CN111670716B - 一种模拟相似穿孔线虫与烟草互作模式的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种模拟相似穿孔线虫与烟草互作模式的方法，涉及生物学技术领域；通过在光照培养箱内，对沙培的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)进行相似穿孔线虫的接种，利用染色观察法观察相似穿孔线虫在根系内侵染的位置，通过侵染根系产生的症状计算严重度，然后统计总线虫数与初始接种量的差异计算繁殖倍率和完成生活史情况。本发明选用本氏烟草作为寄主研究相似穿孔线虫对其的寄生性和致病性，并探究最优的线虫致病条件，为利用本氏烟草研究相似穿孔线虫与寄主互作机制提供研究基础。
Description
技术领域
本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种模拟相似穿孔线虫与烟草互作模式的方法。
背景技术
相似穿孔线虫(Radopholus similis(Cobb,1893)Thorne，1949)是全球十大植物病原线虫之一，是一种毁灭性的迁移性内寄生植物线虫，其寄主多达350多种，包括香蕉、柑橘、胡椒、槟榔、茶树、椰子、小豆蔻香、番茄等多种经济作物和天南星科、棕榈科、竹芋科等观赏花卉植物，被近60个国家、地区或组织将其定义为检疫性害虫，包括欧盟、葡萄牙科学发展协会、欧洲和地中海植物保护组织、土耳其、阿根廷、智利、巴拉圭、乌拉圭和中国等。
近年来，在植物线虫与寄主互作研究上主要选用拟南芥(Arabidopsisthaliana)、普通烟草(N.tabacum)等模式植物。由于拟南芥根系较小，相似穿孔线虫难以侵入其根系，对其寄生性和致病性较弱，不适合作为相似穿孔线虫的模式寄主。普通烟草由于其生长周期较长、株系较大，不利于在培养箱条件下栽培种植。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种模拟相似穿孔线虫与寄主植物烟草互作模式的方法，操作可靠，简单易行，致病显示明显症状，线虫可以完成一整个生活史，可用于后续深入的研究。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种模拟相似穿孔线虫与烟草互作模式的方法，包括以下步骤：向沙培的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)根部接种相似穿孔线虫(Radopholussimilis)，培养23～30d后，测定所述本氏烟草的生长量、根系发病症状、根内线虫数和线虫繁殖率；
所述接种的相似穿孔线虫的数量为150～200条/株；
所述培养的温度为25±1℃，光照强度为1200lx，光照时间为16h。
优选的，所述本氏烟草包括种子育苗20d后接种至所述试管中进行沙培，沙培10d后接种所述相似穿孔线虫。
优选的，所述沙培的条件还包括湿度为3～5％。
优选的，所述试管为直径4cm、高12cm的平底试管；所述沙培用沙子包括粒径为1～1.5mm的石英砂。
优选的，所述石英砂在使用前还包括两次灭菌，每次灭菌的时间为1h，两次灭菌的时间间隔为8～12h；
所述灭菌的温度为120～125℃，压力为20p.s.i。
优选的，所述相似穿孔线虫为雌虫，在接种所述雌虫前，还包括用质量百分含量为0.2～0.3％的硫酸链霉素溶液消毒8～12h。
本发明提供了一种模拟相似穿孔线虫与烟草互作模式的方法，通过在光照培养箱内，对沙培的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)进行相似线虫的接种，利用染色观察法观察相似穿孔线虫在根系内侵染的位置，通过侵染根系产生的症状计算严重度，统计总线虫数与初始接种量的差异计算繁殖倍率和完成生活史情况。本发明选用本氏烟草作为寄主研究相似穿孔线虫对其的寄生性和致病性，并探究最优的线虫致病条件，为利用本氏烟草研究相似穿孔线虫与寄主互作机制提供研究基础。
本发明采用适合用于培养箱种植的本氏烟草作为寄主研究相似穿孔线虫与寄主互作机制研究的线虫致病条件的筛选。与现有的相似穿孔线虫致病性的研究报道相比，本发明采用较稳定的栽培介质对线虫的接种模式进行优化，通过相似穿孔线虫能侵染寄生本氏烟草，并在烟草根系内发育繁殖，完成其生活史，病害症状明显，明确本氏烟草是相似穿孔线虫的合适寄主，可用于线虫与寄主的互作研究。本发明所述方案，对利用本氏烟草研究相似穿孔线虫与寄主的互作机制和相似穿孔线虫的防治具有重要意义。
附图说明
图1为相似穿孔线虫HaiN-H种群以200条/株接种30d后的本氏烟草植株和对照植株；
图2相似穿孔线虫HaiN-H种群以200条/株接种本氏烟草30d后的植株根系和对照根系；
图3为相似穿孔线虫以200条/株接种本氏烟草30d后的植株根系品红染色，A为在烟草根系内的成虫，B为在烟草根系内的幼虫，C为在烟草根系内的虫卵；
图4为不同接种量和不同接种时间下相似穿孔线虫不同种群接种本氏烟草后植株株高，其中A～D:分别为接种9d、16d、23d和30d后烟草植株株高；图中数据为10次重复的平均数±标准误；图中同一接种量处理内相同的小写字母表示在在0.05水平上差异不显著；
图5不同接种量和不同接种时间下相似穿孔线虫不同种群接种本氏烟草后植株根重，其中A～D分别为接种9d、16d、23d和30d后烟草植株根重；图中数据为10次重复的平均数±标准误；图中同一接种量处理内相同的小写字不同接种量和接种时间下相似穿孔线虫；
图6为不同接种量和接种时间下相似穿孔线虫HaiN-H种群对本氏烟草根系的危害症状，其中A～D分别为以50条/株、100条/株、150条/株和200条/株接种处理的烟草根系；1～4分别为接种9d、16d、23d和30d后的烟草根系；CK为健康对照组；
图7为不同接种量和接种时间下相似穿孔线虫GJ-LY323种群对本氏烟草根系的危害症状，其中A～D分别为以50条/株、100条/株、150条/株和200条/株接种处理的烟草根系；1～4分别为接种9d、16d、23d和30d后的烟草根系；CK为健康对照组；
图8为不同接种量和接种时间下相似穿孔线虫DBSR种群对本氏烟草根系的危害症状，其中A～D分别为以50条/株、100条/株、150条/株和200条/株接种处理的烟草根系；1～4分别为接种9d、16d、23d和30d后的烟草根系；CK为健康对照组；
图9为不同接种量和接种时间下相似穿孔线虫HN6种群对本氏烟草根系的危害症状，其中A～D分别为以50条/株、100条/株、150条/株和200条/株接种处理的烟草根系；1～4分别为接种9d、16d、23d和30d后的烟草根系；CK为健康对照组；
图10为不同接种量和不同接种时间下相似穿孔线虫不同种群接种本氏烟草后根内线虫数量，其中A～D分别为接种9d、16d、23d和30d后烟草植株根重；图中数据为10次重复的平均数±标准误；图中同一接种量处理内相同的小写字母表示在在0.05水平上差异不显著；
图11为不同接种量和不同接种时间下相似穿孔线虫不同种群接种本氏烟草后线虫的繁殖率，其中A～D分别为接种9d、16d、23d和30d后烟草植株根重；图中数据为10次重复的平均数±标准误；图中同一接种量处理内相同的小写字母表示在在0.05水平上差异不显著。
具体实施方式
本发明提供了一种模拟相似穿孔线虫与烟草互作模式的方法，包括以下步骤：向沙培的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)根部接种相似穿孔线虫(Radopholussimilis)，培养23～30d后，测定所述本氏烟草的生长量、根系发病症状、根内线虫数和线虫繁殖率；所述接种的相似穿孔线虫的数量为150～200条/株；所述培养的温度为25±1℃，光照强度为1200lx，光照时间为16h。
