JP2022073233A - イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途 - Google Patents

イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途 Download PDF

Info

Publication number
JP2022073233A
JP2022073233A JP2020183088A JP2020183088A JP2022073233A JP 2022073233 A JP2022073233 A JP 2022073233A JP 2020183088 A JP2020183088 A JP 2020183088A JP 2020183088 A JP2020183088 A JP 2020183088A JP 2022073233 A JP2022073233 A JP 2022073233A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
base sequence
protein
polynucleotides
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2020183088A
Other languages
English (en)
Inventor
俊輔 今井
Shunsuke Imai
史紀 米山
Fuminori Yoneyama
治 脇坂
Osamu Wakizaka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Riko Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Riko Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Riko Co Ltd filed Critical Sumitomo Riko Co Ltd
Priority to JP2020183088A priority Critical patent/JP2022073233A/ja
Priority to CN202180035798.1A priority patent/CN115698293A/zh
Priority to PCT/JP2021/038921 priority patent/WO2022091932A1/ja
Priority to EP21886051.8A priority patent/EP4151731A4/en
Publication of JP2022073233A publication Critical patent/JP2022073233A/ja
Priority to US17/968,818 priority patent/US20230065493A1/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60C—VEHICLE TYRES; TYRE INFLATION; TYRE CHANGING; CONNECTING VALVES TO INFLATABLE ELASTIC BODIES IN GENERAL; DEVICES OR ARRANGEMENTS RELATED TO TYRES
    • B60C1/00—Tyres characterised by the chemical composition or the physical arrangement or mixture of the composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01092—(2Z,6Z)-Farnesyl diphosphate synthase (2.5.1.92)
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29D—PRODUCING PARTICULAR ARTICLES FROM PLASTICS OR FROM SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE
    • B29D30/00—Producing pneumatic or solid tyres or parts thereof
    • B29D30/06—Pneumatic tyres or parts thereof (e.g. produced by casting, moulding, compression moulding, injection moulding, centrifugal casting)
    • B29D30/08—Building tyres
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29K—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES B29B, B29C OR B29D, RELATING TO MOULDING MATERIALS OR TO MATERIALS FOR MOULDS, REINFORCEMENTS, FILLERS OR PREFORMED PARTS, e.g. INSERTS
    • B29K2607/00—Use of natural rubber for preformed parts, e.g. for inserts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/0102—Rubber cis-polyprenylcistransferase (2.5.1.20)

Abstract

【課題】本発明は、天然ゴムを効率的に生産し、安定的な確保を実現するための手段を提供し、ゴム資源を安定的に確保することを目的とする。【解決手段】本発明は、（Ａ－１）ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質、又は、（Ａ－２）ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質と、（Ｂ）ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質とを含む、イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物、前記組成物を含む脂質膜構築体、その製造方法、前記組成物を構成するタンパク質を発現する細胞、その作製方法、及び、これらのいずれかを用いるイソプレン重合化合物の製造方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途に関し、詳しくは、イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物、これを含む脂質膜構築物及び細胞、並びに、これを用いるイソプレン重合化合物の製造方法に関する。
天然ゴムは、ゴムノキの樹液に含まれるシス－ポリイソプレンを主成分とする物質であり、自動車産業、建設産業等の各種分野で広く用いられ、世界的に需要が拡大している。天然ゴムは、ゴムノキから採取される農作物であるため、供給が不安定であり、品質にばらつきがある等の問題があり、重大な経営リスクとなるおそれもあった。そのため、天然ゴムを人工的に生産する技術の開発が試みられている。
特許文献１及び非特許文献１には、生体外で、天然ゴム生合成に関わる所定のタンパク質（ＨＲＴ１、ＨＲＴＢＰ及びＲＥＦ）の各遺伝子発現産物をゴム粒子に結合させる結合工程を含むポリイソプレノイドの製造方法が記載されている。
特許第６５８６６９３号公報
Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．ｅＬｉｆｅ ２０１６；５：ｅ１９０２２．ＤＯＩ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．１９０２２
特許文献１及び非特許文献１記載の技術は、ポリイソプレノイドを十分に生産できず実用化するには不十分であった。また、斯かる技術によれば、ゴム粒子を植物から採取する必要があるところ、ゴム粒子の採取処理が煩雑であること、植物からの抽出物であるためゴム粒子の品質安定化が難しいこと、等の問題もあった。
本発明は、天然ゴムを効率的に生産し、安定的な確保を実現するための手段を提供し、ゴム資源を安定的に確保することを目的とする。
本発明によれば、以下の〔１〕～〔２４〕が提供される。
〔１〕（Ａ－１）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、又は、
（Ａ－２）配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質と、
（Ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質と、
を含む、イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物。
