JPH03247273A - イリス属植物のプロトプラストならびにその単離および培養方法 - Google Patents
イリス属植物のプロトプラストならびにその単離および培養方法Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
Landscapes
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はイリス（辿）属植物のプロトプラスト培養系に
関し、より具体的にはイリス属植物のプロトプラスト、
その単離方法および培養方法に関する。
関し、より具体的にはイリス属植物のプロトプラスト、
その単離方法および培養方法に関する。
植物組織培養技術による植物の育種あるいは有用物質生
産においては、細胞融合や遺伝子導入等の技術が広く用
いられる。これらの技術を利用するために、それぞれの
植物種においてプロトプラスト培養系の確立が必要不可
欠である。プロトプラストの培養については、タバコに
ついて連部らにより報告（Ｐｌａｎｔａ、 ９９．１２
〜２０．１９７１） されて以来、数々の植物種にお
いてその培養が報告されている。近年では、培養が困難
とされていたイネについてもその成功例がみられるよう
になった。
産においては、細胞融合や遺伝子導入等の技術が広く用
いられる。これらの技術を利用するために、それぞれの
植物種においてプロトプラスト培養系の確立が必要不可
欠である。プロトプラストの培養については、タバコに
ついて連部らにより報告（Ｐｌａｎｔａ、 ９９．１２
〜２０．１９７１） されて以来、数々の植物種にお
いてその培養が報告されている。近年では、培養が困難
とされていたイネについてもその成功例がみられるよう
になった。
（Ｂｉｏ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ４．１０８５〜
１０９０．１９８６ ；ＰｌａｎｔＣｅｌｌ Ｒｅｐｏ
ｒｔｓ、 ５．８５〜８８．１９８６） 。一方、イ
リス属植物については、通常植物の組織培養技術を使用
する繁殖が報告されている（Ｈｏｒｔ ５ｃｉｅｎｃｅ
。
１０９０．１９８６ ；ＰｌａｎｔＣｅｌｌ Ｒｅｐｏ
ｒｔｓ、 ５．８５〜８８．１９８６） 。一方、イ
リス属植物については、通常植物の組織培養技術を使用
する繁殖が報告されている（Ｈｏｒｔ ５ｃｉｅｎｃｅ
。
第１０巻、第５号、１９７５年）。しかし、その報文で
カルス化に成功したのはイリス属植物の花部を用いた場
合だけであり、その他の部位（例えば根茎部、幼葉部）
ではカルス化が起きなかった。又、花部切片から得られ
たカルスを継代培養した場合に、そのカルスから植物体
への再生を安定して実施できる継代培養の期間について
も不明である。
カルス化に成功したのはイリス属植物の花部を用いた場
合だけであり、その他の部位（例えば根茎部、幼葉部）
ではカルス化が起きなかった。又、花部切片から得られ
たカルスを継代培養した場合に、そのカルスから植物体
への再生を安定して実施できる継代培養の期間について
も不明である。
しかしながら、前述のように植物種が異ると培養方法や
培養条件もことなり、必ずしも他の種で成功した培養方
法を応用できるとは限らない。ところで、イリス属植物
は花壇や切り花月に利用されるだけでなく、種によって
はその根茎部に高級天然精油の一種であるオリス油を蓄
積する重要な香料植物でもあるが、一般にプロトプラス
トは植物に共通してその細胞のもつ生物活性が著しく低
下するためイリス属植物についてそのプロトプラスト培
養に成功した例はみられない。
培養条件もことなり、必ずしも他の種で成功した培養方
法を応用できるとは限らない。ところで、イリス属植物
