WO2022091932A1 - イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途 - Google Patents

イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途 Download PDF

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史紀 米山
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    • C12Y205/0102—Rubber cis-polyprenylcistransferase (2.5.1.20)

Definitions

  • the present invention relates to a protein composition having isoprene polymerization activity and its use, and more particularly to a protein composition having isoprene polymerization activity, a lipid membrane construct and cells containing the same, and a method for producing an isoprene polymerization compound using the same. ..
  • Natural rubber is a substance containing cis-polyisoprene contained in the sap of rubber tree as the main component, and is widely used in various fields such as the automobile industry and the construction industry, and its demand is expanding worldwide. Since natural rubber is an agricultural product collected from rubber tree, there are problems such as unstable supply and variation in quality, which may pose a serious management risk. Therefore, attempts are being made to develop a technique for artificially producing natural rubber.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 describe the production of polyisoprenoids comprising a binding step of binding each gene expression product of a predetermined protein (HRT1, HRTBP and REF) involved in natural rubber biosynthesis to rubber particles in vitro. The method is described.
  • HRT1, HRTBP and REF predetermined protein
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 could not sufficiently produce polyisoprenoids and were insufficient for practical use. Further, according to such a technique, it is necessary to collect rubber particles from a plant, the process of collecting the rubber particles is complicated, and it is difficult to stabilize the quality of the rubber particles because it is an extract from a plant. There were also problems such as.
  • [1] to [24] are provided.
  • [1] (A-1) Selected from a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a protein containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and having the same activity as CPT6.
  • One or more proteins, or (A-2) One or more selected from a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and a protein containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and having the same activity as CPT7.
  • a protein composition having isoprene polymerization activity A polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 5 and encoding a protein having the same activity as CPT6.
  • (A-2) Being a protein encoded by one or more polynucleotides (a-1) selected from nucleotides, (A-2) is A polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 7 and encoding a protein having the same activity as CPT7.
  • C A protein selected from a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a protein containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having the same activity as CPT1 1 More proteins,
  • D One or more proteins selected from a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a protein containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having the same activity as CPT2.
  • (D) Being a protein encoded by one or more polynucleotides (c) selected from nucleotides, (D) is A polynucleotide encoding a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 3 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 3 and encoding a protein having the same activity as CPT2.
  • (E) Being a protein encoded by one or more polynucleotides (d) selected from nucleotides, (E) is A polynucleotide encoding a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 11 and encoding a protein having the same activity as REF1.
  • (F) Being a protein encoded by one or more polynucleotides (e) selected from nucleotides, (F) is A polynucleotide encoding a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 13 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 13 and having the same activity as REF2.
  • (G) Being a protein encoded by one or more polynucleotides (f) selected from nucleotides, (G) is A polynucleotide encoding a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 15 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 15 and having the same activity as REF8.
  • composition according to [4] which is at least one of.
  • [7] A lipid membrane construct containing the composition and phospholipid according to any one of [1] to [6].
  • the polynucleotide encoding the protein constituting the composition according to any one of [1] to [6] is expressed in a cell-free protein production system in the presence of a raw material containing a phospholipid.
  • the polynucleotide encoding the protein constituting the composition according to any one of [1] to [6] is (A-1) A polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 5 and having the same activity as CPT6.
  • the method for producing a lipid membrane construct according to [10] which comprises one or more polynucleotides selected from the encoding polynucleotides.
  • the polynucleotide is a polynucleotide encoding a protein constituting the composition according to [3] or [4].
  • C A polynucleotide encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 1 and having the same activity as CPT1.
  • polynucleotides selected from the encoding polynucleotides (D) A polynucleotide encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 3 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 3 and having the same activity as CPT2.
  • polynucleotides selected from the encoding polynucleotides (E) A polynucleotide encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 11 and having the same activity as REF1.
  • polynucleotides selected from the polynucleotides to encode (F) A polynucleotide encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 13 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 13 and having the same activity as REF2.
  • polynucleotides selected from the encoding polynucleotides (G) A protein encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 15 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 15 and having the same activity as REF8.
  • lipid membrane construct according to [10] or [11], further comprising at least one of one or more polynucleotides selected from polynucleotides encoding proteins encoded by nucleotides and having similar activity to SRPP1.
  • Method. [13] The method for producing a lipid membrane structure according to any one of [10] to [12], wherein the raw material containing a phospholipid contains a liposome and the lipid membrane structure is a proteoliposome.
  • the polynucleotide is (A-1) A polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 5 and having the same activity as CPT6.
  • the polynucleotide is a polynucleotide encoding a protein constituting the composition according to [3] or [4].
  • C A polynucleotide encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 1 and having the same activity as CPT1.
  • polynucleotides selected from the encoding polynucleotides (D) A polynucleotide encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 3 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 3 and having the same activity as CPT2.
  • polynucleotides selected from the encoding polynucleotides (E) A polynucleotide encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 11 and having the same activity as REF1.
  • polynucleotides selected from the encoding polynucleotides (F) A polynucleotide encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 13 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 13 and having the same activity as REF2.
  • polynucleotides selected from the encoding polynucleotides (G) A protein encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 15 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 15 and having the same activity as REF8.
  • polynucleotides selected from the encoding polynucleotides (h) a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 17, and a poly containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 17.
  • a method for producing an isoprene polymerized compound which comprises carrying out an isoprene polymerization reaction using at least one selected from the cells according to the section.
  • a kit for producing an isoprene polymerized compound which comprises at least one selected from the cells described in the section and a low molecular weight allyl compound.
  • a method for producing rubber which comprises producing rubber using an isoprene polymerized compound produced by the production method according to [21] or [22].
  • the protein composition of the present invention has isoprene polymerization activity.
  • the isoprene polymerization activity usually means an activity of directly or indirectly promoting the polymerization reaction of isoprene to produce an isoprene polymerized compound.
  • the isoprene polymerization reaction is usually an isoprene polymerization reaction in an organism.
  • the substrate include low isopentenyl diphosphate (IPP), farnesyl diphosphate (FPP), dimethylallyl diphosphate (DMAPP), geranyl diphosphate (GPP), and geranylgeranyl diphosphate (GGPP). Examples thereof include molecular weight allyl compounds.
  • Hevea genus plants for example, Hevea brasiliensis, Hevea benthamiana, Hevea guianensis
  • Ficus genus plants for example, Indo rubber noki (Ficus elastica), Kasiwa rubber Hevea brasiliensis (a plant having a natural rubber-producing ability), but is not limited to this, and also includes other plant cells, animal cells, and microorganisms.
  • the protein composition comprises at least one of the proteins (A-1) and (A-2) and the protein of (B): (A-1) One or more selected from a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a protein containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and having the same activity as CPT6. Protein; (A-2) One or more selected from a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and a protein containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and having the same activity as CPT7.
  • Protein and (B) a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and a protein containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and having the same activity as CPTL.
  • proteins One or more proteins.
  • amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6, 8 and 10 are the amino acid sequences of cis-prenyltransferase (CPT) 6, CPT7 and CPTL from Hevea brasiliensis, respectively.
  • the proteins (A-1), (A-2) and (B) may be proteins encoded by the polynucleotides (a-1), (a-2) and (b) encoding them, respectively: (A-1) A polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 5 and having the same activity as CPT6.
  • One or more polynucleotides selected from the polynucleotides encoding the protein (A-2) A polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 7 and having the same activity as CPT7.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 5, 7 and 9 are full-length base sequences of CPT6, CPT7 and CPTL derived from Hevea brasiliensis, respectively.
  • the protein composition may contain a protein other than the proteins of (A-1), (A-2) and (B).
  • proteins include proteins that are responsible for the isoprene polymerization reaction itself in vivo and proteins that are known to assist the polymerization reaction.
  • the former include CPT families other than CPT6, CPT7 and CPTL.
  • the latter includes, for example, at least one selected from the rubber elongation factor (REF) family and the small rubber partial protein (SRPP) family.
  • At least one selected from the proteins (C) to (H) is preferable: (C) One or more proteins selected from a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a protein containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having the same activity as CPT1. ; (D) One or more proteins selected from a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a protein containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having the same activity as CPT2.
