JP2002537834A

JP2002537834A - Ｎｐｒ１と相互作用するｄｎａ結合タンパク質

Info

Publication number: JP2002537834A
Application number: JP2000603362A
Authority: JP
Inventors: ユーリンツァン，; マークキンケマ，; キニアンドン，; パメラロナルド，; モーシェンクチャーン，
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA; Duke University
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA; Duke University
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2002-11-12
Also published as: CA2366427A1; US6137031A; EP1165767A4; EP1165767A1; WO2000053741A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＮＰＲ１と相互作用し得るｂＺＩＰポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はまた、ＮＰＲ１と相互作用し得るｂＺＩＰポリペプチド、ならびにＮＰＲ１と相互作用し得るｂＺＩＰポリペプチドをコードする核酸を含むトランスジェニック植物を提供する。本発明によってまた提供されるのは、病原体に対する植物の耐性を増強する方法であり、この方法は、ＮＰＲ１と相互作用するｂＺＩＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された植物プロモーターを含む組換え発現カセットを導入することによる。本発明はまた、ＮＰＲ１と相互作用するさらなるｂＺＩＰポリペプチドをを同定する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】連邦政府に援助された研究開発の下で行われた本発明に対する権利に関する表
明。

【０００２】（発明の背景）植物病原体は、作物に対して、米国において毎年何億ドルもの損害を引き起こ
し、そして全世界規模で顕著により多くの損害を引き起こしている。伝統的な植
物育種技術は、特定の病原体に抵抗性であるいくつかの植物を開発してきたが、
これらの技術は、育種種内の遺伝子移入に限定されており、そして病原体抵抗性
に関係する農学的でない形質の導入の困難さに苦しみ得る。さらに、伝統的な育
種は、一般的な、または全体的な、広いスペクトルの病原体に対する抵抗性より
もむしろ、特定の病原体に対する抵抗性に焦点を当てている。従って、農業の重
要な目的は、植物が病原体に抵抗できるようにする遺伝的要素を同定して、それ
によって、バイオテクノロジーを通して全身抵抗性の植物を開発を可能にするこ
とである。

【０００３】全身獲得抵抗性（ｓｙｓｔｅｍｉｃａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃ
ｅ）（ＳＡＲ）は、一般的な植物の抵抗性応答であり、これは、非病原性の病原
体による局所的感染の間に誘導され得る。ＳＡＲの初期の研究は、タバコモザイ
クウイルス（ＴＭＶ）およびそのナス科の宿主を用いて行われた（例えば、Ｒｏ
ｓｓ，Ａ．Ｆ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１４：３４０−３５８（１９６１）を参照の
こと）が、ＳＡＲは、多くの植物種において実証され、そしてウイルスに対して
のみならず、細菌および真菌の病原体に対しても有効であることが示された（例
えば、Ｋｕｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ３２：８５４−８６０（１９８２
）およびＲｙａｌｓら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１８０９−１８１９（１９
９６）を参照のこと）。ＳＡＲ誘導のために必要なシグナルは、サリチル酸（Ｓ
Ａ）であり；ＳＡ酸化酵素であるサリチル酸ヒドロキシラーゼの発現に起因して
ＳＡを蓄積し損なう植物は、ＳＡＲが損なわれる（Ｇａｆｆｎｅｙ，Ｔ．ら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２６１：７５４−７５６（１９９３））。逆に、ＳＡの内因性レ
ベルの上昇またはＳＡもしくはその合成アナログ（例えば、２，６−ジクロロイ
ソニコチン酸（ＩＮＡ））の内因性適用は、広いスペクトルの抵抗性の増強を生
じるのみならず、病原性関連（ＰＲ）遺伝子として知られる一連の遺伝子の協奏
的な発現をも刺激する（例えば、Ｍａｌａｍｙ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５
０：１００２−１００４（１９９０）；Ｍｅｔｒａｕｘ，Ｊ．−Ｐ．ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２５０：１００４−１００６（１９９０）；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｊ
．Ｂ．ら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ９７：１３４２−１３４７（１９９１
）；Ｙａｌｐａｎｉ，Ｎ．ら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ３：８０９−８１８（１
９９１）；Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．Ｆ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ９９：４１０−４１２（１
９７９）；Ｍｅｔｒａｕｘ，Ｊ．−Ｐ．ら、（１９９１）Ａｄｖａｎｃｅｓｉ
ｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＰｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂ
ｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｈ．およびＶｅｒｍａ，Ｄ
．Ｐ．Ｓ．編（ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｅｔ，Ｔｈ
ｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、第１巻、４３２〜４３９頁；Ｗａｒｄら、Ｐｌ
ａｎｔＣｅｌｌ３：１０８５−１０９４（１９９１）；およびＵｋｎｅｓら
、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ４：６４５−６５６（１９９２）を参照のこと）。Ｐ
Ｒ遺伝子は、抵抗性を付与する際に直接的な役割を果たし得る。なぜなら、それ
らの発現は、ＳＡＲの発生と同時に起こり、そしてＰＲ遺伝子のいくつかは、抗
微生物活性を有する酵素をコードするからである（例えば、Ｗａｒｄら、Ｐｌａ
ｎｔＣｅｌｌ３：１０８５−１０９４（１９９１）；およびＵｋｎｅｓら、
ＰｌａｎｔＣｅｌｌ４：６４５−６５６（１９９２）を参照のこと）。従っ
て、ＰＲ遺伝子発現の調節を理解することは、植物の病害抵抗性の研究の焦点で
ある。

【０００４】ＰＲ遺伝子発現の変化を有する２つのクラスのＡ．ｔｈａｌｉａｎａ変異体が
同定された。１つのクラスは、ＰＲ遺伝子を構成的に発現するが、他のクラスは
ＳＡ−またはＩＮＡ−誘導性ＰＲ遺伝子発現が損なわれている（Ｌａｗｔｏｎ，
Ｋ．ら（１９９３）ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＤｅｆｅｎｃｅＲｅｓｐｏ
ｎｃｅｓｉｎＰｌａｎｔｓ、Ｆｒｉｔｉｇ，Ｂ．およびＬｅｇｒａｎｄ，Ｍ
．編（ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｅｔ，ＴｈｅＮｅ
ｔｈｅｒｌａｎｄｓ）４２２〜４３２頁；Ｂｏｗｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．ら、Ｐｌａ
ｎｔＣｅｌｌ６：１８４５−１８５７（１９９４）；Ｂｏｗｌｉｎｇ，Ｓ．
Ａ．ら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ９：１５７３−１５８４（１９９７）；Ｃｌａ
ｒｋｅ，Ｊ．Ｄ．ら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１０：５７−５６９（１９９８）
；Ｃａｏ，Ｈ．ら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ６：５８３−１５９２（１９９４）
；Ｄｅｌａｎｅｙ，Ｔ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ９２：６０２−６６０６（１９９５）；Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ１４３，９７３−９８２（１９９６）；Ｓｈａｈ，Ｊ．ら、Ｍ
ｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１０：６９−７８（１
９９７））。興味深いことに、第２のクラスの変異体から、１つのみの遺伝子座
、ＮＰＲＩ（ＮＩＭ１としても知られる）が同定された。ＮＰＲ１は、ＳＡ調節
されるＰＲ遺伝子発現および病害抵抗性の鍵となる構成要素であることが示され
てきた。なぜなら、ｎｐｒ１変異体は、ＰＲ１、ＰＲ２、およびＰＲ５の発現を
し損ない、そしてＳＡまたはＩＮＡでの処理後でさえ、感染に対する感受性の増
加を示すからである。さらに、ＮＰＲ１を過剰発現するトランスジェニック植物
は、感染の間により劇的なＰＲ遺伝子の誘導を示し、そして、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ４３２６およびＰｅ
ｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａＮｏｃｏ（この２つは、野生型Ａ
．ｔｈａｌｉａｎａ植物に病原性である、非常に異なる病原体である）（Ｃａｏ
，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５３１−
６５３６（１９９８））に対する完全な抵抗性を示す。

【０００５】ＮＰＲ１の配列分析は、既知の転写因子に対していかなる明白な相同性をも示
さない（例えば、Ｃａｏ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ８８：５７−６３（１９９７）お
よびＲｙａｌｓ，Ｊ．Ａ．ら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ９：４２５−４３９（１
９９７）を参照のこと）。従って、ＮＰＲ１は、直接的にＰＲ遺伝子のプロモー
ターをトランス活性化することに関与することはないようである。しかし、ＮＰ
Ｒ１は、少なくとも４つのアンキリン反復を含み、これは、非常に異なる生物学
的機能を有するタンパク質において見出され、そしてタンパク質−タンパク質相
互作用に関与する（Ｂｏｒｋ，Ｐ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓ１７，３６３−３７
４，Ｍｉｃｈａｅｌｙ，Ｐ．およびＢｅｎｎｅｔ，Ｖ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄ
ｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ２：１２７−１２９）。アンキリン反復
ドメインの機能的な重要性は、ｎｐｒ１−１対立遺伝子およびｎｉｍ１−２対立
遺伝子において見出された変異によって実証されてきた。これらの変異では、第
３および第２のアンキリン反復中の高度に保存性のヒスチジン残基が、それぞれ
チロシンに変化している。これらの保存性ヒスチジン残基は、アンキリン反復ド
メインの三次元構造を安定化する際に重要である水素結合の形成に関与している
（Ｇｏｒｉｎａ，Ｓ．およびＰａｖｌｅｔｉｃｈ，Ｎ．Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２
７４，１００１−１００５（１９９６））ので、ｎｐｒ１−１変異およびｎｉｍ
１−２変異は、アンキリン反復ドメイン内の局所的な構造における破壊を引き起
こし得、そして他のタンパク質と相互作用するその能力を無効にする。これらの
データは、ＮＰＲ１がおそらく他のタンパク質との相互作用によってその調節的
な機能を発揮していることを示唆する。

【０００６】ＳＡ応答性プロモーターエレメント（例えば、カリフラワーモザイクウイルス
（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター中のａｓ−１エレメントならびにＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍのオパインシンターゼプロモーターにおけるｏｃｓおよびｎｏ
ｓエレメント）は、以前に同定され、そして特徴付けされてきた（Ｌａｍ，Ｅ．
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，７８９０−７８９
４（１９８９）；Ｑｉｎ，Ｘ−Ｆ．ら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ６，８６３−８
７４（１９９４）；およびＥｌｌｉｓ，Ｊ．Ｇ．ら、ＰｌａｎｔＪ．４，４３
３−４４３（１９９３））。ａｓ−１エレメントは、タバコの転写因子ＳＡＲＰ
（サリチル酸応答タンパク質）に結合することが示された。このＳＡＲＰは、タ
バコのタンパク質ＴＧＡ１ａ（ｂＺＩＰ転写因子（Ｊｕｐｉｎ，Ｉ．およびＣｈ
ｕａＮ−Ｈ．（１９９６）ＥＭＢＯＪ．１５：５６７９−５６８９））と免
疫学的に関連する。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおいて、タバコＴＧＡ転写因子に相
同性を有する同定された少なくとも６つのｂＺＩＰ遺伝子が存在する（Ｋａｗａ
ｔａ，Ｔ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０，１１４１（１９９
２）；Ｘｉａｎｇ，Ｃ．ら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４，４０３−４
１５（１９９７）；Ｚｈａｎｇ，Ｂ．ら、ＰｌａｎｔＪ．４，７１１−７１６
（１９９３）；Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｕ．ら、Ａ．Ｒ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ
４，１３０９−１３１９（１９９２）；Ｍｉａｏ，Ｚ．Ｈ．ら、ＰｌａｎｔＭ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，１−１１（１９９４）；ならびにＬａｍ，Ｅ．およびＬ
ａｍ，Ｙ．Ｋ．−Ｐ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３、３７７８−
３７８５（１９９５））。これらのＴＡＧ転写因子は、インビトロ結合アッセイ
において、ａｓ−１エレメントについて異なる親和性を有することが示されてい
る（Ｌａｍ，Ｅ．およびＬａｍ，Ｙ．Ｋ．−Ｐ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ２３，３７７８−３７８５（１９９５））。ＡＨＢＰ−１ｂの強力な結合
は、ａｓ−１エレメントに存在するＴＧＡＣＧモチーフ２つのタンデムコピーを
必要とするが、ＴＧＡ６の結合は、モチーフの数によって影響されないようであ
る。なぜなら、単一コピーが十分であるらしいからである。他のｂＺＩＰ遺伝子
は、コムギ（例えば、Ｆｏｌｅｙら、ＰｌａｎｔＪ．３（５）：６６９−７９
（１９９３）を参照のこと）およびタバコ（例えば、Ｆｒｏｍｍら、Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２９：１８１−８８（１９９１）およびＫａｔａｇｉｒｉ
ら、Ｎａｔｕｒｅ３４０：７２７−３０（１９８９）を参照のこと）において
同定された。上記のｂＺＩＰ遺伝子産物のいくつかについて機能が推測されたが
、ｂＺＩＰ遺伝子産物の調節についてはほとんど知られておらず、そして植物の
病害抵抗性に関連する他のタンパク質との相互作用の報告はない。

【０００７】最近、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＰＲ−１遺伝子のプロモーターが、トランスジ
ェニック植物において行われた欠失およびリンカースキャニング変異誘発、なら
びにインビボフットプリンティング分析を用いて徹底的に分析された（Ｌｅｂｅ
ｌ，Ｅ．ら、ＰｌａｎｔＪ．１６，２２３−２３４（１９９８））。これらの
分析を通して、２つのＩＮＡ応答性エレメントが定義された。−６１０にある１
つのエレメントは、転写因子ＮＦ−κＢについての認識配列と類似であるが、残
基−６４０周辺の他のプロモーターエレメントは、ａｓ−１エレメントに存在す
るＣＧＴＣＡモチーフ（相補的配列はＴＧＡＣＧである）を含む。ＣＧＴＣＡモ
チーフは、リンカースキャニング変異誘発によって、ＰＲ−１遺伝子発現のＳＡ
とＩＮＡの両方による誘導について必須であることが示された。

【０００８】病原体に対する植物の抵抗性の遺伝的制御を理解する際の最近の進歩に関わら
ず、病原体抵抗性の鍵となるレギュレーター（例えば、ＮＰＲ１）と相互作用す
る遺伝子の同定および分析における進歩はほとんど報告されていない。このよう
な遺伝子の特徴付けは、所望の種々の形質を有する植物の遺伝子操作を可能にす
る。本発明は、これらおよび他の必要性に取り組む。

【０００９】（発明の要旨）本発明は、ｂＺＩＰポリヌクレオチドおよびＮＰＲ１に結合するｂＺＩＰポリ
ペプチド、ならびに植物病原体に対する増強された抵抗性を有するトランスジェ
ニック植物を生成するためのそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
使用に関する。例えば、本発明は、ｂＺＩＰ遺伝子構築物を使用して、ｂＺＩＰ
発現および活性を調節することによって病原体に対する抵抗性を増強するための
分子的ストラテジーを提供する。従って、ｂＺＩＰ発現を調節することによって
、上昇したかまたは減少した病原体抵抗性を有するトランスジェニック植物が産
生され得る。

