CN102245776A - 植物根特异的线虫抗性 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含与在线虫感染的植物的合胞体中下调的多核苷酸有效连接的根特异性启动子的表达载体，用于产生具有对线虫感染增加的抗性的转基因植物的方法中。本发明也提供了包含此类表达载体的线虫抗性转基因植物和种子。

Description

植物根特异的线虫抗性
本申请要求2008年12月11日提交的美国临时申请编号61/201,471的优先权权益，所述专利的全部内容在此引入作为参考。
发明领域
本发明涉及通过使用线虫抗性转基因植物和种子来增强农业产量，以及制备此类植物和种子的方法。
发明背景
线虫是以多于2000种行栽作物、蔬菜、水果和装饰植物的根、叶和茎为食的显微镜可见的线虫动物，引起世界范围内据估计一千亿美元的作物损失。多种寄生线虫物种感染作物植物，包括根结线虫(RKN)、胞囊形成线虫(cyst-forming nematode)和病变形成线虫(lesion-formingnematode)。以在摄食部位引起根虫瘿形成为特征的根结线虫具有相对广的宿主范围并因此寄生在多种作物物种上。胞囊形成线虫和病变形成线虫物种具有较为有限的宿主范围，但是仍在易感作物中引起相当大的损失。
在全美国均存在寄生性线虫，但主要在南部和西部温暖、潮湿的地区和在沙质土壤地区以最大密集度出现。1954年首次于美国北卡罗莱纳发现大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)，它是大豆植物的最严重害虫。一些地区被大豆胞囊线虫(SCN)如此严重地感染，以至于在没有控制措施时大豆生产不再是经济上可行的。虽然大豆是被SCN侵害的主要经济作物，但SCN寄生于总共大约50种宿主，包括田地作物、蔬菜、装饰植物和杂草。
线虫损害的迹象包括叶的矮缩和黄化、在热的期间植物萎蔫。但是，线虫感染能引起显著的产量损失而无明显的地上症状。产量降低的主要原因是由于地下的根损伤。受到SCN感染的根会矮化或者发育不良。线虫感染也可以减少根上固氮根瘤的数量，并可以使根更易于受到其他土传植物线虫的攻击。
线虫的生活周期有三个主要阶段：卵、幼虫和成虫。在线虫的种之间生活周期是变化的。SCN的生活周期类似于其他植物寄生线虫的生活周期。在最佳的条件下，SCN的生活周期通常可以在24至30天内完成，而其他物种可能需要1年或者更长的时间来完成生活周期。当温度和湿度水平在春天变得充分时，蠕虫形状的幼虫从土壤中的卵孵化出来。仅在幼虫发育阶段的线虫能感染大豆根。
SCN幼虫在进入大豆根后，在根中移动直至它们接触到维管组织，它们停止在维管组织并开始摄食。线虫使用口针注入改变某些根细胞的分泌物，并将根细胞转化为特化的摄食部位。根细胞在形态上转化为大的多核合胞体(或在RKN的情形为巨细胞)，其用作线虫的营养物源。活跃摄食的线虫由此从植物偷取了必需的营养物，导致了植物的产量损失。随着雌性线虫摄食，它们变胖并最终雌性线虫变得如此的大，以至于它们的身体透过根组织并暴露于根的表面。
在一段时间的进食后，雄性SCN线虫移出根，进入土壤并对增大的成年雌性受精。然后雄性线虫死去，而雌性线虫仍附着在根系统并继续摄食。在胖的雌性线虫中的卵开始发育，开始是在体外成团或卵囊，然后在体腔内。最后成体雌性的整个体腔充填着卵，并且雌性线虫死去。死去的雌性线虫充填着卵的身体称为胞囊。胞囊最终脱离并发现游离于土壤中。胞囊壁变得非常结实，为其中含有的约200至400枚卵提供了极好的保护。SCN卵在胞囊中存活直至出现合适的孵化条件。虽然许多卵可以在第一年孵化，但是许多卵也可以仍然在胞囊中存活数年。
线虫以它自身的能力每年仅能在土壤中移动若干英寸。但是线虫感染能以多种方式传播相当大的距离。任何能够移动受感染的土壤的事物都能传播感染，包括农业机械、交通工具和用具、风、水、动物，以及农业工作者。土壤的种子大小的颗粒通常污染收获的种子。结果是，当来自受感染田地的被污染的种子种植在未受感染的田地时，可传播线虫感染。甚至有证据表明某些线虫物种能够通过鸟传播。这些起因中仅有一些可被防止。
管理线虫感染的常规实践包括：在线虫感染的土地中维持合适的土壤营养物和土壤pH水平；控制其它植物疾病以及昆虫和杂草害虫；使用环境卫生实践，如仅在操作了未感染田地后再耕地、种植、培育线虫感染的田地；在受感染田地工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用生长在受感染土地的种子来种植未感染田地，除非所述种子已经完全地清洁过了；轮作被感染田地并用非宿主作物替代宿主作物；使用杀线虫剂；以及种植抗性植物品种。
