JP2001069867A - ユリ属植物の個体再生法 - Google Patents
ユリ属植物の個体再生法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ユリ属植物の普遍的な個体再生法。
【解決手段】以下の工程からなるユリ属植物の個体再生
法； ［ｉ］ユリ属植物体組織の脱分化によるカルスの誘導、
［ｉｉ］該カルスの培養物からのプロトプラストの精
製、［ｉｉｉ］該精製により得られるプロトプラストの
ナース培養、［ｉｖ］該ナース培養により得られるプロ
トプラストのコロニーからのカルスの誘導、及び、
［ｖ］該カルスの培養物を再分化させることによる個体
の再生。
法； ［ｉ］ユリ属植物体組織の脱分化によるカルスの誘導、
［ｉｉ］該カルスの培養物からのプロトプラストの精
製、［ｉｉｉ］該精製により得られるプロトプラストの
ナース培養、［ｉｖ］該ナース培養により得られるプロ
トプラストのコロニーからのカルスの誘導、及び、
［ｖ］該カルスの培養物を再分化させることによる個体
の再生。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はユリ属植物体の脱分
化により得られるプロトプラストをナース培養に供した
後再分化させることからなるユリ属植物の個体再生法に
関する。
化により得られるプロトプラストをナース培養に供した
後再分化させることからなるユリ属植物の個体再生法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】ユリは最も重要な園芸植物の一つであ
り、交配等により極めて多様な品種が作出されている。
新しいユリ品種を作出するための有望な技術として、細
胞融合や遺伝子組換え等が挙げられる。植物体細胞にこ
れらの技術を適用して新しい品種を作出するためには、
プロトプラストの培養及び個体再生が必須である。しか
しユリ属植物のプロトプラスト培養及び個体再生に関す
る研究は極めて少ない。
り、交配等により極めて多様な品種が作出されている。
新しいユリ品種を作出するための有望な技術として、細
胞融合や遺伝子組換え等が挙げられる。植物体細胞にこ
れらの技術を適用して新しい品種を作出するためには、
プロトプラストの培養及び個体再生が必須である。しか
しユリ属植物のプロトプラスト培養及び個体再生に関す
る研究は極めて少ない。
【０００３】このような研究としては、例えば、オリエ
ンタル・ハイブリッド系の栽培品種スィートメモリー
（Lilium speciorubel var.Sweet-Memory）及びアジア
ティック・ハイブリッド系栽培品種の紅姿（Lilium ×e
legans var.Benisugata）に関する報告（杉浦広幸ら、
育種学雑誌、42巻、429-437頁(1993)）並びにシンテッ
ポウユリ（Lilium ×formolongi）に関する報告（Godo,
T. et al., Plant CellReports, 15, 401-404(1996)）
等が挙げられるが、これらはいずれも極少数の栽培種に
限定された実験である。原種に関する研究はほとんど知
られていないのが実状である。そこで、ユリ属栽培種及
び／又は原種に普遍的に適用し得るプロトプラスト培養
法及び個体再生法の開発が望まれていた。
ンタル・ハイブリッド系の栽培品種スィートメモリー
（Lilium speciorubel var.Sweet-Memory）及びアジア
ティック・ハイブリッド系栽培品種の紅姿（Lilium ×e
legans var.Benisugata）に関する報告（杉浦広幸ら、
育種学雑誌、42巻、429-437頁(1993)）並びにシンテッ
ポウユリ（Lilium ×formolongi）に関する報告（Godo,
T. et al., Plant CellReports, 15, 401-404(1996)）
等が挙げられるが、これらはいずれも極少数の栽培種に
限定された実験である。原種に関する研究はほとんど知
られていないのが実状である。そこで、ユリ属栽培種及
び／又は原種に普遍的に適用し得るプロトプラスト培養
法及び個体再生法の開発が望まれていた。
【０００４】一方、ユリ属と同じ単子葉植物であるイネ
科植物においては、プロトプラストの培養及び個体再生
法に関する研究が精力的になされている（特開昭６２−
２３２３８２号公報、Kyozuka,J.,et al.,Mol.Gen.Gene
t.,206,408-413(1987)）。これら引用文献記載の方法で
は、プロトプラストをアガロースに包埋しナース培養を
行なうことにより、プロトプラストの培養及び該培養物
からの個体の再生が効率よく達成されている。しかし、
同様のナース培養をユリ属植物のプロトプラスト培養に
適用した例は知られていなかった。
科植物においては、プロトプラストの培養及び個体再生
法に関する研究が精力的になされている（特開昭６２−
２３２３８２号公報、Kyozuka,J.,et al.,Mol.Gen.Gene
t.,206,408-413(1987)）。これら引用文献記載の方法で
は、プロトプラストをアガロースに包埋しナース培養を
行なうことにより、プロトプラストの培養及び該培養物
からの個体の再生が効率よく達成されている。しかし、
同様のナース培養をユリ属植物のプロトプラスト培養に
適用した例は知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】発明者らはユリ属植物
の脱分化法、プロトプラスト培養法及び植物個体再生法
について鋭意検討した結果、アガロースに包埋したプロ
トプラストをナース培養して得られたプロトプラストの
コロニーから個体を再生させることにより、本発明を完
成した。
の脱分化法、プロトプラスト培養法及び植物個体再生法
について鋭意検討した結果、アガロースに包埋したプロ
トプラストをナース培養して得られたプロトプラストの
コロニーから個体を再生させることにより、本発明を完
成した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）以下の
工程からなるユリ属植物の個体再生法； ［ｉ］ユリ属植物体組織の脱分化によるカルスの誘導、
［ｉｉ］該カルスの培養物からのプロトプラストの精
製、［ｉｉｉ］該精製により得られるプロトプラストの
ナース培養、［ｉｖ］該ナース培養により得られるプロ
トプラストのコロニーからのカルスの誘導、及び、
［ｖ］該カルスの培養物を再分化させることによる個体
の再生、（２）ユリ属植物が原種である（１）記載の個
体再生法、（３）ユリ属植物が栽培種である（１）記載
の個体再生法、（４）ナース培養がナース細胞存在下に
おける固形培地包埋プロトプラストの培養である（１）
乃至（３）のいずれか一つに記載の個体再生法、（５）
ナース培養に使用するナース細胞が茎頂培養に由来する
カルスを液体培地で継代培養した細胞であり且つ活発な
分裂能を有する細胞である（４）記載の個体再生法、
（６）ナース培養に使用するナース細胞がユリ属植物由
来細胞である（５）記載の個体再生法、（７）プロトプ
ラストを包埋する固形培地がアガロース含有培地である
（１）乃至（６）のいずれか一つに記載の個体再生法、
（８）プロトプラストが細胞融合により得られる融合プ
ロトプラストである（７）記載の個体再生法、及び、
（９）プロトプラストがユリ属の異系統間の細胞融合に
より得られる融合プロトプラストである（７）又は
（８）記載の個体再生法、に関する
工程からなるユリ属植物の個体再生法； ［ｉ］ユリ属植物体組織の脱分化によるカルスの誘導、
［ｉｉ］該カルスの培養物からのプロトプラストの精
製、［ｉｉｉ］該精製により得られるプロトプラストの
ナース培養、［ｉｖ］該ナース培養により得られるプロ
トプラストのコロニーからのカルスの誘導、及び、
［ｖ］該カルスの培養物を再分化させることによる個体
の再生、（２）ユリ属植物が原種である（１）記載の個
体再生法、（３）ユリ属植物が栽培種である（１）記載
の個体再生法、（４）ナース培養がナース細胞存在下に
おける固形培地包埋プロトプラストの培養である（１）
乃至（３）のいずれか一つに記載の個体再生法、（５）
