JP2011524164A - 小分子ｒｎａに基づく治療および診断ならびに小分子ｒｎａの実験的研究におけるエンドリソソーム系および分泌小胞（エキソソーム様）の用途 - Google Patents

小分子ｒｎａに基づく治療および診断ならびに小分子ｒｎａの実験的研究におけるエンドリソソーム系および分泌小胞（エキソソーム様）の用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、標的器官または標的細胞へのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の送達速度および／または効率の決定方法と、キットと、ＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの活性および／または細胞間移行を調節するためのエンドリソソーム系の形成に関与するタンパク質または脂質の使用とに関する。それには、特に、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ治療薬の（１つまたは複数の）標的を同定するための方法において、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療薬による治療の効率を決定するための方法において、ならびにヒト、腫瘍または胎児の遺伝子型を調べるためおよび／またはその状態の特性を決定するための方法において、多くの適用がある。

Description

本発明は、標的器官または標的細胞へのｓｉＲＮＡ（低分子干渉リボ核酸）、ｍｉＲＮＡ（マイクロリボ核酸）または関連分子の送達速度および／または効率の決定方法と、キットと、ＲＮＡ（リボ核酸）、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ（Ｐｉｗｉ相互作用リボ核酸）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーリボ核酸）または非コードＲＮＡの活性および／または細胞間移行を調節するためのエンドリソソーム系の形成に関与するタンパク質または脂質の用途とに関する。
本発明の多くの適用の中で、本発明者らは、特に、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ治療薬の（１つまたは複数の）標的を同定するための方法、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療薬による治療の効率を決定するための方法、ならびにヒト、腫瘍または胎児の遺伝子型を調べるためおよび／またはその状態の特性を決定するための方法を挙げることができる。
以下に続く以下の記載において、参考文献とは、添付の参考文献一覧を指す。
参考文献一覧において本明細書に引用されるすべての文献は、下記の本文において参照により組み込まれる。
多胞体（ＭＶＢ）の細胞質表面上に位置するＥＳＣＲＴ（endosomal
sorting complex required for transport）複合体は、ユビキチン化タンパク質を認識し、ＭＶＢ内に出芽する小胞内に選別し、小胞は、リソソームに送達され得るか、またはエキソソームとして細胞外空間内に放出され得る。ＲＮＡサイレンシング機構は膜とは無関係であるといわれることが多いが、Ａｇｏ２（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ−２）が少なくとも、未知の膜と緊密に会合する可能性があると他の証拠から示唆されている。ＧＷ１８２は、ユビキチン結合ドメインを含有し、ユビキチン化される。ＥＳＣＲＴ複合体の幾つかのメンバーを標的とするＳｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ活性をブロックしたが、ＭＶＢへのＧＷ１８２の局在化を著しく乱すことはなかった。ＧＷ１８２は、ｍｉＲＮＡをも含有したエキソソーム中に明確に濃縮された。最後に、エキソソームは、ＢＩＧ２（ブレフェルジンＡ阻害グアニンヌクレオチド交換タンパク質２）に依存してｍｉＲＮＡ活性を標的細胞に移行させた。
多胞体（ＭＶＢ）は、内部に出芽することにより形成される腔内小胞（ＩＬＶ）を含有する、エンドソームとリソソームの間の中間選別センターである。ＭＶＢ内へのタンパク質送達の最も研究された機構の内の１つは、ＥＳＣＲＴ（endosomal sorting complex required for transport）であり、それは、ユビキチン化タンパク質を認識し、このタンパク質をＩＬＶ内に送達する。ＥＳＣＲＴに会合するユビキチン化されたタンパク質および因子は、ＥＳＣＲＴと総称される３種のヘテロマーサブ複合体によりＭＶＢ内に選別されて、さらにエキソソーム中に分泌され、かつ／またはリソソームを介して分解され得る。ＩＬＶは、リソソームに輸送されて分解され得る。あるいは、ＭＶＢは、形質膜に融合して細胞外空間内にＩＬＶを放出することができ、この場合ＩＬＶはエキソソームと称される。エキソソームの放出は、単球、樹状細胞、および幾つかの腫瘍細胞において主として研究されてきたが、ほとんどの細胞がエキソソームを放出すると思われる。エキソソームは、タンパク質性抗原を腫瘍細胞から樹状細胞に移行させ、抗腫瘍免疫応答を活性化することができる。ペプチド抗原の移行が、エンドサイトーシスおよびタンパク質の分解によって起きるのか、または細胞質への抗原の送達によって起きるのかは知られていない。エキソソームは、その表面上に、産生細胞に由来する形質膜受容体をさらに含有し、それにより、エキソソームは、特異的な細胞型を標的として送り込まれ、さらには標的細胞上の形質膜受容体を活性化させる。
細胞質、細胞膜、ゴルジ等の他の小器官、または細胞外空間のタンパク質およびＲＮＡは、タンパク質のユビキチン化によるか、またはＭＶＢ中に選別される他のタンパク質、ＲＮＡまたは脂質に会合するドメインにより、ＭＶＢに送達され得る。次いで、ＭＶＢは、これらのタンパク質を細胞膜に移行させ、エキソソームと呼ばれる小胞内にこのタンパク質を分泌し、またはリソソーム内にこのタンパク質を送達して分解することができる。したがって、本発明において、ｍｉＲＮＡの機能に必須の小分子ＲＮＡおよびタンパク質が、ＭＶＢにより分泌されるエキソソーム内において見出された。
ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｐｉＲＮＡと呼ばれる１８〜３５のヌクレオチドから成るＲＮＡは、ヘテロクロマチンの形成により、あるいはＤＮＡ転写（ＤＮＡ［デオキシリボ核酸］）、ｍＲＮＡの分解もしくは安定化、またはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳の阻害もしくは活性化の変化をもたらす他の修飾により、遺伝子または非コードＲＮＡの発現を調節することができる。これらの小分子ＲＮＡは、生物の多くの発達、癌および免疫において役割を果たす。さらに、ｓｉＲＮＡの技術は、研究および医学においてＲＮＡまたはタンパク質の発現を特異的に阻害するように適合されてきた。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、翻訳を配列特異的に阻害もしくは活性化することができ、または標的ｍＲＮＡの分解もしくは安定化および局在化を促進することができる１９〜２４ヌクレオチドのＲＮＡ分子である。数百種のｍｉＲＮＡが、遺伝子の約３０％を調節すると考えられている。数年前、Ｐ−ボディまたはＧＷ−ボディと呼ばれる細胞内構造が、小分子ＲＮＡと、その機能に必須のタンパク質、例えば、Ｄｃｐ１ａ（デキャッピング酵素ホモログＡ）、ＧＷ１８２およびＡｒｇｏｎａｕｔｅファミリーメンバーを含む、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡにより媒介される転写後調節に関与するタンパク質の内の多くとを集合させ得るとして同定された。Ｐ−ボディは、脂質二重層とは無関係であると考えられ（Ｅｙｓｔａｔｈｉｏｙ，Ｔ．ら、Ａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ，ＧＷ１８２，ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍＲＮＡｓ ｗｉｔｈｉｎ ｎｏｖｅｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｃｋｌｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１３、１３３８〜１３５１頁（２００２）［１］、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｇａｗｋｙ ｉｓ ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｏｄｉｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７４、３４９〜３５８頁（２００６）［２］）、リソソーム、初期エンドソーム、ゴルジまたはペルオキシソームを含むいずれの公知の細胞内小器官または構造とも広範囲には重複しない（［１］、Ｊａｋｙｍｉｗ，Ａ．ら、Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＧＷ ｂｏｄｉｅｓ ｉｍｐａｉｒｓ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７、１２６７〜１２７４頁（２００５）［３］）。しかし、幾つかの証拠は、ＲＮＡサイレンシング機構の成分が膜と会合する可能性があることを示唆する。Ａｇｏ２はマイクロソームにより精製され、マイクロソームのＡｇｏ２は、洗剤による処理の後でのみトリプシン消化に利用可能である（Ｃｉｋａｌｕｋ，Ｄ．Ｅ．ら、ＧＥＲｐ９５，ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１０、３３５７〜３３７２頁（１９９９）［４］）。さらに、ＧＷ１８２を認識する自己抗体と同じ染色パターンが得られる脂質ホスファチジルエタノールアミンに対する自己抗体が最近同定された（Ｌａｕｒｉｎｏ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｈｕｍａｎ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｄｉａｃｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｔ ｏｆ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｄｏｍａｉｎｓ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３、５７２〜５８４頁（２００６）［５］）。驚くべきことに、ＧＷ１８２はユビキチン会合（ＵＢＡ）ドメインを有するが、そのことは、ＧＷ１８２が、ユビキチン化タンパク質によりＭＶＢでＥＳＣＲＴ複合体に結合し得ることを示唆する。
さらに、ユビキチン化タンパク質に結合し、ＭＶＢにおいてユビキチン化タンパク質を選別するＥＳＣＲＴの多くのタンパク質はまた、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡがそのｍＲＮＡおよびその標的タンパク質の発現を低下させることを促進する際に重要であることも分かった。また、エキソソームは、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ活性をある細胞から別の細胞に移行させることが可能であることも分かった。さらに、ＭＶＢの形成に関与する多くのタンパク質は、細胞質分裂に、ならびにＤＮＡヘテロクロマチンによる転写または遺伝子発現の調節に重要であることから、これらのタンパク質の一部は、幾つかの細胞分裂によりｓｉＲＮＡ効果を拡大できる可能性があり、または小分子ＲＮＡがＤＮＡ構造および／または転写、例えばヘテロクロマチン形成または後成的調節による等に影響を及ぼすことができる可能性がある。
エキソソームは、特異的なエキソソーム受容体、例えば、ＩＣＡＭ−１（細胞間接着分子１）（Ｓｅｇｕｒａ，Ｅ．、Ｇｕｅｒｉｎ，Ｃ．、Ｈｏｇｇ，Ｎ．、Ａｍｉｇｏｒｅｎａ，Ｓ．、およびＴｈｅｒｙ，Ｃ．ＣＤ８＋ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｕｓｅ ＬＦＡ−１ ｔｏ ｃａｐｔｕｒｅ ＭＨＣ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｒｏｍ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９、１４８９〜１４９６頁（２００７）［３６］）および、場合により、ＭＦＧ−Ｅ８（乳脂肪球−ＥＧＦ因子８タンパク質）（Ｚｅｅｌｅｎｂｅｒｇ，Ｉ．Ｓ．ら、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８、１２２８〜１２３５頁（２００８）［３７］）によって、マクロファージおよびＤＣ（樹状細胞）を標的とする。エキソソームは、免疫応答を調節するように、離れた抗原提示細胞にリンパ液、胸膜腔または血液で輸送され得る（Ｍｏｒｅｌｌｉ，Ａ．Ｅ．ら、Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｏｒｔｉｎｇ，ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．１０４、３２５７〜３２６６頁（２００４）［３８］）。リンパ節または脾臓におけるＤＣに対する病原菌感染部位における活性化ＤＣにより分泌されるエキソソームによる免疫抑制性ｍｉＲ−１４６および−１５５の輸送（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｒ．Ｍ．、Ｔａｇａｎｏｖ，Ｋ．Ｄ．、Ｂｏｌｄｉｎ，Ｍ．Ｐ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｇ．、およびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ、ＭｉｃｒｏＲＮＡ−１５５ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４、１６０４〜１６０９頁（２００７）［３９］）は、免疫応答のための周縁を確立することの一助となり、全身的活性化および敗血症性ショックのリスクを低下させる可能性がある。特に興味深い可能性は、多くのウイルスまたは細菌による、それらのライフサイクルを達成するためのＲＮＡプロセシングまたは翻訳機構の破壊に関する（Ｐｅｌｃｈｅｎ−Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ａ．、Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．、およびＭａｒｓｈ，Ｍ．Ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ，ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｔｒｏｊａｎ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２、３１０〜３１６頁（２００４）［４０］）。抗原提示細胞への輸送のために日常的にＲＮＡおよび固定タンパク質をエキソソーム内にパッケージングすることは、それ以外の場合に哺乳類におけるタンパク質に基づく抗原特異免疫を回避し得る主要なウイルスタンパク質に対する免疫応答を生じさせる巧妙な方法である。各タイプの分化細胞により産生されるエキソソームは、その細胞に由来する特殊な一組の表面受容体を含有することにより、部分的にｍｉＲＮＡを介して、離れた場所で類似の調節変化を行うことができる。例えば、エキソソームは、皮膚および毛の色を調節する要素、または精子の成熟に関与するエピジモソーム（epididymosome）（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｒ．、Ｓａｅｚ，Ｆ．、Ｇｉｒｏｕａｒｄ，Ｊ．、およびＦｒｅｎｅｔｔｅ，Ｇ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｓｐｅｒｍ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔ ａｌｏｎｇ ｔｈｅ ｍａｌｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ．Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．３５、１〜１０頁（２００５）［４１］）を輸送するメラノソームと多くの類似性を共有する。より離れて、エキソソームは、シナプス小胞、および免疫細胞により分泌される各種の顆粒と類似性を共有する。シナプス−軸索結合がシナプス小胞のｍｉＲＮＡ交換によりフィードバック調節される可能性があり、またはｍｉＲＮＡのサブセットが、免疫細胞顆粒内に特異的に選別される可能性があり、かつ寄生生物（腫瘍形成性）内に送達される可能性があり、またはウイルスで細胞を感染させてそれらの生存に必須の遺伝子を標的としたと推測することができた。この点において興味深いことに、一連の電子顕微観察研究は、肥満細胞顆粒内におけるＲＮＡの存在を示唆する（Ｄｖｏｒａｋ，Ａ．Ｍ．およびＭｏｒｇａｎ，Ｅ．Ｓ．Ｔｈｅ ｃａｓｅ ｆｏｒ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｇｒａｎｕｌｅｓ ｔｏ ｉｎｃｌｕｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｒｏｇ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３７、２３１〜３１８頁（２００２）［２７］）。
ＨＩＶ−１等のレトロウイルス（ヒト免疫不全症ウイルス−１）は、パッケージングおよび細胞間輸送のためのＭＶＢを取り込む（Ｍａｒｔｉｎ−Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｊ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｉｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｅｇｒｅｓｓ．Ｔｒａｆｆｉｃ．８、１２９７〜１３０３頁（２００７）［４２］）。内在性レトロウイルス中におけるＧａｇの保存、およびエキソソームのプロテオミクス研究における内在性レトロウイルスからのＧａｇの発見（Ｓｅｇｕｒａ，Ｅ．、Ａｍｉｇｏｒｅｎａ，Ｓ．、およびＴｈｅｒｙ，Ｃ．Ｍａｔｕｒｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｅ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｗｉｔｈ ｓｔｒｏｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．３５、８９〜９３頁（２００５）［４３］）は、幾つかの内在性レトロウイルスがＭＶＢを利用することもできることを示唆する。一部がレトロウイルスを抑制し得るｍｉＲＮＡ（Ｌｅｃｅｌｌｉｅｒ，Ｃ．Ｈ．ら、Ａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０８、５５７〜５６０頁（２００５）［４４］）と、場合によってはエキソソーム中における活性化内在性レトロウイルスおよび他の転置因子を標的とするｓｉＲＮＡとを含むことは、発生のこれらの作用因子に対する細胞および細胞自律的防御であり得る。さらに、ＩＩＩ型分泌物系を有する細菌は、ＲＮＡサイレンシング機構の成分を標的とする細胞内にタンパク質を注入する。（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎａｖａｒｒｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２００８ ３２１：９６４頁［８７］）。マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacteria smegmatis）等の幾つかの細胞内細菌は、ＥＳＣＲＴ複合体により制限され、場合により直接的または間接的にＲＮＡサイレンシング機構に影響を及ぼす（Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｊ．Ａ．、Ｐｏｒｔｏ，Ｍ．Ｃ．、Ｗａｎｇ，Ｈ．、Ｒｕｂｉｎ，Ｅ．Ｊ．、およびＰｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．ＥＳＣＲＴ ｆａｃｔｏｒｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５、３０７０〜３０７５頁（２００８）［４５］）。
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、毒性が最小限である特異的遺伝子の医薬的標的化のために大きな興味があり、内在性ｍｉＲＮＡは、多くの癌、発育上の欠失、および免疫応答において重要な役割を果たす。しかし、すべての標的細胞の内の大部分の中へのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの送達は、インビボでのそれらの使用を限定する主要な問題である。さらに、直接ｍｉＲＮＡ活性を調節する多くの遺伝子は、細胞生存に必須であり、しかるに薬物で標的とすることは容易ではない。さらに、ＭＶＢを通過する病原菌および／またはＭＶＢに会合し、場合によっては現行の薬物に対する耐性を発現する病原菌を除去する治療はしばしば存在しない。最後に、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの効果は、タンパク質産生の効果的な阻害についての予想よりもしばしば低い。
したがって、細胞に対する望ましくない効果がないか、もしくは小さい、インビボでのすべての標的細胞の大多数へのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの改善された送達方法の開発の必要性、またはｍｉＲＮＡ活性を直接調節する遺伝子を標的とすることの必要性が残っている。さらに、ＭＶＢを通過する病原菌および／またはＭＶＢに会合し、場合によっては現行の薬物に対する耐性を発現する病原菌を除去する治療の必要性が、依然として存在する。
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ここで、本発明の発明者らは、有意な比率のＧＷ１８２およびＡｇｏ２が、ｍｉＲＮＡが細胞間で輸送され得るＰ−ボディ様構造で多胞体（ＭＶＢ）に会合することを完全に予想外に発見した。ＥＳＣＲＴ複合体の幾つかの成分がｍｉＲＮＡの活性にとって重要であるので、ＭＶＢとのＲＮＡサイレンシング機構の会合は機能的である。このように、この研究は、細胞内区画とｍｉＲＮＡ経路との間の新しい結合を提案する。
また、本発明者らは、ＧＷ１８２およびＡｇｏ２を含有するＧＷ−ボディは、ＭＶＢと集合するので、Ｐ−ボディとは異なることをも発見した。さらに、ｍｉＲＮＡ抑制ｍＲＮＡは、細胞膜で特異的に濃縮されるが、このことは、ＭＶＢがｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣ作用の新規な部位であることを意味する。ＭＶＢにより分泌される精製エキソソーム様小胞は、Ｐ−ボディ成分ではなく、ＧＷ１８２中において非常に濃縮される。また、ごくわずかな細胞Ａｇｏ２および成熟ｍｉＲＮＡがエキソソーム中においても見出されるが、ｍｉＲＮＡ抑制ｍＲＮＡは存在しない。ＭＶＢ内へのそのＥＳＣＲＴ依存性選別に一致して、Ｐ−ボディ成分でなくＧＷ１８２は、ユビキチン結合するか、またはユビキチン化タンパク質と相互作用する。さらに、幾つかのＥＳＣＲＴ成分を欠く細胞は、ＧＷ１８２を過剰蓄積し、ｍｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングが損なわれたことを示す。したがって、場合により一部分のｍｉＲＮＡ負荷Ａｇｏ２に会合するＧＷ１８２は、分泌および／またはリソソーム分解のためにＭＶＢ内に選別される。このプロセスは、複数回のｍＲＮＡ抑制に必要な膜結合型ｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣの高い解離速度を可能にする。あるいは、このプロセスは、小分子ＲＮＡの生合成、標的認識、または小分子ＲＮＡ複合体のターンオーバー／分解を調節する際に小分子ＲＮＡによるＡｇｏの負荷に関与する可能性がある。実際、本発明者らは、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的がリソソーム内膜上に蓄積することを示すが、このことは、ｍＲＮＡ標的認識がこれらの膜上で起きる可能性があることを意味する。本発明者らは、リソソームを含有する密度勾配画分中においてＧＷ１８２を見出すが、このことは、小分子ＲＮＡ複合体のターンオーバー／分解がリソソームを介して起きることを示唆する。
また、本発明者らは、Ａｇｏ２およびＧＷ１８２を含むＲＮＡサイレンシング機構の幾つかの主要成分がＭＶＢのマーカーと共局在することをも示した。
驚くべきことに、本発明者らはまた、ＥＳＣＲＴ複合体およびユビキチン化が、哺乳類細胞内におけるＲＮＡサイレンシングおよびその細胞間移行の重要な調節成分であることをも見出した。
また、本発明者らは、多胞体（ＭＶＢ）に会合する大量のＰ−ボディまたはＧＷ−ボディが膜と会合し、場合によっては膜で囲まれる可能性があることをも示す。さらに、ＭＶＢの形成に関与する多くのタンパク質、即ちＥＳＣＲＴ（endosomal sorting complex required for transport）からのタンパク質、例えば、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ（肝細胞応答性血清リンタンパク質）、ｖｐｓ３６（液胞タンパク質選別会合タンパク質３６）、ＥＦ１ａ１および２、ＰＲＰ（プリオンタンパク質）、ＨＭＧＣＲ（ＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素）、スフィンゴミエリナーゼ（化学抑制剤ＧＷ４８６９により標的とされる）、ＮＰＣ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ Ｃ１タンパク質）、またはＭＶＢ、もしくはエキソソームの分泌物（例えばＢＩＧ２）に会合する他のタンパク質が、ｍｉＲＮＡ活性にとって重要であることが示された。ＥＳＣＲＴ複合体は、ｍｉＲＮＡの能力を阻害するか、または増強して、その相補型ｍＲＮＡのタンパク質発現を抑制することができる。ＥＳＣＲＴ複合体は、ある種類の小分子ＲＮＡの機能を、別の種類の機能を無損傷にする一方で選択的に調節するための手段を提供することができる。例えば、ｍｉＲＮＡ活性が影響され得るが、ｓｉＲＮＡ活性はそうではない。また、ＭＶＢ中において形成され、かつ細胞により放出されるエキソソームと呼ばれる少しの小胞（直径約５０ｎｍの）しか、ある細胞から別の細胞にｍｉＲＮＡ活性またはｓｉＲＮＡ活性を移行することができないことも示された。これらの発見は、ｍｉＲＮＡ活性またはｓｉＲＮＡ活性を細胞中において調節することが可能であり、かつ他のヒト細胞に移行することが可能な手段を示す。さらに、本発明者らは、ＥＳＣＲＴ複合体の幾つかのメンバーのノックダウンがｍｉＲＮＡ活性を除去するが、一方で他のノックダウンがその活性を増加させることを見出す。最後に、ＲＮＡサイレンシング機構およびｍｉＲＮＡの成分は、エキソソーム内に負荷され、エキソソームと共にインキュベートされる細胞内における遺伝子発現を阻害することができる。
したがって、本発明の第１の態様は、標的器官もしくは標的細胞へのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくは関連分子またはかかる分子の阻害剤の送達速度および／または効率を決定する方法であって、前記標的器官または標的細胞のエキソソームまたは小胞中の、前記ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの、ならびに／あるいは、前記ｍｉＲＮＡおよび／または前記ｓｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡのレベルを測定することを含む方法に関する。
換言すれば、本発明は、標的器官もしくは標的細胞へのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくは関連分子またはその阻害剤の送達速度および／または送達効率を決定する方法であって、前記標的器官または標的細胞のエキソソームまたは小胞中の、前記ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの、ならびに／あるいは、前記ｍｉＲＮＡおよび／または前記ｓｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡのレベルを測定することを含む方法に関する。
本発明の意味における「ｓｉＲＮＡ」は、本発明に適切であり得る任意の干渉ＲＮＡを意味する。さらに詳しくは、ｓｉＲＮＡは、６〜２９ヌクレオチドを含む短い干渉ＲＮＡを示すことができる。より正確には、およそ２２ヌクレオチド長の短い干渉ＲＮＡを示すことができる。好都合には、場合によりＡＧＯタンパク質１〜４および／またはＧＷ１８２タンパク質Ａ、ＢもしくはＣまたはＴＮＧＷ１（トリヌクレオチドＧＷ１）の内のいずれかを含むＲＮＡサイレンシング複合体の少なくとも１種の成分と共に、例えばｍＲＮＡ開裂、分解、または翻訳の阻害によって遺伝子発現を修飾する短い干渉ＲＮＡであり得る。
本発明の意味における「ｍｉＲＮＡ」は、本発明に適切であり得る任意のｍｉＲＮＡを意味する。好都合には、生物学的活性型において、長さが約１７〜約２５個のヌクレオチド塩基である任意の天然小型非コードＲＮＡである。好ましくは、わずか９個のヌクレオチドであってよく、即ち９個以下のヌクレオチドを含む。好都合には、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ翻訳を抑制するか活性化することにより、またはｍＲＮＡの分解、安定化もしくは細胞内局在性を促進することにより、転写後に遺伝子発現を調節することができる。本発明の意味において、しばしば、しかし限定されることなく、ｍｉＲＮＡは、内因的に発現されて、または合成形態および変異型で投与されて、ｍＲＮＡ翻訳の負の調節因子として機能することが可能であり、即ち、より大きな量の特異的ｍｉＲＮＡがより低いレベルの標的遺伝子発現と相関する。また、ｍｉＲＮＡは、翻訳（例えばＶａｓｕｄｅｖａｎ ｒｅｆｓ ７４および７５の）を活性化することもできる。好都合には、ｍｉＲＮＡ様である小分子ＲＮＡ分子は、転写を活性化することができるか、または抑制することができる。
本発明の意味における「関連分子」は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ｐｉＲＮＡ、合成ヌクレオチド、ならびにｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡまたはその変異体の修飾変異体を含むあらゆるヌクレオチドを意味する。かかる変異体は、化学的に合成することが可能であり、ＲＮＡサイレンシングに関連するプロセスに利点を有する可能性がある。これらの修飾の一部、例えば２’−ｏ−メチル、２’−ｏ−アリル、２’−デオキシ−フルオロウリジン修飾またはホスホロチオエートは、ｓｉＲＮＡ関連分子を分解から保護することの一助となり得る。また、他の修飾、例えばメチレン架橋により２’−酸素がリボース環の４’−炭素に連結されるロックされた核酸の修飾は、ｓｉＲＮＡ関連分子のその標的への親和性を増加させること、または標的外の効果を低下させることの一助となり得る。他の修飾は、例えば、二本鎖ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊複合体の一方の鎖に５’リン酸またはメチルを付加することにより、ＡＧＯ内へのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの正確な鎖の負荷を増強することができる。
本発明の意味において、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子は、動物、好ましくはヒトに、または細胞に投与される。前記ヒトは、それを必要とする患者であってよい。前記投与は、疾患、例えば癌の治療の中に、または細胞へのトランスフェクションにより実施され得る。投与されると、このｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子は、標的器官または標的細胞に送達される。