は花壇や切り花月に利用されるだけでなく、種によって
はその根茎部に高級天然精油の一種であるオリス油を蓄
積する重要な香料植物でもあるが、一般にプロトプラス
トは植物に共通してその細胞のもつ生物活性が著しく低
下するためイリス属植物についてそのプロトプラスト培
養に成功した例はみられない。
前述のごとく重要な植物であるイリス属植物の育種を行
う上で、多様性の期待できるプロトプラスト培養系の開
発が望まれていた。そこで、本発明はイリス属植物のプ
ロトプラスト、その単離方法および培養方法を提供する
ことを目的とする。
う上で、多様性の期待できるプロトプラスト培養系の開
発が望まれていた。そこで、本発明はイリス属植物のプ
ロトプラスト、その単離方法および培養方法を提供する
ことを目的とする。
前記課題は、次の本発明の提供により解決される。
すなわち、第一の本発明は、イリス（Ｉｒｉｓ）属植物
のプロトプラストに関し；第二の本発明は、植物組織培
養用固形培地で誘導したイリス属植物の組織塊を液体懸
濁培養細胞培養用培地に移植して生育した細かい球状の
細胞をプロトプラスト化することを特徴とするプロトプ
ラストの単離方法に関し；そして第三の本発明は、前記
プロトプラストをオーキシン類、炭素源、浸透圧調節剤
を含んでなる液体培地で培養することを特徴とする前記
プロトプラストの培養方法に関する。
のプロトプラストに関し；第二の本発明は、植物組織培
養用固形培地で誘導したイリス属植物の組織塊を液体懸
濁培養細胞培養用培地に移植して生育した細かい球状の
細胞をプロトプラスト化することを特徴とするプロトプ
ラストの単離方法に関し；そして第三の本発明は、前記
プロトプラストをオーキシン類、炭素源、浸透圧調節剤
を含んでなる液体培地で培養することを特徴とする前記
プロトプラストの培養方法に関する。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明において、イリス（Ｉｒｉｓ）属植物とは本発明
が適用できるすべてのイリス属に属する植物をいい、具
体的には根茎性のイリス属植物、イリス・ハリタ（辿ｐ
ａｌｉｄａ） 、イリス・フロレンチナ（Ｉｒｉｓ
ｆｌｏｒｅｎｔｉｎａ） 、イリス−ジャーマニ（ｂｉ
ｓ ｖａｒｉｅｇａｔａ） 、イリス・アフィラ（堕
ａｐｈｙｌｌａ） 、イリス−Ｄチー（Ｉｒｉｓ ｋ
ｏｃｈｉｉ）、イリス・センシアルティ （辿 ｃｅｎ
ｇｉａｌｔｉ）、イリス°アマス（ｂｉｓ ａｍａｓ
） 、イリスφトロジャーナ（Ｉｒｉｓ ｔｒｏｊａ
ｎａ） 、イリス・シベリアナ（Ｉｒｉｓ ｃｙｐｅ
ｒｉａｎａ） 、イリス・メソポタミカイリス属植物の
プロトプラストは、第二の本発明であるプロトプラスト
の単離方法によって単離することができる。
が適用できるすべてのイリス属に属する植物をいい、具
体的には根茎性のイリス属植物、イリス・ハリタ（辿ｐ
ａｌｉｄａ） 、イリス・フロレンチナ（Ｉｒｉｓ
ｆｌｏｒｅｎｔｉｎａ） 、イリス−ジャーマニ（ｂｉ
ｓ ｖａｒｉｅｇａｔａ） 、イリス・アフィラ（堕
ａｐｈｙｌｌａ） 、イリス−Ｄチー（Ｉｒｉｓ ｋ
ｏｃｈｉｉ）、イリス・センシアルティ （辿 ｃｅｎ
ｇｉａｌｔｉ）、イリス°アマス（ｂｉｓ ａｍａｓ
） 、イリスφトロジャーナ（Ｉｒｉｓ ｔｒｏｊａ
ｎａ） 、イリス・シベリアナ（Ｉｒｉｓ ｃｙｐｅ
ｒｉａｎａ） 、イリス・メソポタミカイリス属植物の
プロトプラストは、第二の本発明であるプロトプラスト
の単離方法によって単離することができる。
第二の本発明における組織培養には、イリス属植物の根
茎部、花部および幼葉部のいずれも使用することができ
るが、香料産生植物では根茎部、特に葉のつけ根部分を
使用するのが好ましい。これらの植物片からの組織塊の
誘導は、これらを通常の方法で滅菌したのち、オーキシ
ン類及び場合によりサイトカイニン類を添加した植物組
織培養用固形培地上に置床して組織塊を誘導することが
できる。植物組織培養用固形培地としては、ムラシゲと
スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ）培地
を始め、リンスマイヤーとスクーグ（Ｌｉｎｓｍａｉｅ
ｒ ＆ Ｓｋｏｏｇ ；以下ＬＳと称す）、ホワイト
（Ｗｈｉｔｅ） 、ガンボルグ（Ｇａｎｂｏｒｇ） 、
ニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ）、ヘラ−（Ｈｅｌｌｅｒ）、シ
ェンクとヒルデブランド（Ｓｃｈｅｎｋ ＆ ｆｌｉｌ
ｄｅｂｒａｎｔ）、ニッチとニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ ＆
Ｎ１ｔｓｃｈ）、コーレンバッハとシュミット（Ｋｏ
ｈｌｅｎｂａｃｈ ＆ Ｓｃｈｍｉｄｔ）などのいずれ
の培地を用いてもよい。なお、カルス誘導のためには光
を照射する必要はない。
茎部、花部および幼葉部のいずれも使用することができ
るが、香料産生植物では根茎部、特に葉のつけ根部分を
使用するのが好ましい。これらの植物片からの組織塊の
誘導は、これらを通常の方法で滅菌したのち、オーキシ
ン類及び場合によりサイトカイニン類を添加した植物組
織培養用固形培地上に置床して組織塊を誘導することが
できる。植物組織培養用固形培地としては、ムラシゲと
スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ）培地
を始め、リンスマイヤーとスクーグ（Ｌｉｎｓｍａｉｅ
ｒ ＆ Ｓｋｏｏｇ ；以下ＬＳと称す）、ホワイト
（Ｗｈｉｔｅ） 、ガンボルグ（Ｇａｎｂｏｒｇ） 、
ニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ）、ヘラ−（Ｈｅｌｌｅｒ）、シ
ェンクとヒルデブランド（Ｓｃｈｅｎｋ ＆ ｆｌｉｌ
ｄｅｂｒａｎｔ）、ニッチとニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ ＆
Ｎ１ｔｓｃｈ）、コーレンバッハとシュミット（Ｋｏ
ｈｌｅｎｂａｃｈ ＆ Ｓｃｈｍｉｄｔ）などのいずれ
の培地を用いてもよい。なお、カルス誘導のためには光
を照射する必要はない。
温度は、一般には１５℃〜３０℃の範囲、好ましくは２
０℃〜３０℃、更に好ましくは２５℃〜２７℃である。
０℃〜３０℃、更に好ましくは２５℃〜２７℃である。
又、オーキシン類としては、２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸（以下、２．４−Ｄと略す）、αナフタレン酢酸
、インドール−３−酢酸、インドール−３−酪酸（以下
、ＩＢＡと略す）、２．４゜５−トリクロロフェノキシ
酢酸などのいずれを添加しても良い。サイトカイニン類
としてはゼアチン、６−ベンジルアデニン、カイネチン
（以下、ＫＴと略す）、リボシルゼアチン、イソペンテ
ニルアデニンなどのいずれを添加しても良い。オーキシ
ン類としては２．４−Ｄが好ましく、サイトカイニン類
としてはＫＴが好ましい。添加するオーキシン類の濃度
は一般には０．ＩＩｇｌ−〜１０躍／−の範囲であり、
好ましくは０．５Ｎ／−〜２層／−である。オーキシン
類の濃度が０．ＩＩｇｌ−未満だと、カルスが誘導され
る確率は極端に低下する。
シ酢酸（以下、２．４−Ｄと略す）、αナフタレン酢酸
、インドール−３−酢酸、インドール−３−酪酸（以下
、ＩＢＡと略す）、２．４゜５−トリクロロフェノキシ
酢酸などのいずれを添加しても良い。サイトカイニン類
としてはゼアチン、６−ベンジルアデニン、カイネチン
（以下、ＫＴと略す）、リボシルゼアチン、イソペンテ
ニルアデニンなどのいずれを添加しても良い。オーキシ
ン類としては２．４−Ｄが好ましく、サイトカイニン類
としてはＫＴが好ましい。添加するオーキシン類の濃度
は一般には０．ＩＩｇｌ−〜１０躍／−の範囲であり、
好ましくは０．５Ｎ／−〜２層／−である。オーキシン
類の濃度が０．ＩＩｇｌ−未満だと、カルスが誘導され
る確率は極端に低下する。
オーキシン類の濃度がｌｏｇ ／ｍｌを超えても組織塊
の誘導率が低下する。サイトカイニン類を添加するとカ
ルス化が促進される。サイトカイニン類の濃度は一般に
は０．０１層／ｒｒｔｆｌ！〜１４／−の範囲であり好
ましくは０．０ＩＪＷ ／ｍｊ’ 〜０．５ ｔ１ｇ／
ｒｒＬ／！である。次に、誘導されたカルス様組織は、
その誘導に使用されたのと同じ条件で月に１回程度の間
隔で継代培養する。こうして得られる組織塊は、前記培
地上では大きくゴロゴロした形態であるためプロトプラ
ストの単離には適していない。そこで、この発明の重要
な要件となる前記固形培地で誘導、継代培養した組織塊
を液体懸濁培養細胞培養用培地に移植して細かい球状の
細胞塊を生じさせる必要がある。なお好ましくは、前記
液体培養前に比較的細かい細胞塊を生ずる固形培地、例
えば改変Ｂ５固形培地で培養してもよい。この液体懸濁
培養細胞培養用培地の好ましいものとしては、例えばガ
ンボルダＢ５培地（以下、「改変Ｂ５培地」という）な
どのそれ自体既知のものが挙げられる。
の誘導率が低下する。サイトカイニン類を添加するとカ
ルス化が促進される。サイトカイニン類の濃度は一般に
は０．０１層／ｒｒｔｆｌ！〜１４／−の範囲であり好
ましくは０．０ＩＪＷ ／ｍｊ’ 〜０．５ ｔ１ｇ／
ｒｒＬ／！である。次に、誘導されたカルス様組織は、
その誘導に使用されたのと同じ条件で月に１回程度の間
隔で継代培養する。こうして得られる組織塊は、前記培
地上では大きくゴロゴロした形態であるためプロトプラ
ストの単離には適していない。そこで、この発明の重要
な要件となる前記固形培地で誘導、継代培養した組織塊
を液体懸濁培養細胞培養用培地に移植して細かい球状の
細胞塊を生じさせる必要がある。なお好ましくは、前記
液体培養前に比較的細かい細胞塊を生ずる固形培地、例
えば改変Ｂ５固形培地で培養してもよい。この液体懸濁
培養細胞培養用培地の好ましいものとしては、例えばガ
ンボルダＢ５培地（以下、「改変Ｂ５培地」という）な
どのそれ自体既知のものが挙げられる。
この細かい細胞塊の選抜を続けると液体培養細胞として
順調に生育する細胞を得ることができる。
順調に生育する細胞を得ることができる。
この細胞は、−週間毎に新鮮培地に植え継ぐことにより
継代培養を行い生育の旺盛な時期のものをプロトプラス
ト単離の材料として用いることができる。
継代培養を行い生育の旺盛な時期のものをプロトプラス
ト単離の材料として用いることができる。
プロトプラスト化は、それ自体公知の方法が適用でき、
例えば、カルス由来の細かい球状の細胞塊をセルラーゼ
及びペクチナーゼを含み、浸透圧をマンニトールで調節
した酵素液中で２−３時間ゆっくりと振とう処理するこ
とによりイリス属植物のプロトプラストを得ることがで
きる。
例えば、カルス由来の細かい球状の細胞塊をセルラーゼ
及びペクチナーゼを含み、浸透圧をマンニトールで調節
した酵素液中で２−３時間ゆっくりと振とう処理するこ
とによりイリス属植物のプロトプラストを得ることがで
きる。
こうして得られるプロトプラストは浸透圧を調節した洗
浄液で洗浄した後、第三の本発明であるその培養に供す
ることができる。
浄液で洗浄した後、第三の本発明であるその培養に供す
ることができる。
この発明で用いるプロトプラスト培養培地は、植物ホル
モンとしてサイトカイニン類の添加を必ずしも必要とせ
ず、例えば、オーキシン類を０．５〜５、Ｏｍｇ／ｌ好
ましくは１．０〜２．０ｍｇ／β含み、炭素源を１〜１
０％好ましくは３〜６％含み、そして浸透圧をマンニト
ールで０．３〜０．７Ｍ好ましくは０．４〜０．５Ｍに
調製したものであることが好ましい。オーキシン類とし
ては、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（以下ｒ２．４
−ＤＪと略す）、α−ナフタレン酢酸（以下「ＮＡＡ」
と略す）、インドール−３−酢酸、インドール−３−酪
酸、２゜４＝５−ト’）クロロフェノキシ酢酸などを添
加することができる。炭素源としてはグルコースまたは
ンユークロースを用いることができる。浸透圧は、グル
コースやシュークロースで不足する分を、代謝的に不活
性な糖類、例えばマンニトールやソルビトールのような
浸透圧調節剤で調節するのが好ましい。本発明で用いる
基本培地としては、液体懸濁培養細胞培養用培地、すな
わち改変Ｂ５培地以外のいずれの培地を用いてもよく、
例えばＭＳ、ＬＳ、Ｖ−４７，ＶＫＭ、Ｂ５．ＫＭ８Ｐ
、ＷＢ培地を挙げることができる。イリス属植物のプロ
トプラストの場合、培地中に包埋することはプロトプラ
ストの生育を阻害するため、液体培地中で培養するか、
あるいは液体培地中に包埋細胞を浮遊させることが好ま
しい。培養は、例えば温度約２０〜３０℃で暗下または
照明下に静置もしくは回転数４４０−５０ｒｐでゆっく
りと振とうし培養を行うと、約４０〜５０日後に多数の
コロニーを形成することができる。こうして得られたコ
ロニーは、常法によって適切な培地に移植してカルスを
形成させることができる。
モンとしてサイトカイニン類の添加を必ずしも必要とせ
ず、例えば、オーキシン類を０．５〜５、Ｏｍｇ／ｌ好
ましくは１．０〜２．０ｍｇ／β含み、炭素源を１〜１
０％好ましくは３〜６％含み、そして浸透圧をマンニト
ールで０．３〜０．７Ｍ好ましくは０．４〜０．５Ｍに
調製したものであることが好ましい。オーキシン類とし
ては、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（以下ｒ２．４
−ＤＪと略す）、α−ナフタレン酢酸（以下「ＮＡＡ」
と略す）、インドール−３−酢酸、インドール−３−酪
酸、２゜４＝５−ト’）クロロフェノキシ酢酸などを添
加することができる。炭素源としてはグルコースまたは
ンユークロースを用いることができる。浸透圧は、グル
コースやシュークロースで不足する分を、代謝的に不活
性な糖類、例えばマンニトールやソルビトールのような
浸透圧調節剤で調節するのが好ましい。本発明で用いる
基本培地としては、液体懸濁培養細胞培養用培地、すな
わち改変Ｂ５培地以外のいずれの培地を用いてもよく、
例えばＭＳ、ＬＳ、Ｖ−４７，ＶＫＭ、Ｂ５．ＫＭ８Ｐ
、ＷＢ培地を挙げることができる。イリス属植物のプロ
トプラストの場合、培地中に包埋することはプロトプラ
ストの生育を阻害するため、液体培地中で培養するか、
あるいは液体培地中に包埋細胞を浮遊させることが好ま
しい。培養は、例えば温度約２０〜３０℃で暗下または
照明下に静置もしくは回転数４４０−５０ｒｐでゆっく
りと振とうし培養を行うと、約４０〜５０日後に多数の
コロニーを形成することができる。こうして得られたコ
ロニーは、常法によって適切な培地に移植してカルスを
形成させることができる。
次に実施例によって本発明を具体的に説明する。
但し本発明は以下の態様に限定されるものではな例１
組織環の調製 イリス・バリダ（Ｉｒｉｓ ｐａｌｌｉｄａ）の根茎
の葉のつけ根部分を切りとり、水洗後にｌ ｃｍ立方に
細分し、７０％エタノールに数分間浸漬した。水洗後、
５％次亜塩素酸ナトリウム液に２０分間浸漬し、水洗後
頁に１〜２ ｍｍの厚さに細分した。再度１％次亜塩素
酸ナトリウム液に１０分間浸漬した後に、更に２ｍｒｎ
四方に細分し、２ 、４−Ｄ １．ｏｌｔ／ｍｌ及びＫ
ＴＯ，Ｉｇ／ｍｆを含むＬＳ固形培地上に置床した。
組織環の調製 イリス・バリダ（Ｉｒｉｓ ｐａｌｌｉｄａ）の根茎
の葉のつけ根部分を切りとり、水洗後にｌ ｃｍ立方に
細分し、７０％エタノールに数分間浸漬した。水洗後、
５％次亜塩素酸ナトリウム液に２０分間浸漬し、水洗後
頁に１〜２ ｍｍの厚さに細分した。再度１％次亜塩素
酸ナトリウム液に１０分間浸漬した後に、更に２ｍｒｎ
四方に細分し、２ 、４−Ｄ １．ｏｌｔ／ｍｌ及びＫ
ＴＯ，Ｉｇ／ｍｆを含むＬＳ固形培地上に置床した。
２６℃にて暗所で培養したところ約１ケ月後に組織環が
出現した。得られた培養物を同条件で約１ケ月に１回の
間隔で植え継ぐことにより、継代培養を行い大きくゴロ
ゴロとした形態の組織環を得た。
出現した。得られた培養物を同条件で約１ケ月に１回の
間隔で植え継ぐことにより、継代培養を行い大きくゴロ
ゴロとした形態の組織環を得た。
例２ プロトプラストの単離
例１のようにして得た組織環を、ＬＳ培地と組成の全く
異なる改変Ｂ５固形培地に移植すると細かい球状の細胞
塊の出現がみられた。次に、この細かい球状の細胞塊を
新鮮な改変Ｂ５液体培地中で約４カ月にわたり培養し、
液体培養に適した細かい球状の細胞塊を選抜して液体培
養系を確立した。液体培養細胞は、−週間毎に継代培養
を行い、生育の旺盛な時期の液体懸濁培養細胞をプロト
プラスト単離の材料とした。上記のようにして得た液体
懸濁培養細胞に、浸透圧をマンニトールで０．５Ｍに調
製したセルラーゼ及びペクチナーゼ含有の酵素液を加え
、２７℃にて暗所でゆっくりと振とうした。２時間〜３
時間酵素処理を行った後に４０−のナイロンメツシュで
濾過し、未処理細胞塊及び細胞残さを取り除き、更に遠
心分離により酵素液とプロトプラストを単離した。得ら
れたプロトプラストは、以下の組成よりなる洗浄液で３
回洗浄後次の培養に供した。
異なる改変Ｂ５固形培地に移植すると細かい球状の細胞
塊の出現がみられた。次に、この細かい球状の細胞塊を
新鮮な改変Ｂ５液体培地中で約４カ月にわたり培養し、
液体培養に適した細かい球状の細胞塊を選抜して液体培
養系を確立した。液体培養細胞は、−週間毎に継代培養
を行い、生育の旺盛な時期の液体懸濁培養細胞をプロト
プラスト単離の材料とした。上記のようにして得た液体
懸濁培養細胞に、浸透圧をマンニトールで０．５Ｍに調
製したセルラーゼ及びペクチナーゼ含有の酵素液を加え
、２７℃にて暗所でゆっくりと振とうした。２時間〜３
時間酵素処理を行った後に４０−のナイロンメツシュで
濾過し、未処理細胞塊及び細胞残さを取り除き、更に遠
心分離により酵素液とプロトプラストを単離した。得ら
れたプロトプラストは、以下の組成よりなる洗浄液で３
回洗浄後次の培養に供した。
Ｋ）１２ＰＯ４
Ｎ０３
ＣａＣ１＝ ・２Ｈ２０
ＭｇＳＯ。
ｌ
ＣｕＳＯ４・５ｔ（Ｊ
マンニトール
２７、２ｍｇ／ １
１０１．０ｍｇ／β
１４８０ｍｇ／β
２４０、 Ｏｍｇ／ Ｒ
Ｏ１１６ｍｇ／Ｊ７
０、０２５ｍｇ／ （！
９０ｇ／β
例３ プロトプラストの培養
下記第１表に示す組成からなる基本培地を調製し、この
各基本培地に第２表に示すように植物ホルモンおよび炭
素源を加え、次いでマンニトールで浸透圧を調製して植
物培養用培地を調製した。
各基本培地に第２表に示すように植物ホルモンおよび炭
素源を加え、次いでマンニトールで浸透圧を調製して植
物培養用培地を調製した。
こうして調製した各培地は、例２に従って得た洗浄後の
プロトプラストを細胞濃度１０４個／ｍｌ〜１０６個／
−に懸濁し２７℃にて暗所で培養を開始した。
プロトプラストを細胞濃度１０４個／ｍｌ〜１０６個／
−に懸濁し２７℃にて暗所で培養を開始した。
培養方法としては、液体培養法、固形培養法、液体−固
形培養法を行った。固形培養法では、プロトプラストの
生育は阻害されコロニーの出現はみられなかったが、液
体培養法、液体−固形培養法ではプロトプラストが培養
開始後２〜３日後に第一分裂を開始し、１〜２力月後に
は０．２〜Ｑ、５ ｍｍ程度のコロニーにまで成長した
。このときのコロニーの出現頻度は、第３表に示すとお
りであった。
形培養法を行った。固形培養法では、プロトプラストの
生育は阻害されコロニーの出現はみられなかったが、液
体培養法、液体−固形培養法ではプロトプラストが培養
開始後２〜３日後に第一分裂を開始し、１〜２力月後に
は０．２〜Ｑ、５ ｍｍ程度のコロニーにまで成長した
。このときのコロニーの出現頻度は、第３表に示すとお
りであった。
このようにして出現したコロニーを、通常のカルス継代
用培地（２，４−Ｄ ｌｐｐｍおよびカイネチン０．ｌ
ｐｐｍを添加したリンスマイヤーとスクーグ寒天培地）
に移植したところ順調にカルスにまで成長した。
用培地（２，４−Ｄ ｌｐｐｍおよびカイネチン０．ｌ
ｐｐｍを添加したリンスマイヤーとスクーグ寒天培地）
に移植したところ順調にカルスにまで成長した。
Ｎ）１４Ｎｏ３
ＫＮＯ。
ＣａＣ１２・２Ｈ２０
ＭｇＳＯａ・７Ｈ２０
Ｈ２ＰＯ４
Ｋ［”Ｉ！
Ｆｅ５０． ’７１（２Ｏ
ＮａｚＥＤＴＡ
Ｈ８ＢＯ３
ＭｎＳＯ４・）１２０
ｚｎＳ０４・７Ｈ２７
Ｈ２ＯＮａ、 ・２Ｈ２０
ＣｕＳＯ，’ ５Ｈ２０
ＣＯＣＪ ・６Ｈ２Ｄ
Ｋ＋
イノシトール
第１表
９５０
８
７
０
０．２５
０．０２５
０、０２５
０．７５
００
６５０
９００
４０
７０
７０
８
７
６．２
２２．３
８．６
０．２５
０２５
０、０２５
０．８３
００
０Ｇ
９００
００
００
７０
００
８
７
０
０．２５
０、０２５
０、０２５
０．７５
００
第１表
（続き）
ニコチン酸
ピリドキシン−ＨＩＪ
チアミン・ＨＣｌ
パントテン酸カルシウム
葉酸
ｐ−アミノ安息香酸
ビオチン
塩化コリン
アスコルビン酸
ビタミンＡ
ビタミンＤ３
ビタミンＢ１２
グリンン
ピルビン酸ナトリウム
Ｌ−グルタミン
Ｌ−アスパラギン酸
Ｌ−アルギニン
０
０．４
０．０２
０．０１
０．０１
０．０１
０．０２
０
！１考（続き）
リンゴ酸ナトリウム
フマル酸
カゼイン加水分解物
（ＮＨ４） ２ＳＯ−
ＮａＨ，ＰＯａ ’ ＬＤ
（■／１）
第２表
ＮＡＡｌ、５
ＮＡＡｌ、 ５
Ｎ＾＾０．５
ＮＡＡｌ、５
ＮＡＡｌ、５
ＮＡＡ３．０
（ｐｐｍ）
第３表
培地Ｎα コロニー出現頻度
０
２ ０、０８
３ ＜０．０１
４ ０．１６
５ ＜０．０１
６ ＜０．０１
（％）
〔発明の効果〕
本発明によれば、イリス属植物のプロトプラスト培養系
が提供される。これによって、イリス属植物の細胞融合
や遺伝子導入への、また、カルスから植物体再生への端
緒が開かれる。
が提供される。これによって、イリス属植物の細胞融合
や遺伝子導入への、また、カルスから植物体再生への端
緒が開かれる。
手
続
補
正
書（自発）
平成３年
ノ
月
７０日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、イリス（￥Ｉｒｉｓ￥）属植物のプロトプラスト。 ２、植物組織培養用固形培地で誘導したイリス属植物の
組織塊を液体懸濁培養細胞培養用培地に移植し、生育し
た細かい球状の細胞塊をプロトプラスト化することを特
徴とするプロトプラストの単離方法。 ３、請求項１記載のプロトプラストをオーキシン類、炭
素源、浸透圧調節剤を含んでなる液体培地で培養するこ
とを特徴とする前記プロトプラストの培養方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP637090A JPH03247273A (ja) | 1990-01-17 | 1990-01-17 | イリス属植物のプロトプラストならびにその単離および培養方法 |
| EP91400097A EP0438354A1 (en) | 1990-01-17 | 1991-01-17 | Protoplasts of a plant of the genus Iris and methods of isolating and culturing same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP637090A JPH03247273A (ja) | 1990-01-17 | 1990-01-17 | イリス属植物のプロトプラストならびにその単離および培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03247273A true JPH03247273A (ja) | 1991-11-05 |
Family
ID=11636484
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP637090A Pending JPH03247273A (ja) | 1990-01-17 | 1990-01-17 | イリス属植物のプロトプラストならびにその単離および培養方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0438354A1 (ja) |
| JP (1) | JPH03247273A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109362563B (zh) * | 2018-10-31 | 2021-09-14 | 杭州晨航环境工程有限公司 | 路易斯安娜鸢尾红瑞特的快速繁殖方法 |
| CN109370976A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-02-22 | 江苏省农业科学院 | 马蔺叶肉原生质体及其制备方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61265022A (ja) * | 1985-05-21 | 1986-11-22 | 三井東圧化学株式会社 | イネプロトプラストからの植物体の再生方法 |
| DD263077A1 (de) * | 1987-07-27 | 1988-12-21 | Liebknecht K Paeda Hochschule | Verfahren zur protoplastenisolierung von solanum tuberosum |
-
1990
- 1990-01-17 JP JP637090A patent/JPH03247273A/ja active Pending
-
1991
- 1991-01-17 EP EP91400097A patent/EP0438354A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0438354A1 (en) | 1991-07-24 |
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