JPWO2020130106A1 - 電気穿孔装置及び外来物質導入細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
以下、本発明の好ましい実施の形態について、図面を参照して説明する。図1〜図8を参照して、本発明の電気穿孔装置1、10について説明する。電気穿孔装置1、10(以下、装置1、10ともいう。)は、標的細胞内に目的の外来物質を電気的作用によって導入するよう構成された装置である。標的細胞は、外来物質を導入する対象となる細胞である。装置1、10では、プログラムに従って矩形状のパルス電流を出力する機能を備えた高価なパルスジェネレーターは不要である。装置1、10は、1回の処理に必要な試料の容量(標的細胞数及び外来物質量)を極めて低用量化できるよう構成されている。
C=4πε0εsr ・・・式(1)
=4πε0εs ((3V/4π))1/3
=4×π×8.854×10−12×78×(((3×3×10−6×10−3)/4π))1/3
≒7.76(pF)
溶液の体積Vが3.0(μL)である場合、コンデンサ51の静電容量は、好ましくは9.31〜38.8(pF)に設定され、更に好ましくは19.4〜27.2(pF)に設定される。
R=E/(C×dV/dt+Id) ・・・式(2)
暗流制御部52は、放電発生部3でアーク放電が発生するための最適な電気抵抗値を検討することを考慮し、可変抵抗器を備えてもよい。
コイルに発生する起電力 = インダクタンス値×(電流変化の大きさ/電流変化に要した時間) ・・・式(3)
溶液中の標的細胞へ遺伝子等の外来物質を導入するために印加されるパルス電流のエネルギーは、装置10のインダクタ53のインダクタンス値を用いて調整できる可能性がある。
図34に示すように、作業者は保持部2に外来物質及び細胞を含有する溶液を保持させる(保持工程、S1)。電源部6にて直流高電圧が電力量制御部5に印加されると、コンデンサ51に蓄電される。コンデンサ51の電圧が所定電圧に達するまで、放電発生部3の一対の電極31、32には電流が流れない。コンデンサ51の電圧が所定電圧に達すると、コンデンサ51は蓄電された電荷を放電発生部3に放出し、放電発生部3にアーク放電を生じさせる。アーク放電にて生じたパルス電流は、導電部4を介して、保持部2に供給される(供給工程、S2)。保持部2に供給されたパルス電流は保持部2の一対の電極21、22間を流れる。放電発生部3により所定回数アーク放電が発生された場合、処理を終了する。作業者は、保持部2に保持された溶液を回収する(回収工程、S3)。
図34に示すように、作業者は保持部2に外来物質及び細胞を含有する溶液を保持させる(保持工程、S1)。電源部6にて直流高電圧が放電発生部3に印加されると、コンデンサ51の両端の電位差が所定値よりも大きい場合に、放電発生部3にアーク放電を生じさせる。アーク放電にて生じたパルス電流は、導電部4を介して、保持部2に供給される(供給工程、S2)。保持部2に供給されたパルス電流は保持部2の一対の電極21、22間を流れる。電力量制御部5のコンデンサ51は保持部2に供給されたパルス電流を蓄電する。コンデンサ51に蓄電された荷電がコンデンサ51の静電容量に達すると、コンデンサ51の両端の電位差が電源部6の供給電圧と等しくなり、放電発生部3でのアーク放電が停止する。よって、保持部2を介して流れることのできる電荷量は、保持部2に対して直列接続されたコンデンサ51が蓄えることのできる電荷量だけとなる。放電発生部3のアーク放電が停止すると、電力量制御部5の暗流制御部52を通してコンデンサ51に蓄積された電荷が放電され、コンデンサ51の両端電圧が低下し放電発生部3の電極31、32間の電位差が上昇する。再び放電発生部3の電極31、32間電位差が所定値より大きくなるとアーク放電が生じる。図7及び図8に示すように、装置10がインダクタ53を備える場合、保持部2及びコンデンサ51に対し、並列接続されたインダクタ53がコンデンサ51に蓄積された電荷を放電する。インダクタ53による放電時も、保持部2を介して流れる電流(保持部2に保持された溶液を通過する電荷量)はコンデンサ51に蓄積された電荷量の分だけであるため、放電時の電力量制御もされる。放電発生部3により所定回数アーク放電が発生された場合、処理を終了する。作業者は、保持部2に保持された溶液を回収する(回収工程、S3)。
図2、図9〜図12に示す装置1を製作し、製作された装置1を用いて、外来物質導入細胞を製造した。図2に示すように、実施例1の装置1は、保持部2、放電発生部3、導電部4、電力量制御部5、及び電源部6を備える。保持部2は一対の電極21、22、及び容器23を備える。放電発生部3は一対の電極31、32を備える。図9に示すように、一対の電極21、22、導電部4、及び一対の電極31、32は、厚みの1.0(mm)のアルミニウム板(A1000系、純アルミニウム系)を加工して製作された。一対の電極21、22は、鉛直方向に延びる矩形状に形成された。一対の電極31、32は、側面形状が向かい合う端部に向かって細い三角形状に形成された。図10に示すように、厚さ5.0(mm)の絶縁性樹脂板(アクリル板)8に、一対の電極21、22、及び一対の電極31、32の形状、配置に合わせて鉛直方向に延びるスリットが形成された。図11に示すように、形成されたスリットに一対の電極21、22、及び一対の電極31、32が配置された。スリットに配置された一対の電極21、22は、鉛直方向に延び、1.6(mm)の間隔D2をあけて配置された。一対の電極31、32は鉛直方向に延び、1.0(mm)の間隔D1をあけて配置された。電力量制御部5は、コンデンサ51と、暗流制御部52とを備える。コンデンサ51の静電容量は22(pF)とし、暗流制御部52は45(MΩ)の電気抵抗とした。電源部6は、3kV以上の直流高電圧電源を用いた。図12に示すように、安全性に考慮し高電圧発生部品であるコンデンサ51、暗流制御部52、電源部6はプラスチックケースへ収納された。電極31の端部11と、電極22の端部12とに、プラスチックケースへ収納した部品が導電性のクリップで電気的に接続された。装置1は、全体として縦、横、高さが各々、10(cm)、10(cm)、10(cm)程度の大きさであり、手のひらに載せることが可能であった。
実施例1の装置1は、絶縁破壊電圧を無限面積の平行平板で設計した装置である。このため、先端が尖った形状を有する一対の電極31、32では絶縁破壊電圧が想定された電圧よりも低くなる可能性が考えられる。そこで実施例2では、図3、図14、及び図15に示すように、放電発生部3の一対の電極31、32の先端形状を半円状に設計した装置1を製作し、製作された装置1を用いて、外来物質導入細胞を製造した。実施例2の装置1は、保持部2、放電発生部3、導電部4、電力量制御部5、及び電源部6を備える。図14、図15に示すように、保持部2は一対の電極21、22、容器23、及び油槽27を備える。放電発生部3は、一対の電極31、32を備える。一対の電極21、22、導電部4、及び一対の電極31、32、厚みの1.0(mm)のアルミニウム板(A1000系、純アルミニウム系)を加工することで、製作された。
実施例3では、図7、図19に示すように、市販の1(mm)のギャップを持つキュベットを放電発生部3として使用した装置10を製作し、製作された装置10を用いて、外来物質導入細胞を製造した。実施例3の装置10は、保持部2、放電発生部3、導電部4、電力量制御部5、及び電源部6を備える。保持部2として、図14及び図15に示す実施例2と同様の保持部2が使用された(図19の写真中央下部)。放電発生部3として、一対の電極間の距離が1(mm)であるネッパジーン株式会社製品EC−001Sが用いられた。キュベット電極は、キュベット電極用チャンバーに収容された(図19の写真左上部)。電力量制御部5は、コンデンサ51及びインダクタ53を備える。インダクタ53は、保持部2及びコンデンサ51と並列に設けられた。実施例1の装置1と同様に、安全性に考慮し高電圧発生部品である電源部6及び電力量制御部5はプラスチックケースへ収納された(図19の写真右上部)。電源部6として、冷陰極管インバータ(CCFL)とコッククロフト・ウォルトン回路(CCW回路)とを組み合わせことで3kV以上の電圧を発生できる直流電源装置が用いられた。
実施例4〜8では、図8、図22、図23に示すように、1(mm)のギャップを持つ市販のキュベットを放電発生部3として使用した装置10を製作し、製作された装置10を用いて、実施例2と同様の手順で(ただし、周期調整部9による放電周期の調整は行わない)、外来物質導入細胞を製造した。実施例4の装置10は、保持部2、放電発生部3、導電部4、電力量制御部5、及び電源部6を備える。図23に示すように、保持部2は、一対の電極21、22、及び載置部24を備える。一対の電極21、22は、厚みの1.0(mm)のアルミニウム板(A1000系、純アルミニウム系)を加工することで、製作された。一対の電極21、22は、所定の間隔D2を開けて絶縁性樹脂板(アクリル板)8に保持された(図22の写真左下部)。載置部24は、絶縁性樹脂板8の上面の内の、一対の電極21、22の間となる部分である。放電発生部3として、一対の電極間の距離が1(mm)であるネッパジーン株式会社製品EC−001Sが用いられた。キュベット電極は、キュベット電極用チャンバーに収容された(図22の写真右下部)。電力量制御部5は、コンデンサ51、インダクタ53、及びダイオード54を備える。インダクタ53は、保持部2及びコンデンサ51と並列に設けられた。ダイオード54は、保持部2に対して並列に、且つ、コンデンサ51からインダクタ53に向かう方向を順方向として設けられた。ダイオード54は、超高速スイッチング及び高周波の整流に適するショットキーバリアダイオード(ローム社製、SCS205KGC)が用いられた。実施例1の装置1と同様に、安全性に考慮し、高電圧発生部品である電源部6及び電力量制御部5はプラスチックケースへ収納した(図22の写真上部)。電源部6として、冷陰極管インバータ(CCFL)とコッククロフト・ウォルトン回路(CCW回路)とを組み合わせることで3kV以上の電圧を発生できる直流電源装置が用いられた。
