TWI250210B - An isolated DNA sequence coding for an enzyme involved in the mevalonate pathway or the pathway from isopentenyl pyrophosphate to farnesyl pyrophosphate - Google Patents

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Kazuyuki Ojima
Yutaka Setoguchi
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Description

1250210 A7
1250210 A7 I ---~_ 五、發明說明（2 ) 97，1997)。且Verdoes等人報告更多改良的載體，獲得法 菲亞酵母的轉形物，及其三個能生產胡蘿蔔素的基因，其 編碼催化從焦磷酸槐牛兒基桅牛兒酯到A -胡蘿蔔素之反 應的酵素（國際專利W097/23633 )。遺傳工程方法對法菲 亞酵母之品系改良研究的重要性在不久的將來將會增加， 克服藉著傳統方法所達到的生產力。 報告了來自一般代謝產物乙醯基_c〇A的生產胡蘿蔔素之 路徑，如圖1所示，在能生產胡蘿蔔素的眞核生物中包括 了多個酵素步驟。將兩個乙醯基_c〇A的分子縮合產生乙 醯乙醯基-CoA，藉著3-羥甲基-3-戊二醯基-CoA合成酶的 作用，將其轉變爲3_羥基_3-甲基戊二醯基_c〇A (HMG_
CoA)。接著，3_羥基-3_甲基戊二醯基_coA還原酶將HMG- 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製
Co A轉變爲甲經戊酸’然後藉著兩個激酶（甲義戊酸激酶 和磷酸甲羥戊酸激酶）的作用將兩個分子的磷酸殘基加至 其上。然後藉著甲羥戊酸脱羧酶的作用，將焦磷酸甲羥戊 酸脱複，產生異戊烯焦磷酸（IPP)，其成爲活生物必需之 各種異戊二烯分子的建築單元。該路徑叫做甲羥戊酸路 徑，係取自其重要的中間物甲羥戊酸。藉著Ipp異構酶將 IPP異構化成二甲基芳基焦磷酸（DMApp )。然後，藉著頭 對尾的縮合作用，將IPP和DMAPP轉變爲C1G單元，桅牛兒 基焦磷酸（GPP)。在GPP和IPP之間的類似縮合反應中， 將GPP轉變爲cls單元，焦磷酸法呢酯（Fpp)是在動物中之 膽固醇，在酵母菌中之麥角留醇的重要受酶質，並爲諸如 RAS蛋白質之類的調節蛋白質的法呢基化作用的重要受酶 I____^ 本紙張尺度適用中國國冢標準（CNS)A4規格⑵0 x 297公着）" 1250210 A7 B7 五、發明說明（3 質。一般而言，從IPP和DMAPP生物合成GPP和FPP，係 由 種叫做FPP合成酶的酵素催化（Laskovics等人，
Biochemistry，20，1893-1901，1981 )。另一方面，在諸如 具細菌之類的原核生物中，在經由得自丙酮酸鹽，在酵母 菌和動物中缺乏的1-脱氧木酮糖-5_磷酸之不同路徑中，合 成異戊錦Γ焦鱗故（Rohmer等人，6丨〇〇11€111.了.，295，517-524，1993 )。在類固醇生物合成的專門研究中，顯示類固 醇代謝中限制速率的步驟，是在該甲經戊酸路徑的步驟 中’尤其是在其由HMG-CoA合成和HMG_CoA還原酶催化 的早期步驟中。發明者注意到類固醇和類胡蘿蔔素的生物 合成路徑，分享其從乙醯基_CoA到FPP的中間物路徑，並 没法改良在能產生胡蘿蔔素之路徑中限制速率的步驟，其 可能存在甲羥戊酸路徑的步驟中，尤其是在早期的甲羥戊 酸路徑中，像是由HMG-CoA合成酶和HMG-CoA還原酶催 化之步驟，而得以改良類胡蘿蔔素的生產力，特別是蝦青 素。 本發明以發明者以上的努力爲基礎而產生。根據本發 明，提供涉及從乙醯基-CoA到FPP之甲羥戊酸路徑的基因 和酵素，其爲可用來改良蝦青素生產過程的生物學材料。 本發明涉及選殖和決定編碼HMG-CoA合成酶、HMG-CoA 還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脱羧酶和Fpp合 成酶的基因。本發明亦涉及由於在諸如大腸桿菌（E coli) 之類的適當宿主生物中表現這類基因的結果，定出酵素的 特徵。可在適當的宿主中擴大這些基因，像是法菲亞酵 (請先閱讀背面之注咅？事項再
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -6-
經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 1250210 母，並可藉著在適當的培養條件下，在適當的培養基中培 養這類轉形物，來證實其對產生胡蘿蔔素之作用的影響: 根據本發明，提供編碼涉及甲羥戊酸路徑，或從異戊烯 焦磷酸至焦磷酸法呢酯之反應路徑的酵素之經過分離的 DNA序列。更特定而言，該酵素是具有選自包括弘羥基_ 3-甲基戊二醯基_c：oA合成酶活性、3-巍基_3_甲基戊二醯基 -CoA還原酶活性、甲邊戊酸激酶活性、甲護戊酸焦嶙酸 脱羧酶活性，以及焦磷酸法呢酯合成酶活性之活性的那 些。 可更特定地描述該經過分離之DNA序列的特徵，其特徵 在於（a)其編碼具有選自包括在SEq ID n〇s: 6、7、8、9 和10號中描述之那些的胺基酸序列的酵素，或（b)其編碼 選自（i)對偶基因變體和（ii)具有一或多個胺基添加、插 入、刪除及/或取代’並具有所述之酵素活性之酵素的變 體。上文提及之特別指出的經過分離之DNA序列，可以 是能夠衍生自法菲亞酵母之基因的，並選自（i)以SEq NOs: 1、2、4 或 5 號表示之DNA序列；（ii)以 SEQ ID NOs: 1、2、4或5號表示之DNA序列的同類編碼（isocoding)或 對偶基因變體；以及（山）以SEq ID NOs: 1、2、4或5號表 示之DNA序列，帶有添加、插入、刪除及/或取代一或多 個核甞酸（們），並編碼具有該酵素活性之多肽的衍生物。 這類衍生物可以在本文中揭示之DNA序列爲基礎，藉著 此項技藝中已知之方法，以及由例如Sambrook等人 (Molecular Cloning ? Cold Spring Harbour Laboratory Press ? 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）
1250210 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（5 )
New York，USA，第2版，1989)所揭示的方法，以重組方 式來製造之。在此項技藝中，已知在蛋白質和肽中的胺基 酸交換，通常不會改變活性，並由例如H. Neurath和R.L. Hill 描述在 i)the ProteinsO (Academic Press，New York， 1979，特別參見圖6，第14頁）中。最常見的交換是： Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、 Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、 Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly，以及這些 的顚倒。 本發明亦提供經過分離的DNA序列，其選自（i )以SE Q ID NO: 3號表示之DNA序列；（ii)以SEQ ID NO: 3號 表示之DNA序列的等編碼或對偶基因變體；以及（iii)以 SEQ ID NO: 3號表示之DNA序列，具有添加、插入、 删除及/或取代一或多個核甞酸（們），並編碼具有甲羥戊 酸激酶活性之多肽的衍生物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注音？事項再辦寫本頁) 此外，本發明針對如同上文指定，以及如同例如在序列 一覽表中揭示的那些DNA序列，以及其互補股，或包括 這些序列的那些、在標準條件下與這類序列或其片段雜交 的DNA序列，以及因爲遺傳密碼的簡併，在標準條件下 不與這類序列雜交，但編碼具有恰好相同之胺基酸序列的 DNA序列。 在上下文中，雜交的”標準條件”意指由熟諳此藝者經常 用來檢測特定雜交信號的條件，並描述於例如Sambrook等 人，”Molecular Cloning"第 2 版，Cold Spring Harbour -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210
五、發明說明（6
Laboratory Press 1989，χτΛ ,
New York，或最好是所謂的嚴格 雜交和非·嚴格沖洗之侔株，+ & μ ^件’或更佳的是所謂的嚴格雜交 和嚴格沖洗之條件，爲熟諳此藝者㈣悉的，並被描述在 例如―等人(例如）中。而且，可藉著聚合酶連鎖反 應來製造DNA序列，係藉著使用以在本文中揭示之dna 序列爲基礎，藉著此項技藝中已知的方法來設計的引子， 亦爲本發明之主題。明瞭本發明的DNA序列，亦可以合 成方式來製造，如同在例如歐洲專利747 483號中的描 述0 本發明更進一步提供的是重組的DNA，較佳的是包含編 碼在甲！A酸路徑，4是從異戊缔焦_酸到焦鱗酸法呢醋 之反應路徑中具有酵素功能之序列的載體及/或質體。該 重組的DNA載體及/或質體可包括調節區，像是啓動基因 和終止轉錄之序列，以及上文指定之DNAs的打開密碼。 本發明亦提供該重组DNA、載體或質體轉形宿主生物的 用途。藉著使用能夠過度表現編碼涉及甲羥戊酸路徑或從 異戊晞焦磷酸到焦磷酸法呢酯之反應路徑的酵素之DNA 序列的重組DNA，獲得重組的生物。利用該重組dna轉 形的宿主生物，在改良類異戊二烯和類胡蘿蔔素的生產過 私上可能是有用的，特別是蝦青素。因此本發明亦提供這 類重組的生物/經過轉形的宿主。 本發明更提供產製類異戊二烯或類胡蘿蔔素的方法，較 佳的是類胡蘿蔔素，其包括培養如此而獲得的重組生物。 本發明亦關於產製涉及甲羥戊酸路徑，或從異戊晞焦鱗 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再^寫本頁) . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 B7 五、發明說明（7 ) 酸到焦磷酸法呢酯之反應路徑之酵素的方法，其包括在有 助於產製該酵素之條件下，培養上文提及之重組生物，以 及釋放該酵素本身。 以所附之圖片和下文提供之更詳細的解釋爲基礎，將更 容易明瞭本發明。 圖1描述在法菲亞酵母中推衍的從乙醯基-CoA到蝦青素 之生物合成路徑的圖解。 圖2顯示藉著使用人造之mvk基因的表現研究，其係獲 自在得自法菲亞酵母之假-mvk基因的胺基末端，人工地 添加核甞酸。使得自5 0微升肉湯的細胞接受10%硫酸十二 酯鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE )。跑道1，大腸桿 菌（M15 (pREP4) (pQE30)無 IPTG);路道 2，大腸样菌 (M15 (pREP4) (pQE30)，帶有 ImM IPTG);跑道 3，分子 量標記（105 kDa，82.0 kDa，49.0 kDa，33.3 kDa 及 28.6 kDa，高至低，BIO-RAD);跑道4，大腸桿菌（M15 (pREP4) (pMK1209 #3334)無 IPTG);跑道 5，大腸桿菌 (M15 (pREP4) (pMK1209 #3334)，帶有 ImMIPTG)。 本發明提供經過分離的DNA序列，其編碼涉及包括甲羥 戊酸路徑或從異戊烯焦磷酸到焦磷酸法呢酯之反應路徑的 生物路徑之酵素。可藉著在法菲亞酵母中之甲羥戊酸路 徑，或是從異戊晞焦磷酸到焦磷酸法呢酯之反應路徑的那 些來舉例説明該酵素，像是3-羥基_3_甲基戊二醯基-CoA 合成酶、3_羥基-3-甲基桅牛兒基_CoA還原酶、甲羥戊酸 激酶、甲羥戊酸焦磷酸脱羧酶，以及焦磷酸法呢酯合成 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 B7 五、發明說明（8 ) 酶。本發明可用來產製涉及從甲羥戊酸路徑到能產生胡蘿 蔔素之路徑的生物路徑之化合物，以及各種衍生自這類化 合物的產物。在甲羥戊酸路徑中涉及的化合物爲乙醯乙酿 基-CoA、3-¾甲基-3-槐牛兒基-CoA、甲經戊酸、甲瘦戊 酸-磷酸、甲羥戊酸-焦磷酸，以及異戊烯基-焦轉酸。接 著，經由如同在圖1中指出的”異戊二烯生物合成”反應， 經由槐牛兒基-焦磷酸和焦磷酸法呢酯，將異戊烯基-焦磷 阪轉變爲槐牛兒基槐牛兒基-焦鱗酸。涉及能產生胡蘿荀 素之路徑的化合物爲桅牛兒基槐牛兒基·焦磷酸、八氫番 另p紅素、番蘇紅素、卢·胡蘿蔔素和蝦青素。在涉及上文· 提及之生物合成的化合物中，可利用桅牛兒基·焦磷酸來 產製泛醌。可使用焦磷酸法呢酯來產製類固醇，像是膽固 醇和麥角留醇。桅牛兒基桅牛兒基·焦磷酸是可用來產製 維生素K、維生素E、葉綠素及其類似物的物質。因此當 本發明應用在類異戊二烯的生物產製上時，它將是特別有 用的。類異戊二烯是共同的名詞，其集體地稱呼一系列具 有異戊烯-焦磷酸作爲骨架單位的化合物。類異戊二晞的 更多實例爲維生素A和維生素D3。 本發明之該DNA可意指cDNA，其僅含有在其5，_和3，_未轉 錄區中之短片段之間側面的打開密碼，以及基因組 DNA，其亦含有它的調節序列，像是它的啓動基因和終 止轉錄的序列，爲表現感興趣之基因所必需的。 一般而言，基因由數個部份所構成，其具有彼此不同的 功能。在眞核生物中，轉錄成早熟信使RNA (pre-mRNA) -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（9 ) 之編碼相對應蛋白質的基因與核糖體RNA (rRNA)、小形 核RNA (snRNA)和轉移rna (tRNA)的基因不同。雖然聚合 酶Π (ΡοΙΠ)在轉錄事件中扮演著中心的角色，但是沒有覆 蓋含有啓動基因之上游區的cis要素和上游活化序列 (UAS ) ’以及反式-作用的蛋白質要素，ρ〇1π不能單獨啓 動轉錄作用。首先，表現由認得在基因5，_鄰近區中之啓動 基因序列的數個基本蛋白質成份所構成的轉錄起始複合 物。在该事件中，需要一些額外的參與者，在基因的案例 中，在一些特定的調節之下表現，像是熱休克反應，或是 通應營養的缺乏等等。在這類的案例中，需要玎八8出現在 未轉錄上游區，圍繞著啓動基因序列，以及一些認得 UAS並與其結合的正或負向調節蛋白質。藉著這些圍繞該 啓動基因之反式-作用因子的結合作用，影響轉錄起始複 合物與啓動基因序列的結合強度，而這便得以調節轉錄之 在藉著磷酸化作用活化轉錄起始複合物之後，轉錄起始 複合物從轉錄起始部位開始轉錄。 合物因爲延伸複合物，從啓動基因 (該步驟叫做啓動基因的清除事件） 錄，直到其達到終止轉錄的序列爲 。某些部份的轉錄起始複
加入多腺荅酸，修改如此而產生的Pre_mRNA。 從密碼區移出插入序列結構，並混合表現序列部 297公釐） 本紙張尺度義巾_國糸標準(CNS)A4規格— 1250210 A7 B7 五、發明說明（10 ) 份，產生打開密碼，其序列相當於相對應之蛋白質的初級 胺基酸序列。在其中產生成熟mRNA的修改作用，是穩定 基因表現所必需的。cDNA之一般名詞，相當於從該成熟 mRNA逆向-轉錄的DNA序列。可藉著衍生自病毒物種的 逆向轉錄酶，藉著使用成熟的mRNA作爲模板，以實驗方 式合成之。 欲表現衍生自眞核生物的基因，經常使用將cDNA選殖 到在大腸桿菌中之表現載體内的程序，如同在本發明中所 示的。這是因爲插入序列結構的特異性在生物之間會改 變，以及不能由其他物種辨認該插入序列的事實。事實 上，原核生物在其本身的遺傳背景上，不具有插入序列之 結構。即使是在酵母菌中，遺傳背景在酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae )户斤屬的囊子菌綱（ascomycetea)， 和法菲亞酵母所屬的擔子菌綱（basidiomycetea)之間仍是 不同的。Wery等人顯示得自法菲亞酵母之肌動蛋白基因 的插入序列，不能被囊子菌綱之酵母菌酒酵母菌辨認，亦 不能與其接合（Yeast，12，641-651，1996)。 一些其他的研究者報告了某些種類基因之涉及調節其基 因表現的插入序列結構（Dabeva，M. D·等人，Proc· Natl-Acad· Sci. USA ， 83 ， 5854 ， 1986) 。 在感興趣基因 之自我-選殖的案例中，其插入序列結構涉及它本身之基因表現的 這類調節，使用具有其插入序列的基因組片段，可能是很 重要的。 欲應用遺傳工程的方法來進行品系改良的研究，需要在 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項
Η 頁I 訂 i 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210
五、發明說明（11 ) 諸如轉錄和轉譯之類的事件上研究其遺傳機轉。欲研究遺 傳機轉’決定諸如其UAS、啓動基因、插人㈣結構和終 止轉錄之序列之類的遺傳序列是很重要的。 根據本發明，從法菲亞酵母之基因組DNA中選殖編碼涉 及甲羥戊酸路徑之酵素的基因，並決定其含有111^〇_0:〇八 t成酶（hmc)基因、HMG_c〇A還原酶（hmg)基因、甲羥戊 酸激酶（mvk)基因、甲羥戊酸焦磷酸脱羧酶（mpd)基因和 FPP合成酶（fps)基因，包括其5，_和3，_鄰近區，以及其插 入序列結構的基因組序列。 首先，我們使用簡併的PCR方法，選殖一部份含有 基因、hmg基因、mvk基因、mpd基因和铷基因之部份的 基因片段。該簡併PCR是選殖感興趣之基因，其對得自其 他物種、具有相同或類似功能的已知酵素具有高度之胺基 酸序列同源性的方法。藉著相對應核苷酸簡併的,，）之胺 基酸序列的逆相轉譯，來設計簡併引子，其在簡併pcR中 用來當作引子。在這類簡併引子中，經常使用由任何A、 C、G或T構成的混合引子，或是在雙關性密碼處含有肌 嘗的引子。在本發明中，使用這類混合引子作爲簡併引子 來選殖上述的基因。所使用之PCR.件依據在後文中描述 之待選殖的基因而有所改變。 可k染色體中，藉著使用如同上述之簡併pCR獲得的部 份DNA片段，在將其標記之後作爲探針，篩選以噬菌體 載體或質體載體，在適當宿主中建構的基因組庫，來選殖 含有其舍碼區’帶有其插入序列以及其調節區，像是啓動 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再"
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 B7 五、發明說明（12 ) 基因或終止轉錄之序列的完整基因。通常，在建構基因組 庫，和諸如定序、限制消化作用、連接作用及其類似者之 類的後續遺傳操作中，經常使用大腸桿菌作爲宿主品系， 以及大腸桿菌載體，噬菌體載體，如λ噬菌體載體，或是 質體載體，如pUC載體。在本發明中，依據插入序列的大 小，以λ載體、λ ΖΑΡΠ和λ DASHII的衍生作用來建構法 菲亞酵母的EcoRI基因組庫。在建構基因組庫之前。藉著 每個基因的南方墨點雜交作用決定插入序列的大小，必殖 何種長度的插入序列。在本發明中，依據由供應商 (Boehringer-Mannheim)製備之草案，利用毛地黃毒楚 (DIG)，一種類固醇半抗原，代替傳統的32P標記，標示 用來作爲探針的DNA。藉著使用DIG-標示之DNA片段， 其具有一部份感興趣之基因作爲探針，來篩選從法菲亞酵 母之染色體建構的基因、组庫。挑選雜交的斑點，並用來進 行更進一步的研究。在使用λ DASHII的案例（插入序列的 大小從9 kb到23 kb)中，藉著EcoRI消化所製備之λ DNA，接著將EcoRI插入序列選殖到質體載體中，像是 pUC19或pBluescriptll SK+。當在建構基因組庫中使用；I ZAPII時，藉著使用單股M13噬菌體，Ex協助噬菌體 (Stratagene)，在選殖到質體載體内的後繼步驟中，便利 地使用活體内的刪除草案。以定序來檢查如此所獲得的質 體 DNA。 在本發明中，我們使用自動化的螢光DNA定序器， ALFred系統（Pharmacia)使用自己循環的定序草案，其中 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再‘
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 五、發明說明（13 ) 在大部份的定序案例中使用Taq DNA聚合酶。 在足出基因組序列之後，使用密碼區序列來選殖相對應 基因之cDNA。亦使用PCR方法來選殖cDnA片段。利用添 加適當之限制位置，合成其序列與打開密碼（〇RF) 5，—和3，_ 末端處之序列相同的PCR引子，並藉著使用這些pcr引子 來完成PCR。在本發明中，在選殖cDNa的PCR中，使用 琢cDNA的引子作爲模板。在活體外藉著病毒的逆轉錄酶 和Taq聚合酶（使用由cl〇ntech製造之CapFinder 〖it工具 組）’藉著使用獲自法菲亞酵母的mRNA作爲模板，合成 包括各種cDNA物種的該cdNA集合。此外，在將該cdnA 片段選殖到在大腸样菌中，在強啓動基因活性之下具有功 能的表現載體，像是lac或T 7表現系統内之後，使用如此 而獲得的cDNA來證實其酵素活性。 在證實酵素活性之後，將純化所表現之蛋白質，並利用 它來升高對抗經過純化之酵素的抗體。將可使用如此而獲 得的抗體，定出在品系改良的研究、最適當之培養條件的 研旯，及其類似者中，表現相對應之酵素的特徵。 在定出在生物合成路徑中限制速率的步驟之後，其包括 酵素反應的多重步驟，有三個藉著使用其基因組序列來促 進居限制速率之反應的酵素作用的策略。 一個策略是使用其天然形式的基因本身。最簡單的方法 是擴大包含其調節序列，像是啓動基因和終止轉錄之序列 的基因組序列。這藉著將編碼感興趣之酵素的基因組片段 選殖到適當的載體内而得以實現，在該載體上藏有在法菲 項 頁 16- 1250210 A7 B7 五、發明說明（14 ) 亞酵母中具有功能的選擇標記。通常使用編碼能夠使宿主 在有毒性之抗生素的存在下存活之酵素的抗藥性基因作爲 選擇標記。藏在pGB-Ph9中的G418抗藥性基因（Gene， 184 ’ 89-97，1997)是抗藥性基因的實例。亦可在具有適當 之營養缺陷標記的宿主中，使用營養補充的標記。法菲亞 酵母ATCC24221品系的生長需要胞嘧啶核：y：，爲營養缺陷 的一個實例。藉著使用CTP合成酶作爲ATCC24221的捐贈 者DNA，可建立使用營養補充之宿主載體系統。至於載 體，可使用兩種類型的載體。其中一種載體爲整合的載 體’其不具有自主的複製序列。上文的pGB-Ph9是這類型 載體的實例。因爲這類載體在載體中不具有自主的複製序 列，上述的載體無法自給複製，並由於在載體和染色體之 間’使用同源性序列之單一-交叉重組作用的結果，僅能 以整合的形式出現在宿主的染色體中。在染色體上增加整 合基因之劑量的案例中，通常藉著使用這類抗藥性標記來 使用基因的擴大作用：藉著增加相對應藥物在選擇性培養 基中的丨辰度’而僅有其中因爲重組作用之結果，在染色體 上擴大了整合基因的品系能夠存活。藉著使用這類的選 擇，可選出具有已經擴大基因的品系。其他類型的載體爲 可複製的載體，其具有自主複製的序列。這類載體可以多 重副本的狀態存在，並使得藏匿基因之劑量亦以多重副本 的狀悲存在。藉著使用這類的策略，預期得以過度表現由 該經過擴大之基因編碼的感興趣之酵素。 其他過度表現感興趣之酵素的策略，是將感興趣的基因 -17- (請先閱讀背面之注音？事項再 -Ki.
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1250210 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（15 ) 放置在強啓動基因之下。在這類策略中，基因的副本數目 不必是以多重副本的狀態。該策略亦適用於在適當的啓動 基因下過度表現感興趣的基因，在適當的生長相中，並適 當地安排培養時間，來謗發該啓動基因的啓動活性。在生 長的晚期加快了蝦青素的產生，像是產生二級代謝產物的 案例。因此，在生長的晚期可使能產生胡蘿蔔素之基因的 表現達到最高。在這類時期中，大部份生物合成酵素的基 因表現都會降低。例如，藉著將涉及蝦青素前驅物之生物 合成的基因，且其之表現在營養啓動基因的控制之下，像 是編碼涉及甲羥戊酸路徑之酵素的基因，放置在能產生胡 蘿蔔素之基因的啓動基因之下游，使所有涉及蝦青素之生 物合成的基因，在其時間安排和表現時期方面都變成同步 的。 另一種過度表現感興趣之酵素的策略，是在其調節要素 中謗發突變。爲了這個目的，將一類廣告者基因，如卢_ 半乳糖甞酶基因、蟲螢光素酶基因、編碼綠螢光蛋白質之 基因及其類似物，插入感興趣之基因的啓動基因和終止轉 錄的序列之間，使得包括啓動基因、終止轉錄之序列和報 告者基因的所有部份融合，並彼此具有功能。其中在染色 體上或在載體上導入該報告者基因的經過轉形之法菲亞酵 母，將會在活體内發生突變，在感興趣之基因的啓動基因 區中身發犬交。可藉著檢測由報告者基因編碼之活性的改 變來監視突變。如果突變發生在基因的cis要素上，將由 致突變基因的解救和定序來決定突變點。藉著重組作用在 -------Γ 訂 G------- (請先閱讀背面之注音？事項再_寫本頁) ,¾ 太 -18-
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本紙張尺度適时關 A7 B7 五、發明說明（16 天然的啓動基因序列和突變的序列之間，將已經決定的突 變導入染色體上的啓動基因區。以相同的程序，亦可獲得 發生在編碼反式-作用因子之基因中的突變。其亦可影響 感興趣之基因的過度表現。 曰 亦可藉著在活體外，在啓動基因區中之cis要素的突變 生成作用來謗發突變。在該方法中，使含有報告者基因， 在其5’-末端處與衍生自感興趣基因之啓動基因區，並在其 3 -末^處與彳于自感興趣基因之終止轉錄的序列區融合的基 因卡匣發生突變，然後導入法菲亞酵母中。藉著檢測報告 者基因之活性的差異，將可篩選出有效的突變。可藉著與 在活體内之突變方法相同的方法，將這類突變導入在染色 體上天然的啓動基因區之序列中。 關於捐贈者DNA，可單獨導入編碼甲羥戊酸路徑之酵素 或FPP合成酶的基因，或藉著藏匿在質體載體上來共同_ 導入 了以使用與其天然序列相同的密碼序列，以及其對 偶基因變體，具有一或多個胺基酸添加、刪除及/或取代 的序列，只要其相對應之酵素具有所指定之酵素活性。並 且可藉著轉形作用，將這類載體導入法菲亞酵母中，再藉 著在適當的選擇培養基上散布經過轉形的細胞來選擇轉形 物，像是在PGB-Ph9作爲載體的案例中，使用含有選擇試 劑的YPD瓊脂培養基，或是在使用營養缺陷之ATCQuai 作爲受體的案例中，使用省略掉胞嘧啶核I的最低營養要 求之瓊脂培養基。 知在適當的培養基上培養這類以遺傳工程之方式產生的 (210 X 297 公釐）
1250210 A7 B7 五、發明說明（17 ) 法菲亞酵母，並評估其蝦青素的生產力。以在其生產力與 藉著這類遺傳工程方法所導入之基因或蛋白質的表現程度 之間的相互關係之觀點，來證實如此所選出之蝦青素的高 生產者。 實例 在下文描述的實例中使用下列的材料及方法： 品系 法菲亞酵母ATCC96594 (已經於1998年4月8曰，按照布 達佩斯條約存放，以登錄編號第74438號度存放該品系）。 大腸桿菌 DH5oc : F·，φ8(Μ，lacZAM15，A(lacZYA-argF) U169，hsd(rk_，mk+)，recAl，endAl，deoR，thi_l， supE44，gyrA96，relAl (Toyobo) 大腸桿菌 XLl-Blue MRF’ ： A(mcrA)183，A(mcrCB-hsdSMR-mrr)173，endAl，supE44，thi-1，recAl， gyrA96，relAl，lac[F丨proAB，lacIqZAM15，Tnl0(tetr)] (Stratagene) 大腸样菌 SOLR : el4 (mcrA)，A(mcrCB-hsdSMR-mrr) 171，sbcC，recB，recJ，umuC :: Tn5(kanr)，uvrC，lac， gyrA96，relAl，thi-1，endAl，λ R，[F丨 proAB， laclqZAM15]Su·(非抑制的）（Stratagene，CA，USA) 大腸桿菌 XL1 MRA (P2) ： A(mcrA)183，△(mcrCB· hsdSMR-mrr)173，endAl，supE44，thi-1，gyrA96， relAl，lac (P2細胞溶素原）（Stratagen) 大腸桿菌 BL21 (DE3) (pLysS) : dcm_，ompTrB-mB loiT λ -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公1 ) 請 先 閱 讀 背 面 之 注
II Η 頁I 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 B7 五、發明說明（18 ) (DE3)，pLysS (Stratagene) 大腸样菌 M15 (pREP4) (QIAGEN) (Zamenhof P.J·等人，j· Bacteriol. 110，171-178，1972) 大腸桿菌 KB822 : pcnB80，zad :: TnlO，A(lacU169)， hsdR17，endAl，thi-1，supE44 大腸样菌 TOPIO : F-，mcrA，A(mrr-hsdRMS-mcrBC)， φ80，AlacZM15，AlacX74，recAl，deoR，araD139， (ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Strr)，endAl，nupG (Invitrogen) 載體 λΖΑΡΙΙ (Stratagene) XDASHII (Stratagene) pBluescriptll SK+(Stratagene) pUC57 (MBI Fermentas) pMOSBlue T-載體（Amersham) pET4c (Stratagene) pQE3 0 (QIAGEN) pCR2.1TOPO (Invitrogen) 培養基 例行地將法菲亞酵母品系維特在YPD培養基（DIFCO ) 中。將大腸桿菌品系維持在L B培養基（每公升1 0克細菌-胰蛋白腺，5克酵母萃取物（DIFCO)和5克NaCl)。在軟瓊 月旨（0.7%瓊脂（WAKO))上，使用NZY培養基（每公升5克 NaCl，2 克MgS04-7H20，5 克酵母萃取物（DIFCO)，1〇克 •21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再If寫本頁) . 線赢 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（19 ) NZ胺A型（Sheffield))供λ噬菌體繁殖，在製備瓊脂培養 基之時，補充1.5%瓊脂（WAKO)。 方法 根據分子選殖：a Laboratory Manual，第 2 版（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 )來實施分子遺傳學 的共同方法。限制酵素和T4 DNA連接酶係購自Takara Shuzo (Japan) 0 藉著使用QIAGEN基因組之工具組（QIAGEN)，依據由製 造者提供的草案，進行從法菲亞酵母中分離染色體 DNA。利用自動化DNA分離系統（PI-50，Kurabo，Co. Ltd.，Japan)進行從經過轉形之大腸桿菌中小量製備質體 DNA。藉著使用QIAGEN管柱（QIAGEN)完成從大腸桿菌 轉形物中小量·製備質體DNA。藉著Wizard λ製備DNA純 化系統（Promega )，依據製造者的草案，進行λ DNA的分 離。分離DNA的片段，並藉著使用QIAquick或QIAEX II (QIAGEN )從瓊脂糖中純化。根據製造者的草案來進行凡 噬菌體衍生物的操作。 藉著驗法使用Isogen (Nippon Gene，Japan)，完成從法菲 亞酵母中分離所有的DNA。藉著使用mRNA分離工具組 (Clontecli)從如此而獲得的所有RNA中純化mRNA。藉著 使用 CapFinder cDNA 建構工具組（Clontech)合成 cDNA。 藉著使用Gigapack III金包裝萃取物（Stratagene )完成在 活體外的包裝。 利用得自Perkin Elmer 2400型之熱循環器來進行聚合酶 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再本頁) 訂二 --線泰 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 B7 五、發明說明（2〇 ) (請先閱讀背面之注意事項再一 連鎖反應（PCR)。在實例中描述每個PCR條件。PCR引子 係購自商業上的供應商，或以DNA合成器（392型， Applied Biosystems )合成之。供DNA定序用的螢光DNA引 子係購自Pharmacia。利用自動螢光DNA定序器（ALFred， Pharmacia)完成DNA的定序0 合格的DH5a細胞係購自Toyobo (Japan)。合格的M15細 胞（pREP4 )係藉著 CaCl2 法，按照 Sambrook 等人（Molecular cloning: a Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)的描述來製備。 實例1從法菲亞酵母中分離mDNA，並建構cDNA庫 欲建構法菲亞酵母之cDNA庫，在使細胞破裂之後馬上 藉著酚萃取法分離所有的RNA，並藉著使用mRNA分離工 具組（Clontech)純化得自法菲亞酵母ATCC96594品系的 mRNA 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 首先，藉著離心（1500 X g 1 0分鐘）從1 0毫升在YPD培 養基中培養兩天的培養物中收獲ATCC96594品系的細胞， 並以萃取緩衝溶液（10 mM Na•擰檬酸鹽/HC1 (pH 6.2)，含 有0·7 M KC1)沖洗一次。懸浮於2.5毫升萃取缓衝溶液中 之後，藉著French壓力均質機（Ohtake Works Corp. Japan)，以1500公斤力/平方公分使細胞破裂，並根據製 造者指定的方法，立即與兩倍體積的同類基因（isogen) (Nippon gene)混合。在該步驟中，回收到400微克的總 RNA 0
當藉著使用mRNA分離工具組（Clontech )純化該總RNA -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（21 ) 時，應根據製造者指定的方法。最後，從法菲亞酵母 ATCC96594品系中獲得1 6微克的mRNA。 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 欲建構cDNA庫，根據製造者指定的方法使用CapFinder PCRcDNA建構工具組（Clontech)。依照PCR擴大作用，將 1微克經過純化的mRNA應用於第一股的合成。在藉著 PCR的擴大作用之後，獲得1毫克cDNA的集合。 實例2從法菲亞酵母中選殖部份的hmc (3-羥基-3-甲基戊 二醯基-CoA合成酶）基因 欲從法菲亞酵母中選殖部份的hmc基因，利用簡併的 PCR方法。兩個混合的引子，其核甞酸序列係按照表1中 所示來設計並合成，以得自其他物種之已知HMG-CoA合 成酶基因的共同序列爲基礎。 表1 選殖hmc基因時所使用之引子的序列 Hmgsl ; GGNAARTAYACNATHGGNYTNGGNCA (有意義引子) (SEQ ID NO: 11 號）
Hmgs3 ; TANARNSWNSWNGTRTACATRTTNCC (反義引子） (SEQ ID NO: 12號） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (N=A、C、G 或 T ; R=A 或 G ; Y=C 或 T ; H=A、T 或 C ’· s=c 或 G ; W=A或T)
藉著使用ExTaq (Takara Shuzo )作爲DNA聚合酶和在實例 1中獲得的cDNA集合作爲模板，在95°C 3 0秒，5〇°C 3 0 秒，和72°C 1 5秒的2 5次循環的PCR反應之後，#反應混 合物應用在瓊脂糖凝膠電泳上。回收具有想要長庆的PCR -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（22 )
(請先閱讀背面之注意事項再A 帶狀區，並根據製造者的方法，藉著QjAquick (QIAGEN) 純化’然後與pMOSBlue T-載體（Amersham )連接。在轉形 合格的大腸桿菌DH5a細胞之後，選出6個白色的菌落， 並利用自動化DNA分離系統分離質體。由於定序的結 果’發現一個純種系，其所擁有之序列的推衍胺基酸序 列，與已知之hmc基因的類似。將經過分離的cdNA純種 系命名爲pHMC211，並用來進一步研究。
直A3從法菲亞酵母中分離基因組DNA 欲從法菲亞酵母中分離基因組DNA，根據製造者指定的 方法使用QIAGEN基因組工具組。 首先，藉著離心（1500 X g 10分鐘）從1〇〇毫升過夜培養 在YPD培養基中的培養物中收獲法菲亞酵母ATCC96594品 系的細胞，並以TE緩衝溶液（10 mM Tris/HCl (pH 8.0)含 有1 mM EDTA )沖洗一次。在懸浮於8毫升QIAGEN基因組 工具組的Y 1缓衝溶液中之後，以2毫克/毫升之濃度加入 萊替卡酶（lyticase)(SIGMA)，藉著酵素降解使細胞破 裂，並在30°C下培養反應混合物9 0分鐘，然後進行下一 個萃取步驟。最後，獲得2 0微克的基因組DNA。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 复114藉著使用PHMC211作爲探針來進行南方墨點雜交作用 進行南方墨點雜交作用，選殖含有得自法菲亞酵母之 hmc基因的基因組片段。藉著EcoRI消化2微克的基因組 DNA ’並接受缓脂糖凝膠電泳，接著以酸和驗處理。藉 著使用transblot (Joto Rika) 1小時，將經過變性的DNA移 至尼龍膜（Hybond N+，Amersham)上。藉著加熱處理（80 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（23 ) °C，9 0分鐘）使移至尼龍膜上的DNA固定。藉著利用DIG 多重注滿法（Boehringer Mannheim)標示模板DNA (EcoRI-和Sail-消化過的PHMC211 )來製備探針。利用由製造者指 走的方法來完成雜交作用。結果，在3.5到4.0千個驗基 (k b )的範圍内看到雜交帶。 實例5選殖含有hmc基因之基因組片 藉著EcoRI消化4微克的基因組DNA，並接受瓊脂糖凝 膠電泳。然後藉著QIAEX II凝膠萃取工具組（QIAGEN)，根 據由製造者指定的方法，回收長度在3.0到5.0 kb之範園内 的DNAs。在16°C下，將經過純化的DNA與1微克以EcoRI-消化並以C I A P (牛小腸鹼性磷酸酶）-處理過的 入ZAPII (Stratagene)連接過夜，並藉著Gigapack III金包裝 萃取物（Stratagene)包裝之。以經過包裝之萃取物感染大 腸桿菌XLlBlue MRF’品系，並倒在LB瓊脂培養基上，以 NZY培養基覆蓋。藉著使用以EcoRI-和Sail-消化過的 pHMC211作爲探針，篩選大約6000個溶菌斑。兩個溶菌 斑與經過標示之探針雜交，並根據製造者（Stratagene )指 定的方法，使其接受在活體内的切除草案。發現由於限制 分析和定序的結果，經過分離的質體具有彼此方向相反的 相同片段。由於定序的結果，所獲得的EcoRI片段含有與 pHMC211純種系相同的核甞酸序列。這些質體中有一個 被合名爲PHMC526，並用來進一步研究。藉著PHMC526 之刪除衍生物的定序，獲得完整的核苷酸序列，並以引子 -移動程序定序。PHMC526的插入序列片段，包括3431個 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) -.1 I ter . 1250210 7 A7 B7 五、發明說明（24) 核苷酸，其含有1 0個完整和不完整的表現序列，和1 0個 插入序列，帶有大約1 kb的3’-終端未轉譯區。 實例6選殖hmc基因的上游區 藉著使用Genome Walker工具組（Clontech )完成hmc基因 5’-鄰近區的選殖，因為pHMC526不含hmc基因的5 ’末端。 首先合成PCR引子，其序列顯示在表2中。 表2 在選殖hmc基因之5’-鄰近區時所使用的引子序列 Hmc21 ; GAAGAACCCCATCAAAAGCCTCGA (主要引子） (SEQ ID NO: 13號）
Hmc22 ; AAAAGCCTCGAGATCCTTGTGAGCG (築巢引子） (SEQ ID NO: 14號） 關於庫建構和PCR條件的草案，與製造者指定的那些相 同，並藉著使用在實例3中獲得的基因組DNA製品作為模 板。回收在5’末端具有EcoRV位置（0.45 kb )和在5 ’末端具 有PvuII位置（2.7 kb)的PCR片段，並藉著使用大腸桿菌 DH5oc作為宿主品系，選殖到pMOSBlue T-載體内。由於對 得自兩個構築體之不同純種系的個別5定序，證實選殖 hmc基因的5，鄰近區，並在其3 ’末端發現小部份（0.1 kb ) 的EcoRI片段。將在上述的實驗中，藉著PvuII構築體獲得 的純種系命名為pHMCPv708，並用來進一步研究。 接著，藉著如同在上述實例4中所示的方法來進行南方 墨點分析，並決定hmc基因的5’-鄰近區出現在3 kb之 £(：〇111片段中。在入2人？11中從2.5至3.5 1^)£(：〇111庫中建構 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再
--線* 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 B7 五、發明說明（25 ) (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 之後，篩選600個溶菌斑，並選出6個陽性的純種系。由 於將這6個純種系定序的結果，明瞭在6個陽性溶菌斑中 有4個純種系具有與pHMCPv708相同的序列，將其中一個 命名爲pHMC723，並用來進一步研究。 合成在表3中出示其序列的PCR引子，以便選殖在法菲 亞酵母染色體上，位在3.5 kb和3.0 kb EcoRI片段之間的小 (0.1 kb) EcoRI 片段。 表3 選殖hmc基因之小EcoRI部份時所使用的引子序列 Hmc30 ; AGAAGCCAGAAGAGAAAA (有意義引子）（SEQ ID NO: 15 號）
Hmc31 ; TCGTCGAGGAAAGTAGAT (反義引子）（SEQ ID NO: 16號） PCR條件與在實例2中所示的相同。將經過擴大的片段 (其長度爲0.1 kb)選殖到pMOSBlue T-載體中，並轉形大腸 桿菌DH5a。從5個不同的白色菌落製備質體，並使其接受 定序。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 因此，定出該核甞酸序列（4.8 kb)含有hmc基因（SEQ ID NO: 1號）。密碼區爲2432個鹼基對，其包括1 1個表現序 列和1 0個插入序列。插入序列分散在所有的密碼區中， 並無偏好5 ’或3 ·。發現打開密碼由467個胺基酸（SEQ ID NO: 6號）組成，其序列明顯地類似得自其他物種之HMG-CoA合成酶基因的已知胺基酸序列（與得自粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)之 HMG-CoA 合成酶有 49.6% -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（26 ) 的同一性）。 實例7在大腸桿菌中表現hmc基因，並證實其酵素活性 合成在表4中出示其序列的PCR引子，以便選殖hmc基因 的cDNA片段。 表4 選殖hmc基因之cDNA時所使用的引子序列 Hmc25 ; GGTACCATATGTATCCTTCTACTACCGAAC (有意 義引子）（SEQ ID NO: 17號）
Hmc26 ; GCATGCGGATCCTCAAGCAGAAGGGACCTG (反義 引子）（SEQ ID NO: 18號） PCR條件如下：95°C3 0秒，55°C3 0秒，和72°C3分鐘，循 環2 5次。使用〇· 1微克在實例2中獲得的cDNA作爲模板， 並使用Pfu聚合酶作爲DNA聚合酶。回收經過擴大1.5 kb 的片段，並藉著使用完全弄鈍的選殖工具組（N〇vagen)， 根據製造者指定的草案，選殖到pT7Blue_3載體（Novagen) 中。從大腸桿菌DH5oc轉形物之白色菌落中選出六個個別 的純種系，並從這些轉形物中製備質體。由於限制分析的 結果’藉著定序作爲進一步選擇，選出2個純種系。一個 純種系在位置280處具有胺基酸的取代（從甘胺酸變成丙胺 酸）’而另一個在位置53處具有胺基酸的取代（從丙胺酸 變成蘇胺酸）。將衍生自已知hmc基因的胺基酸序列排成 一直線，在得自其他物種之所有序列中徹底觀察到在位置 28〇處之丙胺酸和甘胺酸殘基，且該事實暗示在位置28〇 處的胺基酸取代，將不會影響其酵素活性。選出該純種系 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再
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五、發明說明（27 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (在位置280處突變）爲pHMC731，以供後續的表現實驗。 接著，將藉著PHMC7M之Ndel·和BamHI·消化作用所獲 得的1.5 kb片段與藉著相同限制酵素對消化過的pETUc連 接（Stratagene)，並導入大腸桿菌DH5oc中。由於限制分析 的結果’回收具有正確結構（pHMC818 )的質體。然後轉形 合格的大腸样菌BL21 (DE3) (pLysS)細胞（Stratagene )，選 出一個具有正確結構的純種系進行進一步的研究。 關於表現研究，在37°C下在100毫升LB培養基中培養品 系 BL21 (DE3) (pLysS) (PHMC818)和載體對照組品系 BL21 (DE3) (pLysS) (pHTllc)，直到在100微克/毫升氨苄青黴素 的存在下，在600毫微米處之〇 D値達到〇· 8 (大約3小時） 爲止。然後，將肉湯分成相同體積的兩部份，在一部份中 加入1 mM異丙基卢-D-硫代吡喃半乳糖嘗（iptG)。在37°C 下再繼續培養4小時。從經過誘導·和未經謗導-的]lmc純 種系培養物和載體對照組培養物中移出2 5微升的肉湯， 並接受十二烷基硫酸鈉·聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE ) 分析。證實利用謗導作用，僅在藏匿有pHMC818之純種 系的案例中表現出大小類似從核甞酸序列推衍出之分子量 (5 0.8 kD a)的蛋白質。精者離心（15〇〇 xg，1〇分鐘）從5 〇 毫升肉湯中收獲細胞，沖洗一次並懸浮於2毫升hmc緩衝 $谷液（200 mM Tris-HCl (pH 8.2))中。藉著 j7rench 壓力均質 機（Ohtake Works)，以1500公斤力/平方公分使細胞破 裂，產生粗製的溶胞產物。在離心粗製的溶胞產物之後， 回收上清液溶離份，並用來作爲酵素分析之粗萃取物。僅 -30 - 本紙^尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱)'一"' -- -------Γ訂-------線* (請先閱讀背面之注咅？事項再_本頁) 嗓 太 1250210 A7 B7 五、發明說明（28 ) (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 在pHMC818之經過謗導的溶胞產物的案例中，將白色小 球旋轉下降並回收之。藉著光度測定，根據Stewart等人（了· Biol· Chem. 241(5)，1212-1221，1966)的方法，進行3_羥基 -3-甲基戊二醯基-CoA (HMG-CoA)合成酶的酵素測定。在 所有的粗萃取物中。並未檢測到3-羥基-3-甲基戊二醯基-CoA合成酶的活性。由於粗萃取物之SDS-PAGE分析的結 果，發現經過表現之蛋白質帶已經在表現肉湯中消失。接 著利用8 Μ胍-HC1使從經過謗導之pHMC818純種系的粗溶 胞產物中回收的白色小球溶解，然後使其接受SDS-PAGE 分析。在白色小球中回收所表現的蛋白質，這暗示經過表 現的蛋白質會形成包涵體。 接著，在更溫和的條件下經營表現實驗。使細胞在28°C 下生長在LB培養基中，並藉著加入0.1 mM的IPTG來進行 謗導。接著，在28 °C下繼續培養3.5小時，然後收獲細 胞，以與先前之草案相同的方式製備粗萃取物。結果概述 於表5中。顯示僅在藏匿有hmc基因之重組品系的經過謗 導之培養物中，觀察到HMG_CoA合成酶之活性，這暗示 經過選殖之hmc基因編碼HMG_CoA合成酶。 表5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 hmc cDNA純種系的酵素特徵 質體 IPTG HMG-CoA之微莫耳/分鐘/毫克-蛋白質 pHMC818 - 0 + 0.146 pETllc - 0 + 0 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（29 ) 眚例8選殖hmg (3-經甲基-3-戊二縫-CoA還原酶）基因 hmg基因之選殖草案幾乎與在實例2至7中所示之hmc基 因的相同。首先，合成以得自其他物種之HMG-CoA還原 酶基因的共同序列爲基礎，在表6中出示其序列的PCR引 子。 表6 選殖hmg基因時所使用之引子的序列 Redl ; GCNTGYTGYGARAAYGTNATHGGNTAYATGCC (有 意義引子）（SEQ ID NO: 19號）
Red2 ; ATCCARTTDATNGCNGCNGGYTTYTTRTCNGT (反義 引子）（SEQ ID NO·· 20號） (N=A、C、G或 T ; R=A或 G，Y=C 或T，H=A、T 或 C，D=A、G 或T) 藉著使用ExTaq (Takara Shuzo )作爲DNA聚合酶，在95°C 3 0秒，54°C 3 0秒和72°C 3 0秒2 5次循環的PCR反應之後， 將反應混合物應用在瓊脂糖凝膠電泳上。回收具有想要長 度的PCR帶，並藉著QIAquick (QIAGEN)，根據製造者的 方法純化，然後連接到pUC57載體（MBIFermentas)上。在 轉形合格的大腸桿菌DH5oc之後，選出7個白色的菌落， 並從這些轉形物中分離出質體。由於定序的結果，發現所 有純種系所具有的序列，其推衍胺基酸序列均與已知的 HMG-CoA還原酶基因類似。將一個經過分離的cDNA純種 系命名爲PRED1219，並用來進一步研究。 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 7 A7 B7 五、發明說明（30 ) 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 m 本 頁 接下來，利用Genome Walker工具組（Clontech)選殖含有 hmg基因51-和3*_鄰近區的基因組片段。選殖出hmg基因之 5’鄰近區的2.5处片段（卩1^〇1^111226)和3’鄰近區的4.0 1^ (pREDEVdl226)。以pREDPVul226之插入序列的序列爲基 礎，合成在表7中出示其序列的PCR引子。 表7 選殖hmg基因之cDNA時所使用之引子的序列 Red8 ; GGCCATTCCACACTTGATGCTCTGC (反義引子）（SEQ ID NO: 21 號）
Red9 ; GGCCGATATCTTTATGGTCCT (有意義引子）（SEQ ID NO: 22號） 接著，藉著使用Red 8和Red 9作爲PCR引子，以及在實 例2中製備之cDNA集合，藉著PCR方法選殖含有hmg cDNA序列之長部份的cDNA片段，並將如此所選殖出之質 體命名爲pRED107。PCR條件如下：94°C 3 0秒，55°C 3 0秒 和72°C 1分鐘的2 5次循環。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 進行南方墨點雜交研究，以便選殖含有得自法菲亞酵母 之完整hmg基因的基因組序列。藉著以DIG多重注滿法標 示模板DNA，pRED107來製備探針。利用製造者指定的方 法來進行雜交。結果，經過標示之探針與兩個帶狀區雜 交，其具有12处和4处之長度。由於定出？1^0?¥111226 序列的結果，並未在選殖的hmg區中找到EcoRI位置。這 暗示另一種hmg基因（其具有4 kb之雜交EcoRI片段）存在 法菲亞酵母的基因組上，就像在其他生物中找到的。 33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（31 ) 接著，在λ DASHII載體中，建構由9至23 kb之EcoRI片 ^ r, . (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 段構成的基因組庫。以經過包裝之萃取物感染大腸桿菌 XL1 Blue，MRA(P2)品系（Stratagene )，並倒在 L B 瓊脂培養 基上，以NZY培養基覆蓋。藉著使用以StuI-消化過之 pRED107的0.6 kb片段作爲探針，篩選大約5000個溶菌 斑。4個溶菌斑與經過標示之探針雜交。然後根據製造者 (Promega)指定的方法製備嗟菌體溶胞產物，以Wizard λ 純化系統來純化DNA，再以EcoRI消化，分離出10 kb之 EcoRI片段，以便在以EcoRI消化並以CIAP-處理過之 pBluescriptll KS- (Stratagene)中選殖。選出 11個白色的菌 落，並藉著使用Red9和_4〇萬能引子（Pharmacia)，使其接 受菌落PCR。菌落PCR的模板DNA係藉著加熱細胞懸浮液 來製備，其中將挑選出的菌落懸浮於1 〇微升無菌的水 中，在PCR反應（PCR條件：94°C3 0秒，55°C3 0秒和72Ό 3分鐘的25次循環）之前，先在99°C下5分鐘。一個菌落得 到4 kb的陽性PCR帶，且其暗示該純種系具有含hmg基因 的完整區域。從該陽性純種系中製備質體，並命名爲 pRED611 〇 P逢後，對pRED611之刪除衍生物進行定序。藉 著將獲自删除突變種之序列與藉著引子-移動程序而獲得 的序列混合，定出含有得自法菲亞酵母之hmg基因的7285 個鹼基對之核甞酸序列（SEQ ID NO : 2號）。得自法菲 亞酵母之hmg基因包括1 0個表現序列和9個插入序列。其 長度爲1092個胺基酸之推衍的胺基酸序列（SEQ ID NO: 7號），顯示與已知的HMG_CoA還原酶有廣泛的同種性（與 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（32 ) 得自玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis )之Η M G-CoA還原酶 有5 3 · 0 %的同一性）。 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 實例9在大腸样菌中表現hmg基因之羧基-終端的功能部位 某些種類的原核生物具有可溶的HMG-CoA還原酶或相 關的蛋白質（Lam 等人，J. Biol· Chem. 267，5829-5834, 1992 )。然而，在眞核生物中，HMG-CoA邏原酶經由胺基 -終端的膜功能部位而被限制在内質網中（Skalnik等人，J. Biol· Chem. 263，6836-6841，1988 )。在眞菌（也就是酒酵 母菌和黑粉菌，玉蜀黍黑粉菌）和動物中，膜功能部位是 大而複雜的，含有7或8個穿透膜片段（Croxen等人， Microbiol. 140，2363-2370，1994) ° 相反的，植物 HMG-CoA還原酶蛋白質之膜功能部位僅具有1或2個穿透膜片 段（Nelson 等人，Plant Mol. Biol· 25，401-412，1994)。不 管在穿透膜功能部位之結構和序列上的差異，催化功能部 位的胺基酸序列跨越了眞核生物、太古細菌（archaebacteria) 和眞細菌而受到保留。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Croxen等人，顯示在大腸样菌中以活性形式表現衍生自 玉米眞菌病原玉蜀黍黑粉菌的HMG-CoA還原酶之C-終端 功能部位（Microbiology，140，2363-2370，1994 )。本發明 的發明者嘗試在大腸桿菌中表現得自法菲亞酵母之HMG-CoA還原酶的C-終端功能部位，以便證實其酵素活性。 首先，合成在表8中出示其序列的PCR引子，以便選殖 hmg基因之部份cDNA片段。有意義引子相當於從第597個 胺基酸（榖胺酸）殘基開始的序列，且預期獲得的蛋白質和 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（33 ) cDNA之長度分別爲496個胺基酸和1.5 kb。 表8 (請先閱讀背面之注意事項再一 在選殖hmg基因之部份cDNA時所使用之引子的序列 Red54 ; GGTACCGAAGAAATTATGAAGAGTGG (有意義引子） (SEQ ID NO: 23號）
Red55 ; CTGCAGTCAGGCATCCACGTTCACAC (反義引子） (SEQ ID NO: 24號） PCR條件如下：95°C3 0秒，55°C30秒和72°C3分鐘，循 環2 5次。使用在實例2中獲得的0.1微克cDNA集合作爲模 板，並使用ExTaq聚合酶作爲DNA聚合酶。回收經過擴大 的1.5 kb片段，並在pMOSBlue T·載體（Novagen)中選殖。 選出得自大腸桿菌DH5oc轉形物之白色菌落的1 2個獨立的 純種系，並從這些轉形物中製備質體。由於限制分析的結 果，藉著定序選出所有的純種系進行進一步的選擇。一個 純種系在全部的密碼序列中不具有胺基酸的取代，並命名 爲 pRED908 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 接著，將藉著以ΚρηΙ-和PstI-消化pRED908所獲得的1.5 kb之片段與藉著相同限制酵素對消化過的pQE30 (QIAGEN) 連接，並轉形大腸样菌KB822。由於限制分析的結果，回 收具有正確結構的質體（pRED1002)。然後，轉形合格的 大腸桿菌Ml5 (pREP4)細胞（QIAGEN )，並選出一個具有 正確結構的純種系進一步的研究。 關於表現研究，在30Ό下在100毫升LB培養基中培養品 系 Μ15 (pREP4) (pRED1002)和載體對照組品系 Μ15 (pREP4) -36- 本^張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（34 ) (PQE30)，直到在25微克/毫升康黴素和100微克/毫升氨 苄青黴素的存在下，在600毫微米處之OD値達到0.8 (大 約5小時）爲止。然後，將肉湯分成相同體積的兩部份， 然後在一部份中加入1111]^1?了0。在3〇°(：下再繼續培養3.5 小時。從經過謗導-和未經謗導-的hmg純種系培養物和載 體對照組培養物中移出2 5微升的肉湯，並使其接受SDS-PAGE分析。證實利用謗導作用，僅在藏匿有pRED1002之 純種系的案例中表現出大小類似從核甞酸序列推衍出之分 子量（52.4 kDa)的蛋白質。藉著離心（ 1500 X g，1〇分鐘）從 5 0毫升肉湯中收獲細胞，沖洗一次並懸浮於2毫升hmg緩 衝溶液（1〇〇111]^嶙酸奸缓衝溶液（0117.〇)，含有1|11；\1 EDTA和10 mM二硫蘇糖醇）中。藉著French壓力均質機 (Ohtake Works)，以1500公斤力/平方公分使細胞破裂， 產生粗製的溶胞產物。在離心粗製的溶胞產物之後，回收 上清液溶離份，並用來作爲酵素分析之粗萃取物。僅在 pRED 1002純種系之經過謗導的溶胞產物的案例中，將白 色小球旋轉下降並回收之。藉著光度測定，根據Servouse 等人（Biochem. J. 240，541-547，1986)的方法，進行 3-¾ 基-3-甲基戊二醯基-CoA (HMG-CoA)還原酶的酵素測定。 在所有的粗萃取物中，並未檢測到3_羥基_3_甲基戊二醯基 -CoA還原酶的活性。由於粗萃取物之SDS-PAGE分析的結 果，發現經過表現之蛋白質帶已經在表現肉湯中消失。接 著利用等體積之20% SDS使從經過謗導之pRED1002純種 系的粗溶胞產物中回收的白色小球溶解，然後使其接受 -37- (請先閱讀背面之注意事項再本頁)
Γ訂· 線泰 本紙張尺度朗㈣國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（35 ) SDS-PAGE分析。在白色小球中回收所表現的蛋白質，這 暗示經過表現的蛋白質將會形成包涵體。 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 接著，在更溫和的條件下進行表現實驗。使細胞在28°C 下生長在LB培養基中，並藉著加入〇1 mM的IPTG來進行 謗導。然後，在28°C下繼續培養3.5小時，並收獲細胞。 以與先前草案相同的方式製備粗萃取物。結果概述於表9 中。顯不觀察到3 0倍南的房導’這暗示經過選殖之hmg基 因編碼HMG-CoA還原酶。 表9 hmg cDNA純種系的酵素特徵 質體_IPTG NADPH之微莫耳/分鐘/毫克-蛋白質 pRED1002 - 0.002 + 0.059 pQE30 - 0 + 0 實例1 0 選殖甲經戊酸激:S每（mvk)基因 mvk基因的選殖草案幾乎與在實例2至7中出示之hmc基 因的相同。首先，以得自其他物種之甲羥戊酸激酶基因的 共同序列爲基礎，合成在表10中出示其序列的PCR引子. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表10 選殖mvk基因時所使用之引子的序列 Mkl ; GCNCCNGGNAARGTNATHYTNTTYGGNGA (有意義引 子）（SEQ ID NO: 25號）
Mk2 ; CCCCANGTNSWNACNGCRTTRTCNACNCC (反義引子) -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（36 ) (SEQ ID NO: 26號） (N=A、C、G 或 T ; R=A 或 G，Y=C 或 T，H=A、T 或 C，S=C 或 G，W=A或T) 藉著使用ExTaq作爲DNA聚合酶，在95°C3 0秒，46°C3 0 秒和72°C 1 5秒，循環2 5次的PCR反應之後，將反應混合 物應用於瓊脂糖凝膠電泳。回收0.6 kb的PCR帶，預期其 長度含有部份的mvk基因，並根據製造者指定的方法，藉 著QIAquick純化，然後連接到pMOSBlue T-載體中。在轉 形合格的大腸桿菌DH5a細胞之後，選出4個白色的菌 落，並分離質體。由於定序的結果，發現其中一個純種系 所具有的序列，其推衍之胺基酸序列與已知的甲羥戊酸激 酶基因類似。將該cDNA純種系命名爲pMK128，並用來進 一步研究。 接下來，藉著PCR選殖含有mvk基因的部份基因組純種 系。合成以pMK128之内部序列爲基礎，在表1 1中出示其 序列的PCR引子。 表1 1 選殖含有mvk基因之基因組DNA時所使用之引子的序列 Mk5 ; ACATGCTGTAGTCCATG (有意義引子）（SEQ ID NO: 27號) Mk6 ; ACTCGGATTCCATGGA (反義引子）（SEQ ID NO: 28號) PCR條件爲94°C30秒，55°C30秒，72°Cl分鐘，循環25 次。將經過擴大的1.4 kb之片段選殖到pMOSBlue T-載體 内。由於定序的結果，證實可獲得具有代表性插入序列之 -39- (請先閱讀背面之注意事項再ifk本頁)
-丨線< 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（37 ) 結構的含mvk基因之基因組片段，並將該基因組純種系命 名爲 PMK2294。 (請先閱讀背面之注音？事項再Θ本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 進行南方墨點雜交研究，以便選殖含有得自法菲亞酵母 之完整mvk基因的基因片段。藉著以DIG多重注滿法標示 模板DNA，以Ncol消化過的pMK224，來製備探針。利用 製造者指定的方法來進行雜交。結果，經過標示之探針與 具有6· 5 kb之長度的帶狀區雜交。接下來，在λ ZAPII載體 中建構含有5至7 kb之EcoRI片段的基因組庫。以經過包裝 之萃取物感染大腸桿菌XL1Blue MRF，品系（Stratagene )， 並倒在LB瓊脂培養基上，以NZY培養基覆蓋。藉著使用 以Ncol-消化過之pMK224的0.8 kb片段作爲探針，篩選大 約5000個溶菌斑。7個溶菌斑與經過標示之探針雜交。然 後根據製造者（Stratagene)指定的方法製備噬菌體溶胞產 物，並藉著使用大腸桿菌XL1Blue MRF，和SOLR品系完成 在活體内的切除作用。選出1 4個白色的菌落，並從這些 選出的轉形物中分離出質體。然後藉著Nc〇l消化經過分離 的質體，並利用與溶菌斑雜交相同的探針，使其接受南方 墨點雜交作用。所有質體的插入序列片段均與探針雜交， 而這暗示可選殖含有mvk基因的基因組片段。從一個陽性 的純種系中製備質體，並命名爲pMK701。藉著引子-移動 程序，定出大約3 kb之序列，而其顯示mvk基因的5，末端 並未包含在pMK701中。 接著合成具有序列：TTGTTGTCGTAGCAGTGGGTGAGAG (SEQ ID NO: 29 號）的 PCR的引子，利用 Genome Walker -40 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）~"" 1250210 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（38 ) 工具組，根據製造者（Clontech)指定的方法，選殖mvk基 因的5鄰近基因組區。擴大特定的1.4 kb之PCR帶，並選 殖到pMOSBlue T-載體中。從所有的DH5a轉形中選出具有 預期長度之插入序列的。後續的定序顯示可選殖mvk基因 的5·-鄰近區。將其中一個純種系命名爲pMKEVR715，並 用來進一步研究。由於使用在實例3中製備之基因組DNA 的南方墨點雜交作用的結果，經過標示之PMKEVR715與 2.7 kb之EcoRI帶雜交。然後建構其中將長度從1.4到3.0 kb之EcoRI片段選殖到λ Z APII内的基因組庫，並以得自 pMKEVR715之1.0 kb的EcoRI片段來篩選。從5000個溶菌 斑中選出1 4個陽性的溶菌斑，並利用在活體内的切除作 用從這些溶菌班中分離質體。 合成得自PMKEVR715之内部序列，在表12中出示其序 列的PCR引子，以便利用菌落PCR來選擇陽性的純種系。 表1 2 選殖mvk基因之5^鄰近區的菌落PCR所使用的PCR引子 Mkl7 ; GGAAGAGGAAGAGAAAAG (有意義引子）（SEQ ID NO: 30號） Mkl8 ; TTGCCGAACTCAATGTAG (反義引子）(SEQ ID NO:31號） PCR條件如下：94X：30秒，50°C30秒，72°Cl5秒，循 環2 5次。從除了一個純種系以外的所有候選者中，產生 陽性的0· 5 kb帶狀區。選出一個純種系，命名爲pMK723， 以便定出mvk基因上游區的序列。在將pMK723之3，_區定 -41 - 巧張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮) -- (請先閱讀背面之注音？事項再本頁)
訂： -線泰 1250210 A7 B7 五、發明說明（39 ) 序，並與pMK701的序列混合之後，定出含有mvk基因的 4.8 kb片段的基因組序列。該1基因包括4個插入序列和 5個表現序列（S E Q ID N 0 : 3號）。除了在胺基終端的4 個胺基酸之外，推衍的胺基酸序列（S E Q ID N 0 : 8號） 顯示與已知的甲羥戊酸激酶有廣泛的同種性（與得自挪威 大鼠（Rattus norvegicus)之甲經戊酸激酶有44.3%的同一 性）。 實例1 1藉著在胺基終端區導入1個鹼基，表現mvk基因 雖然胺基酸序列顯示出對已知的甲羥戊酸激酶有顯著的 同種性，但是未能發現mvk基因的適當啓動密碼子。這個 結果暗示經過選殖的基因可能是甲羥戊酸激酶的假基因。 欲證實該假定，合成在表1 3中出示其序列的引子，導入 結果在胺基終端產生適當啓動密碼子的人造核甞酸中。 表13 在核甞酸中導入mvk基因時所使用的PCR引子 Mk33 ; GGATCCATGAGAGCCCAAAAAGAAGA (有意義引子) (SEQ ID NO: 32號）
Mk34 ; GTCGACTCAAGCAAAAGACCAACGAC (反義引子） (SEQ ID NO: 33 號） 如此導入的人造胺基終端序列如下：NH2-Met-Arg-Ala-Gin。在藉著使用ExTaq聚合酶作爲DNA聚合酶，95°C 3 0 秒，55Ό 3 0秒和72°C 3 0秒，2 5次循環的PCR反應之後。 使反應混合物接受瓊脂糖凝膠電泳。擴大預期的1.4 kb之 PCR帶，並選殖到pCR2.1 TOPO載體内。在轉形合格的大 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)
Γ訂. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7_五、發明說明（4G ) 腸桿菌TOP10細胞之後，選出6個白色的菌落，並分離質 體。由於定序的結果，發現一個純種系僅具有一個胺基酸 殘基的改變（在SEQ ID NO: 8號中第8 1個胺基酸殘基處， Asp至Gly的改變）。將該質體命名爲pMK1130 #3334，並 用來進一步研究。然後將pMK1130 #3334的插入序列選殖 到PQE30中。將該質體命名爲pMK1209 #3334。在轉形表 現宿主M15 (pREP4)之後，經營表現研究。在含有1〇〇微 克/毫升氨苄青黴素的3毫升LB培養基中，培養Ml 5 (pREP4) (ρΜΚ12〇9 #3334)品系和載體對照組品系（MI5 (pREP4) (pQE3〇))。在37°C下培養3.75小時之後，將培養 肉湯分成兩部份。在一部份中加入1 mM IPTG，並繼續培 養3小時。藉著離心從5 0微升肉湯中收獲細胞，並接受 SDS-PAGE 分析。藉著在 M15 (pREP4) (pMK1209 #3334)的 培養物中加入IPTG，謗導具有48.5 kDa之預期分子量的蛋 白質，雖然在載體對照組培養物中沒有觀察到受到謗導的 蛋白質帶（圖2)。這個結果暗示可藉著在胺基終端人爲的 加入一個核苷酸，來表現甲羥戊酸激酶蛋白質的活化形 式。 實fli ?選殖甲羥戊酸焦磷酸脱羧酶（mpd)基因 mpd基因的選殖草案幾乎與在實例2至7中出示之hmc基 因的相同。首先，以得自其他物種之甲羥戊酸焦磷酸脱羧 酶基因的共同序列爲基礎，合成在表1 4中出示其序列的 PCR引子。 (請先閱讀背面之注意事項再#本頁)
. 線泰 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規ίΓ(210 X 297公爱） 1250210 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（Μ) 表1 4 (請先閱讀背面之注意事項再一 選殖mpd基因時所使用之引子的序列 Mpdl ; HTNAARTAYTTGGGNAARMGNGA (有意義引子） (SEQ ID NO: 34號）
Mpd2 ; GCRTTNGGNCCNGCRTCRAANGTRTANGC (反義引 子）（SEQ ID NO: 35號） (N=A、C、G或T ; R=A或G，Y=C或T，H=A、T或C，M=A或C) 藉著使用ExTaq作爲DNA聚合酶，在95°C3 0秒，50°C3 0 秒和72°C 1 5秒，循環2 5次的PCR反應之後，使反應混合 物接受瓊脂糖凝膠電泳。回收0.9 kb的PCR帶，預期其長 度含有部份的mpd基因，並根據製造者製備的方法，藉著 QIAquick純化，然後連接到pMOSBlue T-載體中。在轉形 合格的大腸桿菌DH5a細胞之後，選出6個白色的菌落， 並分離質體。6個純種系中的2個具有預期長度的插入序 列。由於定序的結果，發現其中一個純種系所具有的序 列，其推衍之胺基酸序列與已知的甲羥戊酸焦磷酸脱羧酶 基因類似。將該cDNA純種系命名爲pMPD129，並用來進 一步研究。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 接下來，藉著PCR選殖含有mpd基因的部份基因組純種 系。由於PCR條件與選殖部份cDNA片段的條件相同，獲 得經過擴大的1.05 kb片段，並將其選殖到pMOSBlue T-載 體中。由於定序的結果，證實已經獲得具有代表性插入序 列結構之含有mpd基因的基因組片段，並將該基因組純種 系命名爲pMPD220。 -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 1250210 A7 B7 五、發明說明（42 ) 進行南方墨點雜交研究，以便選殖含有得自法菲亞酵母 之完整mpd基因的基因組片段。藉著以DIG多重注滿法標 示模板DNA，以ΚρηΙ消化過的pMPD220，來製備探針。 利用製造者指定的方法來進行雜交。結果，探針與具有 7· 5 kb之長度的帶狀區雜交。接下來，在λ ΖΑΡΙΙ載體中建 構含有6.5至9.0 kb之EcoRI片段的基因組庫。以經過包裝 之萃取物感染大腸桿菌XLlBlue MRF1品系（Stratagene )， 並倒在L B瓊脂培養基上，以NZY培養基覆蓋。藉著使用 以ΚρηΙ·消化過之pMPD220的0.6 kb片段作爲探針，篩選大 約6000個溶菌斑。4個溶菌斑與經過標示之探針雜交。然 後根據製造者（Stratagene)指定的方法製備噬菌體溶胞產 物，並藉著使用大腸捍菌XLlBlue MRF’和SOLR品系完成 在活體内的切除作用。選出從4個陽性溶菌斑中各別衍生 出3個白色的菌落，並從這些選出的轉形物中分離出質 體。然後使經過分離的質體接受菌落PCR法，其草案與在 實例8中的相同。依據在pMPDl29找到的序列來合成在表 1 4中出示其序列的PCR引子，並用來進行菌落PCR。 表1 5 選殖基因組mpd純種系的菌落PCR中所使用之引子的序列 Mpd7 ; CCGAACTCTCGCTCATCGCC (有意義引子）（SEQ ID NO: 36號）
Mpd8 ; CAGATCAGCGCGTGGAGTGA (反應引子）（SEQ ID NO: 37號）
PCR條件幾乎與選殖mvk基因的相同：94X： 3 0秒，50°C -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)
Γ訂· 1250210 A7 B7 五、發明說明（43 ) (請先閱讀背面之注音？事項再本頁) 3 0秒和72°C 1 0秒，循環2 5次。除了一個以外，所有純種 系均產生陽性0.2 kb的PCR帶。從一個陽性的純種系中製 備質體，將該質體命名爲PMPD701，並藉著引子移動程序 定出其大約3 kb的序列（S E Q ID Ν Ο : 4號）。出現由402 個胺基酸所組成的ORF (SEQ ID NO: 9號），其序列類 似已知之甲羥戊酸焦磷酸脱羧酶的序列（與得自粟酒裂殖 酵母（Schizosaccaromyces pombe )之甲經戊酸焦轉酸脱複酶 有52.3%的同一性）。亦定出0.4 kb之5·-鄰近區，預期它包 含其啓動基因序列。 實例1 3選殖焦磷酸法呢酯合成酶（fps )基因 fps基因的選殖草案幾乎與在實例2至7中出示之hmc基 因的相同。首先，以得自其他物種之焦磷酸法呢酯合成酶 基因的共同序列爲基礎，合成在表16中出示其序列的 PCR引子。 表1 6 選殖fps基因時所使用之引子的序列 Fpsl ; CARGCNTAYTTYYTNGTNGCNGAYGA (有意義引子) (SEQ ID NO: 38號） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Fps2 ; CAYTTRTTRTCYTGDATRTCNGTNCCDATYTT (反義 引子）（SEQ ID NO·· 39號） (N=A、C、G或T ; R=A或G，Y=C或T，D=A、G或T) 藉著使用ExTaq作爲DNA聚合酶，在95°C3 0秒，54°C3 0 秒和72°C 3 0秒，循環2 5次的PCR反應之後，將反應混合 物應用於瓊脂糖凝膠電泳。回收具有想要長度（0.5 kb)的 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210
PCR帶，並根據製造者製備的方法，藉著 卟iek 然後連接到pUC57載體中。在轉形合格的大k純化 之後，選出6個白色的菌落，然後分離質體。、卞靖 有想要長度之插入序列的質體之序列。結果聲$出〜佃真 所具有的序列，其推衍之胺基酸序列與已知仏纯餐系 Λ 勺焦磷於 酯合成酶基因類似。將該cDNA純種系命名& $以法％ 舄 ΡίΊ^ 並用來進一步研究。 Μ〇7, 接下來，藉著使用相同的Fpsl和Fps2引予飯、 選殖基因組片段。使用與選殖部份cDNA之參 ，來聚例相同 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 PCR條件。選殖所產生的1.0 kb之帶狀區並定$ 種系含有與PFPS107相同的序列，和一些代喪性、。謗^ 列片段。將該質體命名爲PFPS113,並用來壤、的插八冷 然後，亦利用在實例8中描述的方法，選緩^ 實給。 的5* -和3·-鄰近區。首先，合成在表17中出$ ^ 1ξ) PCR引子。 其序叫^ 表1 7 選殖fps基因之鄰近區時所使用之引予％ $ Fps7 ; ATCCTCATCCCGATGGGTGAATACT (對下二 義）（SEQ ID NO: 40號） 壤駿有讀 Fps8 ; AGGAGCGGTCAACAGATCGATGAGC (對卜a v τ上辱選殖爲 反義）（SEQ ID NO: 41 號） 分離經過擴大的PCR帶，並選殖到pMOSBlne T-載體 中。由於定序的結果，發現選殖長度具有2.5 kb之5’-鄰近 區和長度具有2.0 kb之3’ -鄰近區。將這些質體分別命名爲 -47 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 的 (請先閱讀背面之注咅？事項再_本頁) 訂： .緩_ 1250210 A7 B7 五、發明說明（45 ) pFPSSTull7和pFPSSTdll7 〇在將這兩個質體定序之後， 發現ORF包括1068個鹼基對，並帶有8個插入序列。推衍 的胺基酸序列顯示與得自其他物種之已知的焦磷酸法呢酯 合成酶有廣泛的同種性。以定出之序列爲基礎，合成兩個 帶有在表1 7中所示之序列的PCR引子，來選殖基因組fps 純種系，並在大腸样菌中以該cDNA純種系來進行fps基因 的表現。 表1 8 cDNA和基因組fps選殖時所使用之引子的序列 Fps27 ; GAATTCATATGTCCACTACGCCTGA (有意義引子) (SEQ ID NO: 42號）
