CN1193253A - 一种利用农杆菌转化兰科植物的技术 - Google Patents

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Abstract

一种转化兰科植物的方法,该方法包括用具有待导入植物的基因的农杆菌感染所述兰科植物的组织。因此使得首次用农杆菌转化兰科植物成为可能。

Description

一种利用农杆菌转化兰科植物的技术
本发明涉及一种产生转基因兰科植物的方法，具体地说，涉及利用含目的基因的农杆菌转化兰科植物的方法。
当今，在植物生物技术领域中，有关于植物转化技术的报道，其中包括原生质体法、基因枪法、农杆菌感染法等。
所谓原生质体法是指利用电穿孔或聚乙二醇技术将目的DNA导入原生质体，然后从所述原生质体再生植株。不过，问题在于此方法不能用于那些还没有建立起由原生质体再生为植株的植物品系，此外，用这种方法导入基因的效率也较低。基因枪法则是将吸附有目的基因的金属粒子高速射入细胞从而进行转化的方法，此方法原则上可以用于任何植物的组织和细胞并且转化效率高，然而它需要基因枪这种专门的昂贵装置。
另一方面，用感染性农杆菌转化植物的方法则已广泛地用于双子叶植物如烟草、kalanchoe等。尽管一般认为农杆菌的寄主限于双子叶植物而非单子叶植物，近年来，已报导用农杆菌转化包括水稻、小麦、大麦以及玉米等禾本科植物在内的单子叶植物(EP 0 672 752 A1和EP 0 604 662 A1)。这些方法是用农杆菌转化培养的禾本科植物去分化组织或非去分化发育不完全的胚以产生转基因植物体。尽管此方法可产生较高的转化率，但还未证实以上方法可用于禾本科以外的单子叶植物。
兰科植物属单子叶植物，因此据认为其不为农杆菌的寄主。事实上，我们前期的实践也表明农杆菌不能感染培养的兰科植物去分化组织，也不能感染非去分化发育不完全的胚(未发表的资料)。因为兰科植物很难由原生质体再生成植株，所以，迄今为止要得到其转化植株，本领域所知唯一有效的方法是利用基因枪向如兰科植物胚状体的上皮导入有用的基因(日本专利公开No.07255300 A)。
本发明的目的是提供一种利用农杆菌的转化来产生转基因兰科植物的方法。因此，此发明提供了一种转化兰科植物的方法。该方法包括利用含有待导入兰科植物基因组的基因的农杆菌感染来源于兰科植物的组织。此方法使得首次利用农杆菌转化了兰科植物。
在本发明中，兰科植物的组织优选是由兰科植物的花梗节所长出的芽。
根据本发明，优选培养感染的组织以产生胚状体(PLB)，然后，再由PLB再生为成熟的兰科植物。根据本方法，很容易获得经过同源转化的成熟兰科植物。
本发明的另一目的是提供包含有目的基因的转基因兰科植物。因此，该发明也提供了由农杆菌转化的转基因兰科植物。
根据本发明，欲用本方法转化的兰科植物可以是兰科中的任何品系，包括：Phalaenopsis，Dortitaenopsis，Doritis，Paraphalaenopsis，Euphalaenopsis及相关种。
根据本发明，欲用农杆菌转染的组织可以是如下兰科植物的组织分化出的幼叶：离体培养的原胚体、胚状体及由花梗节所长出的芽。芽为最优选。如何由花梗切段诱导出芽的方法在本领域中是已知的(M.Tanaka等，“园艺科学”(Scientia Horticulture)，35(1988)117-126)。简言之，将兰科植物的花梗节切成约1-3厘米的片段，切点位于梗节附近，切段培养于适宜的培养基中。优选用于从花梗切段诱导芽的培养基包括：Vacin-Went培养基、Murashige-Skoog培养基、Linsmaier-Skoog培养基及其它类似的但含低浓度盐培养基。这些培养基添加本领域已知的适当成分。最优选的培养基是Vacin-Went培养基，其由以下成分组成：0.2g/l磷酸钙、0.525g/l硝酸钾、0.25g/l磷酸二氢钾、0.5g/l硫酸铵、0.028g/l柠檬酸铁(III)水合物、0.0075g/l四水硫酸锰以及20g/l蔗糖。
花梗切段可在约20-30℃，约50-90％的相对湿度下培养。通常在培养一至三个月后，切段节上发芽。优选用所述得到的芽来以农杆菌感染。众所周知，农杆菌的感染发生在植物的伤口处，因此就必须先损伤植物，用细菌处理受伤部位。譬如，为用农杆菌感染芽，可以尖部涂有农杆菌的竹针损伤芽。
农杆菌已被用作双子叶植物基因工程的载体。本说明书中，“农杆菌”表示农杆菌属或其衍生株系。根据本发明，农杆菌可以是本领域中已知的用于转化双子叶植物的任何株系，如Agrobacterium rhizogenes、Agrobacteriumtumefaciens，及其衍生株系。有许多可从市面上买到的株系。本说明书中的“衍生株系”一词可以是来导入目的基因或促进细菌中所含的Ti/Ri质粒的毒力的天然突变体和由本领域已知的任何方法得到的菌株的突变体。
当植物感染农杆菌后，其Ti/Ri质粒的T-DNA区就会转移并整合到植物细胞的基因组中。通常质粒的T-DNA位点含有决定植物激素生物合成的基因，因而感染的宿主基因的T-DNA区的表达会产生导致感染位点瘤形成的植物组织的异常生长，使感染部位产生肿瘤。为了向宿主植物导入外源基因，必须将目的基因导入细菌Ti/Ri质粒的T区。
向质粒的T-DNA区导入外源基因的方法在本领域中是熟知的(Y.Hiei等，“植物杂志”(The Plant Journal)(1994)6(2)271-282，EP 0 672-752 A1，EP 0604 662 A1及Y.NIWA，“农杆菌和植物细胞的相互作用”BISEIBUTSU(1987)3(4)407-417)。例如，用适当的限制性酶切下的微生物、植物或动物的目的基因可连结到同种限制酶切割的农杆菌质粒的T-DNA区。或者，该区的不需要的基因也可用与上述方法相同的方法除去。另外，也可使用能买到的含有目的基因的菌株。
根据本发明，欲向兰科植物导入的基因可以是任何目的基因，如决定抗病的、抗病毒的、抗虫的、矮化的、控制花色的和抗寒的基因。
根据本发明，质粒的T-DNA区优选还含有一个基因标记以便筛选和验证转化子。标记基因的例子在本领域中熟知，包括抗生素抗性基因，如抗卡那霉素、G418、氯霉素及氨苄青霉素等的抗性基因。另外，因为农杆菌的Ti/Ri质粒本身具有决定感染部位形成瘤的基因，所以感染成功的植物中会观察到瘤或肿胀。例如，用Agrobacterium rhizogenes感染时，约三周后就可以观察到瘤的形成。因此检测用细菌处理过的部位肿胀或瘤的形成可以进行第一次筛选，来筛选感染成功的芽。被感染的芽在含有抗生素的培养基中继续培养4-6周以清除感染的农杆菌。用于除去农杆菌的抗生素的例子包括Claforan，其在本领域中是熟知的。
当细菌清除结束后，立即将感染部位(即芽的肿胀部分)切下并培养于PLB诱导培养基中，以产生胚状体。兰科植物的胚状体被认为是和不定胚相关的组织，不定胚由诸如芽尖、由花梗培养物而来的叶裂片或根尖的外植体诱导。并且认为每个PLB来源于外植体的单个细胞，因此，转化的PLB再生为成熟的植株，获得的植株的所有细胞可能都是被同源转化过了的。
Michio TANAKA 1987年曾在“Kagawa大学农学教师备忘录”(MemoirsofFaculty of Agriculture)(Vol.49，pp1-85)上报导过用片段诱导生成PLB的具体方法。简言之，将芽的肿胀部分切下并切成1厘米见方的片段，再将得到的片段移植到PLB诱导培养基中并在约25℃，光照强度为2000-3000勒克斯下培养。在本发优选使用的PLB诱导培养基的例子由以下成份组成：3.5g/lHyponex(N∶P2O5∶K2O＝7∶6∶19)、100mg/l肌醇、1mg/l烟酸、1mg/l盐酸硫胺素、1mg/lα-萘乙酸(NAA)、10mg/l N6-苯甲基腺嘌呤(BA)、10mg/l腺嘌呤及20g/l蔗糖。在培养约100天后，可观察到已形成PLB。
将得到的PLB分别移植到分化培养基中以获得“幼态植株”，根据本说明书，“幼态植株”表示长至1-2厘米高的植株。用于从PLB产生幼态植株的分化培养基在本领域中是已知的，例如，优选的固体培养基由以下成分组成：3g/l Hyponex、50g/l土豆浸出液和20g/l蔗糖。PLB可在本领域中已知的常规培养条件下培养。
若农杆菌T-DNA区含有抗生素抗性基因，可在从PLB分化成的幼态植株之前或后筛选转化体，筛选可以通过在含所述抗生素的选择培养基上培养PLB或获得的幼态植株来进行。
为验证所选择的转化体是否含有目的基因，在本领域中有一些已知的方法。例如，可将转化子的基因组DNA进行扩增(如利用PCR技术)，再分析扩增DNA以证实是否含目的基因。若感染的农杆菌T-DNA区含有瘤形成基因，由转化的PLB再生出的幼态植株形成瘤可作为转化的信号。此外，可以对PLB或幼态植株进行组织学分析来验证GUS基因的表达。
通过培养在适当的培养基中，可将已验证转化成功的幼态植株培养成成熟植株。培养条件与从PLB分化为幼态植株所需的条件相同。
根据本方法的一个实施方案，分别用几种农杆菌转化兰科植物Phalaenopsis，所用的农杆菌菌株分别为Agrobacterium rhizogenes R-1601，Agrobacterium rhizogenes 03-01724及ATCC No.15834的Agrobacteriumrhizogene系。这些菌株均有包含rol-C基因的Ri质粒，该基因位于T-DNA区，决定植物的矮化。Agrobacterium rhizogenes R-1601菌株由美国华盛顿大学(Seattle，WA 98195，U.S.A.)生物化学系Gordon教授提供；Agrobacteriumrhizogenes 03-01724菌株来源于日本国立农业生物资源研究院。
在梗节附近将Phalaenopsis的花梗节切成约1-3厘米长的片段，浸于1％的苄基二甲基氯化铵(benzalkonium chloride)水溶液中10分钟，再转入氯气有效浓度为1％的次氯酸水溶液中浸20分钟以对切段表面进行消毒，消毒好的切段置于Vacin-Went培养基上，此培养基由以下成分组成：0.2g/l磷酸钙、0.525g/l硝酸钾、0.25g/l磷酸二氢钾、0.028g/l柠檬酸铁(III)水合物、0.0075g/l四水硫酸锰以及20g/l蔗糖。培养温度28℃，相对湿度90％。培养1个月后的切段的节萌发出芽。用然后用涂有上述农杆菌菌株的竹针刺伤芽使之感染，感染后的芽在同样条件下培养。
感染三周后，芽的感染部位肿胀。选择肿胀的芽(即作为感染成功的芽的候选物)并且再在含有500μg/l Claforan的培养基中培养30天以从芽清除农杆菌。
细菌清除结束后，切下肿胀部分并切成1厘米见方的片段，再移植到PLB诱导培养基中固定培养以诱导PLB的形成，培养温度为25℃，光照强度为2000勒克斯，培养基由以下成分组成：3.5g/l Hyponex、100mg/l肌醇、1mg/l烟酸、1mg/l盐酸硫胺素、1mg/lα-萘乙酸、10mg/l苯甲基腺嘌呤、10mg/l腺嘌呤及20g/l蔗糖(Michio TANAKA，Memoirs of Faculty ofAgriculture，Kagawa University，Vol.49，pp1-85，1987)。将产生的PLB分别培养在含3g/l Hyponex、50g/l土豆浸出液和20g/l蔗糖的分化培养基上以诱导幼态植株。
将产生的幼态植株移植到含有抗生素的选择培养基以选择抗生素抗性植株。再于与诱导幼态植株相同的条件下培养选择的幼态植株。若农杆菌T-DNA区在幼株中成功表达，则可在选择出的幼株中观察到瘤。在相同条件下进一步培养3-5个月后，即可得到成熟的矮化植株和成熟的合轴植株。
我们通过下述实施例进一步阐述本发明而不是进行限制。
                        实施例1
在梗节附近将Phalaenopsis的花梗节切成约1-3厘米长的片段，浸于1％的苄叉氯水溶液中10分钟，再转入氯气有效浓度为1％的次氯酸水溶液中浸20分钟以对切段表面进行消毒，消毒好的切段置于Vacin-Went培养基培养，培养基由以下成分组成：0.2g/l磷酸钙、0.525g/l硝酸钾、0.25g/l磷酸二氢钾、0.028g/l柠檬酸铁(III)水合物、0.0075g/l四水硫酸锰以及20g/l蔗糖。培养温度28℃，相对湿度90％，时间为1个月。培养1个月后切段的节萌发出芽。用农杆菌Agrobacterium rhizogenes R-1601感染芽并在同样的培养基上培养。本发明所用的Agrobacterium rhizogenes R-1601菌株由美国华盛顿大学(Seattle，WA 98195，U.SA.)生物化学系Milton P.Gordon教授购得，对其性质Pythoud等已于“生物技术”(Bio.Technology)，5,1323-1327(1987)上加以描述。该菌株的Ri质粒中含特定的vir区，其增加细菌的毒力。另外，Ri质粒中还含G418抗性区及rol-C基因，该基因位于T-DNA区，决定植物的矮化性状。
感染3个月后，芽的被感染部位出现肿胀。选择肿胀的芽并进一步地在含500μg/l Claforan的培养基上培养30天，以清除芽中的农杆菌。
当细菌清除结束后，切下芽的肿胀部分并切成1厘米见方的片段，再移植到PLB诱导培养基中固定培养以产生PLB。培养温度为25℃，光照强度为2000勒克斯。培养基由以下成分组成：3.5g/l Hyponex、100mg/l肌醇、1mg/l酸、1mg/l盐酸硫胺素、1mg/lα-萘乙酸、10mg/l苯甲腺嘌呤、10mg/l腺嘌呤及20g/l蔗糖。然后将产生的PLB分别培养到含3g/l Hyponex、50g/l土豆浸出液和20g/l蔗糖的分化培养基中以诱导幼态植株。
产生的幼态植株移植到含有20μg/l G418的培养基上以筛选抗生素抗性植株，选择出的幼态植株在与诱导幼态植株相同的条件下进一步培养。观察到选择的幼态植株上的瘤的发生，证实农杆菌T-DNA区的基因在再生的植株中成功表达。选择的幼态植株在相同条件下再培养3-5个月，结果得到成熟的矮化植株和成熟的合轴植株。
本发明首次提供了用农杆菌转化兰科植物的方法。据本发明可容易地得到含目的基因的转基因兰科植物。

Claims (8)

1.一种转化兰科植物的方法，其包括如下步骤：利用农杆菌感染所述兰科植物的组织，其中该农杆菌具有待导入该植物的基因。
2.权力要求1的方法，其中，所述兰科植物的组织是指植物花梗节发的芽。
3.权力要求1的方法，其还包括如下步骤：由感染组织诱导胚状体(PLB)，再将所述胚状体转化为成熟的植株。
4.权力要求1的方法，其中，农杆菌选自Agrobacterium rhizogenes、Agrobacterium tumefaciens及其衍生菌株。
5.权力要求4的方法，其中，农杆菌是Agrobacterium rhizogenes及其衍生菌株。
6.权力要求1的方法，其中，兰科植物是选自Phalaenopsis，Doritaenopsis，Doritis，Paraphalaenopsis，Euphalaenopsis及有关菌株。
7.权力要求4的方法，其中，兰科植物是Phalaenopsis。
8.一种转化的兰科植物，其是通过一种方法转化兰科植物得到，该方法包括用具有待导入植物基因组的基因的农杆菌感染所述兰科植物的组织。
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