已经提议了用于遗传转化植物以赋予对植物寄生的线虫提高的抗性的方法。例如，许多方法涉及用能抑制基本线虫基因的双链RNA来转化植物。其他农业生物技术方法提出过量表达编码对线虫有毒性的蛋白质的基因。美国专利号5,589,622和5,824,876涉及在受到线虫附着后在植物的摄食部位内或者附近特异表达的植物基因的鉴定。
US 2009/0089896公开了在SCN感染的大豆的合胞体中诱导的Mtn21样基因的启动子。WO 2008/077892公开了在SCN感染的大豆的合胞体中诱导的过氧化物酶样基因的启动子。WO 2008/071726公开了在SCN感染的大豆的合胞体中诱导的海藻糖-6-磷酸磷酸酶样基因的启动子。WO2008/095887公开了在SCN感染的大豆的合胞体中诱导的Mtn3样基因的启动子。WO 2008/095888公开了在SCN感染的大豆的合胞体中诱导的At5g12170样基因的启动子。
许多专利公开预言性地公开并总体上要求保护包含上千种植物基因中的任意一种或多种并具有改善的农艺学特征的转基因植物。此类专利公开的示例包括US2004/0031072、US2006/0107345、US2004/0034888、US2004/0019927、US2004/0045049、US2004/0019927、US2006/0272060、WO2005/5112608、US2006/0150283和US2007/0214517。在这些专利公开中描述了作为转基因植物的一种潜在改进的农艺学特性公开的病原体抗性，包括线虫抗性。然而，这些专利公开并没有特定地涉及在含有该基因的转基因植物中具有改进的线虫抗性的任一公开的基因。
富含丝氨酸-精氨酸(富含SR)的蛋白质是植物基因表达的关键调节物，其中多个基因家族成员有助于RNA的组成型剪接、核输出、mRNA稳定性的维持和蛋白质翻译。SR蛋白质也参与备选的RNA剪接，其中，它们结合特定的RNA序列并指导剪接复合体在弱剪接位点形成。富含SR的基因家族在植物中具有中等数量，不同的亚组分成了大约5种基于基序的类别。
Avr9诱导的111B样基因是与来自烟草(Nicotiana tabacum)的111BACRE(Avr9/Cf-9快速诱导的)和来自拟南芥属(Arabidopsis)的DREB1A/CBF3具有序列同源性的转录因子。在烟草中，111B ACRE基因是与致病原因相关的转录激活子，其在对由黄枝孢霉(Cladosporiumfulvum)(一种活体营养真菌)表达的Avr9应答时，在表达Cf-9抗性基因的株系中被快速地诱导。在其他物种中，CBF3/DREB1基因涉及激活非生物的胁迫应答。美国专利号7,345,217公开了SEQ ID NO：1408，一种Avr9诱导的111B样基因，其声称是称为G912的拟南芥(Arabidopsisthaliana)DNA的同源物。美国专利号7,345,217从总体上公开了其中所公开的上千种基因的可能用途的许多种类，其中之一个种类鉴定为疾病抗性，包括线虫抗性。但是，在美国专利号7,345,217中提出的G912和其同源物的唯一特定用途是对寒冷、冰冻、干旱和盐胁迫的改善的耐受性。
碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和脱水应答元件结合(DREB)转录因子也是植物中的关键调节分子。已经在植物中实验地表明了一些bHLH基因的生理功能。已知R和TT8基因在玉米和拟南芥属中调节花色素苷累积，而其它bHLH基因与光敏色素相互作用并调节光反应。其它bHLH基因调节激素信号。然而，大多数植物bHLH基因的生理作用是未知的，并且在核心bHLH特征结构域的外面，bHLH基因家族成员之间存在很少的序列保守性。
Dirigent样蛋白质属于在到目前为止分析的所有主要陆生植物组中发现的一个大的、多样的基因家族。Dirigent编码的基因分为5个系统发育亚家族，Dir-A至Dir-E。已经显示，Dir-A亚家族与酚类氧化酶结合地在一系列植物物种中指导木质素(细胞壁组分)和木脂体(植物抗氧化物和防御化合物)的立体特异性组装。来自豌豆(Pisum sativa)的Dir-A基因，PsDIR1的表达在转基因卡诺拉(canola)中赋予了对多种真菌病原体的抗性。许多胁迫，例如机械创伤、食植动物和真菌感染都诱导Dir-A亚家族基因。尽管来自Dir-C亚家族的基因显示出可以通过茉莉酮酸处理、水杨酸和通过无毒的Hessian蝇幼虫进食来诱导，但是还并没有充分表征来自亚族Dir-B、Dir-C、Dir-D和Dir-E(Dir样)蛋白质的基因的具体生物化学功能。
到目前为止，在任何国家中还没有解除对包含能赋予线虫抗性的转基因的基因修饰植物的管制。因此，仍然存在使用农业生物技术来鉴定用于控制植物寄生线虫的安全且有效的组合物和方法的需要。
发明概述
本发明人已经发现，包含编码富含丝氨酸-精氨酸蛋白质、AVR9诱导的_111B样蛋白质、bHLH蛋白质或Dirigent样蛋白质的多核苷酸的转基因在根中的表达使得大豆植物抗SCN感染。因此，本发明提供了克服或者至少减轻线虫感染有价值的农作物的转基因植物和种子，以及方法。
在一个实施方案中，本发明提供包含与多核苷酸有效连接的根特异性启动子的分离的表达载体，所述多核苷酸选自：a)编码富含丝氨酸-精氨酸蛋白质的多核苷酸；b)编码AVR9诱导的_111B样蛋白质的多核苷酸；
c)编码碱性螺旋-环-螺旋蛋白质的多核苷酸；和d)编码dirigent样蛋白质的多核苷酸。
在另一实施方案中，本发明提供制备线虫抗性转基因植物的方法，该方法包括步骤：a)提供包含与多核苷酸有效连接的根特异性启动子的重组表达载体，所述多核苷酸选自：i)编码富含丝氨酸-精氨酸蛋白质的多核苷酸；ii)编码AVR9诱导的_111B样蛋白质的多核苷酸；iii)编码碱性螺旋-环-螺旋蛋白质的多核苷酸；和iv)编码dirigent样蛋白质的多核苷酸；b)用重组表达载体转化植物细胞；c)从转化的植物细胞再生转基因植物；和d)当与不包含重组表达载体的野生型植物比较时，选择对植物寄生性线虫感染显示出增加抗性的转基因植物。
又在另一实施方案中，本发明提供包含含有与多核苷酸有效连接的根特异性启动子的重组表达载体的线虫抗性转基因植物，所述多核苷酸选自：a)编码富含丝氨酸-精氨酸蛋白质的多核苷酸；b)编码AVR9诱导的_111B样蛋白质的多核苷酸；c)编码碱性螺旋-环-螺旋蛋白质的多核苷酸；和d)编码dirigent样蛋白质的多核苷酸。
在另一实施方案中，本发明提供对于包含含有与多核苷酸有效连接的根特异性启动子的重组表达载体的转基因是纯合的种子，所述多核苷酸选自：a)编码富含丝氨酸-精氨酸蛋白质的多核苷酸；b)编码AVR9诱导的_111B样蛋白质的多核苷酸；c)编码碱性螺旋-环-螺旋蛋白质的多核苷酸；和d)编码dirigent样蛋白质的多核苷酸。
附图简述
图1a-1b显示分配给对应的基因和启动子的SEQ ID NO的表。SEQ IDNO 1、37、39和49分别对应于用于编码富含丝氨酸/精氨酸蛋白质的多核苷酸的全长大豆核苷酸序列(SEQ ID NO：1)、编码Avr9-诱导的111B蛋白质的多核苷酸的全长大豆核苷酸序列(SEQ ID NO：37)、编码bHLH蛋白质的多核苷酸的全长大豆核苷酸序列(SEQ ID NO：39)和编码Dirigent样蛋白质的多核苷酸的全长大豆核苷酸序列(SEQ ID NO：49)。合胞体诱导的启动子序列在SEQ ID NO：57(来自拟南芥(A.thaliana)的TPP样启动子)、SEQ ID NO：58(来自大豆的MtN3样启动子)和SEQ IDNO：59(来自拟南芥的基因座At5g12170的启动子)中给出。在SEQ IDNO：60中给出了来自皱叶欧芹(P.crispum)的称为PcUbi4-2的组成型遍在蛋白启动子。
图2a-2c显示使用Vector NTI软件套件v10.3.0(空位开口罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分离罚分＝8)进行的示例性富含丝氨酸/精氨酸蛋白质的氨基酸比对。
图3显示使用Vector NTI软件套件v10.3.0(空位开口罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分离罚分＝8)进行的示例性碱性螺旋-环-螺旋蛋白质的氨基酸比对。
图4显示使用Vector NTI软件套件v10.3.0(空位开口罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分离罚分＝8)进行的示例性Dirigent样蛋白质的氨基酸比对。
优选的实施方案详述
通过参考以下详细的说明和本文中所包含的实施例可以更容易地理解本发明。在本申请中，参考了多种出版物。因此，所有这些出版物的公开和在那些出版物中引用的那些参考文献以其整体都引入本申请中作为参考，以便更充分地说明本发明所属的技术领域。本文中所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，且并不意为限制。如本文中所用，“一”或“一个“可以意为一个或者多个，取决于在其中使用它的上下文。因此，例如，提到“一个细胞”意为可以使用至少一个细胞。
如本文中所用，词语“或者”指特定名单的任一成员并且也包括该名单的成员的任一组合。
如本文中所定义，“转基因植物”是已经用重组DNA技术改变的植物，以含有否则在植物中不存在的分离的核酸。如本文中所用，术语“植物”包括整个植物、植物细胞和植物部分。植物部分包括但不限于，茎、根、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、胼胝体组织、配子体、孢子体、花粉、小孢子等。本发明的转基因植物可以是雄性不育的或者雄性可育的，并且可以进一步包括除本文中所述的包含分离的多核苷酸的那些转基因的转基因。
