WO2017002818A1 - ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 - Google Patents

ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 Download PDF

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山口　晴彦
ゆき乃 井之上
伏原　和久
高橋　征司
哲 山下
中山　亨
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住友ゴム工業株式会社
国立大学法人東北大学
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    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)

Definitions

  • the present invention relates to a method of producing a polyisoprenoid, a vector, a transformed plant, a method of producing a pneumatic tire, and a method of producing a rubber product.
  • natural rubber one kind of polyisoprenoid used for industrial rubber products cultivates rubber-producing plants such as Hevea brasiliensis (Hevea brasiliensis) and Limonaceous plant Ficus elastica.
  • the natural rubber is biosynthesized in the ductal cells of the plant body, and the natural rubber is obtained by manual collection from the plant.
  • Hevea brasiliensis is a plant that can grow only in limited areas such as Southeast Asia and South America. Furthermore, Hevea brasiliensis takes about 7 years to become a mature tree from which trees can be collected, and the period for which natural rubber can be collected is limited to 20 to 30 years. In the future, demand for natural rubber is expected to increase mainly in developing countries, but for the above reasons it is difficult to significantly increase production of natural rubber by Hevea brasiliensis. Therefore, there is concern about the exhaustion of natural rubber resources, and there is a demand for a stable natural rubber supply source other than Hevea brasiliensis mature trees and improvement of the production efficiency of natural rubber in Hevea brasiliensis.
  • Natural rubber has isopentenyl diphosphate (IPP) as a basic unit and has a cis-1,4-polyisoprene structure, and the biosynthesis of natural rubber is related to cis-prenyltransferase (CPT) because of its structure
  • CPT cis-prenyltransferase
  • Patent Document 1 states that improvement in rubber productivity can be expected by introducing a gene encoding a prenyltransferase of Hevea brasiliensis into a plant for transformation.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a polyisoprenoid, which solves the above-mentioned problems, enhances the rubber synthesis activity of rubber particles in vitro and enables an increase in production of natural rubber.
  • Another object of the present invention is to provide a vector capable of solving the above-mentioned problems and improving the production amount of polyisoprenoid by introducing it into a plant by genetic recombination technology.
  • Another object of the present invention is to provide a transformed plant into which the vector has been introduced, and a method for improving the production amount of cis-type isoprenoid and polyisoprenoid in the plant by introducing the vector into the plant.
  • the present invention provides a rubber particle with a protein in which a gene encoding a protein encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family is expressed in vitro, and a protein expressing a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein in vitro
  • CPT cis-prenyltransferase
  • NgBR Nogo-B receptor
  • CPT cis-prenyltransferase family protein
  • the above-mentioned cis-prenyltransferase (CPT) family protein has an aspartic acid residue at position 41 in the Hevea braiensis HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 and a position corresponding thereto, in the Hevea brasiliensis HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 A glycine residue at position 42 and the corresponding position, a position 45 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 2, and an arginine residue at the position corresponding thereto, It is preferable to have an asparagine residue at position 89 in the derived HRT1 and the corresponding position.
  • CPT cis-prenyltransferase family protein
  • A amino acid sequence of the following amino acid sequence (A) at the positions 41 to 49 and the position corresponding thereto in HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2: DGNX 1 RX 2 AKK (A)
  • X 1 and X 2 are the same or different and represent any amino acid residue
  • the amino acid sequence (A) and 7 amino acid residues other than X 1 and X 2 It is preferable that it is an amino acid sequence which has sequence identity in which five or more amino acid residues of
  • CPT cis-prenyltransferase family protein
  • B amino acid sequence in the amino acid sequence of positions 81 to 97 and the position corresponding thereto in HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2: TX 11 X 12 AFSX 13 X 14 NX 15 X 16 RX 17 X 18 X 19 EV (B)
  • X 11 to X 19 are the same or different and represent any amino acid residue
  • the amino acid sequence (B) and 8 amino acid residues other than X 11 to X 19 It is preferable that it is an amino acid sequence which has the sequence identity in which five or more amino acid residues among them are identical.
  • At least one selected from the group consisting of the gene encoding the cis-type prenyltransferase (CPT) family protein and the gene encoding the Nogo-B receptor (NgBR) family protein be derived from a plant.
  • At least one selected from the group consisting of the gene encoding the above-mentioned cis-prenyltransferase (CPT) family protein and the gene encoding Nogo-B receptor (NgBR) family protein is Hevea brasiliensis origin.
  • a cell-free protein synthesis solution containing an mRNA encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein and an mRNA encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein coexists with a rubber particle for protein synthesis And the step of binding the CPT family protein and the NgBR family protein to the rubber particle.
  • CPT cis-prenyltransferase
  • NgBR Nogo-B receptor
  • the cell-free protein synthesis solution contains an embryo extract.
  • the embryo extract is preferably derived from wheat.
  • the concentration of the rubber particles coexisting with the above cell-free protein synthesis solution is preferably 5 to 50 g / L.
  • the first invention of the present invention is also a kneading step of kneading a polyisoprenoid obtained by the method of producing a polyisoprenoid according to the first invention of the first invention and an additive to obtain a kneaded product, and molding a green tire from the kneaded product.
  • the present invention relates to a method of manufacturing a pneumatic tire including a green tire forming process and a vulcanization process of vulcanizing the green tire.
  • the first invention of the present invention is also a kneading step of kneading a polyisoprenoid obtained by the method of producing a polyisoprenoid of the first invention of the first invention and an additive to obtain a kneaded product, and molding a raw rubber product from the kneaded product.
  • the present invention relates to a method for producing a rubber product including a raw rubber product forming step and a vulcanization step of vulcanizing the raw rubber product.
  • the present invention also relates to a vector comprising a promoter having a promoter activity that specifically expresses a gene in the mammary duct and a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein functionally linked to the promoter.
  • NgBR Nogo-B receptor
  • the second aspect of the present invention is also a promoter having a promoter activity for expressing a gene specifically in the mammary duct, and a gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein functionally linked to the promoter and Nogo-
  • CPT cis-prenyltransferase
  • the present invention also relates to a vector containing a gene encoding a B receptor (NgBR) family protein.
  • the promoter having a promoter activity that specifically expresses a gene in the mammary duct is a promoter of a gene encoding Rubber Elongation Factor (REF), a promoter of a gene encoding Small Rubber Particle Protein (SRPP), Hevein 2.1 (HEV2. It is preferable that at least one selected from the group consisting of a promoter of a gene encoding 1) and a promoter of a gene encoding MYC1 transcription factor (MYC1).
  • REF Rubber Elongation Factor
  • SRPP Small Rubber Particle Protein
  • HEV2 Hevein 2.1
  • MYC1 transcription factor MYC1 transcription factor
  • the second invention also relates to a transformed plant into which any of the above-described vectors has been introduced.
  • the second aspect of the present invention also relates to a method for enhancing the production amount of cis-isoprenoid in a plant by introducing any of the vectors described above into the plant.
  • the second aspect of the present invention also relates to a method for enhancing the production of polyisoprenoid in a plant by introducing any of the vectors described above into the plant.
  • the second aspect of the present invention also relates to a kneading step of kneading a polyisoprenoid obtained from a transformed plant obtained by introducing any of the vectors described above into a plant and an additive to obtain a kneaded product;
  • the present invention relates to a method of manufacturing a pneumatic tire including a green tire molding step of molding a green tire and a vulcanization step of vulcanizing the green tire.
  • the second aspect of the present invention also relates to a kneading step of kneading a polyisoprenoid obtained from a transformed plant obtained by introducing any of the vectors described above into a plant and an additive to obtain a kneaded product;
  • the present invention relates to a method for producing a rubber product, including a raw rubber product forming step for forming a raw rubber product, and a vulcanization step for vulcanizing the raw rubber product.
  • a protein in which a gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein is expressed and a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein are expressed in vitro Since the method for producing a polyisoprenoid including a binding step of binding a protein to a rubber particle, the activity of the CPT family protein is stabilized and enhanced by binding the CPT family protein and the NgBR family protein to the rubber particle Is expected. As a result, the rubber synthesis ability of the rubber particles can be enhanced, and rubber can be produced more efficiently in the reaction tank (test tube, plant, etc.).
  • a method of producing a pneumatic tire the step of kneading the polyisoprenoid obtained by the method of producing polyisoprenoid of the first invention and an additive to obtain a kneaded product; Since it is a manufacturing method of a pneumatic tire including a green tire molding process of molding a green tire from the above and a vulcanization process of vulcanizing the green tire, a polyisoprenoid obtained by a method with high manufacturing efficiency at the time of polyisoprenoid manufacture In order to manufacture a pneumatic tire from the above, plant resources can be effectively utilized, and a pneumatic tire can be manufactured in consideration of the environment.
  • the method for producing a rubber product according to the first aspect of the present invention comprises the steps of: kneading the polyisoprenoid obtained by the method for producing a polyisoprenoid according to the first aspect of the present invention with an additive to obtain a kneaded product; Since it is a method of producing a rubber product including a raw rubber product forming step of forming a raw rubber product and a vulcanization step of vulcanizing the raw rubber product, rubber is obtained from a polyisoprenoid obtained by a method having high production efficiency during polyisoprenoid production. In order to manufacture a product, plant resources can be effectively used and rubber products can be manufactured in consideration of the environment.
  • the second vector of the present invention comprises a promoter having a promoter activity for expressing a gene specifically in mammary duct, and a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein functionally linked to the promoter. It is a vector.
  • a gene encoding a protein involved in polyisoprenoid biosynthesis, which is contained in the vector, is expressed specifically in a milk duct, and the production amount of cis-type isoprenoid and polyisoprenoid in the plant Can be improved.
  • a kneaded product is obtained by kneading a polyisoprenoid obtained from a transformed plant obtained by introducing the vector of the second invention into a plant and an additive.
  • a process for producing a pneumatic tire including a kneading step to obtain, a green tire molding step of molding a green tire from the above-mentioned kneaded product, and a vulcanization step of vulcanizing the green tire, so that the transformation with improved polyisoprenoid production amount
  • plant resources can be effectively used, and a pneumatic tire can be manufactured in consideration of the environment.
  • a kneaded product is obtained by kneading a polyisoprenoid obtained from a transformed plant obtained by introducing the vector of the second present invention into a plant and an additive.
  • a process for producing a rubber product comprising a kneading step, a raw rubber product forming step for forming a raw rubber product from the above-mentioned kneaded product, and a vulcanization step for vulcanizing the raw rubber product
  • plant resources can be effectively used, and rubber products can be produced in consideration of the environment.
  • FIG. 4 (a) Very long chain polyisoprenoid synthesized in Examples 1 to 3 (FIG. 4 (a)), Reference Examples 1 to 4 (FIG. 4 (b)), and Reference Examples 5 to 6 (FIG. 4 (c)). It is a graph showing the measurement result of the molecular weight distribution of (natural rubber). It is the schematic which shows a mode that the multiple sequence alignment of CPT family protein derived from various organisms was performed.
  • a first method for producing a polyisoprenoid of the present invention is a protein in which a gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein is expressed in vitro, and a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein And a binding step of binding the expressed protein to the rubber particle.
  • CPT cis-prenyltransferase
  • NgBR Nogo-B receptor
  • the present inventors have found for the first time that the combination of CPT family protein and NgBR family protein is directly involved in rubber synthesis.
  • the CPT family protein and the NgBR family protein are assumed to be disposed on rubber particles as shown in FIG. 1 and performing rubber synthesis.
  • FIG. 1 as an example, CPT is depicted as a CPT family protein
  • NgBR is depicted as an NgBR family protein
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • the production method of the present invention by binding CPT family protein and NgBR family protein to rubber particles in vitro (for example, in a reaction vessel (test tube, plant, etc.)), The rubber synthesis ability of the rubber particles can be enhanced, and rubber can be produced more efficiently in the reaction tank (test tube, plant, etc.).
  • the production method of the first invention may include other steps as long as the above-mentioned bonding step is included, and each step may be performed once or may be repeated plural times. .
  • the amount of CPT family protein and NgBR family protein binding to the rubber particles is not particularly limited.
  • the CPT family protein and the NgBR family protein are bound to the rubber particle means that all or a part of the CPT family protein and the NgBR family protein are incorporated into the rubber particle or the membrane structure of the rubber particle
  • the present invention is not limited to this, and means such as localized on the surface or inside of the rubber particles.
  • the protein bound to the rubber particle and the CPT family protein and the NgBR family protein form a complex as described above and are present on the rubber particle as a complex, they are also bound to the rubber particle It is included in the concept scope of
  • the origin of the rubber particles is not particularly limited.
  • the rubber particles may be derived from a latex of a rubber-producing plant such as Hevea brasiliensis, Russian daffodil, Guayule, Nogesi, Gambira.
  • the particle diameter of the rubber particles is not particularly limited, either one having a predetermined particle diameter may be separated and used, or one having various particle diameters may be used. Even when the particles having a predetermined particle diameter are separated and used, Small Rubber Particles (SRP) having a small particle diameter may be used as the rubber particles to be used, or Large Rubber Particles having a large particle diameter may be used. (LRP) may be used.
  • SRP Small Rubber Particles
  • LRP Large Rubber Particles having a large particle diameter
  • a method which is usually performed can be adopted, for example, a method of performing centrifugal treatment, more preferably multistage centrifugal treatment, etc.
  • a method of performing centrifugal treatment for example, a method of performing centrifugal treatment, more preferably multistage centrifugal treatment, etc.
  • a method of sequentially performing centrifugation at ⁇ 60000 ⁇ g there may be mentioned a method of sequentially performing centrifugation at ⁇ 60000 ⁇ g.
  • processing time of each centrifugation process 20 minutes or more are preferable, 30 minutes or more are more preferable, and 40 minutes or more are still more preferable.
  • 120 minutes or less are preferable and 90 minutes or less are more preferable.
  • the treatment temperature of each centrifugation
  • a protein in which a gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein is expressed in vitro and a protein in which a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein is expressed as Bound to particles.
  • CPT cis-prenyltransferase
  • NgBR Nogo-B receptor
  • CPT cis-prenyltransferase
  • NgBR Nogo-B receptor
  • the gene encoding the above-mentioned cis-prenyltransferase (CPT) family protein and the gene encoding the Nogo-B receptor (NgBR) family protein are the same species.
  • Hevea such as Hevea brasiliensis; Sonchus oleraceus; Sonchus asper; Sonchus such as Hachijona (Sonchus brachyotus); Solidago altissima (Solidago altissima) , Solidago virgaurea subsp. Asiatica, Solidago virgaurea subsp. Leipcarpa, Solidago virgaurea subsp. Leipcarpa f. Paludosa, Ookinokirin Solidago genus such as C. (Solidago virgaurea subsp.
  • Helianthus such as debilis), sunflower (Helianthus decapetalus), giant sunflower (Helianthus gigantes) etc .; dandelion (Taraxacum), ezo dandelion (Tar) H. Koidz), dandelion (Taraxacum hondoense Nakai), dandelion (Taraxacum platycarpum Dahlst), dandelion (Taraxacum japonicum), dandelion (Taraxacum officinale Weber), Russian dandelion (Taraxacumitraci ci at 7: Figs (Ficus carica), Hevea brasiliensis (Ficus elastica), Eurasian finch (Ficus pumila L.), broomfly (Ficus erecta Thumb.), Hosobamucui Novi (Ficus ampelas Burm.
  • Ficus benguetensis Merr. Ficus irisana Elm., Ficus microcarpa L. f., Ficus septica Burm. F., Ficus benghalensis etc.
  • Ficus genus Parthenium genus such as guayule (Parthenium argentatum), black flea tree (Parthenium hysterophorus), ragweed (Parthenium hysterophorus) etc .; Lettuce (Lactuca sativa), Bengal gallage, Arabidopsis thaliana (Arabidopsis thaliana) etc. And the like.
  • a cis-prenyltransferase (CPT) family protein is an enzyme that catalyzes a reaction for extending the chain length of an isoprenoid compound to a cis form.
  • CPT cis-prenyltransferase
  • a polyisoprenoid is biosynthesized by a polyisoprenoid biosynthetic pathway as shown in FIG. 2, and among the pathways, CPT family proteins are surrounded by a dotted frame in FIG. It is believed to be an enzyme that catalyzes the reaction of the A feature of the CPT family protein is that it has an amino acid sequence contained in Cis IPPS domain (NCBI Accession No. cd00475).
  • an isoprenoid compound means a compound having an isoprene unit (C 5 H 8 ).
  • the cis-type isoprenoid is a compound having an isoprenoid compound in which an isoprene unit is linked in a cis-type, and examples thereof include cis-farnesyl diphosphate, undecaprenyl diphosphate, and natural rubber.
  • FIG. al. Biochimica et Biophysica Acta no. 1625 (2003) p. 291-295, Masahiro Fujihashi et. al. , PNAS, Vol. 98, no. 8 (2001) p. From documents such as 4337-4342, box A in FIG.
  • box B parasitisum tree-derived HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 (The corresponding positions 81 to 97) are part of CPT family proteins from various organisms, which are part of highly conserved conserved regions, and the conserved regions mean sites having similar sequences (structures). This is a region presumed to be a site having the same function in protein. In particular, the aspartic acid residue is conserved in the position corresponding to position 41 in Hevea gram-derived HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 ((1) in FIG.
  • amino acids are CPT family proteins Amino acids that are essential for the enzymatic reaction of the enzyme, and any protein having these amino acids at that position has a function as a CPT family protein Considered.
  • the above multiple sequence alignment can be performed by the method of the embodiment described later.
  • the CPT family protein has the aspartic acid residue at position 41 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 2, and the position 42 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2 and A glycine residue at a position corresponding to this, a position 45 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2, and an arginine residue at a position corresponding thereto, and a HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2 It is preferable to have an asparagine residue at position 89 and the corresponding position.
  • the above CPT family protein has such a sequence, it is considered to have a function as a CPT family protein, and as an enzyme catalyzing a reaction for extending the chain length of an isoprenoid compound to a cis form It can function, and by being combined with the rubber particles together with the NgBR family protein, the rubber synthesis ability of the rubber particles can be enhanced, and it becomes possible to synthesize natural rubber in the rubber particles.
  • the CPT family protein has the following amino acid sequence (A) in which the amino acid sequence of positions 41 to 49 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2, and the position corresponding thereto: DGNX 1 RX 2 AKK (A) (In the above amino acid sequence (A), X 1 and X 2 are the same or different and represent any amino acid residue) or the amino acid sequence (A) and 7 amino acid residues other than X 1 and X 2 More preferably, it is an amino acid sequence having a sequence identity in which five or more of the amino acid residues are the same. More preferably, in the above amino acid sequence (A), X 1 represents H, G or R, and X 2 represents W, F or Y.
  • amino acid sequence having the same sequence identity as the above amino acid sequence (A) and 5 amino acid residues or more among 7 amino acid residues excluding X 1 and X 2 has 7 amino acid residues other than X 1 and X 2 More preferably, at least six amino acid residues in the group are identical.
  • the amino acid sequence of positions 81 to 97 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2 and the position corresponding thereto has the following amino acid sequence (B): TX 11 X 12 AFSX 13 X 14 NX 15 X 16 RX 17 X 18 X 19 EV (B) (In the above amino acid sequence (B), X 11 to X 19 are the same or different and represent any amino acid residue) or the amino acid sequence (B) and 8 amino acid residues other than X 11 to X 19 More preferably, it is an amino acid sequence having a sequence identity in which five or more of the amino acid residues are the same.
  • X 11 represents L, V, A or I
  • X 12 represents Y, F or H and X 13 is S, T or I , M or L
  • X 14 represents E, D or H
  • X 15 represents W or F
  • X 16 represents N, S, K, G or R.
  • X 17 represents P, S, H, G, R, K or Q
  • X 18 represents A, K, S or P
  • X 19 represents Q, D, R, To represent I, E, H, or S.
  • amino acid sequence having the same identity as the above amino acid sequence (B) and 5 amino acid residues or more among 8 amino acid residues except X 11 to X 19 has 8 amino acid residues other than X 11 to X 19 It is more preferable that 6 or more amino acid residues among the groups are identical, and it is further preferable that 7 or more amino acid residues are identical.
  • the CPT family protein has the amino acid sequence from position 41 to position 49 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence at a position corresponding thereto shown in SEQ ID NO: 2 It is particularly preferred to have a sequence identity in which at least six amino acid residues of the nine amino acid residues are identical to the amino acid sequence (DGNRRFAKK (SEQ ID NO: 51)) of As the said sequence
  • arrangement identity it is more preferable that 7 amino acid residues or more of 9 amino acid residues are the same, and it is still more preferable that 8 amino acid residues or more are the same.
  • the CPT family protein has the amino acid sequence from position 81 to position 97 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2, and the position 81 to 97 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2 It is particularly preferable to have sequence identity in which 14 amino acid residues or more of the 17 amino acid residues are identical to the amino acid sequence of position (TIYAFSIDNFRRKPHEV (SEQ ID NO: 52)). As the said sequence
  • arrangement identity it is more preferable that 15 amino acid residues or more of 17 amino acid residues are identical, and it is still more preferable that 16 amino acid residues or more are identical.
  • the conserved region corresponding to positions 41 to 49 in Hevea gram-derived HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 is, for example, the undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from E.
  • UPPS undecaprenyl phosphate synthetase
  • coli shown in SEQ ID NO: 45 It corresponds to the 25th to the 33rd position, and in the Undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from the genus Micrococca shown in SEQ ID NO: 46, corresponds to the 29th to 37th position, and is derived from the yeast shown in SEQ ID NO: 47 Corresponds to positions 75 to 83 in SRT1 and corresponds to positions 79 to 87 in AtCPT5 derived from Arabidopsis thaliana shown in SEQ ID NO: 44, and corresponds to positions 43 to 51 in AtCPT8 derived from Arabidopsis thaliana shown in SEQ ID NO: 22 Corresponding to positions 42 to 50 in the tobacco-derived DDPS represented by SEQ ID NO: 48 and represented by SEQ ID NO: 32 It corresponds to the 41st to 49th positions in HRT2 derived from Hevea brasiliensis, and corresponds to the 41st to 49th positions in CPT3 derived from Hevea
  • the conserved region corresponding to positions 81 to 97 in Hevea brasiliensis HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 is, for example, the 65th position in undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from E.
  • UPPS undecaprenyl phosphate synthetase
  • coli shown in SEQ ID NO: 45 It corresponds to the 81st position and corresponds to the 69th to the 85th position in Undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from the genus Micrococca shown in SEQ ID NO: 46, and in the SRT1 derived from yeast shown in SEQ ID NO: 47 It corresponds to positions 115 to 131, and corresponds to positions 119 to 135 in AtCPT5 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 44, and corresponds to positions 84 to 100 in AtCPT8 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 22; It corresponds to the 82nd to 98th positions in the tobacco-derived DDPS shown by No.
  • UPS Undecaprenyl diphosphate synthetase
  • the aspartic acid residue corresponding to position 41 in Hevea gram-derived HRT1 represented by SEQ ID NO: 2 is, for example, the asparagine at position 25 in the undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from Escherichia coli represented by SEQ ID NO: 45 It corresponds to an acid residue, and corresponds to an aspartic acid residue at position 29 in the Undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from Micrococcus sp.
  • UPPS undecaprenyl phosphate synthetase
  • SEQ ID NO: 46 Represented by SEQ ID NO: 46, and is derived from a yeast represented by SEQ ID NO: 47 Corresponds to the aspartic acid residue at position 75 in SRT1, corresponds to the aspartic acid residue at position 79 in AtCPT5 derived from Arabidopsis thaliana shown in SEQ ID NO: 44, and 43 in the AtCPT8 derived from Arabidopsis thaliana shown in SEQ ID NO: 22
  • tobacco-derived DDPS which corresponds to an aspartic acid residue and is represented by SEQ ID NO: 48 It corresponds to the aspartic acid residue at position 2, and corresponds to the aspartic acid residue at position 41 in HRT2 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 32, and aspartate residue 41 in CPT3 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 36
  • CPT4 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 37 corresponds to the
  • a glycine residue corresponding to position 42 in Hevea brasiliensis HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 is, for example, a glycine residue at position 26 in the undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from E. coli shown in SEQ ID NO: 45 Group, which corresponds to the glycine residue at position 30 in the Undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from Micrococca sp.
  • UPPS undecaprenyl phosphate synthetase
  • SEQ ID NO: 46 Shown in SEQ ID NO: 46, and in the yeast SRT1 shown in SEQ ID NO: 47 It corresponds to a glycine residue at position 76, and corresponds to a glycine residue at position 80 in AtCPT5 derived from Arabidopsis thaliana shown in SEQ ID NO: 44, and corresponds to a glycine residue at position 44 in AtCPT8 derived from Arabidopsis thaliana shown in SEQ ID NO: 22
  • SEQ ID NO: 48 Corresponding to a glycine residue at position 43 in the tobacco-derived DDPS represented by SEQ ID NO: 48, It corresponds to the glycine residue at position 42 in HRT2 derived from Hevea brasiliensis, and corresponds to the glycine residue at position 42 in CPT3 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 36, and CPT4 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 37 Correspond
  • an arginine residue corresponding to position 45 in Hevea brasiliensis HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 is, for example, an arginine residue at position 29 in the undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from E. coli shown in SEQ ID NO: 45 Group, which corresponds to the arginine residue at position 33 in the Undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from Micrococca sp.
  • UPPS undecaprenyl phosphate synthetase
  • SEQ ID NO: 46 Shown in SEQ ID NO: 46, and in the yeast SRT1 shown in SEQ ID NO: 47 It corresponds to an arginine residue at position 79 and corresponds to an arginine residue at position 83 in AtCPT5 derived from Arabidopsis thaliana shown in SEQ ID NO: 44 and corresponds to an arginine residue at position 47 in AtCPT8 derived from Arabidopsis thaliana shown in SEQ ID NO: 22
  • SEQ ID NO: 48 Corresponds to the arginine residue at position 45 in HRT2 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 32, and corresponds to the arginine residue at position 45 in CPT3 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 36, shown in SEQ ID NO: 37 It corresponds to the arginine residue at position 46 in CPT4 derived from Hevea brasiliensis, corresponds to the arginine residue at position 45 in
  • the asparagine residue corresponding to position 89 in Hevea gram-derived HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 has, for example, an asparagine residue at position 73 in the undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from E.
  • UPPS undecaprenyl phosphate synthetase
  • SEQ ID NO: 45 Group which corresponds to the asparagine residue at position 77 in the undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from the genus Micrococca shown in SEQ ID NO: 46, and in the yeast SRT1 shown in SEQ ID NO: 47 It corresponds to the asparagine residue at position 123, and corresponds to the asparagine residue at position 127 in AtCPT5 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 44, and corresponds to the asparagine residue at position 92 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 22
  • the tobacco-derived DDPS shown in SEQ ID NO: 48 It corresponds to a Sparagin residue, and corresponds to an asparagine residue at position 89 in HRT2 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 32, and corresponds to an asparagine residue at position 89 in CPT3 derived from
  • CPT family proteins examples include CPT (HRT1, HRT2, CPT3 to 5) derived from Hevea brasiliensis, AtCPT1 to 9 derived from Arabidopsis thaliana, CPT1 to 3 derived from lettuce, CPT1 to 3 derived from Taraxacum brevicorniculatum, and undecaprenylrin derived from E. coli Examples include acid synthetase (UPPS), undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from Micrococcus bacteria, SRT1 derived from yeast, DDPS derived from tobacco, DDPS derived from mouse, HDS derived from human and the like.
  • UPPS acid synthetase
  • UPS undecaprenyl diphosphate synthetase
  • the gene encoding the CPT family protein includes not only rubber-producing plants that produce rubber, but also plants, animals, microorganisms and the like other than rubber-producing plants, and naturally CPT family proteins derived from these are naturally rubber in the natural state Not involved in synthesis. Nevertheless, in the present invention, if it is a CPT family protein, it is possible to enhance the rubber synthesis ability of the rubber particles by bonding to the rubber particles regardless of the origin, type, etc. Natural rubber can be synthesized. Furthermore, it is considered that by binding the CPT family protein to the rubber particle together with the NgBR family protein, it is possible to further enhance the rubber synthesis ability of the rubber particle. This is considered to be due to the interaction between the CPT family protein and the NgBR family protein.
  • the gene encoding the CPT family protein is derived from a plant that produces rubber, is derived from another organism, or is naturally involved in rubber synthesis, etc.
  • the rubber synthesis ability of rubber particles can be enhanced, and natural rubber can be synthesized in the rubber particles.
  • the present inventors have introduced into which host the gene has been introduced rather than the origin and type of the CPT family protein, that is, under what environment did the CPT family protein be expressed? But they are considered to be important in rubber synthesis activity.
