JPS62232382A - イネプロトプラストの培養方法 - Google Patents
イネプロトプラストの培養方法Info
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- JPS62232382A JPS62232382A JP61075700A JP7570086A JPS62232382A JP S62232382 A JPS62232382 A JP S62232382A JP 61075700 A JP61075700 A JP 61075700A JP 7570086 A JP7570086 A JP 7570086A JP S62232382 A JPS62232382 A JP S62232382A
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、コロニー形成率および再現性が高く、また、
品種開蓋の影響が少く、効率よく植物体を再分化させ得
るイネプロトプラストの培養方法に関するものである。
品種開蓋の影響が少く、効率よく植物体を再分化させ得
るイネプロトプラストの培養方法に関するものである。
近年、細胞融合の手法によシ１人為的に新しい形質を持
った植物の作出が種々検討されている。その際、植物細
胞を使用する場合、その細胞壁を除いたプロトプラスト
が用いられる。しかし、プロトプラストから植物体を再
生する系が未だ十分確立されておらず、ナス科植物等に
報告が散見されるものの、世界の主要作物が多く含まれ
るイネ科やマメ科の植物での例は殆んどないという状況
である。わずかにＰＩＫ Ｔｌ・・・・Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｌｅｔｔｅｒｓ、コ、（２）、７Ｑ−７！；（／９ざ
ま）等にイネ懸濁培養細胞から調製し九プロトプラスト
からの植物体の再生の簡単な報告があるが。
った植物の作出が種々検討されている。その際、植物細
胞を使用する場合、その細胞壁を除いたプロトプラスト
が用いられる。しかし、プロトプラストから植物体を再
生する系が未だ十分確立されておらず、ナス科植物等に
報告が散見されるものの、世界の主要作物が多く含まれ
るイネ科やマメ科の植物での例は殆んどないという状況
である。わずかにＰＩＫ Ｔｌ・・・・Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｌｅｔｔｅｒｓ、コ、（２）、７Ｑ−７！；（／９ざ
ま）等にイネ懸濁培養細胞から調製し九プロトプラスト
からの植物体の再生の簡単な報告があるが。
特に特定の種子を使用した場合、コロニー形成率、再現
性の点で更に改良が望まれていた。
性の点で更に改良が望まれていた。
本発明は、コロニー形成率および再現性が高く、また、
品種開蓋の影響が少く、効率よく植物体を再生し得るイ
ネプロトプラストの培養方法の提供を目的とするもので
ある。
品種開蓋の影響が少く、効率よく植物体を再生し得るイ
ネプロトプラストの培養方法の提供を目的とするもので
ある。
上記目的は、イネの完熟種子由来のカルスか以下本発明
の詳細な説明する。
の詳細な説明する。
本発明においては１日本晴、コシヒカリ等のイネの完熟
種子由来のカルスからプロトプラスト′に調製する。即
ち１例えば、上記完熟種子から頴を取り除き、エタノー
ル、次亜塩素酸ソーダ等で滅コ処理した後、 Ｍｕｒａ
ｓｈｉｇｅ＆ＳｋＯＯｇ（Ｍ８）寒天培地（Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、Ｐｌａｎｔ、 ／！ｒ、 １Ｉ７ｊ−１４９７
（／プロコ））等をて置床しＳ コｊ〜、２ｆｆ”Ｃ，
コ０００−ＪＯＯＯ１ｕｘ（／ ７ ｈｒ日長）の条件
下で培養してカルスを誘導する。
種子由来のカルスからプロトプラスト′に調製する。即
ち１例えば、上記完熟種子から頴を取り除き、エタノー
ル、次亜塩素酸ソーダ等で滅コ処理した後、 Ｍｕｒａ
ｓｈｉｇｅ＆ＳｋＯＯｇ（Ｍ８）寒天培地（Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、Ｐｌａｎｔ、 ／！ｒ、 １Ｉ７ｊ−１４９７
（／プロコ））等をて置床しＳ コｊ〜、２ｆｆ”Ｃ，
コ０００−ＪＯＯＯ１ｕｘ（／ ７ ｈｒ日長）の条件
下で培養してカルスを誘導する。
培養コル１週間後にカルスを集め、ａ分しセルラーゼや
ペクチナーゼ等の細胞壁分解酵素を含む酵素液中、−ｒ
〜、７０’Ｃ，ｌＩＯＮｔ Ｏｓｐｍの条件で３〜ダ
時間程度酵素処理する。酵素処理終了後、ろ過して未消
化物を除いて、ろ液にｕ〜、を倍１Ｃ）ＫＡＩ［Ｏ液（
Ｋ（１１０，／ ／ ｇ Ｍ、 ＭｇＧ”Ｌｌｏ、０ｇ
／ ７ Ｍ％０ａＯ１，０，ＯＫ ｊＭ％ｐＨ１ｐ、
０ ） （Ｔｈｅｏｒ。
ペクチナーゼ等の細胞壁分解酵素を含む酵素液中、−ｒ
〜、７０’Ｃ，ｌＩＯＮｔ Ｏｓｐｍの条件で３〜ダ
時間程度酵素処理する。酵素処理終了後、ろ過して未消
化物を除いて、ろ液にｕ〜、を倍１Ｃ）ＫＡＩ［Ｏ液（
Ｋ（１１０，／ ／ ｇ Ｍ、 ＭｇＧ”Ｌｌｏ、０ｇ
／ ７ Ｍ％０ａＯ１，０，ＯＫ ｊＭ％ｐＨ１ｐ、
０ ） （Ｔｈｅｏｒ。
Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、 ！Ｊ、、 ＆？−４３（／
９７ｇ ） ）等を加え。
９７ｇ ） ）等を加え。
遠心分離して壊れた細胞成分等を上清中に分離して除去
し、精製されたプロトプラストを得る。
し、精製されたプロトプラストを得る。
本発明によれば通常活性の高いプロトプラストをカルス
ｇ当り約５〜７ス１０１個の収率で取得することができ
る。
ｇ当り約５〜７ス１０１個の収率で取得することができ
る。
この様にして調製したプロトプラストを例えばＫａｏ
＆ Ｍｉｃｈａｙｌｕに（ＫＭ）培地（Ｐｌａｎｔａ
／ ２６゜１０！； −／１０（／デＩｔ） ）、 Ｒ
２培地（Ｐｌａｎｔ ０ｅｌｌＦｈｙｓｉｏ１．ｂ、
／ ／ ／ ３〜／ｌコ／（／９７．７） ）、Ｒ３培
地（Ｋｃｐ、Ｃｅ１ｌ Ｒａｓ、３０ 、／！ｒ／ 〜
／ｓｒ（／り６ｔ））等に１！！濁し、これを０１ｇ〜
３免程度のアガロースを含む１Ｍ培地あるいはＲコ／Ｂ
よ培地等とを等量づつ混ぜ、速やかにシャーレ中に広げ
て薄く固める。この時のプロトプラストの密度は約！’
Ａ１０”−／Ｘ１０’個／ゴとなるようにし、また。
＆ Ｍｉｃｈａｙｌｕに（ＫＭ）培地（Ｐｌａｎｔａ
／ ２６゜１０！； −／１０（／デＩｔ） ）、 Ｒ
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／ ／ ／ ３〜／ｌコ／（／９７．７） ）、Ｒ３培
地（Ｋｃｐ、Ｃｅ１ｌ Ｒａｓ、３０ 、／！ｒ／ 〜
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３免程度のアガロースを含む１Ｍ培地あるいはＲコ／Ｂ
よ培地等とを等量づつ混ぜ、速やかにシャーレ中に広げ
て薄く固める。この時のプロトプラストの密度は約！’
Ａ１０”−／Ｘ１０’個／ゴとなるようにし、また。
アガロースゲルの厚さは平均θ、り■程度となるように
するのがよい。
するのがよい。
固化したアガロースゲルを３〜−〇１程度の大きさに切
シ、上記培地中で培養する。その際本発明においては、
イネ培養細胞を２００〜７００ ｍｌ （Ｆｒｏｓｈ
Ｗｅｉｇｈｔ） ／ ｄｉｓｈ程度共存させ。
シ、上記培地中で培養する。その際本発明においては、
イネ培養細胞を２００〜７００ ｍｌ （Ｆｒｏｓｈ
Ｗｅｉｇｈｔ） ／ ｄｉｓｈ程度共存させ。
２０− ｌＩＯｒｐｍの回転でゆつくシ振とすしながら
、暗条件下２３〜−７℃で培養する。
、暗条件下２３〜−７℃で培養する。
イネ培養細胞を共存させる方法は上記の様な方法に限定
されるものではなく、プロトプラストと直接混合しない
ような方法１例えば、イネ培養細胞をアガロース中に包
埋させ、その上にプロトプラストをアガロースに包埋さ
せる様に重層するフィーダーレーヤー法、底にミリポア
フィルタ−等を設けた容器にイネ培養細胞を入れ、その
容器をプロトプラストを含む液体培地中に浸してミリポ
アフィルタ−を介して共存させる方法等が拳げられる。
されるものではなく、プロトプラストと直接混合しない
ような方法１例えば、イネ培養細胞をアガロース中に包
埋させ、その上にプロトプラストをアガロースに包埋さ
せる様に重層するフィーダーレーヤー法、底にミリポア
