JP3519743B2 - オオムギプロトプラストからの植物体の再生方法 - Google Patents
オオムギプロトプラストからの植物体の再生方法Info
- Publication number
- JP3519743B2 JP3519743B2 JP15942291A JP15942291A JP3519743B2 JP 3519743 B2 JP3519743 B2 JP 3519743B2 JP 15942291 A JP15942291 A JP 15942291A JP 15942291 A JP15942291 A JP 15942291A JP 3519743 B2 JP3519743 B2 JP 3519743B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- culture
- protoplasts
- barley
- medium
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はオオムギのプロトプラス
トから健全な植物体を再生させる方法に関する。 【０００２】 【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
細胞融合や遺伝子導入等の手法により、新形質を持った
植物の作出方法が検討されている。この技術を植物細胞
に応用する場合、細胞壁を除いたプロトプラストが用い
られ、新形質を導入したプロトプラストから完全な植物
体が得られることが要求される。 【０００３】しかし、ムギ類のプロトプラストからの植
物体再生技術は、未だ十分に確立されておらず、特にオ
オムギに関しては、「Green plantregeneration from p
rotoplasts of barley (Hordeum vulgare L.),Yan．Q e
t al, Kexue Tongbao 35(1990) 」、「Genetic Enginee
ring of Crop Plants、231-238(1990)」の２例の報告が
あるだけであるが、これらにおいても、誘導したカルス
から懸濁細胞系を経てプロトプラスト培養に至るまで、
長期にわたる培養期間を必要とする。また、前者では、
液体培地で誘導したカルスを寒天培地上でさらに選抜す
るステップを必要とし、後者においては、アルビノの出
現も問題であった。 【０００４】本発明者らは、前述のような状況に鑑みて
鋭意検討の結果、高い再分化能を保有する細胞を一定条
件で培養することにより、再分化能を低下させることな
く短期間にプロトプラスト培養が可能な細胞系を作出
し、また得られたプロトプラストから、効率よく健全な
植物体のみを再生する方法を見出し本発明を完成した。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明は、受粉後１０〜
２０日目のオオムギ未熟胚から誘導したカルスを培養し
て得た懸濁細胞のうち直径２ mm 以下の小細胞塊のみを継
代培養し、これを培地１に対して０．１の容量の２年間
以上継代培養を継続中の増殖の活発な細胞系の培養濾過
液を含有する培地で培養した培養液からプロトプラスト
を単離し、当該プロトプラストより得たカルスの胚発生
的に増殖している部分を切り出し、当該部分を再分化培
地で培養してオオムギ植物体を得ることを特徴とするオ
オムギ植物体の再生方法を提供するものである。 【０００６】本発明のオオムギ植物体の再生方法につい
て、以下に詳しく述べる。まず、第１段階として、オオ
ムギ未熟胚から再分化能の高いカルスをカルス誘導培地
にて誘導し、液体振盪培養細胞系を作出する。用いる材
料はオオムギ未熟胚であるが、好ましくは受粉後10〜20
日目のオオムギ未熟胚を用いる。また、カルス誘導培地
としては、糖源としてマルトースまたはショ糖を3.０〜
5.０％、カゼイン加水分解物を0.１〜0.２５％、植物ホ
ルモンである2,4-D を２〜２０mg/lの範囲で含有するKM
｛Kao & Mychailyk(1975) Planta126: 105-110｝または
R2｛Ohira et al.(1973) Plant Cell Physiol.14: 1113
-1121 ｝を含有するものを使用し、２３〜２６℃、好ま
しくは２５℃、暗黒下で培養してカルスを誘導し、次い
で、誘導と同一条件の培地で１ヵ月に１度継代培養を行
う。 【０００７】次に、第２段階として、カルスを液体培地
に移して継代培養を行い、プロトプラストを単離し易い
細胞を選抜し、作出する。この段階で留意すべき点は、
高い再分化能と増殖能を併せ持つ細胞塊を選抜すること
にある。本発明では、この課題を解決するために、篩を
用いた選抜と増殖の活発な細胞系の培養濾液によるコン
デイショニングを行う。増殖の活発な細胞系の培養濾液
とは、２年間以上継代培養を継続中の増殖の活発な細
胞、例えば１週間に３〜７倍増殖するもので、本発明の
細胞系と同じ培地で継代している未熟胚由来の細胞系が
望ましい。 【０００８】カルスを液体培地に移して継代培養を行う
場合は、糖源としてマルトースまたはショ糖を3.０〜5.
０％、カゼイン加水分解物を0.１〜0.２５％、植物ホル
モン2,4-D を２〜４mg/l含有するKM,R2,LM｛Lazzeri et
al.(1990) Genetic Engineering of Crop Plants 231-
238 ｝の各液体培地で当該液体培地１に対し0.０３〜0.
３の重量の細胞を添加し、１週間おきに継代培養を行
う。この場合の培養は２３〜２６℃、好ましくは２５℃
で０〜２００lux 照明下で９０〜１２０rpm の旋回培養
を行うのが適当である。また、継代培養の際には、ステ
ンレス製の篩を用いて直径２mm以下の小細胞塊のみを分
別して継代し、大きな細胞塊は除くことが望ましい。 【０００９】さらに、液体培地１に対し0.１の容量の増
殖の活発な細胞系の培養濾液を添加すると、短期間でプ
ロトプラスト培養を行うことができる。このようにし
て、３〜４ヵ月培養された細胞系からプロトプラストを
適当な酵素液で遊離させる。 【００１０】プロトプラストを遊離させるために使用す
る酵素液は、例えばセルラーゼオノズカRS２％、ペクト
リアーゼY −２３ 0.１％、カゼイン加水分解物 0. ２
％、塩化カルシウム１０mM、MES ５mM、浸透圧調整剤と
してマンニトール0.６M を含むものを用い、pHは5.６〜
5.８に調整する。 【００１１】細胞をこの酵素液中で３時間程振盪培養す
ると、多数のプロトプラストが分離される。この酵素液
を６３um，２６umのステンレス篩で濾過し、未消化の細
胞を除いた後、８００rpm で５分間遠心してプロトプラ
ストを沈澱させ、回収する。 【００１２】このようにして得られたプロトプラスト
は、塩化カルシウム１０mMを含む0.６M マンニトール液
で３回洗浄し、培養に供する。 【００１３】次に、第３段階としてプロトプラストの培
養を行い、コロニーを形成させる。この段階でプロトプ
ラストの安定した分裂によって、多数のコロニーを得る
ために、本発明では浸透圧調整剤として従来使用されて
いるマンニトールやグルコースの代わりにマルトースを
用いる。また、オオムギ懸濁培養細胞を共存させる以下
の手段を用いる。すなわち、0.４M マルトース、2.０〜
4.０mg/l、 2,4-D、1.０〜1.５％のSea Plaque Agarose
を含有するKM,LM 等の培地に、密度0.５〜1.０×１０6
個/ml になるようにプロトプラストを懸濁して、速やか
にシャーレ上に広げ、薄く固める。このとき、アガロー
スゲルの厚さは0.７mm程度になるのが望ましい。 【００１４】固化したアガロースゲルのまわりに液体の
上記培地を加え、さらに増殖の盛んなオオムギ懸濁培養
細胞を３００mg(fresh weight)/6cm dish 程度共存させ
て、２３〜２６℃、好ましくは２５℃で暗黒下でゆっく
り振盪培養を行う。培養開始後２週間目に共存培養細胞
を取り除き、浸透圧調整剤を含まないKM,LM 培地を添加
して、上記と同じ条件下でさらに培養を続けると、１〜
２週間で直径1.０〜2.０mm程度のコロニーが形成され
る。 【００１５】第４段階として、前述のようにして形成さ
れたコロニーからカルスを形成し、器官分化を経て植物
体へ再分化させる。この段階においてコロニーから健全
な植物体のみを簡便に再分化させるために、本発明では
以下の方法を用いる。まず、1.０〜2.０mm程度に成長し
たコロニーを含むアガロースブロックを2.０〜3.０％マ
ルトースおよび植物ホルモンIAA 0.５〜5.０mg/lとZeat
in 0. ０５〜0.５mg/lを含有するR2培地上にのせて、２
３〜２６℃、好ましくは２５℃で１００〜５００lux 、
好ましくは２００lux 照明下で培養する。 【００１６】この場合、最も好ましいホルモンの組み合
わせは、IAA 1.０mg/lとZeatin 0.5mg/lである。培養細
胞の様子を見ながら、ほぼ２週間に１回の割合でクリー
ンベンチ内でシャーレの蓋を開けて３０分から２時間程
度乾燥させ、内部の水滴を除く。 【００１７】培養１ヵ月後にコロニーは増殖してカルス
を形成する。このカルスを実体顕微鏡下で観察すると、
黄緑色を呈し、胚発生的に増殖している部分が観察され
る。この部分のみを直径２〜５mm程度で切り出して新鮮
な再分化培地上に移し、照明を２０００〜６０００lux
に上げて培養を続けると、３〜４週間で緑色の幼植物体
が観察され、さらに２〜３週間後に移植可能な植物体が
得られる。しかし、胚発生的に増殖している部分を切り
出さない場合には、植物体の再分化は見られない。 【００１８】 【実施例】以下に実施例を示して本発明を詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ 植物体再生能を持ったカルスの誘導およびその継代培養 オオムギ（品種：DISSA ）の受粉後１５日目の穂を７０
％アルコールに１分間、次亜塩素酸ナトリウム溶液（塩
素濃度５％）に２０分間浸した後、滅菌蒸留水で３回洗
浄し、未熟胚を取り出した。次いで、KMの基本培地に３
％マルトース、４mg/l 2,4-D 、0.１％カゼイン加水分
解物を含む寒天培地に、胚盤を上側にして置床した。２
５℃暗黒下で１ヵ月培養すると、カルスが得られた。こ
のカルスはを同一条件下で４週間おきに継代培養した。 【００１９】実施例２ 誘導されたカルスの液体培養 実施例１で誘導された直径１cm程度のカルスを、５０ml
三角フラスコに入れ、５mlの液体培地を加えて２５℃で
振盪培養を行った。振盪速度は１分間に１１０回転と
し、液体培地として３％ショ糖、0.１％カゼイン加水分
解物、２mg/l 2,4-Dを含むKM培地を用いた。週に１度培
地を交換し、カルスがフラスコの底面一杯に増殖したと
ころで１００ml三角フラスコに移し、１０mlの培地中で
同様の振盪培養を行った。植え継ぎは週に１度行い、こ
の時クリーム色、コンパクトで直径２mm以下の細胞塊を
篩を用いて選抜した。また、増殖のよい細胞系の培養濾
液を１ml添加した。 【００２０】実施例３ プロトプラストの単離 実施例２のように液体培地中で培養された、継代培養後
３日目の細胞を材料とし、細胞１g につき１０mlの酵素
液を添加して、２５℃、２０rpm の条件で３時間処理し
た。なお、このとき用いた酵素液は、セルラーゼオノズ
カRS ２％、ペクトリアーゼY-23 0.１％、カゼイン加
水分解物 0. ２％、塩化カルシウム１０mM、MES ５mM、
浸透圧調整剤としてマンニトール0.６M を含むものを用
い、pHは5.６〜5.８に調整した。 【００２１】また、プロトプラストを含む酵素液は６３
um, ２６umのステンレス篩で濾過することによって未消
化の細胞を除いた後、８００rpm で５分間遠心してプロ
トプラストを沈澱、回収した。得られたプロトプラスト
は、塩化カルシウム10mMを含む0.６M マンニトール液で
３回洗浄し、培養に供試した。 【００２２】実施例４ プロトプラストの培養 実施例３で得られたプロトプラスト1.０×１０6 個を0.
４M マルトース、２mg/l 2,4-D、1.５％のSea Plaque A
garoseを含有するLM培地1ml に懸濁して、直径６cmのシ
ャーレ上に速やかに広げ、薄く固めた。固化したアガロ
ースゲルのまわりに液体の上記培地を４ml加え、さらに
増殖の盛んなオオムギ懸濁培養細胞を３００mg(fresh w
eight)／６cm dish 程度共存させて、暗黒下で振盪培養
を行った。培養開始後２週間目に共存培養細胞を取り除
き、マルトースを５％含むLM培地を添加して、さらに培
養を続けると、１〜２週間で直径1.０〜2.０mm程度のコ
ロニーが形成された。 【００２３】実施例５ 植物体の再分化 実施例４で得た直径1.０〜2.０mm程度に成長したコロニ
ーを含むアガロースブロックを２％マルトース、1.０mg
/l IAA、0.５mg/l Zeatine、0.１％カゼイン加水分解物
を含み、0.８％ Sea Plaque Agarose で固化したR2培地
上にのせて、２５℃，２００lux 照明下で培養した。培
養１ヵ月後に実体顕微鏡下で、黄緑色を呈し、胚発生的
に増殖している部分を直径２〜５mm程度で切り出して新
鮮な再分化培地上に移し、照明を２０００lux に上げて
培養を続けた。その結果、３〜４週間で緑色の幼植物体
が観察され、さらに２〜３週間で移植可能な完全な植物
体へと成長した。 【００２４】 【発明の効果】本発明のオオムギプロトプラストからの
植物体の再生方法によれば、短期間にかつ効率良く健全
な植物体のみを再生することができる。よって、遺伝子
組換え、細胞融合などのバイオテクノロジーを利用した
新品種の育成に利用されることが期待される。
トから健全な植物体を再生させる方法に関する。 【０００２】 【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
細胞融合や遺伝子導入等の手法により、新形質を持った
植物の作出方法が検討されている。この技術を植物細胞
に応用する場合、細胞壁を除いたプロトプラストが用い
られ、新形質を導入したプロトプラストから完全な植物
体が得られることが要求される。 【０００３】しかし、ムギ類のプロトプラストからの植
物体再生技術は、未だ十分に確立されておらず、特にオ
オムギに関しては、「Green plantregeneration from p
rotoplasts of barley (Hordeum vulgare L.),Yan．Q e
t al, Kexue Tongbao 35(1990) 」、「Genetic Enginee
ring of Crop Plants、231-238(1990)」の２例の報告が
あるだけであるが、これらにおいても、誘導したカルス
から懸濁細胞系を経てプロトプラスト培養に至るまで、
長期にわたる培養期間を必要とする。また、前者では、
液体培地で誘導したカルスを寒天培地上でさらに選抜す
るステップを必要とし、後者においては、アルビノの出
現も問題であった。 【０００４】本発明者らは、前述のような状況に鑑みて
鋭意検討の結果、高い再分化能を保有する細胞を一定条
件で培養することにより、再分化能を低下させることな
く短期間にプロトプラスト培養が可能な細胞系を作出
し、また得られたプロトプラストから、効率よく健全な
植物体のみを再生する方法を見出し本発明を完成した。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明は、受粉後１０〜
２０日目のオオムギ未熟胚から誘導したカルスを培養し
て得た懸濁細胞のうち直径２ mm 以下の小細胞塊のみを継
代培養し、これを培地１に対して０．１の容量の２年間
以上継代培養を継続中の増殖の活発な細胞系の培養濾過
液を含有する培地で培養した培養液からプロトプラスト
を単離し、当該プロトプラストより得たカルスの胚発生
的に増殖している部分を切り出し、当該部分を再分化培
地で培養してオオムギ植物体を得ることを特徴とするオ
オムギ植物体の再生方法を提供するものである。 【０００６】本発明のオオムギ植物体の再生方法につい
て、以下に詳しく述べる。まず、第１段階として、オオ
ムギ未熟胚から再分化能の高いカルスをカルス誘導培地
にて誘導し、液体振盪培養細胞系を作出する。用いる材
料はオオムギ未熟胚であるが、好ましくは受粉後10〜20
日目のオオムギ未熟胚を用いる。また、カルス誘導培地
としては、糖源としてマルトースまたはショ糖を3.０〜
5.０％、カゼイン加水分解物を0.１〜0.２５％、植物ホ
ルモンである2,4-D を２〜２０mg/lの範囲で含有するKM
｛Kao & Mychailyk(1975) Planta126: 105-110｝または
R2｛Ohira et al.(1973) Plant Cell Physiol.14: 1113
-1121 ｝を含有するものを使用し、２３〜２６℃、好ま
しくは２５℃、暗黒下で培養してカルスを誘導し、次い
で、誘導と同一条件の培地で１ヵ月に１度継代培養を行
う。 【０００７】次に、第２段階として、カルスを液体培地
に移して継代培養を行い、プロトプラストを単離し易い
細胞を選抜し、作出する。この段階で留意すべき点は、
高い再分化能と増殖能を併せ持つ細胞塊を選抜すること
にある。本発明では、この課題を解決するために、篩を
用いた選抜と増殖の活発な細胞系の培養濾液によるコン
デイショニングを行う。増殖の活発な細胞系の培養濾液
とは、２年間以上継代培養を継続中の増殖の活発な細
胞、例えば１週間に３〜７倍増殖するもので、本発明の
細胞系と同じ培地で継代している未熟胚由来の細胞系が
望ましい。 【０００８】カルスを液体培地に移して継代培養を行う
場合は、糖源としてマルトースまたはショ糖を3.０〜5.
０％、カゼイン加水分解物を0.１〜0.２５％、植物ホル
モン2,4-D を２〜４mg/l含有するKM,R2,LM｛Lazzeri et
al.(1990) Genetic Engineering of Crop Plants 231-
238 ｝の各液体培地で当該液体培地１に対し0.０３〜0.
３の重量の細胞を添加し、１週間おきに継代培養を行
う。この場合の培養は２３〜２６℃、好ましくは２５℃
で０〜２００lux 照明下で９０〜１２０rpm の旋回培養
を行うのが適当である。また、継代培養の際には、ステ
ンレス製の篩を用いて直径２mm以下の小細胞塊のみを分
別して継代し、大きな細胞塊は除くことが望ましい。 【０００９】さらに、液体培地１に対し0.１の容量の増
殖の活発な細胞系の培養濾液を添加すると、短期間でプ
ロトプラスト培養を行うことができる。このようにし
て、３〜４ヵ月培養された細胞系からプロトプラストを
適当な酵素液で遊離させる。 【００１０】プロトプラストを遊離させるために使用す
る酵素液は、例えばセルラーゼオノズカRS２％、ペクト
リアーゼY −２３ 0.１％、カゼイン加水分解物 0. ２
％、塩化カルシウム１０mM、MES ５mM、浸透圧調整剤と
してマンニトール0.６M を含むものを用い、pHは5.６〜
5.８に調整する。 【００１１】細胞をこの酵素液中で３時間程振盪培養す
ると、多数のプロトプラストが分離される。この酵素液
を６３um，２６umのステンレス篩で濾過し、未消化の細
胞を除いた後、８００rpm で５分間遠心してプロトプラ
ストを沈澱させ、回収する。 【００１２】このようにして得られたプロトプラスト
は、塩化カルシウム１０mMを含む0.６M マンニトール液
で３回洗浄し、培養に供する。 【００１３】次に、第３段階としてプロトプラストの培
養を行い、コロニーを形成させる。この段階でプロトプ
ラストの安定した分裂によって、多数のコロニーを得る
ために、本発明では浸透圧調整剤として従来使用されて
いるマンニトールやグルコースの代わりにマルトースを
用いる。また、オオムギ懸濁培養細胞を共存させる以下
の手段を用いる。すなわち、0.４M マルトース、2.０〜
4.０mg/l、 2,4-D、1.０〜1.５％のSea Plaque Agarose
を含有するKM,LM 等の培地に、密度0.５〜1.０×１０6
個/ml になるようにプロトプラストを懸濁して、速やか
にシャーレ上に広げ、薄く固める。このとき、アガロー
スゲルの厚さは0.７mm程度になるのが望ましい。 【００１４】固化したアガロースゲルのまわりに液体の
上記培地を加え、さらに増殖の盛んなオオムギ懸濁培養
細胞を３００mg(fresh weight)/6cm dish 程度共存させ
て、２３〜２６℃、好ましくは２５℃で暗黒下でゆっく
り振盪培養を行う。培養開始後２週間目に共存培養細胞
を取り除き、浸透圧調整剤を含まないKM,LM 培地を添加
して、上記と同じ条件下でさらに培養を続けると、１〜
２週間で直径1.０〜2.０mm程度のコロニーが形成され
る。 【００１５】第４段階として、前述のようにして形成さ
れたコロニーからカルスを形成し、器官分化を経て植物
体へ再分化させる。この段階においてコロニーから健全
な植物体のみを簡便に再分化させるために、本発明では
以下の方法を用いる。まず、1.０〜2.０mm程度に成長し
たコロニーを含むアガロースブロックを2.０〜3.０％マ
ルトースおよび植物ホルモンIAA 0.５〜5.０mg/lとZeat
in 0. ０５〜0.５mg/lを含有するR2培地上にのせて、２
３〜２６℃、好ましくは２５℃で１００〜５００lux 、
好ましくは２００lux 照明下で培養する。 【００１６】この場合、最も好ましいホルモンの組み合
わせは、IAA 1.０mg/lとZeatin 0.5mg/lである。培養細
胞の様子を見ながら、ほぼ２週間に１回の割合でクリー
ンベンチ内でシャーレの蓋を開けて３０分から２時間程
度乾燥させ、内部の水滴を除く。 【００１７】培養１ヵ月後にコロニーは増殖してカルス
を形成する。このカルスを実体顕微鏡下で観察すると、
黄緑色を呈し、胚発生的に増殖している部分が観察され
る。この部分のみを直径２〜５mm程度で切り出して新鮮
な再分化培地上に移し、照明を２０００〜６０００lux
に上げて培養を続けると、３〜４週間で緑色の幼植物体
が観察され、さらに２〜３週間後に移植可能な植物体が
得られる。しかし、胚発生的に増殖している部分を切り
出さない場合には、植物体の再分化は見られない。 【００１８】 【実施例】以下に実施例を示して本発明を詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ 植物体再生能を持ったカルスの誘導およびその継代培養 オオムギ（品種：DISSA ）の受粉後１５日目の穂を７０
％アルコールに１分間、次亜塩素酸ナトリウム溶液（塩
素濃度５％）に２０分間浸した後、滅菌蒸留水で３回洗
浄し、未熟胚を取り出した。次いで、KMの基本培地に３
％マルトース、４mg/l 2,4-D 、0.１％カゼイン加水分
解物を含む寒天培地に、胚盤を上側にして置床した。２
５℃暗黒下で１ヵ月培養すると、カルスが得られた。こ
のカルスはを同一条件下で４週間おきに継代培養した。 【００１９】実施例２ 誘導されたカルスの液体培養 実施例１で誘導された直径１cm程度のカルスを、５０ml
三角フラスコに入れ、５mlの液体培地を加えて２５℃で
振盪培養を行った。振盪速度は１分間に１１０回転と
し、液体培地として３％ショ糖、0.１％カゼイン加水分
解物、２mg/l 2,4-Dを含むKM培地を用いた。週に１度培
地を交換し、カルスがフラスコの底面一杯に増殖したと
ころで１００ml三角フラスコに移し、１０mlの培地中で
同様の振盪培養を行った。植え継ぎは週に１度行い、こ
の時クリーム色、コンパクトで直径２mm以下の細胞塊を
篩を用いて選抜した。また、増殖のよい細胞系の培養濾
液を１ml添加した。 【００２０】実施例３ プロトプラストの単離 実施例２のように液体培地中で培養された、継代培養後
３日目の細胞を材料とし、細胞１g につき１０mlの酵素
液を添加して、２５℃、２０rpm の条件で３時間処理し
た。なお、このとき用いた酵素液は、セルラーゼオノズ
カRS ２％、ペクトリアーゼY-23 0.１％、カゼイン加
水分解物 0. ２％、塩化カルシウム１０mM、MES ５mM、
浸透圧調整剤としてマンニトール0.６M を含むものを用
い、pHは5.６〜5.８に調整した。 【００２１】また、プロトプラストを含む酵素液は６３
um, ２６umのステンレス篩で濾過することによって未消
化の細胞を除いた後、８００rpm で５分間遠心してプロ
トプラストを沈澱、回収した。得られたプロトプラスト
は、塩化カルシウム10mMを含む0.６M マンニトール液で
３回洗浄し、培養に供試した。 【００２２】実施例４ プロトプラストの培養 実施例３で得られたプロトプラスト1.０×１０6 個を0.
４M マルトース、２mg/l 2,4-D、1.５％のSea Plaque A
garoseを含有するLM培地1ml に懸濁して、直径６cmのシ
ャーレ上に速やかに広げ、薄く固めた。固化したアガロ
ースゲルのまわりに液体の上記培地を４ml加え、さらに
増殖の盛んなオオムギ懸濁培養細胞を３００mg(fresh w
eight)／６cm dish 程度共存させて、暗黒下で振盪培養
を行った。培養開始後２週間目に共存培養細胞を取り除
き、マルトースを５％含むLM培地を添加して、さらに培
養を続けると、１〜２週間で直径1.０〜2.０mm程度のコ
ロニーが形成された。 【００２３】実施例５ 植物体の再分化 実施例４で得た直径1.０〜2.０mm程度に成長したコロニ
ーを含むアガロースブロックを２％マルトース、1.０mg
/l IAA、0.５mg/l Zeatine、0.１％カゼイン加水分解物
を含み、0.８％ Sea Plaque Agarose で固化したR2培地
上にのせて、２５℃，２００lux 照明下で培養した。培
養１ヵ月後に実体顕微鏡下で、黄緑色を呈し、胚発生的
に増殖している部分を直径２〜５mm程度で切り出して新
鮮な再分化培地上に移し、照明を２０００lux に上げて
培養を続けた。その結果、３〜４週間で緑色の幼植物体
が観察され、さらに２〜３週間で移植可能な完全な植物
体へと成長した。 【００２４】 【発明の効果】本発明のオオムギプロトプラストからの
植物体の再生方法によれば、短期間にかつ効率良く健全
な植物体のみを再生することができる。よって、遺伝子
組換え、細胞融合などのバイオテクノロジーを利用した
新品種の育成に利用されることが期待される。
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 昭61−74519（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−265022（ＪＰ，Ａ)
ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｖｏ
ｌ．７（1989．７）Ｐ．581−587
Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒ
ｔ． Ｖｏｌ．７（1988）Ｐ．414−417
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A01H 4/00
ＢＩＯＳＩＳ
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 受粉後１０〜２０日目のオオムギ未熟胚
から誘導したカルスを培養して得た懸濁細胞のうち直径
２mm以下の小細胞塊のみを継代培養し、これを培地１に
対して０．１の容量の２年間以上継代培養を継続中の増
殖の活発な細胞系の培養濾過液を含有する培地で培養し
た培養液からプロトプラストを単離し、当該プロトプラ
ストより得たカルスの胚発生的に増殖している部分を切
り出し、当該部分を再分化培地で培養してオオムギ植物
体を得ることを特徴とするオオムギ植物体の再生方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15942291A JP3519743B2 (ja) | 1991-06-04 | 1991-06-04 | オオムギプロトプラストからの植物体の再生方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15942291A JP3519743B2 (ja) | 1991-06-04 | 1991-06-04 | オオムギプロトプラストからの植物体の再生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04360633A JPH04360633A (ja) | 1992-12-14 |
| JP3519743B2 true JP3519743B2 (ja) | 2004-04-19 |
Family
ID=15693402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15942291A Expired - Fee Related JP3519743B2 (ja) | 1991-06-04 | 1991-06-04 | オオムギプロトプラストからの植物体の再生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3519743B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103947550B (zh) * | 2014-04-20 | 2016-04-13 | 浙江省农业科学院 | 大麦幼胚直接成苗组织培养法及所用培养基 |
| CN109349107B (zh) * | 2018-11-02 | 2021-05-28 | 西藏自治区农牧科学院农业研究所 | 一种青稞试管苗快繁方法 |
| CN113717924A (zh) * | 2021-10-18 | 2021-11-30 | 河北农业大学 | 一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用 |
-
1991
- 1991-06-04 JP JP15942291A patent/JP3519743B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ．７（１９８９．７）Ｐ．５８１−５８７ |
| Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ． Ｖｏｌ．７（１９８８）Ｐ．４１４−４１７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04360633A (ja) | 1992-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Thompson et al. | Protoplast culture of rice (Oryza sativa L.) using media solidified with agarose | |
| JP3865264B2 (ja) | 長期にわたり高度に効率的な植物再生能力を持つ改善されたゼア・メイズ・エルの遺伝子型 | |
| CA1288713C (en) | Method of regenerating rice plant from protoplasts | |
| JP4858790B2 (ja) | 植物生長調整補助剤を使用した再分化植物体の作製方法 | |
| JP3519743B2 (ja) | オオムギプロトプラストからの植物体の再生方法 | |
| Karim et al. | Cell suspension, isolation and culture of protoplasts of Allium cepa | |
| Lührs et al. | Microspore cultures as donor tissue for the initiation of embryogenic cell suspensions in barley | |
| TORIYAMA et al. | Panicle culture in liquid media for obtaining anther calli and protoplasts in rice | |
| JP4329410B2 (ja) | 植物生長調整補助剤及び該植物生長調整補助剤を使用した再分化植物体の作製方法 | |
| US6569680B2 (en) | Efficient method of protoplast culture | |
| JP3806156B2 (ja) | オオムギ植物体の再生方法 | |
| JPH07213183A (ja) | オオムギ植物体の再生方法 | |
| JP2833795B2 (ja) | ナデシコ属植物のプロトプラスト調製方法及び植物体再生方法 | |
| Vuorela et al. | Spontaneous somatic embryogenesis and plant regeneration from root cultures of Peucedanum palustre | |
| JPH07107871A (ja) | ラン科植物の培養方法 | |
| US4977087A (en) | Method of regenerating plantlets from mesophyll protoplasts of phaseolus angularis | |
| JPS62232382A (ja) | イネプロトプラストの培養方法 | |
| JP2944700B2 (ja) | インディカ型イネプロトプラスト用培地 | |
| JPH09206069A (ja) | 半透膜の袋を用いた細胞培養方法 | |
| JP2840854B2 (ja) | ワサビプロトプラストからのカルス再生法 | |
| JP2636325B2 (ja) | コムギ属植物のプロトプラストの培養方法 | |
| SU852275A1 (ru) | Способ регенерации растенийлюцЕРНы | |
| JP2001069867A (ja) | ユリ属植物の個体再生法 | |
| Mitchell et al. | Haploid suspension and protoplast culture from isolated microspores of maize | |
| JPH03247273A (ja) | イリス属植物のプロトプラストならびにその単離および培養方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040130 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080206 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090206 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100206 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100206 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110206 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |