KR101204225B1 - 스쿠알렌 신타제 8ｓｑｓ9 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카로티노이드의 미생물학적 생산성을 증가시키는 과정에 유용한 유전자에 관한 것이다. 카로티노이드 아스타크산틴은 동물, 조류 및 미생물과 같은 다양한 유기체 내에 분포되어 있다. 이는 반응성 산소 종에 대해 강한 산화방지 특성을 갖는다. 아스타크산틴은 착색 시약으로서 특히 양식 어류(예: 연어) 산업에 사용되는데, 이는 아스타크산틴이 동물을 특유한 오렌지-적색으로 착색시켜 시장에서 소비자에게 호감을 주기 때문이다.

Description

스쿠알렌 신타제 8ＳＱＳ9 유전자{SQUALENE SYNTHASE 8SQS9 GENE}

본 발명은 카로티노이드의 미생물학적 생산성을 증가시키는 과정에 유용한 유전자에 관한 것이다.

카로티노이드 아스타크산틴(astaxanthin)은 동물, 조류 및 미생물과 같은 다양한 유기체에 분포되어 있다. 이는 반응성 산소 종에 대해 강한 산화방지 특성을 갖는다. 아스타크산틴은 착색 시약으로서 특히 양식 어류(예: 연어) 산업에 사용되는데, 이는 아스타크산틴이 동물을 특유한 오렌지-적색으로 착색시켜 시장에서 소비자에게 호감을 주기 때문이다.

예컨대, 일반 대사물인 아세틸-CoA로부터 출발하는 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma)의 카로틴-생성 경로에서의 여러 단계들 중 하나는, 아이소펜테닐 피로포스페이트(IPP) 이성질화효소의 작용에 의한 IPP에서 다이메틸아릴 피로포스페이트(DMAPP)로의 이성질화이다. 그 다음, IPP 및 DMAPP는 수미식(head to tail) 축합 반응에 의해 C₁₀ 단위의 게라닐 피로포스페이트(GPP)로 전환된다.

GPP와 IPP 사이의 유사한 축합 반응에서, GPP는, 동물의 콜레스테롤과 효모의 에르고스테롤의 중요한 기질이고 조절 단백질(예: RAS 단백질)의 파르네실화(farnesylation)의 중요한 기질인 C₁₅ 단위의 파르네실 피로포스페이트(FPP)로 전환된다. 일반적으로, IPP 및 DMAPP로부터의 GPP 및 FPP의 생합성은 FPP 신타제로 일컫는 하나의 효소에 의해서 촉진된다. 반면, 진정세균(eubacteria)과 같은 원핵생물에서, 아이소펜테닐 피로포스페이트는 효모 및 동물에서는 없는 피루베이트로부터 1-데옥시자이룰로스-5-포스페이트를 거치는 다른 경로에 의해 합성되었다. 메발로네이트 경로와 관련되는 대부분의 유전자는 파피아 로도지마로부터 클로닝되었다(EP 955,363 호).

한 양태에서, 본 발명은 효소 스쿠알렌 신타제(squalene synthase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 신규한 DNA 단편을 제공한다.

더욱 특히는, 본 발명은 스쿠알렌 신타제 유전자의 개방 판독 프레임뿐만 아니라 조절 영역(예: 프로모터 및 종결자(terminator))을 함유하는 DNA를 제공한다.

본 발명은 파피아 로도지마에서 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 DNA 단편을 제공한다. 상기 DNA는 5'-비번역 영역 및 3'-비번역 영역 내의 짧은 단편들 사이의 측면에 위치하는 개방 판독 프레임만을 포함하는 cDNA, 및 파피아 로도지마에서 스쿠알렌 신타제 유전자의 발현에 필요한 조절 서열(예: 프로모터 및 종결자)을 추가로 포함하는 게놈 DNA를 의미한다.

따라서, 본 발명은 하기 핵산 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분 자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

(a) 적어도, 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드의 성숙한 형태를 코딩하는 핵산 분자;

(b) 서열번호 2로 표시되는 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자;

(c) 유전자 코드의 결과로서 뉴클레오타이드 서열이 상기 (a) 또는 (b)의 뉴클레오타이드 서열로 변성된 핵산 분자;

(d) 상기 (a) 내지 (c)의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 한 개 또는 수 개의 아미노산의 치환, 삭제 및/또는 첨가에 의해, 상기 (a) 내지 (c)의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드로부터 유도된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자;

(e) 상기 (a) 또는 (b)의 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 51.3% 이상 동일한 서열을 갖는 폴리펩타이드로부터 유도된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자;

(f) 상기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 에피토프(epitope)-함유 부분 또는 단편을 포함하고 스쿠알렌 신타제 활성을 갖는 핵산 분자;

(g) 서열번호 4, 5 및 6으로 표시되는 프라이머를 사용하여 파피아(Phaffia) 또는 크산토필로마이세스(Xanthophyllomyces) 핵산 라이브러리(library)로부터 증폭된 핵산 분자의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자;

(h) 상기 (a) 내지 (g) 중 어느 하나의 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 단편이며 스쿠알렌 신타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자;

(i) 상기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드 중 15개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자;

(j) 상기 (a) 내지 (h) 중 어느 하나의 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩타이드에 대해 증가하는 항체에 의해 인식되며 스쿠알렌 신타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자;

(k) 엄격한 조건 하에서, 상기 (a) 내지 (j) 중 어느 하나의 핵산 분자의 서열을 갖고 스쿠알렌 신타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 프로브(probe)를 사용하여 적절한 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득가능한 핵산 분자; 및

(l) 상보적 스트랜드가 엄격한 조건 하에서, 상기 (a) 내지 (k) 중 어느 하나의 핵산 분자와 하이브리드화되며, 스쿠알렌 신타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자.

본원에 사용되는 용어 "유전자(들)", "폴리뉴클레오타이드", "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열", "DNA 서열" 또는 "핵산 분자(들)"는 임의 길이의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 이 용어는 분자의 1차 구조만을 지칭한다.

따라서, 이 용어는 이중가닥 및 단일가닥 DNA 및 RNA를 포함한다. 또한, 이는 공지된 유형의 변형, 예컨대 메틸화, 및 유사체를 사용한 하나 이상의 자연발생 뉴클레오타이드의 "caps" 치환을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 DNA 서열은 앞서 정의된 폴리펩타이드를 코딩하는 코딩 서열을 포함한다.

"코딩 서열"은 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓이는 경우 mRNA로 전사되고/되거나 폴리펩타이드로 번역되는 뉴클레오타이드 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5'-말단에서의 번역 시작 코돈 및 3'-말단에서의 번역 중지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 mRNA, cDNA, 재조합 뉴클레오타이드 서열 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있지만 이에 국한되지 않으며, 또한 인트론은 특정 상황 하에서 존재할 수 있다. 서열번호 1은 파피아 로도지마로부터의 스쿠알렌 신타제 유전자를 위한 코딩 서열 내에 인트론 서열이 삽입된 게놈 DNA를 나타낸다.

일반적으로, 유전자는 서로 다른 작용을 하는 몇 가지 부분으로 구성되어 있다. 진핵생물에서, 상응하는 단백질을 코딩하는 유전자는, 리보솜 RNA(rRNA), 소핵 RNA(snRNA) 및 전달 RNA(tRNA)에 대한 유전자와 달리 미성숙한 전령 RNA(pre-mRNA)로 전사된다. RNA 중합효소 II(PolII)가 전사 상황에서 중심적인 역할을 하지만, 프로모터와 업스트림 활성화 서열((upstream activation sequence, UAS)을 포함하는 업스트림 영역에 작용하는 시스(cis) 요소, 및 트랜스(trans)-작용성 단백질 인자 없이 PolII 단독으로는 전사를 개시할 수 없다. 우선, 몇 가지 염기성 단백질 성분으로 구성된 전사 개시 복합체가 발현시킬 유전자의 5'-인접 영역에서 프로모터 서열을 인식한다. 이때, 유전자가 열 쇼크(shock) 반응 또는 영양소 결핍에 대한 적응 등과 같은 일부 특정의 조절 하에서 발현되는 경우, 몇 가지 추가의 참여자가 필요하다. 이러한 경우, 프로모터 서열 주위의 5'-비번역 업스트림 영역에 UAS(upstream activation sequence)가 존재하는 것이 필요하며, 몇 가지 양성 조절 단백질 또는 음성 조절 단백질이 UAS를 인식하고 UAS와 결합한다. 프로모터 서열에 대한 전사 개시 복합체의 결합 강도는 프로모터 주위의 트랜스-작용성 인자의 결합에 의해 영향을 받고, 이에 의해 전사 활성을 조절할 수 있다.

인산화에 의해 전사 개시 복합체가 활성화되면, 전사 개시 복합체는 전사 개시 부위로부터 전사를 개시한다. 전사 개시 복합체의 일부는 프로모터 영역으로부터 유전자의 3' 방향으로 연장 복합체로서 분리되고(이 단계는 프로모터 클리어런스(clearance) 반응으로 불린다), 연장 복합체는 상기 유전자의 3'-인접 다운스트림(downstream) 영역에 위치한 종결 서열에 도달할 때까지 전사를 계속한다. 이렇게 형성되는 pre-mRNA는, 전사 시작 부위에 거의 상응하는 캡(cap) 부위에 캡 구조가 첨가되고, 3'-인접 다운스트림 영역에 위치하는 폴리아데닐산(polyA) 신호 부위에 polyA 신장체(stretch)가 첨가됨으로써 핵 내에서 변형된다. 그 다음, 코딩 영역으로부터 인트론 구조가 제거되고, 엑손 부분이 결합되어 해당 단백질의 1차 아미노산 서열에 상응하는 개방 판독 프레임을 형성한다. 성숙한 mRNA가 형성되는 이 변형은 유전자를 안정하게 발현시키는데 필요하다. 일반적인 용어로서 cDNA란 이러한 성숙한 mRNA 서열로부터 역전사된 DNA 서열에 해당하는 것이다. cDNA는 실험적으로 성숙한 mRNA를 주형으로서 사용하여 바이러스 종으로부터 유도된 역전사효소에 의해 합성될 수 있다.

진핵생물로부터 유도된 유전자를 발현시키기 위해서는, 본 발명에서 나타낸 바와 같이 cDNA가 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli, E. coli)의 발현 벡터로 클로닝되는 절차가 종종 사용된다. 이것은 인트론 구조의 특이성이 유기체마다 다양하고, 다른 종으로부터의 인트론 서열과 구별할 수 없다는 사실에 기인한다. 사실, 원핵생물은 그 자신의 기본적인 유전자에서는 인트론 구조를 갖지 않는다. 효모에서도, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)가 속한 자낭균(Ascomycetes)의 기본적인 유전자와 파피아 로도지마가 속한 담자균(Basidiomycetes)의 기본적인 유전자는 다르다. 예컨대, 파피아 로도지마로부터의 액틴 유전자의 인트론 구조는 자낭균 효모(사카로마이세스 세레비지애)에 의해 인지 또는 스플라이싱(splice)될 수 없다. 몇몇 유형의 유전자의 인트론 구조는 그들 각각의 유전자의 발현의 조절에 관여하는 것으로 나타난다. 인트론 구조가 해당 유전자 자신의 발현을 위한 조절에 관여하는 유전자의 자가-클로닝의 경우에는, 인트론을 갖는 게놈 단편을 사용하는 것이 중요하다.

균주를 개선시키려는 연구에 유전 공학적 방법을 적용하기 위해서는, 전사 및 번역과 같이 사건의 유전자 메카니즘에 대한 연구가 필요하다. 유전자 메카니즘을 연구하기 위해서는, UAS, 프로모터, 인트론 구조 및 종결자와 같은 유전자 서열을 결정하는 것이 중요하다.

본 발명에 따라, 그의 5'- 및 3'-인접 영역 및 그의 인트론 구조를 포함하는 파피아 로도지마로부터의 스쿠알렌 신타제(SQS) 유전자를 코딩하는 유전자가 결정되었다.

본 발명은, 유전자 코드의 변성(degeneracy)으로 인해 서열번호 2(및 그의 일부)에서 제시된 뉴클레오타이드 서열 중 하나와 상이하며, 이로 인해 서열번호 2에서 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 것처럼 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 실질적으로 상동인 전장 파피아 로도지마 단백질을 코딩한다.

또한, 당해 분야의 숙련자에게는, 아미노산 서열에서의 변화를 초래하는 DNA 서열 다형태가 모집단(예컨대, 파피아 로도지마 모집단) 내에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 스쿠알렌 신타제 유전자 내의 유전자 다형태는 자연 변이로 인해 집단 내에서 개별적으로 존재할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 스쿠알렌 신타제, 바람직하게는 파피아 로도지마로부터의 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 개방 판독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다.

이러한 자연 변이는 전형적으로 스쿠알렌 신타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 1 내지 5% 변이를 나타낼 수 있다. 이러한 임의의 또는 모든 뉴클레오타이드 변이 및 스쿠알렌 신타제에서의 생산된 아미노산 다형태는 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다.

본 발명의 스쿠알렌 신타제 cDNA의 비-파피아 로도지마 동종체 및 자연발생 변이체에 상응하는 폴리뉴클레오타이드는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 사용하는 본원에 개시된 파피아 로도지마 스쿠알렌 신타제 폴리뉴클레오타이드에 대한 그들의 상동성에 기초하여 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 표준 하이브리드화 기술에 따른 하이브리드화 프로브로서 단리될 수 있다. 따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 15개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 바람직하게는, 이는 엄격한 조건 하에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 서열번호 2를 포함하는 핵산 분자로 하이브리드화된다. 다른 실시양태에서, 핵산은 적어도 20, 30, 50, 100, 250개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 표현 "엄격한 조건 하의 하이브리드화"는 앞서 정의되며, 서로 60% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열이 전형적으로 서로 하이브리드화되어 남아 있는 채로 하이브리드화 및 세척하기 위한 조건을 기술하는 것이다. 바람직하게는, 상기 조건들은 서열들이 서로 적어도 약 65 또는 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 75 또는 80%, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 85, 90 또는 95% 이상 동일한 것이다. 바람직하게는, 엄격한 조건 하에서 서열번호 2의 서열로 하이브리드화된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 자연발생 핵산 분자에 상응한다.

