CN106962085A - 一种能使稻属植株快速脱病脱毒的扦插育苗方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能使稻属植株快速脱病脱毒的扦插育苗方法，属植物脱毒技术领域。该能使稻属植株快速脱病脱毒扦插育苗方法包括：野外取材，茎秆脱病脱毒灭菌处理，茎秆扦插的预处理，茎秆扦插，茎秆的复壮培养步骤。本发明利用植物脱病脱毒技术，有效解决了稻属茎秆扦插过程中的污染问题，且扦插的茎秆成活率较高，扦插苗生长旺盛长势较好，为重要杂交材料的复壮快繁以及野生稻优良种质资源的保存提供了有效的手段。该方法简单易行、成本低、扦插成活的稻属植株长势好，基本无病虫害发生；且扦插培苗的周期短，一般为1‑2个月即可进行下一步移栽，不受季节等环境因素影响，能大面积推广和应用。还能应用于保存和快速繁殖一些稀有的稻属品种。

Description

一种能使稻属植株快速脱病脱毒的扦插育苗方法

技术领域

本发明涉及一种能使稻属植株快速脱病脱毒的扦插育苗方法，属植物脱毒技术领域。

背景技术

稻属，禾本科，约25种，分布于热带地区，分为栽培稻和野生稻两种。野生稻是栽培稻(O.sativaL.)和非洲栽培稻(O.glaberrimaSteud.)以外的所有野生种类的总称。

长期的人工选择使我国栽培稻的遗传背景非常狭窄，狭窄的遗传背景再加上近年来全球人口的增长，耕地面积的减少、全球气候变化等因素使水稻生产容易受到病虫害和环境污染的影响，导致水稻产量和品质严重下降。野生稻长期生存在野外抗逆性较强，是天然的基因库，也是适应未来环境变化培育抗病高产优质水稻新材料的基础。对野生稻有利基因的挖掘和利用已成为热点，近年来许多科研工作者已通过传统的杂交和回交的方法，将许多AA基因组野生稻的优良基因转移到栽培稻中，但由于非AA基因组野生稻与栽培稻的杂交率极低，且杂种后代大多不育，很难获得杂交种子，一旦获得杂交植株，为保存获得的杂交植株常进行留桩的方法，但反复留桩导致杂交植株易染病，生长较弱致使利用非AA基因组野生稻的有利基因受到了阻碍。因此，对重要杂交材料的复壮快繁以及野生稻优良种质资源的保存已成为当今世界亟待解决的问题。

若用种子进行生苗繁育需要大量的种子，野生稻与杂交稻的种子具有落粒性，种子收集较困难，野生稻与栽培稻远缘杂交后代大多不育，并且杂交种子还存在着分离。水稻扦插育苗是利用植物细胞的全能性，避开有性繁殖基因重组过程，保持群体纯度，减少生物学混杂。赵洪涛等，2012年在《水稻雄性不育系扦插繁殖与种子》里的研究表明扦插繁殖植株比种子繁殖植株的生长发育期大幅提前，具有矮化、短穗、有效穗多、植株紧凑长势好的特点。近年来，一些学者采取稻属带节茎段扦插的方法来实现野生稻种质资源保存和杂交水稻的复壮快繁。但常规的扦插方法易在培养早期常出现大面积真菌污染，在培养过程中有时还会出现内生细菌的再次污染，造成了材料的损失。

本发明提供的一种能使稻属植株快速脱病脱毒的扦插育苗方法，经文献检索，未见与本发明相同技术的公开报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种能使稻属植株快速脱病脱毒的扦插育苗方法。该方法能使染病植株快速脱毒，减少重要稻属种质资源的损失，提高野生稻和杂交水稻扦插育苗的出芽率和成活率，具有潜在的生态效益和社会效益。

本发明的能使稻属植株快速脱病脱毒的扦插育苗方法，包括：野外取材、茎秆脱病脱毒灭菌处理、茎秆扦插的预处理、茎秆的扦插、及茎秆的复壮培养步骤，具体如下：

a.野外取材：在晴天早晨露水未干时用剪刀剪取带病或生长状态瘦弱的稻属植株上的带节茎秆，取材后立即放入盛有清水的桶中，以避免茎秆失水；再按照不同株系用保鲜膜包裹茎秆，置于冰袋中保鲜带回实验室；

b.茎秆脱病脱毒灭菌处理：带回实验室的稻属茎秆在流动的自来水下冲洗10分钟，将表面的泥浆和污垢彻底冲洗干净后，用体积百分比为75％的酒精棉球擦拭茎秆，并用剪刀将茎秆剪成5cm或7cm的段，茎秆生物学下方剪成斜口，生物学上段剪成平口，每段有1个结节；在无菌操作台用镊子剥离表面带病或发霉叶鞘，保留无病叶鞘，用体积百分比为75％的酒精浸泡20秒，表面灭活后用无菌蒸馏水冲洗5次或6次；用体积百分比为6％的次氯酸钠溶液表面灭活3分钟，摇动灭菌瓶，最后用无菌蒸馏水清洗10次或12次；

c.茎秆扦插的预处理：在无菌操作台中将用无菌蒸馏水配制好的质量体积比为3％的琼脂糖倒入培养瓶中，琼脂糖厚度3cm，待琼脂糖凝固后，将灭菌处理好的茎秆段斜口端向下插入琼脂糖中固定，根据茎秆段的长度在培养瓶中加入深度为3cm已灭菌的自来水，用封口膜封口后置于28℃，相对湿度60％的暗培养箱中培养；待茎秆处长出1cm或2cm新芽后在无菌操作台中将培养瓶中的自来水倒掉，并用已灭菌的自来水清洗培养瓶中茎秆3次，清洗后在培养瓶中再加入深度为1cm的灭菌自来水，封口膜封口后放入28℃，光照强度1600Lux，光照时间为每天6:00-22:00时，空气相对湿度60％的光照培养箱中培养2天；

d.茎秆的扦插：在无菌操作台中用灭菌的镊子取出已出芽的茎秆插入盛有土的组培瓶中，茎秆插入土的深度为茎节刚好被土覆盖，加土的量占整个组培瓶的1/2，并在上面铺一层厚度为5mm珍珠岩；茎秆扦插后在组培瓶中加入10mL已灭菌的自来水，用封口膜封口后放入28℃，空气相对湿度60％，光照强度2000Lux，光照时间为每天6:00-22:00的培养箱中培养，适时喷水，保证土壤湿润；上述所用自来水、组培瓶、土、自来水以及珍珠岩均经121℃，20分钟灭菌；

e.茎秆的复壮培养：茎秆扦插培养4-6天，待新幼芽长至5cm时每周加入pH 5.8的3-5mL 1/4N6液体培养基；待新苗长至10cm时开始炼苗，将封口的封口膜更换为保鲜膜，在组培瓶中加入灭菌自来水，加入自来水的量为超过土壤表面1cm，炼苗处理的第一天至第五天，每天用大头针在封口的保鲜膜膜上刺出8-15个小孔，第六天将小苗移到温室，揭开保鲜膜，按常规水肥管理进行培养。

与现有技术相比本发明的有益效果是：

1、对稻种资源茎秆进行脱病脱毒处理，清除了水稻中带有的病毒，降低了因茎秆携带土壤和田间水中的病菌导致扦插茎秆污染风险。

2、对稻种资源脱病脱毒扦插育苗预处理，将消毒时残留在茎秆中的次氯酸钠排到灭了菌的自来水中，减少和降低了直接将茎秆扦插到土中残留的次氯酸钠对茎秆的毒害，同时也促进新芽的发出，提高了茎秆扦插的成活率。

3、对复壮稻种资源茎秆的处理后稻属植株茎秆扦插出芽率为99％以上，幼苗的成活率达96％以上。

4、本发明方法简单易行、成本低、扦插成活的水稻长势较好，基本无病虫害发生；且扦插培苗的周期短，一般为1-2个月即能进行下一步移栽，不受季节、环境因素影响，能够大面积推广和应用。还能应用于保存和快速繁殖一些稀有的稻属品种。

具体实施方式

实施例一：云南药用野生稻茎秆扦插复壮

本实施例以云南省西双版纳傣族自治州勐海县取的野外生长的药用野生稻(Oryza officinalis Wall.)为实验材料，采用本发明方法进行扦插获得了一批成活率较高药用野生稻的幼苗。实施过程如下：

1)野外取材：药用野生稻植株取材为云南省西双版纳傣族自治州勐海县的野外，在晴天早晨7点时用剪刀剪取生长状态瘦弱的药用野生稻植株上的带节茎秆，取材后立即放入盛有清水的桶中浸泡，以避免茎秆失水，再按照不同株系用保鲜膜包裹茎秆，置于冰袋中保鲜带回实验室；

2)茎秆脱病脱毒灭菌处理：带回实验室的药用野生稻回交后代茎秆用流动的自来水下冲洗10分钟，将表面的泥浆和污垢彻底冲洗干净后用体积百分比为75％的酒精棉球擦拭茎秆，并用剪刀按每段保留有1个茎节的标准将茎秆剪为5cm或7cm的段，切口平滑，茎秆生物学下方要剪成斜口的，生物学上段剪为平口的。在无菌操作台用镊子剥离切好的水稻茎秆表面带病或发霉叶鞘，保留无病叶鞘，用体积百分比为75％的酒精浸泡20秒表面灭活后用无菌蒸馏水冲洗5次。用体积百分比为6％的次氯酸钠溶液表面消毒3分钟，上下摇动灭菌瓶，最后用无菌蒸馏水清洗10次；

3)茎秆扦插的预处理：在无菌操作台中用无菌蒸馏水配制好的质量体积比为3％的琼脂糖倒入培养瓶中，厚度3cm，待琼脂糖凝固后，将灭菌处理好的茎秆段斜口端向下插入琼脂糖中，固定后根据茎秆段的长度在培养瓶中加入深度为3cm已灭菌的自来水，用封口膜封口后置于28℃，相对湿度60％的暗培养箱中培养。3天后，茎秆处长出1cm或2cm的新芽，在无菌操作台中将培养瓶中灭菌自来水倒掉，并用灭菌自来水清洗茎秆3次，清洗后在培养瓶中加入深度为1cm的已灭菌自来水，封口膜封口后放入28℃，空气相对湿度60％，光照强度1600Lux，光照时间为每天6:00-22:00时的培养箱中培养2天，2天后统计处理后的出芽情况；

4)茎秆的扦插：在无菌操作台中将预处理的茎秆用灭菌的镊子取出后插入盛有已灭菌土壤的组培瓶中，加土的量占整个组培瓶的1/2，茎秆插入土的深度为茎节刚好被土覆盖，并在土的上层铺一层厚度为5mm的珍珠岩。茎秆扦插后在组培瓶中加入10mL已灭菌的自来水，然后用封口膜封住瓶口，放入28℃，空气相对湿度60％，光照强度2000Lux，光照时间为每天6:00-22:00时的培养箱中培养，每3天补充灭菌的自来水以保持土壤的湿润。上述所用自来水、组培瓶、土以及珍珠岩均经121℃，20分钟灭菌；

5)茎秆的复壮培养：茎秆扦插培养4天后，新幼芽长至5cm时每周加入pH 5.8的3-5mL 1/4N6液体培养基。待新苗长至10cm时开始炼苗，将封口的封口膜更换为保鲜膜，炼苗处理的第1天至第5天，每天用大头针在封口的保鲜膜膜上刺出8个或15个小孔，第6天将小苗移到温室培养，同时揭开保鲜膜，在温室按常规温室水稻栽培进行管理，待植株长至三叶期时，统计成活率。

在该实施例中脱病脱毒的药用野生稻茎秆出芽率为99.2％，扦插后的成活率在98.6％以上，且育得的幼苗无病虫害影响，质量较好。

实施例二：云南药用野生稻与栽培稻杂交后代茎秆扦插复壮

本实施例以在云南省玉溪市元江县的田间，采集生长瘦弱的云南药用野生稻与栽培稻HY-8杂交的后代为实验材料，采用本发明方法进行扦插获得了一批成活率较高药用野生稻与栽培稻杂交后代的幼苗。

实施过程基本同实施例一，仅以下几点不同：

1)茎秆脱病脱毒灭菌处理：带回实验室的云南药用野生稻与栽培稻HY-8杂交的后代茎秆用流动的自来水冲洗10分钟，将表面的泥浆和污垢彻底冲洗干净后，用体积百分比为75％的酒精棉球擦拭茎秆，并用剪刀将茎秆剪成5cm或7cm的段，茎秆生物学下方要剪成斜口，生物学上段剪为平口，每段有1个结节。在无菌操作台用镊子剥离表面带病或发霉叶鞘，保留无病叶鞘，用体积百分比为75％的酒精浸泡20秒，表面灭活后用无菌蒸馏水冲洗6次。用体积百分比为6％的次氯酸钠溶液表面灭活3分钟，上下摇动灭菌瓶，最后用无菌蒸馏水清洗12次；