  • Protein The amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 12, 14, 16 and 18 contain mature proteins of CPT1, CPT2, REF1, REF2, REF8 and SRPP1 from Hevea brasiliensis, respectively.
  • the proteins (C) to (H) may be proteins encoded by the polynucleotides (c) to (h) encoding each of them: (C) A polynucleotide encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 1 and having the same activity as CPT1.
  • polynucleotides selected from the polynucleotides to encode (D) A polynucleotide encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 3 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 3 and having the same activity as CPT2.
  • polynucleotides selected from the polynucleotides to encode (E) A polynucleotide encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 11 and having the same activity as REF1.
  • polynucleotides selected from the polynucleotides to encode (F) A polynucleotide encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 13 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 13 and having the same activity as REF2.
  • polynucleotides selected from the polynucleotides to encode (G) A protein encoded by a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 15 and a polynucleotide containing a base sequence having 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 15 and having the same activity as REF8.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 3, 11, 13, 15 and 17 are the full-length base sequences of CPT1, CPT2, REF1, REF2, REF8 and SRPP1 derived from Hevea brasiliensis, respectively.
  • the protein composition preferably contains 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more of the proteins (C) to (H), and at least one of (C) and (D) ( It is more preferable to include at least any combination of E) to (H), and it is further preferable to include all of them.
  • identity The identity of the amino acid sequence and the base sequence may be 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more. Identity can be determined under default conditions using, for example, NCBI BLAST (see http: //www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • Activity of mutant protein “Having similar activity” with each protein means, for example, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more of the activity of each protein when measured under the same conditions. It means having 95% or more or 100% or more activity.
  • the mutation may be introduced into a site in the catalytic domain and a site other than the catalytic domain.
  • the position of the amino acid residue into which the mutation may be introduced in the protein that can retain the desired activity can be identified by those skilled in the art. For example, one of ordinary skill in the art will compare 1) the amino acid sequences of multiple proteins with the same activity (eg, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 8 and the amino acid sequences of other proteins involved in the isoprene polymerization reaction). 2) Relatively conserved or unconserved areas, and then 3) Relatively conserved and unconserved areas that can and may play an important role in function. Since it is possible to predict areas that are not present, it is possible to recognize structural and / or functional correlations and identify sites where mutations may be introduced.
  • the mutation introduced into the protein may be a substitution of an amino acid residue with another amino acid residue, preferably a substitution with an amino acid residue having a similar side chain.
  • Classification of amino acids by amino acid residues having similar side chains includes, for example: amino acids having basic side chains such as lysine, arginine and histidine; amino acids having acidic side chains such as aspartic acid and glutamate.
  • Amino acids with non-polar polar chains such as asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine; amino acids with non-polar side chains such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • Amino acids having ⁇ -branched side chains such as leucine, valine, isoleucine
  • amino acids having aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine
  • hydroxyl group-containing side chains such as serine, threonine, and tyrosine (eg, alcohol)
  • Amino acids with phenoxy group-containing side chains such as cysteine and methionine.
  • the base sequence may be modified for the purpose of codon optimization.
  • Codon optimization as used herein means that the base sequence is modified to optimize expression in a particular target cell without altering the sequence of the encoded polypeptide.
  • the optimized base sequence can be easily determined by those skilled in the art by understanding the frequency of codon usage in the introduced cells and utilizing the degeneracy of the genetic code.
  • the target cells include microorganisms such as Escherichia coli, plant cells, and animal cells.
  • Each protein constituting the protein composition may have a purification tag near the C-terminal.
  • Purification tags include, for example, histidine tags; HA, FLAG, V5 and myc epitopes; chitin binding protein (CBP); maltose binding protein (MBP); glutathione-S-transferase. (Glutathione-s-transphase) (GST); and Strep tags.
  • the protein composition may contain factors directly or indirectly involved in the polymerization reaction of isoprene.
  • the lipid membrane structure of the present invention is a structure containing a lipid membrane containing the above protein composition.
  • the protein composition is likely to exhibit the isoprene polymerization activity, and efficient isoprene polymerization can be realized.
  • the lipid membrane may be a single membrane or a double membrane.
  • the single-layered structure include rubber particles (particles extracted from latex derived from rubber tree).
  • the double membrane construct include proteoliposomes and artificial lipid membrane models.
  • the artificial lipid membrane model may be composed of natural lipids, synthetic lipids, or both, and is not particularly limited.
  • a bilayer membrane construct is preferable, and proteoliposomes are more preferable.
  • proteoliposomes As used herein, the term proteoliposomal means an artificial vesicle in which a protein is encapsulated or bound to a part of the lipid bilayer membrane of the liposome.
  • a liposome means an artificial vesicle in which an aqueous component (usually water) is trapped in a space formed by being surrounded by a lipid bilayer membrane.
  • Lipid bilayer membranes are usually composed of lipids such as phospholipids. Phospholipids include, for example, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, cardiolipin, or combinations thereof.
  • Lipids other than phospholipids include, for example, triacylglycerols, waxes, sphingolipids and sterols and their fatty acid esters, or combinations thereof.
  • the lipid constituting the lipid bilayer preferably contains a phospholipid derived from a living body, and more preferably contains a phospholipid derived from soybean.
  • the size of the liposome is not particularly limited, but its diameter is usually 50 to 300 nm.
  • Liposomes may be of natural origin or synthesized, but the former is preferable, and plant-derived liposomes such as soybean are more preferable.
  • Examples of the synthesized liposome include polyalkylene glycol-based liposomes.
  • the present form of the protein composition in the membrane lipid construct is not particularly limited, but in the case of liposome, the form in which the protein composition is bound to the hydrophilic group portion of the phospholipid on the surface of the liposome (a part thereof is embedded inside the membrane). It is presumed that it is also good).
  • Examples of the method for producing a membrane lipid construct include a method including expression of a polynucleotide encoding a protein constituting the composition in a cell-free protein production system in the presence of a raw material containing a phospholipid.
  • the raw material containing phospholipids contains liposomes when the membrane construct is proteoliposomes.
  • the liposome as described above, a liposome of natural origin is preferable, and a liposome derived from a plant such as soybean is preferable.
  • the method for producing proteoliposomes preferably includes expressing the expression unit containing the polynucleotide in a cell-free protein production system in the presence of liposomes.
  • the expression unit contains at least a polynucleotide encoding each protein contained in the protein composition.
  • the polynucleotide is a polynucleotide encoding a protein constituting a protein composition, and contains the above-mentioned (a-1) or (a-2) and (b), and (c) to (h) as required. Further include at least one of.
  • Expression units usually include a promoter. Thereby, the expression product of the polynucleotide encoded by the polynucleotide can be efficiently produced.
  • the promoter examples include a tac promoter, a lac promoter, a trp promoter, a trc promoter, a T7 promoter, a T5 promoter, a T3 promoter, and an SP6 promoter, and may include enhancers.
  • the promoter may be ligated to the polynucleotide in a form capable of its expression, for example, ligated to the upstream (5') side of the coding sequence.
  • the expression unit may be DNA or RNA, but is preferably DNA.
  • the expression unit may include factors such as a terminator, a ribosome binding site, a drug resistance gene, an RNA processing signal, a sequence that improves translation efficiency, a sequence that enhances protein stability, and a sequence that enhances protein secretion.
  • the cell-free protein production system is preferably carried out by a dialysis layered method using a cell extract (for example, wheat germ extract, Escherichia coli extract, rabbit reticular red erythrocyte extract, insect cell extract), and is a commercially available protein. It can be performed according to the cell-free expression kit.
  • a cell extract for example, wheat germ extract, Escherichia coli extract, rabbit reticular red erythrocyte extract, insect cell extract
  • a commercially available protein for example, wheat germ extract, Escherichia coli extract, rabbit reticular red erythrocyte extract, insect cell extract
  • an artificial lipid membrane model may be used instead of the liposome.
  • the protein composition in the artificial lipid membrane model may be constructed according to a conventional method.
  • the artificial lipid membrane model may be composed of natural lipids, synthetic lipids, or both, and is not particularly limited.