〔２〕（Ａ－１）が、
配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ａ－１）によりコードされるタンパク質であること、
（Ａ－２）が、
配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ａ－２）によりコードされるタンパク質であること、及び
（Ｂ）が、
配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｂ）によりコードされるタンパク質であること
の少なくともいずれかである、〔１〕に記載の組成物。
〔３〕ＣＰＴ６、７及びＣＰＴＬ以外のＣＰＴファミリータンパク質、ＲＥＦファミリータンパク質、及びＳＲＰＰファミリータンパク質を更に含む、〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
（Ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
（Ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質、並びに、配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
（Ｇ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、及び
（Ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
から選ばれる少なくとも１つを更に含む、〔１〕に記載の組成物。
〔５〕（Ｃ）が、
配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｃ）によりコードされるタンパク質であること、
（Ｄ）が、
配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｄ）によりコードされるタンパク質であること、
（Ｅ）が、
配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｅ）によりコードされるタンパク質であること、
（Ｆ）が、
配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｆ）によりコードされるタンパク質であること、
（Ｇ）が、
配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｇ）によりコードされるタンパク質であること、及び、
（Ｈ）が、
配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｈ）によりコードされるタンパク質であること、
の少なくともいずれかである、〔４〕に記載の組成物。
〔６〕（Ａ）～（Ｈ）のタンパク質の少なくとも１つは、ゴムノキ由来のタンパク質である、〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔７〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の組成物及びリン脂質を含む脂質膜構築体。
〔８〕脂質二重膜構築体である、〔７〕に記載の構築体。
〔９〕プロテオリポソームである、〔７〕又は〔８〕に記載の構築体。
〔１０〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、リン脂質を含む原料の存在下、無細胞タンパク質生産系にて発現させることを含む、〔７〕～〔９〕のいずれか１項に記載の脂質膜構築体の製造方法。
〔１１〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、
（ａ－１）配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、又は
（ａ－２）配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと
を含む、〔１０〕に記載の脂質膜構築体の製造方法。
〔１２〕ポリヌクレオチドは、〔３〕又は〔４〕に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
（ｃ）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、及び
（ｈ）配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
の少なくともいずれかを更に含む、〔１０〕又は〔１１〕に記載の脂質膜構築体の製造方法。
〔１３〕リン脂質を含む原料はリポソームを含み、脂質膜構築体がプロテオリポソームである、〔１０〕～〔１２〕のいずれか１項に記載の脂質膜構築体の製造方法。
〔１４〕〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の組成物を構成するタンパク質を発現する細胞。
〔１５〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載のタンパク質組成物に含まれる各タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む〔１４〕に記載の細胞。
〔１６〕ポリヌクレオチドは、
（ａ－１）配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、又は
（ａ－２）配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと
を含む、〔１４〕又は〔１５〕に記載の細胞。
〔１７〕ポリヌクレオチドは、〔３〕又は〔４〕に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
（ｃ）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、及び
（ｈ）配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
の少なくともいずれかを更に含む、〔１４〕～〔１６〕のいずれか１項に記載の細胞。
〔１８〕発現単位が異種発現単位である、〔１４〕～〔１７〕のいずれか１項に記載の細胞。
〔１９〕〔９〕に記載の脂質膜構築体を含む、〔１４〕に記載の細胞。
〔２０〕〔９〕に記載の脂質膜構築体を細胞と相互作用させることを含む、〔１４〕に記載の細胞の作製方法。
〔２１〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の組成物、〔７〕～〔９〕に記載の構築体、〔１４〕～〔１９〕のいずれか１項に記載の細胞から選ばれる少なくとも１つを用いてイソプレン重合反応を行うことを含む、イソプレン重合化合物の製造方法。
〔２２〕低分子量アリル化合物を基質としてイソプレン重合反応を行う、〔２１〕に記載の製造方法。
〔２３〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の組成物、〔７〕～〔９〕に記載の構築体及び〔１４〕～〔１９〕のいずれか１項に記載の細胞から選ばれる少なくとも１つ、及び
低分子量アリル化合物
を含む、イソプレン重合化合物製造用キット。
〔２４〕〔２１〕又は〔２２〕に記載の製造方法により製造されるイソプレン重合化合物を用いてゴムを製造することを含む、ゴムの製造方法。
本発明によれば、天然ゴムを効率的に生産し、安定的な確保を実現することができ、世界的に需要が拡大しているゴム資源の安定的な確保の実現が期待できる。
〔タンパク質組成物〕
（イソプレン重合活性）
本発明のタンパク質組成物は、イソプレン重合活性を有する。イソプレン重合活性とは、通常、イソプレンの重合反応を直接または間接的に促進しイソプレン重合化合物を生産する活性を意味する。イソプレンの重合反応とは、通常は、生物におけるイソプレンの重合反応である。基質としては、例えば、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）等の低分子量アリル化合物が挙げられる。
生物としては例えば、Ｈｅｖｅａ属植物（例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｈｅｖｅａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｈｅｖｅａ ｇｕｉａｎｅｎｓｉｓ）、Ｆｉｃｕｓ属植物（例えば、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、カシワバゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｌｙｒａｔａ）、ベンジャミンゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｊａｍｉｎａ））等のゴムノキ（天然ゴム生産能を有する植物）が挙げられるが、これに限定されず、他の植物細胞、動物細胞、微生物も含まれる。
（タンパク質組成物を構成するタンパク質）
