CN115698293A

CN115698293A - 具有异戊二烯聚合活性的蛋白质组合物及其用途

Info

Publication number: CN115698293A
Application number: CN202180035798.1A
Authority: CN
Inventors: 今井俊辅; 米山史纪; 胁坂治
Original assignee: Sumitomo Riko Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Riko Co Ltd
Priority date: 2020-10-30
Filing date: 2021-10-21
Publication date: 2023-02-03
Also published as: EP4151731A1; WO2022091932A1; JP2022073233A; EP4151731A4; US20230065493A1

Abstract

本发明提供一种有效率地生产天然橡胶和实现稳定确保的手段，以稳定确保橡胶资源为目的。本发明提供具有异戊二烯聚合活性的包含(A‑1)具有与CPT6同样活性的蛋白质或(A‑2)具有与CPT7同样活性的蛋白质且包含(B)具有与CPTL同样活性的蛋白质的蛋白质组合物、包含上述组合物的脂质膜构建体、其制造方法、表达构成上述组合物的蛋白质的细胞、其制备方法、以及使用这些中任一种的异戊二烯聚合化合物的制造方法。

Description

具有异戊二烯聚合活性的蛋白质组合物及其用途

技术领域

本发明涉及具有异戊二烯聚合活性的蛋白质组合物及其用途，详细地，涉及具有异戊二烯聚合活性的蛋白质组合物、包含其的脂质膜构建物及细胞、以及使用其的异戊二烯聚合化合物的制造方法。

背景技术

天然橡胶是以橡胶树的树液中所含的顺式-聚异戊二烯为主要成分的物质，广泛用于汽车产业、建设产业等各种领域，全球需求正在扩大。由于天然橡胶是从橡胶树中采集的农作物，所以存在供给不稳定、品质有偏差等问题，也有可能构成重大的经营风险。因此，正在尝试着开发人工生产天然橡胶的技术。

在专利文献1和非专利文献1中，记载了包括在生物体外使与天然橡胶生物合成有关的规定的蛋白质(HRT1、HRTBP及REF)的各基因表达产物与橡胶粒子结合的结合工序的聚类异戊二烯的制造方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：专利第6586693号公报

非专利文献

非专利文献1：Yamashita s.Et al.eLife 2016；5：e19022.DOI：10.7554/eLife.19022

发明内容

发明要解决的课题

专利文献1及非专利文献1记载的技术不能充分生产聚类异戊二烯，不能充分实用化。此外，根据这样的技术，还存在如下问题。即，需要从植物中采集橡胶粒子时，橡胶粒子的采集处理复杂；由于是来自植物的提取物，所以橡胶粒子的品质稳定化困难等问题。

本发明提供一种有效率地生产天然橡胶、实现稳定确保的手段，以稳定确保橡胶资源为目的。

用于解决课题的手段

根据本发明，提供以下[1]～[24]。

[1]一种蛋白质组合物，其具有异戊二烯聚合活性，其中所述蛋白质组合物包含：

(A-1)选自包含序列号6的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号6的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与CPT6同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质，或

(A-2)选自包含序列号8的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号8的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与CPT7同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质，

并且，所述蛋白质组合物包含：

(B)选自包含序列号10的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号10的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与CPTL同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质。

[2]根据[1]所述的组合物，其满足以下至少任一种，

(A-1)为多核苷酸(a-1)编码的蛋白质，所述多核苷酸(a-1)选自包含序列号5的碱基序列的多核苷酸及包含与序列号5的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列且编码具有与CPT6同样活性的蛋白质的多核苷酸中的1种以上，

(A-2)为多核苷酸(a-2)编码的蛋白质，所述多核苷酸(a-2)选自包含序列号7的碱基序列的多核苷酸及包含与序列号7的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列且编码具有与CPT7同样活性的蛋白质的多核苷酸中的1种以上，以及

(B)为多核苷酸(b)编码的蛋白质，所述多核苷酸(b)选自包含序列号9的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号9的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与CPTL同样的活性。

[3]根据[1]或[2]所述的组合物，其进一步包含CPT6、7及CPTL以外的CPT家族蛋白质、REF家族蛋白质及SRPP家族蛋白质。

[4]根据[1]所述的组合物，其进一步包含以下中的至少1个，

(C)选自包含序列号2的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号2的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与CPT1同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质，

(D)选自包含序列号4的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号4的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与CPT2同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质，

(E)选自包含序列号12的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号12的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与REF1同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质，

(F)选自包含序列号14的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号14的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与REF2同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质，

(G)选自包含序列号16的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号16的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与REF8同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质，以及

(H)选自包含序列号18的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号18的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与SRPP1同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质。

[5]根据[4]所述的组合物，其满足以下至少任一种，

(C)为多核苷酸(c)编码的蛋白质，所述多核苷酸(c)选自包含序列号1的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号1的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与CPT1同样的活性，

(D)为多核苷酸(d)编码的蛋白质，所述多核苷酸(d)选自包含序列号3的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号3的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与CPT2同样的活性，

(E)为多核苷酸(e)编码的蛋白质，所述多核苷酸(e)选自包含序列号11的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号11的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与REF1同样的活性，

(F)为多核苷酸(f)编码的蛋白质，所述多核苷酸(f)选自包含序列号13的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号13的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与REF2同样的活性，

(G)为多核苷酸(g)编码的蛋白质，所述多核苷酸(g)选自包含序列号15的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号15的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与REF8同样的活性，以及

(H)为多核苷酸(h)编码的蛋白质，所述多核苷酸(h)选自包含序列号17的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号17的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与SRPP1同样活性。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述组合物，其中，

(A)～(H)的蛋白质的至少1种为来自橡胶树的蛋白质。

[7]一种脂质膜构建体，其包含[1]～[6]中任一项所述组合物及磷脂。

[8]根据[7]所述的构建体，其为脂质双层膜构建体。

[9]根据[7]或[8]所述的构建体，其为脂蛋白体。

[10]一种脂质膜构建体的制造方法，其中，

所述脂质膜构建体为[7]～[9]中任一项所述的脂质膜构建体，

所述方法包括在包含磷脂的原料的存在下，使编码构成[1]～[6]中任一项所述组合物的蛋白质的多核苷酸在无细胞蛋白质生产体系中表达的工序。

[11]根据[10]所述的脂质膜构建体的制造方法，其中，

编码构成[1]～[6]中任一项所述组合物的蛋白质的多核苷酸包含：

(a-1)选自包含序列号5的碱基序列的多核苷酸及包含与序列号5的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列且编码具有与CPT6同样活性的蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，或

(a-2)选自包含序列号7的碱基序列的多核苷酸及包含与序列号7的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列且编码具有与CPT7同样活性的蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，以及

(b)选自包含序列号9的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号9的碱基序列具有90％以上同-性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与CPTL同样的活性。

[12]根据[10]或[11]所述的脂质膜构建体的制造方法，其中，

多核苷酸为编码构成[3]或[4]所述组合物的蛋白质的多核苷酸，进一步包含：

(c)选自包含序列号1的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号1的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与CPT1同样的活性，

(d)选自包含序列号3的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号3的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与CPT2同样的活性，

(e)选自包含序列号11的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号11的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与REF1同样的活性，

(f)选自包含序列号13的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号13的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与REF2同样的活性，

(g)选自包含序列号15的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号15的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与REF8同样的活性，以及

(h)选自包含序列号17的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号17的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与SRPP1同样的活性。

[13]根据[10]～[12]中任一项所述的脂质膜构建体的制造方法，其中，包含磷脂的原料含有脂质体，脂质膜构建体为脂蛋白体。

[14]一种细胞，其表达构成[1]～[5]中任一项所述组合物的蛋白质。

[15]根据[14]所述的细胞，其包含表达单元，所述表达单元包含编码[1]～[6]中任一项所述蛋白质组合物中所含的各蛋白质的多核苷酸。

[16]根据[14]或[15]所述的细胞，其中，多核苷酸为：

(b)选自包含序列号9的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号9的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与CPTL同样的活性。