Fps28 ; GTCGACGGTACCTATCACTCCCGCC (反義引子） (SEQ ID NO: 43 號） PCR 條件如下：94°C 3 0 秒，50°C 3 0 秒，72°C 3 0 秒，循 環2 5次。由於藉著PCR獲得的純種系之定序分析的結 果，選出一個具有正確序列的cDNA純種系，並命名爲 pFPSl 13。接著進行南方墨點雜交研究，以便選殖含有得 自法菲亞酵母之完整fps基因的基因組片段。藉著以DIG 多重注滿法標示模板DNA，pFPS113，來製備探針。結 果，探針與具有大約10 kb之長度的帶狀區雜交。 接下來，在λ DASHII載體中建構含有9至15 kb之EcoRI 片段的基因組庫。以經過包裝之萃取物感染大腸桿菌XL 1 Blue, MRA(P2)品系（Stratagene)，並倒在L B瓊脂培養基 上，以NZY培養基覆蓋。藉著使用以SacI-消化過之 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 B7 五、發明說明（47 ) 序列一覽表 (1) 共同訊息 (請先閱讀背面之注意事項再本頁)
(i) 申請者：F. HOFFMANN-LA ROCHE· AG (ii) 發明標題：改良微生物之類胡蘿蔔素的生產及其 生物學材料 (iii) 序歹丨J數目：43 (iv) 通信地址： (A) 收件人： (B) 街道：Grezacherstrasse 124
(C) 城市：BASLE
(E) 國家：SWITZERLAND (F) 郵遞區號：CH-4002 (v) 電腦可讀形式： (A) 媒體型式：軟碟 (B) 電腦：IBM PC可相容的
(C) 操作系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體：Patentln Release #1.0，Version #1.25 (vi) 最近的申請資料： (A) 串請編號： (B) 建檔日期： (C) 分類： (ix)電傳訊息： (A) 電話：061-688 25 11 (B) 傳眞：061-688 13 95 (C) 電傳：962292/965542 hire 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) SEQ ID NO: 1 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：6370個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：雙股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型·· DNA (基因組的） (iii) 假説：無 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（48 ) (iv)反-義：無 (vi)來源： (A) 生物：法菲亞酵母（Phaffiarhodozyma) (B) 品系：ATCC96594 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置：1441..1466 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：插入序列 (B) 位置：1467..1722 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：表現序列 (B) 位置：1723..1813 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：插入序列 (B) 位置：1814·.1914 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置·· 1915..2535 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：插入序列 (B) 位置：2536..2621 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：表現序列 (B) 位置：2622..2867 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：插入序列 (B) 位置：2868..2942 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：表現序列 (B) 位置：2943..3897 (ix)特徵： (A)名稱/關鍵：插入序列 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------Γ訂_L--------線* (請先閱讀背面之注意事項再ifk本頁) 丹 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 B7 五、發明說明（49 ) (B)位置：3898..4030 (ix)特徵： (A) 名稱/關键··表現序列 (B) 位置：4031..4516 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：插入序列 (B) 位置：4517..4616 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：表現序列 (B) 位置：4617..4909 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：插入序列 (B) 位置：4910..5007 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：表現序列 (B) 位置：5008..5081 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：插入序列 (B) 位置：5082..5195 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置：5196..5446 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：插入序列 (B) 位置：5447..5523 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：表現序列 (B) 位置：5524..5756 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：聚腺苷酸_位置 (B) 位置：6173 (xi)序列説明：SEQ ID ΝΟ:1號： -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------Γ訂l·-------線泰 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) A7 B7 1250210 五、發明說明（50 ) GGAAGACATG ATGGTGTGGG TGTGAGTATG AGCGTGAGCG TGGGTATGGG CCTGGGTGTG 60 GGTATGAGCG GTGGTGGTGA TGGATGGATG GGTGGGTGGC GTGGAGGGGT CCGTGCGGCA 120 AGATGTTTTC TCTGGGTAGG AGCGTTCTGC ATTGGGGCAG GAGAAAAAAT AGTGTGGTTA 180 CGGGAGATCG TGGTTACATC AAGCCATCGT CACTGTAAGG CTCTGTAAGG CTCGGTTGTT 240 CGCGGGGTGA CACTTAGGCT CTGGCGATTA 300 ATATACTTTT GGATAAGAGG TTTCAACAAG 360 GAAGGCGCGA GGGCGTCCCC GTTTTATATC 420 AAGATATACA TATGACGAGC CTAGAGAGGC 480 ATGAACCATG CAAACTAGAG CATGATGGAA 540 AACGAATAGC CTGTAGGGGT AACCCACGTA 600 TGACAGTCAC GGTGTTTCTT GAGAGTCAGT 660 CCCGACACGT GTGCTTCGAC CGAGGTGGGA 720 GGGACGATAG AGAGGACTAC GGAGAACTGT 780 TTCTAGTTGA GCAAGCGATG TGATTTTCAA 840 AGCTCTATAA TAGAAGGACA AAAGTCGTCC 900 ACCGATTGTT TTTTTCCCTA ATGTTTTATT 960 CTCCGCGTAT TCTTCACACA ACGCTCCCTC 1020 TTCGTCTCCT TCCATTGTCT TCTTTCCTTC 1080 AACAGCGACG TCTCTCTCTC TCTGTGTGGT 1140 CTTTCACGAA TCAACTTCGT TTCTTTTCTG 1200 CATACACTCA CACTTACACT CACACCCACA 1260 CTCCCCTTCT TGATCTCCTT CGGCTTAGGC 1320 CTCAAACGAG CAGCCGCGCT CTCCTCTGCT 1380 GTCGTGGTCA CCTTGACGTA CTTTCAGTTG 1440 GTCCGATCAT CTATTTGTCG TGTTCTCCTT 1500 CGTCAGCGTG GCTGGATTTC CGTCTCCATG 1560 TGTTCCTCTA CTTTTCTTTC TCTACCTCCT 1620 GACCACCGAT CCTCAGGATT CATGGCTAAC 1680 CTTCGTCCAC AGTCTTTCTC AGACGATTAG 1740 TGCGTTCTTC TCTTTGGGAT CCAGATACCT 1800 CTCATGCTTC TTTTCTCTCA GTCTTGTGTG 1860 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）
AAGAAGGTAA CCAAGTGTAA TCACTTGGTT ATATATCTGA AGCAGACCAA ACTATTAACA AATCTCAGCT TGAGGAAAAC TCTTATCCAA AGGACCCCTC GCGCATTTGG TCTGCCACTA TCGAGATCAC GAAAACTAAA AAGATGAAGC AATGGGCGAA GAGGCATAAG GGATGGAGGG AGAGAACACG TGATACTTAA CCCGTATCCC AATGTCCAGC TGTGACCTCA CGTGACTAAA CGATCTTTTT TTTGGGGGGA GAAACCGAGT AGTGAATTGT AGTGCGCTCA CTACGGAGAG I TACAATCCCG GACTACAAGC TCTCTAATAG 丨 CACTCCTATC TCCCGCGCGT TTTAATAGAG TTCTTTCCCC GATCGGCTCA TTTTTCTTCT I CGATCTTTTT TCTTCTTGTT CCTGTTCCTC CTTCCTTCCT TCTTGCCTCT AGCCAGCTTC GATCTCCGAC TGTAGTGTCT CTCTCGGTCA ATCGATCGGT CGTCTTTCCC TCAATCCGTG CACTCAAACA CGCTAAATAA TCAGATCCGT .AATGGCTTCC TTGTTCGGCC TCCGGCGGTC CATCCAATCG AAGTCATCCT TTCTACCTTT ATGTACACCA TCAAGCACAG TAATTTGTAC AGTCTCTTTC TCTTCCTCCT TTGTCTTTCG TCATTTCCCT TATTTCCTCT TCCTGTCATT TTCCCTGTCG TTTGCTTTCC TTCGCCAGTT ATGCCCAACA CAAACTTGCA TATCATCTCT CACACAATCT ACCACCAGCT GGGTCGTCGA TGACCTCGCG AAGGTTAGTC AGTTGACCCT 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1250210 ____B7___ 五、發明說明（51 ) TGCGCATATA CCCACTCATA GACATCTTCG TACGCTGCAC TTTCCCTCCC TTAGCAAGCA 1920 GACTCGGCCG ATATCTTTAT GGTCCTCCTC GGTTACGTCC TTATGCACGG CACATTCGTC 1980 CGACTGTTCC TCAACTTTCG TCGGATGGGC GCAAACTTTT GGCTGCCAGG CATGGTTCTT 2040 GTCTCGTCCT CCTTTGCCTT CCTCACCGCC CTCCTCGCCG CCTCGATCCT CAACGTTCCG 2100 ATCGACCCGA TCTGTCTCTC GGAAGCACTT CCCTTCCTCG TGCTCACCGT CGGATTTGAC 2160 AAGGACTTTA CCCTGGCAAA ATCTGTGTTC AGCTCCCCAG AAATCGCACC CGTCATGCTT 2220 AGACGAAAGC CGGTGATCCA ACCAGGAGAT GACGACGATC TCGAACAGGA CGAGCACAGC 2280 AGAGTGGCCG CCAACAAGGT TGACATTCAG TGGGCCCCTC CGGTCGCCGC CTCCCGTATC 2340 GTCATTGGCT CGGTCGAGAA GATCGGGTCC TCGATCGTCA GAGACTTTGC CCTCGAGGTC 2400 GCCGTCCTCC TTCTCGGAGC CGCCAGCGGG CTCGGCGGAC TCAAGGAGTT TTGTAAGCTC 2460 GCCGCGTTAA TTTTGGTGGC CGACTGCTGC TTCACCTTTA CCTTCTATGT CGCCATCCTC 2520 ACCGTCATGG TCGAGGTAAG CCTTTTCTTC AAGTTTCTTG CTGTCATTTT CCTTTCGACA 2580 CGTATGCTCA TCTTTCGTTT CCGTCTCTCT CACCTTTCCA GGTTCACCGA ATCAAGATCA 2640 TCCGGGGCTT CCGACCGGCC CACAATAACC GAACACCGAA TACTGTGCCC TCTACCCCTA 2700 ；CTATCGACGG TCAATCTACC AACAGATCCG GCATCTCGTC AGGGCCTCCG GCCCGACCGA 2760 | CCGTGCCCGT GTGGAAGAAA GTCTGGAGGA AGCTCATGGG CCCAGAGATC GATTGGGCGT 2820 CCGAAGCTGA GGCTCGAAAC CCGGTTCCAA AGTTGAAGTT GCTCTTAGTA AGTAAACTTC 2880 CTTTGTTCTT CTCATCATTC TTTATCTCCG AATCCTGACG TCGGACCCTT CTCGATTCAA 2940
I AGATCTTGGC CTTTCTTATC CTTCATATCC TCAACCTTTG CACGCCTCTG ACCGAGACCA 3000 CAGCTATCAA GCGATCGTCT AGCATACACC AGCCCATTTA TGCCGACCCT GCTCATCCGA 3060 TCGCACAGAC AAACACGACG CTCCATCGGG CGCACAGCCT AGTCATCTTT GATCAGTTCC 3120 TTAGTGACTG GACGACCATC GTCGGAGATC CAATCATGAG CAAGTGGATC ATCATCACCC 3180 TGGGCGTGTC CATCCTGCTG AACGGGTTCC TCCTAAAAGG GATCGCTTCT G(;C:TCTGCTC 3240 TCGGACCCGG TCGTGCCGGA GGAGGAGGAG CTGCCGCCGC CGCCGCCGTC TTGCTCGGAG 3300 GGTGGGAAAT CGTCGATTGG AACAATGAGA CAGAGACCTC AACGAACACT CCGGCTGGTC 3360 CACCCGGCCA CAAGAACCAG AATGTCAACC TCCGACTCAG TCTCGAGCGG GATACTGGTC 3420 TCCTCCGTTA CCAGCGTGAG CAGGCCTACC AGGCCCAGTC TCAGATCCTC GGTCCTATTT 3480 CACCGGTCTC TGTCGCGCCC GTCGTCTCCA ACGGTAACGG TAACGCATCG AAATCGATTG 3540 AGAAACCAAT GCCTCGTTTG GTGGTCCCTA ACGGACCAAG ATCCTTGCCT GAATCACCAC 3600 CTTCGACGAC AGAATCAACC CCGGTCAACA AGGTTATCAT CGGTGGACCG TCCGACAGGC 3660 CTGCCCTAGA CGGACTCGCC AATGGAAACG GTGCCGTCCC CCTTGACAAA CAAACTGTGC 3720 TTGGCATGAG GTCGATCGAA GAATGCGAAG AAATTATGAA GAGTGGTCTC GGGCCTTACT 3780 CACTCAACGA CGAAGAATTG ATTTTGTTGA CTCAAAAGGG AAAGATTCCG CCGTACTCGC 3840 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------- 訂卜------- (請先閱讀背面之注音？事項再本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1250210 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（52 ) TGGAAAAAGC ATTGCAGAAC TGTGAGCGGG CGGTCAAGAT TCGAAGGGCG GTTATCTGTA 3900 GGTCTTTTTC TCCTTTGAAT TTCAAGCCTT GGAGGAGAGG AAAGTGCTTC GGGGTACAAT 3960 ACAGGTTGTG CAAACAAACC AAGAGAAACT AAAGAAAACT TTCTTCTCCT CTCTCTCCCC 4020 TCGACGTCAG CCCGAGCATC CGTTACTAAG ACGCTGGAAA CCTCGGACTT GCCCATGAAG 4080 GATTACGACT ACTCGAAAGT GATGGGCGCA TGCTGTGAGA ACGTTGTCGG ATATATGCCT 4140 CTCCCTGTCG GAATCGGTGG TCCACTTAAC ATTGATGGCG AGGTCGTCCC CATCCCGATG 4200 GCCACCACCG AGGGAACTCT CGTGGCCTCG ACGTCGAGAG GTTGCAAAGC GCTCAACGCG 4260 GGTGGCGGAG TGACCACCGT CATCACCCAG GATGCGATGA CGAGAGGACC GGTGGTGGAT 4320 TTCCCTTCGG TCTCTCAGGC CGCACAGGCC AAACGATGGT TGGATTCGGT CGAAGGAATG 4380’ GAGGTTATGG CCGCTTCGTT CAACTCGACT TCTAGATTCG CCAGGTTGCA GAGCATCAAG 4440 TGTGGAATGG CCGGCCGATC GCTATACATC CGTTTGGCGA CCAGTACCGG AGATGCGATG 4500 GGAATGAACA TGGCTGGTGA GTGCGACGAG TTTTCTTTGT TCTTCTTGTG CGGACCATGT 4560 TTTCTCATCC AGCCAATTCA TTCTTCATTC CTTCTCGGTG TTTGGCAACC TTTTAGGTAA 4620 AGGAACGGAG AAAGCTTTGG AAACCCTGTC CGAGTACTTC CCATCCATGC AGATCCTTGC 4680 TCTTTCTGGT AACTACTGTA TCGACAAGAA GCCTTCTGCC ATCAACTGGA TTGAGGGCCG 4740 TGGAAAGTCC GTGGTGGCCG AGTCGGTGAT CCCTGGAGCG ATCGTCAAGT CTGTCCTCAA 4800 GACAACGGTT GCGGATCTCG TCAACTTGAA CATTAAGAAA AACTTGATCG GAAGTGCCAT 4860 _ GGCAGGCAGC ATTGGAGGAT TCAACGCCCA CGCGTCGAAT ATTTTGACTG TGCGTACTTC 4920 TCTTTCCATA TTCGTCCTCG TTTAATTTCT TTTCTGTCCA GTCTTATGAC GTCTGATTGG 4980 TTCTTCTTTT CACCCACACA CATACAGTCA ATCTTCTTGG CTACAGGTCA GGATCCTGCA 5040 CAGAATGTGG AGTCCTCAAT GTGCATGACA TTGATGGAGG CGTACGTTTT TTGTTTTGTT 5100 TTCCTTCTTT TTCCATATGT TTCTACTTCT ACTTTCTTCC CGAGTCCGCC AAGCTGATAC 5160 CTTTATACGG TCCTTCTCTT TCTCATGACG AGTAGTGTGA ACGACGGAAA AGATCTACTC 5220 ATCACCTGCT CGATGCCGGC GATCGAGTGC GGAACGGTCG GTGGAGGAAC TTTCCTCCCT 5280 CCGCAAAACG CCTGTTTGCA GATGCTCGGT GTCGCAGGTG CCCATCCAGA TTCGCCCGGT 5340 CACAATGCTC GTCGACTAGC AAGAATCATC GCTGCCAGTG TGATGGCTGG AGAGTTGAGT 5400 TTGATGAGTG CTTTGGCCGC TGGTCATTTA ATCAAGGCCC ACATGAGTAA GTCTGCCACC 5460 TTTTGATAAT CAAAAGGGTC GTGGTACTGG TGTCACTGAC TGGTGACTCT TCCTGTCATG 5520 CAGAGCACAA TCGATCGACA CCTTCGACTC CTCTACCGGT CTCACCGTTG GCGACCCGAC 5580 CGAACACGCC GTCCCACCGG TCGATTGGAT TGCTCACACC GATGACGTCT TCCGCATCGG 5640 TCGCCTCGAT GTTCTCTGGG TTCGGTAGTC CGTCGACGAG CTCGCTCAAG ACGGTAGGTA 5700 GCATGGCTTG CGTCAGGGAA CGAGGGGACG AGACGAGTGT GAACGTGGAT GCCTGAACTG 5760 GGGACTCCCT TTTCTTGGTA TCCCTTCCGT TTTTCTTTCG GCCTTTGAAT CCTGTATTCT 5820 -55 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ·ι訂卜-------線‘ (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 1250210 A7 B7 五、發明說明（53 )
TGTCCGTTTT TTCATCTTCT CTTCCTGGTT CTCCTTCTCT CGTTCATCTG CAAAAACAAA ATTCAATCGC ATCGGTCTCT GGCATTCCAT TTGGGTTTCA AAATCAAATC AATCTCTATC TACTATCTCA AATATCTTTT TTTCATCTTT TGATTCATTT CTGTTGAAAA CTGTCTTGCC CTTCTCCTAC TTCTTATCTC TGCCTTCTTG CCAAAGTTCA ATTCGTTGTC CATCTGTGCA CTCTGATCTA TCAGTCTGTA TCAAGTACGC TCTTAAATCT GTAATTGGCT CTCGGAGGTG TCTCGTCATC TCACATATGG CTGGCGATAT GATGTGTCGG TTTCTTCCCC TCCAACAAAG GCGACGTGGC TCCTTCATCA ATCTTTGGCG CAAGCTCTCA AAATTCTCCA AAACGGCTGA CTAAGCAAGG TTTCCAAGTA CTCTCAAACC GAGCAAGGCC ATCCATCCTC AAATCAACTT GTGAAACCCT TTGTGGATAG ACCGTCCAAA CCGAGCTCTT CCCAATCTTC GCCTCCCCTT CTTCCTGCAG 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6370 (2) SEQIDNO:2號的訊息： ⑴序列特徵： (A) 長度：4775個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：雙股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (vi)來源； (A) 生物：法菲亞酵母 (B) 品系·· ATCC96594 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：表現序列 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (B) 位置：1305..1361 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：插入序列 (B) 位置：1362..1504 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置：1505..1522 (ix)特徵： -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（54 ) (A) 名稱/關键：插入序列 (B) 位置：1523..1699 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置：1700..1826 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：插入序列 (B) 位置：1827..1920 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置：1921..2277 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：插入序列 (B) 位置·· 2278..2351 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置：2352..2409 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：插入序列 (B) 位置：2410..2497 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置：2498..2504 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：插入序列 (B) 位置：2505..2586 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置：2587..2768 (ix)特徵： -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------Γ 