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の投与は、標的器官または標的細胞のエキソソームまたは小胞中の、前記ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの、ならびに／あるいは、前記ｍｉＲＮＡおよび／または前記ｓｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡのレベルの測定の前に実施される。
この投与は、当業者により周知のすべての手法により、例えば、ｓｉＲＮＡと、インビトロでのトランスフェクションのために使用されるカチオン脂質トランスフェクション試薬とを混合し、関連組織内にｓｉＲＮＡ脂質複合体を直接注入すること、または体腔内にそれを点滴することにより、あるいは、ｓｉＲＮＡと、細胞内に核酸を運搬することが知られている他の分子（即ち、特定のカチオン性ペプチド）とを混合し、流出静脈内へのカテーテルを介した急激な逆方向の注入を行い、末梢静脈への水圧注入を行い、カチオン性ポリマーもしくはペプチドとｓｉＲＮＡを複合体形成するか、ナノ粒子もしくはリポソーム内にｓｉＲＮＡを組み込むかまたは特異的受容体を担持する細胞へのｓｉＲＮＡの送達を限定するために細胞表面受容体への抗体フラグメントもしくはリガンドに共有結合もしくは非共有結合することにより実施され得るが、この一覧は限定的ではない。
すべての細胞がＲＮＡｉ機構を有し、かついずれの遺伝子も可能な標的であるので、優性遺伝子の発現により引き起こされる、または非常に悪化するいずれの疾患も、概ねＲＮＡｉにより治療され得る。これらの疾患は、例えば癌、神経変性疾患、ウイルス感染症および黄斑変性であり得るが、この一覧は限定的ではない。
本発明の意味において、「送達速度」は、対照と比較した、その作用部位、即ちそのｍＲＮＡ標的が局在する部位に到着し得る、または開裂し得るか、もしくは標的ｍＲＮＡの分解をもたらし得る、または標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る、個体に投与されたｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの任意の比または量を意味する。
本発明の意味において、「送達効率」は、対照と比較した、その作用部位、即ちそのｍＲＮＡ標的が局在する部位で活性を有し得る、または開裂し得るか、もしくは標的ｍＲＮＡの分解をもたらし得る、または標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る、個体に投与されたｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの任意の比または量を意味する。
本発明の意味において、「標的器官または標的細胞」は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくは関連分子が多少のｍＲＮＡの翻訳を抑制し得るか、その分解を増強し得るか、または多少のｍＲＮＡの開裂を向上させ得るあらゆる器官または細胞を意味する。
任意の細胞、細胞群、細胞断片または細胞産物は、本発明の方法で使用され得る。
細胞は、培養培地中に、または生体液中に、または体液中に含まれ得る。
本発明の意味において、「小胞」または「エキソソーム」は、大きさが２０〜２５０ｎｍのあらゆる小胞または膜結合構造を意味する。かかる小胞の例は、微小胞、微粒子、エキソソーム様小胞、デキソソーム、テキソソーム、プロテアソーム、エピジモソーム、「エキソソーム様小胞」であり得るが、この一覧は網羅的ではない。小胞の大きさは、一般に２０〜２５０ｎｍ、例えば２０〜１００ｎｍであるが、１００ｎｍ〜３マイクロＭであってもよい。小胞は、例えば血液、尿、唾液および他の体液から、当業者に公知の手段により精製され得る。例えば、通常、遠心分離により、例えば２００ｇで細胞を除去し、しかるに小胞またはエキソソームを含有する上清を得ることによって小胞を精製することが可能である。小胞またはエキソソームを得る別の方法は、エキソソームまたは小胞を精製するためのさらなる遠心分離ステップを行うことであり、より大きな小胞をさらに除去するための１０００ｇおよび１００００〜１６０００ｇでのステップを含む可能性がある。７００００〜１２００００ｇでのその後の遠心分離が、エキソソーム様小胞を精製するために標準的に使用される。エキソソームまたは小胞を得るための別の方法は、異なる粒度を排除するためのフィルタの組合せを使用することを含み、例えば興味の対象の小胞よりも大きい小胞または粒子を除去するために、０．４５マイクロＭまたは０．２２マイクロＭのフィルタを使用し得る。エキソソームまたは小胞は、最終的にはエキソソーム様小胞について濃縮するためのビーズ（例えば、アガロース／セファロースビーズ、磁性ビーズ、または精製を容易にする他のビーズ）と組み合わせて、抗体、レクチン、または興味の対象の小胞に特異的に結合する他の分子を含む幾つかの手段により精製され得る。エキソソーム様小胞上で濃縮されるタンパク質の例としては、ＣＤ６３、トランスフェリン受容体、シアル酸、ムチン、Ｔｓｇ１０１（腫瘍感受性遺伝子１０１）、Ａｌｉｘ、アネキシンＩＩ、ＥＦ１ａ（翻訳伸長因子１ａ）、ＣＤ８２（分化クラスター８２）、セラミド、スフィンゴミエリン、脂質ラフトマーカー、ＰＲＮＰ（ＰＲｉｏＮタンパク質）を挙げることができるが、勿論これらに限定されるものではない。本発明の場合、興味の対象の細胞型に由来するマーカーが、しばしば使用され得る。例えば、ＲＮＡｉ治療が肝臓組織を対象とする場合、小胞は、他の細胞または組織に由来する小胞から肝臓由来小胞を区別するために肝臓特異的マーカーを使用して無細胞液から精製され得る。エキソソームを精製するための他の手法としては、密度勾配遠心分離法（例えば、ショ糖勾配またはｏｐｔｉｐｒｅｐ勾配）、電荷分離が挙げられる。これらのすべての濃縮手法および精製手法は、他の方法と組み合わせることが可能であるか、または単独で用いることが可能である。したがって、体液から単離されたエキソソームは、ｓｉＲＮＡ治療薬の送達速度または効率の定量的測度を提供することができる。
本発明の意味において、「エキソソーム」は、細胞のあらゆる小型小胞を意味する。本発明の意味において、かかる小型小胞は、多胞体を含むが限定されない幾つかの手段により細胞中において生成され得る。
本発明の意味において、「多胞体」は、異なるタンパク質選別機構を使用し得るエンドリソソーム系の任意のボディ、例えば多胞体の任意のサブタイプを意味する。例えば、ＭＶＢは、エンドソーム、例えば後期エンドソーム、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩＩ負荷区画、エンドリソソーム系に輸送することができるか、もしくはエンドリソソーム系から輸送することができる小胞体およびゴルジに由来するオートファゴソーム、リソソーム、エンドソームおよび小胞を含む細胞内小器官であり得る。
本発明の意味において、「測定」は、定量的または質的な測定を可能にし得る任意の解析、あるいはｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ標的のレベルを比較することを可能にし得る任意の解析を意味する。ＲＮＡを測定するための当業者に公知の任意の方法は、本発明に適切であり得る。かかる方法は、実際の多くの変法におけるｑＲＴ−ＰＣＲ（定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）（例えば、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ、Ｂｅａｃｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはヌクレオチドの特異性がマイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、他のＲＮＡ、またはＤＮＡ分子を検出するために使用される任意の種類または組合せの修飾（特に、ロックされた核酸［ＬＮＡ］、２’−ｏ−メチル）による任意の長さのオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づく手法であってよい。これらの手法において、オリゴヌクレオチドは、溶液中、チップ上、ゲルまたは他の担体の中にあってよい。これらの手法において、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡは、蛍光、またはクエンチャーと蛍光との組合せ、放射能、または他の化学もしくは発光検出方法を使用して検出され得る。ＲＮＡｉの概念に基づくｓｉＲＮＡまたは治療分子が使用される場合、ＲＮＡ分子は、化学的に修飾することが可能であり（例えば、ＬＮＡ、２’−ｏ−メチル）、ＲＮＡｉ治療分子の測定は、ＲＮＡｉ治療薬として使用されるＲＮＡ／ＤＮＡまたは他の分子の修飾を検出することを可能にする任意の手法により実施され得る。４。本発明の一実施形態において、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルの測定は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、あるいはマイクロアレイまたは他のチップ上のハイブリダイゼーションにより、あるいはゲルもしくは膜上または溶液中におけるハイブリダイゼーションにより実施される。
これらの測定は、Ｔｒｉｚｏｌ抽出等、当業者に公知の幾つかの手法の内のいずれかにより単離される、場合によっては精製形態における細胞、組織または小胞からのＲＮＡを含有する画分を例えば必要とすることができる。
例えば、動物の血清を含まない培地中で細胞を培養して、前記血清からのエキソソームの混入を回避することができる。エキソソームからのＲＮＡの測定は、例えば細胞の除去によるより大量の細胞ＲＮＡからの除去または独立を必要とする可能性がある。好都合には、細胞、組織または小胞は、ｓｉＲＮＡ治療の治療条件、またはｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡの研究における興味の対象の条件を保存するかまたは模倣するために培養すること、治療すること、または得ることが可能である。例えば、ｓｉＲＮＡ療法の有効性を確認するために使用される組織または小胞は、低温で処理することが可能であり、直ちにおよび続いて、試料の統合性を保存するのに十分な温度で凍結することが可能である。
例えば、飢餓中に肝臓内のｍｉＲ−１２２により調節されるｍＲＮＡを発見するため、飢餓動物から得られた肝臓組織が模倣体または阻害剤で治療される。ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの模倣体は、内在性ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の多くのまたはすべての性質を保持することができるが、また、ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ分子について上で考察されたようにその安定性または有効性を増強するために修飾されることも可能である。
ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの阻害剤は、阻害すべきｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡに対する１つまたは複数の、完全にまたは部分的にマッチする標的部位を含むことが可能であり、それにより、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの分解を隔離すること、競合すること、または引き起こすことができる。これらの阻害剤は、類似の方法でも修飾され得る。これらの修飾の一部、例えば２’−ｏ−メチル、２’−ｏ−アリル、２’−デオキシ−フルオロウリジン修飾またはホスホロチオエートは、ｓｉＲＮＡ関連分子を分解から保護することの一助となり得る。また、他の修飾、例えばメチレン架橋により２’−酸素がリボース環の４’−炭素に連結されるロックされた核酸の修飾は、ｓｉＲＮＡ関連分子のその標的への親和性を増加させること、または標的外の効果を低下させることの一助となり得る。他の修飾は、例えば、二本鎖ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊複合体の一方の鎖に５’リン酸またはメチルを付加することにより、ＡＧＯ内へのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの正確な鎖の負荷を増強することができる。これらの種類の分子は、幾つかの会社、例えばｍｉＲ−１２２のＱｉａｇｅｎおよびＡｍｂｉｏｎから現在商業的に入手可能であり、血液から精製された肝臓由来エキソソームが使用され得る。
本発明の意味における「前記ｍｉＲＮＡおよび／または前記ｓｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の投与により完全にまたは部分的に脱アデニル化され得るかまたは分解され得る任意のｍＲＮＡを意味する。好都合には、その翻訳は、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡもしくは関連分子により抑制され得るか、または開裂され得る。
前記ｍｉＲＮＡおよび／または前記ｓｉＲＮＡが標的とするかかるｍＲＮＡは、例えば、ｍｉＲ−１９６、Ｌｉｎ−２８、ＣＡＴ−１、ＴＮＦであってよい。ＭｉＲ−１９６は、その標的ｍＲＮＡの内の少なくとも１つ（ＨＯＸＢ８）の開裂をもたらすｍｉＲＮＡの一例である（Ｙｅｋｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年、３０４：５９４頁［８８］）。Ｌｉｎ−２８は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２５ｂ）により分解されるｍＲＮＡの一例である（Ｗｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００５年、２５：９１９８頁［８９］）。ＣＡＴ−１は、ｍｉＲＮＡによる翻訳抑制を受けるｍＲＮＡの一例である（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａら、Ｃｅｌｌ ２００６年、６：１１１１頁［９０］）。ＴＮＦは、その翻訳がｍｉＲ３６９により活性化されるｍＲＮＡの一例である（Ｖａｓｕｄｅｖａｎら、［７４］および［７５］）。また、小分子ＲＮＡは、負および正の方法で転写を調節することもできる（Ｒｏｓｓｉ Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００７年３：１３６頁［９１］）。
本発明の特定の一実施形態において、本発明の方法は、
（ｉ）好ましくは以前にｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡで治療された患者の体液からエキソソームまたは小胞を単離するステップと、
（ｉｉ）前記エキソソーム中のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルを測定するステップと、
（ｉｉｉ）場合により、前記レベルを対照と比較し、
次いでｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達速度および／または効率を決定するステップと
を含む。
本発明の意味において、「単離」は、培地からのエキソソームまたは小胞の分離を意味する。この分離は、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルの測定を可能にする。単離または分離は、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルの測定を可能にするためにエキソソームまたは小胞の精製を伴ってよい。
幾つかの実施形態においては、エキソソームまたは小胞を単離するためにサイズ排除クロマトグラフィーを用いることができる。サイズ排除クロマトグラフィー手法は、本技術分野において周知である。幾つかの実施形態において、空隙体積の画分は、単離され、興味の対象のエキソソームまたは小胞を含む。さらに、幾つかの実施形態において、エキソソームまたは小胞は、本技術分野において周知の通りの（１種または複数のクロマトグラフィー画分の）遠心分離手法により、クロマトグラフ分離の後でさらに単離され得る。幾つかの実施形態においては、例えば密度勾配遠心分離法を、さらにエキソソームを単離するために用いることができる。
本発明の意味において、「レベル」は、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡの定性的（例えば、単離されたエキソソームまたは小胞中に存在するかまたはしないか）および／または定量的（例えば、どれだけ存在するか）な測定を意味する。
本発明の意味において、「対照」は、ｉＲＮＡ治療薬による治療の前もしくは後の同じ個体のエキソソーム中における、またはｉＲＮＡ治療薬で治療されない、もしくはプラセボで治療された別の個体のエキソソームの、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ標的のレベルを意味する。対照は、治療された、治療されていない、または対照で治療された個体、動物または細胞のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡおよび／または他のＲＮＡおよび／またはエキソソームまたは小胞を定量することを許容する／可能にする他の分子、あるいはその成分であってよい。
本発明の意味において、「他のＲＮＡ」は、ｍＲＮＡ分子以外の任意のＲＮＡ分子を意味する。同化または異化のプロセスにおける、非コードＲＮＡ、例えばＸｉｓｔまたはＢＩＣ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムまたは他のＲＮＡ分子。
本発明の本実施形態において、対照は、標的器官または標的細胞のエキソソームまたは小胞中の、以前に投与されたｓｉＲＮＡのレベルに従うことにより実施され得る。エキソソームまたは小胞中のｓｉＲＮＡのレベルは、細胞の他の区画中の、例えば細胞質中の、または細胞外区画中のｓｉＲＮＡのレベルと比較され得る。
また、対照は、標的器官または標的細胞のエキソソームまたは小胞中の、以前に投与されたｍｉＲＮＡのレベルに従って実施することも可能である。エキソソームまたは小胞中におけるｍｉＲＮＡのレベルは、細胞の他の区画中の、例えば細胞質中の、または細胞外区画中のｍｉＲＮＡのレベルと比較され得る。
また、対照は、標的器官または標的細胞のエキソソームまたは小胞中の、以前に投与されたｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡにより標的とされるｍＲＮＡのレベルに従って実施することも可能である。エキソソームまたは小胞中の標的ｍＲＮＡのレベルは、細胞の他の区画中の、例えば細胞質中の、または細胞外区画中の標的ｍＲＮＡのレベルと比較され得る。
また、対照は、標的器官または標的細胞のエキソソームまたは小胞中の、以前に投与された別のＲＮＡのレベルに従って実施することも可能である。この他のＲＮＡは、任意の内在性ｍｉＲＮＡ（５００超のｍｉＲＮＡ／種の一覧についてはｍｉＲｂａｓｅ［Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ ２００８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ３６：（Ｓ１）Ｄ１５４］参照）、任意の合成または誘導ｍｉＲＮＡ模倣体、ｓｉＲＮＡ分子、コードまたは非コードＲＮＡ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２１４、Ｕ６ＲＮＡ、６ＲＮＡによるＹ１、ｔＲＮＡ、２８Ｓ、１８Ｓまたは５ＳｒＲＮＡ、７ＳＫ ＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、チューブリンｍＲＮＡ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ、β−２−マイクログロブリンｍＲＮＡ、ユビキチンｍＲＮＡであってよいが、この一覧は網羅的でない。エキソソームまたは小胞中の他のＲＮＡのレベルは、細胞の他の区画中の、例えば細胞質中の、または細胞外区画中の他のＲＮＡのレベルと比較され得る。
本発明の意味における「エキソソームまたは小胞の定量を許容する他の分子」は、エキソソームまたは小胞中のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡのレベルを測定するための基準として公知の任意の分子を意味する。標的ＲＮＡレベルは、エキソソーム中において比較的一定（±３５の変動）のまたは公知のレベルの脂質、タンパク質、代謝産物等のＲＮＡ以外の分子に正規化され得る。これは、未治療であるかまたは健康なヒトのエキソソームまたは小胞中のレベルが当業者に周知である分子であってよい。例えば、この他の分子は、アクチンまたはＲＲＭ２（リボヌクレオチドレダクターゼＭ２ポリペプチド）ｍＲＮＡ、Ｕ６ ＲＮＡ、ＣＤ６３、ＣＤ８２または他のテトラスパニンタンパク質、ｔｓｇ１０１、ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ、ＥＦ１ａ、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ、スフィンゴミエリン、コレステロール、ＧＰＩアンカー型タンパク質、またはホスファチジルエタノールアミンであってよい。
本発明の意味において、「その成分」は、エキソソームまたは小胞の任意の成分を意味する。この成分は、例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８２、ＰＬＰまたは他のテトラスパニンタンパク質、ｔｓｇ１０１、ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ、ＥＦ１ａ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＴＣＴＰ（翻訳調節腫瘍タンパク質）、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ、スフィンゴミエリン、コレステロール、ＧＰＩアンカー型タンパク質、またはホスファチジルエタノールアミンであってよい。
本発明の意味において、「治療されていない個体」は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡまたは関連分子の投与を受けなかった個体を意味する。この個体は、健康なヒト、あるいはまだ治療されていない、またはｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡもしくは関連分子による治療の効果が低下するのに十分に隔たった時点（３日間〜少なくとも２週間以上）に治療された患者であってよい。
本発明の意味において、「対照で治療された個体」は、プラセボ、または同じ遺伝子の発現を標的とすることができないある分子で以前に治療された任意の個体を意味する。
本発明の一実施形態において、体液は、血液産物、尿、肺洗浄液、唾液、乳、血清、血漿、腹水、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、髄液または脳脊髄液、涙液、喀痰、および他の体液、または培養細胞の上清から選択され得る。
本発明の一実施形態において、本発明の方法のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療の前および後、および／または治療の効果が減少する期間（３日間〜少なくとも２週間以上）の後（即ち、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの投与の前および後）に実施される。
換言すれば、本発明の方法は、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡによる患者の治療の前に１回、ならびにｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡによる患者の治療の後、および／または治療の効果が減少する期間（３日間〜少なくとも２週間以上）の後に１回の２回実施される。治療前および治療後のエキソソームまたは小胞中の標的とされるｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡのレベルを比較することは、こうして可能である。本実施形態において、対照は、治療前のエキソソームまたは小胞中におけるｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡのレベルの測定である。
換言すれば、本発明の方法は、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡで治療されていないヒトからエキソソームまたは小胞を単離するステップと、次いで前記エキソソームまたは小胞中のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルを測定するステップと、次いで、場合により、前記レベルと対照とを比較するステップと、前記ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡを前記ヒトに投与するステップと、次いで本発明の方法のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を実施するステップと、次いでｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療薬の送達速度および／または効率を決定するステップとを含む。
ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）が、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療の前、間および後に実施される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
本発明の意味において、「ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療の間」は、前記方法が、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡで治療された患者からのエキソソームまたは小胞の単離と、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの投与の後の異なる時点での前記エキソソームまたは小胞中のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルの測定とを含むことを意味する。これらの異なる時点は、例えば、ｓｉＲＮＡの送達後０分間、１分間、２分間、５分間、１０分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、３時間、または好ましくは１日間〜５日間であってよい。
本発明の別の目的は、標的器官または標的細胞へのｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達効率または活性の決定方法であって、前述のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の送達速度および／または効率の決定方法を実施することを含む方法である。
換言すれば、標的器官または標的細胞へのｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達効率または活性の決定方法は、前述のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の送達速度および／または効率の決定方法を実施することと、標的器官または標的細胞へのｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達効率または活性の決定とを含む。
本発明の意味における「ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達効率」は、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡがその機能特性を保持し得る方法で細胞に到着する能力を意味する。効率的送達は、対照と比較して標的ｍＲＮＡのレベルの変化（例えば低下）がエキソソーム中において生じる場合に認識され得る。また、効率的送達は、細胞内膜上における標的とされるｍＲＮＡの蓄積によっても認識され得る。また、効率的送達は、エキソソーム中におけるｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの濃縮によっても認識され得る。
本発明の意味において、「ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの活性」は、細胞中における標的ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルに影響を及ぼすｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの能力を意味する。この効果は、細胞中における標的ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの変化（例えば低下）であってよい。さらに詳しくは、それは、エキソソーム中における標的ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの低下であってよい。
本発明の特定の一実施形態において、前記ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達効率または活性は、治療後の、即ちｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは関連分子の投与後のエキソソーム中におけるｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡのレベルの低下または変化によって認識される。
本発明の意味において、「低下」は、対照と比較して、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡのレベルの１％超、または１０％もしくは２０％もしくは３０％超の減少を意味する。
本発明の意味において、「濃縮」は、対照と比較して、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡのレベルの１％超、または１０％もしくは２０％もしくは３０％超の増加を意味する。
本発明の一実施形態において、ステップｉ）の前に、（１つまたは複数の）ｍＲＮＡ標的を同定するために全細胞のｍＲＮＡの含量を決定するステップが実施される。
好都合には、全細胞のｍＲＮＡの含量を決定するこのステップは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の投与前に実施される。好都合には、それは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の投与後に再度実施され得る。
好都合には、あるｍＲＮＡのレベルの低下または変化は、このｍＲＮＡがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の標的である可能性があることを示す。
本発明の一実施形態において、全細胞のｍＲＮＡの含量を決定するステップは、ｍＲＮＡマイクロアレイ、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡが標的とする他のＲＮＡもしくはＤＮＡを同定する大規模方法、ｑＲＴ−ＰＣＲ、大規模多重遺伝子アプローチから選択される方法を用いて実施される。場合により、全細胞のｍＲＮＡの含量の決定は、生物情報科学的解析を用いて確認され得る。
本発明の一実施形態において、標的器官または標的細胞へのｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達効率または活性の決定方法は、前記標的器官もしくは標的細胞の膜画分中および全細胞中における、前記ｓｉＲＮＡおよび／または前記ｍｉＲＮＡ、および／または前記ｍｉＲＮＡおよび／または前記ｓｉＲＮＡが標的とする前記ｍＲＮＡのレベルの測定を含む。
本発明の意味において、「膜画分」は、任意の種類の膜画分を意味する。例えば、これとしては、一般的な膜（小胞体およびゴルジの膜）、トランスゴルジ網、エンドソーム、リソソーム、オートファゴソーム、多胞体、またはこれらの細胞小器官の内のいずれかの間、もしくはエンドリソソーム系の間で輸送されるあらゆる小胞の中において濃縮される画分を挙げることができる。
