KR20150131152A - 핵산 분해를 위한 호열성 뉴클레아제의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핵산을 생체내 및/또는 원위치에서 분해시키기 위한 호열성 뉴클레아제의 용도에 관한 것이고, 상기 호열성 뉴클레아제는 숙주 세포에 이종이고 외부적으로 첨가되기 보다는 상기 숙주 세포에 의해 생산된다. 본 발명은 또한 상기 방법에 따라 생산된 유전자 변형된 세포에 관한 것이다. 본 발명은 바이오매스 또는 바이오매스-유래된 산물에서 재조합 DNA의 생물 활성을 불활성화시키는데 특히 이롭다.

Description

핵산 분해를 위한 호열성 뉴클레아제의 용도{USE OF THERMOPHILIC NUCLEASES FOR DEGRADING NUCLEIC ACIDS}
본 발명은 숙주 세포의 핵산을, 특히 숙주 세포가 재조합 DNA를 포함하는 경우, 이종 호열성 뉴클레아제를 사용하여 생체내 및/또는 원위치에서 분해하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 바이오매스 중의 재조합 DNA의 생물 활성을 불활성화시키는데 이롭다. 상기 재조합 DNA의 생물 활성의 불활성화는 활성 재조합 DNA 분자가 상기 바이오매쓰로부터 단리된 또는 상기 바이오매스 자체 중의 최종 산물 중에 남는 것을 방지하는데 일조한다. 또한, 상기 재조합 DNA의 생물 활성의 불활성화는 활성 재조합 DNA 분자가 환경으로 방출되는 것을 방지하는데 일조한다.
생명공학적 생산 과정들은 생물학적 화합물 및 정제화학약품을 수득하기 위해 점점 더 많이 사용되고 있다. 분자 생물학 기법의 진보는 광범위하게 다양한 생물학적 화합물 및 정제화학약품, 예를 들어 단백질, 항체, 폴리사카라이드, 항생제, 아미노산, 비타민, 알콜 등의 대량 생산을 가능하게 한다. 종종, 생산 효율을 증가시키기 위해서, 목적하는 최종 산물(들)을 생산하는 유전자(들)를 유전자 변형시키고/시키거나 이종 유기체에 도입시킨다. 이어서 상기 목적하는 최종 산물(들)의 생산이 현대식 조절 기법에 의해 조절되는 발효기에서 발생한다. 상기 최종 산물은 세포 자체이거나, 상기 세포로부터 추출되거나, 또는 상기 화합물이 발견되는 세포 배양 브로쓰로부터 수거된다(능동 또는 수동 분비 과정에 의해서 또는 세포 용해에 의해서).
상기 발효 공정의 끝에서 생산되는 바이오매스는 목적하는 최종 산물(들)을 함유하지만, 또한 활성 DNA 분자도 함유함이 목격되는 것은 통상적이다. 종종, 상기 활성 DNA 분자는 재조합 DNA이다. 상기 재조합 DNA 분자는 처리되지 않고 남아있는 경우 단리된 최종 산물 중에 남을 수 있고 또한 환경으로 방출될 수 있다. 농작물 및 식료품 중의 상기 잔류 재조합 DNA 물질은 인간의 건강에 대한 가능한 부작용에 관해서 일반 대중에게 큰 우려가 되어 왔다. 또한, 환경에 대한 상기 재조합 DNA의 잠재적인 영향에 관한 우려는 대부분 국가의 당국 및 기관들로 하여금 상기 발효 공정으로부터 생산되는 폐 물질을 환경으로 방출하기 전에 불활성화시킬 것을 요하는 법적 요건 및 규제를 발생시켰다.
핵산을 불활성화시키는 다수의 방법들이 존재한다. 예를 들어, 핵산을 물리적으로 및 가장 통상적으로는 열에 의해 불활성화시킬 수 있다. 미국특허 제 5,417,862 호는 DNA를 산의 존재하에서 60 내지 100 ℃로 가열함으로써 상기 DNA의 생물 활성을 불활성화시키는 방법을 보고한다. 열 및 산의 조합에 의한 DNA의 유사한 분해 방법이 미국특허 제 5,118,603 호에 보고되어 있다. 상기 가열 방법은 상당량의 에너지를 요하며, 이는 대규모 발효 공정에서 최종 산물의 비용을 가중시킨다. 더욱 또한, 상기 최종 산물의 성질에 따라, 상기 가혹한 열(및/또는 산성) 조건이 상기 산물의 보전 및 활성에 해로울 수 있다.
핵산을 또한 다른 물리적 수단에 의해 불활성화시킬 수 있다. 미국특허 제 6,165,711 호는 생물학적으로 활성인 단백질성 물질 중의 핵산 붕해를 위해 레이저 광선을 사용하는 방법을 보고한다. 또 다른 예로서, 고강도의 펄스화된 다색광을 사용하는 미생물 불활성화 방법이 미국특허 출원 제 09/818,256 호(현재는 포기됨)에 보고되어 있다. 상기 방법은 복잡한 광-발생 장치가 사용되고 일관되게 유지될 것이 요구되며, 따라서 비용-집약적이다. 상기 광선은 핵산뿐만 아니라 다른 생물학적 물질 또는 활성 화합물들도 붕해시킬 수 있으며, 이는 이들 물질의 목적하는 성질을 잃게 할 것이다.
핵산을 또한 산이나 알칼리에 의해 화학적으로 불활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제 7,435,567 호에는 미생물 중의 핵산의 자가소화의 유도를 위해 차아염소산을 사용하는 방법이 보고되어 있다. 상술한 미국특허 제 5,417,862 호 및 미국특허 제 5,118,603 호는 핵산의 분해를 위해 다른 유형의 산을 사용한다. 이들 방법은 핵산의 파괴를 야기하지만, 산 및 알칼리 조건이 가혹하다. 상기 가혹한 조건은 몇몇 생물학적 화합물들, 예를 들어 단백질의 불필요한 변성을 야기할 수 있다. 상기 사용되는 산 및 알칼리의 양은 비교적 많을 수 있으며, 이는 또한 산업적인 생산의 관점에서 상기 방법을 불리하게 한다.
유기체의 핵산을 효소적으로, 예를 들어 뉴클레아제의 사용에 의해서 불활성화시키려는 노력들이 수행되어 왔다. 미국특허 출원 제 13/127,825 호는 백신 생산과 관련된 숙주 세포 핵산의 분해 방법을 보고하며, 이때 상기 방법은 정제된 뉴클레아제를 세포 배양물에 가함으로써 핵산을 분해시키는 단계를 포함한다. 미국특허 출원 제 10/607,903 호에서, 핵산을 분해시키기에 유효한 양으로 이종 뉴클레아제 유전자를 발현하는 트랜스제닉 세균 균주의 구축이 보고된다. 미국특허 출원 제 13/127,825 호에 보고된 바와 같이 뉴클레아제를 시험관내에서 가하는 방법은 핵산의 파괴를 야기하지만, 다량의 뉴클레아제가 필요하기 때문에 비용이 많이 들고, 시험관내에서 첨가시 숙주세포의 세포벽이 상기 뉴클레아제에 의한 핵산으로의 접근을 차단하기 때문에 분해 효율이 낮다. 미국특허 출원 제 10/607,903 호에 보고된 바와 같은 트랜스제닉 접근법은 상기 뉴클레아제가 숙주 세포와 함께 발현되게 하며 따라서 생체내 숙주 핵산으로의 통로를 획득하게 한다. 그러나, 어떠한 보호 기전도 없이, 예를 들어 메틸화 없이 세포에서 뉴클레아제를 공-발현시키는 것은 상기 세포를 현저하게 압박하여, 세포 증식을 약화시키고 최종 산물의 생산을 감소시킬 것이다.
따라서 본 발명의 근원적인 문제는 생물학적 화합물 및 정제화학약품을, 특히 산업적인 생산 규모로 생산하도록 숙주 세포의 핵산을 분해시키는 비용-효과적인 방식을 제공하는 것이다. 본 발명의 근원적인 추가의 문제는 상기 핵산 분해 과정을 조절할 수 있고 숙주 세포에서 목적하는 최종 산물(들)의 생산을 방해하지 않는 방법을 제공하는 것이다. 상기 문제들은 본 발명의 특허청구범위의 주제에 의해 본 발명에 따라 해결된다.
놀랍게도 본 발명에 이르러 호열성 뉴클레아제를, 핵산을 생체내 및/또는 원위치에서 조절된 방식으로 분해하기 위해 사용할 수 있음이 밝혀졌다. 본 발명은 숙주 유기체의 핵산을 분해시키는 신규의 방법에 관한 것으로, 이때 상기 숙주 유기체는 하나 이상의 이종 호열성 뉴클레아제 유전자에 의해 변형되거나 형질전환된다. 본 발명에 개시된 호열성 뉴클레아제는, 세포 배양물이 정상적으로 증식하여 목적하는 산물을 생산하는 온도에서 잠복성이지만, 보다 높은 온도에서 선택적으로 활성화되며, 따라서 일단 활성화되면 숙주 유기체의 핵산 및/또는 상기 숙주 유기체 중에 통합된 재조합 핵산을 분해시킬 수 있다. 상기 활성화는 임의의 목적하는 시점에서, 예를 들어 생성물 형성이 이미 완료된 상기 세포 배양물의 수확 시기에 촉발될 수 있다. 본 발명 방법의 적용은 용이한 조절 외에, 생체내 및/또는 원위치에서 작용하고 따라서 효소 반응의 효율을 개선시키는 이점을 가지며, 기존의 물리적 또는 화학적 방법의 단점 및 문제점들을 피한다. 따라서, 개시된 발명의 적용에 의해, 세포의 활성 핵산 내용물, 특히 재조합 DNA가 분해되고 불활성된, 완전한 세포 형태의 생물학적 화합물 및 정제화학약품의 수득이 가능하게 되었다.
본 발명의 실시를 미생물 및 고등 진핵생물 세포 배양물 모두, 및 특히 상업적인 최종 산물의 대규모 생산에 사용되는 산업적인 균주에 광범위하게 적용할 수 있다.
본 발명의 하나의 태양은 숙주 세포의 핵산을 생체내 및/또는 원위치에서 분해시키는 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 숙주 세포는 호열성 뉴클레아제 유전자를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하고, 상기 방법은 (a) 상기 숙주 세포를 상기 호열성 뉴클레아제가 잠복성인 온도에서 생육시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서의 온도를 상기 호열성 뉴클레아제가 활성인 온도로 변화시킴으로써 상기 숙주 세포의 핵산을 분해시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 상술한 호열성 뉴클레아제 유전자들 중 하나 이상을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형된 세포를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 유전자 변형된 세포는 하나 이상의 최종 산물을 생산하고, 상기 유전자 변형된 세포에 의해 생산된 세포 산물은 상기 호열성 뉴클레아제가 아니다. 하나의 실시태양에서, 상기 유전자 변형된 세포를, 상술한 하나 이상의 이종 호열성 뉴클레아제 유전자를 숙주 세포에 도입시킴으로써 생산한다. 상기 숙주 세포는 유전자 변형되지 않은 세포이거나, 또는 앞서 유전자 변형된 세포일 수 있다. 상기 숙주 세포는, 상기 하나 이상의 이종 호열성 뉴클레아제 유전자에 의해 변형되기 전에, 하나 이상의 최종 산물을 생산하며, 여기에서 상기 하나 이상의 최종 산물은 호열성 뉴클레아제가 아니다. 또 다른 실시태양에서, 상기 언급된 숙주 세포를 먼저 하나 이상의 호열성 뉴클레아제 유전자로 변형시켜 유전자 변형된 세포를 생산할 수 있으며, 상기 유전자 변형된 세포를 후속적으로 유전자 조작하여 하나 이상의 다른 최종 산물을 생산한다.
본 발명의 또 다른 태양은 숙주 세포의 핵산을 생체내 및/또는 원위치에서 분해시키기 위한 호열성 뉴클레아제의 용도에 관한 것이며, 여기에서 상기 호열성 뉴클레아제는 상기 숙주 세포에 대해 이종이다.
본 발명의 더욱 또 다른 태양은 활성 핵산 분자가 없는 바이오매스 산물의 생산 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 바이오매스 산물은 호열성 뉴클레아제 유전자를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포의 산물이고, 여기에서 상기 방법은 (a) 상기 숙주 세포를 상기 호열성 뉴클레아제가 잠복성인 온도에서 발효시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서의 온도를 상기 호열성 뉴클레아제가 활성인 온도로 변화시킴으로써 상기 세포의 핵산을 분해시키는 단계; 및 (c) 상기 바이오매스 산물을 회수하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 단계 (b) 및 단계 (c)의 순서를 바꿀 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 상기 태양에서 언급한 뉴클레아제는 DNA-분해성 뉴클레아제이며 상기 숙주 세포의 핵산은 DNA이다. 하나의 특정한 실시태양에서, 상기 숙주 세포의 DNA는 재조합 DNA를 함유한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 뉴클레아제는 RNA-분해성 뉴클레아제이고 상기 숙주 세포의 핵산은 RNA이다.
하나의 실시태양에서, 상기 본 발명의 공정 및 방법의 단계 (a)에서 온도는 숙주 세포의 생육에 최적이다. 하나의 실시태양에서, 상기 분해를 상기 호열성 뉴클레아제의 최적 온도의 약 ±5 ℃ 이내인 온도에서 수행한다. 특정한 실시태양에서, 상기 분해를 상기 호열성 뉴클레아제의 최적 온도에서 수행한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 분해를 상기 숙주 세포의 저온살균 동안 수행한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 분해를 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도 범위에서 수행한다.
하나의 실시태양에서, 상기 DNA-분해성 뉴클레아제는 TaqI 뉴클레아제이다. 하나의 실시태양에서, 상기 분해를 약 60 ℃ 내지 약 70 ℃ 범위의 온도에서 수행한다. 특정한 실시태양에서, 상기 분해를 65 ℃에서 수행한다. 하나의 실시태양에서, 상기 TaqI 뉴클레아제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 TaqI 뉴클레아제의 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 DNA-분해성 뉴클레아제는 PhoI 뉴클레아제이다. 하나의 실시태양에서, 상기 분해를 약 70 ℃ 내지 약 80 ℃ 범위의 온도에서 수행한다. 특정한 실시태양에서, 상기 분해를 75 ℃에서 수행한다. 하나의 실시태양에서, 상기 PhoI 뉴클레아제는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 PhoI 뉴클레아제의 유전자는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 식물 기원이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 동물 기원이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 미생물 기원이다. 하나의 실시태양에서, 상기 미생물은 효모, 진균, 조류, 세균 및 고세균으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물은 야로위아(Yarrowia), 바실러스(Bacillus), 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 파라코커스(Paracoccus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 모르티에렐라(Mortierella), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 아스퍼질러스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium), 트리코더마(Trichoderma), 크립테코디니움(Crypthecodinium), 스키조키트리움(Schizochytrium), 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 특정한 실시태양에서, 상기 야로위아 종은 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)이다.
하나의 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 호열성 뉴클레아제가 아닌 하나 이상의 최종 산물을 생산한다. 하나의 실시태양에서, 상기 최종 산물은 피토엔, 라이코펜, 베타-카로틴, 알파-카로틴, 베타-크립토잔틴, 루테인, 제아잔틴, 아스타잔틴, 칸타잔틴, 에키네논, 3-하이드록시에키네논, 3'-하이드록시에키네논, 아도니루빈, 비올라잔틴, 아도니잔틴, 유비퀴논, 비타민 K, 비타민 E, 레티놀, 레티날, 레티노산, 레티닐 팔미테이트, 및 이들의 변형된 형태들로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서, 상기 호열성 뉴클레아제의 유전자를 숙주 세포의 코돈 사용 편향성에 맞도록 코돈 최적화시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 코돈 최적화된 호열성 뉴클레아제 유전자는 서열번호 1의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 코돈 최적화된 호열성 뉴클레아제 유전자는 서열번호 8의 핵산 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 하나 초과의 호열성 뉴클레아제 유전자를 상기 숙주 세포에 도입시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 재조합 DNA를 상기 호열성 뉴클레아제의 추가적인 부위들을 포함하도록 최적화시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 재조합 DNA를 500 이하의 뉴클레오타이드마다 하나의 절단 부위를 포함하도록 최적화시킨다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 사용되는 이종 호열성 뉴클레아제 유전자는 상기 숙주 세포의 최종 산물의 생산 효율에 영향을 미치지 않는다.