如本文中所定义，术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的并指线性的或者分支的、单链或者双链的RNA或者DNA或者它们的杂合物。该术语也包括RNA/DNA杂合物。“分离的”核酸分子是基本上与在该核酸的天然来源中存在的其他核酸分子(如，编码其他多肽的序列)分离的一种核酸分子。例如，认为克隆的核酸是分离的。如果核酸已经通过人为干预改变、或者已经将核酸放置于其非天然位点的基因座或位置、或者如果通过转化将它引入细胞中，那么也认为核酸是分离的。此外，分离的核酸分子，例如cDNA分子，可以没有一些其天然结合的其他细胞物质、或者当通过重组技术产生时，没有培养基、或者当化学合成时没有化学前体或其他化学物质。尽管它可以任选地包含位于基因的编码区的3’和5’末端的非翻译序列，但是它可以优选地除去天然地位于其天然存在的复制子中的编码区侧翼的序列。
术语“基因”广泛地用于指与生物学功能相关的核酸的任意区段。因此，当在基因组序列中时，基因包括内含子和外显子，或者当在cDNA中时，基因仅包括编码序列和/或它们的表达所必需的调节序列。例如，基因指表达mRNA或功能RNA、或者编码特定蛋白质的核酸片段，并且包括调节序列。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指连续氨基酸残基的聚合物。
术语“有效连接”和“有效地连接”可互换并在本文中用于指多个分离的多核苷酸在单个核酸片段上连接，使得一个分离的多核苷酸的功能受到另一个分离的多核苷酸影响。例如，如果两个DNA这样排列以至于调节性DNA影响编码DNA的表达则称调节性DNA“有效连接至”表达RNA或编码多肽的DNA。
文中使用的术语“启动子”指这样的DNA序列，当所述DNA序列连接至目的核苷酸序列时，其能控制目的核苷酸序列转录为mRNA。启动子通常，但不是必需地，位于目的核苷酸的5’(如上游)(如邻近结构基因的转录起始位点)，所述启动子控制目的核苷酸转录为mRNA，并提供了用于特异性被RNA聚合酶和用于起始转录的其它转录因子结合的部位。
文中使用的术语“转录调节元件”指能够调节有效连接的多核苷酸转录的多核苷酸。它包括但不限于启动子、增强子、内含子、5’UTR、和3’UTR。
如文中使用的，术语“载体”指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指额外的DNA节段可连接于其中的环状双链DNA环。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换地使用，因为质粒是最经常使用的载体形式。载体可以是双元载体或T-DNA，其包含左边界和右边界并且可包括位于左边界和右边界之间的目的基因。如本文中所用，术语“表达载体”与术语“转基因”可互换，并意为能指导特定的核苷酸在合适的宿主细胞中表达的载体。核苷酸的表达可以是过量表达。表达载体包含与目的核酸有效连接的调节核酸元件，其任选地与终止信号和/或其他调节元件有效连接。
文中使用的术语“同源物(homologs)”指与由共同的祖先DNA序列下来的第二基因相关的基因。术语“同源物”可应用于通过物种形成事件分离的基因(如直向同源物(orthologs))之间的关系，或可应用于通过遗传复制事件分离的基因(如旁系同源物(paralogs))之间的关系。
如文中使用的，术语“直向同源物”指来自不同物种但自共同的祖先基因通过物种形成进化的基因。直向同源物在进化过程中保留相同的功能。直向同源物编码具有相同或相似功能的蛋白质。如文中使用的，术语“旁系同源物”指在基因组中通过复制而相关的基因。旁系同源物通常具有不同的功能或新的功能，但这些功能可以是相关的。
文中使用的术语“保守的区域”或“保守的结构域”指在异源多核苷酸或多肽序列中的如下区域，所述区域为在不同序列之间有相当高程度序列同一性的区域。“保守的区域”可以例如使用Clustal W算法自多重序列比对鉴定。
文中使用的术语“细胞”或“植物细胞”指单个细胞，并且也包括细胞群。所述群可以是包含一种细胞类型的纯的群体。同样，所述群可以包含多于一种细胞类型。在本发明意义内的植物细胞可以是分离的(如在悬浮培养物中)或包含在植物组织、植物器官中或在任一发育阶段的植物中。
文中使用的术语“纯合的(true breeding)”指对于特定特性的植物品种，如果它对所述特性在遗传上纯合到如下程度：当该不分离品种自身授粉时，在后代之间没有观察到对该特性而言显著量的独立分离。
文中使用的术语“无效分离子(null segregant)”指由于孟德尔分离，转基因植物的不含有转基因的后代(或者衍生自后代的株系)。
文中使用的术语“野生型”指在实验意义上没有被遗传修饰或者处理的植物细胞、种子、植物组分、植物组织、植物器官或者整个植物。
