JP7225456B2 - ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡを含む組成物ならびに使用方法 - Google Patents

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Description

本発明は、合成ポリヌクレオチドおよびショートガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む組成物およびその使用方法を対象とする。合成ポリヌクレオチドは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、ｄＣＡＳ９およびｄＣＡＳ９エフェクタードメイン融合タンパク質をコードする合成修飾ＲＮＡである。合成ｓｇＲＮＡは、目的遺伝子を標的化する。合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡは、例えば、治療および／または臨床ならびに研究現場において転写をモジュレートするために使用することができる。
細菌および古細菌クラスタ化等間隔短鎖回文リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）系は、侵入ウイルスおよびプラスミドＤＮＡ内に存在する相補的配列の分解を指向するためのＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＡＳ）タンパク質との複合体中のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に依存する（（非特許文献１）；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系において、プレｃｒＲＮＡは、ＣＡＳ９タンパク質の存在下で二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼＲＮアーゼＩＩＩによるプロセシングをトリガーするプレｃｒＲＮＡ中のリピート配列に対して相補的なトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）によりプロセシングされる。ＣＡＳ９（旧称ＣＳＮ１）は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のキータンパク質であり、外来ＤＮＡのｃｒＲＮＡガイド型サイレンシングを担う唯一のタンパク質であると考えられている（（非特許文献２）；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。ＣＡＳ９タンパク質は、ｃｒＲＮＡ成熟およびｃｒＲＮＡガイド型ＤＮＡ干渉の両方に関与するとも仮定されている（（非特許文献２）；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
ＣＡＳ９エンドヌクレアーゼファミリーは、ゲノム標的化および編集のためのｄｓＤＮＡ切断を生成するための多用途ＲＮＡ指向系を開発するために使用することができる特異的ＤＮＡ部位を開裂するように単一ＲＮＡ分子を用いてプログラムすることができる（（非特許文献２）；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。ＣＡＳ９のこの使用は、ゲノムエンジニアリングの容易性を向上させ得る。
チャーチ実験室（Ｔｈｅ Ｃｈｕｒｃｈ Ｌａｂ）は、ヒト細胞中でカスタムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とともに機能するように細菌および古細菌ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系をエンジニアリングした（（非特許文献１）；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
ＣＲＩＳＰＲ関連触媒不活性ｄＣａｓ９タンパク質と、区別されるエフェクタードメイン（例えば、ＶＰ６４、ｐ６５ＡＤ、ＫＲＡＢ、およびＭｘｉ１）との融合物は、ヒトおよび酵母細胞中の転写の抑制または活性化を可能とすることが示されており、送達の部位は、同時発現されるショートガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってのみ決定される。転写リプレッサードメインに対するｄＣａｓ９のカップリングは、複数の内因性遺伝子の発現をサイレンシングし得、ＲＮＡ配列分析により証明されるとおりオフターゲットは検出不能である（（非特許文献３））。
触媒不活性Ｃａｓ９タンパク質の一例は、突然変異（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ）化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質であり、これは典型的にはｄＣＡＳ９と称される（（非特許文献３）；（非特許文献４））。触媒不活性Ｃａｓ９ももたらした２つのエンドヌクレアーゼドメインおよび単一アミノ酸置換（Ｄ３１Ａ、Ｈ８５８Ａ）を有するストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）Ｃａｓ９が記載されている（（非特許文献５））。
ＣＲＩＳＰＲ系、Ｃａｓ９、およびｄＣａｓ９を記載する他の刊行物としては、以下のコング（Ｃｏｎｇ）ら、２０１３年；ジネック（Ｊｉｎｅｋ）ら、２０１２年；レイ（Ｌｅｉ）ら、２０１３年；ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）ら、２０１３年；ペレ－ピネラ（Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｌａ）ら、２０１３年；メーダ（Ｍａｉｄｅｒ）ら、２０１３年が挙げられる。
ある修飾ｍＲＮＡ配列は、免疫応答の逃避、回避または縮小を上回る利益を有する治療物としての潜在性を有することが示されている。このような研究は、公開されている同時係属出願の、２０１１年８月５日に出願された（特許文献１）および２０１１年１０月３日に出願された（特許文献２）、２０１１年１０月３日に出願された（特許文献３）に詳述されており、これらの内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
上記および他の目的、特徴部および利点は、例えば、同様の参照文字が異なる視点全体にわたり同一の部分を指す添付の図面において説明されるとおり、以下の本発明の特定の実施形態の説明から明らかである。図面は必ずしも寸法どおりでないが、その代わりに本発明の種々の実施形態の原理を説明することに重点が置かれる。
国際公開第２０１２０１９１６８号パンフレット 国際公開第２０１２０４５０７５号パンフレット 国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット
マリ（Ｍａｌｉ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１３年、第３３９巻：ｐ．８２３～８２６ ジネック（Ｊｉｎｅｋ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１２年、第３３７巻：ｐ．８１６～８２１ チイ（Ｑｉ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、２０１３年、第１５２巻、ｐ．１１７３～１１８３ ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、２０１３年、第１５４巻、ｐ．１～１０ スプラナウスカス（Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１１年、第３９巻、ｐ．９２７５～９２８２
本発明の合成ポリヌクレオチドの概略図である。 ＦＬＡＧタグ付きＣａｓ９構築物または対照により形質移入されたＨｅＬａ細胞の溶解物に対して実施された抗ＦＬＡＧウエスタンおよび免疫沈降の結果を示す。 陽性対照としてトリリンク（Ｔｒｉｌｉｎｋ）－ＨＡ－タグ付きＣａｓ９ ｍＲＮＡを使用するＨＡタグ付きギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡにより形質移入されたＨｅＬａ細胞のウエスタン分析の結果を示す。 未処理ＨｅＬａ細胞に対するメーダ（Ｍａｅｄｅｒ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）Ｃａｓ９構築物により形質移入されたＨｅＬａ細胞の細胞溶解物中のＬＣ－ＰＲＭ Ｃａｓ９ペプチド定量の結果を示す。それぞれのチャートは、Ｃａｓ９構築物のペプチド断片の定量を示す。図４Ａは、ＧＮＥＬＡＬＰＳＫペプチド（配列番号１２０）の定量を表す。図４Ｂは、ＹＦＤＴＴＩＤＲペプチド（配列番号１２１）の定量を表す。図４Ｃは、ＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲペプチド（配列番号１２２）の定量を表す。 １４ｕｇのＣａｓ９ ＬＮＰ（ＭＣ３）またはモックを投与された動物からのマウス肝の溶解物に対して実施された抗ＦＬＡＧウエスタンおよび免疫沈降の結果を示す。ＷＣＥ＝全細胞抽出物。ＩＰ＝Ｍ２－アガロースビーズを用いる免疫沈降（シグマ（Ｓｉｇｍａ））。ラダー＝シーブループラス（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ Ｐｌｕｓ）２（商標）プレステインドタンパク質マーカー（ライフテック（ＬｉｆｅＴｅｃｈ））。
本発明は、少なくとも部分的には、ｍＲＮＡを細胞質中で発現させ、核に移行させることができるという驚くべき発見に基づく。本発明のｍＲＮＡ技術は、驚くべきことに、細胞内タンパク質の送達に好適である。本発明のｍＲＮＡ技術は、複数のｍＲＮＡの送達にも望ましく好適である。本発明の方法論は、慣用の遺伝子療法アプローチに伴う問題、例えば、毒性、宿主ゲノム中へのＤＮＡのインテグレーションなどを回避または迂回する。本発明の方法論は、自然免疫を誘導することのない、および慣用の遺伝子療法アプローチに伴う不所望な副作用なしの複数のｍＲＮＡの送達に特に好適である。特に、本発明のｍＲＮＡ送達技術は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９およびそれらのバリアントをコードするｍＲＮＡと、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との組合せの両方の発現を容易にしてインビトロおよびインビボの遺伝子調節を可能とする。ｍＲＮＡベース医薬組成物を使用して、本技術は、従来達成不可能であったＣＲＩＳＰＲ技術の治療適用を提供する。
本明細書に提示されるデータは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例として、タンパク質発現の調節を容易にする調節配列を含むようにエンジニアリングされたタンパク質、および対応するｍＲＮＡ標的化配列（すなわち、ｓｇＲＮＡ）の細胞内発現を達成することが可能であることを証明する。本明細書に提示されるデータは、特に、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含有する医薬組成物のインビボ投与を介するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の細胞内タンパク質発現を達成することが可能であることを実証する。
本発明の種々の実施形態の詳細は、以下の詳細な説明に記載される。本発明の他の特性、目的、および利点は、詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
１つ以上の１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、ｄＣＡＳ９および／またはｄＣＡＳ９エフェクター融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドの設計、調製、製造および／または製剤化のための組成物（例として、医薬組成物）および方法が、本明細書に記載される。目的遺伝子を標的化する１つ以上の合成小分子ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）の設計、調製、製造および／または製剤化のための組成物（例として、医薬組成物）および方法も本明細書に記載される。合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの両方は、典型的には、インビトロ転写を使用する製造物である。一実施形態において、合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡは修飾されており、例えば、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび目的遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡを使用する目的遺伝子の発現のモジュレーションの方法も本明細書に記載される。インビトロおよびインビボ法、例えば、目的遺伝子の発現と相関する疾患状態の治療の方法が含まれる。本明細書に記載の合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡの選択、設計および／または利用のための系、方法、装置およびキットも提供される。
今日まで記載されているＣＲＩＳＰＲ／阻害／活性化（ＣＲＩＳＰＲ／Ｉ／Ａ）系のキーとなる限定は、細胞内転写（ｓｇＲＮＡの）ならびにＣａｓ９、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ９融合タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、およびｄＣａｓ９－ＫＲＡＢの転写および翻訳をドライブするためのウイルスベクターによるＤＮＡの送達に対するそれらの依存性である。転写活性化／抑制を使用するインビボ系についてのこの限定のいくつかの関与が存在する。それというのも、これは反復投与を要求するためである。第１に、シュードウイルスによるＤＮＡの送達は、計測可能な自然免疫活性化（例えば、ＴＬＲを介する）を誘導し、これらは、形質移入効率に影響し、不所望な副作用を有する。第２に、ウイルスキャプシドの反復投与は、反復投与時に適応免疫応答を誘導し得、誘導する可能性が高い。第３に、ＤＮＡの使用および慢性活性化ｄＣａｓ９のリスクは、インビボ治療物についての顕著な安全性および毒性リスクを表す。
修飾合成ポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡ）は、この原核生物プラットフォームの臨床解釈のための理想的なプラットフォームを表す。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、ｄＣＡＳ９をコードする修飾ｍＲＮＡをインビボで、時間制限および（潜在的には、細胞型）標的化様式で安全に送達するための技術が本明細書に開示される。さらに、修飾ｍＲＮＡの使用は、顕著な自然免疫活性化のリスクを回避し、適応応答のリスクを縮小する。
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド
本発明は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、ｄＣＡＳ９およびｄＣＡＳ９融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドを提供する。用語「ポリヌクレオチド」は、最も広義で、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。本発明の例示的なポリヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＭＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＮＡ、例として、β－Ｄ－リボ立体構造を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ立体構造を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、および２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡ）またはそれらのハイブリッドが挙げられる。
一実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。本明細書において使用される場合、用語「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、ポリペプチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードし、翻訳されてコードされるポリペプチドをインビトロ、インビボ、インサイチュまたはエクスビボで生成し得る合成であり得る任意のポリヌクレオチドを指す。本発明において、ｍＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、ｄＣＡＳ９およびｄＣＡ９エフェクター（アクチベータまたはインヒビター）融合タンパク質をコードする。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の追加の記載および配列は、以下のものである。
本発明は、有用な特性、例として、一部の実施形態において、ポリヌクレオチドが導入される細胞の自然免疫応答の実質的な誘導の欠落をポリヌクレオチドに付与する１つ以上の構造的および／または化学的修飾または変更を含む合成ポリヌクレオチドを提供することにより慣習的ｍＲＮＡ分子の機能性の範囲を拡張する。本明細書において使用される場合、「構造的」特性または修飾は、ヌクレオチドそれ自体の顕著な化学的修飾なしで合成ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ中の２つ以上の結合ヌクレオチドが挿入、欠失、二重化、反転またはランダム化されているものである。構造的修飾を行うために化学結合が破壊および再生されることが必須であるため、構造的修飾は、化学的性質のものであり、したがって化学的修飾である。しかしながら、構造的修飾は、異なるヌクレオチドの配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」（配列番号１２３）は、「ＡＴ－５ｍｅＣ－Ｇ」（配列番号１２４）に化学的に修飾することができる。同一のポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」（配列番号１２３）から「ＡＴＣＣＣＧ」（配列番号１２５）に構造的に修飾することができる。ここで、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入され、ポリヌクレオチドの構造的修飾をもたらす。
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質
本発明の合成ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする。用語「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」は、限定されるものではないが、ＣＡＳ９、ＣＳＹ４、ｄＣＡＳ９、およびｄＣＡＳ９エフェクタードメイン（アクチベータおよび／またはインヒビタードメイン）融合タンパク質を含む。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列の例は、以下の表に見出される。
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、任意数の種、例として、限定されるものではないが、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのものであり得る。
合成ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の野生型配列またはバリアントＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードし得る。バリアントは、本明細書にさらに詳細に記載される。本明細書にさらに詳述されるとおり、合成ポリヌクレオチドは、野生型コドン使用頻度または特定の適用のために最適化されたコドン使用頻度、例えば、ヒト治療物のためのヒトコドン最適化のいずれかを含み得る。
本発明によれば、合成ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする結合ヌクレオシドの第１の領域を少なくとも含む。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の例は、以下の表に列記される。任意の特定のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質について、１つ以上のバリアントまたはアイソフォームが存在し得る。潜在的なフランキング領域が表に開示されることが当業者により認識される。これらは、ＯＲＦまたはコード領域の５’（上流）または３’（下流）のいずれかにそれぞれの転写物中でコードされる。コード領域は、タンパク質配列の教示により明確に具体的に開示される。結果的に、タンパク質をコードするものをフランキングすると教示される配列が、フランキング領域とみなされる。１つ以上の利用可能なデータベースまたはアルゴリズムを利用することにより、５’および３’フランキング領域をさらに特徴付けることも可能である。データベースは、転写物のフランキング領域中に含有される特徴部をアノテートしており、これらは当分野において利用可能である。
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ｄＣＡＳ９である。典型的な配列は、以下の表に含まれる。
別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ｄＣＡＳ９エフェクタードメイン融合タンパク質である。エフェクタードメインは、適用に応じて活性化ドメインまたは阻害ドメインであり得る。エフェクタードメインの例は当業者に周知であり、それとしては、例えば、ＫＲＡＢ、ＣＳＤ、ＷＲＰＷ、ＶＰ６４、またはｐ６５ＡＤが挙げられる。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ｄＣＡＳ９－ＫＲＡＢまたはｄＣＡＳ９－ＶＰ６４融合タンパク質である。配列の例は、以下の表および配列表に提供される。
本発明の種々の態様において有用なさらなる構築物としては、配列番号１～９に記載のものが挙げられる。これらとしては、Ｃａｓ９、血清型Ｍ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）；核局在化配列（ＮＬＳ）を有するＦＬＡＧタグ付き（すなわち、トリマーＦＬＡＧ）ＣＡＳ９をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）；ＧＦＰにコンジュゲートしているＮＬＳを有するＨＡタグ付きＣａｓ９（Ｃａｓ９－ＨＡタグ／２×ＮＬＳ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）；ＮＬＳを有するＣａｓ９Ｃ末端断片をコードするヌクレオチド配列（配列番号４）；Ｃａｓ９Ｎ末端断片をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）；ＮＬＳを有するＦＬＡＧタグ付きＣａｓ９（ＦＬＡＧ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号６）；ならびにＣａｓ９タンパク質配列（Ｃａｓ９－配列番号８、Ｃａｓ９血清型Ｍ１－配列番号９）および核局在化配列（ＮＬＳ）を有するＦＬＡＧタグ付き（すなわち、トリマーＦＬＡＧ）ＣＡＳ９（配列番号９）が挙げられる。
合成ポリヌクレオチドアーキテクチャ
本発明の修飾合成ポリヌクレオチドは野生型ｍＲＮＡから、本明細書において証明されるとおり、核酸ベース治療物を使用する有効なポリペプチド産生の既存の問題を克服するように機能するそれらの機能的および／または構造的設計特性において区別される。
図１は、本発明の代表的なポリヌクレオチド一次構築物１００を示す。本明細書において使用される場合、用語「一次構築物」または「一次ｍＲＮＡ構築物」は、１つ以上の目的ポリペプチドをコードし、それにコードされる目的ポリペプチドの翻訳を可能とするために十分な構造的および／または化学的特性を保持するポリヌクレオチド転写物を指す。一次構築物は、本発明のポリヌクレオチドであり得る。構造的または化学的に修飾される場合、一次構築物は、修飾合成ポリヌクレオチドまたはｍｍＲＮＡと称することができる。
図１に戻ると、一次構築物１００は、ここでは、第１のフランキング領域１０４および第２のフランキング領域１０６によりフランキングされる結合ヌクレオチド１０２の第１の領域を含有する。本明細書において使用される場合、「第１の領域」は、「コード領域」または「コードする領域」または単に「第１の領域」と称することができる。この第１の領域としては、限定されるものではないが、コードされる目的ポリペプチド、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を挙げることができる。目的ポリペプチドは、その５’末端においてシグナル配列領域１０３によりコードされる１つ以上のシグナル配列を含み得る。第１のフランキング領域１０４は、１つ以上の完全または不完全５’ＵＴＲ配列を含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。第１のフランキング領域１０４は、５’末端キャッピング領域１０８も含み得る。第２のフランキング領域１０６は、１つ以上の完全または不完全３’ＵＴＲを含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。第２のフランキング領域１０６は、３’テーリング配列１１０も含み得る。
第１の領域１０２の５’末端および第１のフランキング領域１０４の架橋は、第１の作動領域１０５である。慣習的に、第１の作動領域は、開始コドンを含む。作動領域は、代替的に、任意の翻訳開始配列またはシグナル、例として開始コドンを含み得る。
第１の領域１０２の３’末端および第２のフランキング領域１０６の架橋は、第２の作動領域１０７である。慣習的に、この第２の作動領域は、終止コドンを含む。第２の作動領域は、代替的に、任意の翻訳開始配列またはシグナル、例として終止コドンを含み得る。本発明によれば、複数の連続終止コドンを使用することもできる。
一部の実施形態において、合成ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、約３０～約１００，０００ヌクレオチド（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～３，０００、３０～５，０００、３０～７，０００、３０～１０，０００、３０～２５，０００、３０～５０，０００、３０～７０，０００、１００～２５０、１００～５００、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～３，０００、１００～５，０００、１００～７，０００、１００～１０，０００、１００～２５，０００、１００～５０，０００、１００～７０，０００、１００～１００，０００、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～３，０００、５００～５，０００、５００～７，０００、５００～１０，０００、５００～２５，０００、５００～５０，０００、５００～７０，０００、５００～１００，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～３，０００、１，０００～５，０００、１，０００～７，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～２５，０００、１，０００～５０，０００、１，０００～７０，０００、１，０００～１００，０００、１，５００～３，０００、１，５００～５，０００、１，５００～７，０００、１，５００～１０，０００、１，５００～２５，０００、１，５００～５０，０００、１，５００～７０，０００、１，５００～１００，０００、２，０００～３，０００、２，０００～５，０００、２，０００～７，０００、２，０００～１０，０００、２，０００～２５，０００、２，０００～５０，０００、２，０００～７０，０００および２，０００～１００，０００）を含む。
一般に、目的ポリペプチド、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする第１の領域の長さは、約３０ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００ヌクレオチド、またはそれらを超え、１００，０００ヌクレオチドを含むそれ以下である）。
本発明によれば、第１および第２のフランキング領域は、独立して、１５～１，０００ヌクレオチド長の範囲（例えば、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、および９００ヌクレオチド超または少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、および１，０００ヌクレオチド）であり得る。
本発明によれば、３’テーリング配列は、不存在から５００ヌクレオチド長（例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド）の範囲であり得る。テーリング配列がポリＡテールである場合、長さは、ポリＡ結合タンパク質結合の単位で、またはそれに応じて決定することができる。この実施形態において、ポリＡテールは、少なくとも４つのモノマーのポリＡ結合タンパク質に結合するほど十分な長さである。ポリＡ結合タンパク質モノマーは、およそ３８ヌクレオチドのストレッチに結合する。したがって、約８０ヌクレオチドおよび１６０ヌクレオチドのポリＡテールが機能的であることが観察されている。
本発明によれば、５’末端キャッピング領域は、単一キャップまたはキャップを形成する一連のヌクレオチドを含み得る。この実施形態において、キャッピング領域は、１～１０、例えば、２～９、３～８、４～７、１～５、５～１０、または少なくとも２、または１０以下のヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、キャッピング領域は、不存在である。
本発明によれば、第１および第２の作動領域は、３～４０、例えば、５～３０、１０～２０、１５、または少なくとも４、または３０以下のヌクレオチド長の範囲であり得、開始および／または終止コドンに加え、１つ以上のシグナルおよび／または制限配列を含み得る。
環状合成ポリヌクレオチド
本発明によれば、合成ポリヌクレオチドは、翻訳適格性分子を生成してポリＡ結合タンパク質および５’末端結合タンパク質間の相互作用を支援するために環化またはコンカテマー化することができる。環化またはコンカテマー化の機序は、少なくとも３つの異なる経路：１）化学的経路、２）酵素的経路、および３）リボザイム触媒経路を介して生じ得る。新たに形成された５’／３’結合は、分子内または分子間であり得る。
第１の経路において、核酸の５’末端および３’末端は、接近する場合、分子の５’末端および３’末端間の新たな共有結合を形成する化学反応基を含有する。５’末端はＮＨＳエステル反応基を含有し得、３’末端は３’－アミノ末端ヌクレオチドを含有し得、その結果、有機溶媒中で合成ｍＲＮＡ分子の３’末端上の３’－アミノ末端ヌクレオチドが５’－ＮＨＳ－エステル部分に対する求核攻撃を受け、新たな５’－／３’－アミド結合を形成する。
第２の経路において、５’リン酸化核酸分子を核酸の３’－ヒドロキシル基に酵素的に結合させ、新たなホスホロジエステル結合を形成するためにＴ４ＲＮＡリガーゼを使用することができる。一例の反応において、１～１０単位のＴ４ＲＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、イプスウィッチ、マサチューセッツ）と１μｇの核酸分子を製造業者のプロトコルに従って３７℃において１時間インキュベートする。ライゲーション反応は、酵素的ライゲーション反応を支援するために並列で５’および３’領域の両方と塩基対形成し得る分割オリゴヌクレオチドの存在下で行うことができる。
第３の経路において、ｃＤＮＡテンプレートの５’または３’末端のいずれかがリガーゼリボザイム配列をコードし、その結果、インビトロ転写の間、得られる核酸分子が核酸分子の５’末端を核酸分子の３’末端にライゲートし得る活性リボザイム配列を含有し得る。リガーゼリボザイムは、Ｉ群イントロン、Ｉ群イントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピンリボザイムから誘導することができ、またはＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））により選択することができる。リボザイムリガーゼ反応は、０から３７℃の温度において１～２４時間を要し得る。
合成ポリヌクレオチドマルチマー
本発明によれば、３’末端において修飾されているヌクレオチドを使用して３’末端を介して複数の区別される合成ポリヌクレオチドを一緒に結合させることができる。細胞中への送達の化学量論を制御するために化学的コンジュゲーションを使用することができる。例えば、細胞脂肪酸代謝を変更するためにグリオキシル酸回路酵素、イソクエン酸リアーゼおよびリンゴ酸シンターゼをＨｅｐＧ２細胞中に１：１の比において供給することができる。この比は、一方のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ種上の３’－アジド末端ヌクレオチドおよび逆のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ種上のＣ５－エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドを使用してポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを化学結合させることにより制御することができる。修飾ヌクレオチドは、末端トランスフェラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、イプスウィッチ、マサチューセッツ）を製造業者のプロトコルに従って使用して転写後に添加する。３’修飾ヌクレオチドの添加後、文献に記載のクリックケミストリー機序を介する新たな共有結合を形成するために２つのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ種を銅の存在または不存在下で水溶液中で合わせることができる。
別の例において、官能化リンカー分子を使用して３つ以上のポリヌクレオチドを一緒に結合させることができる。例えば、官能化糖分子は、複数の化学反応基（ＳＨ－、ＮＨ２－、Ｎ３など）を含有して３’官能化ｍＲＮＡ分子上のコグネート部分（すなわち、３’－マレイミドエステル、３’－ＮＨＳ－エステル、アルキニル）と反応するように化学的に修飾することができる。コンジュゲートされるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの化学量論比を直接制御するため、修飾糖上の反応基の数を化学量論様式で制御することができる。
合成ポリヌクレオチドコンジュゲートおよび組合せ
タンパク質産生をさらに向上させるため、本発明の合成ポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチド、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドについての特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、規定の細胞型、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、または薬物にコンジュゲートするように設計することができる。
コンジュゲーションは、安定性および／または半減期の増加をもたらし得、細胞、組織または生物中の特異的部位に対するポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの標的化において特に有用であり得る。
本発明によれば、ｍｍＲＮＡまたは一次構築物は、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマーまたはベクターなどの１つ以上と投与することができ、またはそれらをさらにコードし得る。
二機能性合成ポリヌクレオチド
本発明の一実施形態は、二機能性ポリヌクレオチド（例えば、二機能性一次構築物または二機能性ｍｍＲＮＡ）である。この名称が意味するとおり、二機能性ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの機能を有し、または有し得るものである。これらの分子は、慣例により多機能性と称することもできる。
二機能性ポリヌクレオチドの複数の機能性は、ＲＮＡによりコードされ得（コードされる産物が翻訳されるまで機能は顕在化し得ない）、またはポリヌクレオチドそれ自体の特性であり得る。これは、構造的または化学的であり得る。二機能性修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと共有結合的または静電的に会合する機能を含み得る。さらに、２つの機能はｍｍＲＮＡおよび別の分子の複合体に関して提供することができる。
二機能性ポリヌクレオチドは、抗増殖性であるペプチドをコードし得る。これらのペプチドは、直鎖、環状、拘束またはランダムコイルであり得る。これらは、アプタマー、シグナリング分子、リガンドまたはそれらのミミックもしくは模倣物として機能し得る。抗増殖性ペプチドは、翻訳される場合、３～５０アミノ酸長であり得る。これらは、５～４０、１０～３０、またはおよそ１５アミノ酸長であり得る。これらは翻訳されると、単鎖、複数鎖もしくは分枝鎖であり得、または複合体、凝集体もしくは任意の複合構造を形成し得る。
非コードポリヌクレオチドおよび一次構築物
本明細書に記載されるとおり、部分的または実質的に翻訳不能な配列を有する、例えば、非コード領域を有するポリヌクレオチドおよび一次構築物が提供される。このような非コード領域は、一次構築物の「第１のフランキング領域」であり得る。あるいは、非コード領域は、第１の領域以外の領域であり得る。このような分子は一般に翻訳されないが、１つ以上の翻訳機序構成要素、例えば、リボソームタンパク質またはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に対する結合およびそれらの封鎖の１つ以上によりタンパク質産生に対して効果を付与し得、それにより細胞中のタンパク質発現を有効に低減させ、または細胞中の１つ以上の経路もしくはカスケードをモジュレートし、これが次いでタンパク質レベルを変更する。ポリヌクレオチドまたは一次構築物は、１つ以上の長鎖非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ、またはｌｉｎｃＲＮＡ）またはその一部、小分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏ－ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含有またはコードし得る。
目的ポリペプチド（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）
本発明によれば、合成ポリヌクレオチドは、１つ以上の目的ポリペプチドまたはその断片をコードするように設計される。目的ポリペプチドとしては、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、ＣＡＳ９、ｄＣＡＳ９、およびｄＣＡＳ９エフェクタードメイン（アクチベータおよび／またはインヒビタードメイン）融合タンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、本明細書にさらに詳細に記載される。
目的ポリペプチドとしては、限定されるものではないが、１つ以上の核酸、複数の核酸、核酸の断片により独立してコードされ得る全ポリペプチド、複数のポリペプチドもしくはポリペプチドの断片または上記のいずれかのバリアントを挙げることができる。本明細書において使用される場合、用語「目的ポリペプチド」は、本発明の一次構築物中でコードされるように選択される任意のポリペプチドを指す。本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」は、最も多くの場合、ペプチド結合により一緒に結合しているアミノ酸残基（天然または非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書において使用される場合、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。一部の例において、コードされるポリペプチドは、約５０アミノ酸より小さく、この場合、ポリペプチドはペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、それは少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長である。したがって、ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然存在ポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片および他の等価物、バリアント、ならびに上記の類似体が挙げられる。ポリペプチドは単一分子であり得、または多分子複合体、例えば、ダイマー、トリマーもしくはテトラマーであり得る。これらは、単鎖または複数鎖ポリペプチド、例えば、抗体またはインスリンも含み得、会合または結合していてよい。最も一般的なジスルフィド結合は、複数鎖ポリペプチド中に見出される。ポリペプチドという用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然存在アミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまり得る。
用語「ポリペプチドバリアント」は、アミノ酸配列が天然または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較してアミノ酸配列内のある位置における置換、欠失、および／または挿入を保有し得る。通常、バリアントは、天然または参照配列に対して少なくとも約５０％の同一性（相同性）を保有し、好ましくは、それらは天然または参照配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％同一（相同）である。
一部の実施形態において、「バリアントミミック」が提供される。本明細書において使用される場合、用語「バリアントミミック」は、活性化配列を模倣する１つ以上のアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタミン酸は、ホスホロ－トレオニンおよび／またはホスホロ－セリンについてのミミックとして機能し得る。あるいは、バリアントミミックは、失活またはミミックを含有する不活性化産物をもたらし得、例えば、フェニルアラニンは、チロシンについての不活性化置換として作用し得；またはアラニンは、セリンについての不活性化置換として作用し得る。
「相同性」は、アミノ酸配列に適用される場合、最大の相同性パーセントを達成するために配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の第２の配列のアミノ酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸配列中の残基の割合と定義される。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当分野において周知である。相同性が同一性パーセントの計算に依存するが、計算において導入されるギャップおよびペナルティに起因して値が異なり得ることが理解される。
「相同体」とは、ポリペプチド配列に適用される場合、第２の種の第２の配列に対してかなりの同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
「類似体」は、親または出発ポリペプチドの特性のうちの１つ以上を依然として維持する、１つ以上のアミノ酸変更、例えば、アミノ酸残基の置換、付加または欠失だけ異なるポリペプチドバリアントを含むことを意味する。
本発明は、バリアントおよび誘導体を含むポリペプチドベースのいくつかのタイプの組成物を企図する。これらとしては、置換、挿入、欠失および共有結合バリアントおよび誘導体が挙げられる。用語「誘導体」は、用語「バリアント」と同義に使用されるが、一般に任意の手法で参照分子または出発分子に対して修飾され、および／または変化した分子を指す。
したがって、参照配列、特に本明細書に開示のポリペプチド配列に対して置換、挿入および／または付加、欠失ならびに共有結合修飾を含有するポリペプチドをコードするｍｍＲＮＡが、本発明の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１つ以上のリジンを本発明のペプチド配列に付加することができる（例えば、Ｎ末端またはＣ末端において）。配列タグは、ペプチド精製または局在化に使用することができる。リジンは、ペプチド溶解度を増加させ、またはビオチン化を可能とするために使用することができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基は、場合により欠失させ、トランケート配列を提供することができる。あるいは、あるアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、配列の使用に応じて、例えば、可溶性であるより大きい配列の一部としての配列の発現時に欠失させることができ、または固体支持体に結合させることができる。
「置換バリアント」は、ポリペプチドに言及する場合、天然配列または出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所の同一の位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。この置換は単一置換であり、分子中の１つのアミノ酸のみが置換されたものであり得、またはそれらの置換は多置換であり、同一の分子中の２つ以上のアミノ酸が置換されたものであり得る。
本明細書において使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、配列中に通常存在するアミノ酸を、類似のサイズ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸により置換することを指す。保存的置換の例としては、非極性（疎水性）残基、例えば、イソロイシン、バリンおよびロイシンの別の非極性残基との置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、ある極性（親水性）残基の別の残基との置換、例えば、アルギニンおよびリジン間、グルタミンおよびアスパラギン間、ならびにグリシンおよびセリン間の置換が挙げられる。さらに、塩基性残基、例えば、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジンの別の塩基性残基との置換、またはある酸性残基、例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸の別の酸性残基との置換が、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、リジンなどの極性（親水性）残基との置換、および／または極性残基の非極性残基との置換が挙げられる。
「挿入バリアント」は、ポリペプチドに言及する場合、１つ以上のアミノ酸が天然または出発配列中の特定の位置におけるアミノ酸に直接隣接して挿入されたものである。アミノ酸に「直接隣接して」とは、アミノ酸のアルファ－カルボキシ官能基またはアルファ－アミノ官能基のいずれかに連結されていることを意味する。
「欠失バリアント」は、ポリペプチドに言及する場合、天然または出発アミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失バリアントは分子の特定の領域中の１つ以上のアミノ酸が欠失している。
「共有結合誘導体」は、ポリペプチドに言及する場合、有機タンパク質性もしくは非タンパク質性誘導体化剤による天然もしくは出発タンパク質の修飾、および／または翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、慣習的に、タンパク質の標的化アミノ酸残基を、選択された側鎖もしくは末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることにより、または選択された組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾の機構を利用することにより導入される。得られる共有結合誘導体は、生物学的活性、免疫学的アッセイ、または組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の調製に重要な残基の同定を目的とするプログラムにおいて有用である。このような修飾は、当分野の通常の技術の範囲内であり、過度の実験なく実施される。
ある翻訳後修飾は、発現ポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、高い頻度で、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に翻訳後に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態も、本発明により産生されるポリペプチド中に存在し得る。
他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアルファ－アミノ基のメチル化が挙げられる（Ｔ．Ｅ．クレイトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）著、「タンパク質：構造および分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ｗ．Ｈ．フリーマン社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．）、サンフランシスコ、ｐ．７９～８６（１９８３年）。
「特徴部」は、ポリペプチドに言及する場合、分子の区別されるアミノ酸配列ベースの構成要素と定義される。本発明のｍｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの特徴部としては、表面出現、局所立体構造形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
本明細書において使用され、ポリペプチドに言及する場合、用語「表面出現」は、タンパク質のポリペプチドベース構成要素が最も外側の表面上に現れることを指す。
本明細書において使用され、ポリペプチドに言及する場合、用語「局所立体構造形状」は、タンパク質の限定された空間内に局在するタンパク質のポリペプチドベース構造の出現を意味する。
本明細書において使用され、ポリペプチドに言及する場合、用語「折り畳み」は、エネルギー最小化時のアミノ酸配列の得られる立体構造を指す。折り畳みは、折り畳みプロセスの二次または三次レベルで生じ得る。二次レベルの折り畳みの例としては、ベータシートおよびアルファヘリックスが挙げられる。三次レベルの折り畳みの例としては、エネルギー力の凝集または分離に起因して形成されるドメインおよび領域が挙げられる。このようにして形成された領域としては、疎水性および親水性ポケットなどが挙げられる。
本明細書において使用される場合、用語「ターン」は、タンパク質立体構造に関する場合、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を変更する屈曲部を意味し、１、２、３またはそれより多いアミノ酸残基を含み得る。
本明細書において使用される場合、ポリペプチドに言及する場合、用語「ループ」は、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を反転させるように機能し得るポリペプチドの構造的特徴部を指す。ループがポリペプチド中で見い出され、骨格の方向のみを変更する場合、これは４つ以上のアミノ酸残基を含み得る。オリバ（Ｏｌｉｖａ）らは、少なくとも５つのクラスのタンパク質ループを同定している（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）、第２６６巻（第４号）、ｐ．８１４～８３０、１９９７年）。ループは、開ループまたは閉ループであり得る。閉ループまたは「環状」ループは、架橋部分の間に２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多いアミノ酸を含み得る。このような架橋部分は、ジスルフィド架橋を有するポリペプチド中で典型的なシステイン－システイン架橋（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）を含み得、あるいは架橋部分は非タンパク質ベースのもの、例えば、本明細書において使用されるジブロモジリル剤（ｄｉｂｒｏｍｏｚｙｌｙｌ ａｇｅｎｔ）であり得る。
本明細書において使用される場合、ポリペプチドに言及する場合、用語「半ループ」は、由来するループとして同定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するループの部分を指す。ループは必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有し得ないことが理解される。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有し、または奇数のアミノ酸を含むと同定された場合において、奇数のループの半ループは、ループの整数部分または次の整数部分（ループのアミノ酸の数／２＋／－０．５個のアミノ酸）を含む。例えば、７アミノ酸ループと同定されたループは、３アミノ酸または４アミノ酸（７／２＝３．５＋／－０．５は、３または４である）の半ループをもたらし得る。
本明細書において使用される場合、ポリペプチドに言及する場合、用語「ドメイン」は、１つ以上の同定可能な構造または機能的特徴または特性（例えば、結合能、タンパク質－タンパク質相互作用の部位として機能する）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
本明細書において使用される場合、ポリペプチドに言及する場合、用語「半ドメイン」は、由来するドメインとして同定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するドメインの部分を意味する。ドメインは必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有し得ないことが理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有し、または奇数のアミノ酸を含むと同定された場合において、奇数のドメインの半ドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分（ドメインのアミノ酸の数／２＋／－０．５個のアミノ酸）を含む。例えば、７アミノ酸ドメインと同定されたドメインは、３アミノ酸または４アミノ酸（７／２＝３．５＋／－０．５は、３または４である）の半ドメインをもたらし得る。サブドメインがドメインまたは半ドメイン内で同定され得、これらのサブドメインが、それらが由来するドメインまたは半ドメイン中で同定された構造的または機能的特性の全てに満たない構造的または機能的特性を有することも理解される。本明細書のドメイン型のいずれかを含むアミノ酸は、ポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要はない（すなわち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメインまたはサブドメインをもたらし得る）ことも理解される。
本明細書において使用される場合、ポリペプチドに言及する場合、用語「部位」は、アミノ酸ベースの実施形態に関する場合、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義に使用される。部位は、本発明のポリペプチドベース分子内で修飾、操作、変更、誘導体化または変動され得るペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。
本明細書において使用される場合、ポリペプチドに言及する場合、用語「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」または「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」は、ペプチドまたはポリペプチドの端部を指す。このような端部は、ペプチドまたはポリペプチドの第１または最終部位にのみ限定されるのではなく、末端領域中の追加のアミノ酸を含み得る。本発明のポリペプチドベース分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸により終端する）およびＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸により終端する）の両方を有すると特徴付けすることができる。本発明のタンパク質は、一部の場合、ジスルフィド結合または非共有結合力により結び付けられた複数のポリペプチド鎖（マルチマー、オリゴマー）から構成される。これらの種類のタンパク質は、複数のＮ末端およびＣ末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、それらが場合により非ポリペプチドベース部分、例えば、有機コンジュゲートで始まり、または終了するように修飾することができる。
これらの特徴部のいずれかが本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡによりコードされるべきポリペプチドの所望の構成要素であると同定または定義されると、これらの特徴部のいくつかの操作および／または修飾のいずれも、移動、交換、反転、欠失、ランダム化または二重化により実施することができる。さらに、特徴部の操作は本発明の分子の修飾と同一の結果をもたらし得ることが理解される。例えば、ドメインの欠失を含む操作は、全長未満の分子をコードする核酸の修飾のような分子の長さの変更をもたらす。
修飾および操作は、当分野において公知の方法、例えば、限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発により達成することができる。次いで、得られる修飾分子は、インビトロまたはインビボアッセイ、例えば、本明細書に記載のものまたは当分野において公知の任意の他の好適なスクリーニングアッセイを使用して活性について試験することができる。
本発明によれば、ポリペプチドは、一連の実験を介して発見されるコンセンサス配列を含み得る。本明細書において使用される場合、「コンセンサス」配列は、１つ以上の部位における変動性を可能とする配列の集合集団を表す単一配列である。
当業者により認識されるとおり、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、および相同タンパク質も、本発明の目的ポリペプチドの範囲内であるとみなされる。例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００を超えるアミノ酸長の参照タンパク質の任意のタンパク質断片（少なくとも１つのアミノ酸残基が参照ポリペプチド配列より短いが、他の点では同一であるポリペプチド配列を意味する）が本明細書に提供される。別の例において、本明細書に記載の配列のいずれかに対して約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％同一である約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００個のアミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を本発明により利用することができる。ある実施形態において、本発明により利用されるべきポリペプチドは、本明細書に提供または参照される配列のいずれかに示される２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多い突然変異を含む。
目的バリアントポリペプチド
一実施形態において、本発明の合成ポリペプチドは、バリアントポリペプチド、例えば、参照ポリペプチド配列とのある同一性を有するバリアントＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードし得る。本明細書において使用される場合、「参照ポリペプチド配列」は、出発ポリペプチド配列を指す。参照配列は、野生型配列または別の配列の設計において参照される任意の配列であり得る。「参照ポリペプチド配列」は、例えば、ＣＡＳ９、ｄＣＡＳ９、ｄＣＡＳ９－アクチベータドメイン融合タンパク質、ｄＣＡＳ９－インヒビタードメイン融合タンパク質、および／またはそれらのバリアントをコードする任意のものであり得る。
当分野において公知の用語「同一性」は、配列を比較することにより決定される２つ以上のペプチドの配列間の関係を指す。当分野において、同一性は、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間のマッチ数により決定されるペプチド間の配列関連性の程度も意味する。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により処理されるギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のより小さい配列間の同一マッチのパーセントを計測する。関連ペプチドの同一性は、公知の方法により容易に計算することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８年；「生物計算科学：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３年；「配列データのコンピュータ分析、第１部（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １）」、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）、およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．）編、ヒュマーナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージ、１９９４年；「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、フォンハインチェ，Ｇ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）著、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリプスコフ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデブルー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍストックトンプレス（Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１年；ならびにカリッロ（Ｃａｒｉｌｌｏ）ら著、ＳＩＡＭジャーナル・オン・アプライド・マスマティクス（ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．）、第４８巻、ｐ．１０７３（１９８８年）に記載のものが挙げられる。
一部の実施形態において、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドと同一または同様の活性を有し得る。あるいは、バリアントは、参照ポリペプチドに対して変更（例えば、増加または減少）した活性を有し得る。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載され、当業者に公知の配列アライメントプログラムおよびパラメータにより決定されるとおり、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントに対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。このようなアライメントのツールとしては、ＢＬＡＳＴスイートのものが挙げられる（ステフェン Ｆ．アルツシュール（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、トマス Ｌ．マッデン（Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ）、アレジャンドロ Ａ．シャッフェル（Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ）、ジングイ・チャン（Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ）、チェン・チャン（Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ）、ウエブ・ミラー（Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ）、およびデイビッド Ｊ．リップマン（Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ）、１９９７年、「ギャップ挿入ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース探索プログラム（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第２５巻、ｐ．３３８９～３４０２）。他のツールは、本明細書、具体的には、「同一性」の定義に記載される。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムのデフォルトパラメータは、例えば、予測閾値１０、ワードサイズ２８、マッチ／ミスマッチスコア１、－２、線形ギャップコストを含む。任意のフィルタ、ならびに種特異的リピート、例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）特異的リピートの選択を適用することができる。
フランキング領域：非翻訳領域（ＵＴＲ）
本明細書に記載のとおり、本発明の合成ポリヌクレオチドは、非翻訳領域を含む。遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが、翻訳されない。５’ＵＴＲが転写開始部位において始まり開始コドンに続くが、開始コドンを含まない一方、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性に関してＵＴＲが担う制御的役割についての報告が相次いでいる。分子の安定性を向上させるためにＵＴＲの制御特徴部を本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡ中に取り込むことができる。それらが不所望な器官部位に誤指向される場合には転写物の下方制御の制御を確保するために規定の特徴部を取り込むこともできる。
ＵＴＲの例としては、限定されるものではないが、以下の表に見出されるものが挙げられる。
２０１２年１２月１４日に出願された同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書の表２および３は、本発明の一次構築物中でフランキング領域として利用することができる例示的ＵＴＲのリストを提供する。末端の１つ以上のヌクレオチド、例として、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧが付加または除去された５’または３’ＵＴＲのバリアントを利用することができる。
列記されるものは例であり、一次構築物のそれぞれの第１または第２のフランキング領域中に任意の遺伝子からの任意のＵＴＲを取り込むことができることを理解されたい。さらに、任意の公知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを利用することができる。野生型遺伝子のバリアントでない人工ＵＴＲを提供することも本発明の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその部分は、それらが選択された転写物のＵＴＲもしくはその部分と同一の配向で配置することができ、または配向もしくは局在を変更することができる。したがって、５’または３’ＵＴＲは、反転させ、短縮し、延長し、１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを用いてキメラにすることができる。本明細書において使用される場合、用語「変更される」は、ＵＴＲ配列に関する場合、ＵＴＲが参照配列に関して何らかの点が変化したことを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、上記で教示される配向もしくは局在の変化により野生型もしくは天然ＵＴＲに対して変更することができ、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位により変更することができる。「変更された」ＵＴＲ（３’または５’にかかわらず）をもたらすこれらの変化のいずれかは、バリアントＵＴＲを含む。
一実施形態において、ＵＴＲは、２０１３年３月９日に出願された同時係属米国仮特許出願第６１／７７５，５０９号明細書、表題、ｍＲＮＡについての非相同非翻訳領域（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ）の長い表２１および２０１３年３月３１日に出願された同時係属米国仮特許出願第６１／８２９，３７２号明細書、表題、ｍＲＮＡについての非相同非翻訳領域（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ）の長い表２１および表２２に記載のＵＴＲから選択することができ、これらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、二重、三重、または四重ＵＴＲ、例えば、５’または３’ＵＴＲを使用することができる。本明細書において使用される場合、「二重」ＵＴＲは、同一のＵＴＲの２つのコピーが直列で、または実質的に直列でコードされるものである。例えば、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１００１２９８７７号明細書に記載の二重ベータ－グロビン３’ＵＴＲを使用することができる。
パターン化されたＵＴＲを有することも本発明の範囲内である。本明細書において使用される場合、「パターン化されたＵＴＲ」は、１回、２回、または３回以上繰り返されるリピートまたは交互のパターン、例えば、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはそのバリアントを反映するＵＴＲである。これらのパターンにおいて、それぞれの文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルにおける異なるＵＴＲを表す。
一実施形態において、フランキング領域は、タンパク質が共通の機能、構造、特性の特徴部を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、目的ポリペプチドは、特定の細胞、組織中で発現され、または発生の間のある時点において発現されるタンパク質のファミリーに属し得る。これらの遺伝子のいずれかからのＵＴＲは、新たなキメラ一次転写物を作出するために同一または異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換することができる。本明細書において使用される場合、「タンパク質のファミリー」は、最も広義で、少なくとも１つの機能、構造、特徴部、局在化、起源、または発現パターンを共有する２つ以上の目的ポリペプチドの群を指すために使用される。
一実施形態において、本発明の合成ポリヌクレオチドは、コードされる目的タンパク質に対して非相同でない非翻訳領域を含み得る。非限定的な例として、非翻訳領域は、２０１３年３月９日に出願された同時係属米国仮特許出願第６１／７７５，５０９号明細書、表題、ｍＲＮＡについての非相同非翻訳領域（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ）および２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／８２９，３７２号明細書、表題、ｍＲＮＡについての非相同非翻訳領域（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ
ｆｏｒ ｍＲＮＡ）に記載の非翻訳領域の１つ以上の全部または一部またはその断片を含み得、これらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
５’ＵＴＲおよび翻訳開始
本発明の合成ポリヌクレオチドは、典型的には５’ＵＴＲを含む。天然５’ＵＴＲは、翻訳開始についての役割を担う特徴部を担持する。これらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に公知のコザック配列のようなシグネチャーを保有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号１２６）を有し、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、この後に別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも公知である。
規定の標的器官の多量に発現される遺伝子中に典型的に見出される特徴部をエンジニアリングすることにより、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの安定性およびタンパク質産生を向上させることができる。核酸分子、例えば、肝細胞系または肝臓中のｍｍＲＮＡの発現を向上させるため、例えば、肝臓発現ｍＲＮＡ、例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトタンパク質、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子の５’ＵＴＲの導入を使用することができる。同様に、他の組織特異的ｍＲＮＡからの５’ＵＴＲを使用してその組織中の発現を改善することは、筋肉（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルキュリン（Ｈｅｒｃｕｌｉｎ））、内皮細胞（Ｔｉｅ－１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、ｉ－ＮＯＳ）、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）および肺上皮細胞（ＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）について可能である。
５’ＵＴＲ（または３’ＵＴＲ）中に他の非ＵＴＲ配列を取り込むことができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのフランキング領域中に取り込むことができる。イントロン配列の取り込みは、タンパク質産生およびｍＲＮＡレベルを増加させ得る。
本発明における使用のために選択することができる５’ＵＴＲは、構造化ＵＴＲ、例えば、限定されるものではないが、翻訳を制御するための５’ＵＴＲであり得る。非限定的な例として、構造化５’ＵＴＲは、２０１３年１月３１日に出願された同時係属米国仮特許出願第６１／７５８，９２１号明細書、表題、ＲＮＡ構築物を使用する分別標的化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）；２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８１，１３９号明細書、表題、ＲＮＡ構築物を使用する分別標的化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）；２０１２年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／７２９，９３３号明細書、表題、末端最適化ＲＮＡ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＲＮＡｓ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，２２４号明細書、表題、末端最適化ＲＮＡ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＲＮＡｓ）および２０１３年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／８２９，３５９号明細書、表題、末端最適化ＲＮＡ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＲＮＡｓ）に記載の末端修飾のいずれかを使用する場合に有益であり得、これらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
３’ＵＴＲおよびＡＵリッチエレメント
本発明の合成ポリヌクレオチドは、典型的には３’ＵＴＲを含む。３’ＵＴＲは、それらに埋め込まれるアデノシンおよびウリジンのストレッチを有することが公知である。これらのＡＵリッチなシグネチャーは、高代謝回転率を有する遺伝子において特に高頻度で見られる。これらの配列特徴部および機能的特性に基づき、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分類することができ（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９５年）：クラスＩのＡＲＥは、Ｕリッチ領域内のＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。Ｃ－ＭｙｃおよびＭｙｏＤは、クラスＩのＡＲＥを含有する。クラスＩＩのＡＲＥは、２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを有する。このタイプのＡＲＥを含有する分子としては、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－ａが挙げられる。クラスＩＩＩのＡＲＥは、あまり明確にされていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ－Ｊｕｎおよびミオゲニンは、十分に研究されたこのクラスの例の２つである。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質がメッセンジャーを脱安定化することが公知である一方、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、特に注目すべきＨｕＲがｍＲＮＡの安定性を増加させることが報告されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲ中にエンジニアリングすることにより、ＨｕＲ結合、したがってインビボでのメッセージの安定化をもたらす。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの安定性をモジュレートするため、３’ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去または修飾を使用することができる。規定のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡをエンジニアリングする場合、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの安定性を低下させ、それにより得られるタンパク質の翻訳を抑制し、その産生を低減させるためにＡＲＥの１つ以上のコピーを導入することができる。同様に、細胞内安定性を増加させ、したがって得られるタンパク質の翻訳および産生を増加させるため、ＡＲＥを同定し、除去し、または突然変異させることができる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを使用する形質移入実験を関連細胞系中で実施することができ、タンパク質産生を形質移入後の種々の時点においてアッセイすることができる。例えば、異なるＡＲＥエンジニアリング分子により細胞を形質移入することができ、関連タンパク質に対してＥＬＩＳＡキットを使用することにより、形質移入後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７日目の時点において産生されたタンパク質をアッセイする。
３’ＵＴＲおよびマイクロＲＮＡ結合部位
一部の実施形態において、本発明の合成ポリヌクレオチドは、３’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子安定性を低減させること、または翻訳を阻害することのいずれかにより遺伝子発現を下方制御する１９～２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、マイクロＲＮＡ結合部位、またはマイクロＲＮＡシードを含み得る。このような配列は、任意の公知のマイクロＲＮＡ、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書および米国特許出願公開第２００５／００５９００５号明細書に教示のもの、または２０１３年１月３１日に出願された同時係属出願の米国特許出願第６１／７５８，９２１号明細書（代理人整理番号２０３０．１０３９）の表７に列記のものに対応し得、これらの内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
ｍｉＲＮＡ結合部位を含有する３’ＵＴＲの例としては、限定されるものではないが、以下の表に見出されるものが挙げられる。
マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟マイクロＲＮＡの２～８位の領域中の配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン・クリック相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２～８位または２～７位を含み得る。一部の実施形態において、マイクロＲＮＡシードは、７つのヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的中のこのシード相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）によりフランキングされる。一部の実施形態において、マイクロＲＮＡシードは、６つのヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的中のシード相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）によりフランキングされる。例えば、グリムソン Ａ．（Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ）、ファース ＫＫ（Ｆａｒｈ ＫＫ）、ジョンストン ＷＫ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ）、ガーレット－エンゲレ Ｐ）（Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ）、リム ＬＰ（Ｌｉｍ ＬＰ）、バーテル ＤＰ（Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ）著、モレキュラー・セル（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ）、２００７年、７月６日、第２７巻（第１号）、ｐ．９１～１０５参照。マイクロＲＮＡシードの塩基は、標的配列との完全な相補性を有する。マイクロＲＮＡ標的配列を本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中にエンジニアリングすることにより、分解または翻訳低減のためにこの分子を標的化することができるが、但し、当該マイクロＲＮＡが利用可能であることを条件とする。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険を低減させる。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域、およびそれらの発現パターンの同定、ならびに生物学におけるそれらの役割が報告されている（ボノエ（Ｂｏｎａｕｅｒら著、カレント・ドラッグ・ターゲッツ（Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ）、２０１０年、第１１巻、ｐ．９４３～９４９；アナンド（Ａｎａｎｄ）およびチェレシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１７１～１７６；コントレラス（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ）およびラオ（Ｒａｏ）著、リューケミア（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、２０１２年、第２６巻、ｐ．４０４～４１３（２０１１年、１２月２０日．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１ １．３５６）；バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）著、セル（Ｃｅｌｌ）、２００９年、第１３６巻、ｐ．２１５～２３３；ランドグラフ（Ｌａｎｄｇｒａｆ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、２００７年、第１２９巻、ｐ．１４０１～１４１４）。
例えば、核酸分子がｍＲＮＡであり、肝臓に送達されることが意図されないが、そこに行き着く場合、肝臓中に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ－１２２は、ｍｉＲ－１２２の１つまたは複数の標的部位がポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中にエンジニアリングされると、目的遺伝子の発現を阻害し得る。ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの長寿命、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに減少させるため、異なるマイクロＲＮＡについての１つまたは複数の結合部位の導入をエンジニアリングすることができる。
本明細書において使用される場合、用語「マイクロＲＮＡ部位」は、マイクロＲＮＡ標的部位もしくはマイクロＲＮＡ認識部位、またはマイクロＲＮＡが結合もしくは会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、慣習的なワトソン・クリックハイブリダイゼーション規則に従い得、またはマイクロＲＮＡと、マイクロＲＮＡ部位における、もしくはそれに隣接する標的配列との任意の安定的会合を反映し得ることを理解されたい。
逆に、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの目的のため、規定の組織中のタンパク質発現を増加させるために天然に存在するマイクロＲＮＡ結合部位をエンジニアリングして配列から出す（すなわち、配列から除去する）ことができる。例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位は、肝臓中のタンパク質発現を改善するために除去することができる。複数の組織中の発現の調節は、１つまたはいくつかのマイクロＲＮＡ結合部位の導入または除去を介して達成することができる。
マイクロＲＮＡがｍＲＮＡを調節し、それによりタンパク質発現を調節することが公知の組織の例としては、限定されるものではないが、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、神経系（ｍｉＲ－１２４ａ、ｍｉＲ－９）、多能性細胞（ｍｉＲ－３０２、ｍｉＲ－３６７、ｍｉＲ－２９０、ｍｉＲ－３７１、ｍｉＲ－３７３）、膵島細胞（ｍｉＲ－３７５）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、および肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられる。
マイクロＲＮＡは、複雑な生物学的プロセス、例えば、血管新生（ｍｉＲ－１３２）も調節し得る（アナンド（Ａｎａｎｄ）およびチェレシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１７１～１７６）。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡにおいて、そのようなプロセスに関与するマイクロＲＮＡについての結合部位は、生物学的に関連する細胞型に対して、または関連生物学的プロセスに関してポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ発現の発現を調整するために除去または導入することができる。
マイクロＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）、例えば、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）中で発現されることも公知である。免疫細胞特異的マイクロＲＮＡは、免疫原性、自己免疫性、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子療法および組織／臓器移植後の不所望な免疫応答に関与する。例えば、ｍｉＲ－１４２およびｍｉＲ－１４６は、免疫細胞中でのみ発現され、特に骨髄樹状細胞中で豊富に発現される。ポリヌクレオチドまたは遺伝子送達構築物の３’－ＵＴＲ中へのｍｉＲ－１４２結合部位の導入は、ｍｉＲ－１４２媒介ｍＲＮＡ分解を介して抗原提示細胞中の遺伝子発現を選択的に抑制し得、プロフェッショナルＡＰＣ（例えば、樹状細胞）中の抗原提示を限定し、それにより遺伝子送達後の抗原媒介免疫応答を妨害する（アンノニ Ａ（Ａｎｎｏｎｉ Ａ）ら著、ブラッド（ｂｌｏｏｄ）、２００９年、第１１４巻、ｐ．５１５２～５１６１参照、内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる）。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡにおいて、そのようなプロセスに関与するマイクロＲＮＡについての結合部位は、ＡＰＣ中の本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの発現を低減させ、抗原媒介免疫応答を緩和するために導入することができる。
最後に、異なる細胞型中のマイクロＲＮＡの発現パターンの理解を介して、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、規定の細胞型におけるより標的化された発現または規定の生物学的条件下のみでのより標的化された発現のためにエンジニアリングすることができる。組織特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入を介して、組織中のタンパク質発現または生物学的条件に関するタンパク質発現に最適なポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを設計することができる。
エンジニアリングされたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを使用する形質移入実験を関連細胞系において実施することができ、タンパク質産生を形質移入後の種々の時点においてアッセイすることができる。例えば、異なるマイクロＲＮＡ結合部位エンジニアリングポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡにより細胞を形質移入することができ、関連タンパク質に対してＥＬＩＳＡキットを使用することにより、形質移入後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日目において産生されたタンパク質をアッセイする。製剤化されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの組織特異的発現の変化を試験するため、マイクロＲＮＡ結合部位エンジニアリング分子を使用するインビボ実験を実施することもできる。
ウイルス配列
追加のウイルス配列、例えば、限定されるものではないが、大麦縞萎縮ウイルス（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）の翻訳エンハンサー配列をエンジニアリングし、本発明の合成ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中に挿入することができ、インビトロおよびインビボで構築物の翻訳を刺激し得る。形質移入実験を関連細胞系において実施することができ、ＥＬＩＳＡによりタンパク質産生を形質移入後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日目においてアッセイすることができる。
５’キャッピング
本発明の合成ポリヌクレオチドは、５’キャッピング領域または５’キャップを含み得る。ｍＲＮＡの５’キャップ構造は核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を増加させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これはＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して細胞中のｍＲＮＡ安定性および翻訳適格性を担い、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。このキャップは、ｍＲＮＡスプライシングの間に５’近位のイントロンの除去をさらに支援する。
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端キャップして末端グアノシンキャップ残基およびｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチド間に５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸結合を生成することができる。次いで、この５’－グアニル酸キャップはメチル化してＮ７－メチル－グアニル酸残基を生成することができる。ｍＲＮＡの５’末端の末端および／または前末端転写ヌクレオチドのリボース糖を場合により２’－Ｏ－メチル化することもできる。グアニル酸キャップ構造の加水分解および開裂を介する５’デキャッピングは、分解のために核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を標的化し得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの修飾は、デキャッピングを妨害する非加水分解性のキャップ構造を生成し、したがってｍＲＮＡの半減期を増加させ得る。キャップ構造の加水分解が５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル結合の開裂を要求するため、キャッピング反応の間に修飾ヌクレオチドを使用することができる。例えば、５’－ｐｐｐ－５’キャップ中のホスホロチオエート結合を作出するためにニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（イプスウィッチ、マサチューセッツ）のワクシニアキャッピング酵素を製造業者の説明書に従ってα－チオ－グアノシンヌクレオチドとともに使用することができる。追加の修飾グアノシンヌクレオチド、例えば、α－メチル－ホスホン酸およびセレノ－リン酸ヌクレオチドを使用することができる。
追加の修飾としては、限定されるものではないが、糖環の２’－ヒドロキシル基上のｍＲＮＡの５’末端および／または５’前末端ヌクレオチド（上記のもの）のリボース糖の２’－Ｏ－メチル化が挙げられる。核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子の５’キャップを生成するため、複数の区別される５’－キャップ構造を使用することができる。
本明細書において合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも称されるキャップ類似体は、それらの化学構造の点で天然の（すなわち、内因性、野生型または生理学的）５’キャップとは異なる一方、キャップ機能は保持する。キャップ類似体は、化学的（すなわち、非酵素的）または酵素的に合成し、核酸分子に結合させることができる。
例えば、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸基により結合している２つのグアニンを含有し、一方のグアニンは、Ｎ７メチル基、ならびに３’－Ｏ－メチル基（すなわち、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン（ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ、これは同等に３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと命名することができる）を含有する。他方の未修飾グアニンの３’－Ｏ原子は、キャッピングされた核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに結合される。Ｎ７－および３’－Ｏ－メチル化グアニンは、キャッピングされた核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の末端部分を提供する。
別の例示的キャップはｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡと同様であるが、グアノシン上に２’－Ｏ－メチル基（すなわち、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）を有する。
キャップ類似体がインビトロ転写反応において同時に起こる核酸分子のキャッピングを可能とする一方、転写物の最大２０％がキャッピングされないままである。このことおよび内因性細胞転写機構により産生される核酸の内因性５’－キャップ構造とのキャップ類似体の構造差は、翻訳適格性の低減および細胞安定性の低減をもたらし得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡは、より真正の５’－キャップ構造を生成するために酵素を使用して転写後にキャップすることもできる。本明細書において使用される場合、語句「より真正の」は、構造的または機能的のいずれかで内因性または野生型特徴部に酷似し、またはそれを模倣する特徴部を指す。すなわち、「より真正の」特徴部は、先行技術の合成特徴部もしくは類似体などと比較して、内因性、野生型、天然もしくは生理学的細胞機能および／もしくは構造をより良好に表し、またはこれは、対応する内因性、野生型、天然または生理学的特徴部より１つ以上の点で優れている。本発明のより真正の５’キャップ構造の非限定的な例は、当分野において公知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然または生理学的５’キャップ構造）と比較して、とりわけ、向上したキャップ結合タンパク質の結合、増加した半減期、低減した５’エンドヌクレアーゼに対する感受性および／または低減した５’デキャッピングを有するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドおよびグアニンキャップヌクレオチド間に基準の５’－５’－三リン酸結合を作出し得、キャップグアニンはＮ７メチル化を含有し、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチルを含有する。このような構造は、キャップ１構造と称される。このキャップは、例えば、当分野において公知の他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳適格性および細胞安定性、ならびに低減した細胞炎症促進性サイトカインの活性化をもたらす。キャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮｐ（キャップ１）、および７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が挙げられる。
ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは転写後にキャップすることができ、このプロセスがより効率的であるため、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのほぼ１００％をキャップすることができる。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程でｍＲＮＡに結合される場合の約８０％とは対照的である。
本発明によれば、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明によれば、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体としては、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、および２－アジド－グアノシンが挙げられる。
ＩＲＥＳ配列
さらに、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有し得る合成ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡが提供される。最初に特徴的なピコルナウイルスＲＮＡとして同定されたＩＲＥＳは、５’キャップ構造の不存在下でタンパク質合成の開始における重要な役割を担う。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡの唯一のリボソーム結合部位として作用し得、または複数のリボソーム結合部位の１つとして機能し得る。２つ以上の機能的リボソーム結合部位を含有する合成ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、リボソームにより独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る（「ポリシストロン性核酸分子」）。ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡにＩＲＥＳが提供される場合、第２の翻訳可能領域がさらに場合により提供される。本発明により使用することができるＩＲＥＳ配列の例としては、限定されるものではないが、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）からのものが挙げられる。
終止コドン
一実施形態において、本発明の一次構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧから選択することができる。一実施形態において、本発明の一次構築物は、終止コドンＴＧＡおよび１つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態において、追加の終止コドンは、ＴＡＡであり得る。
別の実施形態において、本発明の一次構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）前に３つの終止コドンを含み得る。
シグナル配列
一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ポリペプチドの治療関連部位への輸送を容易にする追加の特徴部もコードし得る。タンパク質輸送を支援するそのような１つの特徴部は、シグナル配列である。本明細書において使用される場合、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、それぞれ、コード領域またはコードされるポリペプチドの５’（またはＮ末端）において取り込まれる、それぞれ、約９～２００ヌクレオチド長（３～６０アミノ酸長）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加は、１つ以上の分泌経路を通るコードされるポリペプチドの小胞体への輸送をもたらす。一部のシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによりタンパク質から開裂される。
シグナル配列は、以下の同時係属特許出願に列記されるもののいずれかから選択することができる：２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号明細書、表題、生物製剤の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）；２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号明細書、表題、生物製剤の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書、表題、生物製剤の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号明細書、表題、抗体の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号明細書、表題、抗体の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号明細書、表題、抗体の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号明細書、表題、ワクチンの産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）； ２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号明細書、表題、ワクチンの産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号明細書、表題、ワクチンの産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号明細書、表題、治療タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）；２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号明細書、表題、治療タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号明細書、治療タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号明細書、表題、分泌タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号明細書、表題、分泌タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号明細書、表題、分泌タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号明細書、表題、細胞膜タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号明細書、表題、細胞膜タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号明細書、表題、細胞膜タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号明細書、表題、細胞質および細胞骨格タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）； ２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号明細書、表題、細胞質および細胞骨格タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ
ａｎｄ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号明細書、表題、細胞質および細胞骨格タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号明細書、表題、細胞内膜結合タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｏｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年７月５日に出願された米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号明細書、表題、細胞内膜結合タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｏｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号明細書、表題、細胞内膜結合タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｏｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号明細書、表題、細胞内膜結合タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ
Ｂｏｕｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号明細書、表題、核タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号明細書、表題、核タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号明細書、表題、核タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号明細書、表題、タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号明細書、表題、タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号明細書、表題、タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ
Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）；２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）；２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特
許出願第６１／７３７，１９１号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）；２０１２年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）、２０１３年３月９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６２号明細書、表題、生物製剤およびヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）；２０１３年３月９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６３号明細書、表題、修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６４号明細書、表題、分泌タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１３年３月９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００５９号明細書、表題、膜タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１３年３月９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６６号明細書、表題、細胞質および細胞骨格タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１３年３月９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６７号明細書、表題、核タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１３年３月９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６０号明細書、表題、タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）；２０１３年３月９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６１号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）；２０１３年３月９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６８号明細書、表題、化粧タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）；および２０１３年３月９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００７０号明細書、表題、癌関連タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）；２０１３年３月１５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１８２１号明細書、表題、タンパク質のインビボ産生（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡによるコードのために取り込むことができるタンパク質シグナル配列としては、α－１－抗トリプシン、Ｇ－ＣＳＦ、第ＩＸ因子、プロラクチン、アルブミン、ＨＭＭＳＰ３８、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、シトクロムＣオキシダーゼサブユニット８Ａ、ＩＩＩ型、細菌、ウイルス、分泌シグナル、Ｖｒｇ－６、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＳＴＩ、ＳＴＩＩ、アミラーゼ、アルファ因子、エンドグルカナーゼＶ、分泌シグナル、真菌、フィブロネクチンおよびインターロイキン（例えば、ＩＬ１２）からのシグナル配列が挙げられる。
同時係属特許出願の表において、ＳＳは分泌シグナルであり、ＭＬＳはミトコンドリアリーダシグナルである。本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、シグナル配列またはその断片またはバリアントのいずれかをコードするように設計することができる。これらの配列は、ポリペプチドコード領域の開始点、中央部または末端において、あるいはフランキング領域中に含めることができる。
本発明において利用することができる追加のシグナル配列としては、例えば、データベースに教示のもの、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／またはｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／において見出されるものが挙げられる。米国特許第８，１２４，３７９号明細書；同第７，４１３，８７５号明細書および同第７，３８５，０３４号明細書に記載のものも本発明の範囲内であり、それぞれの内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
タンパク質開裂シグナルおよび部位
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのタンパク質開裂部位を含有する少なくとも１つのタンパク質開裂シグナルを含み得る。タンパク質開裂部位は、Ｎ末端およびＣ末端間の任意の空間において、例えば、限定されるものではないが、Ｎ末端およびＣ末端間の中間、Ｎ末端および中間点間、中間点およびＣ末端間、ならびにそれらの組合せにおいてＮ末端、Ｃ末端において局在させることができる。
本発明のポリペプチドは、限定されるものではないが、プロタンパク質コンバターゼ（またはプロホルモンコンバターゼ）、トロンビンまたは第Ｘａ因子タンパク質開裂シグナルを含み得る。プロタンパク質コンバターゼは、プロホルモンコンバターゼ１／３（ＰＣ１／３）、ＰＣ２、フーリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、対合塩基性アミノ酸開裂酵素４（ＰＡＣＥ４）およびＰＣ７として公知の酵母ケキシンに関する７つの塩基性アミノ酸特異的サブチリシン様セリンプロテイナーゼ、ならびにサブチリシンケキシンアイソザイム１（ＳＫＩ－１）およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）と呼ばれる非塩基性残基において開裂する他の２つのサブチラーゼを含む９つのプロテイナーゼのファミリーである。
一実施形態において、本発明の一次構築物およびｍｍＲＮＡは、一次構築物またはｍｍＲＮＡが少なくとも１つのコードされるタンパク質開裂シグナルを含有するようにエンジニアリングすることができる。コードされるタンパク質開裂シグナルは、開始コドンの前、開始コドンの後、コード領域の前、コード領域内に局在させることができ、例えば、限定されるものではないが、コード領域中の中間、開始コドンおよび中間点間、中間点および終止コドン間、コード領域の後、終止コドンの前、２つの終止コドンの間、終止コドンの後、ならびにそれらの組合せである。
一実施形態において、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのタンパク質開裂部位を含有する少なくとも１つのコードされるタンパク質開裂シグナルを含み得る。コードされるタンパク質開裂シグナルとしては、限定されるものではないが、プロタンパク質コンバターゼ（もしくはプロホルモンコンバターゼ）、トロンビンおよび／または第Ｘａ因子タンパク質開裂シグナルを挙げることができる。当業者は、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡ中に含めるための適切なコードされるタンパク質開裂シグナルを決定するために以下の表１または他の公知の方法を使用することができる。例えば、シグナル配列から出発し、表１のコドンを考慮して、得られるポリペプチド中でタンパク質シグナルを産生し得る一次構築物についてのシグナルを設計することができる。
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのタンパク質開裂シグナルおよび／または部位を含む。
非限定的な例として、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３７４，９３０号明細書および米国特許出願公開第２００９０２２７６６０号明細書は、フーリン開裂部位を使用して発現産物中のＧＬＰ－１のＮ末端メチオニンをその細胞のゴルジ装置から開裂する。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのタンパク質開裂シグナルおよび／または部位を含むが、但し、ポリペプチドがＧＬＰ－１でないことを条件とする。
一実施形態において、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのコードされるタンパク質開裂シグナルおよび／または部位を含む。
一実施形態において、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのコードされるタンパク質開裂シグナルおよび／または部位を含むが、但し、一次構築物もｍｍＲＮＡもＧＬＰ－１をコードしないことを条件とする。
一実施形態において、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、２つ以上のコード領域を含み得る。複数のコード領域が本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡ中に存在する場合、複数のコード領域は、コードされるタンパク質開裂部位により分離することができる。非限定的な例として、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、順序付けられたパターンで書き込むことができる。このようなパターンは、ＡＸＢＹ形態に従い、式中、ＡおよびＢは、同一もしくは異なるコード領域であり得、および／または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコード領域であり、ＸおよびＹは、同一もしくは異なるタンパク質開裂シグナルをコードし得るコードされるタンパク質開裂シグナルである。第２のこのようなパターンは、ＡＸＹＢＺ形態に従い、式中、ＡおよびＢは、同一もしくは異なるコード領域であり得、および／または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコード領域であり、Ｘ、Ｙ、およびＺは、同一もしくは異なるタンパク質開裂シグナルをコードし得るコードされるタンパク質開裂シグナルである。第３のパターンは、ＡＢＸＣＹ形態に従い、式中、Ａ、ＢおよびＣは、同一もしくは異なるコード領域であり得、および／または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコード領域であり、ＸおよびＹは、同一もしくは異なるタンパク質開裂シグナルをコードし得るコードされるタンパク質開裂シグナルである。
一実施形態において、ポリペプチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡは、ポリペプチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡをタンパク質開裂部位に特異的プロテアーゼによる処理により担体領域または融合相手から放出することができるように、前記タンパク質開裂部位をコードする配列も含有し得る。
ポリＡテール
本発明の合成ポリヌクレオチドは、典型的には、３’テーリング配列、例えば、ポリＡテールを含む。ＲＮＡプロセシングの間、長いアデニンヌクレオチド鎖（ポリＡテール）は、安定性を増加させるためにポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ分子に付加することができる。転写直後、転写物の３’末端が開裂されて３’ヒドロキシルを遊離させ得る。次いで、ポリＡポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、１００から２５０残基長であり得るポリＡテールを付加する。
ユニークなポリＡテール長が、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡにある利点を提供することが発見されている。
一般に、本発明のポリＡテールの長さは、３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態において、ポリＡテールは、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００ヌクレオチド長であり、またはそれらを超える）。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、約３０～約３，０００個のヌクレオチド（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５００～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，０００、２，０００～２，５００、および２，５００～３，０００個）を含む。
一実施形態において、ポリＡテールは、全体のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの長さに対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴部もしくは領域（例えば、第１またはフランキング領域）の長さに基づき得るか、またはポリヌクレオチド、一次構築物もしくはｍｍＲＮＡから発現される最終産物の長さに基づき得る。
これに関して、ポリＡテールは、ポリヌクレオチド、一次構築物もしくはｍｍＲＮＡまたはそれらの特徴部より１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長い長さであり得る。ポリＡテールは、それが属するポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの一部として設計することもできる。これに関して、ポリＡテールは、構築物の全長または構築物の全長からポリＡテールを差し引いた長さの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％またはそれより長いものであり得る。さらに、結合部位のエンジニアリングおよびポリＡ結合タンパク質のためのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのコンジュゲーションは、発現を向上させ得る。
さらに、複数の区別されるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ポリＡテールの３’末端において修飾されたヌクレオチドを使用して３’末端を介してＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）に一緒に結合させることができる。形質移入実験を関連細胞系において実施することができ、ＥＬＩＳＡによりタンパク質産生を形質移入後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日目の時点においてアッセイすることができる。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド一次構築物は、ポリＡ～Ｇカルテットを含むように設計される。Ｇカルテットは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方においてＧリッチ配列により形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態において、Ｇカルテットは、ポリＡテールの終端において取り込まれる。得られるｍｍＲＮＡ構築物は、安定性、タンパク質産生および他のパラメータ、例として種々の時点における半減期についてアッセイされる。ポリＡ～Ｇカルテットは、１２０個のヌクレオチドのポリＡテールを単独で使用して見られるタンパク質産生の少なくとも７５％と同等のタンパク質産生をもたらすことが発見されている。
ＩＩ．合成小分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）
本発明はまた、合成小分子ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを含む。合成ｓｇＲＮＡは、目的遺伝子、例えば、転写のモジュレーションが望まれる遺伝子を標的化する。合成ｓｇＲＮＡは、典型的には、転写開始部位上流の目的遺伝子の５’ＵＴＲの一方の鎖に相補的な２０～２５ヌクレオチド長の配列を含む。合成ｓｇＲＮＡは、ガイド足場配列も含む。典型的なガイド足場配列は、以下のとおりである。
Figure 0007225456000001
ｓｇＲＮＡ設計の説明は、例えば、マリ（Ｍａｌｉ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１３年、第３３９巻：ｐ．８２３～８２６において見出すことができる。
ｓｇＲＮＡ配列の例は、以下の表に見出すことができる。
目的遺伝子
ｓｇＲＮＡは、目的遺伝子を標的化し、合成ポリヌクレオチドによりコードされるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を目的遺伝子と相互作用するように指向する。目的遺伝子は、適用に応じて選択される。目的遺伝子の例としては、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、および／またはアポトーシス遺伝子もしくは老化遺伝子が挙げられる。
ＩＩＩ．合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの設計および合成
本発明の合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡは、任意の利用可能な技術、例として、限定されるものではないが、化学的合成；一般にインビトロ転写（ＩＶＴ）と称される酵素的合成；またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的開裂などにより調製することができる。ＲＮＡを合成する方法は、当分野において公知である（例えば、ゲイト，Ｍ．Ｊ．（Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．）編、「オリゴヌクレオチド合成：実践アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）」、オックスフォード［オックスフォードシャー］、ワシントンＤＣ：ＩＲＬプレス、１９８４年；およびヘルデウィジン，Ｐ．（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．）編、「オリゴヌクレオチド合成：方法および応用（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｖ．２８８（クリフトン、ジュージャージ）、トトワ、ニュージャージ、ヒュマーナプレス、２００５年参照；これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明の一次構築物、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドまたは合成ｓｇＲＮＡを設計および合成する方法は、一般に、遺伝子構築、合成ｍＲＮＡ産生（修飾の有無を問わず）および精製のステップを含む。酵素的合成法において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列またはｓｇＲＮＡをベクター中への取り込みのために最初に選択し、それを増幅させてｃＤＮＡテンプレートを産生する。場合により、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ポリヌクレオチド配列および／または任意のフランキング配列をコドン最適化することができる。次いで、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介してｍＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを産生するためにｃＤＮＡテンプレートを使用する。産生後、ｍＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、精製およびクリーンアッププロセスを受け得る。これらのステップは以下により詳細に提供される。
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドの遺伝子構築
遺伝子構築のステップは、限定されるものではないが、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミド線形化およびクリーンアップ、ならびにｃＤＮＡテンプレート合成およびクリーンアップを含み得る。
目的ポリペプチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、ｄＣＡＳ９またはｄＣＡＳ９エフェクタードメイン融合タンパク質を産生のために選択したら、一次構築物を設計する。一次構築物内で、選択された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）転写物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を使用して目的ポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第１の領域を構築することができる。ＯＲＦは、野生型ＯＲＦ、そのアイソフォーム、バリアントまたは断片を含み得る。本明細書において使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、目的ポリペプチドをコードし得る核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指すことを意味する。ＯＲＦは、開始コドンＡＴＧで始まり、ナンセンスまたは終止コドンもしくはシグナルで終わることが多い。
さらに、第１の領域のヌクレオチド配列は、コドン最適化することができる。コドン最適化法は、当分野において公知であり、いくつかの目的の１つ以上を達成するための試みにおいて有用であり得る。これらの目的としては、標的および宿主生物におけるコドン頻度を一致させて適切な折り畳みを確保すること、ＧＣ含量をバイアスしてｍＲＮＡの安定性を増加させ、もしくは二次構造を低減させること、遺伝子構築または発現を損傷し得るタンデムリピートコドンもしくは塩基ランを最小化すること、転写および翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去すること、コードされるタンパク質中の翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去またはシャッフルすること、制限部位を挿入し、もしくは欠失させること、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、翻訳速度を調整してタンパク質の種々のドメインの適切な折り畳みを可能にすること、またはｍＲＮＡ内の問題の二次構造を低減させ、もしくは排除することが挙げられる。コドン最適化ツール、アルゴリズムおよびサービスは、当分野において公知であり、非限定的な例としては、ジーンアート（ＧｅｎｅＡｒｔ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））および／またはＤＮＡ２．０（メンロパーク、カルフォルニア）からのサービスが挙げられる。一実施形態において、ＯＲＦ配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。それぞれのアミノ酸についてのコドンオプションが表１に挙げられる。
表１．コドンオプション
Figure 0007225456000002
配列がコドン最適化された後、制限部位を含有する領域についてそれをさらに評価することができる。制限部位領域内の少なくとも１つのヌクレオチドは、別のヌクレオチドにより置き換えて配列から制限部位を除去することができるが、ヌクレオチドの置き換えは、コドン最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を変更する。
一部の実施形態において、本明細書により詳細に記載されるとおり、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲはフランキング領域として提供することができる。複数の５’または３’ＵＴＲをフランキング領域中に含めることができ、同一または異なる配列であり得る。フランキング領域の任意の部分（ない場合を含む）をコドン最適化することができ、それらのいずれも、独立して、コドン最適化の前および／または後に１つ以上の異なる構造的または化学的修飾を含有し得る。特徴部の組合せは、第１および第２のフランキング領域中に含めることができ、他の特徴部内に含有させることができる。例えば、ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５’ＵＴＲおよび／またはポリＡテールのテンプレート付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲによりフランキングすることができる。
最適化後（所望の場合）、一次構築物構成要素は、ベクター、例えば、限定されるものではないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体中に再構築および形質転換することができる。例えば、最適化された構築物は、化学コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、アカパンカビ、トウモロコシ、ショウジョウバエ中などに再構築および形質転換することができ、高コピー数のプラスミド様または染色体構造は、本明細書に記載の方法により生じる。
ベクター増幅
次いで、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドまたはｓｇＲＮＡをコードする一次構築物を含有するベクターを増幅させ、当分野において公知の方法、例えば、限定されるものではないが、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ハイピュア・マキシプレップキット（ＨｉＰｕｒｅ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア）を使用するマキシプレップを使用してプラスミドを単離および精製する。
プラスミド線形化
次いで、当分野において公知の方法、例えば、限定されるものではないが、制限酵素および緩衝液の使用を使用してプラスミドを線形化することができる。線形化反応物は、例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア）、ならびにＨＰＬＣベース精製法、例えば、限定されるものではないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、ならびにインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲキット（ＰＣＲ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア）を含む方法を使用して精製することができる。精製法は、実施された線形化反応物のサイズに応じて改変することができる。次いで、線形化されたプラスミドは、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応のためのｃＤＮＡを生成するために使用する。
ｃＤＮＡテンプレート合成
ｃＤＮＡテンプレートは、線形化されたプラスミドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供することにより合成することができる。２０１３年３月９日に出願された米国特許出願第１３／７９１，９２２号明細書の表４は、本発明のＰＣＲ反応において有用であり得るプライマーおよびプローブの一覧を提供する。この一覧が網羅的ではなく、任意の増幅のためのプライマー－プローブ設計が当分野の技術の範囲内であることを理解されたい。プローブは、標的分子に対する塩基対合フィデリティおよび塩基対合強度を増加させるための化学修飾塩基も含有し得る。
一実施形態において、転写前にｃＤＮＡを配列決定分析に供することができる。
ｍＲＮＡ産生
合成ポリヌクレオチドまたはｓｇＲＮＡ産生のプロセスとしては、限定されるものではないが、インビトロ転写、ｃＤＮＡテンプレート除去およびＲＮＡクリーンアップ、ならびにＲＮＡキャッピング領域および／またはテーリング反応を挙げることができる。あるいは、合成ポリヌクレオチドまたはｓｇＲＮＡは、化学合成することができる。
インビトロ転写
先のステップにおいて産生されたｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）系を使用して転写させることができる。この系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮアーゼ阻害剤およびポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、インハウスで製造することができ、供給業者から選択することができ、または本明細書に記載のとおり合成することができる。ＮＴＰは、限定されるものではないが、本明細書に記載のもの、例として、天然および非天然（修飾）ＮＴＰから選択することができる。ポリメラーゼは、限定されるものではないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよび突然変異ポリメラーゼ、例えば、限定されるものではないが、修飾核酸を取り込み得るポリメラーゼから選択することができる。転写系中に無機ピロホスファターゼを含めることができる。
ＲＮＡポリメラーゼ
本発明の一次構築物の設計において、任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントを使用することができる。
ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入し、または欠失させることにより修飾することができる。非限定的な例として、ＲＮＡポリメラーゼは、未修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’－修飾ヌクレオチド三リン酸を取り込む能力の増加を示すように修飾することができる（国際公開第２００８０７８１８０号パンフレットおよび米国特許第８，１０１，３８５号明細書参照；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
バリアントは、ＲＮＡポリメラーゼを進化させ、ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸および／もしくは核酸配列を最適化し、ならびに／または当分野において公知の他の方法を使用することにより得ることができる。非限定的な例として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、エスベルト（Ｅｓｖｅｌｔ）ら（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１１年、第４７２巻（第７３４４号）、ｐ．４９９～５０３；参照により全体として本明細書に組み込まれる）により立案された連続指向進化系を使用して進化させることができ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、少なくとも１つの突然変異、例えば、限定されるものではないが、９３位におけるリジンがトレオニンと置換された突然変異（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１ＮまたはＬ８６４Ｆをコードし得る。別の非限定的な例として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１００１２００２４号明細書および同第２００７０１１７１１２号明細書に記載の突然変異を少なくともコードし得る。ＲＮＡポリメラーゼのバリアントとしては、限定されるものではないが、置換バリアント、保存アミノ酸置換、挿入バリアント、欠失バリアントおよび／または共有結合誘導体を挙げることもできる。
一実施形態において、一次構築物は、野生型またはバリアントＲＮＡポリメラーゼにより認識されるように設計することができる。そうすることにより、一次構築物は、野生型または親一次構築物からの配列変化の部位または領域を含有するように改変することができる。
一実施形態において、一次構築物は、５’ＵＴＲ内、５’ＵＴＲの前および／または５’ＵＴＲの後に、少なくとも１つの置換および／または挿入を、一次構築物のＲＮＡポリメラーゼ結合または認識部位の上流、ＲＮＡポリメラーゼ結合または認識部位の下流、ＴＡＴＡボックス配列の上流、ＴＡＴＡボックス配列の下流であるが、一次構築物のコード領域の上流に含むように設計することができる。
一実施形態において、一次構築物の５’ＵＴＲは、同一の塩基のヌクレオチドの少なくとも１つの領域および／またはストリングの挿入により置き換えることができる。ヌクレオチドの領域および／またはストリングは、限定されるものではないが、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８つのヌクレオチドを含み得、このヌクレオチドは天然および／または非天然であり得る。非限定的な例として、このヌクレオチドの群は、５～８つのアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのいずれかのストリングおよび／またはそれらの組合せを含み得る。
一実施形態において、一次構築物の５’ＵＴＲは、２つの異なる塩基のヌクレオチド、例えば、限定されるものではないが、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのいずれか、および／またはそれらの組合せの少なくとも２つの領域および／またはストリングの挿入により置き換えることができる。例えば、５’ＵＴＲは、５～８つのアデニン塩基を挿入し、次いで５～８つのシトシン塩基を挿入することにより置き換えることができ。別の例において、５’ＵＴＲは、５～８つのシトシン塩基を挿入し、次いで５～８つのアデニン塩基を挿入することにより置き換えることができる。
一実施形態において、一次構築物は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識され得る転写開始部位の下流に少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。非限定的な例として、少なくとも１つの置換および／または挿入は、転写開始部位のすぐ下流（例えば、限定されるものではないが、＋１～＋６）の領域中の少なくとも１つの核酸を置換することにより転写開始部位の下流で生じ得る。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチドの領域を変化させることにより、開始速度に影響を及ぼし、見かけのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）反応一定値を増加させ、初期転写をキュアして転写複合体からの短い転写物の解離を増加させることができる（ブリエバ（Ｂｒｉｅｂａ）ら著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００２年、第４１巻、ｐ．５１４４～５１４９；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。少なくとも１つの核酸の修飾、置換および／または挿入は、核酸配列のサイレント突然変異を引き起こし得、またはアミノ酸配列中の突然変異を引き起こし得る。
一実施形態において、一次構築物は、転写開始部位の下流で、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２または少なくとも１３個のグアニン塩基の置換を含み得る。
一実施形態において、一次構築物は、転写開始部位のすぐ下流の領域中で、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６つのグアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例として、その領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡ（配列番号１２７）である場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４つのアデニンヌクレオチドにより置換することができる。別の非限定的な例において、その領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡ（配列番号１２７）である場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４つのシトシン塩基により置換することができる。別の非限定的な例において、その領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡ（配列番号１２７）である場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３もしくは少なくとも４つのチミン、および／または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかにより置換することができる。
一実施形態において、一次構築物は、開始コドンの上流に少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。明確性の目的のため、当業者は、開始コドンがタンパク質コード領域の第１のコドンである一方、転写開始部位が転写が始まる部位であることを認識する。一次構築物は、限定されるものではないが、ヌクレオチド塩基の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７もしくは少なくとも８つの置換および／または挿入を含み得る。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流の１つ、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４もしくは少なくとも５つの位置に挿入または置換することができる。挿入および／または置換されるヌクレオチドは、同一の塩基（例えば、全てＡまたは全てＣまたは全てＴまたは全てＧ）、２つの異なる塩基（例えば、ＡおよびＣ、ＡおよびＴ、またはＣおよびＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、ＣおよびＴ、またはＡ、ＣおよびＴ）または少なくとも４つの異なる塩基であり得る。非限定的な例として、一次構築物中のコード領域の上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかにより置換することができる。別の非限定的な例において、一次構築物中のグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流であり、開始コドンの前の領域中に１つのグアニン塩基を残すように設計することができる（エスベルト（Ｅｓｖｅｌｔ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１１年、第４７２巻（第７３４４号）、ｐ．４９９～５０３参照；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、転写開始部位の下流であるが開始コドンの上流の１つの位置に少なくとも５つのヌクレオチドを挿入することができ、少なくとも５つのヌクレオチドは同一の塩基型であり得る。
ｃＤＮＡテンプレート除去およびクリーンアップ
ｃＤＮＡテンプレートは、当分野において公知の方法、例えば、限定されるものではないが、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮアーゼＩ）による処理を使用して除去することができる。ＲＮＡクリーンアップとしては、精製法、例えば、限定されるものではないが、ベックマン・コールタ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）（ダンバース、マサチューセッツ）からのアジェンコート（ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ）（登録商標）ＣＬＥＡＮＳＥＱ（登録商標）システム；ＨＰＬＣベース精製法、例えば、限定されるものではないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）を挙げることもできる。
キャッピングおよび／またはテーリング反応
一次構築物またはｍｍＲＮＡは、キャッピングおよび／またはテーリング反応に供することもできる。キャッピング反応は、５’キャップを一次構築物の５’末端に付加する当分野において公知の方法により実施することができる。キャッピングのための方法としては、限定されるものではないが、ワクシニアキャッピング酵素（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、イプスウィッチ、マサチューセッツ）の使用が挙げられる。
ポリＡテーリング反応は、当分野において公知の方法、例えば、限定されるものではないが、２’Ｏ－メチルトランスフェラーゼおよび本明細書に記載の方法により実施することができる。ｃＤＮＡから生成された一次構築物がポリＴを含まない場合、一次構築物をクリーニングする前にポリＡテーリング反応を実施することは有益であり得る。
キャッピング反応に供する試料は、０から１００％の範囲の変動量の５’キャップ構造を有し得る。一部の実施形態において、試料は、０、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％の５’キャップＲＮＡを含む。
合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡ精製
合成ポリヌクレオチドまたはｓｇＲＮＡの精製としては、限定されるものではないが、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡクリーンアップ、品質保証および品質管理を挙げることができる。ＲＮＡクリーンアップは、当分野において公知の方法、例えば、限定されるものではないが、アジェンコート（ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ）（登録商標）ビーズ（ベックマン・コールタ・ゲノミクス（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ダンバース、マサチューセッツ）；ポリＴビーズ；ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（エキシクオン（ＥＸＩＱＯＮ）（登録商標）社、ベスベック（Ｖｅｄｂａｅｋ）、デンマーク）；ＨＰＬＣベース精製法、例えば、限定されるものではないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）またはＲＮＡアーゼＩＩＩ処理（ＲＮＡアーゼＩＩＩによるｍＲＮＡの処理の非限定的な例は、メイス（Ｍｅｉｓ）ら、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３１０２２０３号パンフレットにより記載されている）により実施することができる。用語「精製された」、例えば、「精製されたＲＮＡ」は、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、少なくとも１つの汚染物質から分離されるものを指す。本明細書において使用される場合、「汚染物質」は、別の物質を不適切、不純または劣性にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、天然に見出される形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製法に供する前に存在した形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境において存在する。
品質保証および／または品質管理検査は、限定されるものではないが、ゲル電気泳動、紫外線吸収、または分析的ＨＰＬＣなどの方法を使用して実施することができる。
別の実施形態において、ＲＮＡは、限定されるものではないが、逆転写酵素ＰＣＲなどの方法を使用して配列決定することができる。
一実施形態において、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、限定されるものではないが、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を使用して定量することができる。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（登録商標）分光計（サーモフィッシャ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ）である。定量されたｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、そのｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡが適切なサイズであり得るか否かを決定し、ｍＲＮＡもｍｍＲＮＡも分解が生じていないことを確認するために分析することができる。ｍＲＮＡおよび／またはｍｍＲＮＡの分解は、限定されるものではないが、アガロースゲル電気泳動；ＨＰＬＣベース精製法、例えば、限定されるものではないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）ならびにキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法を使用して確認することができる。
ＩＶ．修飾合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡ
本発明の合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡは、典型的には修飾されている。本明細書において、ポリヌクレオチド（例えば、合成ポリヌクレオチドまたはｓｇＲＮＡ）において、用語「修飾」または適宜「修飾されている」は、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣリボヌクレオチドに関する修飾を指す。一般に、本明細書において、これらの用語は、天然存在５’末端ｍＲＮＡキャップ部分中のリボヌクレオチド修飾を指すものではない。修飾の例は、例えば、内容が全ての目的のために参照により組み込まれる２０１２年１０月３日に出願された米国特許出願第１３／６４４，０７２号明細書（米国特許出願公開第２０１３０１１５２７２号明細書として公開）に見出すことができる。
修飾は、種々の区別される修飾であり得る。一部の実施形態において、コード領域、フランキング領域および／または末端領域は、１、２、または２つより多い（場合により異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有し得る。一部の実施形態において、細胞に導入された修飾ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、未修飾ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと比較して低減した細胞中の分解を示し得る。
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合（例えば、結合リン酸／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格）などに対する任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、場合により置換されているアミノ、場合により置換されているチオール、場合により置換されているアルキル（例えば、メチルまたはエチル）、またはハロ（例えば、クロロまたはフルオロ）と置き換え、またはそれらにより置換することができる。ある実施形態において、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖およびヌクレオシド間結合のそれぞれにおいて存在する。本発明による修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはそれらのハイブリッド）に対するリボ核酸（ＲＮＡ）の修飾であり得る。追加の修飾が本明細書に記載される。
本明細書に記載のとおり、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。誘導される自然免疫応答の特徴としては、１）炎症促進性サイトカインの発現の増加、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５などの活性化、および／または３）タンパク質翻訳の終結もしくは低減が挙げられる。
ある実施形態において、細胞に導入された修飾核酸分子を細胞内で分解することが望ましいこともある。例えば、修飾核酸分子の分解は、タンパク質産生の正確なタイミングが望まれる場合に好ましいこともある。したがって、一部の実施形態において、本発明は、指向された様式で細胞内で作用され得る、分解ドメインを含有する修飾核酸分子を提供する。
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、他の薬剤（例えば、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなど）を場合により含み得る。
一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、任意の塩基、糖、骨格、ビルディングブロックまたは他の構造または式、例として、限定されるものではないが、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１２年１０月３日に出願された国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット、表題、修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸、ならびにそれらの使用（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ａｎｄ
Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）に記載の式ＩからＩＸまたはそれらの任意の下位構造のものを有するｎ数の結合ヌクレオシドを含む。このような構造は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する修飾、またはそれらの組合せを含む。
化学修飾の組合せとしては、限定されるものではないが、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１２年１０月３日に出願された国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット、表題、修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸、ならびにそれらの使用（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）に記載のものに教示されるものが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの合成は、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１２年１０月３日に出願された国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット、表題、修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸、ならびにそれらの使用（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）に記載の方法に従い得る。
一部の実施形態において、シトシン、グアニン、アデニン、およびウラシルからなる群から選択される核酸塩基。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、シュードウリジン（ψ）、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば、５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン、５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有するもの）、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン（ｍ３ψ）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン（ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、および５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンが挙げられる。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、５－アザ－シチジン、６－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４－アセチル－シチジン（ａｃ４Ｃ）、５－ホルミル－シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４－メチル－シチジン（ｍ４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例えば、５－ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α－チオ－シチジン、２’－Ｏ－メチル－シチジン（Ｃｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチル－シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチル－シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチル－シチジン（ｍ４ ２Ｃｍ）、１－チオ－シチジン、２’－Ｆ－アラ－シチジン、２’－Ｆ－シチジン、および２’－ＯＨ－アラ－シチジンが挙げられる。
例示的な実施形態において、修飾核酸塩基は、シュードウリジン（ψ）および１－メチルシュードウリジンから選択される修飾ウラシルである。一部の実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルと修飾シトシン、例えば、５－メチルシトシンとの組合せである。
一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、場合により５－メチルシトシンとの組合せのシュードウリジン（ψ）により完全に修飾されている。一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、場合により５－メチルシトシンとの組合せの１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）により完全に修飾されている。
一部の実施形態において、ｍＲＮＡ分子は、コドン最適化されている。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、２－アミノ－プリン、２、６－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロ－プリン（例えば、２－アミノ－６－クロロ－プリン）、６－ハロ－プリン（例えば、６－クロロ－プリン）、２－アミノ－６－メチル－プリン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン（ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイル－アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデノシン（ｍ６ ２Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６－アセチル－アデノシン（ａｃ６Ａ）、７－メチル－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、α－チオ－アデノシン、２’－Ｏ－メチル－アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチル－アデノシン（ｍ６ ２Ａｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２－アミノ－Ｎ６－メチル－プリン、１－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、２’－Ｆ－アラ－アデノシン、２’－Ｆ－アデノシン、２’－ＯＨ－アラ－アデノシン、およびＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）－アデノシンが挙げられる。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４－デメチル－ワイオシン（ｉｍＧ－１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、未修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７－デアザ－グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル－クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル－クエオシン（ｍａｎＱ）、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチル－イノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチル－グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－グアノシン（ｍ２ ２Ｇ）、Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、α－チオ－グアノシン、２’－Ｏ－メチル－グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２ ２Ｇｍ）、１－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’－Ｏ－メチル－イノシン（Ｉｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチル－イノシン（ｍ１Ｉｍ）、および２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸）（Ｇｒ（ｐ））が挙げられる。
ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジン類似体から独立して選択することができる。例えば、核酸塩基はそれぞれ、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはヒポキサンチンから独立して選択することができる。別の実施形態において、核酸塩基としては、例えば、塩基の天然存在および合成誘導体、例として、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ（例えば、８－ブロモ）、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、デアザグアニン、７－デアザグアニン、３－デアザグアニン、デアザアデニン、７－デアザアデニン、３－デアザアデニン、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５－ａ］１，３，５トリアジノン、９－デアザプリン、イミダゾ［４，５－ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン、ピラジン－２－オン、１，２，４－トリアジン、ピリダジン；および１，３，５トリアジンを挙げることもできる。ヌクレオチドがＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵの略語を使用して示される場合、それぞれの文字は代表的な塩基および／またはその誘導体を指し、例えば、Ａとしては、アデニン、またはアデニン類似体、例えば、７－デアザアデニンが挙げられる。
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、ビルディングブロック分子）は、それぞれが参照により全体として組み込まれる、オガタ（Ｏｇａｔａ）ら著、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、第７４巻、ｐ．２５８５～２５８８、２００９年；パーマル（Ｐｕｒｍａｌ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第２２巻（第１号）、ｐ．７２～７８、１９９４年；フクハラ（Ｆｕｋｕｈａｒａ）ら著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１巻（第４号）、ｐ．５６３～５６８、１９６２年；およびシュウ（Ｘｕ）ら著、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、第４８巻（第９号）、ｐ．１７２９～１７４０、１９９２年に記載の合成法に従って調製することができる。
本発明のポリペプチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、分子の全長に沿って均一に修飾されていてもされていなくてもよい。例えば、１つ以上または全てのタイプのヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくは全て）は、本発明のポリヌクレオチドまたはその所与の所定の配列領域（例えば、図１に表される配列領域の１つ以上）において均一に修飾されていてもされていなくてもよい。一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（またはその所与の配列領域）中の全てのヌクレオチドＸが修飾されており、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、または組合せＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣもしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであり得る。
異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、および／またはヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ中の種々の位置において存在し得る。当業者は、ヌクレオチド類似体または他の修飾がポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの機能が実質的に減少しないようにポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの任意の位置において局在し得ることを認識する。修飾は、５’または３’末端修飾でもあり得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量または１つ以上のタイプのヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、ＵもしくはＣのいずれか１つ以上のいずれかと関連したもの）または任意の中間の割合（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、および９５％～１００％）を含有し得る。
一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、修飾ピリミジン（例えば、修飾ウラシル／ウリジン／Ｕまたは修飾シトシン／シチジン／Ｃ）を含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子中のウラシルまたはウリジン（一般にＵ）は、約１％～約１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、および９５％～１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン）により置き換えることができる。修飾ウラシルまたはウリジンは、単一のユニーク構造を有する化合物または異なる構造（例えば、本明細書に記載の２、３、４つまたはそれより多いユニーク構造）を有する複数の化合物により置き換えることができる。
一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子中のシトシンまたはシチジン（一般にＣ）は、約１％～約１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、および９５％～１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン）により置き換えることができる。修飾シトシンまたはシチジンは、単一のユニーク構造を有する化合物または異なる構造（例えば、本明細書に記載の２、３、４つまたはそれより多いユニーク構造）を有する複数の化合物により置き換えることができる。
一部の実施形態において、シトシンの少なくとも２５％は、式（ｂ１０）～（ｂ１４）の化合物により置き換えられる（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
一部の実施形態において、ウラシルの少なくとも２５％は、式（ｂ１）～（ｂ９）の化合物により置き換えられる（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
一部の実施形態において、シトシンの少なくとも２５％は、式（ｂ１０）～（ｂ１４）に化合物により置き換えられ、ウラシルの少なくとも２５％は、式（ｂ１）～（ｂ９）の化合物により置き換えられる（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
一実施形態において、合成ポリヌクレオチドおよび／またはｓｇＲＮＡは、末端修飾を含む。末端修飾は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１２年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／７２９，９３３号明細書、表題、末端最適化ＲＮＡ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＲＮＡｓ）；２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，２２４号明細書、表題、末端最適化ＲＮＡ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＲＮＡｓ）；２０１３年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８，９２１号明細書、表題、ＲＮＡ構築物を使用する分別標的化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）；２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８１，１３９号明細書、表題、ＲＮＡ構築物を使用する分別標的化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）；２０１３年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／８２９，３５９号明細書、表題、ＲＮＡ構築物を使用する分別標的化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）；２０１３年６月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３９，９０３号明細書、表題、ＲＮＡ構築物を使用する分別標的化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）；２０１３年７月３日に出願された米国仮特許出願第６１／８４２，７０９号明細書、表題、ＲＮＡ構築物を使用する分別標的化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）に記載の修飾であり得る。
別の実施形態において、化学修飾は、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレットに記載の修飾であり得る。
Ｖ．医薬組成物：製剤化、投与、送達および投薬
一実施形態において、本発明は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤との組合せの合成ポリヌクレオチドおよび／またはｓｇＲＮＡ組成物および複合体を含む。医薬組成物は、場合により、１つ以上の追加の活性物質、例えば、治療的および／または予防的に活性な物質を含み得る。医薬剤の製剤化および／または製造における一般の考慮事項は、例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著、「製薬の科学および実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、リッペンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ
＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
合成ポリヌクレオチドおよび／または合成ｓｇＲＮＡ
一実施形態において、合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡが製剤化される。非限定的な例として、合成ポリヌクレオチドおよび／または合成ｓｇＲＮＡは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１４日に出願された国際公開第２０１３０９０６４８号パンフレットおよび／または同時係属米国仮特許出願第６１／８２１，４０６号明細書、表題、修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸組成物の製剤化および送達（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）、２０１３年５月９日に出願された米国仮特許出願第６１／８２１，４０６号明細書、表題、修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸組成物の製剤化および送達（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）および２０１３年６月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／８４０，５１０号明細書、表題、修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸組成物の製剤化および送達（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）に記載の方法により製剤化することができる。
本明細書に提供される医薬組成物の説明は、原則的にヒトへの投与に好適である医薬組成物を対象とするが、そのような組成物は一般に、任意の他の動物への、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者により理解される。組成物を種々の動物への投与に好適とするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の修飾は十分理解されており、獣医薬理学の専門家は、たとえ用いるとしても単なる通常の実験法を用いてそのような修飾を設計および／または実施することができる。医薬組成物の投与が企図される対象としては、限定されるものではないが、ヒトおよび／もしくは他の霊長類；哺乳動物、例として、商業関連の哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラット；ならびに／または鳥類、例として、商業関連の鳥類、例えば、家禽類、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウが挙げられる。
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において公知であり、または今後開発される任意の方法により調製することができる。一般に、このような調製法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と会合させ、次いで、必要および／または望ましい場合、生成物を所望の単回または複数回用量単位へと分割、成形、および／またはパッケージングするステップを含む。
本発明による医薬組成物は、バルクで、１つの単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として、調製し、パッケージングし、および／または販売することができる。本明細書において使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む、医薬組成物の個別的な量である。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投薬量および／またはそのような投薬量の好都合な分率、例えば、そのような投薬量の２分の１もしくは３分の１に等しい。
本発明による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象のアイデンティティ、サイズ、および／または状態に応じて変動し、組成物が投与されるべき経路に応じてさらに変動する。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
製剤化（配合）
本発明の合成ポリヌクレオチドおよび／または合成ｓｇＲＮＡは、：（１）安定性を増加させ；（２）細胞形質移入を増加させ；（３）（例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのデポー製剤からの）持続放出もしくは遅延放出を可能とし；（４）生体分布を変更し（例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを規定の組織または細胞型に標的化する）；（５）コードされるタンパク質の翻訳をインビボで増加させ；および／または（６）コードされるタンパク質の放出プロファイルをインビボで変更するために、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化することができる。慣習的な賦形剤、例えば、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤に加え、本発明の賦形剤は、限定されるものではないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア－シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡ（例えば、対象中への移植のために）で形質移入された細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子ミミックおよびそれらの組合せを含み得る。したがって、本発明の製剤は、１つ以上の賦形剤を含み得、それぞれは一緒にポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡの安定性を増加させ、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによる細胞形質移入を増加させ、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現を増加させ、および／またはポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の放出プロファイルを変更する量である。さらに、本発明の一次構築物およびｍｍＲＮＡは、自己集合性核酸ナノ粒子を使用して製剤化することができる。
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において公知であり、または今後開発される任意の方法により調製することができる。一般に、このような調製法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と会合させるステップを含む。
本開示による医薬組成物は、バルクで、１つの単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として調製し、パッケージングし、および／または販売することができる。本明細書において使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別的な量を指す。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投薬量および／またはそのような投薬量の好都合な分率、例として、限定されるものではないが、そのような投薬量の２分の１もしくは３分の１に等しいことがある。
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、治療されている対象のアイデンティティ、サイズ、および／または状態に応じて変動し、組成物が投与されるべき経路に応じてさらに変動し得る。例えば、組成物は、０．１％～９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載の製剤は、少なくとも１つの合成ポリヌクレオチドを含有し得る。非限定的な例として、製剤は、１、２、３、４、または５つのｍｍＲＮＡを含有し得る。一実施形態において、製剤は、限定されるものではないが、ヒトタンパク質、動物タンパク質、細菌タンパク質、生体タンパク質、抗体、免疫原性タンパク質、治療ペプチドおよびタンパク質、分泌タンパク質、細胞膜タンパク質、細胞質および細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連するタンパク質および／または非ヒト疾患に関連するタンパク質などのカテゴリーから選択されるタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含有し得る。一実施形態において、製剤は、タンパク質をコードする少なくとも３つの修飾ｍＲＮＡを含有する。一実施形態において、製剤は、タンパク質をコードする少なくとも５つの修飾ｍＲＮＡを含有する。
医薬製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含み得、それとしては、本明細書において使用される場合、限定されるものではないが、所望される特定の投薬量に好適なありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤などが挙げられる。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤および組成物を調製するための技術は、当分野において公知である（レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著、「製薬の科学および実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）、リッペンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ボルティモア、メリーランド、２００６年参照；参照により全体が本明細書に組み込まれる）。本開示の範囲内で任意の慣用の賦形剤媒体の使用を企図することができ、但し、例えば、任意の不所望な生体影響をもたらし、またはそうでなければ医薬組成物の任意の他の構成要素と有害な様式で相互作用することにより任意の慣用の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と不適合性であり得る場合を除く。
一部の実施形態において、脂質ナノ粒子の粒子サイズは、増加および／または減少させることができる。粒子サイズの変化は、生体反応、例えば、限定されるものではないが、炎症に対抗する一助となることが可能であり得、または哺乳動物に送達される修飾ｍＲＮＡの生物学的効果を増加させ得る。
医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されるものではないが、不活性希釈剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、保存剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに／または油が挙げられる。このような賦形剤は、場合により本発明の医薬製剤中に含めることができる。
リピドイド
リピドイドの合成は詳細に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの送達に特に好適である（マホン（Ｍａｈｏｎ）ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．）、２０１０年、第２１巻、ｐ．１４４８～１４５４；シュローダ（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）ら著、ジャーナル・オブ・インターナル・メディシン（Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．）、２０１０年、第２６７巻、ｐ．９～２１；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１～５６９；ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４～１８６９；ジークワルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２９９６～３００１参照；これらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
齧歯類および非ヒト霊長類において二本鎖小分子干渉ＲＮＡが有効に送達するためにこれらのリピドイドが使用されている一方（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１～５６９；フランク－カメネトスキー（Ｆｒａｎｋ－Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２００８年、第１０５巻、ｐ．１１９１５～１１９２０；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２～８７９；ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４～１８６９；ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５～１０１０参照；これらの全ては全体として本明細書に組み込まれる）、本開示は、一本鎖ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの送達におけるそれらの製剤化および使用を記載する。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソームまたは粒子を調製することができ、したがって、局所および／または全身投与経路を介するリピドイド製剤の注射後に、コードされるタンパク質の産生により判断されるとおり、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの有効な送達をもたらすことができる。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのリピドイド複合体は、種々の手段、例として、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、または皮下経路により投与することができる。
核酸のインビボ送達は、多くのパラメータ、例として、限定されるものではないが、製剤組成、粒子ＰＥＧ化の性質、負荷の程度、オリゴヌクレオチドと脂質との比、および生物物理学的パラメータ、例えば、粒子サイズにより影響され得る（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２～８７９；参照により全体が本明細書に組み込まれる）。例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長の小さい変化が、インビボ効力に対する顕著な効果をもたらし得る。様々なリピドイド、例として、限定されるものではないが、ペンタ［３－（１－ラウリルアミノプロピオニル）］－トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ－５ＬＡＰ（別称９８Ｎ１２－５）、ムルガイア（Ｍｕｒｕｇａｉａｈ）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４０１巻、第６１号、２０１０年参照）、Ｃ１２－２００（誘導体およびバリアントを含む）、およびＭＤ１を有する製剤をインビボ活性について試験することができる。
本明細書において「９８Ｎ１２－５」と称されるリピドイドは、参照により全体として組み込まれる、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２～８７９により開示されている（図２参照）。
本明細書において「Ｃ１２－２００」と称されるリピドイドは、両方とも参照により全体として本明細書に組み込まれる、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４～１８６９（図２参照）ならびにリウ（Ｌｉｕ）およびフアン（Ｈｕａｎｇ）著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）、２０１０年、ｐ．６６９～６７０（図２参照）により開示されている。リピドイド製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに加え、３もしくは４つのいずれかまたはそれより多い構成要素を含む粒子を含み得る。例として、あるリピドイドを有する製剤は、限定されるものではないが、９８Ｎ１２－５を含み、４２％のリピドイド、４８％のコレステロール、および１０％のＰＥＧ（Ｃ１４アルキル鎖長）を含有し得る。別の例として、あるリピドイドを有する製剤は、限定されるものではないが、Ｃ１２－２００を含み、５０％のリピドイド、１０％のジステロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン、３８．５％のコレステロール、および１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧを含有し得る。
一実施形態において、全身静脈内投与のためにリピドイドとともに製剤化されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、肝臓を標的化し得る。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを使用し、４２％の９８Ｎ１２－５、４８％のコレステロール、および１０％のＰＥＧ－脂質の脂質モル組成を含み、約７．５～１の総脂質とポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡとの最終重量比、およびＰＥＧ脂質上のＣ１４アルキル鎖長を有し、概ね５０～６０ｎｍの平均粒子サイズを有する、最適化された最終静脈内製剤は、肝臓への９０％超の製剤の分布をもたらし得る（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２～８７９参照；全体として本明細書に組み込まれる）。別の例において、Ｃ１２－２００（それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書および公開された国際公開第２０１０１２９７０９号パンフレット参照）リピドイドを使用し、５０／１０／３８．５／１．５のＣ１２－２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧのモル比を有し得、７対１の総脂質とポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡとの重量比、および８０ｎｍの平均粒子サイズを有する静脈内製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを肝細胞に送達するために有効であり得る（参照により全体として本明細書に組み込まれる、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４～１８６９参照）。別の実施形態において、ＭＤ１リピドイド含有製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡをインビボで肝細胞に有効に送達するために使用することができる。筋肉内または皮下経路のために最適化されたリピドイド製剤の特徴は、標的細胞型および製剤が細胞外マトリックスを介して血流中に拡散する能力に応じて顕著に変動し得る。内皮窓のサイズに起因して、１５０ｎｍ未満の粒子サイズが有効な肝細胞送達のために所望され得る一方（参照により本明細書に組み込まれる、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２～８７９参照）、製剤を他の細胞型、例として、限定されるものではないが、内皮細胞、骨髄細胞、および筋肉細胞に送達するためのリピドイド製剤化ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの使用は、同様にサイズ制限されない場合がある。ｓｉＲＮＡをインビボで他の非肝細胞、例えば、骨髄細胞および内皮に送達するためのリピドイド製剤の使用が報告されている（参照により全体として本明細書に組み込まれる、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１～５６９；ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５～１０１０；チョウ（Ｃｈｏ）ら著、アドバンスド・ファンクショナル・マテリアルズ（Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．）、２００９年、第１９巻、ｐ．３１１２～３１１８；第８回国際ユダ・フォークマン・カンファレンス（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｕｄａｈ Ｆｏｌｋｍａｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）、ケンブリッジ、マサチューセッツ、１０月８～９日、２０１０年参照）。骨髄細胞、例えば、単球への有効な送達、リピドイド製剤は、類似の構成要素モル比を有し得る。リピドイドと、他の構成要素、例として、限定されるものではないが、ジステロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン、コレステロール、およびＰＥＧ－ＤＭＧとの異なる比は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの製剤を異なる細胞型、例として、限定されるものではないが、肝細胞、骨髄細胞、筋肉細胞などへの送達のために最適化するために使用することができる。例えば、構成要素モル比としては、限定されるものではないが、５０％のＣ１２－２００、１０％のジステロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン、３８．５％のコレステロール、および％１．５のＰＥＧ－ＤＭＧを挙げることができる（ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５～１０１０参照；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。皮下または筋肉内送達のいずれかを介する核酸の細胞（例えば、限定されるものではないが、脂肪細胞および筋肉細胞）への局所送達のためのリピドイド製剤の使用は、全身送達に所望される製剤構成要素の全てを必要とするわけではない場合があり、したがって、リピドイドおよびポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのみを含み得る。
リピドイドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによる細胞形質移入を増加させ；および／またはコードされるタンパク質の翻訳を増加させ得るため、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにより指向されるタンパク質産生の効力を改善するために異なるリピドイドの組合せを使用することができる（参照により全体として本明細書に組み込まれる、ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ．１６８８～１６９４参照）。
リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化することができる。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層から構成され得、栄養素および医薬製剤の投与のための送達ビヒクルとして使用することができる人工的に調製された小胞である。リポソームは、様々なサイズのもの、例えば、限定されるものではないが、直径数百ナノメートルであり得、狭い水性の区画により分離される一連の同心状二重層を含有し得る多層小胞（ＭＬＶ）、直径５０ｎｍより小さい場合がある小型単細胞小胞（ＳＵＶ）、および直径５０～５００ｎｍであり得る大型単層小胞（ＬＵＶ）であり得る。リポソーム設計としては、限定されるものではないが、非健常組織へのリポソームの付着を改善するため、またはイベント、例えば、限定されるものではないが、エンドサイトーシスを活性化するための、オプソニンまたはリガンドを挙げることができる。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために低ｐＨまたは高ｐＨを含有し得る。
リポソームの形成は、物理化学的特徴、例えば、限定されるものではないが、捕捉される医薬製剤およびリポソーム成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、捕捉される物質の有効濃度およびその潜在的な毒性、小胞の適用および／または送達の間に含まれる任意の追加のプロセス、意図される適用のための小胞の最適化サイズ、多分散性、および貯蔵寿命、ならびに安全で効率的なリポソーム生成物のバッチ間再現性および大規模産生の可能性に依存し得る。
一実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、限定されるものではないが、リポソーム、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ボセル、ワシントン）からのＤｉＬａ２リポソーム、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、およびＭＣ３（米国特許出願公開第２０１００３２４１２０号明細書；参照により全体として本明細書に組み込まれる）から形成されるもの、ならびに小分子薬物を送達し得るリポソーム、例えば、限定されるものではないが、ジャンセン・バイオテック社（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（ホーシャム、ペンシルベニア）からのＤＯＸＩＬ（登録商標）を含み得る。
一実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、限定されるものではないが、リポソーム、例えば、既に記載されており、インビトロおよびインビボでのオリゴヌクレオチド送達に好適であることが示されている安定化プラスミド－脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるものを含み得る（ホイーラ（Ｗｈｅｅｌｅｒ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９９年、第６巻、ｐ．２７１～２８１；チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９９年、第６巻、ｐ．１４３８～１４４７；ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）ら著、ファーマシューティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．）、２００５年、第２２巻、ｐ．３６２～３７２；モリセイ（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２巻、ｐ．１００２～１００７；ジマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００６年、第４４１巻、ｐ．１１１～１１４；ヘイエス（Ｈｅｙｅｓ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ．）、２００５年、第１０７巻、ｐ．２７６～２８７；センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、２０１０年、第２８巻、ｐ．１７２～１７６；ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．）、２００９年、第１１９巻、ｐ．６６１～６７３；ド・フジュロル（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５～１３２参照；これらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。ホイーラ（Ｗｈｅｅｌｅｒ）らによる元の製造法は、洗浄剤透析法であり、それは後にジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らにより改善され、自発的小胞形成法と称される。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに加え、３～４つの脂質構成要素から構成される。例としてリポソームは、限定されるものではないが、ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らにより記載されるとおり、５５％のコレステロール、２０％のジステロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン（ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ－Ｓ－ＤＳＧ、および１５％の１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有し得る。別の例として、あるリポソーム製剤は、ヘイエス（Ｈｅｙｅｓ）らにより記載されるとおり、限定されるものではないが、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、および３０％のカチオン性脂質を含有し得、このカチオン性脂質は、１，２－ジステアールオキシ（ｄｉｓｔｅａｒｌｏｘｙ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、または１，２－ジリノレニルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であり得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、官能性脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞中に製剤化することができる。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、脂質－ポリカチオン複合体中に製剤化することができる。脂質－ポリカチオン複合体の形成は、当分野において公知の方法により、および／または参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号明細書に記載のとおり達成することができる。非限定的な例として、ポリカチオンとしては、カチオン性ペプチドまたはポリペプチド、例えば、限定されるものではないが、ポリリジン、ポリオルニチンおよび／またはポリアルギニンを挙げることができる。別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、中性脂質、例えば、限定されるものではないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）をさらに含み得る、脂質－ポリカチオン複合体中に製剤化することができる。
リポソーム製剤は、限定されるものではないが、カチオン性脂質構成要素の選択、カチオン性脂質飽和の程度、ＰＥＧ化の性質、全ての構成要素の比、および生物物理学的パラメータ、例えば、サイズにより影響を受け得る。センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら（センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、２０１０年、第２８巻、ｐ．１７２～１７６）による一例において、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、および１．４％のＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡから構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成を変化させることにより、ｓｉＲＮＡを種々の抗原提示細胞により有効に送達することができた（バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ．２１８６～２２００；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態において、ＬＮＰ製剤の薬物動態および／または生体分布を変更するため、ＬＮＰ製剤中のＰＥＧの比は増加もしくは減少させることができ、および／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長はＣ１４からＣ１８に修飾することができる。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、およびコレステロールと比較して１～５％の脂質モル比のＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧを含有し得る。別の実施形態において、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧは、ＰＥＧ脂質、例えば、限定されるものではないが、ＰＥＧ－ＤＳＧ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）またはＰＥＧ－ＤＰＧ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）により置き換えることができる。カチオン性脂質は、当分野において公知の任意の脂質、例えば、限定されるものではないが、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、Ｃ１２－２００およびＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡから選択することができる。
一実施形態において、カチオン性脂質は、限定されるものではないが、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１２０４０１８４号パンフレット、同第２０１１１５３１２０号パンフレット、同第２０１１１４９７３３号パンフレット、同第２０１１０９０９６５号パンフレット、同第２０１１０４３９１３号パンフレット、同第２０１１０２２４６０号パンフレット、同第２０１２０６１２５９号パンフレット、同第２０１２０５４３６５号パンフレット、同第２０１２０４４６３８号パンフレット、同第２０１００８０７２４号パンフレット、同第２０１０２１８６５号パンフレットおよび同第２００８１０３２７６号パンフレット、米国特許第７，８９３，３０２号明細書および同第７，４０４，９６９号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１０００３６１１５号明細書に記載のカチオン性脂質から選択することができる。別の実施形態において、カチオン性脂質は、限定されるものではないが、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１２０４０１８４号パンフレット、同第２０１１１５３１２０号パンフレット、同第２０１１１４９７３３号パンフレット、同第２０１１０９０９６５号パンフレット、同第２０１１０４３９１３号パンフレット、同第２０１１０２２４６０号パンフレット、同第２０１２０６１２５９号パンフレット、同第２０１２０５４３６５号パンフレットおよび同第２０１２０４４６３８号パンフレットに記載の式Ａから選択することができる。さらに別の実施形態において、カチオン性脂質は、限定されるものではないが、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８１０３２７６号パンフレットの式ＣＬＩ～ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，８９３，３０２号明細書の式ＣＬＩ～ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，４０４，９６９号明細書の式ＣＬＩ～ＣＬＸＸＸＸＩＩおよび米国特許出願公開第２０１０００３６１１５号明細書の式Ｉ～ＶＩから選択することができる。非限定的な例として、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメミルヘキサコサ（ｄｉｍｅｍｙｌｈｅｘａｃｏｓａ）－１７，２０－ジエン－９－アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ５Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－８－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３Ｊ１６－ジエン－５－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－ＮＪＮ－ジメチルヘニコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン、（１５Ζ，１８Ζ）－Ν，Ν－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメイヒルオクタコサ（ｄｉｍｅｉｈｙｌｏｃｔａｃｏｓａ）－１９，２２－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，，２０－ジエン－７－アミン、（１６Ｚ；１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ；Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコス－１８－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコス－１７－エン－９－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－ＮＪＮ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチル－Ｎ－メチルノナコサ－２０Ｊ２３－ジエン－１０－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－１－ノニルイコサ－１１，１４－ジエン－１－イル］ピロリジン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコス－２０－エン－１０－アミン、（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエプタコス（ｅｐｔａｃｏｓ）－１５－エン－１０－アミン、（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－１４－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－１７－エン－１０－アミン、（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコント－２４－エン－１０－アミン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－２０－エン－１０－アミン、（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２－エン－１０－アミン、（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６－エン－８－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘニコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］エプタデカン（ｅｐｔａｄｅｃａｎ）－８－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘニコサン－１０－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン、Ν，Ν－ジメチルＨ－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン－５－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン、１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ν，Ν－ジメチルオクタデカン－９－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン、Ｒ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、Ｓ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－［（５Ｚ）－オクタ－５－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘプチルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデク－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－（ノニルオキシ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン（化合物９）；（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，９，１２－トリエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－３－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ν，Ν－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－ｌ３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ）－ドコス－１３－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（９Ｚ）－ヘキサデク－９－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｈ（１－メトイルオクチル）オキシ］－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－１－［（３，７－ジメチルオクチル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－（オクチルオキシ）－３－（｛８－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－｛［８－（２－オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミンおよび（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１１，２０，２－トリエン－１０－アミンまたはそれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体から選択することができる。
一実施形態において、カチオン性脂質は、当分野において公知の方法により、および／またはそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１２０４０１８４号パンフレット、同第２０１１１５３１２０号パンフレット、同第２０１１１４９７３３号パンフレット、同第２０１１０９０９６５号パンフレット、同第２０１１０４３９１３号パンフレット、同第２０１１０２２４６０号パンフレット、同第２０１２０６１２５９号パンフレット、同第２０１２０５４３６５号パンフレット、同第２０１２０４４６３８号パンフレット、同第２０１００８０７２４号パンフレットおよび同第２０１０２１８６５号パンフレットに記載のとおり合成することができる。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡのＬＮＰ製剤は、３％の脂質モル比でＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧを含有し得る。別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡのＬＮＰ製剤は、１．５％の脂質モル比でＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧを含有し得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡの医薬組成物は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０９９７５５号パンフレットに記載のＰＥＧ化脂質の少なくとも１つを含み得る。
一実施形態において、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００）を含有し得る。一実施形態において、ＬＮＰ製剤は、当分野において公知のカチオン性脂質であるＰＥＧ－ＤＭＧ２０００および少なくとも１つの他の構成要素を含有し得る。別の実施形態において、ＬＮＰ製剤は、当分野において公知のカチオン性脂質であるＰＥＧ－ＤＭＧ２０００、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含有し得る。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含有し得る。別の非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＳＰＣおよびコレステロールを２：４０：１０：４８のモル比で含有し得る（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、ゲアル（Ｇｅａｌｌ）ら著、「自己増幅ＲＮＡワクチンの非ウイルス送達（Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、２０１２年；ＰＭＩＤ：２２９０８２９４参照）。
一実施形態において、ＬＮＰ製剤は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレットまたは同第２００８１０３２７６号パンフレットに記載の方法により製剤化することができる。非限定的な例として、本明細書に記載の修飾ＲＮＡは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレットおよび／または同第２００８１０３２７６号パンフレットに記載のとおりＬＮＰ製剤中に封入することができる。
一実施形態において、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、ポリカチオン性組成物を含み得る。非限定的な例として、ポリカチオン性組成物は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書の式１～６０から選択することができる。別の実施形態において、ポリカチオン性組成物を含むＬＮＰ製剤は、本明細書に記載の修飾ＲＮＡのインビボおよび／またはインビトロでの送達に使用することができる。
一実施形態において、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、透過性促進剤分子をさらに含み得る。非限定的な透過性促進剤分子は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書に記載されている。
一実施形態において、医薬組成物は、リポソーム、例えば、限定されるものではないが、ＤｉＬａ２リポソーム（マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ボセル、ワシントン）、スマーティクルズ（ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ）（登録商標）（マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ボセル、ワシントン）、中性ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）ベースリポソーム（例えば、卵巣癌のためのｓｉＲＮＡ送達（参照により全体として本明細書に組み込まれる、ランデン（Ｌａｎｄｅｎ）ら著、キャンサー・バイオロジー・アンド・セラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００６年、第５巻（第１２号）、ｐ．１７０８～１７１３）およびヒアルロナンコーティングリポソーム（クワイアット・セラピューティクス（Ｑｕｉｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、イスラエル）中に製剤化することができる。
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を急速排出（ｒａｐｉｄｌｙ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ）脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）として公知の生分解性カチオン性脂質により置き換えることにより改善することができる。イオン化可能なカチオン性脂質、例えば、限定されるものではないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、およびＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡは、血漿および組織中に経時的に蓄積することが示されており、潜在的な毒性源であり得る。急速排出脂質の急速な代謝は、ラットにおいて１ｍｇ／ｋｇ用量～１０ｍｇ／ｋｇ用量の１桁だけ脂質ナノ粒子の忍容性および治療指数を改善し得る。酵素的に分解されるエステル結合の包含は、ｒｅＬＮＰ製剤の活性を依然として維持しながら、カチオン性構成要素の分解および代謝プロファイルを改善し得る。エステル結合は、脂質鎖の内部に局在し得、またはそれは脂質鎖の末端において末端に局在し得る。内部エステル結合は、脂質鎖中の任意の炭素を置き換え得る。
一実施形態において、内部エステル結合は、飽和炭素のいずれかの側に局在し得る。ｒｅＬＮＰの非限定的な例としては、
Figure 0007225456000003
および
Figure 0007225456000004
が挙げられる。
一実施形態において、ナノ化学種、ポリマーおよび免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することにより免疫応答を誘発することができる（米国特許出願公開第２０１２０１８９７００号明細書および国際公開第２０１２０９９８０５号パンフレット；それぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。ポリマーは、ナノ化学種を封入しても、ナノ化学種を部分的に封入してもよい。
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子が粘膜関門を透過するように、粒子の表面特性を変更するようにエンジニアリングすることができる。粘液は、粘膜組織、例えば、限定されるものではないが、口腔（例えば、頬および食道膜ならびに扁桃組織）、眼、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻腔、呼吸器（例えば、鼻腔、咽頭、気管および気管支膜）、生殖器（例えば、膣、子宮頚部および尿道膜）上に局在する。より高い薬物封入効率および幅広い薬物の持続送達を提供する能力のために好ましい１０～２００ｎｍより大きいナノ粒子は、粘膜関門を通り急速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、継続的に分泌され、脱落し、破棄または消化され、再循環されるため、捕捉された粒子のほとんどは、数秒以内または数時間以内に粘膜組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により密にコーティングされた大きいポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ～５００ｎｍ）は、水中で拡散する同一粒子よりわずか４～６倍低く、粘液を通り拡散した（ライ（Ｌａｉ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、２００７年、第１０４巻（第５号）、ｐ．１４８２～４８７、ライ（Ｌａｉ）ら著、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．）、２００９年、第６１巻（第２号）、ｐ．１５８～１７１；それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる）。ナノ粒子の輸送は、透過速度および／または蛍光顕微鏡観察技術、例として、限定されるものではないが、蛍光退色後回復測定（ＦＲＡＰ）および高解像度多粒子追跡（ＭＰＴ）を使用して決定することができる。
粘液を透過するようにエンジニアリングされた脂質ナノ粒子は、ポリマー材料（すなわちポリマーコア）および／またはポリマー－ビタミンコンジュゲートおよび／またはトリブロックコポリマーを含み得る。ポリマー材料としては、限定されるものではないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートを挙げることができる。ポリマー材料は、生分解性および／または生体適合性であり得る。具体的なポリマーの非限定的な例としては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＥＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＰＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノアクラレート（ｃｙａｎｏａｃｒａｌａｔｅ）、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレンおよびポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアルキレンテレフタレート、例えば、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えば、ポリ（酢酸ビニル）、ハロゲン化ポリビニル、例えば、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ならびにそれらのコポリマーおよび混合物、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、およびトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、コポリマー、例えば、限定されるものではないが、ブロックコポリマー、および（ポリ（エチレングリコール）－（ポリ（プロピレンオキシド）－（ポリ（エチレングリコール）トリブロックコポリマー（例えば、米国特許出願公開第２０１２０１２１７１８号明細書および米国特許出願公開第２０１００００３３３７号明細書参照；それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる）によりコーティングし、またはそれと会合させることができる。コポリマーは、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）ポリマーであり得、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学実体が作出されないような手法であり得る。例えば、脂質ナノ粒子は、新たな化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液に急速に透過し得るポロキサマーコーティングＰＬＧＡナノ粒子を含み得る（ヤン（Ｙａｎｇ）ら著、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２０１１年、第５０巻、ｐ．２５９７～２６００；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
ポリマー－ビタミンコンジュゲートのビタミンは、ビタミンＥであり得る。コンジュゲートのビタミン部分は、他の好適な構成要素、例えば、限定されるものではないが、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、他の界面活性剤の疎水性部分、または疎水性構成要素（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖およびアルキレンオキシド鎖）により置換することができる。
粘液に透過するようにエンジニアリングされた脂質ナノ粒子は、表面変質剤、例えば、限定されるものではないが、ｍｍＲＮＡ、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（カチオン性界面活性剤、例えば、ジメチルジオクタデシル－アンモニウムブドミドなど）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコールおよびポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ－アセチルシステイン、オオヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ属、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、サイモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）および種々のＤＮアーゼ、例として、ｒｈＤＮアーゼを含み得る。表面変質剤は、粒子の表面中に包埋もしくは捕捉させ、または脂質ナノ粒子の表面上に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスにより）配置することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１００２１５５８０号明細書および米国特許出願公開第２００８０１６６４１４号明細書参照；これらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
粘液透過性脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の少なくとも１つのｍｍＲＮＡを含み得る。ｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に封入し、および／または粒子の表面上に配置することができる。ｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に共有結合させることができる。粘液透過性脂質ナノ粒子の製剤は、複数のナノ粒子を含み得る。さらに、製剤は、粘液と相互作用し、粘膜接着を減少させるように周囲の粘液の構造特性および／または接着特性を変更し得、それにより粘液透過性脂質ナノ粒子の粘膜組織への送達を増加させ得る粒子を含有し得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、リポプレックス、例えば、限定されるものではないが、サイレンス・セラピューティクス（Ｓｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（ロンドン、英国）からのＡＴＵＰＬＥＸ（商標）系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系および他のｓｉＲＮＡ－リポプレックス技術、ステムジェント（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）（登録商標）（ケンブリッジ、マサチューセッツ）からのステムフェクト（ＳＴＥＭＦＥＣＴ）（商標）、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンベースの標的化および非標的化核酸送達として製剤化される（アレク（Ａｌｅｋｕ）ら著、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、２００８年、第６８巻、ｐ．９７８８～９７９８；ストラムバーグ（Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ）ら著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・ファーマコロジ・アンド・セラピューティクス（Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ）、２０１２年、第５０巻、ｐ．７６～７８；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１２２２～１２３４；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１３６０～１３７０；グトビエル（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、パルモナリー・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第２３巻、ｐ．３３４～３４４；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、マイクロバスキュラー・リサーチ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ）、２０１０年、第８０巻、ｐ．２８６～２９３ ウエイド（Ｗｅｉｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２００９年、第３２巻、ｐ．４９８～５０７；ウエイド（Ｗｅｉｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２００８年、第３１巻、ｐ．１８０～１８８；パスコロ（Ｐａｓｃｏｌｏ）著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第４巻、ｐ．１２８５～１２９４；フォティン－ムレクゼク（Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋ）ら著、２０１１年、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、第３４巻、ｐ．１～１５；ソング（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９～７１７；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２００７年、第６巻、第１０４号、ｐ．４０９５～４１００；ド・フジュロル（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５～１３２；これらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
一実施形態において、このような製剤は、それらが受動的または能動的に、異なる細胞型、例として、限定されるものではないが、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、および白血球にインビボで指向されるようにも構築することができ、または組成を変更することができる（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７～１３６４；ソング（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９～７１７；ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．）、２００９年、第１１９巻、ｐ．６６１～６７３；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、マイクロバスキュラー・リサーチ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ）、２０１０年、第８０巻、ｐ．２８６～２９３；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１２２２～１２３４；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１３６０～１３７０；グトビエル（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、パルモナリー・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第２３巻、ｐ．３３４～３４４；バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ．２１８６～２２００；フェンスケ（Ｆｅｎｓｋｅ）およびクリス（Ｃｕｌｌｉｓ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．）、２００８年、第５巻、ｐ．２５～４４；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３１９巻、ｐ．６２７～６３０；ピア（Ｐｅｅｒ）およびリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１１２７～１１３３；これらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。肝臓細胞に対する製剤の受動的な標的化の一例としては、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよびＭＣ３ベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられ、それらはアポリポタンパク質Ｅに結合し、インビボでそれらの製剤の結合および肝細胞中への取り込みを促進することが示されている（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７～１３６４；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。製剤は、限定されるものではないが、ホレート、トランスフェリン、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、および抗体標的化アプローチにより例として示されるそれらの表面上の異なるリガンドの発現を介して選択的に標的化させることもできる（コルハトカル（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ）ら著、カレント・ドラッグ・ディスカバリー・テクノロジーズ（Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ
Ｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第８巻、ｐ．１９７～２０６；ムサッチオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）およびトルチリン（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ）著、フロンティアズ・イン・バイオサイエンス（Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．）、２０１１年、第１６巻、ｐ．１３８８～１４１２；ユウ（Ｙｕ）ら著、モレキュラー・メンブレン・バイオロジー（Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．）、２０１０年、第２７巻、ｐ．２８６～２９８；パチル（Ｐａｔｉｌ）ら著、クリティカル・レビューズ・イン・セラピューティク・ドラッグ・キャリア・システム（Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．）、２００８年、第２５巻、ｐ．１～６１；ベノア（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオマクロモレキュールズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８～２７１４ シャオ（Ｚｈａｏ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．）、２００８年、第５巻、ｐ．３０９～３１９；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７～１３６４；スリニバサン（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ）ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．）、２０１２年、第８２０巻、ｐ．１０５～１１６；ベン－アリー（Ｂｅｎ－Ａｒｉｅ）ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．）、２０１２年、第７５７巻、ｐ．４９７～５０７；ピア（Ｐｅｅｒ）、２０１０年、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ）、第２０巻、ｐ．６３～６８；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ．４０９５～４１００；キム（Ｋｉｍ）ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．）、２０１１年、第７２１巻、ｐ．３３９～３５３；スブラマンヤ（Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．２０２８～２０３７；ソング（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９～７１７；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３１９巻、ｐ．６２７～６３０；ピア（Ｐｅｅｒ）およびリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１１２７～１１３３；これらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、固体脂質ナノ粒子として製剤化される。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均直径１０～１０００ｎｍを有する球状であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化し得、界面活性剤および／または乳化剤により安定化することができる固体脂質コアマトリックスを有する。さらなる実施形態において、脂質ナノ粒子は、自己集合性脂質－ポリマーナノ粒子であり得る（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ Ｎａｎｏ）、２００８年、第２巻（第８号）、ｐ．１６９６～１７０２参照；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤が、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによる細胞形質移入を増加させ；および／またはコードされるタンパク質の翻訳を増加させ得るため、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにより指向されるタンパク質産生の効力を改善するために使用することができる。１つのそのような例は、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの有効な全身送達を可能とするための脂質封入の使用を含む（ヘイエス（Ｈｅｙｅｓ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２００７年、第１５巻、ｐ．７１３～７２０；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を増加させるために使用することもできる。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、制御放出および／または標的化送達のために製剤することができる。本明細書において使用される場合、「制御放出」は、特定の放出パターンに適合して治療アウトカムをもたらす、医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、制御放出および／または標的化送達のために本明細書に記載の、および／または当分野において公知の送達剤中に封入することができる。本明細書において使用される場合、用語「封入する」は、密封する、包囲する、または包み込むことを意味する。本発明の化合物の製剤に関する場合、封入は、実質的、完全、または部分的であり得る。用語「実質的に封入される」は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、９９．９％超、９９．９％超または９９．９９９％超が、送達剤内に密封され、包囲され、または包み込まれ得ることを意味する。「部分的封入」は、本発明の医薬組成物または化合物の１０未満、１０、２０、３０、４０、５０またはそれより少ないものが、送達剤内に密封され、包囲され、または包み込まれ得ることを意味する。有利には、封入は、蛍光および／または電子顕微鏡写真を使用して本発明の医薬組成物または化合物の脱出または活性を計測することにより決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％超が、送達剤中に封入される。
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子中に封入することができ、次いで脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の、および／または当分野において公知のポリマー、ヒドロゲルおよび／または手術用シーリング材中に封入することができる。非限定的な例として、ポリマー、ヒドロゲルまたは手術用シーリング材は、ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ゲルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）（ナノセラピューティクス社（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、アラチュア、フロリダ）、ハイレネックス（ＨＹＬＥＮＥＸ）（登録商標）（ハロザイム・セラピューティクス（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア）、手術用シーリング材、例えば、フィブリノーゲンポリマー（エシコン社（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．）、コーネリア、ジョージア）、ティッセル（ＴＩＳＳＥＬＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル社（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、ディアフィールド、イリノイ）、ＰＥＧベースのシーリング材、およびコシール（ＣＯＳＥＡＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル社（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、ディアフィールド、イリノイ）であり得る。
別の実施形態において、脂質ナノ粒子は、対象に注射されるとゲルを形成し得る、当分野において公知の任意のポリマーまたはヒドロゲル中に封入することができる。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリックス中に封入することができる。
一実施形態において、制御放出および／または標的化送達のためのポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ製剤は、少なくとも１つの制御放出コーティング剤も含み得る。制御放出コーティング剤としては、限定されるものではないが、オパドライ（ＯＰＡＤＲＹ）（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ユードラジット（ＥＵＤＲＡＧＩＴ）ＲＬ（登録商標）、ユードラジット（ＥＵＤＲＡＧＩＴ）ＲＳ（登録商標）およびセルロース誘導体、例えば、エチルセルロース水性分散液（アクアコート（ＡＱＵＡＣＯＡＴ）（登録商標）およびシュアリース（ＳＵＲＥＬＥＡＳＥ）（登録商標））が挙げられる。
一実施形態において、制御放出および／または標的化送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含み得る。分解性ポリエステルとしては、限定されるものではないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、およびそれらの組合せが挙げられる。別の実施形態において、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧコンジュゲーションを含み得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、治療ナノ粒子中に封入することができる。治療ナノ粒子は、本明細書に記載の、ならびに当分野において公知の方法、例えば、限定されるものではないが、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１０００５７４０号パンフレット、同第２０１００３０７６３号パンフレット、同第２０１０００５７２１号パンフレット、同第２０１０００５７２３号パンフレット、同第２０１２０５４９２３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号明細書、同第２０１００１０４６４５号明細書、同第２０１０００８７３３７号明細書、同第２０１０００６８２８５号明細書、同第２０１１０２７４７５９号明細書、同第２０１０００６８２８６号明細書、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号明細書に記載の方法により製剤化することができる。別の実施形態において、治療ポリマーナノ粒子は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２０１４０７９０号明細書に記載の方法により同定することができる。
一実施形態において、治療ナノ粒子は、持続放出のために製剤化することができる。本明細書において使用される場合、「持続放出」は、規定の一定期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物を指す。一定期間としては、限定されるものではないが、数時間、数日間、数週間、数ヶ月間および数年間を挙げることができる。非限定的な例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマーならびに治療剤、例えば、限定されるものではないが、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを含み得る（国際公開第２０１００７５０７２号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１００２１６８０４号明細書および同第２０１１０２１７３７７号明細書参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
一実施形態において、治療ナノ粒子は、標的特異的となるように製剤化することができる。非限定的な例として、治療ナノ粒子は、コルチコステロイドを含み得る（国際公開第２０１１０８４５１８号パンフレット参照）。一実施形態において、治療ナノ粒子は、癌特異的となるように製剤化することができる。非限定的な例として、治療ナノ粒子は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８１２１９４９号パンフレット、同第２０１０００５７２６号パンフレット、同第２０１０００５７２５号パンフレット、同第２０１１０８４５２１号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１０００６９４２６号明細書、同第２０１２０００４２９３号明細書および同第２０１００１０４６５５号明細書に記載のナノ粒子に製剤化することができる。
一実施形態において、本発明のナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含み得る。非限定的な例として、ナノ粒子は、２つ以上のポリマー、例えば、限定されるものではないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）またはそれらの組合せを含み得る。
一実施形態において、ジブロックコポリマーとしては、ＰＥＧと、ポリマー、例えば、限定されるものではないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）またはそれらの組合せとの組合せを挙げることができる。
一実施形態において、治療ナノ粒子は、ジブロックコポリマーを含む。非限定的な例として、治療ナノ粒子は、ＰＬＧＡ－ＰＥＧブロックコポリマーを含む（米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号明細書および米国特許第８，２３６，３３０号明細書参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。別の非限定的な例において、治療ナノ粒子は、ＰＥＧおよびＰＬＡまたはＰＥＧおよびＰＬＧＡのジブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である（米国特許第８，２４６，９６８号明細書参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
一実施形態において、治療ナノ粒子は、少なくとも１つのアクリルポリマーを含み得る。アクリルポリマーとしては、限定されるものではないが、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸のコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレートならびにそれらの組合せが挙げられる。
一実施形態において、治療ナノ粒子は、本明細書に記載の、および／または当分野において公知の少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含み得る。
一実施形態において、治療ナノ粒子は、少なくとも１つのアミン含有ポリマー、例えば、限定されるものではないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマーおよびそれらの組合せを含み得る。
一実施形態において、治療ナノ粒子は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含み得る。分解性ポリエステルとしては、限定されるものではないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、およびそれらの組合せが挙げられる。別の実施形態において、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧコンジュゲーションを含み得る。
別の実施形態において、治療ナノ粒子は、少なくとも１つの標的化リガンドのコンジュゲーションを含み得る。
一実施形態において、治療ナノ粒子は、癌を標的化するために使用することができる水溶液中で製剤化することができる（国際公開第２０１１０８４５１３号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０２９４７１７号明細書参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、合成ナノ担体中に封入し、それに結合させ、および／またはそれと会合させることができる。合成ナノ担体は、当分野において公知の、および／または本明細書に記載の方法を使用して製剤化することができる。非限定的な例として、合成ナノ担体は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１０００５７４０号パンフレット、同第２０１００３０７６３号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号明細書、同第２０１００１０４６４５号明細書および同第２０１０００８７３３７号明細書に記載の方法により製剤化することができる。別の実施形態において、合成ナノ担体製剤は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１０７２２１８号パンフレットおよび米国特許第８，２１１，４７３号明細書に記載の方法により凍結乾燥させることができる。
一実施形態において、合成ナノ担体は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを放出するための反応性基を含有し得る（国際公開第２０１２０９５２５５２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１２０１７１２２９号明細書参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
一実施形態において、合成ナノ担体は、合成ナノ担体の送達からの免疫応答を向上させるための免疫賦活剤を含有し得る。非限定的な例として、合成ナノ担体は、免疫系のＴｈ１ベースの応答を向上させ得るＴｈ１免疫賦活剤を含み得る（国際公開第２０１０１２３５６９号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０２２３２０１号明細書参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
一実施形態において、合成ナノ担体は、標的化放出のために製剤化することができる。一実施形態において、合成ナノ担体は、規定のｐＨにおいて、および／または所望の時間間隔の後にポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡを放出するように製剤化される。非限定的な例として、合成ナノ粒子は、２４時間後におよび／または４．５のｐＨでポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡを放出するように製剤化することができる（国際公開第２０１０１３８１９３号パンフレットおよび同第２０１０１３８１９４号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１１００２０３８８号明細書および同第２０１１００２７２１７号明細書参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
一実施形態において、合成ナノ担体は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡの制御放出および／または持続放出のために製剤化することができる。非限定的な例として、持続放出のための合成ナノ担体は、当分野において公知であり、本明細書に記載の、および／またはそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１０１３８１９２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１００３０３８５０号明細書に記載のとおり製剤化することができる。
ポリマー、生分解性ナノ粒子、およびコア－シェルナノ粒子
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、天然および／または合成ポリマーを使用して製剤化することができる。送達に使用することができるポリマーの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ミルス（ＭＩＲＵＳ）（登録商標）バイオ（Ｂｉｏ）（マディソン、ウィスコンシン）およびロシュ・マディソン（Ｒｏｃｈｅ Ｍａｄｉｓｏｎ）（マディソン、ウィスコンシン）からのダイナミック・ポリコンジュゲート（Ｄｙｎａｍｉｃ ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ）（商標）製剤、ファゼルクス（ＰＨＡＳＥＲＸ）（商標）ポリマー製剤、例えば、限定されるものではないが、スマート・ポリマー・テクノロジー（ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）（商標）（シアトル、ワシントン）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、ヴィカル（Ｖｉｃａｌ）（サンディエゴ、カリフォルニア）からのヴァクスフェクチン（ＶＡＸＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）アジュバント、キトサン、カランド・ファーマシューティカルズ（Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（パサデナ、カリフォルニア）からのシクロデキストリン、デンドリマーおよびポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ロンデル（ＲＯＮＤＥＬ）（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（アローヘッド・リサーチ・コーポレーション（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、パサデナ、カリフォルニア）ならびにｐＨ応答性コブロックポリマー、例えば、限定されるものではないが、ファゼルクス（ＰＨＡＳＥＲＸ）（商標）（シアトル、ワシントン）が挙げられる。
ＰＬＧＡ製剤の非限定的な例としては、限定されるものではないが、ＰＬＧＡ注射用デポーが挙げられる（例えば、ＰＬＧＡを、６６％のＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）中に溶解させることにより形成され、残部が水性溶媒およびロイプロリドであるエリガード（ＥＬＩＧＡＲＤ）（登録商標）。一旦注射されると、ＰＬＧＡおよびロイプロリドペプチドは、皮下腔に沈殿する）。
これらのポリマーアプローチの多くは、インビボでオリゴヌクレオチドを細胞の細胞質中に送達することにおいて効力を実証している（参照により全体として本明細書に組み込まれる、ド・フジュロル（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５～１３２において概説される）。核酸（この場合、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて）のロバストなインビボ送達をもたらした２つのポリマーアプローチは、ダイナミックポリコンジュゲート（ｄｙｎａｍｉｃ ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ）およびシクロデキストリンベースのナノ粒子である。これらの送達アプローチの第１のアプローチは、ダイナミックポリコンジュゲート（ｄｙｎａｍｉｃ ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を使用し、マウスにおいてインビボでｓｉＲＮＡを有効に送達し、肝細胞内で内因性標的ｍＲＮＡをサイレンシングすることが示されている（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２～１２８８７）。この特定のアプローチは、多成分ポリマー系であり、その重要な特徴部として、核酸（この場合、ｓｉＲＮＡ）がジスルフィド結合を介して共有結合しており、ＰＥＧ（電荷遮蔽のため）基およびＮ－アセチルガラクトサミン（肝細胞標的化のため）基の両方がｐＨ感受性結合を介して結合している膜活性ポリマーが挙げられる（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２～１２８８７）。肝細胞に結合し、エンドソームに進入すると、ポリマー複合体は低ｐＨ環境中で解体し、このポリマーがその陽電荷を露出し、エンドソームからの脱出、およびポリマーから細胞質へのｓｉＲＮＡの放出をもたらす。Ｎ－アセチルガラクトサミン基のマンノース基による置き換えを介して、アシアロ糖タンパク質受容体を発現する肝細胞から、類洞内皮細胞およびクッパー細胞に標的化を変更し得ることが示された。別のポリマーアプローチは、トランスフェリン標的化シクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子を使用することを含む。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体を発現するユーイング肉腫腫瘍細胞中でＥＷＳ－ＦＬＩ１遺伝子産物の標的化サイレンシングを実証しており（フウ－リエスコファン（Ｈｕ－Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ）ら著、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、２００５年、第６５巻、ｐ．８９８４～８９８２）、これらのナノ粒子中に製剤化されたｓｉＲＮＡは、非ヒト霊長類において良好に忍容された（ヘイデル（Ｈｅｉｄｅｌ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ．５７１５～２１）。これらの送達戦略の両方は、標的化送達機構およびエンドソームからの脱出機序の両方を使用する合理的なアプローチを取り込む。
ポリマー製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの持続放出または遅延放出を可能とし得る（例えば、筋肉内または皮下注射後に）。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡについて変更された放出プロファイルは、例えば、長期間にわたるコードされるタンパク質の翻訳をもたらし得る。ポリマー製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を増加させるために使用することもできる。ｍｍＲＮＡ以外の核酸を分解から保護するために生分解性ポリマーが、既に使用されており、インビボでペイロードの持続放出をもたらすことが示されている（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２～１２８８７；スリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．）、２０１０年、第７巻、ｐ．１４３３～１４４６；コンバーティン（Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ）ら著、バイオマクロモレキュールズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１０年、１０月１日；チュウ（Ｃｈｕ）ら著、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ．）、２０１２年、１月１３日；マンガニエロ（Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１２年、第３３巻、ｐ．２３０１～２３０９；ベノア（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオマクロモレキュールズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８～２７１４；シンハ（Ｓｉｎｇｈａ）ら著、ヌクレイック・アシッド・セラピューティクス（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第２巻、ｐ．１３３～１４７；ド・フジュロル（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５～１３２；シャフェルト（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ）およびウェグナー（Ｗａｇｎｅｒ）著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１６巻、ｐ．１１３１～１１３８；シャツルベディ（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．）、２０１１年、第８巻、ｐ．１４５５～１４６８；デービス（Ｄａｖｉｓ）著、モレキュラー・ファーマシューティカルズ（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．）、２００９年、第６巻、ｐ．６５９～６６８；デービス（Ｄａｖｉｓ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６４巻、ｐ．１０６７～１０７０；それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
一実施形態において、医薬組成物は、持続放出製剤であり得る。さらなる実施形態において、持続放出製剤は皮下送達用であり得る。持続放出製剤は、限定されるものではないが、ＰＬＧＡミクロスフェア、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ゲルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）（ナノセラピューティクス社（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、アラチュア、フロリダ）、ハイレネックス（ＨＹＬＥＮＥＸ）（登録商標）（ハロザイム・セラピューティクス（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア）、手術用シーリング材、例えば、フィブリノーゲンポリマー（エシコン社（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．）、コーネリア、ジョージア）、ティッセル（ＴＩＳＳＥＬＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル社（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、ディアフィールド、イリノイ）、ＰＥＧベースのシーリング材、およびコシール（ＣＯＳＥＡＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル社（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、ディアフィールド、イリノイ）を含み得る。
非限定的な例として、修飾ｍＲＮＡは、調整可能な放出速度を有する（例えば、数日間および数週間）ＰＬＧＡミクロスフェアを調製し、修飾ｍＲＮＡをＰＬＧＡミクロスフェア中に封入する一方、封入プロセスの間の修飾ｍＲＮＡの完全性を維持することにより、ＰＬＧＡミクロスフェア中に製剤化することができる。ＥＶＡｃは、前臨床の持続放出埋込物適用において広範に使用される、非生分解性の生体適合性ポリマーである（例えば、緑内障のためのピロカルピン眼内インサートである持続放出製品オキュサート（Ｏｃｕｓｅｒｔ）または持続放出プロゲステロン子宮内デバイスであるプロゲスタサート（ｐｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ）；経皮送達系テストダーム（Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ）、デュラゲジック（Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ）、およびセレギリン（Ｓｅｌｅｇｉｌｉｎｅ）；カテーテル）。ポロキサマーＦ－４０７ＮＦは、５℃未満の温度において低粘度を有する、親水性の非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンのトリブロックコポリマーであり、１５℃を超える温度において固体ゲルを形成する。ＰＥＧベースの手術用シーリング材は、１分間で調製することができ、３分間でシーリングし、３０日以内に再吸収される、送達デバイス中で混合された２つの合成ＰＥＧ構成要素を含む。ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）および天然ポリマーは、投与部位におけるインサイチュのゲル化が可能である。これらは、イオン性相互作用を介してタンパク質およびペプチド治療候補と相互作用して安定化効果を提供することが示されている。
ポリマー製剤は、限定されるものではないが、ホレート、トランスフェリン、およびＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）により例として示される異なるリガンドの発現を介して選択的に標的化することもできる（ベノア（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオマクロモレキュールズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８～２７１４；ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２～１２８８７；デービス（Ｄａｖｉｓ）著、モレキュラー・ファーマシューティカルズ（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．）、２００９年、第６巻、ｐ．６５９～６６８；デービス（Ｄａｖｉｓ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６４巻、ｐ．１０６７～１０７０；それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、ポリマー化合物とともに、またはポリマー化合物中に製剤化することができる。ポリマーとしては、少なくとも１つのポリマー、例えば、限定されるものではないが、ポリエテン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトされたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分枝鎖状ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルブロックランダムコポリマー、直鎖状生分解性コポリマー、ポリ［α－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、アクリルポリマー、アミン含有ポリマーまたはそれらの組合せを挙げることができる。
非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，１７７，２７４号明細書に記載のＰＬＬによりグラフトされたＰＥＧのポリマー化合物とともに製剤化することができる。製剤は、インビトロで細胞を形質移入するため、またはポリヌクレオチド、一次構築物および／もしくはｍｍＲＮＡのインビボ送達のために使用することができる。別の例において、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、カチオン性ポリマーを有する溶液もしくは媒体中に、乾燥医薬組成物中に、またはそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９００４２８２９号明細書および同第２００９００４２８２５号明細書に記載のとおり乾燥させることができる溶液中に懸濁させることができる。
別の非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＰＬＧＡ－ＰＥＧブロックコポリマー（米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号明細書および米国特許第８，２３６，３３０号明細書参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）とともに製剤化することができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＰＥＧおよびＰＬＡまたはＰＥＧおよびＰＬＧＡのジブロックコポリマーとともに製剤化することができる（米国特許第８，２４６，９６８号明細書参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
ポリアミン誘導体は、核酸を送達し、または疾患を治療および／もしくは予防し、または埋込型もしくは注射型デバイス中に含めるために使用することができる（参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１００２６０８１７号明細書）。非限定的な例として、医薬組成物は、修飾核酸およびｍｍＲＮＡならびに内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１００２６０８１７号明細書に記載のポリアミン誘導体を含み得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのアクリルポリマーとともに製剤化することができる。アクリルポリマーとしては、限定されるものではないが、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸のコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレートならびにそれらの組合せが挙げられる。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１１１５８６２号パンフレット、国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレットおよび国際公開第２０１２０６８１８７号パンフレットに記載の少なくとも１つのポリマーとともに製剤化することができる。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１１１５８６２号パンフレットに記載の式Ｚのポリマーとともに製剤化することができる。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレットまたは国際公開第２０１２０６８１８７号パンフレットに記載の式Ｚ、Ｚ’またはＺ’’のポリマーとともに製剤化することができる。本発明の修飾ＲＮＡとともに製剤化されるポリマーは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレットまたは国際公開第２０１２０６８１８７号パンフレットに記載の方法により合成することができる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの製剤は、少なくとも１つのアミン含有ポリマー、例えば、限定されるものではないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマーまたはそれらの組合せを含み得る。
例えば、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、ポリ（アルキレンイミン）、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ポリマー、もしくは生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダムコポリマー、直鎖状生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーまたはそれらの組合せを含む医薬化合物中に製剤化することができる。生分解性カチオン性リポポリマーは、当分野において公知の方法ならびに／またはそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６９６，０３８号明細書、米国特許出願第２００３００７３６１９号明細書、および同第２００４０１４２４７４号明細書に記載の方法により作製することができる。ポリ（アルキレンイミン）は、当分野において公知の方法および／または参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１００００４３１５号明細書に記載の方法を使用して作製することができる。生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、または生分解性ポリエステルランダムコポリマーは、当分野において公知の方法ならびに／または内容がそれぞれ参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５１７，８６９号明細書および同第６，２６７，９８７号明細書に記載の方法を使用して作製することができる。直鎖状生分解性コポリマーは、当分野において公知の方法および／または米国特許第６，６５２，８８６号明細書に記載の方法を使用して作製することができる。ＰＡＧＡポリマーは、当分野において公知の方法および／または参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１７，９１２号明細書に記載の方法を使用して作製することができる。ＰＡＧＡポリマーは共重合させてポリマー、例えば、限定されるものではないが、ポリ－Ｌ－リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチドおよびポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）とともにコポリマーまたはブロックコポリマーを形成することができる。生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーは、当分野において公知の方法および／またはそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０５７，８２１号明細書もしくは米国特許出願公開第２０１２００９１４５号明細書に記載の方法により作製することができる。例えば、マルチブロックコポリマーは、分枝鎖状ポリエチレンイミンと比較して区別されるパターンを有する直鎖状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）ブロックを使用して合成することができる。さらに、組成物または医薬組成物は、当分野において公知の方法、本明細書に記載の方法、またはそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１００００４３１５号明細書もしくは米国特許第６，２６７，９８７号明細書および同第６，２１７，９１２号明細書に記載の方法により作製することができる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルとともに製剤化することができる。分解性ポリエステルとしては、限定されるものではないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、およびそれらの組合せが挙げられる。別の実施形態において、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧコンジュゲーションを含み得る。
一実施形態において、本明細書に記載のポリマーは、脂質末端ＰＥＧにコンジュゲートすることができる。非限定的な例として、ＰＬＧＡは、脂質末端ＰＥＧにコンジュゲートしてＰＬＧＡ－ＤＳＰＥ－ＰＥＧを形成することができる。別の非限定的な例として、本発明とともに使用するためのＰＥＧコンジュゲートは、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２００８１０３２７６号パンフレットに記載されている。
一実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、別の化合物とコンジュゲートすることができる。コンジュゲートの非限定的な例は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，９６４，５７８号明細書および同第７，８３３，９９２号明細書に記載されている。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９６４，５７８号明細書および同第７，８３３，９９２号明細書に記載の式１～１２２のコンジュゲートとコンジュゲートすることができる。
参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１００００４３１３号明細書に記載のとおり、遺伝子送達組成物は、ヌクレオチド配列およびポロキサマーを含み得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１００００４３１３号明細書に記載のポロキサマーを有する遺伝子送達組成物において使用することができる。
一実施形態において、本発明のポリマー製剤は、カチオン性担体を含み得るポリマー製剤を、コレステロールおよびポリエチレングリコール基に共有結合していてよいカチオン性リポポリマーと接触させることにより安定化することができる。ポリマー製剤は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９００４２８２９号明細に記載の方法を使用してカチオン性リポポリマーと接触させることができる。カチオン性担体としては、限定されるものではないが、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－ｂ－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣｌ）ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチル塩化アンモニウムＤＯＤＡＣ）およびそれらの組合せを挙げることができる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ポリマー、脂質、および／または他の生分解性薬剤、例えば、限定されるものではないが、リン酸カルシウムの組合せを使用してナノ粒子として製剤化することもできる。構成要素は、ポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡの送達を向上させることができるようにナノ粒子の微調整を可能にするため、コア－シェル、ハイブリッド、および／または交互積層アーキテクチャとして組み合わせることができる（ワン（Ｗａｎｇ）ら著、ネイチャー・マテリアルズ（Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ．）、２００６年、第５巻、ｐ．７９１～７９６；フラー（Ｆｕｌｌｅｒ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２００８年、第２９巻、ｐ．１５２６～１５３２；デコケル（ＤｅＫｏｋｅｒ）ら著、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．）、２０１１年、第６３巻、ｐ．７４８～７６１；エンドレス（Ｅｎｄｒｅｓ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１１年、第３２巻、ｐ．７７２１～７７３１；スウ（Ｓｕ）ら著、モレキュラー・ファーマシューティカルズ（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．）、２０１１年、６月６日、第８巻（第３号）、ｐ．７７４～８７；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
脂質および／またはポリマーとの組合せの生分解性リン酸カルシウムナノ粒子は、インビボでポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡを送達することが示されている。一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡを送達するために標的化リガンド、例えば、アニスアミドも含有し得る脂質コーティングリン酸カルシウムナノ粒子を使用することができる。例えば、マウス転移性肺モデルにおいてｓｉＲＮＡを有効に送達するために、脂質コーティングリン酸カルシウムナノ粒子が使用された（リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒ
Ｒｅｌ．）、２０１０年、第１４２巻、ｐ．４１６～４２１；リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ．）、２０１２年、第１５８巻、ｐ．１０８～１１４；ヤン（Ｙａｎｇ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２０１２年、第２０巻、ｐ．６０９～６１５）。この送達系は、ｓｉＲＮＡの送達を改善するために標的化ナノ粒子と、エンドソームからの脱出を向上させるための構成要素リン酸カルシウムとの両方を組み合わせる。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡを送達するため、ＰＥＧ－ポリアニオンブロックコポリマーとともにリン酸カルシウムを使用することができる（カジカワ（Ｋａｚｉｋａｗａ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ．）、２００４年、第９７巻、ｐ．３４５～３５６；カジカワ（Ｋａｚｉｋａｗａ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ．）、２００６年、第１１１巻、ｐ．３６８～３７０）。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡを送達するためのナノ粒子を形成するため、ＰＥＧ電荷変換型ポリマー（ピテラ（Ｐｉｔｅｌｌａ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１１年、第３２巻、ｐ．３１０６～３１１４）を使用することができる。ＰＥＧ電荷変換型ポリマーは、酸性ｐＨにおいてポリカチオンに開裂され、したがってエンドソームからの脱出を向上させることによりＰＥＧ－ポリアニオンブロックコポリマーを改善し得る。
コア－シェルナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコアおよび種々のシェルを合成するための高スループットアプローチにさらにフォーカスしている（ジークワルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２９９６～１３００１）。ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達、および内在化は、ナノ粒子のコアおよびシェル構成要素の両方の化学組成を変更することにより正確に制御することができる。例えば、コア－シェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後に、ｓｉＲＮＡをマウス肝細胞に効率的に送達し得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡを送達するため、中間のＰＬＧＡ層およびＰＥＧを含有する外側の中性脂質層を含む、中空の脂質コアを使用することができる。非限定的な例として、ルシフェラーゼ発現腫瘍を担持するマウスにおいて、脂質－ポリマー－脂質ハイブリッドナノ粒子が、慣用のリポプレックスと比較してルシフェラーゼ発現を有意に抑制することが確認された（参照により全体が本明細書に組み込まれる、シー（Ｓｈｉ）ら著、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ．）、２０１１年、第５０巻、ｐ．７０２７～７０３１）。
ペプチドおよびタンパク質
本発明の合成ポリヌクレオチドおよび／または合成ｓｇＲＮＡは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによる細胞の形質移入を増加させるためにペプチドおよび／またはタンパク質とともに製剤化することができる。一実施形態において、医薬製剤を送達するため、ペプチド、例えば、限定されるものではないが、細胞透過性ペプチドならびに細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチドを使用することができる。本発明の医薬製剤とともに使用することができる細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、細胞内空間への送達を容易にする、ポリカチオンに付着している細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドが挙げられる（例えば、カロン（Ｃａｒｏｎ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第３巻（第３号）、ｐ．３１０～８、２００１年、ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ）著、「細胞浸透ペプチド：プロセスおよび用途（Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（ＣＲＣプレス、ボカラトン、フロリダ、２００２年）、エルアンダロウシ（Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ）ら著、カレント・ファーマシューティカル・デザイン（Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．）、第１１巻（第２８号）、ｐ．３５９７～６１１、２００３年、およびデシャイエズ（Ｄｅｓｈａｙｅｓ）ら著、セルラー・アンド・モレキュラー・ライフ・サイエンシズ（Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．）、第６２巻（第１６号）、ｐ．１８３９～４９、２００５年参照、それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。組成物は、組成物の細胞内空間への送達を向上させる細胞透過性薬剤、例えば、リポソームを含むように製剤化することもできる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、細胞内送達を可能にするため、ペプチドおよび／またはタンパク質、例えば、限定されるものではないが、アイレロン・セラピューティクス（Ａｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（ケンブリッジ、マサチューセッツ）およびペルメオン・バイオロジクス（Ｐｅｒｍｅｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）（ケンブリッジ、マサチューセッツ）からのペプチドおよび／またはタンパク質に複合体形成することができる（クロニカン（Ｃｒｏｎｉｃａｎ）ら著、ＡＣＳケミカルバイオロジー（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．）、２０１０年、第５巻、ｐ．７４７～７５２；マクノートン（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２００９年、第１０６巻、ｐ．６１１１～６１１６；ソーヤ（Ｓａｗｙｅｒ）著、ケミカル・バイオロジー・アンド・ドラッグ・デザイン（Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．）、２００９年、第７３巻、ｐ．３～６；ヴェルディン（Ｖｅｒｄｉｎｅ）およびヒリンスキ（Ｈｉｌｉｎｓｋｉ）著、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、２０１２年、第５０３巻、ｐ．３～３３；それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
一実施形態において、細胞透過性ポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含み得る。第１のドメインは、超荷電ポリペプチドを含み得る。第２のドメインは、タンパク質結合相手を含み得る。本明細書において使用される場合、「タンパク質結合相手」としては、限定されるものではないが、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが挙げられる。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合相手のための細胞内結合相手をさらに含み得る。細胞透過性ポリペプチドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを導入することができる細胞から分泌され得る。
ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによる細胞形質移入を増加させ、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡの生体分布を変更し（例えば、規定の組織または細胞型を標的化することにより）、および／またはコードされるタンパク質の翻訳を増加させるため、ペプチドまたはタンパク質を含む製剤を使用することができる。
細胞
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、エクスビボで細胞中に形質移入することができ、続いてそれを対象に移植する。非限定的な例として、医薬組成物は、修飾ＲＮＡを肝臓および骨髄細胞に送達するための赤血球、修飾ＲＮＡをウイルス様粒子（ＶＬＰ）中で送達するためのビロソーム、ならびに修飾ＲＮＡを送達するためのエレクトロポレーション処理細胞、例えば、限定されるものではないが、マックスサイト（ＭＡＸＣＹＴＥ）（登録商標）（ゲイザースバーグ、メリーランド）およびエリテック（ＥＲＹＴＥＣＨ）（登録商標）（リヨン、フランス）からの細胞を含み得る。ｍｍＲＮＡ以外のペイロードを送達するための赤血球、ウイルス粒子およびエレクトロポレーション処理細胞の使用例が報告されている（ゴドフリン（Ｇｏｄｆｒｉｎ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ
Ｔｈｅｒ．）、２０１２年、第１２巻、ｐ．１２７～１３３；ファン（Ｆａｎｇ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２０１２年、第１２巻、ｐ．３８５～３８９；フウ（Ｈｕ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１０９８０～１０９８５；ランド（Ｌｕｎｄ）ら著、ファーマシューティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．）、２０１０年、第２７巻、ｐ．４００～４２０；フックリード（Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・リポソーム・リサーチ（Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．）、２００７年、第１７巻、ｐ．３９～４７；クシ（Ｃｕｓｉ）著、ヒューマン・ワクチン（Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ）、２００６年、第２巻、ｐ．１～７；ド・ジョンジュ（ｄｅ Ｊｏｎｇｅ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２００６年、第１３巻、ｐ．４００～４１１；それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
ポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１０８５２３１号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０１７１２４８号明細書に記載の方法により合成される合成ＶＬＰ中で送達することができる。
細胞形質移入を確保し（例えば、細胞担体中の）、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡの生体分布を変更し（例えば、細胞担体を規定な組織または細胞型に標的化することにより）、および／またはコードされるタンパク質の翻訳を増加させるため、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの細胞ベースの製剤を使用することができる。
種々の方法、例として、ウイルスおよび非ウイルス媒介性技術が当分野において公知であり、核酸の細胞内への導入に好適である。典型的な非ウイルス媒介性技法の例としては、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介性移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介性移入（ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）または細胞融合が挙げられる。
ソノポレーション、または細胞超音波処理の技術は、細胞原形質膜の透過性を改変するための音（例えば、超音波周波数）の使用である。ソノポレーション法は、当業者に公知であり、インビボで核酸を送達するために使用される（ヨーン（Ｙｏｏｎ）およびパーク（Ｐａｒｋ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．）、２０１０年、第７巻、ｐ．３２１～３３０；ポステマ（Ｐｏｓｔｅｍａ）およびギルジャ（Ｇｉｌｊａ）著、カレント・ファーマシューティカル・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００７年、第８巻、ｐ．３５５～３６１；ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）およびベティンガー（Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ）著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２００７年、第１４巻、ｐ．４６５～４７５；それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。ソノポレーション法は、当分野において公知であり、例えば、それが細菌に関する場合、米国特許出願公開第２０１００１９６９８３号明細書において、それが他の細胞型に関する場合、例えば、米国特許出願公開２０１００００９４２４号明細書において教示され、これらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
エレクトロポレーション技術も当分野において周知であり、インビボでおよび臨床的に核酸を送達するために使用される（アンドレ（Ａｎｄｒｅ）ら著、カレント・ジーン・セラピー（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１０巻、ｐ．２６７～２８０；キアレッラ（Ｃｈｉａｒｅｌｌａ）ら著、カレント・ジーン・セラピー（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１０巻、ｐ．２８１～２８６；ホジマン（Ｈｏｊｍａｎ）、カレント・ジーン・セラピー（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１０巻、ｐ．１２８～１３８；全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、実施例２６に記載のとおりエレクトロポレーションにより送達することができる。
ヒアルロニダーゼ
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの筋肉内または皮下局所注射は、ヒアルロナンの加水分解を触媒するヒアルロニダーゼを含み得る。間質性の関門の構成物質であるヒアルロナンの加水分解を触媒することにより、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それにより組織透過性を増加させる（フロスト（Ｆｒｏｓｔ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．）、２００７年、第４巻、ｐ．４２７～４４０；参照により全体として本明細書に組み込まれる）。それらの分散および形質移入細胞により産生されるコードタンパク質の全身への分布を加速することが有用である。あるいは、筋肉内または皮下投与された本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに曝露される細胞の数を増加させるため、ヒアルロニダーゼを使用することができる。
ナノ粒子ミミック
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ナノ粒子ミミック内に封入し、および／またはそれに吸収させることができる。ナノ粒子ミミックは、生物または粒子、例えば、限定されるものではないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオンおよび細胞の送達機能を模倣し得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ウイルスの送達機能を模倣し得る非バイロン（ｎｏｎ－ｖｉｒｏｎ）粒子中に封入することができる（参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１２００６３７６号パンフレット参照）。
ナノチューブ
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのナノチューブ、例えば、限定されるものではないが、ロゼットナノチューブ、リンカーを用いるツイン塩基（ｔｗｉｎ ｂａｓｅｓ）を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブおよび／または単層カーボンナノチューブに付着またはそうでなければ結合させることができる。ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、力、例えば、限定されるものではないが、立体力、イオン力、共有結合力および／または他の力を介してナノチューブに結合させることができる。
一実施形態において、ナノチューブは、１つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを細胞中に放出し得る。体内でナノチューブの相互作用を制御し、および／または本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物もしくはｍｍＲＮＡに付着もしくは結合するように、少なくとも１つのナノチューブのサイズおよび／または表面構造を変更することができる。一実施形態において、ナノチューブの寸法および／または特性を調整するように、少なくとも１つのナノチューブのビルディングブロックおよび／またはそのビルディングブロックに付着される官能基を変更することができる。非限定的な例として、ナノチューブの長さは、ナノチューブが正常な血管の壁の穴を通過するのを妨害するが、依然として腫瘍組織の血管におけるより大きい穴を通過するのに十分に小さくあるように変更することができる。
一実施形態において、少なくとも１つのナノチューブは、送達向上化合物、例として、ポリマー、例えば、限定されるものではないが、ポリエチレングリコールによりコーティングすることもできる。別の実施形態において、少なくとも１つのナノチューブおよび／またはポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、薬学的に許容可能な賦形剤および／または送達ビヒクルと混合することができる。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのロゼットナノチューブに付着および／またはそうでなければ結合させる。ロゼットナノチューブは、当分野において公知のプロセスにより、および／または参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０９４３０４号パンフレットに記載のプロセスにより形成することができる。少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０９４３０４号パンフレットに記載のプロセスにより、少なくとも１つのロゼットナノチューブに付着および／またはそうでなければ結合させることができ、ここでロゼットナノチューブまたはロゼットナノチューブを形成するモジュールは、水性媒体中で、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡをロゼットナノチューブに付着またはそうでなければ結合させ得る条件下で、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡと混合する。
コンジュゲート
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、コンジュゲート、例えば、担体もしくは標的化基に共有結合している、または融合タンパク質を一緒に産生する２つのコード領域を含む（例えば、標的化基および治療タンパク質またはペプチドを担持する）、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含む。
本発明のコンジュゲートは、天然存在物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質を含む。リガンドは、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）でもあり得る。ポリアミノ酸の例としては、以下のものが挙げられ、ポリアミノ酸は、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコライド）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンである。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、アルファヘリックスペプチドが挙げられる。
ポリヌクレオチドコンジュゲートの調製、特にＲＮＡの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書、同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書および同第５，６８８，９４１号明細書；同第６，２９４，６６４号明細書；同第６，３２０，０１７号明細書；同第６，５７６，７５２号明細書；同第６，７８３，９３１号明細書；同第６，９００，２９７号明細書；同第７，０３７，６４６号明細書が挙げられる。
一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡのための担体として機能し得る。コンジュゲートは、カチオン性ポリマー、例えば、限定されるものではないが、ポリ（エチレングリコール）を用いてグラフトすることができるポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、およびポリエチレンイミンを含み得る。非限定的な例として、コンジュゲートは、ポリマーコンジュゲートと類似であり得、ポリマーコンジュゲートを合成する方法は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，５８６，５２４号明細書に記載されている。
コンジュゲートは、標的化基、例えば、細胞または組織標的化薬剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、細胞型、例えば、腎細胞に結合する抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、ホレート、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体またはアプタマーであり得る。
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドについての特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、規定の細胞型、例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞に結合する抗体であり得る。標的化基としては、ホルモンおよびホルモン受容体を挙げることもできる。これらとしては、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーを挙げることもできる。リガンドは、例えば、リポ多糖、またはｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子であり得る。
標的化基は、特異的受容体を標的化し得る任意のリガンドであり得る。例としては、限定されるものではないが、ホレート、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース－６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、およびＨＤＬリガンドが挙げられる。特定の実施形態において、標的化基は、アプタマーである。アプタマーは、未修飾であり得、または本明細書に開示の修飾の任意の組合せを有し得る。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、化学修飾、例えば、限定されるものではないが、ロックド核酸と類似の修飾を含み得る。
ロックド核酸（ＬＮＡ）、例えば、サンタリス（Ｓａｎｔａｒｉｓ）からのものの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、以下のもの：米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，６７０，４６１号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第６，９９８，４８４号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；および同第７，３９９，８４５号明細書が挙げられる。
ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；および同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１年、第２５４巻、ｐ．１４９７～１５００に見出すことができる。
本発明の特色をなす一部の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡならびに他の修飾骨格、特に、上記参照の米国特許第５，４８９，６７７号明細書の－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知］、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－および－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－［式中、天然ホスホジエステル骨格は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－ＣＨ２－として表される］、および上記参照の米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドを含む。一部の実施形態において、本明細書の特色をなすポリヌクレオチドは、上記参照の米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ骨格構造を有する。
２’位における修飾も送達を支援し得る。好ましくは、２’位における修飾は、ポリペプチドコード配列中に局在せず、すなわち、翻訳可能領域中に存在しない。２’位における修飾は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび／またはテーリング領域に局在させることができる。２’位における修飾は、２’位において以下の１つを含み得る：Ｈ（すなわち、２’－デオキシ）；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキル（式中、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る）。例示的な好適な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）・ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、式中、ｎおよびｍは、１～約１０である。他の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、２’位において以下の１つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールもしくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポータ基、インターカレータ、薬物動態特性を改善するための基、または薬力学特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基。一部の実施形態において、修飾としては、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥ）としても公知である）（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら著、ヘルヴェティカ・ケミカ・アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、１９９５年、第７８巻、ｐ．４８６～５０４）すなわち、アルコキシ－アルコキシ基が挙げられる。別の例示的修飾は、本明細書の以下の実施例に記載の２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’－ＤＭＡＯＥとしても公知）、および同様に本明細書の以下の実施例に記載の２’－ジメチルアミノエトキシ（当分野において２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても公知）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ２）２である。他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。類似の修飾は、他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位において、または２’－５’結合ｄｓＲＮＡ中で、および５’末端ヌクレオチドの５’位において作製することもできる。本発明のポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに糖模倣体、例えば、シクロブチル部分も有し得る。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書、同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；および同第５，７００，９２０号明細書が挙げられる。
さらに他の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、細胞透過性ポリペプチドに共有結合的にコンジュゲートされる。細胞透過性ペプチドは、シグナル配列も含み得る。本発明のコンジュゲートは、増加した安定性；増加した細胞形質移入；および／または変更された生体分布（例えば、規定の組織または細胞型に標的化される）を有するように設計することができる。
自己集合性核酸ナノ粒子
自己集合性ナノ粒子は、核酸鎖が容易にリプログラミング可能であり得るように正確に制御することができる、明確に定義されたサイズを有する。例えば、２０ｎｍ超の直径が向上した透過性および保持効果を介して腎クリアランスを回避し、ある腫瘍への送達を向上させるため、癌標的化ナノ送達担体のために最適な粒子サイズは２０～１００ｎｍである。自己集合性核酸ナノ粒子を使用して、向上した送達のために癌標的化リガンドの正確に制御された空間配向および密度を有する、サイズおよび形が均一な単一の集団。非限定的な例として、オリゴヌクレオチドナノ粒子が、ショートＤＮＡ断片および治療ｓｉＲＮＡのプログラミング可能な自己集合を使用して調製される。これらのナノ粒子は、制御可能な粒子サイズならびに標的リガンド局在および密度を有し、分子的に同一である。ＤＮＡ断片およびｓｉＲＮＡは、１ステップ反応に自己集合し、標的化インビボ送達のためにＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ四面体ナノ粒子を生成した。（リー（Ｌｅｅ）ら著、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１２年、第７巻、ｐ．３８９～３９３）。
賦形剤
医薬製剤は、本明細書において使用される場合、所望される特定の剤形に好適なありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などが挙げられる薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含み得る。参照により全体として本明細書に組み込まれる、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著、「製薬の科学および実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）、リッペンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ボルティモア、メリーランド、２００６年参照；は、医薬組成物の製剤化において使用される種々の賦形剤およびそれらの調製のための公知の技術を開示する。例えば、任意の不所望な生体影響をもたらし、またはそうでなければ医薬組成物の任意の他の構成要素と有害な様式で相互作用することにより任意の慣用の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と不適合性であり得る場合を除き、その使用が本開示の範囲内であることが企図される。
一部の実施形態において、薬学的に許容可能な賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。一部の実施形態において、賦形剤は、ヒトにおける使用および獣医学的使用に対して認可されている。一部の実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により認可されている。一部の実施形態において、賦形剤は、医薬品グレードである。一部の実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＵＳＰ））、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＥＰ））、英国薬局方（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、および／または国際薬局方（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の基準を満たしている。
医薬組成物の製造において使用される薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されるものではないが、不活性希釈剤、分散化剤および／もしくは造粒剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに／または油が挙げられる。このような賦形剤は、場合により医薬組成物中に含めることができる。
例示的な希釈剤としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微小結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉糖など、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
例示的な造粒剤および／または分散化剤としては、限定されるものではないが、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘パルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木質製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル－ピロリドン）（クロスポビドン）、ナトリウムカルボキシメチルデンプン（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微小結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ヴィーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物など、ならびに／またはそれらの組合せが挙げられる。
例示的な界面活性剤および／または乳化剤としては、限定されるものではないが、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド状粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびヴィーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末化セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン［ツイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ツイーン（ＴＷＥＥＮ）ｎ（登録商標）６０］、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ツイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）８０］、モノパルミチン酸ソルビタン［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）４０］、モノステアリン酸ソルビタン［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６０］、トリステアリン酸ソルビタン［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、およびソルトール（ＳＯＬＵＴＯＬ）（登録商標））、スクロース糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、クレモホル（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル－ピロリドン）、モノラウリル酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、プルオリンク（ＰＬＵＯＲＩＮＣ）（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー（ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ）（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウムなど、ならびに／またはそれらの組合せが挙げられる。
例示的な結合剤としては、限定されるものではないが、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプンペースト）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール、）；天然および合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュ・モスの抽出物、パンワール（ｐａｎｗａｒ）ガム、ガティガム、イサポール（ｉｓａｐｏｌ）皮の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微小結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル－ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ヴィーガム（Ｖｅｅｇｕｍ）（登録商標））、およびカラマツアラボガラクタン（ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコールなど；ならびにそれらの組合せが挙げられる。
例示的な保存剤としては、限定されるものではないが、酸化防止剤、キレート剤、抗菌性保存剤、抗真菌性保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、および／または他の保存剤を挙げることができる。例示的な酸化防止剤としては、限定されるものではないが、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル（ａｃｏｒｂｙｌ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または亜硫酸ナトリウムが挙げられる。例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。例示的な抗菌性保存剤としては、限定されるものではないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが挙げられる。例示的な抗真菌性保存剤としては、限定されるものではないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が挙げられる。例示的なアルコール保存剤としては、限定されるものではないが、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール系化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、および／またはフェニルエチルアルコールが挙げられる。例示的な酸性保存剤としては、限定されるものではないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ－カロテン、クエン酸、酢酸、ジヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が挙げられる。他の保存剤としては、限定されるものではないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエンド（ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅｄ）（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、グリダントプラス（ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ）（登録商標）、フェノニップ（ＰＨＥＮＯＮＩＰ）（登録商標）、メチルパラベン、ゲルマール（ＧＥＲＭＡＬＬ）（登録商標）１１５、ゲルマベン（ＧＥＲＭＡＢＥＮ）（登録商標）ＩＩ、ネオロン（ＮＥＯＬＯＮＥ）（商標）、カトン（ＫＡＴＨＯＮ）（商標）、および／またはユーキシル（ＥＵＸＹＬ）（登録商標）が挙げられる。
例示的な緩衝剤としては、限定されるものではないが、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプチン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコールなど、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
例示的な滑沢剤としては、限定されるものではないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、グリセリルベハネート（ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｂｅｈａｎａｔｅ）、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、およびそれらの組合せが挙げられる。
例示的な油としては、限定されるものではないが、アーモンド油、杏仁油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、ブラックカラント種子油、ルリジサ油、カデ油、カモミール油、キャノーラ油、キャラウェイ油、カルナバ油、ヒマシ油、桂皮油、ココアバター油、ココナッツ油、タラ肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、月見草油、魚油、亜麻仁油、ゲラニオール油、ウリ油、ブドウ種子油、ヘーゼルナッツ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル油、ホホバ油、ククイナッツ油、ラバンジン油、ラベンダー油、レモン油、リツェアクベバ油、マカダミアナッツ油、ゼニアオイ油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、桃仁油、ピーナッツ油、ケシ種子油、カボチャ種子油、菜種油、米糠油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サスクアナ（ｓａｓｑｕａｎａ）油、セイボリー油、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター油、シリコーン油、ダイズ油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチバー油、クルミ油、および小麦胚芽油が挙げられる。例示的な油としては、限定されるものではないが、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
配合者の判断に従って、賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、矯味剤、ならびに／または着香剤が組成物中に存在し得る。
送達
本開示は、薬物送達の科学進展を考慮する可能性の高い任意の適切な経路による治療、薬学、診断、またはイメージングのいずれかのためのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの送達を包含する。送達は、ネイキッド送達でも製剤化送達でもよい。
ネイキッド送達
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ネイキッドで細胞に送達することができる。本明細書において使用される場合、「ネイキッド」は、形質移入を促進する薬剤を用いずにポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、修飾を含有し得ない。ネイキッドポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、当分野において公知であり、および本明細書に記載の投与経路を使用して細胞に送達することができる。
製剤送達
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の方法を使用して製剤化することができる。製剤は、修飾および／または未修飾であり得るポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含有し得る。製剤は、限定されるものではないが、細胞透過剤、薬学的に許容可能な担体、送達剤、生体内分解性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポーをさらに含み得る。製剤化されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、当分野において公知であり、および本明細書に記載の投与経路を使用して細胞に送達することができる。
組成物は、当分野におけるいくつかの手法のいずれか、例として、限定されるものではないが、直接浸漬または浸浴、カテーテルを介して、ゲル剤、散剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、および／または点滴剤により、基材、例えば、組成物によりコーティングまたは含浸されたファブリックまたは生分解性材料を使用することにより、器官または組織への直接送達のために製剤化することもできる。
投与
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、治療有効アウトカムをもたらす任意の経路により投与することができる。これらとしては、限定されるものではないが、経腸、経胃腸、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（硬膜上）、脳内（大脳の中へ）、脳室内（脳室の中へ）、皮膚上（皮膚上への適用）、皮内、（皮膚自体の中へ）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈中へ）、動脈内（動脈中へ）、筋肉内（筋肉中へ）、心臓内（心臓中へ）、骨内輸注（骨髄中へ）、鞘内（脊柱管中へ）、腹腔内（腹腔の中への輸注または注射）、膀胱内輸注、硝子体内（眼を介して）、空洞内注射（陰茎基部中へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分布のための無傷の皮膚を介する拡散）、経粘膜（粘膜を介する拡散）、吸入（鼻からの吸引）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上に）、または点耳におけるものが挙げられる。具体的な実施形態において、組成物は、それらが血液－脳関門、血管関門、または他の上皮関門を横断することを可能とするような手法で投与することもできる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのための非限定的な投与経路は、以下に記載される。
非経口および注射による投与
経口および非経口投与のための液体剤形としては、限定されるものではないが、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシルが挙げられる。活性成分に加え、液体剤形は、当分野において一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸塩、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などを含み得る。不活性希釈剤の他、経口組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、矯味剤、および／または着香剤を含み得る。非経口投与のためのある実施形態において、組成物は、可溶化剤、例えば、クレモホル（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはそれらの組合せと混合される。
注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、公知の技術に従って、好適な分散化剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を使用して製剤化することもできる。滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤および／または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液、および／またはエマルション、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液としてのものであり得る。用いることができる許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張塩化ナトリウム溶液がある。滅菌固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣用的に用いられる。この目的のため、任意の無菌性の固定油、例として、合成モノ－またはジグリセリドを用いることができる。注射剤の調製において、脂肪酸、例えば、オレイン酸を使用することができる。
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルタに通す濾過により、および／または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体中に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を取り込むことにより滅菌することができる。
活性成分の効果を延長させるため、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅延させることが所望され得る。これは、水への溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用により達成することができる。次いで、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、次いで、溶解速度は結晶サイズおよび結晶形に依存し得る。あるいは、非経口的に投与される薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクル中に溶解または懸濁させることにより達成される。注射用デポー形態は、生分解性ポリマー、例えば、ポリラクチド－ポリグリコライド中に薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作製される。薬物とポリマーとの比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、薬物を、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に捕捉することにより調製される。
直腸および膣内投与
直腸または膣内投与のための組成物は、典型的に坐剤であり、それは組成物を、例えば、周囲温度において固体であるが、体温において液体であり、したがって直腸または膣腔中で溶解して活性成分を放出する好適な非刺激性賦形剤、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスと混合することにより調製することができる。
経口投与
経口投与のための固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、ピル、散剤、および顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形において、活性成分は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムおよび／または充填剤もしくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシア）、保湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、あるケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）、ならびに滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、ならびにそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤およびピルの場合、剤形は緩衝剤を含み得る。
局所または経皮投与
本明細書に記載のとおり、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含有する組成物は、局所投与のために製剤化することができる。皮膚は、それが容易に接近可能であるため、送達に理想的な標的部位であり得る。遺伝子発現は、皮膚に対して制限され、非特異的な毒性を潜在的に回避するだけでなく、皮膚内の特異的な層および細胞型に対しても制限され得る。
送達される組成物の皮膚発現の部位は、核酸送達の経路に依存する。次の３つの経路がポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを皮膚に送達するために一般に考慮される：（ｉ）局所適用（例えば、局所／局部治療および／または美容用途のため）；（ｉｉ）経皮注射（例えば、局所／局部治療および／または美容用途のため）；ならびに（ｉｉｉ）全身送達（例えば、皮膚領域および皮膚外領域の両方を侵す皮膚疾患の治療のため）、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、当分野において公知のいくつかの異なるアプローチにより皮膚に送達することができる。ほとんどの局所送達アプローチ、例えば、限定されるものではないが、非カチオン性リポソーム－ＤＮＡ複合体、カチオン性リポソーム－ＤＮＡ複合体の局所適用、粒子媒介性（遺伝子銃）、穿刺媒介性遺伝子形質移入、およびウイルス送達アプローチが、ＤＮＡの送達に役立つことが示されている。核酸の送達後、遺伝子産物が、多数の異なる皮膚細胞型、例として、限定されるものではないが、基底ケラチン生成細胞、皮脂腺細胞、真皮線維芽細胞および真皮マクロファージ中で検出されている。
一実施形態において、本発明は、本発明の方法を好都合に、および／または有効に実施するための種々のドレッシング（例えば、創傷ドレッシング）または包帯（例えば、粘着包帯）を提供する。典型的には、ドレッシングまたは包帯は、使用者が対象の複数の治療を実施することを可能とするために、本明細書に記載の十分な量の医薬組成物および／またはポリヌクレオチド、一次構築物もしくはｍｍＲＮＡを含み得る。
一実施形態において、本発明は、２回以上の注射で送達すべきポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ組成物を提供する。
一実施形態において、局所および／または経皮投与の前に、透過性を増加させ得るデバイスおよび／または溶液に少なくとも１つの組織の区域、例えば、皮膚を供することができる。一実施形態において、組織は、皮膚の透過性を増加させるため、研磨デバイスに供することができる（参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８０２７５４６８号明細書参照）。別の実施形態において、組織は、超音波強化デバイスに供することができる。超音波強化デバイスとしては、限定されるものではないが、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４０２３６２６８号明細書ならびに米国特許第６，４９１，６５７号明細書および同第６，２３４，９９０号明細書に記載のデバイスを挙げることができる。組織の透過性を向上させる方法は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４０１７１９８０号明細書および同第２００４０２３６２６８号明細書ならびに米国特許第６，１９０，３１５号明細書に記載されている。
一実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡの製剤を送達する前に組織の透過性を増加させるためにデバイスを使用することができる。皮膚の透過性は、当分野において公知の方法および／または参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，３１５号明細書に記載の方法により計測することができる。非限定的な例として、修飾ｍＲＮＡ製剤は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，３１５号明細書に記載の薬物送達法により送達することができる。
別の非限定的な例において、組織は、透過性を増加させ得るデバイスに組織が供され得る前、その間および／またはその後に、局所麻酔薬の共融混合物（ＥＭＬＡ）クリームにより処理することができる。カッツ（Ｋａｔｚ）ら（アネスセジア・アンド・アナルゲジア（Ａｎｅｓｔｈ Ａｎａｌｇ）、２００４年、第９８巻、ｐ．３７１～７６；参照により全体として本明細書に組み込まれる）は、ＥＭＬＡクリームを低エネルギーと組み合わせて使用して、表在性皮膚鎮痛の発生が低エネルギー超音波による前処理の早くも５分後に見られたことを示した。
一実施形態において、透過性を増加させるために組織が処理される前、その間、および／またはその後に、促進剤を組織に適用することができる。促進剤としては、限定されるものではないが、輸送促進剤、物理的促進剤、およびキャビテーション促進剤が挙げられる。促進剤の非限定的な例は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，３１５号明細書に記載されている。
一実施形態において、免疫応答を誘発する物質をさらに含有し得る、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡの製剤を送達する前に、組織の透過性を増加させるためにデバイスを使用することができる。別の非限定的な例において、免疫応答を誘発する物質を含有する製剤は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４０１７１９８０号明細書および同第２００４０２３６２６８号明細書に記載の方法により送達することができる。
組成物の局所および／または経皮投与のための剤形としては、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤および／または貼付剤を挙げることができる。一般に、活性成分は、滅菌条件下で、要求され得るとおりに薬学的に許容可能な賦形剤ならびに／または任意の必要とされる保存剤および／もしくは緩衝液と混和される。
さらに、本発明は、経皮貼付剤の使用を企図し、それは身体への化合物の制御送達を提供するという追加の利点を有することが多い。このような剤形は、例えば、化合物を適切な媒体中で溶解させ、および／または分注することにより調製することができる。あるいは、またはさらに、速度は、速度制御膜を提供することならびに／または化合物をポリマーマトリックスおよび／もしくはゲル中に分散させることにより制御することができる。
局所投与に好適な製剤としては、限定されるものではないが、液体および／もしくは半液体製剤、例えば、リニメント剤、ローション剤、水中油型および／もしくは油中水型エマルション、例えば、クリーム剤、軟膏剤および／もしくはペースト剤、ならびに／または液剤および／もしくは懸濁液が挙げられる。局所的に投与可能な製剤は、例えば、約０．１％～約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解度の限度ほど高くてよい。局所投与のための製剤は、本明細書に記載の追加の成分の１つ以上をさらに含み得る。
デポー投与
本明細書に記載のとおり、一部の実施形態において、組成物は、持続放出のためのデポー中に製剤化される。一般に、規定の器官または組織（「標的組織」）が、投与のために標的化される。
本発明の一部の態様において、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、標的組織内またはその近位で空間的に保持される。標的組織（１つ以上の標的細胞を含有する）を組成物と、組成物、特に組成物の核酸構成要素が標的組織中で実質的に保持され、すなわち、組成物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％超が標的組織中で保持されるような条件下で接触させることにより、組成物を哺乳動物対象の標的組織に提供する方法が提供される。有利には、保持は、１つ以上の標的細胞に進入する組成物中に存在する核酸の量を計測することにより決定される。例えば、投与の一定期間後に、対象に投与される核酸の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９または９９．９９％超が細胞中に存在する。例えば、哺乳動物対象への筋肉内注射が、リボ核酸および形質移入試薬を含有する水性組成物を使用して実施され、組成物の保持は、筋肉細胞中に存在するリボ核酸の量を計測することにより決定される。
本発明の態様は、標的組織（１つ以上の標的細胞を含有する）を組成物と、組成物が標的組織中で実質的に保持されるような条件下で接触させることにより、組成物を哺乳動物対象の標的組織に提供する方法を対象とする。組成物は、目的ポリペプチドが少なくとも１つの標的細胞中で産生されるように、有効量のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含有する。組成物は一般に、細胞透過剤、および薬学的に許容可能な担体を含有するが、「ネイキッド」核酸（例えば、細胞透過剤も他の薬剤も含まない核酸）もまた企図される。
一部の状況において、組織中の細胞により産生されるタンパク質の量は、望ましくは増加される。好ましくは、タンパク質産生のこの増加は、標的組織内の細胞に空間的に制限される。したがって、哺乳動物対象の組織中の目的タンパク質の産生を増加させる方法が提供される。標的組織の所定体積内に含有される細胞のかなりの割合において目的ポリペプチドを産生するように組成物の単位量が決定されていることで特徴付けられる、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含有する組成物が提供される。
一部の実施形態において、組成物は、複数の異なるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含み、このポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの１つまたは２つ以上が目的ポリペプチドをコードする。場合により、組成物は、組成物の細胞内送達を支援するための細胞透過剤も含有する。標的組織の所定体積内に含有される細胞のかなりの割合において目的ポリペプチドを産生する（一般に、所定体積に隣接し、または標的組織に遠位の組織中で目的ポリペプチドの顕著な産生を誘導することなく）ために要求される組成物の用量の決定が行われる。この決定に続いて、決定された用量が哺乳動物対象の組織中に直接導入される。
一実施形態において、本発明は、２回以上の注射で、または分割用量注射により送達すべきポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを提供する。
一実施形態において、本発明は、小型の使い捨て薬物リザーバまたはパッチポンプを使用して標的組織の付近で保持することができる。パッチポンプの非限定的な例としては、ＢＤ（登録商標）（フランクリン・レイクス、ニュージャージ）、インスレット・コーポレーション（Ｉｎｓｕｌｅｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ベドフォード、マサチューセッツ）、ステディメッド・セラピューティクス（ＳｔｅａｄｙＭｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（サンフランシスコ、カリフォルニア）、メドトロニック（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）（ミネアポリス、ミネソタ）、ユニライフ（ＵｎｉＬｉｆｅ）（ヨーク、ペンシルベニア）、ヴァレリタス（Ｖａｌｅｒｉｔａｓ）（ブリッジウォータ、ニュージャージ）、およびスプリングリーフ・セラピューティクス（ＳｐｒｉｎｇＬｅａｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（ボストン、マサチューセッツ）により製造および／または販売されるものが挙げられる。
肺投与
医薬組成物は、口腔を介する肺投与に好適な製剤中に調製し、パッケージングし、および／または販売することができる。このような製剤は、活性成分を含み、約０．５ｎｍ～約７ｎｍまたは約１ｎｍ～約６ｎｍの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。このような組成物は、好適には、粉末を分散させるように噴射剤の流れを向けることができる乾燥粉末リザーバを含むデバイスを使用し、および／または自己噴射溶媒／粉末分注容器、例えば、密封容器中の低沸点噴射剤中で溶解および／もしくは懸濁させた活性成分を含むデバイスを使用する投与のために、乾燥粉末の形態である。このような粉末は、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ｎｍ超の直径を有し、粒子の少なくとも９５％（数基準）が７ｎｍ未満の直径を有する、粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも９５重量％は、１ｎｍ超の直径を有し、粒子の少なくとも９０％（数基準）は、６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、固体微粉末希釈剤、例えば、糖を含み得、それは単位用量形態で好都合に提供される。
低沸点噴射剤としては、一般に、大気圧において１８．３℃（６５°Ｆ）未満の沸点を有する液体噴射剤が挙げられる。一般に、噴射剤は、組成物の５０％～９９．９％（ｗ／ｗ）を構成し得、活性成分は、組成物の０．１％～２０％（ｗ／ｗ）を構成し得る。噴射剤は、追加の成分、例えば、液体非イオン性および／もしくは固体アニオン性界面活性剤ならびに／または固体希釈剤（活性成分を含む粒子と同一の桁の粒子サイズを有し得る）をさらに含み得る。
肺送達のために製剤化される医薬組成物は、液剤および／または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供し得る。このような製剤は、場合により滅菌された活性成分を含む水性および／または希釈アルコール溶液および／または懸濁液として調製し、パッケージングし、および／または販売することができ、好都合に、任意のネブライゼーションおよび／またはアトマイゼーションデバイスを使用して投与することができる。このような製剤は、１つ以上の追加の成分、例として、限定されるものではないが、矯味剤、例えば、サッカリンナトリウム、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、および／または保存剤、例えば、メチルヒドロキシ安息香酸塩をさらに含み得る。この投与経路により提供される液滴は、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
鼻腔内、経鼻および頬側投与
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約０．２μｍ～５００μｍの平均粒子を有する、粗粉である。このような製剤は、鼻からの吸入が行われる様式で、すなわち、鼻に近くに保持された粉末の容器からの鼻道を介する急速な吸入により投与される。
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、最少約０．１％（ｗ／ｗ）～最大１００％（ｗ／ｗ）活性成分を含み得、本明細書に記載の追加の成分の１つ以上を含み得る。医薬組成物は、頬側投与に好適な製剤中に調製し、パッケージングし、および／または販売することができる。このような製剤は、例えば、慣用の方法を使用して作製される錠剤および／またはロゼンジの形態であり得、例えば、０．１％～２０％（ｗ／ｗ）の活性成分であり得、残部は経口的に溶解性および／または分解性の組成物、ならびに場合により、本明細書に記載の追加の成分の１つ以上を含む。あるいは、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに／またはエアロゾル化および／もしくはアトマイズ化溶液および／もしくは懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散される場合、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均粒子および／または液滴サイズを有し得、本明細書に記載の任意の追加の成分の１つ以上をさらに含み得る。
眼内投与
医薬組成物は、眼内投与に好適な製剤中に調製し、パッケージングし、および／または販売することができる。このような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中に、例えば、０．１／１．０（ｗ／ｗ）％の活性成分の溶液および／または懸濁液を含む、点眼剤の形態であり得る。このような液滴は、緩衝剤、塩、および／または本明細書に記載の任意の追加の成分のもう１つ以上をさらに含み得る。有用である他の眼内投与可能な製剤としては、微小結晶形態でおよび／またはリポソーム製剤中に活性成分を含むものが挙げられる。点耳および／または点眼剤は、本発明の範囲内であると企図される。
ペイロード投与：検出可能な薬剤および治療剤
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、物質（「ペイロード」）の生体標的への送達、例えば、標的の検出のための検出可能な物質の送達、または治療剤の送達が所望される多数の異なるシナリオにおいて使用することができる。検出方法としては、限定されるものではないが、インビトロおよびインビボイメージング法の両方、例えば、免疫組織化学、生物発光イメージング法（ＢＬＩ）、磁気共鳴イメージング法（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、電子顕微鏡法、Ｘ線コンピュータ断層撮影法、ラマンイメージング、光干渉断層撮影法、吸収イメージング、熱イメージング、蛍光反射イメージング、蛍光顕微鏡法、蛍光分子トモグラフィーイメージング、核磁気共鳴イメージング、Ｘ線イメージング、超音波イメージング、光音響イメージング、研究室アッセイ、またはタグ付け／染色／イメージングが要求される任意の状況における方法を挙げることができる。
ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、任意の有用な配向でリンカーおよびペイロードの両方を含むように設計することができる。例えば、一方の末端がペイロードに、および他方の末端が核酸塩基に、例えば、デアザ－アデノシンもしくはデアザ－グアノシンのＣ－７もしくはＣ－８位において、またはシトシンもしくはウラシルのＮ－３もしくはＣ－５位に付着させるため、２つの末端を有するリンカーが使用される。本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上のペイロード（例えば、標識および転写阻害剤）、ならびに開裂可能リンカーを含み得る。一実施形態において、修飾ヌクレオチドは、開裂可能リンカーの一方の末端が７－デアザ－アデニンのＣ７位に付着しており、リンカーの他方の末端が阻害剤（例えば、シチジン上の核酸塩基のＣ５位）に付着され、標識（例えば、Ｃｙ５）がリンカーの中心に付着している、修飾７－デアザ－アデノシン三リン酸である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９９４，３０４号明細書の図５におけるＡ＊ｐＣｐＣ５パーグキャップレス（Ｐａｒｇ Ｃａｐｌｅｓｓ）の化合物１ならびに第９および１０欄参照）。修飾７－デアザ－アデノシン三リン酸がコード領域に取り込まれると、得られるポリヌクレオチドは、標識および阻害剤（例えば、ポリメラーゼ阻害剤）に付着している開裂可能なリンカーを有する。リンカーが開裂されると（例えば、開裂可能ジスルフィド部分を有するリンカーを還元するための還元条件により）、標識および阻害剤が放出される。追加のリンカーおよびペイロード（例えば、治療剤、検出可能な標識、および細胞透過性ペイロード）が本明細書に記載される。
例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）において使用することができ、それによりクラスタ中の総細胞と比較して形質移入される細胞を直接追跡することができる。別の例において、薬物をインビボで、例えば、細胞内で追跡するため、リンカーを介してポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡに付着させることができ、蛍光標識することができる薬物を使用することができる。他の例としては、限定されるものではないが、細胞中への可逆的な薬物送達におけるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの使用が挙げられる。
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療剤の、規定の細胞小器官への細胞内標的化において使用することができる。例示的な細胞内標的としては、限定されるものではないが、高度なｍＲＮＡプロセシングのための核局在化、または阻害剤を含有するｍＲＮＡに結合している核局在化配列（ＮＬＳ）を挙げることができる。
さらに、例えば、生存動物において、治療剤を細胞または組織に送達するため、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを使用することができる。例えば、リンカーを介して治療剤に付着しているポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、メンバーの透過を容易にすることにより、治療剤が細胞中に移動して細胞内標的に到達することを可能とし得る。
一部の実施形態において、ペイロードは、治療剤、例えば、細胞毒、放射性イオン、化学療法剤、または他の治療剤であり得る。細胞毒または細胞傷害性薬剤としては、細胞に有害であり得る任意の薬剤が挙げられる。例としては、限定されるものではないが、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｉｎｅｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール（参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２０８，０２０号明細書）、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５、全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７５，０９２号明細書、同第５，５８５，４９９号明細書、および同第５，８４６，５４５号明細書参照）、ならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。放射性イオンとしては、限定されるものではないが、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、およびプラセオジムが挙げられる。他の治療剤としては、限定されるものではないが、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシル デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ クロラムブシル、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソールおよびマイタンシノイド）が挙げられる。
一部の実施形態において、ペイロードは、検出可能な薬剤、例えば、種々の有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素もしくは酵素基質、蛍光材料、発光材料（例えば、ルミノール）、生物発光材料（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン）、化学発光材料、放射性材料（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、または９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸塩（テクネチウム酸塩（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４ －として）、および造影剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、および超小型超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ－ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨード系造影剤媒体（イオヘキソール（Ｉｏｈｅｘｏｌ））、微小気泡、またはペルフルオロ炭素）であり得る。このような光学検出可能な標識としては、例えば、限定されるものではないが、４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体（例えば、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート）；５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４－アミノ－Ｎ－［３－ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド－３，５ジスルホネート；Ｎ－（４－アニリノ－１－ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体（例えば、クマリン、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、および７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１））；シアニン色素；シアノシン；４’，６－ジアミニジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’－ジブロモピロガロール－スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’－ジイソチオシアナトジヒドロ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸；４，４’－ジイソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸；５－［ジメチルアミノ］－ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４－ジメチルアミノフェニルアゾフェニル－４’－イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体（例えば、エオシンおよびエオシンイソチオシアネート）；エリスロシンおよび誘導体（例えば、エリスロシンＢおよびエリスロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオロセインおよび誘導体（例えば、５－カルボキシフルオロセイン（ＦＡＭ）、５－（４，６－ジクロロトリアジン－２－イル）アミノフルオロセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’－ジメトキシ－４’５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオロセイン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、Ｘ－ローダミン－５－（および－６）－イソチオシアネート（ＱＦＩＴＣまたはＸＲＩＴＣ）、およびフルオレスカミン）；２－［２－［３－［［１，３－ジヒドロ－１，１－ジメチル－３－（３－スルホプロピル）－２Ｈ－ベンズ［ｅ］インドール－２－イリデン］エチリデン］－２－［４－（エトキシカルボニル）－１－ピペラジニル］－１－シクロペンテン－１－イル］エテニル］－１，１－ジメチル－３－（３－スルホルプロピル（ｓｕｌｆｏｒｐｒｏｐｙｌ））－１Ｈ－ベンズ［ｅ］インドリウム水酸化物、分子内塩、ｎ，ｎ－ジエチルエタンアミン（１：１）（ＩＲ１４４）との化合物；５－クロロ－２－［２－［３－［（５－クロロ－３－エチル－２（３Ｈ）－ベンゾチアゾール－イリデン）エチリデン］－２－（ジフェニルアミノ）－１－シクロペンテン－１－イル］エテニル］－３－エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩（ＩＲ１４０）；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４－メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；フェノールレッド；Ｂ－フィコエリトリン；ｏ－フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体（例えば、ピレン、酪酸ピレン、およびスクシンイミジル１－ピレン）；酪酸塩量子ドット；リアクティブレッド４（シバクロン（ＣＩＢＡＣＲＯＮ）（商標）ブリリアントレッド３Ｂ－Ａ）；ローダミンおよび誘導体（例えば、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン－３（Ｃｙ３）；シアニン－５（Ｃｙ５）；シアニン－５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン－７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；アレクサ（Ａｌｅｘａ）６４７；ラジョルタブルー（Ｌａ Ｊｏｌｔａ Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニンが挙げられる。
一部の実施形態において、検出可能な薬剤は、活性化されると検出可能となる、検出不可能な前駆体（例えば、蛍光発生テトラジン－フルオロフォア構築物（例えば、テトラジン－ボディパイ（ＢＯＤＩＰＹ）ＦＬ、テトラジン－オレゴングリーン４８８、またはテトラジン－ボディパイ（ＢＯＤＩＰＹ）ＴＭＲ－Ｘ）、または酵素により活性化可能な蛍光発生剤（例えば、プロセンス（ＰＲＯＳＥＮＳＥ）（登録商標）（ＶｉｓＥｎメディカル（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ）））であり得る。酵素標識組成物を使用することができるインビトロアッセイとしては、限定されるものではないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光法、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、およびウエスタンブロット分析が挙げられる。
組合せ
ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、１つ以上の他の治療剤、予防剤、診断剤、またはイメージング剤との組合せで使用することができる。「との組合せで」は、薬剤を同時に投与され、および／または一緒に送達するために製剤化しなければならないことを意味するものではないが、これらの送達法は、本開示の範囲内にある。組成物は、１つ以上の他の所望の治療物または医療処置と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、それぞれの薬剤は、その薬剤のために決定された用量において、および／または時間スケジュールに基づき投与される。一部の実施形態において、本開示は、医薬、予防、診断、またはイメージング組成物を、それらの生体利用能を改善し、それらの代謝を低減させ、および／もしくは改変し、それらの排泄を阻害し、および／またはそれらの体内分布を改変し得る薬剤との組合せで送達することを包含する。非限定的な例として、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、癌の治療のためまたは過剰増殖性細胞を制御するための医薬剤との組合せで使用することができる。参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，９６４，５７１号明細書において、リポポリマーとともにインターロイキン－１２をコードするＤＮＡプラスミドを含む医薬組成物を使用し、少なくとも１つの抗癌剤または化学療法剤も投与する、原発性または転移性固形腫瘍の治療のための併用療法が記載される。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、リポポリマーとともに医薬組成物中に存在し得（例えば、抗増殖性分子をコードするＤＮＡプラスミドおよびリポポリマーを含む医薬組成物を特許請求する、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１０２１８２３１号明細書参照）、それは少なくとも１つの化学療法剤または抗癌剤とともに投与することができる。
投薬
本発明は、本発明によるポリヌクレオチド、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡならびにそれらのコードされるタンパク質もしくは複合体を、それが必要とされる対象に投与することを含む方法を提供する。核酸、タンパク質もしくは複合体、またはその医薬、イメージング、診断、もしくは予防組成物は、疾患、障害、および／または病態（例えば、作業記憶障害に関連する疾患、障害、および／または状態）の予防、治療、診断、またはイメージングに有効な任意の量および任意の投与経路を使用して対象に投与することができる。要求される正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方式、その活性方式などに応じて対象ごとに変動する。本発明による組成物は、投与を容易にし、投薬量を均一にするために、典型的には、単位剤形に製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の総１日使用量は、適切な医学的判断の範囲内で担当医が決定することができることが理解される。任意の特定の患者の特定の治療有効、予防有効、または適切なイメージング用量レベルは、種々の要素、例として、治療される障害および障害の重症度；用いられる規定の化合物の活性；用いられる規定の組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食生活；投与時間、投与経路、および用いられる規定の化合物の排泄速度；治療の持続期間；用いられる規定の化合物との組合せで、またはそれと同時に使用される薬物；ならびに医学分野において周知の同様の要素に依存する。
ある実施形態において、本発明による組成物は、所望の治療、診断、予防、またはイメージング効果を得るために、１日当たり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）を１日１回以上送達するのに十分な投薬量レベルにおいて投与することができる。所望の投薬量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おきに、２日おきに、週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回送達することができる。ある実施形態において、所望の投薬量は、複数回の投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、またはそれより多い投与）を使用して送達することができる。
本発明によれば、分割用量レジメンにおけるｍｍＲＮＡの投与が哺乳動物対象においてより高いレベルのタンパク質を産生することが発見された。本明細書において使用される場合、「分割用量」は、単回単位用量または総１日用量の２つ以上の用量、例えば、単回単位用量の２回以上の投与への分割である。本明細書において使用される場合、「単回単位用量」は、１回用量で／１回で／単一経路で／単一接触点で、すなわち、単回投与イベントで投与される任意の治療物の用量である。本明細書において使用される場合、「総１日用量」は、２４時間の期間内に所与または処方される量である。これは、単回単位用量として投与することができる。一実施形態において、本発明のｍｍＲＮＡは、対象に分割用量で投与される。ｍｍＲＮＡは、緩衝液のみまたは本明細書に記載の製剤中で製剤化することができる。
剤形
本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載の剤形、例えば、局所、鼻腔内、気管内、または注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下）に製剤化することができる。
液体剤形
非経口投与用の液体剤形としては、限定されるものではないが、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、液剤、懸濁液、シロップ剤、および／またはエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加え、液体剤形は、当分野で一般に使用される不活性希釈剤、例として、限定されるものではないが、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含み得る。非経口投与についてのある実施形態において、組成物は、可溶化剤、例えば、クレモホル（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはそれらの組合せと混合することができる。
注射剤
注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、公知技術に従って製剤化することができ、好適な分散化剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を含み得る。滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤および／または溶媒、例えば、１，３－ブタンジオール溶液中の滅菌注射用溶液、懸濁液、および／またはエマルションであり得る。用いることができる許容可能なビヒクルおよび溶媒としては、限定されるものではないが、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。滅菌固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣用的に用いられる。この目的のため、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激固定油が用いることができる。注射剤の調製において、脂肪酸、例えば、オレイン酸を使用することができる。
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルタに通す濾過により、および／または使用前に滅菌剤を滅菌水または他の滅菌注射用媒体中に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で取り込むことにより滅菌することができる。
活性成分の効果を延長させるため、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅延させることが所望され得る。これは、水への溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用により達成することができる。次いで、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの吸収速度は、その溶解速度に依存し、それは次いで結晶サイズおよび結晶形に依存し得る。あるいは、非経口的に投与されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの遅延吸収は、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを油ビヒクル中に溶解または懸濁させることにより達成することができる。注射用デポー形態は、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのマイクロカプセルマトリックスを、生分解性ポリマー、例えば、ポリラクチド－ポリグリコリド中に形成することにより作製される。ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡとポリマーとの比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に捕捉することにより調製することができる。
肺
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に使用することもできる。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約０．２μｍ～５００μｍの平均粒子を有する粗粉であり得る。このような製剤は、鼻からの吸入が行われる様式で、すなわち鼻の近くに保持された粉末の容器からの鼻道を介する急速な吸入により投与することができる。
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、最少約０．１％（ｗ／ｗ）～最大１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得、本明細書に記載の追加の成分の１つ以上を含み得る。医薬組成物は、頬側投与に好適な製剤中に調製し、パッケージングし、および／または販売することができる。このような製剤は、例えば、慣用の方法を使用して作製される錠剤および／またはロゼンジの形態であり得、例えば、約０．１％～２０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含有し得、残部は経口溶解性および／または分解性組成物ならびに場合により本明細書に記載の追加の成分の１つ以上を含み得る。あるいは、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに／またはエアロゾル化および／もしくはアトマイズ化溶液および／もしくは懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散される場合、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均粒子および／または液滴サイズを有し得、本明細書に記載の任意の追加の成分の１つ以上をさらに含み得る。
医薬剤の製剤化および／または製造における一般の考慮事項は、例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著、「製薬の科学および実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、リッペンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年（参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
コーティングまたはシェル
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、ピル、および顆粒剤の固体剤形は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶性コーティングおよび医薬製剤化分野において周知の他のコーティングにより調製することができる。これらは場合により、乳白剤を含み得、それらが腸管のある部分において、場合により、遅延様式で、活性成分のみを放出し、またはそれを優先的に放出する組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。類似のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用する軟および硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いることができる。
医薬組成物の特性
本明細書に記載の医薬組成物は、生物学的利用能、治療域および／または分布体積の１つ以上により特徴付けることができる。
生物学的利用能
ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤を用いて組成物に製剤化される場合、本明細書に記載の送達剤を欠く組成物と比較して、生物学的利用能の増加を示し得る。本明細書において使用される場合、用語「生物学的利用能」は、哺乳動物に投与されるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの所与の量の全身利用能を指す。生物学的利用能は、化合物を哺乳動物に投与した後に、未変化形態の化合物の曲線下面積（ＡＵＣ）または最大血清または血漿濃度（Ｃｍａｘ）を計測することにより評価することができる。ＡＵＣは、縦座標（Ｙ軸）に沿った化合物の血清または血漿濃度を横座標（Ｘ軸）に沿った時間に対してプロットする曲線下面積の決定である。一般に、特定の化合物についてのＡＵＣは、当業者に公知の方法、および参照により本明細書に組み込まれるＧ．Ｓ．バンカー（Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ）著、「現代の薬学、薬物および薬科学（Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第７２巻、マーセル・デッカー、ニューヨーク社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９６年に記載の方法を使用して算出することができる。
Ｃｍａｘ値は、化合物を哺乳動物に投与した後に哺乳動物の血清または血漿において達成される化合物の最大濃度である。特定の化合物のＣｍａｘ値は、当業者に公知の方法を使用して計測することができる。本明細書において使用される語句「生物学的利用能の増加」または「薬物動態の改善」は、哺乳動物においてＡＵＣ、Ｃｍａｘ、またはＣｍｉｎとして計測された第１のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの全身利用能が、本明細書に記載の送達剤と同時投与された場合、本明細書に記載の送達剤とのそのような同時投与が行われない場合より高いことを意味する。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの生物学的利用能は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％だけ増加し得る。
治療域
ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤を用いて組成物に製剤化される場合、本明細書に記載の送達剤を欠く投与されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ組成物の治療域と比較して、投与されたポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ組成物の治療域の増加を示し得る。本明細書において使用される場合、「治療域」は、治療的効果を誘発する可能性の高い、血漿濃度の範囲、または作用部位における治療活性物質のレベルの範囲を指す。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの治療域は、本明細書に記載の送達剤と同時投与される場合、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％だけ増加し得る。
分布体積
ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤を用いて組成物に製剤化される場合、本明細書に記載の送達剤を欠く組成物に対して分布体積（Ｖｄｉｓｔ）の改善、例えば、低減または標的化を示し得る。分布体積（Ｖｄｉｓｔ）は、体内の薬物の量を血液または血漿中の薬物の濃度と関連付ける。本明細書において使用される場合、用語「分布体積」は、血液または血漿中の濃度と同一の濃度において体内の薬物の総量を含有するために要求される液量を指し：Ｖｄｉｓｔは、体内の薬物の量／血液または血漿中の薬物の濃度に等しい。例えば、用量１０ｍｇおよび血漿濃度１０ｍｇ／Ｌの場合、分布体積は１リットルである。分布体積は、薬物が血管外組織に存在する程度を反映する。大量の分布体積は、血漿タンパク質結合と比較して組織構成要素に結合する化合物の傾向を反映する。臨床現場において、負荷用量を決定し、定常状態濃度を達成するためにＶｄｉｓｔを使用することができる。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの分布体積は、本明細書に記載の送達剤とともに同時投与される場合、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％減少し得る。
生物学的効果
一実施形態において、動物に送達される修飾ｍＲＮＡの生物学的効果は、動物におけるタンパク質発現を分析することにより分類することができる。リプログラミングされるタンパク質発現は、本発明の修飾ｍＲＮＡを投与した哺乳動物から回収された生体試料を分析することにより決定することができる。一実施形態において、哺乳動物に投与される修飾ｍＲＮＡによりコードされる少なくとも５０ｐｇ／ｍｌの発現タンパク質が好ましくあり得る。例えば、哺乳動物に送達される修飾ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の５０～２００ｐｇ／ｍｌのタンパク質発現が、哺乳動物における治療有効量のタンパク質とみなすことができる。
定量
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、１つ以上の体液に由来するエキソソーム中で定量することができる。本明細書において使用される場合、「体液」は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便物質、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、囲心腔液、リンパ液、び汁、乳び、胆汁、間質液、月経分泌物、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水様便、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、ならびに臍帯血を含む。あるいは、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から回収することができる。
定量法において、対象から２ｍＬ以下の試料を得、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心法、分画遠心法、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、親和性精製、マイクロフルイディク分離、またはそれらの組合せによりエキソソームを単離する。分析において、ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのレベルまたは濃度は、投与される構築物の発現レベル、存在、不存在、トランケーションまたは変更であり得る。このレベルを１つ以上の臨床表現型と、またはヒト疾患バイオマーカについてのアッセイと相関させることが有利である。アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリ、電気泳動、質量分析、またはそれらの組合せを使用して実施することができる一方、エキソソームは、免疫組織化学法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を使用して単離することができる。エキソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心法、分画遠心法、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、親和性精製、マイクロフルイディク分離、またはそれらの組合せにより単離することもできる。
これらの方法により、調査者は、残留し、または送達されるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのレベルをリアルタイムでモニタリングする能力を得る。これは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡが構造または化学修飾に起因して内因性形態と異なるために可能である。
質量分析による修飾ポリヌクレオチドの検出
質量分析（ＭＳ）は、分子のイオン変換後の分子に関する構造質量および分子量／濃度情報を提供し得る分析技術である。分子は、最初にイオン化されて正または負電荷を得て、次いで、それらは質量分析器を通って移動して、それらの質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って検出器の異なる区域に到達する。
質量分析は、分画された試料をイオン化し、さらなる分析のために荷電分子を作出するためのイオン源を含む質量分析計を使用して実施される。例えば、試料のイオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、電子イオン化、高速原子衝撃（ＦＡＢ）／液体二次イオン化（ＬＳＩＭＳ）、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／血漿スプレーイオン化、および粒子ビームイオン化により実施することができる。当業者は、計測すべき分析物、試料のタイプ、検出器のタイプ、正モードと負モードの選択などに基づきイオン化方法の選択を決定することができることを理解する。
試料をイオン化した後、質量対電荷比（すなわち、ｍ／ｚ）を決定するため、それにより作出される正電荷または負電荷イオンを分析することができる。質量対電荷比の決定に好適な分析器としては、四重極分析器、イオントラップ分析器、および飛行時間型分析器が挙げられる。イオンは、いくつかの検出モードを使用して検出することができる。例えば、選択されたイオンを検出することができ（すなわち、選択的イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を使用して）、あるいは、イオンは、走査モード、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を使用して検出することができる。
ペプチドスダンダードの安定した同位体標識化希釈と連動した液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング（ＬＣ－ＭＳ／ＭＲＭ）が、タンパク質の検証に有効な方法であることが示されている（例えば、ケシシアン（Ｋｅｓｈｉｓｈｉａｎ）ら著、モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、２００９年、第８巻、ｐ．２３３９～２３４９；クーン（Ｋｕｈｎ）ら著、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ）、２００９年、第５５巻、ｐ．１１０８～１１１７；ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら著、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ）、２０１０年、第５６巻、ｐ．２８１～２９０）。バイオマーカ発見の研究で頻繁に使用される非標的化質量分析とは異なり、標的化ＭＳ方法は、計器の完全な分析能力を複合体混合物中の何十～何百もの選択されたペプチドにフォーカスするＭＳのペプチド配列ベースモードである。検出および断片化を目的タンパク質に由来するペプチドのみに制限することにより、感受性および再現性は、発見モードのＭＳ方法と比較して劇的に改善される。このタンパク質の質量分析ベースの多重反応モニタリング（ＭＲＭ）定量方法は、臨床試料の迅速な標的化された多重化タンパク質発現プロファイリングを介してバイオマーカの発見および定量に劇的に影響を与え得る。
一実施形態において、本発明の少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡによりコードされる少なくとも１つのタンパク質を含有し得る生体試料は、ＭＲＭ－ＭＳの方法により分析することができる。生体試料の定量としては、限定されるものではないが、内部スタンダードとして同位体標識ペプチドまたはタンパク質をさらに挙げることができる。
本発明によれば、生体試料は、対象から得られた時点で、酵素消化に供することができる。本明細書において使用される場合、用語「消化する」は、より短いペプチドに分裂することを意味する。本明細書において使用される場合、語句「タンパク質を消化するために試料を処理する」は、試料中のタンパク質を分解するような手法で試料を操作することを意味する。これらの酵素としては、限定されるものではないが、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃおよびキモトリプシンが挙げられる。一実施形態において、本発明の少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡによりコードされる少なくとも１つのタンパク質を含有し得る生体試料は、酵素を使用して消化することができる。
一実施形態において、本発明の修飾ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、エレクトロスプレーイオン化を使用してタンパク質について分析することができる。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析（ＥＳＩＭＳ）は、それらが質量分析により分析される前に溶液から気相へのイオンの移動を支援するために電気的エネルギーを使用する。試料は、当分野において公知の方法を使用して分析することができる（例えば、ホウ（Ｈｏ）ら著、クリニカル・バイオケミスト・レビューズ（Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｒｅｖ．）、２００３年、第２４巻（第１号）、ｐ．３～１２）。溶液中に含有されるイオン種は、電荷液滴の微細スプレーを分散させ、溶媒を蒸発させ、高荷電液滴のミストを生成するためにイオンを荷電液滴から排出させることにより気相中に移すことができる。高荷電液滴のミストは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの質量分析器、例えば、限定されるものではないが、四重極質量分析器を使用して分析することができる。さらに、質量分析法は、精製ステップを含み得る。非限定的な例として、第１の四重極は、単一ｍ／ｚ比を選択するように設定することができ、したがって、異なるｍ／ｚ比を有する他の分子イオンをフィルタアウトすることができ、これは、ＭＳ分析前に複雑で時間のかかる試料精製手順を排除し得る。
一実施形態において、本発明の修飾ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、タンデムＥＳＩＭＳ系（例えば、ＭＳ／ＭＳ）において、タンパク質について分析することができる。非限定的な例として、液滴は、産物スキャン（または娘スキャン）、前駆体スキャン（親スキャン）、中性損失または多重反応モニタリングを使用して分析することができる。
一実施形態において、本発明の修飾ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析（ＭＡＬＤＩＭＳ）を使用して分析することができる。ＭＡＬＤＩは、巨大分子および小分子の両方、例えば、タンパク質の非破壊蒸発およびイオン化を提供する。ＭＡＬＤＩ分析において、分析物は、最初に、高モル過剰のマトリックス化合物、例として、限定されるものではないが、紫外線吸収弱有機酸と共結晶化される。ＭＡＬＤＩにおいて使用されるマトリックスの非限定的な例は、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸、３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸および２，５－ジヒドロキシ安息香酸である。分析物－マトリックス混合物のレーザ放射は、マトリックスおよび分析物の蒸発をもたらし得る。レーザ誘起脱離は、無傷の分析物の高イオン収率を提供し、高精度の化合物の計測を可能とする。試料は、当分野において公知の方法を使用して分析することができる（例えば、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）、ウェイ（Ｗｅｉ）およびシウズダク（Ｓｉｕｚｄａｋ）、エンサイクロペディア・オブ・アナリティカル・ケミストリー（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０００年、ｐ．５８８０～５８９４）。非限定的な例として、ＭＡＬＤＩ分析において使用される質量分析器としては、線形飛行時間（ＴＯＦ）、ＴＯＦリフレクトロン、またはフーリエ変換質量分析器を挙げることができる。
一実施形態において、分析物－マトリックス混合物は、乾燥液滴法を使用して形成することができる。生体試料は、飽和マトリックス溶液を作出するためにマトリックスと混合し、マトリックスと試料との比はおよそ５０００：１である。次いで、分析物－マトリックス混合物を形成するためにアリコート（およそ０．５～２．０ｕＬ）の飽和マトリックス溶液を乾燥させる。
一実施形態において、分析物－マトリックス混合物は、薄層法を使用して形成することができる。マトリックス均質薄膜を最初に形成し、次いで試料をアプライし、分析物－マトリックス混合物を形成するためにマトリックスにより吸収させることができる。
一実施形態において、分析物－マトリックス混合物は、厚層法を使用して形成することができる。マトリックス均質薄膜は、ニトロ－セルロースマトリックス添加剤を用いて形成される。均一なニトロ－セルロースマトリックス層が得られると、試料をアプライし、分析物－マトリックス混合物を形成するためにマトリックス中に吸収させる。
一実施形態において、分析物－マトリックス混合物は、サンドイッチ法を使用して形成することができる。マトリックス結晶の薄層を薄層法と同様に調製し、次いで水性トリフルオロ酢酸、試料およびマトリックスの液滴を添加する。次いで、分析物－マトリックス混合物を形成するために試料をマトリックス中に吸収させる。
ＶＩ．合成ポリヌクレオチドおよび／または合成ｓｇＲＮＡの使用
本発明の合成ポリヌクレオチドおよび／または合成ｓｇＲＮＡは、細胞の表現型を変更するために使用することができる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびｍｍＲＮＡは、目的ポリペプチドを産生するためのペプチド、ポリペプチドまたは複数のタンパク質をコードし得る。目的ポリペプチドは、治療物および／または臨床および研究現場において使用することができる。非限定的な例として、目的ポリペプチドとしては、リプログラミング因子、分化因子および脱分化因子を挙げることができる。
治療剤
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ、例えば、本明細書に記載の修飾核酸および修飾ＲＮＡ、ならびにそれらから翻訳されるタンパク質は、治療または予防剤として使用することができる。これらは、医薬、治療法および予防的治療における使用のために提供される。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチドまたはタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡ）は、対象に投与することができ、このポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、インビボで翻訳されて治療または予防ポリペプチドを対象中で産生する。同様に、および場合により、上記との組合せにおいて、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ（例えば、修飾ｓｇＲＮＡまたは複数のそれら）は、対象に投与することができ、このポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチドまたはタンパク質により遺伝子編集をガイドする。）ヒトおよび他の哺乳動物における疾患または病態の診断、治療または予防のための組成物、方法、キット、および試薬が提供される。本発明の活性治療剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物もしくはｍｍＲＮＡ、ポリヌクレオチド、一次構築物もしくはｍｍＲＮＡを含有する細胞またはポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドを含む。
ある実施形態において、本明細書において、１つまたは複数のタンパク質をコードする翻訳可能領域を含有する１つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを含有する組合せ治療物が提供される。ある実施形態において、本明細書において、非翻訳可能領域、例えば、標的遺伝子配列に対して相補的な領域を含有する１つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡを含有する組合せ治療物が提供される。
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを使用して、細胞集団中で組換えポリペプチドの翻訳を誘導する方法が本明細書に提供される。このような翻訳は、インビボ、エクスビボ、培養下、またはインビトロであり得る。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する有効量の組成物と接触させる。細胞集団はまた、場合により、少なくとも１つのヌクレオシド修飾を有し、標的遺伝子配列に対して相補性を有する核酸、例えば、ｓｇＲＮＡを含有する有効量の組成物と接触させる。集団は、核酸が細胞集団の１つ以上の細胞中に局在化され、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳され、およびまたはｓｇＲＮＡ（または複数のそれら）も細胞集団の１つ以上の細胞中に局在化されるような条件下で接触させる。
「有効量」の組成物は、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸の物理的特徴（例えば、サイズ、および修飾ヌクレオシドの程度）、および他の決定因子に基づいて提供される。一般に、有効量の組成物は、細胞内での効率的な、好ましくは対応する未修飾核酸を含有する組成物より効率的な、タンパク質産生を提供する。増加した効率は、増加した細胞形質移入（すなわち、核酸により形質移入された細胞の割合）、核酸からの増加したタンパク質翻訳、減少した核酸分解（例えば、修飾核酸からのタンパク質翻訳の増加した持続期間により実証される）、または宿主細胞の低減された自然免疫応答により実証することができる。
本発明の態様は、組換えポリペプチド、例えば、組換えＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のインビボ翻訳をそれが必要とされる哺乳動物対象において誘導する方法を対象とする。本発明のさらなる態様は、インビボ遺伝子編集をそれが必要とされる哺乳動物中で誘導する方法を対象とする。その中で、少なくとも１つの構造または化学修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する有効量の組成物が、場合により、少なくとも１つの構造もしくは化学修飾を有し、および／または標的遺伝子に対して相補的な配列を有する１つ以上の核酸、例えば、１つ以上のｓｇＲＮＡを含有する有効量の組成物との組合せで、本明細書に記載の送達方法を使用して対象に投与される。核酸は、核酸が対象の細胞中に局在化され、（１）組換えポリペプチドが細胞中で核酸から翻訳され、および／または（２）ｓｇＲＮＡが標的遺伝子内の相補的配列に結合するような量および他の条件下で提供される。本発明の核酸が局在化される細胞、または細胞が存在する組織は、１または２ラウンド以上の核酸投与により標的化することができる。
ある実施形態において、投与されるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞、組織または生物内で実質的に不存在である機能的活性、例えば、遺伝子編集活性を提供する１つ以上の組換えポリペプチドおよび／または調節ＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡの産生を指向する。ある実施形態において、投与されるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、遺伝子編集に関与する１つ以上の組換えポリペプチドおよび／または調節ＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡの産生を指向し、治療有用性を有する、例えば、組換えポリペプチドが翻訳される細胞、組織または生物内で実質的に不存在である機能的活性を提供する１つ以上の追加の組換えポリペプチドの産生を指向する１つ以上の追加のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡとの組合せで投与される。例えば、欠損した機能的活性は、事実上、酵素的活性、構造的活性、または遺伝子調節活性であり得る。関連する実施形態において、投与されるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞中に存在するが、実質的に不全である機能的活性を増加させる（例えば、相乗的に）、１つ以上の組換えポリペプチドの産生を指向する。
他の実施形態において、投与されるポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞中で実質的に不存在である１つのポリペプチド（または複数のポリペプチド）を置き換える１つ以上の組換えポリペプチドの産生を指向する。このような不存在は、コード遺伝子の遺伝子突然変異またはその調節経路に起因し得る。一部の実施形態において、組換えポリペプチドは、細胞中の内因性タンパク質のレベルを所望のレベルまで増加させ；そのような増加は、内因性タンパク質のレベルを正常未満のレベルから正常なレベルへと、または正常なレベルから過常なレベルへと至らせ得る。
あるいは、組換えポリペプチドは、細胞中、細胞の表面上に存在し、または細胞から分泌される内因性タンパク質の活性をアンタゴナイズするように機能する。通常、内因性タンパク質の活性は、例えば、変更された活性または局在化をもたらす内因性タンパク質の突然変異に起因して、対象に有害である。さらに、組換えポリペプチドは、細胞中、細胞の表面上に存在し、または細胞から分泌される生体部分の活性を直接的または間接的にアンタゴナイズする。アンタゴナイズされる生体部分の例としては、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、代謝産物（例えば、ビリルビン）、タンパク質毒素、例えば、志賀および破傷風毒素、または小分子毒素、例えば、ボツリヌス、コレラ、およびジフテリア毒素が挙げられる。さらに、アンタゴナイズされる生体分子は、不所望な活性、例えば、細胞傷害性または細胞増殖抑制活性を示す内因性タンパク質であり得る。
理論により拘束されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集プロセスは、インビボで病状を反転させ得ることが提案される。したがって、この方法論は多くの遺伝子障害の治療について潜在性を有する。ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチドまたはタンパク質をコードするｍｍＲＮＡは、１つ以上のｓｇＲＮＡとの組合せで、場合により、修正ＤＮＡテンプレートとの組合せで投与する。ＤＮＡテンプレートは、疾患に関連する突然変異遺伝子に対応する正確な配列を含む。例示的なＤＮＡテンプレートは、単一突然変異疾患を引き起こす遺伝子に対応する。必要な構成要素が導入される細胞は、ＣＲＩＳＰＥＲ関連タンパク質を使用して損傷した遺伝子を修復する。それを行うことで、細胞がテンプレートをコピーし、新たな遺伝子材料をゲノム中に導入する。
本明細書において提示されるデータは、本発明の構成要素の有効な肝送達を実証する。したがって、本明細書に記載の方法論は、代謝疾患、例えば、先天性の遺伝子エラーにより引き起こされる代謝疾患、例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損関連疾患の治療に特に好適である。本発明の方法は、疾患進行を減衰するようにも機能し得る。例えば、複数回の筋肉注射を介する筋肉内送達は、適切な修正ＤＮＡテンプレートの包含により筋疾患、例えば、筋ジストロフィーを治療するように機能し得ることも提案される。さらに他の実施形態において、例えば、エクスビボでの造血細胞への薬剤の投与（例えば、エレクトロポレーションを介する）と、場合によりそれに続く適切な構成要素を発現する細胞の選択と、それに続く再コロニー化が続いて生じ得る治療された細胞の投与を含むエクスビボアプローチが想定される。
本明細書に記載の組換えタンパク質、それをコードするｍｍＲＮＡ、および／またはｓｇＲＮＡは、細胞内、潜在的には規定のコンパートメント、例えば、核内の局在化のためにエンジニアリングすることができ、または細胞からの分泌もしくは細胞の細胞膜への移行のためにエンジニアリングする。例示的な実施形態において、組換えタンパク質、それをコードするｍｍＲＮＡ、および／またはｓｇＲＮＡは、核局在化のためにエンジニアリングする。
本開示の他の態様は、哺乳動物対象への、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する細胞の移植に関する。哺乳動物対象への細胞の投与は、当業者に公知であり、それとしては、限定されるものではないが、局所移植（例えば、局所または皮下投与）、器官送達または全身注射（例えば、静脈内注射または吸入）、および薬学的に許容可能な担体中の細胞の製剤が挙げられる。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有するそのような組成物は、筋肉内に、経動脈投与、腹腔内投与、静脈内投与、鼻腔内投与、皮下投与、内視鏡投与、経皮投与、または鞘内投与のために製剤化することができる。一部の実施形態において、組成物は、持続放出のために製剤化することができる。
治療剤が投与することができる対象は、疾患、障害、または有害な病態を罹患し、またはそれらを発症する危険性があり得る。これらに基づき対象を同定し、診断し、および分類する方法が提供され、それとしては、臨床診断、バイオマーカレベル、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）、および当分野において公知の他の方法を挙げることができる。
ＶＩＩ．キットおよびデバイス
本発明は、好都合におよび／または有効に本発明の方法を実施するための種々のキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の複数の治療を実施し、および／または複数の実験を実施し、ならびに細胞および／もしくは細胞の集団を少なくとも１回接触させることを可能とするために十分な量および／または数の構成要素を含む。
一態様において、本発明は、本発明の分子（ポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ）を含むキットを提供する。一実施形態において、キットは、１つ以上の機能的抗体またはその機能的断片を含む。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡ）との組合せにおいて有用なキットおよびデバイスとしては、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１２年１２月１４日に出願された同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書に開示のものが挙げられる。
ＶＩＩＩ．定義
本明細書中の種々の箇所で、本開示の化合物の置換基が、群においてまたは範囲において開示される。本開示は、そのような群および範囲のメンバーのありとあらゆる個々の下位組合せを含むことが具体的に意図される。例えば、用語「Ｃ１～６アルキル」は、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、およびＣ６アルキルを個々に開示することが具体的に意図される。
約：本明細書において使用される場合、用語「約」は、列挙される値の＋／－１０％を意味する。
組合せで投与される：本明細書において使用される場合、用語「組合せで投与される」または「組合せ投与」は、２つ以上の薬剤が、同時にまたは患者に対するそれぞれの薬剤の効果が重複し得るような間隔内で、対象に投与されることを意味する。一部の実施形態において、それらは、互いに約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。一部の実施形態において、薬剤の投与は、組合せ（例えば、相乗的）効果が達成されるように、互いに十分に近接して間隔を置かれる。
動物：本明細書において使用される場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態において、「動物」は、任意の発達段階におけるヒトを指す。一部の実施形態において、「動物」は、任意の発達段階における非ヒト動物を指す。ある実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。一部の実施形態において、動物としては、限定されるものではないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および蠕虫が挙げられる。一部の実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子エンジニアリング動物、またはクローンである。
およそ：本明細書において使用される場合、用語「およそ」または「約」は、１つ以上の目的値に適用される場合、記述される参照値と類似する値を指す。ある実施形態において、用語「およそ」または「約」は、特に記載のない限り、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り、記述される参照値の前後（大きいまたは小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれより小さい範囲内の値の範囲を指す（このような数が考えられる値の１００％を超過する場合を除く）。
と会合している：本明細書において使用される場合、用語「と会合している」、「コンジュゲートしている」、「結合している」、「付着している」および「テザリングしている」は、２つ以上の部分に関して使用される場合、それらの部分が直接または結合剤として機能する１つ以上の追加の部分を介して互いに物理的に会合または連結して十分に安定的な構造を形成し、その結果、それらの部分がその構造が使用される条件、例えば、生理学的条件下で物理的に会合したままであることを意味する。「会合」は、厳密には、直接共有化学結合を介するものである必要はない。これは、「会合している」実体が物理的に会合したままであるように十分に安定的なイオンまたは水素結合またはハイブリダイゼーションベースの連結性も示唆し得る。
二機能性：本明細書において使用される場合、用語「二機能性」は、少なくとも２つの機能の能力を有し得、または維持する任意の物質、分子または部分を指す。この機能は、同一のアウトカムまたは異なるアウトカムを達成し得る。この機能をもたらす構造は、同一でも異なっていてもよい。例えば、本発明の二機能性修飾ＲＮＡが、細胞傷害性ペプチド（第１の機能）をコードし得る一方、コードＲＮＡを含むヌクレオシドは、それ自体として、細胞傷害性（第２の機能）である。この例において、癌細胞への二機能性修飾ＲＮＡの送達は、癌を良化または治療し得るペプチドまたはタンパク質分子をもたらすだけでなく、修飾ＲＮＡの翻訳の代わりに分解が生じる場合、ヌクレオシドの細胞傷害性ペイロードも細胞に送達する。
生体適合性：本明細書において使用される場合、用語「生体適合性」は、損傷も、毒性も免疫系による拒絶の危険性もほとんど、または全くもたらさず、生細胞、組織、器官または系と適合性であることを意味する。
生分解性：本明細書において使用される場合、用語「生分解性」は、生物体の作用により無害の産物に分解され得ることを意味する。
生物学的に活性：本明細書において使用される場合、語句「生物学的に活性」は、生体系および／または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与された場合、その生物に対して生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であるとみなす。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、そのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの一部が生物学的に活性であり、または生物学的に関連するとみなされる活性を模倣する場合であっても、生物学的に活性とみなすことができる。
癌幹細胞：本明細書において使用される場合、「癌幹細胞」は、自己再生ならびに／または腫瘍を形成するための異常な増殖および分化を受け得る細胞である。
化学用語：化学用語は、特に本明細書において定義のない限り、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１２年１２月１４日に出願された同時係属米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号明細書に提供される化学用語の定義に従う。
本明細書において使用される場合、用語「ジアステレオマー」は、互いの鏡像でなく、互いの上に重ね合わせることが不可能である、立体異性体を意味する。
本明細書において使用される場合、薬剤の「有効量」は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されている状況に依存する。例えば、癌を治療する薬剤を投与する状況において、有効量の薬剤は、例えば、薬剤の投与なしで得られる応答と比較して、本明細書に定義される癌の治療を達成するのに十分な量である。
本明細書において使用される場合、「鏡像異性体」という用語は、少なくとも８０％（すなわち、一方の鏡像異性体が少なくとも９０％および他方の鏡像異性体が多くとも１０％）、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％の光学純度または鏡像異性体過剰率（当分野において標準の方法により決定して）を有する、本発明の化合物のそれぞれの個々の光学活性型を意味する。
本明細書において使用される場合、「異性体」という用語は、本発明の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ以上のキラル中心および／または二重結合を有し得、したがって、立体異性体、例えば、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、鏡像異性体（すなわち、（＋）または（－））またはシス／トランス異性体）として存在し得ることが認識される。本発明によれば、本明細書に描写される化学構造、したがって本発明の化合物は、対応する立体異性体の全て、すなわち、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何的に純粋、鏡像異性的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）ならびに鏡像異性体および立体異性体混合物、例えば、ラセミ体の両方を包含する。本発明の化合物の鏡像異性体および立体異性体混合物は、周知の方法、例えば、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩錯体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中の化合物の結晶化により、典型的にそれらの構成要素の鏡像異性体または立体異性体に分解することができる。鏡像異性体および立体異性体は、周知の不斉合成法により、立体異性的または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、および触媒から得ることもできる。
本明細書において使用される場合、用語「立体異性体」は、化合物（例えば、本明細書に記載の任意の式の化合物）が有し得る全ての考えられる様々な異性型ならびに立体配座型、特に全ての考えられる立体化学的および立体配座的異性型、基本的な分子構造の全てのジアステレオマー、鏡像異性体および／または配座異性体を指す。本発明の一部の化合物は、異なる互変異性型として存在し得、その全てが本発明の範囲内に含まれる。
化合物：本明細書において使用される場合、用語「化合物」は、描写される構造の全ての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、および同位体を含むことを意味する。
本明細書に記載の化合物は、不斉であり得る（例えば、１つ以上の立体中心を有する）。特に記載のない限り、全ての立体異性体、例えば、鏡像異性体およびジアステレオマーが意図される。不斉置換炭素原子を含有する本開示の化合物は、光学活性型またはラセミ型で単離することができる。光学活性型を光学活性の出発物質からどのように調製するかに関する方法は、ラセミ混合物の分解により、または立体選択的合成によるものなど、当分野において公知である。オレフィンの多くの幾何異性体、Ｃ＝Ｎ二重結合なども、本発明に記載の化合物中に存在し得、全てそのような安定な異性体が本開示において企図される。本開示の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が記載され、それは異性体の混合物としてまたは分離した異性型として単離することができる。
本開示の化合物は、互変異性型も含む。互変異性型は、単結合の隣接二重結合による交換、および付随するプロトンの移動から生じる。互変異性型は、同一の実験式および総電荷を有する異性体プロトン化状態であるプロトトロピー互変異性体を含む。例示的なプロトトロピー互変異性体としては、ケトン－エノールペア、アミド－イミド酸ペア、ラクタム－ラクチムペア、アミド－イミド酸ペア、エナミン－イミンペア、およびプロトンが複素環系の２つ以上の位置を占有し得る環状型、例えば、１Ｈ－および３Ｈ－イミダゾール、１Ｈ－、２Ｈ－および４Ｈ－１，２，４－トリアゾール、１Ｈ－および２Ｈ－イソインドール、ならびに１Ｈ－および２Ｈ－ピラゾールが挙げられる。互変異性型は、平衡し得、または適切な置換により１つの形態に立体的に固定され得る。
本開示の化合物は、中間体または最終化合物中で生じる原子の同位体の全ても含む。「同位体」は、同一原子番号を有するが、核内の中性子の数が異なることに起因して異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体としては、トリチウムおよびジュウテリウムが挙げられる。
本開示の化合物および塩は、定型の方法により溶媒または水分子と組み合わせて溶媒和物および水和物を形成することにより調製することができる。
方向付けされた：本明細書において使用される場合、用語「方向付けされた」は、細胞を指す場合、細胞が分化経路中に十分存在する場合、通常の環境下で、それが規定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続け、異なる細胞型に分化せず、より分化していない細胞型に戻ることもないことを意味する。
保存されている：本明細書において使用される場合、用語「保存されている」は、それぞれ、比較される２つ以上の配列の同一位置で未変更で生じるものであるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。相対的に保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列中のいずれかの場所で出現するヌクレオチドまたはアミノ酸より関連する配列間で保存されているものである。
一部の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存されている」と言われる。一部の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。一部の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。一部の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存されている」と言われる。一部の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存されている」と言われる。配列の保存は、オリゴヌクレオチドもしくはポリペプチドの全長に当てはまり得、またはそれらの部分、領域もしくは特徴部に当てはまり得る。
制御放出：本明細書において使用される場合、用語「制御放出」は、治療アウトカムをもたらすために特定の放出パターンに適合する、医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
環状または環化：本明細書において使用される場合、用語「環状」は、連続ループの存在を指す。環状分子は、円形である必要はなく、単に連結してサブユニットの途切れのない鎖を形成すればよい。環状分子、例えば、本発明のエンジニアリングされたＲＮＡまたはｍＲＮＡは、単一ユニットもしくはマルチマーであり得、または複合体もしくは高次構造の１つ以上の構成要素を含み得る。
細胞増殖抑制性：本明細書において使用される場合、「細胞増殖抑制性」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオン、またはそれらの組合せの成長、分裂、または増殖を阻害し、低減させ、抑制することを指す。
細胞傷害性：本明細書において使用される場合、「細胞傷害性」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオン、またはそれらの組合せを死滅させ、またはそれらに損傷、毒性、または致命的な影響を引き起こすことを指す。
送達：本明細書において使用される場合、「送達」は、化合物、物質、実体、部分、積み荷またはペイロードを送達する作用または様式を指す。
送達剤：本明細書において使用される場合、「送達剤」は、標的化される細胞へのポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのインビボ送達を少なくとも部分的に容易にする任意の物質を指す。
脱安定化された：本明細書において使用される場合、用語「脱安定的」、「脱安定化する」、または「脱安定化領域」は、同一領域または分子の出発、野生型または天然形態より安定的でない領域または分子を意味する。
検出可能な標識：本明細書において使用される場合、「検出可能な標識」は、別の実体と付着し、取り込まれ、または会合する１つ以上のマーカ、シグナル、または部分を指し、それらのマーカ、シグナルまたは部分は、当分野において公知の方法、例として、ラジオグラフィ、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などにより容易に検出される。検出可能な標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、クロモフォア、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドットなどを挙げることができる。検出可能な標識は、本明細書に開示のペプチドまたはタンパク質中の任意の位置において位置させることができる。これらは、アミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質内に存在し、またはＮもしくはＣ末端において位置させることができる。
発生能：本明細書において使用される場合、「発生能」または「発生効力」は、分化時に細胞により達成され得る全ての発生細胞運命または細胞型の総和を指す。
発生能変更因子：本明細書において使用される場合、「発生能変更因子」は、細胞の発生能を変更し得るタンパク質またはＲＮＡを指す。
消化：本明細書において使用される場合、用語「消化する」は、より小さい片または構成要素に分裂することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質を指す場合、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
分化した細胞：本明細書において使用される場合、用語「分化した細胞」は、天然形態で多能性でない任意の体細胞を指す。分化した細胞は、部分的に分化している細胞も包含する。
分化：本明細書において使用される場合、用語「分化因子」は、所望の細胞型に分化するように細胞を誘導し得る発生能変更因子、例えば、タンパク質、ＲＮＡまたは小分子を指す。
分化する：本明細書において使用される場合、「分化する」は、方向付けされていない、またはあまり方向付けされていない細胞が方向付けされた細胞の特徴部を得るプロセスを指す。
疾患：本明細書において使用される場合、用語「疾患」は、規定の身体的症状を示すことが多い生物の身体に影響を及ぼす異常な病態を指す。
障害：本明細書において使用される場合、用語「障害」は、身体の正常な機能または確立した系の破壊または干渉を指す。
遠位：本明細書において使用される場合、用語「遠位」は、中心から離れて、または目的の箇所もしくは領域から離れて位置することを意味する。
用量分割係数（ＤＳＦ）－用量分割治療のＰＵＤを、総１日用量または単回単位用量のＰＵＤにより割った比。この値は、投薬レジメンの群の比較から導出される。
胚性幹細胞：本明細書において使用される場合、用語「胚性幹細胞」は、胚割球の内部細胞塊の天然存在の多能性幹細胞を指す。
封入する：本明細書において使用される場合、用語「封入する」は、密封し、包囲し、または包み込むことを意味する。
コードされるタンパク質開裂シグナル：本明細書において使用される場合、「コードされるタンパク質開裂シグナル」は、タンパク質開裂シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
エンジニアリングされた：本明細書において使用される場合、本発明の実施形態は、それらが、構造的か化学的かにかかわらず、出発点、野生型または天然分子から変動する特徴部または特性を有するようにそれらを設計する場合、「エンジニアリングされる」。
エキソソーム：本明細書において使用される場合、「エキソソーム」は、哺乳動物細胞により分泌される小胞またはＲＮＡ分解に関与する複合体である。
発現：本明細書において使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下のイベントの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの産生（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）；（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；および（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
特徴部：本明細書において使用される場合、「特徴部」は、特徴、特性、または独特なエレメントを指す。
製剤：本明細書において使用される場合、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡおよび送達剤を含む。
断片：本明細書において使用される場合、「断片」は、部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することにより得られたポリペプチドを含み得る。
機能的：本明細書において使用される場合、「機能的」生物学的分子は、特徴付けされる特性および／または活性を示す形態の生体分子である。
相同性：本明細書において使用される場合、用語「相同性」は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。一部の実施形態において、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一または類似である場合、互いに「相同的」とみなされる。用語「相同的」は、必然的に少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。本発明によれば、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには９９％である場合、相同的とみなされる。一部の実施形態において、相同的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４～５つのユニークに規定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力により特徴付けする。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列について、相同性は、典型的には、少なくとも４～５つのユニークに規定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力により決定する。本発明によれば、２つのタンパク質配列は、タンパク質が少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合、相同的とみなされる。
同一性：本明細書において使用される場合、用語「同一性」は、ポリマー分子間、例えば、オリゴヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、２つの配列を最適な比較目的のためにアラインすることにより実施することができる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために同一でない配列を無視することができる）。ある実施形態において、比較目的のためにアラインされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が第２の配列中の対応する位置と同一のヌクレオチドにより占有されている場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数、およびそれぞれのギャップの長さを考慮し、配列により共有される同一位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８年；「生物計算科学：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３年；「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、フォンハインチェ，Ｇ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）著、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；「配列データのコンピュータ分析、第Ｉ部（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ）」、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）、およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．）編、ヒュマーナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージ、１９９４年；ならびに「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリプスコフ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデブルー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍストックトンプレス（Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１年（それらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものなどの方法を使用して決定することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、例えば、メイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（コンピュータ・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシズ（ＣＡＢＩＯＳ）、１９８９年、第４巻、ｐ．１１～１７）のアルゴリズムを使用して決定することができ、これはＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０加重残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長さペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用する。あるいは、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般に用いられる方法としては、限定されるものではないが、参照により本明細書に組み込まれるカリッロ，Ｈ（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ）、およびリップマン，Ｄ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）著、ＳＩＡＭジャーナル・オン・アプライド・マスマティクス（ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．）、第４８巻、ｐ．１０７３（１９８８年）に開示のものが挙げられる。同一性を決定するための技術は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにコード化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアとしては、限定されるものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、デベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻（第１号）、ｐ．３８７（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ アルツシュール，Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ）、第２１５巻、ｐ．４０３（１９９０年））が挙げられる。
遺伝子の発現を阻害する：本明細書において使用される場合、語句「遺伝子の発現を阻害する」は、遺伝子の発現産物の量の低減を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドであり得る。典型的には、ｍＲＮＡのレベルの低減は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を計測するための標準的技術を使用して決定することができる。
インビトロ：本明細書において使用される場合、用語「インビトロ」は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工的環境において、例えば、試験管または反応槽中、細胞培養物中、ペトリ皿中などで生じるイベントを指す。
インビボ：本明細書において使用される場合、用語「インビボ」は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物またはそれらの細胞もしくは組織）内で生じるイベントを指す。
単離された：本明細書において使用される場合、用語「単離された」は、会合した（天然現場か実験現場かを問わない）構成要素の少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離された物質は、それらが会合していた物質に対して変動レベルの純度を有し得る。単離された物質および／または実体は、それらが最初に会合した他の構成要素の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれより多くから分離することができる。一部の実施形態において、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を上回って純粋である。本明細書において使用される場合、物質は、それが他の構成要素を実質的に含まない場合、「純粋」である。
実質的に単離された：「実質的に単離された」は、化合物が、それが形成または検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分分離物は、例えば、本開示の化合物が濃縮された組成物を含み得る。実質的分離物は、重量基準で少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の本開示の化合物、またはその塩を含有する組成物を含み得る。化合物およびその塩を単離する方法は、当分野において定型的である。
リンカー：本明細書において使用される場合、リンカーは、原子群、例えば、１０～１，０００個の原子を指し、原子または基、例えば、限定されるものではないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、およびイミンを含めることができる。リンカーは、核酸塩基または糖部分上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに第１の末端において、およびペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療剤に第２の末端において付着させることができる。リンカーは、核酸配列中への取り込みを干渉しないほど十分な長さのものであり得る。リンカーは、任意の有用な目的のため、例えば、ｍｍＲＮＡマルチマー（例えば、２つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子の結合を介して）またはｍｍＲＮＡコンジュゲートを形成するため、ならびに本明細書に記載のとおりペイロードを投与するために使用することができる。リンカー中に取り込むことができる化学基の例としては、限定されるものではないが、上記のとおりアルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリル（それぞれは、場合により置換されていてよい）が挙げられる。リンカーの例としては、限定されるものではないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、およびデキストランポリマーが挙げられる。他の例としては、限定されるものではないが、還元剤または光分解を使用して開裂させることができるリンカー内の開裂可能な部分、例えば、ジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）またはアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）などが挙げられる。選択的に開裂可能な結合の非限定的な例としては、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、もしくは他の還元剤の使用、および／または光分解により開裂させることができるアミド結合、ならびに例えば、酸または塩基加水分解により開裂させることができるエステル結合が挙げられる。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位：本明細書において使用される場合、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位は、ｍｉＲＮＡの少なくとも「シード」領域が結合する、核酸転写物のヌクレオチド局在または領域を表す。
修飾された：本明細書において使用される場合、「修飾された」は、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、多くの手法、例として、化学的、構造的、および機能的修飾で修飾することができる。一実施形態において、本発明のｍＲＮＡ分子は、例えば、それが天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣに関する場合、非天然ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入により修飾される。非標準のヌクレオチド、例えば、キャップ構造は、それらがＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なっていても「修飾される」とみなされない。
粘液：本明細書において使用される場合、「粘液」は、粘性であり、ムチン糖タンパク質を含む天然物質を指す。
複能性：本明細書において使用される場合、「複能性」または「部分分化細胞」は、細胞を指す場合、１つ以上の胚葉の細胞に分化するが、３つ全ての胚葉に分化しない発生能を有する細胞を指す。
天然存在：本明細書において使用される場合、「天然存在」は、人工的な支援を伴わない天然の存在を意味する。
非ヒト脊椎動物：本明細書において使用される場合、「非ヒト脊椎動物」は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を除く全ての脊椎動物、例として、野生および飼育種を含む。非ヒト脊椎動物の例としては、限定されるものではないが、哺乳動物、例えば、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、スイギュウ、およびヤクが挙げられる。
オフターゲット：本明細書において使用される場合、「オフターゲット」は、任意の１つ以上の標的、遺伝子および／または細胞転写物に対する任意の意図されない効果を指す。
少能性：本明細書において使用される場合、「少能性」は、細胞を指す場合、複能性幹細胞より制限されたサブセットの細胞系統を生じることを意味する。
オープンリーディングフレーム：本明細書において使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレーム中に終止コドンを含有しない配列を指す。
作動可能に結合している：本明細書において使用される場合、語句「作動可能に結合している」は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分などの間の機能的連結を指す。
場合により、置換されている：本明細書において、「場合により、置換されているＸ」（例えば、場合により、置換されているアルキル）という形態の語句は、「Ｘであって、Ｘは、場合により、置換されている」（例えば、「アルキルであって、前記アルキルは、場合により、置換されている」）と同等であることが意図される。特徴部「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意選択であることを意味することは意図されない。
ペプチド：本明細書において使用される場合、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長のアミノ酸の鎖を指す。
パラトープ：本明細書において使用される場合、「パラトープ」は、抗体の抗原結合部位を指す。
患者：本明細書において使用される場合、「患者」は、治療を求め得、もしくは必要とされ得、治療を要求し、治療を受けており、治療を受ける対象、または特定の疾患もしくは病態についての熟練専門家による治癒中の対象を指す。
薬学的に許容可能な：語句「薬学的に許容可能な」は、本明細書において、過剰な毒性も、刺激も、アレルギー応答も、他の問題または合併症もなく、合理的な利益／リスク比と一致する、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に好適な、妥当な医学的判断の範囲内であるそれらの化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
薬学的に許容可能な賦形剤：本明細書において使用される場合、語句「薬学的に許容可能な賦形剤」は、本明細書に記載の化合物以外（例えば、活性化合物を懸濁または溶解し得るビヒクル）の、患者中で実質的に非毒性および非炎症性である特性を有する任意の成分を指す。賦形剤としては、例えば、抗接着剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、エモリエント剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、皮膜形成剤またはコーティング剤、矯味剤、芳香剤、流動促進剤（流動向上剤）、滑沢剤、保存剤、印刷インク、吸着剤、懸濁化または分散化剤、甘味剤、および水和水を挙げることができる。例示的な賦形剤としては、限定されるものではないが、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールが挙げられる。
薬学的に許容可能な塩：本開示は、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩も含む。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な塩」は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換する（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることにより）ことにより親化合物が修飾される開示化合物の誘導体を指す。薬学的に許容可能な塩の例としては、限定されるものではないが、塩基性残基、例えば、アミンの鉱酸または有機酸塩；酸性残基、例えば、カルボン酸のアルカリまたは有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉相酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオン、例として、限定されるものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の慣用の非毒性塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、慣用の化学的方法により、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、それらの化合物の遊離酸または塩基形態を、化学量論量の適切な塩基または酸と、水中で、または有機溶媒中で、またはそれら２つの混合物中で反応させることにより調製することができ；一般に、非水性媒体、例えば、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルが好ましい。好適な塩のリストは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれるレミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１７版、マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、ペンシルベニア、１９８５年、ｐ．１４１８、「薬学的塩：特性、選択、および使用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ）」、Ｐ．Ｈ．シュタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）およびＣ．Ｇ．ウェルムス（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）（編）、ウィリー－ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）、２００８年、およびベルジ（Ｂｅｒｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第６６巻、ｐ．１～１９（１９７７年）に見出される。
薬物動態：本明細書において使用される場合、「薬物動態」は、それが生存生物に投与される物質の運命の決定に関する場合、分子または化合物の任意の１つ以上の特性を指す。薬物動態は、いくつかの区域、例として、吸収、分布、代謝および排泄の程度および速度に分類される。これは、一般に、ＡＤＭＥと称され：（Ａ）吸収は、血液循環に進入する物質のプロセスであり；（Ｄ）分布は、身体の体液および組織全体にわたる物質の分散または消散であり；（Ｍ）代謝（または生体内転換）は、親化合物の娘代謝物への不可逆的転換であり；（Ｅ）排泄（または排除）は、身体からの物質の排除を指す。まれな場合、一部の薬物は、身体組織中で不可逆的に蓄積する。
薬学的に許容可能な溶媒和物：本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容可能な溶媒和物」は、好適な溶媒の分子が結晶格子中に取り込まれている本発明の化合物を指す。好適な溶媒は、投与される投薬量において生理学的に忍容される。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶、または沈殿により調製することができる。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一、二および三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と称される。
物理化学的：本明細書において使用される場合、「物理化学的」は、物理および／または化学的特性のものまたはそれに関連するものを意味する。
多能：本明細書において使用される場合、「多能」は、様々な条件下で、３つ全ての胚葉を特徴とする細胞型に分化するための発生能を有する細胞を指す。
多能性：本明細書において使用される場合、「多能性」または「多能状態」は、細胞が３つ全ての胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）への分化能を有する細胞の発生能を指す。
予防：本明細書において使用される場合、用語「予防」は、感染、疾患、障害および／もしくは病態の発症の部分的もしくは完全な遅延；特定の感染、疾患、障害、および／もしくは病態の１つ以上の症状、特徴、または臨床的兆候の発症の部分的もしくは完全な遅延；特定の感染、疾患、障害、および／もしくは病態の１つ以上の症状、特徴、または兆候の発症の部分的もしくは完全な遅延；感染、特定の疾患、障害および／もしくは病態からの進行の部分的もしくは完全な遅延；ならびに／または感染、疾患、障害、および／もしくは病態に伴う病変を発症するリスクの減少を指す。
プロドラッグ：本開示は、本明細書に記載の化合物のプロドラッグも含む。本明細書において使用される場合、「プロドラッグ」は、化学または物理的変更時に治療物として作用する物質、分子または実体についての基礎形態である任意の物質、分子または実体を指す。プロドラッグは、哺乳動物対象への投与前、投与時または投与後に活性薬物部分を放出し、またはそれに変換されるまである手法で共有結合させ、または封鎖することができる。プロドラッグは、定型的操作で、またはインビボのいずれかで修飾が開裂されて親化合物になるように、化合物中に存在する官能基を修飾することにより調製することができる。プロドラッグとしては、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が、任意の基に結合しており、哺乳動物対象に投与された場合にそれが開裂して遊離ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基をそれぞれ形成する化合物が挙げられる。プロドラッグの調製および使用は、両方とも参照により全体として本明細書に組み込まれるＴ．ヒグチ（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ）およびＶ．ステラ（Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ）著、「新規送達系としてのプロドラッグ（Ｐｒｏ－ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ａ．Ｃ．Ｓ．シンポジウムシリーズ（Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）の第１４巻、および薬物設計における生体可逆性担体（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）、エドワード Ｂ．（Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．）編、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、米国医薬協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）およびペルガモンプレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年において考察されている。
増殖する：本明細書において使用される場合、用語「増殖する」は、成長、拡張もしくは増加し、または成長、拡張もしくは増加を急速に引き起こすことを意味する。「増殖性」は、増殖能を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖特性と逆の、またはそれに対向する特性を有することを意味する。
前駆細胞：本明細書において使用される場合、用語「前駆細胞」は、分化によりそれを生じ得る細胞に対してより大きい発生能を有する細胞を指す。
タンパク質開裂部位：本明細書において使用される場合、「タンパク質開裂部位」は、化学的、酵素的または光化学的手段によりアミノ酸鎖の制御された開裂が達成され得る部位を指す。
タンパク質開裂シグナル：本明細書において使用される場合、「タンパク質開裂シグナル」は、開裂のためにポリペプチドにフラグまたはマークを付ける少なくとも１つのアミノ酸を指す。
目的タンパク質：本明細書において使用される場合、用語「目的タンパク質」または「所望のタンパク質」は、本明細書に提供されるものならびにその断片、突然変異体、バリアント、および変更物を含む。
近位：本明細書において使用される場合、用語「近位」は、中心または目的の箇所もしくは領域のより近くに位置することを意味する。
精製された：本明細書において使用される場合、「精製する」、「精製された」、「精製」は、実質的に純粋とし、または不所望な構成要素、物質の汚染物、混合物もしくは不完全物を取り除くことを意味する。
反復形質移入：本明細書において使用される場合、用語「反復形質移入」は、複数回のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡによる同一細胞培養物の形質移入を指す。細胞培養物は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、少なくとも５０回、またはそれより多くの回数形質移入することができる。
リプログラミング：本明細書において使用される場合、「リプログラミング」は、細胞または細胞集団の発生能を反転させるプロセスを指す。
リプログラミング因子：本明細書において使用される場合、用語「リプログラミング因子」は、発現があまり分化していない状態または未分化状態への細胞のリプログラミングに寄与する発生能変更因子、例えば、タンパク質、ＲＮＡまたは小分子を指す。
試料：本明細書において使用される場合、用語「試料」または「生体試料」は、その組織、細胞または構成部分のサブセット（例えば、体液、例として、限定されるものではないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液および精液）を指す。試料としては、全生物、またはその組織、細胞もしくは構成部分のサブセット、またはその画分もしくは一部分、例として、限定されるものではないが、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器管、腸管、および尿生殖器管、涙液、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官から調製されるホモジネート、溶解物または抽出物をさらに挙げることができる。試料はさらに、培地、例えば、細胞構成要素、例えば、タンパク質または核酸分子を含有し得る栄養ブロスまたはゲルを指す。
シグナル配列：本明細書において使用される場合、語句「シグナル配列」は、タンパク質の輸送または局在化を指向し得る配列を指す。
単一単位用量：本明細書において使用される場合、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一の接触点で、すなわち、単一投与イベントで投与される任意の治療物の用量である。
類似性：本明細書において使用される場合、用語「類似性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。互いのポリマー分子の類似性パーセントの計算は、同一性パーセントの計算と同一の様式で実施することができるが、但し、類似性パーセントの計算は、当分野において理解されるとおり保存的置換を考慮する。
体細胞：本明細書において使用される場合、「体細胞」は、生殖細胞以外の任意の細胞、着床前胚中に存在し、もしくはそれから得られる細胞、またはそのような細胞のインビトロ増殖から生じる細胞を指す。
体性幹細胞：本明細書において使用される場合、「体性幹細胞」は、非胚性組織、例として、胎児、未熟および成体組織に由来する任意の多能性または複能性幹細胞を指す。
体性多能性細胞：本明細書において使用される場合、「体性多能性細胞」は、発生能が多能状態に変更された体細胞を指す。
分割用量：本明細書において使用される場合、「分割用量」は、単一単位用量または総１日用量を２つ以上に分割した用量である。
安定的：本明細書において使用される場合、「安定的」は、反応混合物から有用な純度の程度で単離後に残るほど十分にロバストであり、好ましくは、有効な治療剤に製剤化することができる化合物を指す。
安定化された：本明細書において使用される場合、用語「安定化する」、「安定化された」、「安定化された領域」は、安定をなし、または安定的になることを意味する。
幹細胞：本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」は、自己再生の特性を有し、複数の細胞型に分化するための発生能を有し、規定の発生能を有さない未分化または部分分化状態の細胞を指す。幹細胞は、増殖し、より多くのそのような幹細胞を生じさせ得る一方、その発生能を維持する。
対象：本明細書において使用される場合、用語「対象」または「患者」は、例えば、実験、診断、予防および／または治療目的のために本発明による組成物を投与することができる任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒト）および／または植物が挙げられる。
実質的には：本明細書において使用される場合、用語「実質的には」は、目的の特徴または特性の全範囲もしくは程度またはそれに近い範囲もしくは程度を示す定性的条件を指す。生物学分野の当業者は、生物学的および化学的現象が、完了し、および／または完全性に進行し、もしくは絶対的結果を達成もしくは回避することは、あるとしても、まれであることを理解する。したがって、用語「実質的には」は、多くの生物学的および化学的現象において固有の完全性の潜在的な欠落を補足するために本明細書において使用される。
実質的に等しい：本明細書において使用される場合、用量間の時間差に関する場合、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時に：本明細書において使用される場合、および複数の用量に関する場合、この用語は、典型的には、２秒以内を意味する。
を罹患する：疾患、障害、および／または病態「を罹患する」個体は、疾患、障害、および／または病態の１つ以上の症状が診断されており、またはそれを示す。
に対して感受性である：疾患、障害、および／または病態「に対して感受性である」個体は、その疾患、障害、および／または病態の症状が診断されておらず、および／またはそれを示し得ないが、疾患またはその症状を発症する傾向を保有する。一部の実施形態において、疾患、障害、および／または病態（例えば、癌）に対して感受性である個体は、以下の１つ以上により特徴付けすることができる：（１）その疾患、障害、および／または病態の発症に関連する遺伝子突然変異；（２）その疾患、障害、および／または病態の発症に関連する遺伝子多型；（３）その疾患、障害、および／または病態に関連するタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増加および／または減少；（４）その疾患、障害、および／または病態の発症に関連する習慣および／または生活様式；（５）その疾患、障害、および／または病態の家族の既往歴；ならびに（６）その疾患、障害、および／または病態の発症に関連する微生物への曝露および／またはそれによる感染。一部の実施形態において、疾患、障害、および／または病態に対して感受性である個体は、その疾患、障害、および／または病態を発症する。一部の実施形態において、疾患、障害、および／または病態に対して感受性である個体は、その疾患、障害、および／または病態を発症しない。
持続放出：本明細書において使用される場合、用語「持続放出」は、規定の一定期間にわたる放出速度に適合する、医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。
合成：用語「合成」は、手作業により産生、調製、および／または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であり得る。
標的細胞：本明細書において使用される場合、「標的細胞」は、任意の１つ以上の目的細胞を指す。この細胞は、インビトロ、インビボ、インサイチュまたは生物の組織もしくは器官中で見出すことができる。生物は、動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト、最も好ましくは、患者であり得る。
治療剤：用語「治療剤」は、対象に投与された場合、治療、診断、および／もしくは予防効果を有し、ならびに／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。
治療有効量：本明細書において使用される場合、用語「治療有効量」は、感染、疾患、障害、および／もしくは病態を罹患し、またはそれらに対して感受性である対象に投与された場合、感染、疾患、障害、および／または病態の症状を治療し、改善し、それらの発症を診断し、予防し、および／または遅延させるために十分である、送達すべき薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。
治療有効アウトカム：本明細書において使用される場合、用語「治療有効アウトカム」は、感染、疾患、障害、および／または病態の症状を治療し、改善し、それらの発症を診断し、予防し、および／または遅延させるために十分な、感染、疾患、障害、および／または病態を罹患し、またはそれらに対して感受性である対象におけるアウトカムを意味する。
総１日用量：本明細書において使用される場合、「総１日用量」は、２４時間の期間で与えられ、または処方される量である。これは、単一単位用量として投与することができる。
分化全能性：本明細書において使用される場合、「分化全能性」は、成体中に見出される細胞の全て、ならびに胚体外組織、例として、胎盤を作製するための発生能を有する細胞を指す。
転写因子：本明細書において使用される場合、用語「転写因子」は、例えば、転写の活性化または抑制によりＤＮＡのＲＮＡへの転写を調節するＤＮＡ結合タンパク質を指す。一部の転写因子は、転写の調節を単独で生じさせる一方、他の転写因子は、他のタンパク質と協調して作用する。一部の転写因子は、ある条件下で転写を活性化および抑制し得る。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域中の特異的標的配列または特異的コンセンサス配列と高度に類似する配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独で、または他の分子との複合体で調節し得る。
転写：本明細書において使用される場合、用語「転写」は、外因性核酸を細胞中に導入する方法を指す。形質移入の方法としては、限定されるものではないが、化学的方法、物理的処理およびカチオン性脂質または混合物が挙げられる。
分化転換：本明細書において使用される場合、「分化転換」は、同定特徴を損失させ、それらの表現型を他の完全分化細胞のものに変化させるあるタイプの分化細胞の能力を指す。
治療：本明細書において使用される場合、用語「治療」は、特定の感染、疾患、障害、および／または病態の１つ以上の症状もしくは特徴の部分的または完全な緩和、良化、改善、軽減、それらの発症の遅延、進行の阻害、重症度の低減、および／または発生率の低減を指す。例えば、癌の「治療」は、腫瘍の生存、成長、および／または拡散の阻害を指し得る。治療は、疾患、障害、および／または病態に伴う病変を発症するリスクを減少させる目的のため、疾患、障害、および／もしくは病態の徴候を示さない対象、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは病態の初期徴候のみを示す対象に施すことができる。
未修飾：本明細書において使用される場合、「未修飾」は、任意の手法で変化する前の任意の物質、化合物または分子を指す。未修飾は、常にというわけではないが、野生型または天然形態の生体分子を指し得る。分子は、それぞれの修飾産物が後続の修飾のための「未修飾」出発分子として機能し得る一連の修飾を受け得る。
均等物および範囲
当業者は、単に定型的な実験を使用して、本明細書に記載の本発明による具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、または確認することができる。本発明の範囲は、上記の詳細な説明に限定されるものではなく、付属の特許請求の範囲に記載されるものである。
特許請求の範囲において、冠詞、例えば、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、反対であることが記載されており、またはそうでなければ文脈から明確でない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。群の１つ以上のメンバー間の「または」を含む特許請求の範囲または詳細な説明は、反対であることが示されており、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り、群メンバーの１つ、２つ以上、または全てが所与の産物またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連する場合、満たされるとみなす。本発明は、群の正確に１つのメンバーが所与の産物またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。本発明は、２つ以上の、または全ての群メンバーが所与の産物またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。
用語「含む」は、無制限であるものとし、追加の要素またはステップの包含を許容するが、要求するものではないことも留意されたい。したがって、用語「含む」が本明細書において使用される場合、用語「からなる」も、包含および開示される。
範囲が与えられる場合、終点を含める。さらに、特に記載のない限り、またはそうでなければ、文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表現される値は、文脈が特に明示しない限り範囲の下限値の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態において記述される範囲内の任意の規定値または下位範囲を想定し得ることを理解すべきである。
さらに、従来技術の範囲内である本発明の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲のいずれか１つ以上から明示的に排除され得ることを理解すべきである。このような実施形態は当業者に公知であると考えられるため、それらは、排除が本明細書に明示されていない場合であっても、排除され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の核酸またはそれによりコードされるタンパク質；任意の産生方法；任意の使用方法など）は、従来技術の存在に関連するか否かにかかわらず、任意の理由で任意の１つ以上の請求の範囲から排除され得る。
全ての引用源、例えば、参照文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、および本明細書に引用される技術は、引用中で明示されていない場合であっても、参照により本出願に取り込まれる。引用源および本出願の記述が矛盾する場合、本出願の記述が優先される。
セクションおよび表の見出しは、限定的なものではない。
（実施例）
実施例１
合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡ産生のためのＤＮＡ構築物
本発明の合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡは、ＤＮＡ構築物の作出；ｃＤＮＡテンプレートのＰＣＲ増幅；ｃＤＮＡテンプレートのインビトロ転写（一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドを使用する）；必要により、インビトロ転写後酵素的ポリＡテーリングおよび／または５’キャッピング；ならびに精製および分析を介して産生する。
合成ポリヌクレオチドのためのＤＮＡ構築物は、オープンリーディングフレームを含む。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、ｄＣＡＳ９またはｄＣＡＳ９活性化因子融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／またはポリＡテールのテンプレート付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得るアルファ－グロビン３’ＵＴＲによりフランキングすることができる。
ＯＲＦは、最適化サービス、例えば、限定されるものではないが、ＤＮＡ２．０（メンロパーク、カリフォルニア）に発注することができる種々の上流または下流付加（例えば、限定されるものではないが、β－グロビン、タグなど）も含み得、ＸｂａＩ認識を有し得るマルチプルクローニング部位も含有し得る。
本発明のｓｇＲＮＡのためのＤＮＡ構築物は、同様の方法を使用して作製する。プラスミド構築物は、ＲＮＡポリメラーゼ特異的５’ＵＴＲ、例えば、Ｔ７ポリメラーゼ５’ＵＴＲにより５’末端上でフランキングされたＮ（２０～２５）ガイド配列およびガイド足場配列を含むｓｇＲＮＡ配列を有するインサートを含む。
合成ポリヌクレオチドおよび／またはｓｇＲＮＡのためのＤＮＡ構築物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換する。本発明のため、ＮＥＢ ＤＨ５－アルファコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用する。形質転換は、ＮＥＢの指示書に従って１００ｎｇのプラスミドを使用して実施する。プロトコルは以下のとおりである：
１．氷上のＮＥＢ５－アルファコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のチューブを１０分間解凍する。
２．１ｐｇ～１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを含有する１～５μｌを細胞混合物に添加する。チューブを慎重に４～５回振り、細胞とＤＮＡを混合する。ボルテックスしないこと。
３．混合物を氷上に３０分間置く。混ぜないこと。
４．４２℃において正確に３０秒間熱ショックを与える。混ぜないこと。
５．氷上に５分間置く。混ぜないこと。
６．室温のＳＯＣの９５０μｌを混合物中にピペッティングする。
７．３７℃において６０分間置く。激しく振盪させ（２５０ｒｐｍ）、または回転させる。
８．選択プレートを３７℃に加温する。
９．チューブを振り、反転させることにより完全に細胞を混合する。
あるいは、３０℃において２４～３６時間または２５℃において４８時間インキュベートする。
次いで、単一コロニーを使用し、適切な抗生物質を使用して５ｍｌのＬＢ成長培地を接種し、５時間成長させる（２５０ＲＰＭ、３７℃）。次いで、これを使用して２００ｍｌの培養培地を接種し、同一条件下で一晩成長させる。
プラスミドを単離するために（最大８５０μｇ）、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ハイピュアマキシプレップキット（ＨｉＰｕｒｅ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア）を製造業者の指示書に従って使用してマキシプレップを実施する。
インビトロ転写（ＩＶＴ）のためのｃＤＮＡを生成するため、制限酵素、例えば、ＸｂａＩを使用して最初にプラスミドを線形化する。ＸｂａＩによる典型的な制限消化は、以下を含む：プラスミド１．０μｇ；１０×緩衝液１．０μｌ；ＸｂａＩ１．５μＬ；ｄＨ２０最大１０μｌ；３７℃における１時間のインキュベーション。実験室規模（＜５μｇ）において実施する場合、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア）を製造業者の指示書に従って使用して、反応物をクリーンアップする。より大規模な精製は、より大きな充填容量を有する製品、例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲキット（ＰＣＲ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア）を用いて行う必要があり得る。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を使用して線形化ベクターを定量し、アガロースゲル電気泳動を使用して分析して線形化を確認する。
実施例２
ｃＤＮＡ産生のためのＰＣＲ
線形化プラスミド（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドをコードし、またはｓｇＲＮＡをコードする）は、ｃＤＮＡ、例えば、転写テンプレートの調製のためのＰＣＲを使用して増幅させる。ｃＤＮＡの調製のためのＰＣＲ手順は、カパ・バイオシステムズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（ウォーバン、マサチューセッツ）による２×カパ ハイファイ（２×ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ）（商標）ホットスタート・レディミックス（ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ）を使用して実施する。この系は、２×カパ レディーミックス（ＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘ）１２．５μｌ；順方向プライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；逆方向プライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；テンプレートｃＤＮＡ；１００ｎｇ；および２５．０μｌに希釈したｄＨ２Ｏを含む。反応条件は、９５℃において５分間、９８℃において２０秒間を２５サイクル、次いで５８℃において１５秒間、次いで７２℃において４５秒間、次いで７２℃において５分間、次いで４℃において終了までである。
一部の実施形態において、本発明の逆方向プライマーは、ｍＲＮＡ中のポリＡ１２０のためのポリＴ１２０を取り込む。ｍＲＮＡ中のポリ（Ａ）テールの長さを調節するため、より長く、または短いポリ（Ｔ）トラクトを有する他の逆方向プライマーを使用することができる。
反応物は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ）（カールスバッド、カリフォルニア）を製造業者の指示書に従って使用してクリーンアップする（最大５μｇ）。より大規模の反応は、より大容量の製品を使用するクリーンアップを要求する。クリーンアップ後、ｃＤＮＡはナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）（商標）を使用して定量し、アガロースゲル電気泳動により分析して、ｃＤＮＡが予測サイズであることを確認する。次いで、ｃＤＮＡを配列決定分析に供してからインビトロ転写反応を進行させる。
実施例３
インビトロ転写（ＩＶＴ）
合成ポリヌクレオチドおよび／または合成ｓｇＲＮＡを生成するためのインビトロ転写のためのテンプレートとして、増幅産物ｃＤＮＡを使用する。インプットヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）混合物は、天然および非天然のＮＴＰを使用してインハウスで作製する。インビトロ転写反応は、修飾合成ポリヌクレオチドおよび／またはｓｇＲＮＡを生成する。
典型的なインビトロ転写反応物は、以下を含む：
テンプレートｃＤＮＡ １．０μｇ
１０×転写緩衝液（４００ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１９０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのスペルミジン）２．０μｌ
カスタムＮＴＰ（それぞれ２５ｍＭ） ７．２μｌ
ＲＮアーゼ阻害剤 ２０Ｕ
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ３０００Ｕ
ｄＨ２Ｏ 最大２０．０μｌ
３７℃における３時間～５時間のインキュベーション。
合成ポリヌクレオチドおよび／またはｓｇＲＮＡは、細胞自然免疫応答を低減させるように修飾することができる。細胞応答を低減させるための修飾としては、本明細書に記載のもの、例えば、シュードウリジン（ψ）および５－メチル－シチジン（５ｍｅＣ、５ｍｃまたはｍ５Ｃ）を挙げることができる（カリコ Ｋ（Ｋａｒｉｋｏ Ｋ）ら著、イミュニティ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、第２３巻、ｐ．１６５～７５、２００５年、カリコ Ｋ（Ｋａｒｉｋｏ Ｋ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）、第１６巻、ｐ．１８３３～４０、２００８年、アンダーソン ＢＲ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＢＲ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（ＮＡＲ）、２０１０年参照；それらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
粗製ＩＶＴ混合物は、翌日のクリーンアップのために４℃において一晩貯蔵することができる。次いで、元のテンプレートを消化するために１ＵのＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼを使用する。３７℃における１５分間のインキュベーション後、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（オースティン、テキサス）を製造業者の指示書に従って使用してｍＲＮＡを精製する。このキットは、最大５００μｇのＲＮＡを精製し得る。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を使用してＲＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動により分析して、ＲＮＡが適切なサイズであること、およびＲＮＡの分解が生じていないことを確認する。
実施例４
ポリＡテーリング反応
一部の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、ポリＡテールなしで合成し、すなわち、ｃＤＮＡ構築物は、ポリＴなしで増幅させる。ｃＤＮＡ中にポリＴがない場合、最終産物のクリーニング前にポリＡテーリング反応を実施しなければならない。これは、キャッピングされたＩＶＴ ＲＮＡ（１００μｌ）；ＲＮアーゼ阻害剤（２０Ｕ）；１０×テーリング緩衝液（０．５Ｍのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）；２０ｍＭのＡＴＰ（６．０μｌ）；ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ最大１２３．５μｌを混合し、３７℃において３０分間インキュベートすることにより行う。ポリＡテールが既に転写物中に存在する場合、テーリング反応を省略し、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（オースティン、テキサス）（最大５００μｇ）によるクリーンアップを直接進行させることができる。ポリＡポリメラーゼは、好ましくは、酵母中で発現される組換え酵素である。
本明細書において実施および記載される研究について、ポリＡテールは、１６０ヌクレオチド長を含むようにＩＶＴテンプレート中でコードされる。しかしながら、ポリＡテーリング反応の進行性または完全性は、常に正確に１６０個のヌクレオチドをもたらすわけではないことを理解されたい。したがって、およそ１６０ヌクレオチド、例えば、約１５０～１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、または１６５のポリＡテールが本発明の範囲内である。
実施例５
合成ポリヌクレオチドの５’キャッピング
合成ポリヌクレオチド（修飾ＲＮＡ）の５’キャッピングは、インビトロ転写反応の間に同時に完了させ、または転写後に酵素的にキャッピングすることができる。
合成ポリヌクレオチド（修飾ＲＮＡ）の５’キャッピングは、製造業者のプロトコルに従って以下の化学的ＲＮＡキャップ類似体を使用して５’－グアノシンキャップ構造を生成して、インビトロ転写反応の間に同時に完了させることができる：３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、イプスウィッチ、マサチューセッツ）。
修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して転写後に完了させ、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、イプスウィッチ、マサチューセッツ）を生成することができる。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および２’－Ｏメチルト－ランスフェラーゼの両方を使用して生成することができ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成する。キャップ２構造は、キャップ１構造から２’－Ｏメチル－トランスフェラーゼを使用して５’末端から３番目のヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化の後に生成することができる。キャップ３構造は、キャップ２構造から２’－Ｏメチル－トランスフェラーゼを使用して５’末端から４番目のヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化の後に生成することができる。酵素は、好ましくは組換え源に由来する。
転写後、合成ポリヌクレオチドのキャッピングを以下のとおり実施する。反応混合物は、ＩＶＴ ＲＮＡが６０μｇ～１８０μｇおよびｄＨ２Ｏが最大７２μｌを含む。混合物は６５℃において５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、次いで直ちに氷上に移す。
このプロトコルは、次いで、１０×キャッピング緩衝液（０．５Ｍのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭのＫＣｌ、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）；２０ｍＭのＧＴＰ（５．０μｌ）；２０ｍＭのＳ－アデノシルメチオニン（２．５μｌ）；ＲＮアーゼ阻害剤（１００Ｕ）；２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）、ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ（最大２８μｌ）の混合；および６０μｇのＲＮＡについては３７℃における３０分間のインキュベーションまたは１８０μｇのＲＮＡについては最大２時間のインキュベーションを含む。
次いで、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（オースティン、テキサス）を製造業者の指示書に従って使用してキャッピングされた合成ポリヌクレオチドを精製する。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（商標）（サーモフィッシャ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ）を使用してキャッピングされた合成ポリヌクレオチドを定量し、アガロースゲル電気泳動により分析し、ＲＮＡが適切なサイズであること、およびＲＮＡの分解が生じていないことを確認する。配列決定のためのｃＤＮＡを生成するために、逆転写ＰＣＲを実行することによりＲＮＡ産物を配列決定することもできる。
合成ポリヌクレオチドのキャッピング効率は、多数の実験的技術を使用してアッセイする。キャッピングされた合成ポリヌクレオチドを細胞中に形質移入し、例えば、ＥＬＩＳＡを使用してＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の量をアッセイする。より高レベルのタンパク質発現は、より高いキャッピング効率と相関する。キャッピングされた合成ポリヌクレオチドは、アガロース－尿素ゲル電気泳動上でランし；電気泳動による単一の併合バンドを有する合成ポリヌクレオチドは、複数のバンドまたは筋状のバンドを有する合成ポリヌクレオチドと比較して高い純度の産物に対応する。キャッピングされた合成ポリヌクレオチドは、ＨＰＬＣカラム上でランし：単一のＨＰＬＣピークを有する合成ポリヌクレオチドは、より高い純度の産物に対応する。キャッピングされた合成ポリヌクレオチドは、ヒト一次ケラチン生成細胞中に複数濃度において形質移入する。形質移入６、１２、２４および３６時間後、培養培地中に分泌された炎症促進性サイトカイン、例えば、ＴＮＦ－アルファおよびＩＦＮ－ベータの量をＥＬＩＳＡによりアッセイする。より高レベルの炎症促進性サイトカインを培地中に分泌する合成ｍＲＮＡは、免疫活性化キャップ構造を含有する合成ｍＲＮＡに対応する。キャッピングされた合成ポリヌクレオチドは、キャッピングされたｍＲＮＡヌクレアーゼ処理後にＬＣ－ＭＳによりキャッピング反応効率について分析する。キャッピングされたｍＲＮＡのヌクレアーゼ処理は、遊離ヌクレオチドおよびＬＣ－ＭＳにより検出可能なキャッピングされた５’－５－三リン酸キャップ構造の混合物を生じさせる。ＬＣ－ＭＳスペクトルに基づくキャッピングされた産物の量は、反応からの合計ｍＲＮＡのパーセントとして表現し、キャッピング反応効率に対応する。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、ＬＣ－ＭＳによるより多量のキャッピングされた産物を有する。
実施例６
合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡを分析する方法
修飾ＲＮＡまたはＲＴ ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動：個々の修飾ＲＮＡ（２０μｌの容量中２００～４００ｎｇ）または逆転写されたＰＣＲ産物（２００～４００ｎｇ）を、非変性１．２％アガロースＥ－ゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア）のウェル中にロードし、製造業者のプロトコルに従って１２～１５分間ランする。
ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）修飾ＲＮＡ定量およびＵＶスペクトルデータ：インビトロ転写反応からのそれぞれの修飾ＲＮＡの収量を定量するためのナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）ＵＶ吸光度読取に、ＴＥ緩衝液（１μｌ）中の修飾ＲＮＡを使用する。
実施例７
タンパク質発現をスクリーニングする方法
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドによる細胞の形質移入後、タンパク質発現を分析する。
Ａ．エレクトロスプレーイオン化
細胞または対象に投与された合成ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を含有し得る生体試料を調製し、１、２、３、または４つの質量分析器を使用して、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のための製造業者のプロトコルに従って分析する。生体試料は、タンデムＥＳＩ質量分析系を使用して分析することもできる。
タンパク質断片のパターン、または総タンパク質は、所与のタンパク質について公知の対照と比較し、比較によりアイデンティティを決定する。
Ｂ．マトリックス支援レーザ脱離／イオン化
細胞または対象に投与された合成ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を含有し得る生体試料を調製し、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）のための製造業者のプロトコルに従って分析する。
タンパク質断片のパターン、または総タンパク質は、所与のタンパク質について公知の対照と比較し、比較によりアイデンティティを決定する。
Ｃ．液体クロマトグラフィー－質量分析－質量分析
合成ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、トリプシン酵素により処理して、中に含有されるタンパク質を消化することができる。得られるペプチドは、液体クロマトグラフィー－質量分析－質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により分析する。ペプチドは断片化して質量分析計中に入れ、コンピュータアルゴリズムを介してタンパク質配列データベースとマッチさせることができる診断パターンを生じさせる。消化された試料は、希釈して所与のタンパク質について１ｎｇ以下の出発物質を得ることができる。単純な緩衝液のバックグラウンド（例えば、水または揮発性塩）を含有する生体試料は、直接的な溶液中消化に適しており；より複雑なバックグラウンド（例えば、界面活性剤、不揮発性塩、グリセロール）は、試料分析を容易にするための追加のクリーンアップステップを要求する。
タンパク質断片のパターン、または総タンパク質は、所与のタンパク質について公知の対照と比較し、比較によりアイデンティティを決定する。
実施例８
マイクロ生理学システム
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法の１つを使用して、例えば、緩衝液、脂質ナノ粒子およびＰＬＧＡ中で製剤化する。次いで、これらの製剤は、それぞれの内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３０８６５０２号パンフレット、国際公開第２０１３０８６４８６号パンフレットおよび国際公開第２０１３０８６５０５号パンフレットに記載のとおり、臓器チップから作出されたマイクロ生理学システムに投与し、またはそれと接触させる。
実施例９
Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９エフェクタードメイン融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドのためのＤＮＡテンプレートの設計
プラスミドは、本明細書に記載の化学合成ポリヌクレオチドを製造するためのインビトロ転写テンプレートとしての使用のために設計した。コング（Ｃｏｎｇ）およびマリ（Ｍａｌｉ）によりそれぞれ記載されるコドン最適化Ｃａｓ９を含有するように２つのプラスミドを設計した（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１３年、第３３９巻、ｐ．８１９～２３およびサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１３年、第３３９巻、ｐ．８２３～６）。第１のプラスミドはＦＬＡＧタグ付きＣａｓ９をコードし、第２のプラスミドはタグなしＣａｓ９をコードした。異なるエフェクタードメインに融合しているコドン最適化ｄｃａｓ９を含有するように２つのプラスミドを設計した（セル（Ｃｅｌｌ）、２０１３年、第１５４巻、ｐ．４４２～５１およびネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２０１３年、第１０巻、ｐ．９７７～９７９参照）。コード配列は、修飾ｍＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７ポリメラーゼプロモータの制御下に置いた。
Ｃａｓ９、ｄＣＡＳ９遺伝子およびエフェクタードメインの配列は、以下の表に見出される。
以下の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ配列を使用した。
Figure 0007225456000005
Figure 0007225456000006
以下の構築物を作出した：（３）ｄＣａｓ９－ＨＡタグ－２ｘＳＶ４０ＮＬＳ－ＫＲＡＢおよび（４）ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＦＬＡＧ－ＶＰ６４。
他の実施形態において、配列コードコドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９遺伝子は、ＨＡタグ、１つ以上のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ＮＬＳ、例えば、１または２つのＮＬＳ、場合により、Ｎおよび／またはＣ末端において）および／または検出タグ（例えば、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、タグＢＦＰなど）と融合することもできる。上記のいずれかは、例えば、上方または下方調節を容易にするために本発明のＣａｓ９構築物中で単独で、またはエフェクタードメイン（ＫＲＡＢ、ＣＳＤ、ＷＲＰＷ、ＶＰ６４、またはｐ６５ＡＤドメイン）との組合せで取り上げることができる）。種々のＣａｓ９、ｄＣＡＳ９遺伝子およびエフェクタードメインの配列は、以下の表中に見出される。
Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９発現は、種々の構築物のＵＴＲ中へのｍｉＲ調節配列のエンジニアリングによりさらに調節することができる。標準的な３’ＵＴＲをｍｉＲ－１２２調節部位含有３’ＵＴＲにより置き換えることにより、２つのｍｉＲ－１２２調節配列含有構築物を作製する。ｍｉＲ－１２２は、肝細胞中で高度に発現され、他の組織中では発現されず；したがって、ｍｉＲ１２２調節（結合）部位を３’ＵＴＲ中に含有するｍＲＮＡの翻訳は、肝細胞中で選択的に下方調節されるが、他の細胞中では下方調節されない。
以下の構築物を設計した：（５）ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉＲ－１２２および（６）ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＦＬＡＧ－ＶＰ６４－ｍｉＲ－１２２）。
構築物１～４（ＤＮＡカセット）を合成し、ベクター（ＤＮＡ２．０、メンロパーク、カリフォルニアからのｐＪ３６４）中に挿入した。プラスミドを上記のとおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質移入し、プラスミドＤＮＡを精製し、制限酵素（ＸｂａＩ）を使用して線形化した。線形化プラスミドをＰＣＲ増幅させ、インビトロ転写のためのテンプレートとして使用して本発明の合成ポリヌクレオチドを産生した。
実施例１０
ＶＥＧＦを標的化する合成ｓｇＲＮＡのためのＤＮＡテンプレートの設計。
インビトロ転写のためのテンプレートとして使用される、目的遺伝子、すなわち、ＶＥＧＦ遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡをそれぞれコードする４つの構築物を作出した。
これらの構築物は、５’ＵＴＲ（Ｔ７）、ＧＧＧ、ＶＥＧＦ遺伝子転写開始の上流の配列に対して相補的な２０～２５ヌクレオチド配列、およびガイドＲＮＡ足場配列をそれぞれ含んだ。ＶＥＧＦｓｇＲＮＡ配列はメーダ（Ｍａｅｄｅｒ）らに基づく。
５’ＵＴＲ配列として以下の配列を使用した。
Figure 0007225456000007
以下の４つのｓｇＲＮＡ構築物を作出し；太字イタリックの配列は、ＶＥＧＦ遺伝子に相補的なものである。
ＶＥＧＦ Ｖ１ ｓｇＲＮＡ構築物配列
Figure 0007225456000008
ＶＥＧＦ Ｖ２ ｓｇＲＮＡ構築物配列
Figure 0007225456000009
ＶＥＧＦ Ｖ３ ｓｇＲＮＡ構築物配列
Figure 0007225456000010
ＶＥＧＦ Ｖ４ ｓｇＲＮＡ構築物配列
Figure 0007225456000011
４つの構築物（ＤＮＡカセット）を合成し、ベクター（ＤＮＡ２．０、メンロパーク、カリフォルニアからのｐＪ２２４）中に挿入した。上記のとおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にプラスミドを形質移入し、プラスミドＤＮＡを精製し、制限酵素（ＸｂａＩ）を使用して線形化した。上記のとおり線形化プラスミドをＰＣＲ増幅させ、インビトロ転写のためのテンプレートとして使用して本発明の合成ｓｇＲＮＡを産生した。
実施例１１
インビトロ転写を介する合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの産生。
本明細書に記載の方法を使用して、上記の構築物のインビトロ転写を使用してＣａｓ９をコードする２つの合成ポリヌクレオチド、ｄＣＡＳ９エフェクター遺伝子融合タンパク質をコードする２つの合成ポリヌクレオチド、およびＶＥＧＦを標的化する４つの合成ｓｇＲＮＡを合成した。以下の配列を有する合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡを合成した。
ｄＣａｓ９－ＨＡタグ－２ｘＳＶ４０ＮＬＳ－ＫＲＡＢのｍＲＮＡ配列
Figure 0007225456000012
Figure 0007225456000013
ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＦＬＡＧ－ＶＰ６４のｍＲＮＡ配列
Figure 0007225456000014
Figure 0007225456000015
ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉＲ１２２のｍＲＮＡ配列
Figure 0007225456000016
Figure 0007225456000017
ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｍｉＲ１２２のｍＲＮＡ配列
Figure 0007225456000018
Figure 0007225456000019
Ｃａｓ９（マリ（Ｍａｌｉ））のｍＲＮＡ
Figure 0007225456000020
Figure 0007225456000021
Ｃａｓ９（コング（Ｃｏｎｇ））のｍＲＮＡ配列
Figure 0007225456000022
Figure 0007225456000023
ＶＥＧＰ Ｖ１ ｓｇＲＮＡ
Figure 0007225456000024
ＶＥＧＰ Ｖ２ ｓｇＲＮＡ
Figure 0007225456000025
ＶＥＧＰ Ｖ３ ｓｇＲＮＡ
Figure 0007225456000026
ＶＥＧＰ Ｖ４ ｓｇＲＮＡ
Figure 0007225456000027
ｍＲＮＡ構築物からのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のインビトロ発現
種々のタグ付きｄＣａｓ９ｍＲＮＡによりＨｅＬａ細胞を形質移入し、細胞抽出物をウエスタン、免疫沈降、およびＬＣ／ＭＳ分析に供して前記ＲＮＡにより発現されたタンパク質の発現を検出した。
以下のプロトコルに従ってＨｅＬａ細胞中にコング（Ｃｏｎｇ）Ｃａｓ９を含有するＦＬＡＧタグ付きＣａｓ９ｍＲＮＡ構築物（配列番号５５）、マリ（Ｍａｌｉ）Ｃａｓ９を含有するタグなしＣａｓ９ｍＲＮＡ構築物（配列番号５６）、ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）ｄＣａｓ９を含有するＨＡタグ付きｄＣａｓ９構築物（配列番号５５）、メーダ（Ｍａｅｄｅｒ）ｄＣａｓ９を含有するＦＬＡＧタグ付きｄＣａｓ９構築物（配列番号５２）、およびおよびＨＡタグ付きトリリンク（Ｔｒｉｌｉｎｋ）Ｃａｓ９構築物（トリリンク（Ｔｒｉｌｉｎｋ））を形質移入した。
形質移入の前日に１０ｃｍプレート上に３×１０６個のＨｅＬａ細胞をプレーティングした。形質移入すべきそれぞれの試料のための２００μＬのオプティ－ＭＥＭ（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）を含有するチューブ中に３０μＬのリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を希釈し、室温において２～５分間保持した。２００μＬのオプティ－ＭＥＭ（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）を含有する別のチューブ中に７．５ｕｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡを希釈した。次いで、２つの希釈物をそれぞれの試料について合わせ、混合した。最終溶液を室温において２０～２５分間静置しておいてから、プレーティングされたＨｅＬａ細胞上に形質移入溶液を積層した。
形質移入７時間後、溶解緩衝液により１×ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤（ピエス（Ｐｉｅｒｃｅ））の存在下で細胞を溶解させた。細胞溶解物からのタンパク質を単離し、ウエスタン、免疫沈降、またはＬＣ－ＭＳアッセイのために保存した。
免疫沈降のため、タンパク質濃度について正規化された溶解物をシグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｍ２アガロースビーズに添加し、洗浄した。免疫沈降は、４℃において一晩実施した。次いで、ビーズを洗浄し、１×ＬＤＳタンパク質試料緩衝液中で再懸濁させた。次いで、シーブループラス（Ｓｅｅ ＢｌｕｅＰｌｕｓ）２（商標）プレステインドタンパク質スタンダード（（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用してＭＥＳ緩衝液（（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））により４～１２％のビス－トリスゲル上で試料をランした。５％ミルクによりＰＢＳ中でニトロセルロースを１時間ブロッキングし、次いで、１：２０００の抗ＦＬＡＧ（セル・シグナリング・テクノロジーズ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））（図２）または１：１０００抗ＨＡ（コバンス（Ｃｏｖａｎｃｅ）ＨＡ．１１
腹水）（図３）によりＰＢＳ＋０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）中で４℃において４時間一晩ブロットした。次いで、膜を洗浄し、ＨＲＰにコンジュゲートしている抗ウサギ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））または抗マウス（シグマ（Ｓｉｇｍａ））と室温において４５分間インキュベートし、ピエス・スーパ・シグナル・ウェスト・フェムト（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ）（ピエス（Ｐｉｅｒｃｅ））により製造業者の指示書に従って検出した。
コング（Ｃｏｎｇ）Ｃａｓ９－ＦＬＡＧタンパク質は、コング（Ｃｏｎｇ）Ｃａｓ９－ＦＬＡＧ ｍＲＮＡ（配列番号５５）により形質移入されたＨｅＬａ細胞中で、直接抗ＦＬＡＧウエスタンおよび免疫沈降抗ＦＬＡＧウエスタンを介して検出した（図２）。メーダ（Ｍａｅｄｅｒ）Ｃａｓ９－ＦＬＡＧタンパク質は、メーダ（Ｍａｅｄｅｒ）Ｃａｓ９－ＦＬＡＧ ｍＲＮＡ（配列番号５２）により形質移入されたＨｅＬＡ細胞中で、免疫沈降抗ＦＬＡＧウエスタンを介して検出した（図２）。マリ（Ｍａｌｉ）Ｃａｓ９およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）Ｃａｓ９－ＨＡは両方とも、ＦＬＡＧドメインを有さず、したがって、抗ＦＬＡＧウエスタンについても免疫沈降についても出現しなかった（図２）。
ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）ｄＣａｓ９－ＨＡタンパク質は、ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）ｄＣａｓ９－ＨＡ ｍＲＮＡ（配列番号５１）により形質移入されたＨｅＬＡ細胞中で、直接抗ＨＡウエスタンを介して検出した（図３）。ｄＣａｓ９発現のための陽性対照としてトリリンク（Ｔｒｉｌｉｎｋ）Ｃａｓ９－ＨＡを使用した。
ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）ｄＣａｓ９－ＨＡ ｍＲＮＡ（配列番号５１）およびメーダ（Ｍａｅｄｅｒ）ｄＣａｓ９－ＦＬＡＧ（配列番号５２）により形質移入されたＨｅＬａ細胞のタンパク質抽出物は、Ｃａｓ９構築物のタンパク質発現についてＬＣ－ＰＲＭペプチド定量を介して分析し、未処理対照ＨｅＬａ細胞タンパク質抽出物と比較した。
全て溶媒はシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）からのＨＰＬＣグレードであり、全ての化学薬品は、特に記載のない限り、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手した。
８Ｍの尿素および０．１Ｍの重炭酸アンモニウムを含有する細胞溶解緩衝液中で試料を調製した。総タンパク質含有量を測定するためのＢＣＡアッセイを実施した。使用して３０μｇのタンパク質を有する試料を還元させ、トリプシンにより一晩消化した。マイクロスピン（ＭＩＣＲＯＳｐｉｎ）（商標）カラム（ザ・ネスト・グループ（Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ））を製造業者の指示書に従って使用して質量分析のためのＣ１８クリーンアップを実施した。ペプチドを乾燥させ、３０μｌ中で、保持時間較正のための対照ペプチド混合物を含有するＬＣ溶媒Ａ（０．１％のギ酸（ＦＡ）を有する水中１％のアセトニトリル）中１μｇ／ｕｌの最終濃度に再溶解させた。
全ての質量分析について、サーモ・サイエンティフィック・イージ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅａｓｙ）ｎＬＣナノ液体クロマトグラフィー系上でペプチド（試料当たり１μｇ）をＣ１８クロマトグラフィーカラム上で分析した。ＬＣ溶媒は、Ａ：０．１％のＦＡを有する水中１％アセトニトリル；Ｂ：０．１％のＦＡを有するアセトニトリル中３％の水であった（勾配溶出）。
ペプチド発見のためのＬＣ－ＭＳ／ＭＳランは、標準的なナノエレクトロスプレー源を備えるサーモ・サイエンティフィックＱエクサクティブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ）（商標）質量分析計上で実施した。
ＬＣ－ＰＲＭは、上記の標準的なナノエレクトロスプレー源を備えるサーモ・サイエンティフィックＱエグザティブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ）（商標）質量分析計上で標的ペプチド前駆体質量を含有する所定の包含リストを使用して実施した（勾配溶出）。
ＬＣ－ＲＰＭのためのＬＣ勾配は、５～３５％の溶媒Ｂで５０分間、次いで３５～１００％のＢで２分間および１００％のＢで８分間であった（総勾配長さは６０分間であった）。
マックスクアント（ＭａｘＱｕａｎｔ）ソフトウェアパッケージを使用してＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータセットを分析し、ユニプロット（ＵｎｉＰｒｏｔ）ヒトデータベースおよび他のデータベースに対して検索を実施した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにおいて良好に検出された標的タンパク質の全てのペプチドについて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析からの最も強いフラグメントイオンを使用してＬＣ－ＰＲＭアッセイを生成した。上位１０個の最も強いアッセイを選択した。
データは、ｍＰｒｏｐｈｅｔ（ライター（Ｒｅｉｔｅｒ）、リンナー（Ｒｉｎｎｅｒ）ら著、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第８巻、２０１１年、ｐ．４３０～４３５）に基づくＬＣ－ＭＲＭおよびＬＣ－ＰＲＭデータの分析のためのスペクトロダイブ（ＳｐｅｃｔｒｏＤｉｖｅ）（商標）（バイオグノシス（Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ））ソフトウェアを使用して加工した。ハウスキーピングタンパク質を表す１０個のペプチドを全ての試料中で定量し、カラム上でロードする試料を評価した。
Ｃａｓ９のペプチドセグメントの相対的定量は、ＬＣ－ＰＲＭを介してタンパク質抽出物のそれぞれについて実施した。Ｃａｓ９ペプチドセグメントの定量：「ＧＮＥＬＡＬＰＳＫ」（配列番号１２０）、「ＹＦＤＴＴＩＤＲ」（配列番号１２１）、および「ＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲ」（配列番号１２２）は、図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃにそれぞれ示す。表２は、それぞれについての相対的定量を示す。
表２．細胞溶解物試料中のＬＣ－ＰＲＭ Ｃａｓ９ペプチド定量
Figure 0007225456000028
インビボ
マウス（ｎ＝１）（８週齢雌ＢａｌｂＣ）に、表３に記載の脂質ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを含む脂質ナノ粒子中に製剤化された配列番号５５＿に記載のとおり、記載の０．０４ｍｇ／ｍＬ（１４μｇ）のＦＬＡＧ－Ｃａｓ９コング（Ｃｏｎｇ）ｍＲＮＡ（およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５’キャップ、キャップ１；１－メチルシュードウリジンにより完全に修飾されている）を３５０ｕｌまたは対照ＰＢＳ（モック）を静脈内投与した。
表３．脂質ナノ粒子製剤
Figure 0007225456000029
投与６時間後、マウスを安楽死させた。マウスから肝臓を回収し、以下に詳述のとおり免疫沈降によりＣａｓ９発現を測定した。
プロテアーゼ阻害剤の存在下でティシュライザ（Ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｅｒ）製剤中で、肝組織を溶解させた。タンパク質を抽出し、ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピエス（Ｐｉｅｒｃｅ））を使用して定量した。試料は、総タンパク質定量により正規化した。免疫沈降のためにＭ２アガロースビーズ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））におよそ８８ｍｇのタンパク質抽出物を添加した。４℃において３～４時間穏やかに混合した後、ビーズを吸引し、ＲＩＰＡ緩衝液により洗浄して上清を除去した。２００μｇ／ｍＬの３×ＦＬＡＧペプチド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））が補給されたＲＩＰＡ緩衝液をビーズに添加し、１１００ｒｐｍにおいて振盪させながらサーモミキサ（ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）中で４℃において３０分間インキュベートした。次いで、ビーズを回転降下させ、上清を除去することによりペプチド溶出を実施した。プレステインドタンパク質スタンダード（（ライフ・テック（ＬｉｆｅＴｅｃｈ））とともにＭＥＳランニング緩衝液（（ライフ・テック（ＬｉｆｅＴｅｃｈ））を使用して試料を４～１２％のビストリスゲル上で７２℃において１２分間インキュベートした。ｉＢｌｏｔ（商標）装置を製造業者の指示書に従って６分間使用してゲルをニトロセルロース上に転写した。膜を取り出し、ブロッティングに好適な容器中に置き、２×ｄｄＨ２Ｏにより洗浄した。次いで、ＰＢＳ中５％脱脂粉乳によりニトロセルロースを４５分間ブロッキングした。次いで、抗Ｍ２ＨＲＰにより１：１５，０００において１％のミルクＰＢＳ０．０５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）中で室温においてニトロセルロースを３０分間ブロッティングした。次いで、一次抗体溶液を除去し、ニトロセルロースをＰＢＳ００．０５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）により洗浄した。ピエス・スーパ・シグナル・フェムト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｆｅｍｔｏ）（商標）によりＦＬＡＧ－Ｃａｓ９ペプチドを検出した。次いで、ニトロセルロース膜をイメージングのために露光した。
免疫沈降の結果を図５に示す。図５に示されるとおり、バンドは、Ｃａｓ９ＬＮＰ試料中でのみ１５０ｋＤにおいて存在し、ＰＢＳ対照処理試料中では存在しなかった。これらのデータは、Ｃａｓ９－ＬＮＰが投与されたマウスにおけるインビボのＬＮＰ製剤化合成ｍＲＮＡからのＣａｓ９タンパク質発現の証拠を提供する。
実施例１２
ｄＣａｓ９エフェクター融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡによる転写のインビトロモジュレーション
ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）は、最も強力な血管新生因子の１つであり、多くの腫瘍、例として、神経膠腫における血管新生の誘導因子として近年同定された。Ｕ－８７ＭＧおよびＡ－１７２は、２つの樹立された膠芽細胞腫細胞系統である。基底ＶＥＧＦ発現は、Ａ－１７２と比較してＵ－８７ＭＧにおいて１桁大きかった（インターナショナル・ジャーナル・オブ・デベロップメンタル・ニューロサイエンス（Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）、１９９９年、８月～１０月、第１７巻（第５－６号）、ｐ．５６５～７７）。これは、ＶＥＧＦの５’フランキングゲノム配列に指向されるｓｇＲＮＡを用いるｄＣａｓ９－ＫＲＡＢおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４による遺伝子調節を試験するための系を提供する。
ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢによる転写の阻害
ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、２０１３年は、ｄＣａｓ９－ｋＲＡＢ融合タンパク質を使用する遺伝子下方調節を記載している。ＫＲＡＢは、およそ４００個のヒト亜鉛フィンガータンパク質ベース転写因子（ＫＲＡＢ亜鉛フィンガータンパク質）中に存在する転写抑制ドメインのカテゴリーである（ハントリー（Ｈｕｎｔｌｅｙ）、２００６年）。ＫＲＡＢドメインは、転写の有効なリプレッサーであることが示されている。
Ｕ－８７ＭＧ細胞系は、内因性ＶＥＧＦを産生する。ｄＣａｓ９－ｋＲＡＢ合成ポリヌクレオチドは、上記のＶＥＧＦを標的化する４つの合成ｓｇＲＮＡと一緒に使用してＵ－８７ＭＧ細胞中のＶＥＧＦ遺伝子の転写を阻害する。以下の実験プロトコルを使用する。１．１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍｌのストレプトマイシン、および１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン中でダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＵ－８７ＭＧを維持する。
２．全ての形質移入は、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を使用し、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０２５９９２４号明細書（２０１３年３月９日に出願された米国特許出願第１３／７９１，９２２号明細書）に記載の形質移入プロトコルを使用してトリプリケートで実施する。
３．形質移入前日に２４ウェルプレート中に１６０，０００個の細胞を播種する。
４．１００ｎｇのｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ ｍＲＮＡおよびｌ００ｎｇのＶＥＧＦ Ｖ１～Ｖ４ ｓｇＲＮＡによりＵ－８７ＭＧ細胞を形質移入する。相乗効果実験のため、１００ｎｇのｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ ｍＲＮＡと、２５ｎｇのＶＥＧＦ Ｖ１～Ｖ４ ｓｇＲＮＡのそれぞれ（合計１００ｎｇの４つの異なるＶＥＧＦ ｓｇＲＮＡ）を形質移入する
５．細胞を８時間インキュベートし、細胞を洗浄して形質移入剤を除去する。
６．ＤＭＥＭ中で細胞をインキュベートし続ける
７．形質移入０時間、１２時間、２４時間、４８時間後、ＶＥＧＦＡ標的化ｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＫＲＡＢをコードするｍＲＮＡにより形質移入されたＵ－８７ＭＧの培養培地を回収した
８．ＥＬＩＳＡによりＶＥＧＦＡタンパク質発現を計測する。
ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢをコードする合成ポリヌクレオチドとＶＥＧＦゲノム配列を標的化するｓｇＲＮＡの導入は、未処理細胞と比較してＶＥＧＦ転写を阻害する。
ｄＣａｓ９－ＶＰ６４による転写の活性化
メーダ（Ｍａｅｄｅｒ）、２０１３年およびペレ－ピネラ（Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ）、２０１３年は、ｄＣａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ）をＶＰ６４トランス活性化ドメインに融合することにより作出されるＲＮＡガイド型転写活性化因子を記載している。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４は、標的配列へのｓｇＲＮＡのハイブリダイゼーションを介してゲノム標的部位を認識する。
ＨＥＫ２９３細胞系は、内因性ＶＥＧＦを産生しない。ｄＣａｓ９－ＶＰ－６４合成ポリヌクレオチドは、上記のＶＥＧＦを標的化する４つの合成ｓｇＲＮＡと一緒に使用してＨＥＫ２９３細胞中のＶＥＧＦ遺伝子の転写を活性化する。以下の実験プロトコルを使用する。
１．１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍｌのストレプトマイシン、および１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン中でダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＨＥＫ２９３を維持する。
２．全ての形質移入は、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を使用し、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０２５９９２４号明細書（２０１３年３月９日に出願された米国特許出願第１３／７９１，９２２号明細書）に記載の形質移入プロトコルを使用してトリプリケートで実施する。
３．形質移入前日に２４ウェルプレート中に１６０，０００個の細胞を播種する。
４．１００ｎｇのｄＣａｓ９－ＶＰ６４ ｍＲＮＡおよび１００ｎｇのＶＥＧＦ Ｖ１～Ｖ４ ｓｇＲＮＡによりＨＥＫ２９３細胞を形質移入する。相乗効果実験のため、１００ｎｇのｄＣａｓ９－ＶＰ６４ ｍＲＮＡと、２５ｎｇのＶＥＧＦ Ｖ１～Ｖ４ ｓｇＲＮＡのそれぞれ（合計１００ｎｇの４つの異なるＶＥＧＦ ｓｇＲＮＡ）を形質移入する
５．細胞を８時間インキュベートし、細胞を洗浄して形質移入剤を除去する。
６．ＤＭＥＭ中で細胞をインキュベートし続ける。
７．形質移入０時間、１２時間、２４時間、４８時間後、ＶＥＧＦＡ標的化ｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４をコードするｍＲＮＡにより形質移入されたＨＥＫ２９３の培養培地を回収する
８．ＥＬＩＳＡによりＶＥＧＦＡタンパク質発現を計測する。
９．ＲＴ－ＰＣＲまたはタックマン（Ｔａｑｍａｎ）またはＱ－ＰＣＲによりＶＥＧＦＡ
ｍＲＮＡを計測する
ｄＣａｓ９－ＶＰ６４をコードする合成ポリヌクレオチドとＶＥＧＦゲノム配列を標的化するｓｇＲＮＡの導入は、未処理細胞と比較してＨＥＫ２９３細胞中のＶＥＧＦ転写を活性化する。
実施例１３
インビトロタンパク質発現の組織特異的モジュレーション
ｍｉＲ－１２２は初代ヒト肝細胞中に存在し、肝細胞癌腫細胞系、例えば、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、およびＳＫ－Ｈｅｐ－１細胞中には存在しない。ｍｉＲ－１２２は、初代肝細胞中で３’ＵＴＲ中のｍｉＲ－１２２結合部位を含有するｍＲＮＡによりコードされるタンパク質産生を下方調節し得るが、ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ中では下方調節し得ないことが示されている。
ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉＲ１２２、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｍｉＲ１２２合成ポリヌクレオチドにより、ＶＥＧＦを標的化する４つの合成ｓｇＲＮＡの組合せとともに初代肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞を形質移入する。
初代肝細胞の形質移入は、本明細書に記載のとおり実施する。表４および５は結果を提供する。
表４：一次肝細胞形質移入の結果
Figure 0007225456000030
ＨＥｐＧ２細胞の形質移入は、本明細書に記載のとおり実施する。以下の表は結果を提供する。
表５．ＨＥｐＧ２形質移入の結果
Figure 0007225456000031
実施例１４
ｄＣａｓ９によるインビボタンパク質発現のモジュレーション
脂質－核酸粒子製剤を使用するｄＣＡＳ９エフェクター融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび目的遺伝子を標的化する合成ｓｇＲＮＡの肝臓への送達は、米国特許出願公開第２０１３／０２５９９２４号明細書（２０１３年３月９日に出願された米国特許出願第１３／７９１，９２２号明細書）に記載の手順に従って実施する。筋肉内注射を介するｄＣＡＳ９エフェクター融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび目的遺伝子を標的化する合成ｓｇＲＮＡの筋肉細胞への送達は、米国特許出願公開第２０１３／０２５９９２４号明細書（２０１３年３月９日に出願された米国特許出願第１３／７９１，９２２号明細書）に記載のとおり実施する。
ａ．ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢによるＴＰＯ遺伝子転写のインビボ阻害
トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、主として肝臓により産生される。ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢまたはｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉＲ１２２をコードする合成ポリヌクレオチドは、トロンボポエチンの５’フランキング配列を標的化するｓｇＲＮＡとともに、ＬＮＰ製剤中で製剤化する。０．００５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢおよびＴＰＯ ｓｇＲＮＡは、マウスに静脈内投与する。血液および肝試料は、投与８時間、２４時間、４８時間、７２時間後において回収する。ＴＰＯタンパク質レベルはＥＬＩＳＡにより計測し、ＴＰＯ ｍＲＮＡはＲＴ－ＰＣＲまたはｑ－ＰＣＲにより計測する。
ＴＰＯ ｓｇＲＮＡによるｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ媒介抑制を用いると、ＴＰＯタンパク質およびｍＲＮＡ発現は減少する。しかしながら、ｍｉＲ－１２２の存在のため、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉＲ１２２ ＴＰＯ ｓｇＲＮＡにより処理された群は、ＴＰＯタンパク質産生およびｍＲＮＡ発現の有意な下方調節を示さない。
ｂ．ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢによるレポータ遺伝子転写のインビボ阻害
レポータ分子、例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、またはヒトＶＥＧＦおよび特異的５’フランキング配列含有ＶＥＧＦ Ｖ１～Ｖ４ ｓｇＲＮＡ配列およびタンパク質発現をドライブするための構成的に活性なプロモータを含む外因性ＤＮＡプラスミドは、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ／ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉＲ１２２をコードする合成ポリヌクレオチドと、およびＶＥＧＦを標的化する４つの合成ｓｇＲＮＡと同時投与する。ポリヌクレオチドはＬＮＰ製剤化し、本明細書に記載のとおり投与する。
ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ／ＶＥＧＦ ｓｇＲＮＡにより処理された群においてレポータ分子の発現の減少が存在する。ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉｒｌ２２／ＶＥＧＦ ｓｇＲＮＡにより処理された群においてレポータ分子の発現の有意な減少は存在しない。
ｃ．ｄＣａｓ９－ＶＰ６４によるＬＤＨＣ遺伝子転写のインビボ活性化
ｄＣａｓ９－ＶＰ６４をコードする合成ポリヌクレオチドを使用して転写の活性化およびタンパク質発現を決定するため、典型的には肝臓により発現されないタンパク質を標的化する。乳酸デヒドロゲナーゼＣ（ＬＤＨＣ）は、精巣特異的酵素である。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４をコードするＬＮＰ製剤化合成ポリヌクレオチドの、マウスＬＤＨＣの５’ゲノム配列を標的化する合成ｓｇＲＮＡと同時の投与は、肝臓中のＬＤＨＣの発現を誘導する。ＬＤＨＣ ｍＲＮＡ転写物はＲＴ－ＰＣＲまたはｑＰＣＲにより計測し、タンパク質発現はＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにより計測する。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｍｉＲ１２２をコードするＬＮＰ製剤化合成ポリヌクレオチドおよびマウスＬＤＨＣの５’ゲノム配列を標的化するｓｇＲＮＡの投与は、肝細胞中のｍｉＲ－１２２の存在のためＬＤＨＣ発現を活性化しない。
ｄ．ｄＣａｓ９－ＶＰ６４によるレポータ遺伝子転写のインビボ活性化
レポータ分子、例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、またはヒトＶＥＧＦおよび特異的５’フランキング配列含有ＶＥＧＦＶ１～Ｖ４ ｓｇＲＮＡ配列および構成的に不活性なプロモータを含む外因性ＤＮＡプラスミドは、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４／ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｍｉＲ１２２をコードする合成ポリヌクレオチドと、およびＶＥＧＦを標的化する合成ｓｇＲＮＡと同時投与する。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４／ＶＥＧＦ ｓｇＲＮＡにより処理された群においてレポータ分子の発現の増加が存在する。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｍｉｒ１２２／ＶＥＧＦ ｓｇＲＮＡにより処理された群においてレポータ分子の発現の有意な増加は存在しない。
ｅ．ＬＤＨＣ遺伝子転写の組織特異的インビボモジュレーション
本明細書に記載のとおり、マイクロＲＮＡは組織特異性を提供し得る。マイクロＲＮＡ１２２を使用してｄＣａｓ９系の組織選択性を実証するため、マウスのある群に、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｍｉｒ１２２をコードするＬＮＰ製剤化合成ポリヌクレオチドおよびＬＤＨＣを標的化する合成ｓｇＲＮＡを静脈内投与し、別の群に筋肉内投与する。肝細胞中のｍｉＲ－１２２の存在に起因して、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４をコードする合成ポリヌクレオチドは発現されず；したがって、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４はＬＤＨＣ発現の活性化を媒介しない。筋肉細胞はｍｉＲ－１２２を含有しないため、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｍｉＲ１２２およびＬＤＨＣ ｓｇＲＮＡの筋肉内注射を受ける群は、精巣特異的タンパク質の発現を示す。
ｆ．レポータ遺伝子転写の組織特異的インビボモジュレーション
別の例は、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢの遺伝子抑制のための標的としてギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らに記載のＤＮＡプラスミドを同時投与することである。１）ＳＶ４０－ＧＦＰ ＤＮＡプラスミド（ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らに記載）、２）ｓｇＧＦＰ－ＮＴ１ ｓｇＲＮＡ（ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らに記載）、および３）ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢまたはｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉＲ１２２のいずれかをコードするｍＲＮＡを担持する製剤化ＬＮＰは、ＩＶを介してｍｉＲ－１２２を含有する肝臓に投与する。ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢを受ける群は、フローサイトメトリまたは免疫組織化学検査による計測としてｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ ｍＲＮＡを受けなかった対照群と比較して低減したＧＦＰ発現を示す。それというのも、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢの翻訳はｍｉＲ１２２により低減されないためである。ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉＲ１２２を受ける群は、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡを受けない対照群と類似のＧＦＰ発現を示す。それというのも、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する肝細胞中のｍｉＲ－１２２の存在のためである。ｍｉＲ－１２２を含有しない筋肉細胞へのＩＭ送達を比較するため、１）ＳＶ４０－ＧＦＰ ＤＮＡプラスミド（ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らに記載）、２）ｓｇＧＦＰ－ＮＴ１ ｓｇＲＮＡ（ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らに記載）、および３）ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢまたはｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉＲ１２２のいずれかをコードするｍＲＮＡを担持する製剤化ＬＮＰは、ＩＭ注射を介して投与する。本発明者らは、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢおよびｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ｍｉＲ１２２群の両方が、フローサイトメトリまたは免疫組織化学検査による計測として筋肉細胞中のＧＰＦ発現を示すことを確認することを予測する。
別の例は、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４の遺伝子活性化のための標的としてギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らに記載のＤＮＡプラスミドを同時投与することである。１）ＧＡＬ４ ＵＡＳ ＧＦＰ ＤＮＡプラスミド（ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らに記載）、２）ｓｇＧＡＬ４－１ ｓｇＲＮＡ（ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らに記載）、および３）ｄＣａｓ９－ＶＰ６４またはｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｍｉＲ１２２のいずれかをコードするｍＲＮＡを担持する製剤化ＬＮＰは、ＩＶを介して肝臓に投与する。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４
ｍＲＮＡを受ける群がフローサイトメトリまたは免疫組織化学検査による計測としてＧＦＰ発現を示す一方、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｍｉＲ１２２を受ける群は、ＧＦＰ発現を示さない。それというのも、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡの翻訳を抑制する肝細胞中のｍｉＲ－１２２の存在のためである。ｍｉＲ－１２２を含有しない筋肉細胞へのＩＭ送達を比較するため、１）ＧＡＬ４ ＵＡＳ ＧＦＰ ＤＮＡプラスミド（ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らに記載）、２）ｓｇＧＡＬ４－１ ｓｇＲＮＡ（ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らに記載）、および３）ｄＣａｓ９－ＶＰ６４またはｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｍｉＲ１２のいずれかをコードするｍＲＮＡを担持する製剤化ＬＮＰは、ＩＭ注射を介して投与する。本発明者らは、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４およびｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｍｉＲ１２２群の両方が、フローサイトメトリまたは免疫組織化学検査による計測として筋肉細胞中のＧＰＦ発現を活性化することを確認することを予測する。
実施例１５
３つの異なる送達系の使用
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡを投与する場合に有意な安全域を可能とするため、標的化機序の組合せを使用する。
第１に、ｄＣＡＳ９エフェクタードメイン融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドは、ＡＰＣ中の発現を防止するためにｍｉＲ－１４２．３ｐ標的化３’ＵＴＲを使用して設計する。
第２に、合成ポリヌクレオチドは、肝細胞中へのＬＤＬ－Ｒ媒介取り込みを標的化するイオン化可能なＬＮＰ中で製剤化する。これは、肝臓中のｄＣＡＳ９エフェクタードメイン融合タンパク質の発現をもたらす。
第３に、目的肝臓遺伝子を標的化する合成ｓｇＲＮＡは、例えば、ＧａｌＮａｃコンジュゲートまたは肝細胞により優先的に取り込まれる類似の標的化部分とコンジュゲートさせる。合成ｓｇＲＮＡは、別個に、および２～３時間遅らせた後に投与することができる。
標的化機序（この場合、３つ：ｍｉｒ－３’ＵＴＲ、ＬＮＰ、ＧａｌＮａｃ）およびＤＮＡの不存在の組合せは、有意な安全域を可能とする。
結果は、任意のタンパク質標的の転写活性化または阻害であり得る（本発明者らの最初のインビボ実験は、肝臓中のｄＣａｓ９融合物の局在化を確認するためのＩＨＣおよびレポータ、例えば、ルシフェラーゼおよび／またはＧＦＰを使用する機能的リードアウトにフォーカスする。
他の実施形態
使用されてきた単語は、限定するものではなく説明のための単語であり、広範な態様において本発明の真の範囲および趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更がなされ得ることを理解されたい。
いくつかの記載の実施形態に関して本発明をある程度の長さである程度具体的に記載してきたが、これが任意のそのような詳細もしくは実施形態、または任意の特定の実施形態に限定すべきものではなく、先行技術に照らしてそのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供し、したがって本発明の意図される範囲を有効に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈すべきである。
本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、節の見出し、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定するものではない。
（付記）
好ましい実施形態として、上記実施形態から把握できる技術的思想について、以下に記載する。
［項目１］
合成ポリヌクレオチドであって、（ａ）表６に見出されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする、結合ヌクレオシドの第１の領域；（ｂ）表７に見出される５’非翻訳領域（ＵＴＲ）からなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列を含む前記第１の領域の５’末端に位置する第１のフランキング領域；
（ｃ）表８に見出される３’非翻訳領域（ＵＴＲ）からなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列を含む前記第１の領域の３’末端に位置する第２のフランキング領域
を含む合成ポリヌクレオチド。
［項目２］
修飾ＲＮＡポリヌクレオチドである、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目３］
配列番号５１～５６から選択される配列からなる、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目４］
前記第１の領域が、ヒトコドン最適化ｄＣＡＳ９をコードする配列を含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目５］
前記第１の領域が、配列番号６１をコードする、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目６］
前記第１の領域が、エフェクタードメインをさらにコードする、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目７］
前記第１の領域が、ＫＲＡＢ、ＶＰ６４、ｐ６５ＡＤおよびＭｘｉからなる群から選択されるエフェクタードメインをさらにコードする、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目８］
前記第１の領域が、表６に開示のＫＲＡＢまたはＶＰ６４をさらにコードする、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目９］
前記第１の領域が、エフェクタードメインをさらにコードし、表６に開示のエフェクタードメインからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１０］
前記第１のフランキング領域が、配列番号７１を含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１１］
前記第２のフランキング領域が、配列番号８１を含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１２］
前記第２のフランキング領域が、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位または１つのｍｉＲ結合部位シードを含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１３］
前記第２のフランキング領域が、ｍｉＲ－１２２またはｍｉＲ－１４２またはｍｉＲ－１４６結合部位を含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１４］
前記第２のフランキング領域が、配列番号８２のｍＩＲ－１２２結合部位からなるｍｉＲ－１２２結合部位を含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１５］
前記第２のフランキング領域が、配列番号８２を含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１６］
前記第２のフランキング領域が、結合ヌクレオシドの３’テーリング配列を含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１７］
前記第２のフランキング領域が、ポリＡテールを含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１８］
前記第２のフランキング領域が、８０～１４０ヌクレオチド長のポリＡテールを含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１９］
前記第２のフランキング領域が、１００ヌクレオチドのポリＡテールを含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目２０］
項目１に記載の合成ポリヌクレオチドをコードする第２の合成ポリヌクレオチド。
［項目２１］
ＤＮＡポリヌクレオチドである、項目２０に記載の第２の合成ポリヌクレオチド。
［項目２２］
ベクターをさらに含む、項目２０に記載の第２の合成ポリヌクレオチド。
［項目２３］
少なくとも１つの５’キャップ構造をさらに含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目２４］
前記結合ヌクレオシドの第１の領域が、少なくとも第１の修飾ヌクレオシドを含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目２５］
前記結合ヌクレオシドの第１の領域が、少なくとも１つの１－メチル－シュードウリジンを含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目２６］
少なくとも２つの修飾を含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目２７］
少なくとも１つの１－メチル－シュードウリジンおよび少なくとも１つの５’－メチルシチジンを含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目２８］
ａ．前記少なくとも２つの修飾が、ヌクレオシドの１つ以上およびヌクレオシド間の骨格結合上の少なくとも一方に位置し；または
ｂ．前記少なくとも２つの修飾が、ヌクレオシドおよび骨格結合上の両方に位置し；または
ｃ．少なくとも１つの修飾が、骨格結合上に位置し；または
ｄ．１つ以上の骨格結合が、１つ以上の酸素原子の置き換えにより修飾されており；または
ｅ．少なくとも１つの修飾が、ホスホロチオエート結合による少なくとも１つの骨格結合の置き換えを含み；または
ｆ．少なくとも１つの修飾が、１つ以上のヌクレオシド上に位置し；または
ｇ．１つ以上の修飾が、１つ以上のヌクレオシドの糖上に存在し；または
ｈ．少なくとも１つの修飾が、シトシン、グアニン、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群から選択される１つ以上の核酸塩基上に位置する、
項目２６に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目２９］
インビトロ転写法を使用して、または化学合成法を使用して産生される、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目３０］
実質的に精製されている、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目３１］
項目１～３０のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチドを含む組成物。
［項目３２］
薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、項目３１に記載の組成物。
［項目３３］
溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒体、希釈剤、分散液、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、脂質、リピドイド リポソーム、脂質ナノ粒子、コア－シェルナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物からなる群から選択される薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、項目３１に記載の組成物。
［項目３４］
ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ｒｅＬＮＰ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＡおよびＰＥＧ化脂質ならびにそれらの混合物から選択される脂質をさらに含む、項目３１に記載の組成物。
［項目３５］
脂質ナノ粒子をさらに含む、項目３１に記載の組成物。
［項目３６］
細胞または組織を、項目１に記載の合成ポリヌクレオチドまたは項目３１に記載の組成物と接触させることを含む、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を産生する方法。
［項目３７］
生物に、項目１に記載の合成ポリヌクレオチドまたは項目３１に記載の組成物を投与することを含む、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を産生する方法。
［項目３８］
１ｐｇ～１ｍｇの総１日用量において前記合成ポリヌクレオチドを投与する、項目３７に記載の方法。
［項目３９］
単回用量で前記合成ポリヌクレオチドを投与する、項目３７に記載の方法。
［項目４０］
単回用量を超えて前記合成ポリヌクレオチドを投与する、項目３７に記載の方法。
［項目４１］
投与が、出生前投与、新生児投与および出生後投与からなる群から選択される、項目３７に記載の方法。
［項目４２］
投与が、経口投与、注射による投与、眼内投与による投与および鼻腔内投与による投与からなる群から選択される、項目３７に記載の方法。
［項目４３］
投与が、注射による投与であり、前記注射が、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下および筋肉内注射からなる群から選択される、項目３７に記載の方法。
［項目４４］
目的遺伝子を標的化するための合成ｓｇＲＮＡであって、
（ａ）前記目的遺伝子の５’ＵＴＲのいずれかの鎖に対して相補的な２０～２５結合ヌクレオシドの第１の領域；
（ｂ）配列番号９０に見出されるガイドＲＮＡ足場配列を含む、前記第１の領域の３’末端に位置する第２のフランキング領域を含む合成ｓｇＲＮＡ。
［項目４５］
配列番号９１、９２、９３または９４から選択される配列からなる、項目４４に記載のｓｇＲＮＡ。
［項目４６］
前記標的遺伝子が、ＶＥＧＦを含む、項目４４に記載のｓｇＲＮＡ。
［項目４７］
前記第１の領域が、配列番号９１、９２、９３または９４に開示の標的配列を含む、項目４４に記載のｓｇＲＮＡ。
［項目４８］
配列番号９０を含む、項目４４に記載のｓｇＲＮＡ。
［項目４９］
項目４４に記載のｓｇＲＮＡをコードする第２の合成ポリヌクレオチド。
［項目５０］
ＤＮＡポリヌクレオチドである、項目４９に記載の第２の合成ポリヌクレオチド。
［項目５１］
ベクターをさらに含む、項目４９に記載の第２の合成ポリヌクレオチド。
［項目５２］
５’ＵＴＲをさらに含む、項目４９に記載の第２の合成ポリヌクレオチド。
［項目５３］
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの５’キャップ構造をさらに含む、項目４４に記載のｓｇＲＮＡ。
［項目５４］
前記結合ヌクレオシドの第１の領域が、少なくとも第１の修飾ヌクレオシドを含む、項目４４に記載のｓｇＲＮＡ。
［項目５５］
前記ｓｇＲＮＡが、少なくとも２つの修飾を含む、項目４４に記載のｓｇＲＮＡ。
［項目５６］
ａ．前記少なくとも２つの修飾が、ヌクレオシドの１つ以上およびヌクレオシド間の骨格結合上の少なくとも一方に位置し；または
ｂ．前記少なくとも２つの修飾が、ヌクレオシドおよび骨格結合上の両方に位置し；または
ｃ．少なくとも１つの修飾が、骨格結合上に位置し；または
ｄ．１つ以上の骨格結合が、１つ以上の酸素原子の置き換えにより修飾されており；または
ｅ．少なくとも１つの修飾が、ホスホロチオエート結合による少なくとも１つの骨格結合の置き換えを含み；または
ｆ．少なくとも１つの修飾が、１つ以上のヌクレオシド上に位置し；または
ｇ．１つ以上の修飾が、１つ以上のヌクレオシドの糖上に存在し；または
ｈ．少なくとも１つの修飾が、シトシン、グアニン、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群から選択される１つ以上の核酸塩基上に位置する、
項目５５に記載のｓｇＲＮＡ。
［項目５７］
血清中の安定化を増加させる少なくとも１つの非翻訳修飾を含む、項目４４に記載のｓｇＲＮＡ。
［項目５８］
インビトロ転写法を使用して、または化学合成法を使用して産生される、項目４４に記載のｓｇＲＮＡ。
［項目５９］
実質的に精製されている、項目４４に記載のｓｇＲＮＡ。
［項目６０］
項目４４～５９のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡを含む組成物。
［項目６１］
薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、項目６０に記載の組成物。
［項目６２］
溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒体、希釈剤、分散液、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、脂質、リピドイド リポソーム、脂質ナノ粒子、コア－シェルナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物からなる群から選択される薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、項目６０に記載の組成物。
［項目６３］
ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ｒｅＬＮＰ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＡおよびＰＥＧ化脂質ならびにそれらの混合物から選択される脂質をさらに含む、項目６０に記載の組成物。
［項目６４］
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をさらに含む、項目６０に記載の組成物。
［項目６５］
ＬＮＰを含まない、項目６０に記載の組成物。
［項目６６］
細胞中の目的遺伝子の転写をモジュレートする方法であって、項目１に記載のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび項目４４に記載の合成ｓｇＲＮＡと、前記目的遺伝子の転写をモジュレートするために十分な条件下で前記細胞を接触させることを含み、前記合成ポリヌクレオチドの第１の領域が、エフェクタードメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記ｓｇＲＮＡの第１の領域配列が、前記目的遺伝子に対して相補的である方法。
［項目６７］
前記合成ポリヌクレオチドおよび前記合成ｓｇＲＮＡが、単一ポリヌクレオチドでない、項目６６に記載の方法。
［項目６８］
前記合成ポリヌクレオチドが、項目１～３０のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチドである、項目６６に記載の方法。
［項目６９］
前記ｓｇＲＮＡが、項目４４～５９のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡである、項目６６に記載の方法。
［項目７０］
前記目的遺伝子が、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、およびＬＤＨＣからなる群から選択される、項目６６に記載の方法。
［項目７１］
項目１に記載の合成ポリヌクレオチドが、前記細胞に特異的なｍｉＲ配列を含む、項目６６に記載の方法。
［項目７２］
前記目的遺伝子が、ＶＥＧＦであり、前記細胞が、Ｕ－９７ＭＧ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、一次ヒト肝細胞、またはＨｅｐＧ２細胞であり、項目２に記載の合成ポリヌクレオチドの１つおよび項目４５に記載のｓｇＲＮＡの１つと、前記ＶＥＧＦ遺伝子の転写をモジュレートするために十分な条件下で前記細胞を接触させることを含む、項目６６に記載の方法。
［項目７３］
対象中の目的遺伝子の転写をモジュレートする方法であって、前記対象に、第１の投薬量の項目１に記載の合成ポリヌクレオチドおよび第２の投薬量の項目４４に記載の合成ｓｇＲＮＡを、前記目的遺伝子の転写をモジュレートするために十分な条件下で投与することを含み、前記合成ポリヌクレオチドの第１の領域が、エフェクタードメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記ｓｇＲＮＡの第１の領域配列が、前記目的遺伝子に対して相補的である方法。
［項目７４］
前記合成ポリヌクレオチドが、項目１～３０のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチドである、項目７３に記載の方法。
［項目７５］
前記ｓｇＲＮＡが、項目４４～５９のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡである、項目７３に記載の方法。
［項目７６］
前記対象がヒトである、項目７３に記載の方法。
［項目７７］
前記合成ポリヌクレオチドおよび前記合成ｓｇＲＮＡの少なくとも一方が、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されている、項目７３に記載の方法。
［項目７８］
前記合成ポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されており、前記ｓｇＲＮＡが、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されていない、項目７３に記載の方法。
［項目７９］
前記目的遺伝子が、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、およびＬＤＨＣからなる群から選択される、項目７３に記載の方法。
［項目８０］
項目１に記載の合成ポリヌクレオチドが、前記細胞に特異的なｍｉＲ配列を含む、項目７３に記載の方法。
［項目８１］
項目７３に記載の方法であって、
ａ．前記第１の投薬量が、０．０００５／ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇの合成ポリヌクレオチドであり；ならびに
ｂ．前記第２の投薬量が、０．０００５／ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇのｓｇＲＮＡであり；ならびに
ｃ．前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡを一緒に投与し、もしくは別個に投与し；ならびに
ｄ．単回用量で、もしくは複数回用量で前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの少なくとも一方を投与し；ならびに
ｅ．１日１回もしくは１日２回以上、前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの少なくとも一方を投与し；ならびに
ｆ．前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの少なくとも一方を、出生前、新生児、出生後、経口、眼内、鼻腔内投与、および、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下もしくは筋肉内注射の少なくとも１つにより投与する
の少なくとも１つである、方法。
［項目８２］
前記目的遺伝子がＴＰＯであり、前記対象がマウスであり、前記マウスに、配列番号５１を含む０．０００５／ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇの合成ポリヌクレオチドおよび前記ＴＰＯ遺伝子の５’ＵＴＲの一方の鎖に対して相補的な配列を含む第１の領域を含む０．０００５／ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇのｓｇＲＮＡを投与することを含む、項目７３に記載の方法。
［項目８３］
対象中の疾患を治療する方法であって、前記対象に、第１の投薬量の項目１に記載の合成ポリヌクレオチドおよび第２の投薬量の項目４４に記載の合成ｓｇＲＮＡを、目的遺伝子の転写をモジュレートするために十分な条件下で投与することを含み、前記合成ポリヌクレオチドの第１の領域が、エフェクタードメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記ｓｇＲＮＡの第１の領域配列が、前記目的遺伝子５’ＵＴＲの一方の鎖に対して相補的であり、前記遺伝子の発現が、前記疾患に結び付く方法。
［項目８４］
前記疾患が癌であり、前記遺伝子が、アポトーシスまたは老化遺伝子である、項目８３に記載の方法。
［項目８５］
前記合成ポリヌクレオチドが、項目１～３０のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチドである、項目８３に記載の方法。
［項目８６］
前記ｓｇＲＮＡが、項目４４～５９のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡである、項目８３に記載の方法。
［項目８７］
前記対象が、ヒトである、項目８３に記載の方法。
［項目８８］
前記合成ポリヌクレオチドおよび前記合成ｓｇＲＮＡの少なくとも一方が、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されている、項目８３に記載の方法。
［項目８９］
前記合成ポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されており、前記ｓｇＲＮＡが、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されていない、項目８３に記載の方法。
［項目９０］
前記目的遺伝子が、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、およびＬＤＨＣからなる群から選択される、項目８３に記載の方法。
［項目９１］
項目１に記載の合成ポリヌクレオチドが、ｍｉＲ配列を含む、項目８３に記載の方法。
［項目９２］
ａ．前記第１の投薬量が、０．０００５／ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇの合成ポリヌクレオチドであり；ならびに
ｂ．前記第２の投薬量が、０．０００５／ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇのｓｇＲＮＡであり；ならびに
ｃ．前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡを一緒に投与し、もしくは別個に投与し；ならびに
ｄ．単回用量で、もしくは複数回用量で前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの少なくとも一方を投与し；ならびに
ｅ．１日１回もしくは１日２回以上、前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの少なくとも一方を投与し；ならびに
ｆ．前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの少なくとも一方を、出生前、新生児、出生後、経口、眼内、鼻腔内投与し、および静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下もしくは筋肉内注射の少なくとも１つにより投与する
の少なくとも１つである、項目８３に記載の方法。
配列表
表５．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質
Figure 0007225456000032
Figure 0007225456000033
Figure 0007225456000034
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Figure 0007225456000039
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Figure 0007225456000041
Figure 0007225456000042
Figure 0007225456000043
Figure 0007225456000044
Figure 0007225456000045
Figure 0007225456000046
Figure 0007225456000047
Figure 0007225456000048
Figure 0007225456000049
Figure 0007225456000050
Figure 0007225456000051
Figure 0007225456000052
表６．５’ＵＴＲ
Figure 0007225456000053
表７．３’ＵＴＲ
Figure 0007225456000054
Figure 0007225456000055
Figure 0007225456000056
Figure 0007225456000057
Figure 0007225456000058
表８．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）をコードするＤＮＡ構築物
Figure 0007225456000059
Figure 0007225456000060
Figure 0007225456000061
Figure 0007225456000062
Figure 0007225456000063
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Figure 0007225456000065
Figure 0007225456000066
Figure 0007225456000067
表９．ｓｇＲＮＡ構築物
Figure 0007225456000068
表１０．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡ
Figure 0007225456000069
Figure 0007225456000070
Figure 0007225456000071
Figure 0007225456000072
Figure 0007225456000073
Figure 0007225456000074
Figure 0007225456000075
Figure 0007225456000076
Figure 0007225456000077
表１１．合成ｓｇＲＮＡ
Figure 0007225456000078
表１２．Ａｄｄｇｅｎｅデータベース（プラスミドレポジトリ、ケンブリッジ、マサチューセッツ）に寄託された追加の配列
Figure 0007225456000079
Figure 0007225456000080
Figure 0007225456000081
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Claims (23)

  1. ウリジンが１－メチル－シュードウリジンにより１００％置換された合成ポリヌクレオチドであって、結合ヌクレオシドの第１の領域を含み、
    前記第１の領域が、配列番号６１、７、８、９、６２、６３、６４、または６５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するか、配列番号１～６または１１０～１１２のいずれか１つの核酸配列によりコードされるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする、合成ポリヌクレオチド。
  2. 前記合成ポリヌクレオチドが、少なくとも２つの修飾を含む、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド。
  3. （ａ）前記少なくとも２つの修飾が、ヌクレオシドの１つ以上およびヌクレオシド間の骨格結合上の少なくとも一方に位置し；または
    （ｂ）前記少なくとも２つの修飾が、ヌクレオシドおよび骨格結合上の両方に位置し；または
    （ｃ）少なくとも１つの修飾が、骨格結合上に位置し；または
    （ｄ）１つ以上の骨格結合が、１つ以上の酸素原子の置き換えにより修飾されており；または
    （ｅ）少なくとも１つの修飾が、ホスホロチオエート結合による少なくとも１つの骨格結合の置き換えを含み；または
    （ｆ）少なくとも１つの修飾が、１つ以上のヌクレオシド上に位置し；または
    （ｇ）１つ以上の修飾が、１つ以上のヌクレオシドの糖上に存在し；または
    （ｈ）少なくとも１つの修飾が、シトシン、グアニン、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群から選択される１つ以上の核酸塩基上に位置する、請求項２に記載の合成ポリヌクレオチド。
  4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチドを含む組成物であって、
    前記組成物が、
    （ａ）薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含み；
    （ｂ）ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ｒｅＬＮＰ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＡおよびＰＥＧ化脂質ならびにそれらの混合物から選択される脂質をさらに含み；または、
    （ｃ）脂質ナノ粒子をさらに含む、組成物。
  5. 前記薬学的に許容可能な賦形剤が、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒体、希釈剤、分散液、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、脂質、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、コア－シェルナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
  6. 細胞または組織を、請求項１～３のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチドまたは請求項４もしくは５に記載の組成物と接触させることを含む、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を産生するインビトロ方法。
  7. ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を産生する治療方法における使用のための組成物であって、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチドを含み、
    前記方法が、前記合成ポリヌクレオチドを含む前記組成物を生物に投与することを含む、組成物。
  8. 前記合成ポリヌクレオチドが、
    （ａ）１ｐｇ～１ｍｇの総１日用量において投与される；
    （ｂ）単回用量で投与される；
    （ｃ）単回用量を超えて投与される；
    （ｄ）出生前投与、新生児投与および出生後投与により投与される；
    （ｅ）経口投与、注射による投与、眼内投与による投与、または鼻腔内投与により投与される；または
    （ｆ）静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下および筋肉内注射からなる群から選択される注射により投与される、請求項７に記載の組成物。
  9. 細胞中の目的遺伝子の転写をモジュレートする治療方法における使用のための組成物であって、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチドを含み、
    前記方法が、前記合成ポリヌクレオチド、および合成ｓｇＲＮＡと、前記目的遺伝子の転写をモジュレートするために十分な条件下で前記細胞を接触させることを含み、前記合成ポリヌクレオチドの第１の領域が、エフェクタードメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記ｓｇＲＮＡの第１の領域配列が、前記目的遺伝子に対して相補的であり、
    前記合成ｓｇＲＮＡが、目的遺伝子を標的化するための合成ｓｇＲＮＡであり、前記合成ｓｇＲＮＡ内のウリジンが、１－メチル－シュードウリジンにより１００％置換されており、
    前記ｓｇＲＮＡが、
    （ａ）前記目的遺伝子の５’ＵＴＲのいずれかの鎖に対して相補的な２０～２５個の結合ヌクレオシドの第１の領域；および
    （ｂ）配列番号９０に見出されるガイドＲＮＡ足場配列を含む、前記第１の領域の３’末端に位置する第２のフランキング領域
    を含む、組成物。
  10. （ｉ）前記合成ポリヌクレオチドおよび前記合成ｓｇＲＮＡが、単一ポリヌクレオチドではない；
    （ｉｉ）前記合成ポリヌクレオチドが、請求項２または３に記載の合成ポリヌクレオチドである；
    （ｉｉｉ）前記目的遺伝子が、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、およびＬＤＨＣからなる群から選択される；
    （ｉｖ）前記合成ポリヌクレオチドが、前記細胞に特異的なｍｉＲ配列を含む；または
    （ｖ）前記目的遺伝子が、ＶＥＧＦであり、前記細胞が、Ｕ－９７ＭＧ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、一次ヒト肝細胞、またはＨｅｐＧ２細胞であり、前記方法が、前記合成ポリヌクレオチドおよび前記ｓｇＲＮＡと、前記ＶＥＧＦ遺伝子の転写をモジュレートするために十分な条件下で前記細胞を接触させることを含む、請求項９に記載の組成物。
  11. 対象中の目的遺伝子の転写をモジュレートする治療方法における使用のための組成物であって、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチドを含み、
    前記方法が、前記対象に、第１の投薬量の前記合成ポリヌクレオチドおよび第２の投薬量の合成ｓｇＲＮＡを、前記目的遺伝子の転写をモジュレートするために十分な条件下で投与することを含み、前記合成ポリヌクレオチドの第１の領域が、エフェクタードメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記ｓｇＲＮＡの第１の領域配列が、前記目的遺伝子に対して相補的であり、
    前記合成ｓｇＲＮＡが、目的遺伝子を標的化するための合成ｓｇＲＮＡであり、前記合成ｓｇＲＮＡ内のウリジンが、１－メチル－シュードウリジンにより１００％置換されており、
    前記ｓｇＲＮＡが、
    （ａ）前記目的遺伝子の５’ＵＴＲのいずれかの鎖に対して相補的な２０～２５個の結合ヌクレオシドの第１の領域；および
    （ｂ）配列番号９０に見出されるガイドＲＮＡ足場配列を含む、前記第１の領域の３’末端に位置する第２のフランキング領域
    を含む、組成物。
  12. （ｉ）前記合成ポリヌクレオチドが、請求項２または３に記載の合成ポリヌクレオチドである；
    （ｉｉ）前記対象がヒトである；
    （ｉｉｉ）前記合成ポリヌクレオチドおよび前記合成ｓｇＲＮＡの少なくとも一方が、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されている；
    （ｉｖ）前記合成ポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されており、前記ｓｇＲＮＡが、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されていない；
    （ｖ）前記目的遺伝子が、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、およびＬＤＨＣからなる群から選択される；
    （ｖｉ）前記合成ポリヌクレオチドが、前記細胞に特異的なｍｉＲ配列を含む；または
    （ｖｉｉ）前記目的遺伝子がＴＰＯであり、前記対象がマウスであり、前記方法が、前記マウスに、配列番号５１を含む０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇの合成ポリヌクレオチドおよび前記ＴＰＯ遺伝子の５’ＵＴＲの一方の鎖に対して相補的な配列を含む第１の領域を含む０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇのｓｇＲＮＡを投与することを含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. （ａ）前記第１の投薬量が、０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇの合成ポリヌクレオチドであり；ならびに
    （ｂ）前記第２の投薬量が、０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇのｓｇＲＮＡであり；ならびに
    （ｃ）前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡが一緒に投与され、もしくは別個に投与され；ならびに
    （ｄ）単回用量で、もしくは複数回用量で前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの少なくとも一方が投与され；ならびに
    （ｅ）１日１回もしくは１日２回以上、前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの少なくとも一方が投与され；ならびに
    （ｆ）前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの少なくとも一方が、出生前、新生児、出生後、経口、眼内、鼻腔内投与、および、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下もしくは筋肉内注射の少なくとも１つにより投与される
    の少なくとも１つである、請求項１１または１２に記載の組成物。
  14. 対象中の疾患を治療する方法における使用のための組成物であって、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチドを含み、
    前記方法が、前記対象に、第１の投薬量の前記合成ポリヌクレオチドおよび第２の投薬量の合成ｓｇＲＮＡを、目的遺伝子の転写をモジュレートするために十分な条件下で投与することを含み、前記合成ポリヌクレオチドの第１の領域が、エフェクタードメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記ｓｇＲＮＡの第１の領域配列が、前記目的遺伝子の５’ＵＴＲの一方の鎖に対して相補的であり、前記遺伝子の発現が、前記疾患に結び付くものであり、
    前記合成ｓｇＲＮＡが、目的遺伝子を標的化するための合成ｓｇＲＮＡであり、前記合成ｓｇＲＮＡ内のウリジンが、１－メチル－シュードウリジンにより１００％置換されており、
    前記ｓｇＲＮＡが、
    （ａ）前記目的遺伝子の５’ＵＴＲのいずれかの鎖に対して相補的な２０～２５個の結合ヌクレオシドの第１の領域；および
    （ｂ）配列番号９０に見出されるガイドＲＮＡ足場配列を含む、前記第１の領域の３’末端に位置する第２のフランキング領域
    を含む、組成物。
  15. （ｉ）前記疾患が癌であり、前記遺伝子が、アポトーシスまたは老化遺伝子である；
    （ｉｉ）前記合成ポリヌクレオチドが、請求項２または３に記載の合成ポリヌクレオチドである；
    （ｉｉｉ）前記対象が、ヒトである；
    （ｉｖ）前記合成ポリヌクレオチドおよび前記合成ｓｇＲＮＡの少なくとも一方が、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されている；
    （ｖ）前記合成ポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されており、前記ｓｇＲＮＡが、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されていない；
    （ｖｉ）前記目的遺伝子が、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、およびＬＤＨＣからなる群から選択される；または
    （ｖｉｉ）前記合成ポリヌクレオチドが、ｍｉＲ配列を含む、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記ｓｇＲＮＡの第１の領域が、配列番号９１、９２、９３または９４に記載の標的配列を含む、請求項９～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. （ａ）前記第１の投薬量が、０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇの合成ポリヌクレオチドであり；ならびに
    （ｂ）前記第２の投薬量が、０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇのｓｇＲＮＡであり；ならびに
    （ｃ）前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡが一緒に投与され、もしくは別個に投与され；ならびに
    （ｄ）単回用量で、もしくは複数回用量で前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの少なくとも一方が投与され；ならびに
    （ｅ）１日１回もしくは１日２回以上、前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの少なくとも一方が投与され；ならびに
    （ｆ）前記合成ポリヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡの少なくとも一方が、出生前、新生児、出生後、経口、眼内、鼻腔内投与し、および静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下もしくは筋肉内注射の少なくとも１つにより投与される
    の少なくとも１つである、請求項１４または１５に記載の組成物。
  18. 前記第１の領域が、
    （ｉ）配列番号６１をコードする；
    （ｉｉ）エフェクタードメインをさらにコードする；または
    （ｉｉｉ）ＫＲＡＢ、ＶＰ６４、ｐ６５ＡＤおよびＭｘｉからなる群から選択されるエフェクタードメインをさらにコードする、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド。
  19. 前記合成ポリヌクレオチドが、配列番号７１、７２、および１５～１８の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）からなる群から選択される結合ヌクレオチドの配列を含む前記第１の領域の５’末端に位置する第１のフランキング領域を含む、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド。
  20. 前記第１のフランキング領域が配列番号７１を含む、請求項１９に記載の合成ポリヌクレオチド。
  21. 前記合成ポリヌクレオチドが、配列番号８１、８２、および１９～３５の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）からなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列を含む前記第１の領域の３’末端に位置する第２のフランキング領域を含む、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド。
  22. 前記第２のフランキング領域が、
    （ｉ）配列番号８１を含む；
    （ｉｉ）配列番号８２を含む；
    （ｉｉｉ）結合ヌクレオシドの３’テーリング配列をさらに含む；
    （ｉｖ）ポリＡテールをさらに含む；
    （ｖ）８０～１４０ヌクレオチド長のポリＡテールをさらに含む；または
    （ｖｉ）１００ヌクレオチドのポリＡテールをさらに含む、請求項２１に記載の合成ポリヌクレオチド。
  23. 前記合成ポリヌクレオチドが、
    （ｉ）修飾ＲＮＡポリヌクレオチドである；
    （ｉｉ）配列番号５１～５６から選択される配列からなる；
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの５’キャップ構造をさらに含む；
    （ｉｖ）少なくとも１つの５’－メチルシチジンを含む；
    （ｖ）実質的に精製されている；または
    （ｖｉ）インビトロ転写法を使用して、または化学合成法を使用して産生される、請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド。
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