JP2000050884A - 向上したイソプレノイドの生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、イソプレノイドの生産性を向上さ
せることを課題とする。 【解決手段】 本発明により、メバロン酸経路またはイ
ソペンテニルピロリン酸からファルネシルピロリン酸へ
の経路に関与する酵素をコードする単離DNA配列、該DNA
配列を含むベクターまたはプラスミド、該DNA、または
ベクターまたはプラスミドのいずれかによって形質転換
された宿主、および該形質転換宿主細胞を利用したイソ
プレノイドおよびカロテノイドの製造法が提供された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、イソプレノイドの
製造を目的とする分子生物学およびそれに有用な生物学
的物質に関する。

【０００２】

【従来の技術】アスタキサンチンは、動物（例えば、フ
ラミンゴおよび紅色トキのような鳥類、ならびにニジマ
スおよびサケのような魚類）、藻類および微生物のよう
な、非常に多様な生物に存在することが知られている。
また、アスタキサンチンは酸素ラジカルに対する強力な
抗酸化特性を有することが知られており、ガンのような
いくつかの病気から、生細胞を守るための薬学的用途に
応用することが期待されている。さらに、産業上の応用
の観点からみると、アスタキサンチンは動物を明瞭なオ
レンジレッドに染色し、市場での消費者の要望に応える
ことから、染色試薬としてのアスタキサンチンの需要
が、サケのような養殖魚産業で特に増加している。

【０００３】Phaffia rhodozymaは、アスタキサンチン
を特異的に生成するカロテノイド生成酵母として知られ
ている。他のカロテノイド生成酵母であるRhodotorula
種と異なり、Phaffia rhodozyma (P. rhodozyma)は、D-
グルコースのようないくつかの糖を発酵させることがで
きる。この点は、産業上の応用の観点からみて、重要な
特徴である。最近の分類学的研究において、P. rhodozy
maの性周期が示され、その優性世代はXanthophyllomyce
s dendrorhousと命名された。（W.I. Golubev;Yeast 1
1, 101-110, 1995）。P. rhodozymaからアスタキサンチ
ンの高産出株を得るための菌株改良研究が行われてきた
が、ここ10年間は、そのような試みは通常の突然変異誘
発法およびプロトプラスト融合法を利用することに限定
されていた。最近、WeryらはP. rhodozymaのゲノムの複
数コピー存在するリボゾームDNAの遺伝子座に、複製で
きないプラスミドを組み込んだP. rhodozymaを利用した
宿主ベクター系を開発した(Weryら, Gene, 184, 89-97,
1997)。また、Verdoesらは、P. rhodozymaの形質転換
体および、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ-カロテ
ンへの反応を触媒する酵素をコードするP. rhodozymaの
3つのカロテノイド生成遺伝子と共に、さらに改良され
たベクターを報告した（国際公開公報第97/23633号）。
近い将来、これまでの方法による限界に達した生産性を
打破するために、P. rhodozymaの菌株改良研究において
遺伝子工学の方法の重要性が増すと考えられる。

【０００４】一般的な代謝物であるアセチル補酵素Aか
らのカロテノイド生成経路は、カロテノイド生成真核生
物では、図1で示すような複数の酵素反応過程から構成
されることが報告されている。2分子のアセチル補酵素A
は縮合して、3-ヒドロキシルメチル-3-グルタリル補酵
素A合成酵素の働きにより、3-ヒドロキシ-3-メチルグル
タリル補酵素A(HMG-CoA)に変換されるアセトアセチル補
酵素Aを生成する。次に、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタ
リル補酵素A還元酵素により、HMG-CoAはメバロン酸に変
換され、このメバロン酸にその後2分子のリン酸基が2種
類のキナーゼ（メバロン酸キナーゼおよびホスホメバロ
ン酸キナーゼ）の働きにより付加される。次にメバロン
酸ピロリン酸は、メバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素の働
きにより脱炭酸化され、イソペンテニルピロリン酸（IP
P）が生成する。この物質は生物に必要な、多様性に富
んだイソプレン分子の構成体となる。この経路は、重要
な中間体であるメバロン酸から由来して、メバロン酸経
路と呼ばれる。IPPは、IPPイソメラーゼの働きにより、
ジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）に異性化される。
次にIPPおよびDMAPPは、ヘッドトゥテイル縮合によりC
₁₀単位であるゲラニルピロリン酸（GPP）へと変換され
る。GPPとIPPとの同様な縮合反応により、GPPはC₁₅単位
であるファルネシルピロリン酸（FPP）へと変換され
る。この物質は動物におけるコレステロールおよび酵母
におけるエルゴステロールの重要な基質であり、かつRA
Sタンパク質のような調節タンパク質のファルネシル化
の重要な基質である。一般に、IPPおよびDMAPPからのGP
PおよびFPPの生合成は、FPP合成酵素(Laskovicsら, Bio
chemistry, 20, 1893-1901, 1981)と呼ばれる一つの酵
素により触媒される。一方、真正細菌のような原核生物
では、イソペンテニルピロリン酸は、酵母や動物には存
在しないピルビン酸から1-デオキシキシルロース-5-リ
ン酸を経由した異なった経路によって合成された(Rohme
rら, Biochem. J., 295, 517-524, 1993)。コレステロ
ール生合成専門の研究では、コレステロール代謝の律速
段階が、このメバロン酸経路の段階であり、特にHMG補
酵素A合成酵素およびHMG補酵素A還元酵素により触媒さ
れる、その経路の初期段階であることが示された。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、イソプレノ
イドの生産性を向上させることを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、コレステ
ロールおよびカロテノイドの生合成経路が、アセチル補
酵素AからFPPへの中間経路を共有することに注目し、カ
ロテノイド生成経路における律速段階を改良しようと試
みた。その経路はメバロン酸経路の段階に存在するもの
と考えられ、特にアスタキサンチンのようなカロテノイ
ドの生産性を向上させるためのHMG補酵素A合成酵素およ
びHMG補酵素A還元酵素によって触媒される段階などにみ
られる初期メバロン酸経路に存在するものと考えられ
る。

【０００７】本発明者らの上記の努力に基づいて、本発
明は考案された。本発明により、アスタキサンチン生成
過程の改良に有用な生物材料である、アセチル補酵素A
からFPPへのメバロン酸経路に含まれる遺伝子および酵
素が提供される。本発明は、HMG補酵素A合成酵素、HMG
補酵素A還元酵素、メバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピ
ロリン酸脱炭酸酵素およびFPP合成酵素をコードする遺
伝子のクローニングおよび同定を含む。また本発明は、
大腸菌のような適した宿主菌中での、その遺伝子の発現
の結果として明らかになる酵素的特徴の解明を含む。こ
れらの遺伝子は、P.rhodozymaのような適した宿主中で
増幅され、カロテノイド生成の効果は、適当な培養条件
のもとで適当な培養液で培養した形質転換体などによっ
て、確認することができる。

【０００８】本発明に従い、メバロン酸経路またはイソ
ペンテニルピロリン酸からファルネシルピロリン酸へ
の、反応経路に関与する酵素をコードする単離されたDN
A配列が提供される。さらに明確に言えば、該酵素は、3
-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-補酵素A合成酵素活
性、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-補酵素A還元酵
素活性、メバロン酸キナーゼ活性、メバロン酸ピロリン
酸脱炭酸酵素活性およびファルネシルピロリン酸合成酵
素活性から成る群より選択される活性を有する酵素であ
る。

【０００９】単離された該DNA配列は、次の点でさらに
明確に特徴付けられる： (a) 配列番号：6、7、8、9、および10に記載した配列か
らなる群より選択されるアミノ酸配列を有する該酵素を
コードするか、または(b) (i)アリル変異体、および(i
i)1つ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失、および/また
は置換されており、かつ記述された酵素活性を有する酵
素から選択される該酵素の変異体をコードする。特に、
上記の明示された単離DNA配列は、Phaffia rhodozymaの
遺伝子に由来し、かつ(i)配列番号：1、2、4または5で
示されたDNA配列、(ii) 配列番号：1、2、4または5に記
載のDNA配列のアイソコード変異体またはアリル変異
体、および(iii) 1つ以上のヌクレオチドが付加、挿
入、欠失、および/または置換された、配列番号：1、
2、4または5で示した、該酵素活性を有するポリペプチ
ドをコードするDNA配列の誘導体から選択される配列で
ある。これらの誘導体は、当技術分野で公知の方法、例
えばSambrookらによって記された方法（Molecular Clon
ing, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New Yor
k, USA second edition 1989）によって、本明細書に記
載されたDNA配列を基にして組換え技術により作製でき
る。概して活性を変化させずにタンパク質およびペプチ
ドのアミノ酸を改変する方法については、当技術分野で
公知であり、例えばH. NeurathおよびR. L. Hillによっ
て記された書「The Proteins」に記載されている(Acade
mic Press, New York, 1979, 特に図6、14ページ参
照)。最も一般的に行われている改変は次のようなもの
である：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gl
y、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Al
a/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Gl
u、Asp/Gly、これらの逆も同様である。

【００１０】本発明により、(i)配列番号：3で示したDN
A配列、(ii) 配列番号：3で示したDNA配列のアイソコー
ド変異体またはアリル変異体、および(iii) 1つ以上の
ヌクレオチドが付加、挿入、欠失、および/または置換
されており、メバロン酸キナーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする配列番号：3で示すDNA配列の誘導体か
ら選択される単離DNA配列もまた提供される。

【００１１】さらに、本発明は、上記の、例えば配列表
に開示されているDNA配列、ならびにその相補鎖、また
は該配列もしくはその断片と標準的な条件下でハイブリ
ダイズするDNA配列、および遺伝コード縮退のため標準
的な条件下で該配列とハイブリダイズしないが完全に同
一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDN
A配列を含むDNA配列を目的とする。

【００１２】本明細書においてハイブリダイゼーション
の「標準的な条件」とは、特異的なハイブリダイゼーシ
ョンシグナルを検出するために当業者によって一般的に
行われる条件で、例えばSambrookらによってCold Sprin
g Harbour Laboratory Press1989, New York 「Molecul
ar Cloning」第二版に記されている条件を意味する。ま
た好ましくは、いわゆるストリンジェントなハイブリダ
イゼーションおよび非ストリンジェントな洗浄条件、よ
り好ましくは、当業者が慣れ親しんでおり、例えばSamb
rookら(前記)に記載されているいわゆるストリンジェン
トなハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな
洗浄条件を意味する。さらに、当技術分野で公知の方法
により、本明細書で開示されたDNA配列に基き設計され
たプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により作製
されるDNA配列もまた、本発明の目的である。本発明のD
NA配列は、例えば欧州特許第747483号に記載されている
ように合成により作製することもできる。

【００１３】さらに本発明により、組換えDNA、好まし
くは、メバロン酸経路または、イソペンテニルピロリン
酸からファルネシルピロリン酸への反応経路で機能する
酵素をコードする配列を含むベクターおよび/またはプ
ラスミドが提供される。該組換えDNAベクターおよび/ま
たはプラスミドは、上記したDNAのオープンリーディン
グフレーム同様プロモーターおよびターミネーターのよ
うな調節領域を含み得る。

【００１４】本発明により、宿主生物への形質転換のた
めの該組換えDNA、ベクターまたはプラスミドの使用が
提供される。組換えDNAの使用によって得られた組換え
生物は、メバロン酸経路または、イソペンテニルピロリ
ン酸からファルネシルピロリン酸への反応経路に関与す
る酵素をコードするDNA配列を、過剰に発現することが
できる。組換えDNAで形質転換された宿主生物は、イソ
プレノイドおよびカロテノイド、特にアスタキサンチン
の製造過程の改良に有用であると考えられる。このよう
に本発明により、組換え生物/形質転換宿主なども提供
される。

【００１５】本発明はさらに、このようにして得られた
組換え生物を培養することを含む、イソプレノイドまた
はカロテノイド、好ましくはカロテノイドの製造法を提
供する。

【００１６】本発明は、メバロン酸経路またはイソペン
テニルピロリン酸からファルネシルピロリン酸への反応
経路に関与する酵素の製造法であって該酵素が製造され
るような条件下で上記の組換え生物を培養することを含
む方法に関し、また該酵素自体にも関する。

【００１７】本発明は、添付の図面および下記のより詳
細なる説明に基づいて、さらに容易に理解されると思わ
れる。

【００１８】本発明により、メバロン酸経路またはイソ
ペンテニルピロリン酸からファルネシルピロリン酸への
反応経路から成る生物的経路に関与する酵素をコードす
る単離DNA配列が提供される。該酵素は、P. rhodozyma
においてメバロン酸経路またはイソペンテニルピロリン
酸からファルネシルピロリン酸への反応経路に関与する
酵素、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-補酵素A合成
酵素、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-補酵素A還元
酵素、メバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸脱炭
酸酵素およびファルネシルピロリン酸合成酵素などを例
とすることができる。本発明は、メバロン酸経路から、
カロテノイド生成経路への生物的経路に関与する化合物
の製造、および該化合物からの多様な誘導体の製造にと
って有用である。メバロン酸経路に関わる化合物には、
アセトアセチル補酵素A、3-ヒドロキシメチル-3-グルタ
リル-補酵素A、メバロン酸、メバロン酸リン酸、メバロ
ン酸ピロリン酸、およびイソペンテニルピロリン酸が含
まれる。その後イソペンテニルピロリン酸は、図1に示
すように「イソプレン生合成」反応により、ゲラニル-
ピロリン酸およびファルネシルピロリン酸を経由して、
ゲラニルゲラニル-ピロリン酸へと変換される。カロテ
ノイド生成経路に関与する化合物は、ゲラニルゲラニル
-ピロリン酸、フィトエン、リコペン、β-カロテンおよ
びアスタキサンチンである。上記した生合成に関連した
化合物の中で、ゲラニル-ピロリン酸は、ユビキノンの
製造に利用できる。ファルネシルピロリン酸は、コレス
テロールおよびエルゴステロールのようなステロールの
製造に利用できる。ゲラニルゲラニル-ピロリン酸は、
ビタミンK、ビタミンE、クロロフィルおよびその他の製
造のための有用な物質である。このように本発明は、イ
ソプレノイドの生物学的製造に応用する場合、特に有用
であると考えられる。イソプレノイドは、骨格単位とし
てイソペンテニルピロリン酸を有する一連の化合物を集
合的に定義した、一般的な名称である。イソプレノイド
のさらなる例として、ビタミンAおよびビタミンD₃が挙
げられる。