2)茎秆扦插的预处理：带节茎秆扦插入用无菌蒸馏水配制好的质量体积比为3％琼脂糖中预处理4天，长出1cm或2cm的新芽，在无菌操作台中将培养瓶中自来水倒掉，并用灭菌自来水清洗茎秆3次后加入深度为1cm的灭菌自来水。封口后放入培养箱中培养2天，培养条件与野生稻带节茎秆培养条件一致，统计出芽情况。

3)茎秆的复壮培养：茎秆扦插培养6天，待新幼芽长至5cm时每周加入pH 5.8的3-5mL 1/4N6液体培养基。

在该实施例中，脱病脱毒的药用野生稻与栽培稻HY-8杂交后代茎秆扦插后的出芽率为99％，成活率96.8％，且育得的幼苗质量较好。

Claims (1)

1.一种能使稻属植株快速脱病脱毒的扦插育苗方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：

a.野外取材：在晴天早晨露水未干时用剪刀剪取带病或生长状态瘦弱的稻属植株上的带节茎秆，取材后立即放入盛有清水的桶中，以避免茎秆失水；再按照不同株系用保鲜膜包裹茎秆，置于冰袋中保鲜带回实验室；

b.茎秆脱病脱毒灭菌处理：带回实验室的稻属茎秆在流动的自来水下冲洗10分钟，将表面的泥浆和污垢彻底冲洗干净后，用体积百分比为75％的酒精棉球擦拭茎秆，并用剪刀将茎秆剪成5cm或7cm的段，茎秆生物学下方剪成斜口，生物学上段剪成平口，每段有1个结节；在无菌操作台用镊子剥离表面带病或发霉叶鞘，保留无病叶鞘，用体积百分比为75％的酒精浸泡20秒，表面灭活后用无菌蒸馏水冲洗5次或6次；用体积百分比为6％的次氯酸钠溶液表面灭活3分钟，摇动灭菌瓶，最后用无菌蒸馏水清洗10次或12次；

c.茎秆扦插的预处理：在无菌操作台中将用无菌蒸馏水配制好的质量体积比为3％的琼脂糖倒入培养瓶中，琼脂糖厚度3cm，待琼脂糖凝固后，将灭菌处理好的茎秆段斜口端向下插入琼脂糖中固定，根据茎秆段的长度在培养瓶中加入深度为3cm已灭菌的自来水，用封口膜封口后置于28℃，相对湿度60％的暗培养箱中培养；待茎秆处长出1cm或2cm新芽后在无菌操作台中将培养瓶中的自来水倒掉，并用已灭菌的自来水清洗培养瓶中茎秆3次，清洗后在培养瓶中再加入深度为1cm的灭菌自来水，封口膜封口后放入28℃，光照强度1600Lux，光照时间为每天6:00-22:00时，空气相对湿度60％的光照培养箱中培养2天；

d.茎秆的扦插：在无菌操作台中用灭菌的镊子取出已出芽的茎秆插入盛有土的组培瓶中，茎秆插入土的深度为茎节刚好被土覆盖，加土的量占整个组培瓶的1/2，并在上面铺一层厚度为5mm珍珠岩；茎秆扦插后在组培瓶中加入10mL已灭菌的自来水，用封口膜封口后放入28℃，空气相对湿度60％，光照强度2000Lux，光照时间为每天6:00-22:00时的培养箱中培养，适时喷水，保证土壤湿润；上述所用自来水、组培瓶、土、自来水以及珍珠岩均经121℃，20分钟灭菌；

e.茎秆的复壮培养：茎秆扦插培养4-6天，待新幼芽长至5cm时每周加入pH 5.8的3-5mL1/4N6液体培养基；待新苗长至10cm时开始炼苗，将封口的封口膜更换为保鲜膜，在组培瓶中加入灭菌自来水，加入自来水的量为超过土壤表面1cm，炼苗处理的第1天至第5天，每天用大头针在封口的保鲜膜膜上刺出8-15个小孔，第6天将小苗移到温室，揭开保鲜膜，按常规水肥管理进行培养。