訂--------I 赢 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 1250210 A7 B7 五、發明說明（55 ) (A) 名稱/關键：插入序列 (B) 位置：2769·.2851 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置：2852·.2891 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：插入序列 (B) 位置：2892··2985 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置：2986..3240 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：插入序列 (B) 位置：3241..3325 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置：3326..3493 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：表現序列 (B) 位置：3494..3601 (ix)特徵： ‘ (A) 名稱/關键：表現序列 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (B) 位置：3602·.3768 (ix)特徵： (A) 名稱/關键：聚腺甞酸_位置 (B) 位置：4043 (xi)序列説明：SEQ ID NO:2號： CATCGAAGAG AGCGAAGTGA TTAGGGAAGC CGAAGAGGCA CTAACAACGT GGTTGTATAT 60 GTGTGTTTAT GAGTGTTATA TCGTCAAGAA CGAAGTCCAT TCATTTAGCT AGACAGGGAG 120 -58 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（56 ) AGAGGGAGAA ACGTACGGGT TTACCCTATT GGACCAGTCT AAAGAGAGAA CGAGAGTTTT 180 TGGGTCGGTC ACCTGAAGAG TTTGAACCTC CACAAGTTTA TTCTAGATTA TTTCCGGGGG 240 TATGTGAAGG ATAATGTCAA ACTTTGTCCA GATTGAAGAA GGCAAGAAAG GAAAGGGGCG 300 AACGAGAGTA TCGTCCCATC TATGGGTGAC CAGTCGACCT TCTGCATCGG CGATCCCGAG 360 AATGGAAGGT TCCGATGGAT CAGAAGTAGG TTTCCTAAGC TCAAACATAG GTCATTGCGA 420 GTGAGATACA TATGCAGACT GATATGCTAG TCAAACCGAA CGAGATTTCT CTGTTTGCTT 480 TCAAAAAGAC GAACCAACCA TTTCATGTCC AAGATGGCAG GTCCTTCGAT TCTTTGAAGC 540 TCCTCCCTGA TGCGGACAGA AAAGAATAAA ,AAGTAGACAG ACTGTCAAGT 'CGACAGCGCA 600 AGTTTATCAA GCTGAGCGAG AAAACTCGAA CTTACATACC TTGGCCGTCA ,GTTCTGTAGA 660 CCAAGCATCG GCCTTTCCTC TTTGCGGCAG GTGTACGCGT TGGCTCACCA TCGTCACTCT 720 CGTCTCCTGA CCCGTTGCTT TCCTTGACAG CAGTCTGTTC CACAGGTTTC TCTAACTGAT 780 AGGTCCCAAC AGCAAAGATA TCTGGATGTC TATGTGAGAA CTCTACTGAG TCGGCAGAGT 840 ACACCGTATC GATATAGGCG AGTGAGGAAG CTTTGAAAGG TGAAGAAGTA GCGAAAGATC 900 ATCAGCGAAT GAGGACTATG ACAAAAAAGA AATTTTCGTA TAATCCACTG GACAAATCAC 960 CTTCCATCGT GTCCTCCAAG AGGGTTTCGT CTGAAACGTA AGGACGAGGT ATTGATAGAT 1020 GATTGACCTT GAGTACGGGG ATGGACAAGG AACGAGCCCA CTCCCAGGGC TATGTAACAC 1080 CACACGTGAC TCCACTTGAA TTGCGGCAGA TAAACGAAGT CTTACGATCG GACGACTTTG 1140 TAACCATTTA GTTATTTACC CGTCTTGTTT TCTTACTTTG ATCGTCCCAT TTTAGACACA 1200 AAAAAAGAAG CCAGAAGAGA AAAGAATAAA ACGTCTACCG TGTTCTCTCC GAATTCTTAC 1260 CACACCCACA AAACCATACA CAATCTCAAT CTAGATATCC AGTTATGTAG ACTTCTACTA 1320 CCGAACAGCG ACCCAAAGAT GTTGGAATTC TCGGTATGGA GGTATGTTGT TCAATTCTGT 1380 TTGTGTTCAA TCTTTAATCA TCTTTAGTCG ACTGACCGGT TCTTCCTTTT TTTTTCTTCA 1440 TCAAACAAAA CAACCCTTCT CGATTCATGT CATCTTTCTT TCCAATGCGC TACTCCTTCT 1500 GTAGATCTAC TTTCCTCGAC GAGTGCGTAA CTATTCTCTC TTCTGCATTC TCTCTCTATT 1560 CCCATGTTCG ATCCCTCGCC CTCATATGGG CGACTGTTTC ATCTCTTTTG CTTCCGTCCA 1620 TTCTTCTTTG ATCTTGTTCA TTTTCTACTA ATATCTCCCG ACGCGAAATA CAACACTGAC 1680 CGCGATTTCT CTCGATCAGG CCATCGCTCA CAAGGATCTC GAGGCTTTTG ATGGGGTTCC 1740 TTCCGGAAAG TACACCATCG GTCTCGGCAA CAACTTCATG GCCTTCACCG ACGACACTGA 1800 GGACATCAAC TCGTTCGCCT TGAACGGTCA GTCTCTTCCG TTTCAGCAAT CGACAGGAAA 1860 AAGGCCCAAG CGCATCTCAC TGACACCTTT CTCCGTTTTG CAATTCCATT TGATTGTTAG 1920 CTGTTTCCGG TCTTCTATCA AAGTACAACG TTGATCCCAA GTCAATCGGT CGAATTGATG 1980 TCGGAACTGA GTCCATCATT GACAAGTCCA AATCTGTCAA GACAGTCCTT ATGGACTTGT 2Ό40 TCGAGTCCCA CGGCAACACA GATATTGAGG GTATCGACTC CAAGAATGCC TGCTACGGTT 2100 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------I訂-I·.-------線在 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) I it 1250210 A7 B7 五、發明說明（57 ) CTACCGCGGC CCTGTTCAAT GCCGTCAACT GGATCGAGTC ATCCTCTTGG GACGGAAGAA 2160 ATGCCATTGT CTTCTGCGGA GACATTGCCA TCTACGCCGA GGGTGCTGCC CGACCTGCCG 2220 GAGGTGCTGG TGGTTGCGCC ATCCTCATCG GACCCGACGC TCCCGTCGTC TTCGAGCGTG 2280 AGTTCCAATC CGTCATTTTC TTCCACGGCA GCGGCTGAAA CAACCCTTAT CCGTCATTCT 2340 CATCAATCTA GCCGTCCACG GAAACTTCAT GACCAACGCT TGGGACTTCT ACAAGCCTAA 2400 TCTTTCTTCG TATGTTCAAA TTTTGAAGTT TGCGCTTGGG AGAGTCTTAC ACTAATTCGG 2460 GGTGCTCGTA TCCTTCGAAT CGTTTGTTGC TTTATAGTGA ATACGTTCGT CTGCGCACCT 2520 CCTATATTTA GTTTTTGATC AAATATTGTC CATTGAATTA ACTCTGAAAC CTTCTCCTCC 2580 AAATAGCCCA TTGTCGATGG ACCTCTCTCC GTCACTTCCT ACGTCAACGC CATTGACAAG 2640 GCCTATGAAG CTTACCGAAC AAAGTATGCC AAGCGATTTG GAGGACCCAA GACTAACGGT 2700 GTCACCAACG GACACACCGA GGTTGCCGGT GTCAGTGCTG CGTCGTTCGA TTACCTTTTG 2760 TTCCACAGGT AAGCGTCATC TTCTGTATTC TCCTTAAATT CAACCGATCA ACGGAGTTAA 2820 TTCGTGTCAT CATATTATCT TGTTGGAACA GTCCTTACGG AAAGCAGGTT GTCAAAGGCC 2880 ACGGCCGACT TGTAAGCAGT CTTTTTGTAA CTCTTAGCTT GCAGATAAAA ACTTTTAGGT 2940 TTCTGGTACT CATTATTTAT GCATCTCTTG AATCACCTTA TCTAGTTGTA CAATGACTTC 3000 CGAAACAACC CCAACGACCC GGTTTTTGCT GAGGTGCCAG CCGAGCTTGC TACTTTGGAC 3060 ATGAAGAAAA GTCTTTCAGA CAAGAATGTC GAGAAATCTC TGATTGCTGC CTCCAAGTCT 3120 TCTTTCAACA AGCAGGTTGA GCCTGGAATG ACCACCGTCC GACAGCTCGG AAACTTGTAC 3180 ACCGCCTCTC TCTTCGGTGC TCTCGCAAGT TTGTTCTCTA ATGTTCCTGG TGACGAGCTC 3240 GTAAGTCTTG ATCTCTATCC CAATCATCTC TTCCTTATCA ATTGAACTGA ACTCTTTTCT 3300 TTAATGCTGG CTTTCTCTTG AACAGGTCGG CAAGCGCATT GCTCTCTACG CCTACGGATC 3360 TGGAGCTGCT GCTTCTTTCT ATGCTCTTAA GGTCAAGAGC TCAACCGCTT TCATCTCTGA 3420 GAAGCTTGAT CTCAACAACC GATTGAGCAA CATGAAGATT GTCCCCTGTG ATGACTTTGT 3480 CAAAGCTCTG AAGGTACGTT GGATAATGAC TTTTTTTGTG GACCGTGGTC TTTGTCAACC 3540 GCTAACAACC TTCTTGAATC GGTCTCTTTT GGTTTGAAAT TCGCTCGGCG CTTCGACACA 3600 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GGTCCGAGAA GAGACTCACA ACGCCGTGTC ATATTCGCCC ATCGGTTCGC TTGACGATCT 3660 CTGGCCTGGA TCGTACTACT TGGGAGAGAT TGACAGCATG TGGCGTCGAC AGTACAAGCA 3720 GGTCCCTTCT GCTTGAACGG GATATTAAAA GTTTCAAAAG TTATGAAAGA GGTCGGCGAA 3780 GATTCAAAAT AAATAAATAT AACACCTTGC TTTTTGGCTT GTTTTCCTTC TTCACTCTCG 3840 TTTCCGATGT GTTTCCTCCG TTTCTTCCCT CTTTTGTTCC TTTTTCCTCC CTCTTTTGGT 3900 TACAATCTCT TTGGGTTTTA CAGGCTGGCA ATCTCTGTAC AATCTTCGTT CGCGTGATCC 3960 GACATAGATA CCGTTGTGGC ATACACCTTG CGTCTTACAT CTTTTGAGAG CTTCGGAGGT 4020 GATCTTGATG AAGAAAATTC ACCATTGACT CCCATCTCTT GAATGTCCTG ACTA?^ATTGA 4080 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（58 ) ATTGGAAGCA ACTTATATGA AGAGCAAATT GATGGATCCA GAAAGGAACA AGTCTAGAAA 4140 TCAGTGATTT GTGCGAAAAA TCAGCAAATG CCGCGCTGAG CCGCTCGCTG GGGAGTAGAC 4200 ATTGCCCATG CGCGTGATGT TGTCTGACCG TTCTCCTCCA TTCCCCCACT CTCAACCTTC 4260 CTCTCTTTGA GAATCGAAGA AGAAGGCGAA GAAAACCTGA CTTGATCCTT TACAGGGTGT 4320 TTCTTTTGTT CGTATCTGAG TTACTTTTCC TCCTTTCCTT CCTGCTTGAG TGAATGACTG 4380 ATCTGACTCC TCCGCCTACC TCGGCGACTG GGCTATATCT TGAGGATAGA ATATCCCCCT 4440 GACAATCCCA TTTCTCAAGA TTCTTTCAAA CAAGAAAACT AGTTCCAATC AATAGATCAT 4500 CTGATCAACC TTGTGTGAAC ATAATCATCT GCAGAAGCAC TGAACTGAGA AAGTCTTCCT 4560 CAGAGGAAAG AGAATACTAG ATAAGATCAT TCGGTTGGGA AGGTAAAGGA ATGAAGTCTG 4620 GTTCTGGGTT TAGCTCTGGT TCCGTAGGGG GTTCGACTAT AGTTTCTTCT GTTCGACTAG 4680 AAACAGGAGA AACCGTACAT GTAAATGGTA TGATATTCTT GTCTCTGTAT CATGTCCCGC 4740 TCATCTCTTT GTTTGCAAGT CACTCTGGAG AATTC 4775 (2) SEQ ID N0:3 號的訊息： ⑴序列特徵： (A) 長度：4135個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：雙股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (vi)來源： (A) 生物：法菲亞酵母 (B) 品系：ATCC96594 (ix)特徵： (A)名稱/關鍵：表現序列 位置：1021..1124 (ix)特徵： (A)名稱/關鍵：插入序列 位置：1125..1630 (ix)特徵： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (A)名稱/關鍵··表現序列 位置：1631..1&56 (ix) ¥ 徵： (A) 名稱/關鍵：插入序列 (B) 位置：1957..2051 (ix)特徵： (A)名稱/關键：表現序列 位置：2052..2366 (ix)特徵： (A)名稱/關鍵：插入序列 位置：2367..2446 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 7 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五 、發明說明（59 )
X) • 1 /V X) •1 X) • 1 £ 稱置稱置稱置稱置明 ••名位··名位··名位··名位説 徵}}徵}}徵}}徵}}列 ίφΑΒ 择 AB_AB_AB宇 .4 /iv/ivd* /l\/lvd— /^\/lv4^i /|\/(\ £/
QE S 表現序列 2651 插入序列 2732 表現序列 3188 聚腺甞酸_位置 ID N0:3 號：
ACTGACTCGG CTACCGGAAA ATATCTTTTC AGGACGCCTT GATCGTTTTG GACAACACCA TGATGTCACC ATATCTTCAG CGGCCGTTGG AGCTAGGAGT AGACATTGTA TACGACTCTG GAACAAAGTA TTTGAGTGGA CACCACGATC TCATGGCTGG TGTGATTACT ACTCGTACTG AGGAGATTGG GAAGGTTCGT GCTTGCTTGC TTTGAATGTC GTGCCTAAAG CCATTGCCAT AAGACAGAGT CTGATCTATG TCGTTTGCCT ACAACAGAGA ATGGCCTGGT TCCCAAATGC TATGGGAAAT GCATTGTCTC CGTTCGACTC GTTCCTTCTT CTCCGAGGAC TCAAAACACT TCCTCTCCGA CTGGACAAGC AGCAGGCCTC ATCTCACCTG ATCGCCTCGT ACTTACACAC CCTCGGCTTT CTTGTTCACT ACCCCGGTCT GCCTTCTGAC CCTGGGTACG AACTTCATAA CTCTCAGGCG AGTGGTGCAG GTGCCGTCAT GAGCTTTGAG ACCGGAGATA TCGCGTTGAG TGAGGCCATC GTGGGCGGAA CCCGAGTTTG GGGAATCAGT GTCAGTTTCG GAGCCGTGAA CAGTTTGATC AGCATGCCTT GTCTAATGAG GTTAGTTCTT ATGCCTTCTT TTCGCGCCTT CTAAAATTTC TGGCTGACTA ATTGGGTCGG TCTTTCCGTT CTTGCATTTC AGTCACGCAT i CTATTCCTGC TCACCTTCGA GCCGAGCGAG GTCTCCCCGA ACATCTGATT CGACTGTGTG TCGGTATTGA GGACCCTCAC GATTTGCTTG ATGATTTGGA GGCCTCTCTT GTGAACGCTG GCGCAATCCG ATCAGTCTCT ACCTCAGATT CATCCCGACC GCTCACTCCT CCTGCCTCTG ATTCTGCCTC GGACATTCAC TCCAACTGGG CCGTCGACCG AGCCAGACAG TTCGAGCGTG TTAGGCCTTC TAACTCGACA GCCGGCGTCG AAGGACAGCT TGCCGAACTC AATGTAGACG ATGCAGCCAG ACTTGCGGGC GATGAGAGCC AAAAAGAAGA AATTCTTGTC AGTGCACCGG GAAAGGTCAT TCTGTTCGGC GAACATGCTG TAGGCCATGG TGTTGTGAGT GAGAAATGAA AGCTTTATGC TCTCATTGCA TCTTAACTTT TCCTCGCCTT TTTTGTTCTC TTCATCCCGT CTTGATTGTA GGGATGCCCC CCTTTGCCCC TTTCCCCTTC TTGCATCTGT CTATATTTCC TTATACATTT CGCTCTTAAG AGCGTCTAGT TGTACCTTAT AACAACCTTT GGTTTTAGCA TCCTTTGATT ATTCATTTCT CTCATCCTTC GGTCAGAGGC TTTCGGCCAT CTTTACGTCT 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 B7
五、發明說明（6G
GATTAGATTG TAATAGCAAG AACTATCTTG CTAAGCCTTT TCTCTTCCTC TTCCTCCTAT ATAAATCGAA TTCACTTTCG GACATGTTTA TTTTGGGGAA ATCATCAAGG GGTGGGGGGC CAATCCCGAC ACTAATTTTC TGCTCACGTC AAAACTCAGC GTTCAGAATC AGTCACTGAC CCTGATACGT GTCTCTATGT GTGTGGGTGT ACGTGCGAAT TGTGACTCGA CGTTCTACGC TTAAAAACAG ACCGGGATCG CTGCTTCCGT TGATCTTCGA TGCTACGCTC TTCTCTCACC CACTGCTACG ACAACAACAT CATCGTCGTT ATCGTCTACA AACATTACCA TCTCCCTAAC GGACCTGAAC TTTACGCAGT CTTGGCCTGT TGATTCTCTT CCTTGGTCAC TTGCGCCTGA CTGGACTGAG GCGTCTATTC CAGAATCTCT CTGCCCGACA TTGCTCGCCG AAATCGAAAG GATCGCTGGT CAAGGTGGAA ACGGAGGAGA AAGGGAGAAG GTGGCAACCA TGGCATTCTT GTATTTGTTG GTGCTATTGA GCAAAGGGAA GCCAAGGTAG GTTTTTTCTG TCTCTTCTTT TTGCCTATAA AGACTCTTAA CTGACGGAGA AAGTGTTGGG TTTCTTCCTT CGGGGGTTCA ATCAATTAAA GTGAGCCGTT CGAGTTGACG GCTCGATCTG CGCTTCCGAT GGGAGCTGGT CTGGGTTCAT CCGCCGCTCT ATCGACCTCT CTTGCCCTAG TCTTTCTTCT CCACTTTTCT CACCTCAGTC CAACGACGAC TGGCAGAGAA TCAACAATCC CGACGGCCGA CACAGAAGTA ATTGACAAAT GGGCGTTCTT AGGTCAAAAA GTCATCCATG GAAATCCGAG TGGGATTGAT AACGCGGTCA GTACGAGAGG AGGCGCTGTT GCTTTCAAAA GAAAGATTGA GGGAAAACAG GAAGGTGGAA TGGAAGCGAT CAAGAGGTAC GCAGACACGG TGCTTCATAT GCCATACTCC AGTCTGATTG ACCCATGATG AACGTCTTTC TACATTTCGA ATATAGCTTC ACATCCATTC GATTCCTCAT CACAGATTCT CGTATCGGAA GGGATACAAG ATCTCTCGTT GCAGGAGTGA ATGCTCGACT GATTCAGGAG CCAGAGGTGA TCGTCCCTTT GTTGGAAGCG ATTCAGCAGA TTGCCGATGA GGCTATTCGA TGCTTGAAAG ATTCAGAGAT GGAACGTGCT GTCATGATCG ATCGACTTCA AGTTAGTTCT TGTTCCTTTC AAGACTCTTT GTGACATTGT GTCTTATCCA TTTCATCTTC TTTTTTCTTC CTTCTTCTGC AGAACTTGGT CTCCGAGAAC CACGCACACC TAGCAGCACT TGGCGTGTCC CACCCATCCC TCGAAGAGAT TATCCGGATC GGTGCTGATA AGCCTTTCGA GCTTCGAACA AAGTTGACAG GCGCCGGTGG AGGTGGTTGC GCTGTAACCC TGGTGCCCGA TGGTAAAGTC TCTCCTTTTC TCTTCCGTCC AAGCGACACA TCTGACCGAT GCGCATCCTG TACTTTTGGT CAACCAGACT TCTCGACTGA AACCCTTCAA GCTCTTATGG AGACGCTCGT TCAATCATCG TTCGCCCCTT ATATTGCCCG AGTGGGTGGT TCAGGCGTCG GATTCCTTTC ATCAACTAAG GCCGATCCGG AAGATGGGGA GAACAGACTT AAAGATGGGC TGGTGGGAAC GGAGATTGAT GAGCTAGACA GATGGGCTTT GAAAACGGGT CGTTGGTCTT TTGCTTGAAC GAAAGATAGG AAACGGTGAT TAGGGTACAG ATCCTTTGCT GTCATTTTTA CAAAACACTT TCTTATGTCT TCATGACTCA ACGTATGCCC TCATCTCTAT CCATAGACAG CACGGTACCT CTCAGGTTTC AATACGTAAG CGTTCATCGA CAAAACATGC GGCACACGAA -63 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360
1250210 A7 B7 五、發明說明（61 ) AACGAGTGGA TATAAGGGAG AAGAGAGATA TTAGAGCGAA AAAGAGAAGA GTGAGAGAGG 3420 ΑΆΑΑΆΑΑΤΑΑ CCGAGAACAA CTTATTCCGG TTTGTTAGAA TCGAAGATCG AGAAATATGA 3480 AGTACATAGT ATAAAGTAAA GAAGAGAGGT TTACCTCAGA GGTGTGTACG AAGGTGAGGA 3540 CAGGTAAGAG GAATAATTGA CTATCGAAAA AAGAGAACTC AACAGAAGCA CTGGGATAAA 3600 GCCTAGAATG TAAGTCTCAT CGGTCCGCGA TGAAAGAGAA ATTGAAGGAA GAAAAAGCCC 3660 CCAGTAAACA ATCCAACCAA CCTCTTGGAC GATTGCGAAA CACACACACG CACGCGGACA 3720 TATTTCGTAC ACAAGGACGG GAGATTCTTT TTTTATATCC GGGTGGGGAG AGAGAGGGTT 3780 ATAGAGGATG AATAGCAAGG TTGATGTTTT GTAAAAGGTT GCAGAAAAAG GAAAGTGAGA 3840 GTAGGAACAT GCATTAAAAA CCTGCCCAAA GCGATTTATA TCGTTCTTCT GTTTTCACTT 3900 CTTTCCGGGC GCTTTCTTAG ACCGCGGTGG TGAAGGGTTA CTCCTGCCAA CTAGAAGAAG 3960 CAACATGAGT CAAGGATTAG ATCATCACGT GTCTCATTTG ACGGGTTGAA AGATATATTT 4020 AGATACTAAC TGCTTCCCAC GCCGACTGAA AAGATGAATT GAATCATGTC GAGTGGCAAC 4080 GAACGAAAGA ACAAATAGTA AGAATGAATT ACTAGAAAAG ACAGAATGAC TAGAA 4135 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) SEQ ID NO:4 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2767個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：雙股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (vi)來源： (A) 生物··法菲亞酵母 (B) 品系：ATCC96594 (ix)特徵： . (A)名稱/關鍵：表現序列 位置：401..451 (ix)特徵： (A)名稱/關鍵：插入序列 位置：452..633 (ix)特徵： (A)名稱/關鍵：表現序列 位置：634..876 (ix)特徵： (A)名稱/關鍵：插入序列 位置：877..1004 (ix)特徵： (A)名稱/關鍵：表現序列 位置：1005..1916 (ix)特徵： -64- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------—訂—--------線秦(請先閱讀背面之注意事項再#本頁) 太 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 B7 五、發明說明（62 ) (A)名稱/關鍵：聚腺甞酸—位置 位置：2217 (xi)序列説明：SEQ ID N0:4號： GAATTCTTCC CGACTGGGCT GATCGACTTG ACTGGAAGAT CTAAGGCGGA GGGATGAAGG 60 AAGTAATTGG AGGGAATGAG GAAAAAAAAA GGCGAGGGAA CGCGGTCTTC TTTCCTGGCA 120 AGGCAATGTC GTGTATCTCT CTTGATTCTT TCGTTGTATC GACGGACCAC ACTCTTTTCG 180 AATGAATATC ACTATCGCAT CCAATGATCG CTATACATGG CATTTACATA TGCCAGACAT 240 CGCTGAGAAA GAGAGAACAT TCCTTTGGAA AAAGCCTACT GTGCCTGAAG TCAGGCTGAT 300 GTTGATTAAA CGTCTTTCCC CATCCTAAGC AGACAAACAA CTTCTTTTCG TTCAACACAC 360 CACCTCTCTC CGAAAAAGCT CTTCAATCCA GTCCATTAAG ATGGTTCATA TCGCTACTGC 420 CTCGGCTCCC GTTAACATTG CGTGTATCAA GGTCCGTCTG CATTGTGAAT GCTGCTCGTT 480 ；TGCCTTGTGT GCGTTTGGTG GATCTGAAAG AACCCTTGCT TGAACCATTC CATCTCTGCT 540 CTTTTTCTTC CTGTCCTTTC CTTTTTCTCA CGACAAAAAA ACCACCTGGA CCCTTTGTGT 600 TCCTTTCCAT TGGTGTTCAT ACACCTAACA CAGTACTGGG GTAAACGGGA TACCAAGTTG 660 ATTCTCCCTA CAAACTCCTC CTTGTCTGTC ACTCTCGACC AGGATCACCT CCGATCGACG 720 ACGTCTTCTG CTTGTGACGC CTCGTTCGAG AAGGATCGAC TTTGGCTTAA CGGGATCGAG 780 GAGGAGGTCA AGGCTGGTGG TCGGTTGGAT GTCTGCATCA AGGAGATGAA GAAGCTTCGA 840 GCGCAAGAGG AAGAGAAGGA TGCCGGTCTG GAGAAAGTGA GTTTTTCTCC TGTGTGCGTG 900 TGTACTCTGT ATAGGTACCG TTGACAGGAC AGTCTTTCTG AAGAGTTTGG ATCTTACTCT 960 TTTTTGGGGG GGTGGTGGTG TTTGAAATAA TGACCAAAAT AAAGCTCTCA TCTTTCAACG 1020 TGCACCTTGC GTCTTACAAC AACTTCCCGA CTGCCGCTGG ACTTGCTTCC TCCGCTTCCG 1080 GTCTAGCTGC GTTGGTCGCC TCGCXCGCCT CGCTCTACAA CCTCCCAACG AACGCATCCG 1140 AACTCTCGCT CATCGCCCGA CAAGGTTCTG GTTCTGCCTG CCGATCGCTC TTCGGCGGGT 1200 TCGTTGCTTG GGAACAGGGC AAGCTTTCCT CTGGAACCGA CTCGTTCGCT GTTCAGGTCG 1260 AGCCCAGGGA ACACTGGCCC TCACTCCACG CGCTGATCTG TGTAGTTTCC GACGAGAAAA 1320 AGACGACGGC CTCGACGGCA GGCATGCAAA CCACGGTGAA CACCTCGCCT TTGCTCCAAC 1380 ACCGAATCGA ACACGTCGTT CCAGCCCGGA TGGAGGCCAT CACCCAGGCG ATCCGGGCCA 1440 AGGATTTCGA CTCGTTCGCA AAGATCACCA TGAAGGACTC CAACCAGTTC CACGCCGTCT 1500 GCCTCGATTC GGAACCCCCG ATCTTTTACT TGAACGATGT CTCCCGATCG ATCATCCATC 1560 TCGTCACCGA GCTCAACAGA GTGTCCGTCC AGGCCGGCGG TCCCGTCCTT GCCGCCTACA 1620 CGTTCGACGC CGGGCCGAAC GCGGTGATCT ACGCCGAGGA ATCGTCCATG CCGGAGATCA 1680 TCAGGTTAAT CGAGCGGTAC TTCCCGTTGG GAACGGCTTT CGAGAACCCG TTCGGGGTTA 1740 ACACCGAAGG CGGTGATGCC CTGAGGGAAG GCTTTAACCA GAACGTCGCC CCGGTGTTCA 1800 GGAAGGGAAG CGTCGCCCGG TTGATTCACA CCCGGATCGG TGATGGACCC AGGACGTATG 1860 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂----------線* (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 1250210 A7 __ B7 五、發明說明（63 ) GCGAGGAGGA GAGCCTGATC GGCGAAGACG GTCTGCCAAA GGTCGTCAAG GCTTAGACTA 1920 TAGGTTGTTT CTTCTAAATT TGAGCCTTCC TCCCGCCTCC CTTCCACAAG CATAAAACAA 1980 AGGATAAACA AATGAATTAT CAAAATAACT ATAGGTTGTT TCTTCTAAAT TTGAGCCTTC 2040 CTCCCGCCTC CCTTCCACAA GCATAAAACA AAGGATAAAC AAATGAATTA TCAAAATAAA 2100 ATAAAAAGTC TGCCTTCTTT GTTTTGGAAT ACATCTTCTT TGGGACATGA CCCTTCTCCT 2160 TCTTTTCCGT ATACATCTTT TTGGGTATTT CATGGTGATC AAACAACATT GTGATCGAAA 2220 GCAGAGACGG CCATGGTGCT GGCTTTGAGC GTCTGGCGTT TTGTGTGTCC TGCACTTGAG 2280 CAACCCCAAG CTGACCGCTA GGAAAACTCA TTGATGTGAT TTATATCGTA CGATGAAAGA 2340 GAATAAAATG ATAGAAGAAC AAAGAAGAAC AAAGTAGAAG AACGTCTGAG AAGAAAGACA 2400 GGAAAATGAC ACGTACATAG TGTTCGATGA TGAATGATAT AATATTAAAT ATAAAATGAG 2460 GTAAACGTAT AGCATCACGG GATGAACGGA TGAACATGTA GTGGACAAGG TTGGGAAATA 2520 GGAATGTAGA ATCCAAGAAT CGTTGACTGA TGGACGGACG TATGTAAACA GGTACACCCC 2580 AAAGAAAAGA AAGAAAGAAA GAAAGAAAAC ACAAAGCCAA GGAAGTAAAG CAGATGGTCT 2640 TCTAAGAATA CGGCTTCAAA AAGACAGTGA ACACTCGTCG TCGAGGAATG ACAAGAAAAG 2700 TGAGAGACTA CGAAAGGAAG AAACCAAGAC GAAAAGAAGA ACGGAGATCG AACGGACAGA 2760 AATAAAG 2767 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) SEQ ID NO:5 號的訊息： ⑴序列特徵： (A) 長度：4092個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：雙股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型·· DNA (基因組的） (iii) 假說：無 (iv) 反-義：無 ， (vi)來源： (A)生物：法菲亞酵母 品系：ATCC96594 (ix)私徵： (A)名稱/關鍵：表現序列 位置：852...986 (ix) # 徵： (A)名稱/關键··插入序列 位置：987·.1173 (ix) # 徵： (A)名稱/關键：表現序列 位置：1174·.1317 (ix) # 徵： (A)名稱/關键··插入序列 位置：1308..1468 -66 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（64 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 稱置稱置稱置稱置稱置稱置稱置稱置稱置稱置稱置稱置稱置稱置明 ••名位··名位··名位··名位：名位：名位：名位：名位··名位：名位：名位：名位··名位：名位説 徵>}徵}}徵}}徵}}徵}}徵}}徵}}徵}}徵}}徵}}徵}}徵}}徵}}徵}}列 恃 A B恃 AB持 ΑΒίφΑ B;^AB^AB睜 AB淨 AB睜 AB泠 AB_ABjtAB 睁 AB涛 AB亭 /fv/ivd^— /—v/lvd^— /|\/|\4^— /ι\/ιν4^· /(ν/ι\Λ_τ /l\/lv^— /v/lv^i /I\/IV4n /—V/IV^T /l\/l\d^— /lv/l\ i/ ^\ xxxxxxxxxxxxxxci • 1 · 1 · 1 · 1 · 1 · 1 · 1 · 1 · 1 · 1 · 1 * 1 ♦ 1 · 1 ^ /IV rv /V κ^N /V /V ^(v rv
關鍵 1469.關鍵 1550.關鍵 1672.關鍵 1795.關鍵 1891.關鍵 1980.關鍵 2093.關鍵 2166.關鍵 2251.關鍵 2392.關鍵 2489.關鍵 2653.關键 2785. 關鍵 3024 :SEQ 表現序列 1549 插入序列 1671 表現序列 1794 插入序列 1890 表現序列 1979 插入序列 2092 表現序列 2165 插入序列 2250 表現序列 2391 插入序列 2488 表現序列 2652 插入序列 2784 表現序列 2902聚腺苷酸_位置 ID NO:5 號： CGCCCGGTAT CTTGCCACAG ATGCCGCCGG AGTGTCTGGC GGAGTGCTAG ATCTCCATCT GACGAGCAAG CGTACCACAA GCTAGCTCTT CGTCTGTCAG ACGCACCTTC CTGGCCTTCG GGGATGGCAC CTTCTCGTCG ACTTCCCATG -67-
GAACAAC AAGGACA GCCGTGC
GTC TCC 60 120 180 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（65 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 TGGCCTTGTG AAGATACTGT TTGCCAAGCT GAGCGCCTCC CCGCTGCTCC 'AGGTCCGCAA 240 GGTCCGAGAG TATTGGACGT CGAAGATATG TTCAAAGTGT CAGGCGAGTT 'CTCGGGAGAA 300 AAAAAAAGCG TGGGCTCTGA AACAGTGTGG AAATGTCTAC AAAGTGAGCT GGATTTATTG 360 TGTGTGTATG TGTGTGTGTG TGTATGTTCT GTGTTGGTTG CTCACTGTAC TCTATGCTCT 420 CTCTTAGATT TGGGGAACAG TGCTGTGAAC GCGTCGCGAA ACATGCTGCA CCTAGCCCTT 480 CACCAGAAGG AGAACCAGAG GGCGGGAATG CTGGTGTCTG ACGCTGCTAC TGCTGCTACG 540 CTAGCCGCTG AGGCTGAGGC TGGCAGAAAC TAAATCCATG ACCCATCAGA TCTTGGTGAT 600 TCGTGGTCTG AGGACACCCA AGTCCAAAAG GGCTATATAT CGACCATCAT CCGTTGCGGT 660 CACTCAGTAG TAACTAAAGC TATACATAGG AATGTTCTGA ACTTGATAAC CCTAACACTA 720 CGAAAATATC TCGGAAAATA GATTAATTTC CTTCTCATCT CAAACAAAAG ACACAACACC 780 ATCAATCACG CTCCTTTCAC ACACTCTCCT TTTTGCTCTC TCGTTCGACA GAAAATAACA 840 TCAATAGCCA AATGTCCACT ACGCCTGAAG AGAAGAAAGC AGCTCGAGCA AAGTTCGAGG 900 CTGTCTTCCC GGTCATTGCC GATGAGATTC TCGATTATAT GAAGGGTGAA GGCATGCCTG 960 CCGAGGCTTT GGAATGGATG AACAAGGTTC GTCAAGGGTT TCTTCTTTAT TCTTCTGGTC 1020 TTTGTTTCGG TCGAACTGGC TTTCGAACTT GGCCTTGACC GGTTGGATCT CGGTTGTTGC 1080 GCCAAAACGA TGTCGAAGCA AAACTTACTC TTACCTGTTC GGTTTCCTTC CTTCCGACCT 1140 TCTCTCTACC CTTGCCTCCG ATCGGTCTTA TAGAACTTGT ACTACAACAC TCCCGGAGGA 1200 AAACTCAACC GAGGACTTTC CGTGGTGGAT ACTTATATCC TTCTCTCGCC TTCTGGAAAA 1260 GACATCTCGG AAGAAGAGTA CTTGAAGGCC GCTATCCTCG GTTGGTGTAT CGAGCTTGTA 1320 CGCGTTTTCT TCATTCACCT TTCTTTCTCG TCTTCTACTC TCTTCTCTCG AACTATCTTC 1380 CCTGCGTGTC ATCCTACACG AATCTTTATA CTTACATGTT GGAACATATG CCCTGTTCTT 1440 AATTCACCTC TTTTGTCTCG GATGGTAGCT CCAAGCTTAC TTCTTGGTGG CTGATGATAT 1500 GATGGACGCC TCAATCACCC GACGAGGCCA ACCCTGTTGG TACAAAGTTG TTAGTCCUTT 1560 CTTCTCTTTC TGTCCTCTTT CTTCTGAGCT ATGCCAATTC TTGATTGAAA TCGGTGGTGC 1620 CGTCCGGACT AATCCGTTTG TCGTTTTTAT CATATCTTCT TGCACAAACA GGAGGGAGTG 1680 TCTAACATTG CCATCAACGA CGCGTTCATG CTCGAGGGAG CTATCTACTT TTTGCTCAAG 1740 AAGCACTTCC GAAAGCAGAG CTACTATGTC GATCTGCTAG AGCTCTTCCA CGATGTTTGT 1800 CTCTATTTCT TTTCTTCCTC CCCTCAATAA ACTGTATTTG TGACCATTCT GGATCCTTTC 1860 CTGACGATGA ATCATTCTTC GGATGAGTAG GTTACTTTCC AAACCGAGTT GGGACAGCTC 1920 ATCGATCTGT TGACCGCTCC TGAGGATCAC GTCGATCTCG ACAAGTTCTC CCTTAACAAG 1980 TATGCCCGTC ATATATTCGT TTTGTTGCAT TCACGTCTGA TTGTCAGCTC CGATTATTGA 2040 CTCTGATGGT GATGGTATTG ACCACATCAT GCGATGTTTG ACTTTCTCGT AGGCACCACC 2100 TCATCGTTGT TTACAAGACC GCTTTCTATT CATTCTACCT TCCTGTCGCA CTCGCTATGC 2160 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂----------線·(請先閱讀背面之注意事項再本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（66 ) GAATGGTGGG TCTCTCTCTT CAACTGTTCT TCCTGATTTT CTTGACCATC TGTAACATAA 2220 ATCCTTGGAA TTTTGAACTC TATGTCATAG GTCGGCGTGA CAGATGAGGA GGCGTACAAG 2280 CTTGCGCTCT CGATCCTCAT CCCGATGGGT GAATACTTTC AAGTTCAGGA TGATGTGCTC 2340 GACGCGTTCG CTCCTCCGGA GATCCTTGGA AAGATCGGAA CCGACATCTT GGTGCGTTTT 2400 CGTTCCTTCC TTCTACGTTC TGTTTTCTAT CTTCTGACTC CCCGTCCATC ATTTATGCTT 2460 CTGTTAAAAC GTATTGAAAC ATCAAAAGGA CAACAAATGT TCATGGCCTA TCAACCTTGC 2520 ACTCTCTCTC GCCTCGCCCG CTCAGCGAGA GATTCTCGAT ACTTCGTACG GTCAGAAGAA 2580 CTCGGAGGCA GAGGCCAGAG TCAAGGCTCT GTACGCTGAG CTTGATATCC AGGGAAAGTT 2 640. CAACGCTTAT GAGTATGTCA TCTTTTTTAA ATTTTCTAAT TTTCTTTTCA TCTCTTGTTC 2700 CCAAGAATTA TTTTGTGAAA GTTCTGGGAC TGAACATGGT GCATCCCTTT GGGTTCACTC 2760 CGCATATGTC TCCCGTTTGA ATAGGCAACA GAGTTACGAG TCGCTGAACA AGTTGATTGA 2820 CAGTATTGAC GAAGAGAAGA GTGGACTCAA GAAAGAAGTC TTCCACAGCT TCCTGGGTAA 2880 GGTCTATAAG CGAAGCAAGT AATTCTCCTC TTTATATGCA AAGGGAAGAT TTTGGCGGGA 2940 GTGATAGGTA GGAAGAGAAG GGAGGGTCAT ATTCATTAGG CATTTCTCTT GCAGATATAG 3000 ATGATCAAAA AGGGATATCG GTCCTCTTCT TTGTTCCGAA TACATAATAA GTCATACGAA 3060 GCCGAACATG ACAAAAGTGG TTCATGAGAT CAAACTTTTT GCATGATCTT CTGCGATTTT 3120 GTACAATTCT CTCGCATCCT ATTAGGATCG AACCAGGAGA AGATGAGAGA AGGAAACCCT 3180 CACCCCGTCA GATAACAAAC GAGAAGTCTC ATCACACACA CACACAGATG AAAGAGAAAA 3240 ATAAACTGAC GAGGATAACT TCCAATCCGA TTTTTCCAGC CCACGAACCT TCCTTGGTCC 3300 CCGCTCCGGT GCCTTCGAGT CCGATCAATG GGGCCCAAAC GCCTGAAGAT CCAAAGAACC 3360 CTTGTTGAGG TGTATTTCTC GTCTGAGCAA TCTTAGATCC TTCAATTTGC AGTCGCGCAT 3420 ATATACCATC AACATCATCG TCATCACCAT CATTGTCGTC CACAACAGCA CCGCAACGCC 3480 GTTAATGGCA GGGCTTGGAC AACTTGAGGC GGTTTCTAGC AGGTCGGACC GATTGGAGCT 3540 CGACCCAGGG TGCACATCAC CAAGACACAT TCTCCTTCAA ATGAGCGAAC AAGACATAAT 3600 GAGGGAAGTA GTACGCTATC GAACGTCTTC TCACATCCCG GGTTCTTGGC GTATCTTTTG 3660 GCGATTCTTT TTGTTGAAAT AGAAAATTGA AGAGAAAAAA AGAGATCCAC ATGATGAAGA 3720 ACGGCTCTGT AGATTCATGC TCGAAAGAAA GAAAGAAAGA AAAAGAGGGG AACGAACGGA 3780 TCTGAATCTG TGGCCAACCA AAAAGTAGGC ACAAAGATGA CAACAGCGCC CTCTTCGACA 3840 AGTCTTTGAA CTGCTTGTGG ATGAGACAAG TCCCAGCAGA TCAACATTCC TGCTTTACCC 3900 CATGGAGTAT CAAACACCTG AGAATAGGTC TTGCCCGGCT GTAGATAATC TCTGGACCGT 3960 CATATGCGCG AAACGATCAG TACGACCGAC TCTACTCGAA GTCGTCAAGA GCACGGACGA 4020 GAACGAAAAG AGGACAAACC GCTCTGGATG CCATAAATTT CTCTTCTCAT ACCTCTCCCA 4080 CCCACCCTCA GG 4092 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------—訂--*-------‘ (請先閱讀背面之注音？事項再本頁) — It- 1250210 A7 B7 五、發明說明（67 ) (2) SEQ ID N0:6 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：1091個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：蛋白質 (iii) 假説··無 (vi)來源： (A)生物：法菲亞酵母 品系·· ATCC96594 (xi)序列説明·· SEQ ID Ν(λ·6 號：
Met Tyr Thr lie Lys His Ser Asn Phe Leu Ser Gin Thr lie Ser Thr 15 10 15
Gin Ser Thr Thr Ser Trp Val Val Asp Ala Phe Phe Ser Leu Gly Ser 20 25 30
Arg Tyr Leu Asp Leu Ala Lys Gin Ala Asp Ser Ala Asp lie Phe Met 35 40 45
Val Leu Leu Gly Tyr Val Leu Met His Gly Thr Phe Val Arg Leu Phe 50 55 60
Leu Asn Phe Arg Arg Met Gly Ala Asn Phe Trp Leu Pro Gly Met Val 65 70 75 80
Leu Val Ser Ser Ser Phe Ala Phe Leu Thr Ala Leu Leu Ala Ala Ser 85 90 95 lie Leu Asn Val Pro lie Asp Pro lie Cys Leu Ser Glu Ala Leu Pro 100 105 110
Phe Leu Val Leu Thr Val Gly Phe Asp Lys Asp Phe Thr Leu Ala Lys 115 120 125
Ser Val Phe Ser Ser Pro Glu lie Ala Pro Val Met Leu Arg Arg Lys 130 135 140
Pro Val lie Gin Pro Gly Asp Asp Asp Asp Leu Glu Gin Asp Glu His 145 150 155 160
Ser Arg Val Ala Ala Asn Lys Val Asp lie Gin Trp Ala Pro Pro Val 165 170 175 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Ala Ala Ser Arg lie Val lie Gly Ser Val Glu Lys lie Gly Ser Ser 180 185 190
He Val Arg Asp Phe Ala Leu Glu Val Ala Val Leu Leu Leu Gly Ala 195 200 205
Ala Ser Gly Leu Gly Gly Leu Lys Glu Phe Cys Lys Leu Ala Ala Leu 210 215 220
He Leu Val Ala Asp Cys Cys Phe Thr Phe Thr Phe Tyr Val Ala He 225 230 235 240
Leu Thr Val Met Val Glu Val His Arg lie Lys lie lie Arg Gly Phe 245 250 255 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（68 )
Arg Pro Ala His Asn Asn Arg Thr Pro Asn Thr Val Pro Ser Thr Pro 260 265 270
Thr 工le Asp Gly Gin Ser Thr Asn Arg Ser Gly lie Ser Ser Gly Pro 275 280 285
Pro Ala Arg Pro Thr Val Pro Val Trp Lys Lys Val Trp Arg Lys Leu 290 295 300
Met Gly Pro Glu lie Asp Trp Ala Ser Glu Ala Glu Ala Arg Asn Pro 305 310 315 320
Val Pro Lys Leu Lys Leu Leu Leu lie Leu Ala Phe Leu lie Leu His 325 330 335 lie Leu Asn Leu Cys Thr Pro Leu Thr Glu Thr Thr Ala lie Lys Arg 340 345 350
Ser Ser Ser lie His Gin Pro lie Tyr Ala Asp Pro Ala His Pro lie 355 360 365
Ala Gin Thr Asn Thr Thr Leu His Arg Ala His Ser Leu Val lie Phe 370 375 380
Asp Gin Phe Leu Ser Asp Trp Thr Thr lie Val Gly Asp Pro lie Met 385 390 395 400
Ser Lys Trp lie lie lie Thr Leu Gly Val Ser lie Leu Leu Asn Gly 405 410 415
Phe Leu Leu Lys Gly He Ala Ser Gly Ser Ala Leu Gly Pro Gly Arg 420 425 430
Ala Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Leu Leu Gly Ala 435 440 445
Trp Glu lie Val Asp Trp Asn Asn Glu Thr Glu Thr Ser Thr Asn Thr 450 455 460
Pro Ala Gly Fro Pro Gly His Lys Asn Gin Asn Val Asn Leu Arg Leu 465 470 475 480
Ser Leu Glu Arg Asp Thr Gly Leu Leu Arg Tyr Gin Arg Glu Gin Ala 485 490 495
Tyr Gin Ala Gin Ser Gin lie Leu Ala Pro lie Ser Pro Val Ser Val 500 505 510 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Ala Pro Val Val Ser Asn Gly Asn Gly Asn Ala Ser Lys Ser lie Glu 515 520 525
Lys Pro Met Pro Arg Leu Val Val Pro Asn Gly Pro Arg Ser Leu Pro 530 535 540
Glu Ser Pro Pro Ser Thr Thr Glu Ser Thr Pro Val Asn Lys Val lie 545 550 555 560 lie Gly Gly Pro Ser Asp Arg Pro Ala Leu Asp Gly Leu Ala Asn Gly 565 570 575
Asn Gly Ala Val Pro Leu Asp Lys Gin Thr Val Leu Gly Met Arg Ser 580 585 590 lie Glu Glu Cys Glu Glu lie Met Lys Ser Gly Leu Gly Pro Tyr Ser 595 600 605 -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1250210 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（69 )
Leu Asn Asp Glu Glu Leu lie Leu Leu Thr Gin Lys Gly Lys lie Pro 610 615 620 Pro Tyr Ser Leu Glu Lys Ala Leu Gin Asn Cys Glu Arg Ala Val Lys 625 630 635 640 工le Arg Arg Ala Val lie Ser Arg Ala Ser Val Thr Lys Thr Leu Glu 645 650 655 Thr Ser Asp Leu Pro Met Lys Asp Tyr Asp Tyr Ser Lys Val Met Gly 660 665 670 Ala Cys Cys Glu Asn Val Val Gly Tyr Met Pro Leu Pro Val Gly lie 675 680 685 Ala Gly Pro Leu Asn lie Asp Gly Glu Val Val Pro 工le Pro Met Ala 690 695 700 Thr Thr Glu Gly Thr Leu Val Ala Ser Thr Ser Arg Gly Cys Lys Ala 705 710 715 720 Leu Asn Ala Gly Gly Gly Val Thr Thr Val lie Thr Gin Asp Ala Met 725 730 735 Thr Arg Gly Pro Val Val Asp Phe Pro Ser Val Ser Gin Ala Ala Gin 740 745 750 Ala Lys Arg Tirp Leu Asp Ser Val Glu Gly Met Glu Val Met Ala Ala 755 760 765 Ser Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gin Ser lie Lys Cys 770 775 780 Gly Met Ala Gly Arg Ser Leu Tyr lie Arg Leu Ala Thr Ser Thr Gly 785 790 795 800 Asp Ala Met Gly Met Asn Met Ala Gly Lys Gly Thr Glu Lys Ala Leu 805 810 815 Glu Thr Leu Ser Glu Tyr Phe Pro Ser Met Gin lie Leu Ala Leu Ser 820 825 830 Gly Asn Tyr Cys lie Asp Lys Lys Pro Ser Ala lie Asn Trp lie Glu 835 840 845 Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Ala Glu Ser Val lie Pro Gly Ala lie 850 855 860 Val Lys Ser Val Leu Lys Thr Thr Val Ala Asp Leu Val Asn Leu Asn 865 870 875 880 lie Lys Lys Asn Leu lie Gly Ser Ala Met Ala Gly Ser lie Gly Gly 885 890 895 Phe Asn Ala His Ala Ser Asp lie Leu Thr Ser lie Phe Leu Ala Thr 900 905 910 Gly Gin Asp Pro Ala Gin Asn Val Glu Ser Ser Met Cys Met Thr Leu 915 920 925 Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu Leu lie Thr Cys Ser Met 930 935 940 Pro Ala lie Glu Cys Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Phe Leu Pro Pro 945 950 955 960 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------—訂---------- (請先閱讀背面之注咅？事項再本頁) 太 1250210 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 i、發明說明（70 )
Gin Asn Ala Cys Leu Gin Met Leu Gly Val Ala Gly Ala His Pro Asp 965 970 975 Ser Pro Gly His Asn Ala Arg Arg Leu Ala Arg lie 工le Ala Ala Ser 980 985 990 Val Met Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser Ala Leu Ala Ala Gly His 995 1000 1005 Leu lie Lys Ala His Met Lys His Asn Arg Ser Thr Pro Ser Thr Pro 1010 1015 1020 Leu Pro Val Ser Pro Leu Ala Thr Arg Pro Asn Thr Pro Ser His Arg 1025 1030 1035 1040 Ser lie Gly Leu Leu Thr Pro Met Thr Ser Ser Ala Ser Val Ala Ser 1045 1050 1055 Het Phe Ser Gly Phe Gly Ser Pro Ser Thr Ser Ser Leu Lys Thr Val 1060 1065 1070 Gly Ser Met Ala Cys Val Arg Glu Arg Gly Asp Glu Thr Ser Val Asn 1075 1080 1085 Val Asp Ala 1090 (2) SEQ ID ΝΟ··7號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：467個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：蛋白質 (iii) 假説··無 (vi)來源： (A) 生物：法菲亞酵母 (B) 品系：ATCC96594 (XI)序列説明：SEQ ID N0:7 號··
Met Tyr Thr Ser Thr Thr Glu Gin Arg Pro Lys Asp Val Gly lie Leu 1 5 10 15 Gly Met Glu lie Tyr Phe Pro Arg Arg Ala lie Ala His Lys Asp Leu 20 25 30 Glu Ala Phe Asp Gly Val Pro Ser Gly Lys Tyr Thr lie Gly Leu Gly 35 40 45 Asn Asn Phe Met; Ala Phe Thr Asp Asp Thr Glu Asp lie Asn Ser Phe 50 55 60 Ala Leu Asn Ala Val Ser Gly Leu Leu Ser Lys Tyr Asn Val Asp Pro 65 70 75 80 Lys Ser lie Gly Arg lie Asp Val Gly Thr Glu Ser lie 工le Asp Lys 85 90 95 Ser Lys Ser Val Lys Thr Val Leu Met Asp Leu Phe Glu Ser His Gly 100 105 110 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
訂· _ 1250210 A7 _______ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（71‘）
Asn Thr Asp lie Glu Gly lie Asp Ser Lys Asn Ala Cys Tyr Gly Ser 115 120 125 Thr Ala Ala Leu Phe Asn Ala Val Asn Trp lie Glu Ser Ser Ser Trp 130 135 140 Asp Gly Arg Asn Ala lie Val Phe Cys Gly Asp lie Ala lie Tyr Ala 145 150 155 160 Giu Gly Ala Ala Arg Pro Ala Gly Gly Ala Gly Ala Cys Ala lie Leu 165 170 175 lie Gly Pro Asp Ala Pro Val Val Phe Glu Pro Val His Gly Asn Phe 180 185 190 Met Thr Asn Ala Trp Asp Phe Tyr Lys Pro Asn Leu Ser Ser Glu Tyr 195 200 205 Pro lie Val Asp Gly Pro Leu Ser Val Thr Ser Tyr Val Asn Ala lie 210 215 220 Asp Lys Ala Tyr Glu Ala Tyr Arg Thr Lys Tyr Ala Lys Arg Phe Gly 225 230 235 240 Gly Pro Lys Thr Asn Gly Val Thr Asn Gly His Thr Glu Val Ala Gly 245 250 255 Val Ser Ala Ala Ser Phe Asp Tyr Leu Leu Phe His Ser Pro Tyr Gly 260 265 270 Lys Gin Val Val Lys Gly His Gly Arg Leu Leu Tyr Asn Asp Phe Arg 275 280 285 Asn Asn Pro Asn Asp Pro Val Phe Ala Glu Val Pro Ala Glu Leu Ala 290 295 300 Thr Leu Asp Met Lys Lys Ser Leu Ser Asp Lys Asn Val Glu Lys Ser 305 310 315 320 Leu lie Ala Ala Ser Lys Ser Ser Phe Asn Lys Gin Val Glu Pro Gly 325 330 335 Met Thr Thr Val Arg Gli> Leu Gly Asn Leu Tyr Thr Ala Ser Leu Phe 340 345 350 Gly Ala Leu Ala Ser Leu Phe Ser Asn Val Pro Gly Asp Glu Leu Val 355 360 365 Gly Lys Arg lie Ala Leu Tyr Ala Tyr Gly Ser Gly Ala Ala Ala Ser 370 375 380 Phe Tyr Ala Leu Lys Val Lys Ser Ser Thr Ala Phe lie Ser Glu Lys 385 390 395 400 Leu Asp Leu Asn Asn Arg Leu Ser Asn Met Lys lie Val Pro Cys Asp 405 410 415 Asp Phe Val Lys Ala Leu Lys Val Arg Glu Glu Thr His Asn Ala Val 420 425 430 Ser Tyr Ser Pro lie Gly Ser Leu Asp Asp Leu Trp Pro Gly Ser Tyr 435 440 445 Tyr Leu Gly Glu lie Asp Ser Met Trp Arg Arg Gin Tyr Lys Gin Val 450 455 460 -74 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂----------線l(請先閱讀背面之注音？事項再本頁) I 太 A7 B7 1250210 五、發明說明（72
Pro Ser Ala 465 (2) SEQ ID NO:8 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度·· 432個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：蛋白質 法菲亞酵母 ATCC96594 SEQ ID ΝΟ··8 號 (iii) 假説：無 (vi)來源： (A) 生物 (B) 品系 (xi)序列説明
Lys Glu Glu lie Leu Val Ser Ala Pro Gly Lys Val lie Leu Phe Gly 1 5 10 15 Glu His Ala Val Gly His Gly Val Thr Gly lie Ala Ala Ser Val Asp 20 25 30 Leu Arg Cys Tyr Ala Leu Leu Ser Pro Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ser 35 40 45 Ser Ser Leu Ser Ser Thr Asn lie Thr lie Ser Leu Thr Asp Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Gin Ser Trp Pro Val Asp Ser Leu Pro Trp Ser Leu Ala Pro 65 70 75 80 Asp Trp Thr Glu Ala Ser lie Pro Glu Ser Leu Cys Pro Thr Leu Leu 85 90 95 Ala Glu lie Glu Arg lie Ala Gly Gin Gly Gly Asn Gly Gly Glu Arg 100 105
Glu Lys Val Ala Thr Met -Ala Phe Leu 115 120 110 Leu Leu Val Leu Leu Ser 125 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Lys Gly Lys Pro Ser Glu Pro Phe Glu Leu Thr Ala Arg Ser Ala Leu 130 135 140
Pro Met Gly Ala Gly Leu Gly Ser Ser Ala Ala Leu Ser Thr Ser Leu 145 150 155 160
Ala Leu Val Phe Leu Leu His Phe Ser His Leu Ser Pro Thr Thr Thr 165 170 175
Gly Arg Glu Ser Thr lie Pro Thr Ala Asp Thr Glu Val 工le Asp Lys 180 185 190
Trp Ala Phe Leu Ala Glu Lys Val lie His Gly Asn Pro Ser Gly lie 195 200 205
Asp Asn Ala Val Ser Thr Arg Gly Gly Ala Val Ala Phe Lys Arg Lys 210 215 220
He Glu Gly Lys Gin Glu Gly Gly Met Glu Ala He Lys Ser Phe Thr 225 230 235 240 75- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐 1250210 A7
五、發明說明（73 ’)
Ser lie Arg Phe Leu lie Thr Asp Ser Arg 工le Gly Arg Asp Thr Arg 245 250 255 Ser Leu Val Ala Gly Val Asn Ala Arg Leu lie Gin Glu Pro Glu Val 260 265 270 工le Val Pro Leu Leu Glu Ala lie Gin Gin lie Ala Asp Glu Ala lie 275 280 285 Arg Cys Leu Lys Asp Ser Glu Met Glu Arg Ala Val Met lie Asp Arg 290 295 300 Leu Gin Asn Leu Val Ser Glu Asn His Ala His Leu Ala Ala Leu Gly 305 310 315 320 Val Ser His Pro Ser Leu Glu Glu lie lie Arg lie Gly Ala Asd Lys 325 330 335 Pro Phe Glu Leu Arg Thr Lys Leu Thr Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys 340 345 350 Ala Val Thr Leu Val Pro Asp Asp Phe Ser Thr Glu Thr Leu Gin Ala 355 360 365 Leu Met Glu Thr Leu Val Gin Ser Ser Phe Ala Pro Tyr lie Ala Arg 370 375 380 Val Gly Gly Ser Gly Val Gly Phe Leu Ser Ser Thr Lys Ala Asp Pro 385 390 395 400 Glu Asp Gly Glu Asn Arg Leu Lys Asp Gly Leu Val Gly Thr Glu lie 405 410 415 Asp Glu Leu Asp Arg Trp Ala Leu Lys Thr Gly Arg Trp Ser Phe Ala 420 425 430 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) SEQIDNO:9號的訊息： (i) 序列特徵·· (A) 長度·· 401個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓樸學·…直線狀 (ii) 分子類型：蛋白質 (iii) 假説：無 (vi)來源： (A)生物：法菲亞酵母 (B5 品系：ATCC96594 (xi)序列説明：SEQ ID NO:9號：
Met Val His lie Ala Thr Ala Ser Ala Pro Val Asn lie Ala Cys lie 15 10 15 Lys Tyr Trp Gly Lys Arg Asp Thr Lys Leu 工le Leu Pro Thr Asn Ser 20 25 30 Ser Leu Ser Val Thr Leu Asp Gin Asp His Leu Arg Ser Thr Thr Ser 35 40 45 Ser Ala Cys Asp Ala Ser Phe Glu Lys Asp Arg Leu Trp Leu Asn Gly 50 55 60 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）
1250210 A7 B7 五、發明說明（74 ) lie Glu Glu Glu Val Lys Ala Gly Gly Arg Leu Asp Val Cys lie Lys 65 70 75 80
Glu Met Lys Lys Leu Arg Ala Gin Glu Glu Glu Lys Asp Ala Gly Leu 85 90 95
Glu Lys Leu Ser Ser Phe Asn Val His Leu Ala Ser Tyr Asn Asn Phe 100 105 110
Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ala Ser Gly Leu Ala Ala Leu 115 120 125
Val Ala Ser Leu Ala Ser Leu Tyr Asn Leu Pro Thr Asn Ala Ser Glu 130 135 140
Leu Ser Leu lie Ala Arg Gin Gly Ser Gly Ser Ala Cys Arg Ser Leu 145 150 155 160
Phe Gly Gly Phe Val Ala Trp Glu Gin Gly Lys Leu Ser Ser Gly Thr 165 170 175
Asp Ser Phe Ala Val Gin Val Glu Pro Arg Glu His Trp Pro Ser Leu 180 185 190
His Ala Leu lie Cys Val Val Ser Asp Glu Lys Lys Thr Thr Ala Ser 195 200 205
Thr Ala Gly Met Gin Thr Thr Val Asn Thr Ser Pro Leu Leu Gin His 210 215 220
Arg lie Glu His Val Val Pro Ala Arg Met Glu Ala lie Thr Gin Ala 225 230 235 240 工le Arg Ala Lys Asp Phe Asp Ser Phe Ala Lys lie Thr Met Lys Asp 245 250 255
Ser Asn Gin Phe His Ala Val Cys Leu Asp Ser Glu Pro Pro lie Phe 260 265 270
Tyr Leu Asn Asp Val Ser Arg Ser lie lie His Leu Val Thr Glu Leu 275 280 285
Asn Arg Val Ser Val Gin Ala Gly Gly Pro Val Leu Ala Ala Tyr Thr 290 295 300
Phe Asp Ala Gly Pro Asn Ala Val lie Tyr Ala Glu Glu Ser Ser Met 305 310 315 320 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Pro Glu lie lie Arg Leu lie Glu Arg Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Ala 325 330 335
Phe Glu Asn Pro Phe Gly Val Asn Thr Glu Gly Gly Asp Ala Leu Arg 340 345 350
Glu Gly Phe Asn Gin Asn Val Ala Pro Val Phe Arg Lys Gly Ser Val 355 360 365
Ala Arg Leu lie His Thr Arg lie Gly Asp Gly Pro Arg Thr Tyr Gly 370 375 380
Glu Glu Glu Ser Leu lie Gly Glu Asp Gly Leu Pro Lys Val Val Lys 385 390 395 400
Ala -77- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（75 ) (2) SEQ ID NO: 1 0 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：355個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：蛋白質 (iii) 假説··無 (vi)來源： (A) 生物：法菲亞酵母 (B) 品系：ATCC96594 (xi)序列説明：SEQ ID NO:10 號：
Met Ser Thr Thr Pro Glu Glu Lys Lys Ala Ala Arg Ala Lys Phe GIu 1 5 10 15
Ala Val Phe Pro Val lie Ala Asp Glu lie Leu Asp Tyr Met Lys Gly 20 25 30
Glu Gly Met Pro Ala Glu Ala Leu Glu Trp Met Asn Lys Asn Leu Tyr 35 40 45
Tyr Asn Thr* Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp 50 55 60
Thr Tyr lie Leu Leu Ser Pro Ser Gly Lys Asp lie Ser Glu Glu Glu 65 70 75 80
Tyr Leu Lys Ala Ala lie Leu Gly Trp Cys lie Glu Leu Leu Gin Ala 85 90 95
Tyr Phe Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Ala Ser 工le Thr Arg Arg 100 105 110