  • the present inventors anticipate the following mechanism. That is, it is thought that the degree of hydrophobicity and space (spatial breadth) at which the product synthesized by the CPT family protein is accumulated determines the chain length of the product synthesized.
  • the CPT family protein is hydrophobic to the CPT family protein even though the CPT family protein exhibits an activity that can not confirm the reaction product or exhibits the activity and can synthesize the product.
  • the chain length of the product extends only to a size that can be accommodated in the cleft structure.
  • the product synthesized by the CPT family protein is transferred from the hydrophobic cleft structure of the CPT family protein into the lipid bilayer membrane in the cell (eg, between endoplasmic reticulum membranes, etc.)
  • the product chain is accumulated because it is accumulated in the lipid bilayer membrane, and the environment is a hydrophobic environment, but is accumulated in a space not so wide as a space in the lipid bilayer membrane in cells. There is a limit to the growth of the length.
  • the product synthesized by the CPT family protein is accumulated in a space not so wide as a lipid bilayer membrane in cells, and is also synthetic There is a limit to the chain length extension of the product.
  • the product synthesized by the CPT family protein is accumulated in the rubber particle, and the environment is Because it is a hydrophobic environment and is much wider than in lipid bilayer membranes in cells, it is a hydrophobic environment and has less space constraints, so the product chain length is sufficiently extended It is possible to synthesize very long chain polyisoprenoid (natural rubber).
  • the CPT family protein used in the present invention have a transmembrane region on the N-terminal side in order to increase the affinity to rubber particles, and if it is not possessed as a wild type, the CPT family protein N
  • the transmembrane region may be artificially fused on the distal side.
  • the amino acid sequence of the transmembrane domain to be fused is not particularly limited, but it is desirable that it be the amino acid sequence of the transmembrane domain possessed by a protein naturally bound to a rubber particle in nature.
  • the Nogo-B receptor (NgBR) family protein has a function of binding to the membrane at one or more transmembrane regions at the N-terminal side, and interacting with the CPT family protein or other proteins at the C-terminal side It is a protein and supports functions by holding CPT family proteins on a membrane.
  • the feature of the NgBR family protein is that it has a transmembrane domain at the N-terminal side, and has an amino acid sequence contained in the Cis IPPS superfamily domain (NCBI Accession No. COG0020) at the C-terminal side.
  • NgBR family proteins examples include NgBR (HRTBP) derived from Hevea brasiliensis, AtLEW1 derived from Arabidopsis thaliana, LsCPTL1 and L2 derived from lettuce, and TbRTA derived from dandelion.
  • HRTBP HRTBP
  • AtLEW1 derived from Arabidopsis thaliana
  • LsCPTL1 and L2 derived from lettuce
  • TbRTA derived from dandelion.
  • a protein may have a function originally possessed even if it contains substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids in the original amino acid sequence. Therefore, the following [2] is also mentioned as a specific example of the above-mentioned CPT family protein.
  • [2] Consists of a sequence comprising substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and extending the chain length of the isoprenoid compound to cis form Protein having enzyme activity catalyzing reaction
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 preferably one or more amino acids, more preferably 1 to 58 amino acids, still more preferably 1 Substitution of-44 amino acids, even more preferably 1-29 amino acids, particularly preferably 1-15 amino acids, most preferably 1-6 amino acids, most preferably 1-3 amino acids, It is preferred that the amino acid sequence comprises deletion, insertion and / or addition.
  • amino acid substitution conservative substitution is preferred, and specifically, substitution within a group in parentheses below is mentioned.
  • (glycine, alanine) valine, isoleucine, leucine) (aspartic acid, glutamic acid) (asparagine, glutamine) (serine, threonine) (lysine, arginine) (phenylalanine, tyrosine).
  • a protein having an amino acid sequence having high sequence identity to the original amino acid sequence may have the same function. Therefore, the following [3] is also mentioned as a specific example of the above-mentioned CPT family protein.
  • sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% Or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, 36, 41, 22, 14, 43, 47, or 50
  • CPT family proteins also include the following [12].
  • It consists of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, 36, 41, 22, 14, 43, 47, or 50, and the chain length of the isoprenoid compound is cis
  • sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, 36, 41, 22, 14, 43, 47, or 50 is preferably 85. %, More preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • sequence identity of amino acid sequences and base sequences can be determined according to the algorithm BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] or FASTA [Methods Enzymol. , 183, 63 (1990)] can be used.
  • a conventionally known method can be used, and for example, a transformant in which a gene encoding a target protein is introduced using E. coli etc. And a method of expressing the target protein and measuring the presence or absence of the function of the target protein by the respective activity measurement methods.
  • a protein may have a function originally possessed even if it contains substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids in the original amino acid sequence. Therefore, the following [5] is also mentioned as a specific example of the said NgBR family protein.
  • One or more membranes consisting of a sequence including substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and having N-terminal side A protein that has the function of binding to the membrane in the penetrating region and interacting with other proteins at the C-terminal side
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 preferably one or more amino acids, more preferably 1 to 52 amino acids, further preferably 1 Substitution of ⁇ 39 amino acids, even more preferably 1 to 26 amino acids, particularly preferably 1 to 13 amino acids, most preferably 1 to 6 amino acids, most preferably 1 to 3 amino acids, It is preferred that the amino acid sequence comprises deletion, insertion and / or addition.
  • amino acid substitution conservative substitution is preferred, and specifically, substitution within a group in parentheses below is mentioned.
  • (glycine, alanine) valine, isoleucine, leucine) (aspartic acid, glutamic acid) (asparagine, glutamine) (serine, threonine) (lysine, arginine) (phenylalanine, tyrosine).
  • sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% Or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • NgBR family proteins also include the following [15].
  • One or more transmembrane regions consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 or 16, and bound to the membrane at one or more transmembrane regions; A protein having a function to interact with other proteins at the C-terminal side
  • sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 or 16 is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further preferably Is preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, most preferably at least 99%.
  • NgBR family protein As a method of confirming that the above NgBR family protein is used, a conventionally known method can be used. For example, an amino acid sequence is identified, and the amino acid sequence contained in Cis IPPS superfamily domain (NCBI Accession No. COG0020) is contained. There is a way to check if it is.
  • the gene encoding the CPT family protein is not particularly limited as long as it encodes a CPT family protein and can be expressed to produce a CPT family protein, and the gene is specifically the following [1] or [2] is mentioned.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 [2] An enzyme that catalyzes a reaction that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and extends the chain length of the isoprenoid compound to a cis form Encoding a protein having
  • hybridize is a step of hybridizing DNA to a DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Therefore, the DNA having the specific base sequence or the base sequence of a part of the DNA is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or long enough to be used as an oligonucleotide primer for PCR (Polymerase Chain Reaction) analysis.
  • the DNA may be The DNA used as a probe may be DNA of at least 100 bases or more, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more, but may be DNA of at least 10 bases or more, preferably 15 bases or more .
  • the above-mentioned stringent conditions include, for example, a filter on which DNA is immobilized and a probe DNA in 50% formamide, 5 ⁇ SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6) After overnight incubation at 42 ° C. in a solution containing 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA, eg 0.2 ⁇ SSC solution at about 65 ° C. Conditions can be mentioned to wash the filter in, but lower stringency conditions can also be used.
  • the change of stringent conditions is possible by adjusting the concentration of formamide (the lower the concentration of formamide, the lower the stringency), and the change of salt concentration and temperature conditions.
  • low stringent conditions for example, 6 ⁇ SSCE (20 ⁇ SSCE, 3 mol / l sodium chloride, 0.2 mol / l sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / l EDTA, pH 7.4), 0 After overnight incubation at 37 ° C. in a solution containing .5% SDS, 30% formamide, 100 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA, 50 ° C. 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS solution The conditions used for washing can be mentioned. Further, as further lower stringency conditions, hybridization conditions may be performed using a solution of high salt concentration (for example, 5 ⁇ SSC) under the above-described low stringency conditions, followed by washing conditions.
  • high salt concentration for example, 5 ⁇ SSC
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing the blocking reagent used to reduce the background of the hybridization experiment.
  • the addition of blocking reagents described above may involve changes in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • the DNA hybridizable under the above-described stringent conditions is, for example, at least 80% of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 when calculated based on the above parameters using a program such as BLAST and FASTA.
  • the DNA comprising a base sequence having a sequence identity of 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more can be mentioned.
  • genes encoding the CPT family protein include the following [11] or [12].
  • [11] A DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31, 35, 40, 21, 13, 42, 63 or 64
  • [12] isoprenoid compound which hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31, 35, 40, 21, 13, 42, 63, or 64; Encoding a protein having an enzymatic activity catalyzing a reaction for extending the chain length of the protein to cis
  • hybridize as used herein is the same as described above.
  • stringent conditions are also the same as described above.
  • DNAs hybridizable under the above stringent conditions for example, SEQ ID NO: 31, 35, 40, 21, 13, 42, when calculated based on the above parameters using a program such as BLAST and FASTA.
  • the DNA that hybridizes with the above-mentioned DNA under stringent conditions is a DNA encoding a protein having a predetermined enzyme activity
  • a conventionally known method can be used, for example, E. coli.
  • the target protein is expressed by a transformant into which a gene encoding a target protein has been introduced, and the activity of the target protein is measured by the respective activity measurement methods.
  • the gene encoding the above NgBR family protein include the following [3] or [4].
  • hybridize as used herein is the same as described above.
  • stringent conditions are also the same as described above.
  • the DNA hybridizable under the above-described stringent conditions is, for example, at least 80% of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 when calculated based on the above parameters using a program such as BLAST and FASTA.
  • the DNA comprising a base sequence having a sequence identity of 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more can be mentioned.
  • genes encoding the above NgBR family protein also include the following [13] or [14].
  • hybridize as used herein is the same as described above.
  • stringent conditions are also the same as described above.
  • the DNA capable of hybridizing under the above stringent conditions is, for example, at least a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23 or 15 when calculated based on the above parameters using a program such as BLAST and FASTA.
  • a DNA consisting of a base sequence having a sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more can be mentioned.
  • the DNA hybridizing with the above-mentioned DNA under stringent conditions is a DNA encoding an NgBR family protein
  • a conventionally known method can be used.
  • the DNA may be used as an amino acid sequence
  • RNA is extracted from a growing plant, mRNA is purified as necessary, and reverse transcription is performed. CDNA is synthesized by reaction. Next, degenerate primers are designed based on the amino acid sequence of a known protein corresponding to the target protein, RT-PCR is performed, a DNA fragment is partially amplified, and a sequence is partially identified. Then, the RACE method or the like is performed to identify the full-length nucleotide sequence and amino acid sequence.
  • RACE Rapid Amplification of cDNA Ends method
  • PCR is performed based on the base sequence information of the known region to determine the unknown region up to the cDNA end.
  • the degenerate primer is preferably prepared from a plant-derived sequence having a sequence site highly common to the target protein.
  • a primer containing an initiation codon and a primer containing a termination codon are designed from the known nucleotide sequence, and RT-PCR is performed using the synthesized cDNA as a template. By doing this, the full-length base sequence and amino acid sequence can be identified.
  • a protein in which a gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein is expressed in vitro and a protein in which a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein is expressed in vitro
  • other proteins may be bound as long as it is bound to the rubber particles.
  • the origin of the above-mentioned other proteins is not particularly limited, but is preferably derived from the above-mentioned plant, and is derived from a plant belonging to at least one genus selected from the group consisting of Hevea, Sonchus, Taraxacum, and Parthenium. It is more preferable that Among them, it is more preferable that it is derived from at least one kind of plant selected from the group consisting of Hevea brasiliensis, Nogeshi, guayule and russian dander, and it is more preferably that it is derived from Hevea brasiliensis.
  • the above-mentioned other proteins are not particularly limited and may be any protein, but from the viewpoint of enhancing the rubber synthesis ability of the rubber particles, it is a protein originally present on the rubber particles in the rubber producing plant body preferable.
  • the protein present on the rubber particle may be a protein which is largely bound to the film surface of the rubber particle, or may be a protein which is bound to be inserted into the film of the rubber particle, or the above-mentioned film Or a protein that forms a complex with the protein bound to the protein and will be present on the membrane surface.
  • Examples of the protein originally present on rubber particles in the rubber-producing plant include Rubber Elongation Factor (REF), Small Rubber Particle Protein (SRPP), ⁇ -1,3-glucanase, Hevein and the like.
  • REF Rubber Elongation Factor
  • SRPP Small Rubber Particle Protein
  • ⁇ -1,3-glucanase Hevein and the like.
  • the means for binding the CPT family protein and the NgBR family protein to the rubber particle is not particularly limited in vitro, as long as the rubber particle can bind the CPT family protein, for example, an mRNA encoding the CPT family protein and NgBR family protein.
  • a cell-free protein synthesis solution containing an mRNA encoding CPT family protein and an mRNA encoding NgBR family protein and a rubber particle are subjected to protein synthesis in coexistence with CPT family protein in the rubber particle.
  • NgBR family proteins are preferably bound.
  • a cell-free protein synthesis solution containing mRNA encoding CPT family protein and NgBR family protein coexists with rubber particles (more specifically, it contains mRNA encoding CPT family protein and NgBR family protein It is preferable to obtain a rubber particle to which a CPT family protein and an NgBR family protein are bound by performing protein synthesis by mixing a cell-free protein synthesis solution and a rubber particle.
  • the liposome is artificially produced as a lipid bilayer membrane composed of phospholipid, glyceroglycolipid, cholesterol and the like, no protein is bound to the surface of the produced liposome, whereas
  • the rubber particles collected from the latex of the production plant are also particles covered with a lipid membrane, but since the membrane is a membrane of natural origin, the protein synthesized in the plant is already bound to its surface . From this, it is expected that it is difficult to further bind the protein to the rubber particle in which the protein is already bound and covered with the protein, as compared to the liposome or the like to which the protein is not bound. .
  • proteins already bound to rubber particles may inhibit cell-free protein synthesis.
  • the protein synthesis carried out in the coexistence of a cell-free protein synthesis solution containing the above CPT family protein and the mRNA encoding the NgBR family protein with a rubber particle is a CPT family protein using a so-called cell-free protein synthesis method, and NgBR. It is a synthesis of family proteins, CPT family proteins carrying a biological function (in native state), and NgBR family proteins can be synthesized, and the cell-free protein synthesis method is carried out in the coexistence of rubber particles. CPT family protein and NgBR family protein can be bound to rubber particles in the native state.
  • the CPT family protein and the NgBR family protein are bound to the rubber particle by performing protein synthesis in the coexistence of the above-mentioned cell-free protein synthesis solution and the rubber particle, the CPT family protein synthesized by the protein synthesis.
  • all or part of each protein of the NgBR family proteins is incorporated into the rubber particles or inserted into the film structure of the rubber particles, but not limited thereto. It also means the case of existence.
  • a complex is formed with a protein bound to a rubber particle, and when it is present on the rubber particle as a complex, it is included in the conceptual range of being bound to the rubber particle.
  • the CPT family protein and the mRNA encoding the NgBR family protein are translation templates that can be translated to synthesize a CPT family protein and an NgBR family protein, respectively.
  • the origin of the mRNA encoding the CPT family protein and the NgBR family protein is not particularly limited, and may be from microorganisms, animals, or plants, but may be plants. Preferably, it is more preferably derived from the above-mentioned plant, and still more preferably derived from a plant belonging to at least one genus selected from the group consisting of Hevea, Sonchus, Taraxacum, and Parthenium.
  • the mRNA encoding the CPT family protein and the mRNA encoding the NgBR family protein are derived from the same species.
  • the mRNA encoding the CPT family protein and the NgBR family protein is a translation template which can be translated to synthesize the CPT family protein and the NgBR family protein, respectively, and the preparation method is not particularly limited.
  • the total RNA is extracted from the latex of the human body by the hot phenol method etc., and cDNA is synthesized from the obtained total RNA, and CPT is prepared using the primer prepared based on the nucleotide sequence information of the gene encoding CPT family protein and NgBR family protein.
  • a DNA fragment of a gene encoding a family protein, NgBR family protein can be obtained, and the DNA fragment can be prepared by carrying out an in vitro transcription reaction usually carried out based on the DNA fragment.
  • the above-mentioned cell-free protein synthesis solution may contain mRNAs encoding other proteins, as long as it contains the above-mentioned CPT family protein and mRNA encoding NgBR family protein.
  • mRNAs encoding the above-mentioned other proteins those which can be translated and can express other proteins can be used.
  • other proteins the same ones as described above can be mentioned.
  • cell-free protein synthesis of CPT family protein and NgBR family protein is preferably performed in the coexistence of rubber particles, and the cell-free protein synthesis is the above-mentioned cell-free protein synthesis.
  • the solution can be used in a conventional manner.
  • a cell-free protein synthesis system to be used a cell-free protein synthesis means usually used can be adopted.
  • Rapid Translation System RTS 500 manufactured by Roshe Diagnostics
  • the origin of the above-mentioned embryo extract is not particularly limited. However, from the viewpoint of translation efficiency, it is preferable to use a plant-derived embryo extract when a protein of a plant is synthesized by a cell-free protein synthesis method. It is particularly preferable to use wheat germ extract. That is, it is also one of the preferred embodiments of the first present invention that the above-mentioned embryo extract is derived from wheat.
  • the method for preparing the above-mentioned embryo extract is not particularly limited, and a usual method for preparing embryo extract can be adopted.
  • a usual method for preparing embryo extract can be adopted.
  • the method described in JP-A-2005-218357 may be adopted.
  • the cell-free protein synthesis solution preferably further contains a cyclic nucleoside monophosphate derivative or a salt thereof (hereinafter, also simply referred to as "activity enhancer").
  • activity enhancer a cyclic nucleoside monophosphate derivative or a salt thereof
  • the cyclic nucleoside monophosphate derivative or a salt thereof is not particularly limited as long as it can enhance cell-free protein synthesis activity, and, for example, adenosine-3 ′, 5 ′ cyclic monophosphate and a salt thereof Adenosine-3 ', 5' cyclic thiomonophosphate (Sp isomer) and a salt thereof, adenosine-3 ', 5' cyclic thiomonophosphate (Rp isomer) and a salt thereof, guanosine-3 ', 5' thyro Click monophosphate and its salt, guanosine-3 ', 5' cyclic thiomonophosphate (Sp isomer) and its salt, guanosine-3 ', 5' cyclic thiomonophosphate (Rp isomer) and its salt, 8-bromoadenosine-3 ', 5'-cyclic monophosphate (bromocAMP) and its salts
  • the base for forming a salt with the cyclic nucleoside monophosphate derivative is not particularly limited as long as it is biochemically acceptable, and forms a salt with the derivative. Among them, preferred is, among them, a preferred one. Examples thereof include alkali metal atoms such as sodium and potassium, and organic bases such as trishydroxyaminomethane.
  • adenosine-3 ', 5'cyclic monophosphate and adenosine-3', 5'cyclic monophosphate sodium are particularly preferable as the activity enhancer.
  • These activity enhancers may be used alone or in combination of two or more.
  • the activity enhancing substance may be added in advance to the cell-free protein synthesis solution, but if it is unstable in the solution, the cell-free protein synthesis solution and the rubber particles are made to coexist and the protein synthesis reaction is performed. It is preferable to add it when
  • the amount of the activity enhancer to be added is not particularly limited as long as the protein synthesis reaction by the cell-free protein synthesis solution can be activated (increased).
  • the final concentration in the reaction system may usually be 0.1 mmol / l or more.
  • the lower limit of the concentration is preferably 0.2 millimoles / liter, more preferably 0.4 millimoles / liter, and particularly preferably 0.8 millimoles / liter.
  • the upper limit of concentration is preferably 24 millimoles / liter, more preferably 6.4 millimoles / liter, and particularly preferably 3.2 millimoles / liter.
  • the temperature of the cell-free protein synthesis solution at the time of adding the activity enhancing substance to the cell-free protein synthesis solution is not particularly limited, but it is preferably 0-30 ° C., more preferably 10-26 ° C.
  • the above-mentioned cell-free protein synthesis solution contains, in addition to mRNA (translation template) encoding CPT family protein and NgBR family protein, ATP, GTP, creatine phosphate, creatine kinase, L-type amino acid which is an essential component for protein synthesis, It contains potassium ion, magnesium ion and the like, and further contains an activity enhancing substance as required.
  • mRNA translation template
  • the first binding process of the present invention it is preferable to carry out protein synthesis in the coexistence of a cell-free protein synthesis solution containing mRNA encoding CPT family protein and NgBR family protein and a rubber particle.
  • a cell-free protein synthesis solution containing mRNA encoding CPT family protein and NgBR family protein and a rubber particle.
  • it can be carried out by adding rubber particles to the above-mentioned cell-free protein synthesis solution at an appropriate time before or after protein synthesis, preferably before protein synthesis.
  • the concentration of the rubber particles coexisting with the cell-free protein synthesis solution is preferably 5 to 50 g / L. That is, it is preferable that 5 to 50 g of rubber particles be allowed to coexist in 1 L of the cell-free protein synthesis solution.
  • the concentration of the rubber particles coexisting with the cell-free protein synthesis solution is less than 5 g / L, separation processing by ultracentrifugation etc. is performed to recover the rubber particles to which the synthesized CPT family protein and NgBR family protein are bound. In some cases, it is difficult to recover the rubber particles to which the CPT family protein synthesized and the NgBR family protein are bound because the rubber layer is not formed.
  • the concentration of the rubber particles to be made to coexist with the cell-free protein synthesis solution exceeds 50 g / L, the rubber particles will aggregate and there is a possibility that the synthesized CPT family protein and NgBR family protein can not be successfully bound to the rubber particles. is there.
  • the concentration of the rubber particles is more preferably 10 to 40 g / L, still more preferably 15 to 35 g / L, and particularly preferably 15 to 30 g / L.
  • rubber particles may be appropriately added as the reaction progresses. While the cell-free protein synthesis system is active, eg, 3 to 48 hours (preferably 3 to 30 hours, more preferably 3 to 24 hours) after adding the rubber particles to the cell-free protein synthesis solution, It is preferable to make the solution and the rubber particles coexist.
  • the rubber particles do not need to be subjected to any special treatment such as pretreatment before being used in the bonding step of the first invention (more preferably, before being allowed to coexist with the cell-free protein synthesis solution).
  • any special treatment such as pretreatment before being used in the bonding step of the first invention (more preferably, before being allowed to coexist with the cell-free protein synthesis solution).
  • the protein was previously removed from the rubber particle with a surfactant. May be
  • the rubber particles used in the first invention are washed with a surfactant before being used in the binding step in the first invention (more preferably, before being allowed to coexist with the cell-free protein synthesis solution). It is also one of the preferred embodiments of the first present invention.
  • the surfactant is not particularly limited, and examples thereof include nonionic surfactants and amphoteric surfactants.
  • nonionic surfactants and amphoteric surfactants are preferably used, and amphoteric surfactants are particularly preferably used, from the viewpoint that the denatured action of the protein on the membrane is small. That is, it is also one of the preferred embodiments of the first present invention that the surfactant is an amphoteric surfactant.
  • These surfactants may be used alone or in combination of two or more.
  • nonionic surfactants examples include polyoxyalkylene ether-based, polyoxyalkylene ester-based, polyhydric alcohol fatty acid ester-based, sugar fatty acid ester-based, alkyl polyglycoside-based and polyoxyalkylene polyglucoside-based nonionic.
  • Surfactants polyoxyalkylene alkyl amines, alkyl alkanolamides and the like.
  • polyoxyalkylene ether nonionic surfactants and polyhydric alcohol fatty acid ester nonionic surfactants are preferable.
  • polyoxyalkylene ether nonionic surfactant examples include polyoxyalkylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl phenyl ether, polyoxyalkylene polyol alkyl ether, polyoxyalkylene mono-, di- or tris-tyryl phenyl ether. Etc. Among these, polyoxyalkylene alkyl phenyl ether is suitably used.
  • the polyol is preferably a polyhydric alcohol having a carbon number of 2 to 12, and examples thereof include ethylene glycol, propylene glycol, glycerin, sorbitol, glucose, sucrose, pentaerythritol, sorbitan and the like.
  • polyoxyalkylene ester nonionic surfactant examples include polyoxyalkylene fatty acid esters and polyoxyalkylene alkyl rosin esters.
  • polyhydric alcohol fatty acid ester nonionic surfactant examples include fatty acid esters of polyhydric alcohols having 2 to 12 carbon atoms, and fatty acid esters of polyoxyalkylene polyhydric alcohols. More specifically, examples thereof include sorbitol fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, pentaerythritol fatty acid ester and the like.
  • these polyalkylene oxide adducts can also be used.
  • sorbitan fatty acid ester is preferably used.
  • sugar fatty acid ester nonionic surfactants include sucrose, glucose, maltose, fructose, fatty acid esters of polysaccharides and the like, and polyalkylene oxide adducts of these can also be used.
  • alkyl polyglycoside nonionic surfactant examples include glucose, maltose, fructose and sucrose as glycosides, and examples thereof include alkyl glucoside, alkyl polyglucoside, polyoxyalkylene alkyl glucoside and polyoxyalkylene alkyl poly.
  • alkyl polyglycoside nonionic surfactant examples include glucose, maltose, fructose and sucrose as glycosides, and examples thereof include alkyl glucoside, alkyl polyglucoside, polyoxyalkylene alkyl glucoside and polyoxyalkylene alkyl poly.
  • a glucoside etc. are mentioned and these fatty acid esters are also mentioned.
  • all these polyalkylene oxide adducts can be used.
  • the alkyl group in these nonionic surfactants includes, for example, a linear or branched saturated or unsaturated alkyl group having 4 to 30 carbon atoms.
  • a linear or branched saturated or unsaturated alkyl group having 4 to 30 carbon atoms As the polyoxyalkylene group, one having an alkylene group having 2 to 4 carbon atoms can be mentioned, and for example, one having an addition mole number of ethylene oxide of about 1 to 50 moles can be mentioned.
  • examples of the fatty acid include linear or branched saturated or unsaturated fatty acids having 4 to 30 carbon atoms.
  • polyoxyethylene ethylene oxide is particularly preferable because the membrane bound protein can be removed appropriately in a state where the film of rubber particles is stabilized and in a state where the denatured action of the protein is small.
  • Octyl phenyl ether Triton X-100
  • sorbitan monolaurate Span 20
  • amphoteric surfactant examples include quaternary ammonium base / sulfonic acid group (—SO 3 H) type, quaternary ammonium base / phosphoric acid group type (soluble in water), quaternary ammonium base / phosphoric acid Zwitterionic surfactants such as acid group type (insoluble in water) and quaternary ammonium base / carboxyl group type can be mentioned.
  • the acid group may be a salt.
  • the zwitterionic surfactant preferably has both + and-charges in one molecule, and the acid dissociation constant (pKa) of the acid group is preferably 5 or less, and 4 or less. It is more preferable that it be 3 or less.
  • amphoteric surfactant 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylamino] -2-hydroxy-1-propanesulfonic acid (CHAPSO), 3-[(3-cholamidopropyl) Dimethylamino] -propanesulfonic acid (CHAPS), N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) -cholamide, n-octadecyl-N, N'-dimethyl-3-amino-1-propanesulfonic acid, n-decyl-N, N'-dimethyl-3-amino-1-propanesulfonic acid, n-dodecyl-N, N'-dimethyl-3-amino-1-propanesulfonic acid, n-tetradecyl-N, N ' -Dimethyl-3-amino-1-propanesulfonic acid ⁇ ZwittergentTM-3-14 ⁇ ,
  • the processing concentration of the surfactant is preferably within 3 times the critical micelle concentration (CMC) of the surfactant used.
  • CMC critical micelle concentration
  • the membrane stability of the rubber particles may be reduced. More preferably, it is within 2.5 times, more preferably within 2.0 times.
  • the lower limit is preferably 0.05 times or more, more preferably 0.1 times or more, and still more preferably 0.3 times or more.
  • reaction system or apparatus for protein synthesis in the above cell-free protein synthesis As a reaction system or apparatus for protein synthesis in the above cell-free protein synthesis, a batch (batch) method (Pratt, J. M. et al., Transcription and Transcription, Hames, 179-209, B. D. & Higgins, S. J., eds, IRL Press, Oxford (1984)), a continuous cell-free protein synthesis system for continuously supplying amino acids, energy sources and the like to reaction systems (Spirin, AS et al., Science , 242,1162-1164 (1988)), etc.
  • a method such as supplying template RNA, amino acid, energy source and the like to a protein synthesis reaction system as needed, and discharging a synthesized product or a degradation product as needed can also be used.
  • the overlay method has the advantage of easy operation, the rubber particles are dispersed in the reaction solution, and it is difficult to efficiently couple the CPT family protein to be synthesized and the NgBR family protein to the rubber particles.