  • the cell of the present invention is a cell that expresses each protein constituting the protein composition (protein of (A), (B) and, if necessary, at least one protein of (C) to (H)). ..
  • Examples of cells include, but are not limited to, microbial cells such as Escherichia coli and yeast, plant cells, and animal cells.
  • the cell preferably contains an expression unit containing the polynucleotide.
  • the expression unit is the same as described in the description of proteoliposomes.
  • the expression unit that the cell can contain is preferably a heterologous expression unit.
  • heterologous expression unit means that at least one of the polynucleotide encoding each protein and the promoter normally contained in the expression unit is not unique to the host cell. Preferably both are not unique to the host cell.
  • Examples of the method for producing cells include a method of transforming with an expression vector containing an expression unit containing a polynucleotide encoding each of the proteins constituting the above protein composition.
  • the expression vector may be one (including expression units containing polynucleotides encoding all proteins) or two or more (each or several). It may include an expression unit containing a polynucleotide of).
  • the expression vector may be an integrated vector or a non-integrated vector.
  • the polynucleotide may be placed under the control of a constitutive promoter or an inducible promoter.
  • Transformation of the host with an expression vector can be performed using one or more known methods. Examples of such a method include a calcium phosphate method, a liposome method, a DEAE dextran method, an electroporation method, a particle gun (gene gun) and the like.
  • a phage vector may be used to infect and introduce the cells into the cells.
  • the cell may be a cell containing the above-mentioned proteoliposomes.
  • the proteoliposomes are preferably made from naturally occurring liposomes. This makes it possible to easily promote the interaction with the cell membrane.
  • Cells containing proteoliposomes can be produced by interacting the two. Examples of the method of interaction include a method of adsorbing or binding a liposome to the cell surface, a method of incorporating the liposome into the cell (endocytosis or phagocytosis), and fusing the lipid bilayer membrane of the liposome with the cell membrane. The method can be mentioned.
  • the protein composition, proteoliposomes, and cells can be used for the production of isoprene polymerized compounds.
  • an isoprene polymerization reaction using a low molecular weight allyl compound as a substrate is performed.
  • the low molecular weight allylic compound include isoprenyl diphosphate and farnesyl diphosphate, and both of them are preferable.
  • Conditions such as reaction temperature and reaction time can be set as appropriate.
  • the typical isoprene polymerized compound include cis-polyisoprene, which is useful as a raw material for rubber.
  • isoprene polymerized compounds include dolichol, polyprenol, and derivatives thereof, which exhibit bioactivity (eg, immunological activity, antiviral activity, antioxidant activity) in the living body, and thus are therefore pharmaceutical and health. It is useful as a material for food. It can also be used as an additive for rubber products (for example, a plasticizer, a compatibilizer).
  • Kits typically include a low molecular weight allyl compound as a substrate. Further, it may contain a reaction vessel and necessary reagents.
  • the isoprene polymerized compound obtained by the above method for producing an isoprene polymerized compound can be used for producing rubber.
  • the procedure and conditions for producing the rubber from the isoprene polymerized compound may be according to a conventional method, and examples thereof include a method of kneading the isoprene polymerized compound, then crosslinking and molding.
  • Additives that can be used as needed include, for example, reinforcing agents, silane coupling agents, fillers, vulcanizers, vulcanization accelerators, vulcanization accelerator aids, oils, cured resins, waxes, anti-aging agents. Examples include agents and colorants. These additives may be added at the appropriate stages.
  • the obtained rubber can be used for various purposes such as tires, building materials, sports equipment, and automobile parts.
  • Examples 1 to 11 (1) Acquisition of natural rubber biosynthetic protein gene 7 proteins (CPT1, CPT2, CPTL) highly produced in latex from "Rubber Database” (http://Matsui-lab.riken.jp/rubber/home.html) , REF1, REF2, REF8, and SRPP1) were selected. In addition, two proteins (CPT6 and CPT7) were selected from the phylogenetic analysis.
  • the CPT1, CPT2, CPT6, CPT7, CPTL, REF1, REF2, REF8, and SRPP1 genes were obtained by PCR using the cDNA of the gene encoding each protein or the plasmid containing each gene as a template. PCR was carried out according to the instructions of PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara) or KOD One PCR Master Mix (TOYOBO), and restriction enzyme digestion sites and His tag sequences were added to the primers as necessary.
  • Primers 1 and 2 Primers 3 and 4, Primers 5 and 6, Primers 7 and 8, as primer sets for the acquisition of the CPT1, CPT2, CPT6, CPT7, CPTL, REF1, REF2, REF8, and SRPP1 genes, respectively.
  • Primers 9 and 10 primers 11 and 12, primers 13 and 14, primers 15 and 16, and primers 17 and 18 were used.
  • Primer 1 5'-atggaattatacaacgggtg-3'(SEQ ID NO: 19)
  • Primer 2 5'-atctcgagttaatgatgatgatgttttag-3'(SEQ ID NO: 20)
  • Primer 3 5'-atggaaatatatacgggtbag-3'(SEQ ID NO: 21)
  • Primer 4 5'-atctcgagttaatgatgatgatgattttaataatct-3'(SEQ ID NO: 22)
  • Primer 5 5'-atggaaaaacatagtagtag-3'(SEQ ID NO: 23)
  • Primer 6 5'-atctcgagtatataactgttttttct-3'(SEQ ID NO: 24)
  • Primer 7 5'-atgcaatcttgtgtgtg-3'(SEQ ID NO: 25)
  • Primer 8 5'-atctcgagttagttaggtctaccatag-3'(SEQ ID NO: 26)
  • Primer 9 5'-atggatttgaacctgg-3'(SEQ ID NO: 27)
  • Primer 10 5'-atctcgagttaatgatgatgatgtgtac-3'(SEQ ID NO: 28)
  • Primer 11 5'-atggctgaaggtgaagaagaggatatcc-3'(SEQ ID NO: 29)
  • Primer 12 5'-atctcggacccacctccatagaccac-3'(SEQ ID NO: 30)
  • Primer 13 5'-atggctgaagaacgaaccaacaag-3'(SEQ ID NO: 31)
  • Primer 14 5'-atctcgagtcatctccataaaacac-3'(SEQ ID NO: 32)
  • Primer 15 5'-atggctgaagggaaaagaagaatttc-3'(SEQ ID NO: 33)
  • Primer 16 5'-atctcgagttactctgcacttctctccac-3'(SEQ ID NO: 34)
  • Primer 17 5'-atggctgaagaggtggagaggagaggc-3'(SEQ ID NO: 35)
  • Primer 18 5'-atctcgagttatgccctcatccatcaac-3'(SEQ ID NO: 36)
  • the sequence was identified, and the full-length base sequence and amino acid sequence were identified.
  • the nucleotide sequences of the CPT1, CPT2, CPT6, CPT7, CPTL, REF1, REF2, REF8, and SRPP1 genes are shown in SEQ ID NOs: 1,3,5,7,9,11,13,15,17, respectively, and the amino acid sequences are shown respectively. It is shown in SEQ ID NO: 2,4,6,8,10,12,14,16,18.
  • Transformation of Escherichia coli The transformation of Escherichia coli JM109 was carried out using the plasmid prepared above, and the transformant was cultured on an LB agar medium containing ampicillin.
  • Example 3 9 kinds were added to the transcription reaction system in an amount of 1.5 ⁇ L each to a total of 13.5 ⁇ L. After completion of the synthesis reaction, a simple purification of Proteiniposome in which 9 kinds of proteins were bound to liposomes was performed according to the attached protocol, and the synthesis was confirmed by SDS-PAGE.
  • the isoprene polymerization activity of the cell-free synthesized protein was measured by the following method.
  • 100 ⁇ L of a reaction solution mixed with 5 ⁇ L Proteoliposome was prepared and reacted at 30 ° C. for 24 hours.
  • Comparative Example 1 (Negative Control) The same operation as in the above example was performed except that proteoliposomes were not added.
  • the radiation dose of each example is higher than that of the comparative example, and the product (estimated to have a molecular weight of about 1,000 to 2,000) is synthesized. Do you get it. Since the radiation doses of Example 1 which is a combination of CPT6 and CPTL and Example 2 which is a combination of CPT7 and CPTL are higher than those of Comparative Example, it was clarified that each combination exerts isoprene polymerization activity. In addition, since Examples 3 to 11 in which other proteins were further combined had higher radiation doses than Comparative Examples and some had higher radiation doses than Examples 1 and 2, proteins other than CPT6, 7 and CPTL were also included. , It became clear that it may promote the isoprene polymerization activity. The above results indicate that the present invention enables efficient production of natural rubber.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of CPT1 SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of CPT1 SEQ ID NO: 3: Nucleotide sequence of CPT2 SEQ ID NO: 4: Nucleotide sequence of CPT2 SEQ ID NO: 5: Nucleotide sequence of CPT6 SEQ ID NO: 6: Nucleotide sequence of CPT6 7: CPT7 base sequence SEQ ID NO: 8: CPT7 amino acid sequence SEQ ID NO: 9: CPTL base sequence SEQ ID NO: 10: CPTL amino acid sequence SEQ ID NO: 11: REF1 base sequence SEQ ID NO: 12: REF1 amino acid sequence SEQ ID NO: 13: REF2 base sequence SEQ ID NO: 14: REF2 amino acid sequence SEQ ID NO: 15: REF8 base sequence SEQ ID NO: 16: REF8 base sequence SEQ ID NO: 17: SRPP1 base sequence SEQ ID NO: 18: SRPP1 amino acid sequence SEQ ID NO: 19: Prime
  • SEQ ID NO: 20 Primer 2 (for CPT1 gene acquisition)
  • SEQ ID NO: 21 Primer 3 (for CPT2 gene acquisition)
  • SEQ ID NO: 22 Primer 4 (for CPT2 gene acquisition)
  • SEQ ID NO: 23 Primer 5 (for CPT6 gene acquisition)
  • SEQ ID NO: 24 Primer 6 (for CPT6 gene acquisition)
  • SEQ ID NO: 25 Primer 7 (for CPT7 gene acquisition)
  • SEQ ID NO: 26 Primer 8 (for CPT7 gene acquisition)
  • SEQ ID NO: 27 Primer 9 (for CPTL gene acquisition)
  • SEQ ID NO: 28 Primer 10 (for CPTL gene acquisition)
  • SEQ ID NO: 30 Primer 12 (for REF1 gene acquisition)
  • SEQ ID NO: 31 Primer 13 (for REF2 gene acquisition)
  • SEQ ID NO: 32 Primer 14 (for REF2 gene acquisition)

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Abstract

本発明は、天然ゴムを効率的に生産し、安定的な確保を実現するための手段を提供し、ゴム資源を安定的に確保することを目的とする。本発明は、（Ａ－１）ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質、又は、（Ａ－２）ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質と、（Ｂ）ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質とを含む、イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物、前記組成物を含む脂質膜構築体、その製造方法、前記組成物を構成するタンパク質を発現する細胞、その作製方法、及び、これらのいずれかを用いるイソプレン重合化合物の製造方法を提供する。

Description

イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途
　本発明は、イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途に関し、詳しくは、イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物、これを含む脂質膜構築物及び細胞、並びに、これを用いるイソプレン重合化合物の製造方法に関する。
　天然ゴムは、ゴムノキの樹液に含まれるシス－ポリイソプレンを主成分とする物質であり、自動車産業、建設産業等の各種分野で広く用いられ、世界的に需要が拡大している。天然ゴムは、ゴムノキから採取される農作物であるため、供給が不安定であり、品質にばらつきがある等の問題があり、重大な経営リスクとなるおそれもあった。そのため、天然ゴムを人工的に生産する技術の開発が試みられている。
　特許文献１及び非特許文献１には、生体外で、天然ゴム生合成に関わる所定のタンパク質（ＨＲＴ１、ＨＲＴＢＰ及びＲＥＦ）の各遺伝子発現産物をゴム粒子に結合させる結合工程を含むポリイソプレノイドの製造方法が記載されている。
特許第６５８６６９３号公報
Ｙａｍａｓｈｉｔａ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．ｅＬｉｆｅ　２０１６；５：ｅ１９０２２．ＤＯＩ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．１９０２２
　特許文献１及び非特許文献１記載の技術は、ポリイソプレノイドを十分に生産できず実用化するには不十分であった。また、斯かる技術によれば、ゴム粒子を植物から採取する必要があるところ、ゴム粒子の採取処理が煩雑であること、植物からの抽出物であるためゴム粒子の品質安定化が難しいこと、等の問題もあった。
　本発明は、天然ゴムを効率的に生産し、安定的な確保を実現するための手段を提供し、ゴム資源を安定的に確保することを目的とする。
　本発明によれば、以下の〔１〕～〔２４〕が提供される。
〔１〕（Ａ－１）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、又は、
　（Ａ－２）配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質と、
　（Ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質と、
を含む、イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物。
〔２〕（Ａ－１）が、
　配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ａ－１）によりコードされるタンパク質であること、
　（Ａ－２）が、
　配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ａ－２）によりコードされるタンパク質であること、及び
　（Ｂ）が、
　配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｂ）によりコードされるタンパク質であること
の少なくともいずれかである、〔１〕に記載の組成物。
〔３〕ＣＰＴ６、７及びＣＰＴＬ以外のＣＰＴファミリータンパク質、ＲＥＦファミリータンパク質、及びＳＲＰＰファミリータンパク質を更に含む、〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
　（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
　（Ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
　（Ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質、並びに、配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
　（Ｇ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、及び
　（Ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
　から選ばれる少なくとも１つを更に含む、〔１〕に記載の組成物。
〔５〕（Ｃ）が、
　配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｃ）によりコードされるタンパク質であること、
　（Ｄ）が、
　配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｄ）によりコードされるタンパク質であること、
　（Ｅ）が、
　配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｅ）によりコードされるタンパク質であること、
　（Ｆ）が、
　配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｆ）によりコードされるタンパク質であること、
　（Ｇ）が、
　配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｇ）によりコードされるタンパク質であること、及び、
　（Ｈ）が、
　配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｈ）によりコードされるタンパク質であること、
の少なくともいずれかである、〔４〕に記載の組成物。
〔６〕（Ａ）～（Ｈ）のタンパク質の少なくとも１つは、ゴムノキ由来のタンパク質である、〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔７〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の組成物及びリン脂質を含む脂質膜構築体。
〔８〕脂質二重膜構築体である、〔７〕に記載の構築体。
〔９〕プロテオリポソームである、〔７〕又は〔８〕に記載の構築体。
