WO2011148996A1 - 物質導入用液体培地及び細胞内への物質導入方法 - Google Patents

物質導入用液体培地及び細胞内への物質導入方法 Download PDF

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Definitions

  • the target molecule is at least one selected from a polypeptide, a polynucleotide, and an antibody. It has a special feature.
  • the damage to the cell means some damage to the cell by the irradiation of the plasma jet regardless of whether it is fatal or not.
  • the substance-introducing liquid medium according to the present embodiment can effectively prevent cells from being damaged by an obstruction factor such as ultraviolet rays or active oxygen species derived from a plasma jet.
  • the amount of such an obstacle-preventing component added to the medium can be 1 to 10%, more preferably 5 to 10%. Below 1%, the failure prevention effect cannot be expected, and even if it exceeds 10%, the improvement in failure prevention effect cannot be expected. In particular, by setting the disorder preventing component within the range of 5 to 10%, a sufficient disorder preventing effect can be expected, and addition without waste while further increasing the survival rate of cells after substance introduction. It can be carried out.
  • the user can irradiate a predetermined cell with a plasma jet generated from the plasma generating unit by operating the micromanipulator unit while observing the cells in the culture vessel.
  • the dielectric constituting the tube plastics such as polytetrafluoroethylene, polyethylene terephthalate and polyimide, glass, quartz, silicon dioxide, aluminum oxide, zirconium oxide, titanium oxide and other metal oxides or barium titanate And the like, and the like.
  • the cylinder diameter can be easily adjusted by using glass for the dielectric.
  • the plasma irradiation apparatus configured as described above can be effectively used when introducing a target substance into cells.
  • the electrode portion 10 includes a tapered tube body 13 formed of glass, and first and second electrodes disposed on the outer peripheral surface of the tube body 13 at a predetermined interval. It consists of electrodes 14 and 15.
  • the other end side of the tube body 13 is formed with an opening 16 in a tapered tip portion, and helium gas venting the inside of the tube body 13 is configured to be ejected from the opening 16.
  • a tapered tip tube 13 can be formed by heating a part of the glass tube in the circumferential direction and pulling it in a red hot state.
  • the tube body 13 having a desired opening diameter can be created by changing the cutting position of the glass tube having a small diameter.
  • the plasma irradiation apparatus B includes a microscope unit as an observation unit for observing the cells 17 in the culture vessel 26, a plasma generation unit for generating the plasma jet 18, and the plasma generation unit. Are provided so as to be movable in a three-dimensional direction, and a control unit 34 is provided.
  • the arm unit 32 is driven in accordance with a drive signal from the manipulator driving unit 33, and moves the electrode unit 10 supported by the arm unit 32 in a three-dimensional direction with high accuracy.

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Abstract

　細胞への標的物質導入を目的としたプラズマ照射に際し、物質導入後の細胞の生存率を可及的高めることのできる物質導入用液体培地を提供する。本発明に係る物質導入用液体培地によれば、所定の標的物質を細胞内に導入させるための物質導入用液体培地であって、前記標的物質を含む液体培地中の前記細胞にプラズマジェットを照射して、前記標的物質を前記細胞内に導入可能とし、しかも、前記液体培地には、前記プラズマジェットに由来する前記細胞への障害を防止する障害防止成分が含有されていることとした。

Description

物質導入用液体培地及び細胞内への物質導入方法
　本発明は、物質導入用液体培地及び細胞内への物質導入方法に関する。
　従来、細胞内に導入したい物質（以下、標的物質という。）を含有する溶液を細胞に滴下し、この細胞に対して、プラズマ発生装置にて発生させたプラズマを照射することで、細胞内に所望の物質を導入する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
　この方法によれば、細胞内に標的物質を細胞内に存在させることができるとしている。
国際公開ＷＯ２００２／０６４７６７号公報
　しかしながら、上記従来の物質の導入方法では、照射したプラズマによる細胞への障害が発生しやすく、プラズマ照射後（物質導入後）の細胞の生存率は、高いとは言い難いものであった。
　本発明は、斯かる事情に鑑みてなされたものであって、細胞への標的物質導入を目的としたプラズマ照射に際し、物質導入後の細胞の生存率を可及的高めることのできる物質導入用液体培地を提供する。また、本発明では、物質導入後の細胞の生存率を可及的高めることのできる細胞内への物質導入方法についても提供する。
　上記従来の課題を解決するために、請求項１に係る本発明では、所定の標的物質を細胞内に導入させるための物質導入用液体培地であって、前記標的物質を含む液体培地中の前記細胞にプラズマジェットを照射して、前記標的物質を前記細胞内に導入可能とし、しかも、前記液体培地には、前記プラズマジェットに由来する前記細胞への障害を防止する障害防止成分が含有されていることとした。
　また、請求項２に係る本発明では、請求項１に記載の物質導入用液体培地において、前記障害防止成分は、２００～３００ｎｍの波長に吸光を示すタンパク質であることに特徴を有する。
　また、請求項３に係る本発明では、請求項１に記載の物質導入用培地において、前記障害防止成分は、２００～３００ｎｍの波長に吸光を示す複数種類のタンパク質の混合物であることに特徴を有する。
　また、請求項４に係る本発明では、請求項３に記載の物質導入用培地において、前記複数種類のタンパク質の混合物は、ウシ胎児血清であることに特徴を有する。
　また、請求項５に係る本発明では、細胞内への物質導入方法において、所定の標的物質を含む請求項１～４に記載の物質導入用培地を収容した培養容器内の細胞にプラズマジェットを照射して、前記標的物質を前記細胞内に導入させることとした。
　また、請求項６に係る本発明では、請求項５に記載の細胞内への物質導入方法において、前記プラズマジェットは、同プラズマジェットを出射するプラズマ照射装置によって照射されるものであり、前記プラズマ照射装置は、前記培養容器内の細胞を観察する観察部と、前記プラズマジェットを発生させるプラズマ発生部と、同プラズマ発生部を３次元方向に移動可能に支持するマイクロマニピュレータ部と、を備えることに特徴を有する。
　また、請求項７に係る本発明では、請求項６に記載の細胞内への物質導入方法において、前記プラズマ発生部は、筒状の誘電体で構成すると共に、筒状内部に希ガスを主成分とするガス流を通気自在とした管体を形成し、該管体の外周面に一定間隔を保持して二極の電極を配設し、低周波高電圧電源から各電極に低周波高電圧を通電することにより、管体内部に放電を生起させて、管体の一端開口部からプラズマジェットを噴出させるように構成したことに特徴を有する。
　また、請求項８に係る本発明では、請求項５～７に記載の細胞内への物質導入方法において、前記標的分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体から選ばれる少なくともいずれか１つであることに特徴を有する。
　また、請求項９に係る本発明では、請求項８に記載の細胞内への物質導入方法において、前記ポリペプチド又は前記抗体には、細胞膜の透過を助長する膜透過シグナル配列が結合されていることに特徴を有する。
　また、請求項１０に係る本発明では、液体培地中で生育する細胞にプラズマジェットを照射して、前記液体培地中に含有させた所定の標的分子を前記細胞内に導入する際の、前記プラズマジェットに由来する前記細胞への障害防止成分として、ウシ胎児血清を使用することとした。
　請求項１に係る本発明によれば、所定の標的物質を細胞内に導入させるための物質導入用液体培地であって、前記標的物質を含む液体培地中の前記細胞にプラズマジェットを照射して、前記標的物質を前記細胞内に導入可能とし、しかも、前記液体培地には、前記プラズマジェットに由来する前記細胞への障害を防止する障害防止成分が含有されていることとしたため、細胞への標的物質導入を目的としたプラズマ照射に際し、物質導入後の細胞の生存率を可及的高めることのできる物質導入用液体培地を提供することができる。
　また、請求項２に係る本発明によれば、前記障害防止成分は、２００～３００ｎｍの波長に吸光を示すタンパク質であることとしたため、プラズマジェットより放射される紫外線を吸光して、細胞に対する障害を抑制することができる。
　また、請求項３に係る本発明によれば、前記障害防止成分は、２００～３００ｎｍの波長に吸光を示す複数種類のタンパク質の混合物であることとしたため、プラズマジェットより放射される紫外線を吸光して、細胞に対する障害を抑制することができる。
　また、請求項４に係る本発明によれば、前記複数種類のタンパク質の混合物は、ウシ胎児血清であることとしたため、プラズマジェットより放射される紫外線を吸光して、細胞に対する障害を抑制しつつ、細胞の育成を助長することができる。
　また、請求項５に係る本発明によれば、所定の標的物質を含む請求項１～４に記載の物質導入用培地を収容した培養容器内の細胞にプラズマジェットを照射して、前記標的物質を前記細胞内に導入させることとしたため、物質導入後の細胞の生存率を可及的高めることのできる細胞内への物質導入方法を提供することができる。
　また、請求項６に係る本発明によれば、前記プラズマジェットは、同プラズマジェットを出射するプラズマ照射装置によって照射されるものであり、前記プラズマ照射装置は、前記培養容器内の細胞を観察する観察部と、前記プラズマジェットを発生させるプラズマ発生部と、同プラズマ発生部を３次元方向に移動可能に支持するマイクロマニピュレータ部と、を備えることとしたため、所定の細胞を確認しつつ、その細胞にピンポイントで所望の物質を導入することができる。
　また、請求項７に係る本発明によれば、前記プラズマ発生部は、筒状の誘電体で構成すると共に、筒状内部に希ガスを主成分とするガス流を通気自在とした管体を形成し、該管体の外周面に一定間隔を保持して二極の電極を配設し、低周波高電圧電源から各電極に低周波高電圧を通電することにより、管体内部に放電を生起させて、管体の一端開口部からプラズマジェットを噴出させるように構成したため、細径で非熱平衡の大気圧プラズマジェットを細胞に照射することができる。
　また、請求項８に係る本発明によれば、前記標的分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体から選ばれる少なくともいずれか１つであることとしたため、生きた細胞内に、ポリペプチドやポリヌクレオチド、抗体を存在させることができる。
　また、請求項９に係る本発明によれば、前記ポリペプチド又は前記抗体には、細胞膜の透過を助長する膜透過シグナル配列が結合されていることとしたため、ポリペプチドや抗体を高効率で細胞内に導入することができる。
　また、請求項１０に係る本発明によれば、液体培地中で生育する細胞にプラズマジェットを照射して、前記液体培地中に含有させた所定の標的分子を前記細胞内に導入する際の、前記プラズマジェットに由来する前記細胞への障害防止成分としてウシ胎児血清を使用することとしたため、細胞への標的物質導入を目的としたプラズマ照射に際し、物質導入後の細胞の生存率を可及的高めつつ、細胞へ標的物質を導入することができる。
本実施形態に係るタンパク質の細胞への導入方法を示した概念図である。 細胞へ導入するためのタンパク質を発現させる発現ベクターを示した説明図である。 プラズマ発生装置の構成を示した説明図である。 電極部の構成を示した説明図である。 タンパク質の細胞への導入試験の結果を示す説明図である。 プラズマ照射装置の構成を示した説明図である。 変形例に係る電極部の構成を示した説明図である。 変形例に係る電極部の構成を示した説明図である。
　本発明は、所定の標的物質を細胞内に導入させるための物質導入用液体培地を提供するものである。
　特に、本実施形態に係る物質導入用液体培地では、前記標的物質を含む液体培地中の前記細胞にプラズマジェットを照射して、前記標的物質を前記細胞内に導入可能とし、しかも、前記液体培地には、前記プラズマジェットに由来する前記細胞への障害を防止する障害防止成分が含有されている点に特徴を有している。
　ここで標的物質は、特に限定されるものではなく、例えば、ポリペプチド（タンパク質）や、ポリヌクレオチド（核酸）や、抗体、有機化合物、無機化合物を対象とすることができる。
　また、標的物質を含有させるための液体培地は、少なくとも細胞を培養できる組成を有するものであれば特に限定されるものではない。すなわち、最少培地であっても、富栄養培地であっても良い。
　また、本明細書において細胞への障害とは、致死的であるか否かに拘わらず、プラズマジェットの照射による細胞への何らかのダメージを意味するものである。特に本実施形態に係る物質導入用液体培地は、プラズマジェットに由来する紫外線や活性酸素種などの障害因子によって細胞が障害されてしまうのを効果的に防止することができる。
　障害防止成分は、２００～３００ｎｍの波長に吸光を示すタンパク質としても良い。このようなタンパク質は特に限定されるものではなく、水溶液の状態で２００～３００ｎｍに吸光を示すようなタンパク質であれば良い。
　また、障害防止成分は、２００～３００ｎｍの波長に吸光を示す複数種類のタンパク質の混合物であっても良い。このような混合状態のタンパク質についても特に限定されるものではなく、個々のタンパク質のうちいずれか一部が２００～３００ｎｍの波長のうち一部分に吸光を示すタンパク質であっても、その他のタンパク質がその他の波長における吸光を補うものであれば良い。換言すれば、混合タンパク質全体として２００～３００ｎｍの波長に吸光を示せばよい。
　このような混合タンパク質としては、例えば、ウシ胎児血清（FBS:Fetal Bovine Serum）とすることができる。ウシ胎児血清を障害防止成分として用いることにより、細胞因子による細胞への障害を防止することができ、しかも、細胞の生育を助長することができる。
　付言すれば、障害防止成分として添加されたウシ胎児血清により細胞に対して致死的なダメージの量や強度では無くなった障害因子であっても、細胞に対して若干の（非致死的な）ダメージを与える場合がある。しかしながら、ウシ胎児血清を障害防止成分として用いることにより、細胞の生育を助長することができ、障害された細胞の回復を促進して、物質導入後の細胞の生存率をさらに高めることができる。
　また、このような障害防止成分の培地中への添加量は、１～１０％、より好ましくは５～１０％とすることができる。１％を下回ると障害防止効果が期待できなくなり、１０％を上回っても障害防止効果の向上は見込めなくなる。特に、障害防止成分を５～１０％の範囲内とすることにより、十分な障害防止効果を期待することができ、また、物質導入後の細胞の生存率をさらに高めつつ、無駄のない添加を行うことができる。
　また、本発明は、所定の標的物質を含んだ本実施形態に係る物質導入用培地を収容した培養容器内の細胞にプラズマジェットを照射して、標的物質を細胞内に導入させる細胞内への物質導入方法を提供するものでもある。
　ここで、プラズマジェットは、同プラズマジェットを出射するプラズマ照射装置によって照射されるものとしても良い。
　特に、本実施形態に係る細胞内への物質導入方法にて使用するプラズマ照射装置は、培養容器内の細胞を観察する観察部と、プラズマジェットを発生させるプラズマ発生部と、同プラズマ発生部を３次元方向に移動可能に支持するマイクロマニピュレータ部と、を備えている点に特徴を有している。
　この際、使用者は、培養容器内の細胞を観察しながらマイクロマニピュレータ部を操作することにより、プラズマ発生部より発生するプラズマジェットを所定の細胞にピンポイントで照射することができる。
　したがって、所定の細胞に対し標的物質を細胞内へ効率的に導入することが可能となる。
　また、プラズマ照射装置のプラズマ発生部は、筒状の誘電体で構成すると共に、筒状内部に希ガスを通気自在とした管体を形成し、該管体の外周面に電極を配設し、低周波高電圧電源から電極に低周波高電圧を通電することにより、管体内部に放電を生起させて、管体の一端開口部からプラズマジェットを噴出させるように構成している。
　ここで、管体を構成する誘電体としては、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド等のプラスチック、ガラス、石英、二酸化珪素、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、酸化チタン等の金属酸化物あるいはチタン酸バリウム等の複合金属酸化物等を挙げることが出来る。特に、誘電体にガラスを用いることにより、筒径を容易に調整することができる。
　また、希ガスを主成分とするガス流は、希ガスを含有していれば特に限定されものではない。希ガスとしては、たとえばヘリウムやアルゴンを好適に使用することができる。この希ガスを主成分とするガス流は、その組成の全部が希ガスであっても良く、また、主成分を希ガスとして、その中へ他のガス種を少量混入していても良い。混入するガス種としては、例えば、酸素（０．１～１０％）を挙げることができる。希ガス以外のガス種として酸素を混入させた場合には、酸素プラズマに起因する活性酸素等のフリーラジカルを発生させることができ、細菌等によりプラズマ照射中に培地が汚染されることを防止することができる。
　また、電極に印加する低周波高電圧は、たとえば周波数を１Ｈｚ～１００ＭＨｚとすることができ、このときの電圧は１Ｖ～２０ｋＶ程度とすることにより、希ガスを電離させてプラズマジェットを発生させることができる。
　このように電極に低周波高電圧を印加すると、管体の開口からプラズマジェットが噴出する。このとき、開口の形状や径は特に限定されるものではなく、プラズマジェットの照射領域の広さに応じて適宜決定することができるが、ごく狭い領域にプラズマジェットを照射する場合には、管体を開口へ向けて細径となるように形成するとよい。
　たとえば単一の細胞にピンポイントでプラズマジェットを照射したい場合には、開口の径を０．１μｍ～１０μｍ程度に形成することで、極細のプラズマジェットを開口から噴出させることができる。
　また、上述のように構成したプラズマ照射装置は、細胞内に標的物質を導入する際に、効果的に使用することができる。
　導入可能な物質としては、例えば、ポリペプチド（標的物質としてのタンパク質。以下、「標的タンパク質」ともいう。）、ポリヌクレオチド（核酸類）、抗体、生理活性物質、薬剤候補物質などあらゆる物質を対象とすることができる。
　特に、導入する物質、すなわち標的物質を標的タンパク質や抗体とした場合には、細胞膜の透過を助長する膜透過シグナル配列が結合するのが好ましい。
　すなわち、標的タンパク質や抗体の導入に際して、タンパク質透過ドメイン（PTD：protein-transduction domain)を結合させた標的タンパク質や抗体を含む溶液中の細胞に、非熱平衡の大気圧プラズマジェットを照射して、前記標的タンパク質や抗体を細胞内に導入することで、非常に効率よく細胞内に標的タンパク質や抗体を存在させることができる。
　ここで、タンパク質透過ドメインは、標的タンパク質や抗体の細胞膜透過性を向上させる機能を有するものであれば特に限定されるものではなく、たとえば、HIV-TAT(YGRKKRRQRR)やANTP(RQIKIKWPQNRRMKWKK)を用いることができる。なお、括弧内は各タンパク質透過ドメインのアミノ酸配列を示している。また、これらのタンパク質透過ドメインは、細胞内に導入する所定のタンパク質のN末端あるいはC末端側に連結するのが好ましいが、タンパク質の種類によってはN末端あるいはC末端以外の部分に付加することも可能である。細胞内に導入するタンパク質を構成するアミノ酸側鎖（例えば、システインのSH基等）に架橋剤などを用いて化学的に結合させても良い。
　なお、PTDを付加した標的タンパク質や抗体が細胞内に取り込まれやすくなることは既に知られているが、それでも効率的な取り込みとは言い難いものである。
　例えば、プラズマを併用せずにPTDを付加した標的タンパク質を取り込む場合、図１（ａ）に示すように、正に帯電した標的タンパク質のPTDと、負に帯電した細胞膜とが引き合う力で行われるため非常に効率が悪い。
　一方、図１（ｂ）に示すように、プラズマジェットの照射を併用すると、プラズマジェットに含まれる電子が細胞膜に付着することで、細胞膜に瞬間的に穿孔が生じ、PTDと細胞膜とが引き合うことで細胞周辺に集合した標的タンパク質が、細胞膜を容易に通り抜けることとなるため、導入効率が飛躍的に向上する。
　また、細胞に照射するプラズマジェットの密度は特に限定されるものではなく、細胞の生存に障害を与えるほど過剰にならなければ良い。
　以下、本実施形態に係る物質導入用液体培地及び細胞内への物質導入方法について、プラズマ照射装置の構成にも言及しつつ、図面を参照しながら説明する。
〔ベクターの調製〕
　あらかじめ入手した11R（アルギニン11個の繰り返し配列）からなるPTDをコードしたDNA断片（33bp）と、緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein:GFP)遺伝子とを、発現ベクターのマルチクローニングサイトに挿入した（図２参照。）。発現ベクターはpET30（Novagen）を用いた。構築したベクター（pET30-PTD-GFP)は、クローニングし、塩基配列の決定を行うことにより目的の位置にPTDをコードするDNA断片とGFP遺伝子とが挿入されたことが確認された。
〔形質転換および発現〕
　次に、宿主としての大腸菌BL21（DE3）株に、調製した発現ベクターを、カルシウム法により導入して形質転換し、LB（Luria-Bertani）培地にて18時間培養を行った。
　培養した宿主としての大腸菌を13,000×ｇで3分間遠心分離することにより回収し、適宜洗浄操作を行った後に、生理食塩水中で超音波処理して宿主抽出液を得た。この宿主抽出液を粗酵素液として、以下に述べる細胞へのタンパク質導入実験に使用した。
〔細胞への標的タンパク質導入実験〕
　次に得られたPTD連結GFPの細胞内への導入を行った。なお説明の便宜上、まずここでは照射するプラズマジェットを出射するプラズマ発生装置の構造について述べ、その後、標的タンパク質の導入実験の詳細について述べる。
（プラズマ発生装置の構造）
　図３に示すように、本実験にて使用したプラズマ発生装置Ａは、プラズマを発生させる電極部１０と、この電極部にヘリウムガスを供給するヘリウムガス供給部１１と、電極部に低周波高電圧を供給する低周波高電圧電源部１２とで構成している。
　そして、電極部１０にヘリウムガス供給部１１よりヘリウムガスを供給するとともに、低周波高電圧電源部１２より低周波高電圧を印加して、プラズマジェット１８を生成し、培養容器２６内の細胞１７に照射可能としている。
　電極部１０は、図４にも示すように、ガラスにて形成される先細状の管体１３と、同管体１３の外周面に一定間隔を保持して配設した第１及び第２の電極１４,１５とで構成している。
　管体１３は、一端をヘリウムガス供給部１１に接続しており、ヘリウムガス供給部１１より供給されるヘリウムガスが管体１３内部を通気可能に構成している。
　また、管体１３の他端側は、先細状とした先端部に開口１６を形成しており、管体１３内部を通気するヘリウムガスが、同開口１６より噴出するよう構成している。なお、このような先端先細状の管体１３は、ガラス管の一部を周方向に熱し、赤熱した状態で引っ張ることにより形成することができる。この際、細径となったガラス管の切断位置を変えることにより、所望の開口径の管体１３を作成することができる。
　第１電極１４は、管体１３の開口１６近傍に同軸状に設けられた電極であり、低周波高電圧電源部１２に電気的に接続されている。また、第２電極１５も管体１３に同軸状に設けられた電極であるが、第１電極１４に比して開口から遠位に配設されており、グラウンド接続されている。
　すなわち、管体１３内部を通気するヘリウムガスの上流側にグラウンド電極としての第２電極１５を配設するとともに、下流側に低周波高電圧電極としての第１電極１４を配設している。
　そして、管体１３内部にヘリウムガスを通気させるとともに、第１及び第２電極１４，１５間に低周波高電圧を印加することにより、開口１６の先端からプラズマジェット１８が噴出されるよう構成している。
（細胞へのタンパク質導入）
　D-MEM+5％FBS培地中で3日間培養したHeLa細胞に、前述のPTD連結GFP又はPTDを連結していないGFPを導入する試験を行った。ここでは、比較対照のため、本実施形態に係る物質導入用液体培地を用いたサンプル１、比較用のサンプル２及び本実施形態に係る物質導入用液体培地を用いたサンプル３の３つのサンプルを調製し、それぞれに対して試験を試みた。調製したサンプルは以下の通りである。
　試験サンプル１：HeLa細胞が培養された培養容器内の培地を除き、本実施形態に係る物質導入用液体培地１００μｌを添加して調製した。この本実施形態に係る物質導入用液体培地は、標的物質としてPTD連結GFPを１００μｇ／ｍｌ含有し、障害防止成分としてのウシ胎児血清（Fetal bovine serum; FBS）を5％含有するD-MEM（pH８．０）である。
　試験サンプル２：HeLa細胞が培養された培養容器内の培地を除き、PTD連結GFPを１００μｇ／ｍｌ含有し、ウシ胎児血清を含有しないD-MEM（pH８．０）を１００μｌ添加した。
　試験サンプル３：HeLa細胞が培養された培養容器内の培地を除き、PTDを連結していないGFPを１００μｇ／ｍｌ含有し、ウシ胎児血清を5％含有するD-MEM（pH８．０）を１００μｌ添加した。
　ついで、これらの各サンプルに、前述のプラズマ発生装置Ａにて発生させたプラズマジェットを３０秒間照射して、試験後の細胞死の割合を検討した。なお、プラズマジェットの照射に際しては、電極部１０には、ヘリウムガスを３．０ｌ／ｍｉｎで供給するとともに、１０ｋＨｚで１０ｋＶの低周波高電圧を印加してプラズマを発生させた。
　その結果、障害防止成分を含有するサンプル１及びサンプル３におけるプラズマジェット照射後の生細胞数は、照射前の細胞数に比して約２４～２９％の減少が見られた。
　一方、障害防止成分を含有しないサンプル２におけるプラズマジェット照射後の生細胞数は、照射前の細胞数に比して約５６％減と相当数の細胞死が確認された。
　これらの現象は、プラズマジェットの照射により、緩衝液中に何らかの活性酸素種や紫外線が発生し、細胞を障害しているものと思われる。すなわち、障害防止成分（ここでは、FBS）は、これら活性酸素種や紫外線から細胞を守る役割を果たしていると考えられる。
　したがって、細胞を障害防止成分存在下でプラズマジェット照射することにより、細胞が液中に存在する場合であっても、活性酸素種による障害を防止しながら、標的物質の導入を行うことができる。
　次に、プラズマジェットを照射したサンプル１及びサンプル３の細胞の検鏡結果を図５に示す。その結果、サンプル３では、細胞核染色において確認された細胞の位置（写真右上）で、GFPによる蛍光は検出されなかった（写真左上）。一方、サンプル１では、細胞核染色において確認された細胞の位置（写真右下）で、GFPによる蛍光が確認された（写真左下）。
　このことから、細胞への標的物質（ここでは、標的タンパク質）導入を目的としたプラズマ照射に際し、障害防止成分を含有させたことにより、物質導入後の細胞の生存率の向上を図ることが可能であることが示された。また、プラズマジェットの照射により、PTDを付加したタンパク質が効率よく細胞内に取り込まれることが示された。
　次に、タンパク質の導入量をより正確に確認すべく、細胞内に導入されたPTD結合GFP（又はGFP）の発光量をフローサイトメトリーにて測定することで比較した。
　その結果、PTD連結GFPを用いてプラズマジェットの照射を行ったサンプル１の細胞は、プラズマジェットの照射を行わなかったサンプル１の細胞に比して、約１．５倍のPTD連結GFPが導入されたことが示された。また、PTD連結GFPを用いてプラズマジェットの照射を行ったサンプル１の細胞は、GFPを用いてプラズマジェットの照射を行ったサンプル３の細胞に比して、約1.2倍のタンパク質が導入されたことが示された。
　上述してきたように、本実施形態に係る物質導入用液体培地によれば、細胞への標的物質導入を目的としたプラズマ照射に際し、物質導入後の細胞の生存率を可及的高めることができる。また、本実施形態に係る細胞内への物質導入方法によれば、物質導入後の細胞の生存率を可及的高めることができる。また、上述のプラズマ照射装置を採用することにより、細胞内へ目的とするタンパク質を効率よく導入することができる。
〔プラズマ照射装置の変形例〕
　次に、変形例に係るプラズマ照射装置Ｂについて図６を参照しながら説明する。
　図６に示すように、変形例に係るプラズマ照射装置Ｂは、培養容器２６内の細胞１７を観察する観察部としての顕微鏡部と、プラズマジェット１８を発生させるプラズマ発生部と、同プラズマ発生部を３次元方向に移動可能に支持するマイクロマニピュレータ部と、制御部３４とが備えられている。
　顕微鏡部は、検鏡対象に光を照射する照明部２０と、同照明部２０から出射する光量の調整を行う照明制御部２１と、検鏡対象となる細胞１７が収容された培養容器２６を載置するステージ部２２と、同ステージ部２２を上下、左右、前後方向に移動させるステージ駆動部２３と、検鏡対象からの光を入射させる対物光学部２４と、対物光学部２４より出射された光を使用者の目に入射させる接眼光学部２５とを備えている。
　照明部２０は、検鏡対象を照明する光を出射するものであり、例えば、白色光を出射する光源を内蔵している。また、この照明部２０は、必要に応じて、所定の物質を励起させる励起光を出射する光源を内蔵しても良い。
　また、照明部２０は、照明制御部２１に電気的に接続されており、同照明制御部２１の制御により、光源から出射される光量や、光源の種類を変更可能に構成している。
　ステージ部２２は、培養した細胞が定着したシャーレ等の培養容器２６が載置される部位である。ステージ部２２の略中央には、検鏡対象から出射された光を対物光学部２４へ導くための透孔（図示せず）が穿設されており、この透孔を通して細胞やプラズマジェット１８が視認される。
　また、ステージ部２２は、ステージ駆動部２３に電気的に接続されており、図示しないステージ移動機構により上下、左右、前後方向に移動可能に構成している。
　対物光学部２４は、拡大倍率の異なる複数の対物レンズ２７,２７と、同対物レンズ２７,２７の位置合わせを行う円盤状の対物レンズ回転台２８と、所定の対物レンズ２７に入射した光を接眼光学部２５へ導くミラー２９とを備えている。なお、ミラー２９は、波長選択性を有するようにしても良い。例えば、可視光は反射するが、プラズマジェット１８から放射される紫外線を反射せず、接眼光学部２５に光を導かないように構成しても良い。このような構成とすることにより、プラズマジェットから放射される紫外線が使用者の目に障害を与えることを防止することができる。
　また、接眼光学部２５は、対物光学部２４より出射された光をレンズ等により屈折させて所定の射出瞳で出射し、検鏡対象の像を使用者の網膜上に所定の倍率で結像させる。
　このように、顕微鏡部は、培養容器内の細胞を観察可能に構成している。
　プラズマ発生部は、前述の電極部１０と、低周波高電圧供給部３０と、ヘリウムガス供給部３１とで構成している。なお、プラズマ発生部の構成については、図３及び図４を用いて説明した構成と略同様であるため、説明を省略する。
　マイクロマニピュレータ部は、電極部１０を移動自在に支持するアーム部３２と、同アーム部３２を駆動させるマニピュレータ駆動部３３とで構成している。
　アーム部３２は、マニピュレータ駆動部３３からの駆動信号に応じて駆動し、アーム部３２に支持した電極部１０を３次元方向に精度良く移動させる。
　また、前述の照明制御部２１と、低周波高電圧供給部３０と、ヘリウムガス供給部３１と、マニピュレータ駆動部３３と、ステージ駆動部２３とは、制御部３４に電気的に接続されている。
　この制御部３４には、さらに、使用者からの動作指示を受け付ける操作部３５が接続されており、制御部３４に接続された各機器類が、使用者の操作入力に応じて動作するよう構成している。
　このような構成を有するプラズマ照射装置Ｂによれば、所定の細胞を確認しつつ、その細胞にピンポイントで所望の物質を導入することができる。
（電極部の変形例１）
　次に、電極部の変形例について図７を参照しながら説明する。図７に示す電極部４０は、先に説明した電極部１０と略同様の構成を有しているが、管体１３の外側に吸引管４１を配設し二重管状としている点で構造を異にしている。なお、以下の説明において、前述の電極部１０と同様の構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
　具体的には、管体１３の外周面と吸引管４１の内周面との間に吸引管路４２を形成し、この吸引管路４２を吸引装置４３に接続して、開口１６から過剰に拡散するヘリウムガスを吸引可能に構成している。また、各電極１４,１５及び管体１３の外周面には絶縁被覆体４４を設けており、各電極１４,１５と吸引管４１との間の絶縁破壊を防ぐようにしている。なお、この絶縁被覆体４４は、例えば、絶縁性を有する熱収縮チューブ等を好適に用いることができる。
　このような構成とすることにより、余分なヘリウムガスを拡散させることがないため、開口１６から噴出する希ガスが細胞へ余分に当たらないようにすることができる。
（電極部の変形例２）
　次に、電極部の更なる変形例について図８を参照しながら説明する。図８に示す電極部５０は、先に説明した電極部４０と略同様の構成を有しているが、管体１３に配設した電極が第１電極１４のみである点に特徴を有している。
　このような構成とした場合、第１電極１４の上流方向へも、ヘリウムガスの流れに逆らってプラズマジェットが伸長することとなるが、開口１６の先端からもプラズマジェット１８を噴出させることができる。
　上述してきたように、本実施形態に係る物質導入用液体培地によれば、所定の標的物質を細胞内に導入させるための物質導入用液体培地であって、前記標的物質を含む液体培地中の前記細胞にプラズマジェットを照射して、前記標的物質を前記細胞内に導入可能とし、しかも、前記液体培地には、前記プラズマジェットに由来する前記細胞への障害を防止する障害防止成分が含有されていることとしたため、細胞への標的物質導入を目的としたプラズマ照射に際し、物質導入後の細胞の生存率を可及的高めることができる。
　また、本実施形態に係る細胞内への物質導入方法によれば、所定の標的物質を含む請求項１～４に記載の物質導入用培地を収容した培養容器内の細胞にプラズマジェットを照射して、前記標的物質を前記細胞内に導入させることとしたため、物質導入後の細胞の生存率を可及的高めることができる。
　また、プラズマ照射装置Ｂを採用することにより、培養容器２６内の細胞１７にプラズマジェット１８を照射するプラズマ照射装置Ｂであって、培養容器２６内の細胞１７を観察する観察部（顕微鏡部）と、プラズマジェット１８を発生させるプラズマ発生部と、同プラズマ発生部を３次元方向に移動可能に支持するマイクロマニピュレータ部と、を備えたことにより、所定の細胞を確認しつつ、その細胞にピンポイントで所望の物質を導入することができる。
　また、タンパク質透過ドメイン(PTD)を有するタンパク質を含有させた溶液中の細胞１７に、非熱平衡の大気圧プラズマジェット１８を照射して、タンパク質を細胞１７内に導入することにより、タンパク質の細胞内への導入効率を飛躍的に向上させることができる。
　最後に、上述した各実施の形態の説明は本発明の一例であり、本発明は上述の実施の形態に限定されることはない。このため、上述した各実施の形態以外であっても、本発明に係る技術的思想を逸脱しない範囲であれば、設計等に応じて種々の変更が可能であることは勿論である。
　例えば、前述の実施例においてプラズマ照射装置は、観察部の一例として顕微鏡部を備えることとしたが、使用者が細胞を目視確認できる構成を有していればこれに限定されるものではない。
　また、プラズマ照射装置の一例として、顕微鏡部とプラズマ発生部とマイクロマニピュレータ部とを備えたプラズマ照射装置により行う例を示したが、これに限定されるものではない。
　例えば、ヒトの体内に挿入可能なカテーテル形状とし、その先端に前述の電極部を装着することにより、ヒトの体内の細胞に所定の物質を導入するよう構成しても良い。このような構成とすることにより、いままで治療が困難であった生体深部の患部にも直接的な治療を行うことができる。
　１０　電極部
　１１　ヘリウムガス供給部
　１２　低周波高電圧電源部
　１３　管体
　１４　第１電極
　１５　第２電極
　１６　開口
　１７　細胞
　１８　プラズマジェット
　２４　対物光学部
　２５　接眼光学部
　２６　培養容器
　２７　対物レンズ
　３３　マニピュレータ駆動部
　３４　制御部
　Ａ　プラズマ発生装置
　Ｂ　プラズマ照射装置

Claims (10)

  1. 　所定の標的物質を細胞内に導入させるための物質導入用液体培地であって、
    　前記標的物質を含む液体培地中の前記細胞にプラズマジェットを照射して、前記標的物質を前記細胞内に導入可能とし、しかも、前記液体培地には、前記プラズマジェットに由来する前記細胞への障害を防止する障害防止成分が含有されていることを特徴とする物質導入用液体培地。
  2. 　前記障害防止成分は、２００～３００ｎｍの波長に吸光を示すタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の物質導入用液体培地。
  3. 　前記障害防止成分は、２００～３００ｎｍの波長に吸光を示す複数種類のタンパク質の混合物であることを特徴とする請求項１に記載の物質導入用培地。
  4. 　前記複数種類のタンパク質の混合物は、ウシ胎児血清であることを特徴とする請求項３に記載の物質導入用培地。
  5. 　所定の標的物質を含む請求項１～４に記載の物質導入用培地を収容した培養容器内の細胞にプラズマジェットを照射して、前記標的物質を前記細胞内に導入させる細胞内への物質導入方法。
  6. 　前記プラズマジェットは、同プラズマジェットを出射するプラズマ照射装置によって照射されるものであり、
    　前記プラズマ照射装置は、
    　前記培養容器内の細胞を観察する観察部と、
    　前記プラズマジェットを発生させるプラズマ発生部と、
    　同プラズマ発生部を３次元方向に移動可能に支持するマイクロマニピュレータ部と、を備えることを特徴とする請求項５に記載の細胞内への物質導入方法。
  7. 　前記プラズマ発生部は、筒状の誘電体で構成すると共に、筒状内部に希ガスを主成分とするガス流を通気自在とした管体を形成し、該管体の外周面に一定間隔を保持して二極の電極を配設し、低周波高電圧電源から各電極に低周波高電圧を通電することにより、管体内部に放電を生起させて、管体の一端開口部からプラズマジェットを噴出させるように構成したことを特徴とする請求項６に記載の細胞内への物質導入方法。
  8. 　前記標的分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体から選ばれる少なくともいずれか１つであることを特徴とする請求項５～７に記載の細胞内への物質導入方法。
  9. 　前記ポリペプチド又は前記抗体には、細胞膜の透過を助長する膜透過シグナル配列が結合されていることを特徴とする請求項８に記載の細胞内への物質導入方法。
  10. 　液体培地中で生育する細胞にプラズマジェットを照射して、前記液体培地中に含有させた所定の標的分子を前記細胞内に導入する際の、前記プラズマジェットに由来する前記細胞への障害防止成分としてのウシ胎児血清の使用。
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