  • the CPT family protein to be synthesized and the amino acid used as the raw material of the NgBR family protein can permeate the dialysis membrane but not the rubber particles, thereby preventing the dispersion of the rubber particles,
  • the dialysis method is preferred because it can bind CPT family proteins and NgBR family proteins efficiently synthesized to rubber particles.
  • the synthesis reaction solution for protein synthesis in the cell-free protein synthesis is used as a dialysis internal fluid, and protein synthesis is performed using an apparatus isolated by a dialysis membrane capable of mass transfer with the dialysis external fluid. It is a method. Specifically, for example, after the above-mentioned synthesis reaction solution from which the translation template has been removed is pre-incubated for an appropriate time as necessary, the translation template is added, and it is put into a suitable dialysis container to make a reaction inner solution. As a dialysis container, the container (The dialysis cup 12000 grade
  • the tube for dialysis (12,000 grade
  • etc., Sanko Junyaku Co., Ltd. make the tube for dialysis (12,000 grade
  • the dialysis membrane one having a molecular weight limit of 10,000 daltons or more is used, but one having a molecular weight limit of about 12,000 daltons is preferable.
  • a buffer solution containing an amino acid is used as the above-mentioned dialysis external fluid.
  • the dialysate can be replaced with fresh one when the reaction rate decreases, to increase the dialysis efficiency.
  • the reaction temperature and time are appropriately selected in the protein synthesis system to be used, but for example, in a system using a wheat germ extract, the temperature is usually 10 to 40 ° C., preferably 18 to 30 ° C., more preferably 20 to 26 C. for 10 minutes to 48 hours (preferably 10 minutes to 30 hours, more preferably 10 minutes to 24 hours).
  • the synthesis of the protein can be carried out by appropriately adding the mRNA during the above protein synthesis reaction. It can be done more efficiently. That is, it is also one of the preferred embodiments of the first invention to further add mRNA encoding the CPT family protein and the NgBR family protein during the protein synthesis reaction.
  • the addition time, the number of additions, the addition amount, and the like of the mRNA are not particularly limited, and can be set as appropriate.
  • a protein in which a gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein is expressed in vitro, and a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein are expressed in vitro After carrying out the binding step of binding the thus obtained protein to the rubber particles, a step of recovering the rubber particles may be carried out, if necessary.
  • CPT cis-prenyltransferase
  • NgBR Nogo-B receptor
  • the rubber particle recovery step is not particularly limited as long as the rubber particles can be recovered, and the rubber particle recovery step can be performed by a method which is usually performed to recover rubber particles. Specifically, for example, a method of performing centrifugation and the like can be mentioned.
  • the rubber particles are recovered by the centrifugation, the centrifugal force, the centrifugal treatment time, and the centrifugal treatment temperature can be appropriately set so that the rubber particles can be recovered, for example, as the centrifugal force of the centrifugal treatment 15000 ⁇ g or more is preferable, 20000 ⁇ g or more is more preferable, and 25000 ⁇ g or more is more preferable.
  • the centrifugal force is preferably 50000 ⁇ g or less, more preferably 45000 ⁇ g or less, as the upper limit of the centrifugal force can not be expected even if the centrifugal force is too large.
  • a centrifugation process time 20 minutes or more are preferable, 30 minutes or more are more preferable, and 40 minutes or more are still more preferable.
  • the upper limit of the centrifugal treatment time is preferably 120 minutes or less, more preferably 90 minutes or less.
  • the centrifugation temperature is preferably 0 to 10 ° C., more preferably 2 to 8 ° C., and 4 ° C., from the viewpoint of maintaining the protein activity of CPT family protein bound to rubber particles and NgBR family protein. Particularly preferred.
  • the rubber particles are separated in the upper layer and the cell-free protein synthesis solution is separated in the lower layer when the centrifugation is performed. Thereafter, by removing the lower cell-free protein synthesis solution, it is possible to recover the rubber particles to which the CPT family protein and the NgBR family protein are bound.
  • the recovered rubber particles can be stored by resuspending in an appropriate pH neutral buffer.
  • the rubber particles recovered after the rubber particle recovery step can be used in the same manner as ordinary natural rubber without further special treatment.
  • the polyisoprenoid obtained by the method for producing a polyisoprenoid according to the first aspect of the present invention can be recovered by subjecting the rubber particles to the following solidifying step.
  • the method for solidifying the above-mentioned solidifying step is not particularly limited.
  • a method of adding rubber particles to a solvent which does not dissolve polyisoprenoid (natural rubber) such as ethanol, methanol, acetone etc., a method of adding an acid to rubber particles, etc. can be mentioned.
  • rubber natural rubber
  • the obtained rubber may be dried before use, as necessary.
  • a protein in which a gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein is expressed in vitro, and a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein can be enhanced by binding the protein that has been expressed to the rubber particles, whereby the rubber synthesis ability of the rubber particles can be enhanced, and thereby the rubber (polyisoprenoid) can be more efficiently contained in the reaction tank (test tube, plant, etc.) It is possible to produce 1).
  • CPT cis-prenyltransferase
  • NgBR Nogo-B receptor
  • a method for synthesizing a polyisoprenoid which comprises expressing a gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein in vitro (for example, in a reaction vessel (test tube, plant, etc.)) And a method of synthesizing a polyisoprenoid including a binding step of binding a protein expressing a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein to a rubber particle, which is also one of the first present inventions It is.
  • CPT cis-prenyltransferase
  • a protein in which a gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein is expressed in vitro, and a protein in which a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein is expressed are bound to rubber particles.
  • the bonding step to be carried out is as described above.
  • polyisoprenoid is a generic term for polymers composed of isoprene units (C 5 H 8 ).
  • examples of the polyisoprenoid include polymers of sesterterpene (C 25 ), triterpene (C 30 ), tetraterpene (C 40 ), natural rubber and the like.
  • isoprenoid means a compound having an isoprene unit (C 5 H 8 ), and is a concept also including polyisoprenoid.
  • the method for producing a rubber product according to the first aspect of the present invention comprises the step of kneading the polyisoprenoid obtained by the method for producing a polyisoprenoid according to the first aspect of the present invention with an additive to obtain a kneaded product; A raw rubber product forming step, and a vulcanizing step of vulcanizing the raw rubber product.
  • the rubber product is not particularly limited as long as it can be manufactured using rubber (preferably natural rubber), and examples thereof include pneumatic tires, rubber rollers, rubber fenders, gloves, medical rubber tubes and the like.
  • the raw rubber product forming step corresponds to the vulcanization process which vulcanizes the above-mentioned green tire to the green tire formation process which molds a tire.
  • a kneading step of kneading a polyisoprenoid obtained by the above-mentioned method of manufacturing polyisoprenoid and an additive to obtain a kneaded product a kneading step of kneading a polyisoprenoid obtained by the above-mentioned method of manufacturing polyisoprenoid and an additive to obtain a kneaded product.
  • the polyisoprenoid obtained by the above-described method for producing polyisoprenoid and the additive are kneaded to obtain a kneaded product.
  • the additive is not particularly limited, and additives used for producing a rubber product can be used.
  • examples thereof include acids, processing aids, various anti-aging agents, softeners such as oils, waxes, vulcanizing agents such as sulfur, and vulcanization accelerators.
  • Kneading in the kneading step may be performed using a rubber kneading apparatus such as an open roll, a Banbury mixer, or a closed-type kneader.
  • a rubber kneading apparatus such as an open roll, a Banbury mixer, or a closed-type kneader.
  • a raw rubber product (green tire in the case of a tire) is formed from the kneaded product obtained in the kneading step. It does not specifically limit as a shaping
  • the rubber product is a pneumatic tire
  • the kneaded product obtained in the kneading step is extruded according to the shape of each tire member, and molded by a usual method on a tire molding machine.
  • a green tire (unvulcanized tire) may be molded.
  • a rubber product is obtained by vulcanizing the raw rubber product obtained by the raw rubber product forming step.
  • the method for vulcanizing the crude rubber product is not particularly limited, and the method used for vulcanizing the crude rubber product may be appropriately applied.
  • the rubber product is a pneumatic tire
  • a green tire (unvulcanized tire) obtained by the raw rubber product forming step is heated and pressurized in a vulcanizer to cure the green tire, thereby obtaining a pneumatic tire.
  • the vector according to the second aspect of the present invention is a gene encoding Nogo-B receptor (NgBR) family protein or a promoter of cis-type prenyltransferase (CPT) family protein, with a promoter having promoter activity to express a gene specifically in mammary duct And a nucleotide sequence obtained by functionally linking a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein.
  • NgBR Nogo-B receptor
  • CPT cis-type prenyltransferase
  • a gene encoding a protein involved in polyisoprenoid biosynthesis which is contained in the vector, is expressed specifically in the mammary duct, and cis-isoprenoid in the plant, It becomes possible to improve the production amount of polyisoprenoid. This is presumed to be because if the expression of the foreign gene introduced to improve the productivity of the emulsion is promoted at a site other than the milk duct, the metabolism of the plant and the production of the emulsion will be adversely affected. .
  • a promoter having promoter activity that causes a gene to be expressed specifically in a mammary duct means that the desired gene is a gene of interest when it is functionally linked to the promoter and introduced into a plant. It means having an activity to control gene expression so as to be specifically expressed in the mammary duct.
  • expression of a gene in a duct-specific manner means that the gene is not expressed at all or hardly at any site other than the duct in the plant, and it can be said that the gene is substantially exclusively expressed in the duct.
  • to functionally link a gene to a promoter means to link the gene sequence downstream of the promoter so as to be under the control of the promoter.
  • the vector of the second invention of the present invention is a vector generally known as a vector for transformation of plants, a nucleotide sequence of a promoter having a promoter activity that causes a gene to be expressed specifically in the mammary duct and Nogo-B receptor.
  • NgBR A nucleotide sequence of a gene encoding a family protein or a nucleotide sequence of a gene encoding a cis prenyltransferase (CPT) family protein and a nucleotide sequence of a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein It can produce by inserting by.
  • the vector of the second invention of the present invention is a nucleotide sequence of a promoter having a promoter activity that specifically expresses a gene in breast duct, and a nucleotide sequence of a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein, or a cis-type Other base sequences may be included as long as they contain the base sequences of the gene encoding the prenyltransferase (CPT) family protein and the gene encoding the Nogo-B receptor (NgBR) family protein.
  • the vector contains sequences derived from the vector, and further includes restriction enzyme recognition sequences, spacer sequences, sequences of marker genes, sequences of reporter genes, and the like.
  • the marker gene examples include drug resistant genes such as kanamycin resistant gene, hygromycin resistant gene and bleomycin resistant gene.
  • the reporter gene is introduced to confirm the expression site in the plant, and, for example, luciferase gene, GUS ( ⁇ glucuronidase) gene, GFP (green fluorescent protein), RFP (red fluorescent protein) Etc.
  • the gene encoding the above-mentioned cis-prenyltransferase (CPT) family protein and the gene encoding the Nogo-B receptor (NgBR) family protein are not particularly limited in their origin, and they may be of animal origin, even if they are microorganisms. Also, it may be derived from a plant, but is preferably derived from a plant, more preferably from the above-mentioned plant, and at least selected from the group consisting of the genera Hevea, Sonchus, Taraxacum, and Parthenium. More preferably, they are derived from plants belonging to one genus.
  • the gene encoding the above-mentioned cis-prenyltransferase (CPT) family protein and the gene encoding the Nogo-B receptor (NgBR) family protein are derived from the same species.
  • CPT cis-prenyltransferase
  • NgBR Nogo-B receptor
  • a nucleotide sequence of a promoter having a promoter activity that specifically expresses a gene in breast duct and a nucleotide sequence of a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein, or cis
  • NgBR Nogo-B receptor
  • it may further comprise a nucleotide sequence of a gene encoding another protein .
  • genes encoding the other proteins include the same as those described above in the first aspect of the present invention.
  • the promoter having a promoter activity for expressing a gene specifically in the mammary duct is a promoter of a gene encoding Rubber Elongation Factor (REF), a promoter of a gene encoding Small Rubber Particle Protein (SRPP), Hevein 2.1 (HEV2)
  • REF Rubber Elongation Factor
  • SRPP Small Rubber Particle Protein
  • HEV2 Hevein 2.1
  • it is at least one selected from the group consisting of the promoter of the gene encoding .1) and the promoter of the gene encoding MYC1 transcription factor (MYC1).
  • Rubber Elongation Factor refers to a rubber particle-binding protein that binds to rubber particles present in the latex of rubber-producing plants such as Hevea brasiliensis, and the rubber particles are stabilized.
  • Contribute to Small Rubber Particle Protein is a rubber particle binding protein which binds to rubber particles present in the latex of rubber producing plants such as Hevea brasiliensis.
  • Hevein 2.1 (HEV 2.1) is a protein that is abundantly expressed in the ductal cells of rubber-producing plants such as Hevea brasiliensis, and is involved in the aggregation of rubber particles and has antifungal activity It is.
  • MYC1 transcription factor is a transcription factor involved in the jasmonic acid signal which is frequently expressed in the latex of rubber-producing plants such as Hevea brasiliensis.
  • transcription factor transcription factor means a protein having an activity to increase or decrease (preferably, increase) the transcription amount of a gene. That is, in the present specification, MYC1 is a protein having an activity (transcription factor activity) to increase or decrease (preferably increase) the transcription amount of a gene encoding at least one protein of proteins involved in jasmonate signal. It is.
  • the promoter of the gene encoding REF is not particularly limited, but is preferably derived from the above-mentioned plant, and is at least one selected from the group consisting of Hevea, Sonchus, Taraxacum, and Parthenium. More preferably, they are derived from plants belonging to the genus of Among them, it is more preferable that it is derived from at least one kind of plant selected from the group consisting of Hevea brasiliensis, Nogeshi, guayule and russian dander, and it is more preferably that it is derived from Hevea brasiliensis.
  • the promoter of the gene encoding REF is preferably a DNA represented by any of the following [A1] to [A3].
  • hybridize as used herein is the same as described above.
  • stringent conditions are also the same as described above.
  • the base sequence of the promoter may also have promoter activity if it has a certain degree of sequence identity with the original base sequence. It is known that there is.
  • the sequence identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 for maintaining promoter activity is at least 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more Still more preferably, it is 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the promoter of the above-mentioned SRPP-encoding gene is not particularly limited in its origin, but is preferably from the above-mentioned plant, and is at least one selected from the group consisting of Hevea, Sonchus, Taraxacum, and Parthenium. More preferably, they are derived from plants belonging to the genus of Among them, it is more preferable that it is derived from at least one kind of plant selected from the group consisting of Hevea brasiliensis, Nogeshi, guayule and russian dander, and it is more preferably that it is derived from Hevea brasiliensis.
  • the promoter of the gene encoding SRPP is preferably a DNA represented by any of the following [B1] to [B3].
  • B3 A DNA consisting of a nucleotide sequence having a sequence identity of 60% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, and having a promoter activity for expressing a gene specifically in the milk duct
  • hybridize as used herein is the same as described above.
  • stringent conditions are also the same as described above.
  • the base sequence of the promoter may also have promoter activity if it has a certain degree of sequence identity with the original base sequence. It is known that there is.
  • the sequence identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 for maintaining promoter activity is at least 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more Still more preferably, it is 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the promoter of the gene encoding HEV2.1 is not particularly limited in its origin, but is preferably derived from the above-mentioned plant, and is at least selected from the group consisting of Hevea, Sonchus, Taraxacum, and Parthenium. More preferably, they are derived from plants belonging to one genus. Among them, it is more preferable that it is derived from at least one kind of plant selected from the group consisting of Hevea brasiliensis, Nogeshi, guayule and russian dander, and it is more preferably that it is derived from Hevea brasiliensis.
  • the promoter of the gene encoding HEV2.1 is preferably a DNA represented by any one of the following [C1] to [C3].
  • [C3] A DNA consisting of a nucleotide sequence having a sequence identity of 60% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 and having a promoter activity to express a gene specifically in the milk duct
  • hybridize as used herein is the same as described above.
  • stringent conditions are also the same as described above.
  • the base sequence of the promoter may also have promoter activity if it has a certain degree of sequence identity with the original base sequence. It is known that there is.
  • the sequence identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 for maintaining the promoter activity is at least 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more Still more preferably, it is 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the promoter of the gene encoding MYC1 is not particularly limited in its origin, but is preferably derived from the above-mentioned plant, and is at least one selected from the group consisting of Hevea, Sonchus, Taraxacum, and Parthenium. More preferably, they are derived from plants belonging to the genus of Among them, it is more preferable that it is derived from at least one kind of plant selected from the group consisting of Hevea brasiliensis, Nogeshi, guayule and russian dander, and it is more preferably that it is derived from Hevea brasiliensis.
  • the promoter of the gene encoding MYC1 is preferably a DNA represented by any of the following [D1] to [D3].
  • [D3] A DNA consisting of a nucleotide sequence having a sequence identity of 60% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12, and having a promoter activity for expressing a gene specifically in breast ducts
  • hybridize as used herein is the same as described above.
  • stringent conditions are also the same as described above.
  • the base sequence of the promoter may also have promoter activity if it has a certain degree of sequence identity with the original base sequence. It is known that there is.
  • the sequence identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 for maintaining promoter activity is at least 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more Still more preferably, it is 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the DNA that hybridizes with the above-mentioned DNA under stringent conditions or the DNA having a sequence identity of 60% or more with the above-mentioned DNA is a DNA having a promoter activity that causes a gene to be expressed specifically in the milk duct
  • Examples of the method of confirmation include a method of confirmation by a reporter assay using, as a reporter gene, ⁇ -galactosidase, luciferase, GFP (Green Fluorescent Protein) or the like, which is a conventionally known method.
  • a conventionally known method can be used as a method of identifying the base sequence of the above-mentioned promoter. For example, genomic DNA is extracted from a growing plant by CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) method. Next, a primer specific to the known base sequence of the promoter and a random primer are designed, and the extracted genomic DNA is used as a template to perform TAIL (Thermal Asymmetric Interlaced) -PCR method, and the gene containing the promoter And identify the nucleotide sequence.
  • CTAB Chip Trimethyl Ammonium Bromide
  • Second vector of the present invention in a promoter having promoter activity that specifically expresses a gene in the mammary duct, a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein or a cis-prenyltransferase (CPT) family protein
  • NgBR Nogo-B receptor
  • CPT cis-prenyltransferase
  • a predetermined protein involved in polyisoprenoid biosynthesis is specifically expressed in the mammary duct, whereby the predetermined protein of the second present invention is newly contained in the plant body into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the functions such as enzyme activity can be enhanced in the intraductal duct to enhance a part of the biosynthetic pathway of polyisoprenoid, and as a result, the production amount of cis-type isoprenoid and polyisoprenoid in plants can be improved.
  • the present inventors have found for the first time that in vitro binding of CPT family protein and NgBR family protein to rubber particles activates rubber synthesis of the rubber particles. From this, it is predicted that co-expression of CPT family protein and NgBR family protein in a plant body enhances rubber synthesis activity. Therefore, it can be expected that the production amount of polyisoprenoid can be further increased by producing polyisoprenoid using a transformed plant co-expressed with CPT family protein and NgBR family protein.
  • a vector comprising a nucleotide sequence in which a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein is functionally linked to a promoter having a promoter activity that specifically expresses a gene in the above-mentioned transformed plant is expressed.
  • NgBR Nogo-B receptor
  • a nucleotide sequence in which a gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein is functionally linked to a promoter having a promoter activity that specifically expresses a gene in the mammary duct It is preferable to use in combination a vector containing
  • a promoter encoding a gene specific to the mammary duct and a gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein and a gene encoding a Nogo-B receptor (NgBR) family protein are functionally added
  • a Nogo-B receptor (NgBR) family protein is encoded as a transformed plant obtained by introducing a vector containing a linked base sequence into a plant, and a promoter having a promoter activity that specifically expresses a gene in the breast duct Gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein,
  • the above-mentioned milk duct is a vector comprising a nucleotide sequence in which a gene encoding a cis-prenyltransferase (CPT) family protein is functionally linked to a promoter having promoter activity that specifically expresses a gene in the above breast duct.
  • CPT cis-prenyltransferase
  • CPT cis-prenyl transferase
  • Such a transformed plant can be produced by a conventionally known method.
  • the plant into which the vector of the second invention of the present invention is introduced to produce the above-mentioned transformed plants is not particularly limited.
  • CPT family proteins and NgBR family proteins are expressed in plants capable of biosynthesizing polyisoprenoids.
  • rubber-producing plants are preferable as the above-mentioned plant, since the improvement of the productivity of polyisoprenoid and the increase of the production amount of polyisoprenoid can be expected in particular.
  • at least one rubber-producing plant selected from the group consisting of Hevea brasiliensis, Nogeshi, Guayule and Russian dandelion is more preferable, and the Hevea brasiliensis is particularly preferable.
  • any method of introducing DNA into plant cells may be used.
  • methods using Agrobacterium JP-A-59-140885, JP-A-60-70080, WO 94/00977
  • electroporation JP-A-60
  • a method using a particle gun Gene gun
  • the vector of the second invention of the present invention may be introduced into the above-mentioned DNA, etc. to produce an organism, part of an organism, an organ, a tissue or a cultured cell such as a microorganism, yeast, animal cell or insect cell.
  • a tissue or a cultured cell such as a microorganism, yeast, animal cell or insect cell.
  • the above-mentioned transformed plant (transformed plant cell) can be obtained by the above method and the like.
  • the above-mentioned transformed plant is a concept including not only the transformed plant cell obtained by the above-mentioned method, but also all the progeny or clones thereof, and the progeny plants obtained by further passing them.
  • progeny or clones are obtained from the transformed plant cell by sexual reproduction, asexual reproduction, tissue culture, cell culture, cell fusion, etc. It is possible to get.
  • propagation materials eg, seeds, fruits, chopped ears, tubers, tuberous roots, strains, adventitious shoots, somatic embryos, calli, protoplasts, etc.
  • propagation materials eg, seeds, fruits, chopped ears, tubers, tuberous roots, strains, adventitious shoots, somatic embryos, calli, protoplasts, etc.
  • a method for regenerating a plant (transformed plant) from a transformed plant cell for example, the method of Toi et al. (Japanese Patent Application No. 11-127025) for Eucalyptus (Japanese Patent Application No. 11-127025), the method of Fujimura et al. , Plant Tissue Culture Lett., Vol. 2: p74-), the method of Shillito et al. (Shillito et al. (1989), Bio / Technology, vol. 7: p581-) for corn, the method of Visser et al. 1989), Theor. Appl. Genet., Vol.
  • expression of the target protein gene can be confirmed by using a known method.
  • the expression of the target protein may be analyzed by western blot.
  • the transformed plant is allowed to root in an appropriate medium, and the rooted body is transplanted to a pot containing a soil containing water.
  • the seeds are grown under appropriate cultivation conditions and finally formed into seeds to obtain the seeds.
  • a seed derived from a transformed plant obtained as described above is sowed on soil containing water and grown under appropriate cultivation conditions. You can get
  • a gene encoding a protein involved in polyisoprenoid biosynthesis included in the vector by introducing the vector of the second aspect of the present invention into a plant (particularly preferably a gene encoding a CPT family protein) And genes encoding NgBR family proteins) can be expressed specifically in the mammary duct, and the production amount of cis-type isoprenoid and polyisoprenoid in the plant can be improved.
  • the transformed plant cells obtained by the above-mentioned method, the callus obtained from the transformed plant cells, the cells redifferentiated from the callus, etc. are cultured in an appropriate medium, or A cis-type isoprenoid or polyisoprenoid can be produced by growing a differentiated transformed plant, a plant obtained from a seed obtained from the transformed plant, etc. under appropriate cultivation conditions.
  • a method of improving the amount of production of cis-isoprenoid in a plant by introducing the vector of the second present invention into a plant is also one of the second present invention.
  • a method of improving the production amount of polyisoprenoid in a plant by introducing the vector of the second present invention into a plant is also one of the second present invention.
  • a kneaded product is obtained by kneading a polyisoprenoid obtained from a transformed plant obtained by introducing the vector of the second present invention into a plant and an additive. It is a manufacturing method of a rubber product including a kneading step to be obtained, a raw rubber product forming step of molding a raw rubber product from the above-mentioned kneaded product, and a vulcanization step of vulcanizing the raw rubber product.
  • the rubber product is the same as that described above in the first invention.
  • the raw rubber product forming step corresponds to the vulcanization process which vulcanizes the above-mentioned green tire to the green tire formation process which molds a tire. That is, in the method for producing a pneumatic tire according to the second aspect of the present invention, a polyisoprenoid obtained from a transformed plant obtained by introducing the vector according to the second aspect of the present invention into a plant is kneaded with an additive.
  • It is a manufacturing method of a pneumatic tire including a kneading step of obtaining a kneaded material, a green tire molding step of molding a green tire from the kneaded material, and a vulcanization step of vulcanizing the green tire.
  • kneading process a polyisoprenoid obtained from a transformed plant obtained by introducing the vector of the second invention of the present invention into a plant and an additive are kneaded to obtain a kneaded product.
  • the polyisoprenoid obtained from the transformed plant obtained by introducing the vector of the second invention of the present invention into the plant is obtained by collecting latex from the above-mentioned transformed plant and subjecting the collected latex to the following solidification step.
  • the method for collecting latex from the above-mentioned transformed plant is not particularly limited, and a commonly used method can be adopted.
  • the emulsion that damages the stem of the plant and oozes out is collected (tapping), roots, etc.
  • a part of the transformed plant can be cut, and the emulsion exuding from the cut portion can be collected, or the cut tissue can be crushed and extracted and collected using an organic solvent.
  • the collected latex is subjected to a solidification step.
  • the method for solidifying is not particularly limited, and a method of adding the latex to a solvent which does not dissolve polyisoprenoid (natural rubber) such as ethanol, methanol and acetone, a method of adding an acid to the latex, and the like can be mentioned.
  • a solvent which does not dissolve polyisoprenoid natural rubber
  • a method of adding an acid to the latex, and the like can be mentioned.
  • rubber natural rubber
  • the obtained rubber may be dried before use, as necessary.
  • the additive is not particularly limited, and additives used for producing a rubber product can be used.
  • rubber components other than rubber obtained from the above latex carbon black, silica, calcium carbonate, alumina, clay, reinforcing filler such as talc, silane coupling agent, Examples thereof include zinc oxide, stearic acid, processing aids, various anti-aging agents, softeners such as oils, waxes, vulcanizing agents such as sulfur, and vulcanization accelerators.
  • Kneading in the kneading step may be performed using a rubber kneading apparatus such as an open roll, a Banbury mixer, or a closed-type kneader.
  • a rubber kneading apparatus such as an open roll, a Banbury mixer, or a closed-type kneader.
  • the raw rubber product forming step is the same as the step described above in the first invention.
  • the vulcanization process is the same as the process described above in the first invention.
  • RNA was extracted from Hevea brasiliensis latex by the hot phenol method.
  • 6 mL of a 100 mM sodium acetate buffer solution and 1 mL of a 10% SDS solution were added, and further 12 mL of water-saturated phenol preheated at 65 ° C. was added. After incubating for 5 minutes at 65 ° C., the mixture was vortexed and centrifuged at 7,000 rpm for 10 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was transferred to a new tube, and 12 mL of a phenol: chloroform (1: 1) solution was added and shaken for 2 minutes.
  • CPT and NgBR Genes from cDNA were obtained using the prepared 1st strand cDNA as a template. PCR was carried out using KOD-plus-Neo (manufactured by TOYOBO) according to the instruction. PCR was performed for 35 cycles, 10 seconds at 98 ° C., 30 seconds at 58 ° C., and 1 minute at 68 ° C.
  • the CPT gene (HRT1) and the NgBR gene (HRTBP) were obtained.
  • the sequences of the resulting genes were identified, and the full-length nucleotide and amino acid sequences were identified.
  • the nucleotide sequence of HRT1 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of HRT1 is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence of HRTBP is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of HRTBP is shown in SEQ ID NO: 4.
  • E. coli DH5 ⁇ is transformed using the vector prepared above, the transformant is cultured on LB agar medium containing ampicillin and X-gal, and E. coli into which the target gene has been introduced is selected by blue / white screening method.
  • E. coli transformed with the plasmid containing the target gene was cultured overnight at 37 ° C. on LB liquid medium, and then the cells were recovered to recover the plasmid.
  • the plasmid was recovered using Fast Gene plasmid mini kit (manufactured by Japan Genetics). Sequence analysis confirmed that there was no mutation in the base sequence of the gene inserted into the recovered plasmid.