〔１０〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、リン脂質を含む原料の存在下、無細胞タンパク質生産系にて発現させることを含む、〔７〕～〔９〕のいずれか１項に記載の脂質膜構築体の製造方法。
〔１１〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、
（ａ－１）配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、又は
（ａ－２）配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと
を含む、〔１０〕に記載の脂質膜構築体の製造方法。
〔１２〕ポリヌクレオチドは、〔３〕又は〔４〕に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
（ｃ）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、及び
（ｈ）配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
の少なくともいずれかを更に含む、〔１０〕又は〔１１〕に記載の脂質膜構築体の製造方法。
〔１３〕リン脂質を含む原料はリポソームを含み、脂質膜構築体がプロテオリポソームである、〔１０〕～〔１２〕のいずれか１項に記載の脂質膜構築体の製造方法。
〔１４〕〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の組成物を構成するタンパク質を発現する細胞。
〔１５〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載のタンパク質組成物に含まれる各タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む〔１４〕に記載の細胞。
〔１６〕ポリヌクレオチドは、
（ａ－１）配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、又は
（ａ－２）配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと
を含む、〔１４〕又は〔１５〕に記載の細胞。
〔１７〕ポリヌクレオチドは、〔３〕又は〔４〕に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
（ｃ）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、及び
（ｈ）配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
の少なくともいずれかを更に含む、〔１４〕～〔１６〕のいずれか１項に記載の細胞。
〔１８〕発現単位が異種発現単位である、〔１４〕～〔１７〕のいずれか１項に記載の細胞。
〔１９〕〔９〕に記載の脂質膜構築体を含む、〔１４〕に記載の細胞。
〔２０〕〔９〕に記載の脂質膜構築体を細胞と相互作用させることを含む、〔１４〕に記載の細胞の作製方法。
〔２１〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の組成物、〔７〕～〔９〕のいずれか１項に記載の構築体、〔１４〕～〔１９〕のいずれか１項に記載の細胞から選ばれる少なくとも１つを用いてイソプレン重合反応を行うことを含む、イソプレン重合化合物の製造方法。
〔２２〕低分子量アリル化合物を基質としてイソプレン重合反応を行う、〔２１〕に記載の製造方法。
〔２３〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の組成物、〔７〕～〔９〕のいずれか１項に記載の構築体及び〔１４〕～〔１９〕のいずれか１項に記載の細胞から選ばれる少なくとも１つ、及び
　低分子量アリル化合物
を含む、イソプレン重合化合物製造用キット。
〔２４〕〔２１〕又は〔２２〕に記載の製造方法により製造されるイソプレン重合化合物を用いてゴムを製造することを含む、ゴムの製造方法。
　本発明によれば、天然ゴムを効率的に生産し、安定的な確保を実現することができ、世界的に需要が拡大しているゴム資源の安定的な確保の実現が期待できる。
〔タンパク質組成物〕
（イソプレン重合活性）
　本発明のタンパク質組成物は、イソプレン重合活性を有する。イソプレン重合活性とは、通常、イソプレンの重合反応を直接または間接的に促進しイソプレン重合化合物を生産する活性を意味する。イソプレンの重合反応とは、通常は、生物におけるイソプレンの重合反応である。基質としては、例えば、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）等の低分子量アリル化合物が挙げられる。
　生物としては例えば、Ｈｅｖｅａ属植物（例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｈｅｖｅａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｈｅｖｅａ　ｇｕｉａｎｅｎｓｉｓ）、Ｆｉｃｕｓ属植物（例えば、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ　ｅｌａｓｔｉｃａ）、カシワバゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ　ｌｙｒａｔａ）、ベンジャミンゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ　ｂｅｎｊａｍｉｎａ））等のゴムノキ（天然ゴム生産能を有する植物）が挙げられるが、これに限定されず、他の植物細胞、動物細胞、微生物も含まれる。
（タンパク質組成物を構成するタンパク質）
（（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質）
　タンパク質組成物は、（Ａ－１）及び（Ａ－２）のタンパク質の少なくともいずれかと、（Ｂ）のタンパク質とを含む：
　（Ａ－１）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；
　（Ａ－２）配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；及び
　（Ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質。
　配列番号６、８、１０のアミノ酸配列は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の、それぞれ、シス－プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）６、ＣＰＴ７、ＣＰＴＬのアミノ酸配列である。
　（Ａ－１）、（Ａ－２）及び（Ｂ）のタンパク質は、それぞれをコードする（ａ－１）、（ａ－２）及び（ｂ）のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質でもよい：
（ａ－１）配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；
（ａ－２）配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド。
　配列番号５、７、９で表される塩基配列は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の、それぞれ、ＣＰＴ６、ＣＰＴ７及びＣＰＴＬの完全長の塩基配列である。
（他のタンパク質）
　タンパク質組成物は、（Ａ－１）、（Ａ－２）及び（Ｂ）のタンパク質以外のタンパク質を含んでいてもよい。他のタンパク質としては、生体内でイソプレンの重合反応そのものを担うタンパク質及び重合反応を補助することが知られているタンパク質が挙げられる。前者としては、例えば、ＣＰＴ６、ＣＰＴ７及びＣＰＴＬ以外のＣＰＴファミリーが挙げられる。後者としては、例えば、ｒｕｂｂｅｒ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー、ｓｍａｌｌ　ｒｕｂｂｅｒ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）ファミリーから選ばれる少なくとも１つが挙げられる。中でも、（Ｃ）～（Ｈ）のタンパク質から選ばれる少なくとも１つが好ましい：
　（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；
　（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；
　（Ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；
　（Ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質、並びに、配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；
　（Ｇ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；及び
　（Ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質。
　配列番号２、４、１２、１４、１６、１８のアミノ酸配列は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の、それぞれ、ＣＰＴ１、ＣＰＴ２、ＲＥＦ１、ＲＥＦ２、ＲＥＦ８、ＳＲＰＰ１の成熟タンパク質を含む。
　（Ｃ）～（Ｈ）のタンパク質は、それぞれをコードする（ｃ）～（ｈ）のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質でもよい：
（ｃ）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；及び
（ｈ）配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド。
　配列番号１、３、１１、１３、１５及び１７で表される塩基配列は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の、それぞれ、ＣＰＴ１、ＣＰＴ２、ＲＥＦ１、ＲＥＦ２、ＲＥＦ８、及びＳＲＰＰ１の完全長の塩基配列である。
　タンパク質組成物は、（Ｃ）～（Ｈ）のタンパク質のうち、２種以上、３種以上、４種以上又は５種以上を含むことが好ましく、（Ｃ）及び（Ｄ）の少なくともいずれかと（Ｅ）～（Ｈ）の少なくともいずれかの組み合わせを含むことがより好ましく、すべてを含むことがさらに好ましい。
（同一性％）
　アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上であってもよい。同一性は、例えばＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）を用い、デフォルトの条件で決定できる。
（変異タンパク質が有する活性）
　各タンパク質と「同様の活性を有する」とは、同一条件で測定された場合、各タンパク質が有する活性の、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％以上の活性を有することを意味する。
（変異）
　上記タンパク質は、同様の活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、及び触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、タンパク質中の変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者であれば特定可能である。例えば、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号６又は８により表されるアミノ酸配列、及び他のイソプレン重合反応に関係するタンパク質のアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存され又はされていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域及び保存されていない領域から、機能に重要な役割を果たし得る領域及び果たし得ない領域を予測できるので、構造及び／又は機能の相関性を認識し、変異が導入されてもよい部位を特定できる。
