enhance the biosynthetic pathway of polyisoprenoid.
  • a part of the biosynthetic pathway of polyisoprenoid is shown in FIG.
  • the mevalonic acid (MVA) pathway Cytosol MVA pathway shown in FIG. 1
  • MEP is used as biosynthetic pathways for one of the important substances, isopentenyl diphosphate (IPP).
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • MVA pathway is a general pathway for providing IPP in rubber latex, and consider the enhancement of the pathway surrounded by the dotted line in FIG. Selected from a variety of proteins that are expected to play an important role, among which, hydroxymethylglutaryl CoA reductase (HMG-CoA reductase) is MVA We found that it was the rate-limiting step of the route.
  • HMG-CoA reductase hydroxymethylglutaryl CoA reductase
  • the present inventors searched for a transcription factor capable of controlling the expression of HMG-CoA reductase.
  • the gene encoding the HMG-CoA reductase derived from the leaves of Para rubber tree (the amino acid sequence of the HMG-CoA reductase is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing) (the nucleotide sequence of the gene is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing)
  • a DNA fragment containing the promoter region were cloned (for details, see Examples). Then, the nucleotide sequence of the obtained DNA fragment was investigated, and the nucleotide sequence of the promoter region of the gene encoding HMG-CoA reductase was clarified.
  • nucleotide sequence of the clarified promoter region was analyzed using a plant promoter analysis database (A Date of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements (PLACE)).
  • PLACE Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements
  • the bZIP type transcription factor is a transcription factor capable of controlling the expression of HMG-CoA reductase, that is, the bZIP type transcription factor can enhance the rate-limiting site of IPP biosynthesis by the MVA pathway, and is a polyisoprenoid. It was strongly suggested that it is a transcription factor that can suitably control the biosynthetic pathway.
  • BZIP9 the base sequence and amino acid sequence of BZIP9 derived from Arabidopsis thaliana are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively
  • BZIP61 the base sequence and amino acid sequence of BZIP61 derived from Arabidopsis thaliana are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively
  • the bZIP transcription factor is a transcription factor that can suitably enhance the expression of HMG-CoA reductase, can enhance the rate-limiting site of IPP biosynthesis by the MVA pathway, and can produce polyisoprenoids. It was discovered that the transcription factor can suitably enhance the synthetic pathway.
  • the rate-limiting site of IPP biosynthesis by the MVA pathway is enhanced by the bZIP-type transcription factor, whereby the polyisoprenoid biosynthesis pathway can be suitably enhanced, and the gene encoding the bZIP-type transcription factor is It has been found that the amount of polyisoprenoid produced can be increased by introducing it into an isoprenoid-producing plant and producing the polyisoprenoid using the isoprenoid-producing plant.
  • hydroxymethylglutaryl CoA reductase is one of the rate-limiting enzymes of the mevalonate pathway, and hydroxymethylglutaryl CoA reductase (NADPH) (EC 1.1.1. 34) and hydroxymethylglutaryl CoA reductase (EC 1.1.1.188).
  • the method of the present invention is a method of regulating the expression of hydroxymethylglutaryl CoA reductase using a bZIP type transcription factor.
  • the bZIP type transcription factor is not particularly limited as long as it is a transcription factor structurally characterized by a leucine zipper motif having a basic region.
  • BZIP9 the sequence sequence of the base sequence and amino acid sequence of BZIP9 derived from Arabidopsis thaliana
  • BZIP61 the base sequence and amino acid sequence of BZIP61 derived from Arabidopsis thaliana are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively
  • a transcription factor refers to a protein having an activity of increasing or decreasing (preferably increasing) the amount of gene transcription.
  • the origin of the bZIP type transcription factor is not particularly limited, but is preferably a transcription factor derived from Para rubber tree, Nogeshi, Guayule, Russian dandelion, or Arabidopsis thaliana.
  • amino acid sequence of bZIP type transcription factor The following [1] is mentioned as a specific example of a bZIP type transcription factor.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4
  • a transcription factor may have transcription factor activity even when it contains substitution, deletion, insertion, or addition of one or more amino acids in the original amino acid sequence.
  • specific examples of bZIP type transcription factors include [2] below.
  • the transcription factor activity means an activity to increase or decrease (preferably increase) the transcription amount of a gene encoding hydroxymethylglutaryl CoA reductase.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferably one or more amino acids, more preferably 1 to 55 amino acids, still more preferably 1 to 41 amino acids.
  • Amino acids particularly preferably 1 to 27 amino acids, most preferably 1 to 13 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids, and most preferably 1 to 2 amino acid substitutions, deletions and insertions And / or an amino acid sequence containing an addition.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is preferably one or more amino acids, more preferably 1 to 65 amino acids, still more preferably 1 to 49 amino acids.
  • Amino acids particularly preferably 1 to 32 amino acids, most preferably 1 to 16 amino acids, more preferably 1 to 6 amino acids, and most preferably 1 to 3 amino acid substitutions, deletions, insertions And / or an amino acid sequence containing an addition.
  • amino acid substitution conservative substitution is preferable, and specifically, substitution within a group in parentheses below can be mentioned.
  • (glycine, alanine) valine, isoleucine, leucine) (aspartic acid, glutamic acid) (asparagine, glutamine) (serine, threonine) (lysine, arginine) (phenylalanine, tyrosine).
  • Amino acid substitutions, deletions, insertions, and / or additions are introduced into regions other than the active domain as a bZIP type transcription factor, the binding domain to the transcription factor binding site, and other parts important for transcription factor activity. It is preferable. Such a domain can be appropriately determined by those skilled in the art from homology analysis with known bZIP type transcription factors.
  • bZIP type transcription factors include [3] below. [3] A protein comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 2 and 4, and having transcription factor activity
  • sequence identity with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 2 and 4 is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and further Preferably it is 95% or more, Especially preferably, it is 98% or more, Most preferably, it is 99% or more.
  • sequence identity of amino acid sequences and base sequences is determined by the algorithm BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] or FASTA [Methods Enzymol. , 183, 63 (1990)].
  • Examples of a method for confirming that the protein has transcription factor activity include, for example, a conventionally known method such as a gel shift assay, a reporter assay using ⁇ -galactosidase, luciferase, GFP (Green Fluorescent Protein) or the like as a reporter gene. The method of confirming by etc. is mentioned.