서열 목록
첨부되는 서열 목록에 나열된 핵산 서열들을 뉴클레오타이드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 나타낸다. 각 핵산 서열의 단지 하나의 가닥만을 나타내지만, 상보성 가닥이 상기 나타낸 가닥에 대한 임의의 기준에 의해 포함되는 것으로 이해한다. 첨부되는 서열 목록에서:
서열번호 1은 야로위아 리포리티카에서의 발현에 최적화된 바와 같은, 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터의 TaqI 뉴클레아제를 암호화하는 DNA 서열이며, 클로닝을 위한 제한 부위 및 5' 리보솜 결합 부위를 포함한다.
서열번호 1:
Figure pct00001
서열번호 2는 써무스 아쿠아티쿠스로부터의, TaqI 뉴클레아제를 암호화하는 최적화되지 않은 DNA 서열이다.
서열번호 2:
Figure pct00002
서열번호 3은 서열번호 1로부터 추론된 바와 같은, TaqI 뉴클레아제의 아미노산 서열이다.
서열번호 3:
Figure pct00003
서열번호 4는 야로위아 리포리티카 균주가 갖는 이종 carB 개방 판독 프레임의 DNA 서열이다.
서열번호 4: carB 유전자
Figure pct00004
서열번호 5 및 6은 서열번호 4 내의 529 bp 단편에 대한 5' 및 3' PCR 프라이머들이다.
서열번호 5: 프라이머 MO4641 : caatctgttgcctccctgc
서열번호 6: 프라이머 M04642: atcctttgtgctgggacgg
서열번호 7은 야로위아 리포리티카 균주가 갖는 이종 crtZ - Dc 개방 판독 프레임의 DNA 서열이다.
서열번호 7: crtZ - Dc 유전자
Figure pct00005
서열번호 8은 야로위아 리포리티카에서의 발현에 최적화된 바와 같은, 피로코커스 호리코쉬이(Pyrococcus horikoshii) OT3으로부터의 PhoI 뉴클레아제를 암호화하는 DNA 서열이며, 클로닝을 위한 제한 부위 및 5' 리보솜 결합 부위를 포함한다.
서열번호 8:
Figure pct00006
서열번호 9는 피로코커스 호리코쉬이 OT3으로부터의 PhoI 뉴클레아제를 암호화하는 최적화되지 않은 DNA 서열이다.
서열번호 9:
Figure pct00007
서열번호 10은 서열번호 8로부터 추론된 바와 같은, PhoI 뉴클레아제의 아미노산 서열이다.
서열번호 10:
Figure pct00008
서열번호 11은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서의 발현에 최적화된 바와 같은, 써무스 아쿠아티쿠스로부터의 TaqI 뉴클레아제를 암호화하는 DNA 서열이며, 클로닝을 위한 제한 부위를 포함한다.
서열번호 11:
Figure pct00009
서열번호 12 및 13은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서의 발현을 위해 주형으로서 pMB6736을 사용하여 taqI를 증폭시키는데 사용된 5' 및 3' PCR 프라이머들이다. 프라이머들은 클로닝을 위한 제한 부위를 포함한다.
서열번호 12: 프라이머 M09315: CACACACCATGGCTTCCACTCAGGCTCAG
서열번호 13: 프라이머 M09316: CACACAGGTACCTTAGGGGGCGGTGAGGGCCTCC
도 1은 taqI 뉴클레아제 유전자의 존재 또는 부재하에서의 야로위아 리포리티카 균주에서 DNA 분해 활성의 시간적 추이를 도시한다.
도 2는 taqI 뉴클레아제 유전자의 존재 또는 부재하에서의 야로위아 리포리티카 균주에서 상이한 온도에서의 DNA 분해 활성을 도시한다.
도 3은 PCR 결과에 근거한 DNA 분해의 완전성을 도시한다.
도 4는 taqI 뉴클레아제 유전자의 존재 또는 부재하에서의 야로위아 리포리티카 균주에서 아스타잔틴 및 그의 전구체의 생산을 도시한다.
도 5는 taqI 뉴클레아제 유전자를 갖는 야로위아 리포리티카 균주에서 제아잔틴 및 그의 전구체의 생산을 도시한다.
도 6은 발효기에서 아스타잔틴 및 제아잔틴을 생산하는 야로위아 리포리티카 균주에서 DNA의 분해에 대한 시간적 추이를 도시한다.
도 7은 야로위아 리포리티카에서 TaqI 및 PhoI 뉴클레아제 각각의 최적 온도 부근의 온도 범위를 도시한다.
도 8은 TaqI 뉴클레아제 유전자를 발현하는 에스케리키아 콜라이에서 TaqI 뉴클레아제의 뉴클레아제 활성을 도시한다.
도 9는 TaqI 뉴클레아제 유전자를 발현하는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 TaqI 뉴클레아제의 뉴클레아제 활성을 도시한다.
도 10은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 TaqI 뉴클레아제의 최적 온도 부근의 온도 범위를 도시한다.
본 발명은 이종 호열성 뉴클레아제를 사용하여 핵산을 생체내 및/또는 원위치에서 분해시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 최종 산물(들)의 생산 동안 임의의 시기에서 유기체의 데옥시리보핵산, 특히 재조합 DNA를 분해시키고, 따라서 상기 데옥시리보핵산의 생물 활성을 불활성화시키고자 한다. 본 발명에 따라, 이종 호열성 뉴클레아제 유전자를, 핵산을 분해시키고자 하는 유기체에 도입시킨다. 상기 호열성 뉴클레아제는 상기 유기체의 통상적인 생육 온도에서 잠복성이나, 상기 온도를, 바람직하게는 상기 호열성 뉴클레아제의 최적 온도 부근의 범위로 상승시킴으로써 활성화될 수 있다.
본 발명에서, 상기 호열성 뉴클레아제를 사용하여 숙주 유기체의 핵산의 생물 활성을 불활성화시킨다. "핵산의 생물 활성을 불활성화시킨다"란 용어는 본 발명에 의한 핵산의 분해를 지칭하는 것으로 간주된다. 핵산을 상기 핵산이 복제, 전사 또는 번역의 역할을 더 이상 수행할 수 없도록 절단시키는 경우, 생물학적으로 불활성화되는 것으로 간주한다. 바람직하게, 상기 핵산은 재조합 DNA이다. 바람직하게, 상기 핵산은 500 염기쌍 이하의 단위로 절단될 것이다.
본 발명에서, 상기 호열성 뉴클레아제는 외부적으로 첨가되기보다는 숙주 세포에 의해 생산되며, 따라서 상기 숙주 세포의 핵산을 생체내 및/또는 원위치에서 분해시킨다. "생체내"란 용어는 숙주 세포에 의해 생산된 호열성 뉴클레아제에 의한 상기 세포 내부의 핵산의 분해를 지칭하며, 상기 세포는 분해시기에 생육성이거나 생육성이 아닐 수도 있다. "원위치"란 용어는 세포벽을 파괴한(완전히 또는 부분적으로) 후의 숙주 세포에 의해 생산된 호열성 뉴클레아제에 의한 핵산의 분해를 지칭한다. 예를 들어, 원위치 분해는, 세포가 용해되어 그의 내용물을 방출하는 발효 과정의 끝에서 수행될 수 있다. 분해는 세포의 용해 직후에 또는 용해된 브로쓰의 일부 추가적인 처리가 이미 발생한 후에 수행될 수 있다.
본 발명과 관련하여, "핵산"이란 용어는 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 부분-이중 가닥 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 나타낸다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "유전자"란 용어는 일반적으로, 임의로 하나 이상의 유전자 산물(즉 RNA 또는 단백질)의 발현에 영향을 미칠 수도 있는 몇몇 조절 요소들을 포함한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 호열성 뉴클레아제 유전자는 상기 호열성 뉴클레아제의 폴리펩타이드를 암호화하는 개방 판독 프레임(ORF), 및 또한 상기 뉴클레아제 유전자의 발현에 영향을 미치는 상기 ORF의 상류, 및/또는 전사의 종결을 위한 영역에 놓이는 몇몇 프로모터 및/또는 다른 조절 요소와 함께 상기 호열성 뉴클레아제의 ORF를 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "이종"이란 용어는 발현되는 유기체 중에 천연으로 존재하지 않는 유전자 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이종 폴리펩타이드를 숙주 세포에서 발현시켜야 하는 경우, 종종 상기 숙주 세포의 코돈 선호를 도모하고/하거나 암호화 서열이 상기 숙주 세포에서 활성인 조절 요소와 연결되도록 조절된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 상기 숙주 세포가 야로위아 균주(예를 들어 야로위아 리포리티카)인 경우, 종종 상기와 같은 야로위아 균주의 코돈 선호와 보다 가깝게 일치하도록 주어진 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 서열을 변경시키는 것이 바람직할 것이다. 몇몇 실시태양에서, 주어진 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 서열을 상기 숙주 세포와 관련된 종의 코돈 선호와 보다 가깝게 일치하도록 변경시킨다. 상기와 같은 실시태양은 주어진 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 서열이 실험(예를 들어 클로닝) 및/또는 다른 이유로 인해 상기 숙주 세포의 코돈 선호와 일치하도록 최적화시키기 어려운 경우 유리하다. 몇몇 실시태양에서, 상기 주어진 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 서열은, 상기와 같은 유전자 서열이 상기 숙주 세포 자체(및 따라서 이종이 아닌)로부터 유래되는 경우에조차 최적화된다. 예를 들어, 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 서열은, 상기와 같은 유전자 서열이 주어진 숙주 세포 균주로부터 단리되더라도, 상기 숙주 세포에서의 발현에 코돈 최적화될 수 있다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 유전자 서열을 상기 숙주 세포의 코돈 선호를 밝히기 위해 추가로 최적화시킬 수 있다. 한편으로, 상기 (비-이종) 유전자 서열을 코돈 최적화시키지 않고 대신에 자기 자신 이외의 조절 요소에 연결시킬 수도 있다(상기 조절 요소가 상기 숙주 중의 또 다른 유전자로부터 나오든 또 다른 종으로부터 나오든 간에). 당해 분야의 숙련가들은 숙주 세포 코돈 선호를 알 것이며 상기 숙주 세포에서 주어진 폴리펩타이드의 최적 발현을 위해 본 발명의 방법 및 본 발명에 개시된 조성물을 사용할 수 있을 것이다.
본 발명에 사용되는 바와 같이 "숙주 세포"는 핵산 구조물 또는 발현 벡터의 도입을 받아들이는 임의의 세포 유형을 의미한다. 상기 핵산 구조물 또는 발현 벡터의 도입 수단은 형질전환, 형질감염, 형질도입 등의 형태일 수 있다. "숙주 세포"란 용어는 복제 중에 발생하는 돌연변이로 인해 모 세포와 일치하지 않는 상기 모세포의 임의의 자손을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 목적하는 생물학적 화합물 또는 정제화학약품인 하나 이상의 최종 산물을 생산한다. 상기 숙주 세포는 산업 균주인 것이 바람직하다. 상기 숙주 세포는 유전자 변형된 세포 또는 초기에는 유전자 변형되지 않은 천연 세포일 수 있다. 유전자 변형된 숙주 세포는 종종 특정한 생물학적 화합물 또는 정제화학약품을 과발현하도록 변형되거나, 가공되거나 조작된 숙주 세포를 지칭한다.
상기 숙주 세포는 원핵생물(세균 또는 고세균) 또는 진핵생물에서 생물학적 화합물 및/또는 정제화학약품의 재조합 생산에 유용한 임의의 세포일 수 있다.
"생물학적 화합물"이란 용어는 당해 분야에 공지되어 있으며 생체 중에서 자연적으로 발견되는 화합물을 포함한다. 생물학적 화합물의 예는 비제한적으로 단백질, 폴리펩타이드, 아미노산, 핵산, 뉴클레오타이드, 탄수화물 및 지질을 포함한다.
"정제화학약품"이란 용어는 당해 분야에 공지되어 있으며 다양한 산업 부문, 예를 들어 비제한적으로 제약 산업, 농업, 화장품, 식품 및 사료 산업에 사용되는 화합물을 포함한다. 이들 화합물은 유기산, 예를 들어 타타르산, 이타콘산 및 다이아미노피멜산, 지질, 포화 및 불포화된 지방산(예를 들어 아라키돈산), 다이올(예를 들어 프로판다이올 및 부탄다이올), 방향족 화합물(예를 들어 방향족 아민, 바닐린 및 인디고), 카로티노이드, 비타민 및 보조인자를 포함한다.
고등 동물은 비타민, 카로티노이드, 보조인자 및 뉴트라슈티칼의 합성 능력을 상실하였으며 따라서 이들(세균과 같은 다른 유기체에 의해 광범위하게 합성되지만)을 섭취할 필요가 있다. 이들 분자는 그 자체가 생물 활성 분자이거나 또는 다수의 대사 경로에서 전자 운반체 또는 중간체로서 제공되는 생물 활성 물질의 전구체이다. 이들 화합물은 그들의 영양가치 외에, 착색제, 산화방지제 및 촉매 또는 다른 가공 보조제로서 중요한 산업적 가치를 또한 갖는다. "비타민"이란 용어는 당해 분야에 공지되어 있으며 정상적인 기능을 위해 유기체에 의해 요구되지만 상기 유기체 자신에 의해서는 합성될 수 없는 영양소를 포함한다. 비타민의 군은 보조인자 및 뉴트라슈티칼 화합물을 포함할 수 있다. "보조인자"란 용어는 정상적인 효소 활성의 발생에 필요한 비-단백질 화합물을 포함한다. 상기 화합물은 유기 또는 무기일 수 있으며; 본 발명의 보조인자 분자는 바람직하게는 유기이다. "뉴트라슈티칼"이란 용어는 유기체 및 동물, 특히 인간에서 건강을 증진시키는 식품 첨가제를 포함한다. 상기와 같은 분자의 예는 비타민, 산화방지제 및 또한 몇몇 지질(예를 들어 다중불포화된 지방산)이다.
야로위아 속 유기체에서 생산될 수 있는 바람직한 정제화학제품 또는 생합성 산물은 카로티노이드, 예를 들어 피토엔, 라이코펜, 베타-카로틴, 알파-카로틴, 베타-크립토잔틴, 루테인, 제아잔틴, 아스타잔틴, 칸타잔틴, 에키네논, 3-하이드록시에키네논, 3'-하이드록시에키네논, 아도니루빈, 비올라잔틴, 아도니잔틴, 및/또는 이들의 변형된 형태(비제한적으로 이들 화합물의 이성화, 에스터화, 글리코실화 및 분해 산물을 포함한다); 퀴논 유도된 화합물, 예를 들어 유비퀴논(비제한적으로 조효소 Q10 및 Q5 내지 Q9 퀴논 화합물을 포함한다), 비타민 K 화합물 및 비타민 E 화합물; 및 레티놀 화합물, 예를 들어 레티놀, 레티날, 레티노산 및 레티닐 팔미테이트이다.
원핵생물 숙주 세포는 임의의 그람-양성 또는 그람-음성 세균일 수 있다. 그람-양성 세균은 비제한적으로 바실러스(Bacillus), 브레비바실러스(Brevibacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 제오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 파에니바실러스(Paenibacillus) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 그람-음성 세균은 비제한적으로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 파라코커스(Paracoccus)를 포함한다.
상기 세균 숙주 세포는 임의의 바실랄레(Bacillale) 세포, 예를 들어 비제한적으로 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis), 바실러스 시르큘란스(Bacillus circulans), 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 제오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 세포일 수 있다.
상기 세균 숙주 세포는 또한 임의의 스트렙토마이세스 세포, 예를 들어 비제한적으로 스트렙토마이세스 아크로모제네스(Streptomyces achromogenes), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포일 수 있다.