　タンパク質に導入される変異は、アミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換でもよく、類似の側鎖を有するアミノ酸残基への置換が好ましい。類似の側鎖を有するアミノ酸残基によるアミノ酸の分類としては、例えば、以下が挙げられる：リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性側鎖を有するアミノ酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性側鎖を有するアミノ酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン等の非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等の非極性側鎖を有するアミノ酸；ロイシン、バリン、イソロイシン等のβ位分岐側鎖を有するアミノ酸；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン等の芳香族側鎖を有するアミノ酸；セリン、スレオニン、チロシン等のヒドロキシル基含有側鎖（例えば、アルコール、フェノキシ基含有側鎖）を有するアミノ酸；及びシステイン、メチオニン等の硫黄含有側鎖を有するアミノ酸。
　塩基配列は、コドン最適化を目的として改変されてもよい。本明細書においてコドン最適化とは、塩基配列が、コードされるポリペプチドの配列を変更することなく、ターゲットである特定の細胞における発現が最適化されるように改変されることを意味する。最適化後の塩基配列は、当業者であれば導入される細胞におけるコドン使用頻度を理解し、遺伝コードの縮重を活用することにより容易に決定できる。ターゲットである細胞としては、例えば、大腸菌等の微生物、植物細胞、動物細胞が挙げられる。
（タンパク質の修飾）
　タンパク質組成物を構成する各タンパク質は、Ｃ末端付近に精製用タグを有していてもよい。精製用タグとしては、例えば、ヒスチジンタグ；ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｖ５およびｍｙｃエピトープ、；キチン結合タンパク質（ｃｈｉｔｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＣＢＰ）；マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＢＰ）；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＧＳＴ）；及びＳｔｒｅｐタグが挙げられる。タンパク質組成物は、上記の他に、イソプレンの重合反応に直接または間接的に関与する因子を含んでもよい。
〔脂質膜構築体〕
　本発明の脂質膜構築体は、上記タンパク質組成物を含む、脂質膜を含む構築体である。脂質膜構築体を用いることにより、タンパク質組成物がイソプレンの重合活性を発揮しやすくなり、効率的なイソプレン重合が実現できる。
　脂質膜は、一重膜でも、二重膜でもよい。一重膜の構築体としては、例えば、ゴム粒子（ゴムノキ由来のラテックスから抽出される粒子）が挙げられる。二重膜の構築体としては、例えば、プロテオリポソーム、人工脂質膜モデルが挙げられる。人工脂質膜モデルは、天然の脂質、合成の脂質またはその両方から構成されていてもよく、特に限定されない。脂質膜構築体は、二重膜の構築体が好ましく、プロテオリポソームがより好ましい。
（プロテオリポソーム）
　本明細書においてプロテオリポソームとは、リポソームの脂質二重膜の一部にタンパク質が内包または結合された人工小胞を意味する。本明細書においてリポソームとは、脂質二重膜に囲まれて形成された空間に水性成分（通常、水）が捕捉された人工小胞を意味する。脂質二重膜は通常、リン脂質等の脂質により構成される。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、カルジオリピン、またはそれらの組合せが挙げられる。リン脂質以外の脂質としては例えば、トリアシルグリセロール、ワックス、スフィンゴ脂質およびステロールおよびそれらの脂肪酸エステル、またはそれらの組合せも挙げられる。脂質二重膜を構成する脂質は、生体由来のリン脂質を含むことが好ましく、ダイズ由来リン脂質を含むことがより好ましい。
　リポソームの大きさは、特に限定されないが、その直径は通常５０～３００ｎｍである。リポソームは、天然起源のものでもよいし合成されたものでもよいが、前者が好ましく、ダイズ等植物由来のものがより好ましい。合成されたリポソームとしては、例えば、ポリアルキレングリコール系のリポソームが挙げられる。
　膜脂質構築体におけるタンパク質組成物の存在形態は特に限定されないが、リポソームの場合、リポソーム表面のリン脂質の親水基の部分にタンパク質組成物が結合した形態（一部が膜内部に埋設されていてもよい）であると推測される。
（製造方法）
　膜脂質構築体の製造方法としては、例えば、組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、リン脂質を含む原料の存在下無細胞タンパク質生産系にて発現させることを含む方法が挙げられる。
　リン脂質を含む原料は、膜構築体がプロテオリポソームである場合、リポソームを含む。リポソームは、上述したように天然起源のリポソームが好ましく、ダイズ等植物由来のリポソームが好ましい。
　プロテオリポソームの製造方法は、前記ポリヌクレオチドを含む発現単位を、リポソームの存在下無細胞タンパク質生産系にて発現させることを含むことが好ましい。
　発現単位は、タンパク質組成物に含まれる各タンパク質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含む。ポリヌクレオチドは、タンパク質組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、上述の（ａ－１）又は（ａ－２）と（ｂ）を含み、必要に応じて（ｃ）～（ｈ）の少なくとも１つを更に含む。発現単位は、通常、プロモーターを含む。これによりポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現産物を効率よく生産され得る。プロモーターとしては、例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、及びＳＰ６プロモーターが挙げられ、エンハンサーを含み得る。プロモーターは、ポリヌクレオチドに、その発現が可能な形式で連結されていればよく、例えば、コード配列の上流（５´）側に連結される。発現単位はＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、好ましくはＤＮＡである。発現単位は、ターミネーター、リボソーム結合部位、薬物耐性遺伝子、ＲＮＡプロセシングシグナル、翻訳効率を向上させる配列、タンパク質の安定性を高める配列、タンパク質の分泌を高める配列等の因子を含んでもよい。
　無細胞タンパク質生産系は、細胞抽出液（例えば、コムギ胚芽抽出液、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、昆虫細胞抽出液）を用いて、透析重層法により実施することが好ましく、市販のタンパク質無細胞発現キットに沿って実施できる。
　なお、リポソームの代わりに、他のタンパク質構築システム、例えば人工脂質膜モデルを用いてもよい。人工脂質膜モデルにおけるタンパク質組成物の構築は、常法に従って行えばよい。なお、人工脂質膜モデルは、天然の脂質、合成の脂質またはその両方から構成されていてもよく、特に限定されない。
（細胞）
　本発明の細胞は、タンパク質組成物を構成する各タンパク質（（Ａ）、（Ｂ）のタンパク質、及び、必要に応じて（Ｃ）～（Ｈ）の少なくとも１つのタンパク質）を発現する細胞である。細胞としては、例えば大腸菌、酵母等の微生物細胞、植物細胞、動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞は、前記ポリヌクレオチドを含む発現単位を含むことが好ましい。発現単位は、プロテオリポソームの説明において説明したのと同様である。細胞が含み得る発現単位は、異種発現単位であることが好ましい。本明細書において異種発現単位とは、発現単位において、各タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び通常含まれるプロモーターの少なくとも一方が宿主細胞に固有のものではないものを意味する。好ましくは両方が宿主細胞に固有のものではない。
　細胞を製造する方法としては、例えば、上記タンパク質組成物を構成するタンパク質のそれぞれをコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む発現ベクターで形質転換する方法が挙げられる。タンパク質組成物は上述のとおり少なくとも２つのタンパク質を含むことから、発現ベクターは１つ（すべてのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む）でもよいし、２つ以上（それぞれの又はいくつかごとのポリヌクレオチドを含む発現単位を含む）でもよい。発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。発現ベクターにおいて、前記ポリヌクレオチドは、構成型プロモーター、又は誘導型プロモーターの制御下に配置され得る。
　発現ベクターによる宿主の形質転換は、１以上の公知の方法を用いて行うことができる。このような方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
　細胞は、上記のプロテオリポソームを含む細胞でもよい。プロテオリポソームは、天然起源のリポソームから作製されたものであることが好ましい。これにより、細胞膜との相互作用を容易に進めることができる。プロテオリポソームを含む細胞は、両者を相互作用させることによって製造できる。相互作用させる方法としては、例えば、リポソームを細胞表面へ吸着又は結合させる方法、リポソームを細胞内へ取り込ませる方法（エンドサイトーシスあるいはファゴサイトーシス）、リポソームの脂質二重膜と細胞膜とを融合させる方法が挙げられる。
〔イソプレン重合化合物の製造方法〕
　上記タンパク質組成物、プロテオリポソーム、及び細胞は、イソプレン重合化合物の製造に用いることができる。
　イソプレン重合化合物の製造においては、低分子量アリル性化合物を基質としたイソプレン重合反応を行う。低分子量アリル性化合物としては、例えば、イソプレニル二リン酸、ファルネシル二リン酸が挙げられ、これらの両方であることが好ましい。反応温度、反応時間等の条件は、適宜設定できる。代表的なイソプレン重合化合物としては、シス－ポリイソプレンが挙げられ、ゴムの原材料として有用である。イソプレン重合化合物の他の例としては、ドリコール、ポリプレノール、これらの誘導体が挙げられ、これらは生体において生理活性（例えば、免疫活性、抗ウイルス活性、抗酸化活性）を発揮することから医薬及び健康食品の材料として有用である。また、ゴム製品の添加剤（例えば、可塑剤、相溶化剤）としても利用できる。
〔イソプレン重合化合物の製造用キット〕
　上記タンパク質組成物、プロテオリポソーム、及び細胞は、イソプレン重合化合物の製造用キットとして用いることができる。キットは、通常、基質としての低分子量アリル化合物を含む。さらに、反応容器、必要な試薬を含んでもよい。
〔ゴムの製造方法〕
　上記イソプレン重合化合物の製造方法により得られるイソプレン重合化合物は、ゴムの製造に用いることができる。イソプレン重合化合物からゴムを製造する手順及び条件は、常法に従えばよく、例えば、イソプレン重合化合物を混練後、架橋及び成型する方法が挙げられる。必要に応じて用いることができる添加剤としては、例えば、補強剤、シランカップリング剤、充填剤、加硫剤、加硫促進剤、加硫促進助剤、オイル、硬化レジン、ワックス、老化防止剤、着色剤が挙げられる。これらの添加剤は、それぞれに応じた段階で添加すればよい。得られるゴムは、タイヤ、建材、スポーツ用品、自動車部品等の各種用途に利用できる。
実施例１～１１
（１）天然ゴム生合成タンパク質遺伝子の取得
　『Ｒｕｂｂｅｒ　Ｄａｔａｂａｓｅ』（ｈｔｔｐ://Ｍａｔｓｕｉ－ｌａｂ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｒｕｂｂｅｒ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）よりラテックス中で高生産される７タンパク質（ＣＰＴ１、ＣＰＴ２、ＣＰＴＬ、ＲＥＦ１、ＲＥＦ２、ＲＥＦ８、及びＳＲＰＰ１）を選抜した。また、系統解析から２タンパク質（ＣＰＴ６及びＣＰＴ７）を選抜した。