  • [1-1] Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 [2-1] Substitution, deletion, insertion and / or substitution of one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • a protein comprising a sequence containing an addition and having transcription factor activity
  • DNA (DNA encoding bZIP type transcription factor) Moreover, as DNA which codes a bZIP type transcription factor, following [1] or [2] is mentioned. [1] DNA comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 and 3 [2] It encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 and 3 and has transcription factor activity.
  • hybridize refers to a step in which DNA hybridizes to DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Therefore, the DNA having the specific base sequence or a part of the base sequence of the DNA is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or can be used as an oligonucleotide primer for PCR (Polymerase Chain Reaction) analysis. It may be DNA. Examples of DNA used as a probe include DNA of at least 100 bases, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more, but may be DNA of at least 10 bases, preferably 15 bases or more. .
  • the above stringent conditions include, for example, a filter in which DNA is immobilized and probe DNA, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6). ) After incubation overnight at 42 ° C. in a solution containing 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA, for example 0.2 ⁇ SSC solution at about 65 ° C. While the conditions for washing the filter can be raised, lower stringent conditions can also be used. Stringent conditions can be changed by adjusting the formamide concentration (lower stringent concentration reduces the stringency), and changing the salt concentration and temperature conditions.
  • low stringent conditions for example, 6 ⁇ SSCE (20 ⁇ SSCE is 3 mol / l sodium chloride, 0.2 mol / l sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / l EDTA, pH 7.4), 0 After overnight incubation at 37 ° C. in a solution containing 5% SDS, 30% formamide, 100 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA, 50 ° C. 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS solution The conditions for using and washing can be raised. Further, examples of lower stringent conditions include conditions under which hybridization is performed using a solution having a high salt concentration (for example, 5 ⁇ SSC) under the above-described low stringency conditions and then washed.
  • a high salt concentration for example, 5 ⁇ SSC
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing a blocking reagent used to suppress the background of hybridization experiments.
  • the addition of the blocking reagent described above may be accompanied by a change in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • the DNA that can hybridize under the stringent conditions described above is represented by any one of SEQ ID NOs: 1 and 3 when calculated based on the above parameters using a program such as BLAST and FASTA.
  • a DNA comprising a base sequence having at least 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more. Can do.
  • the DNA that hybridizes with the above-described DNA under stringent conditions is a DNA encoding a protein having transcription factor activity
  • a conventionally known method such as gel shift assay, ⁇ -The method of confirming by the reporter assay etc. which used galactosidase, luciferase, or GFP (Green Fluorescent Protein) etc. as a reporter gene is mentioned.
  • DNA encoding the bZIP type transcription factor [1-1] DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 [2-1] DNA that hybridizes with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having transcription factor activity It is preferable that it is either.
  • the bZIP-type transcription factor and the DNA encoding the bZIP-type transcription factor are as follows: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), CurrentJoint 1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 and 3 (base sequence of BZIP9 derived from Arabidopsis thaliana, or It can be obtained by introducing a site-specific mutation into the base sequence of BZIP61 derived from Arabidopsis thaliana.
  • Transformant By introducing a gene encoding a bZIP type transcription factor into a host, an organism (transformant) transformed to express the bZIP type transcription factor can be obtained.
  • the expression of hydroxymethylglutaryl CoA reductase is regulated (enhanced) by expressing the bZIP transcription factor.
  • the rate-limiting site of IPP biosynthesis by the MVA pathway is enhanced, whereby the polyisoprenoid biosynthesis pathway is suitably enhanced, and the amount of polyisoprenoid produced in the transformant can be suitably increased.
  • a method for producing an organism (transformant) transformed so as to express a bZIP type transcription factor will be briefly described.
  • a method for producing a transformant transformed so as to mainly express the bZIP type transcription factor will be briefly described.
  • Such a transformant can be prepared by a conventionally known method once the gene encoding the bZIP type transcription factor to be introduced is determined.
  • a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 and 3 (base sequence of BZIP9 derived from Arabidopsis thaliana or base of BZIP61 derived from Arabidopsis thaliana is located downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • DNA containing the sequence is inserted using an appropriate restriction enzyme or the like to produce recombinant DNA.
  • a transformant can be obtained by introducing the recombinant DNA into a host cell suitable for the expression vector.
  • a method for isolating a target DNA molecule using the DNA molecule as a probe is described in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989) and the like. Moreover, you may use the DNA which introduce
  • any microorganisms, yeasts, animal cells, insect cells, plant cells, etc. can be used as long as they can express the gene of interest.
  • polyisoprenoids are biosynthesized. Since only living organisms are plants (isoprenoid producing plants), plants (isoprenoid producing plants) are preferable as hosts, and plant cells (plant cells of isoprenoid producing plants) are preferred as host cells. If the polyisoprenoid can be biosynthesized in plants other than plant cells with the development of future technology, a gene encoding the above bZIP transcription factor may be suitably introduced into the cells. Is possible.
  • the isoprenoid-producing plant is not particularly limited as long as it is a plant capable of producing isoprenoids.
  • the genus of Hevea such as Hevea brasiliensis; Sonchus oleceraceus, Sonchus aspera, Sonchus brach, etc. of Sonchus spp;. goldenrod (Solidago altissima), goldenrod (. Solidago virgaurea subsp asiatica), Miyama goldenrod (. Solidago virgaurea subsp leipcarpa), tung moth Mine goldenrod (Solidago virgaurea subsp leipcarpaf ....
  • Paludosa giant goldenrod (Solidago virgaurea subsp gigantea), Solidago gigantea (Solidago gigantea Ait var leiophylla Fernald) Solidago genus and the like; sunflower (Helianthus annuus), Shirota et sunflower (Helianthus argophyllus), Helianthus Atororubensu (Helianthus atrorubens) Genus Helianthus, such as Sunflower (Helianthus debilis), Kohimawari (Helianthus decapetalus), Giant Sunflower (Helianthus giganteus); Dandelion (Taraxa) um), Ezotanpopo (Taraxacum venustum H.Koidz), Shinano dandelion (Taraxacum hondoense Nakai), Kanto dandelion (Taraxacum platycarpum Dahlst), Kansai dandelion (Taraxacum japonicum),
  • the expression vector one that can autonomously replicate in the host cell or can be integrated into a chromosome and that contains a promoter at a position where the recombinant DNA can be transcribed can be used.