[17]根据[14]～[16]中任一项所述的细胞，其中，多核苷酸为编码构成[3]或[4]所述组合物的蛋白质的多核苷酸，进一步包含以下至少任一种，

[18]根据[14]～[17]中任一项所述的细胞，其中，表达单元为异种表达单元。

[19]根据[14]所述的细胞，其包含[9]所述的脂质膜构建体。

[20]一种细胞的制备方法，其中，所述细胞为[14]所述的细胞，

所述方法包括使[9]所述的脂质膜构建体与细胞相互作用的工序。

[21]一种异戊二烯聚合化合物的制造方法，其包括使用选自[1]～[6]中任一项所述的组合物、[7]～[9]中任一项所述的构建体、[14]～[19]中任一项所述的细胞中的至少1种进行异戊二烯聚合反应的工序。

[22]根据[21]所述的制造方法，其中，以低分子量烯丙基化合物作为底物进行异戊二烯聚合反应。

[23]一种用于制造异戊二烯聚合化合物的试剂盒，其包含：

选自[1]～[6]中任一项所述的组合物、[7]～[9]中任一项所述的构建体及[14]～[19]中任一项所述的细胞中的至少1种，以及低分子量烯丙基化合物。

[24]一种橡胶的制造方法，其包括使用通过[21]或[22]所述的制造方法制造的异戊二烯聚合化合物制造橡胶的工序。

发明效果

根据本发明，能够有效率地生产天然橡胶、实现稳定确保，能够期待全球需求正大扩大的橡胶资源的稳定确保。

发明的具体实施方式

[蛋白质组合物]

(异戊二烯聚合活性)

本发明的蛋白质组合物具有异戊二烯聚合活性。异戊二烯聚合活性通常是指直接或间接促进异戊二烯的聚合反应而生产异戊二烯聚合化合物的活性。异戊二烯的聚合反应通常是异戊二烯在生物中的聚合反应。作为底物，可举出例如异戊烯基二磷酸(IPP)、法尼基二磷酸(FPP)、二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)、香叶基二磷酸(GPP)、香叶基香叶基二磷酸(GGPP)等低分子量烯丙基化合物。

作为生物，可举出例如Hevea属植物(例如，巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)、Hevea benthamiana、Hevea guianensis)、Ficus属植物(例如，印度橡胶树(Ficuselastica)、柏叶橡胶树(Ficus lyrata)、本杰明橡胶树(Ficus benjamina)等橡胶树(具有天然橡胶生产能力的植物)，但并不限定于此，也包括其他植物细胞、动物细胞、微生物。

(构成蛋白质组合物的蛋白质)

((A)及(B)的蛋白质)

蛋白质组合物包含(A-1)及(A-2)的蛋白质的至少任一种和(B)的蛋白质：

(A-1)选自包含序列号6的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号6的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与CPT6同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质；

(A-2)选自包含序列号8的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号8的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与CPT7同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质；以及

序列号为6、8、10的氨基酸序列分别是来自巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)的顺式-异戊烯基转移酶(CPT)6、CPT7、CPTL的氨基酸序列。

(A-1)、(A-2)及(B)的蛋白质可以是编码各自蛋白质的(a-1)、(a-2)及(b)的多核苷酸编码的蛋白质：

(a-1)选自包含序列号5的碱基序列的多核苷酸及包含与序列号5的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列且编码具有与CPT6同样活性的蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸；

(a-2)选自包含序列号7的碱基序列的多核苷酸及包含与序列号7的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列且编码具有与CPT7同样活性的蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸；以及

由序列号5、7、9表示的碱基序列分别是来自巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)的CPT6、CPT7和CPTL的完整长度的碱基序列。

(其他蛋白质)

蛋白质组合物可以包含(A-1)、(A-2)及(B)的蛋白质以外的蛋白质。作为其他蛋白质，可举出在生物体内负责异戊二烯的聚合反应本身的蛋白质和已知辅助聚合反应的蛋白质。作为前者，可举出例如CPT6、CPT7及CPTL以外的CPT家族。作为后者，可举出例如选自橡胶延伸因子(rubber elongation factor，REF)家族、小橡胶粒子蛋白质(small rubberparticle protein，SRPP)家族中的至少1个。其中，优选选自(C)～(H)的蛋白质中的至少1个：

(C)选自包含序列号2的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号2的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与CPT1同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质；

(D)选自包含序列号4的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号4的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与CPT2同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质；

(E)选自包含序列号12的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号12的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与REF1同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质；

(F)选自包含序列号14的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号14的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与REF2同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质；

(G)选自包含序列号16的氨基酸序列的蛋白质及包含与序列号16的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有与REF8同样活性的蛋白质中的1种以上的蛋白质；以及

序列号2、4、12、14、16、18的氨基酸序列分别包含来自巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)的CPT1、CPT2、REF1、REF2、REF8、SRPP1的成熟蛋白质。

(C)～(H)的蛋白质可以是编码各自蛋白质的(c)～(h)的多核苷酸编码的蛋白质：

(c)选自包含序列号1的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号1的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与CPT1同样的活性；

(d)选自包含序列号3的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号3的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与CPT2同样的活性；

(e)选自包含序列号11的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号11的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与REF1同样的活性；

(f)选自包含序列号13的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号13的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与REF2同样的活性；

(g)选自包含序列号15的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号15的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与REF8同样的活性；以及

由序列号1、3、11、13、15及17表示的碱基序列分别是来自巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)的CPTI、CPT2、REF1、REF2、REF8及SRPP1的完整长度的碱基序列。

蛋白质组合物优选包含在(C)～(H)的蛋白质中的2种以上、3种以上、4种以上或5种以上，更优选包含(C)及(D)中的至少任一种与(E)～(H)中的至少任一种的组合，进一步优选包含全部。

(同一性％)

氨基酸序列及碱基序列的同一性可以是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上。同一性能够使用例如NCBI的BLAST(参考http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)，在默认条件下确定。

(变异蛋白质所具有的活性)

与各蛋白质“具有同样的活性”是指，在相同条件下测定时，具有各蛋白质所具有的活性的例如50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或100％以上的活性。

(变异)

上述蛋白质只要能够保持同样的活性，可以在催化剂结构域中的部位及催化剂结构域以外的部位导入变异。能够保持目标活性的蛋白质中的可导入变异的氨基酸残基的位置，对于本领域技术人员而言是可以特定的。例如，本领域技术人员1)比较具有同种活性的多个蛋白质的氨基酸序列(例如，由序列号6或8表示的氨基酸序列及与异戊二烯聚合反应有关的其他蛋白质的氨基酸序列)，2)明确相对保守或非保守的区域，然后3)能够从相对保守的区域和非保守的区域预测对功能能发挥重要作用的区域和不能发挥重要作用的区域，因此能够识别结构和/或功能的相关性，能够特定可导入变异的部位。

导入到蛋白质中的变异可以是氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的变异，优选被具有类似侧链的氨基酸残基取代的变异。作为基于具有类似侧链的氨基酸残基的氨基酸的分类，可举出如下：赖氨酸、精氨酸、组氨酸等具有碱性侧链的氨基酸；天冬氨酸、谷氨酸等具有酸性侧链的氨基酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等具有非带电性极性侧链的氨基酸；甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸等具有非极性侧链的氨基酸；亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等具有β位分支侧链的氨基酸；酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸等具有芳香族侧链的氨基酸；丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等含羟基侧链(例如，醇、含苯氧基侧链)的氨基酸；以及半胱氨酸、蛋氨酸等具有含硫侧链的氨基酸。

以密码子最优化为目的，碱基序列可以被改变。本说明书中，密码子最优化是指碱基序列在不变更被编码的多核苷酸的序列的情况下，以作为靶标的特定细胞中使表达最优化的方式被改变。对于最优化后的碱基序列而言，只要是本领域技术人员就能够通过理解在被导入的细胞中的密码子使用频率并利用遗传编码的简并而容易地确定。作为靶细胞，可举出例如大肠杆菌等微生物、植物细胞、动物细胞。

(蛋白质的修饰)

构成蛋白质组合物的各蛋白质可以在C末端附近具有纯化用标签。作为纯化用标签，可举出例如组氨酸标签；HA、FLAG、V5及myc表位；几丁质结合蛋白(chitin bindingprotein，CBP)；麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein，MBP)；谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase，GST)；以及Strep标签。蛋白质组合物除上述以外，还可以包含与异戊二烯的聚合反应直接或间接相关的因子。

[脂质膜构建体]