（（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質）
タンパク質組成物は、（Ａ－１）及び（Ａ－２）のタンパク質の少なくともいずれかと、（Ｂ）のタンパク質とを含む：
（Ａ－１）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；
（Ａ－２）配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；及び
（Ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質。
配列番号６、８、１０のアミノ酸配列は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の、それぞれ、シス－プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）６、ＣＰＴ７、ＣＰＴＬのアミノ酸配列である。
（Ａ－１）、（Ａ－２）及び（Ｂ）のタンパク質は、それぞれをコードする（ａ－１）、（ａ－２）及び（ｂ）のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質でもよい：
（ａ－１）配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；
（ａ－２）配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド。
配列番号５、７、９で表される塩基配列は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の、それぞれ、ＣＰＴ６、ＣＰＴ７及びＣＰＴＬの完全長の塩基配列である。
（他のタンパク質）
タンパク質組成物は、（Ａ－１）、（Ａ－２）及び（Ｂ）のタンパク質以外のタンパク質を含んでいてもよい。他のタンパク質としては、生体内でイソプレンの重合反応そのものを担うタンパク質及び重合反応を補助することが知られているタンパク質が挙げられる。前者としては、例えば、ＣＰＴ６、ＣＰＴ７及びＣＰＴＬ以外のＣＰＴファミリーが挙げられる。後者としては、例えば、ｒｕｂｂｅｒ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー、ｓｍａｌｌ ｒｕｂｂｅｒ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）ファミリーから選ばれる少なくとも１つが挙げられる。中でも、（Ｃ）～（Ｈ）のタンパク質から選ばれる少なくとも１つが好ましい：
（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；
（Ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；
（Ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質、並びに、配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；
（Ｇ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質；及び
（Ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質。
配列番号２、４、１２、１４、１６、１８のアミノ酸配列は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の、それぞれ、ＣＰＴ１、ＣＰＴ２、ＲＥＦ１、ＲＥＦ２、ＲＥＦ８、ＳＲＰＰ１の成熟タンパク質を含む。
（Ｃ）～（Ｈ）のタンパク質は、それぞれをコードする（ｃ）～（ｈ）のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質でもよい：
（ｃ）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド；及び
（ｈ）配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド。
配列番号１、３、１１、１３、１５及び１７で表される塩基配列は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の、それぞれ、ＣＰＴ１、ＣＰＴ２、ＲＥＦ１、ＲＥＦ２、ＲＥＦ８、及びＳＲＰＰ１の完全長の塩基配列である。
タンパク質組成物は、（Ｃ）～（Ｈ）のタンパク質のうち、２種以上、３種以上、４種以上又は５種以上を含むことが好ましく、（Ｃ）及び（Ｄ）の少なくともいずれかと（Ｅ）～（Ｈ）の少なくともいずれかの組み合わせを含むことがより好ましく、すべてを含むことがさらに好ましい。
（同一性％）
アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上であってもよい。同一性は、例えばＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）を用い、デフォルトの条件で決定できる。
（変異タンパク質が有する活性）
各タンパク質と「同様の活性を有する」とは、同一条件で測定された場合、各タンパク質が有する活性の、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％以上の活性を有することを意味する。
（変異）
上記タンパク質は、同様の活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、及び触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、タンパク質中の変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者であれば特定可能である。例えば、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号６又は８により表されるアミノ酸配列、及び他のイソプレン重合反応に関係するタンパク質のアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存され又はされていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域及び保存されていない領域から、機能に重要な役割を果たし得る領域及び果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識し、変異が導入されてもよい部位を特定できる。
タンパク質に導入される変異は、アミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換でもよく、類似の側鎖を有するアミノ酸残基への置換が好ましい。類似の側鎖を有するアミノ酸残基によるアミノ酸の分類としては、例えば、以下が挙げられる：リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性側鎖を有するアミノ酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性側鎖を有するアミノ酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン等の非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等の非極性側鎖を有するアミノ酸；スレオニン、バリン、イソロイシン等のβ位分岐側鎖を有するアミノ酸；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン等の芳香族側鎖を有するアミノ酸；セリン、スレオニン、チロシン等のヒドロキシル基含有側鎖（例えば、アルコール、フェノキシ基含有側鎖）を有するアミノ酸；及びシステイン、メチオニン等の硫黄含有側鎖を有するアミノ酸。
塩基配列は、コドン最適化を目的として改変されてもよい。本明細書においてコドン最適化とは、塩基配列が、コードされるポリペプチドの配列を変更することなく、ターゲットである特定の細胞における発現が最適化されるように改変されることを意味する。最適化後の塩基配列は、当業者であれば導入される細胞におけるコドン使用頻度を理解し、遺伝コードの縮重を活用することにより容易に決定できる。ターゲットである細胞としては、例えば、大腸菌等の微生物、植物細胞、動物細胞が挙げられる。
（タンパク質の修飾）
タンパク質組成物を構成する各タンパク質は、Ｃ末端付近に精製用タグを有していてもよい。精製用タグとしては、例えば、ヒスチジンタグ；ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｖ５およびｍｙｃエピトープ、；キチン結合タンパク質（ｃｈｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＣＢＰ）；マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＢＰ）；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＧＳＴ）；及びＳｔｒｅｐタグが挙げられる。タンパク質組成物は、上記の他に、イソプレンの重合反応に直接または間接的に関与する因子を含んでもよい。
〔脂質膜構築体〕
本発明の脂質膜構築体は、上記タンパク質組成物を含む、脂質膜を含む構築体である。脂質膜構築体を用いることにより、タンパク質組成物がイソプレンの重合活性を発揮しやすくなり、効率的なイソプレン重合が実現できる。
脂質膜は、一重膜でも、二重膜でもよい。一重膜の構築体としては、例えば、ゴム粒子（ゴムノキ由来のラテックスから抽出される粒子）が挙げられる。二重膜の構築体としては、例えば、プロテオリポソーム、人工脂質膜モデルが挙げられる。人工脂質膜モデルは、天然の脂質、合成の脂質またはその両方から構成されていてもよく、特に限定されない。脂質膜構築体は、二重膜の構築体が好ましく、プロテオリポソームがより好ましい。
（プロテオリポソーム）
本明細書においてプロテオリポソームとは、リポソームの脂質二重膜の一部にタンパク質が内包または結合された人工小胞を意味する。本明細書においてリポソームとは、脂質二重膜に囲まれて形成された空間に水性成分（通常、水）が捕捉された人工小胞を意味する。脂質二重膜は通常、リン脂質等の脂質により構成される。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、カルジオリピン、またはそれらの組合せが挙げられる。リン脂質以外の脂質としては例えば、トリアシルグリセロール、ワックス、スフィンゴ脂質およびステロールおよびそれらの脂肪酸エステル、またはそれらの組合せも挙げられる。脂質二重膜を構成する脂質は、生体由来のリン脂質を含むことが好ましく、ダイズ由来リン脂質を含むことがより好ましい。
リポソームの大きさは、特に限定されないが、その直径は通常５０～３００ｎｍである。リポソームは、天然起源のものでもよいし合成されたものでもよいが、前者が好ましく、ダイズ等植物由来のものがより好ましい。合成されたリポソームとしては、例えば、ポリアルキレングリコール系のリポソームが挙げられる。
膜脂質構築体におけるタンパク質組成物の存在形態は特に限定されないが、リポソームの場合、リポソーム表面のリン脂質の親水基の部分にタンパク質組成物が結合した形態（一部が膜内部に埋設されていてもよい）であると推測される。
（製造方法）
膜脂質構築体の製造方法としては、例えば、組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、リン脂質を含む原料の存在下無細胞タンパク質生産系にて発現させることを含む方法が挙げられる。
リン脂質を含む原料は、膜構築体がプロテオリポソームである場合、リポソームを含む。リポソームは、上述したように天然起源のリポソームが好ましく、ダイズ等植物由来のリポソームが好ましい。
プロテオリポソームの製造方法は、前記ポリヌクレオチドを含む発現単位を、リポソームの存在下無細胞タンパク質生産系にて発現させることを含むことが好ましい。
発現単位は、タンパク質組成物に含まれる各タンパク質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含む。ポリヌクレオチドは、タンパク質組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、上述の（ａ－１）又は（ａ－２）と（ｂ）を含み、必要に応じて（ｃ）～（ｈ）の少なくとも１つを更に含む。発現単位は、通常、プロモーターを含む。これによりポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現産物を効率よく生産され得る。プロモーターとしては、例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、及びＳＰ６プロモーターが挙げられ、エンハンサーを含み得る。プロモーターは、ポリヌクレオチドに、その発現が可能な形式で連結されていればよく、例えば、コード配列の上流（５´）側に連結される。発現単位はＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、好ましくはＤＮＡである。発現単位は、ターミネーター、リボソーム結合部位、薬物耐性遺伝子、ＲＮＡプロセシングシグナル、翻訳効率を向上させる配列、タンパク質の安定性を高める配列、タンパク質の分泌を高める配列等の因子を含んでもよい。
無細胞タンパク質生産系は、細胞抽出液（例えば、コムギ胚芽抽出液、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、昆虫細胞抽出液）を用いて、透析重層法により実施することが好ましく、市販のタンパク質無細胞発現キットに沿って実施できる。
なお、リポソームの代わりに、他のタンパク質構築システム、例えば人工脂質膜モデルを用いてもよい。人工脂質膜モデルにおけるタンパク質組成物の構築は、常法に従って行えばよい。なお、人工脂質膜モデルは、天然の脂質、合成の脂質またはその両方から構成されていてもよく、特に限定されない。
（細胞）
本発明の細胞は、タンパク質組成物を構成する各タンパク質（（Ａ）、（Ｂ）のタンパク質、及び、必要に応じて（Ｃ）～（Ｈ）の少なくとも１つのタンパク質）を発現する細胞である。細胞としては、例えば大腸菌、酵母等の微生物細胞、植物細胞、動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞は、前記ポリヌクレオチドを含む発現単位を含むことが好ましい。発現単位は、プロテオリポソームの説明において説明したのと同様である。細胞が含み得る発現単位は、異種発現単位であることが好ましい。本明細書において異種発現単位とは、発現単位において、各タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び通常含まれるプロモーターの少なくとも一方が宿主細胞に固有のものではないものを意味する。好ましくは両方が宿主細胞に固有のものではない。
細胞を製造する方法としては、例えば、上記タンパク質組成物を構成するタンパク質のそれぞれをコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む発現ベクターで形質転換する方法が挙げられる。タンパク質組成物は上述のとおり少なくとも２つのタンパク質を含むことから、発現ベクターは１つ（すべてのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む）でもよいし、２つ以上（それぞれの又はいくつかごとのポリヌクレオチドを含む発現単位を含む）でもよい。発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。発現ベクターにおいて、前記ポリヌクレオチドは、構成型プロモーター、又は誘導型プロモーターの制御下に配置され得る。
発現ベクターによる宿主の形質転換は、１以上の公知の方法を用いて行うことができる。このような方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
細胞は、上記のプロテオリポソームを含む細胞でもよい。プロテオリポソームは、天然起源のリポソームから作製されたものであることが好ましい。これにより、細胞膜との相互作用を容易に進めることができる。プロテオリポソームを含む細胞は、両者を相互作用させることによって製造できる。相互作用させる方法としては、例えば、リポソームを細胞表面へ吸着又は結合させる方法、リポソームを細胞内へ取り込ませる方法（エンドサイトーシスあるいはファゴサイトーシス）、リポソームの脂質二重膜と細胞膜とを融合させる方法が挙げられる。
〔イソプレン重合化合物の製造方法〕
上記タンパク質組成物、プロテオリポソーム、及び細胞は、イソプレン重合化合物の製造に用いることができる。
イソプレン重合化合物の製造においては、低分子量アリル性化合物を基質としたイソプレン重合反応を行う。低分子量アリル性化合物としては、例えば、イソプレニル二リン酸、ファルネシル二リン酸が挙げられ、これらの両方であることが好ましい。反応温度、反応時間等の条件は、適宜設定できる。代表的なイソプレン重合化合物としては、シス－ポリイソプレンが挙げられ、ゴムの原材料として有用である。イソプレン重合化合物の他の例としては、ドリコール、ポリプレノール、これらの誘導体が挙げられ、これらは生体において生理活性（例えば、免疫活性、抗ウイルス活性、抗酸化活性）を発揮することから医薬及び健康食品の材料として有用である。また、ゴム製品の添加剤（例えば、可塑剤、相溶化剤）としても利用できる。
〔イソプレン重合化合物の製造用キット〕
上記タンパク質組成物、プロテオリポソーム、及び細胞は、イソプレン重合化合物の製造用キットとして用いることができる。キットは、通常、基質としての低分子量アリル化合物を含む。さらに、反応容器、必要な試薬を含んでもよい。
〔ゴムの製造方法〕
上記イソプレン重合化合物の製造方法により得られるイソプレン重合化合物は、ゴムの製造に用いることができる。イソプレン重合化合物からゴムを製造する手順及び条件は、常法に従えばよく、例えば、イソプレン重合化合物を混練後、架橋及び成型する方法が挙げられる。必要に応じて用いることができる添加剤としては、例えば、補強剤、シランカップリング剤、充填剤、加硫剤、加硫促進剤、加硫促進助剤、オイル、硬化レジン、ワックス、老化防止剤、着色剤が挙げられる。これらの添加剤は、それぞれに応じた段階で添加すればよい。得られるゴムは、タイヤ、建材、スポーツ用品、自動車部品等の各種用途に利用できる。
実施例１～１１
（１）天然ゴム生合成タンパク質遺伝子の取得
『Ｒｕｂｂｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ』（ｈｔｔｐ://Ｍａｔｓｕｉ－ｌａｂ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｒｕｂｂｅｒ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）よりラテックス中で高生産される７タンパク質（ＣＰＴ１、ＣＰＴ２、ＣＰＴＬ，ＲＥＦ１、ＲＥＦ２、ＲＥＦ８、及びＳＲＰＰ１）を選抜した。また、系統解析から２タンパク質（ＣＰＴ６及びＣＰＴ７）を選抜した。
各タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡ、あるいは各遺伝子を含んだプラスミドを鋳型としたＰＣＲによってＣＰＴ１、ＣＰＴ２、ＣＰＴ６、ＣＰＴ７、ＣＰＴＬ，ＲＥＦ１、ＲＥＦ２、ＲＥＦ８、及びＳＲＰＰ１遺伝子を取得した。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ｔａｋａｒａ）またはＫＯＤ Ｏｎｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ）の説明書に従って反応を行い、プライマーには必要に応じて制限酵素消化サイト、Ｈｉｓタグ配列を付加した。
ＣＰＴ１、ＣＰＴ２、ＣＰＴ６、ＣＰＴ７、ＣＰＴＬ，ＲＥＦ１、ＲＥＦ２、ＲＥＦ８、及びＳＲＰＰ１遺伝子のそれぞれの取得のためのプライマーセットとして、プライマー１および２、プライマー３および４、プライマー５および６、プライマー７および８、プライマー９および１０、プライマー１１および１２、プライマー１３および１４、プライマー１５および１６、プライマー１７および１８を用いた。
（ＣＰＴ１遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー１：５’－ａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇ－３’（配列番号１９）
プライマー２：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇｔｔｔｔａａｇ－３’（配列番号２０）
（ＣＰＴ２遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー３：５’－ａｔｇｇａａａｔａｔａｔａｃｇｇｇｔｃａｇ－３’（配列番号２１）
プライマー４：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇｔｔｔｔａａａｔａｔｔｃ－３’（配列番号２２）
（ＣＰＴ６遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー５：５’－ａｔｇｇａａａａａｃａｔａｇｃａｇｔａｇ－３’（配列番号２３）
プライマー６：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａｔａｔａａｃｔｇａｔｇｃｔｔｔｔｔｃ－３’（配列番号２４）
（ＣＰＴ７遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー７：５’－ａｔｇｃａａｔｃｃｔｔｇｃａｃｔｔｇ－３’（配列番号２５）
プライマー８：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇｔａａｇｔｃｇｔｃｔａｃｃａｔａｇ－３’（配列番号２６）
（ＣＰＴＬ遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー９：５’－ａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇ－３’（配列番号２７）
プライマー１０：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇｔｇｔａｃ－３’（配列番号２８）
（ＲＥＦ１遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー１１：５’－ａｔｇｇｃｔｇａａｇｇｔｇａａｇａａｇａｇｇｔｇａａｔａｔｃ－３’（配列番号２９）
プライマー１２：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｃａｃｃｃａｔｃｔｃｃａｔａｔａｇｃａｃ－３’（配列番号３０）
（ＲＥＦ２遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー１３：５’－ａｔｇｇｃｔｇａａｇａｃｇａａｇａｃａａｃｃａａｃａａｇ－３’（配列番号３１）
プライマー１４：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｃａａｔｔｃｔｃｔｃｃａｔａａａａｃａｃ－３’（配列番号３２）
（ＲＥＦ８遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー１５：５’－ａｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇａａａｇａａａａｃｇａｇａａｔｔｔｃ－３’（配列番号３３）
プライマー１６：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔｃｔｇｃａｃｔｔｔｃｃｔｔｃａｃ－３’（配列番号３４）
（ＳＲＰＰ１遺伝子取得用プライマーセット）
プライマー１７：５’－ａｔｇｇｃｔｇａａｇａｇｇｔｇｇａｇｇａａｇａｇａｇｇｃ－３’（配列番号３５）
プライマー１８：５’－ａｔｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇａｔｇｃｃｔｃａｔｃｔｃｃａａａｃ－３’（配列番号３６）
上述の方法により得られた各遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＣＰＴ１、ＣＰＴ２、ＣＰＴ６、ＣＰＴ７、ＣＰＴＬ，ＲＥＦ１、ＲＥＦ２、ＲＥＦ８、及びＳＲＰＰ１遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７に示し、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８に示した。
（２）無細胞タンパク質合成用プラスミドの作製
上記（１）で獲得した各遺伝子のＰＣＲ反応産物をプライマーに付加した制限酵素ＸｈｏＩで処理したのち、表１の各組み合わせを選択し、ＥｃｏＲＶとＸｈｏＩで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳに挿入することで無細胞タンパク質合成用プラスミドを作製した。
（３）大腸菌の形質転換
上記作製したプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーＰＣＲによって目的プラスミドが導入された形質転換体を選抜した。
（４）無細胞タンパク質合成法用プラスミドの作製
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔＧｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
（５）大腸菌の形質転換
上記で作製したプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。
（６）無細胞タンパク質合成法用プラスミドの回収
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、１μｇ／μｌになるように調整した。
（７）透析重層法によるリポソーム共存下の膜タンパク質（プロテオリポソーム）合成
ダイズ由来リン脂質で脂質二重膜（リポソーム：直径数百ｎｍ程度）を作製した。無細胞タンパク質合成は、ＰｒｏｔｅｏＬｉｐｏｓｏｍｅ ＢＤ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（セルフリーサイエンス）に付属のプロトコルに従ってリポソーム添加条件で行った。鋳型となる９種タンパク質の発現用プラスミドは、１μｇ／μｌに調整したものを表１に示す組み合わせで用い、全量で約１３μｌとなるよう等量比で用いた。例えば、実施例３においては、９種を１．５μＬずつ、合計１３．５μＬとなるように転写反応系に加えた。合成反応終了後、付属のプロトコルに従い、リポソームに９種タンパク質が結合したＰｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅの簡易精製を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて合成の確認を行った。
（８）イソプレン重合活性の測定
無細胞合成したタンパク質のイソプレン重合活性を以下の方法により測定した。
終濃度５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、終濃度１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、終濃度２ｍＭ ＤＴＴ、終濃度１０μＭファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、５０μＭ終濃度14Ｃ－イソペンテニル二リン酸（14Ｃ－ＩＰＰ）（比放射能：１．４８－２．２２ ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）、５μＬ Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅを混合した反応溶液１００μＬを調製し、３０℃で２４時間反応させた。
反応後、飽和食塩水を２００μＬ添加し、３００μＬの水飽和ｎ－ブタノールによって反応産物を抽出した。回収した水飽和ｎ－ブタノール層に４００μＬの２Ｍ ＮａＣｌを添加、懸濁の後、水飽和ｎ－ブタノール層を回収した。回収した溶液５０ μＬにクリアゾルＩＩ（ナカライテスク） ５ｍＬを加え、よく混合した後に液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ－８０００；Ａｌｏｋａ）にて放射線量（ｄｐｍ）を測定した。Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅを添加していない反応系をネガティブコントロールとし、各種タンパク質を含んだＰｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅを使用した結果を表１に示す。
（９）イソプレン重合反応産物のＴＬＣラジオグラム
上記で回収した水飽和ｎ－ブタノール溶液は遠心エバポレーターによって有機層を揮発させた。終濃度１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、終濃度１Ｕ酸性ホスファターゼ、ジャガイモ由来、１ｍＬのメタノールを混合した反応溶液１．５ｍＬを加え、３７℃で１７時間反応させた。
反応後、ヘキサン５００μＬで抽出し、得られたヘキサン層は遠心エバポレーターによって濃縮乾燥させた。乾燥物をヘキサン１０μＬによって再溶解し、全量をＴＬＣプレート（メルク社、ＴＬＣガラスプレート ＲＰ－１８Ｆ２５４Ｓ ５×１０ｃｍ）にスポットした。アセトン：水＝１９：１にて展開したものをイメージングプレートに露光し、スキャナー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ９５００）を用いて可視化した。
比較例１（ネガティブコントロール）
プロテオリポソームを添加しなかったほかは、上記実施例と同様の操作を行った。
比較例２～９（ネガティブコントロール以外）
各タンパク質の無細胞合成用プラスミドを１μｇ／μｌに調整した。反応におけるプラスミド総量を１３．５μｌとし、各プラスミドの添加量が等比となるように添加した。以降は、上記実施例と同様の操作を行った。
Figure 2022073233000001
表１から明らかなように、各実施例の放射線量は、比較例の放射線量と比較して高く、産物（分子量１，０００～２，０００程度と推測される）が合成されていることが分かった。ＣＰＴ６及びＣＰＴＬの組み合わせである実施例１、ＣＰＴ７及びＣＰＴＬの組み合わせである実施例２は、比較例よりも放射線量が高いことから、各組み合わせがイソプレン重合活性を発揮することが明らかとなった。また、更に他のタンパク質を組み合わせた実施例３～１１も比較例より放射線量が高く、実施例１及び２よりも放射線量が高いものがあったことから、ＣＰＴ６，７，ＣＰＴＬ以外のタンパク質も、イソプレン重合活性を促進する可能性があることが明らかとなった。
以上の結果は、本発明により天然ゴムの効率的な生産が可能であることを示している。
配列番号１：ＣＰＴ１の塩基配列
配列番号２：ＣＰＴ１のアミノ酸配列
配列番号３：ＣＰＴ２の塩基配列
配列番号４：ＣＰＴ２のアミノ酸配列
配列番号５：ＣＰＴ６の塩基配列
配列番号６：ＣＰＴ６のアミノ酸配列
配列番号７：ＣＰＴ７の塩基配列
配列番号８：ＣＰＴ７のアミノ酸配列
配列番号９：ＣＰＴＬの塩基配列
配列番号１０：ＣＰＴＬのアミノ酸配列
配列番号１１：ＲＥＦ１の塩基配列
配列番号１２：ＲＥＦ１のアミノ酸配列
配列番号１３：ＲＥＦ２の塩基配列
配列番号１４：ＲＥＦ２のアミノ酸配列
配列番号１５：ＲＥＦ８の塩基配列
配列番号１６：ＲＥＦ８のアミノ酸配列
配列番号１７：ＳＲＰＰ１の塩基配列
配列番号１８：ＳＲＰＰ１のアミノ酸配列
配列番号１９：プライマー１（ＣＰＴ１遺伝子取得用）
配列番号２０：プライマー２（ＣＰＴ１遺伝子取得用）
配列番号２１：プライマー３（ＣＰＴ２遺伝子取得用）
配列番号２２：プライマー４（ＣＰＴ２遺伝子取得用）
配列番号２３：プライマー５（ＣＰＴ６遺伝子取得用）
配列番号２４：プライマー６（ＣＰＴ６遺伝子取得用）
配列番号２５：プライマー７（ＣＰＴ７遺伝子取得用）
配列番号２６：プライマー８（ＣＰＴ７遺伝子取得用）
配列番号２７：プライマー９（ＣＰＴＬ遺伝子取得用）
配列番号２８：プライマー１０（ＣＰＴＬ遺伝子取得用）
配列番号２９：プライマー１１（ＲＥＦ１遺伝子取得用）
配列番号３０：プライマー１２（ＲＥＦ１遺伝子取得用）
配列番号３１：プライマー１３（ＲＥＦ２遺伝子取得用）
配列番号３２：プライマー１４（ＲＥＦ２遺伝子取得用）
配列番号３３：プライマー１５（ＲＥＦ８遺伝子取得用）
配列番号３４：プライマー１６（ＲＥＦ８遺伝子取得用）
配列番号３５：プライマー１７（ＳＲＰＰ１遺伝子取得用）
配列番号３６：プライマー１８（ＳＲＰＰ１遺伝子取得用）

Claims (24)

  1. （Ａ－１）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、又は、
    （Ａ－２）配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質と、
    （Ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質と、
    を含む、イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物。
  2. （Ａ－１）が、
    配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ａ－１）によりコードされるタンパク質であること、
    （Ａ－２）が、
    配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ａ－２）によりコードされるタンパク質であること、及び
    （Ｂ）が、
    配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｂ）によりコードされるタンパク質であること
    の少なくともいずれかである、請求項１に記載の組成物。
  3. ＣＰＴ６、７及びＣＰＴＬ以外のＣＰＴファミリータンパク質、ＲＥＦファミリータンパク質、及びＳＲＰＰファミリータンパク質を更に含む、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. （Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
    （Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
    （Ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
    （Ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質、並びに、配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、
    （Ｇ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質、及び
    （Ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号１８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質
    から選ばれる少なくとも１つを更に含む、請求項１に記載の組成物。
  5. （Ｃ）が、
    配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｃ）によりコードされるタンパク質であること、
    （Ｄ）が、
    配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｄ）によりコードされるタンパク質であること、
    （Ｅ）が、
    配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｅ）によりコードされるタンパク質であること、
    （Ｆ）が、
    配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｆ）によりコードされるタンパク質であること、
    （Ｇ）が、
    配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｇ）によりコードされるタンパク質であること、及び、
    （Ｈ）が、
    配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド（ｈ）によりコードされるタンパク質であること、
    の少なくともいずれかである、請求項４に記載の組成物。
  6. （Ａ）～（Ｈ）のタンパク質の少なくとも１つは、ゴムノキ由来のタンパク質である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物及びリン脂質を含む脂質膜構築体。
  8. 脂質二重膜構築体である、請求項７に記載の構築体。
  9. プロテオリポソームである、請求項７又は８に記載の構築体。
  10. 請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、リン脂質を含む原料の存在下、無細胞タンパク質生産系にて発現させることを含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の脂質膜構築体の製造方法。
  11. 請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、
    （ａ－１）配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、又は
    （ａ－２）配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと、
    （ｂ）配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと
    を含む、請求項１０に記載の脂質膜構築体の製造方法。
  12. ポリヌクレオチドは、請求項３又は４に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    （ｃ）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
    （ｄ）配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
    （ｅ）配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
    （ｆ）配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
    （ｇ）配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、及び
    （ｈ）配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
    の少なくともいずれかを更に含む、請求項１０又は１１に記載の脂質膜構築体の製造方法。
  13. リン脂質を含む原料はリポソームを含み、脂質膜構築体がプロテオリポソームである、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の脂質膜構築体の製造方法。
  14. 請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物を構成するタンパク質を発現する細胞。
  15. 請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質組成物に含まれる各タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む請求項１４に記載の細胞。
  16. ポリヌクレオチドは、
    （ａ－１）配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ６と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、又は
    （ａ－２）配列番号７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、ＣＰＴ７と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと、
    （ｂ）配列番号９の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号９の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴＬと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドと
    を含む、請求項１４又は１５に記載の細胞。
  17. ポリヌクレオチドは、請求項３又は４に記載の組成物を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    （ｃ）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
    （ｄ）配列番号３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＰＴ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
    （ｅ）配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１１の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
    （ｆ）配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ２と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
    （ｇ）配列番号１５の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＲＥＦ８と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド、及び
    （ｈ）配列番号１７の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１７の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、ＳＲＰＰ１と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれる１以上のポリヌクレオチド
    の少なくともいずれかを更に含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の細胞。
  18. 発現単位が異種発現単位である、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の細胞。
  19. 請求項９に記載の脂質膜構築体を含む、請求項１４に記載の細胞。
  20. 請求項９に記載の脂質膜構築体を細胞と相互作用させることを含む、請求項１４に記載の細胞の作製方法。
  21. 請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物、請求項７～９に記載の構築体、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の細胞から選ばれる少なくとも１つを用いてイソプレン重合反応を行うことを含む、イソプレン重合化合物の製造方法。
  22. 低分子量アリル化合物を基質としてイソプレン重合反応を行う、請求項２１に記載の製造方法。
  23. 請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物、請求項７～９に記載の構築体及び請求項１４～１９のいずれか１項に記載の細胞から選ばれる少なくとも１つ、及び
    低分子量アリル化合物
    を含む、イソプレン重合化合物製造用キット。
  24. 請求項２１又は２２に記載の製造方法により製造されるイソプレン重合化合物を用いてゴムを製造することを含む、ゴムの製造方法。
JP2020183088A 2020-10-30 2020-10-30 イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途 Pending JP2022073233A (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020183088A JP2022073233A (ja) 2020-10-30 2020-10-30 イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途
CN202180035798.1A CN115698293A (zh) 2020-10-30 2021-10-21 具有异戊二烯聚合活性的蛋白质组合物及其用途
PCT/JP2021/038921 WO2022091932A1 (ja) 2020-10-30 2021-10-21 イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途
EP21886051.8A EP4151731A4 (en) 2020-10-30 2021-10-21 PROTEIN COMPOSITION WITH ISOPRENE POLYMERIZATION ACTIVITY AND USE THEREOF
US17/968,818 US20230065493A1 (en) 2020-10-30 2022-10-19 Protein composition with isoprene polymerization activity and application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020183088A JP2022073233A (ja) 2020-10-30 2020-10-30 イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022073233A true JP2022073233A (ja) 2022-05-17

Family

ID=81382339

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020183088A Pending JP2022073233A (ja) 2020-10-30 2020-10-30 イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230065493A1 (ja)
EP (1) EP4151731A4 (ja)
JP (1) JP2022073233A (ja)
CN (1) CN115698293A (ja)
WO (1) WO2022091932A1 (ja)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY174987A (en) * 2011-04-29 2020-05-31 Univ Sains Malaysia Undecaprenyl pyrophosphate synthase from the plant of hevea brasiliensis
EP3323894B1 (en) * 2015-06-15 2020-03-11 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Method for producing natural rubber by using recombinant microorganism
JP6485771B2 (ja) * 2015-06-30 2019-03-20 住友ゴム工業株式会社 凝集の抑制されたゴム粒子の製造方法、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
JP6586693B2 (ja) * 2015-06-30 2019-10-09 住友ゴム工業株式会社 ポリイソプレノイドの製造方法、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
JP6778372B2 (ja) * 2015-06-30 2020-11-04 住友ゴム工業株式会社 ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN115698293A (zh) 2023-02-03
EP4151731A4 (en) 2024-05-08
WO2022091932A1 (ja) 2022-05-05
EP4151731A1 (en) 2023-03-22
US20230065493A1 (en) 2023-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10907179B2 (en) Production method for polyisoprenoid, vector, transgenic plant, production method for pneumatic tire, and production method for rubber product
JP6586693B2 (ja) ポリイソプレノイドの製造方法、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
WO2018116726A1 (ja) トランス型ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
Umar et al. Plant molecular engine out of the chassis: Natural rubber synthesis in cell-free systems
WO2021010101A1 (ja) 融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
BR112016015820B1 (pt) Transformante para expressar cis-preniltransferase e receptor nogo b
JP2022073233A (ja) イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途
JP6757938B2 (ja) イソプレンオリゴマー、ポリイソプレン、及びこれらの製造方法、ゴム組成物、並びに空気入りタイヤ
RU2811542C1 (ru) Композиция белков с активностью полимеризации изопрена и ее применение
WO2021100419A1 (ja) 融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
WO2017022804A1 (ja) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体、及びそれを用いたオレフィン化合物の製造方法
JP7168955B2 (ja) ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
WO2018143163A1 (ja) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体、及びそれを用いたオレフィン化合物の製造方法
WO2018062178A1 (ja) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体、及びそれを用いたオレフィン化合物の製造方法
WO2021177074A1 (ja) ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
WO2023037842A1 (ja) トランス型ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換生物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
JP2024050434A (ja) イソプレノイドの製造方法、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
US20220073953A1 (en) Synthetic enzyme complexes for in vitro rubber production
US20230279369A1 (en) Mutant cis-prenyltransferase (cpt) family protein, method for producing polyisoprenoid, vector, transgenic plant, method for producing pneumatic tire, and method for producing rubber product
WO2024090440A1 (ja) フェルラ酸デカルボキシラーゼ、及びそれを用いた不飽和炭化水素化合物の製造方法
Maric et al. Preparation of selectively deuterated phosphatidylcholine in genetically engineered Escherichia coli

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230705