  • E. coli DH5 ⁇ was transformed using the vector prepared above, and the transformant was cultured on LB agar medium containing ampicillin and X-gal, and E. coli into which the target gene had been introduced was selected by colony PCR.
  • E. coli transformed with the plasmid containing the target gene was cultured overnight at 37 ° C. on LB liquid medium, and then the cells were recovered to recover the plasmid.
  • the plasmid was recovered using Fast Gene plasmid mini kit (manufactured by Japan Genetics).
  • Rubber particles were prepared from Hevea latex by five steps of centrifugation. To 900 mL of Hevea latex, 100 mL of 1 M Tris buffer (pH 7.5) containing 20 mM dithiothreitol (DTT) was added to prepare a latex solution. The resulting latex solution was stepwise centrifuged at different centrifugation speeds of 1000 ⁇ g, 2000 ⁇ g, 8000 ⁇ g, 20000 ⁇ g, 50000 ⁇ g. All centrifugations were performed at 4 ° C. for 45 minutes.
  • Tris buffer pH 7.5
  • DTT dithiothreitol
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • STEP1 mRNA transcription reaction Cell-free protein synthesis reaction was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • WEPRO7240H Expression kit manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • the rubber synthesis activity of the recovered rubber particles after reaction was measured by the following method. First, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM DTT, 5 mM MgCl 2 , 15 ⁇ M farnesyl diphosphate (FPP), 100 ⁇ M 1-14 C isopentenyl diphosphate ([1-14 C] IPP) (specific activity: 5 Ci) / Mol), a reaction solution (Total 100 ⁇ L) in which 10 ⁇ L of rubber particle solution was mixed was prepared, and reacted at 30 ° C. for 16 hours.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • STEP1 mRNA transcription reaction Cell-free protein synthesis reaction was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • WEPRO7240H Expression kit manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • Example 2 Cell-free protein synthesis was carried out in the same manner as in Example 1 except that pEU-C1-HRTBP obtained in [Preparation of a cell-free protein synthesis method] in Example 1 was used as a template, and after recovery reaction The rubber synthesis activity of the rubber particles was measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 1.
  • Example 2 [Synthesis of lettuce (Lactuca sativa) CPT and NgBR gene] Based on the information published in BLAST, lettuce (Lactuca sativa) CPT gene (LsCPT3) and NgBR gene (LsCPTL2), the gene synthesis service of Genscript Japan Co. Composed and created.
  • the Xho I site is added to the 5 'end of LsCPT3 and the Kpn I site is added to the 3' end, and the EcoRV is added to the 5 'end of LsCPTL2 for cloning into a vector for cell-free protein synthesis described later.
  • the Xho I site was added to the 3 'end of the site.
  • the CPT gene (LsCPT3) and the NgBR gene (LsCPTL2) were obtained by the method described above. The sequences of the resulting genes were identified, and the full-length nucleotide and amino acid sequences were identified.
  • the base sequence of LsCPT3 is shown in SEQ ID NO: 13.
  • the amino acid sequence of LsCPT3 is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the nucleotide sequence of LsCPTL2 is shown in SEQ ID NO: 15.
  • the amino acid sequence of LsCPTL2 is shown in SEQ ID NO: 16.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • STEP1 mRNA transcription reaction Cell-free protein synthesis reaction was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • WEPRO7240H Expression kit manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • RNA extraction from Arabidopsis thaliana was extracted from Arabidopsis thaliana by the hot phenol method. After freezing the seedlings with liquid nitrogen and crushing in a mortar, water saturated phenol at 80 ° C, RNA extraction buffer at 80 ° C (100 mM LiCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1% SDS) respectively 400 ⁇ L of each was added and vortexed for 30 seconds. Further, 400 ⁇ L of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) was added and vortexed for 30 seconds.
  • the upper layer was collected by centrifugation at 15,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C.
  • 500 ⁇ L of 4 M LiCl was added and mixed, and allowed to stand at -80 ° C for 1 hour.
  • the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., and the precipitate obtained after removing the supernatant was dissolved in 400 ⁇ L of DEPC-treated water. 880 ⁇ L of ethanol and 40 ⁇ L of 3 M NaOAc were added and mixed.
  • the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., and the precipitate obtained after removing the supernatant was washed with 300 ⁇ L of 70% ethanol.
  • the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the precipitate obtained after removing the supernatant was dissolved in 30 ⁇ L of DEPC-treated water.
  • DNase treatment was performed.
  • DNase I TaKaRa
  • DNase I recombinant RNase-free (Roche) was used.
  • 50 ⁇ L of the reaction solution was prepared according to the conditions recommended by the manufacturer, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • CPT and NgBR Genes from cDNA were obtained using the prepared 1st strand cDNA as a template. PCR was carried out using KOD-plus-Neo (manufactured by TOYOBO) according to the instruction. PCR was carried out for 35 cycles with 10 seconds at 98 ° C., 15 seconds at 55-60 ° C., and 30 seconds at 68 ° C. as one cycle.
  • the CPT gene (AtCPT8) and the NgBR gene (AtLEW1) were obtained by the method described above.
  • the resulting gene was treated with restriction enzymes BamH I, and then inserted into pBluescript IISK (-) similarly treated with BamH I to prepare pBS-AtCPT8 and pBS-AtLEW1.
  • the sequences of each gene in the obtained plasmid were identified, and the full-length base sequence and amino acid sequence were identified.
  • the nucleotide sequence of AtCPT8 is shown in SEQ ID NO: 21.
  • the amino acid sequence of AtCPT8 is shown in SEQ ID NO: 22.
  • the nucleotide sequence of AtLEW1 is shown in SEQ ID NO: 23.
  • the amino acid sequence of AtLEW1 is shown in SEQ ID NO: 24.
  • the CPT and NgBR genes were obtained using the obtained pBS-AtCPT8 and pBS-AtLEW1 as a template. PCR was carried out using KOD-plus-Neo (manufactured by TOYOBO) according to the instruction. PCR was carried out for 35 cycles with 10 seconds at 98 ° C., 15 seconds at 55-60 ° C., and 30 seconds at 68 ° C. as one cycle. Acquisition of CPT gene as a primer Primer 23: 5'- tatcccggggatgaatacc-3 ' Primer 24: 5'- tgaactagtctaatcgagctttttc-3 ' It was used. Acquisition of NgBR gene is used as a primer Primer 25: 5'- acccgggatggattcg-3 ' Primer 26: 5'-cgcggactagtttaagttccatag-3 ' It was used.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • STEP1 mRNA transcription reaction Cell-free protein synthesis reaction was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • WEPRO7240H Expression kit manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • the rubber synthesis ability of the rubber particle can be remarkably enhanced as compared with the case where each of the CPT family protein and the NgBR family protein is individually bonded to the rubber particle.
  • the combination of CPT family protein and NgBR family protein is such that the rubber synthesis activity is suppressed as compared to Comparative Example 1 in which nothing is bonded.
  • the effect is a synergetic effect that combines each single effect, it is possible that the rubber synthesis ability of rubber particles can be significantly enhanced only by using a specific combination of CPT family protein and NgBR family protein. An effect is an effect that can not be predicted even by those skilled in the art.
  • the natural rubber synthesized in Examples 1 to 3 has a peak top at the same GPC elution time, and a natural rubber which can be said to be equivalent in molecular weight distribution pattern is synthesized. It can be said that In addition, since the result of FIG. 4 is not standardized among samples, it can not compare activity by the height of a peak.
  • Example 4 [Acquisition of REF gene from cDNA]
  • the REF gene was obtained using the 1st strand cDNA prepared in [Synthesis of cDNA from Total RNA] in Example 1 as a template.
  • PCR was carried out using KOD-plus-Neo (manufactured by TOYOBO) according to the instruction. PCR was performed for 35 cycles, 10 seconds at 98 ° C., 30 seconds at 58 ° C., and 1 minute at 68 ° C.
  • the REF gene was obtained by the method described above. The sequences of the resulting genes were identified, and the full-length nucleotide and amino acid sequences were identified.
  • the nucleotide sequence of REF is shown in SEQ ID NO: 27.
  • the amino acid sequence of REF is shown in SEQ ID NO: 28.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • Cell-free protein synthesis was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • Example 5 [Acquisition of CPT gene from cDNA]
  • the CPT gene was obtained using the 1st strand cDNA prepared in [Synthesis of cDNA from Total RNA] in Example 1 as a template.
  • PCR was carried out using KOD-plus-Neo (manufactured by TOYOBO) according to the instruction. PCR was performed for 35 cycles, 10 seconds at 98 ° C., 30 seconds at 58 ° C., and 1 minute at 68 ° C.
  • the CPT gene (HRT2) was obtained by the method described above. The sequences of the resulting genes were identified, and the full-length nucleotide and amino acid sequences were identified.
  • the nucleotide sequence of HRT2 is shown in SEQ ID NO: 31.
  • the amino acid sequence of HRT2 is shown in SEQ ID NO: 32.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • Cell-free protein synthesis was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • the vector pEU-His-N2-HRT2 obtained in the above [Preparation of a vector for cell-free protein synthesis method]
  • the vector pEU-C1-HRTBP obtained in [Preparation of a cell-free protein synthesis method of Example 1]
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • Example 6 [Acquisition of CPT gene from cDNA]
  • the CPT gene was obtained using the 1st strand cDNA prepared in [Synthesis of cDNA from Total RNA] in Example 1 as a template.
  • PCR was carried out using KOD-plus-Neo (manufactured by TOYOBO) according to the instruction. PCR was performed for 35 cycles, 10 seconds at 98 ° C., 30 seconds at 58 ° C., and 1 minute at 68 ° C. Acquisition of CPT gene as a primer Primer 13: 5'- atacccgggatggaaatatatac-3 ' Primer 14: 5'- actcccgggttattttaatattc-3 ' It was used.
  • CPT3 The CPT gene (CPT3) was obtained by the method described above. The sequences of the resulting genes were identified, and the full-length nucleotide and amino acid sequences were identified.
  • the nucleotide sequence of CPT3 is shown in SEQ ID NO: 35.
  • the amino acid sequence of CPT3 is shown in SEQ ID NO: 36.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • Cell-free protein synthesis was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • the vector pEU-His-N2-CPT3 obtained in the above [Preparation of a vector for cell-free protein synthesis method] the vector pEU-C1-HRTBP obtained in [Preparation of a cell-free protein synthesis method of Example 1]
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • Example 7 [Acquisition of CPT gene from cDNA]
  • the CPT gene was obtained using the 1st strand cDNA prepared in [Synthesis of cDNA from Total RNA] in Example 1 as a template.
  • PCR was carried out using KOD-plus-Neo (manufactured by TOYOBO) according to the instruction. PCR was performed for 35 cycles, 10 seconds at 98 ° C., 30 seconds at 58 ° C., and 1 minute at 68 ° C. Acquisition of CPT gene as a primer Primer 15: 5'- tatcccgggatggaaata-3 ' Primer 16: 5'- atacccgggttacaactgc-3 ' It was used.
  • the CPT gene (CPT5) was obtained by the method described above. The sequences of the resulting genes were identified, and the full-length nucleotide and amino acid sequences were identified.
  • the nucleotide sequence of CPT5 is shown in SEQ ID NO: 40.
  • the amino acid sequence of CPT5 is shown in SEQ ID NO: 41.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)] Cell-free protein synthesis was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • WEPRO7240H Expression kit manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.
  • the vector pEU-C1-HRTBP obtained in [Preparation of a cell-free protein synthesis method of Example 1]
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • Taraxacum brevicorniculatum CPT gene (TbCPT1) was created by synthesizing the region from the start codon to the stop codon based on the gene synthesis service of Genscript Japan Co., Ltd. The Xho I site was added to the 5 'end of TbCPT1 and the Kpn I site was added to the 3' end for cloning into a vector for cell-free protein synthesis described later.
  • TbCPT1 The CPT gene (TbCPT1) was obtained by the method described above. The sequences of the resulting genes were identified, and the full-length nucleotide and amino acid sequences were identified.
  • the nucleotide sequence of TbCPT1 is shown in SEQ ID NO: 42.
  • the amino acid sequence of TbCPT1 is shown in SEQ ID NO: 43.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • STEP1 mRNA transcription reaction Cell-free protein synthesis reaction was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • WEPRO7240H Expression kit manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • STEP1 mRNA transcription reaction Cell-free protein synthesis was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • WEPRO7240H Expression kit manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • STEP1 mRNA transcription reaction Cell-free protein synthesis reaction was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • WEPRO7240H Expression kit manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • STEP1 mRNA transcription reaction Cell-free protein synthesis reaction was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • WEPRO7240H Expression kit manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • the human (Homo sapiens) CPT gene was created by synthesizing the region from the start codon to the stop codon based on the gene synthesis service of Genscript Japan Ltd. based on the information published in BLAST .
  • the XmaI site was added to the 5 'end of the HDS and the SpeI site was added to the 3' end of the HDS for cloning into a vector for cell-free protein synthesis described later.
  • the CPT gene was obtained by the method described above. The sequences of the resulting genes were identified, and the full-length nucleotide and amino acid sequences were identified.
  • the nucleotide sequence of HDS is shown in SEQ ID NO: 64.
  • the amino acid sequence of HDS is shown in SEQ ID NO: 50.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • STEP1 mRNA transcription reaction Cell-free protein synthesis reaction was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • WEPRO7240H Expression kit manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • yeast (Saccharomyces cerevisiae) CPT gene was created by synthesizing the region from the start codon to the stop codon based on the gene synthesis service of Genscript Japan Ltd. based on the information disclosed in BLAST .
  • the XmaI site was added to the 5 'end of SRT1 and the SpeI site was added to the 3' end, for cloning into a vector for cell-free protein synthesis described later.
  • the CPT gene (SRT1) was obtained by the method described above. The sequences of the resulting genes were identified, and the full-length nucleotide and amino acid sequences were identified.
  • the nucleotide sequence of SRT1 is shown in SEQ ID NO: 63.
  • the amino acid sequence of SRT1 is shown in SEQ ID NO: 47.
  • Cell-free protein synthesis reaction (STEP1 mRNA transcription reaction)
  • STEP1 mRNA transcription reaction Cell-free protein synthesis reaction was performed using WEPRO7240H Expression kit (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).
  • WEPRO7240H Expression kit manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.
  • mRNA transcription reaction was performed according to the protocol of WEPRO7240H Expression kit.
  • Primer 17 5'- ttaggatccatggatattacaacgg-3 '
  • Primer 18 5'- aacggatccttttaagtatctctatg-3 ' It was used.
  • Example 3 the pBS-AtCPT8 obtained in Example 3 was treated with a restriction enzyme Bam HI to obtain an AtCPT8 gene in which the restriction enzymes at the 5 'end and the 3' end were Bam HI.
  • PCR is performed using pGEM-HRTBP and pBS-AtLEW1 obtained in Examples 1 and 3 as a template using the following primers, and they can be cloned into yeast expression vectors pGK415 and pGK425, respectively, at the 5 'end, 3'
  • An HRTBP was obtained in which both restriction enzymes were Xho I at the terminal side, an AtLEW1 gene in which the restriction enzyme at the 5 'end was Sal I, and the restriction enzyme at the 3' end was Bam HI.
  • PCR was carried out using KOD-plus-Neo (manufactured by TOYOBO) according to the instruction.
  • PCR was performed for 35 cycles, 10 seconds at 98 ° C., 30 seconds at 58 ° C., and 1 minute at 68 ° C.
  • Primer 19 5'- tttctcgagatggatttgaaacctggagctg-3 '
  • Primer 20 5'- tttctcgagtcatgtaccataatttt gctgcac-3 ' It was used.
  • Primer 21 5'- gtcgacatggattcgaatcaatcg-3 '
  • Primer 22 5'- ggatccttaagttccatagttttgg-3 ' It was used.
  • each pGEM-NgBR series obtained in the above [Construction of vector] is treated with restriction enzyme Xho I, and then inserted into the expression vector pGK425 for expression of yeast digested with Sal I, pGK425-HRTBP and pGK425-AtLEW1 Made.
  • E. coli DH5 ⁇ was transformed using the vector prepared above, and both were cultured in LB medium containing Amp.
  • the supernatant was removed by centrifugation, and the cells were suspended in Breakage Buffer, and then the cells were disrupted three times using a 0.5 mm glass bead and repeating a cycle of 30 seconds vortex 30 seconds on ice.
  • the supernatant was recovered by centrifugation at 300 ⁇ g for 5 minutes to remove unbroken cells.
  • the supernatant was separated into supernatant and pellet by centrifuging at 17400 ⁇ g.
  • the pellet was suspended in Breakage Buffer to obtain a crude enzyme solution of the insoluble fraction.
  • the compositions of Zymolyase buffer and Breakage Buffer are as follows.
  • Zymolyase buffer Tris-HCl (pH 7.5) 50 mM MgCl 2 10 mM Sorbitol 1M DTT 1x
  • Breakage Buffer Tris-HCl (pH 8.0) 100 mM NaCl 150 mM DTT 1 mM Protease Inhibitor Cocktail (Nacalai tesque) 1x
  • the reaction was stopped by adding 200 ⁇ L of saturated saline, and 1 mL of diethyl ether was added and vortexed. After centrifuging at 15000 rpm for 1 minute, the upper layer (ether layer) was collected in another tube.
  • the reaction product was extracted by adding 1 mL of water-saturated butanol to the aqueous layer and stirring, and then centrifuging at 15000 rpm for 1 minute to recover the upper layer (butanol layer).
  • reaction composition (Total 100 mL): Acetate buffer (pH 5.6) 40 mM Triton X-100 0.1% (v / v) Methanol 40% (v / v) Butanol layer (reaction product) 20% (v / v) Potato acid phosphatase (Roche) 10U
  • the reaction was stopped by adding 120 ⁇ L of 5 M NaOH, and the hydrolysis reaction was performed at 37 ° C. for 30 minutes. 0.7 mL of pentane was added and stirred to extract polyprenol into the pentane layer.
  • the upper layer (pentane layer) was recovered by centrifugation at 15000 rpm for 1 minute, and the product was developed using a reverse phase TLC plate (LKC-18, manufactured by Whatman).
  • the developing solvent was acetone / water (39: 1).
  • the present inventors predict the following mechanism. That is, it is thought that the degree of hydrophobicity and space (spatial breadth) at which the product synthesized by the CPT family protein is accumulated determines the chain length of the product synthesized.
  • the CPT family protein is hydrophobic to the CPT family protein even though the CPT family protein exhibits an activity that can not confirm the reaction product or exhibits the activity and can synthesize the product.
  • the chain length of the product extends only to a size that can be accommodated in the cleft structure.
  • the product synthesized by the CPT family protein is transferred from the hydrophobic cleft structure of the CPT family protein into the lipid bilayer membrane in the cell (eg, between endoplasmic reticulum membranes, etc.)
  • the product chain is accumulated because it is accumulated in the lipid bilayer membrane, and the environment is a hydrophobic environment, but is accumulated in a space not so wide as a space in the lipid bilayer membrane in cells.
  • There is a limit to the extension of the length this is considered to be an isoprene polymer having a chain length of about 90 carbons synthesized as described above).
  • the product synthesized by the CPT family protein is accumulated in a space not so wide as a space within a lipid bilayer membrane in cells, It is also believed that there is a limit to the chain length extension of the product being synthesized.
  • the product synthesized by the CPT family protein is accumulated in the rubber particle, and the environment is Because it is a hydrophobic environment and is much wider than in lipid bilayer membranes in cells, it is a hydrophobic environment and has less space constraints, so the product chain length is sufficiently extended It is possible to synthesize very long chain polyisoprenoid (natural rubber).
  • UDP pyrophosphate synthetase (Escherichia coli CPT) is an excerpt from position 7 to position 125 of undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from Escherichia coli shown by SEQ ID NO: 45.
  • UDP M. gluteus B-P 26 CPT
  • UDP is an excerpt from position 11 to position 129 of Undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from the genus Micrococcus, as shown in SEQ ID NO: 46.
  • SRT1 (Yeast CPT) is an excerpt from positions 57 to 175 of SRT1 derived from yeast shown in SEQ ID NO: 47.
  • AtCPT5 (Arabidopsis thaliana CPT5) is an excerpt from positions 61 to 179 of AtCPT5 derived from Arabidopsis thaliana shown by SEQ ID NO: 44.
  • AtCPT8 (Arabidopsis thaliana CPT8) is an excerpt from positions 25 to 142 of AtCPT8 derived from Arabidopsis thaliana shown by SEQ ID NO: 22.
  • DDPS Naturala sylvestris CPT
  • SEQ ID NO: 48 is an excerpt from positions 24 to 140 of tobacco-derived DDPS represented by SEQ ID NO: 48.
  • HbCPT1 (Hevea brasiliensis CPT) is an excerpt from positions 23 to 139 of HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2.
  • HbCPT2 (Hevea brasiliensis CPT) is an excerpt from positions 23 to 139 of HRT2 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 32.
  • HbCPT3 (Hevea brasiliensis CPT) is an excerpt from positions 23 to 139 of CPT3 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 36.
  • HbCPT4 (Hevea brasiliensis CPT) is an excerpt from positions 24 to 140 of CPT4 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 37.
  • HbCPT5 (Hevea brasiliensis CPT) is an excerpt from positions 23 to 139 of CPT5 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 41.
  • LsCPT3 (Lactuca sativa CPT) is an excerpt from positions 40 to 156 of LsCPT3 derived from lettuce represented by SEQ ID NO: 14.
  • TbCPT1 (Taraxacum brevicorniculatum CPT) is an excerpt from positions 40 to 154 of TbCPT1 derived from Taraxacum brevicorniculatum represented by SEQ ID NO: 43.
  • DDPS (Mouse CPT) is an excerpt from positions 16 to 132 of mouse-derived DDPS represented by SEQ ID NO: 49.
  • HDS Human CPT is an excerpt from positions 16 to 132 of human-derived HDS represented by SEQ ID NO: 50.
  • box B (parasitisum tree-derived HRT1 shown in SEQ ID NO: 2) (Corresponding to positions 81 to 97) is part of CPT family proteins from various organisms and is part of a highly conserved conserved region, particularly corresponding to position 41 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 2 Position is conserved asparagine residue ((1) in FIG. 5), and a position corresponding to position 42 in Hevea gram-derived HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 is a glycine residue (as shown in FIG.
  • the conserved region of box A corresponding to positions 41 to 49 in Hevea brasiliensis HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 corresponds to the position 25 to 33 in the undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from E. coli shown in SEQ ID NO: 45 Equivalent to a rank, It corresponds to positions 29 to 37 in the undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from Micrococcus sp.
  • UPPS undecaprenyl phosphate synthetase
  • AtCPT5 derived from Arabidopsis thaliana shown in SEQ ID NO: 44 corresponds to positions 79 to 87
  • AtCPT8 derived from Arabidopsis thaliana shown in SEQ ID NO: 22 corresponds to positions 43 to 51, 42 to 50 in tobacco-derived DDPS represented by SEQ ID NO: 48
  • HRT2 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 32 corresponds to positions 41 to 49
  • In CPT3 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 36 this corresponds to positions 41 to 49
  • In CPT4 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 37 this corresponds to positions 42 to 50
  • In CPT5 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 41 this corresponds to positions 41 to 49
  • LsCPT3 derived from Arabidopsis thaliana shown in SEQ ID NO: 44 corresponds to positions 79 to 87
  • the conserved region in box B corresponding to the 81st to 97th positions in HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2 corresponds to the 65th to 81st positions in undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from E.
  • UPPS undecaprenyl phosphate synthetase
  • the aspartic acid residue (1) corresponding to position 41 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 2 is the aspartic acid in position 25 in the undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from Escherichia coli shown in SEQ ID NO: 45 Corresponds to the residue, In undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from Micrococcus sp.
  • UPPS undecaprenyl phosphate synthetase
  • SEQ ID NO: 46 this corresponds to the aspartate residue at position 29; It corresponds to the aspartic acid residue at position 75 in yeast-derived SRT1 represented by SEQ ID NO: 47, AtCPT5 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 44 corresponds to the aspartic acid residue at position 79, AtCPT8 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 22 corresponds to an aspartic acid residue at position 43, It corresponds to an aspartic acid residue at position 42 in tobacco-derived DDPS represented by SEQ ID NO: 48, HRT2 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 32 corresponds to the aspartic acid residue at position 41, In CPT3 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 36, this corresponds to the aspartic acid residue at position 41, In CPT4 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 37
  • a glycine residue (2) corresponding to position 42 in Hevea gram-derived HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 is a glycine residue at position 26 in the undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from E. coli shown in SEQ ID NO: 45 Equivalent to In undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from Micrococcus sp.
  • UPPS undecaprenyl phosphate synthetase
  • SEQ ID NO: 46 corresponds to a glycine residue at position 30; Corresponds to a glycine residue at position 76 in yeast-derived SRT1 represented by SEQ ID NO: 47, AtCPT5 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 44 corresponds to a glycine residue at position 80, AtCPT8 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 22 corresponds to a glycine residue at position 44, It corresponds to a glycine residue at position 43 in tobacco-derived DDPS represented by SEQ ID NO: 48, HRT2 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 32 corresponds to a glycine residue at position 42, In CPT3 derived from Hevea brasiliensis shown in SEQ ID NO: 36, this corresponds to a glycine residue at position 42, CPT4 derived from Hevea brasiliensis as shown in
  • An arginine residue (3) corresponding to position 45 in Hevea brasiliensis HRT1 shown in SEQ ID NO: 2 is an arginine residue at position 29 in the undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from E. coli shown in SEQ ID NO: 45 Equivalent to In undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from Micrococcus sp.
  • UPPS undecaprenyl phosphate synthetase
  • SEQ ID NO: 46 this corresponds to an arginine residue at position 33, which corresponds to an arginine residue at position 79 in yeast-derived SRT1 represented by SEQ ID NO: 47, AtCPT5 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 44 corresponds to an arginine residue at position 83, AtCPT8 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 22 corresponds to an arginine residue at position 47, It corresponds to an arginine residue at position 46 in tobacco-derived DDPS represented by SEQ ID NO: 48, HRT2 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 32 corresponds to an arginine residue at position 45, In CPT3 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 36, this corresponds to an arginine residue at position 45, In CPT4 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO:
  • the asparagine residue (4) corresponding to position 89 in Hevea gram-derived HRT1 represented by SEQ ID NO: 2 is the asparagine residue at position 73 in the undecaprenyl phosphate synthetase (UPPS) derived from Escherichia coli shown in SEQ ID NO: 45 Equivalent to In undecaprenyl diphosphate synthetase (UPS) derived from Micrococcus sp.
  • UPPS undecaprenyl phosphate synthetase
  • SEQ ID NO: 46 this corresponds to the asparagine residue at position 77
  • the yeast-derived SRT1 represented by SEQ ID NO: 47 corresponds to an asparagine residue at position 123
  • AtCPT5 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 44 corresponds to an asparagine residue at position 127
  • AtCPT8 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 22 corresponds to an asparagine residue at position 92
  • HRT2 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 32 corresponds to the asparagine residue at position 89
  • In CPT3 derived from Hevea brasiliensis as shown in SEQ ID NO: 36 this corresponds to the asparagine residue at position 89
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of the gene encoding HRT1 derived from Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of HRT1 derived from Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 3: Nucleotide sequence of the gene encoding HRTBP derived from Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 4: HRTBP derived from Hevea brasiliensis Amino acid sequence SEQ ID NO: 5: primer 1 Sequence number 6: Primer 2 Sequence number 7: Primer 3 Sequence number 8: Primer 4 SEQ ID NO: 9: Base sequence of promoter of gene encoding Rubber Elongation Factor from Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 10: Base sequence of promoter of gene encoding Small Rubber Particle Protein from Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 11: Code Hevien 2.1 from Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 12 of the promoter of the
  • SEQ ID NO: 46 Undecaprenyl diphosphate from Micrococcus Amino acid sequence of acid synthase (UPS) SEQ ID NO: 47: Amino acid sequence of yeast-derived SRT1 SEQ ID NO: 48: amino acid sequence of tobacco-derived DDPS SEQ ID NO: 49: Amino acid sequence of mouse-derived DDPS SEQ ID NO: 50: Amino acid sequence of human-derived HDS SEQ ID NO: 51: Amino acid sequence from position 41 to 49 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 52: position 81 in HRT1 derived from Hevea brasiliensis SEQ ID NO: 53: Primer 17 SEQ ID NO: 54: Primer 18 SEQ ID NO: 55: Primer 19 SEQ ID NO: 56: Primer 20 SEQ ID NO: 57: Primer 21 SEQ ID NO: 58: Primer 22 SEQ ID NO: 59: Primer 23 SEQ ID NO: 60: Primer 24 SEQ ID NO:

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Abstract

本発明は、ゴム粒子のゴム合成活性を増強させ、天然ゴムの増産を可能にする、ポリイソプレノイドの製造方法を提供する。 本発明は、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を利用し、これら遺伝子がコードする蛋白質を結合させたゴム粒子を利用した生体外でのポリイソプレノイドの製造方法、または乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子を結合させたベクターを植物に導入し、乳管特異的にこれらの遺伝子がコードする蛋白質を発現させることによるポリイソプレノイドの製造方法である。

Description

ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
本発明は、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法、及びゴム製品の製造方法に関する。
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ　ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０～３０年に限られる。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。そのため、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源やパラゴムノキにおける天然ゴムの生産効率の改善が望まれている。
天然ゴムは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を基本単位とし、シス－１，４－ポリイソプレン構造をとっており、天然ゴムの生合成にはその構造からシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）が関係していると考えられている。例えば、パラゴムノキでは複数のＣＰＴの存在が確認されており、Ｈｅｖｅａ　Ｒｕｂｂｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１（ＨＲＴ１）、Ｈｅｖｅａ　Ｒｕｂｂｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　２（ＨＲＴ２）などが知られている（例えば、非特許文献１、２参照。）。また、タンポポの一種であるゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ）ではＣＰＴの発現量を抑えることにより、ゴムの合成量が低下することが知られている（例えば、非特許文献３参照。）。
また、これまでに天然ゴムの生合成に関わるタンパク質の研究として、Ｒｕｂｂｅｒ　Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）、Ｓｍａｌｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）が注目されてきた（例えば、非特許文献４、５参照。）。しかしながら、これらのタンパク質とＣＰＴとの関係は解明されていない。
他方、ヒトＣＰＴにおけるドリコール生合成において、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）が関与していることが示唆されている（例えば、非特許文献６参照。）。
他方、近年の遺伝子工学の発展に伴い、天然の植物体に所望の外来遺伝子を導入することによって形質の改変を図ることが可能となってきている。例えば、特許文献１では、パラゴムノキのプレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を植物に導入して形質転換することで、ゴムの生産性の向上が期待できるとしている。
ただし、植物体への外来遺伝子の導入として、乳管以外の部位で遺伝子発現が促されると、植物体の代謝や乳液の生産に負荷をかけ、悪影響を及ぼす可能性がある。そのため、乳管で特異的に遺伝子発現を促すプロモーターの探索が行われている（例えば、特許文献２、非特許文献７及び８参照）。
特許第５０３５８７１号公報 特開２０１０－１１９３７３号公報
Ｒａｈａｍａｎ他、ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１３年、第１４巻 Ａｓａｗａｔｒｅｒａｔａｎａｋｕｌ他、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第２７０巻、４６７１～４６８０ページ Ｐｏｓｔ他、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１２年、第１５８巻、１４０６～１４１７ページ Ｈｉｌｌｅｂｒａｎｄ他、ＰＬｏＳ　ＯＮＥ、２０１２年、第７巻 Ｐｒｉｙａ他、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、２００７年、第２６巻、１８３３～１８３８ページ Ｋ.Ｄ.Ｈａｒｒｉｓｏｎ他、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１１年、第３０巻、２４９０～２５００ページ Ｐ．Ｐｒｉｙａ他、Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、第１７１巻、４７０～４８０ページ Ｓａｎｄｅｅｐ　Ｋｕｍａｒ　Ｔａｔａ他、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｃｒｏｐｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、２０１２年、第４０巻、２１９～２２４ページ
上述のように、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源の開発やパラゴムノキにおける天然ゴムの生産効率の改善が望まれており、また、天然ゴムの生産量を向上させることを目的として、遺伝子組換え技術の開発が検討されているが、現状、天然ゴムの生合成機構、特にその調節機構には未解明の部分が多く、天然ゴムの大幅な増産のためにはまだまだ多くの工夫の余地がある。そのような中で、上記課題を解決するための一つのアプローチとして、天然ゴムの生合成においてＣＰＴの活性の安定化及び増強を図ることにより天然ゴムの増産を目指す方法が考えられる。
本発明は、前記課題を解決し、生体外で、ゴム粒子のゴム合成活性を増強させ、天然ゴムの増産を可能にする、ポリイソプレノイドの製造方法を提供することを目的とする。
本発明はまた、前記課題を解決し、遺伝子組換え技術により植物体に導入することでポリイソプレノイドの生産量を向上させることができるベクターを提供することを目的とする。また、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、該植物におけるシス型イソプレノイド、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法を提供することも目的とする。
本発明は、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含むポリイソプレノイドの製造方法に関する。以降、この発明を本発明の第１の発明とし、第１の本発明とも称する。
上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位、及びこれに相当する位置にアスパラギン酸残基を、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４２位、及びこれに相当する位置にグリシン残基を、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４５位、及びこれに相当する位置にアルギニン残基を、並びに、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８９位、及びこれに相当する位置にアスパラギン残基を、有するものであることが好ましい。
上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位から４９位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ａ）：
ＤＧＮＸ１ＲＸ２ＡＫＫ　　　（Ａ）
（上記アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１及びＸ２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）、又は、該アミノ酸配列（Ａ）と、Ｘ１及びＸ２を除く７アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列であることが好ましい。
上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８１位から９７位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ｂ）：
ＴＸ１１Ｘ１２ＡＦＳＸ１３Ｘ１４ＮＸ１５Ｘ１６ＲＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＥＶ　　　（Ｂ）
（上記アミノ酸配列（Ｂ）中、Ｘ１１～Ｘ１９は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）、又は、該アミノ酸配列（Ｂ）と、Ｘ１１～Ｘ１９を除く８アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列であることが好ましい。
上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種は、植物由来であることが好ましい。
上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種は、パラゴムノキ由来であることが好ましい。
上記結合工程は、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を結合させる工程であることが好ましい。
上記無細胞蛋白合成溶液は、胚芽抽出物を含むことが好ましい。
上記胚芽抽出物は、小麦由来であることが好ましい。
上記無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、５～５０ｇ／Ｌであることが好ましい。
第１の本発明はまた、上記第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。
第１の本発明はまた、上記第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。
本発明はまた、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結されたＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターに関する。以降、この発明を本発明の第２の発明とし、第２の本発明とも称する。
第２の本発明はまた、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーター、並びに、該プロモーターに機能的に連結されたシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターにも関する。
上記乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターは、Ｒｕｂｂｅｒ　Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｓｍａｌｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｈｅｖｅｉｎ２．１（ＨＥＶ２．１）をコードする遺伝子のプロモーター、及び、ＭＹＣ１　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＣ１）をコードする遺伝子のプロモーターからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
第２の本発明はまた、上記いずれかのベクターが導入された形質転換植物に関する。
第２の本発明はまた、上記いずれかのベクターを植物に導入することにより、該植物におけるシス型イソプレノイドの生産量を向上させる方法に関する。
第２の本発明はまた、上記いずれかのベクターを植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法に関する。
第２の本発明はまた、上記いずれかのベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。
第２の本発明はまた、上記いずれかのベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。
第１の本発明によれば、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含むポリイソプレノイドの製造方法であるので、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を結合させることで、ＣＰＴファミリー蛋白質の活性が安定化、増強されることが予想される。その結果、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させることができ、より効率的に反応槽（試験管、プラントなど）内でゴムを生産することが可能となる。
第１の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、ポリイソプレノイド製造時の製造効率が高い手法で得られたポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して空気入りタイヤを製造することができる。
第１の本発明のゴム製品の製造方法は、第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、ポリイソプレノイド製造時の製造効率が高い手法で得られたポリイソプレノイドからゴム製品を製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮してゴム製品を製造することができる。
第２の本発明のベクターは、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結されたＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターである。また、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーター、並びに、該プロモーターに機能的に連結されたシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターである。そして、該ベクターを植物に導入することにより、該ベクターに含まれる、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子が乳管特異的に発現し、当該植物におけるシス型イソプレノイド、ポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。
第２の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、第２の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、ポリイソプレノイド生産量の向上した形質転換植物から得られるポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して空気入りタイヤを製造することができる。
第２の本発明のゴム製品の製造方法は、第２の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、ポリイソプレノイド生産量の向上した形質転換植物から得られるポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮してゴム製品を製造することができる。
ＣＰＴ、及びＮｇＢＲがゴム粒子上でゴム合成を行っている様子を示す推測図である。 ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。 実施例において透析法を行っている様子を示す概略図である。 実施例１～３（図４の（ａ））、参考例１～４（図４の（ｂ））、参考例５～６（図４の（ｃ））において合成された超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布の測定結果を表すグラフである。 種々の生物由来のＣＰＴファミリー蛋白質のマルチプルシーケンスアライメントを行った様子を示す概略図である。
本明細書においては、第１の本発明と第２の本発明を合わせて本発明ともいう。まず、第１の本発明について説明し、続いて第２の本発明について説明する。
（第１の本発明）
第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法は、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含む。
本発明者らは、生体外で、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を結合させることで、ゴム粒子のゴム合成が活性化することを初めて見出した。なお、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質の組み合わせが直接的にゴム合成に関与していることは本発明者らが今回初めて見出したことである。ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質は、図１に示すようにゴム粒子上に配置され、ゴム合成を行っているものと推測される。図１には、一例として、ＣＰＴファミリー蛋白質としてＣＰＴが、ＮｇＢＲファミリー蛋白質としてＮｇＢＲが描かれており、基質のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）がＣＰＴにより重合され、ゴム粒子中に天然ゴムが合成される様子が模式的に示されている。
したがって、第１の本発明の製造方法のように、生体外で（例えば、反応槽（試験管、プラントなど）内で）、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を結合させることで、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させることができ、より効率的に反応槽（試験管、プラントなど）内でゴムを生産することができる。
なお、第１の本発明の製造方法は、上記結合工程を含む限りその他の工程を含んでいてもよく、また、各工程は１回行われてもよいし、複数回繰り返し行われてもよい。
また、第１の本発明において、ゴム粒子に結合するＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質の量は特に限定されない。
ここで、本明細書において、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質が結合するとは、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質の全部又は一部がゴム粒子中に取り込まれる又はゴム粒子の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、ゴム粒子表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、上述のようにゴム粒子に結合している蛋白質とＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質が複合体を形成し、複合体としてゴム粒子上に存在する場合もゴム粒子に結合しているとの概念範囲に含まれる。
上記ゴム粒子の由来は特に限定されず、例えば、パラゴムノキ、ロシアンタンポポ、グアユール、ノゲシ、インドゴムノキなどのゴム産生植物のラテックス由来であればよい。
また、上記ゴム粒子の粒子径も特に限定されず、所定の粒子径のものを分取して用いてもよいし、様々な粒子径のものが含まれた状態のものを使用してもよく、所定の粒子径のものを分取して用いる場合であっても、用いられるゴム粒子としては、粒子径の小さいＳｍａｌｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＳＲＰ）を用いてもよいし、粒子径の大きいＬａｒｇｅ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＲＰ）を用いてもよい。
上記所定の粒子径のゴム粒子を分取する方法としては、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、遠心分離処理、より好ましくは多段階の遠心分離処理、を行う方法などが挙げられる。具体的には、５００～１５００×ｇでの遠心分離処理、１７００～２５００×ｇでの遠心分離処理、７０００～９０００×ｇでの遠心分離処理、１５０００～２５０００×ｇでの遠心分離処理、４００００～６００００×ｇでの遠心分離処理を順に行う方法が挙げられる。なお、各遠心分離処理の処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。また、各遠心分離処理の処理温度としては、０～１０℃が好ましく、２～８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
上記結合工程においては、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質がゴム粒子に結合される。
上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、その由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。最も好ましくはいずれもパラゴムノキ由来であることである。また、上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及び、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の由来が同じ種であることも好適な形態の１つである。
上記植物としては、特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ　ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ　ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ　ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ　ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ　ｖｉｒｇａｕｒｅａ　ｓｕｂｓｐ．　ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ　ｖｉｒｇａｕｒｅａ　ｓｕｂｓｐ．　ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ　ｖｉｒｇａｕｒｅａ　ｓｕｂｓｐ．　ｌｅｉｐｃａｒｐａ　ｆ．　ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ　ｖｉｒｇａｕｒｅａ　ｓｕｂｓｐ．　ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ　ｇｉｇａｎｔｅａ　Ａｉｔ．　ｖａｒ．　ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ　Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｖｅｎｕｓｔｕｍ　Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ　Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ　Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ　Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ　ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ　ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ　ｐｕｍｉｌａ　Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ　ｅｒｅｃｔａ　Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ　ａｍｐｅｌａｓ　Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ　ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ　Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ　ｉｒｉｓａｎａ　Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ　ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ　Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ　ｓｅｐｔｉｃａ　Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ　ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ　ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ　ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ　ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ　ｓａｔｉｖａ）、ベンガルボダイジュ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）等が挙げられる。
なお、本明細書において、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、イソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素である。具体的には、例えば、植物では、図２に示すようなポリイソプレノイド生合成経路によってポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路のうち、ＣＰＴファミリー蛋白質は、図２中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素と考えられている。ＣＰＴファミリー蛋白質の特徴としては、Ｃｉｓ　ＩＰＰＳ　ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ｃｄ００４７５）に含まれるアミノ酸配列を有することである。
本明細書において、イソプレノイド化合物とは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を有する化合物を意味する。また、ｃｉｓ型イソプレノイドは、イソプレン単位がシス型に結合したイソプレノイド化合物を有する化合物であり、例えば、ｃｉｓ－ファルネシル二リン酸、ウンデカプレニル二リン酸、天然ゴムなどが挙げられる。
ここで、種々の生物由来のＣＰＴファミリー蛋白質のマルチプルシーケンスアライメントを行った様子を示す概略図を図５に示すが、Ｓｈｏｔａ　Ｅｎｄｏ　ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，Ｎｏ．１６２５（２００３）ｐ．２９１－２９５や、Ｍａｓａｈｉｒｏ　Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ　ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９８，Ｎｏ．８（２００１）ｐ．４３３７－４３４２等の文献から、図５中の囲みＡ（配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１においては、４１位から４９位に相当）、囲みＢ（配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１においては、８１位から９７位に相当）が種々の生物由来のＣＰＴファミリー蛋白質で保存性の高い保存領域の一部であり、保存領域とは、同様の配列（構造）を有する部位を意味し、蛋白質において同様の機能を有する部位であると推察される領域である。そして特に、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位に相当する位置はアスパラギン酸残基が保存され（図５中の（１））、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４２位に相当する位置はグリシン残基が保存され（図５中の（２））、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４５位に相当する位置はアルギニン残基が保存され（図５中の（３））、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８９位に相当する位置はアスパラギン残基が保存されており（図５中の（４））、これらのアミノ酸が、ＣＰＴファミリー蛋白質の酵素反応に必須のアミノ酸であり、当該位置にこれらのアミノ酸を有する蛋白質であればＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を有すると考えられる。
なお、上記マルチプルシーケンスアライメントは、後述の実施例の方法により実施できる。
すなわち、上記ＣＰＴファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位、及びこれに相当する位置にアスパラギン酸残基を、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４２位、及びこれに相当する位置にグリシン残基を、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４５位、及びこれに相当する位置にアルギニン残基を、並びに、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８９位、及びこれに相当する位置にアスパラギン残基を、有するものであることが好ましい。上述したように、上記ＣＰＴファミリー蛋白質がこのような配列を有していれば、ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を有すると考えられ、イソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素として機能することができ、ゴム粒子にＮｇＢＲファミリー蛋白質と共に結合させることで、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させることができ、ゴム粒子中に天然ゴムを合成することが可能となる。
上記ＣＰＴファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位から４９位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ａ）：
ＤＧＮＸ１ＲＸ２ＡＫＫ　　　（Ａ）
（上記アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１及びＸ２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）、又は、該アミノ酸配列（Ａ）と、Ｘ１及びＸ２を除く７アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列であることがより好ましい。更に好ましくは、上記アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１がＨ、ＧもしくはＲを表し、また、Ｘ２がＷ、Ｆ、もしくはＹを表すことである。
上記アミノ酸配列（Ａ）と、Ｘ１及びＸ２を除く７アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列は、Ｘ１及びＸ２を除く７アミノ酸残基のうちの６アミノ酸残基以上が同一であることがより好ましい。
また、上記ＣＰＴファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８１位から９７位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ｂ）：
ＴＸ１１Ｘ１２ＡＦＳＸ１３Ｘ１４ＮＸ１５Ｘ１６ＲＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＥＶ　　　（Ｂ）
（上記アミノ酸配列（Ｂ）中、Ｘ１１～Ｘ１９は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）、又は、該アミノ酸配列（Ｂ）と、Ｘ１１～Ｘ１９を除く８アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列であることがより好ましい。
更に好ましくは、上記アミノ酸配列（Ｂ）中、Ｘ１１がＬ、Ｖ、Ａ、もしくはＩを表し、また、Ｘ１２がＹ、Ｆ、もしくはＨを表し、また、Ｘ１３がＳ、Ｔ、Ｉ、Ｍ、もしくはＬを表し、また、Ｘ１４がＥ、Ｄ、もしくはＨを表し、また、Ｘ１５がＷもしくはＦを表し、また、Ｘ１６がＮ、Ｓ、Ｋ、Ｇ、もしくはＲを表し、また、Ｘ１７がＰ、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｒ、Ｋ、もしくはＱを表し、また、Ｘ１８がＡ、Ｋ、Ｓ、もしくはＰを表し、また、Ｘ１９がＱ、Ｄ、Ｒ、Ｉ、Ｅ、Ｈ、もしくはＳを表すことである。
上記アミノ酸配列（Ｂ）と、Ｘ１１～Ｘ１９を除く８アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列は、Ｘ１１～Ｘ１９を除く８アミノ酸残基のうちの６アミノ酸残基以上が同一であることがより好ましく、７アミノ酸残基以上が同一であることが更に好ましい。
更に、ＣＰＴファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位から４９位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位から４９位のアミノ酸配列（ＤＧＮＲＲＦＡＫＫ（配列番号５１））と、９アミノ酸残基のうちの６アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有することが特に好ましい。当該配列同一性としては、９アミノ酸残基のうちの７アミノ酸残基以上が同一であることがより好ましく、８アミノ酸残基以上が同一であることが更に好ましい。
更に、ＣＰＴファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８１位から９７位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８１位から９７位のアミノ酸配列（ＴＩＹＡＦＳＩＤＮＦＲＲＫＰＨＥＶ（配列番号５２））と、１７アミノ酸残基のうちの１４アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有することが特に好ましい。当該配列同一性としては、１７アミノ酸残基のうちの１５アミノ酸残基以上が同一であることがより好ましく、１６アミノ酸残基以上が同一であることが更に好ましい。
具体的には、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４１位から４９位に相当する保存領域は、例えば、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２５位から３３位に相当し、配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では２９位から３７位に相当し、配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７５位から８３位に相当し、配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では７９位から８７位に相当し、配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４３位から５１位に相当し、配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４２位から５０位に相当し、配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４１位から４９位に相当し、配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４１位から４９位に相当し、配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４２位から５０位に相当し、配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４１位から４９位に相当し、配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では５８位から６６位に相当し、配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では５８位から６６位に相当し、配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３４位から４２位に相当し、配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３４位から４２位に相当する。
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において８１位から９７位に相当する保存領域は、例えば、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では６５位から８１位に相当し、配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では６９位から８５位に相当し、配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では１１５位から１３１位に相当し、配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では１１９位から１３５位に相当し、配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では８４位から１００位に相当し、配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは８２位から９８位に相当し、配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では８１位から９７位に相当し、配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では８１位から９７位に相当し、配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では８２位から９８位に相当し、配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では８１位から９７位に相当し、配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では９８位から１１４位に相当し、配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では９８位から１１４位に相当し、配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは７４位から９０位に相当し、配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは７４位から９０位に相当する。
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４１位に相当するアスパラギン酸残基は、例えば、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２５位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では２９位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７５位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では７９位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４３位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４２位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４１位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４１位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４２位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４１位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では５８位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では５８位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３４位のアスパラギン酸残基に相当し、配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３４位のアスパラギン酸残基に相当する。
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４２位に相当するグリシン残基は、例えば、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２６位のグリシン残基に相当し、配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では３０位のグリシン残基に相当し、配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７６位のグリシン残基に相当し、配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では８０位のグリシン残基に相当し、配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４４位のグリシン残基に相当し、配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４３位のグリシン残基に相当し、配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４２位のグリシン残基に相当し、配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４２位のグリシン残基に相当し、配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４３位のグリシン残基に相当し、配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４２位のグリシン残基に相当し、配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では５９位のグリシン残基に相当し、配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では５９位のグリシン残基に相当し、配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３５位のグリシン残基に相当し、配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３５位のグリシン残基に相当する。
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４５位に相当するアルギニン残基は、例えば、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２９位のアルギニン残基に相当し、配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では３３位のアルギニン残基に相当し、配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７９位のアルギニン残基に相当し、配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では８３位のアルギニン残基に相当し、配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４７位のアルギニン残基に相当し、配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４６位のアルギニン残基に相当し、配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４５位のアルギニン残基に相当し、配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４５位のアルギニン残基に相当し、配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４６位のアルギニン残基に相当し、配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４５位のアルギニン残基に相当し、配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では６２位のアルギニン残基に相当し、配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では６２位のアルギニン残基に相当し、配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３８位のアルギニン残基に相当し、配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３８位のアルギニン残基に相当する。
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において８９位に相当するアスパラギン残基は、例えば、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では７３位のアスパラギン残基に相当し、配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では７７位のアスパラギン残基に相当し、配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では１２３位のアスパラギン残基に相当し、配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では１２７位のアスパラギン残基に相当し、配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では９２位のアスパラギン残基に相当し、配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは９０位のアスパラギン残基に相当し、配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では８９位のアスパラギン残基に相当し、配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では８９位のアスパラギン残基に相当し、配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では９０位のアスパラギン残基に相当し、配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では８９位のアスパラギン残基に相当し、配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では１０６位のアスパラギン残基に相当し、配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では１０６位のアスパラギン残基に相当し、配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは８２位のアスパラギン残基に相当し、配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは８２位のアスパラギン残基に相当する。
上記ＣＰＴファミリー蛋白質としては、パラゴムノキ由来のＣＰＴ（ＨＲＴ１、ＨＲＴ２、ＣＰＴ３～５）、シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ１～９、レタス由来のＣＰＴ１～３、Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＣＰＴ１～３、大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）、マイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）、酵母由来のＳＲＴ１、タバコ由来のＤＤＰＳ、マウス由来のＤＤＰＳ、ヒト由来のＨＤＳなどが挙げられる。
上記ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、ゴムを産生するゴム産生植物の他、ゴム産生植物以外の植物、動物、微生物等も有しており、これら由来のＣＰＴファミリー蛋白質は当然、自然状態ではゴム合成に関与していない。にもかかわらず、本発明においては、ＣＰＴファミリー蛋白質であれば、その由来、種類等に関わらず、ゴム粒子に結合させることで、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させることができ、ゴム粒子中に天然ゴムを合成することができる。そして更に、ＣＰＴファミリー蛋白質をＮｇＢＲファミリー蛋白質と共にゴム粒子に結合させることで、さらにゴム粒子のゴム合成能力を増強させることが可能となると考えられる。これは、ＣＰＴファミリー蛋白質とＮｇＢＲファミリー蛋白質の相互作用によるものと考えられる。
すなわち、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子がゴムを産生する植物由来であるか、それ以外の生物由来であるか、または、自然状態でゴム合成に関与しているかなどに関わらず、本発明においては、ＣＰＴファミリー蛋白質でありさえすれば、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させることができ、ゴム粒子中に天然ゴムを合成することができる。これは驚くべきことであるが、本発明者らは、ＣＰＴファミリー蛋白質の由来や種類よりも、どのような宿主に導入したのか、すなわち、ＣＰＴファミリー蛋白質をどのような環境下に発現させたのかが、ゴム合成活性においては重要である、と考えている。
上記点について、本発明者らは、次のようなメカニズムを予想している。
すなわち、ＣＰＴファミリー蛋白質が合成する生成物が蓄積される場の、疎水度及びスペース（空間的広さ）が、合成される生成物の鎖長を決定している、と考えている。
具体的には、大腸菌のような原核生物中では、ＣＰＴファミリー蛋白質は反応生成物を確認できない程度の活性しか示さないか、活性を示し生成物を合成できたとしても、ＣＰＴファミリー蛋白質の疎水性クレフト構造内に収容可能な程度の大きさまでしか生成物の鎖長は延びない。
また、酵母のような真核生物中では、ＣＰＴファミリー蛋白質が合成した生成物はＣＰＴファミリー蛋白質の疎水性クレフト構造から細胞中の脂質二重膜内（例えば、小胞体膜間など）へ移行し、脂質二重膜内に蓄積されることになり、当該環境は疎水性環境であるが、細胞中の脂質二重膜内というスペースとしてはあまり広くないところに蓄積されることから生成物の鎖長の伸長には限度がある。
シロイヌナズナのようなゴム産生植物でない植物中でも、酵母のときと同様に、ＣＰＴファミリー蛋白質が合成した生成物は、細胞中の脂質二重膜内というスペースとしてはあまり広くないところに蓄積され、やはり合成される生成物の鎖長の伸長には限度がある。
これに対して、ＣＰＴファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させた場合には、図１に示したように、ＣＰＴファミリー蛋白質が合成した生成物はゴム粒子中に蓄積されることになり、当該環境は疎水性環境であり、かつ、スペースとしても細胞中の脂質二重膜内よりもずっと広いことから、疎水性環境であり、かつ、スペースの制約も少ないため、生成物の鎖長は充分に延びることができ、超長鎖のポリイソプレノイド（天然ゴム）を合成できる。
この原理のため、本発明において用いるＣＰＴファミリー蛋白質はゴム粒子との親和性を上げるためＮ末端側に膜貫通領域を持っていることが望ましく、野生型として持っていない場合はＣＰＴファミリー蛋白質のＮ末端側に人工的に膜貫通領域を融合させても良い。融合させる膜貫通領域のアミノ酸配列は特に限定されないが、自然界で本来ゴム粒子に結合している蛋白質が持つ膜貫通領域のアミノ酸配列であることが望ましい。
また、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質は、Ｎ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側でＣＰＴファミリー蛋白質又は他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質であり、ＣＰＴファミリー蛋白質を膜上に保持することにより機能を補助する。上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の特徴としては、Ｎ末端側に膜貫通ドメインを有し、Ｃ末端側にＣｉｓ　ＩＰＰＳ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＣＯＧ００２０）に含まれるアミノ酸配列を有することである。
上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質としては、パラゴムノキ由来のＮｇＢＲ（ＨＲＴＢＰ）、シロイヌナズナ由来のＡｔＬＥＷ１、レタス由来のＬｓＣＰＴＬ１～２、タンポポ由来のＴｂＲＴＡなどが挙げられる。
上記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［１］が挙げられる。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［２］も挙げられる。
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
なお、上記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～５８個のアミノ酸、更に好ましくは１～４４個のアミノ酸、更により好ましくは１～２９個のアミノ酸、特に好ましくは１～１５個のアミノ酸、最も好ましくは１～６個のアミノ酸、より最も好ましくは１～３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［３］も挙げられる。
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
なお、上記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
上記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としてはまた、下記［１１］が挙げられる。
［１１］配列番号３２、３６、４１、２２、１４、４３、４７、又は５０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としてはまた、下記［１２］も挙げられる。
［１２］配列番号３２、３６、４１、２２、１４、４３、４７、又は５０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
なお、上記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号３２、３６、４１、２２、１４、４３、４７、又は５０で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
本明細書において、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０，　５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１８３，　６３　（１９９０）］を用いて決定することができる。
上記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の具体例としては、下記［４］が挙げられる。
［４］配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の具体例としては、下記［５］も挙げられる。
［５］配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質
なお、上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～５２個のアミノ酸、更に好ましくは１～３９個のアミノ酸、更により好ましくは１～２６個のアミノ酸、特に好ましくは１～１３個のアミノ酸、最も好ましくは１～６個のアミノ酸、より最も好ましくは１～３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
また、上述したように、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の具体例としては、下記［６］も挙げられる。
［６］配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質
なお、上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の具体例としてはまた、下記［１４］が挙げられる。
［１４］配列番号２４、又は１６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
また、上述したように、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の具体例としてはまた、下記［１５］も挙げられる。
［１５］配列番号２４、又は１６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質
なお、上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号２４、又は１６で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質であることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、アミノ酸配列を同定し、Ｃｉｓ　ＩＰＰＳ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＣＯＧ００２０）に含まれるアミノ酸配列を有しているかどうかを確認する方法が挙げられる。
上記ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードし、発現させてＣＰＴファミリー蛋白質を産出できるものであれば特に制限されないが、該遺伝子としては、具体的には、下記［１］又は［２］が挙げられる。
［１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍａｎｕａｌ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
上記ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子としてはまた、具体的には、下記［１１］又は［１２］が挙げられる。
［１１］配列番号３１、３５、４０、２１、１３、４２、６３、又は６４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［１２］配列番号３１、３５、４０、２１、１３、４２、６３、又は６４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。
上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号３１、３５、４０、２１、１３、４２、６３、又は６４で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子としては、具体的には、下記［３］又は［４］が挙げられる。
［３］配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［４］配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号３で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子としてはまた、具体的には、下記［１３］又は［１４］が挙げられる。
［１３］配列番号２３、又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［１４］配列番号２３、又は１５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。
上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号２３、又は１５で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、ＤＮＡをアミノ酸配列に翻訳した際に、Ｃｉｓ　ＩＰＰＳ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＣＯＧ００２０）に含まれるアミノ酸配列を有しているかどうかを確認する方法が挙げられる。
また、上記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ－ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、上記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、上記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
なお、上記結合工程においては、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質がゴム粒子に結合される限り、更にその他の蛋白質が結合されてもよい。
上記その他の蛋白質の由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
上記その他の蛋白質としては、何ら制限されずいかなる蛋白質であってもよいが、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させる観点からは、ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質であることが好ましい。なお、ゴム粒子上に存在する蛋白質は、大きくゴム粒子の膜表面に結合する蛋白質であってもよいし、ゴム粒子の膜に挿入されるように結合する蛋白質であってもよいし、上記膜に結合している蛋白質と複合体を形成して膜表面上に存在することになる蛋白質であってもよい。
上記ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質としては、例えば、Ｒｕｂｂｅｒ　Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）、Ｓｍａｌｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）、β－１，３－グルカナーゼ、Ｈｅｖｅｉｎなどが挙げられる。
上記結合工程は、生体外で、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を結合させることができればその手段は特に制限されず、例えば、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を結合させる方法などが挙げられる。
上記結合工程としては、中でも、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を結合させる工程であることが好ましい。
すなわち、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて（より具体的には、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを混合して）蛋白質合成を行うことで、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質の結合したゴム粒子を得ることが好ましい。
なお、リポソームはリン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロール等から構成される脂質二重膜として人工的に製造されるため、製造されたリポソームの表面には蛋白質は結合していないのに対して、ゴム産生植物のラテックスから採取されるゴム粒子も脂質膜で覆われた粒子であるが、その膜は天然由来の膜であるため、その表面には植物体内で合成された蛋白質が既に結合している。このことから、蛋白質が結合していないリポソームなどに比べて、既に蛋白質が結合しており、蛋白質で覆われた状態にあるゴム粒子に更に蛋白質を結合させるのは困難であることが予想される。また、ゴム粒子に既に結合している蛋白質が無細胞蛋白合成を阻害することも懸念される。以上のような点から、ゴム粒子共存下での無細胞蛋白合成は実現が困難であると考えられてきた。このような状況下、本発明者らは、これまでに試みられていなかった、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質の無細胞蛋白合成をゴム粒子の共存下で行ったところ、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質の結合したゴム粒子を製造することができることを見出した。
上記ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて行われる蛋白質合成は、いわゆる、無細胞蛋白合成法を用いたＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質の合成であり、生物学的機能を担持した（ｎａｔｉｖｅ状態の）ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を合成でき、当該無細胞蛋白合成法をゴム粒子の共存下で行うことにより、合成されるＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をｎａｔｉｖｅ状態でゴム粒子に結合することが可能となる。
ここで、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子との共存下、蛋白質合成を行うことで、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質が結合するとは、当該蛋白質合成により合成されたＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質の各蛋白質の全部又は一部がゴム粒子中に取り込まれる又はゴム粒子の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、ゴム粒子表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、上述のようにゴム粒子に結合している蛋白質と複合体を形成し、複合体としてゴム粒子上に存在する場合もゴム粒子に結合しているとの概念範囲に含まれる。
上記ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡはそれぞれ、翻訳されてＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を合成しうる翻訳鋳型である。
上記ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡの由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましく、上述した植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることが更に好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが特に好ましく、最も好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。また、上記ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、及び、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡの由来が同じ種であることも好適な形態の１つである。
上記ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡはそれぞれ、翻訳されてＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を合成しうる翻訳鋳型であればその調製方法は特に制限されないが、例えば、ゴム産生植物のラテックスからホットフェノール法などによりＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、得られたＴｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報を元に作製したプライマーを用いてＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片を取得して、該ＤＮＡ断片を元に通常行われるインビトロでの転写反応を行うことにより調製することができる。
上記無細胞蛋白合成溶液は、上記ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む限り、その他の蛋白質をコードするｍＲＮＡを含んでいてもよい。
上記その他の蛋白質をコードするｍＲＮＡとしては、翻訳されてその他の蛋白質を発現することができるものを用いることができる。なお、その他の蛋白質としては、上述したものと同様のものを挙げることができる。
第１の本発明における結合工程においては、ゴム粒子の共存下でＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質の無細胞蛋白合成が行われることが好ましいが、当該無細胞蛋白合成は、上記無細胞蛋白合成溶液を用いて、従来と同様の方法で行うことができる。用いられる無細胞蛋白合成系としては、通常用いられる無細胞蛋白質合成手段を採用することができる。例えば、Ｒａｐｉｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＲＴＳ５００（Ｒｏｓｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）やＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：５５９－５６４（２０００）、特開２０００－２３６８９６号公報、特開２００２－１２５６９３号公報、特開２００２－２０４６８９号公報に従って調製された小麦胚芽抽出液及びその無細胞蛋白質合成系（特開２００２－２０４６８９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４６５２－１４６５７（２００２））を使用することができる。中でも、胚芽抽出物を用いる系が好ましい。すなわち、上記無細胞蛋白合成溶液が、胚芽抽出物を含むこともまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。
上記胚芽抽出物の由来は特に限定されないが、翻訳効率の観点からは、植物の蛋白質を無細胞蛋白合成法で合成する場合には植物由来の胚芽抽出物を用いることが好ましい。特に好ましくは小麦由来の胚芽抽出物を用いることである。すなわち、上記胚芽抽出物が小麦由来であることもまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。
上記胚芽抽出物の調製方法としては特に制限されず、通常の胚芽抽出物調製方法を採用することができるが、例えば、特開２００５－２１８３５７号公報に記載された方法を採用すればよい。
上記無細胞蛋白合成溶液は、更にサイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体又はその塩（以降、単に「活性増強物質」とも称する。）を含むことが好ましい。該活性増強物質を含有することにより、蛋白質合成活性を更に増強させることができる。
上記サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体又はその塩としては、無細胞蛋白合成活性を増強しうるものであれば特に制限されず、例えば、アデノシン－３’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、アデノシン－３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、アデノシン－３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、グアノシン－３’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、グアノシン－３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、グアノシン－３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、８－ブロモアデノシン－３’，５’－サイクリック一リン酸（ブロモｃＡＭＰ）及びその塩、８－（４－クロロフェニルチオ）アデノシン－３’，５’－サイクリック一リン酸（クロロフェニルチオｃＡＭＰ）及びその塩、５，６－ジクロロ－１－β－Ｄ－リボフラノシルべンジミダゾルアデノシン－３’，５’－サイクリック一リン酸（ジクロロリボフラノシルべンジミダゾルｃＡＭＰ）及びその塩、アデノシン－２’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、アデノシン－２’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、アデノシン－２’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、グアノシン－２’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、グアノシン－２’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、グアノシン－２’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩等が挙げられる。
上記サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体との塩を形成する塩基としては、生化学的に許容しうるもので、当該誘導体と塩を形成するものであれば特に制限されないが、中でも好ましいものとしては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属原子、トリスヒドロキシアミノメタン等の有機塩基が挙げられる。
上記活性増強物質としては、中でも、アデノシン－３’，５’サイクリック一リン酸、アデノシン－３’，５’サイクリック一リン酸ナトリウムが特に好ましい。また、これら活性増強物質は、単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
上記活性増強物質は、あらかじめ上記無細胞蛋白合成溶液に加えておいてもよいが、当該溶液中で不安定である場合には、無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成反応を行う際に加えるのが好ましい。
上記活性増強物質の添加量としては、上記無細胞蛋白合成溶液による蛋白質合成反応が活性化（増加）しうる濃度であれば特に制限されない。具体的には、反応系中の最終濃度として、通常０．１ミリモル／リットル以上であればよい。濃度の下限は、好ましくは０．２ミリモル／リットル、より好ましくは０．４ミリモル／リットル、特に好ましくは０．８ミリモル／リットルである。他方、濃度の上限は、好ましくは２４ミリモル／リットル、より好ましくは６．４ミリモル／リットル、特に好ましくは３．２ミリモル／リットルである。
上記活性増強物質を上記無細胞蛋白合成溶液に加える際の無細胞蛋白合成溶液の温度としては特に限定されないが、０～３０℃が好ましく、１０～２６℃がより好ましい。
上記無細胞蛋白合成溶液は、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ（翻訳鋳型）に加え、蛋白質合成に必須の成分であるＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオン等を含有し、更には必要に応じて活性増強物質を含むものであり、このような無細胞蛋白合成溶液を用いることにより無細胞蛋白合成反応系とすることができる。
なお、上記特開２００５－２１８３５７号公報に記載された方法で調製された胚芽抽出物には蛋白質合成反応に必要とされる量のｔＲＮＡが含まれているため、当該方法により調製された胚芽抽出物を無細胞蛋白合成溶液に用いる場合には、別途調製したｔＲＮＡを追加することは必須要件ではない。すなわち、無細胞蛋白合成溶液には、必要に応じてｔＲＮＡを追加すればよい。
第１の本発明における結合工程は、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行うことが好ましいものであるが、具体的には蛋白質の合成前又は合成後の適当な時期に、好ましくは蛋白質合成前に、上記無細胞蛋白合成溶液にゴム粒子を加えることにより行うことができる。
また、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、５～５０ｇ／Ｌであることが好ましい。すなわち、無細胞蛋白合成溶液１Ｌに対してゴム粒子を５～５０ｇ共存させることが好ましい。無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が５ｇ／Ｌ未満であると、合成されたＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質が結合したゴム粒子を回収するために、超遠心分離等による分離処理を行った際に、ゴム層が形成されず、合成されたＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質が結合したゴム粒子を回収することが困難になる場合がある。一方、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が５０ｇ／Ｌを超えると、ゴム粒子同士が凝集し、合成されたＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質がうまくゴム粒子に結合できなくなるおそれがある。上記ゴム粒子の濃度としてより好ましくは１０～４０ｇ／Ｌ、更に好ましくは１５～３５ｇ／Ｌ、特に好ましくは１５～３０ｇ／Ｌである。
また、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子との共存下での蛋白質合成は、その反応の進展に伴い、適宜ゴム粒子を追加していってもよい。ゴム粒子を上記無細胞蛋白合成溶液に加えてから例えば３～４８時間（好ましくは３～３０時間、より好ましくは３～２４時間）など無細胞蛋白合成系が活性な間、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とが共存するようにしておくことが好ましい。
上記ゴム粒子は、第１の本発明における結合工程に用いる前に（より好ましくは前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に）前処理等の特段の処理を行う必要はない。ただし、ゴム粒子上に存在する蛋白質の内、第１の本発明の方法により結合させたいＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質の割合を高めるために、予め界面活性剤によりゴム粒子から蛋白質を除去してもよい。このように、第１の本発明において用いられるゴム粒子が、第１の本発明における結合工程に用いる前に（より好ましくは前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に）、界面活性剤で洗浄されたものであることもまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。
上記界面活性剤としては特に限定されず、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などが挙げられる。これらの中でも、膜上の蛋白質の変性作用が小さい点で、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が好適に用いられ、両性界面活性剤が特に好適に用いられる。すなわち、上記界面活性剤が、両性界面活性剤であることもまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。
これら界面活性剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
上記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンエーテル系、ポリオキシアルキレンエステル系、多価アルコール脂肪酸エステル系、糖脂肪酸エステル系、アルキルポリグリコシド系、ポリオキシアルキレンポリグルコシド系の非イオン性界面活性剤や、ポリオキシアルキレンアルキルアミン、アルキルアルカノールアミド等が挙げられる。
これらの中でも、ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤、多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が好ましい。
上記ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンポリオールアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンモノ、ジ、又はトリスチリルフェニルエーテル等が挙げられる。これらの中でも、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテルが好適に使用される。なお、前記ポリオールとしては、炭素数２～１２の多価アルコールが好ましく、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、グルコース、スクロース、ペンタエリトリトール、ソルビタン等が挙げられる。
上記ポリオキシアルキレンエステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルロジン酸エステル等が挙げられる。
上記多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、炭素数２～１２の多価アルコールの脂肪酸エステル又はポリオキシアルキレン多価アルコールの脂肪酸エステル等が挙げられる。より具体的には、例えば、ソルビトール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル等が挙げられる。また、これらのポリアルキレンオキサイド付加物（例えば、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレングリセリン脂肪酸エステル等）も使用可能である。これらの中でも、ソルビタン脂肪酸エステルが好適に使用される。
上記糖脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ショ糖、グルコース、マルトース、フルクトース、多糖類の脂肪酸エステル等が挙げられ、これらのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
上記アルキルポリグリコシド系の非イオン性界面活性剤としては、グリコシドとしてグルコース、マルトース、フルクトース、ショ糖などが挙げられ、例えば、アルキルグルコシド、アルキルポリグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルポリグルコシドなどが挙げられ、これらの脂肪酸エステル類も挙げられる。また、これらすべてのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
これら非イオン性界面活性剤におけるアルキル基としては、例えば、炭素数４～３０の直鎖又は分岐した飽和若しくは不飽和のアルキル基が挙げられる。また、ポリオキシアルキレン基としては、炭素数２～４のアルキレン基を有するものが挙げられ、例えば、酸化エチレンの付加モル数が１～５０モル程度のものが挙げられる。また、前記脂肪酸としては、例えば、炭素数４～３０の直鎖又は分岐した飽和若しくは不飽和の脂肪酸が挙げられる。
上記非イオン性界面活性剤としては、中でも、ゴム粒子の膜を安定化させた状態で、かつ蛋白質の変性作用が小さい状態で、適度に膜結合蛋白質を除去できるという理由から、ポリオキシエチレンエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ　２０）が特に好ましい。
上記両性界面活性剤としては、例えば、四級アンモニウム塩基／スルホン酸基（－ＳＯ３Ｈ）タイプ、四級アンモニウム塩基／リン酸酸基タイプ（水に可溶）、四級アンモニウム塩基／リン酸酸基タイプ（水に不溶）、四級アンモニウム塩基／カルボキシル基タイプなどの両性イオン界面活性剤が挙げられる。なお、前記の酸基は塩であってもよい。
特に、前記の両性イオン界面活性剤が一分子中に＋と－の両電荷を有することが好ましく、前記の酸基の酸解離定数（ｐＫａ）が、５以下であることが好ましく、４以下であることがより好ましく、３以下であることが更に好ましい。
上記両性界面活性剤としては、具体的には、３－[（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ]－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、３－[（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ]－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（３－Ｄ－グルコナミドプロピル）－コラミド、ｎ－オクタデシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アミノ－１－プロパンスルホン酸、ｎ－デシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アミノ－１－プロパンスルホン酸、ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アミノ－１－プロパンスルホン酸、ｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アミノ－１－プロパンスルホン酸｛Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）－３－１４｝、ｎ－ヘキサデシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アミノ－１－プロパンスルホン酸、ｎ－オクタデシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アミノ－１－プロパンスルホン酸等のアンモニウムスルホベタイン類、ｎ－オクチルホスホコリン、ｎ－ノニルホスホコリン、ｎ－デシルホスホコリン、ｎ－ドデシルホスホコリン、ｎ－テトラデシルホスホコリン、ｎ－ヘキサデシルホスホコリン等のホスホコリン類、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン類が挙げられる。これらの中でも、ゴム粒子の膜を安定化させた状態で適度に蛋白質を除去できるという理由から、３－[（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ]－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）が特に好ましい。
上記界面活性剤の処理濃度は、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の３倍以内であることが好ましい。臨界ミセル濃度の３倍を超える濃度の界面活性剤で処理するとゴム粒子の膜安定性が低下するおそれがある。より好ましくは２．５倍以内であり、更に好ましくは２．０倍以内である。また下限としては、０．０５倍以上であることが好ましく、０．１倍以上であることがより好ましく、０．３倍以上であることが更に好ましい。
上記無細胞蛋白合成における蛋白質合成のための反応システムまたは装置としては、バッチ（回分）法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９－２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２－１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ　Ｗｈｅａｔ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｃｏｒｅ　ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。その他、蛋白質合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法等も用いることができる。
中でも、重層法は操作が簡便であるという利点はあるものの反応溶液中でゴム粒子が分散してしまい、合成されるＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をゴム粒子に効率よく結合させることが困難であるのに対して、透析法では、合成されるＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質の原料となるアミノ酸は透析膜を透過できるがゴム粒子は透過しないため、ゴム粒子の分散を防ぐことができ、効率的にゴム粒子に合成されるＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を結合させることができることから、透析法が好ましい。
なお、上記透析法とは、上記無細胞蛋白合成における蛋白質合成の合成反応液を透析内液とし、透析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、蛋白質合成を行う方法である。具体的には、例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な透析容器に入れ反応内液とする。透析容器としては、底部に透析膜が付加されている容器（第一化学社製の透析カップ１２，０００等）や、透析用チューブ（三光純薬社製の１２，０００等）が挙げられる。透析膜は、１０，０００ダルトン以上の分子量限界を有するものが用いられるが、１２，０００ダルトン程度の分子量限界を有するものが好ましい。
上記透析外液としては、アミノ酸を含む緩衝液が用いられる。透析外液は反応速度が低下した時点で、新鮮なものと交換することにより透析効率を上昇させることができる。反応温度及び時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、例えば、小麦由来の胚芽抽出物を用いた系においては、通常１０～４０℃、好ましくは１８～３０℃、より好ましくは２０～２６℃で、１０分～４８時間（好ましくは１０分～３０時間、より好ましくは１０分～２４時間）行うことができる。
また、上記無細胞蛋白合成溶液に含まれるＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡは、分解されやすいことから、上記蛋白質合成反応中に適宜当該ｍＲＮＡを追加することで、蛋白質の合成をより効率的に行うことができる。すなわち、上記蛋白質合成反応中に、上記ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを更に加えることもまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。
なお、上記ｍＲＮＡの添加時間、添加回数、添加量等は特に制限されず、適宜設定することができる。
第１の本発明の製造方法においては、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を行った後、必要に応じてゴム粒子を回収する工程を行ってもよい。
上記ゴム粒子回収工程は、ゴム粒子を回収することができればその手法は特に制限されず、ゴム粒子を回収する通常行われる方法により行うことができる。具体的には、例えば、遠心分離により行う方法などが挙げられる。当該遠心分離によりゴム粒子を回収する場合、その遠心力や、遠心分離処理時間、遠心分離処理温度はゴム粒子を回収できるよう適宜設定することができるが、例えば、遠心分離処理の遠心力としては、１５０００×ｇ以上が好ましく、２００００×ｇ以上がより好ましく、２５０００×ｇ以上が更に好ましい。一方、遠心力は大きくしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心力の上限としては、５００００×ｇ以下が好ましく、４５０００×ｇ以下がより好ましい。遠心分離処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、遠心分離処理時間を長くしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心分離処理時間の上限としては、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。
また、遠心分離処理温度としては、ゴム粒子に結合したＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質のタンパク活性を維持するという観点から、０～１０℃が好ましく、２～８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
例えば、上記無細胞蛋白合成を行った場合には、上記遠心分離処理を行うと、ゴム粒子が上層に、無細胞蛋白合成溶液が下層に分離される。その後、下層の無細胞蛋白合成溶液を除去することで、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を結合させたゴム粒子を回収することができる。回収したゴム粒子はｐＨが中性の適当な緩衝液に再懸濁することで保存することができる。
なお、上記ゴム粒子回収工程を行った後に回収されたゴム粒子は更なる特別な処理を経ずに通常の天然ゴムと同様に用いることができる。
更に、第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドは、上記ゴム粒子を以下の固化工程に供することで回収することができる。
上記固化工程において、固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のポリイソプレノイド（天然ゴム）を溶解しない溶媒にゴム粒子を添加する方法やゴム粒子に酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ゴム粒子からゴム（天然ゴム）を固形分として回収できる。得られたゴム（天然ゴム）は、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。
このように、第１の本発明によれば、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させることで、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させることができ、これにより、より効率的に反応槽（試験管、プラントなど）内でゴム（ポリイソプレノイドの１種）を生産することが可能となる。
すなわち、ポリイソプレノイドを合成する方法であって、該方法は、生体外（例えば、反応槽（試験管、プラントなど）内）で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質を、ゴム粒子に結合させる結合工程を含むポリイソプレノイドを合成する方法もまた、第１の本発明の１つである。
なお、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質を、ゴム粒子に結合させる結合工程については、上述したとおりである。
なお、本明細書において、ポリイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成された重合体の総称である。ポリイソプレノイドとしては、例えばセスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）、天然ゴムなどの重合体が挙げられる。また、本明細書において、イソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を有する化合物を意味し、ポリイソプレノイドをも含む概念である。
（ゴム製品の製造方法）
第１の本発明のゴム製品の製造方法は、上記第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
ゴム製品としては、ゴム（好ましくは天然ゴム）を使用して製造できるゴム製品であれば特に限定されず、例えば、空気入りタイヤ、ゴムローラ、ゴム防舷材、手袋、医療用ゴムチューブ等が挙げられる。
ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、第１の本発明のゴム製品の製造方法が第１の本発明の空気入りタイヤの製造方法の場合、上記生ゴム製品成形工程は、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、上記加硫工程は、上記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、第１の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、上記ポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。
＜混練工程＞
混練工程では、上記ポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。
添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、上記ポリイソプレノイド以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。
混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。
＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品（タイヤの場合は生タイヤ）を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ（未加硫タイヤ）を成形すればよい。
＜加硫工程＞
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ（未加硫タイヤ）を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。
（第２の本発明）
（ベクター）
第２の本発明のベクターは、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、又は、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターである。このようなベクターを植物に導入して形質転換を行うことにより、当該ベクターに含まれる、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子が乳管特異的に発現し、当該植物におけるシス型イソプレノイド、ポリイソプレノイドの生産量を向上させることが可能となる。これは、乳液の生産性向上のために導入した外来遺伝子の発現が乳管以外の部位で促進されると、植物体の代謝や乳液の生産に負荷がかかり、悪影響を及ぼすためと推測される。
なお、本明細書において、プロモーターが乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するとは、所望の遺伝子を当該プロモーターと機能的に連結させて植物に導入した場合に、当該所望の遺伝子が乳管で特異的に発現されるように遺伝子発現を制御する活性を有することを意味する。ここで、乳管特異的に遺伝子が発現するとは、当該遺伝子が植物中、乳管以外の部位では全く又はほとんど発現せず、当該遺伝子が実質的に乳管でのみ専ら発現しているといえる状態を意味する。また、遺伝子をプロモーターと機能的に連結させるとは、当該プロモーターの制御を受けるように、当該プロモーターの下流に当該遺伝子配列を連結することを意味する。
第２の本発明のベクターは、一般的に植物の形質転換用ベクターとして知られているベクターに、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターの塩基配列、並びに、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列、又は、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を従来公知の方法により挿入することで作製することができる。第２の本発明のベクターを作製するために使用することができるベクターとしては、例えば、ｐＢＩ系のベクターや、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧなどのバイナリーベクター、ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間系プラスミド、ＧＡＴＥＷＡＹカセットを含むｐＨ３５ＧＳなどが挙げられる。
第２の本発明のベクターは、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターの塩基配列、並びに、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列、又は、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を含む限り、その他の塩基配列を含んでいてもよい。通常、ベクターにはこれらの塩基配列に加えて、ベクター由来の配列が含まれており、更に、制限酵素認識配列、スペーサ―配列、マーカー遺伝子の配列、レポーター遺伝子の配列などが含まれる。
上記マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、上記レポーター遺伝子は、植物体中での発現部位を確認するために導入するものであり、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）等が挙げられる。
上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、その由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましく、上述した植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることが更に好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることがより更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。最も好ましくはいずれもパラゴムノキ由来であることである。また、上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及び、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の由来が同じ種であることも好適な形態な１つである。