  • expression vectors When plant cells are used as host cells, examples of expression vectors include pBI vectors, pUC vectors, Ti plasmids, tobacco mosaic virus vectors, and the like. Any promoter may be used as long as it functions in plant cells. For example, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, rice actin 1 promoter, nopaline synthase gene promoter, and tobacco mosaic virus 35S. Examples thereof include promoters and rice-derived actin gene promoters.
  • an expression vector having a promoter that is specifically expressed in a tissue in which an isoprenoid compound is biosynthesized such as a milk duct.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • a method using Agrobacterium Japanese Patent Laid-Open Nos. 59-140885 and JP Sho-60-70080, WO94 / 00977
  • electroporation method Japanese Patent Laid-Open No. 60-251887
  • particle gun Japanese Patent No. 2517813
  • the present invention provides an isoprenoid-producing plant into which a gene encoding a bZIP type transcription factor has been introduced.
  • the isoprenoid-producing plant is not particularly limited as long as it is an isoprenoid-producing plant having transformed plant cells.
  • transformed plant cells For example, not only transformed plant cells obtained by the above-described method, but also their progeny or clones, and further subculture them. It is a concept that includes all of the progeny plants obtained.
  • offspring or clones can be obtained from the transformed plant cell by sexual reproduction, asexual reproduction, tissue culture, cell culture, cell fusion, etc. It is possible to obtain.
  • a propagation material eg, seed, fruit, cut ear, tuber, tuber, strain, adventitious bud, adventitious embryo, callus, protoplast, etc.
  • the isoprenoid-producing plant can be mass-produced.
  • Methods for regenerating plant bodies from transformed plant cells are, for example, the method of Toi et al. (Japanese Patent Application No. 11-127005) in Eucalyptus, the method of Fujimura et al. (Fujimura et al. (1995), Plant Tissue Culture Lett. , Vol.2: p74-), for corn, the method of Shirito et al. (Shillito et al. (1989), Bio / Technology, vol. 7: p581-), for potatoes, the method of Visser et al. (Visser et al. (1989), Theor. Appl. Genet., Vol.78: p589-), and the method of Akama et al. (Akama et al. (1992), Plant Cell Rep., Vol.12: p7-) is known in Arabidopsis thaliana. If, it regenerating plants from the transformed plant cells by reference.
  • the expression of the target transcription factor gene can be confirmed by using a well-known technique.
  • the expression of the target transcription factor may be analyzed by Western blot.
  • the transformed plant body is rooted in an appropriate medium, and the rooted body is transplanted into a pot containing water-containing soil.
  • the seeds are obtained by growing them under appropriate cultivation conditions and finally forming seeds.
  • a plant is obtained by sowing seeds derived from a transformed plant obtained as described above in water-containing soil and growing them under appropriate cultivation conditions. You can get a body.
  • the amount of polyisoprenoid produced can be increased by producing a polyisoprenoid using an isoprenoid-producing plant into which a gene encoding a bZIP transcription factor has been introduced.
  • transformed plant cells obtained by the above method, callus obtained from transformed plant cells, cells re-differentiated from the callus, etc. are cultured in an appropriate medium or regenerated from transformed plant cells.
  • the polyisoprenoid can be produced by growing the transformed plant body, the plant body obtained from the seed obtained from the transformed plant body, and the like under suitable cultivation conditions.
  • the polyisoprenoid biosynthetic pathway is suitably enhanced by enhancing the rate-limiting site of IPP biosynthesis by the MVA pathway by the introduced bZIP type transcription factor.
  • the production amount of can be increased suitably.
  • polyisoprenoids is a general term for structured polymer with isoprene units (C 5 H 8).
  • examples of polyisoprenoids include monoterpenes (C 10 ), sesquiterpenes (C 15 ), diterpenes (C 20 ), sesterterpenes (C 25 ), triterpenes (C 30 ), tetraterpenes (C 40 ), and natural rubber.
  • a polymer is mentioned.
  • the expression of hydroxymethylglutaryl CoA reductase can be regulated (enhanced) by the bZIP type transcription factor, so that polyisoprenoid
  • the biosynthetic pathway is suitably enhanced, and the amount of polyisoprenoid produced in the transformant can be suitably increased.
  • the isoprenoid-producing plant of the present invention into which a gene encoding a bZIP transcription factor has been introduced has an increased rate-limiting site for IPP biosynthesis by the MVA pathway by the introduced bZIP transcription factor, so that Since the biosynthetic pathway is suitably enhanced, the production amount of polyisoprenoid can be suitably increased by producing polyisoprenoid using the isoprenoid-producing plant.
  • the production amount of polyisoprenoid can be increased by the method of the present invention, the isoprenoid-producing plant of the present invention, and the polyisoprenoid production method of the present invention, it is possible to cope with the depletion of natural rubber resources that are concerned. It is possible.
  • a gene encoding HMG-CoA reductase derived from the leaf of Para rubber tree (the base sequence of the gene is shown in SEQ ID NO: 5) and a DNA fragment containing the promoter were cloned by the following procedure.
  • genomic DNA was extracted from the leaves of Para rubber tree. Extraction was performed using a commercially available genomic DNA extraction kit. Amplification of the gene containing the promoter region of the gene encoding HMG-CoA reductase is performed by TAIL-PCR using a random primer as shown in primers 1 to 6 and a primer corresponding to the gene encoding HMG-CoA reductase. Obtained.
  • Primer 1 5′-ntcgastwtsgwgtt-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
  • Primer 2 5'-nggtcgtswganawgaa-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Primer 3 5'-wgtgnagwancanag-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • Primer 4 5′-stntastntntntgc-3 ′ (SEQ ID NO: 10)
  • Primer 5 5′-sstggstanwatwatt-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
  • Primer 6 5′-agwgnagwancanaga-3 ′ (SEQ ID NO: 12)
  • the promoter sequence of HMG-CoA reductase was obtained.
  • the base sequence of the promoter sequence of HMG-CoA reductase is shown in SEQ ID NO: 13.
  • the promoter sequence was analyzed using an analysis database for plant promoter (A Datebase of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements (PLACE)) (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/).