本発明の特定の一実施形態において、全細胞のｍＲＮＡの測定が行われる。当業者に公知のＲＮＡを測定するための任意の方法が使用され得る。かかる方法は、実際の多くの変種におけるｑＲＴ−ＰＣＲ（定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）（例えば、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ、Ｂｅａｃｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはヌクレオチドの特異性が前記ＲＮＡを検出するために使用される任意の種類または組合せの修飾（特に、ロックされた核酸［ＬＮＡ］、２’−ｏ−メチル）による任意の長さのオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づく手法であってよい。これらの手法において、オリゴヌクレオチドは、溶液中、チップ上、ゲルまたは他の担体の中にあってよい。これらの手法において、ＲＮＡは、蛍光、またはクエンチャーと蛍光との組合せ、放射能、または他の化学もしくは発光検出方法を使用して検出され得る。
ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは関連分子の存在下での全細胞中におけるｍＲＮＡレベルの低下により、それがｍｉＲＮＡ標的であることが確認され得る。
あるいは、標的器官または標的細胞へのｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達効率または活性の決定方法は、エキソソーム、膜画分および全細胞の中におけるｍｉ／ｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡの比を比較するステップを含む。
換言すれば、本発明の方法は、エキソソーム中、膜画分中、および全細胞中におけるｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡのレベルを決定し、次いで、エキソソーム中の標的ｍＲＮＡ／膜画分中の標的ｍＲＮＡの比と、エキソソーム中の標的ｍＲＮＡ／全細胞中の標的ｍＲＮＡの比とを算出するステップを含む。
あるいは、前記方法は、エキソソーム中と細胞中とにおけるｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ（ｍｉ／ｓｉＲＮＡ）標的ｍＲＮＡの比を比較するステップ、またはエキソソーム中と膜中とにおけるｍｉ／ｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡの比を比較するステップ、またはエキソソーム中と細胞中と膜中とにおけるｍｉ／ｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡの比を比較するステップ、または膜中と細胞中とにおけるｍｉ／ｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡの比を比較するステップ、またはｍｉ／ｓｉＲＮＡを含有する細胞に由来するエキソソーム中と前記ｍｉ／ｓｉＲＮＡを含有しない対照細胞に由来するエキソソーム中とにおけるｍｉ／ｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡの比を比較するステップを含む。
本発明の特定の一実施形態において、体液からエキソソームを単離するステップ（ｉ）は、沈殿、溶媒抽出、遠心分離、クロマトグラフィー、分画遠心分離、サイズ濾過、全細胞の除去、密度分離、電気分離、または小胞の特徴的な脂質、糖もしくはタンパク質マーカーを使用する親和性濃縮から選択される手法により実施される。
場合により、前記方法は、前記エキソソームまたは小胞中における前記ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルの検出のステップをさらに含み、場合により、標識、放射能標識、蛍光標識、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、クエンチャーおよび蛍光の組合せ、放射能、ＲＮＡ／ＤＮＡもしくは他の分子の修飾を検出することを可能にする任意の手法のステップを含む。
本発明の別の目的は、前記ｓｉＲＮＡの「標的外」のまたは望ましくない効果の決定を含む、ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡまたは類似の分子が標的とするｍＲＮＡまたは遺伝子を決定するための本発明による方法の使用である。
例えば、この方法は、前記ｓｉＲＮＡの「標的外」のまたは望ましくない効果の決定を含む、ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡもしくは類似の分子のｍＲＮＡ標的の内の大きな比率、例えば１０〜１０００、またはすべての決定のために使用され得る。
本発明の意味において、「標的外」は、ｓｉＲＮＡ媒介サイレンシングの意図しない帰結を意味する。換言すれば、標的外の効果は、ＲＮＡｉ戦略が意図的には標的としなかった遺伝子の調節であり得る。
本発明の意味において、「ｓｉＲＮＡの望ましくない効果の決定」は、ＲＮＡｉの望ましくない標的であるＲＮＡまたはタンパク質に対する認められた効果を意味する。この場合、ｓｉＲＮＡは、１つまたは少しの特異的ＲＮＡを標的とするために使用される可能性があるが、一方でｓｉＲＮＡの効果は、異なるか、またはより多くのＲＮＡまたはタンパク質に対して認められる。この方法は、すぐに約２００００ｍＲＮＡのレベルを定量するためのマイクロアレイまたは高スループット配列決定を使用することができる。
本発明は、費用効果的でかつ効率的な方法でｍｉＲＮＡ標的の内の大きな比率の正確な決定を可能にすることができる。本発明者らは、ｍｉＲＮＡおよび外因的に送達されたｓｉＲＮＡが、エキソソームと呼ばれる細胞が分泌する５０〜１００ｎｍの小胞内に含まれることを示した。本発明者らは、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ活性に関与するタンパク質の選択群がエキソソーム中において分泌される機構を詳細に記載した。ｍｉＲＮＡレポーター系を使用して、本発明者らは、対照ｍＲＮＡと比較して、ｍｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡの輸送および局在化をフォローすることができた。本発明者らは、ｍｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡが、細胞内膜上に５〜１０倍蓄積し、分泌されたエキソソームの内部で同様に減少したことを見出した（図１ｇおよび３ｆ）。ｍｉＲＮＡが標的とする単一のｍＲＮＡにより為されたこの発見を追求するため、本発明者らは、細胞と比較してエキソソーム中におけるすべてのｍＲＮＡの存在を測定した一般公開されているデータを利用した。このデータセットにより、８７％の公知のｍｉＲＮＡ抑制ｍＲＮＡがエキソソーム中において選択的に減少することが確認された。ｍｉＲＮＡが過剰発現するかまたは阻害される場合の膜でのおよびエキソソーム中における反対の濃縮および反対の効果に基づくさらなる対照による最適化戦略は、ｍｉＲＮＡ標的同定の率を８７％へと非常に高めるが、それは、他の利用可能な手法により提供されるｍｉＲＮＡ標的同定の率（２０〜７０％）および精度を既に非常に上回る。
ｍＲＮＡマイクロアレイは、全細胞において実施され得る。ｍｉＲＮＡの存在下での全細胞中におけるｍＲＮＡレベルの低下により、ｍｉＲＮＡ標的としてのｍＲＮＡがさらに確認される（全細胞中における不変のｍＲＮＡレベルが標的としてのｍＲＮＡを除外しないにもかかわらず）。
ｍｉＲＮＡ標的が保存または非保存ｍｉＲＮＡ標的配列を含有することを生命情報科学的に確認することにより、２次的またはｓｉ／ｍｉＲＮＡ独立標的が減少し得るか、または除去され得る。
上記のアプローチの組合せは、偽陽性をほとんど取り除いた総合的なｓｉ／ｍｉＲＮＡ標的の一覧を提供することができる。
マイクロアレイまたは高スループット配列決定の生命情報科学解析と結び付けられたエキソソーム精製が、興味の対象のｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの（１つまたは複数の）標的を同定するために使用され得る。ｍｉＲＮＡの数百または数千の標的とｓｉＲＮＡのおそらくより少ない標的とを詳述する報告を提供することは、本発明の一態様である。生命情報科学を用いて、同定されたｍｉＲＮＡ標的のサブ群により調節される生理学的および細胞プロセスならびに分子ネットワークを予測することができる。これは、ｍｉＲＮＡ標的の総合的な一覧と所定のｍｉＲＮＡにより調節される生理学的プロセスおよび根本的な分子機構の簡潔な一覧とを提供する。本発明は、インビボでのｓｉＲＮＡの送達および有効性のモニタリングを伴うことができる。ｓｉＲＮＡの送達の多くの方法は、動物において示され、ヒトにおける試験の各種段階においてある。これらの方法は、脂質、タンパク質、および多種多様な付随する修飾を有するウイルス由来ベクターを含む。細胞により後で体液中に放出されるエキソソーム中への、細胞中に含まれるｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの選別は、成功したＲＮＡｉ療法の間接的測度を提供することができる。エキソソームは、最初は血液とｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとから精製され、標的または対照のｍＲＮＡは、ｑＲＴ−ＰＣＲで測定され得る。試験がＲＮＡｉ治療の前および後で実施された場合、ＲＮＡｉの効率は、治療後のエキソソーム中における標的ｍＲＮＡのレベルの低下により測定され得る。
マイクロＲＮＡ標的は、エキソソーム中、膜画分中および全細胞中におけるｍｉ／ｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡの比を比較することにより包括的にかつ正確に同定され得る。
好都合には、本発明の方法は、最高水準の技術で不明の予測された標的における信頼水準を提供することを可能にすることができる。この高信頼水準は、本発明の方法の幾つかの要素により提供され得る。第１に、エキソソームおよび／または細胞および／または膜の間のｍＲＮＡ標的の濃縮の差は、特に３つすべての細胞区画を比較する場合、有意な信頼度を提供することができる。ｍＲＮＡ標的の妥当性におけるさらなる信頼度は、インターネット（例えば、ＰｉｃＴａｒ ｐｉｃｔａｒ．ｍｄｃｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ／、ＭＩＲａｎｄａ ｐｉｃｔａｒ．ｍｄｃ−ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ／、ＭＩＲｂａｓｅ ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／、ＤｉａｎａＭｉｃｒｏＴ ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｇｒ／（Ｍａｒａｇｋａｋｉｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２００９年 １〜４）を介して利用可能な一般公開されているＲＮＡ解析アルゴリズムを使用することにより得ることが可能であり、その解析は、ｍｉＲＮＡ標的部位の存在、標的部位アクセシビリティおよび他のパラメータについてＲＮＡ配列を標的とすることができる。多くの変種において、所定のｍＲＮＡが所定のｍｉＲＮＡにより標的とされる確率を予測しようとするスコアを割り当てることができる。これらのアルゴリズムに似ている独立プロセスは、これらの実験においてｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ標的部位を探索するパラメータを最適化するために開発され得る。ｍｉＲＮＡのレベルまたは活性が変化した際にｍＲＮＡレベルが変化したという観察は、前記ｍＲＮＡにおける、少なくとも１つの、多少保存されたかまたは古典的なｍｉＲＮＡ標的部位（相補型シード領域）の存在と組み合わせて、前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの真の標的であったという信頼度を増加させることができる。
本発明の別の目的は、前述の本発明の方法を含む、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡまたはその阻害剤の治療薬の（１つまたは複数の）標的を同定するための方法である。
本実施形態において、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ治療薬の標的は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは関連分子の投与後のエキソソーム中のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡのレベルの低下または変化によって同定される。
場合により、さらなるアッセイは、ｍｉＲＮＡ標的がｍｉＲＮＡ結合部位を含むかどうかを決定するために、および最終的に前記標的部位が幾つかの種のｍＲＮＡの中で保存されるかどうかを決定するために実施される。
本発明の意味において、「幾つかの種のｍＲＮＡの中で保存される」は、幾つかまたは２種以上の種において類似の遺伝子位置内に存在する配列を意味する。ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的の決定は、ｍｉＲＮＡ結合部位についての可能なｍＲＮＡ標的の配列の解析により完了され得る。例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位が予測ｍＲＮＡにおいて見出される場合、ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡにより実際に標的とされる信頼度がより多く与えられ得る。さらに、ｍｉＲＮＡ標的部位が幾つかの種（例えば、ハエ〜ヒト）のｍＲＮＡの中で保存される場合、これは、それが実際のｍｉＲＮＡ標的であるさらにより大きな信頼度を与えることができる。これらの解析は、多くの使用者にとって所望でない方法で予測ｍｉＲＮＡ標的の数を減少させるために用いることが可能である。
ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、一般に約２０ヌクレオチド長であるが、有利には、それは、標的タンパク質の発現を有効に低下させるためにｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７に沿った標的ＲＮＡとの正確なまたはほとんど正確な配列特異的マッチングを必要とし得るのみである。ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡのＲＮＡ標的を生物情報科学的に予測するためにコンピュータアルゴリズム（例えば、ＰｉｃＴａｒ ｐｉｃｔａｒ．ｍｄｃ−ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ／、ＭＩＲａｎｄａ ｐｉｃｔａｒ．ｍｄｃ−ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ／、ＭＩＲｂａｓｅ ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／、ＤｉａｎａＭｉｃｒｏＴ ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｇｒ／（Ｍａｒａｇｋａｋｉｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９年 １〜４））が開発されてきたが、本発明者らの予測ルールが多くの例外を有することから、これらのコンピュータアルゴリズムは不正確であり、かつ偽陽性または偽陰性の高い誤差の傾向がある。しかし、予測標的のその後の生物情報科学的解析なしの本発明の使用は、ｍｉＲＮＡが標的とするＲＮＡのおそらく非常に完全な一覧を与えることができるが、その多くは、コンピュータアルゴリズムまたは他の方法によって予測され得ない。好都合には、ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡのＲＮＡ標的のより対処可能な一覧において、異なる厳密性（使用者が望む標的ＲＮＡ一覧の長さに依存する）で定義されるｍｉＲＮＡ標的部位を有するそれらのＲＮＡだけを保持するため、上述のコンピュータアルゴリズムが使用され得る。コンピュータアルゴリズムの後で得られた一覧は、各標的が真の標的であるより高い信頼度を提供することができるが、すべての標的のおそらくより完全でない一覧を提供する可能性がある。コンピュータアルゴリズムは、ｍｉＲＮＡおよび会合タンパク質へのｍＲＮＡ内におけるこの部位のアクセシビリティによって（領域のＲＮＡ折りたたみエネルギーを解析することによって）、配列マッチングの長さおよび配置（ｍＲＮＡ中、ｍｉＲＮＡ中）によりＲＮＡがｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡの標的である確率をスコアすることができる（Ｍａｒａｇｋａｋｉｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９年 １〜４［９２］）。
前述した通りの本発明による方法を含む、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療薬または他の分子による治療の効率の決定方法。
好都合には、治療は、分子もしくは小胞の形成、相互作用、輸送、またはＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡもしくは非コードＲＮＡの活性および／または細胞間移行を調節するための、多胞体（ＭＶＢ）の活性に関与するタンパク質、脂質、ＲＮＡまたは他の分子により実施され得る。
好都合には、分子は、ＥＳＣＲＴ（endosomal sorting complex
required for transport）、Ａｌｉｘ、ＬＢＰＡ（リゾビスホスファチジン酸）から、または脂質ラフトの形成、コレステロール（例えば、ＮＰＣ１、ＨＭＧＣＲ、ＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素）もしくはスフィンゴミエリン（スフィンゴミエリナーゼ）、例えばＧＷ４８６９の代謝もしくは選別に由来し得る。
この方法において、タンパク質および小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡは、多胞体（ＭＶＢ）または細胞外空間内の他の機構により分泌される小胞内に含まれ得る。
好都合には、小胞は、エキソソームまたはエキソソーム様小胞であってよい。
本発明の特定の一実施形態において、前記タンパク質は、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６（液胞タンパク質選別会合タンパク質３６）、ＥＡＰ３０（３０ｋＤＡのＥＬＬ会合タンパク質、ＳＮＦ８）、ＥＦ１ａ（延長因子１ａ）およびＢＩＧ２、ｈｐｓ４（ヘルマンスキー−パドラック症候群４）、ｈｐｓ１（ヘルマンスキー−パドラック症候群１）、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＳＣＦユビキチンリガーゼ（Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ−Ｆ−ボックスタンパク質）、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ（Ｖ０またはＶ１アデノシン三リン酸分解酵素）、ｖｐｓ４１、ＣＯＧＣ４（保存されたオリゴマーゴルジ成分４）、ＡＴＧ３（オートファジー関連タンパク質３）、ＡＴＧ８、ＣＯＧ４、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）、ＮＥＤＤ４Ｌ（発生的に発現が下方制御された神経前駆細胞４様）、ＡＲＦＧＥＦ４（ＡＤＰリボシル化因子グアニンヌクレオチド交換因子−４タンパク質）、ＣＨＭＬ（コロイデレミア様）、ＲＡＢ１０（ｒａｓ関連ＧＴＰ結合タンパク質１０）、ＲＡＢ３５、ＲＡＬＢ（Ｖ−ｒａｌサル白血病ウイルス癌遺伝子相同体Ｂ）、ＲＡＰＧＥＦ６（Ｒａｐグアニンヌクレオチド交換因子６）、ＳＣＤ（ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ）、ＧＩＰＣ１（ＧＩＰＣ ＰＤＺドメイン含有ファミリー、メンバー１）、ＳＣＧＢ１Ｄ１（セクレトグロビン、ファミリー１Ｄ、メンバー１）、ＵＢＥ２Ｍ（ユビキチン共役酵素Ｅ２Ｍ）、ＵＳＰ１０（ユビキチン特異的プロテアーゼ１０）、ＥＥＦ２（真核生物翻訳伸長因子２）、ＬＩＬＲＢ１（白血球免疫グロブリン様受容体、サブファミリーＢ）、ＲＡＢ３６、ＲＡＮＢＰ２（Ｒａｎ結合タンパク質２）、ＳＦＲＰ２（分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２）、ＳＬＣ４Ａ４（溶質キャリアファミリー４、重炭酸ナトリウム共輸送体、メンバー４）、ＳＭＰＤ３（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ３）、スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンシンターゼ１、スフィンゴミエリンシンターゼ２、Ｅｐｏｐａｍｉｌ結合タンパク質、ｕｓｐ２２（ユビキチン特異的プロテアーゼ２２）、ｔｒｐｃ３（一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＣ、メンバー３）、ＣＬＣＮ７（クロライドチャネル７）、ＣＴＳＣ（カテプシンＣ）、ＬＡＭＲ１（ラミニン受容体１）、ＲＮＦ３２（リングフィンガータンパク質３２）、ＥＲＩ３（増強されたＲＮＡｉ−３）、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素）、ＮＰＣ１（ニーマン−ピック病、Ｃ１型）、ＳＬＣ６Ａ４（ナトリウム依存性セロトニントランスポータ、溶質キャリアファミリー６メンバー４）、ＦＡＵ、ＴＨＥＡ（ＡＣＯＴ１１、アシル補酵素Ａチオエステラーゼ１１）、ＣＫＡＰ４、ＣＯＧ１−８タンパク質、ｖｐｓ１−４５タンパク質、ＣＨＭＰファミリータンパク質、選別ネキシン、ｒａｂ５、７、９、３８、Ａｒｆ２、Ａｒｆ６、ＧＧＡ１−３、スフィンゴミエリンおよびステロール代謝遺伝子および薬物（例えば、ＧＷ４８６９、スフィンゴミエリンエステラーゼ）、ＭＶＢまたはエキソソーム内への選別のその関与に関連するコレステロールまたは脂質ラフト分割および代謝に影響を及ぼす薬物および遺伝子、特にＮＰＣ１、ＨＭＧＣＲ、およびコレステロール低下薬のスタチンクラス（例えばメバスタチン）から成る群から選択され得る。
好都合には、この方法は、マイコバクテリアおよび他の細胞内病原菌、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンティントン舞踏病、脆弱Ｘ症候群、プリオン疾患、例えばクロイツフェルト−ヤコブ、パーキンソン病）、ヘルマンスキー−パドラック症候群、ニーマン−ピック病または心臓血管疾患を含むコレステロールレベルに影響を及ぼす他の状態、ＨＴＬＶ−１（ヒトＴ−リンホトロピックウイルス−１）およびＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、他のレトロウイルス、またはｍｉＲＮＡを産生するウイルスもしくは他の病原菌、例えばＫＳＨＶ（カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス）やＥＢＮＡ（エプスタイン・バー核抗原）により生じる疾患、癌、発育上の欠失、ならびにウイルス感染症を含む群から選択される疾患の予防または治療のために使用され得る。
好都合には、本発明は、疾患のどの部分がｍｉＲＮＡまたは他の小分子ＲＮＡの調節不全に起因し得るのかを認識することを可能にすることができる。多くの疾患、例えばクロイツフェルト−ヤコブ、アルツハイマー、ＡＩＤＳおよび以前に列挙された他のものは、リソソーム内および時にはより特異的にＭＶＢ−エキソソームプロセスに影響する可能性がある。本発明は、これらの疾患の症状の一部がｍｉＲＮＡまたは小分子ＲＮＡ経路に対する効果に起因し得ることを認めることを可能にすることができる。本発明は、ＭＶＢおよびエキソソームに影響を及ぼすことにより、アルツハイマー病がｍｉＲＮＡ活性に悪影響を及ぼす可能性があることを認めることを可能にすることができる。
ｍｉＲＮＡ経路の変更および回復は、アルツハイマー病の治療であり得る。かかる場合、ｍｉＲＮＡ活性は、ｍｉＲＮＡ活性の各種の成分（例えば、ｍｉＲＮＡ、ダイサー、ＧＷ１８２、ＡＧＯ）を細胞に送達することにより、または２次的にｍｉＲＮＡ活性を変えるためにエンドリソソーム系を標的とすることにより、増大され得るか、または回復され得る。
したがって、本発明は、公知のまたはまだ知られていない多くの手段によりｍｉＲＮＡまたは他の小分子ＲＮＡの活性を増加させるか、または変えることによって、病徴を治療する必要性を認めることを可能にすることができる。
実際、本発明の方法は、疾患のより良好な治療または治療投与量を選択するため、そして疾患の治療または予防のためのこの治療を使用するため、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療薬または他の分子による治療の効率を決定した後に使用され得る。
本発明の別の目的は、本発明による方法を含むヒト、腫瘍または胎児の遺伝子型を調べるためおよび／またはその状態の特性を決定するための方法である。
本発明の別の目的は、生物、細胞または植物におけるｍｉＲＮＡまたは小分子ＲＮＡの活性を制御するための方法であって、前記生物の遺伝子修飾、あるいはタンパク質、またはこのタンパク質の活性を修飾する化学物質、またはこのタンパク質を標的とするｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡもしくはその関連分子の生物における投与を含み、このタンパク質が、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６（液胞タンパク質選別会合タンパク質３６）、ＥＡＰ３０（３０ｋＤＡのＥＬＬ会合タンパク質、ＳＮＦ８）、ＥＦ１ａ（延長因子１ａ）およびＢＩＧ２、ｈｐｓ４（ヘルマンスキー−パドラック症候群４）、ｈｐｓ１（ヘルマンスキー−パドラック症候群１）、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＳＣＦユビキチンリガーゼ（Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ−Ｆ−ボックスタンパク質）、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ（Ｖ０またはＶ１アデノシン三リン酸分解酵素）、ｖｐｓ４１、ＣＯＧＣ４（保存されたオリゴマーゴルジ成分４）、ＡＴＧ３（オートファジー関連タンパク質３）、ＡＴＧ８、ＣＯＧ４、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）、ＮＥＤＤ４Ｌ（発生的に発現が下方制御された神経前駆細胞４様）、ＡＲＦＧＥＦ４（ＡＤＰリボシル化因子グアニンヌクレオチド交換因子−４タンパク質）、ＣＨＭＬ（コロイデレミア様）、ＲＡＢ１０（ｒａｓ関連ＧＴＰ結合タンパク質１０）、ＲＡＢ３５、ＲＡＬＢ（Ｖ−ｒａｌサル白血病ウイルス癌遺伝子相同体Ｂ）、ＲＡＰＧＥＦ６（Ｒａｐグアニンヌクレオチド交換因子６）、ＳＣＤ（ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ）、ＧＩＰＣ１（ＧＩＰＣ ＰＤＺドメイン含有ファミリー、メンバー１）、ＳＣＧＢ１Ｄ１（セクレトグロビン、ファミリー１Ｄ、メンバー１）、ＵＢＥ２Ｍ（ユビキチン共役酵素Ｅ２Ｍ）、ＵＳＰ１０（ユビキチン特異的プロテアーゼ１０）、ＥＥＦ２（真核生物翻訳伸長因子２）、ＬＩＬＲＢ１（白血球免疫グロブリン様受容体、サブファミリーＢ）、ＲＡＢ３６、ＲＡＮＢＰ２（Ｒａｎ結合タンパク質２）、ＳＦＲＰ２（分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２）、ＳＬＣ４Ａ４（溶質キャリアファミリー４、重炭酸ナトリウム共輸送体、メンバー４）、ＳＭＰＤ３（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ３）、スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンシンターゼ１、スフィンゴミエリンシンターゼ２、Ｅｐｏｐａｍｉｌ結合タンパク質、ｕｓｐ２２（ユビキチン特異的プロテアーゼ２２）、ｔｒｐｃ３（一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＣ、メンバー３）、ＣＬＣＮ７（クロライドチャネル７）、ＣＴＳＣ（カテプシンＣ）、ＬＡＭＲ１（ラミニン受容体１）、ＲＮＦ３２（リングフィンガータンパク質３２）、ＥＲＩ３（増強されたＲＮＡｉ−３）、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素）、ＮＰＣ１（ニーマン−ピック病、Ｃ１型）、ＳＬＣ６Ａ４（ナトリウム依存性セロトニントランスポータ、溶質キャリアファミリー６メンバー４）、ＦＡＵ（）、ＴＨＥＡ（ＡＣＯＴ１１、アシル補酵素Ａチオエステラーゼ１１）から選択される、方法である。
好都合には、ＥＳＣＲＴ遺伝子、例えばｔｓｇ１０１およびｖｐｓ４５は、植物におけるｍｉＲＮＡ活性に影響を及ぼす。本発明者らは、驚くべきことに、ｔｓｇ１０１およびｖｐｓ４５の植物相同体内にＴＤＮＡ挿入（遺伝子内に挿入され、遺伝子の発現を乱すトランスポゾン）を有するその植物が、制御タンパク質でなく、ｍｉＲＮＡにより調節されるタンパク質の蓄積を示すことができることを示す。したがって、ＭＶＢについて列挙される遺伝子、タンパク質および脂質の同じ群を標的とすることを用いて、植物の抗病原菌防御、例えば抗ウイルスの防御、非細胞自律的ＲＮＡサイレンシング、遺伝子修飾植物の遺伝子発現の維持、または植物形質の後成的維持（ヘテロクロマチンの生殖系列再設定に影響を及ぼすことによる）を調節することができる。
好都合には、本発明者らにより、エキソソームが、それらが由来する細胞と同じｍｉＲＮＡを比例して同様の量で含有することが示されることから、個体のｍｉＲＮＡおよび場合により他の小分子ＲＮＡのレベルの特性を評価するために任意の体液からのエキソソームを使用し、それにより健康のその相対的状態を確認することが可能であり得る。エキソソームおよび細胞は、同じｍｉＲＮＡを含有することが可能であり（例えば両方ともｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ２０６を含有する）、各ｍｉＲＮＡの相対量（例えばプロファイル）は、細胞およびエキソソーム中において同じである可能性がある（例えば細胞およびエキソソームの両方で、ｍｉＲ−１６が最も多く、ｍｉＲ−２０６は５倍少なく、ｍｉＲ−２７ａは３倍少ない）。細胞からのｍｉＲＮＡのプロファイルを使用して診断または予後を得ることができることから、エキソソーム中におけるｍｉＲＮＡのプロファイルは、同様に診断または予後のために使用され得る。
例えば、Ｌｅｔ−７ａは、前立腺癌において下方制御される（Ｓｐｉｚｚｏ ２００９ Ｃｅｌｌ １３７：５８６、［９６］）。前立腺癌が癌細胞中におけるより低いレベルのｌｅｔ−７ａにより診断され得る場合、癌組織からのエキソソームを含有する可能性のある源（例えば、前立腺についての尿）からのエキソソームを使用して、ｌｅｔ−７ａの相対レベルを評価し、生検材料を行うことなく癌の診断および／または予後に到達することができる。同時に、可能性のある腫瘍（例えば、Ｘ線で認められる）の部位に由来する液中において得られるｍｉＲＮＡのプロファイルを使用して、発現したｍｉＲＮＡのプロファイルまたはパターンにより癌だった細胞の種類を決定し、それにより予後の確立を補助することができる。さらに、形質転換細胞や多能性細胞等、所定の状態に関連する特異的なｍｉＲＮＡまたはｐｉＲＮＡ等の他の小分子ＲＮＡの検出は、癌等の患者の状態の重症度を決定する際に一助となり得る。別の例において、羊水からのエキソソームを使用して、受胎の数日後の乳児の性別を決定するために性特異的ｍｉＲＮＡを使用することができる。
本発明の別の目的は、エキソソーム中におけるｍＲＮＡの使用に基づく疾患の診断または予後の方法であって、これが、小分子ＲＮＡに依存する細胞中におけるディファレンシャルスプライシングまたは遺伝子調節によりエキソソーム中に異なって存在する、方法である。
解析は、当業者に公知の任意のステップ、例えば、排除限界濾過、分画超遠心分離、エキソソームまたは小胞に特異的なマーカーを使用する抗体−ビーズ系精製によって、所定の体液からのエキソソームまたは小胞を濃縮することにより実施され得る。ＲＮＡは、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲによるｍｉＲＮＡもしくは他の小分子ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの解析のためのＴｒｉｚｏｌ、マイクロアレイ、または相対量の小分子ＲＮＡ分子を確立することを可能にする他の方法により濃縮され得る。
ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡの量の変化は、エキソソーム中における他のＲＮＡ、タンパク質、脂質または他の分子の量に関して評価され得る。有利には、例えば症状または治療の前および後で、これらの量を、対照（照査基準）で治療した個体における量と比較することが可能であり得る。
本発明の別の目的は、診断または治療のための候補分子のスクリーニングのための本発明による方法の使用である。
本発明の別の目的は、診断基準または予後基準を確立する目的で疾患または病的状態における調節不全ｍｉＲＮＡやｍＲＮＡ等の診断マーカーまたは予後マーカーを同定するための方法である。好都合には、エキソソームは、細胞の他の部分よりも患者から得るのが困難でないので、ｍｉＲＮＡの調節不全を評価するために使用され得る。好都合には、エキソソームは、各種の方法、例えばマイクロアレイまたはｑＲＴ−ＰＣＲによりｍｉＲＮＡの調節不全を評価するために使用され得る。疾患のＭｉＲＮＡマーカーは、疾患の診断または予後であることが既に公知のものから選択され得るか（例えば、Ｓｐｉｚｚｏ ２００９ Ｃｅｌｌ １３７：５８６［９６］）、または本発明もしくは他の手法を使用して新しく開発され得る。これらのマーカーを検出するためのステップは、上記と同じもの、エキソソームの単離、各種方法による特異的ｍｉＲＮＡの検出であってよい。
あるいは、エキソソームＲＮＡにおけるｍＲＮＡマイクロアレイは、疾患状態において上方制御および下方制御されるｍＲＮＡを決定するために使用され得る。続いて、疾患に関連がある（１つまたは複数の）ｍｉＲＮＡを予測するために生命情報科学が使用され得る。
ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは関連分子の投与後にエキソソーム中におけるｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡのレベルの低下または変化が認められる場合、候補分子、マーカーもしくは治療送達剤（例えばリポソーム）または送達方法は選択され得る。
好都合には、候補分子は、ＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの活性および／または細胞間移行を調節するための多胞体（ＭＶＢ）の形成に関与するタンパク質または脂質から選択され得る。
より正確には、タンパク質は、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６、ＥＡＰ３０、ＥＦ１ａ、ＢＩＧ２、ｈｐｓ４、ＰＲＮＰ、ＳＣＦユビキチンリガーゼ、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ、ｖｐｓ４１、Ｎ−スフィンゴミエリナーゼから成る群から選択され得る。
好都合には、本発明の方法は、結核、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンティントン舞踏病、脆弱Ｘ症候群）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ｍｉＲＮＡを産生するウイルス（例えばＫＳＨＶ、ＥＢＮＡ）またはプリオンにより生じる疾患、癌、発育上の欠失、ならびにウイルス感染症または他の感染症を含む群から選択される疾患の予防または治療または診断のために使用され得る。
本発明の別の目的は、
（ａ）体液からエキソソームまたは小胞を単離するための手段と、
（ｂ）前記エキソソーム中のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルを測定するための手段と
を含むキットである。
好都合には、本発明のキットは、対照との比較の手段をさらに含むことができる。
ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡのすべての標的を同定することに関する本発明の部分について、対照とは、同様であるが有効でない分子で治療された細胞または動物を指すことができる。本発明の一実施形態において、小胞またはその成分の量に対するｍＲＮＡ量だけを測定すればよい。かかる実施形態において、前記対照は、小胞またはその成分の量である。他の場合、前記対照は、未治療の個体等であってよい。
本発明の別の目的は、ＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの活性および／または細胞間移行を調節するためのエンドリソソーム系の形成に関与するタンパク質または脂質の使用である。
本発明の意味において、「ＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの活性を調節する」は、細胞中におけるＲＮＡもしくは小分子ＲＮＡの合成における、あるいは細胞中におけるＲＮＡもしくは小分子ＲＮＡのレベルにおける、あるいはＲＮＡの転写を調節するその能力、ＲＮＡのデキャッピング、脱アデニル化もしくは分解を誘導するその能力、翻訳を調節するその能力、またはそれ以外の場合はタンパク質の発現を阻害するその能力における修飾の任意の誘導を意味する。好都合には、前記修飾は、使用前のＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡもしくは非コードＲＮＡ、または前記タンパク質もしくは脂質の活動レベルと比較した遺伝子の低下または阻害であってよい。
本発明の意味において、「ＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの細胞間移行を調節する」は、使用前の移行または前記タンパク質もしくは脂質のレベルと比較した細胞から別の細胞へのＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの移行の修飾を意味する。特に、これはまた、例えば培養培地中において細胞からエキソソームまたは小胞を産生し、次いでエキソソームを個体に移行して個体の細胞中へのＲＮＡ移行を媒介する能力を含むこともできる。
最高水準の技術と比較して、本発明者らは、驚くべきことに、本発明による遺伝子の阻害は、細胞に対する影響が小さく、例えば細胞分裂に対する障害が少ないことを見出した。
好都合には、前記タンパク質は、ＥＳＣＲＴ（endosomal sorting
complex required for transport）に由来し得る。
好都合には、これらのタンパク質および小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡは、細胞外空間中において多胞体（ＭＶＢ）により分泌される小胞中に含まれ得る。
本発明の一実施形態において、前記小胞は、エキソソームであってよい。
本発明の別の一実施形態において、前記タンパク質は、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６、ＥＡＰ３０、ＥＦ１ａおよびＢＩＧ２、ｈｐｓ４、ＰＲＮＰ、ＳＣＦユビキチンリガーゼ、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０もしくはＶ１ＡＴＰアーゼ、ｖｐｓ４１、または請求項３６の方法により同定される遺伝子によりコードされる任意のタンパク質、ｈｐｓ４、ＰＲＮＰ、ＳＣＦユビキチンリガーゼ、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０もしくはＶ１ＡＴＰアーゼ、ｖｐｓ４１、ＣＯＧＣ４、ＡＴＧ３、ＡＴＧ８、ＣＯＧ４、ＰＩ３Ｋ、ＮＥＤＤ４Ｌ、ＡＲＦＧＥＦ４、ＣＨＭＬ、ＲＡＢ１０、ＲＡＢ３５、ＲＡＬＢ、ＲＡＦＧＥＦ６、ＳＣＤ、ＧＩＰＣ１、ＳＣＧＢ１Ｄ１、ＵＢＥ２Ｍ、ＵＳＰＩＯ、ＥＥＦ２、ＬＩＬＲＢ１、ＲＡＢ３６、ＲＡＮＢＰ２、ＳＦＲＰ２、ＳＬＣ４Ａ４、ＳＭＰＤ３、スフィンゴミエリナーゼ、Ｅｐｏｐａｍｉｌ結合タンパク質、ｕｓｐ２２（ユビキチン特異的ペプチダーゼ２２）、ｔｒｐｃ３、ＣＬＣＮ７、ＣＴＳＣ、ＬＡＭＲ１、ＲＮＦ３２、ＰＲＮＩＰ、ＨＭＧＣＲ、ＮＰＣ１、ＳＬＣ６Ａ４、ＦＡＵ、ＴＨＥＡ、ＺＰ２、ＳＣＧＢ１Ｄ１から成る群から選択され得る。
本発明の特定の一態様において、関与するタンパク質または脂質は、結核、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンティントン舞踏病、脆弱Ｘ症候群）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ｍｉＲＮＡを産生するウイルス（例えばＫＳＨＶ、ＥＢＮＡ）またはプリオンにより生じる疾患、癌、発育上の欠失、およびウイルス感染症を含む群から選択される疾患の予防または治療のために使用され得る。
本発明の別の特定の一態様において、前記タンパク質または脂質は、ヒト、腫瘍または胎児の遺伝子型を調べるためおよび／またはその状態の特性を決定するために使用され得る。
本発明の別の目的は、結核、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンティントン舞踏病、脆弱Ｘ症候群）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ｍｉＲＮＡを産生するウイルス（例えばＫＳＨＶ、ＥＢＮＡ）またはプリオンにより生じる疾患、癌、発育上の欠失、およびウイルス感染症を含む群から選択される疾患の治療のためのエンドリソソーム系の体を標的とするためのＡｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６、ＥＡＰ３０、ＥＦ１ａおよびＢＩＧ２、ｈｐｓ４、ＰＲＮＰ、ＳＣＦユビキチンリガーゼ、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ、ｖｐｓ４１から成る群から選択されるタンパク質の使用である。
換言すれば、本発明の別の目的は、結核、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンティントン舞踏病、脆弱Ｘ症候群）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ｍｉＲＮＡを産生するウイルス（例えばＫＳＨＶ、ＥＢＮＡ）またはプリオンにより生じる疾患、癌、発育上の欠失、およびウイルス感染症を含む群から選択される疾患の治療方法であって、エンドリソソーム系の体を標的とするためのＡｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６、ＥＡＰ３０、ＥＦ１ａおよびＢＩＧ２、ｈｐｓ４、ＰＲＮＰ、ＳＣＦユビキチンリガーゼ、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ、ｖｐｓ４１から成る群から選択される医薬的に有効な量のタンパク質または上記のものを、それを必要とする対象に投与することを含む方法である。
さらに換言すれば、本発明の別の目的は、結核、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンティントン舞踏病、脆弱Ｘ症候群）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ｍｉＲＮＡを産生するウイルス（例えばＫＳＨＶ、ＥＢＮＡ）またはプリオンにより生じる疾患、癌、発育上の欠失、およびウイルス感染症を含む群から選択される疾患の治療のための治療薬の製造のための、エンドリソソーム系の体を標的とするためのＡｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６、ＥＡＰ３０、ＥＦ１ａおよびＢＩＧ２、ｈｐｓ４、ＰＲＮＰ、ＳＣＦユビキチンリガーゼ、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ、ｖｐｓ４１、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６（液胞タンパク質選別会合タンパク質３６）、ＥＡＰ３０（３０ｋＤＡのＥＬＬ会合タンパク質、ＳＮＦ８）、ＥＦ１ａ（延長因子１ａ）およびＢＩＧ２、ｈｐｓ４（ヘルマンスキー−パドラック症候群４）、ｈｐｓ１（ヘルマンスキー−パドラック症候群１）、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＳＣＦユビキチンリガーゼ（Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ−Ｆ−ボックスタンパク質）、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ（Ｖ０またはＶ１アデノシン三リン酸分解酵素）、ｖｐｓ４１、ＣＯＧＣ４（保存されたオリゴマーゴルジ成分４）、ＡＴＧ３（オートファジー関連タンパク質３）、ＡＴＧ８、ＣＯＧ４、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）、ＮＥＤＤ４Ｌ（発生的に発現が下方制御された神経前駆細胞４様）、ＡＲＦＧＥＦ４（ＡＤＰリボシル化因子グアニンヌクレオチド交換因子−４タンパク質）、ＣＨＭＬ（コロイデレミア様）、ＲＡＢ１０（ｒａｓ関連ＧＴＰ結合タンパク質１０）、ＲＡＢ３５、ＲＡＬＢ（Ｖ−ｒａｌサル白血病ウイルス癌遺伝子相同体Ｂ）、ＲＡＰＧＥＦ６（Ｒａｐグアニンヌクレオチド交換因子６）、ＳＣＤ（ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ）、ＧＩＰＣ１（ＧＩＰＣ ＰＤＺドメイン含有ファミリー、メンバー１）、ＳＣＧＢ１Ｄ１（セクレトグロビン、ファミリー１Ｄ、メンバー１）、ＵＢＥ２Ｍ（ユビキチン共役酵素Ｅ２Ｍ）、ＵＳＰ１０（ユビキチン特異的プロテアーゼ１０）、ＥＥＦ２（真核生物翻訳伸長因子２）、ＬＩＬＲＢ１（白血球免疫グロブリン様受容体、サブファミリーＢ）、ＲＡＢ３６、ＲＡＮＢＰ２（Ｒａｎ結合タンパク質２）、ＳＦＲＰ２（分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２）、ＳＬＣ４Ａ４（溶質キャリアファミリー４、重炭酸ナトリウム共輸送体、メンバー４）、ＳＭＰＤ３（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ３）、スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンシンターゼ１、スフィンゴミエリンシンターゼ２、Ｅｐｏｐａｍｉｌ結合タンパク質、ｕｓｐ２２（ユビキチン特異的プロテアーゼ２２）、ｔｒｐｃ３（一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＣ、メンバー３）、ＣＬＣＮ７（クロライドチャネル７）、ＣＴＳＣ（カテプシンＣ）、ＬＡＭＲ１（ラミニン受容体１）、ＲＮＦ３２（リングフィンガータンパク質３２）、ＥＲＩ３（増強されたＲＮＡｉ−３）、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素）、ＮＰＣ１（ニーマン−ピック病、Ｃ１型）、ＳＬＣ６Ａ４（ナトリウム依存性セロトニントランスポータ、溶質キャリアファミリー６メンバー４）、ＦＡＵ、ＴＨＥＡ（ＡＣＯＴ１１、アシル補酵素Ａチオエステラーゼ１１）、ＣＫＡＰ４、ＣＯＧ１−８タンパク質、ｖｐｓ１−４５タンパク質、ＣＨＭＰファミリータンパク質、選別ネキシン、ｒａｂ５、７、９、３８、Ａｒｆ２、Ａｒｆ６、ＧＧＡ１−３、スフィンゴミエリンおよびステロール代謝遺伝子および薬物（例えば、ＧＷ４８６９、スフィンゴミエリンエステラーゼ）、ＭＶＢまたはエキソソーム内への選別のその関与に関連するコレステロールまたは脂質ラフト分割および代謝に影響を及ぼす薬物および遺伝子、特にＮＰＣ１、ＨＭＧＣＲ、およびコレステロール低下薬のスタチンクラス（例えばメバスタチン）から成る群から選択されるタンパク質の使用である。
本発明の別の目的は、結核、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンティントン舞踏病、脆弱Ｘ症候群）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ｍｉＲＮＡを産生するウイルス（例えばＫＳＨＶ、ＥＢＮＡ）またはプリオンにより生じる疾患、癌、発育上の欠失、およびウイルス感染症を含む群から選択される疾患の治療のためであって、エンドリソソーム系の体を標的とするための、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６、ＥＡＰ３０、ＥＦ１ａおよびＢＩＧ２、ｈｐｓ４、ＰＲＮＰ、ＳＣＦユビキチンリガーゼ、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ、ｖｐｓ４１から成る群から選択されるタンパク質を標的とするｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡまたはその関連分子の使用である。
本発明の別の目的は、結核、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンティントン舞踏病、脆弱Ｘ症候群）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ｍｉＲＮＡを産生するウイルス（例えばＫＳＨＶ、ＥＢＮＡ）またはプリオンにより生じる疾患、癌、発育上の欠失、およびウイルス感染症を含む群から選択される疾患の治療方法であって、エンドリソソーム系の体を標的とするための、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６、ＥＡＰ３０、ＥＦ１ａおよびＢＩＧ２、ｈｐｓ４、ＰＲＮＰ、ＳＣＦユビキチンリガーゼ、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ、ｖｐｓ４１から成る群から選択されるタンパク質を標的とする治療上有効量のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡまたはその関連分子の、それを必要とする個体への投与を含む。
本発明の別の目的は、結核、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンティントン舞踏病、脆弱Ｘ症候群）、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ｍｉＲＮＡを産生するウイルス（例えばＫＳＨＶ、ＥＢＮＡ）またはプリオンにより生じる疾患、癌、発育上の欠失、およびウイルス感染症を含む群から選択される疾患の治療方法であって、エンドリソソーム系の体を標的とするためのＡｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６、ＥＡＰ３０、ＥＦ１ａおよびＢＩＧ２、ｈｐｓ４、ＰＲＮＰ、ＳＣＦユビキチンリガーゼ、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ、ｖｐｓ４１、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６（液胞タンパク質選別会合タンパク質３６）、ＥＡＰ３０（３０ｋＤＡのＥＬＬ会合タンパク質、ＳＮＦ８）、ＥＦ１ａ（延長因子１ａ）およびＢＩＧ２、ｈｐｓ４（ヘルマンスキー−パドラック症候群４）、ｈｐｓ１（ヘルマンスキー−パドラック症候群１）、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＳＣＦユビキチンリガーゼ（Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ−Ｆ−ボックスタンパク質）、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ（Ｖ０またはＶ１アデノシン三リン酸分解酵素）、ｖｐｓ４１、ＣＯＧＣ４（保存されたオリゴマーゴルジ成分４）、ＡＴＧ３（オートファジー関連タンパク質３）、ＡＴＧ８、ＣＯＧ４、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）、ＮＥＤＤ４Ｌ（発生的に発現が下方制御された神経前駆細胞４様）、ＡＲＦＧＥＦ４（ＡＤＰリボシル化因子グアニンヌクレオチド交換因子−４タンパク質）、ＣＨＭＬ（コロイデレミア様）、ＲＡＢ１０（ｒａｓ関連ＧＴＰ結合タンパク質１０）、ＲＡＢ３５、ＲＡＬＢ（Ｖ−ｒａｌサル白血病ウイルス癌遺伝子相同体Ｂ）、ＲＡＰＧＥＦ６（Ｒａｐグアニンヌクレオチド交換因子６）、ＳＣＤ（ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ）、ＧＩＰＣ１（ＧＩＰＣ ＰＤＺドメイン含有ファミリー、メンバー１）、ＳＣＧＢ１Ｄ１（セクレトグロビン、ファミリー１Ｄ、メンバー１）、ＵＢＥ２Ｍ（ユビキチン共役酵素Ｅ２Ｍ）、ＵＳＰ１０（ユビキチン特異的プロテアーゼ１０）、ＥＥＦ２（真核生物翻訳伸長因子２）、ＬＩＬＲＢ１（白血球免疫グロブリン様受容体、サブファミリーＢ）、ＲＡＢ３６、ＲＡＮＢＰ２（Ｒａｎ結合タンパク質２）、ＳＦＲＰ２（分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２）、ＳＬＣ４Ａ４（溶質キャリアファミリー４、重炭酸ナトリウム共輸送体、メンバー４）、ＳＭＰＤ３（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ３）、スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンシンターゼ１、スフィンゴミエリンシンターゼ２、Ｅｐｏｐａｍｉｌ結合タンパク質、ｕｓｐ２２（ユビキチン特異的プロテアーゼ２２）、ｔｒｐｃ３（一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＣ、メンバー３）、ＣＬＣＮ７（クロライドチャネル７）、ＣＴＳＣ（カテプシンＣ）、ＬＡＭＲ１（ラミニン受容体１）、ＲＮＦ３２（リングフィンガータンパク質３２）、ＥＲＩ３（増強されたＲＮＡｉ−３）、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素）、ＮＰＣ１（ニーマン−ピック病、Ｃ１型）、ＳＬＣ６Ａ４（ナトリウム依存性セロトニントランスポータ、溶質キャリアファミリー６メンバー４）、ＦＡＵ、ＴＨＥＡ（ＡＣＯＴ１１、アシル補酵素Ａチオエステラーゼ１１）、ＣＫＡＰ４、ＣＯＧ１−８タンパク質、ｖｐｓ１−４５タンパク質、ＣＨＭＰファミリータンパク質、選別ネキシン、ｒａｂ５、７、９、３８、Ａｒｆ２、Ａｒｆ６、ＧＧＡ１−３、スフィンゴミエリンおよびステロール代謝遺伝子および薬物（例えば、ＧＷ４８６９、スフィンゴミエリンエステラーゼ）、ＭＶＢまたはエキソソーム内への選別のその関与に関連するコレステロールまたは脂質ラフト分割および代謝に影響を及ぼす薬物および遺伝子、特にＮＰＣ１、ＨＭＧＣＲ、およびコレステロール低下薬のスタチンクラス（例えばメバスタチン）から成る群から選択されるタンパク質の活性を修飾する化学物質を治療上有効量で、それを必要とする個体への投与を含む。
本発明の意味において、「修飾する」は、タンパク質の活性の低下または増加を意味する。
本発明は、こうして多くの適用を見出し、それらの内の幾つかは後で記載される。
一般的に言って、ＲＮＡｉ送達は、治療に対する主要な障壁である。本発明は、早期臨床試験における送達方法を最適化することの一助となるための、後期臨床試験での転帰の測度と医薬品規制当局による承認の機会とを増強するための、および個ヒトのための用量および薬物選択を可能にするための、各患者におけるＲＮＡｉ送達の費用効果的な測度を提供するものである。
前記研究により小分子ＲＮＡ活性を制御するエンドリソソーム系の能力が示されるので、本発明は、どの遺伝子が実際にｍｉＲＮＡ活性に影響を及ぼすのかを同定することを可能にすることができる。これらの遺伝子としては、ＥＳＣＲＴ複合体よりもｍｉＲＮＡ活性に直接関与し得る幾つか、例えばゴルジ小胞選別、多胞体−リソソーム選別に関与する遺伝子を挙げることができるが、この一覧は網羅的ではない。本発明者らの研究は、ＥＳＣＲＴ複合体がｍｉＲＮＡ活性に影響を及ぼすが、実際は、ＥＳＣＲＴ複合体の効果は、他の多胞体プロセス、例えばコレステロール／脂質ラフト選別、ＢＬＯＣ複合体（リソソーム関連細胞小器官複合体の生合成）、セラミド、スフィンゴミエリン、ＧＧＡ複合体（ゴルジ局在性γ−ｅａｒ含有ＡＤＰリボシル化因子結合タンパク質）または他のものに対する間接効果である可能性があることを示唆する。
本発明は、特異的な細胞型を標的とすることを可能にし、血液、またはリンパ管、または細胞間隙および体液への拡散によりｓｉＲＮＡの移行を可能にしうる手段により、細胞中における活性ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを送達することを可能にすることができる。
本発明はまた、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの活性を増加すること、または減少すること、あるいは小分子ＲＮＡ経路の成分を区画するかもしくは制御する細胞間移行によるか、またはヘテロクロマチンによるＤＮＡ転写の調節によるかのいずれかによりその効果を拡大することを可能にすることもできる。したがって、ＭＶＢまたはｍｉＲＮＡに会合するＨＩＶ−１やプリオン等の多くのウイルスおよび疾患は、本発明により標的とされ得る。さらに、本発明は、血液試料によって、状態（例えば腫瘍）またはヒト（特に母親からの血液による胎児）もしくは腫瘍の遺伝子型を診断する方法を提供することができる。
本発明は、小分子ＲＮＡのサブセットの活性を選択的に制御するための新規な手段と、病原菌の増殖を阻害するための有効な手段とを提供することができる。
また、本発明は、例えば、胎児の遺伝子型を調べることと、現在使用される手法より少ないリスクをもたらす血液試料により癌を評価することとを可能にすることもできる。本発明は、本技術分野において周知の手段により特異的細胞型に標的とされ得る内在性手段（最小限の毒性効果および免疫学的な効果）によって、細胞内にｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他の小分子ＲＮＡを移行することを可能にすることができる。
本発明は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ活性、および任意の生物における疾患の治療または治療の調節に使用される他の種類の小分子ＲＮＡの活性を調節するような医療的適用を有することができる。
また、本発明は、疾患のためのｍｉＲＮＡ調節における適用を有することも可能であり、ここで小分子ＲＮＡ、それらのプロセシングまたは効果は、例えば癌、発育上の問題、胚発生、受精およびウイルス感染症にとって重要である。
本発明は、標的細胞への、任意の種類のＲＮＡ、特に小分子ＲＮＡまたはｍＲＮＡの送達における適用を有することもできる。
本発明の別の可能な適用は、血液もしくは別の源からの血液エキソソーム中またはヒトもしくは母親からの他の成分中に含まれるＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは場合によってはＤＮＡの解析を行う能力である。それは、一方で、現在使用される手法（例えば、羊水または生検材料の試料を得る）よりも危険でない方法で、ヒト、腫瘍または胎児の遺伝子型を調べるか、またはその状態の特性を決定することを可能にすることができる。多くの神経変性疾患、ウイルス性疾患、またはプリオンに基づく疾患は、感染の間のＲＮＡと、ｍｉＲＮＡ機構に関与するものと同じタンパク質とに依存する。これらの疾患の治療は、本発明に由来することができる。さらに、本発明は、ｍｉＲＮＡに会合するタンパク質と結合する抗体が存在する自己免疫疾患の、およびＭＶＢまたはｍｉＲＮＡが重要である多くの疾患、例えば、結核、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−２およびＨＩＶ−１、ｍｉＲＮＡを産生するウイルス（ＫＳＨＶ、ＥＢＮＡ等）、プリオン、またはｍｉＲＮＡもしくはＭＶＢ経路を標的とする任意の感染要因、ならびにアルツハイマー病、ハンティントン舞踏病または脆弱Ｘ症候群としての他の神経変性疾患の治療を可能にすることができる。
本発明の別の目的は、内生的に産生された小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡの効率または活性を測定するための方法である。内生的に産生されたｍｉＲＮＡまたは小分子ＲＮＡの活性／効率または発現／欠如は、エキソソーム中における小分子ＲＮＡを直接測定すること、またはその標的ＲＮＡ、通常はｍＲＮＡを測定することにより測定され得る。これは、細胞自体により産生される小分子ＲＮＡの活性または存在または効率に基づく診断試験または予後試験の基礎であり得る。
Ａｇｏ２およびＧＷ１８２が多胞体と共局在することを示す共焦点顕微鏡写真。所定のプラスミドによるトランスフェクションの翌日にＭＶＢを標識するために細胞にＮ−Ｒｈ−ＰＥを負荷し、その細胞を共焦点顕微鏡法により検討した。細胞を、（Ａ）ＣＤ８２−ＹＦＰ、（Ｂ）Ｓｅｃ６１β、（Ｃ）ｅＧＦＰＮ１、（Ｄ、Ｅ）ＧＦＰ−ＧＷ１８２、または（Ｆ、Ｇ）ＧＦＰ−Ａｇｏ２でトランスフェクションした。（Ｈ）において、細胞をＮ−Ｒｈ−ＰＥで負荷しなかった。代わりに、Ｇａｇ−ＲＦＰおよびＡｇｏ２−ＧＦＰを発現するプラスミドで細胞を共トランスフェクションした。（Ｉ）において、Ａｇｏ２−ＧＦＰでトランスフェクションした細胞を軽く固定し、透過化処理し、Ｄｃｐ１ａを免疫蛍光により検出した。 ＭＶＢへのＧＦＰ−ＧＷ１８２の局在化がストレス顆粒形成には依存しないことを示す共焦点顕微鏡写真。細胞を、ＧＦＰ−ＧＷ１８２、ならびにそれぞれストレス顆粒の形成を阻害するかまたは駆動する（Ａ）顕性不活性ＴＩＡ−１または（Ｂ）構成的活性ｅＩＦ２ａ Ｓ５１Ｄを発現するプラスミドで共トランスフェクションした。（Ｃ）において、ＧＦＰ−ＧＷ１８２を発現し、Ｎ−Ｒｈ−ＰＥ（Ｎ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）を負荷した細胞をシクロヘキシミドで処置し、Ｐ−ボディおよびストレス顆粒を溶解させた。 Ｄｃｐ１ａ（ｍＲＮＡ−デキャッピング酵素１Ａ）でなく、ＧＷ１８２がユビキチン結合していることを示すウエスタンブロット。（Ａ）移行受容体、（Ｂ）Ｄｃｐ１ａ、または（Ｃ）ＧＷ１８２およびＵｂの免疫共沈降を行った。内在性タンパク質を認識する抗体でタンパク質を検出した。対照は、種およびアイソタイプ（可能な場合）がマッチした抗体の免疫沈降から成る。（Ｃ）の右のパネルにおいて、Ｇｅ−１を認識する抗体で免疫沈降したユビキチン化タンパク質をブロットした。 ＥＳＣＲＴ複合体のメンバーは、ＭＶＢへのＧＷ１８２の局在化でなくｍｉＲＮＡ活性に影響を及ぼす。（Ａ）ＧＦＰ−ＧＷ１８２、ならびにＡｌｉｘまたはｖｐｓ３６を標的とする５０ｎＭのｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの翌日にＭＶＢを標識するＮ−Ｒｈ−ＰＥを負荷した細胞を示す共焦点顕微鏡写真。（Ｂ）突然変異部位に対するＬｅｔ−７ａの発現率を示す（ウミシイタケルシフェラーゼで正規化）。ＥＳＣＲＴ複合体の幾つかのメンバーのノックダウンは、Ｌｅｔ−７ａの活性を阻害する。対照、ｔｓｇ１０１、ｖｐｓ３６、ｈｒｓ、ａｌｉｘおよびＧＷ１８２についての突然変異部位の発現に対するＬｅｔ−７ａのレベルの解析。ウミシイタケルシフェラーゼを発現するプラスミド、無傷のまたは突然変異したＬｅｔ−７ａ標的部位に結合する５０ｎＭ ｓｉＲＮＡ、およびホタルルシフェラーゼを発現するｐＧＬ３で細胞をトランスフェクションした（ｎ＝６）。（Ｃ）ＥＳＣＲＴ複合体の幾つかのメンバーのノックダウンは、ｍｉＲ−２０６の活性を阻害する。対照、ｔｓｇ１０１、ｖｐｓ３６、ｈｒｓ、ａｌｉｘおよびＧＷ１８２についてのｍｉＲ−２０６標的の発現率の解析。５０ｎＭ ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ−２０６またはｍｉＲ−Ｋ１２−４を発現するプラスミド、および二重ルシフェラーゼプラスミドｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）内に挿入されるエストロゲン受容体３’ＵＴＲで細胞をトランスフェクションした（ｎ＝４）。３０時間後の評価したルシフェラーゼ活性。 分画遠心分離はエキソソームを非常に濃縮する。（Ａ）エキソソームのマーカー（ＣＤ６３、Ｔｆｒ ＲまたはＵｂ）による５０μｇの細胞またはエキソソーム溶解物のウエスタンブロット。（Ｂ）ＢＩＧ２を標的とするｓｉＲＮＡまたは対照による細胞のトランスフェクションの３６時間後のエキソソームペレットの細胞数および総タンパク質定量化。（Ｃ）酢酸ウラニル染色の後の再懸濁エキソソームペレットの電子顕微鏡観察。（Ｄ）ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中に再懸濁した精製エキソソームペレットの動的光散乱解析。上のグラフは、検出された粒子の相対数（ｙ軸）の関数としてのｎｍ（ｘ軸）における大きさとして５セットの測定値を表す。下のグラフは、体積（ｙ軸）の関数としてのｎｍ（ｘ軸）における大きさを表す。体積による測定値は、存在するより大きな粒子の表現を指数的に増幅する。 エキソソームは、ＧＷ１８２中において濃縮され、ｍｉＲＮＡを含有する。（Ａ）ＧＷ１８２、Ａｇｏ２、Ｄｃｐ１ａおよびＧｅ−１を認識する抗体による全細胞溶解物およびエキソソームからの等量のタンパク質のウエスタンブロット。（Ｂ）１５％のアクリルアミドゲル上のトータル細胞ＲＮＡと比較したエキソソームの２つの調製物からのＰＮＫ標識ＲＮＡ。（Ｃ）エキソソームからクローン化した１９〜３３のヌクレオチドのＲＮＡの配列。 エキソソームは、ＢＩＧ２に依存する方法で標的細胞に活性ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを移行する。（Ａ）ＧＦＰでトランスフェクションした細胞から精製されたエキソソーム。ＧＦＰでトランスフェクションした細胞と共にｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡをインキュベートした。フローサイトメトリーによって、８時間または２４時間後にＧＦＰ発現を検討した。ＧＦＰ発現を、１−（ＧＦＰ発現ＧＦＰ ｓｉＲＮＡエキソソーム／ＧＦＰ発現制御ｓｉＲＮＡエキソソーム）×１００（ｎ＝３、ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）として算出した。（Ｂ）ｍｉＲ−２０６またはｍｉＲ−Ｋ１２−４でトランスフェクションした細胞から精製されたエキソソームを、ｐｓｉＣＨＥＣＫ二重ルシフェラーゼプラスミド内に挿入したｍｉＲ−Ｋ１２−４についての標的部位でトランスフェクションした細胞と共にインキュベートした。８時間後にルシフェラーゼの活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ発現の阻害を、１−（ホタルルシフェラーゼ／ウミシイタケルシフェラーゼｍｉＲ−Ｋ１２−４エキソソーム）／（ホタルルシフェラーゼ／ウミシイタケルシフェラーゼｍｉＲ−２０６エキソソーム）×１００（ｎ＝４、ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）として算出した。誤差棒は、平均値の標準誤差を表す。 エキソソームは、ＢＩＧ２に依存する方法でｍｉＲＮＡ活性の移行を媒介する。ｍｉＲ−２０６またはｍｉＲ−Ｋ１２−４ならびにＢＩＧ２を標的とするｓｉＲＮＡまたは対照でトランスフェクションした細胞から精製したエキソソームを、ｍｉＲ−Ｋ１２−４についての挿入標的部位でホタルルシフェラーゼを発現するｐｓｉＣＨＥＣＫ二重ルシフェラーゼプラスミドでトランスフェクションした細胞と共にインキュベートした。他の対照において、ｐｓｉＣＨＥＣＫレポーターを発現する細胞を、ｍｉＲ−２０６またはｍｉＲ−Ｋ１２−４についての裸のプラスミドと共にインキュベートした。８時間後にルシフェラーゼの活性を測定した（ｎ＝４、ｐ＝０．０２８７、ｔ検定、ａ＝０．０５）。左下。ＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡもしくは対照ｓｉＲＮＡ、または裸のトランスフェクションされなかったｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞からのエキソソームを、ＧＦＰでトランスフェクションした細胞と共にインキュベートした。８または２４時間後にＦＡＣＳ解析でＧＦＰ発現を測定した（右）。 精製エキソソームは、Ｄｃｐ１ａやＧｅ−１でなくＧＷ１８２中において濃縮される。（ａ）エキソソームおよび細胞からの等量のタンパク質を、エキソソーム濃縮タンパク質（ＣＤ６３）についてのウエスタンブロットにより解析した。再懸濁エキソソームペレットの電子顕微鏡観察。（ｂ）エキソソームの動的光散乱は、適切な大きさ（２０〜９０ｎｍ）の単一の母集団を示す。誤差棒、５つの測定値のＳＥＭ。（ｃ）ＢＩＧ２のＲＮＡｉは、エキソソーム調製物中におけるタンパク質の回収を低下させる（対応のあるｔ検定、ｎ＝４、ｐ＝０．０１９４、ａ＝０．０５）。対照に対するＢＩＧ２についての細胞数のパーセントと、対照に対するＢＩＧ２についてのエキソソームペレットのパーセントとの解析。（ｄ）エキソソームおよび全細胞からの等量のタンパク質をウエスタンブロットにより解析した。（ｅ）エキソソームを、抗ＧＷ１８２ ｍＡＢ ４Ｂ６で標識し、電子顕微鏡観察により観察した。（ｆ）粗膜画分および細胞質（上清）画分のウエスタンブロット（１６０００ｇ、１５分間）。（ｇ）ウミシイタケルシフェラーゼ（５から適応させた）に融合した標的３’ＵＴＲとのｌｅｔ−７ａ相互作用を示すレポーター構築体。ＭｉＲＮＡ抑制ｍＲＮＡは、細胞質画分内に存在しないが、膜画分内には存在する（１６０００ｇ、４５分間、アクチン ｎ＝３、ｐ＝０．０３９０、ＲＲＭ２ ｎ＝３、ｐ＝０．０２２５）。 Ｄｃｐ１ａでなく、ＧＷ１８２は、多胞体と共局在する。（ａ）細胞に、（ａ）ＹＦＰ−ＣＤ８２、ＭＶＢ濃縮タンパク質、（ｂ、ｃ）ＧＦＰ−ＧＷ１８２、（ｄ）ＧＦＰ−Ａｇｏ２、または（ｅ，ｆ）Ｄｃｐ１ａを発現するプラスミドによるトランスフェクションの後でＮＲｈＰＥを負荷する。（ｇ、ｈ）細胞を、ＧＦＰ−ＧＷ１８２およびＲＦＰ−Ｄｃｐ１ａでトランスフェクションした。スケール棒＝２μＭ。ＲＦＰまたはＮＲｈＰＥは、赤色で示され（左の欄）、ＧＦＰまたはＹＦＰ標識タンパク質は緑色で示され（中央の欄）、共局在は、結合したパネルにおいて黄色で示される（右の欄）。 エキソソームは、成熟ｍｉＲＮＡを含むが、ｍｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡを欠く。（ａ）ヒトゲノムＤＮＡにマッチする配列の割合としての、精製エキソソーム中におけるクローン化小分子ＲＮＡ配列の同一性を表す円グラフ。（ｂ）エキソソームからクローン化した全ｍｉＲＮＡの粒度分布は、２１〜２２のヌクレオチドで中央値を有する母集団を示す。（ｃ）エキソソームは、全細胞と同様のｍｉＲＮＡプロファイルを含む。（ｄ）ＭｉＲＮＡ抑制ｍＲＮＡは、細胞と比較してエキソソームから除外される（アクチンｎ＝４、ｐ＝０．００１９、ＲＲＭ２ ｎ＝３、ｐ＝０．００６）。（ｅ）生物情報科学的事後解析は、ｍｉＲＮＡの確認されたｍＲＮＡ標的がエキソソーム中において過度に少なく示され（１３．６３％、期待値１４、χ２＝６．６３６、ｐ＝０．０１）、より少ないｍｉＲＮＡ標的化を受けるハウスキーピング遺伝子がエキソソーム中において過度に多く示される（３５．８９％、χ２＝１６．６４１、ｐ＜０．０００１）ことを示す。誤差棒は、信頼区間（９５％、改良したＷａｌｄ法）を示す。 ＥＳＣＲＴ複合体成分のノックダウンは、ｍｉＲＮＡ活性に支障を来す。（ａ）Ｄｃｐ１ａではなく、ＧＷ１８２は、ユビキチン化タンパク質と会合する。免疫沈降の抗体は上のレーンに示され、ブロット法の抗体は白色で示される。（ｂ）ＥＳＣＲＴ複合体成分のノックダウンは、ＧＷ１８２の蓄積を引き起こす。（ｃ）ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの３６時間後にＧＦＰ−ＧＷ１８２およびＮ−Ｒｈ−ＰＥの共局在化を検討した。（ｄ）ＥＳＣＲＴ複合体の幾つかの成分のノックダウンは、Ｌｅｔ−７ａの活性を阻害する（分散分析、ｎ＝４、ｐ＝０．００３、Ｆ＝４．８５４、ａ＝０．０５）が、Ｌｅｔ−７ａの蓄積を変化させない。負荷対照としてＵ６ＲＮＡを使用した。（ｅ）ＥＳＣＲＴ複合体の幾つかのメンバーのノックダウンは、ｍｉＲ−２０６の活性を阻害する。（分散分析、ｎ＝３、ｐ＝０．０１５、Ｆ＝６．５７７、ａ＝０．０５）。単球のトランスフェクションの際の単球細胞中における検出可能なｍｉＲ２０６発現およびｍｉＲ２０６の蓄積の欠如がノーザンブロット法により確認された。 ウシ血清に依存しないエキソソーム様小胞中における、および細胞中におけるＧＷ１８２の濃縮は、免疫系統ではない。（ａ）Ｄｃｐ１ａではなく、ＧＷ１８２は、無血清培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ−１５）中で培養された単球細胞または（ｂ）Ｈｅｌａ細胞から調製されたエキソソーム中において濃縮される。 さらなる共焦点顕微鏡画像。ＧＦＰ不含（上）、小胞体特異的タンパク質ｓｅｃ６ｌｂ−ＧＦＰ（中央）およびＮＲｈＰＥ、またはＨＩＶ−１およびＧＦＰ−Ａｇｏ２からのＲＦＰ−Ｇａｇ（下）の共焦点顕微鏡法。スケール棒＝２μＭ。 免疫蛍光による内在性ＧＷ１８２、Ｄｃｐ１ａおよびＭＶＢ（ＣＤ６３）の局在化。（ａ）Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ−６細胞中における抗ヒトＧＷ１８２抗血清１８０３３で標識した一部の病巣がＭＶＢと共局在する（白色の矢印は、共局在した病巣を強調する）。なお、抗ＧＷ１８２抗血清は、ＧＷ１８２に加えてＡｇｏおよびＧｅ−１１６を認識することから、Ｐ−ボディおよびＧＷ−ボディの両方を標識する。（ｂ）ＭＶＢとのより小さい共局在性が、抗Ｄｃｐ１ａ抗体で観察された。（ｃ）前述の２４のように抗ＧＷ１８２ ｍＡｂ ４Ｂ６および抗Ｄｃｐ１ａで共標識された２９３Ｔ細胞。 共焦点顕微鏡写真：Ｄｃｐ１ａではなく、ＧＷ１８２は、Ｈｅｌａ細胞中における多胞体と共局在する。（ａ）Ｎ−Ｒｈ−ＰＥとのＧＦＰ−Ａｇｏ２、ＧＦＰ−Ｄｃｐ１ａもしくはＧＦＰ−ＧＷ１８２の、またはＲＦＰ−Ｄｃｐ１ａとのＧＦＰ−ＧＷ１８２のＨｅｌａ細胞中における共局在性。スケール棒＝２μＭ。ＧＦＰ−ＧＷ１８２およびＭＶＢによるＲＦＰ−Ｄｃｐ１ａの高度な共局在性が、Ｈｅｌａにおいて、単球細胞とは対照的に観察された（それぞれ５８％対６％）。しかし、ＧＦＰ−ＧＷ１８２中断構造は、Ｄｃｐ１ａよりも非常に頻繁にＨｅｌａ細胞中におけるＭＶＢマーカーＮ−Ｒｈ−ＰＥと共局在した（６８％対１５％）。（ｂ）小さい比率の細胞は、ＧＦＰ−Ａｇｏ２とＭＶＢとの間の共局在性を少ししか示さなかった。Ｎ−Ｒｈ−ＰＥとのＧＦＰ−Ａｇｏ２の劣った共局在性、またはＭＶＢ（中央）およびＧＦＰ−ＧＷ１８２（下）とのＲＦＰ−Ｄｃｐ１ａの著しい共局在性を示すＨｅｌａ細胞の例。スケール棒＝２μｍ。 共焦点顕微鏡写真：ＭＶＢに対するＧＦＰＧＷ−１８２の局在化は、ストレス顆粒形成に依存しない。Ｎ−Ｒｈ−ＰＥとのＧＦＰ−ＧＷ１８２の共局在性を、単独（ａ）で、あるいはそれぞれストレス顆粒３３の形成を阻害するかもしくは駆動する（ｂ）ＴＩＡ−１顕性不活性または（ｃ）構成的活性ｅＩＦ２ａ変異体（Ｓ５１Ｄ）による共トランスフェクションの後で検討した。スケール棒＝２μｍ。 細胞と比較してエキソソーム中における濃縮を示す公知のｍｉＲＮＡ標的またはハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの表。ｍｉＲＮＡの公知の標的およびハウスキーピング遺伝子の細胞に対するエキソソーム中におけるｍＲＮＡの比を示すことから誘導されるマイクロアレイデータ。赤色で強調されたｍＲＮＡは、細胞と比較してエキソソーム中における濃縮を示し、緑色のものは、エキソソーム中において減弱する。 ｓｉＲＮＡ治療の有効性の確認。（ａ）所定のｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの３０時間後に単球細胞からｃＤＮＡを調製した。ｂ−アクチンおよび適切なｍＲＮＡを増幅するために３０サイクルのＰＣＲをプライマーにより行った。１０ｎＭ ｓｉＲＮＡによる治療の４８時間後、（ａ）タンパク質レベルのＨｅｌａ細胞におけるノックダウン（ａｌｉｘ、ｈｒｓ、ｓｉＲＮＡ）における通りの（ｂ）ｍＲＮＡレベルについてＨｅｌａ細胞をアッセイするか、またはＥＧＦＲ分解の阻害（ｔｓｇ１０１、ｖｐｓ３６、ｈｒｓ、ＰＴＰＮ２３）を用いて、ｓｉＲＮＡによるそれぞれタンパク質産生およびタンパク質機能の効率的阻害を確認した。ＥＳＣＲＴ複合タンパク質は、Ａｌｉｘを除いて、ＥＧＦによるそのライゲーションの後、ＥＧＦＲの効率的な下方制御のために必要とされる。 効率的なｍｉＲＮＡ活性は、Ｈｅｌａ細胞中における多少のＥＳＣＲＴ複合タンパク質を必要とする。Ｈｅｌａ細胞中における効率的なｍｉＲＮＡ活性は、ＥＳＣＲＴ複合体のメンバーの選択を必要とする。ｓｉＲＮＡおよびレポータープラスミドによる細胞のトランスフェクションの４８時間後に二重ルシフェラーゼ測定を行った。ＥＳＲ（一元配置分散分析、Ｆ＝１０．８２、ｐ＝０．０００４）、Ｌｅｔ−７ａ（一元配置分散分析、Ｆ＝９．４６、ｐ＝２ Ｅ−０７）。 Ｈｅｌａ細胞中におけるｍｉＲＮＡ活性の効率が、ＥＳＣＲＴ複合体のメンバーの選択を必要とすることを示す。ｓｉＲＮＡおよびレポータープラスミドによる細胞のトランスフェクションの４８時間後に二重ルシフェラーゼ測定を行った。（ａ）エストロゲン受容体（ＥＳＲ、ｍｉＲ−２０６についての標的部位を含む）の３’ＵＴＲに結合するホタルルシフェラーゼを有するＰｓｉｃｈｅｃｋ二重ルシフェラーゼレポーターと、ｍｉＲ−２０６前駆体またはｍｉＲＫ１２−４前駆体のいずれかを発現する第２プラスミドとで細胞を共トランスフェクションした（一元配置分散分析、Ｆ＝１０．８２、ｐ＝０．０００４）。値をウミシイタケルシフェラーゼ発現に正規化する。（ｂ）ホタルルシフェラーゼを発現するプラスミドｐＧＬ３と、２つのヒト工的ｌｅｔ−７ａ標的部位または突然変異ｌｅｔ−７ａ標的部位に結合するウミシイタケルシフェラーゼを発現する第２プラスミドとで細胞をトランスフェクションした（一元配置分散分析、Ｆ＝９．４６、ｐ＝２ Ｅ−０７）。値をホタルルシフェラーゼに正規化する。（ｃ）Ｍｏｎｏ−Ｍａｃ６およびＨｅｌａ細胞中におけるｌｅｔ−７ａおよびｍｉＲ２０６レポーターを使用して行われた二重ルシフェラーゼアッセイについての正規化されていない値または生の値。
細胞への活性ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達
材料および方法
抗体
抗体を以下のように得た。ウサギおよびマウス免疫グロブリンＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）、抗モノおよびポリユビキチン化タンパク質クローンＦＫ２［Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ、Ｌｅ Ｐｅｒｒａｙ ｅｎ Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ］、抗Ｄｃｐ１ａウサギポリクローナル（Ｊ．Ｌｙｋｋｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏの寄贈）、抗ＧＷ１８２（血清１８０３３）、抗Ｇｅ−１（血清１Ｃ６）、および正常ヒト血清（Ｍ．Ｆｒｉｔｚｌｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｇａｒｙの寄贈）。
細胞培養
１０％ＦＢＳ（リン酸緩衝食塩水）と非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）とＯＰＩ（オキサロアセテート、ピルベートおよびウシインスリン）培地補助剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とを含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ１６４０緩衝液）中でＭｏｎｏ−Ｍａｃ６細胞系（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ ＡＣＣ−１２４）を培養した。
エキソソームの濃縮
細胞を、８〜２４時間、０．５〜１．０×１０６細胞／ｍＬの密度で増殖させた。細胞を、５分間、４００ｇで遠心分離し、上清を除去した。同じプロセスを、１２００ｇ（５分間）、１００００ｇ（３０分間）で遠心分離により繰り返した。１０００００ｇでの遠心分離（１時間、ＳＷ２７ロータ、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｒｏｉｓｓｙ、Ｆｒａｎｃｅ）の後、すべての上清をマイクロピペットにより除去し、その後の分析のためにＰＢＳ中においてペレットを回収した。
共焦点顕微鏡法
細胞を、遠心分離（９０ｇ、５分間）により濃縮し、培地中に再懸濁し、直ちに解析した。使用するフルオロフォアの明るさおよび６３×対物レンズにより可能となる最小面（０．４〜１．２μｍ）を使用して４８８ｎｍおよび５６１ｎｍのレーザによるＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡で画像を取り込んだ。使用するフィルタは、５００〜５３０ｎｍ（ＧＦＰ）および５５０〜６５０（Ｎ−ローダミン−ホスファチジルエタノールアミン、ローダミン蛍光タンパク質（ＲＦＰ）であった）。ＩｍａｇｅＪを使用して画像を解析した。
Ｎ−ローダミン−ホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−Ｒｈ−ＰＥ）による細胞負荷
（Ｖｉｄａｌ，Ｍ．、Ｍａｎｇｅａｔ，Ｐ．、およびＨｏｅｋｓｔｒａ，Ｄ．Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｒｅｒｏｕｔｅｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｔｏ ａ ｖｅｓｉｃｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１０、１８６７〜１８７７頁（１９９７）［４６］）に記載されるように手法を行った。本質的に、ＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、エタノールにおける３μＭ Ｎ−Ｒｈ−ＰＥ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、ＵＳＡ）を細胞懸濁液内にハミルトン注射器で注入した。ボルテックスした後、細胞を４℃で１．５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、培養培地中で再懸濁し、５％のＣＯ２で３７℃で４時間インキュベートした後、共焦点解析を行った。
プラスミドおよびｓｉＲＮＡ
ＧＦＰ−ｈＡｇｏ２（Ｊａｋｙｍｉｗ，Ａ．ら、Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＧＷ ｂｏｄｉｅｓ ｉｍｐａｉｒｓ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７、１２６７〜１２７４頁（２００５）［４７］）（１１５９０）、ＹＦＰ−ＣＤ８２（Ｓｈｅｒｅｒ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｂｕｄｄｉｎｇ ｉｎｔｏ ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ．Ｔｒａｆｆｉｃ．４、７８５〜８０１頁（２００３）［４８］）（１８１９）、（１８１７）、Ｇａｇ−ＲＦＰ［４８］（１８１４）、Ｓｅｃ６１β−ＧＦＰ（Ｖｏｅｌｔｚ，Ｇ．Ｋ．、Ｐｒｉｎｚ，Ｗ．Ａ．、Ｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．、Ｒｉｓｔ，Ｊ．Ｍ．、およびＲａｐｏｐｏｒｔ，Ｔ．Ａ．Ａ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｈａｐｉｎｇ ｔｈｅ ｔｕｂｕｌａｒ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｃｅｌｌ．１２４、５７３〜５８６頁（２００６）［４９］）（１５１０８）を発現するプラスミドをＡｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を介して入手した。ＧＦＰ−ＧＷ１８２−ＧＦＰ［３］（Ｅｄ Ｃｈａｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ、ＵＳＡ）と、ＴＩＡ−１の顕性不活性バージョン（Ｋｅｄｅｒｓｈａ，Ｎ．Ｌ．、Ｇｕｐｔａ，Ｍ．、Ｌｉ，Ｗ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｉ．、およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＴＩＡ−１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ １）ａｎｄ ＴＩＡＲ（Ｔ−ＣＥＬＬ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）ｌｉｎｋ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅＩＦ−２ ａｌｐｈａ ｔｏ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｔｒｅｓｓ ｇｒａｎｕｌｅｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４７、１４３１〜１４４２頁（１９９９）［７］）（Ｎａｎｃｙ Ｋｅｄｅｒｓｈａ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）と、ｅＩＦ２ａの構成的活性バージョン［７］（Ｒａｎｄａｌｌ Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）とを発現するプラスミドは、Ｎａｎｃｙ Ｋｅｄｅｒｓｈａの寄贈であった。
少なくとも７０％のノックダウンｍＲＮＡ発現が確認されたｓｉＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。これらは以下の通りだった（すべての参照は、特異的ｓｉＲＮＡを示すＱｉａｇｅｎからのカタログ番号である）。Ｈｒｓ（ＳＩ００２８８２３９ＣＣＧＧＡＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡ ＊ ）、ｓｉＲＮＡは、特に明記しない限りＱｉａｇｅｎ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。＊は、少なくとも７５％、それぞれの遺伝子のノックダウンｍＲＮＡ発現に対して会社により確認されたｓｉＲＮＡを示す。これらは、以下の通りだった。Ｈｒｓ（ＣＣＧＧＡＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡ＊）、ＧＷ１８２（ＴＮＲＣ６Ａ、ＳＩ０３６４８７４３：ＡＡＧＡＧＣＴＴＡＡＣＴＣＡＴＣＴＴＴＡＡ＊）、Ａｌｉｘ（ＳＩ０２６５５３４５：ＡＡＧＡＧＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＴＴＣＡＡＴ＊）、Ｖｐｓ３６（ＣＣＣＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＧＡＡＴＴＴＡＴ＊）、Ｔｓｇ１０１（ＳＩ００３１８０４５）、ＧＦＰ（１０２２０６４、ｓｉＲＮＡ ＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＣＣＧ、配列番号：２３）。すべての星印は、陰性対照ｓｉＲＮＡ（この配列は、明らかにされず、それは、企業の秘密１０２７２８１である）。
免疫沈降
２０μＭ ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）とコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）とを有するＰＢＳにおいて、０．５％ＮＰ−４０（ノニルフェノキシルポリエトキシルエタノール４０）、１０％グリセロールにおいて２０×１０６細胞／ｍＬの濃度で細胞を溶解した。４℃で２０分間回転させた後、溶解物を１６０００ｇで３０分間遠心分離した。溶解物に抗体を添加した（ＧＷ１８２およびＧｅ−１については１／４００、ならびに対照の正常ヒト血清；２μｇマウスＩｇＭまたは抗ユビキチンＦＫ２；１／４００抗Ｄｃｐ１ａおよび当量のウサギＩｇ［Ｄｃｐ１ａ濃度のＥＬＩＳＡ測定により決定される］）。３時間後、タンパク質Ｇアガロース（Ｒｏｃｈｅ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）または抗マウスＩｇＭ−アガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１時間添加した。３回の洗浄を溶解緩衝液により行い、１２０００ｇで１分間遠心分離した。
電子顕微鏡観察
０．２５％Ｆｏｒｍｖａｒ膜（ＥＭＳ）を被覆したニッケルカバーガラス（１００メッシュ、ＥＭＳ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ）上で精製エキソソームを静置した。２％酢酸ウラニルで３０秒間染色した後、カバーガラスを乾燥させ、透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ６００、７５ＫＶ）を使用して視覚化した。
動的光散乱
ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝食塩水）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁させた精製エキソソームを、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）からのＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓで解析した。４０マイクロＬの石英キュベット中において試料を負荷し、２０℃で２分間の平衡化時間の後、５回の測定を自動モードで行った。実験データを、粒子が球体であると仮定してマルチプルナローモードで処理し、溶媒の屈折率および粘度について補正した（それぞれ、溶媒組成から算出される通り１．３３２および１．０２９）。平均エキソソーム径を、散乱光の強度の関数としての粒度分布のプロットから導き出した。
ＰＮＫ、低分子量ＲＮＡゲル
トータルＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する１００μＬのＰＢＳ中においてエキソソーム（１００×１０６の細胞に由来する）から抽出し、１０μＬの水の中で再懸濁した。２μＬのエキソソームＲＮＡまたは０．５μＬのトータルＲＮＡを、総体積２０μＬで１時間、３７℃で交換緩衝液Ｂ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｓｔ．Ｒｅｍｙ ｌｅｓ Ｃｈｅｖｒｅｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）および５μＣｕｒｉｅ γＡＴＰ中で１μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと共にインキュベートした。４０μＬの水を添加し、過剰なγＡＴＰ（アデノシン三リン酸）をＧ２５ミニカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｏｒｓａｙ、Ｆｒａｎｃｅ）で除去した。ＲＮＡを、前述のように６Ｍ尿素を含有する１５％ポリアクリルアミドゲル上を移動させた。
ライブラリークローニング
ＭｏｎｏＭａｃ−６細胞からのライブラリーについての２００μｇのトータルＲＮＡとエキソソームからの２μｇのトータルＲＮＡとを使用して、記載されるように（Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｓ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４２７：５１〜６３頁（２００７）［５０］）、小分子ＲＮＡクローニングを行った。４５４テクノロジー（ｗｗｗ．４５４．ｃｏｍ）を使用してライブラリーを配列決定した。以下のデータベースを使用して、記載されるように（Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｓ．、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．、およびＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ２６：Ｕｎｉｔ２６．４．、Ｕｎｉｔ（２００５）［５１］）、配列に注釈をつけた。ゲノム配列は、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒデータベース（ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ３７、２００７年７月）からのものだった。ｔＲＮＡ（移行リボ核酸）、ｒＲＮＡ（リボソームリボ核酸）、ｓｎＲＮＡ（小型核リボ核酸）、ｓｎｏＲＮＡ（小型核小体リボ核酸）およびｓｃＲＮＡ（小型細胞質リボ核酸）配列を、Ｇｅｎｂａｎｋのリリース１５８（２００７年２月１５日）から抽出した。
ｍｉＲＮＡ活性の試験
ｍｉＲ−２０６についての標的を含むＥＳＲ（エストロゲン受容体）の３’ＵＴＲ（３’非翻訳領域）を含む０．２μｇのプラスミド（Ａｄａｍｓ，Ｂ．Ｄ．、Ｆｕｒｎｅａｕｘ，Ｈ．、およびＷｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ｍｉＲＮＡ）ｍｉＲ−２０６ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ（ＥＲａｌｐｈａ）ａｎｄ ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ＥＲａｌｐｈａ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２１、１１３２〜１１４７頁（２００７）［１３］）、ｍｉＲ−２０６またはＫ１２−４を発現する２μｇのいずれかのプラスミド、およびｔｓｇ１０１、ｖｐｓ３６、ｈｒｓ、ａｌｉｘまたはＧＷ１８２を標的とするいずれかの対照ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）で細胞をトランスフェクションした。Ｇｌｏ−Ｍａｘ Ｍｕｌｔｉ蛍光リーダ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）を使用してルシフェラーゼ活性を３０時間後に読み取った。ｓｉＲＮＡ活性の増加率を、以下のように算出した（例えばｔｓｇ１０１）。（［ホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ］Ｋ４ ｍｉＲＮＡ＋ｔｓｇ１０１ ｓｉＲＮＡ／［ホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ］＋２０６ｍｉＲＮＡ＋ｔｓｇ１０１ ｓｉＲＮＡ）／（［ホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ］＋ｍｉＲＮＡ Ｋ４＋対照ｓｉＲＮＡ／［ホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ］＋ｍｉＲＮＡ２０６＋対照ｓｉＲＮＡ）。
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの細胞間移行
一群の細胞を２５０ｎＭ ＧＦＰ ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、８時間培養した後、エキソソームを単離した。エキソソームペレットを、１．２ｍＬのＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｓｔ．Ｂｅａｕｚｉｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）中において再懸濁した。第２群の細胞を、ｅＧＦＰＮ１を発現する１μｇのプラスミドでトランスフェクションした。ＥＧＦＰＮ１プラスミドのトランスフェクションの１時間後、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｓｔ．Ｂｅａｕｚｉｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）中で細胞を２回洗浄し、５００μＬのエキソソーム含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５中に０．４×１０６の細胞を再懸濁させた。標的細胞中における標的発現の阻害率を、１００−（ＧＦＰ ｓｉＲＮＡを含有するエキソソームの幾何平均／対照ｓｉＲＮＡを含有するエキソソームの幾何平均）として、ＧＦＰ＋細胞上でゲーティングして算出した。エキソソームによるｍｉＲＮＡ移行の実験を、エキソソーム産生細胞中へのｍｉＲ−２０６またはｍｉｒ−Ｋ１２−４を発現するプラスミドのトランスフェクションと標的細胞内へのｍｉＲ−Ｋ１２−４についての標的部位を含むｐｓｉＣＨＥＣＫプラスミドのトランスフェクションとを除いて上と同様に繰り返した。対照ｓｉＲＮＡまたはＢＩＧ２ ｓｉＲＮＡを、ｍｉＲ−２０６およびｍｉＲ−Ｋ１２−４で共トランスフェクションした。ホタルルシフェラーゼ発現の阻害率を、（ｍｉＲＫ１２−４を含有するエキソソームを有するホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ）／（ｍｉＲ−２０６を含有するホタル／ウミシイタケルシフェラーゼエキソソーム）として算出した。