　各タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡ、あるいは各遺伝子を含んだプラスミドを鋳型としたＰＣＲによってＣＰＴ１、ＣＰＴ２、ＣＰＴ６、ＣＰＴ７、ＣＰＴＬ、ＲＥＦ１、ＲＥＦ２、ＲＥＦ８、及びＳＲＰＰ１遺伝子を取得した。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（Ｔａｋａｒａ）またはＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（ＴＯＹＯＢＯ）の説明書に従って反応を行い、プライマーには必要に応じて制限酵素消化サイト、Ｈｉｓタグ配列を付加した。
　ＣＰＴ１、ＣＰＴ２、ＣＰＴ６、ＣＰＴ７、ＣＰＴＬ、ＲＥＦ１、ＲＥＦ２、ＲＥＦ８、及びＳＲＰＰ１遺伝子のそれぞれの取得のためのプライマーセットとして、プライマー１および２、プライマー３および４、プライマー５および６、プライマー７および８、プライマー９および１０、プライマー１１および１２、プライマー１３および１４、プライマー１５および１６、プライマー１７および１８を用いた。
（ＣＰＴ１遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー１：５’－ａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇ－３’（配列番号１９）
プライマー２：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇｔｔｔｔａａｇ－３’（配列番号２０）
（ＣＰＴ２遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー３：５’－ａｔｇｇａａａｔａｔａｔａｃｇｇｇｔｃａｇ－３’（配列番号２１）
プライマー４：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇｔｔｔｔａａａｔａｔｔｃ－３’（配列番号２２）
（ＣＰＴ６遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー５：５’－ａｔｇｇａａａａａｃａｔａｇｃａｇｔａｇ－３’（配列番号２３）
プライマー６：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａｔａｔａａｃｔｇａｔｇｃｔｔｔｔｔｃ－３’（配列番号２４）
（ＣＰＴ７遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー７：５’－ａｔｇｃａａｔｃｃｔｔｇｃａｃｔｔｇ－３’（配列番号２５）
プライマー８：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇｔａａｇｔｃｇｔｃｔａｃｃａｔａｇ－３’（配列番号２６）
（ＣＰＴＬ遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー９：５’－ａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇ－３’（配列番号２７）
プライマー１０：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇｔｇｔａｃ－３’（配列番号２８）
（ＲＥＦ１遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー１１：５’－ａｔｇｇｃｔｇａａｇｇｔｇａａｇａａｇａｇｇｔｇａａｔａｔｃ－３’（配列番号２９）
プライマー１２：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｃａｃｃｃａｔｃｔｃｃａｔａｔａｇｃａｃ－３’（配列番号３０）
（ＲＥＦ２遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー１３：５’－ａｔｇｇｃｔｇａａｇａｃｇａａｇａｃａａｃｃａａｃａａｇ－３’（配列番号３１）
プライマー１４：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｃａａｔｔｃｔｃｔｃｃａｔａａａａｃａｃ－３’（配列番号３２）
（ＲＥＦ８遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー１５：５’－ａｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇａａａｇａａａａｃｇａｇａａｔｔｔｃ－３’（配列番号３３）
プライマー１６：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔｃｔｇｃａｃｔｔｔｃｃｔｔｃａｃ－３’（配列番号３４）
（ＳＲＰＰ１遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー１７：５’－ａｔｇｇｃｔｇａａｇａｇｇｔｇｇａｇｇａａｇａｇａｇｇｃ－３’（配列番号３５）
プライマー１８：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇａｔｇｃｃｔｃａｔｃｔｃｃａａａｃ－３’（配列番号３６）
　上述の方法により得られた各遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＣＰＴ１、ＣＰＴ２、ＣＰＴ６、ＣＰＴ７、ＣＰＴＬ、ＲＥＦ１、ＲＥＦ２、ＲＥＦ８、及びＳＲＰＰ１遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７に示し、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８に示した。
（２）無細胞タンパク質合成用プラスミドの作製
　上記（１）で獲得した各遺伝子のＰＣＲ反応産物をプライマーに付加した制限酵素ＸｈｏＩで処理したのち、表１の各組み合わせを選択し、ＥｃｏＲＶとＸｈｏＩで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳに挿入することで無細胞タンパク質合成用プラスミドを作製した。
（３）大腸菌の形質転換
　上記作製したプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーＰＣＲによって目的プラスミドが導入された形質転換体を選抜した。
（４）無細胞タンパク質合成法用プラスミドの作製
　目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔＧｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
（５）大腸菌の形質転換
　上記で作製したプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。
（６）無細胞タンパク質合成法用プラスミドの回収
　目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、１μｇ／μＬになるように調整した。
（７）透析重層法によるリポソーム共存下の膜タンパク質（プロテオリポソーム）合成
　ダイズ由来リン脂質で脂質二重膜（リポソーム：直径数百ｎｍ程度）を作製した。無細胞タンパク質合成は、ＰｒｏｔｅｏＬｉｐｏｓｏｍｅ　ＢＤ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（セルフリーサイエンス）に付属のプロトコルに従ってリポソーム添加条件で行った。鋳型となる９種タンパク質の発現用プラスミドは、１μｇ／μＬに調整したものを表１に示す組み合わせで用い、全量で約１３μＬとなるよう等量比で用いた。例えば、実施例３においては、９種を１．５μＬずつ、合計１３．５μＬとなるように転写反応系に加えた。合成反応終了後、付属のプロトコルに従い、リポソームに９種タンパク質が結合したＰｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅの簡易精製を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて合成の確認を行った。
（８）イソプレン重合活性の測定
　無細胞合成したタンパク質のイソプレン重合活性を以下の方法により測定した。
　終濃度５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、終濃度１０ｍＭ　ＭｇＣｌ2、終濃度２ｍＭ　ＤＴＴ、終濃度１０μＭファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、５０μＭ終濃度14Ｃ－イソペンテニル二リン酸（14Ｃ－ＩＰＰ）（比放射能：１．４８－２．２２　ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）、５μＬ　Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅを混合した反応溶液１００μＬを調製し、３０℃で２４時間反応させた。
　反応後、飽和食塩水を２００μＬ添加し、３００μＬの水飽和ｎ－ブタノールによって反応産物を抽出した。回収した水飽和ｎ－ブタノール層に４００μＬの２Ｍ　ＮａＣｌを添加、懸濁の後、水飽和ｎ－ブタノール層を回収した。回収した溶液５０　μＬにクリアゾルＩＩ（ナカライテスク）　５ｍＬを加え、よく混合した後に液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ－８０００；Ａｌｏｋａ）にて放射線量（ｄｐｍ）を測定した。Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅを添加していない反応系をネガティブコントロールとし、各種タンパク質を含んだＰｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅを使用した結果を表１に示す。
（９）イソプレン重合反応産物のＴＬＣラジオグラム
　上記で回収した水飽和ｎ－ブタノール溶液は遠心エバポレーターによって有機層を揮発させた。終濃度１００ｍＭ　酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、終濃度１Ｕ酸性ホスファターゼ、ジャガイモ由来、１ｍＬのメタノールを混合した反応溶液１．５ｍＬを加え、３７℃で１７時間反応させた。
　反応後、ヘキサン５００μＬで抽出し、得られたヘキサン層は遠心エバポレーターによって濃縮乾燥させた。乾燥物をヘキサン１０μＬによって再溶解し、全量をＴＬＣプレート（メルク社、ＴＬＣガラスプレート　ＲＰ－１８Ｆ２５４Ｓ　５×１０ｃｍ）にスポットした。アセトン：水＝１９：１にて展開したものをイメージングプレートに露光し、スキャナー（Ｔｙｐｈｏｏｎ　ＦＬＡ９５００）を用いて可視化した。
比較例１（ネガティブコントロール）
　プロテオリポソームを添加しなかったほかは、上記実施例と同様の操作を行った。
比較例２～９（ネガティブコントロール以外）
　各タンパク質の無細胞合成用プラスミドを１μｇ／μＬに調整した。反応におけるプラスミド総量を１３．５μＬとし、各プラスミドの添加量が等比となるように添加した。以降は、上記実施例と同様の操作を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から明らかなように、各実施例の放射線量は、比較例の放射線量と比較して高く、産物（分子量１，０００～２，０００程度と推測される）が合成されていることが分かった。ＣＰＴ６及びＣＰＴＬの組み合わせである実施例１、ＣＰＴ７及びＣＰＴＬの組み合わせである実施例２は、比較例よりも放射線量が高いことから、各組み合わせがイソプレン重合活性を発揮することが明らかとなった。また、更に他のタンパク質を組み合わせた実施例３～１１も比較例より放射線量が高く、実施例１及び２よりも放射線量が高いものがあったことから、ＣＰＴ６，７，ＣＰＴＬ以外のタンパク質も、イソプレン重合活性を促進する可能性があることが明らかとなった。
　以上の結果は、本発明により天然ゴムの効率的な生産が可能であることを示している。
配列番号１：ＣＰＴ１の塩基配列
配列番号２：ＣＰＴ１のアミノ酸配列
配列番号３：ＣＰＴ２の塩基配列
配列番号４：ＣＰＴ２のアミノ酸配列
配列番号５：ＣＰＴ６の塩基配列