なお、第２の本発明におけるシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質については、上述の第１の本発明で述べたとおりである。
第２の本発明のベクターにおいては、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターの塩基配列、並びに、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列、又は、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を含む限り、更にその他の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を含んでいてもよい。
上記その他の蛋白質をコードする遺伝子としては、第１の本発明において上述したものと同様のものが挙げられる。
上記乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターとしては、Ｒｕｂｂｅｒ　Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｓｍａｌｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｈｅｖｅｉｎ２．１（ＨＥＶ２．１）をコードする遺伝子のプロモーター、及び、ＭＹＣ１　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＣ１）をコードする遺伝子のプロモーターからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
なお、本明細書において、Ｒｕｂｂｅｒ　Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことであり、ゴム粒子が安定化するのに寄与する。
Ｓｍａｌｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことである。
Ｈｅｖｅｉｎ２．１（ＨＥＶ２．１）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物の乳管細胞に多く発現している蛋白質のことであり、ゴム粒子の凝集に関与し、抗真菌活性を有するものである。
また、ＭＹＣ１　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＣ１）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物のラテックスで多く発現している、ジャスモン酸シグナルに関わる転写因子のことである。ここで、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ（転写因子）とは、遺伝子の転写量を増加若しくは減少（好ましくは増加）させる活性を有する蛋白質を意味する。すなわち、本明細書において、ＭＹＣ１は、ジャスモン酸シグナルに関わる蛋白質のうち少なくとも１種の蛋白質をコードする遺伝子の転写量を増加若しくは減少（好ましくは増加）させる活性（転写因子活性）を有する蛋白質のことである。
（Ｒｕｂｂｅｒ　Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）をコードする遺伝子のプロモーター）
上記ＲＥＦをコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
上記ＲＥＦをコードする遺伝子のプロモーターは、下記［Ａ１］～［Ａ３］のいずれかで表されるＤＮＡであることが好ましい。
［Ａ１］配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［Ａ２］配列番号９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
［Ａ３］配列番号９で表される塩基配列と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡのように、プロモーターの塩基配列は、元の塩基配列とある程度の配列同一性を有している場合には、同様にプロモーター活性を有する場合があることが知られている。プロモーター活性を維持するための、配列番号９で表される塩基配列との配列同一性としては、少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
（ＳＲＰＰをコードする遺伝子のプロモーター）
上記ＳＲＰＰをコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
上記ＳＲＰＰをコードする遺伝子のプロモーターは、下記［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれかで表されるＤＮＡであることが好ましい。
［Ｂ１］配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｂ２］配列番号１０で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
［Ｂ３］配列番号１０で表される塩基配列と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡのように、プロモーターの塩基配列は、元の塩基配列とある程度の配列同一性を有している場合には、同様にプロモーター活性を有する場合があることが知られている。プロモーター活性を維持するための、配列番号１０で表される塩基配列との配列同一性としては、少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
（ＨＥＶ２．１をコードする遺伝子のプロモーター）
上記ＨＥＶ２．１をコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
上記ＨＥＶ２．１をコードする遺伝子のプロモーターは、下記［Ｃ１］～［Ｃ３］のいずれかで表されるＤＮＡであることが好ましい。
［Ｃ１］配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｃ２］配列番号１１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
［Ｃ３］配列番号１１で表される塩基配列と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡのように、プロモーターの塩基配列は、元の塩基配列とある程度の配列同一性を有している場合には、同様にプロモーター活性を有する場合があることが知られている。プロモーター活性を維持するための、配列番号１１で表される塩基配列との配列同一性としては、少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
（ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーター）
上記ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
上記ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターは、下記［Ｄ１］～［Ｄ３］のいずれかで表されるＤＮＡであることが好ましい。
［Ｄ１］配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ２］配列番号１２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
［Ｄ３］配列番号１２で表される塩基配列と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡのように、プロモーターの塩基配列は、元の塩基配列とある程度の配列同一性を有している場合には、同様にプロモーター活性を有する場合があることが知られている。プロモーター活性を維持するための、配列番号１２で表される塩基配列との配列同一性としては、少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡや、上記したＤＮＡと６０％以上の配列同一性を有するＤＮＡが、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡであることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法である、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、又はＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）等をレポーター遺伝子としたレポーターアッセイなどにより確認する方法が挙げられる。
また、上記プロモーターの塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌ　Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ）法によりゲノムＤＮＡを抽出する。次に上記プロモーターの既知の塩基配列を基に特異的なプライマーと、ランダムプライマーを設計し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にしてＴＡＩＬ（Ｔｈｅｒｍａｌ　Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　Ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ）－ＰＣＲ法を行って、上記プロモーターを含む遺伝子の増幅を行い、塩基配列を同定する。
第２の本発明のベクター（乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、又は、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクター）を植物に導入することにより、ポリイソプレノイド生合成に関わる所定の蛋白質を乳管特異的に発現するように形質転換された形質転換植物が得られる。そして、当該形質転換植物では、ポリイソプレノイド生合成に関わる所定の蛋白質が乳管特異的に発現することにより、第２の本発明のベクターが導入された植物体内で新たに該蛋白質が有する所定の酵素活性等の機能が乳管内で増強されてポリイソプレノイドの生合成経路の一部が増強され、結果的に植物体でのシス型イソプレノイド、ポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。
更に、本発明者らは、生体外で、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を結合させることで、ゴム粒子のゴム合成が活性化することを初めて見出した。このことから、植物体内でＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を共発現させると、ゴム合成活性が増強することが予想される。したがって、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を共発現させた形質転換植物を用いて、ポリイソプレノイドの製造を行うことで、ポリイソプレノイドの製造量を更に増大できることが期待できる。
したがって、上記形質転換植物を、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターを植物に導入することにより作出する場合には、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターを併用することが好ましい。これにより、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターを植物に導入することで得られる形質転換植物、及び、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、Ｎｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターと、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターとを植物に導入することで得られる形質転換植物いずれにおいても、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質が共発現することとなるため、ＣＰＴファミリー蛋白質の活性が安定化、増強されると予想される。その結果、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を共発現させた形質転換植物は、ゴム合成活性が継続的に増強し、該形質転換植物を用いて、ポリイソプレノイドの製造を行うことで、ポリイソプレノイドの製造量をより好適に増大できるものと期待される。
なお、上記乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターとは、上記乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターの制御を受けるように、当該プロモーターの下流に上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を連結したものを意味し、第２の本発明のベクターと同様の方法で得られる。
次に、上記形質転換植物の作製方法について簡単に説明するが、このような形質転換植物は従来公知の方法により作製することができる。
上記形質転換植物を作出するために、第２の本発明のベクターが導入される植物としては、特に限定されないが、中でも、ポリイソプレノイドを生合成できる植物でＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を発現させることにより、ポリイソプレノイドの生産性の向上、ポリイソプレノイドの製造量の増大が特に期待できることから、上記植物としては、ゴム産生植物が好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種のゴム産生植物であることがより好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキであることである。
第２の本発明のベクターを植物（カルスや、培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストといった植物細胞を含む）に導入する方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９－１４０８８５号公報、特開昭６０－７００８０号公報、国際公開第９４／００９７７号）、エレクトロポレーション法（特開昭６０－２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等を挙げることができる。中でも、アグロバクテリウムを用いる方法（アグロバクテリウム法）を用いて第２の本発明のベクターを植物に導入して形質転換植物（形質転換植物細胞）を作製するのが好ましい。
なお更には、第２の本発明のベクターを、上記ＤＮＡを導入する方法などにより、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、生物体、生物体の一部、器官、組織や培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストなどに導入することによって、シス型イソプレノイド、ポリイソプレノイドを生産することも可能である。
以上の方法等により、上記形質転換植物（形質転換植物細胞）が得られる。なお、上記形質転換植物は、上述の方法で得られた形質転換植物細胞のみならず、その子孫又はクローン、さらにそれらを継代させて得られる子孫植物の全てを含む概念である。一旦、第２の本発明のベクターが導入された形質転換植物細胞が得られれば、該形質転換植物細胞から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫又はクローンを得ることが可能である。また、該形質転換植物細胞やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該形質転換植物を量産することも可能である。
形質転換植物細胞から植物体（形質転換植物）を再生する方法としては、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特願平１１－１２７０２５号公報）、イネではＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５），　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４－）、トウモロコシではＳｈｉｌｌｉｔｏらの方法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９），　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１－）、ジャガイモではＶｉｓｓｅｒらの方法（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９），　Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９－）、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２），　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７－）が知られており、当業者であれば、これらを参照して形質転換植物細胞から植物体を再生できる。
再生した植物体において、周知の手法を用いることで、目的の蛋白質遺伝子の発現を確認することが出来る。例えば、目的の蛋白質の発現をウエスタンブロット解析すればよい。
上記形質転換植物から種子を得る方法としては、例えば、形質転換植物を適当な培地において発根させ、その発根体を水分含有の土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させ、最終的に種子を形成させて、該種子を得る。また、種子から植物体を得る方法としては、例えば、前記のようにして得られた形質転換植物由来の種子を、水分含有の土に播種し、適当な栽培条件下で生育させることにより植物体を得ることができる。
第２の本発明では、第２の本発明のベクターを植物に導入することにより、該ベクターに含まれるポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子（特に好ましくは、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子）が乳管特異的に発現し、当該植物におけるシス型イソプレノイド、ポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。具体的には、上述の方法で得られた形質転換植物細胞、形質転換植物細胞から得られたカルス、該カルスから再分化した細胞等を適当な培地で培養したり、形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物、該形質転換植物から得られた種子から得られた植物体等を適当な栽培条件下で生育させたりすることにより、シス型イソプレノイド、ポリイソプレノイドを製造することができる。
このように、第２の本発明のベクターを植物に導入することにより、該植物におけるシス型イソプレノイドの生産量を向上させる方法もまた、第２の本発明の１つである。また、第２の本発明のベクターを植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法もまた、第２の本発明の１つである。
（ゴム製品の製造方法）
第２の本発明のゴム製品の製造方法は、上記第２の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
ゴム製品としては、第１の本発明において上述したものと同様である。
ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、第２の本発明のゴム製品の製造方法が第２の本発明の空気入りタイヤの製造方法の場合、上記生ゴム製品成形工程は、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、上記加硫工程は、上記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、第２の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、上記第２の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。
＜混練工程＞
混練工程では、上記第２の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。
上記第２の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドは、上記形質転換植物からラテックスを採取し、採取したラテックスを以下の固化工程に供することにより得られる。
なお、上記形質転換植物からのラテックスの採取方法は特に制限されず、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、植物の幹を傷つけてにじみ出る乳液を回収したり（タッピング）、根など形質転換植物の一部を切断し、切断した部分からにじみ出る乳液を回収したり、切断した組織を粉砕し、有機溶媒を用いて抽出して採取したりすることができる。
＜固化工程＞
上記採取されたラテックスは、固化工程に供される。固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のポリイソプレノイド（天然ゴム）を溶解しない溶媒にラテックスを添加する方法やラテックスに酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ラテックスからゴム（天然ゴム）を固形分として回収できる。得られたゴム（天然ゴム）は、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。
添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、上記ラテックスから得られたゴム以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。
混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。
＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、第１の本発明において上述した工程と同様である。
＜加硫工程＞
加硫工程は、第１の本発明において上述した工程と同様である。
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
（実施例１）
〔ＨｅｖｅａラテックスからのＴｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出〕
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。ラテックス６ｍＬに１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液６ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬを添加し、さらに６５℃で予温しておいた水飽和フェノールを１２ｍＬ添加した。６５℃で５分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール：クロロホルム（１：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１．２ｍＬとイソプロパノール１３ｍＬを添加し、ボルテックスで撹拌した。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを沈殿させるために、－２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取除くことでＴｏｔａｌ　ＲＮＡの沈殿を回収した。回収したＴｏｔａｌ　ＲＮＡは７０％エタノールで２度洗浄したのち、ＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅの水で溶解させた。
〔Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕
回収したＴｏｔａｌ　ＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒa）の説明書に従って行った。
〔ｃＤＮＡからＣＰＴ、及びＮｇＢＲ遺伝子の取得〕
作製した１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ、及びＮｇＢＲ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１：５’－　ｔｔｔｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ－３’
プライマー２：５’－　ｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｃ－３’
を使用した。
ＮｇＢＲ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー３：５’－　ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇ　－３’
プライマー４：５’－　ｔｔｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｇｔａｃｃａｔａａｔｔｔｔｇｃｔｇｃａｃ　－３’
を使用した。
上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＨＲＴ１）、及びＮｇＢＲ遺伝子（ＨＲＴＢＰ）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＨＲＴ１の塩基配列を配列番号１に示した。ＨＲＴ１のアミノ酸配列を配列番号２に示した。また、ＨＲＴＢＰの塩基配列を配列番号３に示した。ＨＲＴＢＰのアミノ酸配列を配列番号４に示した。
〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ－ＨＲＴ１、及びｐＧＥＭ－ＨＲＴＢＰを作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、青／白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ　Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス社製）を使用した。
回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ－ＨＲＴ１を制限酵素Ｂａｍ　ＨＩとＮｏｔ　Ｉで処理したのち、同様にＢａｍ　ＨＩとＮｏｔ　Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ―Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＨＲＴ１を作製した。
同様に、ｐＧＥＭ－ＨＲＴＢＰを制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで処理したのち、同様にＸｈｏ　Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ－Ｃ１に挿入し、ｐＥＵ－Ｃ１－ＨＲＴＢＰを作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーＰＣＲによって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ　Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス社製）を使用した。
〔ゴム粒子の調製〕
ゴム粒子は、５段階の遠心分離によってＨｅｖｅａラテックスから調製した。Ｈｅｖｅａラテックス９００ｍＬに、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬを添加し、ラテックス溶液を調製した。得られたラテックス溶液を、１０００×ｇ、２０００×ｇ、８０００×ｇ、２００００×ｇ、５００００×ｇの異なる遠心速度で段階的に遠心分離した。遠心分離はいずれも４℃、４５分で行った。５００００×ｇでの遠心分離で残ったゴム粒子層に、３－[（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ]－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）を終濃度０．１～２．０×ＣＭＣ（臨界ミセル濃度ＣＭＣの０．１～２．０倍）になるように加え、ゴム粒子を洗浄した。洗浄処理後、洗浄されたゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
透析カップ（ＭＷＣＯ　１２０００）（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｋ社製）中に、以下の量をそれぞれ添加した。ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って全量６０μＬで反応溶液を調整した。反応溶液にゴム粒子を１～２ｍｇ添加した。さらに、ＰＰ容器Ｎｏ．２（マルエム容器）にＳＵＢ－ＡＭＩＸ　６５０μＬを添加した。
透析カップをＰＰ容器Ｎｏ．２にはめ、２６℃で蛋白合成反応を開始した。反応開始から２度のｍＲＮＡの追加と透析外液（ＳＵＢ－ＡＭＩＸ）の交換を行った。反応は２４時間行った。透析法を行っている様子の概略図を図３に示す。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
透析カップの溶液を新しい１．５μＬチューブに移し、反応後のゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を以下の方法により測定した。
まず、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ　ＤＴＴ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５μＭ　ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、１００μＭ　１－１４Ｃイソペンテニル二リン酸（［１－１４Ｃ］ＩＰＰ）（比活性：５Ｃｉ／ｍｏｌ）、１０μＬ　ゴム粒子溶液を混合した反応溶液（Ｔｏｔａｌ　１００μＬ）を調製し、３０℃で１６時間反応させた。
反応後、飽和ＮａＣｌを２００μＬ加え、１ｍＬのジエチルエーテルでイソペンテノールなどを抽出した。次に、水相のポリプレニル二リン酸を１ｍＬの食塩水飽和ＢｕＯＨで抽出し、その後さらに、水相の超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）を１ｍＬのトルエン／ヘキサン（１：１）で抽出し、放射活性を計測した。各層の放射活性は液体シンチレーションカウンターで１４Ｃのカウントを計測した。放射活性（ｄｐｍ）が高いほど、天然ゴムが多く生産されており、ゴム合成活性が高いことを示す。
結果を表１に示す。
〔合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布測定〕
上記合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布を下記の条件でＲａｄｉｏ　ＨＰＬＣにより測定した。結果を図４の（ａ）に示す。
ＨＰＬＣシステム：ＧＩＬＳＯＮ社製
カラム：ＴＯＳＯＨ社製のＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ　ＭＰ（ＸＬ），ＴＳＫｇｅｌ　Ｍｕｌｔｉｐｏｒｅ　ＨＸＬ－Ｍ（２本）
カラム温度：４０℃
溶媒：Ｍｅｒｃｋ社製のＴＨＦ
流速：１ｍｌ／分
ＵＶ検出：２１５ｎｍ
ＲＩ検出：Ｒａｍｏｎａ　Ｓｔａｒ（Ｒａｙｔｅｓｔ　ＧｍｂＨ）
（比較例１）
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ－Ｎ２を鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
結果を表１に示す。
（比較例２）
無細胞蛋白合成において、実施例１の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したｐＥＵ－Ｃ１－ＨＲＴＢＰを鋳型に用いた以外は実施例１と同様にして行い、回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
結果を表１に示す。
（実施例２）
〔レタス（Ｌａｃｔｕｃａ　ｓａｔｉｖａ）ＣＰＴ、及びＮｇＢＲ遺伝子の合成〕
レタス（Ｌａｃｔｕｃａ　ｓａｔｉｖａ）ＣＰＴ遺伝子（ＬｓＣＰＴ３）、及びＮｇＢＲ遺伝子（ＬｓＣＰＴＬ２）はＢＬＡＳＴに公開されている情報をもとに、開始コドンから終始コドンまでの領域をジェンスクリプトジャパン株式会社の遺伝子合成サービスをもとに合成して作成した。後述する無細胞蛋白合成法用ベクターにクローニングするため、ＬｓＣＰＴ３の５′末端側にはＸｈｏ　Ｉサイトを３′末端側にはＫｐｎ　Ｉサイトを付加し、また、ＬｓＣＰＴＬ２の５′末端側にはＥｃｏＲＶサイトを３′末端側にはＸｈｏ　Ｉサイトを付加した。
上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＬｓＣＰＴ３）、及びＮｇＢＲ遺伝子（ＬｓＣＰＴＬ２）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＬｓＣＰＴ３の塩基配列を配列番号１３に示した。ＬｓＣＰＴ３のアミノ酸配列を配列番号１４に示した。また、ＬｓＣＰＴＬ２の塩基配列を配列番号１５に示した。ＬｓＣＰＴＬ２のアミノ酸配列を配列番号１６に示した。
〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片は、ｐＵＣ５７に挿入し、ｐＵＣ５７－ＬｓＣＰＴ３及びｐＵＣ５７－ＬｓＣＰＴＬ２を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＵＣ５７－ＬｓＣＰＴ３を制限酵素Ｘｈｏ　ＩとＫｐｎ　Ｉで処理したのち、同様にＸｈｏ　ＩとＫｐｎ　Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ―Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＬｓＣＰＴ３を作製した。
同様に、ｐＵＣ５７－ＬｓＣＰＴＬ２を制限酵素ＥｃｏＲＶとＸｈｏ　Ｉで処理したのち、同様にＥｃｏＲＶとＸｈｏ　Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ－Ｃ１に挿入し、ｐＥＵ－Ｃ１－ＬｓＣＰＴＬ２を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。結果を表１に示す。
〔合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布測定〕
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布を、実施例１と同様にして測定した。結果を図４の（ａ）に示す。
（実施例３）
〔シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）からのＴｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出〕
シロイヌナズナからホットフェノール法により、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。実生を液体窒素で凍結後、乳鉢で破砕した後、８０℃の水飽和フェノール、８０℃のＲＮＡ抽出バッファー（１００ｍＭ　ＬｉＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）をそれぞれ４００μＬずつ加え３０秒間ボルテックスした。さらにクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を４００μＬ加え３０秒間ボルテックスした。４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上層を回収した。４Ｍ　ＬｉＣｌを５００μＬ加え混合し、－８０℃で１時間静置した。４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を４００μＬのＤＥＰＣ処理水に溶解した。エタノールを８８０μＬ、３Ｍ　ＮａＯＡｃを４０μＬ加え混合した。４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を３００μＬの７０％エタノールで洗浄した。４℃、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を３０μＬのＤＥＰＣ処理水に溶解した。抽出したＴｏｔａｌ　ＲＮＡから混入したゲノムＤＮＡを除去するため、ＤＮａｓｅ処理を行った。ＤＮａｓｅ処理にはＤＮａｓｅ　Ｉ（ＴａＫａＲａ社製）もしくはＤＮａｓｅ　Ｉ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。いずれの場合もメーカー推奨の条件に従い５０μＬの反応溶液を調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応後にＤＥＰＣ処理水を３５０μＬとフェノールを４００μＬ加え混合し、室温、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上層を回収し、エタノールを８８０μＬ、３Ｍ　ＮａＯＡｃを４０μＬ加え混合した。４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を３００μＬの７０％エタノールで洗浄した。４℃、１５，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を５０μＬのＤＥＰＣ処理水に溶解した。
〔Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕
実施例１と同様にして行った。
〔ｃＤＮＡからＣＰＴ、及びＮｇＢＲ遺伝子の取得〕
作製した１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ、及びＮｇＢＲ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５５～６０℃で１５秒、６８℃で３０秒を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー５：５’－　ｃｔａｇｇａｔｃｃｇａｇａｔｇａａｔａｃｃｃｔａｇａａｇ　－３’
プライマー６：５’－　ａａｃｇｇａｔｃｃａａｃｔａｔｃｔａａｔｃｇａｇｃ　－３’
ＮｇＢＲ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー７：５’－　ｃｇｇｇａｔｃｃａｔｇｇａｔｔｃｇａａｔｃａａｔｃｇａｔｇｃｇｇｃｔｃｃｔｃ　－３’
プライマー８：５’－　ｇｃｇｇａｔｃｃａａｔｔｇｇｇａａｃａｇｔａｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｔｇａｃｔｃ　－３’
を使用した。
〔ベクターの構築〕
上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＡｔＣＰＴ８）、及びＮｇＢＲ遺伝子（ＡｔＬＥＷ１）が得られた。得られた遺伝子について、制限酵素ＢａｍＨ　Ｉで処理したのち、同様にＢａｍＨ　Ｉで制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＳＫ（－）に挿入し、ｐＢＳ－ＡｔＣＰＴ８及びｐＢＳ－ＡｔＬＥＷ１を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
得られたプラスミド内の各遺伝子の配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＡｔＣＰＴ８の塩基配列を配列番号２１に示した。ＡｔＣＰＴ８のアミノ酸配列を配列番号２２に示した。また、ＡｔＬＥＷ１の塩基配列を配列番号２３に示した。ＡｔＬＥＷ１のアミノ酸配列を配列番号２４に示した。
上記取得したｐＢＳ－ＡｔＣＰＴ８及びｐＢＳ－ＡｔＬＥＷ１を鋳型にＣＰＴ、及びＮｇＢＲ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５５～６０℃で１５秒、６８℃で３０秒を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー２３：５’－　ｔａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａａｔａｃｃ　－３’
プライマー２４：５’－　ｔｇａａｃｔａｇｔｃｔａａｔｃｇａｇｃｔｔｔｔｔｃ　－３’
を使用した。
ＮｇＢＲ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー２５：５’－　ａｃｃｃｇｇｇａｔｇｇａｔｔｃｇ　－３’
プライマー２６：５’－　ｃｇｃｇｇａｃｔａｇｔｔｔａａｇｔｔｃｃａｔａｇ　－３’
を使用した。
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上述の方法により得られた遺伝子について、制限酵素Ｘｍａ　ＩとＳｐｅ　Ｉで処理したのち、同様にＸｍａ　ＩとＳｐｅ　Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ―Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＡｔＣＰＴ８、ｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＡｔＬＥＷ１を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。結果を表１に示す。
〔合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布測定〕
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布を、実施例１と同様にして測定した。結果を図４の（ａ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
表１より、ＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させることにより、それぞれを単独でゴム粒子に結合された場合に比べて、ゴム粒子のゴム合成能力を顕著に増強させることができることが分かる。更に、ゴム粒子にＮｇＢＲを単独で結合させた比較例２では、何も結合させなかった比較例１に比べてゴム合成活性が抑制されているように、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質の組合せによる効果は、それぞれの単独の効果を足し合わせた以上の相乗効果といえ、ＣＰＴファミリー蛋白質とＮｇＢＲファミリー蛋白質という特定の組合せとすることによって初めてゴム粒子のゴム合成能力を顕著に増強することができるという効果は、当業者であっても予測することのできない効果である。
また、図４の（ａ）より、実施例１～３において合成される天然ゴムは、同程度のＧＰＣ溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。なお、図４の結果は、サンプル間で規格化されていないため、ピークの高さで活性を比較することはできないものである。
（実施例４）
〔ｃＤＮＡからＲＥＦ遺伝子の取得〕
実施例１の〔Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕で作製した１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを鋳型にＲＥＦ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＲＥＦ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー９：５’－　ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇｃｔｇａａｇａｃｇａａｇａｃ　－３’
プライマー１０：５’－　ｔｔｔｇｇａｔｃｃｔｃａａｔｔｃｔｃｔｃｃａｔａａａａｃ　－３’
を使用した。
上述の方法により、ＲＥＦ遺伝子が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＲＥＦの塩基配列を配列番号２７に示した。ＲＥＦのアミノ酸配列を配列番号２８に示した。
〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ－ＲＥＦを作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ－ＲＥＦを制限酵素Ｘｈｏ　ＩとＢａｍ　ＨＩで処理したのち、同様にＸｈｏ　ＩとＢａｍ　ＨＩで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ－Ｃ１に挿入し、ｐＥＵ－Ｃ１－ＲＥＦを作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｃ１－ＲＥＦ、並びに、実施例１の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＨＲＴ１及びｐＥＵ－Ｃ１－ＨＲＴＢＰを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
（実施例５）
〔ｃＤＮＡからＣＰＴ遺伝子の取得〕
実施例１の〔Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕で作製した１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１１：５’－　ｔｔｔｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ－３’
プライマー１２：５’－　ｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｃ－３’
を使用した。
上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＨＲＴ２）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＨＲＴ２の塩基配列を配列番号３１に示した。ＨＲＴ２のアミノ酸配列を配列番号３２に示した。
〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ－ＨＲＴ２を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ－ＨＲＴ２を制限酵素Ｂａｍ　ＨＩとＮｏｔ　Ｉで処理したのち、同様にＢａｍ　ＨＩとＮｏｔ　Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ－Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＨＲＴ２を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＨＲＴ２、実施例１の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｃ１－ＨＲＴＢＰ、及び、実施例４の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｃ１－ＲＥＦを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
（実施例６）
〔ｃＤＮＡからＣＰＴ遺伝子の取得〕
実施例１の〔Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕で作製した１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１３：５’－　ａｔａｃｃｃｇｇｇａｔｇｇａａａｔａｔａｔａｃ　－３’
プライマー１４：５’－　ａｃｔｃｃｃｇｇｇｔｔａｔｔｔｔａａａｔａｔｔｃ　－３’
を使用した。
上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＣＰＴ３）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＣＰＴ３の塩基配列を配列番号３５に示した。ＣＰＴ３のアミノ酸配列を配列番号３６に示した。
〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ－ＣＰＴ３を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ－ＣＰＴ３を制限酵素Ｘｍａ　Ｉで処理したのち、同様にＸｍａ　Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ－Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＣＰＴ３を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＣＰＴ３、実施例１の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｃ１－ＨＲＴＢＰ、及び、実施例４の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｃ１－ＲＥＦを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
（実施例７）
〔ｃＤＮＡからＣＰＴ遺伝子の取得〕
実施例１の〔Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕で作製した１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１５：５’－　ｔａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇｇａａａｔａ　－３’
プライマー１６：５’－　ａｔａｃｃｃｇｇｇｔｔａｃａａｃｔｇｃ　－３’
を使用した。
上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＣＰＴ５）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＣＰＴ５の塩基配列を配列番号４０に示した。ＣＰＴ５のアミノ酸配列を配列番号４１に示した。
〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ－ＣＰＴ５を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ－ＣＰＴ５を制限酵素Ｘｍａ　Ｉで処理したのち、同様にＸｍａ　Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ－Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＣＰＴ５を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＣＰＴ５、実施例１の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｃ１－ＨＲＴＢＰ、及び、実施例４の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｃ１－ＲＥＦを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
（参考例１）
〔Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ　ＣＰＴ遺伝子の合成〕
Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ　ＣＰＴ遺伝子（ＴｂＣＰＴ１）はＢＬＡＳＴに公開されている情報をもとに、開始コドンから終始コドンまでの領域をジェンスクリプトジャパン株式会社の遺伝子合成サービスをもとに合成して作成した。後述する無細胞蛋白合成法用ベクターにクローニングするため、ＴｂＣＰＴ１の５′末端側にはＸｈｏ　Ｉサイトを３′末端側にはＫｐｎ　Ｉサイトを付加した。
上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＴｂＣＰＴ１）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＴｂＣＰＴ１の塩基配列を配列番号４２に示した。ＴｂＣＰＴ１のアミノ酸配列を配列番号４３に示した。
〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片は、ｐＵＣ５７に挿入し、ｐＵＣ５７－ＴｂＣＰＴ１を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＵＣ５７－ＴｂＣＰＴ１を制限酵素Ｘｈｏ　ＩとＫｐｎ　Ｉで処理したのち、同様にＸｈｏ　ＩとＫｐｎ　Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ―Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＴｂＣＰＴ１を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
〔合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布測定〕
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布を、実施例１と同様にして測定した。結果を図４の（ｂ）に示す。図４の（ｂ）より、参考例１において合成される天然ゴムは、実施例１～３において合成される天然ゴムと同程度のＧＰＣ溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。
これらの結果から、更にＮｇＢＲファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させ、ＴｂＣＰＴ１蛋白質とＮｇＢＲファミリー蛋白質とをゴム粒子に結合させると、ゴム粒子上でのＴｂＣＰＴ１蛋白質の活性が安定化、増強され、結果、ゴム粒子のゴム合成能力が増強されることが強く示唆される。
（参考例２）
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。実施例５の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＨＲＴ２を鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
〔合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布測定〕
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布を、実施例１と同様にして測定した。結果を図４の（ｂ）に示す。図４の（ｂ）より、参考例２において合成される天然ゴムは、実施例１～３において合成される天然ゴムと同程度のＧＰＣ溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。
この結果から、更にＮｇＢＲファミリー蛋白質及びＲＥＦをゴム粒子に結合させた実施例５においても、分子量分布パターンとして同等の天然ゴムが合成されていることが強く示唆される。
（参考例３）
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。実施例６の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＣＰＴ３を鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
〔合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布測定〕
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布を、実施例１と同様にして測定した。結果を図４の（ｂ）に示す。図４の（ｂ）より、参考例３において合成される天然ゴムは、実施例１～３において合成される天然ゴムと同程度のＧＰＣ溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。
この結果から、更にＮｇＢＲファミリー蛋白質及びＲＥＦをゴム粒子に結合させた実施例６においても、分子量分布パターンとして同等の天然ゴムが合成されていることが強く示唆される。
（参考例４）
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。実施例７の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＣＰＴ５を鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
〔合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布測定〕
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布を、実施例１と同様にして測定した。結果を図４の（ｂ）に示す。図４の（ｂ）より、参考例４において合成される天然ゴムは、実施例１～３において合成される天然ゴムと同程度のＧＰＣ溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。
この結果から、更にＮｇＢＲファミリー蛋白質及びＲＥＦをゴム粒子に結合させた実施例７においても、分子量分布パターンとして同等の天然ゴムが合成されていることが強く示唆される。
（参考例５）
〔ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＰＴ遺伝子の合成〕
ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＰＴ遺伝子（ＨＤＳ）はＢＬＡＳＴに公開されている情報をもとに、開始コドンから終始コドンまでの領域をジェンスクリプトジャパン株式会社の遺伝子合成サービスをもとに合成して作成した。後述する無細胞蛋白合成法用ベクターにクローニングするため、ＨＤＳの５′末端側にはＸｍａＩサイトを３′末端側にはＳｐｅＩサイトを付加した。
上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＨＤＳ）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＨＤＳの塩基配列を配列番号６４に示した。ＨＤＳのアミノ酸配列を配列番号５０に示した。
〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片は、ｐＵＣ５７に挿入し、ｐＵＣ５７－ＨＤＳを作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＵＣ５７－ＨＤＳを制限酵素ＸｍａＩとＳｐｅＩで処理したのち、同様にＸｍａＩとＳｐｅＩで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ―Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＨＤＳを作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。ただし、反応時間を１６時間から４時間に変更した。測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
〔合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布測定〕
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布を、実施例１と同様にして測定した。結果を図４の（ｃ）に示す。図４の（ｃ）より、参考例５において合成される天然ゴムは、実施例１～３において合成される天然ゴムと同程度のＧＰＣ溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。
これらの結果から、更にＮｇＢＲファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させ、ＨＤＳ蛋白質とＮｇＢＲファミリー蛋白質とをゴム粒子に結合させると、ゴム粒子上でのＨＤＳ蛋白質の活性が安定化、増強され、結果、ゴム粒子のゴム合成能力が増強されることが強く示唆される。
（参考例６）
〔酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＰＴ遺伝子の合成〕
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＰＴ遺伝子（ＳＲＴ１）はＢＬＡＳＴに公開されている情報をもとに、開始コドンから終始コドンまでの領域をジェンスクリプトジャパン株式会社の遺伝子合成サービスをもとに合成して作成した。後述する無細胞蛋白合成法用ベクターにクローニングするため、ＳＲＴ１の５′末端側にはＸｍａＩサイトを３′末端側にはＳｐｅＩサイトを付加した。
上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＳＲＴ１）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＳＲＴ１の塩基配列を配列番号６３に示した。ＳＲＴ１のアミノ酸配列を配列番号４７に示した。
〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片は、ｐＵＣ５７に挿入し、ｐＵＣ５７－ＳＲＴ１を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＵＣ５７－ＳＲＴ１を制限酵素ＸｍａＩとＳｐｅＩで処理したのち、同様にＸｍａＩとＳｐｅＩで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ―Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＳＲＴ１を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１　ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２　透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。ただし、反応時間を１６時間から４時間に変更した。測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
〔合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布測定〕
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の分子量分布を、実施例１と同様にして測定した。結果を図４の（ｃ）に示す。図４の（ｃ）より、参考例６において合成される天然ゴムは、実施例１～３において合成される天然ゴムと同程度のＧＰＣ溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。
これらの結果から、更にＮｇＢＲファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させ、ＳＲＴ１蛋白質とＮｇＢＲファミリー蛋白質とをゴム粒子に結合させると、ゴム粒子上でのＳＲＴ１蛋白質の活性が安定化、増強され、結果、ゴム粒子のゴム合成能力が増強されることが強く示唆される。
＜酵母に導入した場合のＣＰＴファミリー蛋白質のゴム合成能＞
（参考例７）
〔酵母発現用遺伝子の取得〕
実施例１、５で得たｐＧＥＭ－ＨＲＴ１、ｐＧＥＭ－ＨＲＴ２を鋳型に以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、酵母発現用ベクターｐＪＲ１１３３にクローニングできるよう、５′末端側、３′末端側の制限酵素を共にＢａｍ　ＨＩとした、ＨＲＴ１、ＨＲＴ２遺伝子を得た。
ＨＲＴ１及びＨＲＴ２用のプライマーとしては、
プライマー１７：５’－　ｔｔａｇｇａｔｃｃａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇ－３’
プライマー１８：５’－　ａａｃｇｇａｔｃｃｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇ－３’
を使用した。
また、実施例３で得たｐＢＳ－ＡｔＣＰＴ８を制限酵素Ｂａｍ　ＨＩで処理することで、５′末端側、３′末端側の制限酵素を共にＢａｍ　ＨＩとしたＡｔＣＰＴ８遺伝子を得た。
また、実施例１、３で得たｐＧＥＭ－ＨＲＴＢＰ、ｐＢＳ－ＡｔＬＥＷ１を鋳型に以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、酵母発現用ベクターｐＧＫ４１５及びｐＧＫ４２５にそれぞれクローニングできるよう、５′末端側、３′末端側の制限酵素を共にＸｈｏ　ＩとしたＨＲＴＢＰ、５′末端側の制限酵素をＳａｌ　Ｉ、３′末端側の制限酵素をＢａｍ　ＨＩとしたＡｔＬＥＷ１遺伝子を得た。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＨＲＴＢＰ用のプライマーとしては、
プライマー１９：５’－　ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇ－３’
プライマー２０：５’－　ｔｔｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｇｔａｃｃａｔａａｔｔｔｔｇｃｔｇｃａｃ－３’
を使用した。
ＡｔＬＥＷ１用のプライマーとしては、
プライマー２１：５’－　ｇｔｃｇａｃａｔｇｇａｔｔｃｇａａｔｃａａｔｃｇ　－３’
プライマー２２：５’－　ｇｇａｔｃｃｔｔａａｇｔｔｃｃａｔａｇｔｔｔｔｇｇ　－３’
を使用した。
〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ－ＨＲＴ１（ｐＪＲ１１３３用）、ｐＧＥＭ－ＨＲＴ２（ｐＪＲ１１３３用）、ｐＧＥＭ－ＡｔＣＰＴ８（ｐＪＲ１１３３用）、ｐＧＥＭ－ＨＲＴＢＰ（ｐＧＫ４２５用）、ｐＧＥＭ－ＡｔＬＥＷ１（ｐＧＫ４２５用）を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔酵母発現用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得した各ｐＧＥＭ－ＣＰＴシリーズを制限酵素Ｂａｍ　ＨＩで処理したのち、同様にＢａｍ　ＨＩで制限酵素処理した酵母発現用ベクターｐＪＲ１１３３に挿入し、ｐＪＲ１１３３－ＨＲＴ１、ｐＪＲ１１３３－ＨＲＴ２、ｐＪＲ１１３３－ＡｔＣＰＴ８を作製した。
同様に上記〔ベクターの構築〕で獲得した各ｐＧＥＭ－ＮｇＢＲシリーズを制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで処理したのち、Ｓａｌ　Ｉで制限酵素処理した酵母発現用ベクターｐＧＫ４２５に挿入し、ｐＧＫ４２５－ＨＲＴＢＰ、ｐＧＫ４２５－ＡｔＬＥＷ１を作製した。
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、共にＡｍｐを含むＬＢ培地で培養した。
〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。
〔酵母の形質転換〕
上記で得たプラスミドを用いて、以下の組合せで酵母ＳＮＨ２３－７Ｄ（ＭＡＴ－α　ｒｅｒ２－２　ｍｆ－１：：ＡＤＥ２　ｍｆ－２：：ＴＲＰ１　ｂａｒ１：：ＨＩＳ３　ａｄｅ２　ｔｒｐ１　ｈｉｓ３　ｌｅｕ２　ｕｒａ３　ｌｙｓ２）に形質転換した。
（１）ｐＪＲ１１３３－ＨＲＴ１＆ｐＧＫ４２５－ＨＲＴＢＰ
（２）ｐＪＲ１１３３－ＨＲＴ２＆ｐＧＫ４２５－ＨＲＴＢＰ
（３）ｐＪＲ１１３３－ＡｔＣＰＴ８＆ｐＧＫ４２５－ＡｔＬＥＷ１
形質転換した酵母はウラシル(ｐＪＲ１１３３セレクション用)とロイシン（ｐＧＫ４２５セレクション用）を抜いたＳＤ寒天培地で培養し、形質転換体を得た。
〔酵素発現〕
上記形質転換で得られた各酵母を５０ｍＬのＳＣ（＋Ｌｙｓ）培地に加え、２３℃、１８０ｒｐｍで振盪培養した。ＯＤ５４６＝０．８に達したところで、４５ｍＬの菌液を５０ｍＬサンプリングチューブに回収した。５０００×ｇで１０分遠心後、上清を捨て、－８０℃で冷凍保存した。
なお、ＳＣ（＋Ｌｙｓ）培地の組成は以下のとおりである。
硫安：５．０ｇ
Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ：１．７ｇ
Ｌｙｓｉｎｅ　ＨＣｌ：３０ｍｇ
Ｇｌｕｃｏｓｅ：２０ｇ
滅菌水：１Ｌまで
［粗酵素溶液の調製］
冷凍保存していたサンプルを氷上で溶かし、１００μＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、２３℃で１５分静置した。遠心して上清を除去し、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ　１００Ｔを２ｍｇ／ｍＬで加えたＺｙｍｏｌｙａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒを３００μＬ加え、３０℃、４０分酵素反応させスフェロプラスト化した。遠心して上清を除去し、３００μＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。遠心して上清を除去し、菌体をＢｒｅａｋａｇｅ　Ｂｕｆｆｅｒに懸濁した後、０．５ｍｍ　Ｇｌａｓｓ　Ｂｅａｄｓを用いて、３０秒ボルテックス→３０秒氷上のサイクルを３回繰り返し、細胞を破砕した。３００×ｇ、５分で遠心し未破砕細胞を除き、上清を回収した。この上清を１７４００×ｇで遠心することで、上清とペレットに分けた。ペレットをＢｒｅａｋａｇｅ　Ｂｕｆｆｅｒで懸濁したものを不溶性画分の粗酵素溶液とした。Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒ、Ｂｒｅａｋａｇｅ　Ｂｕｆｆｅｒの組成は以下のとおりである。
Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒ：
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）　　５０ｍＭ
ＭｇＣｌ２　　１０ｍＭ
ソルビトール　　１Ｍ
ＤＴＴ　　１ｘ
Ｂｒｅａｋａｇｅ　Ｂｕｆｆｅｒ：
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）　　１００ｍＭ
ＮａＣｌ　　１５０ｍＭ
ＤＴＴ　　１ｍＭ
Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）　　１ｘ
〔ゴム合成活性の測定（逆相ＴＬＣによる反応生成物の分析（ポリプレニル二リン酸））〕
回収した粗酵素溶液中のゴム合成活性を以下の方法により測定した。
まず、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ　７．５）２５ｍＭ、β－メルカプトエタノール　２５ｍＭ、ＫＦ　２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２　４ｍＭ、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）　１０μＭ、１－１４Ｃイソペンテニル二リン酸（［１－１４Ｃ］ＩＰＰ）（比活性：６０Ｃｉ／ｍｏｌ）５０μＭ、粗酵素溶液　５０μｇを混合した反応溶液（Ｔｏｔａｌ　１００μＬ）を調製し、３０℃で２０時間反応させた。
飽和食塩水２００μＬを加えて反応を停止し、ジエチルエーテルを１ｍＬ加えてボルテックスした。１５０００ｒｐｍで１分間遠心した後に上層（エーテル層）を別のチューブに回収した。水層に水飽和ブタノール１ｍＬを加えて攪拌し、その後１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離して上層（ブタノール層）を回収することで、酵素反応生成物を抽出した。
上記ブタノール層を水で洗浄した後、遠心エバポレーターを用いて溶媒を留去し、反応生成物を濃縮した。濃縮した反応生成物は以下に示す反応組成で３７℃、１２時間反応させることで脱リン酸化させ、対応するポリプレノールにした。
反応組成（Ｔｏｔａｌ　１００ｍＬ）：
Ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ　５．６）　　４０ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００　　０．１％（ｖ／ｖ）
メタノール　　４０％（ｖ／ｖ）
ブタノール層（反応生成物）　　２０％（ｖ／ｖ）
Ｐｏｔａｔｏ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）　　１０Ｕ
５Ｍ　ＮａＯＨを１２０μＬ加えることで反応を停止させるとともに、３７℃で３０分間加水分解反応を行った。ペンタンを０．７ｍＬ加えて攪拌し、ポリプレノールをペンタン層に抽出させた。１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離して上層（ペンタン層）を回収し、逆相ＴＬＣプレート（ＬＫＣ－１８、Ｗｈａｔｍａｎ社製）を用いて生成物を展開した。展開溶媒はアセトン／水（３９：１）とした。１４Ｃ標識放射性物質を含むインクでＯｒｉｇｉｎとＳｏｌｖｅｎｔ　Ｆｒｏｎｔの位置をマークし、Ｔｙｐｈｏｏｎ　ＦＬＡ　７０００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）によるオートラジオグラフィーを行い、放射性反応生成物のスポットの位置を標準物質の位置と比較することで生成物の鎖長を分析した。
結果、上記（１）～（３）のいずれのプラスミドを用いた場合にも、炭素数９０程度のイソプレン重合体が合成されていることが確認された。
＜大腸菌に導入した場合のＣＰＴファミリー蛋白質のゴム合成能＞
（参考例８）
〔大腸菌の形質転換〕
実施例１、３、５で得たｐＧＥＭ－ＨＲＴ１、ｐＢＳ－ＡｔＣＰＴ８、ｐＧＥＭ－ＨＲＴ２、及び、実施例１、３で得たｐＧＥＭ－ＨＲＴＢＰ、ｐＢＳ－ＡｔＬＥＷ１を用いて当該各遺伝子をｐＣＯＬＡＤｕｅｔ１ベクターにそれぞれ導入し、それらベクターを用いて以下の組み合わせとなるよう大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換を行った。
（１）ＨＲＴ１－ＨＲＴＢＰ
（２）ＨＲＴ２－ＨＲＴＢＰ
（３）ＡｔＣＰＴ８－ＡｔＬＥＷ１
〔大腸菌内でのゴム合成活性の測定〕
上記〔大腸菌の形質転換〕で得た形質転換された大腸菌を用いて、参考例７と同様にして、ゴム合成活性の測定を行った。結果、上記（１）～（３）のいずれのプラスミドを用いた場合にも、反応生成物が少なく、検出することができなかった。
参考例７～８のように、パラゴムノキ、又はシロイヌナズナ由来のＣＰＴファミリー蛋白質（ＨＲＴ１、ＨＲＴ２、ＡｔＣＰＴ８）を大腸菌に導入した場合には、反応生成物を確認することができなかった。次に、上記ＣＰＴファミリー蛋白質を酵母に導入した場合には、イソプレン重合体の合成が確認されたが、その鎖長は炭素数９０程度であった。
これに対して、実施例１～７、参考例１、５、６のように、上記ＣＰＴファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させてゴム合成活性を測定すると、いずれのＣＰＴファミリー蛋白質を用いた場合にも超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）の合成が見られた。すなわち、ゴム産生植物由来であって、乳管で発現しているといわれているＣＰＴファミリー蛋白質（ＨＲＴ１、ＨＲＴ２、ＣＰＴ３、ＣＰＴ５、ＬｓＣＰＴ３、ＴｂＣＰＴ１）だけでなく、ゴム産生植物ではないシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８、酵母由来のＳＲＴ１、ヒト由来のＨＤＳを用いた場合であっても、ゴム粒子に結合させると天然ゴムを合成することが可能であった。
これらの結果から、ＣＰＴファミリー蛋白質の由来や種類よりも、どのような宿主に導入したのか、すなわち、ＣＰＴファミリー蛋白質をどのような環境下に発現させたのかが、ゴム合成活性においては重要である、ということが示唆された。
上記内容から、本発明者らは、次のようなメカニズムを予想している。
すなわち、ＣＰＴファミリー蛋白質が合成する生成物が蓄積される場の、疎水度及びスペース（空間的広さ）が、合成される生成物の鎖長を決定している、と考えている。
具体的には、大腸菌のような原核生物中では、ＣＰＴファミリー蛋白質は反応生成物を確認できない程度の活性しか示さないか、活性を示し生成物を合成できたとしても、ＣＰＴファミリー蛋白質の疎水性クレフト構造内に収容可能な程度の大きさまでしか生成物の鎖長は延びない。
また、酵母のような真核生物中では、ＣＰＴファミリー蛋白質が合成した生成物はＣＰＴファミリー蛋白質の疎水性クレフト構造から細胞中の脂質二重膜内（例えば、小胞体膜間など）へ移行し、脂質二重膜内に蓄積されることになり、当該環境は疎水性環境であるが、細胞中の脂質二重膜内というスペースとしてはあまり広くないところに蓄積されることから生成物の鎖長の伸長には限度がある（このようにして合成されたのが、上述した炭素数が９０程度の鎖長のイソプレン重合体と考えられる）。
また、シロイヌナズナのようなゴム産生植物でない植物中でも、酵母のときと同様に、ＣＰＴファミリー蛋白質が合成した生成物は、細胞中の脂質二重膜内というスペースとしてはあまり広くないところに蓄積され、やはり合成される生成物の鎖長の伸長には限度があると考えられる。
これに対して、ＣＰＴファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させた場合には、図１に示したように、ＣＰＴファミリー蛋白質が合成した生成物はゴム粒子中に蓄積されることになり、当該環境は疎水性環境であり、かつ、スペースとしても細胞中の脂質二重膜内よりもずっと広いことから、疎水性環境であり、かつ、スペースの制約も少ないため、生成物の鎖長は充分に延びることができ、超長鎖のポリイソプレノイド（天然ゴム）を合成できる。
これらのことから、ＣＰＴファミリー蛋白質であれば、その由来、種類等に関わらず、ＮｇＢＲファミリー蛋白質と共にゴム粒子に結合させることで、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させることができ、本発明の効果を得ることができることが強く示唆される。
＜ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏによるＣＰＴファミリー蛋白質の保存領域の推定＞
図５で示される種々の生物由来のＣＰＴファミリー蛋白質のマルチプルシーケンスアライメントを行い、保存性の高い配列部分（保存領域）を検索した。保存領域周辺のアライメントの結果を図５に示す。
なお、マルチプルシーケンスアライメントは、Ｇｅｎｅｔｙｘ　Ｖｅｒ．１１と呼ばれるソフトを用いて行った。
図５中、ＵＤＰ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＣＰＴ）は、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）の７位から１２５位を抜粋したものである。
ＵＤＰ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｕｔｅｕｓ　Ｂ－Ｐ　２６　ＣＰＴ）は、配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）の１１位から１２９位を抜粋したものである。
ＳＲＴ１（Ｙｅａｓｔ　ＣＰＴ）は、配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１の５７位から１７５位を抜粋したものである。
ＡｔＣＰＴ５（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＣＰＴ５）は、配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５の６１位から１７９位を抜粋したものである。
ＡｔＣＰＴ８（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＣＰＴ８）は、配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８の２５位から１４２位を抜粋したものである。
ＤＤＰＳ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ　ＣＰＴ）は、配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳの２４位から１４０位を抜粋したものである。
ＨｂＣＰＴ１（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ　ＣＰＴ）は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１の２３位から１３９位を抜粋したものである。
ＨｂＣＰＴ２（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ　ＣＰＴ）は、配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２の２３位から１３９位を抜粋したものである。
ＨｂＣＰＴ３（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ　ＣＰＴ）は、配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３の２３位から１３９位を抜粋したものである。
ＨｂＣＰＴ４（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ　ＣＰＴ）は、配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４の２４位から１４０位を抜粋したものである。
ＨｂＣＰＴ５（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ　ＣＰＴ）は、配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５の２３位から１３９位を抜粋したものである。
ＬｓＣＰＴ３（Ｌａｃｔｕｃａ　ｓａｔｉｖａ　ＣＰＴ）は、配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３の４０位から１５６位を抜粋したものである。
ＴｂＣＰＴ１（Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ　ＣＰＴ）は、配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１の４０位から１５４位を抜粋したものである。
ＤＤＰＳ（Ｍｏｕｓｅ　ＣＰＴ）は、配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳの１６位から１３２位を抜粋したものである。
ＨＤＳ（Ｈｕｍａｎ　ＣＰＴ）は、配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳの１６位から１３２位を抜粋したものである。
Ｓｈｏｔａ　Ｅｎｄｏ　ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，Ｎｏ．１６２５（２００３）ｐ．２９１－２９５や、Ｍａｓａｈｉｒｏ　Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ　ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９８，Ｎｏ．８（２００１）ｐ．４３３７－４３４２等の文献から、図５中の囲みＡ（配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１においては、４１位から４９位に相当）、囲みＢ（配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１においては、８１位から９７位に相当）が種々の生物由来のＣＰＴファミリー蛋白質で保存性の高い保存領域の一部であり、特に、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位に相当する位置はアスパラギン酸残基が保存され（図５中の（１））、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４２位に相当する位置はグリシン残基が保存され（図５中の（２））、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４５位に相当する位置はアルギニン残基が保存され（図５中の（３））、パラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８９位に相当する位置はアスパラギン残基が保存されており（図５中の（４））、これらのアミノ酸が、ＣＰＴファミリー蛋白質の酵素反応に必須のアミノ酸であり、当該位置にこれらのアミノ酸を有する蛋白質であればＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を有すると考えられる。
図５から、以下のことが分かる。
配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４１位から４９位に相当する囲みＡの保存領域は、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２５位から３３位に相当し、
配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では２９位から３７位に相当し、
配列番号４７で示される酵母由来ＳＲＴ１では７５位から８３位に相当し、
配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では７９位から８７位に相当し、
配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４３位から５１位に相当し、
配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４２位から５０位に相当し、
配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４１位から４９位に相当し、
配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４１位から４９位に相当し、
配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４２位から５０位に相当し、
配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４１位から４９位に相当し、
配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では５８位から６６位に相当し、
配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では５８位から６６位に相当し、
配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３４位から４２位に相当し、
配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３４位から４２位に相当する。
配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において８１位から９７位に相当する囲みＢの保存領域は、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では６５位から８１位に相当し、
配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では６９位から８５位に相当し、
配列番号４７で示される酵母由来ＳＲＴ１では１１５位から１３１位に相当し、
配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では１１９位から１３５位に相当し、
配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では８４位から１００位に相当し、
配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは８２位から９８位に相当し、
配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では８１位から９７位に相当し、
配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では８１位から９７位に相当し、
配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では８２位から９８位に相当し、
配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では８１位から９７位に相当し、
配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では９８位から１１４位に相当し、
配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では９８位から１１４位に相当し、
配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは７４位から９０位に相当し、
配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは７４位から９０位に相当する。
配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４１位に相当するアスパラギン酸残基（１）は、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２５位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では２９位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７５位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では７９位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４３位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４２位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４１位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４１位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４２位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４１位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では５８位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では５８位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３４位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３４位のアスパラギン酸残基に相当する。
配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４２位に相当するグリシン残基（２）は、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２６位のグリシン残基に相当し、
配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では３０位のグリシン残基に相当し、
配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７６位のグリシン残基に相当し、
配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では８０位のグリシン残基に相当し、
配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４４位のグリシン残基に相当し、
配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４３位のグリシン残基に相当し、
配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４２位のグリシン残基に相当し、
配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４２位のグリシン残基に相当し、
配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４３位のグリシン残基に相当し、
配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４２位のグリシン残基に相当し、
配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では５９位のグリシン残基に相当し、
配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では５９位のグリシン残基に相当し、
配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３５位のグリシン残基に相当し、
配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３５位のグリシン残基に相当する。
配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４５位に相当するアルギニン残基（３）は、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２９位のアルギニン残基に相当し、
配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では３３位のアルギニン残基に相当し、
配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ1では７９位のアルギニン残基に相当し、
配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では８３位のアルギニン残基に相当し、
配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４７位のアルギニン残基に相当し、
配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４６位のアルギニン残基に相当し、
配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４５位のアルギニン残基に相当し、
配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４５位のアルギニン残基に相当し、
配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４６位のアルギニン残基に相当し、
配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４５位のアルギニン残基に相当し、
配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では６２位のアルギニン残基に相当し、
配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では６２位のアルギニン残基に相当し、
配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３８位のアルギニン残基に相当し、
配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３８位のアルギニン残基に相当する。
配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において８９位に相当するアスパラギン残基（４）は、配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では７３位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では７７位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では１２３位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では１２７位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では９２位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは９０位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では８９位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では８９位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では９０位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では８９位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では１０６位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では１０６位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは８２位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは８２位のアスパラギン残基に相当する。
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号３：パラゴムノキ由来のＨＲＴＢＰをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号４：パラゴムノキ由来のＨＲＴＢＰのアミノ酸配列
配列番号５：プライマー１
配列番号６：プライマー２
配列番号７：プライマー３
配列番号８：プライマー４
配列番号９：パラゴムノキ由来のＲｕｂｂｅｒ　Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号１０：パラゴムノキ由来のＳｍａｌｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　ＰａｒｔｉｃｌｅＰｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号１１：パラゴムノキ由来のＨｅｖｉｅｎ２．１をコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号１２：パラゴムノキ由来のＭＹＣ１　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号１３：レタス由来のＬｓＣＰＴ３をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１４：レタス由来のＬｓＣＰＴ３のアミノ酸配列
配列番号１５：レタス由来のＬｓＣＰＴＬ２をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１６：レタス由来のＬｓＣＰＴＬ２のアミノ酸配列
配列番号１７：プライマー５
配列番号１８：プライマー６
配列番号１９：プライマー７
配列番号２０：プライマー８
配列番号２１：シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２２：シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８のアミノ酸配列
配列番号２３：シロイヌナズナ由来のＡｔＬＥＷ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２４：シロイヌナズナ由来のＡｔＬＥＷ１のアミノ酸配列
配列番号２５：プライマー９
配列番号２６：プライマー１０
配列番号２７：パラゴムノキ由来のＲＥＦをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２８：パラゴムノキ由来のＲＥＦのアミノ酸配列
配列番号２９：プライマー１１
配列番号３０：プライマー１２
配列番号３１：パラゴムノキ由来のＨＲＴ２をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号３２：パラゴムノキ由来のＨＲＴ２のアミノ酸配列
配列番号３３：プライマー１３
配列番号３４：プライマー１４
配列番号３５：パラゴムノキ由来のＣＰＴ３をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号３６：パラゴムノキ由来のＣＰＴ３のアミノ酸配列
配列番号３７：パラゴムノキ由来のＣＰＴ４のアミノ酸配列
配列番号３８：プライマー１５
配列番号３９：プライマー１６
配列番号４０：パラゴムノキ由来のＣＰＴ５をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号４１：パラゴムノキ由来のＣＰＴ５のアミノ酸配列
配列番号４２：Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号４３：Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１のアミノ酸配列
配列番号４４：シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５のアミノ酸配列
配列番号４５：大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）のアミノ酸配列
配列番号４６：マイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）のアミノ酸配列
配列番号４７：酵母由来のＳＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号４８：タバコ由来のＤＤＰＳのアミノ酸配列
配列番号４９：マウス由来のＤＤＰＳのアミノ酸配列
配列番号５０：ヒト由来のＨＤＳのアミノ酸配列
配列番号５１：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位から４９位のアミノ酸配列
配列番号５２：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８１位から９７位のアミノ酸配列
配列番号５３：プライマー１７
配列番号５４：プライマー１８
配列番号５５：プライマー１９
配列番号５６：プライマー２０
配列番号５７：プライマー２１
配列番号５８：プライマー２２
配列番号５９：プライマー２３
配列番号６０：プライマー２４
配列番号６１：プライマー２５
配列番号６２：プライマー２６
配列番号６３：酵母由来のＳＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号６４：ヒト由来のＨＤＳをコードする遺伝子の塩基配列
 

Claims (19)

  1. 生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含むポリイソプレノイドの製造方法。
  2. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質が、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位、及びこれに相当する位置にアスパラギン酸残基を、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４２位、及びこれに相当する位置にグリシン残基を、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４５位、及びこれに相当する位置にアルギニン残基を、並びに、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８９位、及びこれに相当する位置にアスパラギン残基を、有するものである請求項１記載のポリイソプレノイドの製造方法。
  3. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位から４９位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ａ）：
    ＤＧＮＸ１ＲＸ２ＡＫＫ　　　（Ａ）
    （上記アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１及びＸ２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）、又は、該アミノ酸配列（Ａ）と、Ｘ１及びＸ２を除く７アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列である請求項１又は２記載のポリイソプレノイドの製造方法。
  4. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８１位から９７位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ｂ）：
    ＴＸ１１Ｘ１２ＡＦＳＸ１３Ｘ１４ＮＸ１５Ｘ１６ＲＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＥＶ　　　（Ｂ）
    （上記アミノ酸配列（Ｂ）中、Ｘ１１～Ｘ１９は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）、又は、該アミノ酸配列（Ｂ）と、Ｘ１１～Ｘ１９を除く８アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列である請求項１～３のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
  5. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種が、植物由来である請求項１～４のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
  6. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種が、パラゴムノキ由来である請求項５記載のポリイソプレノイドの製造方法。
  7. 前記結合工程が、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、及びＮｇＢＲファミリー蛋白質を結合させる工程である請求項１～６のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
  8. 前記無細胞蛋白合成溶液が、胚芽抽出物を含む請求項７記載のポリイソプレノイドの製造方法。
  9. 前記胚芽抽出物が、小麦由来である請求項８記載のポリイソプレノイドの製造方法。
  10. 前記無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が、５～５０ｇ／Ｌである請求項７～９のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
  11. 請求項１～１０のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
  12. 請求項１～１０のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。
  13. 乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結されたＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター。
  14. 乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーター、並びに、該プロモーターに機能的に連結されたシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びＮｏｇｏ－Ｂ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター。
  15. 前記乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターが、Ｒｕｂｂｅｒ　Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｓｍａｌｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｈｅｖｅｉｎ２．１（ＨＥＶ２．１）をコードする遺伝子のプロモーター、及び、ＭＹＣ１　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＣ１）をコードする遺伝子のプロモーターからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１３又は１４記載のベクター。
  16. 請求項１３～１５のいずれかに記載のベクターが導入された形質転換植物。
  17. 請求項１３～１５のいずれかに記載のベクターを植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法。
  18. 請求項１３～１５のいずれかに記載のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
  19. 請求項１３～１５のいずれかに記載のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。
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