本发明所述本氏烟草优选为将种子育苗20d后接种至所述试管中进行沙培，沙培10d后接种所述相似穿孔线虫。本发明所述沙培优选在光照培养箱中进行，并设置：25±1℃、光照强度为1200lx，光照16h，黑暗8h。本发明所述种子育苗，优选为将经过催芽的种子消毒后，点种于MS固体培养基上。本发明所述育苗时的条件优选与沙培的条件相同，在此不再赘述。本发明所述催芽优选包括将所述本氏烟草的种子在无菌水中浸泡1d，促进发芽。本发明所述种子消毒优选包括：将催芽后的种子用无菌水洗涤3次后，用体积百分含量为75％的酒精处理1min，再用12.5％的NaClO水溶液消毒30min，用无菌水洗涤7次每次2min。本发明将育苗20d后长势相同的幼苗移栽到含有石英砂的平底玻璃培养试管中，在移栽10d后进行所述接种。本发明所述石英砂的粒径优选为1～1.5mm。本发明所述平底式管的直径优选为4cm，高优选为12cm，且所述平底式管中石英砂的装入量优选为所述平底式管高度的1/3。本发明所述石英砂，在使用前优选还包括两次灭菌，每次灭菌的时间优选为1h，两次灭菌的时间间隔优选为8h；所述灭菌的温度优选为120～125℃，灭菌的压力优选为20p.s.i(约137.8kPa)。本发明在进行所述沙培时，优选还包括控制湿度，所述湿度为3～5％。
本发明所述相似穿孔线虫的虫态优选为雌虫，在接种所述雌虫前，优选还包括用质量百分含量为0.2～0.3％的硫酸链霉素溶液消毒8～12h。本发明所述接种，优选包括制备线虫雌虫悬浮液(150或200条/管)，用无菌水洗3次，参考丁莎(相似穿孔线虫消毒方法筛选及其对线虫繁殖量的影响，西南大学学报(自然科学版).2013)的线虫灭菌方法用0.001％洗必泰浸泡处理1h后再用0.001％HgCl2水溶液浸泡处理7min，然后用无菌水清洗5次。本发明混匀线虫悬浮液后，用滴管将线虫悬浮液接入到植物苗根部深1cm处，然后将试管放置于所述光照培养箱中进行培养，接种前一天对植物苗进行正常浇水，为了保证线虫侵染，接种3d内不浇水，然后进行常规管理。
本发明所述烟草的生长量优选为株高和根重，根系发病程度为根系被线虫侵染后产生的病斑或根系腐烂程度，根内线虫数为通过洗涤根际土壤，剪碎根，25℃黑暗孵育7d后旋涡震荡分离获得的线虫；线虫的繁殖率是分离接种烟草后根系和土壤内的线虫数量与初始接种量相比的结果。本发明优选通过染色观察法观察相似穿孔线虫在根系内侵染的位置，通过侵染根系产生的症状计算严重度，通过计算总线虫数与初始接种量的差异计算繁殖倍率和完成生活史情况。
下面结合实施例对本发明提供的模拟线虫与寄主植物互作模式的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
相似穿孔线虫对本氏烟草寄生性的测定
1、试验方法
步骤(1)相似穿孔线虫的扩繁
在保种的胡萝卜愈伤组织中用蒸馏水分离出相似穿孔线虫一种群HaiN-H(寄主粉掌，采自深圳)，HaiN-H种群在Screening of reference genes in real-time PCR forRadopholus similis中公开使用过，且20年内对公众发放。在解剖镜下挑取相似穿孔线虫雌虫放在盛有无菌水的1.5ml离心管中，配置以200条/管的线虫悬浮液，用无菌水洗涤线虫三次后，用0.3％硫酸链霉素溶液消毒过夜(8～12h)。消毒后再用无菌水洗涤三次，吸去上清液，在超净工作台中将每管线虫分别接种到一皿培养好的胡萝卜愈伤组织组织上，封口膜封口，在25℃恒温黑暗培养箱中培养60d左右备用。
步骤(2)本氏烟草的种植
种植本氏烟草的介质为石英砂。在玻璃平底培养试管中装入约占高度1/3干燥的石英砂，在125℃、20p.s.i(约137.8kPa)高温高压下灭菌两次，每次灭菌1小时两次灭菌间隔8h。将烟草种子放到无菌水中浸泡1天(促进发芽)，然后将种子用无菌水洗涤3次，再用75％的酒精处理1min和12.5％NaClO水溶液消毒30min，用无菌水洗涤7次，每次2min。将已灭菌的烟草种子用无菌滤纸吸干水分后，将种子点种于含有50mL MS固体培养基的培养瓶中，在25±1℃、光照强度为1200lx的光照培养箱中，在16h光照和8h黑暗交替光照条件下培养20d，挑选长势相同的幼苗移栽到填砂平底玻璃培养试管中，置于上述条件的培养箱中，进行日常管理，定植10d后用于接种线虫。