Gly Gin Pro Cys Trp Tyr Lys Val Glu Gly Val Ser Asn lie Ala lie 115 120 125
Asn Asn Ala Phe Met Leu Glu Gly Ala lie Tyr Phe Leu Leu Lys Lys 130 ‘135 140
His Phe Arg Dys Gin Ser Tyr Tyr Val Asp Leu Leu Glu Leu Phe His 145 150 155 160
Asp Val Thr* Phe Gin Thr Glu Leu Gly Gin Leu lie Asp Leu Leu Thr 165 170 175 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Ala Pro Glu Asp His Val Asp Leu Asp Lys Phe Ser Leu Asn Lys His 180 185 190
His Leu lie Val Val Tyr Lys Thr Ala Phe Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro 195 200 205
Val Ala Leu Ala Met Arg Met Val Gly Val Thr Asp Glu Glu Ala Tyr 210 215 220
Lys Leu Ala Leu Ser lie Leu lie Pro Met Gly Glu Tyr Phe Gin Val 225 230 235 240
Gin Asp Asp Val Leu Asp Ala Phe Arg Pro Pro Glu lie Leu Gly Lys 245 250 255 -78- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1250210 B7_ 五、發明說明（76 ) 工le Gly Thr Asp lie Leu Asp Asn Lys Cys Ser Trp Pro lie Asn Leu 260 265 270
Ala Leu Ser Pro Ala Ser Pro Ala Gin Arg Glu lie Leu Asp Thr Ser 275 280 285
Tyr Gly Gin Lys Asn Ser Glu Ala Glu Ala Arg Val Lys Ala Leu Tyr 290 295 300
Ala Glu Leu Asp lie Gin Gly Lys Phe Asn Ala Tyr Glu Gin Gin Ser 305 310 315 320
Tyr Glu Ser Leu Asn Lys Leu lie Asp Ser lie Asp Glu Glu Lys Ser 325 330 335
Gly Leu Lys Lys Glu Val Phe His Ser Phe Leu Gly Lys Va.l Tyr Lys 340 345 350
Arg Ser Lys 355 (2) SEQ ID NO: 11 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 6個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型··單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO: 11 號： GGNAARTAYA CNATHGGNYT NGGNCA 26 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) SEQ ID NO: 12號的訊息： (i)序列特徵： (A) 長度：2 6個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 -79- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（77 ) (D)拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO: 12 號： TANARNSWNS WNGTRTACAT RTTNCC 26 (2) SEQ ID NO: 13 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 4個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:13 號： GAAGAACCCC ATCAAAAGCC TCGA 24 (2) SEQ ID NO:14 號的訊息： (i) 序列特徵： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (A) 長度：2 5個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型··單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） -80- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（78 ) (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:14 號： AAAAGCCTCG AGATCCTTGT GAGCG 25 (2) SEQ ID NO: 15號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：1 8個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:15 號： AGAAGCCAGA AGAGAAAA 18 (2) SEQ ID NO:16 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：1 8個驗基對 (B) 類型：核酸 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學··直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（79 ) 〇d)序列説明：SEQ ID N0:16號： TCGTCGAGGA AAGTAGAT 18 (2) SEQ ID NO: 17 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：3 0個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:17 號： GGTACCATAT GTATCCTTCT ACTACCGAAC 30 (2) SEQ ID NO: 18 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：3 0個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:18 號： GCATGCGGAT CCTCAAGCAG AAGGGACCTG 30 -82- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 _B7五、發明說明（8〇 ) (2) SEQ ID NO: 19號的訊息： (i)序列特徵： (A) 長度： 3 2個鹼基對 請 先 閱 (B) 類型： 核酸 讀 背 (C) 股型： 單股 之 注 (D) 拓樸學 :直線狀 意 事 (ϋ) 分子類型： DNA (基因組的） 項 再 (iii) 假説：無 身丨 本 (iv) 反- 義：無 ’卞 頁 (xi) 序列説明： SEQ ID NO:19 號： 32 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GCNTGYTGYG ARAAYGTNAT HGGNTAYATG CC (2) SEQ ID NO:20 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：3 2個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID ΝΟ··20 號： ATCCARTTDA TNGCNGCNGG YTTYTTRTCN GT (2) SEQIDNO:21 號的訊息：(i)序列特徵： 32 訂 線 -83 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（81 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (A) 長度：2 5個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:21號 GGCCATTCCA CACTTGATGC TCTGC (2) SEQ ID NO: 22號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 1個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:22號 GGCCGATATC TTTATGGTCC T (2) SEQ ID NO:23 號的訊息： (i)序列特徵： (A) 長度：2 6個鹼基對 (B) 類型：核酸 25 21 -----V--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I訂---------線‘ -84- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 B7 五、發明說明（82 ) (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:23 號： GGTACCGAAG AAATTATGAA GAGTGG (2) SEQ ID NO:24 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 6個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:24 號： CTGCAGTCAG GCATCCACGT TCACAC (2) SEQ ID NO:25 號的訊息： (i)序列特徵： (A) 長度：2 9個驗基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 85 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）
1250210 A7 B7 五、發明說明（83 ) (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:25 號： GCNCCNGGNA ARGTNATHYT NTTYGGNGA 29 (2) SEQ ID NO:26 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 9個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:26 號： CCCCANGTNS WNACNGCRTT RTCNACNCC 29 (2) SEQ ID NO:27 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：1 7個鹼基對 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 -86- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（84 ) (iv)反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:27 號： ACATGCTGTA GTCCATG 17 (2) SEQ ID NO:28 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：1 6個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:28 號： ACTCGGATTC CATGGA 16 (2) SEQ ID NO:29號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 5個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説··無 (vi)來源： (A)生物：法菲亞酵母 -87- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（85 ) (B)品系：ATCC 96594 (xi)序列説明：SEQ ID NO:29 號： TTGTTGTCGT AGCAGTGGGT GAGAG 25 (2) SEQ ID NO:30 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：1 8個驗基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:30 號： GGAAGAGGAA GAGAAAAG 18 (2) SEQIDNO:31 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：1 8個驗基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:31 號： -88- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（86 ) TTGCCGAACT CAATGTAG 18 (2) SEQ ID NO:32 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 6個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (vi)來源： (A) 生物：法菲亞酵母 (B) 品系：ATCC 96594 (xi)序列説明：SEQ ID NO:32 號： GGATCCATGA GAGCCCAAAA AGAAGA 26 (2) SEQ ID NO:33 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 6個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (vi)來源： (A)生物：法菲亞酵母 -89- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（87 ) (B)品系：ATCC 96594 (xi)序列説明：SEQ ID NO:33 號： GTCGACTCAA GCAAAAGACC AACGAC 26 (2) SEQ ID NO:34 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 3個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的）
Ciii)假説：無 (iv)反-義··無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:34 號： HTNAARTAYT TGGGNAARMG NGA 23 (2) SEQ ID NO:35 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 9個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:35 號： -90- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（88 ) GCRTTNGGNC CNGCRTCRAA NGTRTANGC 29 (2) SEQ ID NO:36 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 0個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學··直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:36 號： CCGAACTCTC GCTCATCGCC 20 (2) SEQ ID NO:37 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 0個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説··無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:37 號： CAGATCAGCG CGTGGAGTGA 20 (2) SEQ ID NO:38 號的訊息： -91 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -ϋ I— n I ϋ -1 ϋ -ϋ ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
--------訂---------線I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250210 A7 B7 五、發明說明（89 ) (i) 序列特徵： (A) 長度：2 6個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 26 (xi)序列説明：SEQ ID NO:38 號： CARGCNTAYT TYYTNGTNGC NGAYGA (2) SEQ ID NO:39 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：3 2個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 32 (xi)序列説明：SEQ ID NO:39 號： CAYTTRTTRT CYTGDATRTC NGTNCCDATY TT (2) SEQ ID NO:40 號的訊息： (i)序列特徵： (A)長度：2 5個鹼基對 -92 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（90 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:40 號： ATCCTCATCC CGATGGGTGA ATACT (2) SEQIDN0:41 號的訊息：(i) 序列特徵： (A) 長度：2 5個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID N0:41 號： AGGAGCGGTC AACAGATCGA TGAGC (2) SEQ ID NO:42 號的訊息：(i)序列特徵： (A) 長度：2 5個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 25 25 -93 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 A7 B7 五、發明說明（91 ) (D)拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:42 號： GAATTCATAT GTCCACTACG CCTGA 25 (2) SEQ ID NO:43 號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 5個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA (基因組的） (iii) 假説：無 (iv) 反-義：無 (xi)序列説明：SEQ ID NO:43 號： GTCGACGGTA CCTATCACTC CCGCC 25 ---- — 11 — — — — — — - — — — — I — I ^ "If — — — — — — j (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -94- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250210 申請曰期 en、巧 案 號 088106757 類 別 (以上各欄由本局填註） A4 C4 中文說明書替換頁(93年η月） 4 4 ^ 明 1 --—-— 1塑專利説明書 -、$1名稱 中 文 編碼涉及甲趙戊酸路徑或從異戊烯基焦磷酸至焦磷酸法呢 酯之反應路徑的酵素之分離之DNA序列 英 文 恐=二 WAY PYR0PH0SPHATE T〇 farnesyl 姓 名 國 1. 星野達夫 2. 尾島和幸 3. 瀨戶口豐 均曰本 參 發明 住、居所 1·曰本國神奈川縣鐮倉市笛田808-47 2.日本國神奈川縣藤澤市善行團地3-22-304 3·日本國神奈川縣藤澤市片瀨山孓27_2 黍 姓 名 (名稱） 國 三、申請人 住、居所 (事務所) 代表人 姓 名 荷蘭商DSM智財資產公司 荷蘭 荷蘭提希蘭市海特奥芙倫路1號 J丹哈托
B7 12502J仏1〇6757號專利申請案 中文說明書替換頁(91年12月） 五、發明説明（ ）
玎
pFPS 113的0.6 kb片段作為探針，篩選大約10000個溶菌 斑。8個溶菌斑與經過標示之探針雜交。然後根據製造者 (Promega )指定的方法製備嗤菌體溶胞產物。使所有的溶 菌斑接受溶菌斑PCR，使用Fps27和Fps28引子。藉著在 PCR反應之前，在99°C下加熱2微升噬菌體顆粒的溶液5分 鐘，來製備溶菌斑PCR的模板DNA。PCR條件與前文 pFPS 113選殖的條件相同。所有的溶菌斑均得到2 kb的陽 性PCR帶，而這暗示這些純種系均具有含有fps基因的完 整區域。以EcoRI消化一個藏匿有fps基因的；I DNA，分離 出10 kb的EcoRI片段，並在以EcoRI-消化並以CIAP-處理 過的pBluescriptll KS- (Stratagene)中選殖。從經過轉形的 大腸样菌DH5a細胞中選出1 2個白色的菌落，從這些純 種系中製備質體，並使其接受菌落PCR，使用相同的 Fps27和Fps28引子組，以及相同的PCR條件。從1 2個候選 者中的3個中，產生2個陽性帶。選殖一個純種系，並命 名為pFPS603。證實先前從pFPSSTull7和pFPSSTdll7中決 定的fps基因之序列幾乎是正確的，雖然它們具有一些 PCR錯誤。最後，定出含有得自法菲亞酵母之fps基因的 4092個鹼基對之核甞酸序列（SEQ ID NO·· 5號），並發 現ORF，其包括365個胺基酸並帶有8個插入序列（SEQ I D Ν Ο : 5號）。推衍的胺基酸序列（S E Q I D Ν Ο : 1 0號） 顯示與已知的FPP合成酶有廣泛的同種性（與得自乳酸克 魯維酵母（Kluyveromyces lactis)之FPP合成酶有65%的同 一性）。 -49 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

Claims (1)

  1. J250STO06757號專利申請案 詰識獻： . 中文申請專利範圍替換本(94年1〇月） C8 ; 丨丨丨丨丨IM " ' D8 .- … …^ j 六、申請專利範圍 1· 一種分離的DNA序列，其編碼涉及甲羥戊酸路徑，或從 異戊烯基焦磷酸至焦磷酸法呢酯之路徑的酵素，其係選 自包括 (i)序列編號SEQ ID NOs:l，2,3,4 及 5 (")SEQ ID NOs: 1、2、3、4或5所示之DNA序列的同 類編碼或對偶基因變體； (iii)SEQIDNOs: 1、2、3、4或5 所示之 DNA 序列，具 有一或多個核茹酸之加成、插入、刪除及/或取 代’並編碼具有該酵素活性之多肽的衍生物。 (i v )在嚴苛條件下，如在6 X S S C，6 5 °C下，與SEQ ID NOs: 1-5號所示之序列雜交的DNA序列，或其互補 股或其片段；以及 (v)因為遺傳密碼子的簡併，不像在（iv)中定義地雜交 的DNA序列，但其編碼的多肽，具有與SEQ ID NOs: 6-10號所示者或是由（iv)中定義的DNA序列 所編碼者精確相同的胺基酸序列。 2. 根據申請專利範圍第1項之分離的〇ΝΑ序列，其中該酵 素具有選自包括3-羥基_3·甲基戊二醯基_CoA合成酶活 性、3_羥基-3-甲基戊二醯基-CoA還原酶活性、甲羥戊酸 激酶活性、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶活性和焦磷酸法呢酯 合成酶活性的活性。 3. 根據申請專利範圍第1或2項之分離的DNA序列，其特徵 在於 (a)該DNA序列編碼的酵素，具有選自包括在SEQ ID O:\57\57960-941011 .DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1250210 S C8 ____ D8 六、申請專利範圍 NOs: 6、7、8、9和1 0號中描述的那些胺基酸序列，或 (b)該DNA序列編碼該酵素的變體，其選自⑴對偶基因 變體，和（ii)具有一或多個胺基酸加成、插入、刪除及/ 或取代，並具有所列舉之酵素活性的酵素。 4·根據申請專利範圍第1項之分離的DNA序列，其可衍生 自法菲亞酵母（Phaffia rhodozyma )之基因，並選自： (i) SEQ ID NOs: 1、2、4 或 5 所示之 DNA 序列； (ii) SEQ ID NOs: 1、2、4或5所示之DNA序列的同類編 碼或對偶基因變體；以及 (iii) SEQ ID NOs: 1、2、4 或 5 所示之 DNA 序歹1J，具有一 或多個核甞酸之加成、插入、刪徐及/或取代，並編碼 具有該酵素活性之多肽的衍生物。 5· —種分離的DNA序列，其係選自： (i) SEQ ID NO: 3 所示之 DNA 序歹|J ; (ii) SEQ ID NO: 3所示之DNA序列的同類編碼或對偶基 因變體；以及 (iii) SEQ ID NO·· 3所示之DNA序列，具有一或多個核苷 酸之加成、插入.、刪除及/或取代，並編碼具有甲羥戊 酸激酶活性之多肽的衍生物。 6·根據申請專利範圍第1項之分離的〇ΝΑ序列，其係選 自： ⑴在嚴苛條件下，如在6XSSC，65 °C下，與SEQ ID N〇s: 1·5號所示之序列雜交的DNA序列，或其互補股或 其片段；以及 O:\57\57960-941011.DOC 〇 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(2ι〇χ 2町公釐) 1250210 έ88 C8 ____£8_ 六、申請專利範圍 (11)因為遣傳密碼子的簡併，不像在（i)中定義地雜交的 DNA序列，但其編碼的多肽，具有與SEq id NOs: 6-10 號所示者或是由（i)中定義的DNA序列所編碼者精確相 同的胺基酸序列。 7· —種產製涉及甲羥戊酸路徑，或從異戊婦基焦磷酸至焦 磷酸法呢酯之路徑的酵素的方法，其包括在適合該酵素 產製的條件下，以根據申請專利範圍第1項之DN a序列 轉殖至一宿主細胞，於如異丙基β _ D _硫代半乳糖吡喃糖 甞之謗發劑存在下培養細胞，並視情況回收所產生之酵 素。 8. —種產製涉及甲羥戊酸路徑，或從異戊埽基焦嶙酸至焦 磷酸法呢酯之路徑的中間物的方法，其包括在適人，中 間物產製的條件下，以根據申請專利範圍第丨項之d N A 序列轉殖至一宿主細胞，於如異丙基β _ D _硫代半乳粹峨 喃糖茹之謗發劑存在下培養細胞，並視情況回收所^生 之中間物。 -3- O:\57\57960-941011.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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