본 발명에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 2에 대한 특이적 결합을 규정하기에 충분한 엄격한 조건 하에서, 서열번호 2로 하이브리드화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 단편 및 서열번호 2를 포함한다. 예를 들면, 하기 하이브리드화 및 세척 조건의 임의의 조합은 필요한 특이적 결합을 달성하는데 사용될 수 있다.

매우 엄격한 하이브리드화: 6X SSC, 0.5% SDS, 100㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA, 50% 포름아미드를 42℃에서 부드럽게 흔들어주면서 밤새도록 배양한다.

매우 엄격한 세척: 2X SC, 0.5% SDS 중에서 15분 동안 실온에서 1회 세척한 후, 0.1X SC, 0.5% SDS 중에서 15분 동안 실온에서 추가로 세척한다.

덜 엄격한 하이브리드화: 6X SSC, 0.5% SDS, 100㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA, 50% 포름아미드를 37℃에서 부드럽게 흔들어주면서 밤새도록 배양한다.

덜 엄격한 세척: 0.1X SC, 0.5% SDS 내에서 15분 동안 실온에서 1회 세척한다.

하이브리드화 반응이 일어나고/일어나거나 세척 조건이 앞서 개시한 바와 같이 일어나는 온도로 변화시킴으로써 보통의 엄격한 조건을 얻을 수 있다. 본 발명에서, 파피아 로도지마로부터의 스쿠알렌 신타제 유전자에 대한 안티센스(antisense) 활성을 규정하는 매우 엄격한 하이브리드화 및 세척 조건을 사용하는 것이 바람직하다.

용어 "상동성"은 각각의 핵산 분자 또는 코딩된 단백질이 작용적으로 및/또는 구조적으로 동일한 것을 의미한다. 전술된 핵산 분자와 상동이고 상기 핵산 분자의 유도체인 핵산 분자는, 예컨대 특히 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 동일한 생물학적 기능을 갖는 변형을 나타내는 상기 핵산 분자의 변이이다. 이들은 다른 식물 변종 또는 종, 또는 돌연변이체로부터의 서열과 같은 자연발생 변이일 수 있다. 이들 돌연변이체는 자연적으로 생산되거나 또는 돌연변이유발 기술에 의해 수득될 수 있다. 대립유전자 변이는 합성적으로 생산되거나 또는 유전자 조작된 변이뿐만 아니라 자연발생 대립유전자 변이체일 수 있다. 구조적 등가체(equivalent)는 예컨대 항체와 폴리펩타이드의 결합을 시험함으로써 규정될 수 있다. 구조적 등가체는 유사한 면역학적 특성, 예컨대 유사한 에피토프를 갖는다.

본원에 사용된 바와 같이, "자연발생" 핵산 분자는 자연적으로 생성되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는(예컨대, 자연 단백질을 코딩하는) RNA 또는 DNA 분자를 지칭한다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 자연 파피아 로도지마 스쿠알렌 신타제를 코딩한다.

모집단에 존재할 수 있는 스쿠알렌 신타제 서열의 자연발생 변이체와 더불어, 숙련자는 또한 스쿠알렌 신타제의 작용적 능력을 변형시키지 않고서 코딩된 스쿠알렌 신타제의 아미노산 서열 내의 변화를 초래하는, 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 내의 돌연변이에 인해 변화가 도입될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, "필수적이지 않은" 아미노산 잔기에서 아미노산의 치환을 초래하는 뉴클레오타이드의 치환이 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 서열(예: 서열번호 2)에서 일어날 수 있다. "필수적이지 않은" 아미노산 잔기는 상기 스쿠알렌 신타제의 활성을 변형시키지 않고서 스쿠알렌 신타제 중 하나의 야생형 서열로부터 변형될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 스쿠알렌 신타제 활성에 필요한 것이다. 그러나, 다른 아미노산 잔기(예컨대, 스쿠알렌 신타제 활성을 갖는 도메인 내에 보존되지 않거나 또는 단지 절반만 보존되는 것)는 활성에 대해 필수적인 것은 아니며, 이로 인해 스쿠알렌 신타제 활성을 변형시키지 않고서 쉽게 변형될 수 있다.

따라서, 본 발명은 스쿠알렌 신타제 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기에서의 변화를 포함하는 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 이러한 스쿠알렌 신타제는, 본원에 기술된 스쿠알렌 신타제 활성을 여전히 보유하고 있는 서열번호 3에 함유된 서열과 아미노산 서열에서 상이하다. 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며 스쿠알렌의 합성에 참여할 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자에 의해 코딩된 단백질은 서열번호 3 내의 서열과 적어도 약 60 내지 65% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열번호 3 내의 서열과 적어도 약 60 내지 70% 동일하고, 더욱더 바람직하게는 서열번호 3 내의 서열과 적어도 약 70 내지 80%, 80 내지 90%, 90 내지 95% 일치하고, 가장 바람직하게는 서열번호 3 내의 서열과 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.

2개의 아미노산 서열(예컨대, 서열번호 3의 서열 중 하나 및 그의 돌연변이 형태) 또는 2개의 핵산의 상동성(%)을 측정하기 위해, 서열들은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예컨대, 갭(gap)들이 다른 단백질 또는 핵산과의 최적의 정렬을 위한 하나의 단백질 또는 핵산의 서열 내에 도입될 수 있다). 그 다음, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 하나의 서열(예컨대, 서열번호 2 또는 3의 서열 중 하나) 내의 하나의 위치가 다른 서열 내의 상응하는 위치에서의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되는 경우, 분자들은 그 위치에서 상동적이다(예컨대, 본원에서 아미노산 또는 핵산을 사용하는 경우, "상동성"은 아미노산 또는 핵산의 "동일성"과 동일한 것이다). 2개의 서열 사이의 상동성(%)은 서열을 공유하는 동일 위치의 수의 함수이다(즉, 상동성(%) = 동일 위치의 수/위치의 총 수 × 100). 상동성은 Blast 2.0과 같은 컴퓨터 프로그램에 의해 측정될 수 있다[문헌 (Altschul SF, Nuc. Acid. Res., 25,3389-3402, 1997)]. 본 발명에서, 이러한 상동성 분석 소프트웨어로서 그의 디폴트 알고리듬(default algorithm)을 사용하는 GENETYX-SV/RC 소프트웨어(일본 도쿄 소재의 소프트웨어 디벨롭먼트 캄파니 리미티드(Software Development Co., Ltd.))가 사용된다. 이 소프트웨어는 그의 분석 알고리듬을 위한 리프만-피어손 방법(Lipman-Pearson method)을 사용한다.

서열번호 3의 단백질 서열에 상동적인 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 핵산 분자는, 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 삭제에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 내에 도입됨으로써 생성될 수 있다. 특히, 서열번호 2의 경우는, 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 삭제가 코딩된 단백질 내에 도입된다. 표준 기술, 예컨대 부위-지향(site-directed) 돌연변이유발(mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 서열번호 2와 같은 서열 내로 돌연변이가 유도될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 예측된 필수적이지 않은 아미노산 잔기에서 수행된다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 부류는 당해 분야에 정의되어 있다. 이들 부류는 염기 측쇄(예: 라이신, 알기닌, 히스티딘), 산 측쇄(예: 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(예: 글라신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예: 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄(예: 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예: 트립신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 스쿠알렌 신타제 내의 예측된 필수적이지 않은 아미노산 잔기는, 동일 부류인 다른 아미노산 잔기와 대체되는 것이 바람직하다. 다르게는, 다른 실시양태에서, 돌연변이는 예컨대 포화 돌연변이에 의해 스쿠알렌 신타제 코딩 서열 모두 또는 그의 일부를 따라 랜덤하게 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이체는 스쿠알렌 신타제 활성을 보유하는 돌연변이체를 동정하기 위해 본원에 기술된 스쿠알렌 신타제 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 서열번호 2의 서열 중 하나를 돌연변이유발시킨 후, 코딩된 단백질은 재조합적으로 발현될 수 있고, 단백질의 활성은 예컨대 본원에 기술된 검정을 사용하여 측정될 수 있다.

따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 하나의 바람직한 실시양태는 DNA 또는 RNA이다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 일부를 갖는 핵산 분자는 본원에 제공된 서열 정보 및 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들면, 스쿠알렌 신타제 cDNA는 하이브리드화 프로브 및 표준 하이브리드화 기술과 같이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 서열 중 하나 모두 또는 그의 일부를 사용하여 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 서열 중 하나 모두 또는 그의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 이 서열에 기초하여 디자인된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의해 단리될 수 있다(예컨대, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 서열 중 하나의 모두 또는 그의 일부를 포함하는 핵산 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 동일한 서열에 기초하여 디자인된 서열번호 4, 5 또는 6과 같은 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의해 단리될 수 있다). 예를 들면, mRNA는 파피아와 같은 세포로부터 (예컨대, 치르그윈(Chirgwin) 등의 구아니디늄-싸이오사이아네이트 추출 절차에 의해) 단리될 수 있고, cDNA는 역전사효소(예컨대, 미국 매디슨 소재의 프로메가(Promega)로부터 입수가능한 몰로니(Moloney) MLV 역전사효소 또는 AMV 역전사효소)를 사용하여 제조될 수 있다. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 위한 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열 중 하나에 기초하여 디자인될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 표준 PCR 증폭 기술에 따라 cDNA 또는 다르게는 게놈 DNA(주형으로서) 및 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 이렇게 증폭된 폴리뉴클레오타이드는 적절한 벡터 내로 클로닝될 수 있고, DNA 서열 분석에 의해 특징화될 수 있다. 더욱이, 스쿠알렌 신타제 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드는 자동화 DNA 합성기와 같은 것을 사용하는 표준 합성 기술에 의해 생산될 수 있다.

용어 "단편", "서열의 단편" 또는 "서열의 일부"는 언급되는 고유 서열의 절단된(truncated) 서열을 의미한다. 절단된 서열(핵산 또는 단백질 서열)은 길이가 폭넓게 변할 수 있으며, 최소 크기는 언급되는 고유 서열의 적어도 견줄만한 기능 및/또는 활성을 갖는 서열을 제공하기에 충분한 크기의 서열이지만, 최대 크기는 중요하지 않다. 일부 적용에서, 최대 크기는 통상적으로 고유 서열의 목적하는 활성 및/또는 기능(들)을 제공하는데 필요한 것보다 실질적으로 크지 않다.

전형적으로는, 절단된 아미노산 서열은 약 5 내지 약 60개 아미노산 길이를 가질 것이다. 그러나 더욱 전형적으로는, 서열은 최대 약 50개 아미노산 길이, 바 람직하게는 최대 약 30개 아미노산 길이를 가질 것이다. 통상적으로, 적어도 약 10, 12 또는 15개 아미노산의 서열로부터 최대 약 20 또는 25개 아미노산까지 선택하는 것이 바람직하다.

용어 "에피토프"는 항원 결정기(antigenic determinate)로서도 공지된 항원 내의 특이적 면역반응성 부위를 지칭한다. 이들 에피토프는 중합체 조성물 중의 선형 어레이(array)의 단량체(예컨대, 단백질 중의 아미노산)일 수 있거나, 또는 더욱 복잡한 2차 또는 3차 구조로 이루어지거나 포함할 수 있다. 숙련자는 모든 면역원(즉, 면역 반응을 도출할 수 있는 물질)이 항원임을 알 것이지만, 그러나 일부 항원(예: 불완전 항원(hapten))은 면역원이 아니지만 담체 분자와의 커플링에 의해 면역원이 될 수 있다. 용어 "항원"은 항체가 생산될 수 있고/있거나 항체가 특이적으로 면역 반응하는 관련 물질을 포함한다.

용어 "하나 또는 몇몇 아미노산"은 하나 이상의 아미노산이지만, 60% 미만이 동일한 상동성을 나타내는 아미노산의 수 이하인 아미노산을 지칭한다. 바람직하게는, 70 또는 80% 초과, 더욱 바람직하게는 85, 90 또는 95%, 더욱더 바람직하게는 96, 97, 98 또는 99%가 동일하다.

용어 "스쿠알렌 신타제" 또는 "스쿠알렌 신타제 활성"은, 전술된 바와 같거나 효소 검정 방법으로 측정될 수 있는 폴리펩타이드의 효소 활성을 지칭한다. 더욱이, 본원의 검정에서 비활성이지만 스쿠알렌 신타제에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩타이드, 즉 하나 이상의 스쿠알렌 신타제 에피토프를 갖는 폴리펩타이드도 또한 용어 "스쿠알렌 신타제" 하에 포함된다. 이들의 경우, 활성 은 그들의 면역 활성을 지칭한다.

용어 "폴리펩타이드" 및 "핵산 분자"는 또한 "단리된" 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자를 지칭한다. "단리된" 핵산 분자는 핵산의 자연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 바람직하게는, "단리된" 핵산은 핵산이 유도되는 유기체의 게놈 DNA 내의 핵산을 자연적으로 플랭킹시키는(flank) 서열(즉, 핵산의 5'- 및 3'-말단에 위치하는 서열)이 없다.

예를 들면, 다양한 실시양태에서, PNO 폴리뉴클레오타이드는 핵산이 유도되는 세포(예컨대, 파피아 세포)의 게놈 DNA 내의 핵산을 자연적으로 플랭킹시키는 뉴클레오타이드 서열의 약 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 또는 0.1kb 미만을 함유할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 특히 "단리된" 핵산 분자(예: cDNA 분자)는 다른 세포 물질, 배양 매질(재조합 기술에 의해 생산되는 경우), 화학 전구체, 또는 다른 화학물질(화학적으로 합성되는 경우)이 실질적으로 존재할 수 없다.

바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열 중 하나를 포함한다. 서열번호 2의 서열은 본 발명의 파피아 로도지마 스쿠알렌 신타제 cDNA에 상응한다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 앞서 언급된 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 중 하나 또는 그의 일부에 상보적인 핵산 분자를 포함한다. 서열번호 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열 중 하나에 상보적인 핵산 분자는, 서열번호 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열 중 하나가 하이브리드화되어 안정한 중복 부위(duplex)를 형성할 수 있도록 하는, 서열번호 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열 중 하나에 충분히 상보적인 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 일부의 약 60% 이상, 바람직하게는 적어도 약 65 내지 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70 내지 80%, 80 내지 90%, 또는 90 내지 95%, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 95, 96, 97, 98, 99% 이상인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열 중 하나 또는 그의 일부로 하이브리드화된(예컨대, 본원에서 정의된 바와 같이 엄격한 조건 하에서 하이브리드화된) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

더욱이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 2 내의 서열 중 하나의 코딩 영역의 일부만, 예컨대 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 단편만 또는 스쿠알렌 신타제의 생물학적 활성 부분을 코딩하는 단편만을 포함할 수 있다. 파피아 로도지마로부터의 스쿠알렌 신타제 유전자의 클로닝으로부터 측정된 뉴클레오타이드 서열은, 다른 세포 유형 및 유기체에서 스쿠알렌 신타제 동종체를 규정하고/하거나 클로닝하는데 사용하도록 디자인된 프라이머 및 프로브를 생산시킨다. 프로브/프라이머는 전형적으로 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 엄격한 조건 하에서 예컨대 서열 번호 2 내에 개시된 서열 중 하나의 센스 스트랜드, 예컨대 서열 번호 2에 개시된 서열 중 하나의 안티-센스 서열, 또는 그의 자연발생 돌연변이체의 적어도 약 12, 15개, 바람직하게는 약 20 또는 25개, 더욱 바람직하게는 약 40, 50 또는 75개의 보존적 뉴클레오타이드로 하이브리드화된 뉴클레오타이드 서열의 영역을 포함한다. 본 발명의 뉴클레오타이드에 기초한 프라이머는 PCR 반응에서 스쿠알렌 신타제 동종체를 클로닝하는데 사용될 수 있다. 스쿠알렌 신타제 뉴클레오타이드 서열에 기초한 프로브는 동일 또는 상동성 단백질을 코딩하는 게놈 서열 또는 전사체를 검출하는데 사용될 수있다. 프로브는 그에 부착된 표지 그룹을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 표지 그룹은 방사선 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조-인자일 수 있다. 이러한 프로브는 예컨대 세포의 샘플 내의 스쿠알렌 신타제-코딩 핵산 분자를 측정함으로써, 예를 들면 스쿠알렌 신타제 mRNA 수준을 검출함으로써 또는 게놈 스쿠알렌 신타제 유전자가 돌연변이화 되었는지 또는 삭제되었는지 여부를 측정함으로써, 스쿠알렌 신타제를 발현시키는 세포를 규정하기 위한 게놈 마커 시험 키트의 일부로서 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 단백질 또는 그의 일부가 특히 미생물 또는 식물 내의 실례로 기술되는 바와 같이 스쿠알렌 특히 스쿠알렌 신타제 활성의 합성에 참여하는 능력을 유지시키도록, 서열 번호 3의 아미노산 서열에 충분하게 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 그의 일부를 코딩한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 문구 "충분하게 상동적인"은, 단백질 또는 그의 일부가 미생물 또는 식물 내의 스쿠알렌의 합성에 참여할 수 있도록, 서열 번호 3의 아미노산 서열에 동일하거나 동등한 아미노산 잔기(예컨대, 본 발명의 폴리펩타이드의 서열 중 하나 내의 아미노산 잔기로서의 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기)의 최소 수를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 일부를 지칭한다. 스쿠알렌 신타제 활성의 예는 또한 본원에 기술되어 있다.

상기 단백질은 서열 번호 3의 전체 아미노산 서열에 적어도 약 60 내지 65%, 바람직하게는 적어도 약 66 내지 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70 내지 80%, 80 내지 90%, 90 내지 95%, 가장 바람직하게는 약 96, 97, 98, 99% 이상 상동적이다.

본 발명의 스쿠알렌 신타제 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 단백질 일부는 스쿠알렌 신타제 중 하나의 생물학적 활성 부분인 것이 바람직하다.

본원에서 언급된 바와 같이, 용어 "스쿠알렌 신타제의 생물학적 활성 부분"은 스쿠알렌 신타제에 특이적으로 결합하는 항체에 결합도록 면역학적 활성을 갖거나 또는 스쿠알렌의 생합성에 참여하는 도메인/모티프(motif)와 같은 부분을 포함하는 것이다. 스쿠알렌 신타제 또는 그의 생물학적 활성 부분이 대사에 참여는지 여부를 측정하기 위해, 효소 활성의 검정이 실시될 수 있다. 이러한 검정방법은 실시예에서 상세하게 설명되는 바와 같이 당해 분야의 숙련자에 잘 공지되어 있다. 스쿠알렌 신타제의 생물학적 활성 부분을 코딩하는 추가의 핵산 단편은 서열 번호 2 내의 서열 중 하나의 일부를 단리시키고, 스쿠알렌 신타제 또는 펩타이드의 코딩된 부분을 (예컨대, 생체 외 재조합 발현에 의해) 발현시키고, 스쿠알렌 신타제 또는 펩타이드의 코딩된 부분의 활성을 평가함으로써 생산될 수 있다.

우선, SQS 유전자의 일부를 함유하는 부분 유전자 단편은 변성 PCR 방법을 사용하여 클로닝되었다. 상기 변성 PCR은 동일한 또는 유사한 기능을 갖는 다른 종류로부터의 공지된 효소에 대해 높은 상동성의 아미노산 서열을 갖는 해당 유전자를 클로닝하는 방법이다. 변성 PCR에서 프라이머로서 사용되는 변성 프라이머는, 아미노산 서열의 상응하는 뉴클레오타이드로의 역 번역에 의해 디자인되었다("변성되었다"). 이러한 변성 프라이머에서, A, C, G 또는 T 중 임의로 구성된 혼합된 프라이머, 또는 모호(ambiguity) 코드가 일반적으로 사용된다. 본 발명에서, 이러한 혼합된 프라이머는 변성 프라이머에 대해 상기 유전자를 클로닝하는데 사용되었다.

인트론을 갖는 코딩 영역, 및 프로모터 또는 종결자와 같은 조절 영역을 포함하는 전체 유전자는, 전술한 바와 같은 변성 PCR에 의해 수득된 부분 DNA 단편을 표지한 후 프로브로 사용하여, 적절한 숙주에서 파아지 벡터 또는 플라스미드 벡터로 구성된 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써, 염색체로부터 클로닝할 수 있다. 일반적으로, 라이브러리를 구성하고, 서열 분석, 제한 효소 분해 및 결찰(ligation) 등과 같이 유전자를 조작하는데, 숙주 균주로서 E. coli가 종종 사용되고, E. coli 벡터로서 λ 파아지 벡터와 같은 파아지 벡터, 또는 pUC 벡터와 같은 플라스미드 벡터가 종종 사용된다. 본 발명에서는, 파피아 로도지마의 EcoRI 게놈 라이브러리를 삽입체 크기에 따라 λ 벡터의 유도체(λDASHII)를 사용하여 구성하였다. 클로닝되어야 하는 삽입체의 길이를 나타내는 삽입체 크기는 라이브러리를 구성하기 전에 각 유전자에 대해 서던 블롯(Southern blot) 하이브리드화를 수행하여 결정하였다. 본 발명에서, 프로브로 사용된 DNA는 통상의 ³²P 표지 방법 대신 공급업자(독일 만하임 소재의 뵈링거-만하임(Boehringer-Mannheim))가 지시한 프로토콜에 따라 스테로이드 불완전 항원인 디곡시게닌(digoxigenin, DIG)으로 표지되었다. 파피아 로도지마의 염색체로부터 구성된 게놈 라이브러리를 표적 유전자의 일부를 갖는 DIG-표지된 DNA 단편을 프로브로 사용하여 스크리닝하였다. 하이브리드화된 플라크(plaque)를 골라 이후의 연구에 사용하였다. λDASHII(9kb 내지 23kb의 삽입체 크기)를 사용하는 경우에는, 생산된 λDNA를 EcoRI으로 분해하고, 이어서 이 EcoRI 삽입체를 pUC19 또는 pBluescriptII SK+와 같은 플라스미드 벡터 내에 클로닝하였다. 이렇게 수득된 플라스미드 DNA의 서열을 분석하였다.

본 발명에서는 대부분의 서열 분석에, 자동 주기 서열화 분석 프로토콜에 따라 Taq DNA 중합효소를 사용하는 자동 형광 DNA 서열 분석기인 알프레드(ALFred) 시스템(스웨덴 웁살라 소재의 파마시아(Pharmacia))를 사용하였다.

게놈 서열을 결정한 후에, 코딩 영역의 서열을 사용하여 상응하는 유전자의 cDNA를 클로닝하였다. cDNA 단편을 클로닝하는데 또한 PCR 방법을 사용하였다. 개방 판독 프레임(ORF)의 5'-말단 및 3'-말단의 서열과 동일한 서열의 PCR 프라이머를 적절한 제한 부위를 포함시켜 합성하였고, 이러한 PCR 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 본 발명에서는, cDNA를 PCR 클로닝하는데 cDNA 풀(pool)을 주형으로 사용하였다. cDNA 풀은 파피아 로도지마로부터 수득된 mRNA를 주형으로 사용하여 바이러스 역전사효소 및 Taq 중합효소(미국 팔로 알토 소재의 클론테크(Clontech)에 의해 생산된 캡파인더 키트(CapFinder Kit)를 사용하였다)에 의해 생체 외에서 합성된 다양한 cDNA 종으로 구성된다. 이렇게 수득된 표적 cDNA의 서열을 확인하였다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 벡터 내에 삽입함을 포함하는 재조합 벡터의 생산방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유하고 본 발명의 상기 방법에 의해 생산되는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연결된 폴리뉴클레오타이드를 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터 중 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중나선 DNA 루프를 지칭한다. 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 또는 PNA 세그먼트가 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(예컨대, 복제의 박테리아 기원인 박테리아 벡터, 및 에피솜 포유동물 벡터(episomal mammalian vector)). 다른 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입됨에 따라 숙주 세포의 게놈 내에 통합되며, 이로 인해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 벡터는 "발현 벡터"로서 본원에서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태로 존재한다. 본원에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용된 형태임에 따라 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면 바이러스 벡터(예컨대, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노바이러스-의존 바이러스(adeno-associated virus))를 포함한다.

또한, 본 발명은 코스미드(cosmid), 바이러스, 박테리아파아지, 및 본 발명에 따라 핵산 분자를 함유하는 유전자 조작에서 통상적으로 사용되는 다른 벡터에 관한 것이다. 당해 분야의 숙련자에게 잘 공지된 방법이 다양한 플라스미드 및 벡터를 구성하는데 사용될 수 있다. 다르게는, 본 발명의 핵산 분자 및 벡터는 표적 세포로의 전달을 위해 리포솜 내로 재구성될 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 실시양태는, 벡터 내에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현을 허용하는 발현 제어 서열과 작동적으로 연결된 벡터에 관한 것이다. 이러한 제어 서열의 속성은 숙주 유기체에 따라 상이하다. 원핵생물에서, 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 종결자를 포함한다. 진핵생물에서, 일반적으로 제어 서열은 프로모터, 종결자를 포함하며, 일부의 경우, 증강인자(enhancer), 발현조절자(transactivator) 또는 전사 인자들을 포함한다.

용어 "제어 서열"은 적어도 발현에 필요한 성분을 포함하는 것이며, 또한 추가의 유리한 성분들을 포함할 수 있다.

용어 "작동적으로 연결된"은 기술된 성분들이 그들의 의도된 방식으로 작용하는 관계로 존재하는 근접 배치(juxtaposition)를 지칭한다. 코딩 서열에 대해 "작동적으로 연결된" 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 상용적인 조건 하에서 달성되는 방식으로 결찰된다. 제어 서열이 프로모터인 경우, 숙련자에게는 이중가닥 핵산이 사용된다는 것은 알기 쉬운 것이다.

이러한 조절 서열은 숙련자에게 알려져 있다. 조절 서열은 여러 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열을 구성적으로 발현시키는 서열, 및 특정 숙주 세포에서만 또는 특정 조건 하에서만 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 서열을 포함한다. 당해 분야의 숙련자는, 발현 벡터의 디자인이, 변형되는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어서, 본원에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 융합 단백질 또는 펩타이드를 비롯한 단백질 또는 펩타이드가 생산될 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 스쿠알렌 신타제의 발현을 위해 디자인될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 코딩하는 유전자는 박테리아 세포(예컨대 E. coli), 곤충 세포(바쿨로바이러스 발현 벡터를 사용함), 효모 및 다른 진균 세포, 조류, 섬모충[예를 들어 WO 98/01,572 호에 기술된 변형 방법에 따른 벡터를 갖는, 홀로트리키아(Holotrichia), 페리트리키아(Peritrichia), 스피로트리키아(Spirotrichia), 숙토리아(Suctoria), 테트라히메나(Tetrahymena), 파라메시움(Paramecium), 콜피디움(Colpidium), 글라우코마(Glaucoma), 플라티오프르야(Platyophrya), 포토마쿠스(Potomacus), 슈도코닐렘부스(Pseudocohnilembus), 유플로테스(Euplotes), 엔겔마니엘라(Engelmaniella) 및 스틸로니키아(Stylonychia), 특히 스틸로니키아 렘나에(Stylonychia lemnae)], 다세포 식물 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 숙련자에게 알려져 있다. 다르게는, 재조합 발현 벡터는 예컨대 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 생체 외에서 전사되고 번역될 수 있다.

원핵생물에서 단백질의 발현은 대부분 융합 단백질 또는 비융합 단백질의 발현에 관여하는 구성적 또는 유도가능한 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 실시될 수 있다. 융합 벡터는 이 벡터에서 코딩되는 단백질, 통상적으로, 재조합 단백질의 아미노 말단 또는 C-말단에 다수의 아미노산을 첨가하거나, 상기 단백질 내의 적합한 영역 내에 융합된다. 이러한 융합 벡터는 전형적으로 다음의 3가지 목적을 제공한다: 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키고, 2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키고, 3) 친화 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제에 도움이 되고자 하는 목적. 종종, 융합 발현 벡터에서, 원핵생물의 분할 부위는 융합 잔기와 재조합 단백질의 접합부에 도입되어 융합 잔기로부터의 재조합 단백질의 분리 및 이후의 융합 단백질의 정제를 가능하게 한다. 이러한 효소 및 그들의 동종(cognate) 인지 서열은 펙터(Factor) Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다.

전형적인 융합 발현 벡터는, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A 각각을 표적 재조합 단백질에 융합시키는, pGEX(파마시아 바이오테크 인코포레이티드(Pharmacia Biotech Inc.)), pMAL(미국 베버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)), pRIT5(미국 피스카타웨이 소재의 파마시아)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 코딩 서열은 pGEX 발현 벡터 내에 클로닝되어서, N-터미널로부터 C-터미널까지의 GST-트롬빈 분할 부위-X 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 생산시킨다. 융합 단백질은 글루타티온-아가로스 수지를 사용하여 친화 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예를 들면, GST에 비융합된 재조 합 스쿠알렌 신타제는 트롬빈을 사용하는 융합 단백질의 분할에 의해 회수될 수 있다.

적합한 유도가능한 비융합 E. coli 발현 벡터의 예로는 pTrc 및 pET 11d가 포함된다. pTrc 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 중합효소 전사에 의존적이다. pET 11d 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 동시발현된 바이러스 RNA 중합효소(T7 gnl)에 의해 매개된 T7 gnl0-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존적이다. 이 바이러스 중합효소는 lacUV 5 프로모터의 전사 조절 하에서 T7 gnl 유전자 내에 존재하는 잔여 λ 프로파아지로부터의 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 공급된다.

재조합 단백질 발현을 최대화시키기 위한 하나의 전략은, 재조합 단백질을 단백질분해에 의해 분할시키는 능력이 손상된 숙주 박테리아에서 단백질을 발현시키는 것이다. 다른 전략은 각각의 아미노산에 대한 개별 코돈이 발현을 위해 선택된 박테리아(예: E. coli)에 바람직하게 이용되도록 발현 벡터 내로 삽입되는 핵산의 핵산 서열을 변형시키는 것이다. 본 발명의 이러한 핵산 서열의 변형은 표준 DNA 합성 기술에 의해 실시될 수 있다.

또한, 스쿠알렌 신타제 벡터는 효모 발현 벡터일 수 있다. 효모 사카로마이세스 세레비지아애에서 발현을 위한 벡터의 예로는 pYepSec1, pMFa, pJRY88 및 pYES2(미국 샌디에고 소재의 인비트로젠(Invitrogen))가 포함된다. 다른 진균류(예: 필라멘터스(filamentous) 진균류)에 사용하는데 적절한 벡터 및 이의 구성을 위한 방법은 숙련자에게 알려져 있다.

다르게는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 바쿨로바이러스 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포 내에 도입될 수 있다. 배양된 곤충 세포(예: sf9 세포)에서 단백질의 발현에 이용가능한 바쿨로바이러스 벡터는 pAc 시리즈 및 pVL 시리즈를 포함한다.

다르게는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에 도입된다. 포유동물 발현 벡터의 예는 pCDM8 및 pMT2PC를 포함한다. 포유동물 세포에 사용되는 경우, 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들면, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스 2(Adenovirus 2), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 및 심미안 바이러스 40(Simian Virus 40)으로부터 유도된다. 원핵생물 및 진핵생물 세포 모두에 적합한 다른 발현 시스템들이 숙련자에게 알려져 있다.

재조합 포유동물 발현 벡터는 바람직하게는 특정 세포 유형에서 핵산을 발현시킬 수 있다(예컨대, 조직-특이적 조절 요소들은 핵산을 발현시키는데 사용된다). 조직-특이적 조절 요소는 당해 분야에 알려져 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비제한적 예는 알부민 프로모터(간-특이적), 림프구-특이적 프로모터, 특히 T 세포 수용체 및 면역글로불린의 프로모터, 뉴론-특이적 프로모터(예: 뉴로필라멘트 프로모터), 이자-특이적 프로모터 및 포유동물 선(gland)-특이적 프로모터(예컨대, 유장(milk whey) 프로모터; 미국 특허 제 4,873,316 호 및 EP 264,166 호)를 포함한다. 쥐의 hox 프로모터 및 태아단백질(fetoprotein) 프로모터와 같은 전개-조절된 프로모터도 또한 포함된다.

이렇게 발현된 SQS 유전자는 예컨대 효소 검정 방법에 의해 그의 활성이 입증될 수 있다. 일부 실험 프로토콜이 문헌에 기술되어 있다. 스쿠알렌 신타제 활성을 측정하는데 사용되는 방법들 중 하나는 다음과 같다: 스쿠알렌 신타제 활성은 [1-³H] FPP의 스쿠알렌으로의 전환을 모니터링함으로써 측정된다. 반응 혼합물(500㎖)은 50mM Tris-HCI(pH 7.4), 2mM KF, 1mM MgCl₂, 1mM NADPH, 효소, 10mM [1-³H] FPP(370MBq/밀리몰, 3.7kBq/㎖; 메사추세츠주 보스톤 소재의 뉴 잉글랜드 뉴클리어(New England Nuclear))를 포함한다. 반응은 [1-³H] FPP를 첨가함으로써 시작된다. 37℃에서 10분 동안 항온처리 후, 에탄올 1㎖를 첨가하여 반응이 종결된다. H₂O 1㎖를 첨가한 후, 혼합물은 30분 동안 석유 에터 3㎖와 함께 격렬하게 진탕된다. 추출된 지질은 증발되고, 클로로포름 25㎖ 중에 재현탁된다. 샘플을 박막 크로마토그래피(TLC)를 위한 플라스틱-베이킹된 시이트(실리카 겔 60, F254; 뉴져지주 라웨이 소재의 머크(Merk))에 적용되고, 15분 동안 헵테인 중에 전개된다. 스쿠알렌 분획물 내에 포함된 방사선활성은 액체 신틸레이션 계수에 의해 측정된다. 사카로마이세스 세레비지아애를 위한 발현 벡터가 사용되는 경우, 상보 분석은 사카로마이세스 세레비지아애로부터 유도된 조건의 스쿠알렌 신타제 돌연변이체 ERG9 균주를 그의 활성 확인을 위한 숙주 균주로서 사용함으로써 편리하게 활용될 수 있다[메르쿨로브(Merkulov) 등의 문헌 "Yeast, 16,197-206, 2000"].

효소 활성의 확인 후, 발현된 단백질은 정제된 효소에 대한 항체의 상승을 위해 정제되고 사용된다. 이렇게 생산된 항체는 균주 개선 연구에서 상응하는 효소의 발현의 특성화, 배양 조건의 최적화 연구 등에 사용된다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 일부, 즉 이러한 단백질의 특이적 단편 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

본 발명의 항체는 다른 스쿠알렌 신타제 및 유전자를 확인 및 단리하는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 항체의 단편, 예컨대 Fab, Fv 또는 scFv 단편 등 뿐만 아니라 단일 클론성 항체, 다클론성 항체 또는 합성 항체일 수 있다. 단일 클론성 항체는 예컨대 면역된 포유동물로부터 유도된 비장 세포에 마우스 골수종 세포를 융합시킴을 포함하는 숙련자에게 알려진 기술에 의해 생산될 수 있다.

더욱이, 전술된 펩타이드에 대한 항체 또는 그의 단편은 숙련자에게 공지된 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 이들 항체는 예컨대 본 발명에 따른 단백질의 면역침전 및 면역국지화(immunolocalization)뿐만 아니라 재조합 유기체의 상기 단백질의 합성의 모니터링, 및 본 발명에 따른 단백질과 상호작용하는 화합물의 확인을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, BlAcore 시스템에 사용되는 표면 플라스몬 공명(plasmon resonance)을 파아지 항체 선택의 효율성을 증가시키는데 사용하여, 본 발명의 단백질의 에피토프에 결합하는 단일 라이브러리의 파아지 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 다수의 경우, 항원에 대한 항체의 결합 현상은 다른 리간드/안티-리간드 결합과 동일하다.

본 발명에서, 스쿠알렌 신타제에 대한 유전자 단편은, 파피아 로도지마 내의 발현 수준을 감소시키려는 목적으로, 클로닝된 유전자 단편을 사용하는 유전자-조작 방법에 의해 파피아 로도지마로부터 클로닝되었다.

본 발명은, 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 유전자를 적합한 숙주(예: 파피아 로도지마)에서 그의 발현이 감소하도록 개질시키고, 그러한 변형체를 적절한 배양 조건 하에 적절한 배지에서 배양하는, 카로티노이드의 생산방법을 제공한다.

유전자-조작 방법으로 유전자 발현을 감소시키기 위해서는 몇몇 전략이 사용될 수 있다. 이들 중 하나는 유전자-붕괴(disruption) 방법이다. 이 방법에서, 붕괴되는 목적 유전자의 일부 단편이 숙주 유기체에서 복제할 수 없는 통합 벡터 상에서 약물 내성 카세트(cassette)에 결찰된다. 독성 항생제의 존재 하에서 숙주가 생존하는데 필요한 효소를 코딩하는 약물 내성 유전자가 흔히 선택 표지로 사용된다. 파피아 로도지마에서 작용하는 약물 내성 유전자의 한 예는 pGB-Ph9 내에 존재하는 G418 내성 유전자이다. 영양소 상보성 마커도 또한 적절한 영양요구 마커를 갖는 숙주에서 사용될 수 있다. 영양요구주(auxotroph)의 한 예는 성장에 있어 사이티딘을 필요로 하는 파피아 로도지마 ATCC24221 균주이다. ATCC24221에서 CTP 합성효소를 공여체 DNA로 사용하여, 영양소 상보성을 이용하는 숙주 벡터 시스템을 생산할 수 있다.

숙주 유기체의 변형, 및 벡터 상의 목적 유전자 단편과 그의 상응하는 숙주 유기체의 염색체 상의 유전자 단편 사이의 재조합 후, 통합 벡터는 단일 교차 재조합에 의해 숙주의 염색체로 통합된다. 재조합의 결과, 약물 내성 카세트는, 번역된 생산물이 그의 효소적 기능을 갖지 않는 절단된 형태로만 합성되는 목적 유전자 내에 삽입된다. 유사한 방식으로, 목적 유전자의 2개의 부분은 또한 약물 내성 유전자가 통합 벡터 상의 목적 유전자의 상기 2개의 부분 단편들 사이에 삽입될 수 있는 유전자 붕괴 연구를 위해 사용되었다. 이 유형의 벡터의 경우, 통합 벡터 상에 내재된 유전자 단편과 숙주의 염색체 상의 상응하는 유전자 단편 사이의 이중 재조합 사건이 예기된다. 이 이중 교차 재조합의 빈도가 단일 교차 재조합보다 낮을지라도, 이중 교차 재조합에 의한 목적 유전자의 무표지 표현형(null phenotype)은 단일 교차 재조합에 의한 것보다 안정하다.

이 전략은 플라스미드 상에 박테리아 카로티노겐 유전자가 내재된 칸디다 우틸리스(Candida utilis)의 리코펜-생산 재조합체를 구성하는데 사용되었다[심마다(Shimada) 등의 문헌 (Applied and Environmental Microbiology, 64 (7), 2676-2680,1998))]. 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 ERG9 유전자는 칸디다 우틸리스로부터 클로닝되고, 그의 유전자 붕괴는 리코펜-생산 칸디다 우틸리스의 염색체 상의 ERG9 유전자의 이중 교차 재조합 후에 유도되었다. 심마다 등은, ERG9 유전자의 붕괴가, 3-하이드록시 메틸글루타릴-CoA 리덕타제가 숙주의 염색체 상에 다중 복제된 리보솜 DNA 로커스 상에서 증폭되는 숙주로부터 특히 유도된 재조합 칸디다 우틸리스에 의한 카로틴-생산에 대한 긍정적인 효과를 제공하는 것으로 보고하였다.

반면, 이 전략은 기능이 필수적이고 붕괴가 숙주 유기체에 치명적인 유전자(예: 스쿠알렌 신타제 유전자)의 경우에 어려움을 갖는다. 상기 참고문헌(심마다 등)에서, 숙주 염색체 상의 2개의 복제 내의 스쿠알렌 신타제 유전자의 복제물 중 하나가 붕괴하였다. 이러한 구조에서, 스쿠알렌 신타제 활성의 감소 수준이 카로티노이드 경로 내로의 탄소 플럭스를 증가시키는데 충분하다는 것을 확인하지 못하였다.

이러한 경우, 다른 전략을 적용하여, 붕괴시키지 않고 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 그 중 하나는 스쿠알렌 신타제를 위한 발현이 감소한 돌연변이체를 스크리닝하기 위한 통상의 돌연변이이다. 이 방법에서, 적절한 리포터(reporter) 유전자가 숙주 유기체로부터의 스쿠알렌 신타제 유전자의 프로모터 영역에 융합된 적절한 재조합체가 돌연변이화되고, 리포터 유전자 생산물이 약한 활성을 나타내는 돌연변이체가 스크리닝될 수 있다. 이러한 돌연변이체에서, 스쿠알렌 신타제 활성의 발현은 프로모터 유전자 자체에 존재하는 돌연변이가 아니라, 스쿠알렌 신타제 유전자의 발현에 영향을 미치는 트랜스-작용 영역, 또는 리포터 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 돌연변이에 의해 감소한 것으로 예측된다. 리포터 융합의 프로모터 영역에서 발생하는 돌연변이의 경우, 이러한 돌연변이는 상응하는 영역의 서열에 의해 단리될 수 있다. 이렇게 단리된 돌연변이는 염색체 상의 스쿠알렌 신타제 유전자의 고유 프로모터와, 돌연변이된 프로모터 단편 사이의 재조합에 의해 파피아 로도지마로부터 유도된 여러 카로티노이드, 특히 아스타크산틴 생산 돌연변이체에 도입될 수 있다. 트랜스-작용 영역에서 발생하는 돌연변이를 제외하고, 돌연변이는 또한 프로모터 영역 내의 시스 요소의 생체 외 돌연변이에 의해 유도될 수 있다. 이 접근에서, 5'-말단에서의 관심 유전자로부터 유도된 프로모터 영역, 및 3'-말단에서의 관심 유전자로부터 유도된 종결자 영역에 융합된 리포터 유전자를 함유하는 유전자 카세트는, 돌연변이화된 후, 파피아 로도지마 내로 도입되다. 리포터 유전자의 활성의 차이를 검출함으로써, 효과적인 돌연변이가 스크리닝될 수 있다. 이러한 돌연변이는 생체 내 돌연변이 접근의 경우와 동일한 방법에 의해 염색체 상의 고유 프로모터 영역의 서열 내에 도입될 수 있다. 그러나, 이들 방법은 일부 시간-소모적인 공정을 갖는 일부 단점을 갖는다.

유전자 발현을 감소시키기 위한 다른 전략은 안티센스 방법이다. 이 방법은 종종 유성생식형(teleomorphic) 유기체(예: 파피아 로도지마)가 숙주 유기체로서 사용되는 경우에도 유전자 발현을 감소시키는데 사용되며, 여기서는 돌연변이 및 유전자 붕괴 방법이 통상적으로 적용되기 어렵다. 안티센스 방법은 인조 유전자 단편을 도입시킴으로써 해당 유전자의 발현을 감소시키는 방법이며, 그의 서열은 해당 유전자의 cDNA 단편에 상보적이다.

"안티센스" 핵산 분자는, 단백질을 코딩하는 "센스" 핵산 분자에 상보적인, 예컨대 이중가닥 cDNA 분자의 코딩 스트랜드에 상보적인 또는 mRNA 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산 분자는 센스 핵산 분자에 수소결합할 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 전체 스쿠알렌 신타제-코딩 스트랜드에 상보적이거나, 또는 그의 일부에만 상보적일 수 있다. 따라서, 안티센스 핵산 분자는 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 코딩 스트랜드의 "코딩 영역"에 안티센스일 수 있다. 용어 "코딩 영역"은 아미노산 잔기로 번역되는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 지칭한다. 또한, 안티센스 핵산 분자는 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 코딩 스트랜드의 "비코딩 영역"에 안티센스이다. 용어 "비코딩 영역"은 폴리펩타이드로 번역되지 않는 코딩 영역을 플랭킹하는 5' 및 3' 서열을 지칭한다(즉, 또한 5' 및 3' 비번역된 영역을 지칭한다).

본원에 개시된 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 코딩 스트랜드 서열이 제공되면, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 와트슨 앤드 크릭 염기 짝짓기 법칙(the rules of Watson and Crick base pairing)에 따라 디자인될 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 스쿠알렌 신타제 mRNA의 전체 코딩 영역에 상보적일 수 있지만, 또한 스쿠알렌 신타제 mRNA의 번역 시작 부위의 주위 영역에 상보적일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 예컨대 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 절차를 사용하는 효소적 결찰 반응 및 화학적 합성을 사용하여 구성될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 핵산 분자(예: 안티센스 올리고뉴클레오타이드)는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 또는 안티센스와 센스 핵산 사이에 형성된 중복 부위의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다양하게 개질된 뉴클레오타이드 또는 자연발생 뉴클레오타이드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다(예컨대, 포스포로싸이오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오타이드가 사용될 수 있다). 안티센스 핵산 분자를 생산시키는데 사용될 수 있는 개질된 뉴클레오타이드의 예로는, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복실하이드록시메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-싸이오류리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 다이하이드로우라실, 베타-D-갈락토실-위에오신, 이노신, N6-아이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸리노신, 2,2-다이메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-싸이오우라실, 베타-D-만노실퀴에오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸싸이오-N6-아이소페테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위뷰톡소신, 슈도우라실, 퀴에오신, 2-싸이오사이토신, 5-메틸-2-싸이오우라실, 2-싸이오우라실, 4-싸이오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스터, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-싸이오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, (acp3)w 및 2,6-다이아미노퓨린이 포함된다. 다르게는, 안티센스 핵산 분자는 폴리뉴클레오타이드가 안티센스 배향으로 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생산될 수 있다(즉, 삽입된 폴리뉴클레오타이드로부터 전사된 RNA는 아래에 추가로 기술되는 해당 표적 폴리뉴클레오타이드로의 안티센스 배향으로 존재할 것이다).

전형적으로 본 발명의 안티센스 핵산 분자는, 이들이 예컨대 전사 및/또는 번역을 억제시킴으로써 세포 mRNA 및/또는 스쿠알렌 신타제를 코딩하는 게놈 DNA로 하이브리드화되거나 또는 이들에 결합하여 단백질의 발현을 억제시키도록, 세포에 투여되거나 또는 동일 반응계에서 생산된다. 하이브리드화는, 안정한 중복 부위를 형성하는 통상적인 뉴클레오타이드의 상보성에 의한 것이거나, 예컨대 DNA 중복 부위에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에는 이중 헬릭스(helix)의 주요 그루브(groove)에서의 특정 상호작용을 통한 것일 수 있다. 안티센스 분자는 예컨대 안티센스 핵산 분자를 펩타이드 또는 항체(이는 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합한다)에 연결시킴으로써, 선택된 세포 표면 상에서 발현된 항원 또는 수용체에 특이적으로 결합하도록 개질될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산 분자는 본원에 기술된 벡터를 사용하여 세포로 전달될 수 있다. 안티센스 분자의 세포 내 충분한 농도를 달성하기 위해, 안티센스 핵산 분자가, 강한 원핵생물, 바이러스, 진핵 생물(이는 식물을 포함한다) 프로모터의 제어 하에 놓이는 벡터 구조가 바람직하다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머(anomeric) 핵산 분자일 수 있다. α-아노머 핵산 분자는, 통상적인 β-단위와 달리, 가닥들이 서로 평행하게 진행하는 상보적 RNA를 갖는 특이적 이중가닥 하이브리드를 형성한다. 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-o-메틸리보뉴클레오타이드 또는 키메라(chimeric) RNA-DNA 유사체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 리보자임(ribozyme)일 수 있다. 리보자임은 상보적 영역을 갖는 단일나선 핵산(예: mRNA)을 분할시킬 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임(예컨대, 해머헤드(hammerhead) 리보자임)은 스쿠알렌 신타제 mRNA 전사체를 촉매적으로 분할하여 mRNA의 번역을 억제하는데 사용될 수 있다. 스쿠알렌 신타제-코딩 핵산 분자에 특이적인 리보자임은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열에 기초하여 디자인될 수 있다. 예를 들면, 테트라하이메나(Tetrahymena) L-19 IVS RNA의 유도체는 활성 부위의 뉴클레오타이드 서열이 코딩 mRNA에서 분할되는 뉴클레오타이드 서열에 상보적이도록 구성될 수 있다(미국 특허 제 4,987,071 호 및 미국 특허 제 5,116,742 호). 다르게는, 스쿠알렌 신타제 mRNA는 RNA 분자의 풀로부터 특이적 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA를 선택하는데 사용될 수 있다.

파피아 로도지마로부터의 카로티노이드 중복생산 균주를 구성하는 안티센스 방법의 적용은 EP 1,158,051 호에 예시되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내에 유도하는 것을 포함하는 재조합 숙주 세포의 생산방법에 관한 것이다.

벡터 DNA는 통상의 핵산전달감염(transfection) 또는 형질전환 기술을 통해 원핵생물 또는 진핵생물 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산전달감염", "형질전환", 접합(conjugation) 및 형질도입은, 인산칼슘 또는 염화 칼슘 동시-침전, DEAE-덱스트란-매개된 핵산전달감염, 지질감염(lipofection), 자연 경쟁(natural competence), 화학물질-매개된 전달 또는 전기천공(electroporation)과 같이 외래의(foreign) 핵산(예: DNA)을 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 다양한 당해-인식된 기술을 지칭하는 것이다. 식물 세포를 비롯한 숙주 세포를 형질전환 또는 핵산전달감염시키는 적합한 방법이 숙련자에게 알려져 있다.

포유동물 세포의 안정한 핵산전달감염에서, 사용된 발현 벡터 및 핵산전달감염 기술에 따라 단지 작은 분획의 세포만이 외래의 DNA를 그들의 게놈 내로 통합시킬 수 있음이 공지되어 있다. 이들 통합체를 규정하고 선택하기 위해, 선택가능한 마커를 코딩하는(예컨대, 항생제에 대해 내성을 갖는) 유전자는 일반적으로 해당 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 바람직한 선택가능한 마커는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 것들을 포함한다. 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산은, 본 발명의 폴립펩타이드를 코딩하는 것과 동일한 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입되거나, 또는 별도의 벡터 상에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안전하게 핵산전달감염된 세포는 예컨대 약물 선택에 의해 확인될 수 있다(예컨대, 선택가능한 마커 유전자가 혼입된 세포는 잔존할 것이지만, 기타 세포는 죽는다).

상동의 재조합 미생물을 생산시키기 위해, 치환, 첨가 또는 삭제가 도입되어 스쿠알렌 신타제 유전자가 변형된, 예컨대 작용적으로 붕괴된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부를 함유하는 벡터가 생산된다. 바람직하게는, 이 스쿠알렌 신타제 유전자는 파피아 로도지마 스쿠알렌 신타제 유전자이지만, 이는 관련 공급원 또는 상이한 공급원과 상동적일 수 있다. 다르게는, 벡터는, 상동적 재조합에 따라, 내인성 스쿠알렌 신타제 유전자가 돌연변이화되거나 또는 달리 변형되지만, 여전히 작용적 단백질을 코딩하도록 디자인될 수 있다(예컨대, 업스트림 조절 영역은 내인성 스쿠알렌 신타제의 발현을 변형시키도록 변형될 수 있다). 상동적 재조합을 통한 점 돌연변이(point mutation)를 생산하기 위해, 또한 키메라성형체(chimeraplast)로서 공지된 DNA-RNA 하이브리드가 사용될 수 있다.

벡터가 세포 내에 도입되고, 도입된 폴리뉴클레오타이드 유전자가 내인성 스쿠알렌 신타제 유전자와 상동적으로 재조합된 세포가 당해 공지된 기술을 사용하여 선택된다.

또한, 도입된 유전자의 조절된 발현을 위해 허용된 선택 시스템을 함유하는 숙주 세포가 생산될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 함유물을 lac 오페론의 제어 하에 벡터 상에 위치시키는 것은, 단지 IPTG의 존재 하에서만 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용한다. 이러한 조절 시스템은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.

바람직하게는, 도입된 핵산 분자는 숙주 세포에 외래적이다.

"외래적"이란 핵산 분자가 숙주 세포와 이종적인 것을 의미하거나, 다른 게놈 환경에서의 세포 또는 유기체로부터 유도된 것을 의미하거나, 또는 숙주 세포와 상동적이지만 상기 핵산 분자의 자연발생 대응부분이 아닌 다른 게놈 환경에 존재하는 것이다. 이는, 핵산 분자가 숙주 세포에 대해 상동적이면, 이것이 상기 숙주 세포의 게놈 내의 원래 위치에 존재하지 않으며, 특히 이것이 다른 유전자들에 의해 둘러쌓임을 의미한다. 핵산 분자는 자신의 프로모터의 제어 하에 놓이거나 또는 이종의 프로모터의 제어 하에 존재할 수 있다. 숙주 세포 내에 존재하는 본 발명에 따른 벡터 또는 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈 내에 통합되거나, 또는 염색체 외에서 특정 형태로 유지될 수 있다. 이 면에서, 또한 본 발명의 핵산 분자는 상동적 재조합을 통해 돌연변이체 유전자를 복구 또는 생산시키는데 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터로 유전자-조작된 숙주 세포에 관한 것이다.

용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 후손(progeny) 또는 잠재적 후손에 관한 것으로 이해된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인한 후속 세대에서의 특정 변형이 가능하기 때문에, 이러한 후손은 사실상 모 세포와 동일할 수 없지만, 여전히 본원에서 사용된 용어의 범위 내에 포함된다.

예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 곤충 세포, 진균 세포 또는 포유동물 세포(예컨대, 중국산 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 COS 세포), 조류, 섬모충, 식물 세포, 진균 또는 다른 미생물(예: E. coli) 뿐만 아니라 박테리아 세포 내에 도입될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당해 분야의 숙련자에게 공지된다. E. coli, 바쿨로바이러스, 아그로박테리움 또는 진균 세포가 바람직하다. 예를 들면, 사카로마이세스 속, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아애 또는 파피아 로도지마 종(Xanthophylomyces dendrorhous)의 세포가 바람직하다.

또한, 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 진균 세포의 게놈 내로의 도입을 포함하는 진균 형질전환체의 생산방법에 관한 것이다.

식물 세포에서 센스 또는 안티센스 배향으로 본 발명에 따른 핵산 분자의 발현에서, 상기 분자는 진균 세포에서의 발현을 보장하는 조절 요소의 제어 하에 위치된다. 이들 조절 요소는 발현되는 핵산 분자 및 형질전환되는 진균 종에 대해 이종적이거나 상동적일 수 있다.

일반적으로, 이러한 조절 요소는 진균 세포 내의 프로모터 활성을 포함한다. 진균 세포 내의 구성적 발현을 수득하기 위해, 바람직하게는 파피아 로도지마로부터의 글라세르알데히드-3-데하이드로게나제 프로모터와 같은 구성 프로모터가 사용된다(WO 97/23,633 호). 유도가능한 프로모터는 발현을 정확하게 제어할 수 있도록 사용될 수 있다. 유도가능한 프로모터의 예로는 열 쇼크 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터가 있다. 또한, 이러한 유도가능한 프로모터의 후보인 아밀라제 유전자 프로모터가 기술되어 있다(EP 1,035,206 호). 조절 요소는 진균 세포 내에 전사 및/또는 번역 증강인자를 추가로 포함할 수 있다. 더욱이, 조절 요소는 안정성을 개선시킬 수 있는 전사체에 폴리-A 테일을 첨가하게 되는 전사 종결 신호(예: 폴리-A 신호)를 포함할 수 있다.

외래적인 DNA를 진균 세포 내에 도입시키는 방법이 또한 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 이들은 예컨대 LiCl 방법을 사용한 형질전환, 원형질체의 융합, 전기천공, 바이오리스틱 방법(biolistic method)(예컨대, 입자 충격요법(particle bombardment)), 및 당해 분야에 공지된 다른 방법을 포함한다. 적절한 벡터의 생산방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 바이오리스틱 방법을 사용하는 형질전환 방법은 당해 분야의 숙련자에게 잘 공지되어 있다.

본원에 사용되는 용어 "형질전환"은 전달에 사용되는 방법에 상관없이 외인성 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 내로의 전달을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내로 일시적으로 또는 안정적으로 도입될 수 있으며, 비통합된 것으로 예컨대 플라스미드 또는 키메라 링크로서 유지되거나, 또는 다르게는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따라 변형될 수 있고 본 발명에 따라 단백질의 과발현 또는 이러한 단백질의 합성을 감소시키는 진균은, 임의의 목적하는 진균 종으로 부터 유도될 수 있다.

또한, 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따라 수득가능한 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 진균 세포에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 또한 진균 세포의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하는 조절 요소에 연결되는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드(이는 형질전환된 진균 세포에 외래적이다)를 함유하는(바람직하게는 게놈 내로 안정하게 통합되는) 유전자이전(transgenic) 진균 세포에 관한 것이다. 용어 "외래적"에 대해서는 앞서 설명한 내용을 참고한다.

형질전환된 진균 세포 내의 폴리뉴클레오타이드의 존재 및 발현은 스쿠알렌의 합성을 조정하고, 바람직하게는 감소시키며, 카로티노이드 생산, 특히 앞서 수득된 형질전환된 진균 세포, 바람직하게는 파피아 로도지마 세포 내의 아스타크산틴 생산의 증가를 초래한다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따라 형질전환된 진균 세포에 관한 것이다.

따라서, 스쿠알렌 신타제의 변형된 발현으로 인해, 세포 대사 경로는 생산량, 및/또는 생산 효율에서 조정된다.

용어 "생산" 또는 "생산성"은 당해 분야에 인지되어 있으며, 소정의 시간 및 소정의 발효 부피 내에서 형성된 발효 생산물(예컨대, 지방산, 카로티노이드, (폴리)사카라이드, 바이타민, 아이소프레노이드, 지질, 왁스 에스터, 및/또는 중합체, 예컨대 폴리하이드록시알카노에이트 및/또는 그의 대사 생산물, 또는 본원에 언급 된 추가의 목적 미세 화학물질)의 농도를 포함한다(예컨대 생산물(㎏)/시/ℓ).

용어 생산물의 "효율"은 달성되는 특정 생산 수준에 요구되는 시간(예컨대, 특히 카로티노이드, (폴리)사카라이드, 지질, 바이타민, 아이소프레노이트 등으로의 앞서 변형된 수율의 생산량의 특정 비율을 획득하는데 있어서의 세포에서의 기간)을 포함한다.

용어 "수율" 또는 "생산/탄소 수율"은 당해 분야에 인지되어 있으며, 탄소 공급원의 생산물(즉, 아세틸 CoA, 지방산, 카로티노이드, 바이타민, 아이소프레노이드, 지질 등, 및/또는 앞서 정의된 바와 같고 생합성이 상기 생산물에 기초하는 추가의 화합물)로의 변환의 효율을 포함한다. 이는 일반적으로 예컨대 탄소 공급원(㎏)당 생산물(㎏)로서 기록된다. 화합물의 수율 또는 생산이 증가하면, 소정 시간에 걸쳐 소정 양의 배지 내의 화합물의 유용한 회수된 분자의 양, 또는 회수된 분자의 양이 증가된다.

용어 "생합성"(세포, 조직, 식물 등에서 "생물학적 생산물"의 합성"과 동의어로 사용됨) 또는 "생합성 경로"는 당해 분야에 인지되어 있고, 세포에 의해 중간체 화합물로부터 화합물의 합성, 바람직하게는 유기 화합물의 합성을 포함하며, 이는 다단계 및 매우 규칙적인 공정일 수 있다.

용어 "대사"는 당해 분야에 공지되어 있으며, 유기체에서 발생하는 생화학적 반응 전체를 포함한다. 특정 화합물의 대사(예컨대, 아세틸 CoA, 지방산, 헥소스, 지질, 아이소프레노이드, 바이타민, 카로티노이드 등의 대사)는 상기 화합물과 관련된 세포에서의 전체 생합성, 변형 및 분해 경로를 포함한다.

이러한 유전자-조작된 파피아 로도지마는 적절한 배지에서 배양되며, 카로티노이드, 특히 아스타크산틴의 생산성 또는/및 수율에 대해 평가된다. 이렇게 선택된 아스타크산틴의 하이퍼(hyper) 생산자에서, 그의 생산성과 상기 유전자-조작 방법에 의해 도입된 유전자 또는 단백질 발현 수준 사이의 관계를 확인할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명된다.

다음의 물질 및 방법을 하기 실시예에 사용하였다.

균주

파피아 로도지마 ATCC96594(이 균주는 1998년 4월 8일자로 부다페스트 조약에 의거하여 수탁번호 ATCC 74438 호로서 재기탁되었다).

E. coli DH5α: F^-, φ80d, lacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, hsd(r_K ^-, mK⁺), recA1, endA1, deoR, thi-1, supE44, gyrA96, relA1(일본 오사카 소재의 도요보(Toyobo))

E. coli XL1 MRA (P2): Δ(mcrA)183, Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, supE44, thi-1, gyrA96, relA1, lac (P2 lysogen)(미국 라 졸라 소재의 스트래타진)

벡터

XDASHII(스트래타진)

pBluescriptII KS-(스트래타진)

pMOSBIue T-vector(영국 버킹검 소재의 아머샴(Amersham))

배지

파피아 로도지마 균주는 YPD 배지(디프코(DIFCO) 제품)에서 통상적으로 보존한다. E. coli 균주는 LB 배지(1ℓ당 10g 박토-트립톤(Bacto-trypton), 5g 효모 추출물(디프코 제품) 및 5g NaCl)에서 보존배양한다. NZY 배지(1ℓ당 5g NaCl, 2g MgSO₄-7H₂O, 5g 효모 추출물(디프코 제품) 및 10g NZ 아민형 A(쉐필드(Sheffield) 제품))는 연질 한천(0.7% 한천(와코(WAKO) 제품))에서 λ 파아지를 증식시키는데 사용한다. 한천 배지를 생산할 때는, 1.5%의 한천(와코 제품)을 보충하였다.

방법

제한 효소 및 T4 DNA 리가제는 다카라 슈조(Takara Shuzo)(일본 오츠 소재)로부터 구입하였다.

퀴아진(QIAGEN) 게노믹(genomic) 키트(퀴아진 제품)를 사용하여 제조업자가 제공한 프로토콜에 따라 파피아 로도지마로부터 염색체 DNA를 분리하였다. 자동 DNA 분리 시스템(PI-50, 일본 오사카 소재의 구라보 캄파니 리미티드(Kurabo, Co. Ltd.) 제품)으로 형질전환된 E. coli로부터 플라스미드 DNA를 미니-프렙하였다(mini-prep). 형질전환된 E. coli로부터 플라스미드 DNA의 미디-프렙(midi-prep)은 퀴아진 칼럼(퀴아진 제품)을 사용하여 행하였다. λDNA의 분리는 위저드(Wizard) λ 프렙 DNA 정제 시스템(프로메가(Promega) 제품)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 행하였다. DNA 단편을 분리하고 퀴아퀵(QIAquick) 또는 퀴아엑스(QIAEX) II(퀴아진 제품)를 사용하여 아가로스(agarose)로부터 정제하였다. λ 파아지 유도체는 제조업자(스트래타진)의 프로토콜에 따라 조작하였다.

이소진(Isogen)(일본 도야마 소재의 닛폰 진(Nippon Gene))을 사용하는 페놀 방법에 의해 파피아 로도지마로부터 전체 RNA를 분리하였다. 이렇게 수득된 전체 mRNA로부터 mRNA 분리 키트(클론테크 제품)를 사용하여 mRNA를 정제하였다. 캡파인더(CapFinder) cDNA 구성 키트(클론테크 제품)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.

생체 외 팩키징(packaging)은 지가팩 III 골드 팩키징 익스트렉트(Gigapack III Gold packaging extract)(스트래타진 제품)를 사용하여 행하였다.

중합효소 연쇄 반응(PCR)은 퍼킨 엘머 모델(Perkin Elmer model) 2400에서 열 순환기(thermal cycler)로 행하였다. 각 PCR 조건은 하기 실시예에 기술된다. PCR 프라이머는 판매상에게서 구입하거나, DNA 합성기(모델 392, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 제품)로 합성하였다. DNA 서열 분석을 위한 형광 DNA 프라이머는 파마시아로부터 구입하였다. DNA 서열 분석은 자동 형광 DNA 서열 분석기(알프레드, 파마시아 제품)로 행하였다.

DH5α의 컴피턴트(competent) 세포는 도요보(일본)로부터 구입하였다.

실시예 1: 파피아 로도지마로부터 mRNA의 분리 및 cDNA 라이브러리의 구성

파피아 로도지마의 cDNA 라이브러리를 구성하기 위해서, 세포를 파괴한 직후 전체 RNA를 페놀 추출 방법으로 분리하고, 파피아 로도지마 ATCC96594 균주의 mRNA를 mRNA 분리 키트(클론테크 제품)를 사용하여 정제하였다.

우선, YPD 배지에서 이틀간 배양한 10㎖의 배양액으로부터 ATCC96594의 균주 세포를 원심분리(1500×g에서 10분간)하여 회수하고, 추출용 완충액(0.7M KCl을 포함하는 10mM Na-시트레이트/HCl(pH 6.2))으로 1회 세척하였다. 2.5㎖의 추출용 완충액에 현탁시킨 후, 세포를 프렌치 프레스(French press) 균질화기(일본 도쿄 소재의 오타케 웍스 코포레이션(Ohtake Works Corp.) 제품)로 1500㎏f/㎠에서 파괴하고, 즉시 제조업자에게서 지시한 방법에 따라 2배 용적의 이소진(닛폰 진 제품)과 혼합하였다. 이 단계에서, 400㎍의 전체 RNA가 회수되었다.

그 다음, 회수된 전체 RNA를 mRNA 분리 키트(클론테크 제품)를 사용하여 제조업자에게서 지시한 방법에 따라 정제하였다. 최종적으로, 파피아 로도지마 ATCC96594로부터 16㎍의 mRNA가 수득되었다.

cDNA 라이브러리를 구성하기 위해서, 캡파인더 PCR cDNA 구성 키트(클론테크 제품)를 제조업자에게서 지시한 방법에 따라 사용하였다. 1㎍의 정제된 mRNA를 처음의 스트랜드 합성에 적용하고, 이어서 PCR 증폭시켰다. PCR에 의한 증폭 후에, 1㎎의 cDNA 풀이 수득되었다.

실시예 2: 파피아 로도지마로부터 부분 SQS 유전자의 클로닝

파피아 로도지마로부터 부분 SQS 유전자를 클로닝하기 위해, 변형 PCR 방법 을 사용하였다.

Ustilago maydis Q92459 (SwissProt)

Schizosaccharomyces pombe P36596 (SwissProt)

Saccharomyces cerevisiae M63979 (GenBank)

Rattus norvegicus Q02769 (SwissProt)

Mus musculus P53798 (SwissProt)

Candida albicans P78589 (SwissProt)

Homo sapiens 138245 (Pir)

Arabidopsis thaliana U79159, AF004396

Leishmania major U30455

Glycyrrhiza glabra D86410

2가지 혼합된 프라이머의 뉴클레오타이드 서열은, 다른 종에서 공지된 스쿠알렌 신타제 유전자의 통상의 서열, 즉 squ1(센스 프라이머)(서열번호 4), squ4(안티센스 프라이머)(서열번호 5) 및 squ5(안티센스 프라이머)(서열번호 6)(서열에서, "n"은 뉴클레오타이드 a, c, g 또는 t를 의미하고, "r"은 뉴클레오타이드 a 또는 g를 의미하고, "y"는 뉴클레오타이드 c 또는 t를 의미한다)에 기초하여 디자인하고 합성하였다.

DNA 중합효소로서 ext.(다카라 슈조 제품)를 사용하고 주형으로서 실시예 1에서 수득한 cDNA 풀을 사용하여 95℃에서 30초간, 45℃에서 30초간 및 72℃에서 15초간의 1주기를 25회 행하는 PCR 반응 후에, 반응 혼합물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. 목표 길이를 갖는 PCR 밴드를, squ1과 squ4, squ1과 squ5의 조합을 사용하여 PCR 반응 혼합물로부터 회수하고, 퀴아퀵(QIAquick)(퀴아진 제품)에 의해 제조업자의 방법에 따라 정제한 다음, pMOSBlue T-벡터(아머샴 제품)에 연결하였다. 이 벡터로 컴피턴트 E. coli DH5α 균주를 형질전환시킨 후, 6개의 백색 콜로니를 선택하고 플라스미드를 자동 DNA 분리 시스템으로 분리하였다. 서열을 분석한 결과, 3개의 클론이 공지된 스쿠알렌 신타제 유전자와 유사한 추론된 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다. 이들 단리된 cDNA 클론에서, squ1과 squ5를 사용하여 PCR 반응 혼합물로부터 회수된 pSQS1007로서 표기하고, squ1과 squ4를 사용하여 PCR 반응 혼합물로부터 회수된 pSQS1006으로서 표기하고, 이후 스크리닝 연구에서 pSQS1006을 사용하였다.

실시예 3: 파피아 로도지마로부터 게놈 DNA의 분리

파피아 로도지마로부터 게놈 DNA를 분리하기 위해, 퀴아진 게노믹 키트를 제조업자에게서 지시한 방법에 따라 사용하였다.

우선, YPD 배지에서 하룻밤 동안 배양한 100㎖의 배양액으로부터 파피아 로도지마 ATCC96594 세포를 원심분리(1500×g에서 10분간)하여 회수하고, TE 완충액(1mM EDTA를 포함하는 10mM Tris/HCl(pH 8.0))으로 1회 세척하였다. 8㎖의 퀴아진 게노믹 키트의 Y1 완충액에 현탁시킨 후, 용해효소(미국 세인트 루이스 소재의 시그마(SIGMA) 제품)를 2㎎/㎖의 농도로 첨가하여 효소 분해에 의해 세포를 파괴하고, 반응 혼합물을 30℃에서 90분간 항온처리한 후, 추출 단계로 진행시켰다. 최 종적으로 20㎍의 게놈 DNA가 수득되었다.

실시예 4: 프로브로 pSQS1006을 사용하는 서던 블롯 하이브리드화

파피아 로도지마로부터 SQS 유전자를 포함하는 게놈 단편을 클로닝하기 위해, 서던 블롯 하이브리드화를 행하였다. 2㎍의 게놈 DNA를 EcoRI으로 분해하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분석한 다음, 이어서 산 처리 및 알칼리 처리를 행하였다. 변성된 DNA를 트랜스블롯(transblot)(일본 도쿄 소재의 조토 리카(Joto Rika) 제품)을 사용하여 1시간 동안 나일론 멤브레인(membrane)(하이본드(Hybond) N+, 아머샴 제품)에 옮겼다. 나일론 멤브레인으로 옮겨진 DNA를 열 처리(80℃에서 90분)하여 고정시켰다. 주형 DNA(EcoRI로 분해된 pSQS1006)를 DIG 다중주입식 방법(뵈링거 만하임)으로 표지하여 프로브를 제조하였다. 하이브리드화는 제조업자에게서 지시한 방법으로 행하였다. 그 결과, 9.0 내지 23.0 킬로베이스(kilobase, kb) 범위에서 하이브리드화 밴드가 나타났다.

실시예 5: SQS 유전자를 포함하는 게놈 단편의 클로닝

4㎍의 게놈 DNA를 EcoRI으로 분해하고 아가로스 겔 전기영동하였다. 그 다음, 길이가 9.0 내지 20.0kb 범위내인 DNA를 퀴아엑스 II 겔 추출 키트(퀴아진 제품)에 의해 제조업자에게서 지시한 방법에 따라 회수하였다. 정제된 DNA를 16℃에서 하룻밤 동안 0.5㎍의, EcoRI-분해되고 CIAP(송아지의 장내 알칼리 포스파타제)-처리된 λDASHII(스트래타진 제품)에 연결시키고, 지가팩 III 골드 팩키징 익스트랙트(스트래타진 제품)로 팩키징하였다. 팩키징된 추출물로 E. coli MRA(P2) 균주를 감염시키고, LB 한천 배지 위에 NZY 배지를 부어 덮었다. 프로브로서 EcoRI로 분해된 pSQS1006을 사용하여 약 5000개의 플라크를 스크리닝하였다. 5개의 플라크가 표지된 프로브에 하이브리드화되었다.

파피아 로도지마로부터 추정상의 SQS 유전자를 함유하는 상기 λDASH II 유도체는 위저드(Wizard) 람다 예비 DNA 정제 시스템(프로메가)을 이용하여 제조하였다. 그 다음, 주형으로서 상기 λDASH II 유도체를 사용하고 프라이머로서 2개의 프라이머, squ9와 squ10을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이들 squ9와 squ10 프라이머를 pSQS1006: squ9(센스 프라이머)(서열번호 7) 및 squ10(안티센스 프라이머)(서열번호 8)의 내부 서열에 기초하여 디자인하였다.

실시예 2에서 기술한 바와 동일한 PCR 조건하에서 PCR을 수행한 결과, 예상한 0.5 kb 밴드가 형성되었다. 상기 λDASH II 유도체 모두는 파피아 로도지마로부터 추정상의 SQS 유전자를 함유할 수 있음이 시사되었다. 상기 λDASH II 유도체 중의 20.0 kb의 삽입 EcoRI 단편을 키아퀵(퀴아젠)을 사용하여 정제하고, 숙주 균주로서 DH5α를 이용하여 pBluescriptII KS-벡터(스트래타진)에 서브클로닝시켜 pSQS1229를 수득하였다.

실시예 6. SQS 유전자를 함유하는 게놈성 단편의 서열화

오토리드(AutoRead) 서열화 키트(파마시아)를 사용하는 프라이머 워킹(walking) 절차로 pSQS1229를 서열화였다.

서열 분석 결과, 프로모터(1549bp) 및 종결자(836bp)를 함유하는 파피아 로도지마로부터의 SQS 유전자를 함유하는 게놈 단편의 4807개 염기 쌍을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 결정되었다(서열번호 1).

코딩 영역은 9개 엑손과 8개 인트론으로 구성된 2422개 염기 쌍에 존재하였다. 인트론은 모두 5' 또는 3' 바이어스(bias) 없이 코딩 영역 전체에 분산되었다. 유전학적 분석 소프트웨어인, 제네틱스(GENETYX)-SV/RC(소프트웨어 디벨롭먼트 캄파니, 리미티드(Software Development Co., Ltd.), 일본 도쿄 소재) 소프트웨어에 의해, 개방 판독 프레임(서열번호 2)이, 그 서열이 다른 종으로부터의 대체 옥시다제의 공지된 아미노산 서열과 현저하게 유사한(아스퍼질러스 니거로부터의 대체 옥시다제에 대해 51.5% 일치) 512개 아미노산(서열번호 3)으로 이루어짐을 밝혀내었다.

실시예 7. SQS 유전자에 대한 안티센스 플라스미드의 구성

SQS 유전자에 대한 전체 구조 유전자를 포함하는 안티센스 유전자 단편을 PCR 방법으로 증폭시킨 다음, 안티센스 SQS 유전자가 파피아 로도지마에서 SQS 프로모터에 의해 전사되는 통합 벡터에 클로닝하였다.

이러한 프라이머는 제한 효소, SfiI에 대한 비대칭 인식 서열(GGCCNNNNNGGCC)을 갖지만, 그의 비대칭 잔존 서열은 상이하도록 디자인되었다. 이것은 그의 접합 서열에서 동일한 비대칭 서열을 갖는 발현 벡터로의 지향성 클로닝을 가능하게 할 수 있다. 이러한 구성의 사용은 EP 1,158,051 호에 예시되어 있 다.

안티센스 SQS 유전자의 전사를 유도할 수 있는 프로모터 및 종결자 단편에서, SQS 프로모터 및 종결자는 서열번호 1에 나열된 서열 정보를 사용하여 염색체로부터 클로닝한다.

다음으로, pG418Sa330(EP 1 035 206 호)의 G418 내성 카세트에 대한 SQS 종결자를 함유하는 DNA 단편을, 적절한 벡터(예컨대, pBluescriptII KS-(스트래타진(Stratagene)))에 접합시켜 SQS 종결자 단편을 G418 내성 카세트에 융합시켰다.

이어서, 리보좀 DNA(rDNA) 위치를 함유하는 3.1 kb의 SacI 단편(웨리(Wery) 등의 문헌[Gene, 184, 89-97, 1997]을 pUAST418의 G418 카세트의 다운스트림에 삽입하였다. rDNA 단편은 진핵생물의 염색체 상의 다중복제물에 존재한다. rDNA 단편을 통한 통합은 사용된 숙주의 염색체 상으로의 다중복제 통합을 야기하고, 이것은 발현 벡터에 존재하는 외래 유전자의 과발현을 가능하게 한다.

이어서, SQS 프로모터를 SQS 종결자의 업스트림에 삽입하여 파피아 로도지마에서 작용하는 발현 벡터를 구축하였다.

최종적으로, 파피아 로도지마에서 작용하는 앞서 제조된 발현 벡터 내에 안티센스 SQS를 함유하는 1.5kb의 SfiI 단편을 삽입하여 안티센스 SQS 구성을 완성하였다. 유사한 플라스미드 구성인 EP 1,158,051 호에 예시되어 있다.

실시예 8. SQS -안티센스 벡터에 의한 파피아 로도지마의 형질전환

EP 1,158,051 호에 기술된 프로토콜에 따라 바이오리스틱 형질전환에 의해, SQS-안티센스 벡터를 파피아 로도지마 야생형 균주, ATCC96594에 형질전환시켰다.

실시예 9. 파피아 로도지마의 안티센스 SQS 재조합체의 특성화

파피아 로도지마의 안티센스 SQS 재조합체, ATCC96594를, 20℃에서 3일간 시험관(21㎜ 직경)에서 10㎖의 YPD 배지에서 성장시킨 그의 종균 배양물을 사용하여, 20℃에서 3일간 500㎖ 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 50㎖의 YPD 배지 중에서 배양하였다. 생산된 카로티노이드의 분석을 위해, 적절한 부피의 배양액을 꺼내어 그의 성장, 카로티노이드(특히 아스타잔틴)의 생산성에 대한 분석을 위해 사용하였다. 성장에 대한 분석을 위해, UV-1200 광도계(시마주 코포레이션(Shimadzu Corp.), 일본 교토 소재)를 사용하여, 660nm에서의 흡광도를 측정하는 것 이외에, 100℃에서 1일간 미세원심분리한 후, 1㎖의 배양액으로부터 유도된 세포를 건조시켜 그의 건조된 세포 무게를 측정하였다.

아스타잔틴 함량 및 전체 카로티노이드의 함량 분석을 위해, 세포를 미세원심분리 후 1.0㎖의 배양액으로부터 수거하고, 유리 비드로 파쇄시켜 파피아 로도지마 세포로부터 카로티노이드를 추출하는데 사용하였다. 추출 후에, 파쇄된 세포를 원심분리에 의해 제거하고 생성물을 HPLC를 사용하여 카로티노이드 함량에 대해 분석하였다. 이용된 HPLC 조건은 다음과 같았다:

HPLC 컬럼: 크롬팩 리크로졸브 시-60(Chrompack Lichrosorb si-60)(4.6㎜, 250㎜)

온도: 실온

용출액: 아세톤/헥세인(18/82)을 용출제에 1㎖/ℓ로 물 첨가

주입 부피: 10㎕

유량: 2.0 ㎖/분

검출: 450nm에서의 UV.

기준 샘플은 에프. 호프만-라 로슈 아게(F. Hoffmann-La Roche AG)(스위스 바젤 소재)(특히 아스타크산틴) 또는 다른 상업적 공급업자(WAKO, SIGMA 등)에서 입수하였다.

<110> DSM IP ASSETS B.V. <120> SQS gene <130> NDR5218 <140> PCT/EP03/10573 <141> 2003-09-23 <150> EP 02021619.8 <151> 2002-09-27 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 4807 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <221> 5'UTR <222> (1469)..(1470) <220> <221> exon <222> (1550)..(1577) <220> <221> Intron <222> (1578)..(1752) <220> <221> exon <222> (1753)..(1766) <220> <221> Intron <222> (1767)..(1882) <220> <221> exon <222> (1883)..(2071) <220> <221> Intron <222> (2072)..(2182) <220> <221> exon <222> (2183)..(2397) <220> <221> Intron <222> (2398)..(2474) <220> <221> exon <222> (2475)..(3087) <220> <221> Intron <222> (3088)..(3230) <220> <221> exon <222> (3231)..(3356) <220> <221> Intron <222> (3357)..(3453) <220> <221> exon <222> (3454)..(3475) <220> <221> Intron <222> (3476)..(3564) <220> <221> exon <222> (3565)..(3881) <220> <221> Intron <222> (3882)..(3958) <220> <221> exon <222> (3959)..(3970) <220> <221> polyA_site <222> (4106)..(4107) <400> 1 gttcctgttc agtcaaagag 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Gly Ser Met Trp Val Leu Ser Ala Met Thr Leu Asp Ala Ile Thr 285 290 295 cat act acc gac gca ctg gac tac ctc tca ctt cta aag aac cag agt 2970 His Thr Thr Asp Ala Leu Asp Tyr Leu Ser Leu Leu Lys Asn Gln Ser 300 305 310 gtt ttc aac ttt tgt gct atc ccg gct gtc atg tcg att gca acg ttg 3018 Val Phe Asn Phe Cys Ala Ile Pro Ala Val Met Ser Ile Ala Thr Leu 315 320 325 330 gag cta tgc ttc atg aac cca gcg gtg ttc caa cga aac ata aaa atc 3066 Glu Leu Cys Phe Met Asn Pro Ala Val Phe Gln Arg Asn Ile Lys Ile 335 340 345 aga aag gga gaa gcc gtc gag gtgcgttcgc gcgttctgtt tctacctttc 3117 Arg Lys Gly Glu Ala Val Glu 350 ataacattgg aggttcttga ctcttaagcg tcttccaatc tgatgcctcc aattatcatc 3177 atttttgtct tttttgcttt cctcttgttt cttttcggcg tgattcaatc cag ctc 3233 Leu att atg aag tgc aac aac cct cgg gag gtg gca tac atg ttt aga gat 3281 Ile Met Lys Cys Asn Asn Pro Arg Glu Val Ala Tyr Met Phe Arg Asp 355 360 365 370 tat gct cga aag att cat gcc aag gct att cct aca gat cct aac ttc 3329 Tyr Ala Arg Lys Ile His Ala Lys Ala Ile Pro Thr Asp Pro Asn Phe 375 380 385 atc aag ttg agc gtt gcg tgt ggt cga gtgagttgat cgatcgatcc 3376 Ile Lys Leu Ser Val Ala Cys Gly Arg 390 395 atcttttgtt ttgatcatcg cgagacttga ctgatcgatt actcaaaaca tcatcgcttc 3436 tccttcttgc tctctag atc gaa caa tgg gct gag cac t gtatgttcct 3485 Ile Glu Gln Trp Ala Glu His 400 ccgcccctcc ttcaagtttc ctctcgcttc atctttgttg agaagaggga tctgatgtat 3545 ctttctttgt tcggatcag ac tac ccc tca ttt atg atg att cgg cct tcg 3596 Tyr Tyr Pro Ser Phe Met Met Ile Arg Pro Ser 405 410 aat gac cct caa aac ccc gca ccc tca acg gcg ctt gac cct ttc tca 3644 Asn Asp Pro Gln Asn Pro Ala Pro Ser Thr Ala Leu Asp Pro Phe Ser 415 420 425 gga gac gct cgt tta agg ata gcc tct aag aag gct gag atc acc gcc 3692 Gly Asp Ala Arg Leu Arg Ile Ala Ser Lys Lys Ala Glu Ile Thr Ala 430 435 440 445 gct gct ctt gtc agg aag aaa gcc cgg gat cac gct aag tgg aga gag 3740 Ala Ala Leu Val Arg Lys Lys Ala Arg Asp His Ala Lys Trp Arg Glu 450 455 460 tcc aag gga ttg cct ccg agc gat ccg aac aag 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Ala Arg Lys Ile His Ala Lys Ala Ile Pro Thr Asp Pro 370 375 380 aac ttc atc aag ttg agc gtt gcg tgt ggt cga atc gaa caa tgg gct 1200 Asn Phe Ile Lys Leu Ser Val Ala Cys Gly Arg Ile Glu Gln Trp Ala 385 390 395 400 gag cac tac tac ccc tca ttt atg atg att cgg cct tcg aat gac cct 1248 Glu His Tyr Tyr Pro Ser Phe Met Met Ile Arg Pro Ser Asn Asp Pro 405 410 415 caa aac ccc gca ccc tca acg gcg ctt gac cct ttc tca gga gac gct 1296 Gln Asn Pro Ala Pro Ser Thr Ala Leu Asp Pro Phe Ser Gly Asp Ala 420 425 430 cgt tta agg ata gcc tct aag aag gct gag atc acc gcc gct gct ctt 1344 Arg Leu Arg Ile Ala Ser Lys Lys Ala Glu Ile Thr Ala Ala Ala Leu 435 440 445 gtc agg aag aaa gcc cgg gat cac gct aag tgg aga gag tcc aag gga 1392 Val Arg Lys Lys Ala Arg Asp His Ala Lys Trp Arg Glu Ser Lys Gly 450 455 460 ttg cct ccg agc gat ccg aac aag ccg gac aac tcg gag gat gtt aat 1440 Leu Pro Pro Ser Asp Pro Asn Lys Pro Asp Asn Ser Glu Asp Val Asn 465 470 475 480 tgg gta ttg atc ggc ggt atg atc gtt gga ttg ttg ctc gtg atg ggc 1488 Trp Val Leu Ile Gly Gly Met Ile Val Gly Leu Leu Leu Val Met Gly 485 490 495 gtg ctc ggt ttg gct atc gct tgg gtt gtt ctt cag ttt gag caa taa 1536 Val Leu Gly Leu Ala Ile Ala Trp Val Val Leu Gln Phe Glu Gln 500 505 510 <210> 3 <211> 511 <212> PRT <213> Phaffia rhodozyma <400> 3 Met Gly Ile Ser Asp Tyr Leu Val Leu Ala Phe Thr His Pro Ala Asp 1 5 10 15 Leu Arg Ala Leu Met Gln Tyr Ala Ile Trp His Glu Pro Arg Arg Asn 20 25 30 Ile Thr Ala Gln Glu Glu His Ala Thr Ser Gly Trp Asp Arg Glu Thr 35 40 45 Met Lys Glu Cys Trp Lys Tyr Leu Asp Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala 50 55 60 Ala Val Ile Lys Glu Leu Asp Gly Asp Leu Thr Arg Val Ile Cys Leu 65 70 75 80 Phe Tyr Leu Ala Leu Arg Gly Leu Asp Thr Ile Glu Asp Asp Met Ser 85 90 95 Leu Ser Asn Asp Val Lys Leu Pro Leu Leu Arg Thr Phe Trp Glu Lys 100 105 110 Leu Asp Ser Pro Gly Trp Thr Phe Thr Gly Ser Gly Pro Asn Glu Lys 115 120 125 Asp Arg Glu Leu Leu Val His Phe Asp Val Ala Ile Ala Glu Phe Ala 130 135 140 Asn Leu Asp Val Asn Ser Arg Asn Val Ile Arg Asp Ile Thr Arg Lys 145 150 155 160 Met Gly Asn Gly Met Ala Asp Phe Ala Ser Leu Ser Thr Pro Ser Lys 165 170 175 Pro Val Ala Glu Val Gln Ser Thr Glu Asp Phe Asn Leu Tyr Cys His 180 185 190 Tyr Val Ala Gly Leu Val Gly Glu Gly Leu Ser Arg Leu Phe Val Ala 195 200 205 Thr Glu Lys Glu Arg Pro Phe Leu Ala Asn Gln Met Val Leu Ser Asn 210 215 220 Ser Phe Gly Leu Leu Leu Gln Lys Thr Asn Ile Leu Arg Asp Ile Arg 225 230 235 240 Glu Asp Ala Asp Glu Gly Arg Gly Phe Trp Pro Arg Glu Ile Trp Ala 245 250 255 Asn Pro Ile Tyr Thr Ala His Ala Pro Gly Thr Arg Phe Asn Ser Leu 260 265 270 Thr Asp Leu Val Lys Lys Glu Asn Ile Asp Lys Gly Ser Met Trp Val 275 280 285 Leu Ser Ala Met Thr Leu Asp Ala Ile Thr His Thr Thr Asp Ala Leu 290 295 300 Asp Tyr Leu Ser Leu Leu Lys Asn Gln Ser Val Phe Asn Phe Cys Ala 305 310 315 320 Ile Pro Ala Val Met Ser Ile Ala Thr Leu Glu Leu Cys Phe Met Asn 325 330 335 Pro Ala Val Phe Gln Arg Asn Ile Lys Ile Arg Lys Gly Glu Ala Val 340 345 350 Glu Leu Ile Met Lys Cys Asn Asn Pro Arg Glu Val Ala Tyr Met Phe 355 360 365 Arg Asp Tyr Ala Arg Lys Ile His Ala Lys Ala Ile Pro Thr Asp Pro 370 375 380 Asn Phe Ile Lys Leu Ser Val Ala Cys Gly Arg Ile Glu Gln Trp Ala 385 390 395 400 Glu His Tyr Tyr Pro Ser Phe Met Met Ile Arg Pro Ser Asn Asp Pro 405 410 415 Gln Asn Pro Ala Pro Ser Thr Ala Leu Asp Pro Phe Ser Gly Asp Ala 420 425 430 Arg Leu Arg Ile Ala Ser Lys Lys Ala Glu Ile Thr Ala Ala Ala Leu 435 440 445 Val Arg Lys Lys Ala Arg Asp His Ala Lys Trp Arg Glu Ser Lys Gly 450 455 460 Leu Pro Pro Ser Asp Pro Asn Lys Pro Asp Asn Ser Glu Asp Val Asn 465 470 475 480 Trp Val Leu Ile Gly Gly Met Ile Val Gly Leu Leu Leu Val Met Gly 485 490 495 Val Leu Gly Leu Ala Ile Ala Trp Val Val Leu Gln Phe Glu Gln 500 505 510 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n = a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> y = c or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n = a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n = a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n = a, c, g or t <400> 4 gcnytngaya cngtngarga ygayatg 27 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n = a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n = a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n = a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n = a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n = a, c, g or t <400> 5 atngccatna cytgnggnat ngcrca 26 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n = a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n = a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n = a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n = a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n = a, c, g or t <400> 6 ccnacngtnc cngcnacrta rtgrcarta 29 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 7 aatgatgtga agcttcccct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 8 ccagatctct cttggccaga 20

Claims (28)

1. (a) 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드의 성숙한 형태를 코딩하는 핵산 분자;

   (b) 서열번호 2로 표시되는 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및

   (f) 상기 (a) 또는 (b)의 핵산 분자에 의해 코딩된 단편을 포함하고 스쿠알렌 신타제 활성을 갖는 핵산 분자

   로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자를 하나 이상 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
2. (m) 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자 및

   (q) 상기 (m)의 핵산 분자에 의해 코딩된 단편을 포함하고 스쿠알렌 신타제 활성을 갖는 핵산 분자

   로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자를 하나 이상 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma)의 균주로부터 유도된, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 벡터 내에 삽입함을 포함하는 재조합 벡터의 생산 방법.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 벡터.
7. 제 6 항에 있어서,

   폴리뉴클레오타이드가 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 발현 가능하도록 하는 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 벡터.
8. 제 6 항에 따른 재조합 벡터를 숙주 유기체 내에 도입함을 포함하는, 재조합 유기체의 생산 방법.
9. 제 8 항에 있어서,

   상기 숙주 유기체가 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli, E. coli) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터 선택되는, 재조합 유기체의 생산 방법.
10. 제 6 항에 따른 벡터를 함유하는 재조합 유기체.
11. 제 10 항에 따른 재조합 유기체를 배양하는 단계, 및 상기 재조합 유기체의 배양액으로부터 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 스쿠알렌 신타제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 생산 방법.
12. 제 11 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 폴리펩타이드.
13. 제 12 항에 따른 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체.
14. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 폴리뉴클레오타이드에 대한 안티센스 (antisense) 폴리뉴클레오타이드.
15. 제 14 항에 따른 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 벡터 내에 삽입함을 포함하는, 재조합 벡터의 생산 방법.
16. 제 14 항에 따른 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 벡터.
17. 제 16 항에 있어서,

    안티센스 폴리뉴클레오타이드가 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 발현 가능하도록 하는 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 벡터.
18. 제 16 항에 따른 벡터를 숙주 유기체 내에 도입함을 포함하는, 재조합 유기체의 생산 방법.
19. 제 18 항에 있어서,

    상기 숙주 유기체가 파피아 로도지마 또는 크산토필로마이세스 덴드로로우스(Xanthophyllomyces dendrorhous)의 균주인 방법.
20. 제 16 항에 따른 벡터를 함유하는 재조합 유기체.
21. 제 20 항에 있어서,

    스쿠알렌 신타제의 유전자 발현이 숙주 유기체에 비해 감소되고, 이로 인해 숙주 유기체에 비해 증가된 수준으로 카로티노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 유기체.
22. 제 21 항에 있어서,

    스쿠알렌 신타제의 유전자 발현이, 안티센스 기술, 부위-지향(site-directed) 돌연변이유발(mutagenesis), 오류유발(error prone) PCR 및 화학적 돌연변이유발로부터 선택된 기술에 의해 감소된 재조합 유기체.
23. 제 21 항에 따른 재조합 유기체를 배양함을 포함하는, 카로티노이드의 생산 방법.
24. 제 23 항에 있어서,

    상기 카로티노이드가 아스타크산틴, β-카로틴, 리코펜, 제아크산틴 및 칸타크산틴으로부터 선택된 하나 이상인, 카로티노이드의 생산 방법.
25. 제 23 항에 있어서,

    제 21 항에 따른 재조합 유기체에서의 스쿠알렌 신타제의 유전자 발현이, 안티센스 기술, 부위-지향 돌연변이유발, 오류유발 PCR 및 화학적 돌연변이유발로부터 선택된 기술에 의해 감소된, 카로티노이드의 생산 방법.
26. 파피아 로도지마를 배양함으로써 카로티노이드를 생산하는 방법으로서,

    상기 파피아 로도지마에서의 서열번호 1의 서열을 갖는 스쿠알렌 신타제 유전자의 발현이 안티센스 기술, 부위-지향 돌연변이유발, 오류유발 PCR 및 화학적 돌연변이유발로부터 선택된 기술에 의해 감소되는 것을 특징으로 하는 카로티노이드의 생산 방법.
27. 제 26 항에 있어서,

    상기 생산 방법이 생성된 카로티노이드를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
28. 제 6 항에 있어서,

    상기 벡터가 바쿨로바이러스 벡터인 벡터.