本发明的脂质膜构建体是包含含有上述蛋白质组合物的脂质膜的构建体。通过使用脂质膜构建体，蛋白质组合物容易发挥异戊二烯的聚合活性，能够实现有效的异戊二烯聚合。

脂质膜可以是一层膜，也可以是双层膜。作为一层膜的构建体，可举出例如橡胶粒子(从来自橡胶树的胶乳中提取的粒子)。作为双层膜的构建体，可举出例如脂蛋白体、人工脂质膜模型。人工脂质膜模型可以由天然脂质、合成脂质或两者构成，并没有特别限定。脂质膜构建体优选双层膜的构建体，更优选脂蛋白体。

(脂蛋白体)

在本说明书中，脂蛋白体是指在脂质体的脂质双层膜的一部分内包或结合有蛋白质的人工小泡。在本说明书中，脂质体是指在被脂质双层膜包围而形成的空间中捕获水性成分(通常为水)的人工小泡。脂质双层膜通常由磷脂等脂质构成。作为磷脂，可举出例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、心磷脂、或它们的组合。作为磷脂以外的脂质，也可举出例如三酰基甘油、蜡、鞘脂和甾醇及它们的脂肪酸酯、或它们的组合。构成脂质双层膜的脂质优选包含来自生物体的磷脂，更优选包含来自大豆的磷脂。

脂质体的大小没有特别限定，其直径通常为50～300nm。脂质体可以是天然起源的脂质体，也可以是合成的脂质体，优选前者，更优选来自大豆等植物的脂质体。作为合成的脂质体，可举出例如聚亚烷基二醇系脂质体。

在膜脂质构建体中的蛋白质组合物的存在形式没有特别限定，在脂质体的情况下，推测为蛋白质组合物结合在脂质体表面的磷脂的亲水基团部分的形式(一部分可以埋设在膜内部)。

(制造方法)

作为膜脂质构建体的制造方法，可举出例如包括在包含磷脂的原料的存在下，使编码构成组合物的蛋白质的多核苷酸在无细胞蛋白质生产体系中表达的工序的方法。

包含磷脂的原料在膜构建体为脂蛋白体的情况下包含脂质体。脂质体如上所述优选天然起源的脂质体，优选来自大豆等植物的脂质体。

脂蛋白体的制造方法优选包括在脂质体的存在下，使包含上述多核苷酸的表达单元在无细胞蛋白质生产体系中表达的工序。

表达单元至少包含编码蛋白质组合物中所含的各蛋白质的多核苷酸。多核苷酸是编码构成蛋白质组合物的蛋白质的多核苷酸，包含上述(a-1)或(a-2)和包含(b)，根据需要进一步包含(c)～(h)中的至少1个。表达单元通常包含启动子。由此，可以有效率地生产由多核苷酸编码的多核苷酸的表达产物。作为启动子，可举出例如tac启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、T7启动子、T5启动子、T3启动子、及SP6启动子，可包含增强子。启动子以多核苷酸能够表达的方式连接于多核苷酸即可，例如连接于编码序列的上游(5’)侧。表达单元可以是DNA，也可以是RNA，优选是DNA。表达单元可以包含终止子、核糖体结合位点、耐药性基因、RNA处理信号、提高翻译效率的序列、提高蛋白质稳定性的序列、提高蛋白质分泌的序列等因子。

无细胞蛋白质生产体系优选使用细胞提取液(例如，小麦胚芽提取液、大肠杆菌提取液、兔网状红细胞提取液、昆虫细胞提取液)通过透析多层法实施，能够按照市售的蛋白质无细胞表达试剂盒实施。

另外，代替脂质体，可以使用其他蛋白质构建系统，例如人工脂质膜模型。在人工脂质膜模型中的蛋白质组合物的构建按照常规方法进行即可。另外，人工脂质膜模型可以由天然的脂质、合成的脂质或两者构成，没有特别限定。

(细胞)

本发明的细胞是表达构成蛋白质组合物的各蛋白质((A)、(B)的蛋白质以及根据需要的(C)～(H)中的至少1个蛋白质)的细胞。作为细胞，可举出例如大肠杆菌、酵母等微生物细胞、植物细胞、动物细胞，但并不限定于此。

细胞优选包含含有上述多核苷酸的表达单元。表达单元与在脂蛋白体的说明中说明的相同。细胞可包含的表达单元优选为异种表达单元。在本说明书中，异种表达单元是指在表达单元中编码各蛋白质的多核苷酸及通常包含的启动子中的至少一者不是宿主细胞固有的表达单元。优选地，两者都不是宿主细胞固有的。

作为制造细胞的方法，可举出例如用包含表达单元的表达载体进行转化的方法，上述表达单元包含编码构成上述蛋白质组合物的各蛋白质的多核苷酸。由于蛋白质组合物如上所述包含至少2个蛋白质，因此表达载体可以是1个(包含含有编码所有蛋白质的多核苷酸的表达单元)，也可以是2个以上(包含含有各自或每几个多核苷酸的表达单元)。表达载体可以是整合(integrative)载体或非整合载体。在表达载体中，上述多核苷酸可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下配置。

利用表达载体的宿主的转化能够使用1种以上的公知方法进行。作为这样的方法，可举出例如磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、电穿孔法、粒子枪(基因枪)等。此外，也可以采用使用质粒载体以外的噬菌体载体，感染菌体而使其导入菌体内的方法。

细胞可以是包含上述脂蛋白体的细胞。脂蛋白体优选由天然起源的脂质体制成。由此，能够容易地进行与细胞膜的相互作用。包含脂蛋白体的细胞能够通过使两者相互作用而制造。作为相互作用的方法，可举出例如使脂质体吸附或结合于细胞表面的方法、使脂质体进入细胞内的方法(内吞作用或吞噬作用)、使脂质体的脂质双层膜与细胞膜融合的方法。

[异戊二烯聚合化合物的制造方法]

上述蛋白质组合物、脂蛋白体及细胞能够用于异戊二烯聚合化合物的制造中。

在异戊二烯聚合化合物的制造中，进行以低分子量烯丙基性化合物为底物的异戊二烯聚合反应。作为低分子量烯丙基性化合物，可举出例如异戊烯基二磷酸、法尼基二磷酸，优选为这两者。反应温度、反应时间等条件能够适当设定。作为代表性的异戊二烯聚合化合物，可举出顺式-聚异戊二烯，作为橡胶的原料有用。作为异戊二烯聚合化合物的其他例，可举出长醇、多萜醇、它们的衍生物，这些由于在生物体中发挥生理活性(例如，免疫活性、抗病毒活性、抗氧化活性)，因此作为医药和健康食品的材料有用。此外，也能够作为橡胶制品的添加剂(例如，增塑剂、增容剂)利用。

[异戊二烯聚合化合物的制造用试剂盒]

上述蛋白质组合物、脂蛋白体及细胞能够用作异戊二烯聚合化合物的制造用试剂盒。试剂盒通常包含作为底物的低分子量烯丙基化合物。进而，反应容器可以包含所需的试剂。

[橡胶的制造方法]

通过上述异戊二烯聚合化合物的制造方法得到的异戊二烯聚合化合物能够用于橡胶的制造中。

由异戊二烯聚合化合物制造橡胶的步骤及条件只要按照常规方法即可，可举出例如将异戊二烯聚合化合物混炼后进行交联及成型的方法。作为能够根据需要使用的添加剂，可举出例如增强剂、硅烷偶联剂、填充剂、硫化剂、硫化促进剂、硫化促进助剂、油、固化树脂、蜡、抗老化剂、着色剂。这些添加剂分别在相应的阶段添加即可。得到的橡胶能够利用于轮胎、建材、体育用品、汽车部件等各种用途中。

实施例

实施例1～11

(1)天然橡胶生物合成蛋白质基因的获取

从《Rubber Database》(http：//Matsui-lab.riken.jp/rubber/home.html)中选出在胶乳中高产的7种蛋白质(CPT1、CPT2、CPTL、REF1、REF2、REF8及SRPP1)。此外，从系统分析中选出2种蛋白质(CPT6及CPT7)。

通过将编码各蛋白质的基因的cDNA或包含各基因的质粒作为模板的PCR，获得CPT1、CPT2、CPT6、CPT7、CPTL、REF1、REF2、REF8及SRPP1基因。PCR按照PrimeSTAR Max DNAPolymerase(Takara)或KOD One PCR Master Mix(TOYOBO)的说明书进行反应，在引物中根据需要附加限制酶消化位点、His标签序列。

作为用于分别获得CPT1、CPT2、CPT6、CPT7、CPTL、REF1、REF2、REF8及SRPP1基因的引物组，使用引物1和2、引物3和4、引物5和6、引物7和8、引物9和10、使用引物11和12、引物13和14、引物15和16、引物17和18。

(用于获取CPT1基因的引物组)

引物1：5’-atggaattatacaacggtg-3’(序列号19)

引物2：5’-atctcgagttaatgatgatgatgatgatgttttaag-3’(序列号20)

(用于获取CPT2基因的引物组)

引物3：5’-atggaaatatatacgggtcag-3’(序列号21)

引物4：5’-atctcgagttaatgatgatgatgatgatgttttaaatattc-3’(序列号22)

(用于获取CPT6基因的引物组)

引物5：5’-atggaaaaacatagcagtag-3’(序列号23)

引物6：5’-atctcgagttatataactgatgctttttc-3’(序列号24)

(用于获取CPT7基因的引物组)

引物7：5’-atgcaatccttgcacttg-3’(序列号25)

引物8：5’-atctcgagttatgtaagtcgtctaccatag-3’(序列号26)

(用于获取CPTL基因的引物组)

引物9：5’-atggatttgaaacctgg-3’(序列号27)

引物10：5’-atctcgagttaatgatgatgatgatgatgtgtac-3’(序列号28)

(用于获取REF1基因的引物组)

引物11：5’-atggctgaaggtgaagaagaggtgaatatc-3’(序列号29)

引物12：5’-atctcgagtcacccatctccatatagcac-3’(序列号30)

(用于获取REF2基因的引物组)

引物13：5’-atggctgaagacgaagacaaccaacaag-3’(序列号31)

引物14：5’-atctcgagtcaattctctccataaaacac-3’(序列号32)

(用于获取REF8基因的引物组)

引物15：5’-atggctgaagggaaagaaaacgagaatttc-3’(序列号33)

引物16：5’-atctcgagttactctgcactttccttcac-3’(序列号34)

(用于获取SRPP1基因的引物组)

引物17：5’-atggctgaagaggtggaggaagagaggc-3’(序列号35)

引物18：5’-atctcgagttatgatgcctcatctccaaac-3’(序列号36)

对于通过上述方法得到的各基因，鉴定其序列，鉴定全长的碱基序列和氨基酸序列。将CPT1、CPT2、CPT6、CPT7、CPTL、REF1、REF2、REF8及SRPP1基因的碱基序列分别显示于序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17中，将氨基酸序列分别显示于序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18中。

(2)无细胞蛋白质合成用质粒的制备

将上述(1)中获得的各基因的PCR反应产物用附加于引物的限制酶XhoI处理后，选择表1的各组合，插入到用EcoRV和XhoI进行了限制酶处理的无细胞表达用载体pEU-E01-MCS中，由此制备无细胞蛋白质合成用质粒。

(3)大肠杆菌的转化

将上述制备的质粒在大肠杆菌JM109中进行转化，在包含氨苄西林的LB琼脂培养基上培养转化体，通过菌落PCR选出导入了目标质粒的转化体。

(4)无细胞蛋白质合成法用质粒的制备

将用包含目标基因的质粒转化了的大肠杆菌在LB液体培养基上于37℃培养过夜后，回收菌体，进行质粒的回收。质粒的回收使用FastGene质粒小量提取试剂盒(QIAGENPlasmid Mini Kit，日本Genetics)。通过测序分析确认插入于回收的质粒中的基因的碱基序列没有变异。

(5)大肠杆菌的转化

使用上述中制备的质粒进行大肠杆菌JM109的转化，在包含氨苄西林的LB琼脂培养基上培养转化体。

(6)无细胞蛋白质合成法用质粒的回收

将用包含目标基因的质粒转化了的大肠杆菌在LB液体培养基上于37℃培养过夜后，回收菌体，进行质粒的回收。质粒的回收使用QIAGEN质粒中量提取试剂盒(QIAGENPlasmid Midi Kit，QIAGEN)进行，调整为1μg/μL。

(7)利用透析多层法的在脂质体共存下的膜蛋白质(脂蛋白体)的合成

用来自大豆的磷脂制备脂质双层膜(脂质体：直径数百nm左右)。无细胞蛋白质合成是按照脂蛋白体BD表达试剂盒(ProteoLiposome BD Expression Kit，CellFreeSciences)附带的方案(protocol)，在脂质体添加条件下进行的。对于成为模板的9种蛋白质的表达用质粒而言，将调整为1μg/μL的质粒以示于表1中的组合使用，为了使总量约为13μL，以等量比使用。例如，在实施例3中，将9种以每种为1.5μL、合计13.5μL的方式加入到转录反应体系中。合成反应结束后，按照附带的方案，对在脂质体结合有9种蛋白质的脂蛋白体(Proteoliposomes)进行简易纯化，用SDS-PAGE进行合成确认。

(8)异戊二烯聚合活性的测定

通过以下方法测定无细胞合成的蛋白质的异戊二烯聚合活性。

制备将终浓度50mM Tris-HCl(pH7.5)、终浓度10mM MgCl₂、终浓度2mM DTT、终浓度10μM法尼基二磷酸(FPP)、50μM终浓度¹⁴C-异戊烯基二磷酸(¹⁴C-IPP)(比放射能：1.48-2.22GBq/mmol)、5μL脂蛋白体混合了的反应溶液100μL，于30℃反应24小时。

反应后，添加饱和盐水200μL，利用300μL的水饱和正丁醇提取反应产物。在回收的水饱和正丁醇层中添加400μL的2M NaCl，悬浊后回收水饱和正丁醇层。在回收的溶液50μL中加入透明溶胶II(Nacalai Tesque)5mL，充分混合后，用液体闪烁计数器(LSC-8000；Aloka)测定放射剂量(dpm)。将未添加脂蛋白体的反应体系作为阴性对照组，将使用包含各种蛋白质的脂蛋白体的结果示于表1中。

(9)异戊二烯聚合反应产物的TLC射线图

对于上述中回收的水饱和正丁醇溶液，通过离心蒸发器使有机层挥发。加入将终浓度100mM乙酸钠(pH 5.5)、终浓度1U酸性磷酸酶、来自马铃薯的1mL甲醇混合了的反应溶液1.5mL，于37℃反应17小时。

反应后，用己烷500μL提取，对于得到的己烷层通过离心蒸发器浓缩干燥。将干燥物利用己烷10μL再溶解，将总量点在TLC板(Merck公司、TLC玻璃板RP-18F254S 5×10cm)。用丙酮∶水＝19∶1展开后，在成像板曝光，使用扫描仪(Typhoon FLA9500)进行可视化。

比较例1(阴性对照组)

除不添加脂蛋白体以外，进行与上述实施例同样的操作。

比较例2～9(阴性对照组以外)

将各蛋白质的无细胞合成用质粒调整未1μg/μL。将反应中的质粒总量设为13.5μL，以各质粒的添加量成等比的方式进行添加。以后，进行与上述实施例同样的操作。

[表1]

表1各实施例的蛋白质的组合及放射剂量的测定结果

由表1明显可知，各实施例的放射剂量与比较例的放射剂量相比高，合成了产物(推测为分子量1000～2000左右)。作为CPT6和CPTL的组合的实施例1、作为CPT7和CPTL的组合的实施例2的放射剂量比比较例高，由此明确了各组合发挥异戊二烯聚合活性。此外，进一步组合了其他蛋白质的实施例3～11的放射剂量也比比较例高，放射剂量也比实施例1及2高，由此明确了CPT6、7、CPTL以外的蛋白质也有促进异戊二烯聚合活性的可能性。

以上结果表明，通过本发明可以有效率地生产天然橡胶。

[序列表自由文本]

序列号1：CPT1的碱基序列

序列号2：CPT1的氨基酸序列

序列号3：CPT2的碱基序列

序列号4：CPT2的氨基酸序列

序列号5：CPT6的碱基序列

序列号6：CPT6的氨基酸序列

序列号7：CPT7的碱基序列

序列号8：CPT7的氨基酸序列

序列号9：CPTL的碱基序列

序列号10：CPTL的氨基酸序列

序列号11：REF1的碱基序列

序列号12：REF1的氨基酸序列

序列号13：REF2的碱基序列

序列号14：REF2的氨基酸序列

序列号15：REF8的碱基序列

序列号16：REF8的氨基酸序列

序列号17：SRPP1的碱基序列

序列号18：SRPP1的氨基酸序列

序列号19：引物1(用于获取CPT1基因)