步骤(3)相似穿孔线虫的接种
从胡萝卜愈伤组织中分离供试线虫，在显微镜下挑取雌虫至一离心管中，制备线虫雌虫悬浮液，用无菌水洗3次，参考丁莎(相似穿孔线虫消毒方法筛选及其对线虫繁殖量的影响，西南大学学报(自然科学版).2013)的线虫灭菌方法用0.001％洗必泰浸泡处理1h后再用0.001％HgCl2浸泡处理7min，然后用无菌水清洗5次。混匀线虫悬浮液后，用滴管将线虫悬浮液接入到植物苗根部深1cm处，然后将试管放置于25℃±1℃(16h光照，8h黑暗)及光照强度为1200lx的光照培养箱中培养，接种前一天对植物苗进行正常浇水，为了保证线虫侵染，接种3d内不浇水，然后进行常规管理。
步骤(4)相似穿孔线虫对本氏烟草寄生性的测定
将相似穿孔线虫HaiN-H种群，以200条/株的接种量，于接种30d后选取表现出病害症状的根组织进行品红染色并观察根内线虫。品红染色方法，具体如下：将病根组织切成1cm的小段，将其放入烧杯中，在烧杯中加入50ml蒸馏水和20ml 5.25％NaClO，用玻璃棒不断搅拌，4min后取出根组织用流水冲洗45s，然后将根组织浸泡在蒸馏水中15min。将根组织移至另一个装有50ml蒸馏水的烧杯中，加入2ml酸性品红贮液，在微波炉中将有根组织的染液煮沸2min，待染液冷却后用流水冲洗根组织并用滤纸吸干水分。将根组织放入装有30ml甘油(纯甘油中加入2～3滴5mol/L HCl)的烧杯中用微波炉中加热1min左右，使根组织褪色。将根组织切片后置于Nikon Eclipse 90i显微镜镜检拍照。
2、试验结果
(1)相似穿孔线虫对本氏烟草的寄生性测定
在25±1℃条件下，相似穿孔线虫HaiN-H种群接种本氏烟草30d后，与对照相比，发病本氏烟草植株地上部症状明显，植株矮小，叶片发黄(图1)；植株根系明显变褐坏死，在根系形成凹陷腐烂(图2)。对病害根系经品红染色制片后，在显微镜下可观察到线虫的雌虫、幼虫和卵虫(图3)。
实施例2
相似穿孔线虫对本氏烟草致病性研究的接种条件筛选
1、试验方法
步骤(1)相似穿孔线虫的扩繁、本氏烟草的种植和线虫的接种见实施例1步骤(1)，其中相似穿孔线虫的种群除使用实施例1的种群外，外加GJ-LY323(寄主柑橘，采自福建)、DBSR(寄主大巴水榕，采自广州)和HN6种群(寄主巴西蕉，采自海南)，共4个种群；且HN6种群在Screening of reference genes in real-time PCR for Radopholus similis中已报道使用过；DBSR种群在相似穿孔线虫消毒方法筛选及其对线虫繁殖量的影响和Screeningof reference genes in real-time PCR for Radopholus similis中已报道使用过；GJ-LY323种群在Screening of reference genes in real-time PCR for Radopholussimilis中公开使用过，且上述4个种群均承诺，20年内对公众发放。
步骤(2)供试4个相似穿孔线虫以不同接种量和接种时间进行接种
将相似穿孔线虫HaiN-H、GJ-LY323、DBSR和HN6种群，分别以50条/株、100条/株、150条/株和200条/株的接种量接种于本氏烟草根系，接种方法按实施例1中的步骤(3)进行接种，于接种9d、16d、23d和30d后，观察和拍照记录，每个种群接种一种植物为一个处理，每个处理设10次重复，以接种清水植物为空白对照。
步骤(3)供试相似穿孔线虫不同种群、不同的接种量和接种时间对本氏烟草生长量和根系病害严重度的测定。
取长有本氏烟草幼苗的试管，加入自来水使砂子悬浮，将根系和砂子轻轻地从管中取出，并用细水流将根系与砂子分离。对与砂子分离后的植株进行观察拍照记录根系病害症状，并用直尺量取植株株高，剪下整株根系用天平秤取根重，记录植株相关数据。
步骤(4)供试线虫的分离和计数