ナース培養に使用するナース細胞が茎頂培養に由来する
カルスを液体培地で継代培養した細胞であり且つ活発な
分裂能を有する細胞である（４）記載の個体再生法、
（６）ナース培養に使用するナース細胞がユリ属植物由
来細胞である（５）記載の個体再生法、（７）プロトプ
ラストを包埋する固形培地がアガロース含有培地である
（１）乃至（６）のいずれか一つに記載の個体再生法、
（８）プロトプラストが細胞融合により得られる融合プ
ロトプラストである（７）記載の個体再生法、及び、
（９）プロトプラストがユリ属の異系統間の細胞融合に
より得られる融合プロトプラストである（７）又は
（８）記載の個体再生法、に関する
【０００７】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。
る。
【０００８】本発明においては、ユリ属植物の野生種を
原種という。ユリ属植物の原種としては、例えば、ササ
ユリ、サクキカノコ等が挙げられる。本発明において原
種をもとに交雑し、育成されている種を栽培種という。
ユリ属植物の栽培種としては、例えば、オリエンタル・
ハイブリッド系（学名；Lilium speciorybel）、アジア
ティック・ハイブリッド系（Lilium ×elegans）等が挙
げられる。本発明においては、種（species）を系統
（又は系）という。従って、本発明において、ユリ属の
異系統とはユリ属の異種を意味する。ユリ属栽培種の各
系統には交配等によって得られた園芸品種（cultivar）
が存在する。本発明においては、園芸品種を単に品種と
いう。
原種という。ユリ属植物の原種としては、例えば、ササ
ユリ、サクキカノコ等が挙げられる。本発明において原
種をもとに交雑し、育成されている種を栽培種という。
ユリ属植物の栽培種としては、例えば、オリエンタル・
ハイブリッド系（学名；Lilium speciorybel）、アジア
ティック・ハイブリッド系（Lilium ×elegans）等が挙
げられる。本発明においては、種（species）を系統
（又は系）という。従って、本発明において、ユリ属の
異系統とはユリ属の異種を意味する。ユリ属栽培種の各
系統には交配等によって得られた園芸品種（cultivar）
が存在する。本発明においては、園芸品種を単に品種と
いう。
【０００９】本発明において、ユリ属植物体の再生法
は、［ｉ］ユリ属植物体組織の脱分化によるカルスの誘
導、［ｉｉ］該カルス培養物からのプロトプラストの精
製、［ｉｉｉ］該精製により得られるプロトプラストの
ナース培養、［ｉｖ］該ナース培養により得られるプロ
トプラストのコロニーからのカルスの誘導、及び［ｖ］
該カルス培養物からの個体再生の５つの工程に分けられ
る。このうち［ｉｖ］及び［ｖ］は連続して行なわれ
る。
は、［ｉ］ユリ属植物体組織の脱分化によるカルスの誘
導、［ｉｉ］該カルス培養物からのプロトプラストの精
製、［ｉｉｉ］該精製により得られるプロトプラストの
ナース培養、［ｉｖ］該ナース培養により得られるプロ
トプラストのコロニーからのカルスの誘導、及び［ｖ］
該カルス培養物からの個体再生の５つの工程に分けられ
る。このうち［ｉｖ］及び［ｖ］は連続して行なわれ
る。
【００１０】以下、５つの工程について説明する。 ［ｉ］ユリ属植物体組織の脱分化によりカルスを誘導す
る工程 ユリ属植物体から組織を分離して脱分化することにより
カルスを誘導する。ユリ属植物の組織としては、通常カ
ルス誘導に使用される組織であれば特に限定されない
が、例えば、茎頂、りん片、花器等が挙げられ、好適に
は茎頂、りん片である。分離した組織を、脱分化作用を
有するホルモンを１ｍｇ／ｍｌ以上含有する培地上に置
床して暗条件下で培養し、カルスを誘導し増殖させる。
培養温度の範囲は、下限が１８乃至２３℃、上限が２６
乃至２８℃、好適な範囲は２３乃至２６℃である。
る工程 ユリ属植物体から組織を分離して脱分化することにより
カルスを誘導する。ユリ属植物の組織としては、通常カ
ルス誘導に使用される組織であれば特に限定されない
が、例えば、茎頂、りん片、花器等が挙げられ、好適に
は茎頂、りん片である。分離した組織を、脱分化作用を
有するホルモンを１ｍｇ／ｍｌ以上含有する培地上に置
床して暗条件下で培養し、カルスを誘導し増殖させる。
培養温度の範囲は、下限が１８乃至２３℃、上限が２６
乃至２８℃、好適な範囲は２３乃至２６℃である。
【００１１】脱分化作用を有する植物ホルモンは、ユリ
属植物を脱分化させ得るものであれば特に限定されない
が、好適にはオーキシン系化合物である。オーキシン系
化合物としては、通常使用されるものであれば特に限定
されないが、例えば、ピクロラム（Picloram）等が挙げ
られる。
属植物を脱分化させ得るものであれば特に限定されない
が、好適にはオーキシン系化合物である。オーキシン系
化合物としては、通常使用されるものであれば特に限定
されないが、例えば、ピクロラム（Picloram）等が挙げ
られる。
【００１２】カルス増殖に用いる培地としては、通常カ
ルス培養に用いられる培地であれば特に限定されない
が、例えば、ムラシゲ・スクーグ培地（Murashige & Sk
oog Medium：以下、「ＭＳ培地」という。：文献（Mura
shige,T.& Skoog,F.,Physiol.Plant.,15,473-497(196
2)）参照）、リンスマイアー・スクーグ培地（Linsmaie
r& Skoog Medium：以下、「ＬＳ培地」という。：文献
（Linsmaier,E.M.& Skoog,F.,Physiol.Plant.,18,100-1
27(1965)）参照）等が挙げられる。培地の性状は、液体
及び固体のどちらでもよい。液体培地の場合、培養時に
は振盪することが好ましい。振盪速度の範囲は、下限が
９０乃至１００回転／分（revolutions perminute：以
下、「ｒｐｍ」という。）、上限が１１０乃至１２０ｒ
ｐｍであり、好適な範囲は１００乃至１１０ｒｐｍであ
る。固体培地は液体培地に固化剤を添加して作製する。
固化剤としては、通常培地の固化に用いられているもの
であれば特に限定されないが、例えば、アガロース、ジ
ェランガム（Gellam gum）等が挙げられる。 ［ｉｉ］カルス培養物からプロトプラストを精製する工
程 ［ｉ］で増殖させたカルスを細胞壁分解酵素液中に浸
し、室温で２乃至１６時間保温し、カルス中の細胞壁や
結合組織を溶解させる。細胞壁分解酵素としては、通常
植物の細胞壁の分解に使用されるものであれば特に限定
されないが、例えば、セルラーゼ、ペクチナーゼ等が挙
げられる。該分解酵素反応は、無機塩を含む緩衝液中で
行なう。該緩衝液に添加する無機塩としては、該分解酵
素反応に必須なもの又は該分解酵素反応に好ましい効果
をもたらすものであれば特に限定されないが、例えば、
１０ｍＭ塩化カルシウム等が挙げられる。また該分解酵
素反応は等張液中で行なうことが好ましく、例えば、該
緩衝液に０．６Ｍソルビトール等を添加する。該分解酵
素反応終了後、ナイロン製のメッシュで反応物を濾過
し、未消化物等を除去する。
ルス培養に用いられる培地であれば特に限定されない
が、例えば、ムラシゲ・スクーグ培地（Murashige & Sk
oog Medium：以下、「ＭＳ培地」という。：文献（Mura
shige,T.& Skoog,F.,Physiol.Plant.,15,473-497(196
2)）参照）、リンスマイアー・スクーグ培地（Linsmaie
r& Skoog Medium：以下、「ＬＳ培地」という。：文献
（Linsmaier,E.M.& Skoog,F.,Physiol.Plant.,18,100-1
27(1965)）参照）等が挙げられる。培地の性状は、液体
及び固体のどちらでもよい。液体培地の場合、培養時に
は振盪することが好ましい。振盪速度の範囲は、下限が
９０乃至１００回転／分（revolutions perminute：以
下、「ｒｐｍ」という。）、上限が１１０乃至１２０ｒ
ｐｍであり、好適な範囲は１００乃至１１０ｒｐｍであ
る。固体培地は液体培地に固化剤を添加して作製する。
固化剤としては、通常培地の固化に用いられているもの
であれば特に限定されないが、例えば、アガロース、ジ
ェランガム（Gellam gum）等が挙げられる。 ［ｉｉ］カルス培養物からプロトプラストを精製する工
程 ［ｉ］で増殖させたカルスを細胞壁分解酵素液中に浸
し、室温で２乃至１６時間保温し、カルス中の細胞壁や
結合組織を溶解させる。細胞壁分解酵素としては、通常
植物の細胞壁の分解に使用されるものであれば特に限定
されないが、例えば、セルラーゼ、ペクチナーゼ等が挙
げられる。該分解酵素反応は、無機塩を含む緩衝液中で
行なう。該緩衝液に添加する無機塩としては、該分解酵
素反応に必須なもの又は該分解酵素反応に好ましい効果
をもたらすものであれば特に限定されないが、例えば、
１０ｍＭ塩化カルシウム等が挙げられる。また該分解酵
素反応は等張液中で行なうことが好ましく、例えば、該
緩衝液に０．６Ｍソルビトール等を添加する。該分解酵
素反応終了後、ナイロン製のメッシュで反応物を濾過
し、未消化物等を除去する。
【００１３】回収された濾液を密度勾配遠心分離法によ
る分画に供し、プロトプラストを精製する。密度勾配遠
心分離法に用いる試薬としては、通常該方法に用いられ
るものであり且つプロトプラストにストレスを与えない
ものであれば特に限定されないが、例えば、糖類、合成
コロイド等が挙げられる。糖類としては蔗糖、デキスト
ランが好ましく、合成コロイドとしてはパーコール（Pe
rcoll：ファルマシア社製：珪酸のポリビニルピロリド
抱合物）が好ましい。密度勾配遠心分離法により得られ
たプロトプラスト画分は、カルス培養用固形培地等の夾
雑物が少なく、細胞質がち密であり、高い分裂活性を有
する。
る分画に供し、プロトプラストを精製する。密度勾配遠
心分離法に用いる試薬としては、通常該方法に用いられ
るものであり且つプロトプラストにストレスを与えない
ものであれば特に限定されないが、例えば、糖類、合成
コロイド等が挙げられる。糖類としては蔗糖、デキスト
ランが好ましく、合成コロイドとしてはパーコール（Pe
rcoll：ファルマシア社製：珪酸のポリビニルピロリド
抱合物）が好ましい。密度勾配遠心分離法により得られ
たプロトプラスト画分は、カルス培養用固形培地等の夾
雑物が少なく、細胞質がち密であり、高い分裂活性を有
する。
【００１４】プロトプラスト化の判定は、Ｃａｌｃｏｆ
ｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ ＳＴ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙ
ａｎａｍｉｄ社製）を用いた細胞壁の染色により行なっ
た（長田敏行著、植物プロトプラストの細胞工学、12-1
3頁、講談社刊、１９９３年）。 ［ｉｉｉ］精製されたプロトプラストをナース培養に供
する工程 先ず、プロトプラスト画分を固形培地中に包埋する。基
本となる培地としては、通常プロトプラストの培養に使
用される液体培地であれば特に限定されないが、例えば
ＭＳ培地等が挙げられる。［ｉｉ］で得られたプロトプ
ラスト画分を上記液体培地に懸濁し、該液体培地に固化
剤を溶解させたものを等量加えて混合し、シャーレに注
いで室温に放置し固化させる。固化剤としては、通常培
地の固化に用いられるものであれば特に限定されない
が、例えば、アガロース、ジェランガム等が挙げられ、
好適にはアガロースである。
ｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ ＳＴ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙ
ａｎａｍｉｄ社製）を用いた細胞壁の染色により行なっ
た（長田敏行著、植物プロトプラストの細胞工学、12-1
3頁、講談社刊、１９９３年）。 ［ｉｉｉ］精製されたプロトプラストをナース培養に供
する工程 先ず、プロトプラスト画分を固形培地中に包埋する。基
本となる培地としては、通常プロトプラストの培養に使
用される液体培地であれば特に限定されないが、例えば
ＭＳ培地等が挙げられる。［ｉｉ］で得られたプロトプ
ラスト画分を上記液体培地に懸濁し、該液体培地に固化
剤を溶解させたものを等量加えて混合し、シャーレに注
いで室温に放置し固化させる。固化剤としては、通常培
地の固化に用いられるものであれば特に限定されない
が、例えば、アガロース、ジェランガム等が挙げられ、
好適にはアガロースである。
【００１５】次に、固化した培地（以下、「ゲル」とい
う。）に包埋したプロトプラストをナース培養する。本
発明においてナース培養とは、ゲルに包埋したユリ属植
物由来のプロトプラストを、ナース細胞の共存下、液体
培地中で培養することである。本発明においてナース細
胞とは、分裂の活発なユリ属植物由来の培養細胞であ
る。ナース細胞は、ユリ属植物体組織を脱分化すること
によりカルスを誘導し、該カルスを培養することにより
得られる。カルスの誘導及びその培養は、［ｉ］と全く
同様に行なう。該培養細胞は１４日毎に植え継ぐ。該培
養細胞の培養速度は、カルス誘導から４乃至６ヶ月経過
すると安定する。増殖速度の安定した培養細胞を最後の
植え継ぎから１０乃至１２日目に取り出し、ただちにナ
ース培養に用いる。
う。）に包埋したプロトプラストをナース培養する。本
発明においてナース培養とは、ゲルに包埋したユリ属植
物由来のプロトプラストを、ナース細胞の共存下、液体
培地中で培養することである。本発明においてナース細
胞とは、分裂の活発なユリ属植物由来の培養細胞であ
る。ナース細胞は、ユリ属植物体組織を脱分化すること
によりカルスを誘導し、該カルスを培養することにより
得られる。カルスの誘導及びその培養は、［ｉ］と全く
同様に行なう。該培養細胞は１４日毎に植え継ぐ。該培
養細胞の培養速度は、カルス誘導から４乃至６ヶ月経過
すると安定する。増殖速度の安定した培養細胞を最後の
植え継ぎから１０乃至１２日目に取り出し、ただちにナ
ース培養に用いる。
【００１６】プロトプラストを包埋したゲルのナース培
養；プロトプラストを包埋したゲルを数等分して液体培
地に浸す。ゲルを浸した液体培地に増殖の活発なナース
細胞を添加し、振盪しつつ暗条件下で培養する。振盪速
度の範囲は、下限が１０乃至２０ｒｐｍ、上限が３０乃
至５０ｒｐｍであり、好適な範囲は２０乃至３０ｒｐｍ
である。培養温度の範囲は、下限が１８乃至２３℃、上
限が２６乃至２８℃であり、好適な範囲は２３乃至２６
℃である。ナース培養の培地として好適なものはプロト
プラストの包埋に使用した液体培地であり、より好適に
は浸透圧調節剤を添加する。浸透圧調節剤としては、通
常使用されるものであれば特に限定されないが、例えば
終濃度０．５Ｍのグルコース等が挙げられる。ナース培
養開始後１乃至２週間で第１分裂が始まり、約３週間後
には細胞数１０以上のコロニーが形成される。コロニー
の直径が１００μｍ以上になるまで培地を定期的に交換
しつつナース培養を続ける。培地の交換は約１週間毎に
行なうのが好ましい。
養；プロトプラストを包埋したゲルを数等分して液体培
地に浸す。ゲルを浸した液体培地に増殖の活発なナース
細胞を添加し、振盪しつつ暗条件下で培養する。振盪速
度の範囲は、下限が１０乃至２０ｒｐｍ、上限が３０乃
至５０ｒｐｍであり、好適な範囲は２０乃至３０ｒｐｍ
である。培養温度の範囲は、下限が１８乃至２３℃、上
限が２６乃至２８℃であり、好適な範囲は２３乃至２６
℃である。ナース培養の培地として好適なものはプロト
プラストの包埋に使用した液体培地であり、より好適に
は浸透圧調節剤を添加する。浸透圧調節剤としては、通
常使用されるものであれば特に限定されないが、例えば
終濃度０．５Ｍのグルコース等が挙げられる。ナース培
養開始後１乃至２週間で第１分裂が始まり、約３週間後
には細胞数１０以上のコロニーが形成される。コロニー
の直径が１００μｍ以上になるまで培地を定期的に交換
しつつナース培養を続ける。培地の交換は約１週間毎に
行なうのが好ましい。
【００１７】また、ナース培養に供するプロトプラスト
は細胞融合によって得られる融合プロトプラストであっ
てもよい。細胞融合法としては、公知の方法であれば特
に限定されないが、例えば、電気パルス法（Akagi,H.,e
t al.,Mol.Ge. Genet,325,501-506(1989)参照）等が挙
げられる。
は細胞融合によって得られる融合プロトプラストであっ
てもよい。細胞融合法としては、公知の方法であれば特
に限定されないが、例えば、電気パルス法（Akagi,H.,e
t al.,Mol.Ge. Genet,325,501-506(1989)参照）等が挙
げられる。
【００１８】さらに、融合プロトプラストはユリ属の異
系統間の細胞融合によって得られる融合プロトプラスト
であってもよい。細胞融合法と本発明の個体再生法を組
合わせることにより、従来法では交配できなかったユリ
属の異系統品種間の交配を可能にする。ユリ属の異系統
間の細胞融合の組み合わせには、原種と原種、原種と栽
培種、栽培種と栽培種の３つが考えられる。このうち栽
培種と栽培種の組み合わせによる異系統間の細胞融合と
しては、例えば、オリエンタル・ハイブリッド系とアジ
アティック・ハイブリッド系の組み合わせ等が挙げられ
る。［ｉｖ］及び［ｖ］ナース培養により得られるプロ
トプラストのコロニーよりカルスを誘導し、該カルスの
培養物を脱分化することにより個体を再生する工程［ｉ
ｉｉ］で得られたコロニーを増殖培地に置床し、カルス
を形成させる。カルスを再分化培地に移植して培養し、
３乃至６週間後に分化した幼植物体を得る。培養は光照
射下で行ない、好適には１６時間日長で行なう。培養温
度の範囲は、下限が１８乃至２３℃、上限が２６乃至２
８℃、好適な範囲は２３乃至２６℃である。再分化培地
としては、植物ホルモンを含まない通常の培地であれば
特に限定されないが、例えば、ＭＳ培地等が挙げられ
る。
系統間の細胞融合によって得られる融合プロトプラスト
であってもよい。細胞融合法と本発明の個体再生法を組
合わせることにより、従来法では交配できなかったユリ
属の異系統品種間の交配を可能にする。ユリ属の異系統
間の細胞融合の組み合わせには、原種と原種、原種と栽
培種、栽培種と栽培種の３つが考えられる。このうち栽
培種と栽培種の組み合わせによる異系統間の細胞融合と
しては、例えば、オリエンタル・ハイブリッド系とアジ
アティック・ハイブリッド系の組み合わせ等が挙げられ
る。［ｉｖ］及び［ｖ］ナース培養により得られるプロ
トプラストのコロニーよりカルスを誘導し、該カルスの
培養物を脱分化することにより個体を再生する工程［ｉ
ｉｉ］で得られたコロニーを増殖培地に置床し、カルス
を形成させる。カルスを再分化培地に移植して培養し、
３乃至６週間後に分化した幼植物体を得る。培養は光照
射下で行ない、好適には１６時間日長で行なう。培養温
度の範囲は、下限が１８乃至２３℃、上限が２６乃至２
８℃、好適な範囲は２３乃至２６℃である。再分化培地
としては、植物ホルモンを含まない通常の培地であれば
特に限定されないが、例えば、ＭＳ培地等が挙げられ
る。
【００１９】
【実施例】以下、実施例及び参考例により本発明をより
詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。 実施例１．ユリ栽培種のプロトプラスト培養及び植物体
再生
詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。 実施例１．ユリ栽培種のプロトプラスト培養及び植物体
再生
【００２０】ユリ栽培種であるオリエンタル・ハイブリ
ッド（品種；白妙）の無菌植物体よりりん片を採取し、
ピクロラム（Picloram：リーデル・デ・ヘーン社製）１
ｍｇ／Ｌ及びジェランガム（Gellan Gum：関東化学
（株）製）２ｇ／Ｌを含有するＭＳ培地に置床してカル
スを誘導した。
ッド（品種；白妙）の無菌植物体よりりん片を採取し、
ピクロラム（Picloram：リーデル・デ・ヘーン社製）１
ｍｇ／Ｌ及びジェランガム（Gellan Gum：関東化学
（株）製）２ｇ／Ｌを含有するＭＳ培地に置床してカル
スを誘導した。
【００２１】得られたカルスをピクロラム（Picloram：
リーデル・デ・ヘーン社）１ｍｇ／Ｌを含有するＭＳ液
体培地中にて１１０ｒｐｍで振盪しながら２４℃暗条件
下で培養し、２週間毎に植え継ぎした。培養開始後約４
ヶ月、増殖の安定したカルスをプロトプラストの調製材
料とした。
リーデル・デ・ヘーン社）１ｍｇ／Ｌを含有するＭＳ液
体培地中にて１１０ｒｐｍで振盪しながら２４℃暗条件
下で培養し、２週間毎に植え継ぎした。培養開始後約４
ヶ月、増殖の安定したカルスをプロトプラストの調製材
料とした。
【００２２】２％セルラーゼ（セルラーゼＯｎｏｚｕｋ
ａＲＳ：ヤクルト本社製）、０．５％マセロザイムＲ−
１０（ヤクルト本社製）、０．０５％ペクトリアーゼＹ
−２３（盛進製薬（株）製）、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５ｍＭ モルフォリノエタンスルホン酸一水和物
（morpholinoethane sulfonic acid, monohydrate：以
下、「ＭＥＳ」という。）、０．６Ｍソルビトールから
なる溶液（以下、「酵素液」という。）をｐＨ５．８に
調整しポアサイズ０．４５μｍのフィルター（Sterlie
Acrodisc：ゲルマン社製）で濾過滅菌した。植え継ぎ１
２日目のカルスを集めて酵素液に懸濁し、２５℃暗条件
下で３時間酵素処理を行った後、該反応液をポアサイズ
４５μｍのナイロン製の細胞分別用メッシュ（共進理工
（株）製）で濾過し、濾液に２倍容の１０ｍＭ塩化カル
シウム、５ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍソルビトールからな
る溶液を添加して混合し、１００×Ｇ、３分間遠心分離
した。遠沈管の底に沈降したプロトプラスト画分を回収
した。
ａＲＳ：ヤクルト本社製）、０．５％マセロザイムＲ−
１０（ヤクルト本社製）、０．０５％ペクトリアーゼＹ
−２３（盛進製薬（株）製）、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５ｍＭ モルフォリノエタンスルホン酸一水和物
（morpholinoethane sulfonic acid, monohydrate：以
下、「ＭＥＳ」という。）、０．６Ｍソルビトールから
なる溶液（以下、「酵素液」という。）をｐＨ５．８に
調整しポアサイズ０．４５μｍのフィルター（Sterlie
Acrodisc：ゲルマン社製）で濾過滅菌した。植え継ぎ１
２日目のカルスを集めて酵素液に懸濁し、２５℃暗条件
下で３時間酵素処理を行った後、該反応液をポアサイズ
４５μｍのナイロン製の細胞分別用メッシュ（共進理工
（株）製）で濾過し、濾液に２倍容の１０ｍＭ塩化カル
シウム、５ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍソルビトールからな
る溶液を添加して混合し、１００×Ｇ、３分間遠心分離
した。遠沈管の底に沈降したプロトプラスト画分を回収
した。
【００２３】２５％パーコール（Percoll：ファルマシ
ア社製）４ｍｌを遠沈管に注ぎ、プロトプラストを０．
６Ｍソルビトールに懸濁したもの０．５ｍｌを重層し、
１００×Ｇ、３分間遠心分離した。中間層を回収して
０．６Ｍソルビトールで洗浄し、より夾雑物の少なく純
度の高いプロトプラストを得た。
ア社製）４ｍｌを遠沈管に注ぎ、プロトプラストを０．
６Ｍソルビトールに懸濁したもの０．５ｍｌを重層し、
１００×Ｇ、３分間遠心分離した。中間層を回収して
０．６Ｍソルビトールで洗浄し、より夾雑物の少なく純
度の高いプロトプラストを得た。
【００２４】上述の通り精製したプロトプラストを改変
ＭＳ培地（２０６．２５ｍｇ／Ｌ硝酸アンモニウム、１
ｍｇ／Ｌピクロラム（Picloram：リーデル・デ・ヘーン
社）、６０ｇ／Ｌグルコースを含むＭＳ培地）に懸濁し
た。該懸濁液０．５ｍｌを等量の２．５％アガロースを
含有する改変ＭＳ培地と混合し、直径３５ｍｍのプラス
チック・シャーレに注いで固化させた。固化したゲルを
扇状に８等分し、直径６０ｍｍのプラスチック・シャー
レに入れた改変ＭＳ培地５ｍｌに浸し、下記ユリ培養細
胞１００ｍｇを添加し、３０ｒｐｍで振盪しつつ２５℃
暗条件下でナース培養した。培地の交換は２週間毎に行
なった。
ＭＳ培地（２０６．２５ｍｇ／Ｌ硝酸アンモニウム、１
ｍｇ／Ｌピクロラム（Picloram：リーデル・デ・ヘーン
社）、６０ｇ／Ｌグルコースを含むＭＳ培地）に懸濁し
た。該懸濁液０．５ｍｌを等量の２．５％アガロースを
含有する改変ＭＳ培地と混合し、直径３５ｍｍのプラス
チック・シャーレに注いで固化させた。固化したゲルを
扇状に８等分し、直径６０ｍｍのプラスチック・シャー
レに入れた改変ＭＳ培地５ｍｌに浸し、下記ユリ培養細
胞１００ｍｇを添加し、３０ｒｐｍで振盪しつつ２５℃
暗条件下でナース培養した。培地の交換は２週間毎に行
なった。
【００２５】ナース培養に用いたナース細胞は、ユリ栽
培種であるオリエンタル・ハイブリッド（品種；レッド
・ルビー）に由来する。該品種の茎頂部から上述の方法
で誘導したカルスをＭＳ培地にて１１０ｒｐｍで振盪し
つつ２４℃１６時間日長で培養した。１４日毎に植え継
ぎ、５乃至６ヶ月経過して増殖速度が安定した後、最後
の植え継ぎから１０乃至１２日目の培養物を取り出し、
ただちにナース培養に用いた。
培種であるオリエンタル・ハイブリッド（品種；レッド
・ルビー）に由来する。該品種の茎頂部から上述の方法
で誘導したカルスをＭＳ培地にて１１０ｒｐｍで振盪し
つつ２４℃１６時間日長で培養した。１４日毎に植え継
ぎ、５乃至６ヶ月経過して増殖速度が安定した後、最後
の植え継ぎから１０乃至１２日目の培養物を取り出し、
ただちにナース培養に用いた。
【００２６】ナース培養開始後１乃至２週間で第１分裂
が始まり、約１ヶ月後には細胞数１０乃至２０以上のコ
ロニーを形成した。約２ヶ月後には直径１乃至３ｍｍの
カルスに増殖し、これを１ｍｇ／Ｌピクロラム（Piclor
am：リーデル・デ・ヘーン社）と６０ｇ／Ｌグルコース
を含有するＭＳ固形培地に植え継ぎ、２４℃１６時間日
長で培養し、直径約５ｍｍのカルスになるまで増殖させ
た。
が始まり、約１ヶ月後には細胞数１０乃至２０以上のコ
ロニーを形成した。約２ヶ月後には直径１乃至３ｍｍの
カルスに増殖し、これを１ｍｇ／Ｌピクロラム（Piclor
am：リーデル・デ・ヘーン社）と６０ｇ／Ｌグルコース
を含有するＭＳ固形培地に植え継ぎ、２４℃１６時間日
長で培養し、直径約５ｍｍのカルスになるまで増殖させ
た。
【００２７】増殖したカルスを再分化培地（３％蔗糖を
含有し且つ植物ホルモンを含有しないＭＳ培地）に植え
継ぎ、２４℃１６時間日長で１乃至３ヶ月培養し、植物
体を再生した。
含有し且つ植物ホルモンを含有しないＭＳ培地）に植え
継ぎ、２４℃１６時間日長で１乃至３ヶ月培養し、植物
体を再生した。
【００２８】同じくユリ栽培種であるオリエンタル・ハ
イブリッド（品種；カサブランカ、アカプルコ、マルコ
・ポーロ、アベルナ、レッド・ルビー、ダンブランシ
ュ）、シンテッポウユリ（品種；白鳥）についても同様
に実験を行ない、プロトプラストの培養と個体の再生が
達成された。
イブリッド（品種；カサブランカ、アカプルコ、マルコ
・ポーロ、アベルナ、レッド・ルビー、ダンブランシ
ュ）、シンテッポウユリ（品種；白鳥）についても同様
に実験を行ない、プロトプラストの培養と個体の再生が
達成された。
【００２９】結果を表１にまとめた。
【００３０】
【表１】ユリ属主要栽培種のプロトプラスト培養効率及び個体再生効率 系統/品種 フ゜ロトフ゜ラスト分裂率％a カルス再分化率％b オリエンタル・ハイフ゛リット゛ /白妙 4.6 80.0オリエンタル・ハイフ゛リット゛ /カサフ゛ランカ 20.0 85.0オリエンタル・ハイフ゛リット゛ /アカフ゜ルコ 15.5 72.5オリエンタル・ハイフ゛リット゛ /マルコ・ホ゜ーロ 18.5 70.0オリエンタル・ハイフ゛リット゛ /アヘ゛ルナ 20.0 65.0オリエンタル・ハイフ゛リット゛ /レット゛・ルヒ゛ー 18.0 75.0オリエンタル・ハイフ゛リット゛ /タ゛ンフ゛ランシュ 21.0 90.0シンテッホ゜ウユリ/白鳥 13.5 55.5 aフ゜ロトフ゜ラスト分裂率％＝（分裂したフ゜ロトフ゜ラスト数÷培養したフ゜ロトフ゜ラスト数）×１００ bカルス再分化率％＝（再分化したカルス数÷培養したカルス数）×１００ 表１から明らかなように、本発明のユリ属植物のプロト
プラスト培養法及び該プロトプラストからの個体再生法
は、栽培種の品種に幅広く適用することができた。 実施例２．ユリ原種のプロトプラスト培養及び植物体再
生
プラスト培養法及び該プロトプラストからの個体再生法
は、栽培種の品種に幅広く適用することができた。 実施例２．ユリ原種のプロトプラスト培養及び植物体再
生
【００３１】ユリ原種であるササユリよりりん片を採取
し、ピクロラム（Picloram：リーデル・デ・ヘーン社
製）１ｍｇ／Ｌ及びジェランガム（Gellan Gum：関東化
学（株）製）２ｇ／Ｌを含有するＭＳ培地に置床してカ
ルスを誘導した。
し、ピクロラム（Picloram：リーデル・デ・ヘーン社
製）１ｍｇ／Ｌ及びジェランガム（Gellan Gum：関東化
学（株）製）２ｇ／Ｌを含有するＭＳ培地に置床してカ
ルスを誘導した。
【００３２】得られたカルスをピクロラム（Picloram：
リーデル・デ・ヘーン社）１ｍｇ／Ｌを含有するＭＳ液
体培地中にて１１０ｒｐｍで振盪しながら２４℃暗条件
下で培養し、２週間毎に植え継ぎした。培養開始後約４
ヶ月、増殖の安定したカルスをプロトプラストの調製材
料とした。
リーデル・デ・ヘーン社）１ｍｇ／Ｌを含有するＭＳ液
体培地中にて１１０ｒｐｍで振盪しながら２４℃暗条件
下で培養し、２週間毎に植え継ぎした。培養開始後約４
ヶ月、増殖の安定したカルスをプロトプラストの調製材
料とした。
【００３３】２％セルラーゼ（セルラーゼＯｎｏｚｕｋ
ａＲＳ：ヤクルト本社製）、０．５％マセロザイムＲ−
１０（ヤクルト本社製）、０．０５％ペクトリアーゼＹ
−２３（盛進製薬（株）製）、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍソルビトールからなる溶
液（以下、「酵素液」という。）をｐＨ５．８に調整し
ポアサイズ０．４５μｍのフィルター（Sterlie Acrodi
sc：ゲルマン社製）で濾過滅菌した。植え継ぎ１２日目
のカルスを集めて酵素液に懸濁し、２５℃暗条件下で３
時間酵素処理を行った後、該反応液をポアサイズ４５μ
ｍのナイロン製の細胞分別用メッシュ（共進理工（株）
製）で濾過し、濾液に２倍容の１０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍソルビトールからなる溶
液を添加して混合し、１００×Ｇ、３分間遠心分離し
た。遠沈管の底に沈降したプロトプラスト画分を回収し
た。この画分を０．６Ｍソルビトールで２回洗浄した。
ａＲＳ：ヤクルト本社製）、０．５％マセロザイムＲ−
１０（ヤクルト本社製）、０．０５％ペクトリアーゼＹ
−２３（盛進製薬（株）製）、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍソルビトールからなる溶
液（以下、「酵素液」という。）をｐＨ５．８に調整し
ポアサイズ０．４５μｍのフィルター（Sterlie Acrodi
sc：ゲルマン社製）で濾過滅菌した。植え継ぎ１２日目
のカルスを集めて酵素液に懸濁し、２５℃暗条件下で３
時間酵素処理を行った後、該反応液をポアサイズ４５μ
ｍのナイロン製の細胞分別用メッシュ（共進理工（株）
製）で濾過し、濾液に２倍容の１０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍソルビトールからなる溶
液を添加して混合し、１００×Ｇ、３分間遠心分離し
た。遠沈管の底に沈降したプロトプラスト画分を回収し
た。この画分を０．６Ｍソルビトールで２回洗浄した。
【００３４】０．６５Ｍ蔗糖６ｍｌを遠沈管に注ぎ、上
記プロトプラスト画分を０．６Ｍソルビトールに懸濁し
たもの０．５ｍｌを重層し、１００×Ｇ、３分間遠心分
離した。中間層を回収して０．６Ｍソルビトールで洗浄
し、より狭雑物の少なく純度の高いプロトプラストを得
た。
記プロトプラスト画分を０．６Ｍソルビトールに懸濁し
たもの０．５ｍｌを重層し、１００×Ｇ、３分間遠心分
離した。中間層を回収して０．６Ｍソルビトールで洗浄
し、より狭雑物の少なく純度の高いプロトプラストを得
た。
【００３５】上述の通り精製したプロトプラストを改変
ＭＳ培地（２０６．２５ｍｇ／Ｌ硝酸アンモニウム、１
ｍｇ／Ｌピクロラム（Picloram：リーデル・デ・ヘーン
社）、６０ｇ／Ｌグルコースを含むＭＳ培地）に懸濁し
た。該懸濁液０．５ｍｌを等量の２．５％アガロースを
含有する改変ＭＳ培地と混合し、直径３５ｍｍのプラス
チック・シャーレに注いで固化させた。固化したゲルを
扇状に８等分し、直径６０ｍｍのプラスチック・シャー
レに入れた改変ＭＳ培地５ｍｌに浸し、下記ユリ培養細
胞１００ｍｇを添加し、３０ｒｐｍで振盪しつつ２５℃
暗条件下でナース培養した。培地の交換は２週間毎に行
なった。
ＭＳ培地（２０６．２５ｍｇ／Ｌ硝酸アンモニウム、１
ｍｇ／Ｌピクロラム（Picloram：リーデル・デ・ヘーン
社）、６０ｇ／Ｌグルコースを含むＭＳ培地）に懸濁し
た。該懸濁液０．５ｍｌを等量の２．５％アガロースを
含有する改変ＭＳ培地と混合し、直径３５ｍｍのプラス
チック・シャーレに注いで固化させた。固化したゲルを
扇状に８等分し、直径６０ｍｍのプラスチック・シャー
レに入れた改変ＭＳ培地５ｍｌに浸し、下記ユリ培養細
胞１００ｍｇを添加し、３０ｒｐｍで振盪しつつ２５℃
暗条件下でナース培養した。培地の交換は２週間毎に行
なった。
【００３６】ナース培養に用いたナース細胞は、ユリ栽
培種であるオリエンタル・ハイブリッド（品種；レッド
・ルビー）に由来する。該品種の茎頂部から上述の方法
で誘導したカルスをＭＳ培地にて１１０ｒｐｍで振盪し
つつ２４℃１６時間日長で培養した。１４日毎に植え継
ぎ、５乃至６ヶ月経過して増殖速度が安定した後、最後
の植え継ぎから１０乃至１２日目の培養物を取り出し、
ただちにナース培養に用いた。
培種であるオリエンタル・ハイブリッド（品種；レッド
・ルビー）に由来する。該品種の茎頂部から上述の方法
で誘導したカルスをＭＳ培地にて１１０ｒｐｍで振盪し
つつ２４℃１６時間日長で培養した。１４日毎に植え継
ぎ、５乃至６ヶ月経過して増殖速度が安定した後、最後
の植え継ぎから１０乃至１２日目の培養物を取り出し、
ただちにナース培養に用いた。
【００３７】ナース培養開始後１０乃至１４日で第１分
裂が始まり、４乃至６週間後には細胞数１０乃至２０以
上のコロニーを形成した。約２ヶ月後には直径１乃至３
ｍｍのカルスに増殖し、これを１ｍｇ／Ｌピクロラム
（Picloram：リーデル・デ・ヘーン社）と６０ｇ／Ｌグ
ルコースを含有するＭＳ固形培地に植え継ぎ、２４℃１
６時間日長で培養し、直径約５ｍｍのカルスになるまで
増殖させた。
裂が始まり、４乃至６週間後には細胞数１０乃至２０以
上のコロニーを形成した。約２ヶ月後には直径１乃至３
ｍｍのカルスに増殖し、これを１ｍｇ／Ｌピクロラム
（Picloram：リーデル・デ・ヘーン社）と６０ｇ／Ｌグ
ルコースを含有するＭＳ固形培地に植え継ぎ、２４℃１
６時間日長で培養し、直径約５ｍｍのカルスになるまで
増殖させた。
【００３８】増殖したカルスを再分化培地（３％蔗糖を
含有し且つ植物ホルモンを含有しないＭＳ培地）に植え
継ぎ、２４℃１６時間日長で１乃至３ヶ月培養し、植物
体を再生した。
含有し且つ植物ホルモンを含有しないＭＳ培地）に植え
継ぎ、２４℃１６時間日長で１乃至３ヶ月培養し、植物
体を再生した。
【００３９】同じくユリ原種であるサクキカノコについ
ても同様に実験を行ない、プロトプラストの培養と個体
の再生が達成された。
ても同様に実験を行ない、プロトプラストの培養と個体
の再生が達成された。
【００４０】結果を表２にまとめた。
【００４１】
【表２】ユリ属主要原種のプロトプラスト培養効率及び個体再生効率 種 フ゜ロトフ゜ラスト分裂率％a カルス再分化率％b ササユリ 14.0 50.0サクキカノコ 18.0 82.5 aフ゜ロトフ゜ラスト分裂率％＝（分裂したフ゜ロトフ゜ラスト数÷培養したフ゜ロトフ゜ラスト数）×１００ bカルス再分化率％＝（再分化したカルス数÷培養したカルス数）×１００ 表２から明らかなように、本発明のユリ属植物のプロト
プラスト培養法及び該プロトプラストからの個体再生法
は、複数の原種に適用することができた。
プラスト培養法及び該プロトプラストからの個体再生法
は、複数の原種に適用することができた。
【００４２】表１及び２の結果から、本発明の植物個体
再生法は、ユリ属植物に普遍的に適用できることが示唆
された。 実施例３．細胞融合させたプロトプラストの培養とカル
スの分化 ユリ栽培種であるアジアティック・ハイブリッド（品
種；モナ）とオリエンタル・ハイブリッド（品種；カサ
ブランカ）よりそれぞれりん片を採取し、ピクロラム
（Picloram：リーデル・デ・ヘーン社製）１ｍｇ／Ｌ及
びジェランガム（Gellan Gum：関東化学（株）製）２ｇ
／Ｌを含有するＭＳ培地に置床してカルスを誘導した。
再生法は、ユリ属植物に普遍的に適用できることが示唆
された。 実施例３．細胞融合させたプロトプラストの培養とカル
スの分化 ユリ栽培種であるアジアティック・ハイブリッド（品
種；モナ）とオリエンタル・ハイブリッド（品種；カサ
ブランカ）よりそれぞれりん片を採取し、ピクロラム
（Picloram：リーデル・デ・ヘーン社製）１ｍｇ／Ｌ及
びジェランガム（Gellan Gum：関東化学（株）製）２ｇ
／Ｌを含有するＭＳ培地に置床してカルスを誘導した。
【００４３】得られたカルスをピクロラム（Picloram：
リーデル・デ・ヘーン社）１ｍｇ／Ｌを含有するＭＳ液
体培地中にて１１０ｒｐｍで振盪しながら２４℃暗条件
下で培養し、２週間毎に植え継ぎした。増殖の安定した
カルスをプロトプラストの調製材料とした。
リーデル・デ・ヘーン社）１ｍｇ／Ｌを含有するＭＳ液
体培地中にて１１０ｒｐｍで振盪しながら２４℃暗条件
下で培養し、２週間毎に植え継ぎした。増殖の安定した
カルスをプロトプラストの調製材料とした。
【００４４】２％セルラーゼ（セルラーゼＯｎｏｚｕｋ
ａＲＳ：ヤクルト本社製）、０．５％マセロザイムＲ−
１０（ヤクルト本社製）、０．０５％ペクトリアーゼＹ
−２３（盛進製薬（株）製）、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍソルビトールからなる溶
液（以下、「酵素液」という。）をｐＨ５．８に調整し
ポアサイズ０．４５μｍのフィルター（Sterlie Acrodi
sc：ゲルマン社製）で濾過滅菌した。植え継ぎ後１２日
目のカルスを集めて酵素液に懸濁し、２５℃暗条件下で
３時間酵素処理を行った後、該反応液をポアサイズ４５
μｍのナイロン製の細胞分別用メッシュ（共進理工
（株）製）で濾過し、濾液に２倍容の１０ｍＭ塩化カル
シウム、５ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍソルビトールからな
る溶液を添加して混合し、１００×Ｇ、３分間遠心分離
した。遠沈管の底に沈降したプロトプラスト画分を回収
した。この画分を０．６Ｍソルビトールで２回洗浄し
た。
ａＲＳ：ヤクルト本社製）、０．５％マセロザイムＲ−
１０（ヤクルト本社製）、０．０５％ペクトリアーゼＹ
−２３（盛進製薬（株）製）、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍソルビトールからなる溶
液（以下、「酵素液」という。）をｐＨ５．８に調整し
ポアサイズ０．４５μｍのフィルター（Sterlie Acrodi
sc：ゲルマン社製）で濾過滅菌した。植え継ぎ後１２日
目のカルスを集めて酵素液に懸濁し、２５℃暗条件下で
３時間酵素処理を行った後、該反応液をポアサイズ４５
μｍのナイロン製の細胞分別用メッシュ（共進理工
（株）製）で濾過し、濾液に２倍容の１０ｍＭ塩化カル
シウム、５ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍソルビトールからな
る溶液を添加して混合し、１００×Ｇ、３分間遠心分離
した。遠沈管の底に沈降したプロトプラスト画分を回収
した。この画分を０．６Ｍソルビトールで２回洗浄し
た。
【００４５】０．６５Ｍ蔗糖６ｍｌを遠沈管に注ぎ、上
記プロトプラスト画分を０．６Ｍソルビトールに懸濁し
たもの０．５ｍｌを重層し、１００×Ｇ、３分間遠心分
離した。中間層を回収して０．６Ｍソルビトールで洗浄
し、より狭雑物の少なく純度の高いプロトプラストをそ
れぞれの栽培種について得た。カサブランカより調製し
たプロトプラスト画分には終濃度２ｍＭとなるようヨー
ドアセトアミド（Iodoacetamide：以下、「ＩＯＡ」と
いう。）を添加し、分裂能を失わせた。ＩＯＡによる細
胞の不活性化については文献（Nehls,R.,et al.,Mol.Ge
n.Genet.,116,117-118,(1989)）参照。
記プロトプラスト画分を０．６Ｍソルビトールに懸濁し
たもの０．５ｍｌを重層し、１００×Ｇ、３分間遠心分
離した。中間層を回収して０．６Ｍソルビトールで洗浄
し、より狭雑物の少なく純度の高いプロトプラストをそ
れぞれの栽培種について得た。カサブランカより調製し
たプロトプラスト画分には終濃度２ｍＭとなるようヨー
ドアセトアミド（Iodoacetamide：以下、「ＩＯＡ」と
いう。）を添加し、分裂能を失わせた。ＩＯＡによる細
胞の不活性化については文献（Nehls,R.,et al.,Mol.Ge
n.Genet.,116,117-118,(1989)）参照。
【００４６】細胞融合は電気パルス融合法（Akagi,H.,e
t al.,Mol.Gen.Genet.,215,501-506,(1989)）により、
細胞融合装置EFS-100（IWAKI（株）製）を用いた。先
ず、細胞融合用緩衝液（１０ｍＭ塩化カルシウム、５ｍ
Ｍ ＭＥＳ、０．６Ｍソルビトール）に両栽培種由来の
プロトプラストを懸濁させ、高周波（強度４００Ｖp-p
／ｃｍ、印加数１回、印加時間５０秒）の電界を加え
て、プロトプラストを連鎖状に接触させた。次に、顕微
鏡観察下で細胞連鎖の両末端にパルス（電圧１．５乃至
２．５ＫＶ／ｃｍ、幅５０μ秒）を加え、細胞膜どうし
が接触している部分に孔を開け、細胞融合させた。顕微
鏡観察下でプロトプラストの融合を確認した後、該懸濁
液を１００×ｇで５分間遠心分離し、沈澱にプロトプラ
スト画分を回収した。異品種間の融合プロトプラストを
選抜する方法：分裂活性を保持していたカサブランカ由
来のプロトプラストを上述の方法によりＩＯＡ処理し分
裂能を失わせた。一方モナ由来のプロトプラストは分裂
活性を保持していなかった。そこで細胞融合後、分裂活
性を保持していたものを目的とする異品種間の融合プロ
トプラストと見なした。この選抜法については文献（Ak
agi,H.,et al.,Mol.Gen.Genet.,215,501-506,(1989)）
参照。
t al.,Mol.Gen.Genet.,215,501-506,(1989)）により、
細胞融合装置EFS-100（IWAKI（株）製）を用いた。先
ず、細胞融合用緩衝液（１０ｍＭ塩化カルシウム、５ｍ
Ｍ ＭＥＳ、０．６Ｍソルビトール）に両栽培種由来の
プロトプラストを懸濁させ、高周波（強度４００Ｖp-p
／ｃｍ、印加数１回、印加時間５０秒）の電界を加え
て、プロトプラストを連鎖状に接触させた。次に、顕微
鏡観察下で細胞連鎖の両末端にパルス（電圧１．５乃至
２．５ＫＶ／ｃｍ、幅５０μ秒）を加え、細胞膜どうし
が接触している部分に孔を開け、細胞融合させた。顕微
鏡観察下でプロトプラストの融合を確認した後、該懸濁
液を１００×ｇで５分間遠心分離し、沈澱にプロトプラ
スト画分を回収した。異品種間の融合プロトプラストを
選抜する方法：分裂活性を保持していたカサブランカ由
来のプロトプラストを上述の方法によりＩＯＡ処理し分
裂能を失わせた。一方モナ由来のプロトプラストは分裂
活性を保持していなかった。そこで細胞融合後、分裂活
性を保持していたものを目的とする異品種間の融合プロ
トプラストと見なした。この選抜法については文献（Ak
agi,H.,et al.,Mol.Gen.Genet.,215,501-506,(1989)）
参照。
【００４７】２５％パーコール（Percoll：ファルマシ
ア社製）４ｍｌを遠沈管に注ぎ、融合プロトプラスト含
有画分を０．６Ｍソルビトールに懸濁したもの０．５ｍ
ｌを重層し、１００×Ｇで３分間遠心分離した。中間層
を回収して０．６Ｍソルビトールで洗浄し、より夾雑物
の少なく純度の高い融合プロトプラストを得た。
ア社製）４ｍｌを遠沈管に注ぎ、融合プロトプラスト含
有画分を０．６Ｍソルビトールに懸濁したもの０．５ｍ
ｌを重層し、１００×Ｇで３分間遠心分離した。中間層
を回収して０．６Ｍソルビトールで洗浄し、より夾雑物
の少なく純度の高い融合プロトプラストを得た。
【００４８】上述の通り精製した融合プロトプラストを
改変ＭＳ培地（２０６．２５ｍｇ／Ｌ硝酸アンモニウ
ム、１ｍｇ／Ｌピクロラム（Picloram：リーデル・デ・
ヘーン社）、６０ｇ／Ｌグルコースを含むＭＳ培地）に
懸濁した。該懸濁液０．５ｍｌを等量の２．５％アガロ
ースを含有する改変ＭＳ培地と混合し、直径３５ｍｍの
プラスチック・シャーレに注いで固化させた。固化した
ゲルを扇状に８等分し、直径６０ｍｍのプラスチック・
シャーレに入れた改変ＭＳ培地５ｍｌに浸し、下記ユリ
培養細胞１００ｍｇを添加し、３０ｒｐｍで振盪しつつ
２５℃暗条件下でナース培養した。培地の交換は２週間
毎に行なった。
改変ＭＳ培地（２０６．２５ｍｇ／Ｌ硝酸アンモニウ
ム、１ｍｇ／Ｌピクロラム（Picloram：リーデル・デ・
ヘーン社）、６０ｇ／Ｌグルコースを含むＭＳ培地）に
懸濁した。該懸濁液０．５ｍｌを等量の２．５％アガロ
ースを含有する改変ＭＳ培地と混合し、直径３５ｍｍの
プラスチック・シャーレに注いで固化させた。固化した
ゲルを扇状に８等分し、直径６０ｍｍのプラスチック・
シャーレに入れた改変ＭＳ培地５ｍｌに浸し、下記ユリ
培養細胞１００ｍｇを添加し、３０ｒｐｍで振盪しつつ
２５℃暗条件下でナース培養した。培地の交換は２週間
毎に行なった。
【００４９】ナース培養に用いたナース細胞は、ユリ栽
培種であるオリエンタル・ハイブリッド（品種；レッド
・ルビー）に由来する。該品種の茎頂部から上述の方法
で誘導したカルスをＭＳ培地にて１１０ｒｐｍで振盪し
つつ２４℃１６時間日長で培養した。１４日毎に植え継
ぎ、５乃至６ヶ月経過して増殖速度が安定した後、最後
の植え継ぎから１０乃至１２日目の培養物を取り出し、
ただちにナース培養に用いた。
培種であるオリエンタル・ハイブリッド（品種；レッド
・ルビー）に由来する。該品種の茎頂部から上述の方法
で誘導したカルスをＭＳ培地にて１１０ｒｐｍで振盪し
つつ２４℃１６時間日長で培養した。１４日毎に植え継
ぎ、５乃至６ヶ月経過して増殖速度が安定した後、最後
の植え継ぎから１０乃至１２日目の培養物を取り出し、
ただちにナース培養に用いた。
【００５０】直径１乃至３ｍｍまで増殖したカルスを１
ｍｇ／Ｌピクロラム（Picloram：リーデル・デ・ヘーン
社）と６０ｇ／Ｌグルコースを含有するＭＳ固形培地に
植え継ぎ、２４℃１６時間日長で培養し、直径約５ｍｍ
のカルスになるまで増殖させた。
ｍｇ／Ｌピクロラム（Picloram：リーデル・デ・ヘーン
社）と６０ｇ／Ｌグルコースを含有するＭＳ固形培地に
植え継ぎ、２４℃１６時間日長で培養し、直径約５ｍｍ
のカルスになるまで増殖させた。
【００５１】増殖したカルスを再分化培地（３％蔗糖を
含有し且つ植物ホルモンを含有しないＭＳ培地）に植え
継ぎ、２４℃１６時間日長で１乃至３ヶ月培養し、植物
体を再生した。参考例１．本発明のプロトプラスト培養
法と従来の培養法との比較ユリ栽培種であるオリエンタ
ル・ハイブリッド（品種；カサブランカ、白妙）、アジ
アティック・ハイブリッド（品種；モナ）及びユリ原種
であるササユリについて、実施例１記載の方法により、
それぞれりん片よりカルスを誘導し、プロトプラストを
精製及び培養した。
含有し且つ植物ホルモンを含有しないＭＳ培地）に植え
継ぎ、２４℃１６時間日長で１乃至３ヶ月培養し、植物
体を再生した。参考例１．本発明のプロトプラスト培養
法と従来の培養法との比較ユリ栽培種であるオリエンタ
ル・ハイブリッド（品種；カサブランカ、白妙）、アジ
アティック・ハイブリッド（品種；モナ）及びユリ原種
であるササユリについて、実施例１記載の方法により、
それぞれりん片よりカルスを誘導し、プロトプラストを
精製及び培養した。
【００５２】得られたそれぞれのプロトプラストを従
来のジェランガム包埋法（以下、「従来法」という。）
と本発明のアガロース包埋及びナース培養の組合せ法
（以下、「本発明法」という。）の二通りの方法で培養
し、その効率を比較した。は文献（Godo,T.,et al.,P
lant Cell Report,15,401-404(1996)）に、は実施例
１に、それぞれ従った。
来のジェランガム包埋法（以下、「従来法」という。）
と本発明のアガロース包埋及びナース培養の組合せ法
（以下、「本発明法」という。）の二通りの方法で培養
し、その効率を比較した。は文献（Godo,T.,et al.,P
lant Cell Report,15,401-404(1996)）に、は実施例
１に、それぞれ従った。
【００５３】結果を表３にまとめた。
【００５４】
【表３】従来法及び本発明法によるユリ主要品種のプロトプラスト培養効率の比較 プロトプラスト分裂率％a 系統／品種 実験番号 従来法 本発明法 オリエンタル・ハイフ゛リット゛ /カサフ゛ランカ 1 9.8 20.0オリエンタル・ハイフ゛リット゛ /カサフ゛ランカ 2 2.5 16.0オリエンタル・ハイフ゛リット゛ /白妙 1 1.2 4.0オリエンタル・ハイフ゛リット゛ /白妙 2 0.7 4.6アシ゛アンティック・ハイフ゛リット゛ /モナ 1 0.8 2.2アシ゛アンティック・ハイフ゛リット゛ /モナ 2 0.6 4.8 原種/ササユリ 1 1.5 6.8原種/ササユリ 2 2.8 14.0 aフ゜ロトフ゜ラスト分裂率％＝（分裂したフ゜ロトフ゜ラスト数÷培養したフ゜ロトフ゜ラスト数）×１００ 表３から明らかなように、本発明法は従来法に比して、
実験番号によるばらつきは見られるものの、分裂率が２
乃至８倍ほど高く、ジェランガム包埋による従来法に対
するアガロース包埋及びナース培養による本発明法の優
位が示された。
実験番号によるばらつきは見られるものの、分裂率が２
乃至８倍ほど高く、ジェランガム包埋による従来法に対
するアガロース包埋及びナース培養による本発明法の優
位が示された。
【００５５】
【発明の効果】本発明により、ユリ属植物のプロトプラ
ストから効率よく個体を再生することが可能となった。
ストから効率よく個体を再生することが可能となった。
【００５６】また、本発明のユリ属植物の個体再生法
は、原種及び栽培種の双方に幅広く適用でき、ユリ属植
物の普遍的な個体再生法として有用である。
は、原種及び栽培種の双方に幅広く適用でき、ユリ属植
物の普遍的な個体再生法として有用である。
【００５７】さらに、本発明のユリ属植物の個体再生法
は細胞融合法により得られる融合プロトプラストにも適
用できるので、従来の交配方法では得られなかったよう
な異系統間の交配をも可能にする。
は細胞融合法により得られる融合プロトプラストにも適
用できるので、従来の交配方法では得られなかったよう
な異系統間の交配をも可能にする。
Claims (9)
- 【請求項１】以下の工程からなるユリ属植物の個体再生
法； ［ｉ］ユリ属植物体組織の脱分化によるカルスの誘導、
［ｉｉ］該カルスの培養物からのプロトプラストの精
製、［ｉｉｉ］該精製により得られるプロトプラストの
ナース培養、［ｉｖ］該ナース培養により得られるプロ
トプラストのコロニーからのカルスの誘導、及び、
［ｖ］該カルスの培養物を再分化させることによる個体
の再生。 - 【請求項２】ユリ属植物が原種である請求項１記載の個
体再生法。 - 【請求項３】ユリ属植物が栽培種である請求項１記載の
個体再生法。 - 【請求項４】ナース培養がナース細胞存在下における固
形培地包埋プロトプラストの培養である請求項１乃至３
のいずれか一つに記載の個体再生法。 - 【請求項５】ナース培養に使用するナース細胞が茎頂培
養に由来するカルスを液体培地で継代培養した細胞であ
り且つ活発な分裂能を有する細胞である請求項４記載の
個体再生法。 - 【請求項６】ナース培養に使用するナース細胞がユリ属
植物由来細胞である請求項５記載の個体再生法。 - 【請求項７】プロトプラストを包埋する固形培地がアガ
ロース含有培地である請求項１乃至６のいずれか一つに
記載の個体再生法。 - 【請求項８】プロトプラストが細胞融合により得られる
融合プロトプラストである請求項７記載の個体再生法。 - 【請求項９】プロトプラストがユリ属の異系統間の細胞
融合により得られる融合プロトプラストである請求項７
又は８記載の個体再生法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000197431A JP2001069867A (ja) | 1999-07-01 | 2000-06-30 | ユリ属植物の個体再生法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-187806 | 1999-07-01 | ||
| JP18780699 | 1999-07-01 | ||
| JP2000197431A JP2001069867A (ja) | 1999-07-01 | 2000-06-30 | ユリ属植物の個体再生法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001069867A true JP2001069867A (ja) | 2001-03-21 |
Family
ID=26504571
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000197431A Pending JP2001069867A (ja) | 1999-07-01 | 2000-06-30 | ユリ属植物の個体再生法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001069867A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011016760A (ja) * | 2009-07-09 | 2011-01-27 | Noevir Co Ltd | ユリ属植物の球根及び／又はカルス抽出物を有効成分とする皮膚外用剤、経口用剤、保湿剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤 |
| KR101293739B1 (ko) * | 2011-08-01 | 2013-08-07 | 대한민국 | 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법 |
| CN108949665A (zh) * | 2018-07-12 | 2018-12-07 | 北京林业大学 | 百合花瓣原生质体的制备方法 |
-
2000
- 2000-06-30 JP JP2000197431A patent/JP2001069867A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011016760A (ja) * | 2009-07-09 | 2011-01-27 | Noevir Co Ltd | ユリ属植物の球根及び／又はカルス抽出物を有効成分とする皮膚外用剤、経口用剤、保湿剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤 |
| KR101293739B1 (ko) * | 2011-08-01 | 2013-08-07 | 대한민국 | 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법 |
| CN108949665A (zh) * | 2018-07-12 | 2018-12-07 | 北京林业大学 | 百合花瓣原生质体的制备方法 |
| CN108949665B (zh) * | 2018-07-12 | 2022-03-04 | 北京林业大学 | 百合花瓣原生质体的制备方法 |
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