序列号20：引物2(用于获取CPT1基因)

序列号21：引物3(用于获取CPT2基因)

序列号22：引物4(用于获取CPT2基因)

序列号23：引物5(用于获取CPT6基因)

序列号24：引物6(用于获取CPT6基因)

序列号25：引物7(用于获取CPT7基因)

序列号26：引物8(用于获取CPT7基因)

序列号27：引物9(用于获取CPTL基因)

序列号28：引物10(用于获取CPTL基因)

序列号29：引物11(用于获取REF1基因)

序列号30：引物12(用于获取REF1基因)

序列号31：引物13(用于获取REF2基因)

序列号32：引物14(用于获取REF2基因)

序列号33：引物15(用于获取REF8基因)

序列号34：引物16(用于获取REF8基因)

序列号35：引物17(用于获取SRPP1基因)

序列号36：引物18(用于获取SRPP1基因)。

序列表

<110> 住友理工株式会社

<120> 具有异戊二烯聚合活性的蛋白质组合物

<130> PA-R032779

<150> JP 2020-183088

<151> 2020-10-30

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 873

<212> DNA

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 1

atggaattat acaacggtga gaggccaagt gtgttcagac ttttagggaa gtatatgaga 60

aaagggttat atagcatcct aacccagggt cccatcccta ctcatattgc cttcatattg 120

gatggaaaca ggaggtttgc taagaagcat aaactgccag aaggaggtgg tcataaggct 180

ggatttttag ctcttctgaa cgtactaact tattgctatg agttaggagt gaaatatgcg 240

actatctatg cctttagcat cgataatttt cgaaggaaac ctcatgaggt tcagtacgta 300

atggatctaa tgctggagaa gattgaaggg atgatcatgg aagaaagtat catcaatgca 360

tatgatattt gcgtacgttt tgtgggtaac ctgaagcttt taagtgagcc agtcaagacc 420

gcagcagata agattatgag ggctactgcc aacaattcca aatgtgtgct tctcattgct 480

gtatgctata cttcaactga tgagatcgtg catgctgttg aagaatcctc tgaattgaac 540

tccaatgaag tttgtaacaa tcaagaattg gaggaggcaa atgcaactgg aagcggtact 600

gtgattcaaa ttgagaacat ggagtcgtat tctggaataa aacttgtaga ccttgagaaa 660

aacacctaca taaatcctta tcctgatgtt ctgattcgaa cttctgggga gacccgtctg 720

agcaactact tactttggca gactactaat tgcatactgt attctcctca tgcactgtgg 780

ccagagattg gtcttcgaca cgtggtgtgg gcagtaatta actgccaacg tcattattct 840

tacttggaga aacataagga atacttaaaa taa 873

<210> 2

<211> 290

<212> PRT

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 2

Met Glu Leu Tyr Asn Gly Glu Arg Pro Ser Val Phe Arg Leu Leu Gly

1 5 10 15

Lys Tyr Met Arg Lys Gly Leu Tyr Ser Ile Leu Thr Gln Gly Pro Ile

20 25 30

Pro Thr His Ile Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asn Arg Arg Phe Ala Lys

35 40 45

Lys His Lys Leu Pro Glu Gly Gly Gly His Lys Ala Gly Phe Leu Ala

50 55 60

Leu Leu Asn Val Leu Thr Tyr Cys Tyr Glu Leu Gly Val Lys Tyr Ala

65 70 75 80

Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Asn Phe Arg Arg Lys Pro His Glu

85 90 95

Val Gln Tyr Val Met Asp Leu Met Leu Glu Lys Ile Glu Gly Met Ile

100 105 110

Met Glu Glu Ser Ile Ile Asn Ala Tyr Asp Ile Cys Val Arg Phe Val

115 120 125

Gly Asn Leu Lys Leu Leu Ser Glu Pro Val Lys Thr Ala Ala Asp Lys

130 135 140

Ile Met Arg Ala Thr Ala Asn Asn Ser Lys Cys Val Leu Leu Ile Ala

145 150 155 160

Val Cys Tyr Thr Ser Thr Asp Glu Ile Val His Ala Val Glu Glu Ser

165 170 175

Ser Glu Leu Asn Ser Asn Glu Val Cys Asn Asn Gln Glu Leu Glu Glu

180 185 190

Ala Asn Ala Thr Gly Ser Gly Thr Val Ile Gln Ile Glu Asn Met Glu

195 200 205

Ser Tyr Ser Gly Ile Lys Leu Val Asp Leu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile

210 215 220

Asn Pro Tyr Pro Asp Val Leu Ile Arg Thr Ser Gly Glu Thr Arg Leu

225 230 235 240

Ser Asn Tyr Leu Leu Trp Gln Thr Thr Asn Cys Ile Leu Tyr Ser Pro

245 250 255

His Ala Leu Trp Pro Glu Ile Gly Leu Arg His Val Val Trp Ala Val

260 265 270

Ile Asn Cys Gln Arg His Tyr Ser Tyr Leu Glu Lys His Lys Glu Tyr

275 280 285

Leu Lys

290

<210> 3

<211> 891

<212> DNA

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 3

atggaaatat atacgggtca gaggccaagt gtgtttagaa tttttgggaa atacatgaga 60

aaagggttat atagcatcct aacccaaggt cccatcccta ctcatcttgc cttcataatg 120

gatggaaacc ggaggtttgc taagaagcac aaaatgaaag aagcagaagg ttataaggca 180

ggatatttag ctcttctgag aacactaact tattgctatg agttgggagt gaggtatgta 240

accatttatg cctttagcat tgataatttt cgaaggcaac ctcgtgaggt tcagtgcgta 300

atgaatctaa tgatggagaa gattgaagag attatcgtgg aagaaagtat catgaatgca 360

tatgatgttg gcgtacgtat tgtgggtaac ctgaatcttt tagatgagcc aatcaggatc 420

gcagcagaaa agattatgag ggctactgcc aataattcca ggtttgtgct tctcattgct 480

gtagcctata gttcaactga tgagatcgtg catgctgttg aagaatcctc taaagacaaa 540

ttgaactcca atgaagtttg caacaatggg attgaagctg aacaagaatt taaggaggca 600

aacggaactg gaaacagtgt gattccagtt cagaagacgg agtcatattc tggaataaat 660

cttgcagacc ttgagaaaaa cacctacgta aatcctcatc ctgatgtctt gattcgaact 720

tctgggttga gccgtctaag taactaccta ctttggcaga ctagtaattg catactgtat 780

tctccttttg cactgtggcc agagattggt ctcaggcact tggtatggac agtaatgaac 840

ttccaacgtc atcattctta tttggagaag cataaggaat atttaaaata a 891

<210> 4

<211> 296

<212> PRT

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 4

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Lys Tyr Met Arg Lys Gly Leu Tyr Ser Ile Leu Thr Gln Gly Pro Ile

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Pro Thr His Leu Ala Phe Ile Met Asp Gly Asn Arg Arg Phe Ala Lys

35 40 45

Lys His Lys Met Lys Glu Ala Glu Gly Tyr Lys Ala Gly Tyr Leu Ala

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Leu Leu Arg Thr Leu Thr Tyr Cys Tyr Glu Leu Gly Val Arg Tyr Val

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Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Asn Phe Arg Arg Gln Pro Arg Glu

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Val Gln Cys Val Met Asn Leu Met Met Glu Lys Ile Glu Glu Ile Ile

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Val Glu Glu Ser Ile Met Asn Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Ile Val

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Gly Asn Leu Asn Leu Leu Asp Glu Pro Ile Arg Ile Ala Ala Glu Lys

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Ile Met Arg Ala Thr Ala Asn Asn Ser Arg Phe Val Leu Leu Ile Ala

145 150 155 160

Val Ala Tyr Ser Ser Thr Asp Glu Ile Val His Ala Val Glu Glu Ser

165 170 175

Ser Lys Asp Lys Leu Asn Ser Asn Glu Val Cys Asn Asn Gly Ile Glu

180 185 190

Ala Glu Gln Glu Phe Lys Glu Ala Asn Gly Thr Gly Asn Ser Val Ile

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Pro Val Gln Lys Thr Glu Ser Tyr Ser Gly Ile Asn Leu Ala Asp Leu