线虫的分离方法具体如下：将上述步骤(2)中分离出来的砂子悬浮液分别置于贝曼漏斗上进行分离线虫，所得的线虫悬浮液转移到计数皿中，使用体视显微镜测定从砂子中分离得到的线虫数量并标记为N1。将分离出来的根系切成小段然后放置于10ml带盖试管中并加入适量的蒸馏水，将试管直立置于密封的黑色聚乙烯袋中，在25±1℃培养箱中黑暗培养7d。然后将2ml无菌蒸馏水加入到每个管中，并将这些管在涡旋震荡机上混合10秒。将每个得到的线虫悬浮液转移到计数皿中，并且使用体视显微镜测定从每个根系分离的线虫的数量并标记为N2，总虫量为N1+N2。
步骤(5)数据处理
实验结果数据平均数和标准误(SE)的计算机分析采用SPSS(13.0)和EXCEL 2013软件；利用邓肯氏新复极差法(Duncan’s multiple ranger test,DMRT)，在p＝0.05水平上进行差异显著性分析。
2、试验结果
(1)供试线虫接种量和接种时间对本氏烟草株高的影响。
相似穿孔线虫HaiN-H、GJ-LY323、DBSR和HN6种群4个种群侵染本氏烟草后植株株高存在差异，不同接种量和接种时间处理的烟草根系表现出不同植株高度(图4)。在25±1℃条件下，4个相似穿孔线虫种群分别以50条/株、100条/株、150条/株和200条/株接种量接种烟草。在接种9d后，200条/株接种量处理中，各种群处理株高开始显著小于对照组(p<0.05)；在其余接种量处理中，HN6种群处理株高最小，各种群处理间均有两个或三个株高差异不显著(p>0.05)。接种16d后，除50条/株接种量处理外，其余接种量处理中各种群处理株高均显著小于对照(p<0.05)；50条/株、100条/株和150条/株接种量处理中，各处理间均有两个种群间株高差异不显著(p>0.05)；200条/株接种量处理中，HN6种群处理株高显著小于其他三个种群处理(p<0.05)，而这三个种群间株高差异不显著(p>0.05)。接种23d后，50条/株接种量处理时，GJ-LY323种群和DBSR种群处理株高与对照组相比仍差异不显著(p>0.05)，其他种群处理均显著小于对照(p<0.05)；100条/株和200条/株接种量处理时，各种群处理间均仅有两个种群株高差异显著(p<0.05)，其余种群处理间差异均不显著(p>0.05)；150条/株接种量处理时，DBSR种群处理株高显著大于其他种群处理(p<0.05)。接种30d后，50条/株和100条/株接种量处理中，各处理间均有三个种群间株高差异不显著(p>0.05)；150条/株接种量处理时，HN6种群株高显著小于其他种群处理(p<0.05)，且GJ-LY323种群处理分别与HaiN-H种群和DBSR种群处理株高差异不显著(p>0.05)，其余种群处理间株高均差异显(p<0.05)；200接种量处理时，各种群处理间株高均差异显著(p<0.05)。因此，从株高影响情况来确定，在25±1℃条件下，测定不同种群对烟草株高的影响可选用150条/株接种23d或30d；200条/株接种30d。
(2)供试线虫接种量和接种时间对本氏烟草根重的影响。
相似穿孔线虫HaiN-H、GJ-LY323、DBSR和HN6种群4个种群侵染本氏烟草后植株根重存在差异，不同接种量和接种时间处理的烟草根系根重存在差异(图5)。在25±1℃条件下，将4个相似穿孔线虫种群分别以50条/株、100条/株、150条/株和200条/株接种量侵染烟草，除了HN6种群处理在以50条/株和100条/株接种9d后与对照组根重差异不显著外(p>0.05)，其他处理根重均显著少于对照(p<0.05)，HN6种群处理的根重在各处理中均显著大于其他三个种群处理(p<0.05)。除50条/株接种16d、100条/株和150条/株接种23d和30d以及200条/株接种30d六个接种条件下，HaiN-H种群、GJ-LY323种群和DBSR种群三个处理间存在一个种群处理与另外两个种群处理根重差异显著外(p<0.05)，其他接种条件下，这三个种群处理根重均差异不显著(p>0.05)。因此，从根重影响情况来确定，在25±1℃条件下，测定不同种群对烟草根重的影响较合适的接种条件有100条/株或150条/株接种23d或30d和200条/株接种30d。
(3)供试线虫接种量和接种时间对本氏烟草根系病害严重度的影响。
在25±1℃条件下，将HaiN-H、GJ-LY323、DBSR和HN6种群4个种群分别以50条/株、100条/株、150条/株和200条/株的接种量接种于本氏烟草根际中，于接种9d、16d、23d和30d后观察其根系病害症状。在HaiN-H种群的接种处理中(图6)，接种9d后，50条/株接种量处理的根系没有明显的发病症状，100条/株、150条/株接种量和200条/株接种量处理的有少量根系出现病斑。接种16d后，50条/株接种量处理的根系开始出现病斑；其他接种量处理根系病斑范围变大；150条/株和200条/株接种处理根病害症状差异不太明显。接种23d后，所有的接种量处理均出现明显的发病症状，根系数量与对照相比明显减少，150条/株和200条/株接种量处理根系开始坏死腐烂，症状明显加重。接种30d后，150条/株接种量处理病害明显加重，200条/株接种量处理几乎整株根系坏死。
在GJ-LY323种群的接种处理中(图7)，接种9d后，50条/株接种量处理的根系均没有明显的发病症状，100条/株、150条/株接种量和200条/株接种量处理的有少量根系出现病斑。接种16d后，50条/株接种量处理少量根系出现病斑；100条/株、150条/株和200条/株接种处理根系病斑数量增多，但病害程度较轻。接种23d后，150条/株和200条/株接种量处理根系数量较对照明显减少，病害程度较重。50条/株和100条/株接种量处理根系病害程度明显加重，但根系数量与对照相比差异不明显。接种30d后，所有接种量处理根系数量与对照相比明显减少，病害程度较重，150条/株和200条/株接种量处理根系一半以上坏死。
在DBSR种群的接种处理中(图8)，接种9d后，4个接种量处理根系均出现病斑，病害严重度较轻。接种16d后，100条/株、150条/株和200条/株接种处理病害症状加重，根系数量明显少于对照组。接种23d后，150条/株和200条/株接种处理根系开始腐烂，症状明显，但两接种量处理间病害程度差异不明显。接种30d后，所有接种量处理根系均有明显的腐烂症状，200条/株接种处理根系几乎整株坏死。
在HN6种群的接种处理中(图9)，接种9d后，仅有200条/株的接种量处理根系出现病斑，其余的接种量处理均无明显的发病症状。接种16d后，150条/株接种量的处理，出现发病症状。接种23d后，4个接种量处理根系均出现发病症状，根系数量与对照相比明显减少，150条/株和200条/株接种处理发病症状差异不明显。接种30d后，100条/株和150条/株接种处理发病症状差异不明显，接种200条/株接种处理病症状明显比其他处理严重，根系数量明显减少。
结合4个种群接种处理后的根系病害症状表明，相似穿孔线虫4个种群接种烟草后烟草根系的发病症状存在差异。寄主根系发病症状严重程度随着接种量和接种时间的增加而增加。HaiN-H种群在侵染早期症状较不明显；在接种23d或30d后，症状明显加重，致病力较强。GJ-LY323种群和DBSR种群在侵染早期病害症状已较明显，在侵染早期致病力较强，但病害症状随接种时间的增加加重较缓慢。HN6种群病害症状较轻，致病力较弱。因此，在25±1℃条件下，测定相似穿孔线虫对烟草致病性较优的接种模式是以150/株或200条/株接种量接种23d或30d。
(4)供试线虫以不同的接种量和接种时间侵染本氏烟草后烟草根内线虫数量