【００１９】本発明の該DNAは、5’末端および3’末端
の非翻訳領域にある短い断片に挟まれたオープンリーデ
ィングフレームのみを含むcDNA、ならびに目的の遺伝子
の発現に必要なプロモーターおよびターミネーターのよ
うな調節配列をも含むゲノムDNAも指している。

【００２０】一般に遺伝子は、お互いに異なった機能を
持ついくつかの部分から構成されている。真核生物で
は、リボゾームRNA(rRNA)、微小核RNA(snRNA)およびト
ランスファーRNA(tRNA)の遺伝子とは異なり、相当する
タンパク質をコードする遺伝子は、未成熟メッセンジャ
ーRNA(pre-mRNA)に転写される。RNAポリメラーゼII(Pol
II)は、この転写において中心的役割をしているが、プ
ロモーターを含む上流域、および上流活性化配列（UA
S）を含むシスエレメント、ならびにトランス作用タン
パク質ファクターなしで、PolIIは単独で転写を始める
ことはできない。最初に、いくつかの基礎タンパク質成
分からなる転写開始複合体は、発現する遺伝子の5’側
に隣接した領域にあるプロモーター配列を認識する。こ
の過程で、熱ショック応答、または栄養飢餓への適応な
どのある特別な調節の下で発現される遺伝子の場合、い
くつかの付加的に動員される物質が必要である。そのよ
うな場合、UASがプロモーター配列の周辺にある5’末端
非翻訳上流域に存在する必要があり、ポジティブまたは
ネガティブ調節タンパク質は、UASを認識し結合する。
転写開始複合体のプロモーター配列への結合強度は、プ
ロモーター周辺のトランス作用ファクターの結合のよう
なものに影響され、このことにより転写活性の調節が可
能となる。

【００２１】リン酸化による転写開始複合体の活性化
後、転写開始複合体は転写開始点から転写を開始する。
転写開始複合体のいくつかの部分は、プロモーター領域
から遺伝子の3’方向へ分離して伸長複合体となり（こ
の段階は、プロモータークリアランスと呼ばれる）、伸
長複合体は遺伝子の3’側の下流域に位置する終結配列
へ到達するまで、転写を続ける。このようにして生成し
た前駆mRNAは核において、転写開始部位にほぼ相当する
キャップサイトでのキャップ構造の付加により、修飾さ
れる。そして、3’側の下流域に位置するポリAシグナル
部位で伸長したポリAの付加により修飾される。次に、
イントロン構造はコード領域から除かれ、エキソン部分
は結合し、相当するタンパク質の一次アミノ酸配列に相
当するオープンリーディングフレームが生成される。成
熟mRNAが生成されるこの修飾は安定な遺伝子の発現に必
要である。一般的な意味でcDNAは、この成熟mRNA配列か
ら逆転写されたDNA配列に相当する。cDNAは、実験的に
成熟mRNAを鋳型として用い、ウイルス種に由来する逆転
写酵素によって合成される。

【００２２】真核生物に由来する遺伝子を発現させるた
めに、cDNAを大腸菌の発現ベクターへクローニングする
方法は、本発明で示すようにしばしば利用される。これ
は、イントロン構造の特異性が、生物によって異なると
いうこと、および他種からはイントロン配列を認識でき
ない事が、原因となっている。実際、原核生物は、それ
自体の遺伝的背景において、イントロン構造を持たな
い。酵母でさえ、遺伝的背景は、Saccharomyces cerevi
siaeが属する子嚢菌類と、P. rhodozymaが属する担子菌
類とで異なる。Weryらは、P. rhodozymaのアクチン遺伝
子のイントロン構造は、Saccharomyces cerevisiaeのよ
うな子嚢菌類では、認識もスプライシングも起こらない
ことを示した(Yeast, 12, 641-651, 1996)。

【００２３】いくつかの種類の遺伝子のイントロン構造
は、遺伝子の発現の調節に関係していることが、他の研
究者らによりいくつか報告されている(Dabeva, M. D.
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 5854, 198
6)。イントロン構造が、それ自体の遺伝子発現の調節に
働く目的の遺伝子の自己クローニングの場合、イントロ
ンを持つゲノム断片を利用することは重要であると考え
られる。

【００２４】菌株改良研究のための遺伝子工学法を応用
するために、転写や翻訳といった現象の遺伝的機構を研
究することは必要である。遺伝的機構の研究のために、
UAS、プロモーター、イントロン構造、およびターミネ
ーターといった遺伝子配列を決定することは重要であ
る。

【００２５】本発明により、メバロン酸経路に関する酵
素をコードする遺伝子が、P. rhodozymaのゲノムDNAか
らクローニングされ、5’および3’末端近傍領域を含む
HMG補酵素A合成酵素(hmc)遺伝子、およびHMG補酵素A還
元酵素(hmg)遺伝子、メバロン酸キナーゼ(mvk)遺伝子、
メバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素(mpd)遺伝子、およびF
PP合成酵素(fps)遺伝子を含むゲノム配列、ならびにイ
ントロン構造が決定された。

【００２６】はじめに本発明者らは、hmc遺伝子、hmg遺
伝子、mvk遺伝子、mpd遺伝子、およびfps遺伝子の一部
を含む部分的な遺伝子断片を、デジェネレートPCR法に
よりクローニングした。該デジェネレートPCRは、同一
または類似の機能を有する他の種の既知の酵素とのアミ
ノ酸配列相同性が高い目的の遺伝子をクローニングする
方法である。デジェネレートPCRで使用されるプライマ
ーであるデジェネレートプライマーは、アミノ酸配列の
相当するヌクレオチドへの逆翻訳によって設計された
（「デジェネレーテッド」）。このようなデジェネレー
トプライマーでは、A、C、GもしくはTのいずれかから成
る混合プライマー、または多義コード部分においてイノ
シンを含むプライマーが一般的に使用される。本発明で
は、上記の遺伝子をクローニングするために、デジェネ
レートプライマーには混合プライマーが用いられた。使
用したPCRの条件は、本明細書に後記するように、クロ
ーンに対するプライマーおよび遺伝子に応じて異なる。

【００２７】プロモーターまたはターミネーターのよう
な調節領域同様、イントロンを有するコード領域を含む
完全な遺伝子は、上記のようにデジェネレートPCRによ
って得られた部分的なDNA断片を、ラベルした後プロー
ブとして用いることにより、適当な宿主中のファージベ
クターまたはプラスミドベクターとして構築されたゲノ
ムライブラリーの選択によって染色体からクローニング
できる。一般に、宿主菌として大腸菌、および大腸菌ベ
クター、λファージベクターのようなファージベクタ
ー、またはpUCベクターのようなプラスミドベクター
は、ライブラリーの構築、およびその後の配列決定、制
限酵素処理、ライゲーション等の遺伝子操作でよく用い
られる。本発明では、P. rhodozymaのEcoRIゲノムライ
ブラリーは、インサートのサイズに依存して、λベクタ
ー、λZAPIIおよびλDASHIIの誘導体により構築され
た。クローニングされるインサートサイズは、ライブラ
リーの構築の前に、それぞれの遺伝子に対するサザンブ
ロットハイブリダイゼーションによって決定された。本
発明では、プローブとして使用されるDNAは、供給会社
（ベーリンガーマンハイム）によって調製されたプロト
コールに従って、通常の³²Pの代わりにステロイドハプ
テンであるジゴキシゲニン（DIG）でラベルされた。P.
rhodozymaの染色体から構築されたゲノムライブラリー
は、目的の遺伝子の一部を持つDIGでラベルされたDNA断
片をプローブとして用いて選択された。ハイブリダイズ
したプラークを拾い、その後の研究に用いた。λDASHII
（インサートサイズは9kbから23kb）を利用する場合、
調製したλDNAは、EcoRIで消化し、つぎにpUC19またはp
BluescriptII SK+のようなプラスミドベクターへ、EcoR
Iインサートのクローニングを行った。λZAPIIをゲノム
ライブラリーの構築に用いる場合、インビボの切り出し
プロトコールが、一本鎖M13ファージの誘導体であるEx
アシストファージ（ストラタジーン）を用いることによ
り、その後プラスミドベクターへのクローニングの段階
に、便宜的に利用される。このようにして得られたプラ
スミドDNAについて、塩基配列決定を行った。

【００２８】本発明では、Taq DNAポリメラーゼがたい
ていの塩基配列決定に用いられるオートサイクル塩基配
列決定プロトコールを利用して、自動蛍光DNAシーケン
サー、ALFredシステム（ファルマシア）を使用した。

【００２９】ゲノム塩基配列の決定の後、コード領域の
配列は、相当する遺伝子のcDNAのクローニングのために
利用された。PCR法も、cDNA断片のクローニングのため
に利用した。オープンリーディングフレーム（ORF）の
5’および3’末端の配列と同一の配列であるPCRプライ
マーは、適当な制限部位が付加されるように合成され、
これらのPCRプライマーを用いてPCRを実行した。本発明
では、cDNAプールを、このPCRでのcDNAのクローニング
における鋳型として用いた。該cDNAプールは、P. rhodo
zymaから得られるmRNAを鋳型として用いて、ウイルス由
来の逆転写酵素およびTaqポリメラーゼ（クロンテック
によって製造されたCapFinder Kitを使用）により、イ
ンビトロで合成された種々のcDNAから構成される。この
ようにして得られた目的のcDNAは、その塩基配列によっ
て確認された。さらに、lacまたはT7発現系のような強
力なプロモーター活性の支配下で、大腸菌で機能する発
現ベクターへのcDNA断片のクローニングの後、このよう
にして得られたcDNAは、その酵素活性の確認に利用し
た。

【００３０】酵素活性の確認に続いて、発現したタンパ
ク質は精製され、精製された酵素に対する抗体の作製に
用いられる。このようにして調製された抗体は、菌株改
良研究、培養条件の最適化などの研究において、相当す
る酵素の発現の特徴を明らかにすることに利用できると
考えられる。

【００３１】酵素反応の複数の段階から成る生合成経路
における律速段階の決定後、そのゲノム配列を用いるこ
とによって、律速段階の反応の酵素活性を上昇させる3
つの戦略がある。

【００３２】1つの戦略は、その遺伝子自体をそのまま
の形で利用するというものである。最も簡単なアプロー
チは、プロモーターおよびターミネーターのような調節
配列を含むゲノム配列を増幅することである。P. rhodo
zymaで機能する選択マーカーを持つ適当なベクターへ
の、目的の酵素をコードするゲノム断片のクローニング
により実現する。毒性のある抗生物質の存在下で、宿主
が生育できるようにする酵素をコードする薬剤耐性遺伝
子は、選択マーカーとして、よく利用される。pGB−Ph9
上にあるG418耐性遺伝子（Weryら、Gene 184, 89-97, 1
997）は、薬剤耐性遺伝子の一例である。栄養相補マー
カーは、適当な栄養要求マーカーを持つ宿主において用
いられる。シチジンを生育に必要とするP. rhodozyma A
TCC24221は、栄養要求株の一例である。ATCC24221に対
するドナーDNAとしてCTP合成酵素を用いることにより、
栄養相補を利用した宿主ベクター系を確立することがで
きる。ベクターとして、2種類のベクターを用いられ
る。そのうちの1つのベクターは、自律複製配列を持た
ないインテグレートベクターである。上記のpGB−Ph9
は、このタイプのベクターの一例である。そのようなベ
クターは、ベクター上に自律複製配列を持たないため、
上記のベクターは自律複製できず、ベクターと染色体と
の間の相同配列間で起こる単交差組換えの結果として生
じる宿主染色体に組み込まれた形でしか、存在できな
い。染色体上に組み込まれる遺伝子の数を増やす場合、
遺伝子の増幅は、薬剤耐性マーカーのようなものを利用
して行うことができる。相当する薬剤の選択培地中の濃
度を上昇させることにより、組換えの結果、組み込まれ
た遺伝子が染色体上で増幅した株のみ、生育することが
できる。そのような選択を利用することにより、増幅し
た遺伝子を持つ株を選ぶことができる。別の種類のベク
ターは、自律複製配列を持つ複製可能なベクターであ
る。そのようなベクターは多コピーで存在し、したがっ
て含まれる遺伝子の量も、多コピーの状態で存在する。
そのような戦略を利用することにより、増幅した遺伝子
によってコードされる目的の酵素を、過剰発現させるこ
とが期待できる。

【００３３】目的の酵素を過剰発現させる別の戦略は、
目的の遺伝子を強力なプロモーターの下流に置くことで
ある。このような戦略では、遺伝子のコピー数は必ずし
も多コピーである必要はない。この戦略は、プロモータ
ー活性が適当な生育期、および適当な培養の時期におい
て上昇するような、適当なプロモーターの支配下におく
ことで、目的の遺伝子を過剰発現させるためにも応用さ
れる。アスタキサンチンの生産は、二次代謝物の生産の
場合のように、遅い生育期において加速する。したがっ
て、カロテノイド生成遺伝子の発現は、遅い生育期にお
いて最高になると考えられる。そのような期間では、た
いていの生合成酵素の遺伝子発現は低下する。例えば、
メバロン酸経路に関連する酵素をコードする遺伝子のよ
うな増殖期プロモーター（vegetative promoter）の支
配下で発現するアスタキサンチン前駆体の生合成に関与
した遺伝子を、カロテノイド生成遺伝子のプロモーター
の下流に置くことで、アスタキサンチンの生合成に関与
する全ての遺伝子は、発現の時期と段階が同調するよう
になる。