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Glu Lys Asn Thr Tyr Val Asn Pro His Pro Asp Val Leu Ile Arg Thr

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Ser Gly Leu Ser Arg Leu Ser Asn Tyr Leu Leu Trp Gln Thr Ser Asn

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Cys Ile Leu Tyr Ser Pro Phe Ala Leu Trp Pro Glu Ile Gly Leu Arg

260 265 270

His Leu Val Trp Thr Val Met Asn Phe Gln Arg His His Ser Tyr Leu

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290 295

<210> 5

<211> 1122

<212> DNA

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 5

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agaatttgca tatttcgtgt gttatccatg ggacccatcc ccaatcattt tgccttcata 120

atggatggaa atcggaggta tgctaagaag gagaacatga aaaaaggggc aggtcatagg 180

gctggattct tagctcttat atccatactt aagtactgct atgaattggg agtgaagtat 240

gtaacaattt acgcctttag cattgataat ttcaaaagga gtcctgatga agttaaggac 300

ctgatggatc tgatgctaga aaagattgag gatttgctga gggacgaaag cattgtgaac 360

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gtagaggata ataagaaggt taatggagtc atcccatttg tttttttaga atcccagaaa 660

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gatgcattgt ggccagaaat tggtttatgg cacttggtgt gggcagtatt aaacttccaa 1080

cgaaaccatg cttatttgga aaagaaaaag catcagttat aa 1122

<210> 6

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<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

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165 170 175

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Lys Ser Gln Ala Thr Met Ala Ser Val Thr Cys Ser Cys Leu Ala Arg

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Gly Val Glu Gly Gly Gly Asn Lys Asn Ser Met Val Val Arg Ala Val

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Arg Gly Ser Tyr Glu Asp Lys Trp Asp Asn Cys Gln Ala Met Met Glu

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Asn Arg Thr Gly Asn Gly Val Thr Leu Ser Glu Glu Ser Glu Asn Met

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Tyr Met Ala Val Ala Pro Glu Pro Asp Ile Leu Ile Arg Ser Ser Gly

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Glu Ser Arg Leu Ser Asn Phe Leu Leu Trp Gln Thr Ser Glu Cys Gln

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<212> DNA

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 7

atgcaatcct tgcacttggc cctccctctc cctttttaca acactctaac tcctcaaaaa 60

cacaaacact tcctttctcc cgatgccaga actaatacac gcccaattca ccgccttctc 120

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gccgtgatca tggacggcaa tgggaggtgg gcccagctgc gaggtcagat ggcatcgatg 300

ggtcatcagg ctggtgcacg gtctttgctg gagatcgtgc agctttcttg tcaatggggg 360

attaaagttc ttagcgtttt tgcgttttct tgcgataatt ggactaggcc caaagtcgtg 420

caggtggaga ttgatttctt gatgagtttg ttcgaaagcg tgttaaagtc agagatggat 480

aaatttgtga gggaaggtat tcgaatctct gtgatcgggg actcatcaag gcttccacag 540

tctttgcaaa gattaataaa tgaagtggag gagaccacca gaaatttctc gaaactgcac 600

cttctagtgg cggttagcta cagtggaaag tatgatgttg taaaagcatg caaaagtatt 660

gcttgtctgg taaaggatgg tgttattgaa ccagaagaca ttagcgaaag cctaattgag 720

caggagttgg aaacaaattg ctccgagttt ccctcccctg atttattaat ccgaactagt 780

ggtgaactta gaattagcaa cttcttgcta tggcagttgg cctacactga acttttcttt 840

gcggaagaac tctggcctga ttttggaaaa actggattca tagaggcctt aacttcatac 900

caacaaaggc aaagacgcta tggtagacga cttacataa 939

<210> 8

<211> 312

<212> PRT

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 8

Met Gln Ser Leu His Leu Ala Leu Pro Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Leu

1 5 10 15

Thr Pro Gln Lys His Lys His Phe Leu Ser Pro Asp Ala Arg Thr Asn

20 25 30

Thr Arg Pro Ile His Arg Leu Leu Gly Ala Lys Thr Asp Val Ala Val

35 40 45

Lys Gln Glu Glu Thr Ile Ala Val Ser Thr Gly Asp Ser Pro Lys Thr

50 55 60

Glu Pro Leu Pro Glu Gly Leu Arg Gly Glu Leu Met Pro Arg His Val

65 70 75 80

Ala Val Ile Met Asp Gly Asn Gly Arg Trp Ala Gln Leu Arg Gly Gln

85 90 95

Met Ala Ser Met Gly His Gln Ala Gly Ala Arg Ser Leu Leu Glu Ile

100 105 110

Val Gln Leu Ser Cys Gln Trp Gly Ile Lys Val Leu Ser Val Phe Ala

115 120 125

Phe Ser Cys Asp Asn Trp Thr Arg Pro Lys Val Val Gln Val Glu Ile

130 135 140

Asp Phe Leu Met Ser Leu Phe Glu Ser Val Leu Lys Ser Glu Met Asp

145 150 155 160

Lys Phe Val Arg Glu Gly Ile Arg Ile Ser Val Ile Gly Asp Ser Ser

165 170 175

Arg Leu Pro Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asn Glu Val Glu Glu Thr

180 185 190

Thr Arg Asn Phe Ser Lys Leu His Leu Leu Val Ala Val Ser Tyr Ser

195 200 205

Gly Lys Tyr Asp Val Val Lys Ala Cys Lys Ser Ile Ala Cys Leu Val

210 215 220

Lys Asp Gly Val Ile Glu Pro Glu Asp Ile Ser Glu Ser Leu Ile Glu

225 230 235 240

Gln Glu Leu Glu Thr Asn Cys Ser Glu Phe Pro Ser Pro Asp Leu Leu

245 250 255

Ile Arg Thr Ser Gly Glu Leu Arg Ile Ser Asn Phe Leu Leu Trp Gln

260 265 270

Leu Ala Tyr Thr Glu Leu Phe Phe Ala Glu Glu Leu Trp Pro Asp Phe

275 280 285

Gly Lys Thr Gly Phe Ile Glu Ala Leu Thr Ser Tyr Gln Gln Arg Gln

290 295 300

Arg Arg Tyr Gly Arg Arg Leu Thr

305 310

<210> 9

<211> 774

<212> DNA

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 9

atggatttga aacctggagc tggagggcag agagttaatc gtttagtgga tccgattagt 60

tatcattttc ttcaatttct gtggcgtact ctacatcttc ttgtcagctt atggtacctt 120

caagttagta tggtccaaat gatcgaaggc tttctaatct ctagtggact tgtgaaacgc 180

tatggagccc tcgatattga caaggtccgg taccttgcca ttgtggtaga tagtgaagaa 240

gcttaccaaa tttctaaagt tattcagctt ttgaaatggg tggaagatat gggtgtgaaa 300

catttatgcc tctatgattc aaaaggagtt ctcaagacaa acaagaaaac catcatggag 360

agtttgaaca atgctatgcc atttgaggaa gcagttgaaa aagatgtttt actggaccag 420

aaacagatga ctgtggaatt tgcttccagc tccgatggaa aggaagcaat aaccagggca 480

gctaacgtac tctttatgaa gtatttgaag tatgctaaaa ctggtgtagg aaaggaagaa 540

ccatgcttta cagaagatca aatggatgag gcactaaaag ctataggtta caaagggccg 600

gaacctgact tgctattaat ttatggacct gttagatgcc atctaggttt ctcaccgtgg 660

agacttcgat atactgagat ggtgcatatg ggacccttga ggtacatgaa cctcggttca 720

ctaaaaaagg ccattcacag gttcacaaca gtgcagcaaa attatggtac ataa 774

<210> 10

<211> 257

<212> PRT

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 10

Met Asp Leu Lys Pro Gly Ala Gly Gly Gln Arg Val Asn Arg Leu Val

1 5 10 15

Asp Pro Ile Ser Tyr His Phe Leu Gln Phe Leu Trp Arg Thr Leu His

20 25 30

Leu Leu Val Ser Leu Trp Tyr Leu Gln Val Ser Met Val Gln Met Ile

35 40 45

Glu Gly Phe Leu Ile Ser Ser Gly Leu Val Lys Arg Tyr Gly Ala Leu

50 55 60

Asp Ile Asp Lys Val Arg Tyr Leu Ala Ile Val Val Asp Ser Glu Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Gln Ile Ser Lys Val Ile Gln Leu Leu Lys Trp Val Glu Asp

85 90 95

Met Gly Val Lys His Leu Cys Leu Tyr Asp Ser Lys Gly Val Leu Lys

100 105 110

Thr Asn Lys Lys Thr Ile Met Glu Ser Leu Asn Asn Ala Met Pro Phe

115 120 125

Glu Glu Ala Val Glu Lys Asp Val Leu Leu Asp Gln Lys Gln Met Thr

130 135 140

Val Glu Phe Ala Ser Ser Ser Asp Gly Lys Glu Ala Ile Thr Arg Ala

145 150 155 160

Ala Asn Val Leu Phe Met Lys Tyr Leu Lys Tyr Ala Lys Thr Gly Val

165 170 175

Gly Lys Glu Glu Pro Cys Phe Thr Glu Asp Gln Met Asp Glu Ala Leu

180 185 190

Lys Ala Ile Gly Tyr Lys Gly Pro Glu Pro Asp Leu Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

Gly Pro Val Arg Cys His Leu Gly Phe Ser Pro Trp Arg Leu Arg Tyr

210 215 220

Thr Glu Met Val His Met Gly Pro Leu Arg Tyr Met Asn Leu Gly Ser

225 230 235 240

Leu Lys Lys Ala Ile His Arg Phe Thr Thr Val Gln Gln Asn Tyr Gly

245 250 255

Thr

<210> 11

<211> 528

<212> DNA

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 11

atggctgaag gtgaagaaga ggtgaatatc caagaagagg caaataaagg agaggagaat 60

ccccaagaag aggcgaatat ccaagaagag acgaataaag gagaggagaa tatccaagaa 120

gaggcgaata tcgaagaaga ggctaataag gaggaagaga gcctaaagta tttggatttt 180

gtgcaagcgg ctacagttta tgccagggct tctttctcaa agctctacct ttttgccaag 240

gacaagtctg gtccattcaa gcctggcgtc aatactgttg agagtaggtt taagagcgtg 300

gttagacccg tctataataa gttccaacct gttcccaaca aggttctcaa gtttgcagac 360

cgtagggttg atgcatatgt cactgtttta gatcgcattg ttcctccaat tgtcaagcgg 420

gcatctatcc aagcttattc agtagcccca ggagctgctc gtgctgtggc ttcttatttg 480

cctttgcata ccaagagact ttttaaggtg ctatatggag atgggtga 528

<210> 12

<211> 175

<212> PRT

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 12

Met Ala Glu Gly Glu Glu Glu Val Asn Ile Gln Glu Glu Ala Asn Lys

1 5 10 15

Gly Glu Glu Asn Pro Gln Glu Glu Ala Asn Ile Gln Glu Glu Thr Asn

20 25 30

Lys Gly Glu Glu Asn Ile Gln Glu Glu Ala Asn Ile Glu Glu Glu Ala

35 40 45

Asn Lys Glu Glu Glu Ser Leu Lys Tyr Leu Asp Phe Val Gln Ala Ala

50 55 60

Thr Val Tyr Ala Arg Ala Ser Phe Ser Lys Leu Tyr Leu Phe Ala Lys

65 70 75 80

Asp Lys Ser Gly Pro Phe Lys Pro Gly Val Asn Thr Val Glu Ser Arg

85 90 95

Phe Lys Ser Val Val Arg Pro Val Tyr Asn Lys Phe Gln Pro Val Pro

100 105 110

Asn Lys Val Leu Lys Phe Ala Asp Arg Arg Val Asp Ala Tyr Val Thr

115 120 125

Val Leu Asp Arg Ile Val Pro Pro Ile Val Lys Arg Ala Ser Ile Gln

130 135 140

Ala Tyr Ser Val Ala Pro Gly Ala Ala Arg Ala Val Ala Ser Tyr Leu

145 150 155 160

Pro Leu His Thr Lys Arg Leu Phe Lys Val Leu Tyr Gly Asp Gly

165 170 175

<210> 13

<211> 417

<212> DNA

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 13

atggctgaag acgaagacaa ccaacaaggg cagggggagg ggttaaaata tttgggtttt 60

gtgcaagacg cggcaactta tgctgtgact accttctcaa acgtctatct ttttgccaaa 120

gacaaatctg gtccactgca gcctggtgtc gatatcattg agggtccggt gaagaacgtg 180

gctgtacctc tctataatag gttcagttat attcccaatg gagctctcaa gtttgtagac 240

agcacggttg ttgcatctgt cactattata gatcgctctc ttcccccaat tgtcaaggac 300

gcatctatcc aagttgtttc agcaattcga gctgccccag aagctgctcg ttctctggct 360

tcttctttgc ctgggcagac caagatactt gctaaggtgt tttatggaga gaattga 417

<210> 14

<211> 138

<212> PRT

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 14

Met Ala Glu Asp Glu Asp Asn Gln Gln Gly Gln Gly Glu Gly Leu Lys

1 5 10 15

Tyr Leu Gly Phe Val Gln Asp Ala Ala Thr Tyr Ala Val Thr Thr Phe

20 25 30

Ser Asn Val Tyr Leu Phe Ala Lys Asp Lys Ser Gly Pro Leu Gln Pro

35 40 45

Gly Val Asp Ile Ile Glu Gly Pro Val Lys Asn Val Ala Val Pro Leu

50 55 60

Tyr Asn Arg Phe Ser Tyr Ile Pro Asn Gly Ala Leu Lys Phe Val Asp

65 70 75 80

Ser Thr Val Val Ala Ser Val Thr Ile Ile Asp Arg Ser Leu Pro Pro

85 90 95

Ile Val Lys Asp Ala Ser Ile Gln Val Val Ser Ala Ile Arg Ala Ala

100 105 110

Pro Glu Ala Ala Arg Ser Leu Ala Ser Ser Leu Pro Gly Gln Thr Lys

115 120 125

Ile Leu Ala Lys Val Phe Tyr Gly Glu Asn

130 135

<210> 15

<211> 354

<212> DNA

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 15

atggctgaag ggaaagaaaa cgagaatttc caacaagagg ctaatgagca ggaagagaag 60

ctaaagtatt tggaatttgt acaagcgact acagataatg ctgtaactgc cctctcaaac 120

atttaccttt atgccaagga caattctggt ccgttgaagc ctggggtcga gactattgag 180

ggtgtggcaa agaccgtggt tattccggcc agtaaaattc ccactgaagc tatcaagttt 240

gcagacagag cggtggatgc atctttcact actctacaaa acattgttcc ctcagttctc 300

aagcagttgc ctacccaagc ttgcgatact agtgtgaagg aaagtgcaga gtaa 354

<210> 16

<211> 117

<212> PRT

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 16

Met Ala Glu Gly Lys Glu Asn Glu Asn Phe Gln Gln Glu Ala Asn Glu

1 5 10 15

Gln Glu Glu Lys Leu Lys Tyr Leu Glu Phe Val Gln Ala Thr Thr Asp

20 25 30

Asn Ala Val Thr Ala Leu Ser Asn Ile Tyr Leu Tyr Ala Lys Asp Asn

35 40 45

Ser Gly Pro Leu Lys Pro Gly Val Glu Thr Ile Glu Gly Val Ala Lys

50 55 60

Thr Val Val Ile Pro Ala Ser Lys Ile Pro Thr Glu Ala Ile Lys Phe

65 70 75 80

Ala Asp Arg Ala Val Asp Ala Ser Phe Thr Thr Leu Gln Asn Ile Val

85 90 95

Pro Ser Val Leu Lys Gln Leu Pro Thr Gln Ala Cys Asp Thr Ser Val

100 105 110

Lys Glu Ser Ala Glu

115

<210> 17

<211> 615

<212> DNA

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 17

atggctgaag aggtggagga agagaggcta aagtatttgg attttgtgcg agcggctgga 60

gtttatgctg tagattcttt ctcaactctc tacctttatg ccaaggacat atctggtcca 120

ttaaaacctg gtgtcgatac tattgagaat gtggtgaaga ccgtggttac tcctgtttat 180