상기 세균 숙주 세포는 또한 임의의 파라코커스 세포, 예를 들어 비제한적으로 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans), 파라코커스 베르수투스(Paracoccus versutus), 파라코커스 카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens), 파라코커스 마르쿠시이(Paracoccus marcusii) 및 파라코커스 제아잔티니파시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens) 세포일 수 있다.
상기 숙주 세포는 또한 진핵생물, 예를 들어 포유동물, 곤충, 식물, 조류 또는 진균 세포일 수 있다.
상기 조류 숙주 세포는 크립테코디니움(Crypthecodinium), 스키조키트리움(Schizochytrium) 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 세포, 예를 들어 크립테코디니움 코니이(Crypthecodinium cohnii), 스키조키트리움 스페시즈(Schizochytrium sp .) 또는 트라우스토키트리움 스페시즈(Thraustochytrium sp .) 세포일 수 있다.
상기 숙주 세포는 진균 세포일 수 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "진균"은 아스코마이코타, 바시디오마이코타, 키트리디오마이코타 및 자이고마이코타(문헌[Hawksworth et al, In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK]에 의해 정의된 바와 같다)뿐만 아니라 오오마이코타(상기 문헌[Hawksworth et al, 1995, page 171]에 인용된 바와 같다) 문 및 모든 불완전 균류(상기 문헌[Hawksworth et al, 1995])를 포함한다.
상기 진균 숙주 세포는 섬유상 진균 세포일 수 있다. "섬유상 진균"은 모든 섬유 형태의 유마이코타 및 오오마이코타 일부분을 포함한다(상기 문헌[Hawksworth et al, 1995]). 상기 섬유상 진균은 일반적으로 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난 및 다른 폴리사카라이드 복합체로 구성된 균사벽을 특징으로 한다. 생장성 증식은 균사 신장에 의하며 탄소 이화작용은 절대 호기성이다. 대조적으로, 사카로마이세스 세레비지아에와 같은 효모에 의한 생장성 증식은 단세포 엽상체의 발아에 의하며 탄소 이화작용은 발효에 의할 수 있다.
상기 섬유상 진균 숙주 세포는 아크레모니움(Acremonium), 아스퍼질러스(Aspergillus), 아우레오바시디움(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리오프시스(Ceriporiopsis), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코프리누스(Coprinus), 코리오루스(Coriolus), 크립토코커스(Cryptococcus), 필리바시디움(Filibasidium), 푸사리움(Fusarium), 휴미콜라(Humicola), 마그나포르테(Magnaporthe), 뮤코르(Mucor), 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 파네로카에테(Phanerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 플레우로투스(Pleurotus), 스키조필룸(Schizophyllum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트라메테스(Trametes) 또는 트리코더마(Trichoderma) 세포일 수 있다.
예를 들어, 상기 섬유상 진균 숙주 세포는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 브제르칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리오프시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리오프시스 카레기에아(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리오프시스 길베센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리오프시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리오프시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리오프시스 수브루파(Ceriporiopsis subrufa), 세리포리오프시스 수브베르미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 크리소스포리움 이노프스(Chrysosporium inops), 크리소스포리움 케라티노필룸(Chrysosporium keratinophilum), 크리소스포리움 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense), 크리소스포리움 메르다리움(Chrysosporium merdarium), 크리소스포리움 판니콜라(Chrysosporium pannicola), 크리소스포리움 퀸스랜디쿰(Chrysosporium queenslandicum), 크리소스포리움 트로피쿰(Chrysosporium tropicum), 크리소스포리움 조나툼(Chrysosporium zonatum), 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리오루스 히르수투스(Coriolus hirsutus), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크루크웰렌세(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로제움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 술푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로슘(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 뮤코르 미에헤이(Mucor miehei), 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 파네로카에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 플레비아 라디아타(Phlebia radiata), 플레우로투스 에린기이(Pleurotus eryngii), 틸라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor), 트리코더마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코더마 코닌기이(Trichoderma koningii), 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei), 또는 트리코더마 비리데(Trichoderma viride) 세포일 수 있다.
상기 진균 숙주 세포는 또한 효모 세포일 수 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "효모"는 자낭포자형성 효모(엔도마이세탈레스), 담자포자형성 효모, 및 임페르펙티(Imperfecti) 진균(블라스토마이세테스)에 속하는 효모를 포함한다. 상기 효모의 분류는 차후 변할 수 있기 때문에, 본 발명의 목적을 위해서, 효모를 문헌[Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980]에 개시된 바와 같이 정의할 것이다.
상기 효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 또는 야로위아 세포, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 듀글라시이(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 또는 야로위아 리포리티카 세포일 수 있다.
진균 세포를 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 공지된 방식으로 원형질체 형성, 상기 원형질체의 형질전환, 및 세포벽의 재생을 수반하는 방법에 의해 형질전환시킬 수 있다. 아스퍼질러스 및 트리코더마 숙주 세포의 적합한 형질전환 과정은 EP 238023 및 문헌[Yelton et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474]에 개시되어 있다. 푸사리움 종의 적합한 형질전환 방법은 문헌[Malardier et al, 1989, Gene 78: 147-156] 및 WO 96/00787에 개시되어 있다. 효모를 문헌[Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York]; 문헌[Ito et al, 1983, J. Bacteriol. 153: 163-168]; 및 문헌[Hinnen et al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933]에 개시된 과정을 사용하여 형질전환시킬 수 있다.
이종 호열성 뉴클레아제 유전자를 갖는 숙주 세포 균주를 구축하기 위해서, 상기 재조합 호열성 뉴클레아제 유전자 구조물을 상기 숙주에서 최적의 유전자 발현을 허용하는 숙주 특이성 벡터에 삽입한다. 벡터는 문헌["Cloning Vectors" (Pouwels et al, Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]에 널리 공지되어 있다. 벡터는 플라스미드 뿐만 아니라 숙련가들에게 공지된 모든 다른 벡터들, 예를 들어 파지, 바이러스, 예를 들어 SV40, CMV, 바큘로바이러스 및 아데노바이러스, 트랜스포손, IS 요소, 플라스미드, 코스미드, 및 선형 또는 환상 DNA를 의미하는 것으로서 이해해야 한다. 이들 벡터는 숙주 유기체에서 자율적으로 또는 염색체에 의해 복제될 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 예를 들어 본 발명에 따른 하나 이상의 벡터로 형질전환되고 상기 호열성 뉴클레아제의 생산에 사용될 수 있는 재조합 유기체의 생산을 허용한다. 본 발명에 따른 상술한 재조합 구조물을 유리하게는 상기 숙주 유기체의 게놈에 도입시켜 발현시킨다. 당해 발현 시스템에서 상기 호열성 핵산의 발현을 일으키기 위해서 숙련가에게 공지된 통상적인 클로닝 및 형질감염 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 적합한 시스템들은 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al, Eds., Wiley Interscience, New York 1997]에 개시되어 있다.
일부 실시태양에서, 상기 변형된 숙주 세포는 이종 호열성 뉴클레아제 유전자를 갖는 플라스미드를 함유하며 상기 플라스미드는 상기 숙주 유기체에서 자율적으로 복제한다.
DNA는 재조합 DNA 기법의 적용으로부터 생산되는 경우 "재조합체"인 것으로 간주된다. 재조합 기법의 예는 비제한적으로 클로닝, 돌연변이유발, 형질전환 등을 포함한다. 재조합 DNA 기법은 예를 들어 문헌[Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1989)] 및 문헌[Ausubel FM, et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York (1998)]에 개시되어 있다.
"뉴클레아제"란 용어는 핵산에서 뉴클레오티드의 5'-포스페이트기와 인접 뉴클레오티드의 3'-하이드록시기간의 에스터 결합의 가수분해 절단을 초래하고 따라서 DNA 또는 RNA 분자의 분해를 수행하는 효소를 나타낸다. 뉴클레아제는 다수의 유기체들로부터 공지되어 있다. 뉴클레아제는 RNA 또는 DNA를 보다 작은 단위들로 또는 심지어 단량체로 절단한다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 호열성 뉴클레아제는 DNA-분해성 뉴클레아제이며, 상기 호열성 뉴클레아제가 분해시키는 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA이다. 특정한 실시태양에서, 상기 분해되는 DNA는 재조합 DNA이다.
본 발명의 바람직한 실시태양은 DNA의 불활성화에 관한 것이지만, 임의의 핵산 분자의 불활성화를 성취할 수 있다. 이는 RNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 핵산-단백질 접합체의 불활성화를 포함한다.
"DNA-분해성 뉴클레아제"는 DNA 분자를 보다 작은 단위 또는 단량체로 절단할 수 있는 뉴클레아제를 의미한다. 상기와 같은 효소를 또한 현재의 기술 수준에서 "DNase"라 칭한다. "RNA-분해성 뉴클레아제"는 RNA 분자를 보다 작은 단위 또는 단량체로 절단할 수 있는 뉴클레아제를 의미한다. 상기와 같은 효소를 또한 현재의 기술 수준에서 "RNase"라 칭한다.
상기 DNA 또는 RNA 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 엔도뉴클레아제는 핵산 쇄를 상기 쇄 중의 한 위치로부터 분해하는 효소이다. 환언하면, 엑소뉴클레아제는 상기 쇄의 한쪽 또는 양쪽 단부 모두로부터 핵산 쇄를 분해하는 효소이다. 상기 뉴클레아제가 엔도뉴클레아제인 것이 바람직하다.
"호열성 뉴클레아제"는 45 ℃ 이상의 온도에서 최적의 활성을 갖는 뉴클레아제를 의미한다. 상기 최적의 활성은 상기 뉴클레아제의 활성에 최적인 온도에서 관찰된다. 상기 최적의 온도는 당해 분야의 숙련가에 의해 측정되는 바와 같이, 의도된 용도에 관련된 적합한 기질 및 분석 조건(배지 조성, 분석 시간 등에 의해)하에서 상기 뉴클레아제를 본 발명에 따른 재조합 숙주에서 발현시키는 시험관내 분석 또는 생체내 분석에서 상기 뉴클레아제에 대해 측정될 수 있다. 일례로, TaqI와 같은 뉴클레아제의 최적 온도는 정제된 TaqI 뉴클레아제를 사용하여 시험관내에서 전형적으로 측정된다. 고정된 양의 효소를 1 ㎍의 람다 DNA와 함께 1시간 동안 일련의 온도(전형적으로 25 내지 85 ℃)에서 유지된 50 ㎕ 반응기에서 배양시킬 수 있다. 상기 최적 온도는 가장 많은 절단이 관찰되는(예를 들어 생산되는 람다 DNA TaqI 제한 단편의 젤 전기영동에 의해 분석되는 바와 같이) 온도이다. 한편으로, 효소 1 단위는 상기 최적의 온도에서 1시간 동안 50 ㎕ 반응기에서 1 ㎍의 람다 DNA를 완전히 절단시키는데 필요한 단백질의 양으로서 정의된다. 따라서, 상기 최적의 온도는 완전한 절단을 성취하는데 필요한 단백질의 양이 최저인 온도이다. 상기 세포내의 최적의 온도를 한정하기 위해서, 효소 대 DNA 기질의 한정된 비(시험관내 분석에 사용되는 바와 같은)를 보장할 수는 없다. 대신에, 보다 실용적인 접근법을 수행한다. 생체내 최적 온도가 시험관내와 유사한 듯하다면, 상기 시험관내 한정된 최적 조건이 지침으로서 사용될 수 있다. 상기 뉴클레아제에 의한 뉴클레아제 산 절단을 시험관내 최적 온도 및 그 부근에서 검사한다. 상기 최적의 온도는 가장 많은 절단이 관찰된 온도이다. 일부 뉴클레아제의 경우, 상기 생체내 최적 온도는, 게놈 DNA의 완전한 절단이 일련의 온도 범위 전체를 통해 관찰될 수 있으므로, 단일 온도라기보다는 상기 일련의 온도 범위이다.
본 출원에 개시된 호열성 뉴클레아제는 고유의 호열성 뉴클레아제, 및 호열성 뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 동족체 또는 그의 변체를 모두 포함한다. 본 발명에 사용되는 호열성 뉴클레아제를 수득하기 위한 수단은 비제한적으로 호열균으로부터의 단리, 호열성 활성을 획득하고/하거나 열내성을 증가시키기 위해 합리적인 효소 공학 및/또는 방향 진화에 의한 동종 뉴클레아제의 변형을 포함한다. 대다수의 세포와 달리, 호열균은 50 ℃ 이상의 최적의 생육 온도를 갖는 호열(heat-loving) 유기체이다. 대조적으로, 대부분의 세포는 보다 낮은 온도에서 생육하며 호열균에 바람직한 고온에서는 생존할 수 없다. 예를 들어, 통상적인 미생물은 25 내지 40 ℃의 온도에서 생육하고, 포유동물 세포 배양물은 약 37 ℃에서 생육하며, 식물 및 곤충 배양물은 당해 분야에 공지된 그들 각각의 저온에서 생육한다. 호열성 뉴클레아제는 그의 최적 온도 밖에서는 활성을 상실하며 통상적인 미생물 및 세포 배양물이 생육하는 온도에서는 보다 낮은 활성을 갖는다. 저온에서 각 호열성 뉴클레아제의 뉴클레아제 활성 수준은 상이하며 따라서 개별적으로 측정되어야 한다. 본 발명에서, 호열성 뉴클레아제는, 상기 뉴클레아제 활성이 상기 뉴클레아제의 최적 반응 온도에서의 최고 활성의 20% 미만으로 감소되는 경우, 저온에서 잠복성인 것으로 간주된다.
본 발명의 방법은 광범위한 호열성 뉴클레아제를 받아들일 수 있다. 숙주 미생물 또는 진핵생물 세포 배양물의 정상 생육 온도에서 잠복성이지만 자신의 최적 반응 온도에서 (매우) 활성인 임의의 뉴클레아제가 본 발명에 사용하기에 적합하다.
일부 호열성 뉴클레아제는 다른 것들에 비해 본 발명에 덜 적합하다. 예를 들어, 일부 호열성 뉴클레아제는 25 내지 37 ℃의 낮은 온도에서 낮은-수준의 뉴클레아제 활성을 갖는다. 숙주 세포의 생육 온도에서 상기와 같은 잔류 활성은 상기 숙주 세포의 생육을 구속할 수 있으며 따라서 그의 최종 산물의 생산을 방해할 수 있다. 일부 호열성 뉴클레아제는 그의 최적 온도에서 강한 뉴클레아제 활성을 갖지 않을 수도 있으며 따라서 핵산의 분해에 효과가 없다. 따라서, 선별 공정을 수행하여 본 발명에 가장 잘 작용하는 호열성 뉴클레아제를 선택할 수 있다.
최상의 호열성 뉴클레아제 후보는, 숙주 유기체에 어떠한 현저한 스트레스도 부여하지 않도록 정상 생육 온도에서 충분히 낮고, 최적의 반응 온도에서는 상기 숙주의 핵산의 효율적인 분해를 수행하기에 충분히 높은 뉴클레아제 활성을 갖는 것들이다.
통상적인 숙주 유기체가 생육하는 온도 범위 밖의 온도에서 핵산 분해 활성을 나타내는 성질로 인해, 본 발명에 따른 호열성 뉴클레아제는 상기 숙주 세포의 핵산을 분해함에 있어서 조절된 방식으로 유리하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 이종 호열성 뉴클레아제 유전자를 숙주 세포에 도입시키고 따라서 숙주 세포의 핵산을 분해하는데 사용함을 개시한다. 본 발명에 따라, 상기 호열성 뉴클레아제 유전자를, 분해시키고자 하는 핵산을 갖는 숙주 세포에 도입시킨다. 상기 숙주 세포를 이종 호열성 뉴클레아제가 잠복성인 상기 세포의 최적의 생육 온도에서 증식시킨다. 상기 숙주 세포가 일정한 기간 동안 일정한 시기, 예를 들어 상기 세포의 수확 시기로 증식한 후에, 상기 숙주 세포에서 상기 호열성 뉴클레아제의 활성을, 온도를 상기 뉴클레아제 활성에 최적인 온도로 전환시킴으로써 활성화시킬 수 있다. 상기 호열성 뉴클레아제를 활성화시킴으로써, 상기 숙주 세포의 DNA 및/또는 RNA가 상기 뉴클레아제에 의해 분해되며, 따라서 상기 숙주 세포의 DNA 및/또는 RNA의 활성이 제거된다.
본 발명에 따라, 고유 호열성 뉴클레아제의 임의의 동족체 또는 변체를 상기 동족체 또는 변체가 호열성 뉴클레아제 활성을 갖는 한 상기 고유 호열성 뉴클레아제 대신에 사용할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 방법은 이종 호열성 뉴클레아제 유전자를 사용하는 대신에, 합리적인 효소 공학 및/또는 방향 진화와 같은 방법을 사용하여 호열성으로 만든 숙주 세포 뉴클레아제의 동족체 또는 변체를 사용할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 하나의 호열성 뉴클레아제를 숙주 세포에 도입시키고 따라서 상기 숙주 세포의 핵산을 분해시키는데 사용한다. 또 다른 실시태양에서, 2개 이상의 호열성 뉴클레아제를 숙주 세포에 도입시킨다. 추가적인 호열성 뉴클레아제의 도입은 예를 들어 상기 핵산의 분해 효율을 증대시킬 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 분해시키려는 재조합 DNA의 서열을, 상기 호열성 뉴클레아제의 추가적인 절단 부위를 포함하도록 최적화시킨다. 상기 절단 부위의 첨가는 상기 재조합 DNA의 완전한 분해를 보장하는데 일조한다. 상기 분해시키려는 재조합 DNA는 상기 뉴클레아제 유전자 자체를 포함할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 재조합 DNA의 서열을 500 이하의 뉴클레오타이드마다 하나의 절단 부위를 포함하도록 조작한다. 상기 절단 부위를 단일 뉴클레아제 또는 다수의 뉴클레아제에 의해 인식되도록 설계할 수도 있다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 재조합 DNA의 서열을, 생산되는 단백질의 아미노산 서열이 변경되지 않는 방식으로 절단 부위를 포함하도록 조작한다.
상기 핵산 분해 방법을 실험대에서부터 상업적인 규모의 발효에 이르는 임의의 규모로 수행할 수 있다. 본원의 배경설명 섹션에 개시된 바와 같이, 숙주 세포의 DNA, 특히 재조합 DNA를 생성물 회수 전에(예를 들어 발효 공정의 끝에서) 분해시키는 것이 바람직하다. 본 발명은 바이오매스 중의 재조합 DNA를 분해시키고 따라서 임의의 재조합 DNA를 불활성화시키는 방법을 제공한다. 상기 바이오매스는 예를 들어 미생물 또는 고등 진핵생물 세포 배양물의 배양으로부터 수확되는 세포일 수 있다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 상기 바이오매스 중의 재조합 DNA를 불활성화시키는 발효 공정을 제공한다. 상기와 같은 공정에 대한 방법 단계들을 하기와 같이 예시한다: 먼저, 본 발명에 따른 호열성 뉴클레아제를 암호화하는 유전자를 숙주 세포에 도입시킨다. 호열성 뉴클레아제의 유전자를 함유하는 핵산 구조물의 상기 숙주 세포에의 통합은 염색체내에서 또는 염색체외에서 발생할 수 있다. 두 번째, 상기 숙주 세포를 상기 숙주 세포의 생육 및/또는 생산 공정에 최적인 온도에서 발효기에서 증식시킨다. 세 번째, 상기 발효 공정의 끝에서, 상기 발효기의 온도를 상기 호열성 뉴클레아제의 최적 온도로 상승시키고 따라서 상기 뉴클레아제를 활성화시킨다. 보다 높은 온도를 상기 숙주 세포 중의 DNA(재조합이든 아니든)의 충분한 분해를 허용하는 시간 동안 유지시킨다. 후속으로, 상기 바이오매스를 수거하고 임의로 추가로 조작하여 최종 산물(상기 바이오매스 자체가 아닌 경우)을 정제한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 바이오매스 중의 DNA를 분해시키는 대신에, 본 발명에 개시된 방법을 또한 부분적으로 정제된 생성물 중의 DNA 분해에 사용할 수 있다. 예를 들어, 상술한 발효 공정에서, 바이오매스의 수거전에 상기 호열성 뉴클레아제를 활성화시키는 대신에, 상기 뉴클레아제의 활성화를 상기 바이오매스가 수거된 후 및 추가로 조작하여 부분적으로 정제된 최종 산물이 수득될 때까지 억제시킬 수 있다. 이어서 상기 호열성 뉴클레아제를 활성화시켜 상기 부분적으로 정제된 최종 산물 중에 함유된 DNA를 분해시키고, 이어서 경우에 따라 추가로 정제시킬 수 있다. 상기 초기(부분) 정제 공정에서, 상기 뉴클레아제의 활성을 유지시키는 것은 필수적이다. 실제로, 상기 호열성 뉴클레아제의 활성이 상기 바이오매스 수거 후 공정 동안 보존되는 한, 상기 숙주 세포의 DNA의 분해를 상기 바이오매스 수거 후 임의의 시기에 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 발효 외에 다수의 다른 기술 분야에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 방법을 백신 생산 동안 숙주 세포의 DNA를 불활성화시키는데 사용할 수 있다.
바이러스 또는 바이러스 항원을 함유하는 백신을 생산하는 세포 배양-기재 방법은 바이러스 백신의 상업적인 생산에 점점 더 많이 사용되고 있다. 그러나, 백신 생산을 위해 세포 배양물을 사용함과 관련된 위험들 중 하나는 숙주 세포의 오염성 잔류 세포 DNA에의 백신 수용자의 노출임이 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 숙주 세포 DNA가 상기 숙주 세포 시스템에서 구축된 백신의 최종 제형으로부터 제거되고, 따라서 상기 최종 산물로부터 임의의 잠재적인 발암유전자가 제거된다는 우려가 존재한다. 본 발명에 따른 방법을 세포 배양물에 의해 생성된 바이러스 또는 그의 바이러스 항원과 관련된 숙주 세포 핵산을 분해시키기 위해 수행할 수 있다. 상기 방법은 (a) 호열성 DNA 뉴클레아제의 유전자를 숙주 세포 배양물에 도입시키고 따라서 새로운 숙주 균주를 생산하는 단계; (b) 상기 새로운 숙주 균주의 집단에 바이러스를 접종하는 단계; (c) 상기 바이러스가 복제되도록 상기 숙주 세포의 집단을 배양하되, 상기 배양을 상기 호열성 뉴클레아제가 잠복성인 온도에서 수행하는 단계; (d) 상기 단계 (c)에서의 온도를 상기 호열성 DNA 뉴클레아제가 활성인 온도로 변화시킴으로써 상기 숙주 세포의 DNA를 분해시키는 단계; (e) 이에 의해 생성된 바이러스를 수거하여 바이러스 수확을 제공하는 단계; 및 (f) 상기 바이러스를 단리하는 단계들을 포함한다. 상기 단계 (d) 내지 (f)의 순서는 교환가능할 수 있다. 상기 바이러스는 예를 들어 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 그러나, 임의의 바이러스 또는 바이러스 항원을 본 발명에 따라 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 또한 유전자 변형된 농작물의 핵산을 불활성화시키기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 호열성 뉴클레아제를 유전자 변형된 농작물에 도입시킬 수 있다. 상기 농작물을 통상적으로 50 ℃를 초과하지 않는 온도로 들에서 증식시킨다. 상기 농작물을 수확한 후에, 이를 예를 들어 상기 농작물의 핵산을 분해시키기 위해서 상기 호열성 뉴클레아제의 최적 온도에서 조작할 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 또한 세포 용해물에서 점도를 감소시키기 위해 사용할 수 있다. 세포가 용해될 때, DNA가 상기 세포로부터 방출되고 따라서 상기 세포 용해물을 점성으로 되게함은 당해 분야에 공지되어 있다. 이는 세포 용해물의 추가적인 조작을 방해한다. 상기 호열성 DNA 분해 뉴클레아제는 DNA를 작은 올리고뉴클레오타이드 단편들로 절단하고 따라서 상기 DNA 내용물에 의해 야기된 점성을 조절된 방식으로 제거함으로써 작용한다.
본 발명에 따라 사용되는 호열성 뉴클레아제는 예를 들어 써무스 아쿠아티쿠스로부터의 TaqI 엔도뉴클레아제일 수 있다. TaqI는 65 ℃의 최적 온도를 갖는다. 다른 호열성 뉴클레아제를 본 발명에의 사용에 대한 적합성에 대해 시험할 수 있다. 추가적인 호열성 뉴클레아제의 예는 65 ℃의 최적 온도를 갖는 Tsp509I, 60 ℃의 최적 온도를 갖는 MwoI, 75 ℃의 최적 온도를 갖는 PhoI, 60 ℃의 최적 온도를 갖는 BsaJI, 및 50 ℃의 최적 온도를 갖는 BspQI를 포함한다.
기본적으로, 현재의 기술 수준에서 공지된 임의의 기존의 호열성 뉴클레아제 또는 여전히 동정해야 할 임의의 호열성 뉴클레아제를, 상기와 같은 호열성 뉴클레아제들이 그들의 최적 반응 온도에서 높은 핵산 절단 활성을 갖지만 숙주 미생물 또는 세포 배양물이 정상적으로 생육하는 보다 낮은 온도에서는 잠복성인 한, 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
본 발명의 범위내에서 핵산 분해 온도는 특정한 호열성 뉴클레아제의 최적 활성을 갖는 것으로 공지된 온도인 것이 바람직하다. 예를 들어, 호열성 뉴클레아제 TaqI를 사용하여 숙주 세포의 핵산을 분해시키기에 바람직한 하나의 온도는, TaqI가 65 ℃에서 가장 활성인 것으로 공지되어 있으므로, 65 ℃이다. 그러나, 본 발명에 따른 최적 온도는 단일 온도 점으로 제한되지 않는다. 본 발명에 따라, 핵산 분해 온도는 상기 호열성 뉴클레아제의 공지된 최적 온도의 ±5 ℃ 범위 이내의 임의의 온도가 또한 바람직하다. TaqI의 경우에, 예를 들어 바람직한 온도는 60 ℃ 내지 70 ℃ 내에 있는 임의의 온도이다. 또 다른 예에서, PhoI는 75 ℃에서 가장 활성인 것으로 공지되어 있다. PhoI의 바람직한 온도는 70 ℃ 내지 80 ℃ 내에 있는 임의의 온도이다. 상기 호열성 뉴클레아제의 공지된 최적 온도의 ±1 ℃, ±2 ℃, ±3 ℃ 또는 ±4 ℃ 내에 있는 온도가 상기 호열성 뉴클레아제의 활성화 온도인 것이 특히 바람직하다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 상기 호열성 뉴클레아제 활성을 활성화시키는데 사용되는 온도는 상기 호열성 뉴클레아제의 공지된 최적 온도의 ±5 ℃이다.
상기 호열성 뉴클레아제 활성을 활성화시키는데 사용되는 온도는 단지 선택된 호열성 뉴클레아제의 공지된 최적 온도의 ±5 ℃ 이내인 온도 범위로만 제한되는 것은 아님이 당해 분야의 숙련가에게 명백하다. 대안으로서, 상기 호열성 뉴클레아제 활성을 활성화시키는데 사용되는 온도는, 숙주 세포가 능동 생육은 갖지 않지만 상기 호열성 뉴클레아제가 능동적인 효소 활성을 갖는 임의의 온도일 수 있다. 예를 들어, TaqI의 활성화에 사용되는 온도는, 숙주 세포가 능동 생육은 갖지 않지만 상기 호열성 뉴클레아제가 여전히 효소 활성을 갖는 75 ℃일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 호열성 뉴클레아제 활성을 활성화시키는데 사용되는 온도는 상기 호열성 뉴클레아제가 그의 최적 효소 활성의 20% 이상을 갖는 온도 또는 온도 범위이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 호열성 뉴클레아제 활성을 활성화시키는데 사용되는 온도는 상기 숙주 세포가 그의 최적 생육률의 20% 이하로 생육하거나 또는 생육하지 않는 온도 및 상기 호열성 뉴클레아제가 그의 최적 효소 활성의 20% 이상을 갖는 온도 또는 온도 범위이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 호열성 뉴클레아제 활성을 활성화시키는데 사용되는 온도는 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도이다.
핵산의 분해를 그의 효율을 위태롭게 하지 않는 온도 범위에서 수행할 수 있는 한, 바람직한 온도는 다른 고려사항들, 예를 들어 비제한적으로 최종-산물 역가, 최종-산물 안정성, 최종-산물 순도, 최종-산물 수율, 후속 조작 단계에 대한 물질 취급 용이성 등이 최적의 균형에 이르는 온도 범위 이내의 임의의 온도이다.
따라서, 핵산의 효율적인 분해를 허용하는 임의의 온도를 상기 호열성 뉴클레아제 활성을 활성화시키기 위해 선택할 수 있음은 본 발명의 범위 내에 있다. 때때로 상기와 같은 온도는 최선의 호열성 뉴클레아제 활성을 제공하지 못할 수도 있지만, 일부 추가적인 인자들과 함께 최선의 전체적인 효율을 제공할 수 있다. 예를 들어, 가열 저온살균을 호열성 뉴클레아제의 가열 활성화 단계 대신에 사용할 수 있다. 바이오매스를 저온살균 동안 점차적으로 가열함으로써, 숙주 세포의 저온살균 및 상기 세포에서 호열성 뉴클레아제 활성의 활성화를 모두 한 단계로 수행할 수 있으며 따라서 비용이 절감된다. 상기와 같은 경우에, 상기 최적 온도 또는 온도 범위는 상기 저온살균 온도에 대한 궤도와 엇갈린다.
본 발명에 따른 핵산 분해 공정을 비교적 급속히 수행할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 핵산 분해 공정을 48시간 미만, 24시간 미만, 1시간 미만, 40분 미만, 30분 미만, 또는 20분 미만의 지속기간 동안 상기 호열성 뉴클레아제의 최적 온도에서 수행한다. 상기 최적의 시간 길이를 각각의 호열성 뉴클레아제에 대해서 및 특정한 실험 조건하에서 실험적으로 결정할 수 있다.
본 발명을 임의의 숙주 세포에 사용할 수 있다. 숙주 세포의 예는 미생물 및 고등 진핵생물 세포, 예를 들어 농작물 또는 동물 세포를 포함한다. 본 발명에 따라, 상기 미생물은 예를 들어 원핵생물 세포, 예를 들어 세균 또는 고세균, 또는 진핵생물 세포, 예를 들어 효모, 하등 또는 고등 진균, 조류, 또는 원생동물일 수 있다. 바람직한 실시태양에 따라, 미생물은 세균 세포, 진균 세포 또는 효모, 또는 미세조류 세포이다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 방법에 따라 분해될 수 있는 핵산을 갖는 유기체는 예를 들어 비제한적으로 야로위아, 바실러스, 코리네박테리움, 에스케리키아, 슈도모나스, 파라코커스, 칸디다, 한세눌라, 사카로마이세스, 모르티에렐라, 스키조사카로마이세스, 아스퍼질러스, 푸사리움, 트리코더마, 크립테코디니움, 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움과 같은 속으로부터의 미생물이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 숙주 세포는 야로위아 리포리티카이다. 야로위아 리포리티카의 이점은 예를 들어 다루기 쉬운 유전학 및 분자 생물학, 게놈 서열의 유효성, 다양한 비용-효과적인 생육 조건에의 적합성, 높은 세포 밀도로 증식하는 능력, 및 안전한 사용 경력을 포함한다. 야로위아 리포리티카에 대해서는 이미 광범위한 상업적인 경험이 존재한다.
에스케리키아 콜라이는 가장 통상적으로 사용되는 세균 균주이므로 유용하다. 상기는 재조합 DNA에 대한 담체 균주로서 정규적으로 사용되어 왔다.
사카로마이세스 세레비지아에도 또한, 특히 그의 실험적으로 다루기 쉬운 성질 및 연구자들이 상기 유기체에 대해 축적한 광범위한 경험으로 인해 본 발명에 따른 유용한 숙주 세포이다.
본 발명에 따른 숙주 세포는 또한 고등 진핵생물 세포를 포함한다. "고등 진핵생물 세포"란 용어는 발달 상태가 높은 진핵생물 세포, 예를 들어 동물 또는 식물 유기체 중에 존재하는 것들을 의미한다. 고등 진핵생물 세포는 모든 생명유지의 생화학 및 대사 기능을 독립적으로 수행하는 것은 아니며, 따라서 상기 세포를 세포 배양물로서 증식시킬 수 있다. 본 발명에 따른 고등 진핵생물 세포는 특히 포유동물, 식물, 곤충 또는 조류로부터의 모든 세포를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 상기 고등 진핵생물 세포는 포유동물 기원이다. 본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 상기 고등 진핵생물 세포는 식물 기원이다. 본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 상기 고등 진핵생물 세포는 곤충 기원이다.
본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 상기 숙주 세포의 핵산의 분해를 상기 숙주 세포의 다른 세포 성분에 대한 영향 없이 또는 최소의 영향으로 수행한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 숙주 세포의 핵산의 분해를, 상기 숙주 세포를 조작하여 생산하는 생물학적 화학물 및/또는 정제화학약품의 생산에 대한 영향 없이 또는 최소의 영향으로 수행한다. 하나의 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 야로위아 균주이며 유전자 조작하여 생산되는 생물학적 화합물은 피토엔, 라이코펜, 베타-카로틴, 알파-카로틴, 베타-크립토잔틴, 루테인, 제아잔틴, 아스타잔틴, 칸타잔틴, 에키네논, 3-하이드록시에키네논, 3'-하이드록시에키네논, 아도니루빈, 비올라잔틴, 아도니잔틴, 유비퀴논, 비타민 K, 비타민 E, 레티놀, 레티날, 레티노산, 레티닐 팔미테이트, 및 이들의 변형된 형태(비제한적으로 상기 화합물들의 이성화, 에스터화, 글리코실화, 및 분해 산물 포함)를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 야로위아 균주는 유전자 변형된 야로위아 균주이다. 특정한 실시태양에서, 호열성 뉴클레아제 유전자가 도입되는 상기 유전자 변형된 야로위아 균주 세포는 야로위아 리포리티카 균주 ML12924이며 상기 생산되는 생물학적 화합물은 아스타잔틴이다. 또 다른 실시태양에서, 호열성 뉴클레아제 유전자가 도입되는 상기 유전자 변형된 야로위아 균주 세포는 야로위아 리포리티카 균주 ML12921이며 상기 생산되는 생물학적 화합물은 제아잔틴이다. 또 다른 실시태양에서, 호열성 뉴클레아제 유전자가 도입되는 상기 유전자 변형된 야로위아 균주 세포는 야로위아 리포리티카 균주 ML12805이며 상기 생산되는 생물학적 화합물은 라이코펜이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 숙주 세포에서 이종 뉴클레아제 유전자의 발현을 증대시키기 위해서 코돈 최적화를 수행한다. 비-고유 유전자들의 발현이 숙주 유기체에 비해 그들 각각의 코돈 사용 패턴의 변화의 존재에 의해 방해를 받는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해서, 본 발명에 따른 코돈 최적화를, 상기 유전자를 숙주 세포에 도입시키기 전에 숙주 코돈 사용에 맞추기 위해서 상기 호열성 뉴클레아제 유전자상에서 수행한다. 상기 과정은 원래의 아미노산 서열에 대해 100% 일치성 또는 거의 100% 일치성을 유지하면서 상기 숙주 코돈 사용 편향성에 가깝게 맞도록 하기 위해서 상기 뉴클레아제 유전자의 DNA 서열내 희귀 코돈의 치환을 포함한다. 이러한 코돈 최적화 과정은 또한 GC 함량의 변화로부터 발생할 수 있는 예견된 mRNA 2차 구조의 동시 변형을 허용한다.
본 발명의 호열성 뉴클레아제에서, 상기 코돈 사용 패턴은 암호화된 아미노산 서열의 변경 없이 전형적인 상기 호열성 뉴클레아제 유전자로부터 변경되어 상기 코돈을 변형시킨다. 다수의 호열성 뉴클레아제 유전자에 대한 핵산 서열은 공지되어 있다. 상기 서열이 초기에 공지되지 않은 경우에, 상기 정보는 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 공지된 방법(비제한적으로 DNA 및 RNA 서열분석을 포함한다)에 의해 유도될 수 있다. 본 발명에 따라서, 호열성 뉴클레아제 유전자 분절을, 동일한 번역된 서열을 갖지만 또 다른 코돈 용도를 갖는 서열로 전환시켰다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 고유 호열성 뉴클레아제 TaqI(서열번호 2)의 코돈 사용 패턴을 야로위아 리포리티카의 코돈 편향성에 최적화시킨다. 생산되는 코돈 변형된 TaqI 유전자를 서열번호 1에 명시한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 고유 호열성 뉴클레아제 TaqI(서열번호 2)의 코돈 사용 패턴을 에스케리키아 콜라이의 코돈 편향성에 최적화시킨다. 생산되는 코돈 변형된 TaqI 유전자를 서열번호 11에 명시한다. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 11에 의해 암호화된 아미노산 서열을 서열번호 3에 명시한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 고유 호열성 뉴클레아제 PhoI(서열번호 9)의 코돈 사용 패턴을 야로위아 리포리티카의 코돈 편향성에 최적화시킨다. 생산되는 코돈 변형된 phoI 유전자를 서열번호 8에 명시한다. 서열번호 8 및 서열번호 9에 의해 암호화된 아미노산 서열을 서열번호 10에 명시한다.
서열번호 1 및 서열번호 8에 예시된 코돈 변형된 taqI 및 phoI 유전자는 단지 다수의 가능한 코돈 변형된 taqI 및 phoI 유전자, 또는 다른 호열성 뉴클레아제 유전자의 예로서 제공된다. 임의의 적합한 코돈 변형 방법을 사용하여 본 발명에 따른 호열성 뉴클레아제 유전자를 변형시킬 수 있으며, 상이한 코돈 변형 방법의 사용으로부터 생산되는 서열은 다양할 수 있음이 숙련가에게 명백하다. 이제 본 발명을 일반적으로 개시하였지만, 하기의 특정한 실시예들을 참조하여 본 발명은 더욱 쉽게 이해될 것이며, 이들 실시예는 단지 예시를 위해 본 발명에 포함되고 달리 명시되지 않는 한 제한을 의도하지는 않는다.
하기의 실시예들은 본 발명을 예시한다.
실시예
하기의 표 1은 하기의 예시에 사용되는 몇몇 야로위아 리포리티카 균주들을 개시한다.
Figure pct00010
야로위아 균주 ML8195, ML12805, ML11956, ML12924, ML11218, ML12921 및 ML13270을 구성 프로모터의 조절하에서 이종 유전자(예를 들어 TEF1)의 도입에 의해 구축하고, 미국특허 제 7,851,199 B2 호에 개시된 바와 같이 ML350 및 ATCC201249로 출발하여 다수의 잡종교배 세대와 결합시켰다. GGS 유전자 및 절두된 HMG 유전자("HMG - tr")는 각각 고유의 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제 및 하이드록시메틸글루타릴-CoA 리덕타제 유전자에 상응하는 야로위아 리포리티카 서열들로부터 유래되었다. carRP 및 carB 유전자는 뮤코르 시르시넬로이데스로부터 유래되었고, 이들은 각각 이작용성 피토엔 신타제/라이코펜 사이클라제 및 피토엔 데하이드로게나제를 암호화한다. crtW 유전자는 파르뷸라르큘라 베르뮤덴시스(Parvularcula bermudensis)의 카로틴 케톨라제를 암호화하도록 합성되었다. crtZ 유전자는 잔토박터 아우토트로피쿠스(Xanthobacter autotrophicus )( Xa)로부터 증폭되었거나, 또는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 박테리움 DC404(Dc)(서열번호 7)로부터의 카로틴 하이드록실라제를 암호화하도록 합성되었다. 이들 유전자는 때때로, 항상은 아니지만, 영양요구성 마커(URA3 , LEU2 , URA2 , LYS1, ADEl) 또는 loxP 부위, HygR(하이그로마이신 내성) 마커의 잔류물과 회합된다.
실시예 1: 야로위아 균주 구축을 위한 플라스미드의 생산
플라스미드를 표 2에 개시된 바와 같이 야로위아에서 TaqI 호열성 뉴클레아제의 발현을 위해 생산하였다. 코돈 최적화된 taqI 뉴클레아제 ORF 서열을 서열번호 1에 명시된 바와 같은 야로위아 리포리티카 코돈 편향성을 사용하여, 써무스 아쿠아티쿠스의 taqI 뉴클레아제 유전자의 서열(서열번호 2)을 기본으로 드노보 합성하였다. 상기 코돈-최적화된 taqI 뉴클레아제 ORF를 NheI 및 MluI를 사용하여 절단하고 NheI 및 MluI로 절단된 pMB5082에 연결하여 pMB6722를 생산하였다. 생산되는 pMB6722의 암호화된 TaqI 단백질을 서열번호 3에 명시한다.
두 번째 플라스미드에서, 동일한 taqI 뉴클레아제 유전자 서열을 플라스미드 pMB6722로부터 절제하고 상이한 플라스미드 주쇄, pMB6157에 클로닝하여 새로운 플라스미드 pMB6736을 생산하였다.
플라스미드를 표 2에 개시된 바와 같이 PhoI 호열성 뉴클레아제의 발현을 위해 생산하였다. 코돈 최적화된 phoI 뉴클레아제 ORF 서열을 서열번호 8에 명시된 바와 같은 야로위아 리포리티카 코돈 편향성을 사용하여, 피로코커스 호리코쉬이 OT3의 phoI 뉴클레아제 유전자의 서열(서열번호 9)을 기본으로 드노보 합성하였다. 상기 코돈-최적화된 phoI 뉴클레아제 ORF를 NheI 및 MluI를 사용하여 절단하고 NheI 및 MluI로 절단된 pMB6771에 연결하여 pMB6868을 생산하였다. 생산되는 pMB6868의 암호화된 PhoI 단백질을 서열번호 10에 명시한다.
플라스미드 구축을 기본적인 분자 생물학 및 DNA 조작 과정을 바탕으로 수행하였다. 본 실시예 및 다른 실시예들에 개시된 모든 기본적인 분자 생물학 및 DNA 조작 과정들은 일반적으로 문헌[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (eds). 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York]; 문헌[Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (eds). 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York]에 따라 수행된다.
플라스미드
플라스미드 주쇄 삽입물 올리고 또는 공급원
pMB6722 pMB5082(URA3) taqI 합성된 NheI-MluI 단편
pMB6736 pMB6157(HygR) taqI pMB6722로부터의 NheI-MluI 단편
pMB6868 pMB6771(HygR) phoI 합성된 NheI-MluI 단편
실시예 2: TaqI 뉴클레아제를 발현하는 야로위아 리포리티카의 뉴클레아제 활성의 입증
본 실시예에서, TaqI 뉴클레아제를 암호화하는 유전자를 야로위아 리포리티카의 숙주 균주에 도입시켰다. 상기 숙주 균주 중의 TaqI 뉴클레아제 활성을 시험하였다.
플라스미드 pMB6722를 XbaI로 절단하고 숙주 균주 ML8195(표 1)내로 형질전환시켰다. 야로위아 균주 ML8195는 앞서 라이코펜을 생산하도록 유전자 변형된 균주이다. 이종 taqI 뉴클레아제 유전자가 도입된 형질전환체를 0.12 mM 아데닌이 보충된 YNB 글루타메이트 플레이트상에서 선택하고; 하나의 상기와 같은 콜로니를 선택하여 야로위아 균주 ML12805로서 표시하였다. ML12805를 125 ㎖ 플라스크 중의 20 ㎖ YPD 배지 중에서 30 ℃, 250 rpm에서 3일 동안 배양하였다. 상기 배양물을 분할하고 1.5 ㎖ 분액을 65 ℃ 또는 25 ℃에서 5분 내지 24시간 동안 배양하였다.
균주 ML8195 및 ML12805로부터 DNA를 추출하고 65 ℃ 또는 25 ℃에서 배양 후 분석하였다. DNA를 "스매쉬 앤드 그랩(Smash and Grab)" 효모 게놈 DNA 추출 프로토콜을 사용하여 추출하였다. 필수적으로, 1.5 ㎖의 3-일 배양물을 펠릿화하고, 상등액을 경사분리하고 세포를 0.5 ㎖ 수에 재현탁시켰다. 세포를 10초 동안 펠릿화하고 상등액을 경사분리하였다. 상기 펠릿을 0.2 ㎖ 스매쉬 앤드 그랩 용액(1% SDS, 2% 트리톤-X100, 100 mM NaCl, 10 mM 트리스 pH 8.0, 1 mM EDTA) 및 0.2 ㎖ 페놀-클로로폼-아이소아밀 알콜 중에 재현탁시키고 0.3 g 유리 비드를 가하였다. 상기 튜브를 다중-튜브 홀더를 사용하여 5분 동안 와동시켰다. 상기 혼합물에 0.2 ㎖ TE pH 8.0(10 mM 트리스, 1 mM EDTA)을 가하고 5분 동안 원심분리시켰다. 수성상을 새로운 튜브로 옮기고 1.0 ㎖ 저온 에탄올을 가하고 혼합하여 DNA를 침전시켰다. 5분 동안 원심분리 후에, 상등액을 제거하였다. 상기 펠릿을 75 ㎍/㎖ RNaseA가 있는 0.4 ㎖ TE 중에 재현탁시키고 실온에서 5분 동안 배양하였다. 10 ㎕의 4M 암모늄 아세테이트 및 1.0 ㎖의 에탄올을 가하였다. 얼음상에서 5분 동안 배양하고 10분 동안 원심분리 후에, 상등액을 버렸다. 상기 펠릿을 0.5 ㎖의 70% 에탄올로 세척하고 10분 동안 원심분리시켰다. 상기 상등액을 버리고, 펠릿을 공기 건조시키고, 이어서 100 ㎕ TE에 재현탁시켰다. 상기 추출 공정으로부터 생산되는 DNA를 100 V에서 1.5시간 동안 1x 트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 실행 완충제 중의 0.8% 아가로스 젤상에서 전기영동에 의해 분석하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, taqI 뉴클레아제 유전자가 없는 야로위아 리포리티카의 숙주 균주(ML8195)는 65 ℃ 또는 25 ℃에서 DNA 분해 활성을 나타내지 않았다. taqI 뉴클레아제 유전자를 갖는 야로위아 리포리티카의 숙주 균주(ML12805)는 65 ℃에서는 DNA 분해 활성을 나타내었지만 25 ℃에서는 아니었다. 상기 분해 활성을, 세포 배양물을 65 ℃에서 배양시킨 후에 20분 정도 일찍 관찰하였다. 상기 ML12805 균주는 24시간 동안 배양한 후에조차 25 ℃에서 어떠한 DNA 분해 활성도 나타내지 않았으며, 이는 상기 야로위아 리포리티카 균주에서 TaqI 뉴클레아제가 25 ℃에서 잠복성임을 나타낸다.
실시예 3: TaqI의 온도 활성 프로파일
본 실시예에서, TaqI 뉴클레아제의 활성을 상이한 온도에서 검사하였다.
야로위아 리포리티카 균주 ML12805 및 ML8195를 실시예 2에 개시된 바와 같이 3일 동안 증식시켰다. 1.5 ㎖ 분액의 ML12805 및 ML8195 세포를 25 ℃, 30 ℃, 40 ℃, 50 ℃ 및 65 ℃의 온도에서 1.5시간 동안 배양하고 실시예 2에 개시된 바와 같이 DNA를 추출하고 분석하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, DNA 분해는 균주 ML12805 및 ML8195 모두에서 25 ℃, 30 ℃, 40 ℃ 및 50 ℃의 온도에서 관찰되지 않았다. DNA 분해는 실시예 2에 도시된 바와 같이, 오직 균주 ML12805에서만, 65 ℃에서 관찰되었다. 상기 결과는 TaqI 뉴클레아제가 50 ℃ 이하의 온도에서 잠복성임을 나타낸다.
실시예 4: 생체내 TaqI -절단된 gDNA의 PCR 분석
본 실시예에서, 재조합 야로위아 리포리티카 균주에서의 이종 carB 유전자의 분해를 검사하였다.
상기 carB 유전자는 길이가 1740 뉴클레오타이드이며 카로티노이드 생합성 경로의 효소인 피토엔 데하이드로게나제를 암호화한다. 상기 carB 유전자를 카로티노이드를 생산할 수 있도록 야로위아 리포리티카에 도입시켰다. 실시예 2에 개시된 바와 같이, ML8195는 어떠한 호열성 뉴클레아제도 없는 라이코펜-생산 균주이고, ML12805는 taqI 뉴클레아제 유전자를 함유하는 ML8195의 유도체이며; 따라서 상기 두 균주는 모두 carB 유전자를 함유한다.
상기 carB 유전자의 존재를 균주 ML8195 및 ML12805에서 25 ℃ 및 65 ℃ 모두에서 검사하였다. 25 ℃ 또는 65 ℃에서 24시간 동안 배양된 ML12805로부터의 게놈 DNA의 일련의 희석물을 제조하였다. PCR을 상기 carB 유전자의 529 bp 단편을 증폭시키기 위해 설계된 프라이머를 사용하여 상기 샘플들상에서 수행하였다. 프라이머 MO4641의 서열을 서열번호 5에 명시한다. 프라이머 MO4642의 서열을 서열번호 6에 명시한다. 올리고 MO4641 및 MO4642 사이의 carB 유전자의 DNA 단편은 2개의 TaqI 부위를 함유한다.
PCR을 하기에 개시된 조건하에서 수행하였다. 각각 25 ㎕ 반응기에서, 1 ㎕의 희석된 gDNA를 0.5 ㎕의 각 프라이머(10 μM 모액), 0.5 ㎕의 물 및 22.5 ㎕의 백금 Taq 슈퍼 믹스와 합하였다. 반응 매개변수는 94 ℃에서 2분 동안 1주기에 이어서 94 ℃에서 30초, 58 ℃에서 30초, 및 72 ℃에서 60초의 45주기였다. MJ 리써치 PTC-225 펠티엘 써말 사이클러(Peltier Thermal Cycler)에서 5분 동안 72 ℃의 최종 단일 주기로 상기 PCR을 마무리하였다. 전체 반응물 + 1x 부하 염료를 0.5 ㎍/㎖ 에티디움 브로마이드와 함께 1x TAE 젤에서 2% 아가로스상에 부하하고 100V에서 1.5시간 동안 실행시켰다.
도 3에 도시된 바와 같이, 상기 taqI 뉴클레아제 유전자가 도입된 야로위아 리포리티카 균주(ML12805)에 대해서, carB의 529 bp PCR 산물이, 25 ℃에서 배양된 샘플 중에서 관찰되었으나, 65 ℃에서 배양된 샘플에서는 관찰되지 않았다(당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 공지된 바와 같이, PCR 주형의 일련의 희석을 수행하여 상기 분석의 감도를 입증하였다). 이러한 결과는 TaqI 뉴클레아제가 65 ℃에서 배양시 균주 ML12805에서 상기 재조합 DNA(carB 유전자)를 분해시켰음을 보인다. 도 3은 또한 균주 ML12805에서 외래 DNA가 분해를 위해 표적화될 수 있으며, 상기 절단을 완료하고, 대략 500 뉴클레오타이드의 검출 가능한 단편을 생산하지 않음을 예시한다.
실시예 5a: taqI 호열성 뉴클레아제 유전자를 갖는 야로위아 리포리티카 균주에서 아스타잔틴 생산
본 실시예에서, 야로위아 리포리티카의 균주에서 taqI 뉴클레아제 유전자의 도입 전후에 아스타잔틴의 생산을 검사하였다.
본 실시예에서, 아스타잔틴을 생산하는 야로위아 리포리티카의 균주(ML11956)를 사용하였다. 2차 균주(ML12924)를, 균주 ML11956에 taqI 뉴클레아제 유전자(MB6736)를 도입시킴으로써 구축하였다. 상기 두 균주 모두에서 아스타잔틴 및 그의 전구체의 양을 측정하였다. 측정은 세포 증식 기간 동안 및 상기 숙주 균주를 65 ℃에서 배양한 후에 상이한 시점들에서 수행되었다.
균주 ML11956 및 ML12924를 유가 공정을 사용하여 발효기에서 증식시켰다. 샘플들을 상기 발효 공정 동안 상이한 시점들에서 취하고 카로티노이드 분석을 앞서 미국특허 제 7,851,199 B2 호에 개시된 방법에 따라 수행하였다.
도 4는 아스타잔틴의 양이 균주 ML11956이 증식함에 따라 증가하였고 상기 생산은 결국 평탄역에 도달하였음을 보인다. 상기 아스타잔틴의 양은 ML11956을 65 ℃에서 배양한 후에 변하지 않았다. 균주 ML12924는 균주 ML11956과 동일한 방식으로 반응하였다. 균주 ML12924에 의해 생산된 아스타잔틴의 양은 상기 발효 기간 전체를 통해서 및 65 ℃에서 배양 후에 균주 ML11956에서와 동일하였다. 상기 생산된 아스타잔신 전구체의 양은 또한 65 ℃에서 배양 전후에 균주 ML11956 및 ML12924에서 변하지 않은 채로 남아있었다. 상기 결과는 상기 taqI 뉴클레아제 유전자의 도입도, 그의 활성의 활성화도 야로위아 리포리티카에 의해 생산된 아스타잔틴의 양 또는 순도에 영향을 미치지 않았음을 보인다.
실시예 5b: taqI 호열성 뉴클레아제 유전자를 갖는 야로위아 리포리티카 균주에서 제아잔틴 생산
본 실시예에서, 상기 taqI 뉴클레아제 유전자를 갖는 야로위아 리포리티카의 숙주 균주에서 제아잔틴의 생산을 검사하였다.
본 실시예에서, 제아잔틴을 생산하는 야로위아 리포리티카의 균주(ML11218)를 taqI 뉴클레아제 유전자(MB6736)로 형질전환시켰다. 상기 생산되는 야로위아 리포리티카 균주(ML12921)에서, 생산된 제아잔틴 및 그의 전구체의 양을 측정하였다. 측정은 세포 증식 기간 동안 상이한 시점들에서 수행되었으며 상기 숙주 균주를 65 ℃에서 배양한 후에 또한 수행되었다.
균주 ML12921을 유가 공정을 사용하여 발효기에서 증식시켰다. 샘플들을 상기 발효 공정 동안 상이한 시점들에서 취하고 카로티노이드 분석을 앞서 미국특허 제 7,851,199 B2 호에 개시된 방법에 따라 수행하였다.
도 5는 제아잔틴의 양이 균주 ML12921이 증식함에 따라 증가하였고 상기 생산은 결국 평탄역에 도달하였음을 보인다. 상기 제아잔틴의 양은 숙주 세포를 65 ℃에서 배양한 후에 변하지 않았다. 제아잔틴 전구체의 양도 또한 상기 숙주 세포를 65 ℃에서 배양한 후에 동일하게 남아있었다. 대조용 균주 ML11218(도시되지 않음)에서, 제아탄신 생산은 모든 시험 조건에서 ML12921과 유사하였다. 상기 결과는 상기 taqI 뉴클레아제의 도입도, 그의 활성화도 야로위아 리포리티카에서 제아잔틴의 생산 또는 순도에 영향을 미치지 않음을 보인다.
실시예 5c: 아스타잔틴 또는 제아잔틴을 생산하는 균주에서 TaqI 뉴클레아제 활성의 입증
본 실시예에서, 실시예 5a 및 5b에 개시된 야로위아 리포리티카 균주 ML11956, ML12924, 및 ML12921의 TaqI 뉴클레아제 활성을 검사하였다.
균주 ML11956, ML12924 및 ML12921을 발효기에서 증식시켰다. 균주 ML11956 및 ML12924(보다 오랜 발효에서 아스타잔틴을 생산한다)의 경우, 샘플들을 접종 후 46, 121 및 236시간 째에 취하였다. 균주 ML12921(보다 짧은 발효에서 제아잔틴을 생산한다)의 경우, 샘플들을 접종 후 46 및 69시간 째에 취하였다. 상기 발효 공정의 끝에서(아스타잔틴 균주의 경우 236시간 및 제아잔틴 균주의 경우 69시간), 온도를 65 ℃로 상승시키고 균주들을 상기 온도에서 6시간 동안 배양하였다. 샘플들을 보다 높은 온도로의 이동 후 0분, 10분, 30분, 2시간 및 6시간째에 취하였다. DNA를 실시예 2에 개시된 바와 같이 추출하고 분석하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, DNA 분해는 뉴클레아제가 없는 균주 ML11956에서 관찰되지 않았다. 균주 ML12924 및 ML12921 모두에서, DNA 분해는 상기 세포를 65 ℃에서 배양시킨 후에 관찰되었다. 상기 결과는 상기 TaqI 뉴클레아제가 야로위아 리포리티카 균주에서 상기 발효 온도에서 잠복성이지만 65 ℃에서는 활성이고, 이는 목적하는 최종 산물(아스타잔틴 또는 제아잔틴)의 양 또는 순도에 영향을 미치지 않으면서 DNA 분해를 허용함을 나타낸다.
실시예 6: 각각의 최적조건 부근에 집중된 TaqI 및 PhoI에 대한 온도 범위
본 실시예에서, TaqI 및 PhoI 뉴클레아제의 활성을 그들의 최적 온도 및 그 부근에서 검사하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 상기 taqI 뉴클레아제 유전자를 갖는 야로위아 리포리티카의 균주(ML12921)는 65 ℃에서 DNA 분해 활성을 나타내었지만 25 ℃에서는 나타내지 않았다. ML12921은 60 ℃ 및 70 ℃, 즉 TaqI 뉴클레아제 활성에 대한 최적 온도인 65 ℃의 ±5℃에서 DNA 분해 활성을 추가로 나타내었다. 유사하게, PhoI 뉴클레아제 유전자를 갖는 야로위아 리포리티카의 균주(ML13270)는 75 ℃에서 DNA 분해 활성을 나타내었지만 25 ℃에서는 나타내지 않았다. ML13270은 70 ℃ 및 80 ℃, 즉 PhoI 뉴클레아제 활성에 대한 최적 온도인 75 ℃의 ±5℃에서 DNA 분해 활성을 또한 나타내었다. 상기 결과는 외인성 뉴클레아제 유전자로 형질전환된 야로위아 리포리티카 숙주 균주에서, 상기 숙주 균주의 게놈 DNA가 상기 뉴클레아제 유전자의 최적 온도 부근에 집중된 10도 이상의 온도 범위내에서 분해될 수 있음을 나타낸다. 상기 결과는 각각의 뉴클레아제가 상이한 최적 온도를 갖는 2개의 상이한 뉴클레아제들에서 관찰되었다.
실시예 7: 세균 발현을 위한 플라스미드의 생산
플라스미드를 표 3에 나타낸 바와 같이 에스케리키아 콜라이에서 TaqI 호열성 뉴클레아제의 발현을 위해 생산하였다. 코돈 최적화된 taqI 뉴클레아제 ORF 서열을 서열번호 11에 명시된 바와 같은 에스케리키아 콜라이 코돈 편향성을 사용하여, 써무스 아쿠아티쿠스의 taqI 뉴클레아제 유전자의 서열(서열번호 2)을 기본으로 드노보 합성하였다. 상기 코돈-최적화된 taqI 뉴클레아제 ORF를 NcoI 및 Acc65I를 사용하여 절단하고 NcoI 및 Acc65I로 절단된 pMB4124(KanR oriP15)에 연결시켜 pMB7268(trcP - taqI)을 생산하였다. 상기 생산되는 pMB7268의 암호화된 TaqI 단백질을 서열번호 3에 명시한다.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 TaqI 호열성 뉴클레아제의 발현을 위해서, 단편을 올리고 MO9315 및 MO9316 및 주형으로서 pMB6736을 사용하여 PCR에 의해 생산하고, NcoI 및 KpnI로 절단하고 NcoI 및 Acc65I로 절단된 pMB4124에 연결시켜 pMB7263(trcP-taqI)을 생산하였다. 상기 생산되는 pMB7263의 암호화된 TaqI 단백질을 서열번호 3에 명시한다. 프라이머 MO9315의 서열을 서열번호 12에 명시한다. 프라이머 MO9316의 서열을 서열번호 13에 명시한다.
플라스미드
플라스미드 주쇄 삽입물 올리고 또는 공급원
pMB4124 KanR oriP15 lac1 q trcP lacZ 앞서 합성된
pMB7268 pMB4124 taqI 합성된 NcoI-Acc65I 단편
pMB7263 pMB4124 taqI 올리고 MO9315 및 MO9316 및 주형으로서 pMB6736을 사용하여 PCR 증폭된
실시예 8: TaqI 뉴클레아제를 발현하는 에스케리키아 콜라이의 뉴클레아제 활성의 입증
본 실시예에서, TaqI 뉴클레아제를 암호화하는 유전자를 에스케리키아 콜라이의 숙주 균주에 도입시켰다. 상기 숙주 균주 중의 TaqI 뉴클레아제 활성을 시험하였다.
pMB4124(trcP - lacZ) 또는 pMB7268(trcP-taqI)을 갖는 에스케리키아 콜라이 DH5α(F-Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA - argF) U169 recAl endA1 hsdRl7(rK-, mK+) phoA supE44λ-thi-l gyrA96 relAV)를 30 ℃에서 지수 증식기로 증식시키고, 37 ℃로 1시간 동안 이동시키고, 500 μM 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 2.5시간 동안 유도하였다. 이어서 세포를 25 ℃에서 4 및 18시간 동안, 또는 65 ℃에서 1.5, 4 및 18시간 동안 배양하였다. 전체 DNA를 제조사의 권장사항에 따라 퀴아겐(Qiagen) 혈액 및 조직 DNeasy 키트를 사용하여 약 1 A600 단위의 세포로부터 제조하였으나, 단 프로테이나제 K 절단을 위한 배양 온도를 22 ℃로 변화시켰다. 도 8에서 보이는 바와 같이, trcP - taqI 구조물을 갖는 세포는 65 ℃에서 광범위한 DNA 분해를 보였으나 25 ℃에서는 보이지 않았다. 상기 trcP -taqI 구조물이 없는 대조용 세포는 어느 온도에서도 분해를 나타내지 않는다.
실시예 9: TaqI 뉴클레아제를 발현하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 뉴클레아제 활성의 입증
본 실시예에서, TaqI 뉴클레아제를 암호화하는 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰의 숙주 균주에 도입시켰다. 상기 숙주 균주 중의 TaqI 뉴클레아제 활성을 시험하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 균주 MA428을, ATCC 13032의 고유 hom ( thrA )-thrB 오페론을 코리네박테리움 글루타미쿰 gpd 프로모터(미국특허 출원 제 10/858,730 호, 현재 포기됨)에 의해 구동되는 스트렙토마이세스 코엘리콜라 hom의 피드백-내성 대립유전자(G362E)로 대체하여 구축하였다. 상기 균주를 pMB7263(trcP-taqI)으로 형질전환시키고, KanR 콜로니를 20 ㎍/㎖ 가나마이신이 보충된 BHI 배지에서 30 ℃에서 증식시키고, 밤새 250 μM IPTG로 유도하였다. 이어서 세포를 25, 60, 65 또는 70 ℃에서 배양하고, DNA를 그람-양성 세균에 대한 제조사의 권장사항에 따라 퀴아겐 혈액 및 조직 DNeasy 키트를 사용하여 추출하였으나, 단 프로테이나제 K 절단에 대한 배양 온도를 22 ℃로 변화시켰다. 상기 trcP - taqI 구조물을 갖는 세포를 25 ℃에서 5시간 및 65 ℃에서 0.5, 1, 2.5 및 5시간 동안 배양하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 상기 trcP - taqI 구조물을 함유하는 세포는 65 ℃에서 광범위한 DNA 분해를 나타내었지만 25 ℃에서는 나타내지 않았다. 도 10은 상기 활성의 온도 의존성을 도시한다(모든 배양은 5시간 동안 수행되었다). 숙주 균주 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 DNA는 65 ℃의 TaqI 뉴클레아제에 대한 최적 온도 부근에 집중된 10도 이상의 온도 범위내에서 분해되었다.
본 발명에 개시된 다양한 태양, 실시태양 및 선택사항들은 모두 모든 변화로 병행될 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원들은 각각의 개별적인 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 인용됨을 가리키는 것과 동일한 정도로 본 발명에 참고로 인용된다.
<110> DSM IP ASSETS B.V. <120> USE OF THERMOPHILIC NUCLEASES FOR DEGRADING NUCLEIC ACIDS <130> 29097-WO-PCT[2] <140> PCT/US2014/026379 <141> 2014-03-13 <150> US 61/794,400 <151> 2013-03-15 <150> US 61/928,080 <151> 2014-01-16 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 811 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence containing the codon optimized taqI gene <400> 1 gctagccaca aaaatggctt ccactcaggc tcagaaggct cttgagactt tcgagcgatt 60 tctcgcttct cttgacctgg agtcctacca gcagaagtac cgacccatca agactgttga 120 gcaggacctt ccccgagagc tgaaccccct tcccgacctg tacgagcact actggaaggc 180 ccttgaggat aacccctcct tcctgggctt cgaggagttc tttgaccact ggtgggagaa 240 gcgacttcga cccctcgacg agttcattcg aaagtacttt tggggttgct cctacgcctt 300 tgttcgactt ggccttgagg ctcgactgta ccgaactgcc gtttccatct ggactcagtt 360 tcacttctgc taccgatgga acgcctcctg cgagcttccc cttgaggccg cccccgagct 420 tgacgcccag ggcattgacg ccctgattca cacttccggt tcctctaccg gaatccagat 480 caagaaggag acttaccgat ccgaggccaa gtccgagaac cgatttctcc gaaagcagcg 540 aggcaccgcc ctcatcgaga ttccctacac ccttcagact cccgaggagc ttgaggagaa 600 ggccaagcga gcccgagtta acggagagac ttaccgactt tgggccaagg ttgctcacca 660 ccttgaccga cttgagaacg gttttgtcat ttttcgagag tcttacgtta agtctattga 720 gcttttcctc cagaagaacg ctcccaccct ttctggactc attcgatggg accgagttgc 780 tcaggaggcc ctcaccgccc cctaaacgcg t 811 <210> 2 <211> 792 <212> DNA <213> Thermus aquaticus <220> <223> taqI gene <400> 2 atggcttcca cacaagccca gaaagcgctc gaaacttttg agcgttttct cgcaagcttg 60 gacctcgagt cctaccagca aaagtaccgc cctatcaaaa cggttgaaca agacctgcct 120 agggagctga acccgcttcc ggacctgtac gagcattatt ggaaagcgct tgaggataac 180 ccttccttcc tgggcttcga agagttcttt gaccactggt gggaaaagcg cctacggccc 240 ttggacgagt tcatacgcaa atacttttgg ggatgctcct acgcgtttgt tcgcttgggc 300 ctcgaggcta ggctgtaccg aacagccgtt tccatctgga ctcagtttca cttctgctac 360 cgctggaacg cctcctgcga gcttcctcta gaagctgccc cagaactcga cgcccaaggg 420 atagacgcgc tgattcatac aagcgggtcc tcaacaggaa tccagatcaa aaaggaaact 480 taccgttccg aggccaagag cgagaaccgc tttttaagga agcaaagagg caccgccctc 540 atcgagattc cctacaccct gcagacacca gaggagctcg aagaaaaagc caaacgggca 600 agagtgaacg gagaaaccta ccgtctatgg gccaaggttg cacaccattt ggaccgtcta 660 gaaaacggat tcgtcatttt tcgggaaagt tatgtgaaaa gcattgagct ttttctccag 720 aaaaacgctc ctaccctatc tgggctcatc cgctgggaca gggtggccca ggaagccctc 780 accgccccgt ga 792 <210> 3 <211> 263 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <220> <223> Amino Acid sequence of TaqI nuclease <400> 3 Met Ala Ser Thr Gln Ala Gln Lys Ala Leu Glu Thr Phe Glu Arg Phe 1 5 10 15 Leu Ala Ser Leu Asp Leu Glu Ser Tyr Gln Gln Lys Tyr Arg Pro Ile 20 25 30 Lys Thr Val Glu Gln Asp Leu Pro Arg Glu Leu Asn Pro Leu Pro Asp 35 40 45 Leu Tyr Glu His Tyr Trp Lys Ala Leu Glu Asp Asn Pro Ser Phe Leu 50 55 60 Gly Phe Glu Glu Phe Phe Asp His Trp Trp Glu Lys Arg Leu Arg Pro 65 70 75 80 Leu Asp Glu Phe Ile Arg Lys Tyr Phe Trp Gly Cys Ser Tyr Ala Phe 85 90 95 Val Arg Leu Gly Leu Glu Ala Arg Leu Tyr Arg Thr Ala Val Ser Ile 100 105 110 Trp Thr Gln Phe His Phe Cys Tyr Arg Trp Asn Ala Ser Cys Glu Leu 115 120 125 Pro Leu Glu Ala Ala Pro Glu Leu Asp Ala Gln Gly Ile Asp Ala Leu 130 135 140 Ile His Thr Ser Gly Ser Ser Thr Gly Ile Gln Ile Lys Lys Glu Thr 145 150 155 160 Tyr Arg Ser Glu Ala Lys Ser Glu Asn Arg Phe Leu Arg Lys Gln Arg 165 170 175 Gly Thr Ala Leu Ile Glu Ile Pro Tyr Thr Leu Gln Thr Pro Glu Glu 180 185 190 Leu Glu Glu Lys Ala Lys Arg Ala Arg Val Asn Gly Glu Thr Tyr Arg 195 200 205 Leu Trp Ala Lys Val Ala His His Leu Asp Arg Leu Glu Asn Gly Phe 210 215 220 Val Ile Phe Arg Glu Ser Tyr Val Lys Ser Ile Glu Leu Phe Leu Gln 225 230 235 240 Lys Asn Ala Pro Thr Leu Ser Gly Leu Ile Arg Trp Asp Arg Val Ala 245 250 255 Gln Glu Ala Leu Thr Ala Pro 260 <210> 4 <211> 1740 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <223> carB <400> 4 atgtccaaga aacacattgt cattatcggt gctggcgtgg gtggcacggc tacagctgct 60 cgtttggccc gcgaaggctt caaggtcact gtggtggaga aaaacgactt tggtggcggc 120 cgctgctcct tgatccatca ccagggccat cgctttgatc agggcccgtc gctctacctg 180 atgcccaagt actttgagga cgcctttgcc gatctggacg agcgcattca agaccacctg 240 gagctgctgc gatgcgacaa caactacaag gtgcactttg acgacggtga gtcgatccag 300 ctgtcgtctg acttgacacg catgaaggct gaattggacc gcgtggaggg cccccttggt 360 tttggccgat tcctggattt catgaaagag acacacatcc actacgaaag cggcaccctg 420 attgcgctca agaagaattt cgaatccatc tgggacctga ttcgcatcaa gtacgctcca 480 gagatctttc gcttgcacct gtttggcaag atctacgacc gcgcttccaa gtacttcaag 540 accaagaaga tgcgcatggc attcacgttt cagaccatgt atatgggcat gtcgccctac 600 gatgcgcctg ctgtctacag cctgttgcag tacaccgagt tcgctgaagg catctggtat 660 ccccgtggcg gcttcaacat ggtggttcag aagctagagg cgattgcaaa gcaaaagtac 720 gatgccgagt ttatctacaa tgcgcctgtt gccaagatta acaccgatga tgccaccaaa 780 caagtgacag gtgtaacctt ggaaaatggc cacatcatcg atgccgatgc ggttgtgtgt 840 aacgcagatc tggtctatgc ttatcacaat ctgttgcctc cctgccgatg gacgcaaaac 900 acactggctt ccaagaaatt gacgtcttct tccatttcct tctactggtc catgtccacc 960 aaggtgcctc aattggacgt gcacaacatc tttttggccg aggcttatca ggagagcttt 1020 gacgaaatct tcaaggactt tggcctgcct tctgaagcct ccttctacgt caatgtgccc 1080 tctcgcatcg atccttctgc tgctcccgac ggcaaggact ctgtcattgt cttggtgcct 1140 attggtcata tgaagagcaa gacgggcgat gcttccaccg agaactaccc ggccatggtg 1200 gacaaggcac gcaagatggt gctggctgtg attgagcgtc gtctgggcat gtcgaatttc 1260 gccgacttga ttgagcatga gcaagtcaat gatcccgctg tatggcagag caagttcaat 1320 ctgtggagag gctcaattct gggtttgtct catgatgtgc ttcaggtgct gtggttccgt 1380 cccagcacaa aggattctac cggtcgttat gataacctat tctttgtggg tgcaagcacg 1440 catcccggaa ctggtgttcc cattgtcctt gcaggaagca agctcacctc tgaccaagtt 1500 gtcaagagct ttggaaagac gcccaagcca agaaagatcg agatggagaa cacgcaagca 1560 cctttggagg agcctgatgc tgaatcgaca ttccctgtgt ggttctggtt gcgcgctgcc 1620 ttttgggtca tgtttatgtt cttttacttc ttccctcaat ccaatggcca aacgcccgca 1680 tcttttatca ataatttgtt acctgaagta ttccgcgttc ataactctaa tgtcatttaa 1740 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer M04641 <400> 5 caatctgttg cctccctgc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer M04642 <400> 6 atcctttgtg ctgggacgg 19 <210> 7 <211> 558 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <223> crtZ-Dc <400> 7 atgcttgcgt tgtggaatac cgggatcgtg ctactgacta tcatcatcat ggaaggggtg 60 gcaacgttcg cacacaagta catcatgcac ggctggggat ggggctggca tcattcgcac 120 cataccccgc gcaaaggggc gtttgagcgt aacgatctct atgcggtggt gtttgcgcta 180 ctggccattg cgctgattta cgcgggcagc gaagggtact ggccgcttca gtggattggc 240 gcgggaatga ccggctacgg cgtgatctac tttatcgttc acgatggtct tgtccaccag 300 cgctggccgt tccgttacgt gccgcgccgc ggctatctgc gccgcctcta catggcacac 360 cggctgcatc acgcggtgcg ggggcgcgaa gggtgcgtct ccttcgggtt tatctacgcc 420 ccaccggtgg acaagctgca ggcggtgctg cgcgaacgta acggcagacc cgccagcgcg 480 ggcgctgcca gaggtgcgga tcgcgcggcg gccagctcgc cttccgggaa gccatcgcct 540 gcttcgcgcc ggaaataa 558 <210> 8 <211> 977 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence containing the codon optimized phoI gene <400> 8 tgctagccac aaaaatggag atgtacaagg ttggtcgata cctcgttgat tccctccaga 60 tttacttccc cgcttctctt gagatccagg aggagcttat taacaacggc ttctacgttc 120 cccgatctcc tgatcgaaag gtttctatgc ccattcccat tgtttactcc gattttggtg 180 gtcgagttat ttctattgag cgactcattc ctcccgagtg gcttgagatt tctcccgagc 240 agctcggttg ggaggagact taccttgaga acaagcgagg tttcaagctc cctaaggagg 300 aggtttacgt tgatgtttct atttctaacg attccattat tttcgagctt gacgttaaga 360 actaccacct tgagcgaacc tccattcgag gcatcaaccc tgagaagtgg aagaactggg 420 ttatgtttta cattgatctc aagtacgttg atgagttcat taacgctctt cgagagcaca 480 tccctgcttt cgagaacaag acccgagtta ttcgagagaa gcagcagggt ggcaaggagg 540 ttacttacta cgctaaggtt aacgtcaaga acttctctct ttgtctcggt tgtttcgatc 600 tcgctcagcg ataccttcag atcaaggcta aggagcactg taacatttac cctggttctc 660 ccacctgtaa cgattctctc tctaagctca agctccgact tgagtacgat ccctccatta 720 ccacctttgc taaggttggt attgccaaga tttctggtaa gcgaccccag atcatggtta 780 agctcacctc taccgagact aagaccattc gaggtattct caagcctgag attaagggta 840 aggcccgagg taagctcgtt tactgtgatc accgagagaa gcgacagtac attgctcttg 900 acctcttcga tttttacaag gccctcgttt ctactaagaa gtacgagggt aagctcccta 960 ccgatgatta aacgcgt 977 <210> 9 <211> 957 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <220> <223> phoI gene <400> 9 atggaaatgt ataaggttgg aagatacctt gttgattccc ttcaaatata ttttcccgct 60 tcactagaga tccaggagga gcttataaat aatggcttct acgtacccag gagcccagat 120 agaaaagtaa gcatgccaat tccaatagta tactccgatt ttggagggag ggttatatct 180 attgagaggt taatacctcc ggagtggctt gaaatctcgc cagagcaatt aggttgggaa 240 gaaacttatt tagagaacaa acgtggtttt aaactaccta aagaagaggt ctacgtggat 300 gttagtataa gcaacgattc cataatattc gagctagacg tgaaaaatta tcaccttgaa 360 aggacatcca ttagaggcat caatcctgaa aaatggaaga attgggtgat gttttatatt 420 gatttgaagt acgtagatga gttcattaac gctttaaggg aacatatccc agctttcgaa 480 aataaaacaa gggttattcg tgaaaagcag caagggggca aggaagttac atattatgct 540 aaagttaacg tcaagaattt cagcttatgc ttaggatgct tcgatctcgc tcaaaggtat 600 cttcaaatca aagctaaaga gcactgtaac atatatccag gctcaccaac atgtaacgat 660 tctctaagca aattaaaatt aaggcttgaa tacgatccat ccattactac ctttgctaaa 720 gttggaatag ccaagatctc aggcaagaga ccccagatca tggttaaatt aacctctacg 780 gaaactaaaa ctataagggg aatacttaag ccagaaataa aaggtaaggc gcgtggtaaa 840 cttgtatatt gcgatcacag agaaaagaga cagtatatag ctttggactt gtttgatttt 900 tacaaggcct tggtaagcac taagaagtat gaaggtaagc taccgactga tgattaa 957 <210> 10 <211> 318 <212> PRT <213> Pyrococcus horikoshii <220> <223> Amino acid sequence of PhoI nuclease <400> 10 Met Glu Met Tyr Lys Val Gly Arg Tyr Leu Val Asp Ser Leu Gln Ile 1 5 10 15 Tyr Phe Pro Ala Ser Leu Glu Ile Gln Glu Glu Leu Ile Asn Asn Gly 20 25 30 Phe Tyr Val Pro Arg Ser Pro Asp Arg Lys Val Ser Met Pro Ile Pro 35 40 45 Ile Val Tyr Ser Asp Phe Gly Gly Arg Val Ile Ser Ile Glu Arg Leu 50 55 60 Ile Pro Pro Glu Trp Leu Glu Ile Ser Pro Glu Gln Leu Gly Trp Glu 65 70 75 80 Glu Thr Tyr Leu Glu Asn Lys Arg Gly Phe Lys Leu Pro Lys Glu Glu 85 90 95 Val Tyr Val Asp Val Ser Ile Ser Asn Asp Ser Ile Ile Phe Glu Leu 100 105 110 Asp Val Lys Asn Tyr His Leu Glu Arg Thr Ser Ile Arg Gly Ile Asn 115 120 125 Pro Glu Lys Trp Lys Asn Trp Val Met Phe Tyr Ile Asp Leu Lys Tyr 130 135 140 Val Asp Glu Phe Ile Asn Ala Leu Arg Glu His Ile Pro Ala Phe Glu 145 150 155 160 Asn Lys Thr Arg Val Ile Arg Glu Lys Gln Gln Gly Gly Lys Glu Val 165 170 175 Thr Tyr Tyr Ala Lys Val Asn Val Lys Asn Phe Ser Leu Cys Leu Gly 180 185 190 Cys Phe Asp Leu Ala Gln Arg Tyr Leu Gln Ile Lys Ala Lys Glu His 195 200 205 Cys Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Pro Thr Cys Asn Asp Ser Leu Ser Lys 210 215 220 Leu Lys Leu Arg Leu Glu Tyr Asp Pro Ser Ile Thr Thr Phe Ala Lys 225 230 235 240 Val Gly Ile Ala Lys Ile Ser Gly Lys Arg Pro Gln Ile Met Val Lys 245 250 255 Leu Thr Ser Thr Glu Thr Lys Thr Ile Arg Gly Ile Leu Lys Pro Glu 260 265 270 Ile Lys Gly Lys Ala Arg Gly Lys Leu Val Tyr Cys Asp His Arg Glu 275 280 285 Lys Arg Gln Tyr Ile Ala Leu Asp Leu Phe Asp Phe Tyr Lys Ala Leu 290 295 300 Val Ser Thr Lys Lys Tyr Glu Gly Lys Leu Pro Thr Asp Asp 305 310 315 <210> 11 <211> 800 <212> DNA <213> Thermus aquaticus <220> <223> DNA sequence encoding TaqI nuclease <400> 11 ccatggcatc aacccaagca caaaaagccc tggaaacctt cgaacgcttc ctggcgagcc 60 tggacctgga atcataccaa cagaaatacc gtccgattaa aaccgtggaa caggatctgc 120 cgcgtgaact gaacccgctg ccggacctgt atgaacatta ctggaaagca ctggaagata 180 atccgtcctt tctgggcttc gaagaatttt tcgatcactg gtgggaaaaa cgtctgcgcc 240 cgctggacga atttattcgc aaatatttct ggggctgcag ctacgcgttt gttcgtctgg 300 gtctggaagc gcgtctgtat cgcaccgccg tcagcatctg gacgcaattt catttctgct 360 accgctggaa cgcctcttgt gaactgccgc tggaagcagc accggaactg gatgcacagg 420 gcattgacgc tctgatccac accagtggca gctctacggg tatccaaatc aaaaaagaaa 480 cctaccgtag tgaagcaaaa tccgaaaatc gttttctgcg caaacagcgt ggtacggctc 540 tgattgaaat cccgtatacc ctgcaaacgc cggaagaact ggaagaaaaa gcaaaacgtg 600 ctcgcgtcaa cggcgaaacc taccgtctgt gggcgaaagt ggcccatcac ctggatcgcc 660 tggaaaatgg ttttgtgatt ttccgtgaat catacgttaa atcgatcgaa ctgttcctgc 720 agaaaaacgc cccgaccctg tcgggcctga ttcgttggga ccgtgtcgca caagaagcac 780 tgaccgctcc gtgaggtacc 800 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer M09315 <400> 12 cacacaccat ggcttccact caggctcag 29 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer M09316 <400> 13 cacacaggta ccttaggggg cggtgagggc ctcc 34

Claims (97)

  1. 호열성 뉴클레아제 유전자를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형된 세포로, 상기 호열성 뉴클레아제 유전자에 의해 생산된 호열성 뉴클레아제가, 상기 세포가 정상적인 생육을 갖는 온도에서 잠복성이고, 상기 유전자 변형된 세포가 하나 이상의 최종 산물을 생산하되, 상기 하나 이상의 최종 산물이 상기 호열성 뉴클레아제는 아닌 세포.
  2. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레아제가 DNA-분해성 뉴클레아제인 세포.
  3. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레아제가 RNA-분해성 뉴클레아제인 세포.
  4. 제 2 항에 있어서,
    DNA-분해성 뉴클레아제가 TaqI 뉴클레아제인 세포.
  5. 제 2 항에 있어서,
    DNA-분해성 뉴클레아제가 PhoI 뉴클레아제인 세포.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 변형된 세포가 식물 기원인 세포.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 변형된 세포가 동물 기원인 세포.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 변형된 세포가 미생물 기원인 세포.
  9. 제 8 항에 있어서,
    미생물이 효모, 진균, 조류, 세균 및 고세균으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 세포.
  10. 제 9 항에 있어서,
    미생물이 야로위아(Yarrowia), 바실러스(Bacillus), 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 파라코커스(Paracoccus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 모르티에렐라(Mortierella), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 아스퍼질러스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium), 트리코더마(Trichoderma), 크립테코디니움(Crypthecodinium), 스키조키트리움(Schizochytrium), 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 세포.
  11. 제 10 항에 있어서,
    야로위아 종이 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)인 세포.
  12. 제 11 항에 있어서,
    최종 산물이 피토엔, 라이코펜, 베타-카로틴, 알파-카로틴, 베타-크립토잔틴, 루테인, 제아잔틴, 아스타잔틴, 칸타잔틴, 에키네논, 3-하이드록시에키네논, 3'-하이드록시에키네논, 아도니루빈, 비올라잔틴, 아도니잔틴, 유비퀴논, 비타민 K, 비타민 E, 레티놀, 레티날, 레티노산, 레티닐 팔미테이트, 및 이들의 변형된 형태들로 이루어지는 군 중에서 선택되는 세포.
  13. 제 1 항에 있어서,
    호열성 뉴클레아제의 유전자가 숙주 세포의 코돈 사용 편향성에 맞도록 코돈 최적화된 세포.
  14. 제 4 항에 있어서,
    TaqI 뉴클레아제가 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 세포.
  15. 제 5 항에 있어서,
    PhoI 뉴클레아제가 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 세포.
  16. 제 1 항에 있어서,
    최종 산물의 생산이 이종 핵산 서열을 함유하지 않는 세포로부터의 최종 산물의 생산에 비해 변화가 전혀 없거나 거의 없는 세포.
  17. 제 1 항에 있어서,
    하나 초과의 호열성 뉴클레아제 유전자의 조합을 포함하는 세포.
  18. 숙주 세포의 핵산을 생체내 및/또는 원위치에서 분해시키는 방법으로, 상기 숙주 세포가 호열성 뉴클레아제 유전자를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하고,
    (a) 상기 숙주 세포를 상기 호열성 뉴클레아제가 잠복성인 온도에서 생육시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서의 온도를 상기 호열성 뉴클레아제가 활성인 온도로 변화시킴으로써 상기 숙주 세포의 핵산을 분해시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    뉴클레아제가 DNA-분해성 뉴클레아제이고 핵산이 DNA인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    숙주 세포의 DNA가 재조합 DNA를 함유하는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서,
    뉴클레아제가 RNA-분해성 뉴클레아제이고 핵산이 RNA인 방법.
  22. 제 18 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (a)에서의 온도가 숙주 세포의 생육에 최적인 방법.
  23. 제 18 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분해를 호열성 뉴클레아제의 최적 온도의 약 ±5 ℃ 이내의 온도에서 수행하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    분해를 호열성 뉴클레아제의 활성에 최적인 온도에서 수행하는 방법.
  25. 제 18 항에 있어서,
    분해를 숙주 세포의 저온살균 동안 수행하는 방법.
  26. 제 18 항에 있어서,
    분해를 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도 범위에서 수행하는 방법.
  27. 제 19 항에 있어서,
    DNA-분해성 뉴클레아제가 TaqI 뉴클레아제인 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    분해를 약 60 ℃ 내지 약 70 ℃ 범위의 온도에서 수행하는 방법.
  29. 제 27 항에 있어서,
    분해를 65 ℃에서 수행하는 방법.
  30. 제 19 항에 있어서,
    DNA-분해성 뉴클레아제가 PhoI 뉴클레아제인 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    분해를 약 70 ℃ 내지 약 80 ℃ 범위의 온도에서 수행하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    분해를 75 ℃에서 수행하는 방법.
  33. 제 18 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포가 식물 기원인 방법.
  34. 제 18 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포가 동물 기원인 방법.
  35. 제 18 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포가 미생물 기원인 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    미생물이 효모, 진균, 조류, 세균 및 고세균으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    미생물이 야로위아, 바실러스, 에스케리키아, 슈도모나스, 파라코커스, 코리네박테리움, 칸디다, 한세눌라, 사카로마이세스, 모르티에렐라, 스키조사카로마이세스, 아스퍼질러스, 푸사리움, 트리코더마, 크립테코디니움, 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서,
    야로위아 종이 야로위아 리포리티카인 방법.
  39. 제 18 항에 있어서,
    호열성 뉴클레아제의 유전자를 숙주 세포의 코돈 사용 편향성에 맞도록 코돈 최적화시키는 방법.
  40. 제 27 항에 있어서,
    TaqI 뉴클레아제가 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
  41. 제 30 항에 있어서,
    PhoI 뉴클레아제가 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
  42. 제 18 항에 있어서,
    하나 초과의 호열성 뉴클레아제 유전자를 숙주 세포에 도입시키는 방법.
  43. 제 20 항에 있어서,
    재조합 DNA를 호열성 뉴클레아제의 추가적인 부위를 포함하도록 최적화시키는 방법.
  44. 제 20 항에 있어서,
    재조합 DNA를 500 이하의 뉴클레오타이드마다 하나의 절단 부위를 포함하도록 최적화시키는 방법.
  45. 숙주 세포의 핵산을 생체내 및/또는 원위치에서 분해시키기 위한 호열성 뉴클레아제의 용도로, 상기 호열성 뉴클레아제가 상기 숙주 세포에 대해 이종인 용도.
  46. 제 45 항에 있어서,
    뉴클레아제가 DNA-분해성 뉴클레아제이고 핵산이 DNA인 용도.
  47. 제 46 항에 있어서,
    숙주 세포의 DNA가 재조합 DNA를 함유하는 용도.
  48. 제 45 항에 있어서,
    뉴클레아제가 RNA-분해성 뉴클레아제이고 핵산이 RNA인 용도.
  49. 제 45 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분해를 호열성 뉴클레아제의 최적 온도의 약 ±5 ℃ 이내의 온도에서 수행하는 용도.
  50. 제 49 항에 있어서,
    분해를 호열성 뉴클레아제의 활성에 최적인 온도에서 수행하는 용도.
  51. 제 45 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분해를 숙주 세포의 저온살균 동안 수행하는 용도.
  52. 제 45 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분해를 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도 범위에서 수행하는 용도.
  53. 제 46 항에 있어서,
    DNA-분해성 뉴클레아제가 TaqI 뉴클레아제인 용도.
  54. 제 53 항에 있어서,
    분해를 약 60 ℃ 내지 약 70 ℃의 온도에서 수행하는 용도.
  55. 제 54 항에 있어서,
    분해를 65 ℃에서 수행하는 용도.
  56. 제 46 항에 있어서,
    DNA-분해성 뉴클레아제가 PhoI 뉴클레아제인 용도.
  57. 제 56 항에 있어서,
    분해를 약 70 ℃ 내지 약 80 ℃ 범위의 온도에서 수행하는 용도.
  58. 제 57 항에 있어서,
    분해를 75 ℃에서 수행하는 용도.
  59. 제 45 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포가 식물 기원인 용도.
  60. 제 45 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포가 동물 기원인 용도.
  61. 제 45 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포가 미생물 기원인 용도.
  62. 제 61 항에 있어서,
    미생물이 효모, 진균, 조류, 세균 및 고세균으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 용도.
  63. 제 62 항에 있어서,
    미생물이 야로위아, 바실러스, 에스케리키아, 슈도모나스, 파라코커스, 코리네박테리움, 칸디다, 한세눌라, 사카로마이세스, 모르티에렐라, 스키조사카로마이세스, 아스퍼질러스, 푸사리움, 트리코더마, 크립테코디니움, 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 용도.
  64. 제 63 항에 있어서,
    야로위아 종이 야로위아 리포리티카인 용도.
  65. 제 45 항에 있어서,
    호열성 뉴클레아제의 유전자를 숙주 세포의 코돈 사용 편향성에 맞도록 코돈 최적화시키는 용도.
  66. 제 53 항에 있어서,
    TaqI 뉴클레아제가 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 용도.
  67. 제 56 항에 있어서,
    TaqI 뉴클레아제가 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 용도.
  68. 제 45 항에 있어서,
    호열성 뉴클레아제가 하나 초과의 호열성 뉴클레아제의 조합인 용도.
  69. 제 47 항에 있어서,
    재조합 DNA를 호열성 뉴클레아제의 추가적인 부위를 포함하도록 최적화시키는 용도.
  70. 제 47 항에 있어서,
    재조합 DNA를 500 이하의 뉴클레오타이드마다 하나의 절단 부위를 포함하도록 최적화시키는 용도.
  71. 활성 핵산 분자가 없는 바이오매스 산물의 생산 방법으로, 상기 바이오매스 산물이 호열성 뉴클레아제 유전자를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포의 산물이고,
    (a) 상기 숙주 세포를 상기 호열성 뉴클레아제가 잠복성인 온도에서 발효시키는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서의 온도를 상기 호열성 뉴클레아제가 활성인 온도로 변화시킴으로써 상기 세포의 핵산을 분해시키는 단계; 및
    (c) 상기 바이오매스 산물을 회수하는 단계
    를 포함하되, 상기 단계 (b) 및 단계 (c)의 수행 순서를 바꿀 수 있는, 방법.
  72. 제 71 항에 있어서,
    뉴클레아제가 DNA-분해성 뉴클레아제이고 핵산이 DNA인 방법.
  73. 제 72 항에 있어서,
    숙주 세포의 DNA가 재조합 DNA를 함유하는 방법.
  74. 제 71 항에 있어서,
    뉴클레아제가 RNA-분해성 뉴클레아제이고 핵산이 RNA인 방법.
  75. 제 71 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (a)에서의 온도가 숙주 세포의 생육에 최적인 방법.
  76. 제 71 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분해를 호열성 뉴클레아제의 최적 온도의 약 ±5 ℃ 이내의 온도에서 수행하는 방법.
  77. 제 76 항에 있어서,
    단계 (a)에서의 온도를 호열성 뉴클레아제의 활성에 최적인 온도로 변화시키는 방법.
  78. 제 71 항에 있어서,
    분해를 바이오매스의 저온살균 동안 수행하는 방법.
  79. 제 71 항에 있어서,
    분해를 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도 범위에서 수행하는 방법.
  80. 제 72 항에 있어서,
    DNA-분해성 뉴클레아제가 TaqI 뉴클레아제인 방법.
  81. 제 77 항에 있어서,
    분해를 약 60 ℃ 내지 약 70 ℃ 범위의 온도에서 수행하는 방법.
  82. 제 81 항에 있어서,
    분해를 65 ℃에서 수행하는 방법.
  83. 제 72 항에 있어서,
    DNA-분해성 뉴클레아제가 PhoI 뉴클레아제인 방법.
  84. 제 83 항에 있어서,
    분해를 약 70 ℃ 내지 약 80 ℃ 범위의 온도에서 수행하는 방법.
  85. 제 84 항에 있어서,
    분해를 75 ℃에서 수행하는 방법.
  86. 제 71 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포가 식물 기원인 방법.
  87. 제 71 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포가 동물 기원인 방법.
  88. 제 71 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포가 미생물 기원인 방법.
  89. 제 88 항에 있어서,
    미생물이 효모, 진균, 조류, 세균 및 고세균으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법.
  90. 제 89 항에 있어서,
    미생물이 야로위아, 바실러스, 에스케리키아, 슈도모나스, 파라코커스, 코리네박테리움, 칸디다, 한세눌라, 사카로마이세스, 모르티에렐라, 스키조사카로마이세스, 아스퍼질러스, 푸사리움, 트리코더마, 크립테코디니움, 스키조키트리움 및 트라우스토키트리움으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법.
  91. 제 90 항에 있어서,
    야로위아 종이 야로위아 리포리티카인 방법.
  92. 제 71 항에 있어서,
    호열성 뉴클레아제의 유전자를 숙주 세포의 코돈 사용 편향성에 맞도록 코돈 최적화시키는 방법.
  93. 제 80 항에 있어서,
    TaqI 뉴클레아제가 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
  94. 제 83 항에 있어서,
    PhoI 뉴클레아제가 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
  95. 제 71 항에 있어서,
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  96. 제 72 항에 있어서,
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