配列番号６：ＣＰＴ６のアミノ酸配列
配列番号７：ＣＰＴ７の塩基配列
配列番号８：ＣＰＴ７のアミノ酸配列
配列番号９：ＣＰＴＬの塩基配列
配列番号１０：ＣＰＴＬのアミノ酸配列
配列番号１１：ＲＥＦ１の塩基配列
配列番号１２：ＲＥＦ１のアミノ酸配列
配列番号１３：ＲＥＦ２の塩基配列
配列番号１４：ＲＥＦ２のアミノ酸配列
配列番号１５：ＲＥＦ８の塩基配列
配列番号１６：ＲＥＦ８のアミノ酸配列
配列番号１７：ＳＲＰＰ１の塩基配列
配列番号１８：ＳＲＰＰ１のアミノ酸配列
配列番号１９：プライマー１（ＣＰＴ１遺伝子取得用）
配列番号２０：プライマー２（ＣＰＴ１遺伝子取得用）
配列番号２１：プライマー３（ＣＰＴ２遺伝子取得用）
配列番号２２：プライマー４（ＣＰＴ２遺伝子取得用）
配列番号２３：プライマー５（ＣＰＴ６遺伝子取得用）
配列番号２４：プライマー６（ＣＰＴ６遺伝子取得用）
配列番号２５：プライマー７（ＣＰＴ７遺伝子取得用）
配列番号２６：プライマー８（ＣＰＴ７遺伝子取得用）
配列番号２７：プライマー９（ＣＰＴＬ遺伝子取得用）
配列番号２８：プライマー１０（ＣＰＴＬ遺伝子取得用）
配列番号２９：プライマー１１（ＲＥＦ１遺伝子取得用）
配列番号３０：プライマー１２（ＲＥＦ１遺伝子取得用）
配列番号３１：プライマー１３（ＲＥＦ２遺伝子取得用）
配列番号３２：プライマー１４（ＲＥＦ２遺伝子取得用）
配列番号３３：プライマー１５（ＲＥＦ８遺伝子取得用）
配列番号３４：プライマー１６（ＲＥＦ８遺伝子取得用）
配列番号３５：プライマー１７（ＳＲＰＰ１遺伝子取得用）
配列番号３６：プライマー１８（ＳＲＰＰ１遺伝子取得用）

Claims (24)

  1. 　（Ａ－１）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、又は、
    　（Ａ－２）配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質と、
    　（Ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質と、
    を含む、イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物。
  2. 　（Ａ－１）が、
    　配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ａ－１）によりコードされるタンパク質であること、
    　（Ａ－２）が、
    　配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ａ－２）によりコードされるタンパク質であること、及び
    　（Ｂ）が、
    　配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｂ）によりコードされるタンパク質であること
    の少なくともいずれかである、請求項１に記載の組成物。
  3. 　ＣＰＴ６、７及びＣＰＴＬ以外のＣＰＴファミリータンパク質、ＲＥＦファミリータンパク質、及びＳＲＰＰファミリータンパク質を更に含む、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
    　（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
    　（Ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
    　（Ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質、並びに、配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
    　（Ｇ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、及び
    　（Ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質
    　から選ばれる少なくとも１つを更に含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 　（Ｃ）が、
    　配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｃ）によりコードされるタンパク質であること、
    　（Ｄ）が、
    　配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｄ）によりコードされるタンパク質であること、
    　（Ｅ）が、
    　配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｅ）によりコードされるタンパク質であること、
    　（Ｆ）が、
    　配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌＦクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｆ）によりコードされるタンパク質であること、
    　（Ｇ）が、
    　配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｇ）によりコードされるタンパク質であること、及び、
    　（Ｈ）が、
    　配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｈ）によりコードされるタンパク質であること、
    の少なくともいずれかである、請求項４に記載の組成物。
  6. 　（Ａ）～（Ｈ）のタンパク質の少なくとも１つは、ゴムノキ由来のタンパク質である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物及びリン脂質を含む脂質膜構築体。
  8. 　脂質二重膜構築体である、請求項７に記載の構築体。
  9. 　プロテオリポソームである、請求項７又は８に記載の構築体。
  10. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、リン脂質を含む原料の存在下、無細胞タンパク質生産系にて発現させることを含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の脂質膜構築体の製造方法。
  11. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、
    （ａ－１）配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、又は
    （ａ－２）配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと、
    （ｂ）配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと
    を含む、請求項１０に記載の脂質膜構築体の製造方法。
  12. 　ポリヌクレオチドは、請求項３又は４に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    （ｃ）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
    （ｄ）配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
    （ｅ）配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
    （ｆ）配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
    （ｇ）配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、及び
    （ｈ）配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
    の少なくともいずれかを更に含む、請求項１０又は１１に記載の脂質膜構築体の製造方法。
  13. 　リン脂質を含む原料はリポソームを含み、脂質膜構築体がプロテオリポソームである、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の脂質膜構築体の製造方法。
  14. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物を構成するタンパク質を発現する細胞。
  15. 　請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質組成物に含まれる各タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む請求項１４に記載の細胞。
  16. 　ポリヌクレオチドは、
    （ａ－１）配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、又は
    （ａ－２）配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと、
    （ｂ）配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと
    を含む、請求項１４又は１５に記載の細胞。
  17. 　ポリヌクレオチドは、請求項３又は４に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    （ｃ）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
    （ｄ）配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
    （ｅ）配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
    （ｆ）配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、
    （ｇ）配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、及び
    （ｈ）配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
    の少なくともいずれかを更に含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の細胞。
  18. 　発現単位が異種発現単位である、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の細胞。
  19. 　請求項９に記載の脂質膜構築体を含む、請求項１４に記載の細胞。
  20. 　請求項９に記載の脂質膜構築体を細胞と相互作用させることを含む、請求項１４に記載の細胞の作製方法。
  21. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物、請求項７～９のいずれか１項に記載の構築体、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の細胞から選ばれる少なくとも１つを用いてイソプレン重合反応を行うことを含む、イソプレン重合化合物の製造方法。
  22. 　低分子量アリル化合物を基質としてイソプレン重合反応を行う、請求項２１に記載の製造方法。
  23. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物、請求項７～９のいずれか１項に記載の構築体及び請求項１４～１９のいずれか１項に記載の細胞から選ばれる少なくとも１つ、及び
    　低分子量アリル化合物
    を含む、イソプレン重合化合物製造用キット。
  24. 　請求項２１又は２２に記載の製造方法により製造されるイソプレン重合化合物を用いてゴムを製造することを含む、ゴムの製造方法。
PCT/JP2021/038921 2020-10-30 2021-10-21 イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途 WO2022091932A1 (ja)

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