【００１０】本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番
号９に対して少なくとも５００塩基対にわたって、少なくとも９５％同一である
ポリヌクレオチドを含む、単離された核酸を提供する。この単離された核酸は、
例えば、イネまたはトマトに由来し得る。好ましい実施形態において、このポリ
ヌクレオチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配
列番号１０をコードする。

【００１１】本発明はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配
列番号９に対して少なくとも５００塩基対にわたって、少なくとも９５％同一で
あり、かつＮＰＲ１と相互作用し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドに作動可能に連結された植物プロモーターを含む組換えカセットを含む、トラ
ンスジェニック植物を提供する。

【００１２】プロモーターは、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。本発明に
おいて使用され得る植物プロモーターは、本発明にとっては重要ではない。その
プロモーターは、構成的、誘導性、または、器官、組織、もしくは細胞について
特異的であり得る。

【００１３】本発明はまた、ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された植物プ
ロモーターを有する組換え発現カセットを植物に導入することによって、および
増強された抵抗性を有する植物を選択することによって、病原体に対する植物の
抵抗性を増強する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、イネ
植物またはトマト植物で行われる。別の実施形態において、植物の抵抗性は、防
御関連（ｄｅｆｅｎｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ）プロモーターからの増加した発現に
ついて測定することによって決定される。この方法の好ましい実施形態において
、ｂＺＩＰポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番
号８、または配列番号１０をコードする。他の好ましい実施形態において、この
方法のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７
、または配列番号９である。

【００１４】本発明はまた、植物の病害抵抗性に関与する他のポリペプチドを同定する方法
を提供する。この方法は、ＮＰＲ１に結合するポリペプチドを同定する工程、お
よび同定されたポリペプチドが病害抵抗性を調節するか否かを決定する工程を包
含する。いくつかの実施形態において、決定する工程は、同定されたポリペプチ
ドが少なくとも１つの防御関連遺伝子の発現を調節するか否かを決定することを
含む。好ましくは、防御関連遺伝子は、病原性関連タンパク質をコードする。別
の好ましい実施形態において、決定する工程は、同定されたポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを、植物に導入することを含む。なお他の実施形態にお
いて、この方法において使用されるポリペプチドは、トマトまたはイネに由来す
る。

【００１５】（定義）句「核酸配列」とは、５’から３’末端に読まれる、一本鎖または二本鎖のデ
オキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基のポリマーをいう。こ
れは、染色体ＤＮＡ、自己複製プラスミド、ＤＮＡもしくはＲＮＡの感染性ポリ
マー、および一次構造的な役割を行うＤＮＡもしくはＲＮＡを含む。

【００１６】用語「プロモーター」とは、転写の開始から上流および／または下流に位置し
、そして転写を開始するＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および
結合に関与する領域または配列をいう。「植物プロモーター」は、植物細胞にお
いて転写を開始し得るプロモーターである。

【００１７】用語「植物」には、植物体全体、シュート植物性の器官／構造（例えば、葉、
茎、および塊茎）、根、花卉、および花の器官／構造（例えば、苞葉、萼片、花
弁、雄蕊、心皮、葯、および胚珠）、種子（胚、内乳、および種皮を含む）およ
び果実（成熟子房）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）ならびに
細胞（孔辺細胞、卵細胞、毛状突起など）ならびにこれらの子孫。本発明の方法
において使用され得る植物のクラスは、一般的に広く、形質転換技術に受け入れ
可能な、高等植物および下等植物までのクラスにわたり、被子植物（単子葉植物
および双子葉植物）、裸子植物、シダ、および多細胞藻類が含まれる。これには
、種々の倍数性レベル（異数体、倍数体、二倍体、一倍体、および半接合体を含
む）の植物が含まれる。

【００１８】「増加または増強されたｂＺＩＰ活性またはｂＺＩＰ遺伝子の発現」とは、ｂ
ＺＩＰ活性の増強された変化をいう。このような増加された活性または発現の例
には以下が含まれる。ＢＺＩＰ活性またはｂＺＩＰ遺伝子の発現は、野生型の、
トランスジェニックでないコントロール植物の活性または発現のレベルよりも上
に増加する（すなわち、ｂＺＩＰ活性またはｂＺＩＰ遺伝子の発現の量が増加す
る）。ＢＺＩＰ活性またはｂＺＩＰ遺伝子の発現は、野生型の、トランスジェニ
ックでないコントロール植物では通常に検出されない器官、組織、または細胞に
おいてである（すなわち、ｂＺＩＰ活性またはｂＺＩＰ遺伝子の発現の空間的分
布が増加する）。ｂＺＩＰ活性またはｂＺＩＰ遺伝子の発現が、野生型の、トラ
ンスジェニックでないコントロールよりも、より長い期間、器官、組織、または
細胞において存在する場合、ＢＺＩＰ活性または発現は増加する（すなわち、ｂ
ＺＩＰ活性またはｂＺＩＰ遺伝子の発現の持続時間が増加する）。

【００１９】ポリヌクレオチド配列は、それが外来種由来である場合、またはそれが同じ種
由来でそのもともとの形態から改変されている場合には、生物または第２のポリ
ヌクレオチド配列に対して「異種」である。例えば、異種コード配列に作動可能
に連結されているプロモーターは、そのプロモーターが由来した種とは異なる種
由来のコード配列といわれるか、または、それが同じ種由来である場合、天然に
はプロモーターを伴わないコード配列といわれる（例えば、遺伝子操作されたコ
ード配列または異なる生態型もしくは変種由来の対立遺伝子）。

【００２０】「組換え」とは、人が操作したポリヌクレオチドまたは人が操作したポリヌク
レオチドのコピーもしくは相補物をいう。例えば、第２のポリヌクレオチドに作
動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットは、発現カセットを
含む単離された核酸の人の操作（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏ
ｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ第１巻〜第３巻、
ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４−１９９８）に記載
される方法による）の結果として第２のポリヌクレオチドに対して異種であるプ
ロモーターを含み得る。別の例において、組換え発現カセットは、ポリヌクレオ
チドが、極度に天然に見出されるようではないようなやり方で合わせられたポリ
ヌクレオチドを含み得る。例えば、人の操作した制限部位またはプラスミドベク
ター配列は、第２のポリヌクレオチドからプロモーターを隣接または分離し得る
。当業者は、多くの方法においてポリヌクレオチドが操作され得、そして上記の
例に限定されないことを認識する。

【００２１】個々の植物に対して「異種」であるポリヌクレオチドは、有性交雑以外の任意
の手段によって植物に導入されるポリヌクレオチドである。このことが達成され
る手段の例は以下に記載され、そしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換
、微粒子銃法、エレクトロポレーションなどを含む。異種核酸を含むこのような
植物は、本明細書ではＴ₁（例えば、真空浸透によりＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ中
で）またはＲ₀（インビトロで形質転換された細胞から再生された植物について
）世代トランスジェニック植物といわれる。有性交雑からまたは自家受粉によっ
て生じたトランスジェニック植物は、このような植物の子孫である。

【００２２】本発明の「ｂＺＩＰ核酸」または「ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列」は、ポリ
ペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番
号１０）をコードする、部分配列または全長ポリヌクレオチド配列（例えば、配
列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９）またはその相補
物である。本発明のＢＺＩＰポリペプチドは、ロイシンジッパードメインおよび
塩基性ドメインの存在によって特徴付けられる（例えば、Ｂａｒａｎｇｅｒ、Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２（１）：１８−２３（１９９８）；
Ｘｉａｎｇら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：４０３−１５（１９９７
）；およびＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄ
ｅｖ．４：６４２−４６（１９９４）を参照のこと）。ロイシンジッパードメイ
ンは、他のタンパク質とダイマー化するために機能し得る（例えば、Ｖｉｎｓｏ
ｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：９１１−１６（１９８９）を参照のこと）。従
って、ＢＺＩＰタンパク質は、ヘテロダイマーおよびホモダイマーを形成し得、
異なるＤＮＡ特異性またはタンパク質特異性を可能にする。ｂＺＩＰタンパク質
の塩基性ドメインは、ＤＮＡが結合するポリペプチドの領域である。本発明のＢ
ＺＩＰポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１、配列番号３、配列番号５
、配列番号７、配列番号９に対して、少なくとも５００塩基対にわたって、少な
くとも９５％同一、より好ましくは、少なくとも９７％同一、そして最も好まし
くは、少なくとも９９％同一である。

【００２３】本発明のＢＺＩＰポリペプチドは、ＮＰＲ１と相互作用する。この相互作用は
、直接的なタンパク質−タンパク質相互作用によってであり得る。あるいは、そ
の相互作用は間接的であり得る。例えば、第３のポリペプチドは、ｂＺＩＰポリ
ペプチドとＮＰＲ１との両方に結合し得、それによって、これらの３つのポリペ
プチドを互いに近接に保つ。タンパク質相互作用は、当業者に公知の多くの異な
る方法によって測定され得る。このような相互作用を測定するためのシステムの
例は、とりわけ、酵母ツーハイブリッドシステム（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ、Ｎａ
ｔｕｒｅ３４０（６２３０）：２４５−６（１９８９）およびＦｉｎｌｅｙ，
Ｒ．Ｌ．ＪＲ＆ＢｒｅｎｔＲ．（１９９６）ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ−Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａ
ｃｈ、ＧｌｏｖｅｒＤ．＆ＨａｍｅｓＢ．Ｄ編（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、１６９〜２０３
頁を参照のこと）、免疫沈降（例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第２巻、１０．１６節、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４−１９９８）を参照のこと）
、または非変性条件下でポリペプチドの単離を可能にする種々の配列タグ（例え
ば、ＴＡＧ、Ｈｉｓなど）の使用（例えば、ＣｈｅｎおよびＨａｉＧｅｎｅ
１３９（１）：７３−５（１９９４）；およびＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ第２巻、１０．１１Ａ−Ｂ
節、１０．１５節、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４
−１９９８）を参照のこと）。従って、これらの方法は、ＮＰＲ１と相互作用す
るタンパク質を同定するために使用され得る。当業者は、タンパク質−タンパク
質相互作用が多数の方法によって測定され得、そして上記の方法に限定されない
ことを認識する。

【００２４】導入遺伝子の発現および内因性遺伝子の阻害の両方の場合（例えば、アンチセ
ンスまたは同時抑制による）、当業者は、挿入されるポリヌクレオチド配列は、
同一である必要はないが、それが由来する遺伝子の配列に対して単に「実質的に
同一」であり得ることを認識する。以下に説明するように、これらの実質的に同
一な改変体は、具体的には、用語ｂＺＩＰ核酸によってカバーされる。

【００２５】挿入されたポリヌクレオチド配列が転写されかつ翻訳されて機能的ポリペプチ
ドを産生する場合、当業者は、コドンの縮重に起因して、多くのポリヌクレオチ
ド配列が同じポリペプチドをコードすることを認識する。これらの改変体は、詳
細には、用語「ｂＺＩＰ核酸」、「ｂＺＩＰポリヌクレオチド」およびそれらの
等価物によってカバーされる。さらに、この用語は、詳細には、ｂＺＩＰポリヌ
クレオチド配列と実質的に同一（以下に記載するように決定する）であり、かつ
ｂＺＩＰポリペプチドの機能を保持するタンパク質（例えば、ｂＺＩＰポリペプ
チド中のアミノ酸の保存的置換から生じる）をコードする全長配列を含む。

【００２６】本発明の「ＮＰＲ１ポリヌクレオチド配列」は、記載されるように（例えば、
Ｃａｏ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ８８（１）：５７−６３（１９９７）およびＲｙａ
ｌｓ，Ｊ．Ａ．ら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ９：４２５−４３９（１９９７）（
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７６７０７およびＵ８７７９４もまた参照のこと）に
よる）、ポリペプチドまたはその相補体をコードする、サブ配列または全長ポリ
ヌクレオチド配列である。当業者は、ＮＰＲ１がまた、異なる植物種由来の任意
のＮＰＲ１のオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）を含むことを認識する。例えば、
以下に記載するように、トマトＮＰＲ１遺伝子は、ＮＰＲ１オルソログであり、
従って、本発明の「ＮＰＲ１ポリヌクレオチド」である。

【００２７】「サリチル酸（ＳＡ）応答性エレメント」は、シス活性ＤＮＡ配列であり、こ
の配列は、植物または植物の一部の、植物において全身性に獲得される耐性を誘
導し得るサリチル酸、サリチル酸塩もしくは任意の化学物質（例えば、アセチル
−サリチル酸、または、２，６ジクロロイソニコチン酸（例えば、Ｗａｒｄら、
ＰｌａｎｔＣｅｌｌ３：１０８５−１０９４（１９９１）を参照のこと））
への曝露に対する応答における、特定の遺伝子発現を調節する。既知のＳＡ−応
答性プロモーターエレメントとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス
（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター中のａｓ−１エレメントならびにＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍのオピンシンターゼプロモーター中のｏｃｓ−１およびｎｏｓ
エレメントが挙げられる（例えば、Ｌａｍ，Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：７８９０−７８９４（１９８９）；Ｑｉｎ，Ｘ−
Ｆ．ら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ６：８６３−８７４（１９９４）；およびＥｌ
ｌｉｓ，Ｊ．Ｇ．ら、ＰｌａｎｔＪ．４：４３３−４４３（１９９３）を参照
のこと）。多くのＳＡ応答性エレメント中に生じるモチーフは、ＴＧＡＣＧ（ま
たはこの相補鎖のＣＧＴＣＡ）である。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター
は、ａｓ−１エレメントを含み、配列ＴＧＡＣＧを含む２１ｂｐＤＮＡ配列と
して同定される（例えば、Ｑｉｎら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ６：８６３−７４
（１９９４）；Ｘｉａｎｇ，Ｃ．ら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：４
０３−４１５（１９９７）を参照のこと）。別のＳＡ応答性エレメントであるｈ
ｅｘエレメントはまた、ＴＧＡＣＧ配列を含む（Ｘｉａｎｇ，Ｃ．ら、Ｐｌａｎ
ｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：４０３−４１５（１９９７）；Ｋａｔａｇｉｒｉ
ら、Ｎａｔｕｒｅ３４０：７２７−３０（１９８９））。同様に、ＣａＭＶ
３５Ｓプロモーターのｎｏｓ−１エレメントはまた、ＴＧＡＣＧモチーフを含み
、サリチル酸への植物の曝露の応答における遺伝子発現の制御に役割を果たす（
例えば、Ｌａｍら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６５（１７）：９９０９−１３
（１９９０）およびＫｉｍら、ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ１２４（１）：
１０５−１７（１９９４）を参照のこと）。別のＳＡ応答性エレメントは、Ｃａ
ＭＶ３５Ｓプロモーターのｏｃｓエレメントである。ｏｃｓコンセンサスエレ
メントは、ＴＧＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡＧＴＣＡ（配列番号１７）（例えば
、Ｚｈａｎｇ，Ｂ．ら、ＰｌａｎｔＪ．４、７１１−７１６（１９９３）を参
照のこと）であり、そして高等植物に見出されるｏｃｓエレメントのファミリー
を表す（例えば、Ｂｏｕｃｈｅｚら、ＥＭＢＯＪ．８：４１９７−２０４（１
９８９）を参照のこと）。ｏｃｓ配列内のｂＺＩＰタンパク質の１つの潜在的な
結合部位は、モチーフ（Ａ）ＣＧＴＣＡを含む（例えば、Ｌｅｂｅｌら、Ｐｌａ
ｎｔＪ．１６（２）：２２３−２３３（１９９８）およびＲｕｓｈｔｏｎら、
ＥＭＢＯＪ．１５：５６９０−５７００（１９９６）を参照のこと）。ＳＡ応
答性エレメントのさらなる例は、とりわけ、Ｓｔａｎｇｅら、ＰｌａｎｔＪ．
１１（６）：１３１５−２４（１９９７）；Ｈｏｒｖａｔｈら、ＭｏｌＰｌａ
ｎｔＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔ．１１（９）：８９５−９０５（１９
９８）；およびＵｌｍａｓｏｖら、ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ．２６（４）
：１０５５−６４（１９９４）において議論される。

