CN106106161A - 一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法。所述方法包括以下步骤：步骤(1)组织培养得到宽叶不死鸟幼苗；步骤(2)侵染和共培养；步骤(3)筛选和分离抗性苗共培养结束后，将叶片转接到筛选培养基上进行筛选培养；步骤(4)验证提取获得的抗性苗的叶片的DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳验证。本发明建立了稳定的宽叶不死鸟的转基因体系，为宽叶不死鸟的转基因育种提供了关键的技术支持，能够培育出具有高观赏价值的宽叶不死鸟新品种。本发明提供的农杆菌介导高效转染体系适合对宽叶不死鸟进行转基因功能验证、宽叶不死鸟突变体的获得、宽叶不死鸟转基因育种。

Description

一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法
技术领域
本发明属于农杆菌介导技术领域，尤其涉及一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法。
背景技术
宽叶不死鸟(K.daigremontian)，又名大叶落地生根、花蝴蝶、倒吊莲、伤药、打不死、晒不死、古仔灯、新娘灯、大疔黄、土三七、叶生根、番鬼牡丹、叶爆芽、天灯笼、枪刀草、厚面皮、著生药、大还魂、复叶落地生根、墨西哥斗笠。是景天科(Crassulaceae)，伽蓝菜属(Kalanchoe)中一种极易栽培的观赏植物。景天科植物有其特殊的光合作用方式景天酸代谢，景天酸代谢途径是一种植物应对干旱环境的生理生态适应，是光合作用的一条重要节水型途径。宽叶不死鸟原产非洲马达加斯加地区，多年生肉质草本植物，株高50～100cm，茎单生且直立，基部木质化，叶片肉质，叶背具有不规则淡红褐斑纹，叶长15～20cm，边缘锯齿，能够自发地在叶片边缘锯齿处产生胎生苗从而进行无性生殖，聚伞状圆锥花序，宽筒状下垂，淡灰紫色。宽叶不死鸟的胎生苗在叶片边缘锯齿处发生，对称地排列于叶片边缘缺刻处；待到根系系统形成时，胎生苗从母叶上脱落，掉在地上并成长为新的植株。
宽叶不死鸟因其奇特的造型而成为一种重要的园艺观赏植物，不仅可以独自盆栽观赏以及作为植物配制中的背景植物，而且作为冬切花能在温度低的条件下保持较长花期。此外，宽叶不死鸟也可以作为科学研究的一个重要模型：宽叶不死鸟在景天酸代谢植物的生理生化、系统进化方面扮演着非常重要的角色；宽叶不死鸟不通过种子形成体细胞胚的能力为研究体细胞胚胎发生过程提供了一个极具吸引力的模型。因为宽叶不死鸟有着重要的园艺经济价值与科研价值，所以建立一个以宽叶不死鸟作为模型的研究平台有着重要的意义。
农杆菌介导的植物基因转化系统目前广泛应用于植物基因工程研究。根癌农杆菌中含Ti质粒，该质粒的部分DNA片段可整合到宿主细胞中，从而整合到植物的基因组中。农杆菌介导的植物基因转化虽然比较常见，但由于植物基因的屏障作用，农杆菌并非能够介导任意植物基因。宽叶不死鸟的基因屏障作用较强，目前还没有文献和专利报道过利用农杆菌成功将外源基因导入到宽叶不死鸟中。
发明内容
本发明针对现有技术无法在宽叶不死鸟中建立农杆菌介导转化体系，提供了一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，所述方法能够打破宽叶不死鸟的基因屏障，使用农杆菌介导宽叶不死鸟转化，打通宽叶不死鸟农杆菌介导高效转染体系，这是使宽叶不死鸟快速获得目的性状的第一步，也是较为重要的一步。
本发明的技术方案如下：一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤(1)无菌苗培养：摘取带宽叶不死鸟的小芽，进行清洗灭菌；将清洗灭菌后的小芽接种到SH基础培养基中，小芽均匀分布在培养基上进行光照培养；将长至3～5cm高的苗整株取出，切成小段，每段带有一个叶节，然后把叶节接入SH基础培养基中，进行扩繁培养得到宽叶不死鸟幼苗；
所述宽叶不死鸟叶片清洗灭菌操作如下：用流水冲洗除去叶片表面的灰尘和泥土，使用75％酒精消毒50～70s，用无菌水涮洗3～5次，转移到无菌培养瓶中，加入0.1～0.2％的升汞消毒3～5min，升汞倒回原来的瓶中，最后用无菌水洗5-7次。
所述SH基础培养基的成分如下：SH基础配方+琼脂8～16g·L-1+蔗糖20～60g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高温灭菌20～30min，
SH基础配方成分如下：硝酸钾2.5～5.0g·L-1，硫酸镁0.195～0.4g·L-1，磷酸二氢铵0.3～0.6g·L-1，氯化钙151～300mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，盐酸硫胺素0.4～0.8mg·L-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，烟酸0.5～1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳19.8～40mg·L-1，六水氯化钴0.1～0.2mg·L-1，五水硫酸铜0.2～0.4mg·L-1，硼酸5～10mg·L-1，碘化钾1～2mg·L-1，一水硫酸锰10～20mg·L-1，二水钼酸钠0.1～0.2mg·L-1，七水硫酸锌1～2mg·L-1，以下步骤所述的SH基础配方也采用该配方。
所述光照培养的条件如下：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃培养15～20天。
所述扩繁培养的条件如下：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃培养15～20天。
步骤(2)侵染和共培养：将扩繁培养后的宽叶不死鸟幼苗取出，并将叶片剥下，沿主叶脉方向将叶片切为2-3截，放入无菌三角瓶；加入农杆菌菌液进行侵染；结束后将叶片取出，滤去菌液，待叶片晾干后接种到垫有滤纸的共培养基中进行共培养；
所述含有AS的农杆菌菌液的OD600为0.4～0.8，AS终浓度为100～500μmol/L；侵染期间将叶片与含有AS(乙酰丁香酮)的农杆菌菌液轻轻摇匀，静置1～2h，静置过程中采用0.5～0.9MPa真空处理40～80min。
所述共培养培养基由以下成分组成：SH基础配方、2，4-D 0.1～0.9mg/L、NAA 0.2～1.0mg/L、6-BA 1.0～3.0mg/L、蔗糖20～50g/L、葡萄糖10～50g/L、200～500ul/L AS、琼脂8～16g/L；所述共培养的条件为：22～26℃暗培养3～5天，共培养基中采用的激素组合及加入量能够保证侵染后的宽叶不死鸟叶片存活和正常生长。
步骤(3)筛选和分离抗性苗：共培养结束后，将叶片转接到筛选培养基上进行筛选培养，有少部分活下来并分化出小芽；将小芽转接到抗性苗培养基中进行抗性苗分离培养；然后将分离出的抗性苗再转接到新的抗性苗培养基中进行抗性苗生长培养；
所述筛选培养基由以下成分组成：SH基础配方、2,4-D 0.1～1.2mg/L、NAA 0.1～1.0mg/L、6-BA0.3～0.9mg/L、蔗糖20～60g/L、Hyg 10～40mg/L、carb 250～750mg/L、cef250～750mg/L、琼脂8～16g/L；筛选培养基中抗生素组合以及抗生素添加量能有效抑制农杆菌生长，筛选出抗性阳性苗。
所述筛选培养条件如下：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃光照培养15～20天。
所述抗性苗培养基由以下成分组成：SH基础配方、蔗糖30～60g/L、carb 250～750mg/L、cef250～750mg/L、琼脂8～16g/L。
步骤(3)所述抗性苗分离培养的条件：当抗性苗长大到2mm长度，就可以进行分离培养；
抗性苗生长培养的条件为：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃光照培养15～20天。
步骤(4)验证：提取获得的抗性苗的叶片的DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染宽叶不死鸟的阳性苗，农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系。
本发明农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的要点如下：农杆菌植物转化虽然比较常见，但一般都针对水稻等谷物植物；由于观赏类植物的基因屏障作用较强，农杆菌很难侵染到观赏植物基因中。以宽叶不死鸟为模型的研究平台，建立宽叶不死鸟的组织培养体系以及转基因体系的重点在于共培养、筛选和抗性苗分离。而共培养基、筛选培养基、以及抗性苗分离培养基中加入的激素种类及组合、激素添加量以及培养时间，都有不可预知、不可控的结果。根据研究，发现宽叶不死鸟对本发明采用的激素配方以及培养时间比较适合，容易打破其基因屏障，农杆菌能够成功介导，并且愈伤组织形成频率较高。本发明通过对共培养、筛选和抗性苗分离步骤的不断探索，摸索出最佳培养条件，成功打通宽叶不死鸟农杆菌介导高效转染体系。
与现有育种技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明采用农杆菌介导转化宽叶不死鸟，建立了稳定的宽叶不死鸟的转基因体系，为宽叶不死鸟的转基因育种提供了关键的技术支持，能够以宽叶不死鸟作为研究景天科植物的模式植物，能够培育出具有高观赏价值的宽叶不死鸟新品种。
附图说明
图1为宽叶不死鸟潮霉素转化阳性苗PCR扩增后的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制；下述实施例中未注明的具体技术或条件，均为常规技术或条件，或按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。所述的百分比若无特殊说明是指质量百分比。
SH：Protocol for Schenk and Hildebrandt，SH培养基；
6-BA：6-苄氨基腺嘌呤；
NAA：a-萘乙酸；
AS：乙酰丁香酮；
Hyg：潮霉素；
Cef：头孢霉素；
Carb：羧苄青霉素；
2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸；
实施例1：宽叶不死鸟的诱导愈伤及农杆菌介导高效转染
步骤1外植体消毒阶段：摘取大棚里宽叶不死鸟，叶片上的小芽若干，用流水冲洗去掉表面的灰尘和泥土等，放入培养瓶中，在超净台里用75％酒精消毒60s，用无菌水涮洗3～5次，转移到无菌培养瓶中，加入0.1％的升汞，晃动消毒5min，升汞到会原来的瓶中，用无菌水洗5-7次即可。
步骤2接种阶段：
将消毒后的小芽，用镊子接种后到SH基础培养基中，每瓶接种3-4个小芽，均匀分布在培养基上，接完后放到培养间，光照强度1800～2000lx，每天光照12～13h，23～25℃光照培养15～17天；
SH基础培养基的成分如下：硝酸钾3.0g·L-1，硫酸镁0.25g·L-1，磷酸二氢铵0.4g·L-1，氯化钙200mg·L-1，甘氨酸3mg·L-1，肌醇150mg·L-1，盐酸硫胺素0.5mg·L-1，盐酸吡哆素0.7mg·L-1，烟酸0.7mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳25mg·L-1，六水氯化钴0.15mg·L-1，五水硫酸铜0.25mg·L-1，硼酸7mg·L-1，碘化钾1.25mg·L-1，一水硫酸锰12mg·L-1，二水钼酸钠0.15mg·L-1，七水硫酸锌1.5mg·L-1，琼脂12g·L-1，蔗糖30g·L-1，pH5.2～5.5，118～122℃高温灭菌20～30min。
步骤3无菌苗的扩繁阶段：
一般无菌苗长到5cm左右即可用于扩繁。用镊子把无菌苗取出放入培养皿中，用手术刀把无菌苗切成小段，每段带有一个叶节，然后把叶节接入SH基础培养基中，每瓶4-5个，放入培养间22～23℃光照培养，一个月至两个月就能长大作为实验材料用于转基因。
步骤4农杆菌的制备阶段：
将导入植物双元载体PCAMBIA1301的农杆菌加入到同时添加了卡那霉素和利福平抗生素的YM培养基中，摇床培养的转速200r/min，28℃培养过夜，之后把菌液放入离心机，4000r/min，4℃离心10min，倒掉上清液，加入重悬液使OD值达到0.4-0.8；重悬液为SH基础培养基，pH5.2～5.5，118～121℃灭菌20-30min。最后向菌液中加入200μmol/L AS，混匀备用；
步骤5侵染和共培养阶段：
把植株从培养瓶取出放入培养皿中，将叶片从植株上剥下，剩下的茎和顶芽放到一边，在主叶脉竖着方向上用手术刀将叶片切成2-3截，切完后将切好的叶片放入三角瓶中，一般切取5-6瓶的无菌苗。把重悬好的菌液倒入三角瓶中，一般一瓶倒40-50ml菌液，用刀或者镊子把瓶壁上材料推入菌液，套上塑料封口膜并用橡筋扎紧，在超净台内放置1.5～2小时，使菌液充分与材料接触。0.5MPa真空处理1小时，期间轻轻摇匀。抽完真空后将材料从真空泵取出，静置1-3小时，放入超净台，倒去菌液，把叶片放入铺有2-3层滤纸的培养皿中，待其菌液晾干后，接入垫有滤纸的共培养培养基中，接种时要接的较分散，完全铺满整个培养皿，接种完后用封口膜封口25℃暗培养3个整天。共培养培养基成分为：SH基础配方、2,4-D 0.1mg/L、NAA 0.2mg/L、6-BA 1.0mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、200ul/L AS、琼脂8g/L；所述共培养的条件为：22～24℃暗培养3天；
SH基础配方：硝酸钾4.0g·L-1，硫酸镁0.30g·L-1，磷酸二氢铵0.35g·L-1，氯化钙190mg·L-1，甘氨酸2.5mg·L-1，肌醇110mg·L-1，盐酸硫胺素0.5mg·L-1，盐酸吡哆素0.7mg·L-1，烟酸0.7mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳22mg·L-1，六水氯化钴0.11mg·L-1，五水硫酸铜0.20mg·L-1，硼酸7.5mg·L-1，碘化钾1.45mg·L-1，一水硫酸锰13mg·L-1，二水钼酸钠0.14mg·L-1，七水硫酸锌1.5mg·L-1；
步骤6筛选阶段：
把共培养时间到的材料取出，接种到筛选培养基上，一皿接种5-6排，每个材料间隔2cm左右，接种完以后，封口膜封口，放到培养间，25℃光照培养，培养期间随时观察，发现细菌污染后及时转移未污染材料到新的培养基上，继续光照培养，一般培养20天，大部分材料会死亡，少部分活下来并分化出小芽。筛选培养基成分为：SH基础配方(同步骤5)、2,4-D0.1mg/L、NAA 0.2mg/L、6-BA 1.0mg/L、蔗糖30g/L、Hyg 10mg/L、carb 250mg/L、cef 250mg/L、琼脂8g/L。培养条件为：光照强度1500～2000lx，每天光照12～13h，22～24℃光照培养17天。
步骤7抗性苗分离阶段：
将筛选后出芽的材料转入抗性苗培养基中长大并检测，未分化出小芽的材料继续接种到新的筛选培养基中，抗性苗培养基即加入抗生素的普通SH培养基，其成分为：SH基础配方(同步骤5)、蔗糖30g/L、carb 250mg/L、cef250mg/L、琼脂8g/L。培养条件为：光照强度1800～2000lx，每天光照12～13h，22～23℃。
步骤8抗性苗生长阶段：
抗性苗培养基中的抗性苗生长比较缓慢，需要更换一次新的抗性苗培养基才能较快速的生长，所以分离下来的抗性苗在生长18天以后需要更换一次新的抗性苗培养基，待其生长至40天即可移栽；培养条件为：光照强度1900～2000lx，每天光照12～13h，22～24℃。
步骤9阳性苗的验证阶段：
抗性苗经过PCR检测和凝胶电泳验证为阳性苗。
取0.5cm抗性苗叶片作为样品，放入灭菌的1.5ml离心管中利用CTAB法提取总DNA，具体步骤如下：
(1)在含有样品的1.5ml离心管中加入灭菌钢珠，盖上盖子在液氮中防止2～5分钟后利用研磨仪将叶片磨碎；
(2)加入800μl的CTAB提取缓冲液，混匀(CTAB在65℃水浴预热)，每5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min，离心15min；
(3)小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿为1:1的(各400μl)溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；
(4)小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000r/min，离心10min。
(5)重复步骤(4)1-2次，以蛋白层不出现为止；
(6)取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000r/min，离心10min；
(7)弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2次；
(8)室温下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50μl去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。
在提取出了样品的DNA后，就可以进行PCR了，标准的PCR反应体系如下：
10×扩增缓冲液 2.5μl
2.5mmol/L dNTP混合物 1.5μl
引物F、R各0.5μl
模板DNA(即提取出的样品DNA) 1μl
Taq DNA聚合酶 0.2μl
加双或三蒸水至 25μl
按照上面的比例配置完成标准体系后进行PCR反应的程序如下：
PCR体系中所使用的引物是本实验室根据载体pCambia1301中GUS基因设计序列如下：
引物F:5'-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC
引物R:5'-CCTGACCTATTGCATCTCCC
本发明检测的抗性植株对于潮霉素具有一定的抗性，证明农杆菌介导的抗性基因已经表达。
筛选之后分化所得的阳性苗经过如上验证，证实了本发明中通过农杆菌遗传介导的方法能将外源基因引入宽叶不死鸟基因组(参见图1，9号，26号，43号泳道为DL2000marker购买自大连宝生物技术公司；50号泳道为阳性对照；51号泳道为阴性对照；1号，2号，3号，4号，8号，10号，12号，13号，15号，19，20号，21号，24号，25号，29号，31号，33号，34号，35号，36号，37号，38号，40号，44号，45号泳道经PCR证明为阳性植株)。并且经过对传代的植株进行了如上验证后发现，经过本体系传代得到的转基因植株传代稳定。
本实施例中愈伤组织形成频率为95.4％，长绿苗的频率为82.1％，生根率98.8％，转化率54.3％，结果如表1、表2和表3所示。
表1
表2
表3
实施例2
步骤1外植体消毒阶段：
摘取大棚里宽叶不死鸟，叶片上的小芽若干，用流水冲洗去掉表面的灰尘和泥土等，放入培养瓶中，在超净台里用75％酒精消毒70s，用无菌水涮洗3～5次，转移到无菌培养瓶中，加入0.1％的升汞，晃动消毒5min，升汞到会原来的瓶中，用无菌水洗5-7次即可。
步骤2接种阶段：
将消毒后的小芽，用镊子接种后到SH基础培养基中，每瓶接种3-4个小芽，均匀分布在SH基础培养基上，接完后放到培养间，光照强度2400～2500lx，每天光照13～14h，25～26℃光照培养18～20天；
SH基础培养基成分：硝酸钾3.6g·L-1，硫酸镁0.30g·L-1，磷酸二氢铵0.45g·L-1，氯化钙250mg·L-1，甘氨酸2.5mg·L-1，肌醇150mg·L-1，盐酸硫胺素0.6mg·L-1，盐酸吡哆素0.8mg·L-1，烟酸0.85mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳25mg·L-1，六水氯化钴0.1mg·L-1，五水硫酸铜0.2mg·L-1，硼酸6mg·L-1，碘化钾1.0mg·L-1，一水硫酸锰20mg·L-1，二水钼酸钠0.2mg·L-1，七水硫酸锌1.2mg·L-1，琼脂10g·L-1，蔗糖40g·L-1；pH5.4～5.8，120～121℃高温灭菌20～30min。
步骤3无菌苗的扩繁阶段：
一般无菌苗长到5cm左右即可用于扩繁。用镊子把无菌苗取出放入培养皿中，用手术刀把无菌苗切成小段，每段带有一个叶节，然后把叶节接入SH基础培养基中，每瓶4-5个，放入培养间25～26℃光照培养，一个月至两个月就能长大作为实验材料用于转基因。
步骤4农杆菌的制备阶段：
将导入植物双元载体PCAMBIA1301的农杆菌加入到同时添加了卡那霉素和利福平抗生素的YM培养基中，摇床培养的转速200r/min，28℃培养过夜，之后把菌液放入离心机，4000r/min，4℃离心10min，倒掉上清液，加入重悬液使OD值达到0.6-1.0；重悬液为SH基础培养基，pH5.4～5.8，122～125℃灭菌20-30min。最后向菌液中加入400μmol/L AS，混匀备用；
步骤5侵染和共培养阶段：
把植株从培养瓶取出放入培养皿中，将叶片从植株上剥下，剩下的茎和顶芽放到一边，在主叶脉竖着方向上用手术刀将叶片切成2-3截，切完后将切好的叶片放入三角瓶中，一般切取5-6瓶的无菌苗。把重悬好的菌液倒入三角瓶中，一般一瓶倒40-50ml菌液，用刀或者镊子把瓶壁上材料推入菌液，套上塑料封口膜并用橡筋扎紧，在超净台内放置1.5～2.5小时，使菌液充分与材料接触。0.5MPa真空处理1小时，期间轻轻摇匀。抽完真空后将材料从真空泵取出，静置1-3小时，放入超净台，倒去菌液，把叶片放入铺有2-3层滤纸的培养皿中，待其菌液晾干后，接入垫有滤纸的共培养培养基中，接种时要接的较分散，完全铺满整个培养皿，接种完后用封口膜封口25℃暗培养3个整天。共培养培养基成分为：SH基础配方、2，4-D 0.5mg/L、NAA 0.8mg/L、6-BA2.5mg/L、蔗糖40g/L、葡萄糖45g/L、500ul/L AS、琼脂12g/L；所述共培养的条件为：25～26℃暗培养4～5天；
SH基础配方：硝酸钾2.7g·L-1，硫酸镁0.2g·L-1，磷酸二氢铵0.30g·L-1，氯化钙160mg·L-1，甘氨酸2.1mg·L-1，肌醇110mg·L-1，盐酸硫胺素0.5mg·L-1，盐酸吡哆素0.78mg·L-1，烟酸0.55mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳28mg·L-1，六水氯化钴0.16mg·L-1，五水硫酸铜0.35mg·L-1，硼酸8mg·L-1，碘化钾1.6mg·L-1，一水硫酸锰15mg·L-1，二水钼酸钠0.12mg·L-1，七水硫酸锌1.6mg·L-1
步骤6筛选阶段：
把共培养时间到的材料取出，接种到筛选培养基上，一皿接种5-6排，每个材料间隔2cm左右，接种完以后，封口膜封口，放到培养间，25℃光照培养，培养期间随时观察，发现细菌污染后及时转移未污染材料到新的培养基上，继续光照培养，一般培养20天，大部分材料会死亡，少部分活下来并分化出小芽。筛选培养基成分为：SH基础配方(同步骤5)、2，4-D0.5mg/L、NAA 0.8mg/L、6-BA2.5mg/L、蔗糖40g/L、Hyg 30mg/L、carb350mg/L、cef 400mg/L、琼脂11g/L。培养条件为：光照强度2400～2500lx，每天光照13～14h，25～26℃光照培养15～20天。
步骤7抗性苗分离阶段：
将筛选后出芽的材料转入抗性苗培养基中长大并检测，未分化出小芽的材料继续接种到新的筛选培养基中，抗性苗培养基即加入抗生素的普通SH培养基，其成分为：SH基础配方(同步骤5)、蔗糖40g/L、carb 550mg/L、cef450mg/L、琼脂15g/L。培养条件为：光照强度2300～2500lx，每天光照13～14h，24～26℃。
步骤8抗性苗生长阶段：
抗性苗培养基中的抗性苗生长比较缓慢，需要更换一次新的抗性苗培养基才能较快速的生长，所以分离下来的抗性苗在生长15～20天以后需要更换一次新的抗性苗培养基，待其生长至40天即可移栽；培养条件为：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃。然后进行验证，确认得到阳性苗。
本实施例中愈伤组织形成频率为96.5％，长绿苗的频率为81.8％，生根率98.5％，转化率52.7％，结果如表4、表5和表6所示。
表4
表5
表6
实施例3
分别改变侵染条件、共培养条件，具体结果如表7、8、9和10所示。
表7
说明：表中的转化率是指共培养后，叶片就进行GUS染色，得到的转化率。(采用组织化学法检测，以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。)
由表7可知：本发明提供的侵染条件和共培养条件可以使农杆菌成功介导宽叶不死鸟，且转化率较高。
其中，虽然共培养8～10天转化率稍高一些，但是后期农杆菌抑制不住，在筛选的时候全部死亡。共培养3～7天后，上筛选农杆菌能抑制住，在筛选的时候农杆菌污染比较少。
表8
说明：表中的转化率是指共培养后，叶片就进行GUS染色，得到的转化率。(采用组织化学法检测，以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。)
表8可以看出在合适的正空度下(0.5～0.9Kpa)，转化率比较好。
表9
说明：表中的转化率是指共培养后，叶片就进行GUS染色，得到的转化率。(采用组织化学法检测，以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。)
表9可以看出在合适的侵染时间范围内(1h～4h)，转化率比较好。时间过长，则会造成侵染过度，使得植物细胞死亡。
表10
说明：表中的转化率是指共培养后，叶片就进行GUS染色，得到的转化率。(采用组织化学法检测，以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。)
表10可以看出，缺少某一种激素培养时，转化率都偏低。

Claims (10)

1.一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤(1)宽叶不死鸟组织培养：摘取带宽叶不死鸟的小芽，进行清洗灭菌；将清洗灭菌后的小芽接种到SH基础培养基中进行光照培养；将长至3～5cm高的苗整株取出，切成小段，每段带有一个叶节，然后把叶节接入SH基础培养基中，进行扩繁培养得到宽叶不死鸟幼苗；
步骤(2)侵染和共培养：将扩繁培养后的宽叶不死鸟幼苗取出，并将叶片剥下，沿主叶脉方向将叶片切为2-3截，放入无菌三角瓶；加入农杆菌菌液进行侵染；结束后将叶片取出，滤去菌液，待叶片晾干后接种到垫有滤纸的共培养基中进行共培养；
步骤(3)筛选和分离抗性苗：共培养结束后，将叶片转接到筛选培养基上进行筛选培养，部分活下来并分化出小芽；将小芽转接到抗性苗培养基中进行抗性苗分离培养；然后将分离出的抗性苗再转接到新的抗性苗培养基中进行抗性苗生长培养；
所述筛选培养基由以下成分组成：SH基础配方、2,4-D 0.1～1.2mg/L、NAA 0.1～1.0mg/L、6-BA0.3～0.9mg/L、蔗糖20～60g/L、Hyg 10～40mg/L、carb 250～750mg/L、cef250～750mg/L、琼脂8～16g/L；
步骤(4)验证：提取获得的抗性苗的叶片的DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染宽叶不死鸟的阳性苗，即农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系。
2.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，步骤(1)所述宽叶不死鸟叶片清洗灭菌操作如下：用流水冲洗除去叶片表面的灰尘和泥土，使用75％酒精消毒50～70s，用无菌水涮洗3～5次，转移到无菌培养瓶中，加入0.1～0.2％的升汞消毒3～5min，升汞倒回原来的瓶中，最后用无菌水洗5-7次。
3.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，步骤(1)所述SH基础培养基的成分如下：SH基础配方+琼脂8～16g·L-1+蔗糖20～60g·L-1；pH5.2～5.8，118～125℃高温灭菌20～30min；
所述SH基础配方成分如下：硝酸钾2.5～5.0g·L-1，硫酸镁0.195～0.4g·L-1，磷酸二氢铵0.3～0.6g·L-1，氯化钙151～300mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，盐酸硫胺素0.4～0.8mg·L-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，烟酸0.5～1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳19.8～40mg·L-1，六水氯化钴0.1～0.2mg·L-1，五水硫酸铜0.2～0.4mg·L-1，硼酸5～10mg·L-1，碘化钾1～2mg·L-1，一水硫酸锰10～20mg·L-1，二水钼酸钠0.1～0.2mg·L-1，七水硫酸锌1～2mg·L-1。
4.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，步骤(1)所述光照培养的条件如下：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃培养15～20天。
5.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，步骤(1)所述扩繁培养的条件如下：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃培养15～20天。
6.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，步骤(2)所述含有AS的农杆菌菌液的OD600为0.4～1.8，AS终浓度为100～500μmol/L；侵染期间将叶片与含有AS的农杆菌菌液轻轻摇匀，静置1～2h，静置过程中采用0.5～0.9MPa真空处理40～80min。
7.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，步骤(2)所述共培养培养基由以下成分组成：SH基础配方、2，4-D 0.1～0.9mg/L、NAA 0.2～1.0mg/L、6-BA 1.0～3.0mg/L、蔗糖20～50g/L、葡萄糖10～50g/L、200～500ul/L AS、琼脂8～16g/L；所述共培养的条件为：22～26℃暗培养3～5天。
8.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，步骤(3)所述筛选培养条件如下：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃培养15～20天。
9.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，步骤(3)所述抗性苗培养基由以下成分组成：SH基础配方、蔗糖30～60g/L、carb 250～750mg/L、cef250～750mg/L、琼脂8～16g/L。
10.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，步骤(3)所述抗性苗分离培养的条件：当抗性苗长到2mm长度，就可以进行分离培养；
抗性苗生长培养的条件为：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃光照培养15～20天。
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