実施例5では、実施例4と同様の装置10を用いて、外来物質導入細胞を製造した。標的細胞は浮遊型のヒトHL60細胞株とし、外来物質はpCXLE−EGFP遺伝子とし、水系の溶液は培地OPTI−MEMバッファーとし、実施例2と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。4(μL)の細胞懸濁液の液滴Wは、一対の電極21、22の間の載置部24に載置された。コンデンサ60の静電容量が0(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が2000(pF)であり、印加時間が30(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。比較例として、従来の遺伝子導入装置であるNEPA21(ネッパジーン社)を用いて同様の実験を行った。
実施例6では、実施例4と同様の装置10を用いて、iPS細胞を製造した。標的細胞は、血液のリンパT細胞とし、外来物質は山中因子遺伝子(OCT−3/4、SOX2、KLF4、L−MYC)と、山中因子遺伝子が細胞に導入され、未分化になると緑色蛍光タンパク質(EGFP)が発現するマーカーであるEOS−EGFPベクターとし、水系の溶液は培地OPTI−MEMバッファーとした。標的細胞は、4(μL)の細胞懸濁液の液滴W内に約8万個となるように調製し、実施例2と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。4(μL)の細胞懸濁液の液滴Wは、一対の電極21、22の間の載置部24に載置された。条件14では、コンデンサ60の静電容量が4000(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が1000(pF)であり、印加時間が15(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。条件15では、コンデンサ60の静電容量が1500(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が500(pF)であり、印加時間が15(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが10(μH)とした。細胞懸濁液に電圧を印加しない条件をネガティブコントロールとした。
実施例7では、実施例4と同様の装置10を用いて、ゲノム編集と多重遺伝子導入とが可能であるかを確認した。標的細胞は、HEK293細胞とし、外来物質は、ゲノム編集を行うためのCAS9酵素と赤色蛍光タンパク質(RFP)が発現するCas9−RFP Lenti Plasmid (Sigma−Aldrich社製)と、ゲノム編集された場合にGFPが発現する2種類のplasmidDNAであるpX330−Cetn1/1及びpCAG−EGxxFP−Cetn1(Addgene社製、大阪大学井川研究室提供)とし、水系の溶液は培地OPTI−MEMバッファーとし、実施例2と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。4(μL)の細胞懸濁液の液滴Wは、一対の電極21、22の間の載置部24に載置された。条件16では、コンデンサ60の静電容量が0(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が3000(pF)であり、印加時間が60(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。条件17では、コンデンサ60の静電容量が0(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が2000(pF)であり、印加時間が60(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。条件18では、コンデンサ60の静電容量が4000(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が1000(pF)であり、印加時間が60(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。細胞懸濁液に電圧を印加しない条件をネガティブコントロールとした。
実施例8では、実施例4と同様の装置10を用いて、外来物質導入細胞を製造し、哺乳類HEK細胞における遺伝子導入成功率を確認した。標的細胞は哺乳類HEK細胞とし、外来物質はpCMV−EGFP遺伝子とし、水系の溶液は培地OPTI−MEMバッファーとし、実施例2と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。4(μL)の細胞懸濁液の液滴Wは、一対の電極21、22の間の載置部24に載置された。条件19では、コンデンサ60の静電容量が4000(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が1000(pF)であり、印加時間が15(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。条件20では、コンデンサ60の静電容量が4000(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が1000(pF)であり、印加時間が30(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。条件21では、コンデンサ60の静電容量が0(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が3000(pF)であり、印加時間が15(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。条件22では、コンデンサ60の静電容量が0(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が3000(pF)であり、印加時間が30(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。
2:保持部
3、37:放電発生部
4:導電部
5:電力量制御部
6:電源部
8:絶縁性樹脂板
9:周期調整部
21、22、31、32、35、36:電極
23:容器
27:油槽
39:電線
51、60:コンデンサ
52:暗流制御部
54:ダイオード
以下、本発明の好ましい実施の形態について、図面を参照して説明する。図1〜図8を参照して、本発明の電気穿孔装置1、10について説明する。電気穿孔装置1、10(以下、装置1、10ともいう。)は、標的細胞内に目的の外来物質を電気的作用によって導入するよう構成された装置である。標的細胞は、外来物質を導入する対象となる細胞である。装置1、10では、プログラムに従って矩形状のパルス電流を出力する機能を備えた高価なパルスジェネレーターは不要である。装置1、10は、1回の処理に必要な試料の用量(標的細胞数及び外来物質量)を極めて低用量化できるよう構成されている。
C=4πε0εsr ・・・式(1)
=4πε0εs ×(3V/4π) 1/3
=4×π×8.854×10−12×78×((3×3×10−6×10−3)/4π) 1/3
≒7.76(pF)
溶液の体積Vが3.0(μL)である場合、コンデンサ51の静電容量は、好ましくは9.31〜38.8(pF)に設定され、更に好ましくは19.4〜27.2(pF)に設定される。
R=E/(C×dV/dt+Id) ・・・式(2)
暗流制御部52は、放電発生部3でアーク放電が発生するための最適な電気抵抗値を検討することを考慮し、可変抵抗器を備えてもよい。
コイルに発生する起電力 = インダクタンス値×(電流変化の大きさ/電流変化に要した時間) ・・・式(3)
溶液中の標的細胞へ遺伝子等の外来物質を導入するために印加されるパルス電流のエネルギーは、装置10のインダクタ53のインダクタンス値を用いて調整できる可能性がある。
図34に示すように、作業者は保持部2に外来物質及び細胞を含有する溶液を保持させる(保持工程、S1)。電源部6にて直流高電圧が電力量制御部5に印加されると、コンデンサ51に蓄電される。コンデンサ51の電圧が所定電圧に達するまで、放電発生部3の一対の電極31、32には電流が流れない。コンデンサ51の電圧が所定電圧に達すると、コンデンサ51は蓄電された電荷を放電発生部3に放出し、放電発生部3にアーク放電を生じさせる。アーク放電にて生じたパルス電流は、導電部4を介して、保持部2に供給される(供給工程、S2)。保持部2に供給されたパルス電流は保持部2の一対の電極21、22間を流れる。放電発生部3により所定回数アーク放電が発生された場合、処理を終了する。作業者は、保持部2に保持された溶液を回収する(回収工程、S3)。
図34に示すように、作業者は保持部2に外来物質及び細胞を含有する溶液を保持させる(保持工程、S1)。電源部6にて直流高電圧が放電発生部3に印加されると、コンデンサ51の両端の電位差が所定値よりも大きい場合に、放電発生部3にアーク放電を生じさせる。アーク放電にて生じたパルス電流は、導電部4を介して、保持部2に供給される(供給工程、S2)。保持部2に供給されたパルス電流は保持部2の一対の電極21、22間を流れる。電力量制御部5のコンデンサ51は保持部2に供給されたパルス電流を蓄電する。コンデンサ51に蓄電された荷電がコンデンサ51の静電容量に達すると、コンデンサ51の両端の電位差が電源部6の供給電圧と等しくなり、放電発生部3でのアーク放電が停止する。よって、保持部2を介して流れることのできる電荷量は、保持部2に対して直列接続されたコンデンサ51が蓄えることのできる電荷量だけとなる。放電発生部3のアーク放電が停止すると、電力量制御部5の暗流制御部52を通してコンデンサ51に蓄積された電荷が放電され、コンデンサ51の両端電圧が低下し放電発生部3の電極31、32間の電位差が上昇する。再び放電発生部3の電極31、32間電位差が所定値より大きくなるとアーク放電が生じる。図7及び図8に示すように、装置10がインダクタ53を備える場合、保持部2及びコンデンサ51に対し、並列接続されたインダクタ53がコンデンサ51に蓄積された電荷を放電する。インダクタ53による放電時も、保持部2を介して流れる電流(保持部2に保持された溶液を通過する電荷量)はコンデンサ51に蓄積された電荷量の分だけであるため、放電時の電力量制御もされる。放電発生部3により所定回数アーク放電が発生された場合、処理を終了する。作業者は、保持部2に保持された溶液を回収する(回収工程、S3)。
図2、図9〜図12に示す装置1を製作し、製作された装置1を用いて、外来物質導入細胞を製造した。図2に示すように、実施例1の装置1は、保持部2、放電発生部3、導電部4、電力量制御部5、及び電源部6を備える。保持部2は一対の電極21、22、及び容器23を備える。放電発生部3は一対の電極31、32を備える。図9に示すように、一対の電極21、22、導電部4、及び一対の電極31、32は、厚みの1.0(mm)のアルミニウム板(A1000系、純アルミニウム系)を加工して製作された。一対の電極21、22は、鉛直方向に延びる矩形状に形成された。一対の電極31、32は、側面形状が向かい合う端部に向かって細い三角形状に形成された。図10に示すように、厚さ5.0(mm)の絶縁性樹脂板(アクリル板)8に、一対の電極21、22、及び一対の電極31、32の形状、配置に合わせて鉛直方向に延びるスリットが形成された。図11に示すように、形成されたスリットに一対の電極21、22、及び一対の電極31、32が配置された。スリットに配置された一対の電極21、22は、鉛直方向に延び、1.6(mm)の間隔D2をあけて配置された。一対の電極31、32は鉛直方向に延び、1.0(mm)の間隔D1をあけて配置された。電力量制御部5は、コンデンサ51と、暗流制御部52とを備える。コンデンサ51の静電容量は22(pF)とし、暗流制御部52は45(MΩ)の電気抵抗とした。電源部6は、3kV以上の直流高電圧電源を用いた。図12に示すように、安全性に考慮し高電圧発生部品であるコンデンサ51、暗流制御部52、電源部6はプラスチックケースへ収納された。電極31の端部11と、電極22の端部12とに、プラスチックケースへ収納した部品が導電性のクリップで電気的に接続された。装置1は、全体として縦、横、高さが各々、10(cm)、10(cm)、10(cm)程度の大きさであり、手のひらに載せることが可能であった。
実施例1の装置1は、絶縁破壊電圧を無限面積の平行平板で設計した装置である。このため、先端が尖った形状を有する一対の電極31、32では絶縁破壊電圧が想定された電圧よりも低くなる可能性が考えられる。そこで実施例2では、図3、図14、及び図15に示すように、放電発生部3の一対の電極31、32の先端形状を半円状に設計した装置1を製作し、製作された装置1を用いて、外来物質導入細胞を製造した。実施例2の装置1は、保持部2、放電発生部3、導電部4、電力量制御部5、及び電源部6を備える。図14、図15に示すように、保持部2は一対の電極21、22、容器23、及び油槽27を備える。放電発生部3は、一対の電極31、32を備える。一対の電極21、22、導電部4、及び一対の電極31、32、厚みの1.0(mm)のアルミニウム板(A1000系、純アルミニウム系)を加工することで、製作された。
実施例3では、図7、図19に示すように、市販の1(mm)のギャップを持つキュベットを放電発生部3として使用した装置10を製作し、製作された装置10を用いて、外来物質導入細胞を製造した。実施例3の装置10は、保持部2、放電発生部3、導電部4、電力量制御部5、及び電源部6を備える。保持部2として、図14及び図15に示す実施例2と同様の保持部2が使用された(図19の写真中央下部)。放電発生部3として、一対の電極間の距離が1(mm)であるネッパジーン株式会社製品EC−001Sが用いられた。キュベット電極は、キュベット電極用チャンバーに収容された(図19の写真左上部)。電力量制御部5は、コンデンサ51及びインダクタ53を備える。インダクタ53は、保持部2及びコンデンサ51と並列に設けられた。実施例1の装置1と同様に、安全性に考慮し高電圧発生部品である電源部6及び電力量制御部5はプラスチックケースへ収納された(図19の写真右上部)。電源部6として、冷陰極管インバータ(CCFL)とコッククロフト・ウォルトン回路(CCW回路)とを組み合わせことで3kV以上の電圧を発生できる直流電源装置が用いられた。
実施例4〜8では、図8、図22、図23に示すように、1(mm)のギャップを持つ市販のキュベットを放電発生部3として使用した装置10を製作し、製作された装置10を用いて、実施例2と同様の手順で(ただし、周期調整部9による放電周期の調整は行わない)、外来物質導入細胞を製造した。実施例4の装置10は、保持部2、放電発生部3、導電部4、電力量制御部5、及び電源部6を備える。図23に示すように、保持部2は、一対の電極21、22、及び載置部24を備える。一対の電極21、22は、厚みの1.0(mm)のアルミニウム板(A1000系、純アルミニウム系)を加工することで、製作された。一対の電極21、22は、所定の間隔D2を開けて絶縁性樹脂板(アクリル板)8に保持された(図22の写真左下部)。載置部24は、絶縁性樹脂板8の上面の内の、一対の電極21、22の間となる部分である。放電発生部3として、一対の電極間の距離が1(mm)であるネッパジーン株式会社製品EC−001Sが用いられた。キュベット電極は、キュベット電極用チャンバーに収容された(図22の写真右下部)。電力量制御部5は、コンデンサ51、インダクタ53、及びダイオード54を備える。インダクタ53は、保持部2及びコンデンサ51と並列に設けられた。ダイオード54は、保持部2に対して並列に、且つ、コンデンサ51からインダクタ53に向かう方向を順方向として設けられた。ダイオード54は、超高速スイッチング及び高周波の整流に適するショットキーバリアダイオード(ローム社製、SCS205KGC)が用いられた。実施例1の装置1と同様に、安全性に考慮し、高電圧発生部品である電源部6及び電力量制御部5はプラスチックケースへ収納した(図22の写真上部)。電源部6として、冷陰極管インバータ(CCFL)とコッククロフト・ウォルトン回路(CCW回路)とを組み合わせることで3kV以上の電圧を発生できる直流電源装置が用いられた。
実施例5では、実施例4と同様の装置10を用いて、外来物質導入細胞を製造した。標的細胞は浮遊型のヒトHL60細胞株とし、外来物質はpCXLE−EGFP遺伝子とし、水系の溶液は培地OPTI−MEMバッファーとし、実施例2と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。4(μL)の細胞懸濁液の液滴Wは、一対の電極21、22の間の載置部24に載置された。コンデンサ60の静電容量が0(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が2000(pF)であり、印加時間が30(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。比較例として、従来の遺伝子導入装置であるNEPA21(ネッパジーン社)を用いて同様の実験を行った。
実施例6では、実施例4と同様の装置10を用いて、iPS細胞を製造した。標的細胞は、血液のリンパT細胞とし、外来物質は山中因子遺伝子(OCT−3/4、SOX2、KLF4、L−MYC)と、山中因子遺伝子が細胞に導入され、未分化になると緑色蛍光タンパク質(EGFP)が発現するマーカーであるEOS−EGFPベクターとし、水系の溶液は培地OPTI−MEMバッファーとした。標的細胞は、4(μL)の細胞懸濁液の液滴W内に約8万個となるように調製し、実施例2と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。4(μL)の細胞懸濁液の液滴Wは、一対の電極21、22の間の載置部24に載置された。条件14では、コンデンサ60の静電容量が4000(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が1000(pF)であり、印加時間が15(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。条件15では、コンデンサ60の静電容量が1500(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が500(pF)であり、印加時間が15(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが10(μH)とした。細胞懸濁液に電圧を印加しない条件をネガティブコントロールとした。
実施例7では、実施例4と同様の装置10を用いて、ゲノム編集と多重遺伝子導入とが可能であるかを確認した。標的細胞は、HEK293細胞とし、外来物質は、ゲノム編集を行うためのCAS9酵素と赤色蛍光タンパク質(RFP)が発現するCas9−RFP Lenti Plasmid (Sigma−Aldrich社製)と、ゲノム編集された場合にGFPが発現する2種類のplasmidDNAであるpX330−Cetn1/1及びpCAG−EGxxFP−Cetn1(Addgene社製、大阪大学井川研究室提供)とし、水系の溶液は培地OPTI−MEMバッファーとし、実施例2と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。4(μL)の細胞懸濁液の液滴Wは、一対の電極21、22の間の載置部24に載置された。条件16では、コンデンサ60の静電容量が0(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が3000(pF)であり、印加時間が60(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。条件17では、コンデンサ60の静電容量が0(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が2000(pF)であり、印加時間が60(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。条件18では、コンデンサ60の静電容量が4000(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が1000(pF)であり、印加時間が60(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。細胞懸濁液に電圧を印加しない条件をネガティブコントロールとした。
実施例8では、実施例4と同様の装置10を用いて、外来物質導入細胞を製造し、哺乳類HEK細胞における遺伝子導入成功率を確認した。標的細胞は哺乳類HEK細胞とし、外来物質はpCMV−EGFP遺伝子とし、水系の溶液は培地OPTI−MEMバッファーとし、実施例2と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。4(μL)の細胞懸濁液の液滴Wは、一対の電極21、22の間の載置部24に載置された。条件19では、コンデンサ60の静電容量が4000(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が1000(pF)であり、印加時間が15(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。条件20では、コンデンサ60の静電容量が4000(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が1000(pF)であり、印加時間が30(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。条件21では、コンデンサ60の静電容量が0(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が3000(pF)であり、印加時間が15(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。条件22では、コンデンサ60の静電容量が0(pF)であり、コンデンサ51の静電容量が3000(pF)であり、印加時間が30(s)であり、インダクタ53のインダクタンスが5(μH)とした。
2:保持部
3、37:放電発生部
4:導電部
5:電力量制御部
6:電源部
8:絶縁性樹脂板
9:周期調整部
21、22、31、32、35、36:電極
23:容器
27:油槽
39:電線
51、60:コンデンサ
52:暗流制御部
54:ダイオード
Claims (11)
- 外来物質及び細胞を含有する溶液を保持する保持部と、
所定間隔で配置された一対の電極を有し、前記一対の電極間にアーク放電を発生させる放電発生部と、
前記保持部と、前記放電発生部とを電気的に接続し、前記放電発生部にて発生された前記アーク放電によるパルス電流を前記保持部に供給する導電部と、
前記保持部に供給される前記パルス電流の電力量を制御する電力量制御部と
を備えることを特徴とする電気穿孔装置。 - 前記電力量制御部は、電源部と、前記放電発生部とに電気的に接続され、前記電源部によって電圧が印加されることで蓄電し、蓄電された電荷を前記放電発生部に放出するコンデンサと
を備えることを特徴とする請求項1に記載の電気穿孔装置。 - 前記放電発生部は、電源部と電気的に接続され、
前記電力量制御部は、前記保持部と電気的に接続され、前記保持部に供給された前記パルス電流を蓄電するコンデンサを備えることを特徴とする請求項1に記載の電気穿孔装置。 - 3kV以上の直流高電圧を供給可能な前記電源部を更に備えることを特徴とする請求項2又は3に記載の電気穿孔装置。
- 前記放電発生部は前記所定間隔を変更可能であることを特徴とする請求項1から4の何れかに記載の電気穿孔装置。
- 前記放電発生部の前記一対の電極は、先端が球状に形成されることを特徴とする請求項1から5の何れかに記載の電気穿孔装置。
- 前記電力量制御部は、前記放電発生部に生じる暗流を制御する暗流制御部を更に備えることを特徴とする請求項1から6の何れかに記載の電気穿孔装置。
- 所定のインターバルで周期的に前記放電発生部に電圧を印加する周期調整部を更に備えることを特徴とする請求項1から7の何れかに記載の電気穿孔装置。
- 前記電力量制御部は、前記保持部及び前記コンデンサと並列に接続されたインダクタを備えることを特徴とする請求項3に記載の電気穿孔装置。
- 前記電力量制御部は、前記保持部と並列に接続され、前記コンデンサから放電された電流が流れる方向を順方向とするダイオードを備えることを特徴とする請求項9に記載の電気穿孔装置。
- 外来物質及び細胞を含有する溶液を、請求項1から10の何れかの電気穿孔装置の保持部に保持させる保持工程と、
アーク放電にてパルス電流を発生させ、発生された前記パルス電流を前記保持部に供給する供給工程と、
前記供給工程を経た前記溶液を、前記保持部から回収する回収工程とを備えることを特徴とする外来物質導入細胞の製造方法。
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