文中使用的术语“对照植物”是指用于针对转基因的或遗传修饰的植物进行比较的植物细胞、外植体、种子、植物组分、植物组织、植物器官、或完整植物，目的在于鉴定转基因的或遗传修饰的植物中增强的表型或所希望的特性。“对照植物”在一些情况下可以是下述转基因植物品系，所述转基因植物品系包含空载体或标记基因但不含有在所评价的转基因的或遗传修饰的植物中存在的重组目的多核苷酸。对照植物可以与所测试的转基因的或遗传修饰的植物是相同品系或品种的植物，或可以是其它品系或品种，如已知具有特定表型、特征或已知基因型的植物。合适的对照植物包括亲本品系的遗传上未改变的或非转基因植物，用于产生文中的转基因植物。
文中使用的术语“合胞体部位”指线虫感染后在植物的根形成的摄食部位。该部位用作线虫的营养物源。合胞体是胞囊线虫的摄食部位，且巨细胞是根结线虫的摄食部位。
在一个实施方案中，本发明提供包含与多核苷酸有效连接的根特异性启动子的分离的表达载体，所述多核苷酸选自a)编码富含丝氨酸-精氨酸蛋白质的多核苷酸；b)编码AVR9诱导的_111B样蛋白质的多核苷酸；c)编码碱性螺旋-环-螺旋蛋白质的多核苷酸；和d)编码dirigent样蛋白质的多核苷酸。
可以在本发明的表达载体中使用任一根特异性启动子。示例性根特异性启动子包括但不限于，来源于谷物烟酰胺合酶基因的启动子(US20030131377)和稻RCC3启动子(US 11/075,113)。在本发明中特别使用在线虫摄食部位(即，合胞体)中诱导的根特异性启动子。优选地，可以在本发明线虫诱导的表达载体中使用在WO 2008/095887中公开的Mtn3样线虫诱导启动子、在US 2009/0089896公开的线虫诱导的Mtn21样启动子、在WO 2008/077892中公开的线虫诱导的过氧化物酶样启动子、在WO2008/071726中公开的线虫诱导的海藻糖-6-磷酸磷酸酶样启动子和在WO2008/095888中公开的线虫诱导的At5g12170样启动子。
可以在本发明的分离的表达载体中使用任一编码富含丝氨酸-精氨酸蛋白质的多核苷酸。优选地，多核苷酸编码的富含丝氨酸-精氨酸蛋白质选自：包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-253的多肽；包含SEQ ID NO：4的氨基酸1-249的多肽；包含SEQ ID NO：6的氨基酸1-247的多肽；包含SEQID NO：8的氨基酸1-249的多肽；包含SEQ ID NO：10的氨基酸1-249的多肽；包含SEQ ID NO：12的氨基酸1-245的多肽；包含SEQ ID NO：14的氨基酸1-240的多肽；包含SEQ ID NO：16的氨基酸1-261的多肽；包含SEQ ID NO：18的氨基酸1-280的多肽；包含SEQ ID NO：20的氨基酸1-248的多肽；包含SEQ ID NO：22的氨基酸1-252的多肽；包含SEQ IDNO：24的氨基酸1-265的多肽；包含SEQ ID NO：26的氨基酸1-263的多肽；包含SEQ ID NO：28的氨基酸1-220的多肽；包含SEQ ID NO：30的氨基酸1-220的多肽；包含SEQ ID NO：32的氨基酸1-263的多肽；包含SEQ ID NO：34的氨基酸1-218的多肽；包含SEQ ID NO：36的氨基酸1-245的多肽。更优选地，多核苷酸编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-253的富含丝氨酸-精氨酸的蛋白质。
可以在本发明的分离的表达载体中使用任一编码AVR9诱导的_111B蛋白质的多核苷酸。优选地，AVR9诱导的_111B蛋白质包含SEQ IDNO：38的氨基酸1-226。
可以在本发明的分离的表达载体中使用任一编码碱性螺旋-环-螺旋蛋白质的多核苷酸。优选地，该碱性螺旋-环-螺旋蛋白质选自包含SEQ ID NO：40的氨基酸1-231的多肽；包含SEQ ID NO：42的氨基酸1-226的多肽；包含SEQ ID NO：44的氨基酸1-232的多肽；包含SEQ ID NO：46的氨基酸1-233的多肽；和包含SEQ ID NO：48的氨基酸1-260的多肽。更优选地，该碱性螺旋-环-螺旋蛋白质包含SEQ ID NO：40的氨基酸1-231。
可以在本发明的分离的表达载体中使用任一编码dirigent样蛋白质的多核苷酸。优选地，dirigent样蛋白质选自包含SEQ ID NO：50的氨基酸1-191的多肽；包含SEQ ID NO：52的氨基酸1-191的多肽；包含SEQ IDNO：54的氨基酸1-189；和包含SEQ ID NO：56的氨基酸1-189的多肽。更优选地，dirigent样蛋白质包含SEQ ID NO：50的氨基酸1-191.