在25±1℃条件下，将相似穿孔线虫HaiN-H、GJ-LY323、DBSR和HN6种群4个种群分别以50条/株、100条/株、150条/株和200条/株接种量接种本氏烟草，于接种的9d、16d、23d和30d后，分离统计根内线虫数量。结果表明，本氏烟草根内的线虫数量，均随侵染时间的增加而增加(图10)。接种9d后，GJ-LY323种群处理和DBSR种群处理的根内线虫数量在各接种量处理中均差异不显著(p>0.05)，在150条/株和200条/株接种量处理中与其余两个种群差异显著(p<0.05)；接种16d后，各种群处理间根内线虫数量均差异显著(p<0.05)，以GJ-LY323种群处理最大，HaiN-H种群处理最小；接种23d后，GJ-LY 323种群处理和DBSR种群处理在以100条/株和150条/株接种量处理中差异不显著(p>0.05)，在其余接种量处理中差异显著(p<0.05)，其余种群间在各接种量处理中均差异显著(p<0.05)，以GJ-LY323种群处理最大，HN6种群处理最小；30d后，GJ-LY 323种群处理和DBSR种群处理在以50条/株和100条/株接种量处理中差异不显著(p>0.05)，在其余接种量处理中差异显著(p<0.05)，其余种群间在各接种量处理中均差异显著(p<0.05)，以GJ-LY323种群处理最大，HN6种群处理最小。因此，从根内线虫数量情况来确定，在25±1℃条件下，测定不同种群对烟草致病力的影响可选用150条/株接种30d；200条/株接种23d或30d。
(5)供试线虫以不同的接种量和接种时间侵染本氏烟草后线虫的繁殖倍数
在25±1℃条件下，将相似穿孔线虫HaiN-H、GJ-LY323、DBSR和HN6种群4个种群分别以50条/株、100条/株、150条/株和200条/株接种量接种本氏烟草，于接种的9d、16d、23d和30d后，分离统计线虫总虫量，并计算线虫繁殖倍数。结果表明。同一接种量处理的线虫繁殖倍数随接种时间的增加而增加(图11)。在接种30d后，除了HN6种群处理外，其余各种群处理的繁殖倍数均超过1，各种群接种处理间繁殖倍数均差异显著(p<0.05)，以HaiN-H种群处理最大，HN6种群处理最小。在接种16d和23d后，各种群接种处理间繁殖倍数均差异显著(p<0.05)，以GJ-LY3223种群处理最大。由于50条/株和100条/株接种处理寄主症状发展缓慢，不同接种时间之间症状变化不明显，不宜判断发病严重度，不适合评估线虫的致病力。因此，从线虫繁殖倍数情况来确定，在25±1℃条件下，测定不同种群对烟草致病力的影响可选用150条/株或200条/株接种23d或30d。
本发明提供了一种模拟线虫与寄主植物互作模式的方法，在25±1℃情况下，以150条/株接种烟草处理30d或200条/株接种烟草处理23d，可取得良好的模拟效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种模拟相似穿孔线虫与烟草互作模式的方法，其特征在于，包括以下步骤：向沙培的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)根部接种相似穿孔线虫(Radopholus similis)，培养23～30d后，测定所述本氏烟草的生长量、根系发病症状、根内线虫数和线虫繁殖率；
所述接种的相似穿孔线虫的数量为150～200条/株；
所述培养的温度为25±1℃，光照强度为1200lx，光照时间为16h；
所述本氏烟草包括种子育苗20d后接种至试管中进行沙培，沙培10d后接种所述相似穿孔线虫。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述沙培的条件还包括湿度为3～5％。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述试管为直径4cm、高12cm的平底试管；所述沙培用沙子包括粒径为1～1.5mm的石英砂。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述石英砂在使用前还包括两次灭菌，每次灭菌的时间为1h，两次灭菌的时间间隔为8～12h；
所述灭菌的温度为120～125℃，压力为20p.s.i。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述相似穿孔线虫为雌虫，在接种所述雌虫前，还包括用质量百分含量为0.2～0.3％的硫酸链霉素溶液消毒8～12h。
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