トランスフェクション
ｍｉＲＮＡ活性のアッセイ以外のすべての実験について、５×１０６の細胞を、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ（Ａｍａｘａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中でＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩで、製造業者の説明書に従ってトランスフェクションした。遺伝子発現の阻害のために、５０ｎＭ ｓｉＲＮＡを使用した。ｍｉＲＮＡ活性を評価する実験のため、２５０μｇ／ｍＬのＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、ＦＢＳを含まない１００μＬの培養培地中において、１×１０６の細胞をトランスフェクションした。細胞は、３７℃で１．５時間インキュベートした。１０μＬのＤＭＳＯを添加した。３分後、２ｍＬの細胞培養培地を添加し、細胞を遠心分離し、ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０中で３０時間再懸濁させた。
結果
ｍｉＲＮＡ機構の成分は多胞体と共局在する
ホスファチジルエタノールアミンに対する自己抗体は、ＧＷ１８２に対する自己抗体と共局在し［５］、ＧａｗｋｙショウジョウバエＧＷ１８２相同体のノックダウンは、拡大したＭＶＢをもたらす［２］。Ｎ−ローダミン標識ホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−Ｒｈ−ＰＥ）は、ＭＶＢ中に選択的に蓄積する（Ｖｉｄａｌ，Ｍ．、Ｍａｎｇｅａｔ，Ｐ．、およびＨｏｅｋｓｔｒａ，Ｄ．Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｒｅｒｏｕｔｅｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓｆｒｏｍ ａ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｔｏ ａ ｖｅｓｉｃｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１０，１８６７〜１８７７頁（１９９７）［６］）。したがって、本発明者らは、Ａｇｏ２およびＧＷ１８２がＮ−Ｒｈ−ＰＥおよびＭＶＢと共局在するのかについて試験した。Ｎ−Ｒｈ−ＰＥによるＭＶＢの正確な標識は、ＣＤ８２との共局在性（図１Ａ）、およびＳｅｃ６１βまたはＧＦＰとの共局在性の欠如（図１Ｂ、Ｃ）により確認された。ＧＦＰ−ＧＷ１８２は、有意な比率でＮ−Ｒｈ−ＰＥと共局在した中断構造を標識した。同様の結果は、ＧＦＰ−Ａｇｏ２について見出された（図１Ｆ、Ｇ）。また、Ａｇｏ２−ＧＦＰはＧａｇとも共局在し、別のタンパク質はＭＶＢ中に選択的に蓄積した（図１Ｈ）。
一時的トランスフェクション細胞中で認められるＡｇｏ２−ＧＦＰの局在化が内在性Ａｇｏ２について予想されたものに対応することを確認するため、細胞を軽く固定し、透過化処理し、抗Ｄｃｐ１ａ Ａｂで染色してＰ−ボディをマークした。Ａｇｏ２−ＧＦＰは、予想通り内在性Ｄｃｐ１ａと共局在化した（図１１）。
Ａｇｏ２等のｍｉＲＮＡ機構の成分は、ストレス顆粒と共局在化することができる。本発明者らは、ＧＦＰ−ＧＷ１８２およびＧＦＰ−Ａｇｏ２がストレス顆粒の一部としてＭＶＢと共局在化したかどうかについて調べた。構成的活性ｅｉＦ２ａ変異体によるストレス顆粒の誘導も、ＴＩＡ−１の顕性不活性バージョンによるストレス顆粒の阻害も［７］、ＭＶＢとのＧＦＰ−ＧＷ１８２の共局在性を改変しなかった（図２Ａ、Ｂ）。これは、ＧＷ１８２およびＡｇｏ２が、ストレス顆粒を生成する古典的ストレス応答の一部としてＭＶＢと共局在しないことを示唆する。実際、ＧＷ１８２は、ストレス顆粒中においてではなく、Ｐ−ボディ中のみにおいて局在すると考えられる（Ｋｅｄｅｒｓｈａ，Ｎ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｔｒｅｓｓ ｇｒａｎｕｌｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｏｄｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４３１：６１〜８１頁（２００７）［８］）。
Ｐ−ボディは、シクロヘキシミドによる治療の際に分解される［８］。したがって、中断ＧＷ１８２＋構造は、シクロヘキシミド治療細胞中において、少ししか、または全くＭＶＢと共局在しないことが観察された（図２Ｃ）。したがって、有意なプールのＧＷ１８２およびＡｇｏ２がＰ−ボディ様構造の一部としてＭＶＢと共局在する。
したがって、小分子ＲＮＡ機構にとっての多くの必須成分が、特異的細胞小器官、即ちＭＶＢ中に局在すると思われる。
ＧＷ１８２はユビキチン結合する。
ＭＶＢに対する選別タンパク質の主要な機構は、ユビキチン化タンパク質と結合するＥＳＣＲＴ複合体である。本発明者らは、ユビキチン化タンパク質との会合のための、または特異的もしくは抗Ｕｂ抗体との免疫沈降による直接的ユビキチン化のためのＲＮＡサイレンシング機構の幾つかの成分を試験した。陽性対照としてのトランスフェリン受容体（ＴｆｒＲ）を、抗Ｕｂ抗体により免疫沈降するタンパク質の中で検出することができたが、逆に、免疫沈降したＴｆｒＲは、抗Ｕｂ抗体によって検出することができた（図３Ａ）。Ｄｃｐ１ａ免疫沈降物中において、ユビキチン化タンパク質をわずかに検出した。これらのタンパク質はＤｃｐ１ａの分子量と一致せず、抗Ｕｂ抗体により免疫沈降したタンパク質の中でＤｃｐ１ａは検出されなかった（図３Ｂ）。したがって、Ｄｃｐ１ａは、多少のユビキチン化タンパク質と弱くまたは一時的に相互作用し得るが、直接ユビキチン化しない可能性がある。ＧＷ１８２は、他のタンパク質においてしばしばユビキチンと結合するＵＢＡドメインを有するが、ＵＢＡドメインを有するタンパク質は、しばしばそれ自身でユビキチン化する（Ｐｅｓｃｈａｒｄ，Ｐ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ Ｃｂｌ−ｂ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２７、４７４〜４８５頁（２００７）［９］）。抗Ｕｂ抗体は、抗ＧＷ１８２抗血清との反応性があるタンパク質を免疫沈降させ（図３Ｃ）、抗ＧＷ１８２抗体は、ＧＷ１８２の大きさに一致したユビキチン化タンパク質を免疫沈降させた（図３Ｃ）。抗ＧＷ１８２血清は、主にＧＷ１８２を認識すると共に、Ｇｅ−１を認識する抗体をも含む。Ｇｅ−１はユビキチン化タンパク質の中で検出されなかったが（図３Ｄ）、このことは、Ｇｅ−１ではなくＧＷ１８２がユビキチン化され、かつ検出されたユビキチン会合タンパク質であることを示唆する。
ＥＳＣＲＴ経路は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ活性に対する負の効果を有する。
ＭＶＢへの成分の局在化は、サイレンシング機構のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはタンパク質成分を効率的に再組織するための手段を提供することができる。本発明者らは、この局在化を乱すことがｍｉＲＮＡ活性に影響を及ぼし得ると仮定した。
前述のように、Ａｌｉｘまたはｖｐｓ３６（ＥＳＣＲＴ複合体の成分）を標的とするｓｉＲＮＡは、幾つかの細胞中におけるＭＶＢの大きさの増大（ｖｐｓ３６を標的とするｓｉＲＮＡ）またはＭＶＢの核周囲分布の増大（Ａｌｉｘを標的とするｓｉＲＮＡ）を誘導した（Ｃａｂｅｚａｓ，Ａ．、Ｂａｃｈｅ，Ｋ．Ｇ．、Ｂｒｅｃｈ，Ａ．、およびＳｔｅｎｍａｒｋ，Ｈ．Ａｌｉｘ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｃｔｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐａｔｉａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１８、２６２５〜２６３５頁（２００５）［１１］）。しかし、これらの変化したＭＶＢとのＧＷ１８２の共局在性は、著しくは乱れなかった（図４Ａ）。このことにもかかわらず、本発明者らは、ＥＳＣＲＴ複合体の成分がｓｉＲＮＡにより標的とされた細胞中におけるｍｉＲＮＡの活性を試験した。ｔｓｇ１０１（補足図１）ではなく、ｈｒｓ（ＥＳＣＲＴ複合体の別の成分）、ｖｐｓ３６またはａｌｉｘのノックダウンは、ｌｅｔ−７部位に２つのヌクレオチド変化を有する対照と比較してｌｅｔ−７の活性を有意に阻害した（図４Ｂ）（Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１８、５０４〜５１１頁（２００４）［１２］）。ＥＳＣＲＴ複合体の成分、特にａｌｉｘによるｍｉＲＮＡ活性の阻害は、ＧＷ１８２のノックダウンの際に達成されたものに近づいた（図４Ｂ）。
ｍｉＲＮＡ活性に対するＥＳＣＲＴ複合体の効果がｌｅｔ−７または以前のレポーター系に限定されなかったことを確認するため、本発明者らは、第２の系による類似の実験を行った。ｍｉＲ−２０６またはカポジ肉腫ウイルス（ＫＳＨＶ）ｍｉＲＮＡ Ｋ−１２−４を発現するプラスミドを、ｍｉＲ−２０６の内在性標的（エストロゲン受容体−α３’ＵＴＲ）に結合するレポーターと共に細胞内にトランスフェクションした［１３］。以前の系と一致して、ｔｓｇ１０１ではなく、ａｌｉｘまたはｈｒｓのノックダウンは、ｍｉＲ−２０６の比活性を阻害した。
エキソソームの特性決定
ｍｉＲＮＡ経路の成分がＭＶＢに局在することから、それらの成分を、ＭＶＢ内におけるＩＬＶ内にパッケージし、エキソソームとしばしば称されるものとして細胞外空間内に放出することが可能だった。この可能性を検討するため、本発明者らは、最初に、本発明者らの手中にある確立されたプロトコルによって精製されたエキソソームの同一性および純度の特性決定を行った。精製されたエキソソームを、トランスフェリン受容体、ＣＤ６３およびユビキチン化タンパク質、エキソソームのすべての古典的マーカーの中で高度に濃縮した（Ｂｕｓｃｈｏｗ，Ｓ．Ｉ．、Ｌｉｅｆｈｅｂｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．、Ｗｕｂｂｏｌｔｓ，Ｒ．、およびＳｔｏｏｒｖｏｇｅｌ，Ｗ．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｃｏｎｔａｉｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．３５、３９８〜４０３頁（２００５）［１４］、Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．、Ｚｉｔｖｏｇｅｌ，Ｌ．、およびＡｍｉｇｏｒｅｎａ，Ｓ．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，５６９〜５７９頁（２００２）［１５］）（図５Ａ）。精製されたエキソソームは、電子顕微鏡観察により視覚化した際に予想された大きさおよび形態の小胞を含有した（図５Ｂ）。本発明者らの調製物中におけるエキソソームの純度を確立するため、本発明者らは２つの方法を用いた。第１に、ブレフェルジンＡ阻害グアニンヌクレオチド交換タンパク質（ＢＩＧ２、補足図１に示されるノックダウン）を標的とするｓｉＲＮＡは、エキソソーム様小胞の放出に重要であり（Ｉｓｌａｍ，Ａ．ら、Ｔｈｅ ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ−ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＩＧ２，ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＴＮＦＲ１ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｌｉｋｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２、９５９１〜９５９９頁（２００７）［１６］）エキソソーム放出を約５０％低下させた（図４Ｃ）。使用する単球細胞中におけるトランスフェクション効率の適度なレベル（プラスミドＤＮＡにより約５０％）を考慮に入れると、これは、大多数の精製材料がエキソソームから成ることを示唆する。第２に、本発明者らは、精製されたエキソソームの均質性を数量化するために動的光散乱を用いた。精製材料は、エキソソームに一致した平均的大きさを有し、大きさが均質で（低分散の単一の母集団を認めることができる）、９９％超の相対純度を有した（図４Ｄ）。これは、標準的手法により精製されるエキソソームが非常に純粋であることを示唆する。
ｍｉＲＮＡ経路の成分は、分泌エキソソーム中において見出される
ｍｉＲＮＡ経路の成分がＭＶＢに局在することから、それらの成分は、最終的にはエキソソーム中に分泌され得る。本発明者らは、エキソソーム陽性対照について上で実施したように、ウエスタンブロットを用いて、全細胞溶解物からの等量のタンパク質と比較してエキソソーム中におけるＲＮＡサイレンシングのタンパク質成分の存在を調べた。Ａｇｏ２は、全細胞溶解物と同等の量のエキソソーム中において見出された。際立って、ＧＷ１８２は、全細胞溶解物と比較してエキソソーム中において非常に濃縮され（図６Ａ）、Ｄｃｐ１ａはほとんど存在しなかった。
エキソソームはｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ１７を含有したことが以前に示されていた。１５％アクリルアミドゲル上におけるポリヌクレオチドキナーゼ標識ＲＮＡの分離は、エキソソームおよび全細胞の中に含まれる小分子ＲＮＡの視覚化を可能にした。エキソソームからのＲＮＡは、全細胞ＲＮＡと比較したＲＮＡの幾つかのバンドの明瞭な濃縮を示したが、このことは、エキソソーム中における幾つかの小分子ＲＮＡ種の選択的負荷を示唆する。また、ｍｉＲＮＡに一致する１９〜２４のヌクレオチド長さのＲＮＡの独立した集団が、エキソソームＲＮＡ中において観察された（図５Ｂ）。１９〜３３ヌクレオチド長さのＲＮＡのライブラリーを精製エキソソームから作製し、トータルＲＮＡを単球から作製した。ハイスループットパイロシークエンシングの予備的解析は、有意な量のｍｉＲＮＡの存在を示した（図７）。例えば、ｍｉＲ−１６およびｍｉＲ−２７ｂは、有意な量で存在した［１．４３％（１０６／７４３６）および０．３０％（２２／７４３６）］。ｍｉＲ−１６＊に由来する配列は取り出されなかったが、このことは、鎖分離後にエキソソーム中へのｍｉＲＮＡの負荷が生じることを示唆する。これらの結果より、非常に精製されたエキソソームがｍｉＲＮＡを含有することが確認される。
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの細胞間移行
エキソソームをマクロファージおよび樹状細胞に標的とし、続いて形質膜陥入する（Ｍｏｒｅｌｌｉ，Ａ．Ｅ．ら、Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｏｒｔｉｎｇ，ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．１０４、３２５７〜３２６６頁（２００４）［１８］）。エキソソームに会合するタンパク質をペプチドに分解することが可能であり、エキソソームを取る細胞のＭＨＣクラスＩ上に提示することができる［１５］。これは、エキソソームまたはエキソソームの幾つかの成分が、リソソームにおける完全な分解の前にサイトゾルに流出することができることを示唆する。植物およびＣ・エレガンスにおいて、ｍｉＲＮＡの細胞間輸送が発生するので（Ｖｏｉｎｎｅｔ，Ｏ．Ｎｏｎ−ｃｅｌｌ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５７９、５８５８〜５８７１頁（２００５）［１９］）、本発明者らは、エキソソームによって輸送されるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが標的細胞中における遺伝子発現を阻害することができたのかについて試験した。ＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクションし、エキソソームを８〜１２時間後に精製し、ＧＦＰ発現細胞に添加した。ＧＦＰ発現は、対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞に由来するエキソソームとインキュベートした細胞と比較して、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡトランスフェクション細胞からのエキソソームと共にインキュベートした細胞中において７．３％低下した（図７Ａ）。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡエキソソームによるＧＦＰ発現の減少は、添加した再懸濁エキソソームの数と共に増加した（図７Ａ、１００μＬのエキソソームで１．５８％、対して５００μＬのエキソソームで７．３％）。標的細胞中におけるＧＦＰ ｓｉＲＮＡの効果は、６時間と比較して２４時間でわずかに減少した（図７Ｂ、６時間でＧＦＰ発現の６．１％の阻害、対して２４時間で４．３％）。
本発明者らは、ｍｉＲＮＡの転写およびプロセシングがエキソソーム中にパッケージする前に生じなければならない場合、観察される小分子ＲＮＡの細胞間移行が依然として生じるのかについて試験するためのウイルスｍｉＲＮＡおよび標的を使用した。１バッチの細胞を、ＫＨＳＶ ｍｉＲ−Ｋ１２−４を発現するプラスミドまたはｍｉＲ−２０６を発現する対照プラスミドでトランスフェクションした。細胞によるｍｉＲ−Ｋ１２−４を含有するエキソソームのインキュベーションは、ｍｉＲ−２０６を含有するエキソソームと比較して、ｍｉＲ−Ｋ１２−４標的レポーターの発現を１５．３％減少させた（図７Ｃ）。標的細胞中におけるレポーター発現のノックダウンがｍｉＲ−Ｋ１２−４のエキソソーム媒介移行に起因する場合、ＢＩＧ２を標的とするｓｉＲＮＡは、エキソソームの放出を阻害することによりこの効果をブロックする（図４Ｃ）［１６］。ｍｉＲ−Ｋ１２−４またはｍｉＲ−２０６を発現するプラスミドと同時にＢＩＧ２を標的とするｓｉＲＮＡの送達は、ｍｉＲ−Ｋ１２−４またはその前駆体の内の１つを含む可能性があるエキソソームにより、標的細胞中におけるｍｉＲ−Ｋ１２−４レポーター発現のノックダウンを阻害した。したがって、エキソソーム様小胞は、ＢＩＧ２に依存する方法で機能性ｍｉＲＮＡを標的細胞に移行することができる。
細胞への活性ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達
本発明者らは、有意な比率のＲＮＡサイレンシング機構がＭＶＢと共局在することを示す。本発明者らは、ＲＮＡサイレンシング機構の少なくとも２つの分離可能なプールがＭＶＢと会合することを示唆する。ＧＷ１８２、多少のＡｇｏ２およびｍｉＲＮＡを含むが少しのＤｃｐ１ａしか含まない一方のプールを、ＩＬＶ中において細胞質ＲＮＡから隔離する。これらのＩＬＶを、エキソソームとして放出することができる。エキソソーム中におけるｍｉＲＮＡの最初の説明（［１７］）は、細胞質の内容のランダム負荷と解釈することができた。ＭＶＢにおけるＧＷ１８２およびＡｇｏ２の共局在性、ならびにエキソソーム中におけるＧＷ１８２の明瞭な濃縮およびＤｃｐ１ａの欠如がある場合、ｍｉＲＮＡおよび場合によってはそのｍＲＮＡ標的は、エキソソーム中への負荷のための選択的選別プロセスを受ける可能性がある。ＧＷ１８２はエキソソーム中において非常に濃縮されるが、一方で、少しのＤｃｐ１ａしか存在しなかった。これは、エキソソーム中へのＰ−ボディの、すべてではないが、幾つかの成分を集める特異的選別機構が存在することを示唆する。ＧＷ１８２のＵＢＡドメイン、およびＧＷ１８２の共有結合性ユビキチン化は、ＭＶＢとのその相互作用とエキソソーム内への選別とを駆動することができる。逆に、Ｄｃｐ１ａのユビキチン化の欠如は、エキソソーム内へのその負荷を好まない可能性がある。Ａｇｏ２は、ユビキチン化タンパク質と会合し（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．ら、Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．５、４１４５〜４１５１頁（２００５）［２０］）、ＧＷ１８２に結合するが、（Ｅｌ−Ｓｈａｍｉ，Ｍ．ら、Ｒｅｉｔｅｒａｔｅｄ ＷＧ／ＧＷ ｍｏｔｉｆｓ ｆｏｒｍ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＡＲＧＯＮＡＵＴＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｉｎ ＲＮＡｉ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２１、２５３９〜２５４４頁（２００７）［２１］）、このことは、エキソソーム中におけるその外観のための機構を示唆する。Ｄｃｐ１ａは、ＧＷ１８２がＩＬＶに送達される前にＰ−ボディ複合体から位置を変化させることができるか、または、場合によっては、ＧＷ１８２がエキソソーム中にパッケージされ、Ｄｃｐ１ａがリソソーム分解のための明瞭なＩＬＶ内にパッケージされる。
ＲＮＡサイレンシング機構の第２のプールは、Ａｇｏ２の膜局在化を生化学的に記載した以前の研究と一致してＭＶＢの表面上にある可能性がある［４］。本発明者らは、ＧＷ１８２およびＡｇｏ２の局在化が、ｍｉＲＮＡ成熟、ＡｇｏへのｍｉＲＮＡ結合、標的ｍＲＮＡ結合、翻訳阻害の特定の手段、デキャッピング、またはｍＲＮＡ分解、およびＲＮＡサイレンシング機構の更新のためのものであるのかについてのｍｉＲＮＡ活性の特定のステージにおけるアドレシング機構であると仮定する。これらのステップのいずれかの崩壊は、ＥＳＣＲＴ複合体の幾つかの成分のノックダウンの際に観察される通りのｍｉＲＮＡ活性を阻害する可能性があった。
ＩＬＶ含有ｍｉＲＮＡは、エキソソームとしてリソソーム分解または細胞外放出について標的とされ得る。メッセンジャーＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、以前はエキソソーム中に（Ｖａｌａｄｉ，Ｈ．ら、Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９、６５４〜６５９頁（２００７）［１７］）、および無細胞血漿中に（Ｃｈｉｍ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５４、４８２〜４９０頁（２００８）［２２］）おいて示されていた。前者の研究は、標的細胞中のエキソソームｍＲＮＡの転写を示したことを主張したが、幾つかの不確かなものが残存した〔１７］。
本発明者らは、エキソソーム中におけるｍｉＲＮＡの存在を確認し、小分子ＲＮＡが標的細胞にエキソソームにより機能形態で移行され得、成熟ｍｉＲＮＡは、エキソソームにより移行される活性要素であることを初めて示す。
本発明によれば、多胞体およびユビキチン化は、種全体のｍｉＲＮＡ成分の局在化および活性のためのプラットフォームを表すことができる。ＧＷ１８２のＵＢＡドメインでなく、そのそばのグルタミンを多く含むドメインは、欠失変異体の末端上のＵＢＡドメインが機能しない場合を除き［２３］、Ｐ−ボディへのＧＷ１８２の局在化を担う（［３］、Ｂｅｈｍ−Ａｎｓｍａｎｔ，ｌ．ら、ｍＲＮＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉＲＮＡｓ ａｎｄ ＧＷ１８２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｂｏｔｈ ＣＣＲ４：ＮＯＴ ｄｅａｄｅｎｙｌａｓｅ ａｎｄ ＤＣＰ１：ＤＣＰ２ ｄｅｃａｐｐｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０、１８８５〜１８９８頁（２００６）［２３］）。ＧＷ１８２はユビキチン化され、ＵＢＡドメインを含むので、これは、ＥＳＣＲＴ複合体上の足場を駆動する可能性があるＣｂｌ［９］に関して、その自己会合性を駆動することができる。Ｃ・エレガンスおよび植物において、細胞骨格機構の成分および２種のＡＲＦタンパク質は、ｍｉＲＮＡ活性にとって重要であることが同定されたが（Ｐｅｔｅｒ ＢｒｏｄｅｒｓｅｎおよびＯｌｉｖｉｅｒ Ｖｏｉｎｎｅｔ；提出済）（Ｐａｒｒｙ，Ｄ．Ｈ．、Ｘｕ，Ｊ．、およびＲｕｖｋｕｎ，Ｇ．Ａ ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ＲＮＡｉ Ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｍｉＲＮＡ ｐａｔｈｗａｙ ｇｅｎｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１７、２０１３〜２０２２頁（２００７）［２４］）、これは、ｍｉＲＮＡ活性における小胞輸送の可能性を示唆する。興味深いことに、小胞は、ｂｉｃｏｉｄ ＲＮＡの輸送に関与する卵母細胞スポンジ体に会合することが認められた（Ｗｉｌｓｃｈ−Ｂｒａｕｎｉｎｇｅｒ，Ｍ．、Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｈ．、およびＮｕｓｓｌｅｉｎ−Ｖｏｌｈａｒｄ，Ｃ．Ａ ｓｐｏｎｇｅ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｏｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３９、８１７〜８２９頁（１９９７）［２５］）。Ｖｐｓ３６は、ｂｉｃｏｉｄ ＲＮＡの輸送に必要であり（Ｉｒｉｏｎ，Ｕ．およびＳｔ，Ｊ．Ｄ．ｂｉｃｏｉｄ ＲＮＡ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ．４４５、５５４〜５５８頁（２００７）［２６］）、本発明者らは、このＥＳＣＲＴ複合体タンパク質がｍｉＲＮＡ活性に影響を及ぼすことを本明細書で示す。
ＲＮＡサイレンシングにおいて、ユビキチン経路およびＭＶＢの他の成分、例えば、ＭＥＸ−３Ｂ（Ｄｖｏｒａｋ，Ａ．Ｍ．およびＭｏｒｇａｎ，Ｅ．Ｓ．Ｔｈｅ ｃａｓｅ ｆｏｒ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｇｒａｎｕｌｅｓ ｔｏ ｉｎｃｌｕｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｒｏｇ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３７、２３１〜３１８頁（２００２）［２７］）、ＴＲＩＭ（３要素モチーフ）またはＮＨＬ（リングフィンガーｂ−ｂｏｘコイルドコイル）ファミリータンパク質（Ｓｃｈｗａｍｂｏｒｎら、Ｃｅｌｌ２００９ １３６：９１３頁［９３］）、および場合によりＲｏ５２（Ｂｈａｎｊｉ，Ｒ．Ａ．、Ｅｙｓｔａｔｈｉｏｙ，Ｔ．、Ｃｈａｎ，Ｅ．Ｋ．、Ｂｌｏｃｈ，Ｄ．Ｂ．、およびＦｒｉｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ＧＷ／Ｐ ｂｏｄｉｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５、２４７〜２５６頁（２００７）［２８］）、亜鉛フィンガー−リング型ユビキチンリガーゼ、またはｍＲＮＡ上のタンパク質の特定の構築体を認識する他の種類のユビキチンリガーゼが使用され得る。かかるリガーゼは、例えばＡＵＦ１であってよく、３’ＵＴＲへの結合は、ユビキチン媒介分解のためのｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ対を標的とすることができる（Ｌａｒｏｉａ，Ｇ．、Ｓａｒｋａｒ，Ｂ．、およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｒａｐｉｄ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ＡＵ−ｒｉｃｈ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｍＲＮＡｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９、１８４２〜１８４６頁（２００２）［２９］）。同様に、ｎｈｌ−２、およびＲＢＣＣ−リングファミリーの他のタンパク質、可能なユビキチンリガーゼは、アルゴノートと結合するために使用することが可能であり、ｌｅｔ−７標的ｍＲＮＡに対するｍＲＮＡ貯蔵機構を集める（Ｓｃｈｗａｍｂｏｒｎら、［９３］）。このモデルと一致して、ユビキチンは、Ａｇｏ複合体ＩＩおよびＩＩＩにおいて見出され、ポリリボソーム、ＰＡＢＰおよびｍＲＮＡを有するショ糖画分から取り出される（Ｈｏｃｋ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｒｇｏｎａｕｔｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．８、１０５２〜１０６０頁（２００７）［３０］）。実際、ｍＲＮＡキャップ結合複合体の幾つかの成分は、ユビキチン化により調節されるが（Ｄｏｒｒｅｌｌｏ，Ｎ．Ｖ．ら、Ｓ６Ｋ１− ａｎｄ ｂｅｔａＴＲＣＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤＣＤ４ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１４、４６７〜４７１頁（２００６）［３１］）、このことは、ＭＶＢでの局在化ユビキチン化および選別が、ｍｉＲＮＡによる翻訳開始の阻害を微細に調節することができたことを示唆する。
本発明によれば、多胞体が配位結合する小胞輸送は、植物およびＣ・エレガンスにおける非細胞自律的ＲＮＡｉのために利用され得る。細胞外空間内のエキソソーム様小胞は、最近ＭＶＢと会合する植物において同定された（Ａｎ，Ｑ．、Ｈｕｃｋｅｌｈｏｖｅｎ，Ｒ．、Ｋｏｇｅｌ，Ｋ．Ｈ．、およびｖａｎ Ｂｅｌ，Ａ．Ｊ．Ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ ｉｎ ａ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｆｅｎｃｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｂａｒｌｅｙ ｌｅａｖｅｓ ａｔｔａｃｋｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｆｕｎｇｕｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８、１００９〜１０１９頁（２００６）［３２］）。さらに、遺伝子スクリーニングによって、ＭＶＢ形成、輸送にとって重要な、またはユビキチン経路における機能を有する幾つかのタンパク質はＲＮＡｉに必要であることが分かった。Ｒａｂ７は、ドロソフィラおよびシノラブディス・エレガンスにおけるＲＮＡｉに必須である。Ｒａｂ７はＭＶＢへの輸送に関与し、Ｒａｂ７のエフェクター、ＲＩＬＰは、ｖｐｓ３６と相互作用し、多胞体形態および機能にも重要である（Ｗａｎｇ，Ｔ．およびＨｏｎｇ，Ｗ．ＲＩＬＰ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＶＰＳ２２ ａｎｄ ＶＰＳ３６ ｏｆ ＥＳＣＲＴ−ＩＩ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅｉｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５０、４１３〜４２３頁（２００６）［３３］）。ショウジョウバエ、アラビドプシスおよびシノラブディス・エレガンスにおけるＲＮＡｉ移動に関与する幾つかのタンパク質は、後期エンドソーム、または多胞体様構造（例えば、ｖｐｓ４１およびｖｐｓ３４）またはユビキチン化（ＣＧ８１８４、ＵＢＡドメイン；ＳＤＥ−５（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｉｎｚｏｎ，Ｉ．ら、ＳＤＥ５，ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｍＲＮＡ ｅｘｐｏｒｔ ｆａｃｔｏｒ，ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｓｉＲＮＡ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．５０、１４０〜１４８頁（２００７）［３４］）またはＣＧ５３８２（Ｓａｌｅｈ．ＭＣら、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ ８：７９３頁［９４］）、ｖｐｓ５１（リングフィンガードメイン）［５］）に会合する。
多胞体へのＧＷ１８２の選別は、マイクロＲＮＡ活性を制御する
材料および方法
エキソソーム精製
前述のように分画遠心分離によりエキソソームを精製した（Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．ら、Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｓｅｃｒｅｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ１８３、１１６１〜７２頁（１９９６）［８２］）。
共焦点顕微鏡法
４８８ｎｍおよび５６１ｎｍのレーザおよび６３×対物レンズによるＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡で画像を取り込んだ。使用するフィルタは、５００〜５３０ｎｍ（ＧＦＰ）および５５０〜６５０ｎｍ（Ｎ−Ｒｈ−ＰＥ、ＲＦＰ）だった。
動的光散乱
ＤＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁させた精製エキソソームを、４０マイクロＬの石英キュベット中においてＭａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）からのＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓで解析した。２０℃で２分間の平衡化の後、５回の測定を自動モードで行った。実験データを、球状粒子と仮定してマルチプルナローモードで製造業者のソフトウェアにより処理した。溶媒の屈折率（１．３３２）および粘度（１．０２９）についての補正を用いた。
ｍｉＲＮＡ活性の試験
ｍｉＲＮＡ活性を試験するため、ｍｉＲ−２０６についての標的部位を含むＥＳＲの３’ＵＴＲを発現する０．２ｕｇのプラスミド、ｍｉＲ−２０６またはＫ１２−４を発現する２μｇのいずれかのプラスミド、および１０ｎＭ ｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクションした。Ｇｌｏ−Ｍａｘ Ｍｕｌｔｉ蛍光リーダ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）を使用してルシフェラーゼ活性を３０時間後に読み取った。他の実験において、ウミシイタケルシフェラーゼを発現する０．２ｕｇプラスミド、２つの結合ｌｅｔ−７ａ標的部位またはその突然変異バージョン（図１１ｄ）、構築体、Ｌｅｔ−７ａおよびｂ（Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ１８、５０４〜１１頁（２００４）［５６］）、ホタルルシフェラーゼを発現する１ｕｇプラスミドｐＧＬ３、および１０ｎＭ対照または特異的ｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクションし、上記のように解析した。特異的ｍｉＲＮＡによる阻害ルシフェラーゼ発現率を、例えば、ｔｓｇ１０１（［特異的ｌｕｃ／対照ｌｕｃ．］特異的ｍｉＲＮＡ＋ｔｓｇ１０１ ｓｉＲＮＡ／［特異的ｌｕｃ／対照ｌｕｃ］対照ｍｉＲＮＡ＋ｔｓｇ１０１ ｓｉＲＮＡ）として算出した。ｍｉＲＮＡ活性率を、１００−阻害ルシフェラーゼ発現率として算出した。
統計量
示されるすべての誤差棒は、平均値の標準誤差を表す。
抗体
抗体を、以下のように得た。ウサギおよびマウス免疫グロブリンＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）、抗ＣＤ６３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗モノおよびポリユビキチン化タンパク質クローンＦＫ２［Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ、Ｌｅ Ｐｅｒｒａｙ ｅｎ Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ］、抗Ｄｃｐ１ａウサギポリクローナル（Ｊ．Ｌｙｋｋｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏの寄贈）、抗ＧＷ１８２（血清１８０３３、最初に論文Ｅｙｓｔａｔｉｏｙら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ２００２ １３：１３３８［９５］において、自己免疫性患者から採取し、かつＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｇａｒｙ ＣａｎａｄａのＭａｒｖｉｎ Ｆｒｉｔｚｌｅｒにより特性が評価された「発端患者血清」、以下の抗Ｇｅ−１血清１Ｃ６の導出と同じ）、抗Ｇｅ−１（血清１Ｃ６）、および正常ヒト血清（Ｍ．Ｆｒｉｔｚｌｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｇａｒｙの寄贈）、抗ｈｒｓ（ａｂ５６４６８、ＡＢＣＡＭ）、抗ａｌｉｘ（クローン２Ｈ１１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。
細胞培養、およびＮ−ローダミン−ホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−Ｒｈ−ＰＥ）による負荷
１０％ＦＢＳと非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）とＯＰＩ培地補助剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とを含有するＲＰＭＩ１６４０中でＭｏｎｏ−Ｍａｃ６細胞系（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ ＡＣＣ−１２４）を培養した。あるいは、Ｘ−Ｖｉｖｏ−１５無血清培地（Ｌｏｎｚａ、Ｌｅｖａｌｌｏｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）中でＭｏｎｏ−Ｍａｃ６を培養した。５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中でＨｅｌａ細胞を増殖させた。記載されるように（Ｖｉｄａｌ，Ｍ．、Ｍａｎｇｅａｔ，Ｐ．およびＨｏｅｋｓｔｒａ，Ｄ．Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｒｅｒｏｕｔｅｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｔｏ ａ ｖｅｓｉｃｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ１１０（Ｐｔ１６）、１８６７〜７７頁（１９９７）［５８］）、細胞に３μＭ Ｎ−Ｒｈ−ＰＥ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、ＵＳＡ）を負荷した。
プラスミドおよびｓｉＲＮＡ
ＧＦＰ−ｈＡｇｏ２（１１５９０）（Ａｄｄｇｅｎｅ）（Ｊａｋｙｍｉｗ，Ａ．ら、Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＧＷ ｂｏｄｉｅｓ ｉｍｐａｉｒｓ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７、１２６７〜１２７４頁（２００５）［８３］）、ＹＦＰ−ＣＤ８２（１８１９）（Ａｄｄｇｅｎｅ）（Ｓｈｅｒｅｒ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｂｕｄｄｉｎｇ ｉｎｔｏ ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ．Ｔｒａｆｆｉｃ ４、７８５〜８０１頁（２００３）［５７］）、Ｇａｇ−ＲＦＰ（１８１４）（Ａｄｄｇｅｎｅ）（［５７］）、Ｓｅｃ６１β−ＧＦＰ（１５１０８）（Ａｄｄｇｅｎｅ）、および無傷の（１１３２５）（Ａｄｄｇｅｎｅ）または突然変異した（１１３２４）２つのｌｅｔ−７ａ標的部位５６を含む３’ＵＴＲを発現するプラスミドをＡｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を介して入手した。ＧＦＰ−ＧＷ１８２（Ｅｄ Ｃｈａｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ、ＵＳＡ）と、Ｄｃｐ１ａ−ＲＦＰと、Ｄｃｐ１ａ−ＧＦＰと、ＴＩＡ−１８４の顕性不活性バージョン（Ｎａｎｃｙ Ｋｅｄｅｒｓｈａ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）と、ｅＩＦ２ａの構成的活性バージョン（Ｒａｎｄａｌｌ Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）とを発現するプラスミドは、Ｎａｎｃｙ Ｋｅｄｅｒｓｈａの寄贈であった。
ｓｉＲＮＡを、特に明記しない限りＱｉａｇｅｎ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。＊は、少なくとも７５％、それぞれの遺伝子のノックダウンｍＲＮＡ発現に対して会社により確認されたｓｉＲＮＡを示す。これらは、以下の通りだった。Ｈｒｓ（ＣＣＧＧＡＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡ＊（配列番号１）、ＧＣＡＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＡ＊（配列番号２）、ＧＷ１８２（ＴＮＲＣ６Ａ、ＡＡＧＡＧＣＴＴＡＡＣＴＣＡＴＣＴＴＴＡＡ＊（配列番号３）、ＡＴＧＧＡＴＡＴＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡＡＡ＊（配列番号４））、Ａｌｉｘ（ＡＡＧＡＧＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＴＴＣＡＡＴ＊（配列番号５）、ＧＡＧＧＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＡＴＡ＊（配列番号６））、ｖｐｓ３６（ＣＣＣＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＧＡＡＴＴＴＡＴ＊（配列番号７）、ＡＣＧＧＡＧＧＴＧＴＡＣＴＧＣＴＴＡＧＴＡ（配列番号８））、ｔｓｇ１０１（ＣＡＧＴＴＴＡＴＣＡＴＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡ＊（配列番号９）、ＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＧＴＡ＊（配列番号１０））、ＢＩＧ２（ＣＧＡＵＧＡＡＡＵＵＡＡＡＧＣＡＧＡＡ（配列番号１１））、ＰＴＰＮ２３（Ａｍｂｉｏｎ）、ＡＧＵＵＵＧＵＣＣＵＧＡＡＧＡＡＵＵＡｔｔ＊（配列番号１２）。すべての星印は、陰性対照ｓｉＲＮＡ（１０２７２８１）。遺伝子発現のノックダウンを、以下のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲにより確認した。ｔｓｇ１０１（５’ ＧＡＴＡＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴ ３’（配列番号１３）および５’ ＧＴＣＡＣＴＧＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡ ３’（配列番号１４））、ｖｐｓ３６（５’ ＣＡＧＴＧＧＣＧＴＣＡＴＧＧＴＡＡＴＴＧ ３’（配列番号１５）および５’ ＣＴＧＡＧＴＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡ ３’（配列番号１６））、ａｌｉｘ（５’ ＴＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＣＴＧＴＡＴＣ ３’（配列番号１７）および５’ ＡＧＧＧＣＡＣＧＡＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＣ ３’（配列番号１８））、ＢＩＧ２（５’ ＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴ ３’（配列番号１９）および５’ ＣＣＣＧＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＴ ３’（配列番号２０））、ならびにｈｒｓ（５’ ＧＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＣＡＧＡ ３’（配列番号２１）および５’ ＡＧＴＧＧＴＧＣＴＴＡＣＧＧＧＴＣＡＴＣ ３’（配列番号２２））。
小分子ＲＮＡクローニングおよびライブラリー
記載されるように（Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｓ．、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．およびＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ２６、Ｕｎｉｔ２６ ４（２００５）［８５］）、ＭｏｎｏＭａｃ６細胞からの２００μｇのＲＮＡ、またはＭｏｎｏＭａｃ６由来エキソソームからの２μｇのＲＮＡを使用して、小分子ＲＮＡクローニングを行った。ＧＡＴＣ（Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により４５４パイロシークエンシングテクノロジー（ｗｗｗ．４５４．ｃｏｍ）を使用してライブラリーを配列決定した。以下のデータベースを使用して、配列に注釈をつけた。ゲノム配列は、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒデータベース（ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ３７、２００７年７月）からのものだった。ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎ−ｓｎｏＲＮＡおよびｓｃＲＮＡ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋのリリース１５８（２００７年２月１５日）から抽出した。ｍｉＲＢａｓｅバージョン１０．１を使用してｍｉＲＮＡを同定した。
ｍｉＲＮＡに依存するｍＲＮＡ選別実験
Ｌｅｔ−７ａについての標的部位を有する１μｇのレポータープラスミドでＭｏｎｏ−Ｍａｃ−６細胞をトランスフェクションした（図１１ｄ）。２４時間後、細胞を、ＰＢＳ中で３回洗浄し、０．２５０Ｍショ糖、７８ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、８．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ ｐＨ７．０における７０行程のダウンス型ホモジナイザにより破砕した。膜選別実験のため、細胞溶解物を１０００ｇ（５分間）で２回遠心分離し、続いて１６０００ｇ（４５分間）で遠心分離した。２５０μＬのＰＢＳ中でペレットを再懸濁させ、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡを２５０μＬの上清からのものと並行して抽出した。エキソソーム選別実験を同様に行い、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳを使用してＲＮＡの抽出のために２５０μＬのＰＢＳ中において全細胞および精製エキソソームを再懸濁させた。
エキソソームへのｍＲＮＡ選別の生物情報科学的解析
エキソソームと比較した神経膠芽細胞腫細胞における転写物の相対的濃縮を詳述する比較ｍＲＮＡマイクロアレイが最近公開された（［２］）。２００単位の背景閾値を越えたシグナルを検出する１９６１９本のプローブの中で、１３５０４本（３１．１７％）が、細胞よりもエキソソーム中における高レベルで検出された。エキソソーム中におけるｍｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡの低下を評価するため、本発明者らは、マイクロアレイ５３に使用する神経膠芽細胞腫細胞およびエキソソーム中における高レベルで検出される１１のｍｉＲＮＡのために実験的に確認された標的（ｍｉＲｅｃｏｒｄ）を利用した。同様に解析して、４５のｍｉＲＮＡ抑制ｍＲＮＡの内で６（１３．６３％、期待値１４、χ２＝６．６３６、ｐ＝０．０１）がエキソソーム中において過度に多かった。ｍｉＲＮＡが標的としないｍＲＮＡのセットは容易に利用可能ではないことから、本発明者らは、場合によってはｍｉＲＮＡ６３による調節を最小限に抑えるために、３’ＵＴＲ８６を短縮した傾向がある一組のハウスキーピング遺伝子（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．およびＬｅｖａｎｏｎ，Ｅ．Ｙ．Ｈｕｍａｎ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｃｏｍｐａｃｔ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ１９、３６２〜５頁（２００３）［８６］）を利用した。ハウスキーピングｍＲＮＡ（１５７７本の合計プローブ）の内、５６８本（３５．８９％、期待値４９２、χ２＝１６．６４１、ｐ＜０．０００１）が、細胞と比較してエキソソーム中において濃縮された。
結果
エキソソームに似ている分泌小胞から抽出されたＲＮＡ（［５２］）（直径５０〜１００ｎｍ）はｍｉＲＮＡを含む（Ｓｋｏｇ，Ｊ．ら、Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｕｍｏｕｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１０、１４７０〜６頁（２００８）［５３］）。かかる小胞がｍｉＲＮＡ活性に必要なタンパク質を含むのかについて試験するため、本発明者らは、エキソソームを分泌することが知られている培養単球を使用した。本発明者らは、エキソソームに一致する大きさが均一な集団を形成する形態的に一様の小胞を精製した（図９ａ〜ｂ）。これらを、ＣＤ６３（公知のエキソソームマーカー）において非常に濃縮した（図９ａ）。さらに、エキソソーム解放の放出に必要であるブレフェルジンＡ阻害グアニンヌクレオチド交換タンパク質２（ＢＩＧ２）のＲＮＡｉ（Ｉｓｌａｍ，Ａ．ら、Ｔｈｅ ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ−ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＩＧ２，ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＴＮＦＲ１ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｌｉｋｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２、９５９１〜９頁（２００７）［５４］）は、小胞収率を約５０％低下させた（図９ｃ）。精製エキソソーム様材料は、全細胞溶解物中において非常により小さいが多少のＡｇｏ２を含有し、Ａｇｏ２への結合によるｍｉＲＮＡ機能に必要であるＧＷ１８２において非常に濃縮された（図９ｄ）。透過化処理された精製小胞の免疫金標識および電子顕微鏡観察によって、このＧＷ１８２濃縮がさらに確認された（図９ｅ）。逆に、Ｐ−ボディ成分Ｄｃｐ１ａは、デキャッピング複合体中におけるＤｃｐ１ａと相互作用するＧｅ−１のように全細胞溶解物と比較して分泌小胞中においてわずかに検出可能だった（Ｙｕ，Ｊ．Ｈ．、Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｈ．、Ｇｕｌｉｃｋ，Ｔ．、Ｂｌｏｃｈ，Ｋ．Ｄ．およびＢｌｏｃｈ，Ｄ．Ｂ．Ｇｅ−１ ｉｓ ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｏｄｙ．Ｒｎａ１１、１７９５〜８０２頁（２００５）［５５］）（図９ｄ）。同様の結果は、無血清培地中で培養した単球で（ウシ血清からの小胞の寄与を除外する）（図１３ａ）、およびＨｅｌａ（図１３ｂ）およびエクスビボ由来樹状細胞（データ示さず）から第三者（Ｓ．Ａｍｉｇｏｒｅｎａおよび同僚、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｃｕｒｉｅ、Ｐａｒｉｓ）により独立して精製されたエキソソームで得られた。
エキソソーム内にパッケージするため、またはエキソソームと会合するため、ＧＷ１８２およびＧＷ１８２結合Ａｇｏ２は、膜と相互作用する。実際、Ｄｃｐ１ａよりも非常に大きな量のＧＷ１８２およびＡｇｏ２が、全細胞１６０００ｇの画分の上清とは対照的にペレット中において認められた（図９ｆ）。ｍｉＲＮＡ抑制ｍＲＮＡが膜にも標的とされるのかについて試験するため、本発明者らは、２つのＬｅｔ−７ａ標的部位５を含む３’ＵＴＲに融合するウミシイタケｍＲＮＡを発現するプラスミド、または２つのシードミスマッチを含む陰性対照を使用した（図９ｇ）。著しいことに、ほとんどのＬｅｔ−７ａ抑制ｍＲＮＡは、対照ｍＲＮＡと比較して膜と会合したが（図９ｇ）、このことは膜会合ｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣの存在を示唆する。エキソソームはＭＶＢにより分泌されるので、本発明者らは、ＧＷ１８２およびＡｇｏ２会合細胞小器官がＭＶＢを含み得るのかについて試験した。本発明者らは、Ｎ−ローダミン標識脂質ホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−Ｒｈ−ＰＥ）を使用したが、その理由は、Ｎ−Ｒｈ−ＰＥがＭＶＢ（多胞体）ＭＶＢ５７に選別され、その中に保持されるからである。さらに、ＰＥに対する自己抗体は、幾つかの状況において選択的にＭＶＢ５８中において蓄積するが、ＧＷ１８２自己抗体５９と同じ病巣を染色する。単球における正確なＭＶＢ標識化は、ＭＶＢ会合テトラスパニンタンパク質ＣＤ８２とのＮ−Ｒｈ−ＰＥの共局在性により確認された（図１０ａ；図１４）。ＧＦＰ標識ＧＷ１８２（ＧＦＰ−ＧＷ１８２）は、中断構造を形成したが、その大部分は、試験された単球の９３％においてＮ−Ｒｈ−ＰＥと共局在した（ｎ＝８３）（図１０ｂ〜ｃ）。Ｎ−Ｒｈ−ＰＥとのＧＦＰ−Ａｇｏ２中断構造の類似の共局在性は、膜画分内におけるＡｇｏ２の存在と一致して（図９ｆ）、８３％の細胞において観察された（図１０ｄ）。さらに、ＧＦＰ−Ａｇｏ２は、ＭＶＢ標的ＨＩＶ−１Ｇａｇタンパク質５７と共局在した（図１４）。逆に、６％の細胞のみが、ＧＦＰ標識Ｄｃｐ１ａとＰ−ボディ特異的マーカーとＮ−Ｒｈ−ＰＥとの間に共局在性を示した（図１０ｅ〜ｆ）。同様に、ＧＦＰ−ＧＷ１８２およびＲＦＰ標識Ｄｃｐ１ａ（ＲＦＰ−Ｄｃｐ１ａ）は、３％の細胞のみにおいて共局在した（図１０ｇ〜ｈ）。免疫蛍光により、内在性ＧＷ１８２病巣が、内在性Ｄｃｐ１ａ病巣よりも頻繁にＭＶＢマーカーＣＤ６３と共局在し（図１５）、同様に、あまり大きくない差であるが、Ｎ−Ｒｈ−ＰＥ標識Ｈｅｌａ細胞においてＧＦＰ−ＧＷ１８２、ＧＦＰ−Ａｇｏ２およびＤｃｐ１ａ−ＧＦＰのそれぞれの局在化の間でも観察された（図１６）ことが確認された。ストレス顆粒がＧＷ１８２不含６０であるという以前の実証に一致して、ストレス顆粒の誘導も抑制も、単球中におけるＭＶＢとのＧＦＰ−ＧＷ１８２の共局在性を変化させなかった（図１７）。したがって、ＭＶＢと共局在するＡｇｏ２およびＧＷ１８２病巣は、Ｐ−ボディおよびストレス顆粒とは異なる細胞下構造を規定する。本発明者らは、Ａｇｏ２会合ＲＮＡサイレンシング成分の少なくとも２つの細胞プールが存在すると推論する。「ＧＷ」ボディを規定する一方のプールは、ＧＷ１８２が多く、Ｄｃｐ１ａが少なく、しばしばＭＶＢと会合する。第２のプールは、非膜性で、Ｄｃｐ１ａが多く、ＧＷ１８２が少なく、Ｐ−ボディと一般に定義される構造と同じである。
ＭＶＢとのＧＷ１８２、Ａｇｏ２およびＤｃｐ１ａの相対的共局在性は、膜画分中におけるそれらの存在および分泌されたエキソソーム様小胞内への組込み（またはその欠如）に非常に一致する。したがって、ＭＶＢは、ｍｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの機能的部位を構成する可能性がある。本発明者らは、ｍｉＲＮＡ前駆体転写物、パッセンジャー鎖またはｍｉＲＮＡ分解産物とは対照的に、必ずしも以前のｑＲＴ−ＰＣＲまたはＤＮＡチップ解析において区別されなかったエキソソーム様小胞中における成熟ｍｉＲＮＡの存在を最初にアッセイした（［５３］、Ｖａｌａｄｉ，Ｈ．ら、Ｅｘｏｓｏｍｅｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９、６５４〜９頁（２００７）［６１］）。単球エキソソーム様小胞から単離される１９〜３３ｎｔ ＲＮＡ画分を配列決定に供した。６９８６のゲノムがマッチする配列の中で、１７％が公知のｍｉＲＮＡであった（図１１ａ）。以前のｑＲＴ−ＰＣＲ研究に一致して、小胞および全細胞から単離される成熟ｍｉＲＮＡのクローニング頻度（［５３］、Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｄ．およびＧｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｓ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ １１０、１３〜２１頁（２００８）［６２］）および長さは同様であり（図１１ｂ〜ｃ、データ示さず）、同様に、ｍｉＲＮＡパッセンジャー鎖（０．７９３％対０．５５８％）およびステムループ（３．４８％対１．８５％）を、エキソソーム様画分および細胞画分において、非常に低いが同等の頻度でクローン化した。単球エキソソーム様小胞中に多いＬｅｔ−７ａの解析（図１１ｃ）は、膜が、ＲＮＡｓｅ治療に対して成熟ｍｉＲＮＡを保護することをさらに示した（図１８）。したがって、精製エキソソーム様小胞は、高レベルのＧＷ１８２および低レベルのＡｇｏ２に加えて一本鎖成熟ｍｉＲＮＡを含む。
Ａｇｏ２およびＧＷ１８２等、ｌｅｔ−７ａ抑制ｍＲＮＡを膜会合することを確立したので（図９ｆ〜ｇ）、本発明者らは、エキソソームに対するそれらの標的化の可能性をさらに試験した。しかし、著しいことに、ｌｅｔ−７ａ抑制ｍＲＮＡは、単球の精製エキソソーム様小胞において顕著に少なく示された（図１１ｄ）。神経膠芽細胞腫のエキソソームｍＲＮＡ含量に対する全細胞の比較［５３］は、公知のｍｉＲＮＡ標的転写物が、検出されたすべてのｍＲＮＡと比較してエキソソーム中において少なく示されることを同様に明らかにした（図１１ｄ、図１９）。逆に、ハウスキーピング遺伝子ｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ媒介抑制をあまり受けず（Ｆａｒｈ，Ｋ．Ｋ．ら、Ｔｈｅ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｏｎ ｍＲＮＡ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３１０、１８１７〜２１頁（２００５）［６３］）、エキソソーム中において濃縮される（図１１ｄ）。エキソソーム中においてｍｉＲＮＡ標的が少なく示されることは、ｍｉＲＮＡ媒介ｍＲＮＡ分解から生じる可能性が低く、前記減少は、通常、標的ｍＲＮＡ（あるとしても）の非常により小さい画分に影響を及ぼし、ＭＶＢや分泌小胞とは異なるＤＣＰ１ａ会合Ｐ−ボディにおいて生じる（Ｅｕｌａｌｉｏ，Ａ．ら、Ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｏｆ ｄｅｃａｐｐｉｎｇ ｉｎ ｍｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２１、２５５８〜７０頁（２００７）［６４］）（図９ｄおよび１０ｅｆ）。したがって、ｍｉＲＮＡ抑制転写物は、ＧＷ１８２およびＡｇｏ２会合膜画分において濃縮されると共に、エキソソーム様小胞から選択的に除外されると思われる。本発明者らはこうして、ＭＶＢに選別されかつエキソソーム／リソソーム経路を介してさらに分泌または代謝回転される膜結合Ａｇｏ−ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡサイレンシング複合体からＧＷ１８２のプールが特異的に解離することを予想した。
主要なＭＶＢ選別機構は、ＥＳＣＲＴ複合体によるユビキチン化タンパク質の認識に依存する。Ａｇｏ２は、公知でないユビキチン化タンパク質で精製され（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．ら、Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ５、４１４５〜５１頁（２００５）［６５］）、ユビキチンは、密度によって単離される幾つかのＡｇｏ複合体に見出される（Ｈｏｃｋ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍＲＮＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ８、１０５２〜６０頁（２００７）［６６］）。ＧＷ−ボディ成分がユビキチン化され、したがってＭＶＢに選別されるのかを決定するため、サイレンシング因子を総タンパク質抽出物から免疫沈降し、ユビキチン化タンパク質とのそれらの会合または直接的なユビキチン化を試験した。抗Ｕｂ抗体は、ＧＷ１８２抗血清と反応するタンパク質を（わずかにより小さい大きさでではあるが）免疫沈降させ、抗ＧＷ１８２抗体は、ＧＷ１８２の大きさに一致するユビキチン化タンパク質を免疫沈降させた（図１２ａ）。したがって、ＧＷ１８２は、ユビキチン化される、かつ／またはユビキチン化タンパク質と相互作用する。主にＧＷ１８２を認識すると共に、使用するＧＷ１８２抗血清は、Ｇｅ−１に対する抗体をも含む（Ｂｌｏｃｈ，Ｄ．Ｂ．、Ｇｕｌｉｃｋ，Ｔ．、Ｂｌｏｃｈ，Ｋ．Ｄ．およびＹａｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｏｄｙ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ．Ｒｎａ１２、７０７〜９頁（２００６）［６７］）。しかし、ＧＷ１８２とは対照的に、Ｇｅ−１は、ユビキチン化タンパク質の中で検出されず、Ｄｃｐ１ａでもなかったが（図１２ａ）、このことは分泌エキソソーム中におけるそれらの非存在と一致する。ＭＶＢへのユビキチン化ＧＷ１８２のＥＳＣＲＴ依存選別は、ｖｐｓ３６、ｔｓｇ１０１、Ａｌｉｘ（エキソソーム中において見出されるか、または通常のＭＶＢ生合成／機能に必要とされる）およびＨｒｓ（ＭＶＢの中の腔内小胞蓄積に必要（Ｒａｚｉ，Ｍ．およびＦｕｔｔｅｒ，Ｃ．Ｅ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ Ｔｓｇ１０１ ａｎｄ Ｈｒｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｗａｒｄ ｖｅｓｉｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ１７、３４６９〜８３頁（２００６）［６８］））を含むＥＳＣＲＴ成分のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンの結果によってさらに支持された。実際、ＨｒｓおよびＡｌｉｘサイレンシングは、Ｄｃｐ１ａではなくＧＷ１８２の細胞含量を特異的に増加させたが、このことは、エキソソーム分泌および／またはＧＷ１８２のリソソーム分解におけるこれらの２種のタンパク質の可能な役割を示す（図１２ｂ）。注目すべきは、報告されるように［１８］、ｖｐｓ３６およびＡｌｉｘのＲＮＡｉは、それぞれＭＶＢの大きさを増大させ、かつ核周囲ＭＶＢ分布を増強し、ＭＶＢへのＧＦＰ−ＧＷ１８２の局在化は、これらの治療により（図１２ｃ）、そしてｔｓｇ１０１またはＨｒｓのノックダウンの際（データ示さず）に不変のままだった。