【００２８】「防御関連（ｄｅｆｅｎｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ）」遺伝子は、植物が病原体と
接触されるかまたは病原体によって感染された場合に、その発現が増加する植物
核酸をいう。当業者は、多様に予想される機能を有するポリペプチドをコードす
る防御関連遺伝子を認識する。代表的には、防御関連遺伝子は、侵入してくる病
原体もしくは病原体の生成物を阻害または破壊し得るポリペプチドをコードする
。例えば、いくつかの防御関連遺伝子が、キチナーゼをコードすると予想され、
キチナーゼは、侵入してくる真菌病原体の細胞壁を破壊し得る。多くの防御関連
遺伝子の発現がまた、サリチル酸（ＳＡ）またはＳＡアナログ（例えば、２，６
−ジクロロイソニコチン酸（ＩＮＡ））に対する曝露に対して、誘導または増加
される。防御関連遺伝子の例としては、病原関連タンパク質（ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ）（ＰＲ）をコードする遺伝子が挙
げられる（例えば、Ｗａｒｄら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ３：１０８５−１０９
４（１９９１）；Ｒｅｕｂｅｒら、ＰｌａｎｔＪ．１６（４）：４７３−８５
（１９９８）；ＨｅｉｔｚＴら、ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ２４５（２）
：２４６−５４（１９９４）；およびＳｔｉｎｔｚｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ
７５（８）：６８７−７０６（１９９３）を参照のこと）。病原タンパク質とし
ては、β−１，３−グルカナーゼおよびキチナーゼを含む機能を有するタンパク
質に相同性を有するいくつかのタンパク質が挙げられる。全てのＰＲタンパク質
が、予想される機能を持つわけではない（例えば、ＰＲ−１）。防御関連遺伝子
の他の例としては、フィトアレキシン、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（
ＰＡＬ）、プロテイナーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓトランスフェ
ラーゼ、リポキシゲナーゼをコードする遺伝子、ならびにイネＰｉｒ７ｂ遺伝子
（例えば、Ｗａｓｐｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（１）：３２−
７（１９９８）を参照のこと）、およびアルファルファ由来のＳＲＧ１およびＳ
ＲＧ２（例えば、ＴｒｕｅｓｄｅｌｌおよびＤｉｃｋｍａｎ、ＰｌａｎｔＭｏ
ｌＢｉｏｌ．３３（４）：７３７−４３（１９９７）を参照のこと）（これら
は、病原体感染の際の誘導の特徴によって同定された）のような遺伝子が挙げら
れる。例えば、防御関連遺伝子のさらなる例および総説については、Ｈｕｎｔら
、Ｇｅｎｅ１７９（１）：８９−９５（１９９６）；Ｆｌｕｈｒら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍＳｏｃＳｙｍｐ６０：１３１−４１（１９９４）；Ｂｏｗｌｅｓら
、ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ５９：８７３−９０７（１９９０）；Ｇ
ｌａｚｅｂｒｏｏｋら、ＡｎｎｕＲｅｖＧｅｎｅｔ３１：５４７−６９（
１９９７）；Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．ら、ＡｄｖＧｅｎｅｔ．２８：１６５−２３４
（１９９０）；Ｗａｒｄ，Ｅ．ら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ３：１０８５−１０
９４（１９９１）；Ｌａｗｔｏｎら、ＰｌａｎｔＪ．１０：７１−８２（１９
９６）；およびＦｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｌ．ら、ＰｌａｎｔＪ．１０：６１−７
０（１９９６）を参照のこと。

【００２９】「病原体」としては、限定されないが、ウイルス、細菌、線虫、真菌または昆
虫が挙げられる（例えば、Ａｇｒｉｏｓ、ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）１９８８を参照のこ
と）。

【００３０】２つの核酸配列またはポリペプチドは、２つの配列におけるヌクレオチドまた
はアミノ酸残基の配列が、それぞれ、同じである場合「同一」であるといわれ、
このとき、以下に記載されるように最大の一致に対して整列される。２つ以上の
核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」またはパーセント「
同一性」は、同じであるかまたは同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチド
の特定されたパーセンテージを有する、２つ以上の配列またはサブ配列をいい、
このとき、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いてかまたは手動の整列およ
び視覚的検査によって測定されるように、比較ウインドウにおいて最大の一致で
比較されそして整列される。配列同一性のパーセンテージがタンパク質またはペ
プチドを参照する際に使用される場合、同一でない残基の位置が保存的アミノ酸
置換によってしばしば異なると認識され、ここで、アミノ酸残基は、類似の化学
特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換され、従っ
て、分子の機能特性を変化させない。保存的置換において配列が異なる場合、パ
ーセント配列同一性は、置換の保存的性質を訂正するように上方へ調節され得る
。この調節を作製するための手段は、当業者に周知である。代表的には、これは
、全体のミスマッチよりもむしろ部分として保存的置換をスコア付けし、それに
よってパーセンテージ配列同一性を増加させることを含む。従って、例えば、同
一なアミノ酸が１のスコアを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与え
られた場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換の
スコア付けは、例えば、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）（例えば、プロ
グラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ
Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）において実行されるように）のアル
ゴリズムに従って計算される。

【００３１】２つの核酸またはポリペプチドの文脈において、フレーズ「実質的に同一」は
、少なくとも６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％のヌクレ
オチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する配列またはサブ配列をいい、このと
き以下の配列比較アルゴリズムの１つまたは手動の整列および視覚的検査によっ
て測定されるように比較ウインドウにおいて最大の一致に対して整列される。こ
の定義はまた、試験配列の相補体をいい、これは、試験配列が参照配列に実質的
な同一性を有する場合、実質的な配列またはサブ配列相補性を有する。

【００３２】当業者は、２つのポリペプチドが免疫学的に類似する場合、２つのポリペプチ
ドがまた「実質的に同一」であり得ると認識する。従って、全体的なタンパク質
構造は、類似であり得るが、２つのポリペプチドの１次構造は優位な変異を示す
。従って、２つのポリペプチドが実質的に同一か否かを測定する方法は、各ポリ
ペプチドに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の結合を測定す
る工程を包含する。第１のポリペプチドに特異的な抗体が第２のポリペプチドに
第１のポリペプチドに対する親和性の少なくとも３分の１の親和性で結合する場
合、２つのポリペプチドは、実質的に同一である。

【００３３】配列比較に関して、代表的に、１つの配列は参照配列としてはたらき、それに
対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験およ
び参照配列を、コンピューターの中に入力し、サブ配列座標が設計され、必要に
応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプロ
グラムパラメーターを使用し得るか、または代替のパラメーターを指定し得る。
次いで、配列比較アルゴリズムによって、プログラムパラメーターに基づいて、
参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

【００３４】「比較ウィンドウ」とは、本明細書中で使用される場合、２０〜６００、通常
は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群より選択される
連続位置数のいずれか１つのセグメントの言及を含み、このセグメントにおいて
、配列が、同じ連続位置数の参照配列と、その２つの配列が最適に整列された後
に比較され得る。比較のための配列の整列方法は、当該分野において周知である
。比較のための配列の最適な整列は、例えば、以下によって実行され得る：Ｓｍ
ｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ、２：４８２（１
９８１）の局所的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズム
、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリ
ズムのコンピューター化された実行（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ
ＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧ
ｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおける、
ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手整列お
よび視覚的検査。

【００３５】有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進
行性の対合整列を使用して、関連配列のグループから多重配列整列を作製し、関
連性および配列同一性パーセントを示す。ＰＩＬＥＵＰはまた、その整列を作製
するために使用されたクラスター形成関係を示す、ツリーまたは樹状図をプロッ
トする。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖ
ｏｌ．３５：３５１〜３６０（１９８７）の進行性整列法の簡略法を使用する。
使用される方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ５：１５
１〜１５３（１９８９）により記載される方法と類似する。このプログラムは、
３００個までの配列（各々最大長が５，０００ヌクレオチドまたは５，０００ア
ミノ酸）を整列し得る。その多重整列手順は、最も類似する２つの配列の対合整
列で始まり、整列された２つの配列のクラスターを作製する。次いで、このクラ
スターが、その次に最も関連する配列、または整列された配列のその次に最も関
連するクラスターに整列される。配列の２つのクラスターが、２つの個々の配列
の対合整列の単純な拡大により整列される。最終的な整列は、一連の進行性対合
整列によって達成される。このプログラムは、特定の配列および配列比較の領域
についてのそれらのアミノ酸またはヌクレオチドの座標を指定することによって
、そしてそのプログラムのパラメーターを指定することによって、実行される。
例えば、参照配列が、他の試験配列と比較され得て、以下のパラメーターを使用
して、配列同一性の関連パーセントが決定され得る：デフォールトギャップウェ
イト（ｄｅｆａｕｌｔｇａｐｗｅｉｇｈｔ）（３．００）、デフォールトギ
ャップレンクスウェイト（ｄｅｆａｕｌｔｇａｐｌｅｎｇｔｈｗｅｉｇｈ
ｔ）（０．１０）、およびウェイティッドエンドギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ
ｅｎｄｇａｐ）。

【００３６】配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なア
ルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈ
ｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）に記載さ
れる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣ
ｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して、公に
利用可能である。このアルゴリズムは、照会配列において長さＷの短いワードを
同定することによって高スコア配列対（ｈｉｇｈｓｃｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｐａｉｒ）（ＨＳＰ）をまず同定する工程を包含し、このワードは、デ
ータベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、いくらかの正の値の
閾値スコアＴと一致するかまたはこのＴを満たすかのいずれかである。Ｔは、近
隣ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄｗｏｒｄｓｃｏｒｅｔ
ｈｒｅｓｈｏｌｄ）とも呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初
の近隣ワードヒットは、それらを含むもっと長いＨＳＰを見出すための検索を開
始するために種として作用する。このワードヒットは、累積整列スコアが増加し
得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向でのこのワードヒットの
伸長は、累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下する場合；１つ以
上の負のスコアの残基整列の蓄積に起因して、その累積スコアが０以下になる場
合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合に、停止される。このＢＬＡＳ
ＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、その整列の感度および速度を
決定する。このＢＬＡＳＴアルゴリズムは、デフォールトとして、ワードレンク
ス（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ
およびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）整列（Ｂ）が５０、期待値（ｅｘｐ
ｅｃｔａｔｉｏｎ）（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使
用する。

【００３７】ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を実施
する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照のこ
と）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最小合
計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔｓｕｍｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））で
あり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然生じ
る確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最
小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ま
しくは約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列に類似するとみなされる
。

【００３８】「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用
される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一なアミ
ノ酸配列または本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、または
その核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。
遺伝コードの縮重が原因で、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定のタンパ
ク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべ
て、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンにより特定され
るすべての位置で、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変更することな
く、記載される対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸配列
の改変は、「サイレントな改変」であり、これは、保存的に改変された改変の１
つの種類である。ポリペプチドをコードする本明細書中のどの核酸配列もまた、
その核酸の可能なすべてのサイレントな改変を記載する。当業者は、核酸中の各
コドン（ＡＵＧ（これは、通常はメチオニンについての唯一のコドンである）を
除く）が、機能的に同一な分子を生じるように改変され得ることを認識する。従
って、ポリペプチドをコードする核酸のサイレントな改変各々が、記載される各
配列に含まれている。

【００３９】アミノ酸配列に関して、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、または
タンパク質配列において、コードされる配列中の１つのアミノ酸またはアミノ酸
の小さい割合を変化させる個々の置換が、「保存的に改変された改変体」であり
、この改変体において、その変化が、化学的に類似するアミノ酸でのアミノ酸の
置換を生じることを、当業者は認識する。機能的に類似するアミノ酸を提供する
保存的置換の表は、当業者に周知である。

【００４０】以下の６つのグループ各々が、互いに代わる保存的置換であるアミノ酸を含む
：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）
。

【００４１】２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である指標は、第１の核酸
によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチ
ドに対して惹起される抗体と免疫学的交差反応性であることである。従って、ポ
リペプチドは代表的には、例えば、以下の場合に、第２のポリペプチドと実質的
に同一である：その２つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合。２
つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、その２つの分子またはその成分
が、下記のようなストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることで
ある。

【００４２】句「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」とは、ストリンジェン
トな条件下で、特定のヌクレオチド配列のみに対しての、その配列が複合混合物
（例えば、全細胞またはライブラリーの、ＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場
合の、分子の結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズをいう。

【００４３】句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、代
表的には、核酸の複合混合物中で、その標的部分配列にハイブリダイズするが、
他の配列にはハイブリダイズしない、条件をいう。ストリンジェントな条件は、
配列依存性であり、そして異なる環境では異なる。より長い配列は、より高温で
特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指
針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＰｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐ
ｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｓ
ｔｒａｔｅｇｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｓｓａｙｓ」（１９９３
）に見出される。一般的には、非常にストリンジェントな条件は、規定されたイ
オン強度、ｐＨでの特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低いように
選択される。低ストリンジェンシー条件は、一般的に、Ｔｍより約１５〜３０℃
下であるように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブのうちの５０％が
、平衡状態で標的配列にハイブリダイスする（標的配列が過剰に存在する場合に
、Ｔｍにて、プローブの５０％が、平衡状態で占められている）温度（規定され
たイオン強度、ｐｈ、および核酸濃度下で）である。ストリンジェントな条件は
、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３にて、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、代
表的には、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり
、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については
少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよ
り長く）については、少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェント
な条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。
選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、ポジティブなシグナル
は、少なくともバックグラウンドの２倍、好ましくは、バックグラウンドハイブ
リダイゼーションの１０倍である。

【００４４】ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それら核酸
がコードするポリペプチドが実質的に同じ場合には、なお実質的に同一である。
これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝コードにより許容される最大のコドンの
縮重を使用して作製される場合に、生じる。このような場合において、この核酸
は、代表的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
ハイブリダイズする。