在另一实施方案中，将本发明的分离的表达载体用于制备线虫抗性转基因植物的方法中，该方法包括步骤：a)提供上述重组表达载体；b)用重组表达载体转化植物细胞；c)从转化的植物细胞再生转基因植物；和d)选择与不含有重组表达载体的野生型植物比较，对植物寄生性线虫感染表现出增加的抗性的转基因植物。
已知多种将多核苷酸导入植物基因组的方法和用于从植物组织或植物细胞再生植物的方法，所述方法在例如Plant Molecular Biology andBiotechnology一书中(CRC出版社，Boca Raton，Florida)、第6/7章，第71-119页(1993)；White FF(1993)Vectors for Gene Transfer in HigherPlants；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和Wu R编著，Academic Press，15-38；Jenes B等人，(1993)Techniques forGene Transfer；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编著，Academic Press，第128-143页；Potrykus(1991)AnnuRev Plant Physiol Plant Molec Biol 42：205-225；Halford NG，Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1)：62-73。
转化方法可包括转化的直接方法和间接方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、使用基因枪的生物弹射击法(Fromm ME等人，Bio/Technology.8(9)：833-9，1990；Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2：603，1990)、电穿孔、在包含DNA的溶液中孵育干燥胚、和显微注射。在这些直接转化法中，所使用的质粒无需满足任一特别的要求。可以使用简单的质粒，如那些pUC系列、pBR322、M13mp系列、pACYC184等。如果欲从经转化的细胞产生完整的植物，优选地在质粒上定位有额外的可选择标记基因。直接转化技术对于双子叶和单子叶植物同样适用。
也可以借助农杆菌(Agrobacterium)通过细菌感染(例如EP 0 116718)、借助于病毒载体通过病毒感染(EP 0 067 553；US 4,407,956；WO95/34668；WO 93/03161)或借助于花粉(EP 0 270 356；WO 85/01856；US4,684,611)实施转化。基于农杆菌的转化技术(尤其对于双子叶植物)在本领域是熟知的。农杆菌菌株(如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes))包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，其在用农杆菌感染植物后转移至植物。T-DNA(转化DNA)整合入植物细胞的基因组。T-DNA可定位于Ri-或Ti-质粒上或分开地包含在所谓的双元载体中。对于农杆菌介导的转化方法描述在例如Horsch RB等人，(1985)Science 225：1229中。在例如White FF，Vectors for Gene Transferin Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页；Jenes B等人，Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant MolecBiol 42：205-225中描述了通过农杆菌转化植物。
可将文中所述核苷酸直接转化入质体基因组中。质体表达利用了多于核表达基因的许多拷贝数来允许高的表达水平，其中在质体表达中基因通过同源重组插入每一植物细胞中存在的几千个拷贝的环状质体基因组。在一个实施方案中，将核苷酸插入靶向质体的载体，并转化入目的植物宿主的质体基因组。获得了对含有所述核苷酸序列的质体基因组而言是同质的植物，并且其优选地能够高表达所述核苷酸。质体转化技术例如深入地描述于美国专利号5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,877,462、WO 95/16783和WO 97/32977、以及McBride等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，7301-7305中。
上述方法产生了本发明的另一实施方案，包含含有与多核苷酸有效连接的根特异性启动子的重组表达载体的线虫抗性转基因植物，所述多核苷酸选自a)编码富含丝氨酸-精氨酸蛋白质的多核苷酸；b)编码AVR9诱导的_111B样蛋白质的多核苷酸；c)编码碱性螺旋-环-螺旋蛋白质的多核苷酸；和d)编码dirigent样蛋白质的多核苷酸。本发明的转基因植物可以用于控制受到植物寄生性线虫感染的作物。
本发明也提供了植物育种的方法，如用来制备杂交的能育转基因植物。使用植物育种的已知方法，可以将本发明的转基因植物与类似的转基因植物或与缺少本发明核酸的转基因植物或者与非转基因植物杂交以制备种子。此外，本发明的转基因植物可以包含，和/或是与另一种包含一种或者多种核酸的转基因植物杂交，因此在植物和/或其后代中产生转基因的“堆积”。然后，将种子种植以获得包含本发明表达载体的杂交能育转基因植物。杂交的能育转基因植物可具有通过雌性亲本或通过雄性亲本遗传的表达载体。第二种植物可以是近交系植物。杂交的能育转基因植物可以是杂交体。
