CN1035304C - 转化植物的方法及装置 - Google Patents

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Abstract

一种转化植物的方法及装置，属于植物遗传工程的基因导入技术，该方法如下：将分离出的目的基因配制成含有20mM/lMgCl2、1.5mM/l硼酸、5%PEG 6000(w/v)和目的基因DNA的注射缓冲液；对受体植物进行套袋隔离，人工授粉一段时间后，将上述注射缓冲液注入子房；在注射创伤处及周围轻涂凡士林软膏；重新隔离受注射的子房，直至种子成熟。用于上述转化的注射装置，包括微针、微针固定旋钮、针筒和推进旋钮，该装置是通过旋转推进取样和注射的。采用本发明的技术和装置后，可提高转化效果和可重复性。

Description

转化植物的方法及装置
本发明涉及植物遗传工程的基因导入技术，尤其是通过注射手段把外源基因导入受体植物的方法和装置。
目前针对植物的基因导入技术有多种，其中包括农杆菌介导法，PEG(polyethylene glycol)介导法，电击法(electroporation)，基因枪法等等。然而，这些技术受到植物种类的强烈限制，如农杆菌介导法主要只对双子叶植物有效；有些技术则受到植物组织培养要求的限制，如PEG介导法和电击法，要求成熟的植物原生质体分离、培养和再生体系；基因枪方法也需要植物愈伤组织的诱导、培养和植物再生技术的配合。目前摆脱了植物组织培养技术限制的转化方法有三类，即花粉介导法、花粉管通道法和注射法。然而由于这些方法的受体是整体植株，存在着许多不可控因素，所以不易重复和验证，各有缺陷，下面依次说明。
花粉介导法是外源基因与植物花粉共混合，或以显微注射，基因枪等手段将外源基因导入花粉后，把受处理的花粉授给相应的雌穗，以期得到含有外源基因的种子(Ohta，1986.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：715-719)。由于花粉离体后一段时间活力即会下降甚至死亡，受过处理后活力也会下降，而且携带的外源基因无论在花粉粒表面还是内部，只能以相当低的比例通过花柱而进入子房和胚囊。故而迄今具备充分说服力的实验证据并不多。
花粉管通道法是指在授粉后的植物花柱柱头上或柱头断面上，涂抹外源DNA溶液，由花粉管通过花柱进入胚囊留下的通道，自发地将外源基因吸收到胚囊中去转化合子，从而得到含有外源基因的种子(龚荼荼等，1988，中国科学(B辑)，6：611-614)。由于外源DNA分子在所说的花粉管通道中的运动机制尚不清楚，在进入胚囊的过程中受到核酸酶的威胁，能够进入合子的外源基因数量和完整性都存在问题，所以具有完备证据的实例也很有限。
注射法是指以注射器将外源基因直接注入植物子房(刘博林等，1989，中国科学(B辑)，89(7)：699-705)或幼穗腔(de laPcna等，1987，Nature，325：274-276)，使外源基因进入配子或合子细胞，发育成熟后得到含有外源基因的种子。由于常用的注射装置为一般的医用注射器、微量上样器或略加改装的装置，注射过程中对植物子房伤害较大，注射量不易控制，操作不便。而且注射后的子房容易败育，注射时机和位置要求一定的技巧，所以也受到很大限制。
本发明的目的在于提供一种通过注射手段转化植物的方法及装置，克服现有技术中的上述缺陷，提高转化效率和可重复性。
本发明的目的可以通过以下措施来实现：
一种转化植物的方法，包括以下步骤：a.分离纯化目的基因DNA；b.将分离出的目的基因配制成含有20mM/l MgCl2、1.5mM/l硼酸、5％PEG 6000(w/v)和目的基因DNA的注射缓冲液；c.对受体植物进行套袋隔离，人工授粉一段时间后，用注射方法将上述注射缓冲液注入子房；d，在注射创伤处及周围轻涂凡士林软膏，以防霉菌侵染；e.重新隔离受注射的子房，直至种子成熟，收获后进行分子验证。注入每个子房的缓冲液量为2μl。
用于上述转化的注射装置，包括微针、微针固定旋纽、针筒和推进旋纽，该装置是通过旋转推进取样和注射的。
本发明的优点在于：1.与其他转化技术相比，本发明的应用范围不受植物种类和基因型的限制，可对任何感兴趣的作物品系实施，有利于目的基因在农业育种和大田生产上的应用；本技术不需要组织培养和植株再生过程，缩短了工作周期。
2.与其他的注射技术相比，本发明中特殊的注射缓冲液配方使目的基因受到保护，免受植物细胞内核酸酶的降解；注射装置使注射针对子房的伤害大大降低，并可以定量控制注射量；有效的保护手段(凡士林软膏涂抹)使注射后的子房不易受霉菌侵染，种子得率大大提高，从百分之几提高到百分之五十左右，转化率也随之提高。
3.简单易行，易于重复和验证。
图1是本发明转化用注射装置的立体图；
图2是图1所示装置的剖视图；
图3是图1所示装置的组装示意图；
图4是转基因植株叶片DNA Southern杂交结果；
图5是转化植株的自交后代叶片DNA经PCR扩增结果；
图6是丁4号植株叶片DNA PCR扩增结果；图7是丁4号植株叶片DNA多酶切Southern杂交结果；
图8是转基因植株叶片DNA Southern杂交结果；
图9是转Bar基因植株叶片DNA Southern杂交结果；
图10是田间喷施除草剂Basta的情况，大部分植株枯死，只有转基因植株存活；
图11是敏感植株与转基因植株(绿色)在喷施了除草剂Basta的对比情况。
下面将结合附图和实施例详细介绍本发明：实施例1：
将Bt基因导入玉米自交系P136
采用本发明中叙述的方法将苏云金杆菌的毒蛋白基因(Bacillus thuringiensis.简称Bt)注入了玉米自交系P136的胚囊，将收获到的种子播种，对长出的小苗进行PCR扩增和分子杂交鉴定，结果表明在检测的种子中有一株为转基因植株，并在其后代植株中也检出了Bt基因序列。说明本方法能够有效地将外源基因导入植物，而且导入的外源基因能够遗传到后代，参见图4和图5。实施例2：
将Bt基因导入玉米单交种农大60
为了进一步验证本发明的效果，再一次以Bt基因作为目的基因进行玉米子房注射，从得到的种子中经PCR扩增和分子杂交鉴定，又鉴定出一株转基因玉米，定名为丁4号。
图7是丁4号植株叶片DNA经PCR扩增的结果，图8是丁4号植株叶片DNA经EcoRI，BglII和AccI三种酶分别酶切后的Southern杂交结果，不仅证实了Bt基因已整合在玉米染体上，而且只有一个拷贝，结果见图6和图7。实施例3：
将Bt基因导入玉米自交系P138
为了扩大转基因植株群体，以Bt基因对玉米自交系P138进行了子房注射。经筛选鉴定出三株转基因植株，同时在丁4号的子代植株中也检出了Bt基因，结果如图8所示。
上图所示的结果表明，经注射进入丁4号的Bt基因传递到了后代；Bt基因同样能够进入玉米自交系P138中。实施例4：
将Bar基因导入玉米自交系P138
由以上三例可见，用注射手段能够将Bt基因分别导入玉米自交系P136和P138及单交种农大60，证实本技术不受植物种系的限制；而且注入植物的目的基因可以传递到后代。为了验证其他基因的效果，还将抗除草剂基因Bar基因导入玉米自交系P138，检出了Bar基因的序列，如图9所示，而且得到的植株对除草剂具有明显的抵抗力，进一步证实采用本发明技术导入植物的外源基因是完整的，可以正常发挥功能，如图10、11所示。
参见图1、2、3，用于转化的注射装置，包括微针(1)、微针固定旋纽(2)、针筒(6)和推进旋纽(7)，通过旋转推进取样和注射，微针(1)是用毛细玻管加热拉制而成，微针固定旋纽(2)中央设有放置微针的孔，针筒(6)两端内壁设有螺纹，用于安装微针固定旋纽(2)和推进旋纽(7)，在安装微针一端的内壁还设有一凸缘，推进旋纽(7)推杆的端头部分有一凹槽，用于安装密封圈(5)，针筒的前端设有弹性垫圈(3)和刚性垫圈(4)。

Claims (10)

1.一种转化植物的方法，包括以下步骤：
a.分离纯化目的基因DNA；
b.将分离出的目的基因配制成含有20mM/l MgCl2、1.5mM/l硼酸、5％PEG 6000(w/v)和目的基因DNA的注射缓冲液；
c.对受体植物进行套袋隔离，人工授粉一段时间后，用注射方法将上述注射缓冲液注入子房；
d.在注射创伤处及周围轻涂凡士林软膏，以防霉菌侵染；
e.重新隔离受注射的子房，直至种子成熟，收获后进行分子验证。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因是苏云金杆菌的毒蛋白基因Bt基因。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因是抗除草剂基因Bar基因。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于受体植物是玉米自交系P136、P138或玉米单交种农大60。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于注入每个子房的注射缓冲液为2μl。
6.一种用于转化的注射装置，包括微针(1)、微针固定旋纽(2)、针筒(6)和推进旋纽(7)，该装置是通过旋转推进取样和注射的。
7.如权利要求6所述的装置，其特征在于所述微针(1)是用毛细玻璃管加热拉制而成，微针固定旋钮(2 )中央设有放置微针的孔。
8.如权利要求6所述的装置，其特征在于针筒(6)两端内壁设有螺纹，用于安装微针固定旋钮(2)和推进旋钮(7)，在安装微针一端的内壁还设有一凸缘。
9.如权利要求6所述的装置，其特征在于推进旋钮(7)推杆的端头部分有一凹槽，用于安装密封圈(5)。
10.如权利要求6所述的装置，其特征在于针筒的前端设有弹簧垫圈(3)和刚性垫圈(4)。
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