【００４５】本発明において、本発明のＡＮＴ核酸を含有するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ
を、本明細書において開示される核酸配列を使用するストリンジェントな条件下
の標準的なサザンブロットにおいて、同定し得る。この開示の目的のために、そ
のようなハイブリダイゼーションのための適切なストリンジェントな条件は、４
０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中での３７℃でのハ
イブリダイゼーション、そして少なくとも約５０℃（通常は、約５５℃〜約６０
℃）の温度で０．２×ＳＳＣ中で、２０分間の少なくとも１回の洗浄を含む条件
、または等価の条件である。陽性ハイブリダイゼーションは、少なくともバック
グラウンドの２倍である。当業者は、代替的なハイブリダイゼーション条件およ
び洗浄条件を、類似のストリンジェンシーの条件を提供するために使用し得るこ
とを、容易に認識する。

【００４６】核酸がコードするポリペプチドが実質的に同一な場合、ストリンジェントな条
件下でお互いにハイブリダイズしない核酸であってもなお、実質的に同一である
。例えば、このことは、核酸のコピーが遺伝子コードによって許容される最大の
コドン縮重を使用して作製される場合に生じる。そのような場合、この核酸は、
代表的には中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブ
リダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件」としては、４０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液
中での３７℃でのハイブリダイゼーション、そして４５℃の温度で１×ＳＳＣ中
での洗浄を含む条件である。陽性ハイブリダイゼーションは、少なくともバック
グラウンドの２倍である。当業者は、代替的なハイブリダイゼーション条件およ
び洗浄条件を、類似のストリンジェンシーの条件を提供するために使用し得るこ
とを、容易に認識する。

【００４７】次に、２つのポリヌクレオチドが実質的に同一であるというさらなる指標は、
１対のオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅された参照配列が、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブとして使用され、ｃＤＮＡ
ライブラリーまたはゲノムライブラリーから試験配列を単離し得るか、または例
えば、ｍＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション分析またはＤＮＡゲルブロ
ットハイブリダイゼーション分析において、試験配列を同定し得る場合である。

【００４８】（具体的な実施形態の記載）本発明は、ｂＺＩＰ遺伝子およびその遺伝子産物が、植物病原体耐性の重要な
成分であるＮＰＲ１と相互作用し、そしてＮＰＲ１によって調節されるという初
めての決定的な証拠を提供する。本発明はまた、ＮＰＲ１と相互作用するポリペ
プチドをコードするイネおよびトマトのｂＺＩＰポリヌクレオチドを初めて提供
する。

【００４９】ｂＺＩＰ遺伝子産物は、サリチル酸応答性ＤＮＡエレメントに結合する転写因
子としておそらく機能するようであるので（例えば、ＰＲ−１プロモーター内の
推定ｂＺＩＰ結合部位：Ｌｅｂｅｌ，Ｅら、ＰｌａｎｔＪ．１６、２２３〜２
３４（１９９８）を参照のこと）、当業者は、改変されたｂＺＩＰ活性に関連す
る所望の表現型が、ｂＺＩＰによって調節される遺伝子の発現または活性を調節
することによって得られ得ることを認識する。発現またはタンパク質活性を増加
または減少するために記載される任意の公知の方法が、本発明において使用され
得る。

【００５０】（ＢＺＩＰ活性またはＢＺＩＰ遺伝子発現の増加）当該分野において周知の任意の多数の手段を使用して、植物内のｂＺＩＰ活性
を増加し得る。増強された発現は、例えば、病原体に対する植物全体の耐性を増
強するために有用である。任意の器官（例えば、苗条栄養器官／構造（例えば、
葉、茎および管）、根、花、および花の器官／構造（例えば、包葉、萼、花弁、
雄ずい、心皮、葯および胚珠）、種（胚、内乳、および種皮を含む）ならびに果
実）を標的とし得る。あるいは、１つまたはいくつかのｂＺＩＰ遺伝子が構成性
に発現し得る（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを使用して）。

【００５１】増加したｂＺＩＰ活性またはｂＺＩＰ発現を使用して、特定の病原体に対する
植物の耐性もまた、増強し得る。従って、例えば、ｂＺＩＰ発現を標的として、
特定の病原体に対して有害な防御関連遺伝子を誘導し得る。

【００５２】（ｂＺＩＰ遺伝子発現の増加）本発明において記載されるように調製された単離された配列を使用して、当該
分野において周知の方法を使用して、特定のｂＺＩＰ核酸の発現を導入して、遺
伝子発現を増加し得る。適切な構築物の調製および植物中へのその調製物の導入
手段を、以下に記載する。

【００５３】当業者は、本発明の遺伝子によってコードされるポリペプチドが、他のタンパ
ク質のように、異なる機能を行う異なるドメインを有することを認識する。従っ
て、タンパク質の所望の機能的ドメインが発現する限り、遺伝子配列は、全長で
ある必要はない。ｂＺＩＰポリペプチド（ロイシンジッパーおよび塩基性ドメイ
ンを含む）の際立て特徴的な性質は、Ｆｏｌｅｙら（ＰｌａｎｔＪ．３：６６
９〜７９（１９９３））およびＳｉｎｇｈら（ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：８９
１〜９０３（１９９０））において考察される。本発明のｂＺＩＰポリペプチド
は、ＮＰＲ１と相互作用する。

【００５４】改変されたタンパク質鎖もまた、当業者に周知である、以下に詳細に記載され
る種々の組換えＤＮＡ技術を使用して容易に設計され得る。例えば、鎖は、アミ
ノ酸の置換、付加、欠失などによって一次構造レベルにおいて、天然に生じる配
列と異なり得る。これらの改変を、多数の組合せにおいて使用して、最終的な改
変されたタンパク質鎖を産生し得る。

【００５５】（内在性ｂＺＩＰ遺伝子の改変）植物遺伝子内への遺伝子変異の導入方法、および所望の形質を有する植物の選
択方法は、周知である。例えば、種子または他の植物材料を、標準的技術に従っ
て、変異原性化学物質を用いて処理し得る。そのような化学物質としては、以下
が含まれるが、これらに限定されない：硫酸ジエチル、エチレンイミン、エチル
メタンスルホン酸、およびＮ−ニトロソ−Ｎ−エチルウレア。あるいは、Ｘ線ま
たはガンマ線のような線源からの電離放射線を使用し得る。

【００５６】あるいは、相同組換えを使用して、インビボにおいてｂＺＩＰ遺伝子を特異的
に標的化することによって、標的とされた遺伝子の改変を誘導し得る（一般的に
、ＧｒｅｗａｌおよびＫｌａｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１４６：１２２１〜１２３
８（１９９７）およびＸｕら、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１０：２４１１〜２４２２
（１９９６）を参照のこと）。相同組換えが、植物において実証されている（Ｐ
ｕｃｈｔａら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ５０：２７７〜２８４（１９９４）
、Ｓｗｏｂｏｄａら、ＥＭＢＯＪ．１３：４８４〜４８９（１９９４）；Ｏｆ
ｆｒｉｎｇａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：７３
４６〜７３５０（１９９３）；およびＫｅｍｐｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ３８９：
８０２〜８０３（１９９７））。

【００５７】本発明の遺伝子に対して相同組換え技術を適用する際に、ｂＺＩＰ遺伝子配列
（５’上流、３’下流、および遺伝子内領域を含む）の選択された部分の内の変
異（例えば、本明細書において開示される）を、インビトロにおいて作製し、そ
して次に、標準的な技術を使用して所望の植物内に導入する。相同組換えの効率
が使用するベクターに依存することが公知であるので、２つのシストロンを有す
る遺伝子ターゲッティングベクターの使用が、Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄら（Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：４３０３〜４３０７（１９９４
）；およびＶａｕｌｏｎｔら（ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓ．４：２４７〜２
５５（１９９５））に記載され、そしてトランスジェニック植物内での改変され
たｂＺＩＰ遺伝子発現についての選択の効率を増加するために、都合よく使用さ
れる。変異した遺伝子は、標的野生型遺伝子に対して相互作用して、その相互作
用により、野生型遺伝子の相同組換えおよび標的化した置換をトランスジェニッ
ク植物細胞内で生じ、ｂＺＩＰ活性の抑制を生じる。

【００５８】あるいは、末端に二重のヘアピンキャップを有する二重鎖コンフォメーション
内のＲＮＡおよびＤＮＡ残基の連続するストレッチから構成されるオリゴヌクレ
オチドを使用し得る。ＲＮＡ／ＤＮＡ配列を標的ｂＺＩＰ遺伝子の配列と整列し
て、所望のヌクレオチド変化を含むように設計する。染色体外Ｔ−ＤＮＡプラス
ミド上へのキメラオリゴヌクレオチドの導入は、少数の形質転換された植物細胞
内におけるキメラ分子による効率的かつ特異的なｂＺＩＰ遺伝子変換を生じる。
この方法は、Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３：１３８６
〜１３８９（１９９６））、およびＹｏｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：２０７１〜２０７６（１９９６））に記載される。

【００５９】（ｂＺＩＰ活性を増加する他の方法）ｂＺＩＰ発現を増加する１つの方法は、「活性化変異誘発」を使用することで
ある（例えば、Ｈｉｙａｓｈｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：１３５０〜１３５
３（１９９２）を参照のこと））。この方法において、内在性ｂＺＩＰ遺伝子を
改変して、強力／構成性プロモーターを内在性ｂＺＩＰ遺伝子の上流に含むＴ−
ＤＮＡ配列の挿入によって、構成性に、異所性に、または過剰に発現するように
、改変し得る。以下に説明するように、ｂＺＩＰを過剰発現するトランスジェニ
ック植物の調製を使用してもまた、ｂＺＩＰ発現を増加し得る。内在性ｂＺＩＰ
遺伝子の活性化変異誘発は、トランスジェニック植物におけるトランスジェニッ
クｂＺＩＰ核酸の過剰発現と同一の効果をもたらす。あるいは、ｂＺＩＰ活性ま
たは内在性ｂＺＩＰ遺伝子の発現のエンハンサーをコードする内在性遺伝子を、
類似の様式においてＴ−ＤＮＡ配列の挿入によって発現するように改変し得、そ
してｂＺＩＰ活性を増加し得る。

【００６０】ｂＺＩＰ発現を増加する別のストラテジーは、改変したｂＺＩＰトランスジー
ンを発現することによる、優性であって過剰に活性なｂＺＩＰの変異体の使用で
あり得る。例えば、ｂＺＩＰ活性の負のレギュレーターとの相互作用に重要であ
るドメイン欠損する、改変されたｂＺＩＰの発現を使用して、優性であって過剰
に活性なｂＺＩＰタンパク質を生成し得る。あるいは、負のレギュレーターと相
互作用するドメインのみを有する短縮型ｂＺＩＰタンパク質の発現は、負のレギ
ュレーターを滴定し得、そしてそれによって内在性ｂＺＩＰ活性を増加し得る。
標的遺伝子を過剰活性化する優性変異体の使用が、Ｍｉｚｕｋａｍｉら（Ｐｌａ
ｎｔＣｅｌｌ８：８３１〜８４５（１９９６））に記載される。

【００６１】（ｂＺＩＰ活性またはｂＺＩＰ遺伝子発現の阻害）上記に説明したように、ｂＺＩＰ活性は、多数の防御関連遺伝子の発現の制御
において重要である。この制御は、その遺伝子のプロモーターおよび他のタンパ
ク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）との相互作用を介する。ｂＺＩＰ遺伝子発
現活性の阻害を使用して、例えば、植物における病原耐性を減少し得る。具体的
には、内在性遺伝子発現を阻害するｂＺＩＰ核酸の標的化された発現を使用して
（例えば、アンチセンスまたは共抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ））、病
原耐性を減少し得る。

【００６２】（ｂＺＩＰ遺伝子発現の阻害）本明細書において開示される核酸配列を使用して、植物におけるｂＺＩＰ遺伝
子発現または関連する遺伝子発現を阻害する多数の方法において有用な核酸を設
計し得る。例えば、アンチセンス技術を、都合よく使用し得る。このことを達成
するために、所望される遺伝子由来の核酸セグメントを、クローン化して、プロ
モーターに作動可能に連結して、その結果、ＲＮＡのアンチセンス鎖を転写する
。次に、この構築物を植物中に形質転換し、そしてＲＮＡのアンチセンス鎖を産
生する。植物細胞において、アンチセンス抑制が、ＲＮＡ翻訳の抑制を含む遺伝
子制御の全てのレベルにおいて作用し得ること（Ｂｏｕｒｑｕｅ（Ｐｌａｎｔ
Ｓｃｉ．（Ｌｉｍｅｒｉｃｋ）１０５：１２５〜１４９（１９９５））；Ｐａｎ
ｔｏｐｏｕｌｏｓ（ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅ
ｓｅａｒｃｈａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第４８巻、Ｃｏ
ｈｎ，Ｗ．Ｅ．およびＫ．Ｍｏｌｄａｖｅ（編）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ、Ｉｎｃ．：ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ；Ｌｏｎｄ
ｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ、ＵＫ、第１８１〜２３８頁）；Ｈｅｉｓｅｒら（Ｐｌａ
ｎｔＳｃｉ．（Ｓｈａｎｎｏｎ）１２７：６１〜６９（１９９７）を参照のこ
と）、および目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を妨げることによっ
て（Ｂｏｕｌｃｏｍｂｅ（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏ．３２：７９〜８８（１
９９６））；ＰｒｉｎｓおよびＧｏｌｄｂａｃｈ（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４
１：２２５９〜２２７６（１９９６））；Ｍｅｔｚｌａｆｆら（Ｃｅｌｌ８８
：８４５〜８５４（１９９７））、Ｓｈｅｅｈｙら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８８０５〜８８０９（１９８８））、およびＨｉ
ａｔｔら米国特許第４，８０１，３４０号を参照のこと）作用し得ることが示唆
されている。

【００６３】一般的に導入される核酸セグメントは、抑制される内在性ｂＺＩＰ遺伝子（単
数または複数）の少なくとも一部に対して実質的に同一である。しかし、その配
列は、発現を阻害するために、完全に同一である必要はない。阻害効果を、標的
遺伝子に対する同一性を示す遺伝子のファミリー内の他の遺伝子に対してか、ま
たは標的遺伝子に対して実質的同一性を示す遺伝子のファミリー内の他の遺伝子
に対して、適用するように、本発明のベクターを設計し得る。

【００６４】アンチセンス抑制のために、導入した配列もまた、最初の転写産物または完全
にプロセスされたｍＲＮＡのいずれかと比較して、全長である必要はない。一般
に、より高度な同一性を、より短い配列の使用を補うために使用し得る。さらに
、導入される配列は、同一のイントロンパターンもエクソンパターンも有する必
要はなく、そして非コードセグメントの同一性は、同等に有効であり得る。通常
、約３０〜４０ヌクレオチドの間の配列、およびほぼ全長のヌクレオチドを使用
するべきであるが、少なくとも約１００ヌクレオチドの配列が好ましく、そして
少なくとも約２００ヌクレオチドの配列がより好ましく、そして約５００〜約３
５００ヌクレオチドの配列が特に好ましい。

【００６５】多数の遺伝子領域を標的として、ｂＺＩＰ遺伝子発現を抑制し得る。この標的
としては、例えば、コード領域、イントロン、エキソン／イントロン接合部由来
の配列、５’または３’非翻訳領域などが挙げられ得る。

【００６６】抑制のための別の周知の方法は、センス共抑制（ｓｅｎｓｅｃｏ−ｓｕｐｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ）である。センス方向に構成された核酸の導入は、近年、標的遺
伝子の転写をブロックする効果的な手段であることが示されている。内在性遺伝
子の発現を調節するための、この方法の使用の例（Ａｓｓａａｄら（Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２：１０６７〜１０８５（１９９３））；Ｆｌａｖｅｌｌ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３４９０〜３４９６
（１９９４））；Ｓｔａｍら（ＡｎｎａｌｓＢｏｔ．７９：３〜１２（１９９
７））；Ｎａｐｏｌｉら（ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：２７９〜２８９
（１９９０））；および米国特許第５，０３４，３２３号、同５，２３１，０２
０号、および同５，２８３，１８４号を参照のこと）。

【００６７】抑制効果は、導入された配列自体がコード配列を全く含まないが、内在性配列
の最初の転写物中に存在する配列と相同なイントロンまたは非翻訳配列のみを含
む場合に、生じる。この導入された配列は、一般に、抑制されることが意図され
る内在性配列と実質的に同一である。最小の同一性は、代表的には約６５％より
大きいが、より大きな同一性は、内在性配列の発現の、より効果的な抑制を発揮
し得る。約８０％を超える実質的な同一性が好ましいが、約９５％までの絶対的
同一性が、最も好ましい。アンチセンス調節を用いる場合のように、この効果は
、同一性または実質的同一性を示す遺伝子の類似のファミリー内の他の任意のタ
ンパク質に適用される。

【００６８】共抑制のために、導入された配列は、最初の転写産物または完全にプロセスさ
れたｍＲＮＡのいずれかに対して、絶対的な同一性を必要とせず、また全長であ
る必要もない。このことは、導入された配列を過剰発現するいくつかの植物の同
時的な産生を避けるために好ましくあり得る。全長よりも短い配列におけるより
高度な同一性は、より長く、より低い同一性の配列を補う。さらに、導入された
配列は、同一のイントロンまたはエキソンパターンを有する必要はなく、そして
非コードセグメントの同一性は、同程度に効果的である。通常、アンチセンス調
節について上記に記載されたサイズの範囲の配列が、使用される。さらに、アン
チセンス調節について述べられた同一の遺伝子領域を、共抑制技術を使用して標
的とし得る。

【００６９】オリゴヌクレオチドベースの三重らせん形成もまた、ｂＺＩＰ遺伝子発現を破
壊するために使用し得る。三重鎖ＤＮＡは、ＤＮＡ転写および複製を阻害し得、
そして部位特異的変異を生成し得、ＤＮＡを切断し得、そして相同組換えを誘導
し得る（例えば、ＨａｒｖｅおよびＧｌａｚｅｒ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６７
：７３２４〜７３３１（１９９３）；Ｓｃａｎｌｏｎら（ＦＡＳＥＢＪ．９：
１２８８〜１２９６（１９９５））；Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉら、Ｂｉｏｃ
ｈｍｉｓｔｒｙ３５：１０５３９〜１０５４８（１９９６）；Ｃｈａｎおよび
ＧｌａｚｅｒＪ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｒｌｉｎ）７５：２６７〜
２８２（１９９７）を参照のこと）。三重らせんＤＮＡを使用して、アンチセン
ス調節について同定された同一の配列を標的とし得る。

【００７０】触媒性ＲＮＡ分子またはリボザイムもまた、ｂＺＩＰ遺伝子の発現を阻害する
ために使用し得る。ほとんど任意の標的ＲＮＡと特異的に対形成し、そして特異
的な位置でホスホジエステル骨格を切断し、それによって標的ＲＮＡを機能的に
不活化するリボザイムを設計することが可能である。この切断を行う際に、リボ
ザイムは、それ自体が変化しない。従って、このリボザイムは、リサイクリング
して、他の分子を切断することが可能である。このことは、リボザイムを真正な
酵素とする。リボザイム配列をアンチセンスＲＮＡ内に組み込むことは、アンチ
センスＲＮＡにＲＮＡ切断活性を与え、それによって構築物の活性を増加する。
従って、リボザイムを使用して、アンチセンス調節について同定されたものと同
一の配列を標的とし得る。

【００７１】リボザイムの多数のクラスが、同定されている。リボザイムの１つのクラスは
、植物中での自己切断および複製が可能である多数の小さな環状ＲＮＡに由来す
る。このＲＮＡは、単独（ウイロイドＲＮＡ）で、またはヘルパーウイルスとと
もに（サテライトＲＮＡ）のいずれかにおいて、複製する。例としては、ａｖｏ
ｃａｄｏｓｕｎｂｌｏｔｃｈのウイロイド由来のＲＮＡおよびタバコのリング
スポット（ｒｉｎｇｓｐｏｔ）ウイルス由来のサテライトＲＮＡ、ルサーン一過
性ストリークウイルス（ｌｕｃｅｒｎｅｔｒａｎｓｉｅｎｔｓｔｒｅａｋ
ｖｉｒｕｓ）、ベルベットタバコモトルウイルス（ｖｅｌｖｅｔｔａｂａｃｃ
ｏｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ）、ナスノディフロラムモトルウイルス（ｎｏｄ
ｉｆｌｏｒｕｍｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ）およびサブタレニアンクローバモ
トルウイルス（ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎｃｌｏｖｅｒｍｏｔｔｌｅｖｉ
ｒｕｓ）が挙げられる。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計および使用は、Ｚｈ
ａｏおよびＰｉｃｋ（Ｎａｔｕｒｅ３６５：４４８〜４５１（１９９３）；Ｅ
ａｓｔｈａｍおよびＡｈｌｅｒｉｎｇ、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ１５６：１１８６
〜１１８８（１９９６）；ＳｏｋｏｌおよびＭｕｒｒａｙ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉ
ｃＲｅｓ．５：３６３〜３７１（１９９６））；Ｓｕｎら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：２４１〜２５１（１９９７）；ならびにＨａｓｅｌｏ
ｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５〜５９１（１９８８））に記載される。

【００７２】（内在性ｂＺＩＰ遺伝子の改変）上記の遺伝子変異を導入する方法を使用して、ｂＺＩＰ発現が減少した植物も
また選択し得る。

【００７３】（ｂＺＩＰ活性の他の阻害方法）ｂＺＩＰ活性を、ｂＺＩＰの細胞特異的遺伝子発現に必要なタンパク質を除去
することによって、改変し得る。従って、ｂＺＩＰ遺伝子発現を制御する調節タ
ンパク質および／または配列の発現を、本明細書に記載の方法によって調節し得
る。

【００７４】別のストラテジーは、ｂＺＩＰタンパク質が、それ自体または他のタンパク質
と相互作用する能力を阻害することである。これは、例えば、ｂＺＩＰに特異的
な抗体を使用することによって達成され得る。この方法において、ｂＺＩＰ特異
的抗体の細胞特異的発現を使用して、抗体：抗原認識を介して機能的ドメインを
不活性化する（例えば、Ｈｕｐｐら、Ｃｅｌｌ８３：２３７−２４５（１９９
５））。ｂＺＩＰ相互作用タンパク質の活性の妨害は、類似の様式で適用され得
る。あるいは、ｂＺＩＰのドミナントネガティブ変異体を、短縮型ｂＺＩＰタン
パク質をコードする導入遺伝子を発現させることによって調製する。トランスジ
ェニック植物において標的遺伝子を不活性化するための、ドミナントネガティブ
変異体の使用は、Ｍｉｚｕｋａｍｉら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：８３１−８
４５（１９９６）に記載される。

【００７５】（ｂＺＩＰポリペプチドの精製）天然に存在するｂＺＩＰポリペプチドまたは組換えｂＺＩＰポリペプチドのい
ずれかが、機能的アッセイにおける使用のために精製され得る。天然に存在する
ｂＺＩＰポリペプチドは、例えば、植物組織およびｂＺＩＰホモログの任意の他
の供給源から精製され得る。組換えｂＺＩＰポリペプチドは、任意の適切な発現
系から精製され得る。

【００７６】ｂＺＩＰポリペプチドは、標準的な技術によって実質的に純粋に精製され得る
。これらの技術としては、硫酸アンモニウムのような物質での選択的沈殿；カラ
ムクロマトグラフィー、免疫精製方法など（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅ
ｉｎＰｕｒｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉ
ｃｅ（１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら、前
出；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）が挙げられる。

【００７７】組換えｂＺＩＰポリペプチドを精製する場合、多くの手順が使用され得る。例
えば、確立された分子接着特性を有するタンパク質が、ｂＺＩＰポリペプチドに
可逆的に融合され得る。適切なリガンドを用いて、このｂＺＩＰポリペプチドは
、精製カラムに選択的に吸着され、次いで、そのカラムから比較的純粋な形態で
遊離され得る。次いで、この融合タンパク質は、酵素活性によって除去される。
最後に、このｂＺＩＰポリペプチドは、免疫アフィニティーカラムを用いて精製
され得る。

【００７８】（ｂＺＩＰ核酸の単離）一般的に、以下に記載の組換えＤＮＡ技術における技術用語および実験手順は
、当該分野で周知かつ一般に使用されるものである。標準的方法が、クローニン
グ、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、増幅、ならびに精製のために使用される。ＤＮ
Ａリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む一般的な
酵素反応は、製造業者の説明書に従って行う。これらの技術および種々の他の技
術は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＶｏｌｕｍｅｓ１−３，ＪｏｈｎＷｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４−１９９８）に従って行う。

【００７９】ｂＺＩＰ核酸の単離は、多くの技術によって達成され得る。例えば、本明細書
に開示される配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ｃＤＮＡラ
イブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーにおける所望の遺伝子を同定し得る
。ゲノムライブラリーを構築するために、ゲノムＤＮＡの大きいセグメントを、
ランダムなフラグメント化によって生成し（例えば、制限エンドヌクレアーゼを
使用して）、そしてベクターＤＮＡと連結させてコンカテマーを形成し、このコ
ンカテマーは、適切なベクターにパッケージングされ得る。ｃＤＮＡライブラリ
ーを調製するために、ｍＲＮＡを所望の起源（例えば、葉）から単離し、そして
ｂＺＩＰ遺伝子転写物を含むｃＤＮＡライブラリーを、ｍＲＮＡから調製する。
あるいは、ｃＤＮＡは、ｂＺＩＰ遺伝子またはｂＺＩＰホモログが発現される他
の組織から抽出されたｍＲＮＡから調製され得る。

【００８０】次いで、このｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーを、本明細書中
に開示されるクローニングされたｂＺＩＰ遺伝子の配列に基づくプローブを使用
して、スクリーニングし得る。プローブは、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配
列とハイブリダイズさせて、同じ植物種または異なる植物種の相同遺伝子を単離
するために使用され得る。あるいは、ｂＺＩＰポリペプチドに対して惹起された
抗体を使用して、ｍＲＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし得る。

【００８１】あるいは、目的の核酸を、増幅技術を使用して、核酸サンプルから増幅され得
る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、ｂＺＩＰ遺伝子
の配列を、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブ
ラリーから、直接的に増幅し得る。ＰＣＲおよび他のインビトロ増幅法もまた、
例えば、発現させるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするた
め、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用す
るための核酸を作製するため、核酸配列決定のため、または他の目的のために、
有用であり得る。ＰＣＲの一般的概論については、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ
：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
．（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．，Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．およびＷｈ
ｉｔｅ，Ｔ．編）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ（１９
９０）を参照のこと。植物細胞からｂＺＩＰ配列を同定するために適切なプライ
マーおよびプローブは、本明細書中に提供される配列（例えば、配列番号１、配
列番号３など）の比較から生成される。

【００８２】ポリヌクレオチドはまた、技術文献に記載のされるような、周知の技術によっ
て合成され得る。例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８（１９
８２）、およびＡｄａｍｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１（
１９８３）を参照のこと。次いで、二本鎖ＤＮＡフラグメントが、相補鎖を合成
し、そして適切な条件下でそれらの鎖を共にアニーリングさせることによってか
、または適切なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを使用して、相補鎖を
付加することによってかの、いずれかで得られ得る。

【００８３】（組換えベクターの調製）上記技術において単離された配列を使用するために、植物細胞の形質転換に適
切な組換えＤＮＡベクターを調製する。広範な種々の高等植物種を形質転換する
ための技術が周知であり、技術文献および科学文献に記載される。例えば、Ｗｅ
ｉｓｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７（１９８８
）を参照のこと。所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（例えば、全長タ
ンパク質をコードするｃＤＮＡ配列）は、好ましくは、転写および翻訳開始調節
配列と組み合わされ、これらの調節配列は、形質転換された植物の意図される組
織中での、その遺伝子からのその配列の転写を指向する。

【００８４】例えば、過剰発現のために、植物プロモーターフラグメントが使用され、これ
は、再生された植物の全ての組織において、遺伝子の発現を指向する。このよう
なプロモーターは、本明細書中で「構成的」プロモーターと呼ばれ、そして多く
の環境条件および発生または細胞分化の状態の下で、活性である。構成的プロモ
ーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開
始領域、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍａｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ由
来の１’−プロモーターまたは２’−プロモーター、および当業者に公知の種々
の植物遺伝子由来の他の翻訳開始領域が挙げられる。このような遺伝子としては
、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＡＣＴ１１（Ｈｕａｎｇら、Ｐｌａｎ
ｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：１２５−１３９（１９９６））、Ａｒａｖｉｄｏ
ｐｓｉｓ由来のＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ４３１４７、Ｚｈｏｎｇら、Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１：１９６−２０３（１９９６））、Ｂｒａｓ
ｓｉｃａｎａｐｕｓ由来のステアロイル−アシルキャリアタンパク質デサチュ
ラーゼをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｘ７４７８２、Ｓｏｌｏｃｏｍ
ｂｅら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０４：１１６７−１１７６（１９９４
））、トウモロコシ由来のＧＰｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ１５５９６、Ｍａｒ
ｔｉｎｅｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ２０８：５５１−５６５（１９８９））
、ならびにトウモロコシ由来のＧｐｃ２（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ４５８５５、Ｍ
ａｎｊｕｎａｔｈら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：９７−１１２（１
９９７））が挙げられる。

【００８５】あるいは、植物プロモーターは、特定の組織、器官または細胞型においてｂＺ
ＩＰ核酸の発現を指向し得るか（例えば、組織特異的プロモーター）、あるいは
さもなければ、より正確な環境制御下または発生制御下でｂＺＩＰ核酸の発現を
指向し得る（例えば、誘導性プロモーター）。誘導性プロモーターによって転写
をもたらし得る環境条件の例としては、嫌気的条件、温度上昇、光の存在、また
は化学物質／ホルモンのスプレーが挙げられる。組織特異的プロモーターは、誘
導性であり得る。同様に、組織特異的プロモーターは、その組織内で発生段階の
特定の時間枠内でのみ転写を促進し得る。他の組織特異的プロモーターは、特定
の組織の生活環を通して活性であり得る。当業者は、組織特異的プロモーターが
、標的組織以外の組織中で、作動可能に連結された配列の発現を駆動し得ること
を認識する。従って、本明細書中で使用されるように、組織特異的プロモーター
は、標的の組織または細胞型において優先的に発現を駆動するが、他の組織にお
いても同様にいくらかの発現を誘導し得るプロモーターである。

【００８６】多くの組織特異的プロモーターもまた、本発明で使用され得る。例えば、葉、
根または花において核酸の発現を指向するプロモーターが、これらの器官を感染
する病原体に対する耐性を増強するために有用である。植物の気中の成長器官に
おけるｂＺＩＰポリヌクレオチドの発現のために、光合成器官特異的プロモータ
ー（例えば、ＲＢＣＳプロモーター（Ｋｈｏｕｄｉら、Ｇｅｎｅ１９７：３４
３，１９９７）が使用され得る。ｂＺＩＰポリヌクレオチドの根特異的発現は、
根特異的ＡＮＲ１プロモーター（Ｚｈａｎｇ＆Ｆｏｒｄｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
，２７９：４０７，１９９８）の制御下で達成され得る。任意の強力な構成的プ
ロモーター（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）は、植物全体にわたるｂ
ＺＩＰポリヌクレオチドの発現のために使用され得る。

【００８７】適切なポリペプチド発現が所望される場合、ポリアデニル化領域が、そのコー
ド領域の３’末端に含まれるべきである。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子
、種々の他の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡに由来し得る。

【００８８】本発明の遺伝子由来の配列（例えば、プロモーターまたはコード領域）を含む
ベクターは、代表的に、植物細胞に対して選択可能な表現型を付与するマーカー
遺伝子を含む。例えば、マーカーは、殺生剤耐性（特に、抗生物質耐性（例えば
、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシンに対する耐性）
または除草剤耐性（例えば、クロロスルホンまたはＢａｓｔａに対する耐性））
をコードし得る。

【００８９】（トランスジェニック植物の産生）本発明のＤＮＡ構築物は、種々の従来技術によって、所望の植物宿主のゲノム
内に導入され得る。例えば、このＤＮＡ構築物は、植物細胞プロトプラストのエ
レクトロポレーションおよびマイクロインジェンクションのような技術を使用し
て、植物細胞のゲノムＤＮＡ内に直接的に導入され得るか、またはこのＤＮＡ構
築物は、ＤＮＡ粒子ボンバートメントのような銃式（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）方法
を使用して、植物組織に直接的に導入され得る。

【００９０】マイクロインジェンクション技術は、当該分野で公知であり、そして科学文献
および特許文献によく記載されている。ポリエチレングリコール沈殿を使用する
ＤＮＡ構築物の導入は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｅｍｂｏ．Ｊ．３：２７１７
−２７２２（１９８４）に記載される。エレクトロポレーション技術は、Ｆｒｏ
ｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：５８２４（１
９８５）に記載される。銃式形質転換技術は、Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ３
２７：７０−７３（１９８７）に記載される。

【００９１】あるいは、これらのＤＮＡ構築物は、適切なＴ−ＤＮＡ隣接領域と組み合わせ
られ、そして従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主
ベクターに導入され得る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ宿主の毒性機能が、植物細胞をその細菌で感染させる場合に、その構築物およ
び隣接マーカーのその植物細胞ＤＮＡへの挿入を指向する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換技術（安全化（ｄｉｓａｒｍｉ
ｎｇ）および二成分ベクターの使用を含む）が、科学文献によく記載されている
。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：４９６−４９８（１９８
４）、およびＦｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８０：４８０３（１９８３）およびＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰｌ
ａｎｔｓ，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉ
ｎ１９９５）を参照のこと。

【００９２】任意の上記形質転換技術によって誘導される形質転換された植物を培養して、
形質転換された遺伝子型、従って、所望の表現型（例えば、種子質量の増加）を
有する、植物全体を再生し得る。このような再生技術は、組織培養増殖培地中の
特定の植物ホルモンの操作に依存し、これは、代表的に、所望のヌクレオチド配
列と共に導入された殺生剤および／または除草剤マーカーに依存する。培養され
たプロトプラストからの植物再生は、Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＣｕｌｔｕｒｅ，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｌ
ａｎｔＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ、１２４−１７６頁、ＭａｃＭｉｌｌｉｌａ
ｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８３；お
よびＢｉｎｄｉｎｇ，ＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＰｌａｎｔｓ，Ｐｌａ
ｎｔＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、２１−７３頁、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，１９８５に記載される。再生はまた、植物カルス、外植片、器官
、またはそれらの部分から得られ得る。このような再生技術は、Ｋｌｅｅら、Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓ．３８：４６７−４８６（１９８７
）に、一般的に記載される。

【００９３】本発明の核酸は、本質的に任意の植物に対して所望の形質を付与するために使
用され得る。従って、本発明は、広範な植物にわたる用途を有する。これらの植
物には、以下の属由来の種が挙げられる：Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ、Ａｒａｃｈｉ
ｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ａｖｅｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃｉ
ｔｒｕｓ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃｏ
ｃｏｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｄａｕｃｕｓ、
Ｅｌａｅｉｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅ
ｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙ
ａｍｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｌｙ
ｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｍａｌｕｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｍｅ
ｄｉｃａｇｏ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｌｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｅｕｍ、
Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ、Ｐｅｒｓｅａ、Ｐｈａｓｅｌｏｕｓ、Ｐｉｓｔａｃｈｉ
ａ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｙｒｕｓ、Ｐｒｕｎｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｒｉｃｉｎｕ
ｓ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｒ
ｇｈｕｍ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍｕｓ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、
Ｖｉｃｉａ、Ｖｉｔｉｓ、ＶｉｇｎａおよびＺｅａ。

【００９４】当業者は、発現カセットがトランスジェニック植物に安定に組み込まれ、そし
て作動可能であることを確認された後、このカセットを、有性交配によって他の
植物に導入し得ることを認識する。任意の多くの標準的な育種技術が、交配され
る種に依存して使用され得る。

【００９５】公知の手順を使用して、当業者は、トランスジェニック植物におけるｂＺＩＰｍＲＮＡまたはｂＺＩＰタンパク質の増加または減少を検出することによって
、本発明の植物についてスクリーニングし得る。ｍＲＮＡまたはタンパク質を検
出および定量するための手段は、当該分野で周知である。

【００９６】（病原体に対する植物耐性を増強する方法）本発明は、ｂＺＩＰポリヌクレオチドおよび／またはｂＺＩＰポリペプチドの
発現および／または活性を調節することによる、病原体に対する植物耐性を増強
する方法を提供する。特定の作用機構に本発明を限定することなく、ｂＺＩＰポ
リヌクレオチドまたはｂＺＩＰポリペプチドの発現の増加が、病原体に対する植
物の耐性を増強するために使用され得る。耐性は、例えば、病原体の種または属
に関連して増強され得るか、または全身性の後天性耐性が、ｂＺＩＰポリヌクレ
オチドまたはｂＺＩＰポリペプチドの発現の増加によって誘導され得る。あるい
は、またはこれらと組み合わせて、ｂＺＩＰポリヌクレオチドまたはｂＺＩＰポ
リペプチドは、例えば、植物病原体耐性に重要な他の成分とのｂＺＩＰポリペプ
チドの相互作用を増加または減少させることによって、耐性を増強するように改
変され得る。

【００９７】特定の作用機構に本発明を限定することなく、ｂＺＩＰポリペプチドが耐性を
調節する１つの可能な機構は、例えば、防御関連遺伝子のプロモーターとの相互
作用による。これらのプロモーターとのｂＺＩＰポリペプチドの相互作用は、防
御関連転写物の転写の増加を直接的に導き得、これによって、病原体に対する耐
性を増強する。あるいは、ｂＺＩＰポリペプチドは、他の遺伝子のプロモーター
、ならびに他の調節因子と相互作用し得、これによって、防御関連遺伝子または
耐性に関連する他の遺伝子の発現を調節する。例えば、ｂＺＩＰポリペプチドは
、転写リプレッサーと相互作用し得、これによって、防御関連遺伝子の発現を可
能にする。

【００９８】（耐性が増強された植物の選択）耐性が増強された植物は、多くの方法で選択され得る。当業者は、以下の方法
が、可能なほんの数例であることを認識する。耐性が増強された植物を選択する
１つの方法は、特定の植物病原体に対する植物の耐性を決定することである。可
能な病原体としては、ウイルス、細菌、線虫、真菌または昆虫が挙げられるが、
これらに限定されない（例えば、Ａｇｒｉｏｓ，ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇ
ｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）（１９８８）
を参照のこと）。当業者は、植物の耐性応答が、多くの因子（どの病原体または
植物が使用されるか、を含む）に依存して変化することを認識する。一般的に、
耐性の増強は、コントロール植物と比較した場合の疾病症状の減少または排除に
よって、測定される。しかし、いくつかの場合において、耐性の増強はまた、植
物の過敏性応答（ＨＲ）の生成によって測定され得る（例えば、Ｓｔａｓｋａｗ
ｉｃｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８（５２１１）：６６１−７（１９９５）を参
照のこと）。耐性が増強された植物は、コントロール植物と比べて、増強された
過敏性応答を生じ得る。

【００９９】耐性の増強はまた、防御関連プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発
現の増加を測定することによって決定され得る。このような発現の測定は、ＲＮ
Ａまたは引き続くタンパク質産物の蓄積を定量することによって、測定され得る
（例えば、それぞれ、ノーザンブロット技術またはウェスタンブロット技術を使
用して（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｌら、およびＡｕｓｕｂｅｌらを参照のこと）
。防御遺伝子プロモーター発現を測定するための可能な代替的ストラテジーは、
このプロモーターにレポーター遺伝子を作動可能に連結させることを含む。レポ
ーター遺伝子構築物は、目的のプロモーターからの発現の容易な測定を可能にす
る。レポーター遺伝子の例としては、β−ｇａｌ、ＧＵＳ（例えば、Ｊｅｆｆｅ
ｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．ら、ＥＭＢＯＪ６：３９０１−３９０７（１９８７）を
参照のこと）、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどが挙げられる。

【０１００】以下の実施例は、限定でなく、例示目的で提供される。

【０１０１】（実施例１）本実施例は、Ｎｉｆ１（トマトｂＺＩＰポリペプチド）が、酵母ツーハイブリ
ッドシステムにおいて、トマトＮＰＲ１オーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）と相互
作用することを示す。

【０１０２】（材料および方法）（株およびプラスミド）酵母株ＥＧＹ４８、ならびにプラスミドｐＥＧ２０２、ｐＳＨ１８−３４、ｐ
ＪＫ１０１、ｐＲＦＨＭ１、ｐＳＨ１７−４およびｐＪＧ４−５を含む、酵母ツ
ーハイブリッドシステムを、Ｒ．Ｂｒｅｎｔ（Ｇｙｕｒｉｓ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ
７５：７９１−８０３（１９９３））から得た。全長トマトＮＰＲ１ホモログ
を、ＰＣＲを用いたｃＤＮＡクローン（ｐＴｏｍＮＰＲ１）からの増幅後に、ｐ
ＥＧ２０２にクローニングした。同様に、全長Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＮＰＲ１
ｃＤＮＡを、ｐＫＥｘＮＰＲ１（Ｃａｏ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ８８：５７−６
３（１９９７））から増幅し、ｐＥＧ２０２にクローニングした。ＰＣＲをまた
使用して、短縮型ＮＰＲ１ベイト（ｂａｉｔ）を構築した。ｐＥＧＮＰＲ１_1-17 ₇ は、ＮＰＲ１のアミノ末端１７７アミノ酸をコードし、ｐＥＧＮＰＲ１_1-432は
、このアミノ末端部分およびアンキリン反復を含み、そしてｐＥＧＮＰＲ１_178- ₅₉₃ は、このアンキリン反復およびＮＰＲ１のカルボキシル末端をコードする。
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａｂＺＩＰ転写因子遺伝子ＡＨＢＰ−１ｂ、ＴＧＡ６およ
びＯＢＦ５を、ｃＤＮＡ調製物からのＰＣＲから得て、そしてｐＪＨ４−５にク
ローニングした。ＡＨＢＰ−１ｂおよびＯＢＦ５はまた、ｐＥＴ２４Ｃ（＋）（
Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、このタンパク質のカルボキシル末端に（Ｈ
ｉｓ）₆−タグ（配列番号１８）を付加した。これらの得られたプラスミドを、
ｐＥＴ−ＡＨＢＰ−１ｂおよびｐＥＴ−ＯＢＦ５と命名した。ｎｐｒ１−１およ
びｎｐｒ１−２変異を含むベイト構築物（Ｃａｏ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ８８：５
７−６３（１９９７））を、ＰＣＲベースの「連鎖スキャニング（ｌｉｎｋｓ
ｃａｎｎｉｎｇ）」方法（Ｌｉ，Ｘ＆Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１：３７４５−３７４８（１９９３））を使用する、
部位特異的変異誘発によって生成した。

【０１０３】（トマト由来ＮＰＲ１ホモログの単離）トマト葉ｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６２：１４３２−１４３６（１９９３））の約１００万個のプラークを、Ａ
．ｔｈａｌｉａｎａＮＰＲ１ｃＤＮＡおよびＮｉｃｏｔｉａｎａｇｌｕｔ
ｉｎｏｓａ由来のＮＰＲ１ホモログ（Ｍ．ＫｉｎｋｅｍａおよびＸ．Ｄｏｎｇ、
未公開データ）の両方を使用してスクリーニングした。コロニー／プラークスク
リーニングナイロンフィルター（ＮＥＮＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＰｒｏｄ
ｕｃｔｓ）を、４０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、１％ＳＤ
Ｓ、および１０％硫酸デキストラン中で、３７℃でハイブリダイズさせた。最終
洗浄は、２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分間であった。３つの別
個のコロニーをスクリーニングして、それらの重複領域において同一であること
を見出した。全長ｃＤＮＡを含むクローンを、ｐＴｏｍＮＰＲ１と命名した。

【０１０４】（酵母ツーハイブリッドスクリーニングおよびアッセイ）酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った（Ｆｉｎｌｅｙ，Ｒ．Ｌ．ら（
１９９６）ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ−ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ：
ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＧｌｏｖｅｒＤ．およびＨａｍ
ｅｓＢ．Ｄ編（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）１６９〜２０３頁に記載されるように）。プレイ（ｐｒ
ｅｙ）ライブラリーを、ｃＤＮＡ（１．８ｋｂの平均サイズ）（ＴＭＶ感染トマ
トＶＦ３６葉より抽出され、そして１０⁷の独立したクローンを含む）を使用し
てプラスミドｐＪＧ４−５に構築した。

【０１０５】（結果）（酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいてトマトＮＰＲ１相同体は、ｂ
ＺＩＰ転写因子と相互作用する）ＮＰＲ１インタラクター（ｉｎｔｅｒｃａｔｏｒ）をコードする遺伝子を同定
するために、全長トマトＮＰＲ１相同体をバイト（ｂａｉｔ）（ｐＥＧＴｏｍＮ
ＰＲ１）として使用して酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。そして
ｃＤＮＡライブラリーを、ＴＭＶ感染トマト葉組織より抽出されたＲＮＡより作
製した（Ｄｒ．Ｂ．Ｂａｋｅｒ，ＵＳＤＡによって親切にも提供された）。本発
明の酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいて使用されたトマトＮＰＲ１
ｃＤＮＡクローンは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＮＰＲ１の本物の相同体である。
なぜなら、有意な相同性（５４％の同一性および７３％の類似性）がタンパク質
に渡って検出され、そして種々のｎｐｒ１変異誘発遺伝子によって定義される機
能的に重要な残基は、このクローンにおいて保存されているからである。

【０１０６】このｃＤＮＡライブラリーおよびバイトプラスミドｐＥＧＴｏｍＮＰＲ１を、
酵母ＥＹＧ４８株に同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）し、そして２．
５×１０⁶コロニーを得た。これらの第１形質転換体からの２．５×１０⁷細胞を
ロイシンドロップアウト（ｄｒｉｐ−ｏｕｔ）プレート上にプレートした。７つ
の別のクラスのトマト遺伝子が酵母ツーハイブリッド系においてＴｏｍＮＰＲ１
と相互作用することを見出した。１つのクラス、ＮＩＦ１（ＮＰＲ１−Ｉｎｔｅ
ｒａｃｔｉｎｇＦａｃｔｏｒ１）をより詳細に特徴付けた。相互作用を確認す
るために、ＮＩＦ１プラスミド（ｐＪＧＮＩＦ１）を単離し、そしてＥＹＧ４８
に再び形質転換した。ｐＪＧＮＩＦ１およびｐＥＧＴｏｍＮＰＲ１の両方を保有
するコロニーは、ロイシンを欠くプレート上で増殖し、そして２４時間以内にＸ
−ｇａｌプレート上で暗青色になった。ロイシン原栄養菌株性の回復およびβガ
ラクトシダーゼ活性の発現は、ガラクトースの存在に依存し、酵母ＧＡＬ１遺伝
子のプロモーターによって駆動されるＮＩＦ１の発現は、両方のレポーター遺伝
子の発現に必要であったことを示した。このクローンをまた、ベクターｐＥＧ２
０２と共にＥＧＹ４８に形質転換し、ＮＩＦ１それ自体が、レポーター遺伝子の
転写を活性化するかどうかを試験した。ＮＩＦ１単独の発現は、ロイシン原栄養
菌株性を回復せず、そして検出可能なβガラクトシダーゼ活性を生じなかった。

【０１０７】（実施例２）この実施例は、酵母ツーハイブリッド系においてＡＨＢＰ−１ｂおよびＴＧＡ
６、２つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｂＺＩＰポリペプチドが、Ａｒａｂｉｄｏ
ｐｓｓｉｓＮＰＲ１に結合するＮｉｆ１に関連することを示す。

【０１０８】（ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＮＰＲ１は、酵母ツーハイブ
リッド系においてＡＨＢＰ−１ｂおよびＴＧＡ６と強く相互作用するが、ＯＢＦ
５と弱く相互作用する）ＮＩＦを配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋＤａｔａｂａｓｅの検索は、３
つの独立した、密接に関連したＡ．ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子を同定し、それらは
ｂＺＩＰ転写因子ＡＨＢＰ−１ｂ（Ｋａｗａｔａら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓＲｅｓ．２０：１１４１（１９９２））、ＴＡＧ６（Ｘｉａｎｇら、Ｐｌａ
ｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：４０３〜４１５（１９９７））およびＯＢＦ５
（Ｚｈａｎｇら、ＰｌａｎｔＪ．４：７１１〜７１６（１９９３））をコード
する。ＮＩＦ１、ＡＨＢＰ−１ｂ、ＴＡＧ６およびＯＢＦ５の配列比較は、酵母
ツーハイブリッドスクリーニングにおいて同定されたＮＩＦ１クローンが、ｂＺ
ＩＰ転写因子の２／３のカルボキシルをコードし、ＤＮＡ結合ドメインおよびロ
イシンジッパードメインを含まないことを明らかにする。ＮＩＦ１クローンは、
これらのＡ．ｔｈａｌｉａｎａ相同体とアミノ酸レベルで６９〜７５％の同一性
および８３〜８７％の類似性を共有する。

【０１０９】Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＮＰＲ１が、ＮＩＦ１のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ相同体
、と相互作用するかどうかを決定するために、全長ＡＨＢＰ−１ｂ、ＴＧＡ６お
よびＯＢＦ５遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅し、そしてｐＪＧ４−５に
クローン化した。次いで、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＮＰＲ１と全ての３つの転写
因子との間の相互作用を酵母ツーハイブリッド系で試験した。１２８６ユニット
のβガラクトシダーゼ活性が検出されたＴｏｍＮＰＲ１およびＮＩＦ１で観察さ
れたように、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＮＰＲ１は、ＡＨＢＰ−１ｂおよびＴＧＡ
６と強く相互作用し、６７３および３７２ユニットのβガラクトシダーゼ活性を
それぞれ生じた。興味深いことに、ＮＰＲ１とＯＢＦ５との間の相互作用は、よ
り弱かく、７．６ユニットのβガラクトシダーゼ活性を有するのみであった。

【０１１０】（実施例３）この実施例は、ＡＨＢＰ−１ｂおよびＯＢＦ５が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＮＰＲ１タンパク質と相互作用し、そしてＡＨＢＰ−１ｂがアンキリン繰り返し
を含むＮＰＲ１ドメインに相互作用することを示す。

【０１１１】（材料および方法）（転写因子タンパク質の過剰発現および精製）ｐＥＴ−ＡＨＢＰ−１ｂまたはｐＥＴ−ＯＢＦ５を保有するＥ．ｃｏｌｉＢ
Ｌ２１（ＤＥ３）株をＬＢ培地（１Ｌ）中で増殖させ（ＯＤ₆₀₀＝１．０）、そ
してＡＨＢＰ−１ｂまたはＯＢＦ５の発現を、ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）の添加に
よって誘導した。２時間後、細菌を収集し、アルミナ粉末中（細胞ペレットの重
量の２倍）に置き、次いで５０ｍｌ中の緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ７．５、５０ｍＭＫＣｌ、１×プロテイナーゼインヒビターカクテル（２
１）、６ｍＭ２メルカプトエタノール、および１０％グリセロール）に再懸濁
した。細胞抽出物を２度スピンし、そしてＮＩ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を
、上清に添加し、１時間インキュベートした。この混合物をカラムにロードし、
そして洗浄緩衝液（１ＭＫＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、
１０％グリセロール、６ｍＭ２−メルカプトエタノール、および１０ｍＭイミ
ダゾール）で洗浄した。次いで、このタンパク質を緩衝液中（５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＫＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、６ｍＭ
２−メルカプトエタノール、および１０％グリセロール）に溶出した。溶出さ
れたタンパク質溶液を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＫ
Ｃｌ、６ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１０％グリセロールに対して透
析した。

【０１１２】（バキュロウイルス系を使用するＮＰＲ１の過剰発現）ＮＰＲ１ｃＤＮＡを初めに、制限部位ＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩを使用する
ＰＣＲによってｐＶＬ１３９２にクローン化し、次いでインビボでＢａｃｕｌｏ
Ｇｏｌｄ（ＰｈａｒＭｉｇｅｎ）に組み替えた。増幅されたウイルス調製物を使
用して、Ｓｆ９昆虫細胞（２×１０⁶）に感染した。細胞を収集し、そして合計
のタンパク質抽出物を記載されるように抽出した（ＰｈａｒＭｉｇｅｎ）。タン
パク質抽出物中のＮＰＲ１の存在を、タンパク質のカルボキシル末端の１６のア
ミノ酸に対して調整された抗血清を使用して確認した（Ｃａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５３１−６５３６（１９９８））
。

【０１１３】（タンパク質−タンパク質相互作用のインビトロ分析）部分的に精製されたＨｉｓタグ化転写因子（１０μｇ）を結合緩衝液中（５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＫＣｌ、１×プロテイナーゼ
インヒビターカクテル、６ｍＭ２−メルカプトエタノール、および１０％グリ
セロール）に混合した。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＮＰＲ１を発現する昆虫細胞抽
出物（５０μｌ）と共に混合した。このタンパク質混合物を２時間、氷上でイン
キュベートした。次いでＮｉ−ＮＴＡ樹脂をタンパク質混合物に添加し、そして
さらに１時間インキュベートした。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂をペレット化し、そして洗
浄緩衝液（５０ｍＭＫＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０
％グリセロール、６ｍＭ２−メルカプトエタノール、および１０ｍＭイミダゾ
ール）で５回洗浄した。タンパク質をＮｉ−ＮＴＡから緩衝液（５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＫＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、６ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール、および１０％グリセロール）中に溶出し、そし
てタンパク質の１／４をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、続いてＰｒｏｔｒａｎニ
トロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。Ｈｉｓ
タグ化転写因子を有するＮＰＲ１の共精製（ｃｏ−ｐｕｒｙｆｉ）について調べ
るためにＮＰＲ１に対して惹起された抗体（Ｃａｏら、参照のこと）を使用して
免疫ブロット分析を行った。

【０１１４】（結果）（ＮＰＲ１は、ＡＨＢＰ−１ＢおよびＯＢＦ５と、インビトロで相互作用する
）ＮＰＲ１が、ＡＨＢＰ−１ｂおよびＰＢＦ５と、インビトロで相互作用するか
どうかを試験するために、Ｈｉｓタグ化ＡＨＢＰ−１ｂおよびＯＢＰ５タンパク
質をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＮｉ−ＮＴＡカラムを使用して精製した。
次いで精製されたＡＨＢＰ−１ｂまたはＯＢＦ５タンパク質をバキュロウイルス
で発現されたＮＰＲ１タンパク質を含む抽出物と混合した。次いで、ＡＨＢＰ−
１ｂおよびＯＢＦ５タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して「落とした（ｐｕ
ｌｌｅｄｄｏｗｎ）」。ＮＰＲ１に対する抗血清を使用する免疫ブロット分析
は、ＮＰＲ１タンパク質がＡＨＢＰ−１ｂと共精製し、ＡＨＢＰ−１ｂがインビ
トロで物理的にＮＰＲ１に関連することを実証することを示した。ネガティブコ
ントロールとして、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂単独をＮＰＲ１タンパク質抽出物と混合し
た。ＮＰＲ１は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂自体に結合しないことを、この結果は示した
。部分的に精製されたＯＢＦ５タンパク質調製物を実験に使用した場合、ＮＰＲ
１の共精製はまた検出された。これは、ＯＢＦ５がＮＰＲ１と、インビトロで相
互作用し得ることを示す；このアッセイは、酵母ツーハイブリッドスクリーニン
グで見られるようなＮＰＲ１のＡＨＢＰ−１ｂおよびＯＢＦ５への結合親和性に
おける差を検出するのに十分な感受性を有さない。

【０１１５】（ＮＰＲ１は、アンキリン繰り返しドメインを介してＡＨＢＰ−１ｂと相互作
用する）ＡＨＢＰ−１ｂと直接相互作用するＮＰＲ１における領域を定義するために、
タンパク質の異なるドメインをコードするＮＰＲ１遺伝子フラグメントをバイト
ベクターにクローン化した。エキソン−イントロンの境界で切断した。なぜなら
、これらの境界は、ＮＰＲ１とその相同体との間で保存されているからであり、
従って、タンパク質の別の機能的ドメインを規定し得る。ｐＥＧＮＰＲ１_1-177
は、ＮＰＲ１遺伝子の第１のエキソンを保有し、そしてアミノ末端１７７残基を
コードする；ｐＥＧＮＰＲ１_1-432は、ＮＰＲ１（エキソン１および２）のアミ
ノ末端およびアンキリン繰り返しドメインの両方を含む；ｐＥＧＮＰＲ１_178-59 ₃ は、ＮＰＲ１（エキソン２、３および４）のアンキリン繰り返しドメインおよ
びカルボキシル末端を含む。切断されたＮＰＲ１タンパク質を、酵母において転
写因子ＡＨＢＰ−１ｂと共発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓ）し、そしてβガラクト
シダーゼレポーター遺伝子活性を測定した。ＮＰＲ１_1-432およびＡＨＢＰ−１
ｂを発現する酵母において、βガラクトシダーゼレポーター遺伝子活性（５２２
ユニット）は、全長ＮＰＲ１（６７３ユニット）を発現する細胞において観察さ
れた活性と類似であった。これは、ＮＰＲ１がＡＨＢＰ−１ｂとアミノ末端およ
び／またはアンキリン繰り返しドメインを介して相互作用することを示す。しか
し、ＮＰＲ１_178-593を発現する細胞（アミノ末端の１７７残基を欠く）におい
て、ＮＰＲ１−ＡＨＢＰ−１ｂの相互作用は、より低いレベル（１７．６ユニッ
ト）でさえ、なお生じた。これは、ＮＰＲ１のアンキリン繰り返しドメインが直
接にＡＨＢＰ−１ｂと相互作用することを意味する。ＮＰＲ１_178-593は、全長
ＮＰＲ１よりも低い親和性を有するＡＨＢＰ−１ｂと相互作用するので、ＮＰＲ
１のアミノ末端領域はまた、ＮＰＲ１−ＡＨＢＰ−１ｂの相互作用に寄与する。
アミノ末端領域単独では、ＡＨＢＰ−１ｂと相互作用しないので、この領域はお
そらく、アンキリン繰り返しドメインの安定化に役立つ。驚いたことに、プレイ
（ｐｒｅｙ）なしで酵母において発現される際に、ＮＰＲ１のアミノ末端領域単
独は、検出された低レベルの内因性トランス活性化活性（６ユニット）を有する
ようである。

【０１１６】（実施例４）この実施例は、ＮＰＲ１変異体は、ＡＨＢＰ−１ｂおよびＴＧＡ６と相互作用
しないことを示す。

【０１１７】（ＮＰＲ１−ＡＨＢＰ−１ｂとＮＰＲ１−ＴＧＡ６の相互作用は、ｎｐｒ１変
異体によって消される）ＮＰＲ１−ＡＨＢＰ−１ｂとＮＰＲ１−ＴＧＡ６の相互作用の特異性をさらに
決定するために、本発明者らは、ｎｐｒ１−１またはｎｐｒ１−２点変異のいず
れかを含むバイト構築物を作製した（Ｃａｏら、Ｃｅｌｌ８８：５７−６３（
１９９７））。ｎｐｒ−１において、アンキリン繰り返しドメインにおいて高度
に保存されたヒスチジン₃₃₄は、チロシンに変化し、一方でｎｐｒ１−２におい
てＮＰＲ１のアミノ末端領域のシステイン₁₅₀は、チロシンに転換される。これ
らの変異体構築物を、ＡＨＢＰ−１またはＴＧＡ６クローンのいずれかで酵母に
同時形質転換し、そして生じた形質転換体におけるβガラクトシダーゼ活性を測
定した。両方の形質転換体において、βガラクトシダーゼ活性のバックグラウン
ドのレベルのみが検出され、ｎｐｒ１−１およびｎｐｒ１−２変異体が、ＡＨＢ
Ｐ−１ｂまたはＴＧＡ６と相互作用するＮＰＲ１の能力を消すことを示した。こ
れらの酵母株由来の合計のタンパク質調製物のウエスタンブロット分析は、ｎｐ
ｒ１−１およびｎｐｒ１−２が、野生型ＮＰＲ１タンパク質と同様のレベルで発
現されたことを示した。従って、レポーター遺伝子の発現の欠失は、変異型バイ
トタンパク質の乏しい発現の結果ではないが、しかし傷害性相互作用の結果は、
点変異を生じた。

【０１１８】（実施例５）この実施例は、ＡＨＢＰ−１ｂがＰＲ−１プロモーターに結合することを示す
。

【０１１９】（方法および材料）（ゲル移動度シフトアッセイ）ゲル移動度シフトアッセイにおいて使用されたオリゴヌクレオチドプローブを
、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＰＲ−１遺伝子においてＩＮＡ−およびＳＡ−応答性
プロモーターエレメントの配列に従って消化した（Ｌｅｂｅｌら、Ｐｌａｎｔ
Ｊ．１６：２２３−２３４（１９９８））。アッセイにおいて使用された野生型
オリゴヌクレオチドは、５’ＣＴＣＴＡＣＧＴＣＡＣＴＡＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＧＴＣＡＴＡＧＡＴＧ３
’（配列番号１９）でり、一方、使用された変異体は、５’ＣＴＣＴＡｔｔｃｔＡＣＴＡＴＴＴＴＡＣＴＴＡｔｔｃｔＡＴＡＧＡＴＧ３
’（配列番号２０）であった。各鎖のプローブを、１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレ
オチドを２０μｌの反応中で１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ
）および５０μＣｉの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰと共にインキュベートすることによっ
て末端標識した。次いで、２つの相補的な鎖を混合し、アニールし、そしてＮｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅＲｅｍｏｖａｌＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し
た。各結合反応について、１μｇの部分的に精製された転写因子タンパク質を１
００ｎｇのポリ［ｄＩ−ｄＣ］および２０μｌの結合緩衝液（１２ｍＭＨＥＰ
ＥＳ、ｐＨ７．９、６０ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ₂、１０％グリセロー
ル、１ｍＭＤＤＴ、１×プロテアーゼインヒビターカクテル）と共に添加した
。この混合物を、標識プローブの添加（３０，０００ｃｐｍ／反応）の添加前に
室温で１０分間、インキュベートした。この反応を、さらに３０分間インキュベ
ートし、次いで０．５×ＴＢＥ緩衝液中で４％（ｗ／ｖ）ネイティブポリアクリ
ルアミドゲルにかけた。電気泳動後、このゲルを乾燥し、そしてオートラジオグ
ラフした。

【０１２０】（結果）（ＡＨＢＰ−１ｂは、ＰＲ−１遺伝子内のプロモーターエレメントに結合する
）ＳＡ−応答性遺伝子発現の制御におけるＡＨＢＰ−１ｂの役割を分析するため
に、ゲル移動度シフトアッセイを行い、ＡＨＢＰ−１ｂがＰＲ−１遺伝子のプロ
モーターエレメントに結合し得るかどうかを決定した。使用されたＡ．ｔｈａｌ
ｉａｎａＰＲ−１遺伝子プロモーターフラグメントは、ａｓ−１様のエレメン
トを含み、それは以前にｂＺＩＰ転写因子の結合モチーフとして同定されており
、そして、リンカー走査変異によって、足底におけるＩＮＡ−およびＳＡ−誘導
ＰＲ−１遺伝子発現の両方に必須であることが示されている（Ｌｅｂｅｌ，Ｅ．
，ら、ＰｌａｎｔＪ．１６：２２３〜２３４（１９９８））。部分的に精製さ
れた転写因子（１μｇ）を用いて、オリゴヌクレオチドプローブについて、移動
度シフトを観察した。この移動度シフトがＡＨＢＰ−１ｂの結合に起因し、そし
て調製物中の他の非特異的タンパク質に起因しなかったことを実証するために、
理想的な条件下で精製された関連しないタンパク質を使用してコントロール反応
を行った。コントロールタンパク質調製物は、プローブに結合しなかった。さら
に結合の特異性を試験するために、過剰量の非標識プローブ（ｂＺＩＰ転写因子
結合部位を含む）を使用して、競合実験を行った。４０倍の過剰量の非標識オリ
ゴヌクレオチドが反応に含まれた場合、標識プローブへのＡＨＢＰ−１の結合は
、完全に無くなった。ネガティブコントロールのように、ｂＺＩＰ結合モチーフ
に点変異を含むオリゴヌクレオチドをまた、競合実験に使用した。標識プローブ
へのＡＨｂＰ−１ｂの結合は、変異型フラグメントの存在によって影響されなか
った。たとえその濃度が標識プローブよりも１００倍高い場合でさえも。

【０１２１】（実施例６）この実施例は、酵母ツーハイブリッド系においてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＮ
ＰＲ１に結合する４つのイネｂＺＩＰ遺伝子産物、ＭＮ１、ＭＮ８、ＭＮ３８お
よびＭＮ１４０を示す。

【０１２２】（結果）（４つのイネｂＺＩＰポリペプチドは、酵母ツーハイブリッド系においてＮＰ
Ｒ１と相互作用する）ｐＡＤ−ＧＡＬ４ベクター内に調製されたイネｃＤＮＡライブラリー（未発表
；Ｓｏｎｇ，Ｗ．およびＲｏｎａｌｄ，Ｐ．）を、全長Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
Ｎｐｒ１ｃＤＮＡをバイトとして使用してスクリーニングした。Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓＮＰＲ１バイトを、プラスミドｐＭＣ８６のＳｍａＩおよびＢｇ
ｌＩＩ部位にクローン化した。プラスミドｐＭＣ８６は、ｐＰＣ８６内のＧＡＬ
４活性化ドメインのＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ＤＢ）（ｐＰＣ９
７内）での置換によって構築された。酵母宿主ＨＦ７ｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐ
ａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）において、ＧＡＬ４ＤＢ：：ＮＰＲ１融合タンパク質
としてＮＰＲ１を発現した。約２千万の酵母形質転換体のスクリーニング後、４
つの独立したクローンを単離した。それらのクローンは、ヒスチジン原栄養菌性
を示し、そしてｌａｃＺポジティブであった。これらのクローンは本明細書中で
、ＭＮ１、ＭＮ８、ＭＮ３８およびＭＮ１４０と呼ばれる。

【０１２３】ＭＮ１およびＭＮ８ｃＤＮＡの５’末端を、同じイネライブラリーｃＤＮＡ
をテンプレートして用いる各クローンについてネスト化された（ｎｅｓｔｅｄ）
ＰＣＲ反応を行うことによって得た。アンカープライマーＳＳ２０（５’ＡＧＧ
ＧＡＴＧＴＴＴＡＡＴＡＣＣＡＣＴＡＣ）（配列番号２１）およびＭＮ１につい
ては遺伝子特異的プライマーｍｍ１−１（５’ＧＡＡＧＣＣＡＴＧＡＣＴＧＣＡ
ＣＣＡ）（配列番号２２）、またはＭＮ８ついてはプライマーｍｎ８−１（５’
ＴＴＡＴＣＧＴＣＧＧＴＡＴＣＣＡＧＧＡ）（配列番号２３）を用いてこの第１
の反応を行った。第２の反応は、アンカープライマー（５’ＡＣＣＣＧＧＧＡＧ
ＡＧＡＴＣＧＡＴＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡ）（配列番号２４）およびＭＮ１につい
ては遺伝子特異的プライマーｍｎ１−２（５’ＣＡＣＣＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＴ
ＴＴＴＣ）（配列番号２５）、またはＭＮ８についてはプライマーｍｎ８−２（
５’ＧＧＡＣＴＧＴＴＧＡＴＧＴＧＴＣＡＧＴ）（配列番号２６）を使用した。
ＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ
ｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）プラスミドベクター内にクローン化した。各々について２
つのクローンを配列決定した。配列が比較された場合、ツーハイブリッドスクリ
ーニングより得たＭＮ８クローンは、完全ｃＤＮＡコード領域を含むようであっ
た。第１の１８アミノ酸をコードするＭＮ１配列を本来のＭＮ１クローンと組み
合わせ、完全なｃＤＮＡコード配列を得る。

【０１２４】上記の実施例は、本発明の例示のために提供されるが、その範囲の限定しない
。本発明の他の改変は、当業者には容易に明らかであり、添付の請求項に含まれ
る。本明細書中に列挙される全ての刊行物、特許および特許出願は、すべての目
的のために参考として援用される。

【０１２５】

【化１】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ツァン，ユーリンアメリカ合衆国カリフォルニア 95616，デイビス，エフ．ストリート 808，アパートメント 201 (72)発明者キンケマ，マークアメリカ合衆国ノースカロライナ 27707，ダラム，ユニバーシティドライブナンバー713 4600 (72)発明者ドン，キニアンアメリカ合衆国ノースカロライナ 27707，ダラム，ドーバーロード 3619 (72)発明者ロナルド，パメラアメリカ合衆国カリフォルニア 95616，デイビス，ロード 96 26951 (72)発明者チャーン，モーシェンクアメリカ合衆国カリフォルニア 95616，デイビス，アダムズストリート 878 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 2G045 AA34 AA35 BB14 BB46 BB48 BB51 CB20 DA13 DA36 FB02 FB05 FB08 4B024 AA08 AA11 AA20 BA79 BA80 CA04 CA07 CA09 DA01 DA02 DA07 DA12 EA02 EA04 FA02 GA11 HA03 HA11 HA13 HA14 HA20 4B063 QA07 QA13 QQ43 QQ54 QQ79 QR32 QR35 QR40 QR48 QR56 QR76 QR80 QS16 QS32 QX01 QX10 4B065 AA88X AA88Y AA90X AB01 AC14 AC20 BA02 BD14 CA24 CA46 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸構築物
であって、該ポリヌクレオチド配列が、以下：１）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に
対して少なくとも５００塩基対にわたって少なくとも９５％同一であるか、また
は２）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８もしくは配列番号１０
に示されるようなポリペプチドをコードする、単離された核酸構築物。
【請求項２】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、トマト由来である、
請求項１に記載の構築物。
【請求項３】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、イネ由来である、請
求項１に記載の構築物。
【請求項４】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号１である、
請求項１に記載の構築物。
【請求項５】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号３である、
請求項１に記載の構築物。
【請求項６】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号５である、
請求項１に記載の構築物。
【請求項７】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号７である、
請求項１に記載の構築物。
【請求項８】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号９である、
請求項１に記載の構築物。
【請求項９】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号２をコード
する、請求項１に記載の構築物。
【請求項１０】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号４をコー
ドする、請求項１に記載の構築物。
【請求項１１】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号６をコー
ドする、請求項１に記載の構築物。
【請求項１２】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号８をコー
ドする、請求項１に記載の構築物。
【請求項１３】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号１０をコ
ードする、請求項１に記載の構築物。
【請求項１４】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され
たプロモーターをさらに含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項１５】前記プロモーターが、組織特異的プロモーターである、請
求項１４に記載の構築物。
【請求項１６】前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項
１４に記載の構築物。
【請求項１７】組換え発現カセットを含むトランスジェニック植物であっ
て、該カセットが、ＮＰＲ１と相互作用し得るポリペプチドをコードするｂＺＩ
Ｐポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された植物プロモーターを含み、ここ
で、該ポリヌクレオチドが、１）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に
対して少なくとも５００塩基対にわたって少なくとも９５％同一であるか、また
は２）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８もしくは配列番号１０
に示されるようなポリペプチドをコードする、トランスジェニック植物。
【請求項１８】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号１である
、請求項１７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１９】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号３である
、請求項１７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２０】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号５である
、請求項１７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２１】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号７である
、請求項１７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２２】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号９である
、請求項１７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２３】前記植物プロモーターが、異種プロモーターである、請求
項１７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２４】前記植物がイネである、請求項１７に記載のトランスジェ
ニック植物。
【請求項２５】前記植物がトマトである、請求項１７に記載のトランスジ
ェニック植物。
【請求項２６】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号２に示さ
れるようなポリペプチドをコードする、請求項１７に記載のトランスジェニック
植物。
【請求項２７】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号４に示さ
れるようなポリペプチドをコードする、請求項１７に記載のトランスジェニック
植物。
【請求項２８】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号６に示さ
れるようなポリペプチドをコードする、請求項１７に記載のトランスジェニック
植物。
【請求項２９】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号８に示さ
れるようなポリペプチドをコードする、請求項１７に記載のトランスジェニック
植物。
【請求項３０】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号１０に示
されるようなポリペプチドをコードする、請求項１７に記載のトランスジェニッ
ク植物。
【請求項３１】植物において病原体に対する耐性を増強する方法であって
、該方法が、以下：ａ）植物に、ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された植物プロ
モーターを含む組換え発現カセットを導入する工程；およびｂ）増強された耐性を有する植物を選択する工程を包含する、方法。
【請求項３２】請求項３１に記載の方法であって、ここで、前記選択する
工程が、防御関連遺伝子のプロモーターからの増加した発現を測定することによ
って実施される、方法。
【請求項３３】前記植物がイネである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】前記植物がトマトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号２に示さ
れるようなｂＺＩＰポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号４に示さ
れるようなｂＺＩＰポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号６に示さ
れるようなｂＺＩＰポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号８に示さ
れるようなｂＺＩＰポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号１０に示
されるようなｂＺＩＰポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号１に示さ
れるような配列である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号３に示さ
れるような配列である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号５に示さ
れるような配列である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号７に示さ
れるような配列である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】前記ｂＺＩＰポリヌクレオチド配列が、配列番号９に示さ
れるような配列である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】前記プロモーターが、組織特異的プロモーターである、請
求項３１に記載の方法。
【請求項４６】前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項
３１に記載の方法。
【請求項４７】植物病害耐性に関与するポリペプチドを同定する方法であ
って、該方法が、以下：ａ）ＮＰＲ１に結合するポリペプチドを同定する工程、ｂ）該同定されたポリペプチドが、病害耐性を調節するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項４８】請求項４７に記載の方法であって、ここで、前記決定する
工程が、前記同定されたポリペプチドが少なくとも１つの防御関連遺伝子の発現
を調節するか否かを決定する工程を包含する、方法。
【請求項４９】請求項４７に記載の方法であって、ここで、前記決定する
工程が、植物に、前記同定されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
導入する工程を包含する、方法。
【請求項５０】前記ポリペプチドが、トマト由来である、請求項４７に記
載の方法。
【請求項５１】前記ポリペプチドが、イネ由来である、請求項４７に記載
の方法。
【請求項５２】前記防御関連遺伝子が、病原関連タンパク質をコードする
、請求項４８に記載の方法。