【００３４】目的の酵素を過剰発現するための別の戦略
は、その調節エレメントの変異の誘導である。この目的
のために、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラー
ゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子等
の、あるレポーター遺伝子は目的の遺伝子のプロモータ
ー配列とターミネーター配列との間に挿入され、その
際、プロモーター、ターミネーターおよびレポーター遺
伝子を含む全ての部分が融合し、互いに機能し合う。該
レポーター遺伝子が染色体またはベクターに導入された
P. rhodozymaの形質転換体は、目的の遺伝子のプロモー
ター領域中の変異を誘導するために、インビボで変異誘
発される。変異はレポーター遺伝子によってコードされ
る活性の変化を検知することにより測定できる。もし変
異が、遺伝子のシスエレメントで起こっている場合、変
異部位は、変異遺伝子の回復および配列決定によって決
定できる。決定した変異は、元のプロモーター配列と、
変異配列との間の組換えによって染色体のプロモーター
領域へ導入される。同様な方法により、トランス作用フ
ァクターをコードする遺伝子に起こる変異もまた、得る
ことができる。これも目的の遺伝子の過剰発現に影響が
ある。

【００３５】プロモーター領域のシスエレメントのイン
ビトロ変異誘発によって、変異を誘導することもでき
る。このアプローチでは、5’末端に目的の遺伝子に由
来するプロモーター領域、および3’末端に目的の遺伝
子に由来するターミネーター領域が融合したレポーター
遺伝子を含む遺伝子カセットを、変異誘発し、次にP. r
hodozymaへ導入する。レポーター遺伝子の活性の違いを
検出することにより、効果的な変異をスクリーニングす
ることができる。そのような変異は、インビボの変異導
入の場合と同じ方法で、染色体上の本来のプロモーター
領域の配列に導入できる。

【００３６】ドナーDNAとして、メバロン酸経路の酵
素、またはFPP合成酵素をコードする遺伝子は、単独で
導入される、またはプラスミドベクター上に乗るように
して一緒に導入することが可能であろう。もともとの配
列と同一なコード配列は、1つ以上のアミノ酸が付加、
欠失、および/または置換されているアリル変異体同
様、相当する酵素が安定な酵素活性を持つ限り利用でき
る。そしてそのようなベクターは、P. rhodozymaへ形質
転換によって導入でき、形質転換体は、pGB-Ph9をベク
ターとする場合にはジェネチシンを含むYPD寒天培地ま
たは栄養要求株ATCC24221をレシピエントとして使う場
合にはシチジンを欠く最小寒天培地のような適当な選択
培地上に、形質転換した細胞を播くことにより選択する
ことができる。

【００３７】そのような遺伝子的に処理されたP. rhodo
zymaを、適当な培地で培養し、アスタキサンチンの生産
性を評価する。このようにして選択されたアスタキサン
チンの高生産株は、その生産性と遺伝子工学によって導
入された遺伝子またはタンパク質の発現のレベルとの関
係をみて、確かめることができると思われる。

【００３８】本発明に係る単離DNA配列においては、
（１）メバロン酸経路、またはイソペンテニルピロリン
酸からファルネシルピロリン酸への経路に関連する酵素
をコードする単離DNA配列であることを特徴とする。

【００３９】また、本発明に係る単離DNA配列において
は、（２）酵素が3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-補
酵素A合成酵素活性、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル
-補酵素A還元酵素活性、メバロン酸キナーゼ活性、メバ
ロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素活性、およびファルネシル
ピロリン酸合成酵素活性からなる群より選択される活性
を有する、上記（1）記載の単離DNA配列であることを特
徴とする。

【００４０】また、本発明に係る単離DNA配列において
は、（３）以下の点を特徴とする、上記（1）または
（2）記載の単離DNA配列であることを特徴とする： (a)該DNA配列が、配列番号：6、7、8、9および10に記載
の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を持つ酵
素をコードする、または(b)該DNA配列が、(i)アリル変
異体と、(ii)1つ以上のアミノ酸付加、挿入、欠失、お
よび/または置換を有し、記述された酵素活性を有する
酵素とから選択される酵素の変異体をコードする。

【００４１】また、本発明に係る単離DNA配列において
は、（４）Phaffia rhodozymaの遺伝子に由来し、以下
の（i）〜（iii）から選択される、上記（1）〜（3）の
いずれか一項記載の単離DNA配列であることを特徴とす
る： (i)配列番号：1、2、4、または5に記載のDNA配列、(ii)
配列番号：1、2、4、または5に記載のDNA配列のアイソ
コード変異体またはアリル変異体、および(iii)1つ以上
のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、および/または置
換を有し、該酵素活性を有するポリペプチドをコードす
る、配列番号：1、2、4または5に記載のDNA配列の誘導
体。

【００４２】また、本発明に係る単離DNA配列において
は、（５）以下の（i）〜（iii）から選択される単離DN
A配列であることを特徴とする： (i)配列番号：3に記載のDNA配列、(ii)配列番号：3に記
載のDNA配列のアイソコード変異体またはアリル変異
体、および(iii)1つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、
欠失、および/または置換を有し、メバロン酸キナーゼ
活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号：3
記載のDNA配列の誘導体。

【００４３】また、本発明に係る単離DNA配列において
は、（６）以下の（i）および（ii）から選択される、
上記（1）または（2）記載の単離DNA配列であることを
特徴とする： (i)配列番号：1〜10に記載の配列、またはその相補鎖も
しくは断片と、標準的な条件下でハイブリダイズするDN
A配列、および(ii)遺伝コードの縮退のために(i)で定義
されたようにハイブリダイズしないが、配列番号：1〜1
0に記載の配列と完全に同一なアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、または上記(i)によって定義されたDNA配列
によってコードされるポリペプチドをコードするDNA配
列。

【００４４】また、本発明に係るベクターまたはプラス
ミドにおいては、（７）上記（1）〜（6）のいずれか一
項記載のDNA配列を含むベクターまたはプラスミドであ
ることを特徴とする。

【００４５】また、本発明に係る宿主細胞においては、
（８）上記（1）〜（6）のいずれか一項記載のDNA配
列、または請求項7記載のベクターもしくはプラスミド
によって形質転換またはトランスフェクションされた宿
主細胞であることを特徴とする。

【００４６】また、本発明に係る製造法においては、
（９）メバロン酸経路またはイソペンテニルピロリン酸
からファルネシルピロリン酸への経路に関連する酵素を
製造する方法であって、該酵素が産生されるような条件
下で、上記（8）記載の宿主細胞を培養することを含む
方法であることを特徴とする。

【００４７】また、本発明に係る製造法においては、
（１０）適当な培養条件で上記（8）記載の宿主細胞を
培養することを含む、イソプレノイドまたはカロテノイ
ド、好ましくはアスタキサンチンの製造法であることを
特徴とする。

【００４８】

【発明の実施の形態】次に示す物質および方法が、以下
に記載した実施例において使用された。

【００４９】株 P. rhodozyma ATCC96594（この株は1998年4月8日に寄託
番号74438のブダペスト条約寄託として再寄託され
た。） 大腸菌DH5α：F^-,φ80d,lacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U16
9,hsd(r_K ^-,m_K ⁺),recA1,endA1,deoR,thi-1,supE44,gyrA9
6,relA1(Toyobo) 大腸菌XL1-Blue MRF'：Δ(mcrA)183,Δ(mcrCB-hsdSMR-m
rr)173,endA1,supE44,thi-1,recA1,gyrA96,relA1,lac
[F'proAB,lacI^qZΔM15,Tn10(tet^r)](Stratagene) 大腸菌SOLR：e14^-(mcrA),Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171,sbc
C,recB,recJ,umuC::Tn5(kan^r),uvrC,lac,gyrA96,relA1,
thi-1,endA1,λ^R,[F'proAB,lacl^qZΔM15]Su^-(非抑制性)
(Stratagene,CA,USA) 大腸菌XL1 MRA(P2)：Δ(mcrA)183,Δ(mcrCB-hsdSMR-mr
r)173,endA1,supE44,thi-1,gyrA96,relA1,lac(P2溶原
菌)(Stratagene) 大腸菌BL21(DE3)(pLysS)：dcm^-,ompTr_B ^-m_B ^-lon^-λ(DE
3),pLysS（Stratagene） 大腸菌M15(pREP4)(QIAGEN)(Zamenhof P.J.ら、J.Bacter
iol.110,171-178,1972) 大腸菌KB822：pcnB80,zad::Tn10,Δ(lacU169),hsdR17,e
ndA1,thi-1,supE44 大腸菌TOP10：F^-,mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC),φ80,Δl
acZ M15,ΔlacX74,recA1,deoR,araD139,(ara-leu)7697,
galU,galK,rpsL(Str^r),endA1,nupG(Invitrogen)

【００５０】ベクター λZAPII（Stratagene） λDASHII（Stratagene） pBluescriptII SK+（Stratagene） pUC57（MBI Fermentas） pMOSBlue Tベクター（Amersham） pET4c（Stratagene） pQE30（QIAGEN） pCR2.1TOPO（Invitrogen）

【００５１】培地 P. rhodozyma株はYPD培地（DIFCO）で通常に維持され
る。大腸菌は、LB培地（1リットルあたり、10gバクトト
リプトン、5g酵母抽出物（DIFCO）、5gNaCl）で維持さ
れた。NZY培地（1リットルあたり、5gNaCl、2gMgSO₄-7H
₂O、5g酵母抽出物（DIFCO）、10gNZアミンタイプA(Shef
field)）の軟寒天培地（0．7％寒天（WAKO））はλファ
ージの増殖に用いる。寒天培地を調製するときは、1．5
％の寒天（WAKO）を添加した。

【００５２】方法 分子遺伝学の一般的な方法は、「Molecular cloning: a
Laboratory Manual,第二版（Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, 1989年）」に従って行った。制限酵素お
よびT4DNAリガーゼはTakara Shuzo〔日本〕から購入し
た。

【００５３】P. rhodozymaからの染色体DNAの単離は、Q
IAGEN Genomic Kit (QIAGEN)を用い、製造元が提供した
プロトコールに従って行った。形質転換した大腸菌から
のプラスミドDNAのMini-prepは、自動DNA単離システム
（PI-50, Kurabo株式会社、日本）を用いて行った。大
腸菌形質転換体からのプラスミドDNAのMidi-prepは、QI
AGENカラム(QIAGEN)を用いて行った。λDNAの単離は、W
izard lambda preps DNA精製システム(Promega)を用
い、製造元のプロトコールに従って行った。アガロース
からのDNA断片の単離と精製はQIAquickまたはQIAEX II
(QIAGEN)を用いた。λファージ誘導体の操作は、製造元
(Stratagene)のプロトコールに従って行った。

【００５４】P. rhodozymaからの全RNAの単離は、Isoge
n(Nippon Gene, 日本)を用いたフェノール法によって行
った。mRNAは、このようにして得られた全RNAからmRNA
分離キット(Clontech)を利用して精製された。cDNAは、
CapFinder cDNA construction kit (Clontech)を用いて
合成された。

【００５５】インビトロパッケージングは、GigapackII
I gold packaging extract (Stratagene)を用いて行っ
た。

【００５６】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、Perkin
Elmer model 2400のサーマルサイクラーで行った。各々
のPCRの条件は実施例に記載されている。PCRプライマー
は市販の供給業者から購入、またはDNA合成機（model39
2, Applied Biosystems）によって合成した。DNA塩基配
列決定の蛍光DNAプライマーは、Pharmaciaから購入し
た。DNA塩基配列決定は、自動蛍光DNAシーケンサー(ALF
red, Pharmacia)で行った。

【００５７】コンピテントセルのDH5αは、Toyobo(日
本)から購入した。コンピテントセルのM15(pREP4)は、S
ambrookら(Molecular Cloning : a Laboratory Manual,
第二版, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989
年)により記載されたCaCl₂法により調製した。

【００５８】

【実施例】実施例１．P. rhodozymaからのmRNAの単離お
よびcDNAライブラリーの構築 P. rhodozymaからcDNAライブラリーを構築するために、
全RNAを、細胞破壊の直後、フェノール抽出法によって
分離し、P. rhodozyma ATCC96594株からのmRNAを、mRNA
分離キット（Clontech）を用いて精製した。

【００５９】はじめに、YPD培地で2日間培養した10mlか
らATCC96594株の細胞を、遠心分離（1500xg、10分）で
回収し、抽出緩衝液（0.7 M KClを含む10mM クエン酸ナ
トリウム/ HClでpH 6.2に調製）で1回洗浄した。2．5ml
の抽出緩衝液で懸濁させた後、細胞を1500kgf/cm²でFre
nch press homogenizer(Ohtake Works Corp., 日本)に
より破壊し、製造元が指定する方法に従って、二倍当量
のisogen (Nippon gene)をすぐに混合した。この段階
で、400μgの全RNAが回収された。

【００６０】次にこの全RNAを、製造元が指定する方法
に従って、mRNA分離キット（Clontech）を用いて精製し
た。最終的に、P. rhodozyma ATCC96594株から16μgのm
RNAを得た。

【００６１】cDNAライブラリーを構築するために、製造
元が指定する方法に従って、CapFinder PCR cDNA構築キ
ット（Clontech）を用いた。1μgの精製したmRNAは、最
初の鎖の合成、続いてPCR増幅に用いた。このPCR増幅の
後、1mgのcDNAプールを得た。

【００６２】実施例２．P. rhodozymaから部分的なhmc
(3-ヒドロキシル-3-メチルグルタリル-補酵素A合成酵
素)遺伝子のクローニング P. rhodozymaから部分的なhmc遺伝子をクローニングす
るために、デジェネレートPCR法を採用した。表1に示す
ように設計され、合成されたヌクレオチド配列を持つ二
種類の混合プライマーは、他の種の既知のHMG-補酵素A
合成遺伝子の共通配列に基づいている。

【表１】hmc遺伝子のクローニングに用いたプライマー
の塩基配列 Hmgs1；GGNAARTAYACNATHGGNYTNGGNCA（センスプライマ
ー）(配列番号:11) Hmgs3；TANARNSWNSWNGTRTACATRTTNCC（アンチセンスプ
ライマー）(配列番号:12) （N=A,C,G,又はT；R=A又はG;Y=C又はT；H=A,T又はC；S=
C又はG；W=A又はT）

【００６３】DNAポリメラーゼとしてExTaq (Takara Shu
zo)ならびに鋳型として実施例１で得られたcDNAプール
を用いた、95℃30秒、50℃30秒、72℃15秒を25サイクル
から成るPCR反応の後、反応液をアガロースゲル電気泳
動に供した。目的の長さのPCRバンドを回収し、製造元
が提供する方法に従って、QIAquick(QIAGEN)により精製
し、pMOSBlue T-vector (Amersham)にライゲーションし
た。コンピテント大腸菌DH5αへの形質転換の後、6個の
白色コロニーを選択し、自動DNA単離システムで、プラ
スミドを単離した。塩基配列決定の結果、1つのクロー
ンは推定アミノ酸配列が、既知のhmc遺伝子と類似して
いることが判った。この単離cDNAクローンをpHMC211と
命名し、その後の試験に用いた。

【００６４】実施例３． P. rhodozymaからゲノムDNAの
単離 P. rhodozymaからゲノムDNAを単離するため、QIAGENゲ
ノムキットを、製造元の指示する方法に従って用いた。

【００６５】はじめに、YPD培地100mlの一晩培養液か
ら、P. rhodozyma ATCC96594株の細胞を遠心分離（1500
x g, 10分）によって回収し、TE緩衝液（1mM EDTAを含
む10mMTris/ HCl (pH 8.0)）で一度洗浄した。QIAGENゲ
ノムキットのY1緩衝液8mlに懸濁した後、酵素分解して
細胞を破壊するために、2mg/mlの濃度のリティカーゼ
（SIGMA）を加え、反応液は30℃、90分でインキュベー
トした後、次の抽出の段階に進めた。最終的に20μgの
ゲノムDNAが得られた。

【００６６】実施例４． プローブとしてpHMC211を用い
たサザンブロットハイブリダイゼーション サザンブロットハイブリダイゼーションを、P. rhodozy
maからhmc遺伝子を含むゲノム断片をクローニングする
ために行った。2μgのゲノムDNAをEcoRIで消化し、アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、その後、酸およびアルカリ
処理を行った。変性DNAを、トランスブロット（Joto Ri
ka）によりナイロン膜(Hybond N+, Amersham)に1時間転
写した。ナイロン膜に転写したDNAを、熱処理（80℃、9
0分）により固定した。DIGマルチプライミング法(Boehr
inger Mannheim)によって、鋳型DNA(EcoRIおよびSalIで
消化したpHMC211)をラベルすることにより、プローブを
調製した。ハイブリダイゼーションは製造元によって指
示されている方法で行った。その結果、ハイブリダイズ
したバンドは、3．5から4．0キロベース（kb）の範囲で
視覚化された。

【００６７】実施例５． hmc遺伝子を含むゲノム断片の
クローニング 4μgのゲノムDNAをEcoRIで消化し、アガロースゲル電気
泳動を行った。その後、長さが3．0から5．0kbの間のDN
Aを、製造元が指定する方法に従って、QIAEX IIゲル抽
出キット（QIAGEN）で、回収した。精製したDNAを、Eco
RIで消化しCIAP（仔ウシ腸アルカリフォスファターゼ）
処理した1μgのλZAPII(Stratagene)に16℃で一晩ライ
ゲーションし、GigapackIII gold packaging extract
(Stratagene)でパッケージングした。パッケージされた
抽出物を、大腸菌XL1Blue MRF'株に感染させ、LB寒天培
地上に積層するようにNZY培地を注入した。約6000個の
プラークを、EcoRIおよびSalIで消化したpHMC211をプロ
ーブとしてスクリーニングした。2つのプラークは、ラ
ベルしたプローブにハイブリダイズし、製造元（Strata
gene）が指定する方法に従って、インビボ切り出しプロ
トコールの実験に用いた。単離したプラスミドは、制限
酵素処理解析および塩基配列解析の結果、お互いに反対
方向である同じ断片を持っていることが判明した。塩基
配列解析の結果、得られたEcoRI断片は、pHMC211クロー
ンと同じヌクレオチド配列を含んでいた。これらのプラ
スミドの中の1つを、pHMC526と命名し、更なる研究に用
いた。完全なヌクレオチド配列は、pHMC526の欠失誘導
体の塩基配列解析、およびプライマーウォーキング法に
よる配列解析によって得られた。pHMC526のインサート
断片は、10の完全なエキソン、1個の不完全なエキソ
ン、10のイントロンおよび約1kb の3’末端非翻訳領域
を持つ3431ヌクレオチドから成る。

【００６８】実施例６． hmc遺伝子の上流域のクローニ
ング hmc遺伝子の5’近傍領域のクローニングは、pHMC526がh
mc遺伝子の5’末端を含まないので、Genome Walker Kit
(Clontech)を用いて行われた。最初に、表2で示す配列
を持つPCRプライマーを合成した。

【表２】hmc遺伝子の5’近傍領域のクローニングに用い
たプライマーの塩基配列 Hmc21；GAAGAACCCCATCAAAAGCCTCGA（プライマリープラ
イマー）（配列番号:13） Hmc22；AAAAGCCTCGAGATCCTTGTGAGCG（ネスティッドプラ
イマー）（配列番号:14）

【００６９】ライブラリー構築およびPCR条件のための
プロトコールは、実施例3で得たゲノムDNA調製物をPCR
の鋳型として用いる製造元によって指示されている方法
と同じであった。5’末端（0．45kb）のEcoRV部位、お
よび5’末端（2．7kb）のPvuII部位を持つPCR断片を回
収し、大腸菌DH5αを宿主菌として用いることにより、p
MOSBlue T-vectorへクローニングした。両構築物からの
各々5つの独立したクローンの塩基配列解析の結果、hmc
遺伝子の5’近傍領域はクローニングされ、3’末端にあ
るEcoRI断片の小さな部分(0.1kb)が見られることが確認
された。上記の実験におけるPvuII構築物によって得ら
れたクローンをpHMCPv708と命名し、その後の研究に用
いた。

【００７０】次に、サザンブロット解析を、上記の実施
例4で示す方法で行い、3kbのEcoRI断片に存在するhmc遺
伝子の5’近傍領域を決定した。λZAPIIの2.5から3.5kb
のEcoRIライブラリーの構築後、600個のプラークをスク
リーニングし、6個の陽性クローンを選択した。これら
の6個のクローンの塩基配列解析の結果、6個の陽性プラ
ーク中4個のクローンが、pHMCPv708と同じ配列を持つこ
とが明らかになり、そのうちの1つを、pHMC723と名付
け、更なる解析に用いた。

【００７１】表3に示す配列を持つPCRプライマーを、P.
rhodozymaの染色体の3.5kbから3.0kbのEcoRI断片に位
置する小さな(0.1kb)EcoRI断片をクローニングするため
に合成した。

【表３】hmc遺伝子の小さなEcoRI部分をクローニングす
るのに用いたプライマーの塩基配列 Hmc30；AGAAGCCAGAAGAGAAAA（センスプライマー）（配
列番号:15） Hmc31；TCGTCGAGGAAAGTAGAT（アンチセンスプライマ
ー）（配列番号:16）

【００７２】PCRの条件は、実施例2で示すものと同じで
あった。増幅した断片(長さ0.1kb)を、pMOSBlue T-vect
orへクローニングし、大腸菌DH5αに形質転換した。プ
ラスミドは5個の独立した白色コロニーから調製し、塩
基配列解析に用いた。

【００７３】このようにして、hmc遺伝子（配列番号：
1）を含むヌクレオチド配列(4.8kb)を決定した。コード
領域は、11のエキソンと10のイントロンとから成る2432
塩基対の中にあった。イントロンは5’または3’側の偏
りが見られず、コード領域全てにわたって分布してい
た。オープンリーディングフレームは、他の種の既知の
HMG-補酵素A合成酵素遺伝子のアミノ酸配列と非常に類
似している配列を持つ467個のアミノ酸（配列番号：6）
から構成されている（Schizosaccharomyces pombeのHMG
-補酵素A合成酵素と49．6％が同一）。

【００７４】実施例７． 大腸菌におけるhmc遺伝子の発
現、およびその酵素活性の確認 表4で示す配列を持つPCRプライマーを、hmc遺伝子のcDN
A断片をクローニングするために合成した。

【表４】hmc遺伝子のcDNAのクローニングに用いたプラ
イマーの塩基配列 Hmc25；GGTACCATATGTATCCTTCTACTACCGAAC（センスプラ
イマー）（配列番号:17） Hmc26；GCATGCGGATCCTCAAGCAGAAGGGACCTG（アンチセン
スプライマー）（配列番号:18）

【００７５】PCRの条件は次のとおりである；95℃30
秒、55℃30秒、72℃3分を25サイクル。鋳型として実施
例2で得た0.1μgのcDNAプールを用い、DNAポリメラーゼ
としてPfuポリメラーゼを用いた。増幅した1．5kb断片
を回収し、製造元が指定したプロトコールに従ってperf
ectly blunt cloning kit (Novagen)を用いてpT7Blue-3
ベクター（Novagen）へクローニングした。大腸菌DH5α
形質転換体の白色コロニーから、6個の独立したクロー
ンを選択し、これらの形質転換体からプラスミドを回収
した。制限酵素解析の結果、2個のクローンを、塩基配
列解析による更なる選択のために選んだ。1つのクロー
ンは、280位のアミノ酸置換（グリシンからアラニン）
を有しており、別のクローンは53位にアミノ酸置換（ア
ラニンからスレオニン）を有していた。既知のhmc遺伝
子由来のアミノ酸配列のアラインメントにより、280番
目のアラニン残基およびグリシン残基は、他の種の全て
の配列によく見られるものであることが分かり、この事
実から280番目の位置のアミノ酸の置換は、酵素活性に
影響を及ぼさないと考えられることが示唆された。この
クローン（280位の変異）は、その後の発現実験のた
め、pHMC731として選択された。

【００７６】次に、pHMC731をNdeIおよびBamHIで消化し
て得た1.5kbの断片を、同じ制限酵素の組合せで消化し
たpET11c (Stratagene)にライゲーションし、大腸菌DH5
αへ導入した。制限酵素解析の結果、正常な構造(pHMC8
18)を持つプラスミドを回収した。次に、コンピテント
大腸菌BL21(DE3) (pLysS)細胞（Stratagene）を形質転
換し、正常な構造を持つ1つのクローンを更なる実験の
ために選択した。

【００７７】発現実験のために、BL21(DE3)(pLysS)(pHM
C818)株およびベクター対照株BL21(DE3) (pLysS)(pET11
c)を、100μg/mlのアンピシリン存在下で、600nmのODが
0．8に達するまで37℃で100mlのLB培地にて培養した(約
3時間)。次に、培地は等量になるように2つに分け、そ
の1つに1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシ
ド（IPTG）を加えた。培養は37℃でさらに4時間続け
た。25μlの培養液を、hmcクローンおよびベクター対照
の誘導および非誘導培養液から採取し、ドデシル硫酸ナ
トリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動解析（SDS-P
AGE）に供した。ヌクレオチド配列から推定される分子
量(50.8 kDa)とほぼ同じサイズのタンパク質は、誘導を
かけたpHMC818を持つクローンの場合のみ発現されるこ
とを確認した。50ml培地からの細胞を、遠心分離(1500
x g, 10分)で回収し、1回洗浄し2mlのhmc緩衝液(200mM
Tris-HCl (pH8.2))に懸濁した。細胞は1500kgf/cm²でFr
ench press homogenizer (Ohtake Works)で破壊し、粗
ライセートを得た。粗ライセートの遠心分離の後、上清
のフラクションを回収し、酵素解析のための粗抽出液と
して用いた。誘導をかけたpHMC818クローンのライセー
トの場合のみ、白色ペレットが沈殿し、これを回収し
た。3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-補酵素A(HMG-Co
A)合成酵素のための酵素アッセイを、Stewartらによる
方法に従って、光学アッセイによって行った（J.Biol.C
hem.,241(5),1212-1221,1966）。全ての粗抽出液では、
3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-補酵素A合成酵素の
活性は検出されなかった。粗抽出液のSDS-PAGE解析の結
果、発現した培地で見られる発現タンパク質のバンドは
消失した。その後、誘導をかけたpHMC818クローンの粗
ライセートから回収した白色ペレットを、8M グアニジ
ンHClで可溶化し、SDS-PAGE解析に用いた。発現したタ
ンパク質は白色ペレットの中から回収された。それゆ
え、発現したタンパク質は封入体を形成していることが
示唆された。

【００７８】次に、より緩和な条件による発現実験を行
った。細胞はLB培地で28℃にて培養し、誘導は0.1mMのI
PTGを加えて行った。その後さらに28℃で3．5時間培養
を続け、細胞を回収した。粗抽出液の調製は以前のプロ
トコールと同じであった。結果を表5に要約した。HMG-
補酵素A合成酵素の活性は、hmc遺伝子を持つ組換え株の
誘導をかけた培養液にのみ見られたことから、クローニ
ングしたhmc遺伝子はHMG-補酵素A合成酵素をコードして
いることが示唆された。

【表５】 hmc cDNAクローンの酵素的特徴解析プラスミド IPTG HMG補酵素A μモル/分/mgタンパク質 pHMC818 − 0 ＋ 0.146 pET11c − 0 ＋ 0

【００７９】実施例８． hmg (3-ヒドロキシメチル-3-
グルタリル-補酵素A還元酵素)遺伝子のクローニング hmg遺伝子のクローニングのプロトコールは実施例2から
7で示したhmc遺伝子のものとほとんど同じである。最
初、他の種からHMG-補酵素A還元酵素遺伝子の共通配列
に基づく、表6で示した配列を持つPCRプライマーを合成
した。

【表６】hmg遺伝子のクローニングで用いたプライマー
の塩基配列 Red1；GCNTGYTGYGARAAYGTNATHGGNTAYATGCC（センスプラ
イマー）（配列番号:19） Red2；ATCCARTTDATNGCNGCNGGYTTYTTRTCNGT（アンチセン
スプライマー）（配列番号:20） （N=A,C,G又はT；R=A又はG；Y=C又はT；H=A,T又はC；D=
A,G又はT）

【００８０】DNAポリメラーゼとしてExTaq (Takara Shu
zo)を用いた、95℃30秒、54℃30秒、72℃30秒を25サイ
クルから成るPCR反応の後、反応液をアガロースゲル電
気泳動に用いた。目的の長さのPCRバンドを回収し、製
造元が提供する方法に従って、QIAquick(QIAGEN)により
精製し、pUC57ベクター (MBI Fermentas)にライゲーシ
ョンした。コンピテント大腸菌DH5αへの形質転換の
後、7個の白色コロニーを選択し、これらの形質転換体
からプラスミドを単離した。塩基配列解析の結果、全て
のクローンは推定アミノ酸配列が、既知のHMG-補酵素A
還元酵素遺伝子と類似していることが判明した。この単
離cDNAクローンの1つをpRED1219と名付け、その後の研
究に用いた。

【００８１】次に、hmg遺伝子の5’および3’近傍領域
を含むゲノム断片を、Genome Walkerkit (Clontech)で
クローニングした。hmg遺伝子の5’近傍領域の2.5kb断
片(pREDPVu1226)、および3’近傍領域の4.0kb断片(pRED
EVd1226)をクローニングした。pREDPVu1226のインサー
ト配列に基づいて、表7で示す配列を持つPCRプライマー
を合成した。

【表７】hmg遺伝子のcDNAのクローニングに用いたプラ
イマーの塩基配列 Red8；GGCCATTCCACACTTGATGCTCTGC（アンチセンスプラ
イマー）（配列番号:21） Red9；GGCCGATATCTTTATGGTCCT（センスプライマー）
（配列番号:22）

【００８２】次に、hmg cDNA配列の長い一部を含むcDNA
断片を、Red8およびRed9をPCRプライマーとして、およ
び実施例2で調製したcDNAプールを用いたPCR法によりク
ローニングし、このようにしてクローニングしたプラス
ミドを、pRED107と名付けた。PCRの反応条件は次のとお
りである；94℃30秒、55℃30秒、72℃1分を25サイク
ル。

【００８３】サザンブロットハイブリダイゼーション実
験を、P. rhodozymaから完全なhmg遺伝子を含むゲノム
配列をクローニングするために行った。プローブを、DI
Gマルチプライミング法で鋳型DNAであるpRED107をラベ
ルすることにより調製した。ハイブリダイゼーションは
製造元によって指示されている方法で行った。その結
果、ラベルしたプローブは、長さが12kbおよび4kbの2つ
のバンドとハイブリダイズした。pREDPVu1226の塩基配
列解析の結果、クローニングしたhmg領域にはEcoRI部位
は見られなかった。このことにより、hmg遺伝子の別の
種（ハイブリダイズした4kbのEcoRI断片を有する）は、
他の生物で見られるようにP. rhodozymaのゲノム上に存
在することが示唆された。

【００８４】次に、λDASHIIベクター上に9から23kbのE
coRI断片から成るゲノムライブラリーを構築した。パッ
ケージされた抽出物を、大腸菌XL1Blue、MRA(P2)株(Str
atagene)に感染させ、LB寒天培地上に積層するようにNZ
Y培地を播いた。約5000個のプラークを、StuIで消化し
たpRED107の0.6kb断片をプローブとして用いスクリーニ
ングした。4つのプラークは、ラベルしたプローブにハ
イブリダイズした。次にファージライセートを調製し、
製造元(Promega)が指定する方法に従って、DNAをWizard
lambda 精製システムで精製し、EcoRIで消化し10kbのE
coRI断片を単離し、EcoRIで消化およびCIAP処理したpBl
uescriptII KS- (Stratagene)へクローニングした。11
個の白色コロニーを選択し、Red9および-40ユニバーサ
ルプライマー(Pharmacia)を用いたコロニーPCRを行っ
た。コロニーPCRの鋳型DNAは、拾ったコロニーをPCR反
応の前に10μlの滅菌水に懸濁させ、その細胞懸濁液を9
9℃で5分間加熱することにより調製した（PCR反応条
件；94℃30秒、55℃30秒、72℃3分を25サイクル）。1つ
のコロニーから、陽性4kbのPCRバンドが得られた。そし
て、このクローンはhmg遺伝子を含む完全な領域を持つ
ことが示唆された。この陽性クローンからのプラスミド
を調製し、pRED611と名付けた。その後、pRED611の欠失
誘導体を、塩基配列解析のために作製した。欠失変異体
から得た配列と、プライマーウォーキング法で得た配列
とを結合させることにより、P. rhodozymaのhmg遺伝子
を含む7285塩基対のヌクレオチド配列を決定した（配列
番号：2）。P. rhodozymaのhmg遺伝子は10のエキソンお
よび9のイントロンから成る。長さが1092のアミノ酸か
ら成る推定アミノ酸配列（配列番号：7）は、既知のHMG
-補酵素A還元酵素と広範な相同性を示した（Ustilago m
aydisのHMG-補酵素A還元酵素と53．0％の同一性）。

【００８５】実施例９． 大腸菌におけるhmg遺伝子のカ
ルボキシル末端ドメインの発現 原核生物のある種は、可溶性のHMG-補酵素A還元酵素ま
たは関連したタンパク質を有する(Lamら、J. Biol. Che
m. 267, 5829-5834, 1992)。しかし真核生物では、HMG-
補酵素A還元酵素は、アミノ末端膜ドメインによって小
胞体に繋がれている(Skalnikら、J. Biol. Chem. 263,
6836-6841, 1988)。菌類（すなわち、Saccharomyces ce
revisiaeおよび黒穂病菌のUstilago maydis）および動
物では、膜ドメインは大きく複雑で、7または8個の膜貫
通セグメントを含む(Croxenら、Microbiol. 140, 2363-
2370, 1994)。対照的に植物のHMG-補酵素A還元酵素タン
パク質の膜ドメインは、1つのみ、または2つの膜貫通セ
グメントを持っている(Nelsonら、Plant Mol. Biol. 2
5, 401-412, 1994)。膜貫通ドメインの構造および配列
の違いに関わらず、触媒ドメインのアミノ酸配列は、真
核生物、古細菌および真正細菌の間で保存されている。

【００８６】Croxenらはトウモロコシ病原菌のUstilago
maydisに由来するHMG-補酵素A還元酵素のC末端ドメイ
ンが、大腸菌において活性型で発現することを示した(M
icrobiology, 140, 2363-2370, 1994)。本発明の発明者
らは、酵素活性を確認するために、大腸菌においてP. r
hodozymaのHMG-補酵素A還元酵素のC末端ドメインの発現
を試みた。

【００８７】最初、表8に示す配列を持つPCRプライマー
を合成し、hmg遺伝子の部分cDNA断片をクローニングし
た。センスプライマー配列は、597番目のアミノ酸残基
（グルタミン酸）から始まる配列に相当し、得ることが
期待されるタンパク質およびcDNAの長さは、それぞれ49
6アミノ酸、1.5 kbであった。

【表８】hmg遺伝子の部分cDNAのクローニングに用いた
プライマーの塩基配列 Red54；GGTACCGAAGAAATTATGAAGAGTGG（センスプライマ
ー）（配列番号:23） Red55；CTGCAGTCAGGCATCCACGTTCACAC（アンチセンスプ
ライマー）(配列番号:24)

【００８８】PCRの条件は次のとおりである；95℃30
秒、55℃30秒、72℃3分を25サイクル。鋳型として実施
例2で得た0.1μgのcDNAプールを用い、DNAポリメラーゼ
としてExTaqポリメラーゼを用いた。増幅した1．5kb断
片を回収し、pMOSBlue T-vector(Novagen)へクローニン
グした。大腸菌DH5α形質転換体の白色コロニーから、1
2個の独立したクローンを選択し、これらの形質転換体
からプラスミドを調製した。制限酵素解析の結果、全て
のクローンを、塩基配列解析による更なる選択のために
選んだ。1つのクローンは、コード配列全てにわたって1
つのアミノ酸置換もなく、pRED908と名付けた。

【００８９】次に、pRED908のKpnIおよびPstI消化によ
って得た1.5 kbの断片を、同じ制限酵素の組合せで消化
したpQE30 (QIAGEN)へライゲーションし、大腸菌KB822
へ形質転換した。制限酵素解析の結果、正常な構造を持
つプラスミド(pRED1002)を回収した。次にコンピテント
大腸菌M15(pREP4)細胞(QIAGEN)を形質転換し、正常な構
造を持つ1つのクローンをさらなる研究のために選択し
た。

【００９０】発現実験のために、M15(pREP4)(pRED1002)
株およびベクター対照株M15(pREP4)(pQE30)を、25μg/m
lのカナマイシンおよび100μg/mlのアンピシリン存在下
で、600nmのODが0．8(約5時間)に達するまで30℃で100m
lのLB培地で培養した。次に、培地は等量になるように2
つに分け、その1つに1mMのIPTGを加えた。培養は30℃で
さらに3．5時間続けた。25μlの培養液を、hmgクローン
およびベクター対照の誘導および非誘導培養液から採取
し、SDS-PAGE解析を行った。ヌクレオチド配列から推定
される分子量(52.4 kDa)とほぼ同じサイズのタンパク質
は、誘導をかけたpRED1002を持つクローンの場合のみ発
現されることが確認された。50ml培養液からの細胞を、
遠心分離(1500 x g, 10分)で回収し、1回洗浄し2mlのhm
g緩衝液(1 mMのEDTAおよび10 mMのジチオスレイトール
を含む100mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7.0))に懸濁し
た。細胞は1500kgf/cm²でFrench press (Ohtake Works)
で破壊し、粗ライセートを得た。粗ライセートの遠心分
離の後、上清のフラクションを回収し、酵素解析のため
の粗抽出液として用いた。誘導をかけたpRED1002クロー
ンのライセートの場合のみ、白色ペレットが沈殿し、こ
れを回収した。3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-補酵
素A(HMG-CoA)還元酵素のための酵素アッセイを、Servou
seらによる方法に従って、光学アッセイによって行った
（Biochem.J.240,541-547,1986）。全ての粗抽出液で
は、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-補酵素A合成酵
素の活性は検出されなかった。粗抽出液のSDS-PAGE解析
の結果、発現した培養液で見られた発現タンパク質のバ
ンドは消失した。その後、誘導をかけたpRED1002クロー
ンの粗ライセートから回収した白色ペレットを、等量の
20％SDSで可溶化し、SDS-PAGE解析に用いた。発現した
タンパク質は白色ペレットの中に回収された。それゆ
え、発現したタンパク質は封入体を形成しているものと
示唆された。

【００９１】次に、より緩和な条件による発現実験を行
った。細胞はLB培地で28℃にて培養し、誘導は0.1mMのI
PTGを加えて行った。その後さらに28℃で3．5時間培養
を続け、細胞を回収した。粗抽出液の調製は以前のプロ
トコールと同じである。結果を表9に要約した。30倍以
上の誘導が観察されたことから、クローニングしたhmg
遺伝子はHMG-補酵素A還元酵素をコードしていることが
示唆された。

【表９】 hmg cDNAクローンの酵素的特徴解析プラスミド IPTG NADPH μモル/分/mgタンパク質 pRED1002 − 0.002 ＋ 0.059 pQE30 − 0 ＋ 0

【００９２】実施例１０． メバロン酸キナーゼ(mvk)遺
伝子のクローニング mvk遺伝子のクローニングのプロトコールは実施例2から
7で示したhmc遺伝子のものとほとんど同じである。最
初、他の種からのメバロン酸キナーゼ遺伝子の共通配列
に基づく、表10に示した配列を持つPCRプライマーを合
成した。

【表１０】mvk遺伝子のクローニングで用いたプライマ
ーの塩基配列 Mk1；GCNCCNGGNAARGTNATHYTNTTYGGNGA（センスプライマ
ー）（配列番号:25） Mk2；CCCCANGTNSWNACNGCRTTRTCNACNCC（アンチセンスプ
ライマー）（配列番号:26） （N=A,C,G又はT；R=A又はG；Y=C又はT；H=A,T又はC；S=
C又はG；W=A又はT）

【００９３】DNAポリメラーゼとしてExTaqを用いた、95
℃30秒、46℃30秒、72℃15秒を25サイクルから成るPCR
反応の後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供した。
部分的なmvk遺伝子を含むことが期待される長さの0.6 k
bのPCRバンドを回収し、製造元が提示する方法に従っ
て、QIAquickにより精製し、pMOSBlue T-vectorにライ
ゲーションした。コンピテント大腸菌DH5α細胞への形
質転換の後、4個の白色コロニーを選択し、プラスミド
を単離した。塩基配列解析の結果、1つのクローンは推
定アミノ酸配列が、既知のメバロン酸キナーゼ遺伝子と
類似していることが判明した。この単離cDNAクローンを
pMK128と命名し、その後の研究に用いた。

【００９４】次に、mvk遺伝子を含む部分的なゲノムク
ローンを、PCRによってクローニングした。表11に示し
たpMK128の内部配列に基づいた配列のPCRプライマーを
合成した。

【表１１】mvk遺伝子を含むゲノムDNAのクローニングに
用いたプライマーの塩基配列 Mk5；ACATGCTGTAGTCCATG（センスプライマー）（配列番
号:27） Mk6；ACTCGGATTCCATGGA（アンチセンスプライマー）
（配列番号:28）

【００９５】PCRの条件は、94℃30秒、55℃30秒、72℃1
分を25サイクルである。増幅した1．4kb断片を回収し、
pMOSBlue T-vectorへクローニングした。塩基配列解析
の結果、典型的なイントロン構造を有するmvk遺伝子を
含むゲノム断片が得られたことを確認した。このゲノム
クローンをpMK224と名付けた。

【００９６】サザンブロットハイブリダイゼーション実
験を、P. rhodozymaから完全なmvk遺伝子を含むゲノム
断片をクローニングするために行った。プローブを、DI
Gマルチプライミング法で鋳型DNAであるNcoIで消化した
pMK224をラベルすることにより調製した。ハイブリダイ
ゼーションは製造元によって指示されている方法で行っ
た。その結果、ラベルしたプローブは、長さが6.5 kbの
バンドとハイブリダイズした。次に、5から7kbのEcoRI
断片から成るゲノムライブラリーを、λZAPIIベクター
に構築した。パッケージされた抽出物は、大腸菌XL1Blu
e、MRF'株(Stratagene)へ感染させ、LB寒天培地上へNZY
培地を積層させた。約5000個のプラークを、NcoIで消化
したpMK224の0.8 kb断片をプローブとして用い、スクリ
ーニングした。7つのプラークはラベルしたプローブと
ハイブリダイズした。次に、ファージライセートを、製
造元(Stratagene)によって指示されている方法に従って
調製し、インビボの切り出しを、大腸菌XL1 Blue MRF'
およびSOLR株を用いて行った。14個の白色コロニーを選
択し、これらの選択した形質転換体からプラスミドを単
離した。続いて、単離したプラスミドをNcoIで消化し、
プラークハイブイリダイゼーションのときと同じプロー
ブによるサザンブロットハイブリダイゼーションに用い
た。全てのプラスミドのインサート断片は、プローブと
ハイブリダイズしたことから、mvk遺伝子を含むゲノム
断片はクローニングされたことが示唆された。陽性クロ
ーンのうちの1つからプラスミドを調製し、pMK701と名
付けた。約3 kbの配列を、プライマーウォーキング法に
よって決定し、mvk遺伝子の5’末端はpMK701へ含まれて
いないことが示された。

【００９７】次に、TTGTTGTCGTAGCAGTGGGTGAGAG（配列
番号：29）の配列を有するPCRプライマーを合成し、製
造元(Clontech)によって指示されている方法に従って、
GenomeWalker Kitでmvk遺伝子の5’近傍ゲノム領域をク
ローニングした。特異的な1.4kbのPCRバンドが増幅さ
れ、pMOSBlue T-vectorへクローニングした。選択したD
H5αの全ての形質転換体は、期待した長さのインサート
を有していた。その後の塩基配列解析から、mvk遺伝子
の5’近傍領域をクローニングできたことが示された。
そのクローンのうちの1つをpMKEVR715と命名し、更なる
研究に用いた。実施例3で調製したゲノムDNAを用いたサ
ザンブロットハイブリダイゼーションの結果、ラベルし
たpMKEVR715は、2.7 kbのEcoRIバンドとハイブリダイズ
した。次に、長さが1.4から3.0 kbのEcoRI断片が、λZA
PIIへクローニングしてあるゲノムライブラリーを構築
し、pMKEVR715からの1.0 kbのEcoRI断片でスクリーニン
グした。14個の陽性プラークを、5000個のプラークから
選択し、インビボ切り出し法でこれらのプラークからプ
ラスミドを調製した。

【００９８】pMKEVR715の内部配列に由来する、表12に
示す配列を持つPCRプライマーを合成し、コロニーPCRで
陽性クローンを選択した。

【表１２】mvk遺伝子の5’近傍領域をクローニングする
ためのコロニーPCR用に使用したPCRプライマー Mk17；GGAAGAGGAAGAGAAAAG（センスプライマー）（配列
番号:30） Mk18；TTGCCGAACTCAATGTAG（アンチセンスプライマー）
（配列番号:31）

【００９９】PCRの条件は次のとおりである；94℃30
秒、50℃30秒、72℃15秒を25サイクル。1つのクローン
を除く全ての候補から、陽性0.5 kbバンドが生じた。そ
のクローンの1つを選択しpMK723と名付け、mvk遺伝子の
上流域の配列を決定した。pMK723の3’領域の塩基配列
解析、およびpMK701の配列との結合の後、mvk遺伝子を
含む4.8 kbの断片のゲノム配列を決定した。mvk遺伝子
は4つのイントロンおよび5つのエキソンから構成されて
いる（配列番号：3）。アミノ末端の4つのアミノ酸を除
く推定アミノ酸配列（配列番号：8）は、既知のメバロ
ン酸キナーゼと広範な相同性を示した（Rattus norvegi
cusのメバロン酸キナーゼと44．3％が同一）。

【０１００】実施例１１． アミノ末端領域の1塩基の導
入によるmvk遺伝子の発現 アミノ酸配列は既知のメバロン酸キナーゼと有意な相同
性を示すが、mvk遺伝子の適当な開始コドンは見つから
なかった。この結果から、クローニングした遺伝子は、
メバロン酸キナーゼの偽遺伝子かもしれないと示唆され
た。この仮説を検証するため、表13で示す配列を持つPC
Rプライマーを合成し、アミノ末端に適当な開始コドン
ができるように人工的なヌクレオチドを導入した。

【表１３】mvk遺伝子へのヌクレオチドの導入のために
用いたPCRプライマー Mk33；GGATCCATGAGAGCCCAAAAAGAAGA（センスプライマ
ー）（配列番号:32） Mk34；GTCGACTCAAGCAAAAGACCAACGAC（アンチセンスプラ
イマー）（配列番号:33）

【０１０１】導入した人工的なアミノ末端配列は次のと
おりである；NH₂-Met-Arg-Ala-Gln。DNAポリメラーゼと
してExTaqポリメラーゼ (Takara Shuzo)を用いた、95℃
30秒、55℃30秒、72℃30秒を25サイクルから成るPCR反
応の後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供した。目
的の1.4 kbのPCRバンドが増幅し、pCR2.1 TOPOベクター
へクローニングした。コンピテント大腸菌TOP10細胞の
形質転換の後、6個の白色コロニーを選択しプラスミド
を単離した。塩基配列解析の結果、1つのクローンはア
ミノ酸残基の変化を一つしか持たないことが判明した
(配列番号：8の81番目のアミノ酸残基におけるAspからG
lyへの変化)。このプラスミドをpMK1130 #3334と名付
け、更なる研究に用いた。次に、pMK1130 #3334のイン
サート断片をpQE30へクローニングした。このプラスミ
ドをpMK1209 #3334と名付けた。発現宿主M15 (pREP4)の
形質転換の後、発現実験を行った。M15 (pREP4)(pMK120
9 #3334)株およびベクター対照株(M15 (pREP4)(pQE30))
を、100μg/mlのアンピシリンを含む3mlのLB培地へ植菌
した。37℃で3．75時間の培養後、培養液を2つに分け
た。1mM IPTGをその1つに添加し、培養を3時間続けた。
細胞を遠心分離によって50μlの培養液から回収し、SDS
-PAGE解析に用いた。48.5 kDaの期待された分子量を有
するタンパク質は、M15 (pREP4)(pMK1209 #3334)の培養
液へのIPTGの添加によって誘導されたが、ベクター対照
培養液では、誘導されたタンパク質のバンドは観察され
なかった(図2)。この結果から、メバロン酸キナーゼタ
ンパク質の活性型は、アミノ末端の1ヌクレオチドの人
工的な付加によって発現されることが示唆された。

【０１０２】実施例１２． メバロン酸ピロリン酸脱炭
酸酵素(mpd)遺伝子のクローニング mpd遺伝子のクローニングプロトコールは、実施例2から
7で示すhmc遺伝子のものとほとんど同じである。最初
に、他の種のメバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素遺伝子の
共通配列に基づく表14で示した配列を有するPCRプライ
マーを合成した。

【表１４】mpd遺伝子のクローニングに用いたプライマ
ーの塩基配列 Mpd1；HTNAARTAYTTGGGNAARMGNGA（センスプライマー）
（配列番号:34） Mpd2；GCRTTNGGNCCNGCRTCRAANGTRTANGC（アンチセンス
プライマー）（配列番号:35） （N=A,C,G又はT；R=A又はG；Y=C又はT；H=A,T又はC；M=
A又はC）

【０１０３】DNAポリメラーゼとしてExTaqを用いた、95
℃30秒、50℃30秒、72℃15秒を25サイクルから成るPCR
反応の後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供した。
部分的なmpd遺伝子を含むことが期待される長さの0.9 k
bのPCRバンドを回収し、製造元が提示している方法に従
って、QIAquickにより精製し、pMOSBlue T-vectorにラ
イゲーションした。コンピテント大腸菌DH5αへの形質
転換の後、6個の白色コロニーを選択し、プラスミドを
単離した。6個中2個は期待される長さのインサートを持
っていた。塩基配列解析の結果、1つのクローンは、推
定されるアミノ酸配列が既知のメバロン酸ピロリン酸脱
炭酸酵素遺伝子と類似していることが判明した。このcD
NAクローンをpMPD129と命名し、その後の研究に用い
た。

【０１０４】次に、mpd遺伝子を含む部分的なゲノム断
片をPCRでクローニングした。部分的なcDNA断片のクロ
ーニングの場合と同じPCR条件で、増幅した1.05 kb断片
を得て、pMOSBlue T-vectorへクローニングした。塩基
配列解析の結果、典型的なイントロン構造を持つmpd遺
伝子を含むゲノム断片が得られたことが確認され、この
ゲノムクローンをpMPD220と名付けた。

【０１０５】サザンブロットハイブリダイゼーション実
験を、P. rhodozymaから完全なmpd遺伝子を含むゲノム
断片をクローニングするために行った。プローブを、DI
Gマルチプライミング法で鋳型DNAであるKpnIで消化した
pMPD220をラベルすることにより調製した。ハイブリダ
イゼーションは製造元によって指定された方法で行っ
た。その結果、ラベルしたプローブは、長さが7.5 kbの
バンドとハイブリダイズした。次に、6.5から9.0 kbのE
coRI断片から成るゲノムライブラリーを、λZAPIIベク
ターに構築した。パッケージされた抽出物は、大腸菌XL
1Blue、MRF'株(Stratagene)へ感染させ、LB寒天培地上
へNZY培地を積層させた。約6000個のプラークを、KpnI
で消化したpMPD220の0.6 kb断片をプローブとして用
い、スクリーニングした。4つのプラークはラベルした
プローブとハイブリダイズした。次に、ファージライセ
ートを、製造元(Stratagene)によって指定された方法に
従って調製し、インビボの切り出しを、大腸菌XL1 Blue
MRF'およびSOLR株を用いて行った。4個の陽性プラー
クに由来するそれぞれの3個の白色コロニーを選択し、
プラスミドをこれらの選択した形質転換体から単離し
た。次に、単離したプラスミドを実施例8と同様なプロ
トコールであるコロニーPCR法に供した。pMPD129で見ら
れる配列をもとに表14に示す配列を持つPCRプライマー
を合成し、コロニーPCRに用いた。

【表１５】ゲノムmpdクローンをクローニングするため
のコロニーPCRで用いたプライマーの塩基配列 Mpd7；CCGAACTCTCGCTCATCGCC（センスプライマー）（配
列番号:36） Mpd8；CAGATCAGCGCGTGGAGTGA（アンチセンスプライマ
ー）（配列番号:37）

【０１０６】PCR条件はmvk遺伝子のクローニングのとき
とほとんど同じであった；94℃30秒、50℃30秒、72℃10
秒を25サイクル。1つを除く全てのクローンは陽性の0.2
kbPCRバンドを生成した。プラスミドを陽性クローンの
1つから調製し、該プラスミドをpMPD701と名付け、その
約3kbの配列を、プライマーウォーキング法で決定した
（配列番号：4）。既知のメバロン酸ピロリン酸脱炭酸
酵素の配列と類似した402アミノ酸配列（配列番号：
９）からなるORFが存在した（Schizosaccaromycespombe
のメバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素と、52.3%が同
一）。プロモーター配列を含むと考えられる5’近傍領
域の0.4 kbも決定された。

【０１０７】実施例１３． ファルネシルピロリン酸合
成酵素(fps)遺伝子のクローニング fpg遺伝子のクローニングのプロトコールは、実施例2か
ら7で示すhmc遺伝の場合とほとんど同じであった。最初
に、他の種のファルネシルピロリン酸合成酵素遺伝子の
共通配列に基づいた表16で示す配列を有するPCRプライ
マーを合成した。

【表１６】fps遺伝子のクローニングに用いたプライマ
ーの塩基配列 Fps1；CARGCNTAYTTYYTNGTNGCNGAYGA（センスプライマ
ー）（配列番号:38） Fps2；CAYTTRTTRTCYTGDATRTCNGTNCCDATYTT（アンチセン
スプライマー）（配列番号:39） （N=A,C,G又はT；R=A又はG；Y=C又はT；D=A,G又はT）

【０１０８】DNAポリメラーゼとしてExTaqを用いた、95
℃30秒、54℃30秒、72℃30秒を25サイクルから成るPCR
反応の後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供した。
望ましい長さ（0．5kb）のPCRバンドを回収し、製造元
が提供する方法に従って、QIAquickにより精製し、pUC5
7ベクターにライゲーションした。コンピテント大腸菌D
H5αの形質転換の後、6個の白色コロニーを選択し、プ
ラスミドを単離した。望ましい長さのインサート断片を
持つプラスミドの1つを、塩基配列解析した。その結
果、このクローンは、推定アミノ酸配列が、既知のファ
ルネシルピロリン酸合成酵素遺伝子と類似した配列を持
つことが判明した。このcDNAクローンをpFPS107と名付
け、その後の研究に用いた。

【０１０９】次に、Fps1およびFps2の同一プライマーセ
ットを用いて、ゲノム断片をPCRによりクローニングし
た。部分的なcDNAのクローニングの場合と同じPCR条件
を用いた。生成した1.0 kbのバンドをクローニングし、
塩基配列解析を行った。このクローンはpFPS107と同じ
配列およびいくつかの典型的なイントロン断片を含んで
いた。このプラスミドをpFPS113と名付け、更なる試験
に用いた。

【０１１０】その次に、実施例8で記載した方法でfps遺
伝子を含む5’および3’近傍領域をクローニングした。
最初、表17で示す配列を持つPCRプライマーを合成し
た。

【表１７】fps遺伝子の近傍領域のクローニングに用い
たプライマーの塩基配列 Fps7；ATCCTCATCCCGATGGGTGAATACT（下流クローニング
のためのセンス鎖）（配列番号:40） Fps9；AGGAGCGGTCAACAGATCGATGAGC（上流クローニング
のためのアンチセンス鎖）（配列番号:41）

【０１１１】増幅したPCRバンドを単離し、pMOSBlue T-
vectorへクローニングした。塩基配列解析の結果、2.5
kbの長さの5’近傍領域、および2.0 kbの長さの3’近傍
領域がクローニングされたことが判明した。これらのプ
ラスミドをpFPSSTu117およびpFPSSTd117と、それぞれ名
付けた。両方のプラスミドの塩基配列解析の結果、ORF
は8つのイントロンを持つ1068塩基対から構成されてい
ることが判明した。推定アミノ酸配列は、他の種に由来
する既知のファルネシルピロリン酸合成酵素と広範な相
同性を示した。決定した塩基配列を基に、表17に示す配
列の2つのPCRプライマーを合成し、ゲノムfpsクローン
および大腸菌におけるfps遺伝子の発現のためのcDNAク
ローンをクローニングした。

【表１８】cDNAおよびゲノムfpsクローニングに用いた
プライマーの塩基配列 Fps27；GAATTCATATGTCCACTACGCCTGA（センスプライマ
ー）（配列番号:42） Fps28；GTCGACGGTACCTATCACTCCCGCC（アンチセンスプラ
イマー）（配列番号:43）

【０１１２】PCRの条件は次のとおりである；94℃30
秒、50℃30秒、72℃30秒を25サイクル。PCRによって得
たクローンの塩基配列解析の結果、正確な配列を有する
1つのcDNAクローンを選択し、pFPS113と名付けた。次
に、サザンブロットハイブリダイゼーション実験を行
い、P. rhodozymaから完全なfps遺伝子を含むゲノム断
片をクローニングした。プローブを、鋳型DNAのpFPS113
をDIGマルチプライミング法でラベルして調製した。そ
の結果、ラベルしたプローブは長さが約10 kbのバンド
とハイブリダイズした。

【０１１３】次に、9から15kbのEcoRI断片から成るゲノ
ムライブラリーを、λDASHIIベクターに構築した。パッ
ケージされた抽出物を大腸菌XL1 Blue, MRA(P2)株(Stra
tagene)へ感染させLB寒天培地上へNZY培地を積層させ
た。約10000個のプラークを、SacIで消化したpFPS113の
0.6 kb断片をプローブとして用い、スクリーニングし
た。8つのプラークはラベルしたプローブとハイブリダ
イズした。次にファージライセートを製造元(Promega)
によって指定された方法に従って調製した。全てのプラ
ークをFps27プライマーおよびFps28プライマーを用いた
プラークPCRに用いた。プラークPCRのための鋳型DNA
を、PCR反応前にファージ粒子溶液の2μlを99℃で5分加
熱して調製した。PCR条件は、本明細書に前記したpFPS1
13クローニングの場合と同じである。全てのプラークか
ら2 kbの陽性PCRバンドが得られ、このことからこれら
のクローンは、fps遺伝子を含む完全な領域を持つこと
が示唆された。fps遺伝子を持つλDNAのうちの1つを、E
coRIで消化し、10 kbのEcoRI断片を単離し、EcoRIで消
化しCIAP処理したpBluescriptII KS- (Stratagene)へク
ローニングした。形質転換した大腸菌DH5αからの12個
の白色コロニーを選択し、これらのクローンからプラス
ミドを調製し、Fps27およびFps28の同一プライマーセッ
トを用いて、および同一PCR条件で、コロニーPCRを行っ
た。2 kbの陽性バンドを12の候補から3つ得た。1つのク
ローンをクローニングし、pFPS603と名付けた。pFPSSTu
117およびpFPSStd117の配列から以前決定したfps遺伝子
の配列は、いくつかのPCRエラーはあるが、ほとんど正
確であった。最終的に、P. rhodozymaからのfps遺伝子
を含む4092塩基対のヌクレオチド配列を決定し（図
3）、8つのイントロンを持つ365のアミノ酸から成るORF
が見つかった（配列番号：5）。推定されるアミノ酸配
列（配列番号：10）は、既知のFPP合成酵素と広範な相
同性を示した（Kluyveromyces lactisのFPP合成酵素と6
5％同一）。

【０１１４】

【発明の効果】本発明により、メバロン酸経路またはイ
ソペンテニルピロリン酸からファルネシルピロリン酸へ
の経路に関与する酵素をコードする単離DNA配列、該DNA
配列を含むベクターまたはプラスミド、該DNA、または
ベクターまたはプラスミドのいずれかによって形質転換
された宿主、および該形質転換宿主細胞を利用したイソ
プレノイドおよびカロテノイドの製造法が提供された。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> F.HOFFMANN-LA ROCHE. AG <120> Improvement of microbiological carotenoid production and biological materials therefor <130> RC-108 <150> EP 98108210.0 <151> 1998-5-6 <160> 43 <170> PatentIn Release #1.0, Version #1.25 <210> 1 <211> 6370 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <221> exon <222> (1441)...(1466) <220> <221> intron <222> (1467)...(1722) <220> <221> exon <222> (1723)...(1813) <220> <221> intron <222> (1814)...(1914) <220> <221> exon <222> (1915)...(2535) <220> <221> intron <222> (2536)...(2621) <220> <221> exon <222> (2622)...(2867) <220> <221> intron <222> (2868)...(2942) <220> <221> exon <222> (2943)...(3897) <220> <221> intron <222> (3898)...(4030) <220> <221> exon <222> (4031)...(4516) <220> <221> intron <222> (4517)...(4616) <220> <221> exon <222> (4617)...(4909) <220> <221> intron <222> (4910)...(5007) <220> <221> exon <222> (5008)...(5081) <220> <221> intron <222> (5082)...(5195) <220> <221> exon <222> (5196)...(5446) <220> <221> intron <222> (5447)...(5523) <220> <221> exon <222> (5524)...(5756) <220> <221> polyA_site <222> 6173 <223> STRAIN: ATCC96594 <400> 1 ggaagacatg atggtgtggg tgtgagtatg agcgtgagcg tgggtatggg cctgggtgtg 60 ggtatgagcg gtggtggtga tggatggatg ggtgggtggc gtggaggggt ccgtgcggca 120 agatgttttc tctgggtagg agcgttctgc attggggcag gagaaaaaat agtgtggtta 180 cgggagatcg tggttacatc aagccatcgt cactgtaagg ctctgtaagg ctcggttgtt 240 aagaaggtaa ccaagtgtaa tcacttggtt cgcggggtga cacttaggct ctggcgatta 300 atatatctga agcagaccaa actattaaca atatactttt ggataagagg tttcaacaag 360 aatctcagct tgaggaaaac tcttatccaa gaaggcgcga gggcgtcccc gttttatatc 420 aggacccctc gcgcatttgg tctgccacta aagatataca tatgacgagc ctagagaggc 480 tcgagatcac gaaaactaaa aagatgaagc atgaaccatg caaactagag catgatggaa 540 aatgggcgaa gaggcataag ggatggaggg aacgaatagc ctgtaggggt aacccacgta 600 agagaacacg tgatacttaa cccgtatccc tgacagtcac ggtgtttctt gagagtcagt 660 aatgtccagc tgtgacctca cgtgactaaa cccgacacgt gtgcttcgac cgaggtggga 720 cgatcttttt tttgggggga gaaaccgagt gggacgatag agaggactac ggagaactgt 780 agtgaattgt agtgcgctca ctacggagag ttctagttga gcaagcgatg tgattttcaa 840 tacaatcccg gactacaagc tctctaatag agctctataa tagaaggaca aaagtcgtcc 900 cactcctatc tcccgcgcgt tttaatagag accgattgtt tttttcccta atgttttatt 960 ttctttcccc gatcggctca tttttcttct ctccgcgtat tcttcacaca acgctccctc 1020 cgatcttttt tcttcttgtt cctgttcctc ttcgtctcct tccattgtct tctttccttc 1080 cttccttcct tcttgcctct agccagcttc aacagcgacg tctctctctc tctgtgtggt 1140 gatctccgac tgtagtgtct ctctcggtca ctttcacgaa tcaacttcgt ttcttttctg 1200 atcgatcggt cgtctttccc tcaatccgtg catacactca cacttacact cacacccaca 1260 cactcaaaca cgctaaataa tcagatccgt ctccccttct tgatctcctt cggcttaggc 1320 aatggcttcc ttgttcggcc tccggcggtc ctcaaacgag cagccgcgct ctcctctgct 1380 catccaatcg aagtcatcct ttctaccttt gtcgtggtca ccttgacgta ctttcagttg 1440 atgtacacca tcaagcacag taatttgtac gtccgatcat ctatttgtcg tgttctcctt 1500 agtctctttc tcttcctcct ttgtctttcg cgtcagcgtg gctggatttc cgtctccatg 1560 tcatttccct tatttcctct tcctgtcatt tgttcctcta cttttctttc tctacctcct 1620 ttccctgtcg tttgctttcc ttcgccagtt gaccaccgat cctcaggatt catggctaac 1680 atgcccaaca caaacttgca tatcatctct cttcgtccac agtctttctc agacgattag 1740 cacacaatct accaccagct gggtcgtcga tgcgttcttc tctttgggat ccagatacct 1800 tgacctcgcg aaggttagtc agttgaccct ctcatgcttc ttttctctca gtcttgtgtg 1860 tgcgcatata cccactcata gacatcttcg tacgctgcac tttccctccc ttagcaagca 1920 gactcggccg atatctttat ggtcctcctc ggttacgtcc ttatgcacgg cacattcgtc 1980 cgactgttcc tcaactttcg tcggatgggc gcaaactttt ggctgccagg catggttctt 2040 gtctcgtcct cctttgcctt cctcaccgcc ctcctcgccg cctcgatcct caacgttccg 2100 atcgacccga tctgtctctc ggaagcactt cccttcctcg tgctcaccgt cggatttgac 2160 aaggacttta ccctcgcaaa atctgtgttc agctccccag aaatcgcacc cgtcatgctt 2220 agacgaaagc cggtgatcca accaggagat gacgacgatc tcgaacagga cgagcacagc 2280 agagtggccg ccaacaaggt tgacattcag tgggcccctc cggtcgccgc ctcccgtatc 2340 gtcattggct cggtcgagaa gatcgggtcc tcgatcgtca gagactttgc cctcgaggtc 2400 gccgtcctcc ttctcggagc cgccagcggg ctcggcggac tcaaggagtt ttgtaagctc 2460 gccgcgttaa ttttggtggc cgactgctgc ttcaccttta ccttctatgt cgccatcctc 2520 accgtcatgg tcgaggtaag ccttttcttc aagtttcttg ctgtcatttt cctttcgaca 2580 cgtatgctca tctttcgttt ccgtctctct cacctttcca ggttcaccga atcaagatca 2640 tccggggctt ccgaccggcc cacaataacc gaacaccgaa tactgtgccc tctaccccta 2700 ctatcgacgg tcaatctacc aacagatccg gcatctcgtc agggcctccg gcccgaccga 2760 ccgtgcccgt gtggaagaaa gtctggagga agctcatggg cccagagatc gattgggcgt 2820 ccgaagctga ggctcgaaac ccggttccaa agttgaagtt gctcttagta agtaaacttc 2880 ctttgttctt ctcatcattc tttatctccg aatcctgacg tcggaccctt ctcgattcaa 2940 agatcttggc ctttcttatc cttcatatcc tcaacctttg cacgcctctg accgagacca 3000 cagctatcaa gcgatcgtct agcatacacc agcccattta tgccgaccct gctcatccga 3060 tcgcacagac aaacacgacg ctccatcggg cgcacagcct agtcatcttt gatcagttcc 3120 ttagtgactg gacgaccatc gtcggagatc caatcatgag caagtggatc atcatcaccc 3180 tgggcgtgtc catcctgctg aacgggttcc tcctaaaagg gatcgcttct ggctctgctc 3240 tcggacccgg tcgtgccgga ggaggaggag ctgccgccgc cgccgccgtc ttgctcggag 3300 cgtgggaaat cgtcgattgg aacaatgaga cagagacctc aacgaacact ccggctggtc 3360 cacccggcca caagaaccag aatgtcaacc tccgactcag tctcgagcgg gatactggtc 3420 tcctccgtta ccagcgtgag caggcctacc aggcccagtc tcagatcctc gctcctattt 3480 caccggtctc tgtcgcgccc gtcgtctcca acggtaacgg taacgcatcg aaatcgattg 3540 agaaaccaat gcctcgtttg gtggtcccta acggaccaag atccttgcct gaatcaccac 3600 cttcgacgac agaatcaacc ccggtcaaca aggttatcat cggtggaccg tccgacaggc 3660 ctgccctaga cggactcgcc aatggaaacg gtgccgtccc ccttgacaaa caaactgtgc 3720 ttggcatgag gtcgatcgaa gaatgcgaag aaattatgaa gagtggtctc gggccttact 3780 cactcaacga cgaagaattg attttgttga ctcaaaaggg aaagattccg ccgtactcgc 3840 tggaaaaagc attgcagaac tgtgagcggg cggtcaagat tcgaagggcg gttatctgta 3900 ggtctttttc tcctttgaat ttcaagcctt ggaggagagg aaagtgcttc ggggtacaat 3960 acaggttgtg caaacaaacc aagagaaact aaagaaaact ttcttctcct ctctctcccc 4020 tcgacgtcag cccgagcatc cgttactaag acgctggaaa cctcggactt gcccatgaag 4080 gattacgact actcgaaagt gatgggcgca tgctgtgaga acgttgtcgg atatatgcct 4140 ctccctgtcg gaatcgctgg tccacttaac attgatggcg aggtcgtccc catcccgatg 4200 gccaccaccg agggaactct cgtggcctcg acgtcgagag gttgcaaagc gctcaacgcg 4260 ggtggcggag tgaccaccgt catcacccag gatgcgatga cgagaggacc ggtggtggat 4320 ttcccttcgg tctctcaggc cgcacaggcc aaacgatggt tggattcggt cgaaggaatg 4380 gaggttatgg ccgcttcgtt caactcgact tctagattcg ccaggttgca gagcatcaag 4440 tgtggaatgg ccggccgatc gctatacatc cgtttggcga ccagtaccgg agatgcgatg 4500 ggaatgaaca tggctggtga gtgcgacgag ttttctttgt tcttcttgtg cggaccatgt 4560 tttctcatcc agccaattca ttcttcattc cttctcggtg tttggcaacc ttttaggtaa 4620 aggaacggag aaagctttgg aaaccctgtc cgagtacttc ccatccatgc agatccttgc 4680 tctttctggt aactactgta tcgacaagaa gccttctgcc atcaactgga ttgagggccg 4740 tggaaagtcc gtggtggccg agtcggtgat ccctggagcg atcgtcaagt ctgtcctcaa 4800 gacaacggtt gcggatctcg tcaacttgaa cattaagaaa aacttgatcg gaagtgccat 4860 ggcaggcagc attggaggat tcaacgccca cgcgtcgaat attttgactg tgcgtacttc 4920 tctttccata ttcgtcctcg tttaatttct tttctgtcca gtcttatgac gtctgattgg 4980 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210 215 220 Ile Glu Gly Lys Gln Glu Gly Gly Met Glu Ala Ile Lys Ser Phe Thr 225 230 235 240 Ser Ile Arg Phe Leu Ile Thr Asp Ser Arg Ile Gly Arg Asp Thr Arg 245 250 255 Ser Leu Val Ala Gly Val Asn Ala Arg Leu Ile Gln Glu Pro Glu Val 260 265 270 Ile Val Pro Leu Leu Glu Ala Ile Gln Gln Ile Ala Asp Glu Ala Ile 275 280 285 Arg Cys Leu Lys Asp Ser Glu Met Glu Arg Ala Val Met Ile Asp Arg 290 295 300 Leu Gln Asn Leu Val Ser Glu Asn His Ala His Leu Ala Ala Leu Gly 305 310 315 320 Val Ser His Pro Ser Leu Glu Glu Ile Ile Arg Ile Gly Ala Asp Lys 325 330 335 Pro Phe Glu Leu Arg Thr Lys Leu Thr Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys 340 345 350 Ala Val Thr Leu Val Pro Asp Asp Phe Ser Thr Glu Thr Leu Gln Ala 355 360 365 Leu Met Glu Thr Leu Val Gln Ser Ser Phe Ala Pro Tyr Ile Ala Arg 370 375 380 Val Gly Gly Ser Gly Val Gly Phe Leu Ser Ser Thr Lys Ala Asp Pro 385 390 395 400 Glu Asp Gly Glu Asn Arg Leu Lys Asp Gly Leu Val Gly Thr Glu Ile 405 410 415 Asp Glu Leu Asp Arg Trp Ala Leu Lys Thr Gly Arg Trp Ser Phe Ala 420 425 430 <210> 9 <211> 401 <212> PRT <213> Phaffia rhodozyma <220> <223> STRAIN: ATCC96594 <400> 9 Met Val His Ile Ala Thr Ala Ser Ala Pro Val Asn Ile Ala Cys Ile 1 5 10 15 Lys Tyr Trp Gly Lys Arg Asp Thr Lys Leu Ile Leu Pro Thr Asn Ser 20 25 30 Ser Leu Ser Val Thr Leu Asp Gln Asp His Leu Arg Ser Thr Thr Ser 35 40 45 Ser Ala Cys Asp Ala Ser Phe Glu Lys Asp Arg Leu Trp Leu Asn Gly 50 55 60 Ile Glu Glu Glu Val Lys Ala Gly Gly Arg Leu Asp Val Cys Ile Lys 65 70 75 80 Glu Met Lys Lys Leu Arg Ala Gln Glu Glu Glu Lys Asp Ala Gly Leu 85 90 95 Glu Lys Leu Ser Ser Phe Asn Val His Leu Ala Ser Tyr Asn Asn Phe 100 105 110 Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ala Ser Gly Leu Ala Ala Leu 115 120 125 Val Ala Ser Leu Ala Ser Leu Tyr Asn Leu Pro Thr Asn Ala Ser Glu 130 135 140 Leu Ser Leu Ile Ala Arg Gln Gly Ser Gly Ser Ala Cys Arg Ser Leu 145 150 155 160 Phe Gly Gly Phe Val Ala Trp Glu Gln Gly Lys Leu Ser Ser Gly Thr 165 170 175 Asp Ser Phe Ala Val Gln Val Glu Pro Arg Glu His Trp Pro Ser Leu 180 185 190 His Ala Leu Ile Cys Val Val Ser Asp Glu Lys Lys Thr Thr Ala Ser 195 200 205 Thr Ala Gly Met Gln Thr Thr Val Asn Thr Ser Pro Leu Leu Gln His 210 215 220 Arg Ile Glu His Val Val Pro Ala Arg Met Glu Ala Ile Thr Gln Ala 225 230 235 240 Ile Arg Ala Lys Asp Phe Asp Ser Phe Ala Lys Ile Thr Met Lys Asp 245 250 255 Ser Asn Gln Phe His Ala Val Cys Leu Asp Ser Glu Pro Pro Ile Phe 260 265 270 Tyr Leu Asn Asp Val Ser Arg Ser Ile Ile His Leu Val Thr Glu Leu 275 280 285 Asn Arg Val Ser Val Gln Ala Gly Gly Pro Val Leu Ala Ala Tyr Thr 290 295 300 Phe Asp Ala Gly Pro Asn Ala Val Ile Tyr Ala Glu Glu Ser Ser Met 305 310 315 320 Pro Glu Ile Ile Arg Leu Ile Glu Arg Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Ala 325 330 335 Phe Glu Asn Pro Phe Gly Val Asn Thr Glu Gly Gly Asp Ala Leu Arg 340 345 350 Glu Gly Phe Asn Gln Asn Val Ala Pro Val Phe Arg Lys Gly Ser Val 355 360 365 Ala Arg Leu Ile His Thr Arg Ile Gly Asp Gly Pro Arg Thr Tyr Gly 370 375 380 Glu Glu Glu Ser Leu Ile Gly Glu Asp Gly Leu Pro Lys Val Val Lys 385 390 395 400 Ala <210> 10 <211> 355 <212> PRT <213> Phaffia rhodozyma <220> <223> STRAIN: ATCC96594 <400> 10 Met Ser Thr Thr Pro Glu Glu Lys Lys Ala Ala Arg Ala Lys Phe Glu 1 5 10 15 Ala Val Phe Pro Val Ile Ala Asp Glu Ile Leu Asp Tyr Met Lys Gly 20 25 30 Glu Gly Met Pro Ala Glu Ala Leu Glu Trp Met Asn Lys Asn Leu Tyr 35 40 45 Tyr Asn Thr Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp 50 55 60 Thr Tyr Ile Leu Leu Ser Pro Ser Gly Lys Asp Ile Ser Glu Glu Glu 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Ala Ala Ile Leu Gly Trp Cys Ile Glu Leu Leu Gln Ala 85 90 95 Tyr Phe Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Ala Ser Ile Thr Arg Arg 100 105 110 Gly Gln Pro Cys Trp Tyr Lys Val Glu Gly Val Ser Asn Ile Ala Ile 115 120 125 Asn Asn Ala Phe Met Leu Glu Gly Ala Ile Tyr Phe Leu Leu Lys Lys 130 135 140 His Phe Arg Lys Gln Ser Tyr Tyr Val Asp Leu Leu Glu Leu Phe His 145 150 155 160 Asp Val Thr Phe Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Ile Asp Leu Leu Thr 165 170 175 Ala Pro Glu Asp His Val Asp Leu Asp Lys Phe Ser Leu Asn Lys His 180 185 190 His Leu Ile Val Val Tyr Lys Thr Ala Phe Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro 195 200 205 Val Ala Leu Ala Met Arg Met Val Gly Val Thr Asp Glu Glu Ala Tyr 210 215 220 Lys Leu Ala Leu Ser Ile Leu Ile Pro Met Gly Glu Tyr Phe Gln Val 225 230 235 240 Gln Asp Asp Val Leu Asp Ala Phe Arg Pro Pro Glu Ile Leu Gly Lys 245 250 255 Ile Gly Thr Asp Ile Leu Asp Asn Lys Cys Ser Trp Pro Ile Asn Leu 260 265 270 Ala Leu Ser Pro Ala Ser Pro Ala Gln Arg Glu Ile Leu Asp Thr Ser 275 280 285 Tyr Gly Gln Lys Asn Ser Glu Ala Glu Ala Arg Val Lys Ala Leu Tyr 290 295 300 Ala Glu Leu Asp Ile Gln Gly Lys Phe Asn Ala Tyr Glu Gln Gln Ser 305 310 315 320 Tyr Glu Ser Leu Asn Lys Leu Ile Asp Ser Ile Asp Glu Glu Lys Ser 325 330 335 Gly Leu Lys Lys Glu Val Phe His Ser Phe Leu Gly Lys Val Tyr Lys 340 345 350 Arg Ser Lys 355 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggnaartaya cnathggnyt nggnca 26 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tanarnswns wngtrtacat rttncc 26 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gaagaacccc atcaaaagcc tcga 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 aaaagcctcg agatccttgt gagcg 25 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 agaagccaga agagaaaa 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tcgtcgagga aagtagat
１８ <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggtaccatat gtatccttct actaccgaac 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gcatgcggat cctcaagcag aagggacctg 30 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gcntgytgyg araaygtnat hggntayatg cc 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 atccarttda tngcngcngg yttyttrtcn gt 32 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ggccattcca cacttgatgc tctgc 25 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ggccgatatc tttatggtcc t 21 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ggtaccgaag aaattatgaa gagtgg 26 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ctgcagtcag gcatccacgt tcacac 26 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gcnccnggna argtnathyt nttyggnga 29 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ccccangtns wnacngcrtt rtcnacncc 29 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 acatgctgta gtccatg 17 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 actcggattc catgga 16 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <223> STRAIN: ATCC96594 <400> 29 ttgttgtcgt agcagtgggt gagag 25 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 ggaagaggaa gagaaaag 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ttgccgaact caatgtag 18 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <223> STRAIN: ATCC96594 <400> 32 ggatccatga gagcccaaaa agaaga 26 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <223> STRAIN: ATCC96594 <400> 33 gtcgactcaa gcaaaagacc aacgac 26 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 htnaartayt tgggnaarmg nga 23 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gcrttnggnc cngcrtcraa ngtrtangc 29 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ccgaactctc gctcatcgcc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 cagatcagcg cgtggagtga 20 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 cargcntayt tyytngtngc ngayga 26 <210> 39 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 cayttrttrt cytgdatrtc ngtnccdaty tt 32 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 atcctcatcc cgatgggtga atact 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 aggagcggtc aacagatcga tgagc 25 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gaattcatat gtccactacg cctga 25 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gtcgacggta cctatcactc ccgcc 25

【図面の簡単な説明】

【図１】 P. rhodozymaにおけるアセチル補酵素Aから
アスタキサンチンへの推測される生合成経路の概要を示
した図である。

【図２】 P. rhodozymaの擬mvk遺伝子のアミノ末端に
人工的なヌクレオチドを付加して得られた、人工的なmv
k遺伝子を利用した発現研究を示す図である。50μlの培
養液から得た細胞を、10％ドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に供した。レ
ーン1、大腸菌(M15(pREP4)(pQE30)IPTGなし)； レーン
2、大腸菌(M15(pREP4)(pQE30)1mM IPTG) ； レーン3、
分子量マーカー(105kDa, 82.0kDa, 49.0kDa, 33.3kDaお
よび28.6kDa, 上から下へ、BIO-RAD)； レーン4、大腸
菌(M15(pREP4)(pMK1209 #3334)IPTGなし) ； レーン5、
大腸菌(M15(pREP4)(pMK1209 #3334) 1mM IPTG)。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｐ 23/00 23/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 瀬戸口 豊 神奈川県藤沢市片瀬山４−27−２

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 メバロン酸経路、またはイソペンテニル
   ピロリン酸からファルネシルピロリン酸への経路に関連
   する酵素をコードする単離DNA配列。
2. 【請求項２】 酵素が3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリ
   ル-補酵素A合成酵素活性、3-ヒドロキシ-3-メチルグル
   タリル-補酵素A還元酵素活性、メバロン酸キナーゼ活
   性、メバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素活性、およびファ
   ルネシルピロリン酸合成酵素活性からなる群より選択さ
   れる活性を有する、請求項1記載の単離DNA配列。
3. 【請求項３】 以下の点を特徴とする、請求項1または2
   記載の単離DNA配列： (a)該DNA配列が、配列番号：6、7、8、9および10に記載
   の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を持つ酵
   素をコードする、または(b)該DNA配列が、(i)アリル変
   異体と、(ii)1つ以上のアミノ酸付加、挿入、欠失、お
   よび/または置換を有し、記述された酵素活性を有する
   酵素とから選択される酵素の変異体をコードする。
4. 【請求項４】 Phaffia rhodozymaの遺伝子に由来し、
   以下の（i）〜（iii）から選択される、請求項1〜3のい
   ずれか一項記載の単離DNA配列： (i)配列番号：1、2、4、または5に記載のDNA配列、(ii)
   配列番号：1、2、4、または5に記載のDNA配列のアイソ
   コード変異体またはアリル変異体、および(iii)1つ以上
   のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、および/または置
   換を有し、該酵素活性を有するポリペプチドをコードす
   る、配列番号：1、2、4または5に記載のDNA配列の誘導
   体。
5. 【請求項５】 以下の（i）〜（iii）から選択される単
   離DNA配列： (i)配列番号：3に記載のDNA配列、(ii)配列番号：3に記
   載のDNA配列のアイソコード変異体またはアリル変異
   体、および(iii)1つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、
   欠失、および/または置換を有し、メバロン酸キナーゼ
   活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号：3
   記載のDNA配列の誘導体。
6. 【請求項６】 以下の（i）および（ii）から選択され
   る、請求項1または2記載の単離DNA配列： (i)配列番号：1〜10に記載の配列、またはその相補鎖も
   しくは断片と、標準的な条件下でハイブリダイズするDN
   A配列、および(ii)遺伝コードの縮退のために(i)で定義
   されたようにハイブリダイズしないが、配列番号：1〜1
   0に記載の配列と完全に同一なアミノ酸配列を有するポ
   リペプチド、または上記(i)によって定義されたDNA配列
   によってコードされるポリペプチドをコードするDNA配
   列。
7. 【請求項７】 請求項1〜6のいずれか一項記載のDNA配
   列を含むベクターまたはプラスミド。
8. 【請求項８】 請求項1〜6のいずれか一項記載のDNA配
   列、または請求項7記載のベクターもしくはプラスミド
   によって形質転換またはトランスフェクションされた宿
   主細胞。
9. 【請求項９】 メバロン酸経路またはイソペンテニルピ
   ロリン酸からファルネシルピロリン酸への経路に関連す
   る酵素を製造する方法であって、該酵素が産生されるよ
   うな条件下で、請求項8記載の宿主細胞を培養すること
   を含む方法。
10. 【請求項１０】 適当な培養条件で請求項8記載の宿主
    細胞を培養することを含む、イソプレノイドまたはカロ
    テノイド、好ましくはアスタキサンチンの製造法。