ＭＶＢへのＧＷ１８２選別がＲＮＡサイレンシングに関連したのならば、ＥＳＣＲＴ成分のノックダウンは、ｍｉＲＮＡ活性に支障を来すと考えられるであろう。二重ルシフェラーゼアッセイにおいて、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓおよびｖｐｓ３６のＲＮＡｉは、単球（図１２ｄ）およびＨｅｌａ細胞（２つの独立したｓｉＲＮＡ／遺伝子、図２１）の両方におけるｌｅｔ−７ａ活性を、ＧＷ１８２ＡのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンと同じ程度に実際に阻害した（約２０％、他（Ｌｉｕ，Ｊ．ら、Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐ−ｂｏｄｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＧＷ１８２ ｉｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ７、１２６１〜６頁（２００５）［７０］）によって観察される通り）。逆に、ＥＧＦＲ分解［２０］に必要な初期エンドソーム［６８］またはＰＴＰＮ２３の中の液胞ドメインを形成するｔｓｇ１０１のノックダウンによってほとんどまたは全く効果が得られなかった（図１２ｄ、図２１）。上記のｓｉＲＮＡ治療のいずれも、ｌｅｔ−７ａ蓄積（図１２ｂ、右のパネル）に影響を及ぼさなかった。同様の実験を、エキソソームおよび単球には存在しないｍｉＲ−２０６を発現するプラスミド（または対照ｍｉＲＮＡ）で行った（図１２ｃ）。エストロゲン受容体α転写物（確認されたｍｉＲ−２０６標的）の３’ＵＴＲを有するホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを発現する第２のプラスミドをトランスフェクションした。ｌｅｔ−７ａと同様に、ｔｓｇ１０１やＰＴＰＮ２３ではなく、ＡｌｉｘまたはＨｒｓのノックダウンは、ｍｉＲ−２０６の比活性を阻害した（図１２ｅ、図２１）。本発明者らは、ＥＳＣＲＴの統合性の変化が、おそらくＭＶＢへのＧＷ１８２の選別による干渉によって、一般にｍｉＲＮＡ機能に支障を来すと結論する。
スポンジ体およびＥＲ様区画は、翻訳調節ｍＲＮＡまたは選択Ｐ−ボディ成分が会合する膜区画の例である（Ｄｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．およびＰａｒｋｅｒ，Ｒ．ＣＡＲ−１ ａｎｄ ｔｒａｉｌｅｒ ｈｉｔｃｈ：ｄｒｉｖｉｎｇ ｍＲＮＰ ｇｒａｎｕｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ＥＲ？Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７３、１５９〜６３頁（２００６）［７２］）。本発明者らは、特異的ｍｉＲＮＡ経路成分、成熟ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ抑制転写物は、著しくＭＶＢを含む細胞膜上に物理的にかつ機能的に集合することを示す。したがって、本発明者らは、各種の哺乳類の細胞型において一般に検出され、かつ以前は「ＧＷ」−ボディと定義されたＧＷ１８２凝集体が、必ずというわけではないが、しばしば、ＭＶＢに相当することを提案する。ＭＶＢとＰ−ボディ特異的成分Ｄｃｐ１ａとの間の限定された共局在性は、本発明者らおよび他が見出したＤｃｐ１ａとのＧＷ１８２の不完全な会合と同時に起こる（Ｂｕｃｈｅｔ−Ｐｏｙａｕ，Ｋ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｍｅｘ ３ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ ｎｏｖｅｌ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｔｏ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｏｄｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５、１２８９〜３００頁（２００７）［７３］、Ｖａｓｕｄｅｖａｎ，Ｓ．、Ｔｏｎｇ，Ｙ．およびＳｔｅｉｔｚ，Ｊ．Ａ．Ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ７、１５４５〜９頁（２００８）［７４］）。さらに、Ｄｃｐ１ａではなく、ＧＷ１８２は、ｍｉＲＮＡに誘導された翻訳活性化の間にＦＸＲ１およびＡｇｏ２と部分的に共局在する（Ｖａｓｕｄｅｖａｎ，Ｓ．およびＳｔｅｉｔｚ，Ｊ．Ａ．ＡＵ−ｒｉｃｈ−ｅｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＦＸＲ１ ａｎｄ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２．Ｃｅｌｌ１２８、１１０５〜１８頁（２００７）［７５］）が、このことは、ＧＦＰ−Ａｇｏ２凝集体の有意部分が、単球およびＨｅｌａ細胞中におけるＧＷ−ボディと局在するという本発明者らの発見に一致する。しかし、本発明者らは、一貫して、Ｄｃｐ１ａ、ＧＷ１８２およびＭＶＢが明らかに共局在する一部のＨｅｌａ細胞を観察したが、このことはまた、他（Ｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．およびＢｌａｕ，Ｈ．Ｍ．Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ２／ＲＩＳＣ ｒｅｓｉｄｅｓ ｉｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ ｋｎｏｗｎ ａｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ７、６３３〜６頁（２００５）［７６］）により為された観察をも支持する。これらの差の基礎となり得る１つの主要な要素は、ｍｉＲＮＡ活性が、Ｐ−ボディではなくＧＷ−ボディと同期して細胞周期に依存する方法で調節されると思われ［７４］、その結果、培養細胞の中のサイクル進行の差が、有意な標識化不均質性を生じる可能性があるということである。
それらはＭＶＢに会合するにもかかわらず、ｍｉＲＮＡ抑制ｍＲＮＡおよび大部分のＡｇｏ２はエキソソームから除外される。逆に、ＧＷ１８２は、それらの小胞中において選択的に濃縮される。本発明者らの解釈は、Ａｇｏ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびＧＷ１８２を含有する膜結合型ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の高解離速度が、複数回のｍＲＮＡ抑制（インビトロでのＲＩＳＣの公知の生化学的特徴）にインビボで必要であることを伴う［２６］。これらの高オフ率は、ＭＶＢへのユビキチン結合ＧＷ１８２分子の特異的な−および、おそらく連続的な−ＥＳＣＲＴ依存性除去により付与され得るが、これにより、エキソソーム内へのそれらのその後の分泌、および／または、リソソームにおける分解が可能になる。この仮説に対して黙示的には、ＧＷ１８２は、ｍｉＲＮＡ媒介サイレンシングにおいて律速であるべきであり、このことは、ＧＷ１８２がノックダウンされる場合、ｍＲＮＡに結合するＡｇｏ２がもはや抑圧的でないという最近の実証により支持される（Ｌｉ，Ｓ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＷ１８２ ａｎｄ ｉｔｓ ｎｏｖｅｌ ｉｓｏｆｏｒｍ ＴＮＧＷ１ ａｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｉｎ Ａｇｏ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ１２１、４１３４〜４４頁（２００８）［７８］）。多少のｍｉＲＮＡ負荷Ａｇｏ２が、最近ＡＧＯアンカーと同定されたＧＷ−反復と直接相互作用する可能性が高いので、ＧＷ１８２のＥＳＣＲＴ依存性選別に結び付くＲＩＳＣを作製しないこと、および再度作製することは、中程度の部分のＡｇｏ２および成熟ｍｉＲＮＡがエキソソーム中にも分割されることをさらに満たす（ＥＩ−Ｓｈａｍｉ，Ｍ．ら、Ｒｅｉｔｅｒａｔｅｄ ＷＧ／ＧＷ ｍｏｔｉｆｓ ｆｏｒｍ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＡＲＧＯＮＡＵＴＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｉｎ ＲＮＡｉ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２１、２５３９〜４４頁（２００７）［７９］）。前記モデルはまた、支障を来すＥＳＣＲＴ統合性が、ＭＶＢへのＧＷ１８２の共局在性を変化させることなくｍｉＲＮＡ機能を混乱させる理由、およびＧＷ１８２レベルがＡｌｉｘまたはＨｒｓノックダウンの際に増加する理由をも説明しており、分泌／分解の低下は、細胞膜におけるＧＷ１８２の蓄積を引き起こし、それは、サイレンシング複合体の提案されたターンオーバーに同時に支障を来す。ＭＶＢにおけるｍｉＲＮＡ複合体の再利用はまた、同時期の研究（Ｌｅｅら参照）とも完全に一致しており、このことは、ＭＶＢ輸送経路が、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡによるショウジョウバエＡｇｏｓの効率的な負荷に必要とされることを示唆する。しばしばパラロガス因子により、ＥＳＣＲＴ経路の明瞭な分岐は各種ＭＶＢ機能を制御する。故に、ＰＴＰＮ２３は、ＥＧＦＲのライゲーション後の分解を制御するが、一方でＡｌｉｘは、それに対する効果を少ししか有さない（Ｄｏｙｏｔｔｅ，Ａ．、Ｍｉｒｏｎｏｖ，Ａ．、ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｅ．およびＷｏｏｄｍａｎ，Ｐ．Ｔｈｅ Ｂｒｏ１−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＤ−ＰＴＰ／ＰＴＰＮ２３ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｃａｒｇｏ ｓｏｒｔｉｎｇ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｙ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０５、６３０８〜１３頁（２００８）［７１］）。逆に、ＡｌｉｘサイレンシングはＭＶＢおよびｍｉＲＮＡ活性に対するＧＷ１８２選別に支障を来すが、一方でＰＴＰＮ２３ノックダウンはそうではない。したがって、それらの制御的なＥＧＦＲ下方制御から区別されるＥＳＣＲＴ成分の特異的なサブセットは、本明細書で報告されるプロセスに関与すると思われる。
ｍｉＲＮＡ作用の、さらなる、以前に特性が評価されていない部位としてＭＶＢを同定することは、ＭＶＢ会合ｍｉＲＮＡ活性とＰ−ボディ−会合ｍｉＲＮＡ活性との間に機能的区別が為されるのかについての問題を喚起する。本発明者らの結果は、抑制ｍＲＮＡの翻訳阻害または貯蔵が大部分は膜のＧＷ−ボディで生じるが、一方でｍＲＮＡ分解が細胞質Ｐ−ボディにおいて起きることを示す。ショウジョウバエ細胞における以前の研究は、ＧＷ１８２が、ｍＲＮＡ分解機構の非存在下で遺伝子発現を抑制することが可能であり、かつ、ＧＷ１８２が、ｐｏｌｙＡテールのないｍＲＮＡを非発現化することが可能であることを実際に示す（Ｅｕｌａｌｉｏ，Ａ．、Ｈｕｎｔｚｉｎｇｅｒ，Ｅ．およびＩｚａｕｒｒａｌｄｅ，Ｅ．ＧＷ１８２ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｍｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ１５、３４６〜５３頁（２００８）［８０］）。翻訳抑制は、Ｇｅ−１およびＤｃｐ１ａが欠失した細胞において持続し、増強される可能性があることから、Ｐ−ボディから独立して生じることが示唆されたが［１３］、このことは、翻訳抑制機構がＭＶＢで少なくとも部分的に集合してＧＷ−ボディを形成する可能性があることを意味する。これはまた、ｍｉＲＮＡ媒介翻訳抑制が検出可能Ｐ−ボディの非存在下で機能することができる理由について説明することも可能である（Ｃｈｕ，Ｃ．Ｙ．およびＲａｎａ，Ｔ．Ｍ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ＲＣＫ／ｐ５４．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ４、ｅ２１０（２００６）［８１］）。
標的器官または標的細胞へのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の送達速度および／または効率の決定方法
ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡまたはその阻害剤による動物または患者の治療の約１２時間〜４日後に、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが標的とする組織または細胞を排出する部位からの血清、上清または体液（例えば、前立腺または腎臓標的ｓｉＲＮＡ用尿試料）の採取の第一段階を実現する。
次いで、１００〜４００ｇで５分間の低速の遠心分離による細胞材料および他の大きな材料の除去を行う。上清を回収する。
例えば８０００〜１２０００ｇで３０分間の第２の遠心分離により、大きなデブリ、小胞および他の微粒子の除去を行う。あるいは、このステップを、例えば０．２２μＭ、０．４５μＭまたは最高１μＭフィルタカットオフを用いるサイズ排除濾過と置き換える。フィルタを通過する材料を回収する。
小さい小胞またはエキソソームをペレット化するため、７００００〜１２００００ｇで１時間の最後の遠心分離を用いる。
小胞またはエキソソームにおいて濃縮される分子に結合する抗体または他の分子を使用して、例えば抗ＣＤ６３、抗ＭＨＣクラスＩ、またはビーズもしくは他の容易に精製される構造に結合するスフィンゴミエリン結合分子を使用して、いずれかのステップ（開始時、ステップ後、１、２、３または４）で小胞をさらに精製する。
Ｔｒｉｚｏｌ抽出等の方法によりＲＮＡを単離する。グリコーゲン、酵母ｔＲＮＡまたは他の材料の添加によりＲＮＡ沈殿を増強する。
ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ治療またはその阻害剤が標的とする特異的ｍＲＮＡ（および、場合によっては対照ＲＮＡ）を、定量的リアルタイムＰＣＲまたは同様の結果を伴う他の方法により定量する。
ｍＲＮＡの量を、対照ＲＮＡまたはエキソソーム量（例えば、スフィンゴミエリン、ＣＤ６３の量）の測度に正規化する。あるいは、ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡまたは阻害剤を小胞において直接定量する。
特異的ｍＲＮＡの量を、ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡまたはその阻害剤による患者または動物の治療の前または後に行う同様の測定と、または治療されないもしくはプラセボ分子で治療されたた動物もしくは患者とさらに比較し、それにより標的器官または標的細胞へのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の送達速度および／または効率を決定することを可能にする。あるいは、特異的ｍＲＮＡのレベルを、ｓｉＲＮＡが送達されない細胞、例えば白血球における同じｍＲＮＡのレベルと比較する。
このプロトコルを、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡの発現レベルまたは存在と関連する患者の診断または予後を得るためにも用いる。
診断または治療のための候補分子のスクリーニング方法
ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを模倣するか、または阻害する分子を、本発明を使用するそれらの標的および標的外の効果についてスクリーニングすることができる。
治療状態に近い組織または細胞を、ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡまたは阻害剤で治療する。
約８時間〜４日間の期間の後に、エキソソーム様小胞を組織または細胞から精製し（実施例３のプロトコルに従って）、最適な全細胞および／または膜画分を同じ組織または細胞から調製する。
ダウンスホモジナイゼーションにより細胞を溶解することによって膜画分を調製する。続いて核除去後上清（約１０００ｇ、５分間）を約１００００ｇ〜１０００００ｇで遠心分離する。次いでペレット化材料を膜画分として使用する。あるいは、密度勾配における遠心分離、または電気的勾配における単離を、膜画分の単離に用いる。
Ｔｒｉｚｏｌ抽出等の方法により各種試料からＲＮＡを単離する。
好ましくは、Ｓｏｌｅｘａ配列決定やマイクロアレイ等、並行して多数のＲＮＡの解析を可能にする方法により、ＲＮＡ量を解析する。
各ＲＮＡの比または他の比較発現を、エキソソーム、全細胞および／または膜画分の中で確立する。比は、小分子ＲＮＡによるＲＮＡの標的化を示す。細胞および／または膜画分と比較したエキソソーム中におけるＲＮＡの減少は、それがｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡにより標的とされることを示す。幾つかの例において、試料の種類（エキソソーム様小胞、全細胞、膜画分）の内の１種だけを使用してｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ標的を決定することが可能である。
治療された、および治療されていない細胞における各ＲＮＡの比の比較は、所定のＲＮＡがｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡにより標的とされる信頼度をさらに増加させる。
以前のステップからｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡにより標的とされる可能性のあるＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ標的部位の存在について検討する。所定のＲＮＡがｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡにより標的とされる信頼度をさらに増強するため、小分子ＲＮＡ配列を有するヌクレオチド２〜７「シード領域」のマッチの探索を用いる。
保持されたＲＮＡは、興味の対象の小分子ＲＮＡの標的であると考えられる。

Claims (20)

  1. 標的器官または標的細胞への／標的器官または標的細胞中のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の送達速度および／または効率を決定する方法であって、前記標的器官または標的細胞のエキソソームまたは小胞中の、前記ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ、ならびに／あるいは前記ｍｉＲＮＡおよび／または前記ｓｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡのレベルを測定することを含む方法。
  2. （ｉ）好ましくは以前にｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡで治療された患者の体液からエキソソームまたは小胞を単離するステップと、
    （ｉｉ）前記エキソソーム中のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルを測定するステップと、
    （ｉｉｉ）場合により、前記レベルを対照と比較し、次いで、内在形態または治療薬形態のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達速度および／または効率を決定するステップと
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記体液が、血液産物、尿、肺洗浄液および唾液、他の体液、または培養細胞の上清から選択される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
  4. ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルの前記測定が、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、あるいはマイクロアレイまたは他のチップ上のハイブリダイゼーションにより、あるいはゲルもしくは膜上または溶液中でのハイブリダイゼーションにより実施される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記対照が、治療された、治療されていない、または対照で治療された個体、動物または細胞のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡおよび／または他のＲＮＡおよび／または小胞の定量を許容する他の分子、あるいはその成分である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）が、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療の前および後、および最終的にはその間に実施される、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 標的器官または標的細胞へのｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達効率または活性を決定するための、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達効率または活性が、治療後のエキソソーム中のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡのレベルの低下または変化によって認識される、請求項７に記載の方法。
  9. 全細胞のｍＲＮＡの含量を決定する前記ステップが、ｍＲＮＡマイクロアレイ、ｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡまたは他のＲＮＡもしくはＤＮＡを同定する大規模方法、ｑＲＴ−ＰＣＲ、大規模多重遺伝子アプローチから選択される方法を用いて実施される、請求項７乃至８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記標的器官または標的細胞の膜画分中および全細胞中の、前記ｓｉＲＮＡおよび／または前記ｍｉＲＮＡ、および／または前記ｍｉＲＮＡおよび／または前記ｓｉＲＮＡが標的とする前記ｍＲＮＡのレベルを測定することを含む、請求項７乃至９のいずれか一項に記載の方法。
  11. エキソソーム、膜画分および全細胞の中におけるｍｉ／ｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡの比を比較するステップを含む、請求項７乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ治療薬の（１つまたは複数の）標的を同定するための、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療薬または他の分子により行われる治療の効率を決定するための、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記治療が、ＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの活性および／または細胞間移行を調節するための多胞体（ＭＶＢ）の形成、相互作用または活性に関与するタンパク質、脂質、ＲＮＡまたは他の分子により実施される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記タンパク質が、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６（液胞タンパク質選別会合タンパク質３６）、ＥＡＰ３０（３０ｋＤＡのＥＬＬ会合タンパク質、ＳＮＦ８）、ＥＦ１ａ（延長因子１ａ）およびＢＩＧ２、ｈｐｓ４（ヘルマンスキー−パドラック症候群４）、ｈｐｓ１（ヘルマンスキー−パドラック症候群１）、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＳＣＦユビキチンリガーゼ（Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ−Ｆ−ボックスタンパク質）、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ（Ｖ０またはＶ１アデノシン三リン酸分解酵素）、ｖｐｓ４１、ＣＯＧＣ４（保存されたオリゴマーゴルジ成分４）、ＡＴＧ３（オートファジー関連タンパク質３）、ＡＴＧ８、ＣＯＧ４、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）、ＮＥＤＤ４Ｌ（発生的に発現が下方制御された神経前駆細胞４様）、ＡＲＦＧＥＦ４（ＡＤＰリボシル化因子グアニンヌクレオチド交換因子４タンパク質）、ＣＨＭＬ（コロイデレミア様）、ＲＡＢ１０（ｒａｓ関連ＧＴＰ結合タンパク質１０）、ＲＡＢ３５、ＲＡＬＢ（Ｖ−ｒａｌサル白血病ウイルス癌遺伝子相同体Ｂ）、ＲＡＰＧＥＦ６（Ｒａｐグアニンヌクレオチド交換因子６）、ＳＣＤ（ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ）、ＧＩＰＣ１（ＧＩＰＣ ＰＤＺドメイン含有ファミリー、メンバー１）、ＳＣＧＢ１Ｄ１（セクレトグロビン、ファミリー１Ｄ、メンバー１）、ＵＢＥ２Ｍ（ユビキチン共役酵素Ｅ２Ｍ）、ＵＳＰ１０（ユビキチン特異的プロテアーゼ１０）、ＥＥＦ２（真核生物翻訳伸長因子２）、ＬＩＬＲＢ１（白血球免疫グロブリン様受容体、サブファミリーＢ）、ＲＡＢ３６、ＲＡＮＢＰ２（Ｒａｎ結合タンパク質２）、ＳＦＲＰ２（分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２）、ＳＬＣ４Ａ４（溶質キャリアファミリー４、重炭酸ナトリウム共輸送体、メンバー４）、ＳＭＰＤ３（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ３）、スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンシンターゼ１、スフィンゴミエリンシンターゼ２、Ｅｐｏｐａｍｉｌ結合タンパク質、ｕｓｐ２２（ユビキチン特異的プロテアーゼ２２）、ｔｒｐｃ３（一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＣ、メンバー３）、ＣＬＣＮ７（クロライドチャネル７）、ＣＴＳＣ（カテプシンＣ）、ＬＡＭＲ１（ラミニン受容体１）、ＲＮＦ３２（リングフィンガータンパク質３２）、ＥＲＩ３（増強されたＲＮＡｉ−３）、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素）、ＮＰＣ１（ニーマン−ピック病、Ｃ１型）、ＳＬＣ６Ａ４（ナトリウム依存性セロトニントランスポータ、溶質キャリアファミリー６メンバー４）、ＦＡＵ、ＴＨＥＡ（ＡＣＯＴ１１、アシル補酵素Ａチオエステラーゼ１１）、ＣＫＡＰ４、ＣＯＧ１−８タンパク質、ｖｐｓ１−４５タンパク質、ＣＨＭＰファミリータンパク質、選別ネキシン、ｒａｂ５、７、９、３８、Ａｒｆ２、Ａｒｆ６、ＧＧＡ１−３、スフィンゴミエリンおよびステロール代謝遺伝子および薬物（例えば、ＧＷ４８６９、スフィンゴミエリンエステラーゼ）、ＭＶＢまたはエキソソーム内への選別のその関与に関連するコレステロールまたは脂質ラフト分割および代謝に影響を及ぼす薬物および遺伝子、特にＮＰＣ１、ＨＭＧＣＲ、およびコレステロール低下薬のスタチンクラスから成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法を含む、ヒト、腫瘍または胎児の遺伝子型を調べるため、および／またはその状態の特性を決定するための方法。
  17. 生物、細胞または植物におけるｍｉＲＮＡまたは小分子ＲＮＡの活性をコントロールするための方法であって、
    タンパク質、またはこのタンパク質の活性を修飾する化学物質、またはこのタンパク質を標的とするｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡもしくはその関連分子を生物に投与することを含み、
    このタンパク質が、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６（液胞タンパク質選別会合タンパク質３６）、ＥＡＰ３０（３０ｋＤＡのＥＬＬ会合タンパク質、ＳＮＦ８）、ＥＦ１ａ（延長因子１ａ）およびＢＩＧ２、ｈｐｓ４（ヘルマンスキー−パドラック症候群４）、ｈｐｓ１（ヘルマンスキー−パドラック症候群１）、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＳＣＦユビキチンリガーゼ（Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ−Ｆ−ボックスタンパク質）、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ（Ｖ０またはＶ１アデノシン三リン酸分解酵素）、ｖｐｓ４１、ＣＯＧＣ４（保存されたオリゴマーゴルジ成分４）、ＡＴＧ３（オートファジー関連タンパク質３）、ＡＴＧ８、ＣＯＧ４、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）、ＮＥＤＤ４Ｌ（発生的に発現が下方制御された神経前駆細胞４様）、ＡＲＦＧＥＦ４（ＡＤＰリボシル化因子グアニンヌクレオチド交換因子−４タンパク質）、ＣＨＭＬ（コロイデレミア様）、ＲＡＢ１０（ｒａｓ関連ＧＴＰ結合タンパク質１０）、ＲＡＢ３５、ＲＡＬＢ（Ｖ−ｒａｌサル白血病ウイルス癌遺伝子相同体Ｂ）、ＲＡＰＧＥＦ６（Ｒａｐグアニンヌクレオチド交換因子６）、ＳＣＤ（ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ）、ＧＩＰＣ１（ＧＩＰＣ ＰＤＺドメイン含有ファミリー、メンバー１）、ＳＣＧＢ１Ｄ１（セクレトグロビン、ファミリー１Ｄ、メンバー１）、ＵＢＥ２Ｍ（ユビキチン共役酵素Ｅ２Ｍ）、ＵＳＰ１０（ユビキチン特異的プロテアーゼ１０）、ＥＥＦ２（真核生物翻訳伸長因子２）、ＬＩＬＲＢ１（白血球免疫グロブリン様受容体、サブファミリーＢ）、ＲＡＢ３６、ＲＡＮＢＰ２（Ｒａｎ結合タンパク質２）、ＳＦＲＰ２（分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２）、ＳＬＣ４Ａ４（溶質キャリアファミリー４、重炭酸ナトリウム共輸送体、メンバー４）、ＳＭＰＤ３（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ３）、スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンシンターゼ１、スフィンゴミエリンシンターゼ２、Ｅｐｏｐａｍｉｌ結合タンパク質、ｕｓｐ２２（ユビキチン特異的プロテアーゼ２２）、ｔｒｐｃ３（一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＣ、メンバー３）、ＣＬＣＮ７（クロライドチャネル７）、ＣＴＳＣ（カテプシンＣ）、ＬＡＭＲ１（ラミニン受容体１）、ＲＮＦ３２（リングフィンガータンパク質３２）、ＥＲＩ３（増強されたＲＮＡｉ−３）、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素）、ＮＰＣ１（ニーマン−ピック病、Ｃ１型）、ＳＬＣ６Ａ４（ナトリウム依存性セロトニントランスポータ、溶質キャリアファミリー６メンバー４）、ＦＡＵ、ＴＨＥＡ（ＡＣＯＴ１１、アシル補酵素Ａチオエステラーゼ１１）、ＣＫＡＰ４、ＣＯＧ１−８タンパク質、ｖｐｓ１−４５タンパク質、ＣＨＭＰファミリータンパク質、選別ネキシン、ｒａｂ５、７、９、３８、Ａｒｆ２、Ａｒｆ６、ＧＧＡ１−３、スフィンゴミエリンおよびステロール代謝遺伝子および薬物（例えば、ＧＷ４８６９、スフィンゴミエリンエステラーゼ）、ＭＶＢまたはエキソソーム内への選別のその関与に関連するコレステロールまたは脂質ラフト分割および代謝に影響を及ぼす薬物および遺伝子、特にＮＰＣ１、ＨＭＧＣＲ、およびコレステロール低下薬のスタチンクラスから選択される、方法。
  18. 診断または治療のための候補分子のスクリーニングのための、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法の用途。
  19. 前記候補分子が、ＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの活性および／または細胞間移行を調節するための、多胞体（ＭＶＢ）の形成に関与するタンパク質または脂質から選択される、請求項１８に記載の用途。
  20. （ａ）体液からエキソソームまたは小胞を単離するための手段と、
    （ｂ）前記エキソソーム中のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルを測定するための手段と
    を含むキット。
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