tatattcccc ttgaggctgt caagtttgta gacaaaacgg tggatgtatc ggtcactagc 240

ctagatggcg ttgttccccc agttatcaag caggtgtctg cccaaactta ctcggtagct 300

caagatgctc caagaattgt tcttgatgtg gcttcttcag ttttcaacac tggtgtgcag 360

gaaggcgcaa aagctctgta cgctaatctt gaaccaaaag ctgagcaata tgcggtcatt 420

acctggcgtg ccctcaataa gctgccacta gttcctcaag tggcaaatgt agttgtgcca 480

accgctgttt atttctctga aaagtacaac gatgttgttc gtggcactac tgagcaggga 540

tatagagtgt cctcttattt gcctttgttg cccactgaga aaattactaa ggtgtttgga 600

gatgaggcat cataa 615

<210> 18

<211> 204

<212> PRT

<213> 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）

<400> 18

Met Ala Glu Glu Val Glu Glu Glu Arg Leu Lys Tyr Leu Asp Phe Val

1 5 10 15

Arg Ala Ala Gly Val Tyr Ala Val Asp Ser Phe Ser Thr Leu Tyr Leu

20 25 30

Tyr Ala Lys Asp Ile Ser Gly Pro Leu Lys Pro Gly Val Asp Thr Ile

35 40 45

Glu Asn Val Val Lys Thr Val Val Thr Pro Val Tyr Tyr Ile Pro Leu

50 55 60

Glu Ala Val Lys Phe Val Asp Lys Thr Val Asp Val Ser Val Thr Ser

65 70 75 80

Leu Asp Gly Val Val Pro Pro Val Ile Lys Gln Val Ser Ala Gln Thr

85 90 95

Tyr Ser Val Ala Gln Asp Ala Pro Arg Ile Val Leu Asp Val Ala Ser

100 105 110

Ser Val Phe Asn Thr Gly Val Gln Glu Gly Ala Lys Ala Leu Tyr Ala

115 120 125

Asn Leu Glu Pro Lys Ala Glu Gln Tyr Ala Val Ile Thr Trp Arg Ala

130 135 140

Leu Asn Lys Leu Pro Leu Val Pro Gln Val Ala Asn Val Val Val Pro

145 150 155 160

Thr Ala Val Tyr Phe Ser Glu Lys Tyr Asn Asp Val Val Arg Gly Thr

165 170 175

Thr Glu Gln Gly Tyr Arg Val Ser Ser Tyr Leu Pro Leu Leu Pro Thr

180 185 190

Glu Lys Ile Thr Lys Val Phe Gly Asp Glu Ala Ser

195 200

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物1，用于扩增CPT1

<400> 19

atggaattat acaacggtg 19

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物2，用于扩增CPT1

<400> 20

atctcgagtt aatgatgatg atgatgatgt tttaag 36

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物3，用于扩增CPT2

<400> 21

atggaaatat atacgggtca g 21

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物4，用于扩增CPT2

<400> 22

atctcgagtt aatgatgatg atgatgatgt tttaaatatt c 41

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物5，用于扩增CPT6

<400> 23

atggaaaaac atagcagtag 20

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物6，用于扩增CPT6

<400> 24

atctcgagtt atataactga tgctttttc 29

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物7，用于扩增CPT7

<400> 25

atgcaatcct tgcacttg 18

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物8，用于扩增CPT7

<400> 26

atctcgagtt atgtaagtcg tctaccatag 30

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物9，用于扩增CPTL

<400> 27

atggatttga aacctgg 17

<210> 28

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物10，用于扩增CPTL

<400> 28

atctcgagtt aatgatgatg atgatgatgt gtac 34

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物11，用于扩增REF1

<400> 29

atggctgaag gtgaagaaga ggtgaatatc 30

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物12，用于扩增REF1

<400> 30

atctcgagtc acccatctcc atatagcac 29

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物13，用于扩增REF2

<400> 31

atggctgaag acgaagacaa ccaacaag 28

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物14，用于扩增REF2

<400> 32

atctcgagtc aattctctcc ataaaacac 29

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物15，用于扩增REF8

<400> 33

atggctgaag ggaaagaaaa cgagaatttc 30

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物16，用于扩增REF8

<400> 34

atctcgagtt actctgcact ttccttcac 29

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物17，用于扩增SRPP1

<400> 35

atggctgaag aggtggagga agagaggc 28

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物18，用于扩增SRPP1

<400> 36

atctcgagtt atgatgcctc atctccaaac 30

Claims

1.一种蛋白质组合物，其具有异戊二烯聚合活性，其中所述蛋白质组合物包含：

并且，所述蛋白质组合物包含：

2.根据权利要求1所述的组合物，其满足以下至少任一种，

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其进一步包含CPT6、7及CPTL以外的CPT家族蛋白质、REF家族蛋白质及SRPP家族蛋白质。

4.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含以下中的至少1个，

5.根据权利要求4所述的组合物，其满足以下至少任一种，

(H)为多核苷酸(h)编码的蛋白质，所述多核苷酸(h)选自包含序列号17的碱基序列的多核苷酸及编码下述蛋白质的多核苷酸中的1种以上的多核苷酸，所述蛋白质由包含与序列号17的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的多核苷酸编码且具有与SRPP1同样的活性。

6.根据权利要求1～5中任一项所述组合物，其中，

(A)～(H)的蛋白质的至少1种为来自橡胶树的蛋白质。

7.一种脂质膜构建体，其包含权利要求1～6中任一项所述组合物及磷脂。

8.根据权利要求7所述的构建体，其为脂质双层膜构建体。

9.根据权利要求7或8所述的构建体，其为脂蛋白体。

10.一种脂质膜构建体的制造方法，其中，

所述脂质膜构建体为权利要求7～9中任一项所述的脂质膜构建体，

所述方法包括在包含磷脂的原料的存在下，使编码构成权利要求1～6中任一项所述组合物的蛋白质的多核苷酸在无细胞蛋白质生产体系中表达的工序。

11.根据权利要求10所述的脂质膜构建体的制造方法，其中，

编码构成权利要求1～6中任一项所述组合物的蛋白质的多核苷酸包含：

12.根据权利要求10或11所述的脂质膜构建体的制造方法，其中，

多核苷酸为编码构成权利要求3或4所述组合物的蛋白质的多核苷酸，进一步包含：

13.根据权利要求10～12中任一项所述的脂质膜构建体的制造方法，其中，包含磷脂的原料含有脂质体，脂质膜构建体为脂蛋白体。

14.一种细胞，其表达构成权利要求1～5中任一项所述组合物的蛋白质。

15.根据权利要求14所述的细胞，其包含表达单元，所述表达单元包含编码权利要求1～6中任一项所述蛋白质组合物中所含的各蛋白质的多核苷酸。

16.根据权利要求14或15所述的细胞，其中，多核苷酸为：

17.根据权利要求14～16中任一项所述的细胞，其中，多核苷酸为编码构成权利要求3或4所述组合物的蛋白质的多核苷酸，进一步包含以下至少任一种，

18.根据权利要求14～17中任一项所述的细胞，其中，表达单元为异种表达单元。

19.根据权利要求14所述的细胞，其包含权利要求9所述的脂质膜构建体。

20.一种细胞的制备方法，其中，所述细胞为权利要求14所述的细胞，

所述方法包括使权利要求9所述的脂质膜构建体与细胞相互作用的工序。

21.一种异戊二烯聚合化合物的制造方法，其包括使用选自权利要求1～6中任一项所述的组合物、权利要求7～9中任一项所述的构建体、权利要求14～19中任一项所述的细胞中的至少1种进行异戊二烯聚合反应的工序。

22.根据权利要求21所述的制造方法，其中，以低分子量烯丙基化合物作为底物进行异戊二烯聚合反应。

23.一种用于制造异戊二烯聚合化合物的试剂盒，其包含：

选自权利要求1～6中任一项所述的组合物、权利要求7～9中任一项所述的构建体及权利要求14～19中任一项所述的细胞中的至少1种，以及低分子量烯丙基化合物。

24.一种橡胶的制造方法，其包括使用通过权利要求21或22所述的制造方法制造的异戊二烯聚合化合物制造橡胶的工序。