“基因堆积”也可以通过植物转化来转移两种或多种基因到细胞核中来完成。在转化期间，可以将多个基因依次或者同时引入到细胞核中。根据本发明，可以堆积多个编码富含丝氨酸-精氨酸、AVR9诱导的_111B样、bHLH和Dirigent样蛋白质的基因以提供增强的线虫抗性。这些堆积的组合可以通过任一方法产生，所述方法包括但不限于通过常规方法杂交育种植物或者通过基因转化。如果通过基因转化堆积性状，那么富含丝氨酸-精氨酸、AVR9诱导的_111B样、bHLH和Dirigent样蛋白质基因可以以任一方式组合。例如，如果要引入两种基因，那么两种序列可以包含于分开的转化盒中或者在相同的转化盒上。序列的表达可以通过相同或者不同的启动子驱动。
上述转基因植物产生了本发明的又一个实施方案，对于转基因而言是纯合的种子，其包含含有与多核苷酸有效连接的根特异性启动子的重组表达载体，所述多核苷酸选自：a)编码富含丝氨酸-精氨酸蛋白质的多核苷酸；b)编码AVR9诱导的_111B样蛋白质的多核苷酸；c)编码碱性螺旋-环-螺旋蛋白质的多核苷酸；和d)编码dirigent样蛋白质的多核苷酸。本发明的转基因种子可以用于控制作物感染上植物寄生性线虫。
作物植物和对应的寄生性线虫列于美国植物疾病索引(Index of PlantDiseases in the United States)(美国农业部手册号165，1960)；植物寄生线虫物种在北美的分布(Distribution of Plant-Parasitic NematodeSpecies in North America)(线虫学家协会，1985)；和美国植物和植物产品上的真菌(Fungi on Plants and Plant Products in the United States)(美国植物病理学协会，1989)。例如，本发明靶向的植物寄生线虫包括但不限于，胞囊线虫和根结线虫。本发明靶向的具体植物寄生线虫包括但不限于，大豆异皮线虫、甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)、燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)、稻异皮线虫(Heterodera oryzae)、木豆异皮线虫(Heterodera cajani)、车轴草异皮线虫(Heterodera trifolii)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)或烟草球异皮线虫(Globodera tabacum)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、北方根结线虫(M.hapla)、爪哇根结线虫(M.javanica)、纳西根结线虫(M.naasi)、短小根结线虫(M.exigua)、起绒草茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、窄小茎线虫(Ditylenchus angustus)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、多带螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、伤残短体线虫(Pratylenchusvulnus)、弯曲短体线虫(Paratylenchus curvitatus)、玉米短体线虫(Paratylenchus zeae)、肾形小盘旋线虫(Rotylenchulus reniformis)、银莲花拟毛刺线虫(Paratrichodorus anemones)、较小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、Paratrichodorus christiei、麦粒鳗线虫(Anguinatritici)、Bidera avenae、小麦根瘿线虫(Subanguina radicicola)、塞氏纽带线虫(Hoplolaimus seinhorsti)、哥伦比亚纽带线虫(HoplolaimusColumbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、半穿刺小垫刃线虫(Tylenchulus semipenetrans)、花生鞘线虫(Hemicycliophora arenaria)、椰子细杆刃线虫(Rhadinaphelenchus cocophilus)、水平对刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、原始毛刺线虫(Trichodorus primitivus)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、贝氏滑刃线虫(Aphelenchoides besseyi)、卡纳亚拟鞘线虫(Hemicriconemoides kanayaensis)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchus claytoni)、美洲剑线虫(Xiphinema americanum)、瘟疫坏死线虫(Cacopaurus pestis)、玉米异皮线虫(Heterodera zeae)、菲利普异皮线虫(Heterodera filipjevi)等。