フィルタ−等を設けた容器にイネ培養細胞を入れ、その
容器をプロトプラストを含む液体培地中に浸してミリポ
アフィルタ−を介して共存させる方法等が拳げられる。
本発明で使用するイネ培養細胞は、旺盛に分裂している
細かい細胞塊を毎週植継ぎ、＋〜７日目目量のを使用す
るのが好ましい。この様な培養細胞は１例えば、未熟胚
由来のカルスや朽由来のカルスを液体培地中で継代して
１選抜して行く等の公知の方法に準じて容易に得られる
。
細かい細胞塊を毎週植継ぎ、＋〜７日目目量のを使用す
るのが好ましい。この様な培養細胞は１例えば、未熟胚
由来のカルスや朽由来のカルスを液体培地中で継代して
１選抜して行く等の公知の方法に準じて容易に得られる
。
培Ｖ開始後、Ｊ−＆目量でｆＪＸ／分裂が始まυ約７週
間で第７分裂が終了する。第１分裂終了後はイネ培養細
胞は特に共存しなくともプロトプラストは増殖するので
、通常第１分裂後に新しい培地に植え継ぐときはイネ培
養細胞を取）除いて培養を続ける。培養後、２〜ｌＩ週
間後には、０．３〜／、Ｏｔｍφ程度のコロニーが形成
される。この時のコロニー形成率は約Ｏ０ｊ〜／方で培
地（Ｓｃｉ、日１ｎ、／４．Ａｊデーｂｇｔｒ（ｉデク
り）に２．≠−り約コ”Ｗ／ｌ、ＢａＩ’約Ｏ０よｒｑ
７ｔを添加し。
間で第７分裂が終了する。第１分裂終了後はイネ培養細
胞は特に共存しなくともプロトプラストは増殖するので
、通常第１分裂後に新しい培地に植え継ぐときはイネ培
養細胞を取）除いて培養を続ける。培養後、２〜ｌＩ週
間後には、０．３〜／、Ｏｔｍφ程度のコロニーが形成
される。この時のコロニー形成率は約Ｏ０ｊ〜／方で培
地（Ｓｃｉ、日１ｎ、／４．Ａｊデーｂｇｔｒ（ｉデク
り）に２．≠−り約コ”Ｗ／ｌ、ＢａＩ’約Ｏ０よｒｑ
７ｔを添加し。
コＪ〜２７℃で暗条件下で培養すれば７〜Ｈ３で３〜Ａ
ｌ１１φのカルスに生長する。
ｌ１１φのカルスに生長する。
比
とのカルスを再分化培養、例えば、Ｈ＆培地。
但し、ホルモンフリーあるｂはサイト力イニンコ〜よＩ
ＩＩＩ／を添加・シ、＝３〜．２７℃でコｏｏ。
ＩＩＩ／を添加・シ、＝３〜．２７℃でコｏｏ。
〜ｊ ０００１ｕｘ （／りｈｒ日長）の条件下に培養
すれば一〜３週間で幼植物の形成が認められ。
すれば一〜３週間で幼植物の形成が認められ。
更に一〜Ｊ週間で移植可能な植物体が得られる。
この時の再分化率は非常に高（、ｒ０３以上のイ固
カルスからそれぞれ複数回の個体が得られる。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例／
（イネ完熟種子由来プロトプラストの調製）穎を取シ除
いた日本謂の完熟種子を滅菌処理した後、Ｍｕｒａｓｈ
ｉｇｅ ＆ ＳｌｃＯＯｇ（ＭＳ ）寒天培地（コ謙−
Ｄコｗｑ／ｌ；カゼイン加水分解物二ｉ７ｔ ；パクト
アガーｔｉ７ｔ）に置床して、コロ℃で培養してカルス
を誘導した。３週間後にカルスを集め、細分してａＮセ
ルラーゼ（セルラーゼＲ８）および／Ｘペクチナーゼ（
マセロザイムＲ１０）を含むＯ，グＭシュークロース溶
液（ｐＨ３，３）に移して３０″Ｃ，ＡＯａｐｍの条件
で３〜“時間酵素処理し次・ イ合酵素
処理液をろ過した後、ろ液にダ培量のＫＭＯ液（ＫＱｌ
ｏ、／ ／ Ｋ Ｍ、 ０ａＯ１４０，Ｏｔ ｊＭ、
ＭｇＯ１４０，０１／ ７Ｍ、 ｐＨｌ−，０）を加え
、遠心分離して沈降し九プロトプラストを得た。このプ
ロトプラストを上記ＫＭＯ液で一回洗浄した。
いた日本謂の完熟種子を滅菌処理した後、Ｍｕｒａｓｈ
ｉｇｅ ＆ ＳｌｃＯＯｇ（ＭＳ ）寒天培地（コ謙−
Ｄコｗｑ／ｌ；カゼイン加水分解物二ｉ７ｔ ；パクト
アガーｔｉ７ｔ）に置床して、コロ℃で培養してカルス
を誘導した。３週間後にカルスを集め、細分してａＮセ
ルラーゼ（セルラーゼＲ８）および／Ｘペクチナーゼ（
マセロザイムＲ１０）を含むＯ，グＭシュークロース溶
液（ｐＨ３，３）に移して３０″Ｃ，ＡＯａｐｍの条件
で３〜“時間酵素処理し次・ イ合酵素
処理液をろ過した後、ろ液にダ培量のＫＭＯ液（ＫＱｌ
ｏ、／ ／ Ｋ Ｍ、 ０ａＯ１４０，Ｏｔ ｊＭ、
ＭｇＯ１４０，０１／ ７Ｍ、 ｐＨｌ−，０）を加え
、遠心分離して沈降し九プロトプラストを得た。このプ
ロトプラストを上記ＫＭＯ液で一回洗浄した。
こ０ようにして得られたプロトプラストを１ｃａｏ ＆
Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ （ＫＭ ）培地（ｕ、４−Ｄ
２１４／ｌ。
Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ （ＫＭ ）培地（ｕ、４−Ｄ
２１４／ｌ。
０、’ｌ Ｍシェークロース）に懸濁し、この懸濁液Ｏ
０よ―と約弘Ｑ℃に温めたアガロースゲル片九を含むＫ
Ｍ培地０．２−とを混合し、速やかに３５−一シャーレ
に均一に広げて固化させた。この時の細胞密度は！Ｘ１
０’個／−であった。この固化したアガロースゲルをＳ
ＸコＯ■位の大きさに切シ、上記ＫＭ培地６−のはいっ
ている６１φのシャーレに浮べ、同時にイネの培養細胞
コｏ ＯＭｇ（ＩＦＷ）を加えた。このイネの培！！Ｉ
細胞は次のよりにして調製した。即ち、Ｆ３由来カルス
を液体培地中で週７回の頻度で何代にもわたって植継き
維持している、分裂旺盛な細かい培養細胞の植継ぎ後５
日月のものを３７μｍのナイロンメツシュで濾過して培
養細胞を集め之。
０よ―と約弘Ｑ℃に温めたアガロースゲル片九を含むＫ
Ｍ培地０．２−とを混合し、速やかに３５−一シャーレ
に均一に広げて固化させた。この時の細胞密度は！Ｘ１
０’個／−であった。この固化したアガロースゲルをＳ
ＸコＯ■位の大きさに切シ、上記ＫＭ培地６−のはいっ
ている６１φのシャーレに浮べ、同時にイネの培養細胞
コｏ ＯＭｇ（ＩＦＷ）を加えた。このイネの培！！Ｉ
細胞は次のよりにして調製した。即ち、Ｆ３由来カルス
を液体培地中で週７回の頻度で何代にもわたって植継き
維持している、分裂旺盛な細かい培養細胞の植継ぎ後５
日月のものを３７μｍのナイロンメツシュで濾過して培
養細胞を集め之。
これをｊ Ｏｒｐｍ位の回転でゆつくシ振とうしながら
暗条件下、コよ℃で培養した。培養開始後、７−４Ｚ日
目で第１分裂が始まシ、約／週間で第７分裂が終了した
。第１分裂終了後、イネ培養細胞を取シ除き、新しい１
Ｍ培地６−を加えて引続き同一条件で培養を行ったとこ
ろ、３週間後には０．５〜／、０．φのコロニーが形成
すした。コロニーの形成率は約（１１，ｊ Ｘであった
。
暗条件下、コよ℃で培養した。培養開始後、７−４Ｚ日
目で第１分裂が始まシ、約／週間で第７分裂が終了した
。第１分裂終了後、イネ培養細胞を取シ除き、新しい１
Ｍ培地６−を加えて引続き同一条件で培養を行ったとこ
ろ、３週間後には０．５〜／、０．φのコロニーが形成
すした。コロニーの形成率は約（１１，ｊ Ｘであった
。
このコロニーヲ増殖培地（Ｎ４：コ、４！−Ｄ コ”
ｆ／Ｌ、 ＢＡＰ □、よ”Ｐ／ｌ、シュークａ−ｘ
ｊＸ） Ｋよ００個／ｄ工θｈとなるように広げてλ
！℃で培養したとζろ％７〜ｇ日で３〜Ａｌ１１φのカ
ルスに生長した。次いで、このカルスを再分比倍ｍ（Ｎ
ｂ ：ホルモンフリー、シュークロースＡ Ｘ ）に
移しコよ℃で培養を続けたところ、約二〜Ｊ週間で幼植
物の形成か認められ念。この時の再分化は高頻度に起ｐ
ｒｏ％以上のカルスから複数の個体が得られた。更に一
〜３週間生育させた後、／／Ａ；０００ａのワグネルボ
ットに移植したところ、コケ力抜においても全株とも植
物体として健全に生育してい次。
ｆ／Ｌ、 ＢＡＰ □、よ”Ｐ／ｌ、シュークａ−ｘ
ｊＸ） Ｋよ００個／ｄ工θｈとなるように広げてλ
！℃で培養したとζろ％７〜ｇ日で３〜Ａｌ１１φのカ
ルスに生長した。次いで、このカルスを再分比倍ｍ（Ｎ
ｂ ：ホルモンフリー、シュークロースＡ Ｘ ）に
移しコよ℃で培養を続けたところ、約二〜Ｊ週間で幼植
物の形成か認められ念。この時の再分化は高頻度に起ｐ
ｒｏ％以上のカルスから複数の個体が得られた。更に一
〜３週間生育させた後、／／Ａ；０００ａのワグネルボ
ットに移植したところ、コケ力抜においても全株とも植
物体として健全に生育してい次。
比較例／
実施？ｉｌ＋Ｊ ／ Ｋ、お−て、イネの培養細胞を加
えることなくプロトプラストのアガロースゲル片を培養
したが、実施例／で得られたようなコロニーは形成され
なかった。
えることなくプロトプラストのアガロースゲル片を培養
したが、実施例／で得られたようなコロニーは形成され