  • HMG-CoA reductase promoter -1 to -1500 bp, -1 to -1000 bp, -1 to -500 bp PCR products were cloned into pMD20T (Takara Bio) to construct pMD20T-hmgpro (-1500), pMD20T-hmgpro (-1000), and pMD20T-hmgpro (-500). It was confirmed that there was no mutagenesis by conducting a sequence analysis of the inserted PCR product.
  • the plasmid constructed in (amplification of promoter region) is restricted with SpeI and HindIII, KpnI, or BamHI, so that the site where the T7 promoter region of pYES3 / CT / LacZ is removed, ie, immediately above the reporter lacZ gene.
  • Each promoter sequence fragment was incorporated into pYES3-hmgprolacZ (-1500), pYES3-hmgprolacZ (-1000), and pYES3-hmgpro (-500). Ligation is performed using Ligation high ver. 2 (TOYOBO).
  • PCR was performed using an Arabidopsis cDNA library as a template.
  • Two types of PCR fragments At5g24800 (BZIP9) (SEQ ID NO: 1) and At3g58120 (BZIP61) (SEQ ID NO: 3), were obtained by PCR.
  • the obtained PCR products were cloned into pMD20T to construct pMD20T-BZIP9 and pMD20T-BZIP61. It was confirmed that there was no mutagenesis by conducting a sequence analysis of the inserted PCR product.
  • each transcription factor gene is incorporated downstream of the TEF1 promoter region of p427TEF (Cosmo Bio), and pTEF-BZIP9, pTEF -BZIP61 was constructed. Ligation is performed using Ligation high ver. 2 was used.
  • yeast transformation The plasmid constructed in (Construction of gene introduction vector into yeast chromosome) and (Construction of transcription factor expression vector) was introduced into yeast (BY4741 strain) by electroporation. The selection of the transgenic yeast was performed by culturing the yeast on a medium containing Aureobasidin A (Takara Bio) and G418 (Wako Pure Chemical Industries), which are antifungal antibiotics.
  • the transformed yeast was cultured on a medium containing X-gal to investigate the expression of lacZ due to transcription factor activity. Specifically, when lacZ, which is a reporter gene linked to a promoter sequence, is expressed, X-gal contained in the medium is decomposed to exhibit a blue color. Therefore, when blue is displayed, lacZ is expressed due to transcription factor activity. It was judged. Table 1 shows the number of times lacZ was expressed by transcription factor activity after 10 tests.
  • At5g24800 BZIP9
  • At3g58120 BZIP61
  • At5g24800 (BZIP9) the rate-limiting site of IPP biosynthesis by the MVA pathway is enhanced, and the biosynthetic pathway of polyisoprenoid is increased. It was proved that it can be suitably enhanced and the production of polyisoprenoid can be suitably increased.
  • SEQ ID NO: 1 Base sequence of a gene encoding BZIP9 derived from Arabidopsis
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of BZIP9 derived from Arabidopsis
  • SEQ ID NO: 3 Base sequence of a gene encoding BZIP61 derived from Arabidopsis
  • SEQ ID NO: 4 BZIP61 derived from Arabidopsis Amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 5 base sequence of a gene encoding HMG-CoA reductase derived from Para rubber tree
  • SEQ ID NO: 6 amino acid sequence of HMG-CoA reductase derived from Para rubber tree
  • SEQ ID NO: 7 primer 1
  • Sequence number 8 Primer 2 Sequence number 9: Primer 3
  • Sequence number 10 Primer 4 Sequence number 11: Primer 5
  • Sequence number 12 Primer 6 SEQ ID NO: 13: Base sequence of promoter sequence of HMG-CoA reductase derived from Para rubber tree

Abstract

本発明はポリイソプレノイドの生合成経路を増強する方法を提供する。また、ポリイソプレノイドの生合成経路が増強されたイソプレノイド産生植物、及び該イソプレノイド産生植物を用いたポリイソプレノイドの製造方法を提供する。 本発明はヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現をｂＺＩＰ型転写因子により調整する方法に関する。

Description

ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現をｂＺＩＰ型転写因子により調整する方法、ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物、及び該イソプレノイド産生植物を用いたポリイソプレノイドの製造方法
本発明は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現をｂＺＩＰ型転写因子により調整する方法、ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物、及び該イソプレノイド産生植物を用いたポリイソプレノイドの製造方法に関する。
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ　ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物より採取することにより得られる。
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０～３０年に限られる。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。そのため、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源やパラゴムノキにおける天然ゴムの生産効率の改善が望まれている。
パラゴムノキでの天然ゴムの生産効率を改善する方法としては、例えば、より大量の天然ゴムを得るために、より大量のラテックスを採取する方法が挙げられる。具体的には、例えば、ゴムノキの幹に対してエチレンやＥｔｈｅｐｈｏｎ（２－クロロエチルホスホン酸）による刺激を加える方法、ジャスモン酸やジャスモン酸前駆体のリノレン酸等を配合したラノリンにより乳管分化を促進する方法がある（例えば、非特許文献１）。
しかし、エチレン刺激によるラテックスを増産する方法は、幹に対し長期的に使用し続けると樹皮割れが生じ易くなるおそれがある。また、エチレン刺激は、乳管からのラテックスの流出をより円滑にする方法であり、樹木のラテックス生産能力そのものを改善するものではなく、当該方法によるラテックスの増産には限界があり、十分ではない。
また、ジャスモン酸等を用いて乳管形成を促進し、乳管数を増大させることが可能であるが、タッピングによってラテックスを回収する際に、乳管から流出するラテックスが傷口で凝固し、生産されたラテックスを十分に回収できないという問題がある。
一方、ポリイソプレノイドの生合成量は、光応答、傷害応答、冷温処理等によって変化することが知られている。しかしながら、どの転写因子がこれらの応答により活性化され、ポリイソプレノイドの生合成量を制御しているか具体的には分かっていない。
Ｈａｏ、他、Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ、　２０００年、第８５巻、３７～４３ページ
本発明は、前記課題を解決し、ポリイソプレノイドの生合成経路を増強する方法を提供することを目的とする。また、ポリイソプレノイドの生合成経路が増強されたイソプレノイド産生植物、及び該イソプレノイド産生植物を用いたポリイソプレノイドの製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現をｂＺＩＰ型転写因子により調整する方法に関する。
上記方法においては、上記ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、上記ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現を調整することが好ましい。
上記遺伝子が、以下の［１］又は［２］に記載のＤＮＡであることが好ましい。
［１］配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
上記方法が、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現を増強する方法であることがより好ましい。
上記ｂＺＩＰ型転写因子が、以下の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質であることが好ましい。
［１］配列番号２，４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号２，４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ転写因子活性を有する蛋白質
［３］配列番号２，４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ転写因子活性を有する蛋白質
上記宿主がイソプレノイド産生植物であることが好ましい。
本発明はまた、ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物に関する。
上記遺伝子が、以下の［１］又は［２］に記載のＤＮＡであることが好ましい。
［１］配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
本発明はまた、上記イソプレノイド産生植物を用いたポリイソプレノイドの製造方法に関する。
本発明の方法は、ポリイソプレノイドの生合成経路の上流に位置するメバロン酸（ＭＶＡ）経路の律速段階であるヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現をｂＺＩＰ型転写因子により調整する方法であるので、ＭＶＡ経路によりイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が生合成される際の律速部位が増強されることにより、ポリイソプレノイドの生合成経路を好適に増強できる。また、本発明のイソプレノイド産生植物は、ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物であるので、ポリイソプレノイドの生合成経路が好適に増強されており、該イソプレノイド産生植物を使用してポリイソプレノイドの製造を行うことにより、ポリイソプレノイドの製造量を増大できる。
ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。
本発明者らは、ポリイソプレノイドの生合成経路を増強するために、種々の検討を行った。ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を図１に示す。ポリイソプレノイドの生合成経路のなかでも、重要物質の１つであるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を生合成する経路として、メバロン酸（ＭＶＡ）経路（図１に記載のＣｙｔｏｓｏｌ　ＭＶＡ　ｐａｔｈｗａｙ）とＭＥＰ経路（図１に記載のＰｌａｓｔｉｄｉａｌ　ＤＸＰ　ｐａｔｈｗａｙ）の２種類の経路が知られている。
本発明者らは、ゴムラテックスにおいてＩＰＰを提供する一般的な経路であるという理由から、ＭＶＡ経路に着目し、図１の点線で囲った経路の増強を考慮して、ポリイソプレノイドの生合成経路に関与している様々な蛋白質の中から、重要な働きをしているのではないかと予想される複数の蛋白質を選定し、その中でも、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ）がＭＶＡ経路の律速段階であることを見出した。
そして、本発明者らは、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの発現を制御するために、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの発現を制御可能な転写因子の探索を行うこととした。具体的には、パラゴムノキの葉由来のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（該ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列を配列表配列番号６に示す）をコードする遺伝子（該遺伝子の塩基配列を配列表配列番号５に示す）とそのプロモーター領域を含むＤＮＡ断片をクローニングした（詳細は実施例参照）。そして、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を調査し、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を明らかにした。
更に、明らかにしたプロモーター領域の塩基配列について、植物プロモーター用解析データベース（Ａ　Ｄａｔｅｂａｓｅ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＤＮＡ　Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　（ＰＬＡＣＥ））を用いて解析を行った。解析の結果、ｂＺＩＰ型転写因子の結合（認識）サイト（ＡＣＡＣＮＮＧ）が見つかった。
この解析結果より、ｂＺＩＰ型転写因子が、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの発現を制御可能な転写因子であること、すなわち、ｂＺＩＰ型転写因子が、ＭＶＡ経路によるＩＰＰ生合成の律速部位を増強でき、ポリイソプレノイドの生合成経路を好適に制御可能な転写因子であることが強く示唆された。そして、酵母を使用して確認試験を行ったところ、ｂＺＩＰ型転写因子の中で、ＢＺＩＰ９（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＢＺＩＰ９の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号１，２に示す）、ＢＺＩＰ６１（シロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ６１の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号３，４に示す）を使用するとＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの発現を増強できることを確認した。
このように、本発明者らは、ｂＺＩＰ型転写因子が、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの発現を好適に増強可能な転写因子であり、ＭＶＡ経路によるＩＰＰ生合成の律速部位を増強でき、ポリイソプレノイドの生合成経路を好適に増強可能な転写因子であることを発見した。そして、ｂＺＩＰ型転写因子により、ＭＶＡ経路によるＩＰＰ生合成の律速部位が増強されることにより、ポリイソプレノイドの生合成経路を好適に増強することが可能であり、ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入し、該イソプレノイド産生植物を使用してポリイソプレノイドの製造を行うことにより、ポリイソプレノイドの製造量を増大できることを見出した。
なお、本明細書において、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ）は、メバロン酸経路の律速酵素の一つであり、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ　（ＮＡＤＰＨ）（ＥＣ　１．１．１．３４）とヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ　１．１．１．８８）の両方を含む。
本発明の方法は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現をｂＺＩＰ型転写因子により調整する方法である。
ｂＺＩＰ型転写因子としては、塩基性領域を持つロイシンジッパーモチーフを構造的特徴とする転写因子であれば特に限定されず、例えば、ＢＺＩＰ９（シロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ９の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号１，２に示す）、ＢＺＩＰ６１（シロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ６１の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号３，４に示す）等が挙げられる。
なお、本明細書において、転写因子とは、遺伝子の転写量を増加もしくは減少（好ましくは増加）させる活性を有するタンパク質のことを言う。
ｂＺＩＰ型転写因子は、その由来は特に限定されないが、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール、ロシアンタンポポ、又は、シロイヌナズナ由来の転写因子であることが好ましい。
（ｂＺＩＰ型転写因子のアミノ酸配列）
ｂＺＩＰ型転写因子の具体例としては、下記［１］が挙げられる。
［１］配列番号２，４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
また、転写因子は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても転写因子活性を有する場合があることが知られている。従って、ｂＺＩＰ型転写因子の具体例としては、下記［２］も挙げられる。
［２］配列番号２，４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ転写因子活性を有する蛋白質
ここで、本明細書において、転写因子活性とは、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子の転写量を増加もしくは減少（好ましくは増加）させる活性をいう。
なお、転写因子活性を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～５５個のアミノ酸、更に好ましくは１～４１個のアミノ酸、特に好ましくは１～２７個のアミノ酸、最も好ましくは１～１３個のアミノ酸、より最も好ましくは１～５個のアミノ酸、更に最も好ましくは１～２個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
また、転写因子活性を維持するためには、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～６５個のアミノ酸、更に好ましくは１～４９個のアミノ酸、特に好ましくは１～３２個のアミノ酸、最も好ましくは１～１６個のアミノ酸、より最も好ましくは１～６個のアミノ酸、更に最も好ましくは１～３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
なお、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加は、ｂＺＩＰ型転写因子としての活性ドメイン、および転写因子結合サイトへの結合ドメインその他の転写因子活性に重要な部分以外の領域に導入されることが好ましい。そのようなドメインは、既知のｂＺＩＰ型転写因子との相同性解析から当業者は適宜決定することができる。
また、転写因子のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の活性を有する場合があることが知られている。従って、ｂＺＩＰ型転写因子の具体例としては、下記［３］も挙げられる。
［３］配列番号２，４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ転写因子活性を有する蛋白質
なお、転写因子活性を維持するためには、配列番号２，４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０，　５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１８３，　６３　（１９９０）］を用いて決定することができる。
転写因子活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法である、ゲルシフトアッセイや、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、若しくはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）等をレポーター遺伝子としたレポーターアッセイ等により確認する方法が挙げられる。
なお、ｂＺＩＰ型転写因子としては、
［１－１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２－１］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ転写因子活性を有する蛋白質
［３－１］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ転写因子活性を有する蛋白質
のいずれかであることが好ましい。
（ｂＺＩＰ型転写因子をコードするＤＮＡ）
また、ｂＺＩＰ型転写因子をコードするＤＮＡとしては、下記［１］又は［２］が挙げられる。
［１］配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍａｎｕａｌ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、転写因子活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法である、ゲルシフトアッセイや、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、若しくはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）等をレポーター遺伝子としたレポーターアッセイ等により確認する方法が挙げられる。
なお、ｂＺＩＰ型転写因子をコードするＤＮＡとしては、
［１－１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２－１］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
のいずれかであることが好ましい。
なお、ｂＺＩＰ型転写因子及び該ｂＺＩＰ型転写因子をコードするＤＮＡは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１０，　６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７９，　６４０９（１９８２）　、Ｇｅｎｅ，　３４，　３１５　（１９８５）　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１３，　４４３１　（１９８５）　、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８２，　４８８　（１９８５）　等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列（シロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ９の塩基配列、又はシロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ６１の塩基配列）に部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
（形質転換体）
ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子を宿主に導入することにより、ｂＺＩＰ型転写因子を発現するように形質転換された生物体（形質転換体）が得られる。そして、当該形質転換体では、ｂＺＩＰ型転写因子が発現することにより、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現が調整（増強）される。その結果、ＭＶＡ経路によるＩＰＰ生合成の律速部位が増強されることにより、ポリイソプレノイドの生合成経路が好適に増強され、形質転換体においてポリイソプレノイドの製造量を好適に増大できる。
次に、ｂＺＩＰ型転写因子を発現するように形質転換された生物体（形質転換体）の作製方法について簡単に説明する。ここでは、主として上記ｂＺＩＰ型転写因子を発現するように形質転換された形質転換体の作製方法について簡単に説明する。このような形質転換体は、導入したいｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子が決まれば、従来公知の方法により作製することができる。
具体的には、例えば、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に、配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列（シロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ９の塩基配列、又はシロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ６１の塩基配列）を含むＤＮＡを適当な制限酵素等を用いて挿入し、組換え体ＤＮＡを作製する。そして、該組換え体ＤＮＡを該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
また、上記説明では、配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列（シロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ９の塩基配列、又はシロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ６１の塩基配列）を含むＤＮＡを用いる場合について説明したが、シロイヌナズナ由来の他のｂＺＩＰ型転写因子、又はシロイヌナズナ以外の生物由来のｂＺＩＰ型転写因子をコードするＤＮＡを用いてもよい。この場合には、公知の手法により、例えば、配列番号１で表される塩基配列の一部をプローブとして用いて、スクリーニングすることにより、ｂＺＩＰ型転写因子をコードするＤＮＡを特定し、単離すればよい。ＤＮＡ分子をプローブとして用いて、目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。また、上記ＤＮＡに変異を導入したＤＮＡを用いてもよい。
宿主（宿主細胞）としては、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができるが、現状では、ポリイソプレノイドを生合成できる生物は、植物（イソプレノイド産生植物）だけであることから、宿主としては植物（イソプレノイド産生植物）が好ましく、宿主細胞としては植物細胞（イソプレノイド産生植物の植物細胞）が好ましい。なお、今後の技術の発展に伴い、植物細胞以外においてもポリイソプレノイドを生合成できるようになった場合には、当該細胞にも好適に上述のｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子を導入することが可能である。
イソプレノイド産生植物としては、イソプレノイドを産生可能な植物であれば特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａｆ． ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｇｉｇａｎｔｅａ Ａｉｔ． ｖａｒ． ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｖｅｎｕｓｔｕｍ Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ ｐｕｍｉｌａ Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ａｍｐｅｌａｓ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｉｒｉｓａｎａ Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｓｅｐｔｉｃａ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ　ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ　ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましく、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール、及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、上記組換え体ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものを使用できる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクター、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、タバコモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、イネ由来アクチン遺伝子プロモーター等をあげることができる。
なお、イソプレノイド化合物が生合成される組織、例えば乳管に特異的に発現するプロモーターを持った発現ベクターを使用することが好ましい。ポリイソプレノイドが生合成される組織に特異的に発現させることにより、植物の生長遅延などの弊害を抑制することが出来る。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９－１４０８８５号公報、特開昭６０－７００８０号公報、ＷＯ９４／００９７７号公報）、エレクトロポレーション法（特開昭６０－２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等をあげることができる。
以上の方法等により、ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子が導入された形質転換体（形質転換植物細胞）が得られる。
本発明は、ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物を提供するものである。該イソプレノイド産生植物は、形質転換植物細胞を有するイソプレノイド産生植物であれば特に限定されず、例えば、上述の方法で得られた形質転換植物細胞のみならず、その子孫又はクローン、さらにそれらを継代させて得られる子孫植物の全てを含む概念である。一旦、ゲノム内に上記ＤＮＡやベクターが導入された形質転換植物細胞が得られれば、該形質転換植物細胞から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫又はクローンを得ることが可能である。また、該形質転換植物細胞やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該イソプレノイド産生植物を量産することも可能である。
形質転換植物細胞から植物体を再生する方法は、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特願平１１－１２７０２５号公報）、イネではＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５），　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４－）、トウモロコシではＳｈｉｌｌｉｔｏらの方法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９），　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１－）、ジャガイモではＶｉｓｓｅｒらの方法（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９），　Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９－）、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２），　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７－）が知られており、当業者であれば、これらを参照して形質転換植物細胞から植物体を再生できる。
再生した植物体において、周知の手法を用いることで、目的の転写因子遺伝子の発現を確認することが出来る。例えば、目的の転写因子の発現をウエスタンブロット解析すればよい。
上記形質転換植物体から種子を得る方法としては、例えば、形質転換植物体を適当な培地において発根させ、その発根体を水分含有の土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させ、最終的に種子を形成させて、該種子を得る。また、種子から植物体を得る方法としては、例えば、前記のようにして得られた形質転換植物体由来の種子を、水分含有の土に播種し、適当な栽培条件下で生育させることにより植物体を得ることができる。
本発明では、ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物を使用してポリイソプレノイドの製造を行うことにより、ポリイソプレノイドの製造量を増大できる。具体的には、上述の方法で得られた形質転換植物細胞、形質転換植物細胞から得られたカルス、該カルスから再分化した細胞等を適当な培地で培養したり、形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体、該形質転換植物体から得られた種子から得られた植物体等を適当な栽培条件下で生育させたりすることにより、ポリイソプレノイドを製造することができる。本発明のイソプレノイド産生植物は、導入されたｂＺＩＰ型転写因子により、ＭＶＡ経路によるＩＰＰ生合成の律速部位が増強されることにより、ポリイソプレノイドの生合成経路が好適に増強されているため、ポリイソプレノイドの製造量を好適に増大できる。
ここで、本明細書において、ポリイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成された重合体の総称である。ポリイソプレノイドとしては、例えばモノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）、天然ゴムなどの重合体が挙げられる。
以上の説明の通り、本発明では、ｂＺＩＰ型転写因子により、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現を調整（増強）できるため、ＭＶＡ経路によるＩＰＰ生合成の律速部位が増強されることにより、ポリイソプレノイドの生合成経路が好適に増強され、形質転換体においてポリイソプレノイドの製造量を好適に増大できる。
また、ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子が導入された本発明のイソプレノイド産生植物は、導入されたｂＺＩＰ型転写因子により、ＭＶＡ経路によるＩＰＰ生合成の律速部位が増強されることにより、ポリイソプレノイドの生合成経路が好適に増強されているため、該イソプレノイド産生植物を使用してポリイソプレノイドの製造を行うことにより、ポリイソプレノイドの製造量を好適に増大できる。
以上のように、本発明の方法、本発明のイソプレノイド産生植物、及び本発明のポリイソプレノイドの製造方法により、ポリイソプレノイドの製造量を増大できるため、懸念されている天然ゴム資源の枯渇に対応することが可能である。
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
（プロモーター配列の調製）
パラゴムノキの葉由来のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子（該遺伝子の塩基配列を配列表配列番号５に示す）とそのプロモーターを含むＤＮＡ断片を以下の手順でクローニングした。まず、パラゴムノキの葉からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出は市販のゲノムＤＮＡ抽出キットを用いて行った。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子の増幅はプライマー１～６に示すようなランダムプライマーとＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子に対応したプライマーを用いたＴＡＩＬ－ＰＣＲ法を行うことにより得た。
プライマー１：５’－ｎｔｃｇａｓｔｗｔｓｇｗｇｔｔ－３’　（配列番号７）
プライマー２：５’－ｎｇｔｃｇｔｓｗｇａｎａｗｇａａ－３’　（配列番号８）
プライマー３：５’－ｗｇｔｇｎａｇｗａｎｃａｎａｇ－３’　（配列番号９）
プライマー４：５’－ｓｔｔｎｔａｓｔｎｃｔｎｔｇｃ－３’　（配列番号１０）
プライマー５：５’－ｓｓｔｇｇｓｔａｎａｔｗａｔｗｃｔ－３’　（配列番号１１）
プライマー６：５’－ａｇｗｇｎａｇｗａｎｃａｎａｇａ－３’　（配列番号１２）
上記プライマーを使用して得られたＤＮＡ断片の塩基配列を調べた結果、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのプロモーター配列が得られた。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのプロモーター配列の塩基配列を配列番号１３に示した。
上記プロモーター配列は植物プロモーター用解析データベース（Ａ　Ｄａｔｅｂａｓｅ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＤＮＡ　Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　（ＰＬＡＣＥ））（　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／）を用いて解析を行った。
解析の結果、ｂＺＩＰ型転写因子の結合（認識）サイト（ＡＣＡＣＮＮＧ）が見つかった。
（プロモーター領域の増幅）
上記遺伝子のプロモーター領域は以下の範囲をＰＣＲによって増幅した。
ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼプロモーター：－１～－１５００ｂｐ、－１～－１０００ｂｐ、－１～－５００ｂｐ
ＰＣＲ産物はｐＭＤ２０Ｔ（タカラバイオ）にクローニングし、ｐＭＤ２０Ｔ－ｈｍｇｐｒｏ（－１５００）、ｐＭＤ２０Ｔ－ｈｍｇｐｒｏ（－１０００）、ｐＭＤ２０Ｔ－ｈｍｇｐｒｏ（－５００）を構築した。挿入されたＰＣＲ産物のシークエンス解析を行うことにより変異導入がないことを確認した。
（レポーター配列結合ベクターの構築）
（プロモーター領域の増幅）で構築したプラスミドをＳｐｅＩと、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、又はＢａｍＨＩで制限処理することにより、ｐＹＥＳ３／ＣＴ　／ＬａｃＺのＴ７プロモーター領域が除かれた部位、すなわちレポーターであるｌａｃＺ遺伝子の直上に、各プロモーター配列断片を組み込み、ｐＹＥＳ３－ｈｍｇｐｒｏｌａｃＺ（－１５００）、ｐＹＥＳ３－ｈｍｇｐｒｏｌａｃＺ（－１０００）、ｐＹＥＳ３－ｈｍｇｐｒｏ（－５００）を構築した。ライゲーションはＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。
（酵母染色体への遺伝子導入ベクターの構築）
（レポーター配列結合ベクターの構築）で構築したプラスミドのＳｐｅＩサイトからＣＹＣ１　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌまでをＰＣＲで増幅し、その断片をＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、又はＳｐｈＩで制限酵素処理を行うことにより、各種プロモーター配列とｌａｃＺ遺伝子を連結させたＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を酵母の染色体上に挿入するため、同じく制限酵素処理したｐＡＵＲ１０１　ＤＮＡ（タカラバイオ）に組み込み、ｐＡＵＲ１０１－ｈｍｇｐｒｏｌａｃＺ（－１５００）　ｐＡＵＲ１０１－ｈｍｇｐｒｏｌａｃＺ　（－１０００）、ｐＡＵＲ１０１－ｈｍｇｐｒｏ（－５００）を構築した。ライゲーションは先ほど同様Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　ｖｅｒ．２を用いて行った。
（転写因子遺伝子の獲得）
次に、シロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーを鋳型にし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲによりＡｔ５ｇ２４８００（ＢＺＩＰ９）（配列番号１）、Ａｔ３ｇ５８１２０（ＢＺＩＰ６１）（配列番号３）の２種類のＰＣＲ断片が得られた。得られたＰＣＲ産物はｐＭＤ２０Ｔにクローニングし、ｐＭＤ２０Ｔ－ＢＺＩＰ９、ｐＭＤ２０Ｔ－ＢＺＩＰ６１を構築した。挿入されたＰＣＲ産物のシークエンス解析を行うことにより変異導入がないことを確認した。
（転写因子発現ベクターの構築）
（転写因子遺伝子の獲得）で構築したプラスミドをＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、又はＥｃｏＲＶで制限処理することにより、ｐ４２７ＴＥＦ　（コスモバイオ）のＴＥＦ１プロモーター領域の下流に、各転写因子遺伝子を組み込み、ｐＴＥＦ－ＢＺＩＰ９、ｐＴＥＦ－ＢＺＩＰ６１を構築した。ライゲーションはＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　ｖｅｒ．２を用いて行った。
（酵母の形質転換）
（酵母染色体への遺伝子導入ベクターの構築）と（転写因子発現ベクターの構築）において構築したプラスミドはエレクトロポレーション法を用いることにより酵母（ＢＹ４７４１株）に導入した。遺伝子導入酵母の選別は抗真菌抗生物質であるＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ　Ａ（タカラバイオ）とＧ４１８（和光純薬工業）を含む培地上で酵母を培養することで行った。
（転写因子の効果確認）
形質転換酵母をＸ－ｇａｌを含む培地上で培養することにより、転写因子活性によるｌａｃＺの発現を調査した。具体的には、プロモーター配列につながれたレポーター遺伝子であるｌａｃＺが発現すると、培地に含まれるＸ－ｇａｌが分解されて青色を呈するため、青色を呈した場合に、転写因子活性によりｌａｃＺが発現したと判断した。１０回試験を行い、転写因子活性によりｌａｃＺが発現した回数を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
表１より、Ａｔ５ｇ２４８００（ＢＺＩＰ９）（配列番号１，２）、Ａｔ３ｇ５８１２０（ＢＺＩＰ６１）（配列番号３，４）（特に、Ａｔ５ｇ２４８００（ＢＺＩＰ９））を用いることでレポーター遺伝子の活性が増加することがわかった。更に、プロモーター領域の配列が長いほどレポーター遺伝子の活性が発現した回数が多い、すなわち、Ａｔ５ｇ２４８００（ＢＺＩＰ９）、Ａｔ３ｇ５８１２０（ＢＺＩＰ６１）の結合サイトの数が多いプロモーター配列ほどレポーター遺伝子の活性が発現した回数が多いことから、Ａｔ５ｇ２４８００（ＢＺＩＰ９）、Ａｔ３ｇ５８１２０（ＢＺＩＰ６１）が、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの転写因子として機能することが立証された。このことからＡｔ５ｇ２４８００（ＢＺＩＰ９）、Ａｔ３ｇ５８１２０（ＢＺＩＰ６１）（特に、Ａｔ５ｇ２４８００（ＢＺＩＰ９））をイソプレノイド産生植物に導入することにより、ＭＶＡ経路によるＩＰＰ生合成の律速部位が増強され、ポリイソプレノイドの生合成経路を好適に増強でき、ポリイソプレノイドの産出量を好適に増加させることができることが裏付けられた。
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：シロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ９をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２：シロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ９のアミノ酸配列
配列番号３：シロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ６１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号４：シロイヌナズナ由来のＢＺＩＰ６１のアミノ酸配列
配列番号５：パラゴムノキ由来のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号６：パラゴムノキ由来のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列
配列番号７：プライマー１
配列番号８：プライマー２
配列番号９：プライマー３
配列番号１０：プライマー４
配列番号１１：プライマー５
配列番号１２：プライマー６
配列番号１３：パラゴムノキ由来のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのプロモーター配列の塩基配列

Claims (9)

  1. ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現をｂＺＩＰ型転写因子により調整する方法。
  2. 前記ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、前記ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現を調整する請求項１に記載の方法。
  3. 前記遺伝子が、以下の［１］又は［２］に記載のＤＮＡである請求項２に記載の方法。
    ［１］配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡ
    ［２］配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
  4. ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの発現を増強する方法である請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記ｂＺＩＰ型転写因子が、以下の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質である請求項１～４のいずれかに記載の方法。
    ［１］配列番号２，４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
    ［２］配列番号２，４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ転写因子活性を有する蛋白質
    ［３］配列番号２，４のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ転写因子活性を有する蛋白質
  6. 前記宿主がイソプレノイド産生植物である請求項２又は３に記載の方法。
  7. ｂＺＩＰ型転写因子をコードする遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物。
  8. 前記遺伝子が、以下の［１］又は［２］に記載のＤＮＡである請求項７に記載のイソプレノイド産生植物。
    ［１］配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡ
    ［２］配列番号１，３のいずれかの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
  9. 請求項７又は８に記載のイソプレノイド産生植物を用いたポリイソプレノイドの製造方法。
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