根据本发明的可以给予线虫抗性的植物包括单子叶植物和双子叶植物。根据本发明产生的线虫抗性植物，包括但不限于，玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉和裸麦草。植物可以是选自豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、西红柿、马铃薯、棉花、烟草、胡椒、油籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣和拟南芥(Arabidopsis thaliana)等。
本发明通过以下的实施例进行进一步说明，并非以任一方式解释作为对其范围施加限制。
实施例1：载体构建
使用生物信息学方法，与未感染的根组织比较，将四种大豆基因，TA52573_3847(SEQ ID NO：3)、AVR9诱导的_111B(SEQ ID NO：37)、GmbHLH_47172355(SEQ ID NO：39)和GmDirigent_59580836(SEQ IDNO：49)鉴定为在SCN感染的大豆根的合胞体中下调的基因。如本文中所述，称为TA52573_3847 SEQ ID NO：3的基因编码富含丝氨酸-精氨酸蛋白质。在下述分离的表达载体中使用的富含Gm丝氨酸-精氨酸基因(SEQ IDNO：1)编码与TA52573_3847(SEQ ID NO：3)具有93％序列同一性的蛋白质。
将来自芹菜的组成型遍在蛋白启动子(WO 2003/102198；SEQ IDNO：60，称为PcUbi4)、来自大豆的线虫诱导的MtN3样启动子(WO2008/095887，SEQ ID NO：58)、来自拟南芥属的线虫诱导的TPP样启动子(WO 2008/071726，SEQ ID NO：57)和组成型超级启动子(参见US5955,646)用于制备在下表1中所述的构建体。
表1
Figure BDA0000067855910000171
表达载体也包含WO 2008/124495中所述的乙酰羟酸合酶(AHAS)选择基因的突变形式，其赋予对除草剂ARSENAL(灭草烟(Imazapyr)，BASFCorporation，Mount Olive，NJ)的抗性。AHAS2的表达受芹菜遍在蛋白启动子(SEQ ID NO：60)的驱动。
实施例2：线虫生物测定法
评估通过本文中所述的多核苷酸赋予的线虫抗性的生物测定法使用在共有的共同待决的USSN 12/001,234中公开的有根植物测定系统进行。在用实施例1中描述的双元载体转化后产生转基因根。将多种转基因根株系传代培养并以大约500 J2/孔的水平，用表面净化的race 3 SCN第二阶段幼体(J2)接种。线虫接种后4周，计数每一孔中的胞囊数目。对于每一转化构建体，计算每一株系的胞囊数目以测定构建体的平均胞囊数和标准误。将每一转化构建体的胞囊数值与平行测试的空载体对照的胞囊数值对比以确定测试的构建体是否导致胞囊数的减少。相对于已知的易感品种Williams82来说，用载体RBM024、RBM036、RBM019、RBM031、RTP1124、RTP1125、RTP1126、RTP1127和RTP1090转化的生根外植体培养物显示出减少的胞囊数目和雌性指数的一般趋势。相对于对照株系，由组成型PcUbi4启动子调节的表达GmDirigent_59580836基因(载体RTP1086)的转基因根并不表现出减少的胞囊数目。一些组成型表达具有PcUbi4启动子的富含Gm丝氨酸-精氨酸基因的根株系产生了深棕色斑块。深棕色斑块的位置在不同的转基因根株系中不同，在一些情况下仅局限于零散的单个细胞、或侧根突出区或者完全沿老根长度延伸。相对于对照株系，过量表达受组成型PcUbi4启动子(RBM019)或组成型超级启动子(RTP1124)调节的AVR9诱导的_111B基因的转基因根产生了更粗且更短的根，并且减少了侧根的数目。
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Claims (3)

1.制备线虫抗性转基因植物的方法，所述方法包括步骤：
a)提供重组表达载体，所述重组表达载体包含与编码AVR9诱导的_111B样蛋白质的多核苷酸有效连接的根特异性启动子，所述AVR9诱导的_111B样蛋白质包含SEQ ID NO：38的氨基酸1-226；
b)用重组表达载体转化植物细胞；
c)从转化的植物细胞再生转基因植物；和
d)选择转基因植物，所述转基因植物当与不包含重组表达载体的野生型植物比较时，对植物寄生性线虫感染表现出增加的抗性。
2.包含重组表达载体的线虫抗性转基因植物，所述重组表达载体包含与编码富含丝氨酸-精氨酸的蛋白质的多核苷酸有效连接的根特异性启动子，所述富含丝氨酸-精氨酸的蛋白质包含SEQ ID NO：38的氨基酸1-226。
3.种子，其对于转基因是纯合的，包含重组表达载体，所述重组表达载体包含与编码AVR9诱导的_111B样蛋白质的多核苷酸有效连接的根特异性启动子，所述AVR9诱导的_111B样蛋白质包含SEQ ID NO：38的氨基酸1-226。
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