なかった。
本発明方法によれば、分裂頻度および再現性が高く、ま
た、品種開蓋の影響が少なく、効率よく植物体を再分化
させ得るイネプロトプラストを容易に得ることができる
。
た、品種開蓋の影響が少なく、効率よく植物体を再分化
させ得るイネプロトプラストを容易に得ることができる
。
Claims (1)
- （１）イネ完熟種子由来のカルスから調製したプロトプ
ラストを、イネ培養細胞を含む液体培地中で培養するこ
とを特徴とするイネプロトプラストの培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61075700A JPS62232382A (ja) | 1986-04-02 | 1986-04-02 | イネプロトプラストの培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61075700A JPS62232382A (ja) | 1986-04-02 | 1986-04-02 | イネプロトプラストの培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62232382A true JPS62232382A (ja) | 1987-10-12 |
| JPH0556944B2 JPH0556944B2 (ja) | 1993-08-20 |
Family
ID=13583754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61075700A Granted JPS62232382A (ja) | 1986-04-02 | 1986-04-02 | イネプロトプラストの培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62232382A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001001761A1 (fr) * | 1999-07-01 | 2001-01-11 | Sankyo Company, Limited | Procede de regeneration d'une plante appartenant au genre lilium |
| CN106962085A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-07-21 | 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 | 一种能使稻属植株快速脱病脱毒的扦插育苗方法 |
-
1986
- 1986-04-02 JP JP61075700A patent/JPS62232382A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001001761A1 (fr) * | 1999-07-01 | 2001-01-11 | Sankyo Company, Limited | Procede de regeneration d'une plante appartenant au genre lilium |
| CN106962085A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-07-21 | 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 | 一种能使稻属植株快速脱病脱毒的扦插育苗方法 |
| CN106962085B (zh) * | 2017-03-29 | 2019-09-20 | 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 | 一种能使稻属植株快速脱病脱毒的扦插育苗方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0556944B2 (ja) | 1993-08-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |