JP2016523564A - CRISPR関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび合成sgRNAを含む組成物ならびに使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9タンパク質であり、これは典型的にはdCAS9と称される((非特許文献3);(非特許文献4))。触媒不活性Cas9ももたらした2つのエンドヌクレアーゼドメインおよび単一アミノ酸置換(D31A、H858A)を有するストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophiles)Cas9が記載されている((非特許文献5))。
ドおよび合成sgRNAの選択、設計および/または利用のための系、方法、装置およびキットも提供される。
本発明は、1つ以上のCRISPR関連タンパク質、例えば、dCAS9およびdCAS9融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドを提供する。用語「ポリヌクレオチド」は、最も広義で、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および/または物質を含む。本発明の例示的なポリヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GMA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(locked nucleic acid)(LNA、例として、β−D−リボ立体構造を有するLNA、α−L−リボ立体構造を有するα−LNA(LNAのジアステレオマー)、2’−アミノ官能化を有する2’−アミノ−LNA、および2’−アミノ官能化を有する2’−アミノ−α−LNA)またはそれらのハイブリッドが挙げられる。
化学結合が破壊および再生されることが必須であるため、構造的修飾は、化学的性質のものであり、したがって化学的修飾である。しかしながら、構造的修飾は、異なるヌクレオチドの配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ATCG」(配列番号123)は、「AT−5meC−G」(配列番号124)に化学的に修飾することができる。同一のポリヌクレオチドは、「ATCG」(配列番号123)から「ATCCCG」(配列番号125)に構造的に修飾することができる。ここで、ジヌクレオチド「CC」が挿入され、ポリヌクレオチドの構造的修飾をもたらす。
本発明の合成ポリヌクレオチドは、CRISPR関連タンパク質をコードする。用語「CRISPR関連タンパク質」は、限定されるものではないが、CAS9、CSY4、dCAS9、およびdCAS9エフェクタードメイン(アクチベータおよび/またはインヒビタードメイン)融合タンパク質を含む。CRISPR関連タンパク質ポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列の例は、以下の表に見出される。
別の実施形態において、CRISPR関連タンパク質は、dCAS9エフェクタードメイン融合タンパク質である。エフェクタードメインは、適用に応じて活性化ドメインまたは阻害ドメインであり得る。エフェクタードメインの例は当業者に周知であり、それとしては、例えば、KRAB、CSD、WRPW、VP64、またはp65ADが挙げられる。
供される。
本発明の修飾合成ポリヌクレオチドは野生型mRNAから、本明細書において証明されるとおり、核酸ベース治療物を使用する有効なポリペプチド産生の既存の問題を克服するように機能するそれらの機能的および/または構造的設計特性において区別される。
る一連のヌクレオチドを含み得る。この実施形態において、キャッピング領域は、1〜10、例えば、2〜9、3〜8、4〜7、1〜5、5〜10、または少なくとも2、または10以下のヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、キャッピング領域は、不存在である。
本発明によれば、合成ポリヌクレオチドは、翻訳適格性分子を生成してポリA結合タンパク質および5’末端結合タンパク質間の相互作用を支援するために環化またはコンカテマー化することができる。環化またはコンカテマー化の機序は、少なくとも3つの異なる経路:1)化学的経路、2)酵素的経路、および3)リボザイム触媒経路を介して生じ得る。新たに形成された5’/3’結合は、分子内または分子間であり得る。
本発明によれば、3’末端において修飾されているヌクレオチドを使用して3’末端を介して複数の区別される合成ポリヌクレオチドを一緒に結合させることができる。細胞中への送達の化学量論を制御するために化学的コンジュゲーションを使用することができる。例えば、細胞脂肪酸代謝を変更するためにグリオキシル酸回路酵素、イソクエン酸リアーゼおよびリンゴ酸シンターゼをHepG2細胞中に1:1の比において供給することができる。この比は、一方のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNA種上の3’−
アジド末端ヌクレオチドおよび逆のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNA種上のC5−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドを使用してポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを化学結合させることにより制御することができる。修飾ヌクレオチドは、末端トランスフェラーゼ(ニュー・イングランド・バイオラブズ(New England Biolabs)、イプスウィッチ、マサチューセッツ)を製造業者のプロトコルに従って使用して転写後に添加する。3’修飾ヌクレオチドの添加後、文献に記載のクリックケミストリー機序を介する新たな共有結合を形成するために2つのポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNA種を銅の存在または不存在下で水溶液中で合わせることができる。
タンパク質産生をさらに向上させるため、本発明の合成ポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチド、色素、インターカレート剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、プソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドについての特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、規定の細胞型、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、または薬物にコンジュゲートするように設計することができる。
本発明の一実施形態は、二機能性ポリヌクレオチド(例えば、二機能性一次構築物または二機能性mmRNA)である。この名称が意味するとおり、二機能性ポリヌクレオチドは、少なくとも2つの機能を有し、または有し得るものである。これらの分子は、慣例により多機能性と称することもできる。
性であり得る。これは、構造的または化学的であり得る。二機能性修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと共有結合的または静電的に会合する機能を含み得る。さらに、2つの機能はmmRNAおよび別の分子の複合体に関して提供することができる。
本明細書に記載されるとおり、部分的または実質的に翻訳不能な配列を有する、例えば、非コード領域を有するポリヌクレオチドおよび一次構築物が提供される。このような非コード領域は、一次構築物の「第1のフランキング領域」であり得る。あるいは、非コード領域は、第1の領域以外の領域であり得る。このような分子は一般に翻訳されないが、1つ以上の翻訳機序構成要素、例えば、リボソームタンパク質またはトランスファーRNA(tRNA)に対する結合およびそれらの封鎖の1つ以上によりタンパク質産生に対して効果を付与し得、それにより細胞中のタンパク質発現を有効に低減させ、または細胞中の1つ以上の経路もしくはカスケードをモジュレートし、これが次いでタンパク質レベルを変更する。ポリヌクレオチドまたは一次構築物は、1つ以上の長鎖非コードRNA(IncRNA、またはlincRNA)またはその一部、小分子核小体RNA(sno−RNA)、マイクロRNA(miRNA)、小分子干渉RNA(siRNA)またはPiwi相互作用RNA(piRNA)を含有またはコードし得る。
本発明によれば、合成ポリヌクレオチドは、1つ以上の目的ポリペプチドまたはその断片をコードするように設計される。目的ポリペプチドとしては、CRISPR関連タンパク質、例えば、CAS9、dCAS9、およびdCAS9エフェクタードメイン(アクチベータおよび/またはインヒビタードメイン)融合タンパク質が挙げられる。CRISPR関連タンパク質は、本明細書にさらに詳細に記載される。
は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然存在アミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまり得る。
「類似体」は、親または出発ポリペプチドの特性のうちの1つ以上を依然として維持する、1つ以上のアミノ酸変更、例えば、アミノ酸残基の置換、付加または欠失だけ異なるポリペプチドバリアントを含むことを意味する。
なくとも1つのアミノ酸残基が除去され、その場所の同一の位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。この置換は単一置換であり、分子中の1つのアミノ酸のみが置換されたものであり得、またはそれらの置換は多置換であり、同一の分子中の2つ以上のアミノ酸が置換されたものであり得る。
本明細書において使用され、ポリペプチドに言及する場合、用語「局所立体構造形状」は、タンパク質の限定された空間内に局在するタンパク質のポリペプチドベース構造の出現を意味する。
は、由来するドメインとして同定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するドメインの部分を意味する。ドメインは必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有し得ないことが理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有し、または奇数のアミノ酸を含むと同定された場合において、奇数のドメインの半ドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分(ドメインのアミノ酸の数/2+/−0.5個のアミノ酸)を含む。例えば、7アミノ酸ドメインと同定されたドメインは、3アミノ酸または4アミノ酸(7/2=3.5+/−0.5は、3または4である)の半ドメインをもたらし得る。サブドメインがドメインまたは半ドメイン内で同定され得、これらのサブドメインが、それらが由来するドメインまたは半ドメイン中で同定された構造的または機能的特性の全てに満たない構造的または機能的特性を有することも理解される。本明細書のドメイン型のいずれかを含むアミノ酸は、ポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要はない(すなわち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメインまたはサブドメインをもたらし得る)ことも理解される。
0、20、30、40、50、60、70、80、90、100、または100を超えるアミノ酸長の参照タンパク質の任意のタンパク質断片(少なくとも1つのアミノ酸残基が参照ポリペプチド配列より短いが、他の点では同一であるポリペプチド配列を意味する)が本明細書に提供される。別の例において、本明細書に記載の配列のいずれかに対して約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、または約100%同一である約20、約30、約40、約50、または約100個のアミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を本発明により利用することができる。ある実施形態において、本発明により利用されるべきポリペプチドは、本明細書に提供または参照される配列のいずれかに示される2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い突然変異を含む。
一実施形態において、本発明の合成ポリペプチドは、バリアントポリペプチド、例えば、参照ポリペプチド配列とのある同一性を有するバリアントCRISPR関連タンパク質をコードし得る。本明細書において使用される場合、「参照ポリペプチド配列」は、出発ポリペプチド配列を指す。参照配列は、野生型配列または別の配列の設計において参照される任意の配列であり得る。「参照ポリペプチド配列」は、例えば、CAS9、dCAS9、dCAS9−アクチベータドメイン融合タンパク質、dCAS9−インヒビタードメイン融合タンパク質、および/またはそれらのバリアントをコードする任意のものであり得る。
ば、増加または減少)した活性を有し得る。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載され、当業者に公知の配列アライメントプログラムおよびパラメータにより決定されるとおり、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントに対して少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%であるが、100%未満の配列同一性を有する。このようなアライメントのツールとしては、BLASTスイートのものが挙げられる(ステフェン F.アルツシュール(Stephen F.Altschul)、トマス L.マッデン(Thomas L.Madden)、アレジャンドロ A.シャッフェル(Alejandro A.Schaeffer)、ジングイ・チャン(Jinghui Zhang)、チェン・チャン(Zheng Zhang)、ウエブ・ミラー(Webb Miller)、およびデイビッド J.リップマン(David J.Lipman)、1997年、「ギャップ挿入BLASTおよびPSI−BLAST:新世代のタンパク質データベース探索プログラム(Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein database search programs)」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)、第25巻、p.3389〜3402)。他のツールは、本明細書、具体的には、「同一性」の定義に記載される。
本明細書に記載のとおり、本発明の合成ポリヌクレオチドは、非翻訳領域を含む。遺伝子の非翻訳領域(UTR)は、転写されるが、翻訳されない。5’UTRが転写開始部位において始まり開始コドンに続くが、開始コドンを含まない一方、3’UTRは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性に関してUTRが担う制御的役割についての報告が相次いでいる。分子の安定性を向上させるためにUTRの制御特徴部を本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および/またはmmRNA中に取り込むことができる。それらが不所望な器官部位に誤指向される場合には転写物の下方制御の制御を確保するために規定の特徴部を取り込むこともできる。
2012年12月14日に出願された同時係属米国仮特許出願第61/737,130号明細書の表2および3は、本発明の一次構築物中でフランキング領域として利用することができる例示的UTRのリストを提供する。末端の1つ以上のヌクレオチド、例として、A、T、CまたはGが付加または除去された5’または3’UTRのバリアントを利用することができる。
変更される」は、UTR配列に関する場合、UTRが参照配列に関して何らかの点が変化したことを意味する。例えば、3’または5’UTRは、上記で教示される配向もしくは局在の変化により野生型もしくは天然UTRに対して変更することができ、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位により変更することができる。「変更された」UTR(3’または5’にかかわらず)をもたらすこれらの変化のいずれかは、バリアントUTRを含む。
for mRNA)に記載の非翻訳領域の1つ以上の全部または一部またはその断片を含み得、これらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本発明の合成ポリヌクレオチドは、典型的には5’UTRを含む。天然5’UTRは、翻訳開始についての役割を担う特徴部を担持する。これらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に公知のコザック配列のようなシグネチャーを保有する。コザック配列は、コンセンサスCCR(A/G)CCAUGG(配列番号126)を有し、Rは、開始コドン(AUG)の3塩基上流のプリン(アデニンまたはグアニン)であり、この後に別の「G」が続く。5’UTRは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも公知である。
本発明の合成ポリヌクレオチドは、典型的には3’UTRを含む。3’UTRは、それらに埋め込まれるアデノシンおよびウリジンのストレッチを有することが公知である。これらのAUリッチなシグネチャーは、高代謝回転率を有する遺伝子において特に高頻度で見られる。これらの配列特徴部および機能的特性に基づき、AUリッチエレメント(ARE)は、3つのクラスに分類することができ(チェン(Chen)ら、1995年):ク
ラスIのAREは、Uリッチ領域内のAUUUAモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。C−MycおよびMyoDは、クラスIのAREを含有する。クラスIIのAREは、2つ以上の重複するUUAUUUA(U/A)(U/A)ノナマーを有する。このタイプのAREを含有する分子としては、GM−CSFおよびTNF−aが挙げられる。クラスIIIのAREは、あまり明確にされていない。これらのUリッチ領域は、AUUUAモチーフを含有しない。c−Junおよびミオゲニンは、十分に研究されたこのクラスの例の2つである。AREに結合するほとんどのタンパク質がメッセンジャーを脱安定化することが公知である一方、ELAVファミリーのメンバー、特に注目すべきHuRがmRNAの安定性を増加させることが報告されている。HuRは、3つ全てのクラスのAREに結合する。HuR特異的結合部位を核酸分子の3’UTR中にエンジニアリングすることにより、HuR結合、したがってインビボでのメッセージの安定化をもたらす。
一部の実施形態において、本発明の合成ポリヌクレオチドは、3’UTR中のmiRNA結合部位を含む。マイクロRNA(またはmiRNA)は、核酸分子の3’UTRに結合し、核酸分子安定性を低減させること、または翻訳を阻害することのいずれかにより遺伝子発現を下方制御する19〜25ヌクレオチド長の非コードRNAである。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、1つ以上のマイクロRNA標的配列、マイクロRNA配列、マイクロRNA結合部位、またはマイクロRNAシードを含み得る。このような配列は、任意の公知のマイクロRNA、例えば、米国特許出願公開第2005/0261218号明細書および米国特許出願公開第2005/0059005号明細書に教示のもの、または2013年1月31日に出願された同時係属出願の米国特許出願第61/758,921号明細書(代理人整理番号2030.1039)の表7に列記のものに対応し得、これらの内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
マイクロRNA配列は、「シード」領域、すなわち、成熟マイクロRNAの2〜8位の領域中の配列を含み、この配列は、miRNA標的配列に対して完全なワトソン・クリック相補性を有する。マイクロRNAシードは、成熟マイクロRNAの2〜8位または2〜7位を含み得る。一部の実施形態において、マイクロRNAシードは、7つのヌクレオチド(例えば、成熟マイクロRNAのヌクレオチド2〜8)を含み得、対応するmiRNA標的中のこのシード相補的部位は、マイクロRNA1位と反対のアデニン(A)によりフランキングされる。一部の実施形態において、マイクロRNAシードは、6つのヌクレオチド(例えば、成熟マイクロRNAのヌクレオチド2〜7)を含み得、対応するmiRNA標的中のシード相補的部位は、マイクロRNA1位と反対のアデニン(A)によりフラ
ンキングされる。例えば、グリムソン A.(Grimson A)、ファース KK(Farh KK)、ジョンストン WK(Johnston WK)、ガーレット−エンゲレ P)(Garrett−Engele P)、リム LP(Lim LP)、バーテル DP(Bartel DP)著、モレキュラー・セル(Mol Cell)、2007年、7月6日、第27巻(第1号)、p.91〜105参照。マイクロRNAシードの塩基は、標的配列との完全な相補性を有する。マイクロRNA標的配列を本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの3’UTR中にエンジニアリングすることにより、分解または翻訳低減のためにこの分子を標的化することができるが、但し、当該マイクロRNAが利用可能であることを条件とする。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険を低減させる。マイクロRNA、マイクロRNA標的領域、およびそれらの発現パターンの同定、ならびに生物学におけるそれらの役割が報告されている(ボノエ(Bonauerら著、カレント・ドラッグ・ターゲッツ(Curr Drug Targets)、2010年、第11巻、p.943〜949;アナンド(Anand)およびチェレシュ(Cheresh)著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー(Curr Opin Hematol)、2011年、第18巻、p.171〜176;コントレラス(Contreras)およびラオ(Rao)著、リューケミア(Leukemia)、2012年、第26巻、p.404〜413(2011年、12月20日.doi:10.1038/leu.201 1.356);バーテル(Bartel)著、セル(Cell)、2009年、第136巻、p.215〜233;ランドグラフ(Landgraf)ら著、セル(Cell)、2007年、第129巻、p.1401〜1414)。
−7、miR−30c)、心臓(miR−1d、miR−149)、腎臓(miR−192、miR−194、miR−204)、および肺上皮細胞(let−7、miR−133、miR−126)が挙げられる。
追加のウイルス配列、例えば、限定されるものではないが、大麦縞萎縮ウイルス(BYDV−PAV)の翻訳エンハンサー配列をエンジニアリングし、本発明の合成ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの3’UTR中に挿入すること
ができ、インビトロおよびインビボで構築物の翻訳を刺激し得る。形質移入実験を関連細胞系において実施することができ、ELISAによりタンパク質産生を形質移入後12時間、24時間、48時間、72時間、および7日目においてアッセイすることができる。
本発明の合成ポリヌクレオチドは、5’キャッピング領域または5’キャップを含み得る。mRNAの5’キャップ構造は核外輸送に関与し、mRNAの安定性を増加させ、mRNAキャップ結合タンパク質(CBP)に結合し、これはCBPとポリ(A)結合タンパク質との会合を介して細胞中のmRNA安定性および翻訳適格性を担い、成熟環状mRNA種を形成する。このキャップは、mRNAスプライシングの間に5’近位のイントロンの除去をさらに支援する。
供する。
さらに、内部リボソーム進入部位(IRES)を含有し得る合成ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAが提供される。最初に特徴的なピコルナウイルスRNAとして同定されたIRESは、5’キャップ構造の不存在下でタンパク質合成の開始における重要な役割を担う。IRESは、mRNAの唯一のリボソーム結合部位として作用し得、または複数のリボソーム結合部位の1つとして機能し得る。2つ以上の機能的リボソーム結
合部位を含有する合成ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、リボソームにより独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る(「ポリシストロン性核酸分子」)。ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAにIRESが提供される場合、第2の翻訳可能領域がさらに場合により提供される。本発明により使用することができるIRES配列の例としては、限定されるものではないが、ピコルナウイルス(例えば、FMDV)、ペストウイルス(CFFV)、ポリオウイルス(PV)、脳心筋炎ウイルス(ECMV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、古典的ブタコレラウイルス(CSFV)、マウス白血病ウイルス(MLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)またはコオロギ麻痺ウイルス(CrPV)からのものが挙げられる。
一実施形態において、本発明の一次構築物は、3’非翻訳領域(UTR)の前に少なくとも2つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、TGA、TAAおよびTAGから選択することができる。一実施形態において、本発明の一次構築物は、終止コドンTGAおよび1つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態において、追加の終止コドンは、TAAであり得る。
シグナル配列
一次構築物またはmmRNAは、ポリペプチドの治療関連部位への輸送を容易にする追加の特徴部もコードし得る。タンパク質輸送を支援するそのような1つの特徴部は、シグナル配列である。本明細書において使用される場合、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、それぞれ、コード領域またはコードされるポリペプチドの5’(またはN末端)において取り込まれる、それぞれ、約9〜200ヌクレオチド長(3〜60アミノ酸長)のポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加は、1つ以上の分泌経路を通るコードされるポリペプチドの小胞体への輸送をもたらす。一部のシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによりタンパク質から開裂される。
Biologics);2012年4月2日に出願された米国仮特許出願第61/618,866号明細書、表題、抗体の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies);2012年8月10日に出願された米国仮特許出願第61/681,647号明細書、表題、抗体の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of
Antibodies);2012年12月14日に出願された米国仮特許出願第61/737,134号明細書、表題、抗体の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production
of Antibodies);2012年4月2日に出願された米国仮特許出願第61/618,868号明細書、表題、ワクチンの産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines); 2012年8月10日に出願された米国仮特許出願第61/681,648号明細書、表題、ワクチンの産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines);2012年12月14日に出願された米国仮特許出願第61/737,135号明細書、表題、ワクチンの産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines);2012年4月2日に出願された米国仮特許出願第61/618,870号明細書、表題、治療タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for
the Production of Therapeutic Proteins and Peptides);2012年8月10日に出願された米国仮特許出願第61/681,649号明細書、表題、治療タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the
Production of Therapeutic Proteins and Peptides);2012年12月14日に出願された米国仮特許出願第61/737,139号明細書、治療タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides);2012年4月2日に出願された米国仮特許出願第61/618,873号明細書、表題、分泌タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins);2012年8月10日に出願された米国仮特許出願第61/681,650号明細書、表題、分泌タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins);2012年12月14日に出願された米国仮特許出願第61/737,147号明細書、表題、分泌タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins);2012年4月2日に出願された米国仮特許出願第61/618,878号明細書、表題、細胞膜タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins);2012年8月10日に出願された米国仮特許出願第61/681,654号明細書、表題、細胞膜タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins);2012年12月14日に出願された米国仮特許出願第61/737,152号明細書、表題、細胞膜タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins);2012年4月2日に出願された米国仮特許出願第61/618,885号明細書、表題、細胞質および細胞骨格タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins); 2012年8月10日に出願された米国仮特許出願第61/681,658号明細書、表題、細胞質および細胞骨格タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic
and Cytoskeletal Proteins);2012年12月14日に
出願された米国仮特許出願第61/737,155号明細書、表題、細胞質および細胞骨格タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins);2012年4月2日に出願された米国仮特許出願第61/618,896号明細書、表題、細胞内膜結合タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular
Membrane Bound Proteins);2012年7月5日に出願された米国仮特許出願第61/668,157号明細書、表題、細胞内膜結合タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides
for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins);2012年8月10日に出願された米国仮特許出願第61/681,661号明細書、表題、細胞内膜結合タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins);2012年12月14日に出願された米国仮特許出願第61/737,160号明細書、表題、細胞内膜結合タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane
Bound Proteins);2012年4月2日に出願された米国仮特許出願第61/618,911号明細書、表題、核タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins);2012年8月10日に出願された米国仮特許出願第61/681,667号明細書、表題、核タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins);2012年12月14日に出願された米国仮特許出願第61/737,168号明細書、表題、核タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins);2012年4月2日に出願された米国仮特許出願第61/618,922号明細書、表題、タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of
Proteins);2012年8月10日に出願された米国仮特許出願第61/681,675号明細書、表題、タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Proteins);2012年12月14日に出願された米国仮特許出願第61/737,174号明細書、表題、タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Proteins);2012年4月2日に出願された米国仮特許出願第61/618,935号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with
Human Disease);2012年8月10日に出願された米国仮特許出願第61/681,687号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease);2012年12月14日に出願された米国仮特許出願第61/737,184号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for
the Production of Proteins Associated w
ith Human Disease);2012年4月2日に出願された米国仮特許出願第61/618,945号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for
the Production of Proteins Associated with Human Disease);2012年8月10日に出願された米国仮特許出願第61/681,696号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease);2012年12月14日に出願された米国仮特
許出願第61/737,191号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated
with Human Disease);2012年4月2日に出願された米国仮特許出願第61/618,953号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated
with Human Disease);2012年8月10日に出願された米国仮特許出願第61/681,704号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease);2012年12月14日に出願された米国仮特許出願第61/737,203号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease)、2013年3月9日に出願された国際出願第PCT/US2013/030062号明細書、表題、生物製剤およびヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease);2013年3月9日に出願された国際出願第PCT/US2013/030063号明細書、表題、修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides);国際出願第PCT/US2013/030064号明細書、表題、分泌タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins);2013年3月9日に出願された国際出願第PCT/US2013/030059号明細書、表題、膜タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins);2013年3月9日に出願された国際出願第PCT/US2013/030066号明細書、表題、細胞質および細胞骨格タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins);2013年3月9日に出願された国際出願第PCT/US2013/030067号明細書、表題、核タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins);2013年3月9日に出願された国際出願第PCT/US2013/030060号明細書、表題、タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modifie
d Polynucleotides for the Production of Proteins);2013年3月9日に出願された国際出願第PCT/US2013/030061号明細書、表題、ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease);2013年3月9日に出願された国際出願第PCT/US2013/030068号明細書、表題、化粧タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides);および2013年3月9日に出願された国際出願第PCT/US2013/030070号明細書、表題、癌関連タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド(Modified Polynucleotides for the Production of Oncology−Related Proteins and Peptides);2013年3月15日に出願された国際出願第PCT/US2013/031821号明細書、表題、タンパク質のインビボ産生(In Vivo Production of Proteins)、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAによるコードのために取り込むことができるタンパク質シグナル配列としては、α−1−抗トリプシン、G−CSF、第IX因子、プロラクチン、アルブミン、HMMSP38、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、シトクロムCオキシダーゼサブユニット8A、III型、細菌、ウイルス、分泌シグナル、Vrg−6、PhoA、OmpA、STI、STII、アミラーゼ、アルファ因子、エンドグルカナーゼV、分泌シグナル、真菌、フィブロネクチンおよびインターロイキン(例えば、IL12)からのシグナル配列が挙げられる。
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも1つのタンパク質開裂部位を含有する少なくとも1つのタンパク質開裂シグナルを含み得る。タンパク質開裂部位は、N末端およびC末端間の任意の空間において、例えば、限定されるものではないが、N末端およびC末端間の中間、N末端および中間点間、中間点およびC末端間、ならびにそれらの組合せにおいてN末端、C末端において局在させることができる。
サブチリシン様セリンプロテイナーゼ、ならびにサブチリシンケキシンアイソザイム1(SKI−1)およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシンケキシン9(PCSK9)と呼ばれる非塩基性残基において開裂する他の2つのサブチラーゼを含む9つのプロテイナーゼのファミリーである。
非限定的な例として、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第7,374,930号明細書および米国特許出願公開第20090227660号明細書は、フーリン開裂部位を使用して発現産物中のGLP−1のN末端メチオニンをその細胞のゴルジ装置から開裂する。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも1つのタンパク質開裂シグナルおよび/または部位を含むが、但し、ポリペプチドがGLP−1でないことを条件とする。
一実施形態において、本発明の一次構築物またはmmRNAは、少なくとも1つのコードされるタンパク質開裂シグナルおよび/または部位を含むが、但し、一次構築物もmmRNAもGLP−1をコードしないことを条件とする。
、式中、A、BおよびCは、同一もしくは異なるコード領域であり得、および/または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコード領域であり、XおよびYは、同一もしくは異なるタンパク質開裂シグナルをコードし得るコードされるタンパク質開裂シグナルである。
本発明の合成ポリヌクレオチドは、典型的には、3’テーリング配列、例えば、ポリAテールを含む。RNAプロセシングの間、長いアデニンヌクレオチド鎖(ポリAテール)は、安定性を増加させるためにポリヌクレオチド、例えば、mRNA分子に付加することができる。転写直後、転写物の3’末端が開裂されて3’ヒドロキシルを遊離させ得る。次いで、ポリAポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をRNAに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、100から250残基長であり得るポリAテールを付加する。
一般に、本発明のポリAテールの長さは、30ヌクレオチド長を超える。別の実施形態において、ポリAテールは、35ヌクレオチド長を超える(例えば、少なくとも約35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、および3,000ヌクレオチド長であり、またはそれらを超える)。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、約30〜約3,000個のヌクレオチド(例えば、30〜50、30〜100、30〜250、30〜500、30〜750、30〜1,000、30〜1,500、30〜2,000、30〜2,500、50〜100、50〜250、50〜500、50〜750、50〜1,000、50〜1,500、50〜2,000、50〜2,500、50〜3,000、100〜500、100〜750、100〜1,000、100〜1,500、100〜2,000、100〜2,500、100〜3,000、500〜750、500〜1,000、500〜1,500、500〜2,000、500〜2,500、500〜3,000、1,000〜1,500、1,000〜2,000、1,000〜2,500、1,000〜3,000、1,500〜2,000、1,500〜2,500、1,500〜3,000、2,000〜3,000、2,000〜2,500、および2,500〜3,000個)を含む。
構築物またはmmRNAの一部として設計することもできる。これに関して、ポリAテールは、構築物の全長または構築物の全長からポリAテールを差し引いた長さの10、20、30、40、50、60、70、80、または90%またはそれより長いものであり得る。さらに、結合部位のエンジニアリングおよびポリA結合タンパク質のためのポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAのコンジュゲーションは、発現を向上させ得る。
本発明はまた、合成小分子ガイドRNAまたはsgRNAを含む。合成sgRNAは、目的遺伝子、例えば、転写のモジュレーションが望まれる遺伝子を標的化する。合成sgRNAは、典型的には、転写開始部位上流の目的遺伝子の5’UTRの一方の鎖に相補的な20〜25ヌクレオチド長の配列を含む。合成sgRNAは、ガイド足場配列も含む。典型的なガイド足場配列は、以下のとおりである。
sgRNA配列の例は、以下の表に見出すことができる。
sgRNAは、目的遺伝子を標的化し、合成ポリヌクレオチドによりコードされるCRISPR関連タンパク質を目的遺伝子と相互作用するように指向する。目的遺伝子は、適用に応じて選択される。目的遺伝子の例としては、VEGF、TPO、および/またはアポトーシス遺伝子もしくは老化遺伝子が挙げられる。
本発明の合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAは、任意の利用可能な技術、例として、限定されるものではないが、化学的合成;一般にインビトロ転写(IVT)と称される酵素的合成;またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的開裂などにより調製することができる。RNAを合成する方法は、当分野において公知である(例えば、ゲイト,M.
J.(Gait,M.J.)編、「オリゴヌクレオチド合成:実践アプローチ(Oligonucleotide synthesis:a practical approach)」、オックスフォード[オックスフォードシャー]、ワシントンDC:IRLプレス、1984年;およびヘルデウィジン,P.(Herdewijn,P.)編、「オリゴヌクレオチド合成:方法および応用(Oligonucleotide synthesis:methods and applications)」、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods in Molecular Biology)、v.288(クリフトン、ジュージャージ)、トトワ、ニュージャージ、ヒュマーナプレス、2005年参照;これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる)。
遺伝子構築のステップは、限定されるものではないが、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミド線形化およびクリーンアップ、ならびにcDNAテンプレート合成およびクリーンアップを含み得る。
nologies))および/またはDNA2.0(メンロパーク、カルフォルニア)からのサービスが挙げられる。一実施形態において、ORF配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。それぞれのアミノ酸についてのコドンオプションが表1に挙げられる。
テンプレート付加のためのオリゴ(dT)配列を含み得る3’UTRによりフランキングすることができる。
次いで、CRISPR関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドまたはsgRNAをコードする一次構築物を含有するベクターを増幅させ、当分野において公知の方法、例えば、限定されるものではないが、インビトロジェン(Invitrogen)ピュアリンク(PURELINK)(商標)ハイピュア・マキシプレップキット(HiPure Maxiprep Kit)(カールスバッド、カリフォルニア)を使用するマキシプレップを使用してプラスミドを単離および精製する。
次いで、当分野において公知の方法、例えば、限定されるものではないが、制限酵素および緩衝液の使用を使用してプラスミドを線形化することができる。線形化反応物は、例えば、インビトロジェン(Invitrogen)のピュアリンク(PURELINK)(商標)PCRマイクロキット(PCR Micro Kit)(カールスバッド、カリフォルニア)、ならびにHPLCベース精製法、例えば、限定されるものではないが、強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)、ならびにインビトロジェン(Invitrogen)の標準ピュアリンク(PURELINK)(商標)PCRキット(PCR Kit)(カールスバッド、カリフォルニア)を含む方法を使用して精製することができる。精製法は、実施された線形化反応物のサイズに応じて改変することができる。次いで、線形化されたプラスミドは、インビトロ転写(IVT)反応のためのcDNAを生成するために使用する。
cDNAテンプレートは、線形化されたプラスミドをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に供することにより合成することができる。2013年3月9日に出願された米国特許出願第13/791,922号明細書の表4は、本発明のPCR反応において有用であり得るプライマーおよびプローブの一覧を提供する。この一覧が網羅的ではなく、任意の増幅のためのプライマー−プローブ設計が当分野の技術の範囲内であることを理解されたい。プローブは、標的分子に対する塩基対合フィデリティおよび塩基対合強度を増加させるための化学修飾塩基も含有し得る。
mRNA産生
合成ポリヌクレオチドまたはsgRNA産生のプロセスとしては、限定されるものではないが、インビトロ転写、cDNAテンプレート除去およびRNAクリーンアップ、ならびにRNAキャッピング領域および/またはテーリング反応を挙げることができる。あるいは、合成ポリヌクレオチドまたはsgRNAは、化学合成することができる。
先のステップにおいて産生されたcDNAは、インビトロ転写(IVT)系を使用して
転写させることができる。この系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸(NTP)、RNアーゼ阻害剤およびポリメラーゼを含む。NTPは、インハウスで製造することができ、供給業者から選択することができ、または本明細書に記載のとおり合成することができる。NTPは、限定されるものではないが、本明細書に記載のもの、例として、天然および非天然(修飾)NTPから選択することができる。ポリメラーゼは、限定されるものではないが、T7RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼおよび突然変異ポリメラーゼ、例えば、限定されるものではないが、修飾核酸を取り込み得るポリメラーゼから選択することができる。転写系中に無機ピロホスファターゼを含めることができる。
本発明の一次構築物の設計において、任意の数のRNAポリメラーゼまたはバリアントを使用することができる。
’UTRの後に、少なくとも1つの置換および/または挿入を、一次構築物のRNAポリメラーゼ結合または認識部位の上流、RNAポリメラーゼ結合または認識部位の下流、TATAボックス配列の上流、TATAボックス配列の下流であるが、一次構築物のコード領域の上流に含むように設計することができる。
よび/または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかにより置換することができる。
cDNAテンプレートは、当分野において公知の方法、例えば、限定されるものではないが、デオキシリボヌクレアーゼI(DNアーゼI)による処理を使用して除去することができる。RNAクリーンアップとしては、精製法、例えば、限定されるものではないが、ベックマン・コールタ(Beckman Coulter)(ダンバース、マサチューセッツ)からのアジェンコート(AGENCOURT)(登録商標)CLEANSEQ(登録商標)システム;HPLCベース精製法、例えば、限定されるものではないが、強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)を挙げることもできる。
一次構築物またはmmRNAは、キャッピングおよび/またはテーリング反応に供することもできる。キャッピング反応は、5’キャップを一次構築物の5’末端に付加する当分野において公知の方法により実施することができる。キャッピングのための方法としては、限定されるものではないが、ワクシニアキャッピング酵素(ニュー・イングランド・バイオラブズ(New England Biolabs)、イプスウィッチ、マサチューセッツ)の使用が挙げられる。
合成ポリヌクレオチドまたはsgRNAの精製としては、限定されるものではないが、mRNAまたはmmRNAクリーンアップ、品質保証および品質管理を挙げることができる。RNAクリーンアップは、当分野において公知の方法、例えば、限定されるものではないが、アジェンコート(AGENCOURT)(登録商標)ビーズ(ベックマン・コールタ・ゲノミクス(Beckman Coulter Genomics)、ダンバース、マサチューセッツ);ポリTビーズ;LNA(商標)オリゴT捕捉プローブ(エキシクオン(EXIQON)(登録商標)社、ベスベック(Vedbaek)、デンマーク);HPLCベース精製法、例えば、限定されるものではないが、強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)またはRNAアーゼIII処理(RNAアーゼIIIによるmRNAの処理の非限定的な例は、メイス(Meis)ら、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第2013102203号パンフレットにより記載されている)により実施することができる。用語「精製された」、例えば、「精製されたRNA」は、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、少なくとも1つの汚染物質から分離されるものを指す。本明細書において使用される場合、「汚染物質」は、別の物質を不適切、不純または劣性にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)は、天然に見出される形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製法に供する前に存在した形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境において存在する。
別の実施形態において、RNAは、限定されるものではないが、逆転写酵素PCRなどの方法を使用して配列決定することができる。
本発明の合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAは、典型的には修飾されている。本明細書において、ポリヌクレオチド(例えば、合成ポリヌクレオチドまたはsgRNA)において、用語「修飾」または適宜「修飾されている」は、A、G、UまたはCリボヌクレオチドに関する修飾を指す。一般に、本明細書において、これらの用語は、天然存在5’末端mRNAキャップ部分中のリボヌクレオチド修飾を指すものではない。修飾の例は、例えば、内容が全ての目的のために参照により組み込まれる2012年10月3日に出願された米国特許出願第13/644,072号明細書(米国特許出願公開第20130115272号明細書として公開)に見出すことができる。
ランキング領域および/または末端領域は、1、2、または2つより多い(場合により異なる)ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有し得る。一部の実施形態において、細胞に導入された修飾ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、未修飾ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと比較して低減した細胞中の分解を示し得る。
Uses Thereof)に記載の式IからIXまたはそれらの任意の下位構造のものを有するn数の結合ヌクレオシドを含む。このような構造は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する修飾、またはそれらの組合せを含む。
nd Nucleic Acids,and Uses Thereof)に記載のものに教示されるものが挙げられる。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、シュードウリジン(ψ)、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−アザ−ウリジン、6−アザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオ−ウリジン(s2U)、4−チオ−ウリジン(s4U)、4−チオ−シュードウリジン、2−チオ−シュードウリジン、5−ヒドロキシ−ウリジン(ho5U)、5−アミノアリル−ウリジン、5−ハロ−ウリジン(例えば、5−ヨード−ウリジンまたは5−ブロモ−ウリジン)、3−メチル−ウリジン(m3U)、5−カルボキシメチル−ウリジン(cm5U)、1−カルボキシメチル−シュードウリジン、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン(chm5U)、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル(mchm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−ウリジン(mcm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオ−ウリジン(mcm5s2U)、5−アミノメチル−2−チオ−ウリジン(nm5s2U)、5−メチルアミノメチル−ウリジン(mnm5U)、5−メチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(mnm5s2U)、5−メチルアミノメチル−2−セレノ−ウリジン(mnm5se2U)、5−カルバモイルメチル−ウリジン(ncm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン(cmnm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(cmnm5s2U)、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−シュードウリジン、5−タウリノメチル−ウリジン(τm5U)、1−タウリノメチル−シュードウリジン、5−タウリノメチル−2−チオ−ウリジン(τm5s2U)、1−タウリノメチル−4−チオ−シュードウリジン、5−メチル−ウリジン(m5U、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有するもの)、1−メチルシュードウリジン(m1ψ)、5−メチル−2−チオ−ウリジン(m5s2U)、1−メチル−4−チオ−シュードウリジン(m1s4ψ)、4−チオ−1−メチル−シュードウリジン、3−メチル−シュードウリジン(m3ψ)、2−チオ−1−メチル−シュードウリジン、1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジヒドロシュードウリジン、5,6−ジヒドロウリジン、5−メチル−ジヒドロウリジン(m5D)、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロシュードウリジン、2−メトキシ−ウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−シュードウリジン、4−メトキシ−2−チオ−シュードウリジン、N1−メチル−シュードウリジン、3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)シュードウリジン(acp3ψ)、5−(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2−チオ−ウリジン(inm5s2U)、α−チオ−ウリジン、2’−O−メチル−ウリジン(Um)、5,2’−O−ジメチル−ウリジン(m5Um)、2’−O−メチル−シュードウリジン(ψm)、2−チオ−2’−O−メチル−ウリジン(s2Um)、5−メトキシカルボニルメチル−2’−O−メチル−ウリジン(mcm5Um)、5−カルバモイルメチル−2’−O−メチル−ウリジン(ncm5Um)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2’−O−メチル−ウリジン(cmnm5Um)、3,2’−O−ジメチル−ウリジ
ン(m3Um)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2’−O−メチル−ウリジン(inm5Um)、1−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、2’−F−アラ−ウリジン、2’−F−ウリジン、2’−OH−アラ−ウリジン、5−(2−カルボメトキシビニル)ウリジン、および5−[3−(1−E−プロペニルアミノ)ウリジンが挙げられる。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、2−アミノ−プリン、2、6−ジアミノプリン、2−アミノ−6−ハロ−プリン(例えば、2−アミノ−6−クロロ−プリン)、6−ハロ−プリン(例えば、6−クロロ−プリン)、2−アミノ−6−メチル−プリン、8−アジド−アデノシン、7−デアザ−アデニン、7−デアザ−8−アザ−アデニン、7−デアザ−2−アミノ−プリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノ−プリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2,6−ジアミノプリン、1−メチル−アデノシン(m1A)、2−メチル−アデニン(m2A)、N6−メチル−アデノシン(m6A)、2−メチルチオ−N6−メチル−アデノシン(ms2m6A)、N6−イソペンテニル−アデノシン(i6A)、2−メチルチオ−N6−イソペンテニル−アデノシン(ms2i6A)、N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(io6A)、2−メチルチオ−N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(ms2io6A)、N6−グリシニルカルバモイル−アデノシン(g6A)、N6−トレオニルカルバモイル−アデノシン(t6A)、N6−メチル−N6−トレオニルカルバモイル−
アデノシン(m6t6A)、2−メチルチオ−N6−トレオニルカルバモイル−アデノシン(ms2g6A)、N6,N6−ジメチル−アデノシン(m6 2A)、N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(hn6A)、2−メチルチオ−N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(ms2hn6A)、N6−アセチル−アデノシン(ac6A)、7−メチル−アデニン、2−メチルチオ−アデニン、2−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、2’−O−メチル−アデノシン(Am)、N6,2’−O−ジメチル−アデノシン(m6Am)、N6,N6,2’−O−トリメチル−アデノシン(m6 2Am)、1,2’−O−ジメチル−アデノシン(m1Am)、2’−O−リボシルアデノシン(リン酸)(Ar(p))、2−アミノ−N6−メチル−プリン、1−チオ−アデノシン、8−アジド−アデノシン、2’−F−アラ−アデノシン、2’−F−アデノシン、2’−OH−アラ−アデノシン、およびN6−(19−アミノ−ペンタオキサノナデシル)−アデノシンが挙げられる。
デニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、デアザグアニン、7−デアザグアニン、3−デアザグアニン、デアザアデニン、7−デアザアデニン、3−デアザアデニン、ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、イミダゾ[1,5−a]1,3,5トリアジノン、9−デアザプリン、イミダゾ[4,5−d]ピラジン、チアゾロ[4,5−d]ピリミジン、ピラジン−2−オン、1,2,4−トリアジン、ピリダジン;および1,3,5トリアジンを挙げることもできる。ヌクレオチドがA、G、C、TまたはUの略語を使用して示される場合、それぞれの文字は代表的な塩基および/またはその誘導体を指し、例えば、Aとしては、アデニン、またはアデニン類似体、例えば、7−デアザアデニンが挙げられる。
を含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA分子中のウラシルまたはウリジン(一般にU)は、約1%〜約100%の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン(例えば、1%〜20%、1%〜25%、1%〜50%、1%〜60%、1%〜70%、1%〜80%、1%〜90%、1%〜95%、10%〜20%、10%〜25%、10%〜50%、10%〜60%、10%〜70%、10%〜80%、10%〜90%、10%〜95%、10%〜100%、20%〜25%、20%〜50%、20%〜60%、20%〜70%、20%〜80%、20%〜90%、20%〜95%、20%〜100%、50%〜60%、50%〜70%、50%〜80%、50%〜90%、50%〜95%、50%〜100%、70%〜80%、70%〜90%、70%〜95%、70%〜100%、80%〜90%、80%〜95%、80%〜100%、90%〜95%、90%〜100%、および95%〜100%の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン)により置き換えることができる。修飾ウラシルまたはウリジンは、単一のユニーク構造を有する化合物または異なる構造(例えば、本明細書に記載の2、3、4つまたはそれより多いユニーク構造)を有する複数の化合物により置き換えることができる。
は約100%)。
Targeting Using RNA Constructs)に記載の修飾であり得る。
V.医薬組成物:製剤化、投与、送達および投薬
一実施形態において、本発明は、1つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤との組合せの合成ポリヌクレオチドおよび/またはsgRNA組成物および複合体を含む。医薬組成物は、場合により、1つ以上の追加の活性物質、例えば、治療的および/または予防的に活性な物質を含み得る。医薬剤の製剤化および/または製造における一般の考慮事項は、例えば、レミントン(Remington)著、「製薬の科学および実践(The Science and Practice of Pharmacy)、第21版、リッペンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス(Lippincott Williams
& Wilkins)、2005年(参照により全体として本明細書に組み込まれる)に見出すことができる。
一実施形態において、合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAが製剤化される。非限定的な例として、合成ポリヌクレオチドおよび/または合成sgRNAは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、2013年3月14日に出願された国際公開第2013090648号パンフレットおよび/または同時係属米国仮特許出願第61/821,406号明細書、表題、修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸組成物の製剤化および送達(Formulation and Delivery of Modified Nucleoside,Nucleotide,and Nucleic Acid Compositions)、2013年5月9日に出願された米国仮特許出願第61/821,406号明細書、表題、修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸組成物の製剤化および送達(Formulation and Delivery of Modified Nucleoside,Nucleotide,and Nucleic Acid Compositions)および2013年6月28日に出願された米国仮特許出願第61/840,510号明細書、表題、修飾ヌクレオシド、ヌクレ
オチド、および核酸組成物の製剤化および送達(Formulation and Delivery of Modified Nucleoside,Nucleotide,and Nucleic Acid Compositions)に記載の方法により製剤化することができる。
本発明の合成ポリヌクレオチドおよび/または合成sgRNAは、:(1)安定性を増加させ;(2)細胞形質移入を増加させ;(3)(例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのデポー製剤からの)持続放出もしくは遅延放出を可能とし;(4)生体分布を変更し(例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを規定の組織または細胞型に標的化する);(5)コードされるタンパク質の翻訳をインビボで増加させ;および/または(6)コードされるタンパク質の放出プロファイルをインビボで変更するために、1つ以上の賦形剤を使用して製剤化することができる。慣習的な賦形剤、例えば、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤に加え、本発明の賦形剤は、限定されるものではないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA(例えば、対象中への移植のために)で形質移入された細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子ミミックおよびそれらの組合せを含み得る。したが
って、本発明の製剤は、1つ以上の賦形剤を含み得、それぞれは一緒にポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAの安定性を増加させ、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAによる細胞形質移入を増加させ、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAによりコードされるタンパク質の発現を増加させ、および/またはポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAによりコードされるタンパク質の放出プロファイルを変更する量である。さらに、本発明の一次構築物およびmmRNAは、自己集合性核酸ナノ粒子を使用して製剤化することができる。
リピドイドの合成は詳細に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの送達に特に好適である(マホン(Mahon)ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー(Bioconjug Chem.)、2010年、第21巻、p.1448〜1454;シュローダ(Schroeder)ら著、ジャーナル・オブ・インターナル・メディシン(J Intern Med.)、2010年、第267巻、p.9〜21;アキンク(Akinc)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nat Biotechnol.)、2008年、第26巻、p.561〜569;ラブ(Love)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci U.S.A.)、2010年、第107巻、p.1864〜1869;ジークワルト(Siegwart)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci U.S.A.)、2011年、第108巻、p.12996〜3001参照;これらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
Sci U.S.A.)、2010年、第107巻、p.1864〜1869;ロイシュナー(Leuschner)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nat Biotechnol.)、2011年、第29巻、p.1005〜1010参照;これらの全ては全体として本明細書に組み込まれる)、本開示は、一本鎖ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの送達におけるそれらの製剤化および使用を記載する。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソームまたは粒子を調製することができ、したがって、局所および/または全身投与経路を介するリピドイド製剤の注射後に、コードされるタンパク質の産生により判断されるとおり、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの有効な送達をもたらすことができる。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのリピドイド複合体は、種々の手段、例として、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、または皮下経路により投与することができる。
著な効果をもたらし得る。様々なリピドイド、例として、限定されるものではないが、ペンタ[3−(1−ラウリルアミノプロピオニル)]−トリエチレンテトラミン塩酸塩(TETA−5LAP(別称98N12−5)、ムルガイア(Murugaiah)ら著、アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)、第401巻、第61号、2010年参照)、C12−200(誘導体およびバリアントを含む)、およびMD1を有する製剤をインビボ活性について試験することができる。
細胞送達のために所望され得る一方(参照により本明細書に組み込まれる、アキンク(Akinc)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2009年、第17巻、p.872〜879参照)、製剤を他の細胞型、例として、限定されるものではないが、内皮細胞、骨髄細胞、および筋肉細胞に送達するためのリピドイド製剤化ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの使用は、同様にサイズ制限されない場合がある。siRNAをインビボで他の非肝細胞、例えば、骨髄細胞および内皮に送達するためのリピドイド製剤の使用が報告されている(参照により全体として本明細書に組み込まれる、アキンク(Akinc)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nat Biotechnol.)、2008年、第26巻、p.561〜569;ロイシュナー(Leuschner)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nat Biotechnol.)、2011年、第29巻、p.1005〜1010;チョウ(Cho)ら著、アドバンスド・ファンクショナル・マテリアルズ(Adv.Funct.Mater.)、2009年、第19巻、p.3112〜3118;第8回国際ユダ・フォークマン・カンファレンス(International Judah Folkman Conference)、ケンブリッジ、マサチューセッツ、10月8〜9日、2010年参照)。骨髄細胞、例えば、単球への有効な送達、リピドイド製剤は、類似の構成要素モル比を有し得る。リピドイドと、他の構成要素、例として、限定されるものではないが、ジステロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン、コレステロール、およびPEG−DMGとの異なる比は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの製剤を異なる細胞型、例として、限定されるものではないが、肝細胞、骨髄細胞、筋肉細胞などへの送達のために最適化するために使用することができる。例えば、構成要素モル比としては、限定されるものではないが、50%のC12−200、10%のジステロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン、38.5%のコレステロール、および%1.5のPEG−DMGを挙げることができる(ロイシュナー(Leuschner)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nat Biotechnol.)、2011年、第29巻、p.1005〜1010参照;参照により全体として本明細書に組み込まれる)。皮下または筋肉内送達のいずれかを介する核酸の細胞(例えば、限定されるものではないが、脂肪細胞および筋肉細胞)への局所送達のためのリピドイド製剤の使用は、全身送達に所望される製剤構成要素の全てを必要とするわけではない場合があり、したがって、リピドイドおよびポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのみを含み得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、1つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化することができる。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層から構成され得、栄養素および医薬製剤の投与のための送達ビヒクルとして使用することができる人工的に調製された小胞である。リポソームは、様々なサイズのもの、例えば、限定されるものではないが、直径数百ナノメートルであり得、狭い水性の区画により分離される一連の同心状二重層を含有し得る多層小胞(MLV)、直径50nmより小さい場合がある小型単細胞小胞(SUV)、および直径50〜500nmであり得る大型単層小胞(LUV)であり得る。リポソーム設計とし
ては、限定されるものではないが、非健常組織へのリポソームの付着を改善するため、またはイベント、例えば、限定されるものではないが、エンドサイトーシスを活性化するための、オプソニンまたはリガンドを挙げることができる。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために低pHまたは高pHを含有し得る。
Therapy)、1999年、第6巻、p.1438〜1447;ジェフズ(Jeffs)ら著、ファーマシューティカル・リサーチ(Pharm Res.)、2005年、第22巻、p.362〜372;モリセイ(Morrissey)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nat Biotechnol.)、2005年、第2巻、p.1002〜1007;ジマーマン(Zimmermann)ら著、ネイチャー(Nature)、2006年、第441巻、p.111〜114;ヘイエス(Heyes)ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース(J Contr Rel.)、2005年、第107巻、p.276〜287;センプル(Semple)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech.)、2010年、第28巻、p.172〜176;ジャッジ(Judge)ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J Clin Invest.)、2009年、第119巻、p.661〜673;ド・フジュロル(deFougerolles)著、ヒューマン・ジーン・セラピー(Hum Gene Ther.)、2008年、第19巻、p.125〜132参照;これらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる)。ホイーラ(Wheeler)らによる元の製造法は、洗浄剤透析法であり、それは後にジェフズ(Jeffs)らにより改善され、自発的小胞形成法と称される。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに加え、3〜4つの脂質構成要素から構成される。例としてリポソームは、限定されるものではないが、ジェフズ(Jeffs)らにより記載されるとおり、55%のコレステロール、20%のジステロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン(DSPC)、10%のPEG−S
−DSG、および15%の1,2−ジオレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DODMA)を含有し得る。別の例として、あるリポソーム製剤は、ヘイエス(Heyes)らにより記載されるとおり、限定されるものではないが、48%のコレステロール、20%のDSPC、2%のPEG−c−DMA、および30%のカチオン性脂質を含有し得、このカチオン性脂質は、1,2−ジステアールオキシ(distearloxy)−N,N−ジメチルアミノプロパン(DSDMA)、DODMA、DLin−DMA、または1,2−ジリノレニルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)であり得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物および/またはmmRNAは、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化することができる。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当分野において公知の方法により、および/または参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第20120178702号明細書に記載のとおり達成することができる。非限定的な例として、ポリカチオンとしては、カチオン性ペプチドまたはポリペプチド、例えば、限定されるものではないが、ポリリジン、ポリオルニチンおよび/またはポリアルギニンを挙げることができる。別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物および/またはmmRNAは、中性脂質、例えば、限定されるものではないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)をさらに含み得る、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化することができる。
ット、同第2011022460号パンフレット、同第2012061259号パンフレット、同第2012054365号パンフレット、同第2012044638号パンフレット、同第2010080724号パンフレット、同第201021865号パンフレットおよび同第2008103276号パンフレット、米国特許第7,893,302号明細書および同第7,404,969号明細書、ならびに米国特許出願公開第20100036115号明細書に記載のカチオン性脂質から選択することができる。別の実施形態において、カチオン性脂質は、限定されるものではないが、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第2012040184号パンフレット、同第2011153120号パンフレット、同第2011149733号パンフレット、同第2011090965号パンフレット、同第2011043913号パンフレット、同第2011022460号パンフレット、同第2012061259号パンフレット、同第2012054365号パンフレットおよび同第2012044638号パンフレットに記載の式Aから選択することができる。さらに別の実施形態において、カチオン性脂質は、限定されるものではないが、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第2008103276号パンフレットの式CLI〜CLXXIX、米国特許第7,893,302号明細書の式CLI〜CLXXIX、米国特許第7,404,969号明細書の式CLI〜CLXXXXIIおよび米国特許出願公開第20100036115号明細書の式I〜VIから選択することができる。非限定的な例として、カチオン性脂質は、(20Z,23Z)−N,N−ジメチルノナコサ−20,23−ジエン−10−アミン、(17Z,20Z)−N,N−ジメミルヘキサコサ(dimemylhexacosa)−17,20−ジエン−9−アミン、(1Z,19Z)−N5N−ジメチルペンタコサ−16,19−ジエン−8−アミン、(13Z,16Z)−N,N−ジメチルドコサ−13J16−ジエン−5−アミン、(12Z,15Z)−NJN−ジメチルヘニコサ−12,15−ジエン−4−アミン、(14Z,17Z)−N,N−ジメチルトリコサ−14,17−ジエン−6−アミン、(15Z,18Z)−N,N−ジメチルテトラコサ−15,18−ジエン−7−アミン、(18Z,21Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ−18,21−ジエン−10−アミン、(15Ζ,18Ζ)−Ν,Ν−ジメチルテトラコサ−15,18−ジエン−5−アミン、(14Z,17Z)−N,N−ジメチルトリコサ−14,17−ジエン−4−アミン、(19Z,22Z)−N,N−ジメイヒルオクタコサ(dimeihyloctacosa)−19,22−ジエン−9−アミン、(18Z,21Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ−18,21−ジエン−8−アミン、(17Z,20Z)−N,N−ジメチルヘキサコサ−17,,20−ジエン−7−アミン、(16Z;19Z)−N,N−ジメチルペンタコサ−16,19−ジエン−6−アミン、(22Z,25Z)−N,N−ジメチルヘントリアコンタ−22,25−ジエン−10−アミン、(21Z,24Z)−N;N−ジメチルトリアコンタ−21,24−ジエン−9−アミン、(18Z)−N,N−ジメチルヘプタコス−18−エン−10−アミン、(17Z)−N,N−ジメチルヘキサコス−17−エン−9−アミン、(19Z,22Z)−NJN−ジメチルオクタコサ−19,22−ジエン−7−アミン、N,N−ジメチルヘプタコサン−10−アミン、(20Z,23Z)−N−エチル−N−メチルノナコサ−20J23−ジエン−10−アミン、1−[(11Z,14Z)−1−ノニルイコサ−11,14−ジエン−1−イル]ピロリジン、(20Z)−N,N−ジメチルヘプタコス−20−エン−10−アミン、(15Z)−N,N−ジメチルエプタコス(eptacos)−15−エン−10−アミン、(14Z)−N,N−ジメチルノナコス−14−エン−10−アミン、(17Z)−N,N−ジメチルノナコス−17−エン−10−アミン、(24Z)−N,N−ジメチルトリトリアコント−24−エン−10−アミン、(20Z)−N,N−ジメチルノナコス−20−エン−10−アミン、(22Z)−N,N−ジメチルヘントリアコンタ−22−エン−10−アミン、(16Z)−N,N−ジメチルペンタコサ−16−エン−8−アミン、(12Z,15Z)−N,N−ジメチル−2−ノニルヘニコサ−12,15−ジエン−1−アミン、(13Z,16Z)−N,N−ジメチル−3−ノニルドコサ−13,16−ジエン−1−アミン、N,N−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オク
チルシクロプロピル]エプタデカン(eptadecan)−8−アミン、1−[(1S,2R)−2−ヘキシルシクロプロピル]−N,N−ジメチルノナデカン−10−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ノナデカン−10−アミン、N,N−ジメチル−21−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘニコサン−10−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2S)−2−{[(1R,2R)−2−ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]ノナデカン−10−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘキサデカン−8−アミン、Ν,Ν−ジメチルH−[(1R,2S)−2−ウンデシルシクロプロピル]テトラデカン−5−アミン、N,N−ジメチル−3−{7−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘプチル}ドデカン−1−アミン、1−[(1R,2S)−2−ヘプチルシクロプロピル]−Ν,Ν−ジメチルオクタデカン−9−アミン、1−[(1S,2R)−2−デシルシクロプロピル]−N,N−ジメチルペンタデカン−6−アミン、N,N−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ペンタデカン−8−アミン、R−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、S−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−{2−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−1−[(オクチルオキシ)メチル]エチル}ピロリジン、(2S)−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−[(5Z)−オクタ−5−エン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、1−{2−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−1−[(オクチルオキシ)メチル]エチル}アゼチジン、(2S)−1−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、(2S)−1−(ヘプチルオキシ)−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデク−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−(ノニルオキシ)−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−[(9Z)−オクタデカ−9−エン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン(化合物9);(2S)−N,N−ジメチル−1−[(6Z,9Z,12Z)−オクタデカ−6,9,12−トリエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(ペンチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−(ヘキシルオキシ)−3−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、1−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−Ν,Ν−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−[(13Z,16Z)−ドコサ−l3,16−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−[(13Z,16Z)−ドコサ−13,16−ジエン−1−イルオキシ]−3−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、(2S)−1−[(13Z)−ドコサ−13−エン−1−イルオキシ]−3−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、1−[(13Z)−ドコス−13−エン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−[(9Z)−ヘキサデク−9−エン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2R)−N,N−ジメチル−H(1−メトイルオクチル)オキシ]−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、(2R)−1−[(3,7−ジメチルオクチル)オキシ]−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、N,N−ジメチル−1−(オクチルオキシ)−3−({8−[(1S,2S)−2−{[(1R,2R)−2−ペンチルシクロプロピル]メチル}シ
クロプロピル]オクチル}オキシ)プロパン−2−アミン、N,N−ジメチル−1−{[8−(2−オクチルシクロプロピル)オクチル]オキシ}−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミンおよび(11E,20Z,23Z)−N,N−ジメチルノナコサ−11,20,2−トリエン−10−アミンまたはそれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体から選択することができる。
明細書に記載の修飾RNAのインビボおよび/またはインビトロでの送達に使用することができる。
一実施形態において、ナノ化学種、ポリマーおよび免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することにより免疫応答を誘発することができる(米国特許出願公開第20120189700号明細書および国際公開第2012099805号パンフレット;それぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる)。ポリマーは、ナノ化学種を封入しても、ナノ化学種を部分的に封入してもよい。
−ラクチド−co−PEO−co−D,L−ラクチド)、ポリ(D,L−ラクチド−co−PPO−co−D,L−ラクチド)、ポリアルキルシアノアクラレート(cyanoacralate)、ポリウレタン、ポリ−L−リジン(PLL)、ヒドロキシプロピルメタクリレート(HPMA)、ポリエチレングリコール、ポリ−L−グルタミン酸、ポリ(ヒドロキシ酸)、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ(エステルアミド)、ポリアミド、ポリ(エステルエーテル)、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレンおよびポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリアルキレンオキシド(PEO)、ポリアルキレンテレフタレート、例えば、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えば、ポリ(酢酸ビニル)、ハロゲン化ポリビニル、例えば、ポリ(塩化ビニル)(PVC)、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン(PS)、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ(メチル(メタ)アクリレート)(PMMA)、ポリ(エチル(メタ)アクリレート)、ポリ(ブチル(メタ)アクリレート)、ポリ(イソブチル(メタ)アクリレート)、ポリ(ヘキシル(メタ)アクリレート)、ポリ(イソデシル(メタ)アクリレート)、ポリ(ラウリル(メタ)アクリレート)、ポリ(フェニル(メタ)アクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)、ポリ(オクタデシルアクリレート)ならびにそれらのコポリマーおよび混合物、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ(オルト)エステル、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)、ポリ(ラクチド−co−カプロラクトン)、およびトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、コポリマー、例えば、限定されるものではないが、ブロックコポリマー、および(ポリ(エチレングリコール)−(ポリ(プロピレンオキシド)−(ポリ(エチレングリコール)トリブロックコポリマー(例えば、米国特許出願公開第20120121718号明細書および米国特許出願公開第20100003337号明細書参照;それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる)によりコーティングし、またはそれと会合させることができる。コポリマーは、一般に安全と認められる(GRAS)ポリマーであり得、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学実体が作出されないような手法であり得る。例えば、脂質ナノ粒子は、新たな化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液に急速に透過し得るポロキサマーコーティングPLGAナノ粒子を含み得る(ヤン(Yang)ら著、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション(Angew.Chem.Int.Ed.)、2011年、第50巻、p.2597〜2600;参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
ブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、サイモシンβ4ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン)および種々のDNアーゼ、例として、rhDNアーゼを含み得る。表面変質剤は、粒子の表面中に包埋もしくは捕捉させ、または脂質ナノ粒子の表面上に(例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスにより)配置することができる(例えば、米国特許出願公開第20100215580号明細書および米国特許出願公開第20080166414号明細書参照;これらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
型、例として、限定されるものではないが、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、および白血球にインビボで指向されるようにも構築することができ、または組成を変更することができる(アキンク(Akinc)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2010年、第18巻、p.1357〜1364;ソング(Song)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnol.)、2005年、第23巻、p.709〜717;ジャッジ(Judge)ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J Clin Invest.)、2009年、第119巻、p.661〜673;カウフマン(Kaufmann)ら著、マイクロバスキュラー・リサーチ(Microvasc Res)、2010年、第80巻、p.286〜293;サンテル(Santel)ら著、ジーン・セラピー(Gene
Ther)、2006年、第13巻、p.1222〜1234;サンテル(Santel)ら著、ジーン・セラピー(Gene Ther)、2006年、第13巻、p.1360〜1370;グトビエル(Gutbier)ら著、パルモナリー・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス(Pulm Pharmacol.Ther.)、2010年、第23巻、p.334〜344;バシャ(Basha)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2011年、第19巻、p.2186〜2200;フェンスケ(Fenske)およびクリス(Cullis)著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー(Expert Opin Drug Deliv.)、2008年、第5巻、p.25〜44;ピア(Peer)ら著、サイエンス(Science)、2008年、第319巻、p.627〜630;ピア(Peer)およびリーバーマン(Lieberman)、ジーン・セラピー(Gene Ther.)、2011年、第18巻、p.1127〜1133;これらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる)。肝臓細胞に対する製剤の受動的な標的化の一例としては、DLin−DMA、DLin−KC2−DMAおよびMC3ベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられ、それらはアポリポタンパク質Eに結合し、インビボでそれらの製剤の結合および肝細胞中への取り込みを促進することが示されている(アキンク(Akinc)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2010年、第18巻、p.1357〜1364;参照により全体として本明細書に組み込まれる)。製剤は、限定されるものではないが、ホレート、トランスフェリン、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)、および抗体標的化アプローチにより例として示されるそれらの表面上の異なるリガンドの発現を介して選択的に標的化させることもできる(コルハトカル(Kolhatkar)ら著、カレント・ドラッグ・ディスカバリー・テクノロジーズ(Curr Drug Discov
Technol.)、2011年、第8巻、p.197〜206;ムサッチオ(Musacchio)およびトルチリン(Torchilin)著、フロンティアズ・イン・バイオサイエンス(Front Biosci.)、2011年、第16巻、p.1388〜1412;ユウ(Yu)ら著、モレキュラー・メンブレン・バイオロジー(Mol Membr Biol.)、2010年、第27巻、p.286〜298;パチル(Patil)ら著、クリティカル・レビューズ・イン・セラピューティク・ドラッグ・キャリア・システム(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.)、2008年、第25巻、p.1〜61;ベノア(Benoit)ら著、バイオマクロモレキュールズ(Biomacromolecules)、2011年、第12巻、p.2708〜2714 シャオ(Zhao)ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー(Expert Opin Drug Deliv.)、2008年、第5巻、p.309〜319;アキンク(Akinc)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2010年、第18巻、p.1357〜1364;スリニバサン(Srinivasan)ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods Mol Biol.)、2012年、第820巻、p.105〜116;ベン−アリー(Ben−Arie)ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods Mol Biol.)、2012年、第757巻、p.497〜507;ピア(Peer)、2010年、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース(J Con
trol Release)、第20巻、p.63〜68;ピア(Peer)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci U.S.A.)、2007年、第104巻、p.4095〜4100;キム(Kim)ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods Mol Biol.)、2011年、第721巻、p.339〜353;スブラマンヤ(Subramanya)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2010年、第18巻、p.2028〜2037;ソング(Song)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nat.Biotechnol.)、2005年、第23巻、p.709〜717;ピア(Peer)ら著、サイエンス(Science)、2008年、第319巻、p.627〜630;ピア(Peer)およびリーバーマン(Lieberman)著、ジーン・セラピー(Gene Ther.)、2011年、第18巻、p.1127〜1133;これらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99、または99.99%超が、送達剤中に封入される。
細書、同第20110274759号明細書、同第20100068286号明細書、ならびに米国特許第8,206,747号明細書に記載の方法により製剤化することができる。別の実施形態において、治療ポリマーナノ粒子は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20120140790号明細書に記載の方法により同定することができる。
粒子は、PEGおよびPLAまたはPEGおよびPLGAのジブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である(米国特許第8,246,968号明細書参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
一実施形態において、治療ナノ粒子は、少なくとも1つのアミン含有ポリマー、例えば、限定されるものではないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ(アミドアミン)デンドリマーおよびそれらの組合せを含み得る。
一実施形態において、治療ナノ粒子は、癌を標的化するために使用することができる水溶液中で製剤化することができる(国際公開第2011084513号パンフレットおよび米国特許出願公開第20110294717号明細書参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
1ベースの応答を向上させ得るTh1免疫賦活剤を含み得る(国際公開第2010123569号パンフレットおよび米国特許出願公開第20110223201号明細書参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、天然および/または合成ポリマーを使用して製剤化することができる。送達に使用することができるポリマーの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ミルス(MIRUS)(登録商標)バイオ(Bio)(マディソン、ウィスコンシン)およびロシュ・マディソン(Roche Madison)(マディソン、ウィスコンシン)からのダイナミック・ポリコンジュゲート(Dynamic POLYCONJUGATE)(商標)製剤、ファゼルクス(PHASERX)(商標)ポリマー製剤、例えば、限定されるものではないが、スマート・ポリマー・テクノロジー(SMARTT POLYMER TECHNOLOGY)(商標)(シアトル、ワシントン)、DMRI/DOPE、ポロキサマー、ヴィカル(Vical)(サンディエゴ、カリフォルニア)からのヴァクスフェクチン(VAXFECTIN)(登録商標)アジュバント、キトサン、カランド・ファーマシューティカルズ(Calando Pharmaceuticals)(パサデナ、カリフォルニア)からのシクロデキストリン、デンドリマーおよびポリ(乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)ポリマー、ロンデル(RONDEL)(商標)(RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達)ポリマー(アローヘッド・リサーチ・コーポレーション(Arrowhead
Research Corporation)、パサデナ、カリフォルニア)ならびにpH応答性コブロックポリマー、例えば、限定されるものではないが、ファゼルクス(PHASERX)(商標)(シアトル、ワシントン)が挙げられる。
ピー(Hum Gene Ther.)、2008年、第19巻、p.125〜132において概説される)。核酸(この場合、小分子干渉RNA(siRNA)を用いて)のロバストなインビボ送達をもたらした2つのポリマーアプローチは、ダイナミックポリコンジュゲート(dynamic polyconjugate)およびシクロデキストリンベースのナノ粒子である。これらの送達アプローチの第1のアプローチは、ダイナミックポリコンジュゲート(dynamic polyconjugate)を使用し、マウスにおいてインビボでsiRNAを有効に送達し、肝細胞内で内因性標的mRNAをサイレンシングすることが示されている(ロゼマ(Rozema)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci U.S.A.)、2007年、第104巻、p.12982〜12887)。この特定のアプローチは、多成分ポリマー系であり、その重要な特徴部として、核酸(この場合、siRNA)がジスルフィド結合を介して共有結合しており、PEG(電荷遮蔽のため)基およびN−アセチルガラクトサミン(肝細胞標的化のため)基の両方がpH感受性結合を介して結合している膜活性ポリマーが挙げられる(ロゼマ(Rozema)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci U.S.A.)、2007年、第104巻、p.12982〜12887)。肝細胞に結合し、エンドソームに進入すると、ポリマー複合体は低pH環境中で解体し、このポリマーがその陽電荷を露出し、エンドソームからの脱出、およびポリマーから細胞質へのsiRNAの放出をもたらす。N−アセチルガラクトサミン基のマンノース基による置き換えを介して、アシアロ糖タンパク質受容体を発現する肝細胞から、類洞内皮細胞およびクッパー細胞に標的化を変更し得ることが示された。別のポリマーアプローチは、トランスフェリン標的化シクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子を使用することを含む。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体を発現するユーイング肉腫腫瘍細胞中でEWS−FLI1遺伝子産物の標的化サイレンシングを実証しており(フウ−リエスコファン(Hu−Lieskovan)ら著、キャンサー・リサーチ(Cancer Res.)、2005年、第65巻、p.8984〜8982)、これらのナノ粒子中に製剤化されたsiRNAは、非ヒト霊長類において良好に忍容された(ヘイデル(Heidel)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci
U.S.A.)、2007年、第104巻、p.5715〜21)。これらの送達戦略の両方は、標的化送達機構およびエンドソームからの脱出機序の両方を使用する合理的なアプローチを取り込む。
、2011年、第2巻、p.133〜147;ド・フジュロル(deFougerolles)著、ヒューマン・ジーン・セラピー(Hum Gene Ther.)、2008年、第19巻、p.125〜132;シャフェルト(Schaffert)およびウェグナー(Wagner)著、ジーン・セラピー(Gene Ther.)、2008年、第16巻、p.1131〜1138;シャツルベディ(Chaturvedi)ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー(Expert Opin Drug Deliv.)、2011年、第8巻、p.1455〜1468;デービス(Davis)著、モレキュラー・ファーマシューティカルズ(Mol Pharm.)、2009年、第6巻、p.659〜668;デービス(Davis)著、ネイチャー(Nature)、2010年、第464巻、p.1067〜1070;それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
982〜12887;デービス(Davis)著、モレキュラー・ファーマシューティカルズ(Mol Pharm.)、2009年、第6巻、p.659〜668;デービス(Davis)著、ネイチャー(Nature)、2010年、第464巻、p.1067〜1070;それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
ロタミン、ポリラクチドおよびポリ(ラクチド−co−グリコリド)とともにコポリマーまたはブロックコポリマーを形成することができる。生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーは、当分野において公知の方法および/またはそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第8,057,821号明細書もしくは米国特許出願公開第2012009145号明細書に記載の方法により作製することができる。例えば、マルチブロックコポリマーは、分枝鎖状ポリエチレンイミンと比較して区別されるパターンを有する直鎖状ポリエチレンイミン(LPEI)ブロックを使用して合成することができる。さらに、組成物または医薬組成物は、当分野において公知の方法、本明細書に記載の方法、またはそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第20100004315号明細書もしくは米国特許第6,267,987号明細書および同第6,217,912号明細書に記載の方法により作製することができる。
チジン)、ポリ(アルギニン)、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン(DOTAP)、N−[1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、1−[2−(オレオイルオキシ)エチル]−2−オレイル−3−(2−ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド(DOTIM)、2,3−ジオレイルオキシ−N−[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]−N,N−ジメチル−1−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩(DOSPA)、3B−[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレステロール塩酸塩(DC−コレステロールHCl)ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン(DOGS)、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N−(1,2−ジミリスチルオキシプロプ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチル塩化アンモニウムDODAC)およびそれらの組合せを挙げることができる。
Rel.)、2010年、第142巻、p.416〜421;リー(Li)ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース(J Contr Rel.)、2012年、第158巻、p.108〜114;ヤン(Yang)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2012年、第20巻、p.609〜615)。この送達系は、siRNAの送達を改善するために標的化ナノ粒子と、エンドソームからの脱出を向上させるための構成要素リン酸カルシウムとの両方を組み合わせる。
本発明の合成ポリヌクレオチドおよび/または合成sgRNAは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによる細胞の形質移入を増加させるためにペプチドおよび/またはタンパク質とともに製剤化することができる。一実施形態において、医薬製剤を送達するため、ペプチド、例えば、限定されるものではないが、細胞透過性ペプチドならびに細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチドを使用することができる。本発明の医薬製剤とともに使用することができる細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、細胞内空間への送達を容易にする、ポリカチオンに付着している細胞透過性ペプチド配列、例えば、HIV由来TATペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはhCT由来細胞透過性ペプチドが挙げられる(例えば、カロン(Caron)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol.Ther.)、第3巻(第3号)、p.310〜8、2001年、ランゲル(Langel)著、「細胞浸透ペプチド:プロセスおよび用途(Cell−Penetrating Peptides:Processes and Applications)」(CRCプレス、ボカラトン、フロリダ、2002年)、エルアンダロウシ(El−Andaloussi)ら著、カレント・ファーマシューティカル・デザイン(Curr.Pharm.Des.)、第11巻(第28号)、p.3597〜611、2003年、およびデシャイエズ(Deshayes)ら著、セルラー・アンド・モレキュラー・ライフ・サイエンシズ(Cell.Mol.Life Sci.)、第62巻(第16号)、p.1839〜49、2005年参照、それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる)。組成物は、組成物の細胞内空間への送達を向上させる細胞透過性薬剤、例えば、リポソームを含むように製剤化することもできる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、細胞内送達を可能にするため、ペプチドおよび/またはタンパク質、例えば、限定されるものではないが、アイレロン・セラピューティクス(Aileron Therapeutics)(ケンブリッジ、マサチ
ューセッツ)およびペルメオン・バイオロジクス(Permeon Biologics)(ケンブリッジ、マサチューセッツ)からのペプチドおよび/またはタンパク質に複合体形成することができる(クロニカン(Cronican)ら著、ACSケミカルバイオロジー(ACS Chem Biol.)、2010年、第5巻、p.747〜752;マクノートン(McNaughton)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)、2009年、第106巻、p.6111〜6116;ソーヤ(Sawyer)著、ケミカル・バイオロジー・アンド・ドラッグ・デザイン(Chem Biol Drug Des.)、2009年、第73巻、p.3〜6;ヴェルディン(Verdine)およびヒリンスキ(Hilinski)著、メソッズ・イン・エンジモロジー(Methods Enzymol.)、2012年、第503巻、p.3〜33;それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、エクスビボで細胞中に形質移入することができ、続いてそれを対象に移植する。非限定的な例として、医薬組成物は、修飾RNAを肝臓および骨髄細胞に送達するための赤血球、修飾RNAをウイルス様粒子(VLP)中で送達するためのビロソーム、ならびに修飾RNAを送達するためのエレクトロポレーション処理細胞、例えば、限定されるものではないが、マックスサイト(MAXCYTE)(登録商標)(ゲイザースバーグ、メリーランド)およびエリテック(ERYTECH)(登録商標)(リヨン、フランス)からの細胞を含み得る。mmRNA以外のペイロードを送達するための赤血球、ウイルス粒子およびエレクトロポレーション処理細胞の使用例が報告されている(ゴドフリン(Godfrin)ら著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー(Expert Opin Biol
Ther.)、2012年、第12巻、p.127〜133;ファン(Fang)ら著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー(Expert Opin Biol Ther.)、2012年、第12巻、p.385〜389;フウ(Hu)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci U.S.A.)、2011年、第108巻、p.10980〜10985;ランド(Lund)ら著、ファーマシューティカル・リサーチ(Pharm Res.)、2010年、第27巻、p.400〜420;フックリード(Huckriede)ら著、ジャーナル・オブ・リポソーム・リサーチ(J Liposome Res.)、2007年、第17巻、p.39〜47;クシ(Cusi)著、ヒューマン・ワクチン(Hum Vaccin)、2006年、第2巻、p.1〜7;ド・ジョンジュ(de Jonge)ら著、ジーン・セラピー(Gene Ther.)、2006年、第13巻、p.400〜411;それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの筋肉内または皮下局所注射は、ヒアルロナンの加水分解を触媒するヒアルロニダーゼを含み得る。間質性の関門の構成物質であるヒアルロナンの加水分解を触媒することにより、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それにより組織透過性を増加させる(フロスト(Frost)著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー(Expert Op
in.Drug Deliv.)、2007年、第4巻、p.427〜440;参照により全体として本明細書に組み込まれる)。それらの分散および形質移入細胞により産生されるコードタンパク質の全身への分布を加速することが有用である。あるいは、筋肉内または皮下投与された本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに曝露される細胞の数を増加させるため、ヒアルロニダーゼを使用することができる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、ナノ粒子ミミック内に封入し、および/またはそれに吸収させることができる。ナノ粒子ミミックは、生物または粒子、例えば、限定されるものではないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオンおよび細胞の送達機能を模倣し得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、ウイルスの送達機能を模倣し得る非バイロン(non−viron)粒子中に封入することができる(参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第2012006376号パンフレット参照)。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、少なくとも1つのナノチューブ、例えば、限定されるものではないが、ロゼットナノチューブ、リンカーを用いるツイン塩基(twin bases)を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブおよび/または単層カーボンナノチューブに付着またはそうでなければ結合させることができる。ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、力、例えば、限定されるものではないが、立体力、イオン力、共有結合力および/または他の力を介してナノチューブに結合させることができる。
少なくとも1つのポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAをロゼットナノチューブに付着またはそうでなければ結合させ得る条件下で、少なくとも1つのポリヌクレオチド、一次構築物および/またはmmRNAと混合する。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、コンジュゲート、例えば、担体もしくは標的化基に共有結合している、または融合タンパク質を一緒に産生する2つのコード領域を含む(例えば、標的化基および治療タンパク質またはペプチドを担持する)、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含む。
同第5,587,371号明細書;同第5,595,726号明細書;同第5,597,696号明細書;同第5,599,923号明細書;同第5,599,928号明細書および同第5,688,941号明細書;同第6,294,664号明細書;同第6,320,017号明細書;同第6,576,752号明細書;同第6,783,931号明細書;同第6,900,297号明細書;同第7,037,646号明細書が挙げられる。
ロックド核酸(LNA)、例えば、サンタリス(Santaris)からのものの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、以下のもの:米国特許第6,268,490号明細書;同第6,670,461号明細書;同第6,794,499号明細書;同第6,998,484号明細書;同第7,053,207号明細書;同第7,084,125号明細書;および同第7,399,845号明細書が挙げられる。
の5’位において作製することもできる。本発明のポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに糖模倣体、例えば、シクロブチル部分も有し得る。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,981,957号明細書;同第5,118,800号明細書;同第5,319,080号明細書;同第5,359,044号明細書;同第5,393,878号明細書;同第5,446,137号明細書;同第5,466,786号明細書;同第5,514,785号明細書;同第5,519,134号明細書;同第5,567,811号明細書;同第5,576,427号明細書;同第5,591,722号明細書;同第5,597,909号明細書;同第5,610,300号明細書;同第5,627,053号明細書、同第5,639,873号明細書;同第5,646,265号明細書;同第5,658,873号明細書;同第5,670,633号明細書;および同第5,700,920号明細書が挙げられる。
自己集合性ナノ粒子は、核酸鎖が容易にリプログラミング可能であり得るように正確に制御することができる、明確に定義されたサイズを有する。例えば、20nm超の直径が向上した透過性および保持効果を介して腎クリアランスを回避し、ある腫瘍への送達を向上させるため、癌標的化ナノ送達担体のために最適な粒子サイズは20〜100nmである。自己集合性核酸ナノ粒子を使用して、向上した送達のために癌標的化リガンドの正確に制御された空間配向および密度を有する、サイズおよび形が均一な単一の集団。非限定的な例として、オリゴヌクレオチドナノ粒子が、ショートDNA断片および治療siRNAのプログラミング可能な自己集合を使用して調製される。これらのナノ粒子は、制御可能な粒子サイズならびに標的リガンド局在および密度を有し、分子的に同一である。DNA断片およびsiRNAは、1ステップ反応に自己集合し、標的化インビボ送達のためにDNA/siRNA四面体ナノ粒子を生成した。(リー(Lee)ら著、ネイチャー・ナノテクノロジー(Nature Nanotechnology)、2012年、第7巻、p.389〜393)。
医薬製剤は、本明細書において使用される場合、所望される特定の剤形に好適なありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などが挙げられる薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含み得る。参照により全体として本明細書に組み込まれる、レミントン(Remington)著、「製薬の科学および実践(The Science and Practice of Pharmacy)」、第21版、A.R.ジェンナロ(A.R.Gennaro)、リッペンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス(Lippincott Williams & Wilkins)、ボルティモア、メリーランド、2006年参照;は、医薬組成物の製剤化において使用される種々の賦形剤およびそれらの調製のための公知の技術を開示する。例えば、任意の不所望な生体影響をもたらし、またはそうでなければ医薬組成物の任意の他の構成要素と有害な様式で相互作用することにより任意の慣用の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と不適合性であり得る場合を除き、その使用が本開示の範囲内であることが企図される。
も96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%純粋である。一部の実施形態において、賦形剤は、ヒトにおける使用および獣医学的使用に対して認可されている。一部の実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局(United States Food and Drug Administration)により認可されている。一部の実施形態において、賦形剤は、医薬品グレードである。一部の実施形態において、賦形剤は、米国薬局方(United States Pharmacopoeia(USP))、欧州薬局方(European Pharmacopoeia(EP))、英国薬局方(British Pharmacopoeia)、および/または国際薬局方(International Pharmacopoeia)の基準を満たしている。
ツイーン(TWEEN)(登録商標)80]、モノパルミチン酸ソルビタン[スパン(SPAN)(登録商標)40]、モノステアリン酸ソルビタン[スパン(SPAN)(登録商標)60]、トリステアリン酸ソルビタン[スパン(SPAN)(登録商標)65]、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン[スパン(SPAN)(登録商標)80])、ポリオキシエチレンエステル(例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン[MYRJ(登録商標)45]、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、およびソルトール(SOLUTOL)(登録商標))、スクロース糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル(例えば、クレモホル(CREMOPHOR)(登録商標))、ポリオキシエチレンエーテル、(例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル[BRIJ(登録商標)30])、ポリ(ビニル−ピロリドン)、モノラウリル酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、プルオリンク(PLUORINC)(登録商標)F68、ポロキサマー(POLOXAMER)(登録商標)188、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウムなど、ならびに/またはそれらの組合せが挙げられる。
ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール系化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、および/またはフェニルエチルアルコールが挙げられる。例示的な酸性保存剤としては、限定されるものではないが、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンE、ベータ−カロテン、クエン酸、酢酸、ジヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および/またはフィチン酸が挙げられる。他の保存剤としては、限定されるものではないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム(deteroxime)、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエンド(hydroxytoluened)(BHT)、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES)、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、グリダントプラス(GLYDANT PLUS)(登録商標)、フェノニップ(PHENONIP)(登録商標)、メチルパラベン、ゲルマール(GERMALL)(登録商標)115、ゲルマベン(GERMABEN)(登録商標)II、ネオロン(NEOLONE)(商標)、カトン(KATHON)(商標)、および/またはユーキシル(EUXYL)(登録商標)が挙げられる。
またはそれらの組合せが挙げられる。
送達
本開示は、薬物送達の科学進展を考慮する可能性の高い任意の適切な経路による治療、薬学、診断、またはイメージングのいずれかのためのポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの送達を包含する。送達は、ネイキッド送達でも製剤化送達でもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、ネイキッドで細胞に送達することができる。本明細書において使用される場合、「ネイキッド」は、形質移入を促進する薬剤を用いずにポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、修飾を含有し得ない。ネイキッドポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、当分野において公知であり、および本明細書に記載の投与経路を使用して細胞に送達することができる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、本明細書に記載の方法を使用して製剤化することができる。製剤は、修飾および/または未修飾であり得るポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを含有し得る。製剤は、限定されるものではないが、細胞透過剤、薬学的に許容可能な担体、送達剤、生体内分解性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポーをさらに含み得る。製剤化されたポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、当分野において公知であり、および本明細書に記載の投与経路を使用して細胞に送達することができる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、治療有効アウトカムをもたらす任意の経路により投与することができる。これらとしては、限定されるものではないが、経腸、経胃腸、硬膜外、経口、経皮、硬膜外(硬膜上)、脳内(大脳の中へ)、脳室内(脳室の中へ)、皮膚上(皮膚上への適用)、皮内、(皮膚自体の中へ)、皮下(皮膚の下)、経鼻投与(鼻を介して)、静脈内(静脈中へ)、動脈内(動脈中へ)、筋肉内(筋肉中へ)、心臓内(心臓中へ)、骨内輸注(骨髄中へ)、鞘内(脊柱管中へ)、腹腔内(腹腔の中への輸注または注射)、膀胱内輸注、硝子体内(眼を介して)、空洞内注射(陰茎基部中へ)、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮(全身への分布のための無傷の皮膚を介する拡散)、経粘膜(粘膜を介する拡散)、吸入(鼻からの吸引)、舌下、口唇下、浣腸、点眼(結膜上に)、または点耳におけるものが挙げられる。具体的な実施形態において、組成物は、それらが血液−脳関門、血管関門、または他の上皮関門を横断することを可能とするような手法で投与することもできる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAのための非限定的な投与経路は、以下に記載される。
経口および非経口投与のための液体剤形としては、限定されるものではないが、薬学的
に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシルが挙げられる。活性成分に加え、液体剤形は、当分野において一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸塩、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などを含み得る。不活性希釈剤の他、経口組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、矯味剤、および/または着香剤を含み得る。非経口投与のためのある実施形態において、組成物は、可溶化剤、例えば、クレモホル(CREMOPHOR)(登録商標)、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはそれらの組合せと混合される。
直腸または膣内投与のための組成物は、典型的に坐剤であり、それは組成物を、例えば、周囲温度において固体であるが、体温において液体であり、したがって直腸または膣腔中で溶解して活性成分を放出する好適な非刺激性賦形剤、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスと混合することにより調製することができる。
経口投与のための固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、ピル、散剤、および顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形において、活性成分は、少なくとも1つの不活性な薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムおよび
/または充填剤もしくは増量剤(例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸)、結合剤(例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシア)、保湿剤(例えば、グリセロール)、崩壊剤(例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、あるケイ酸塩、および炭酸ナトリウム)、溶解遅延剤(solution retarding agents)(例えば、パラフィン)、吸収促進剤(例えば、第四級アンモニウム化合物)、湿潤剤(例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール)、吸収剤(例えば、カオリンおよびベントナイト粘土)、ならびに滑沢剤(例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム)、ならびにそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤およびピルの場合、剤形は緩衝剤を含み得る。
本明細書に記載のとおり、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを含有する組成物は、局所投与のために製剤化することができる。皮膚は、それが容易に接近可能であるため、送達に理想的な標的部位であり得る。遺伝子発現は、皮膚に対して制限され、非特異的な毒性を潜在的に回避するだけでなく、皮膚内の特異的な層および細胞型に対しても制限され得る。
一実施形態において、局所および/または経皮投与の前に、透過性を増加させ得るデバイスおよび/または溶液に少なくとも1つの組織の区域、例えば、皮膚を供することができる。一実施形態において、組織は、皮膚の透過性を増加させるため、研磨デバイスに供することができる(参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20080275468号明細書参照)。別の実施形態において、組織は、超音波強化デバイスに供することができる。超音波強化デバイスとしては、限定されるものではないが、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20040236268号明細書ならびに米国特許第6,491,657号明細書および同第6,234,990号明細書に記載のデバイスを挙げることができる。組織の透過性を向上
させる方法は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20040171980号明細書および同第20040236268号明細書ならびに米国特許第6,190,315号明細書に記載されている。
成分の溶解度の限度ほど高くてよい。局所投与のための製剤は、本明細書に記載の追加の成分の1つ以上をさらに含み得る。
本明細書に記載のとおり、一部の実施形態において、組成物は、持続放出のためのデポー中に製剤化される。一般に、規定の器官または組織(「標的組織」)が、投与のために標的化される。
一実施形態において、本発明は、小型の使い捨て薬物リザーバまたはパッチポンプを使用して標的組織の付近で保持することができる。パッチポンプの非限定的な例としては、
BD(登録商標)(フランクリン・レイクス、ニュージャージ)、インスレット・コーポレーション(Insulet Corporation)(ベドフォード、マサチューセッツ)、ステディメッド・セラピューティクス(SteadyMed Therapeutics)(サンフランシスコ、カリフォルニア)、メドトロニック(Medtronic)(ミネアポリス、ミネソタ)、ユニライフ(UniLife)(ヨーク、ペンシルベニア)、ヴァレリタス(Valeritas)(ブリッジウォータ、ニュージャージ)、およびスプリングリーフ・セラピューティクス(SpringLeaf Therapeutics)(ボストン、マサチューセッツ)により製造および/または販売されるものが挙げられる。
医薬組成物は、口腔を介する肺投与に好適な製剤中に調製し、パッケージングし、および/または販売することができる。このような製剤は、活性成分を含み、約0.5nm〜約7nmまたは約1nm〜約6nmの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。このような組成物は、好適には、粉末を分散させるように噴射剤の流れを向けることができる乾燥粉末リザーバを含むデバイスを使用し、および/または自己噴射溶媒/粉末分注容器、例えば、密封容器中の低沸点噴射剤中で溶解および/もしくは懸濁させた活性成分を含むデバイスを使用する投与のために、乾燥粉末の形態である。このような粉末は、粒子の少なくとも98重量%が0.5nm超の直径を有し、粒子の少なくとも95%(数基準)が7nm未満の直径を有する、粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも95重量%は、1nm超の直径を有し、粒子の少なくとも90%(数基準)は、6nm未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、固体微粉末希釈剤、例えば、糖を含み得、それは単位用量形態で好都合に提供される。
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約0.2μm〜500μmの平均粒子を有する、粗粉である。このような製剤は、鼻からの吸入が行われる様式で、すなわち、鼻に近くに保持された粉末の容器からの鼻道を介する急速な吸入により投与される。
、頬側投与に好適な製剤中に調製し、パッケージングし、および/または販売することができる。このような製剤は、例えば、慣用の方法を使用して作製される錠剤および/またはロゼンジの形態であり得、例えば、0.1%〜20%(w/w)の活性成分であり得、残部は経口的に溶解性および/または分解性の組成物、ならびに場合により、本明細書に記載の追加の成分の1つ以上を含む。あるいは、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに/またはエアロゾル化および/もしくはアトマイズ化溶液および/もしくは懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化、および/またはエアロゾル化製剤は、分散される場合、約0.1nm〜約200nmの範囲の平均粒子および/または液滴サイズを有し得、本明細書に記載の任意の追加の成分の1つ以上をさらに含み得る。
医薬組成物は、眼内投与に好適な製剤中に調製し、パッケージングし、および/または販売することができる。このような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中に、例えば、0.1/1.0(w/w)%の活性成分の溶液および/または懸濁液を含む、点眼剤の形態であり得る。このような液滴は、緩衝剤、塩、および/または本明細書に記載の任意の追加の成分のもう1つ以上をさらに含み得る。有用である他の眼内投与可能な製剤としては、微小結晶形態でおよび/またはリポソーム製剤中に活性成分を含むものが挙げられる。点耳および/または点眼剤は、本発明の範囲内であると企図される。
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、物質(「ペイロード」)の生体標的への送達、例えば、標的の検出のための検出可能な物質の送達、または治療剤の送達が所望される多数の異なるシナリオにおいて使用することができる。検出方法としては、限定されるものではないが、インビトロおよびインビボイメージング法の両方、例えば、免疫組織化学、生物発光イメージング法(BLI)、磁気共鳴イメージング法(MRI)、ポジトロン放出断層撮影法(PET)、電子顕微鏡法、X線コンピュータ断層撮影法、ラマンイメージング、光干渉断層撮影法、吸収イメージング、熱イメージング、蛍光反射イメージング、蛍光顕微鏡法、蛍光分子トモグラフィーイメージング、核磁気共鳴イメージング、X線イメージング、超音波イメージング、光音響イメージング、研究室アッセイ、またはタグ付け/染色/イメージングが要求される任意の状況における方法を挙げることができる。
、無機化合物、ナノ粒子、酵素もしくは酵素基質、蛍光材料、発光材料(例えば、ルミノール)、生物発光材料(例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン)、化学発光材料、放射性材料(例えば、18F、67Ga、81mKr、82Rb、111In、123I、133Xe、201Tl、125I、35S、14C、3H、または99mTc(例えば、過テクネチウム酸塩(テクネチウム酸塩(VII)、TcO4 −として)、および造影剤(例えば、金(例えば、金ナノ粒子)、ガドリニウム(例えば、キレート化Gd)、酸化鉄(例えば、超常磁性酸化鉄(SPIO)、単結晶酸化鉄ナノ粒子(MION)、および超小型超常磁性酸化鉄(USPIO)、マンガンキレート(例えば、Mn−DPDP)、硫酸バリウム、ヨード系造影剤媒体(イオヘキソール(Iohexol))、微小気泡、またはペルフルオロ炭素)であり得る。このような光学検出可能な標識としては、例えば、限定されるものではないが、4−アセトアミド−4’−イソチオシアナトスチルベン−2,2’ジスルホン酸;アクリジンおよび誘導体(例えば、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート);5−(2’−アミノエチル)アミノナフタレン−1−スルホン酸(EDANS);4−アミノ−N−[3−ビニルスルホニル)フェニル]ナフタルイミド−3,5ジスルホネート;N−(4−アニリノ−1−ナフチル)マレイミド;アントラニルアミド;BODIPY;ブリリアントイエロー;クマリンおよび誘導体(例えば、クマリン、7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC、クマリン120)、および7−アミノ−4−トリフルオロメチルクマリン(クマリン151));シアニン色素;シアノシン;4’,6−ジアミニジノ−2−フェニルインドール(DAPI);5’5’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン(ブロモピロガロールレッド);7−ジエチルアミノ−3−(4’−イソチオシアナトフェニル)−4−メチルクマリン;ジエチレントリアミンペンタアセテート;4,4’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸;4,4’−ジイソチオシアナトスチルベン−2,2’−ジスルホン酸;5−[ジメチルアミノ]−ナフタレン−1−スルホニルクロリド(DNS、ダンシルクロリド);4−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−4’−イソチオシアネート(DABITC);エオシンおよび誘導体(例えば、エオシンおよびエオシンイソチオシアネート);エリスロシンおよび誘導体(例えば、エリスロシンBおよびエリスロシンイソチオシアネート);エチジウム;フルオロセインおよび誘導体(例えば、5−カルボキシフルオロセイン(FAM)、5−(4,6−ジクロロトリアジン−2−イル)アミノフルオロセイン(DTAF)、2’,7’−ジメトキシ−4’5’−ジクロロ−6−カルボキシフルオロセイン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、X−ローダミン−5−(および−6)−イソチオシアネート(QFITCまたはXRITC)、およびフルオレスカミン);2−[2−[3−[[1,3−ジヒドロ−1,1−ジメチル−3−(3−スルホプロピル)−2H−ベンズ[e]インドール−2−イリデン]エチリデン]−2−[4−(エトキシカルボニル)−1−ピペラジニル]−1−シクロペンテン−1−イル]エテニル]−1,1−ジメチル−3−(3−スルホルプロピル(sulforpropyl))−1H−ベンズ[e]インドリウム水酸化物、分子内塩、n,n−ジエチルエタンアミン(1:1)(IR144)との化合物;5−クロロ−2−[2−[3−[(5−クロロ−3−エチル−2(3H)−ベンゾチアゾール−イリデン)エチリデン]−2−(ジフェニルアミノ)−1−シクロペンテン−1−イル]エテニル]−3−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩(IR140);マラカイトグリーンイソチオシアネート;4−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン;ニトロチロシン;パラローズアニリン;フェノールレッド;B−フィコエリトリン;o−フタルジアルデヒド;ピレンおよび誘導体(例えば、ピレン、酪酸ピレン、およびスクシンイミジル1−ピレン);酪酸塩量子ドット;リアクティブレッド4(シバクロン(CIBACRON)(商標)ブリリアントレッド3B−A);ローダミンおよび誘導体(例えば、6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)、6−カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルクロリドローダミン(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンXイソチオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダミン101のスルホニルクロリド誘導体(テキサスレッド)、N,N,N’,N’
テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC);リボフラビン;ロゾール酸;テルビウムキレート誘導体;シアニン−3(Cy3);シアニン−5(Cy5);シアニン−5.5(Cy5.5)、シアニン−7(Cy7);IRD700;IRD800;アレクサ(Alexa)647;ラジョルタブルー(La Jolta Blue);フタロシアニン;ならびにナフタロシアニンが挙げられる。
ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、1つ以上の他の治療剤、予防剤、診断剤、またはイメージング剤との組合せで使用することができる。「との組合せで」は、薬剤を同時に投与され、および/または一緒に送達するために製剤化しなければならないことを意味するものではないが、これらの送達法は、本開示の範囲内にある。組成物は、1つ以上の他の所望の治療物または医療処置と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、それぞれの薬剤は、その薬剤のために決定された用量において、および/または時間スケジュールに基づき投与される。一部の実施形態において、本開示は、医薬、予防、診断、またはイメージング組成物を、それらの生体利用能を改善し、それらの代謝を低減させ、および/もしくは改変し、それらの排泄を阻害し、および/またはそれらの体内分布を改変し得る薬剤との組合せで送達することを包含する。非限定的な例として、ポリヌクレオチド、一次構築物および/またはmmRNAは、癌の治療のためまたは過剰増殖性細胞を制御するための医薬剤との組合せで使用することができる。参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第7,964,571号明細書において、リポポリマーとともにインターロイキン−12をコードするDNAプラスミドを含む医薬組成物を使用し、少なくとも1つの抗癌剤または化学療法剤も投与する、原発性または転移性固形腫瘍の治療のための併用療法が記載される。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明のポリヌクレオチド、一次構築物および/またはmmRNAは、リポポリマーとともに医薬組成物中に存在し得(例えば、抗増殖性分子をコードするDNAプラスミドおよびリポポリマーを含む医薬組成物を特許請求する、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20110218231号明細書参照)、それは少なくとも1つの化学療法剤または抗癌剤とともに投与することができる。
本発明は、本発明によるポリヌクレオチド、一次構築物および/またはmmRNAならびにそれらのコードされるタンパク質もしくは複合体を、それが必要とされる対象に投与することを含む方法を提供する。核酸、タンパク質もしくは複合体、またはその医薬、イメージング、診断、もしくは予防組成物は、疾患、障害、および/または病態(例えば、作業記憶障害に関連する疾患、障害、および/または状態)の予防、治療、診断、またはイメージングに有効な任意の量および任意の投与経路を使用して対象に投与することができる。要求される正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方式、その活性方式などに応じて対象ごとに変動する。本発明による組成物は、投与を容易にし、投薬量を均一にするために、典型的には、単位剤形に製剤化さ
れる。しかしながら、本発明の組成物の総1日使用量は、適切な医学的判断の範囲内で担当医が決定することができることが理解される。任意の特定の患者の特定の治療有効、予防有効、または適切なイメージング用量レベルは、種々の要素、例として、治療される障害および障害の重症度;用いられる規定の化合物の活性;用いられる規定の組成物;患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食生活;投与時間、投与経路、および用いられる規定の化合物の排泄速度;治療の持続期間;用いられる規定の化合物との組合せで、またはそれと同時に使用される薬物;ならびに医学分野において周知の同様の要素に依存する。
本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載の剤形、例えば、局所、鼻腔内、気管内、または注射用(例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下)に製剤化することができる。
非経口投与用の液体剤形としては、限定されるものではないが、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、液剤、懸濁液、シロップ剤、および/またはエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加え、液体剤形は、当分野で一般に使用される不活性希釈剤、例として、限定されるものではないが、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含み得る。非経口投与についてのある実施形態において、組成物は、可溶化剤、
例えば、クレモホル(CREMOPHOR)(登録商標)、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはそれらの組合せと混合することができる。
注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、公知技術に従って製剤化することができ、好適な分散化剤、湿潤剤、および/または懸濁化剤を含み得る。滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤および/または溶媒、例えば、1,3−ブタンジオール溶液中の滅菌注射用溶液、懸濁液、および/またはエマルションであり得る。用いることができる許容可能なビヒクルおよび溶媒としては、限定されるものではないが、水、リンゲル液、U.S.P.、および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。滅菌固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣用的に用いられる。この目的のため、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激固定油が用いることができる。注射剤の調製において、脂肪酸、例えば、オレイン酸を使用することができる。
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に使用することもできる。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約0.2μm〜500μmの平均粒子を有する粗粉であり得る。このような製剤は、鼻からの吸入が行われる様式で、すなわち鼻の近くに保持された粉末の容器からの鼻道を介する急速な吸入により投与することができる。
くは懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化、および/またはエアロゾル化製剤は、分散される場合、約0.1nm〜約200nmの範囲の平均粒子および/または液滴サイズを有し得、本明細書に記載の任意の追加の成分の1つ以上をさらに含み得る。
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、ピル、および顆粒剤の固体剤形は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶性コーティングおよび医薬製剤化分野において周知の他のコーティングにより調製することができる。これらは場合により、乳白剤を含み得、それらが腸管のある部分において、場合により、遅延様式で、活性成分のみを放出し、またはそれを優先的に放出する組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。類似のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用する軟および硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いることができる。
本明細書に記載の医薬組成物は、生物学的利用能、治療域および/または分布体積の1つ以上により特徴付けることができる。
ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、本明細書に記載の送達剤を用いて組成物に製剤化される場合、本明細書に記載の送達剤を欠く組成物と比較して、生物学的利用能の増加を示し得る。本明細書において使用される場合、用語「生物学的利用能」は、哺乳動物に投与されるポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの所与の量の全身利用能を指す。生物学的利用能は、化合物を哺乳動物に投与した後に、未変化形態の化合物の曲線下面積(AUC)または最大血清または血漿濃度(Cmax)を計測することにより評価することができる。AUCは、縦座標(Y軸)に沿った化合物の血清または血漿濃度を横座標(X軸)に沿った時間に対してプロットする曲線下面積の決定である。一般に、特定の化合物についてのAUCは、当業者に公知の方法、および参照により本明細書に組み込まれるG.S.バンカー(G.S.Banker)著、「現代の薬学、薬物および薬科学(Modern Pharmaceutics,Drugs and the
Pharmaceutical Sciences)」、第72巻、マーセル・デッカー、ニューヨーク社(Marcel Dekker,New York)、1996年に記載の方法を使用して算出することができる。
とも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%だけ増加し得る。
ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、本明細書に記載の送達剤を用いて組成物に製剤化される場合、本明細書に記載の送達剤を欠く投与されたポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNA組成物の治療域と比較して、投与されたポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNA組成物の治療域の増加を示し得る。本明細書において使用される場合、「治療域」は、治療的効果を誘発する可能性の高い、血漿濃度の範囲、または作用部位における治療活性物質のレベルの範囲を指す。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの治療域は、本明細書に記載の送達剤と同時投与される場合、少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%だけ増加し得る。
ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、本明細書に記載の送達剤を用いて組成物に製剤化される場合、本明細書に記載の送達剤を欠く組成物に対して分布体積(Vdist)の改善、例えば、低減または標的化を示し得る。分布体積(Vdist)は、体内の薬物の量を血液または血漿中の薬物の濃度と関連付ける。本明細書において使用される場合、用語「分布体積」は、血液または血漿中の濃度と同一の濃度において体内の薬物の総量を含有するために要求される液量を指し:Vdistは、体内の薬物の量/血液または血漿中の薬物の濃度に等しい。例えば、用量10mgおよび血漿濃度10mg/Lの場合、分布体積は1リットルである。分布体積は、薬物が血管外組織に存在する程度を反映する。大量の分布体積は、血漿タンパク質結合と比較して組織構成要素に結合する化合物の傾向を反映する。臨床現場において、負荷用量を決定し、定常状態濃度を達成するためにVdistを使用することができる。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの分布体積は、本明細書に記載の送達剤とともに同時投与される場合、少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%減少し得る。
一実施形態において、動物に送達される修飾mRNAの生物学的効果は、動物におけるタンパク質発現を分析することにより分類することができる。リプログラミングされるタンパク質発現は、本発明の修飾mRNAを投与した哺乳動物から回収された生体試料を分析することにより決定することができる。一実施形態において、哺乳動物に投与される修飾mRNAによりコードされる少なくとも50pg/mlの発現タンパク質が好ましくあり得る。例えば、哺乳動物に送達される修飾mRNAによりコードされるタンパク質の50〜200pg/mlのタンパク質発現が、哺乳動物における治療有効量のタンパク質とみなすことができる。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、1
つ以上の体液に由来するエキソソーム中で定量することができる。本明細書において使用される場合、「体液」は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便物質、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、囲心腔液、リンパ液、び汁、乳び、胆汁、間質液、月経分泌物、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水様便、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、ならびに臍帯血を含む。あるいは、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から回収することができる。
質量分析(MS)は、分子のイオン変換後の分子に関する構造質量および分子量/濃度情報を提供し得る分析技術である。分子は、最初にイオン化されて正または負電荷を得て、次いで、それらは質量分析器を通って移動して、それらの質量/電荷(m/z)比に従って検出器の異なる区域に到達する。
リング(MRM)または選択反応モニタリング(SRM)を使用して検出することができる。
る生体試料は、タンデムESIMS系(例えば、MS/MS)において、タンパク質について分析することができる。非限定的な例として、液滴は、産物スキャン(または娘スキャン)、前駆体スキャン(親スキャン)、中性損失または多重反応モニタリングを使用して分析することができる。
本発明の合成ポリヌクレオチドおよび/または合成sgRNAは、細胞の表現型を変更するために使用することができる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物およびmmRNAは、目的ポリペプチドを産生するためのペプチド、ポリペプチドまたは複数のタンパク質をコードし得る。目的ポリペプチドは、治療物および/または臨床および研究現場において使用することができる。非限定的な例として、目的ポリペプチドとしては、リプログラミング因子、分化因子および脱分化因子を挙げることができる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNA、例えば、本明細書に記載の修飾核酸および修飾RNA、ならびにそれらから翻訳されるタンパク質は、治療または予防剤として使用することができる。これらは、医薬、治療法および予防的治療における使用のために提供される。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNA(例えば、CRISPR関連ポリペプチドまたはタンパク質をコードする修飾mRNA)は、対象に投与することができ、このポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、インビボで翻訳されて治療または予防ポリペプチドを対象中で産生する。同様に、および場合により、上記との組合せにおいて、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNA(例えば、修飾sgRNAまたは複数のそれら)は、対象に投与することができ、このポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、CRISPR関連ポリペプチドまたはタンパク質により遺伝子編集をガイドする。)ヒトおよび他の哺乳動物における疾患または病態の診断、治療または予防のための組成物、方法、キット、および試薬が提供される。本発明の活性治療剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物もしくはmmRNA、ポリヌクレオチド、一次構築物もしくはmmRNAを含有する細胞またはポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAから翻訳されるポリペプチドを含む。
プチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する有効量の組成物が、場合により、少なくとも1つの構造もしくは化学修飾を有し、および/または標的遺伝子に対して相補的な配列を有する1つ以上の核酸、例えば、1つ以上のsgRNAを含有する有効量の組成物との組合せで、本明細書に記載の送達方法を使用して対象に投与される。核酸は、核酸が対象の細胞中に局在化され、(1)組換えポリペプチドが細胞中で核酸から翻訳され、および/または(2)sgRNAが標的遺伝子内の相補的配列に結合するような量および他の条件下で提供される。本発明の核酸が局在化される細胞、または細胞が存在する組織は、1または2ラウンド以上の核酸投与により標的化することができる。
連する突然変異遺伝子に対応する正確な配列を含む。例示的なDNAテンプレートは、単一突然変異疾患を引き起こす遺伝子に対応する。必要な構成要素が導入される細胞は、CRISPER関連タンパク質を使用して損傷した遺伝子を修復する。それを行うことで、細胞がテンプレートをコピーし、新たな遺伝子材料をゲノム中に導入する。
本発明は、好都合におよび/または有効に本発明の方法を実施するための種々のキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の複数の治療を実施し、および/または複数の実験を実施し、ならびに細胞および/もしくは細胞の集団を少なくとも1回接触させることを可能とするために十分な量および/または数の構成要素を含む。
012年12月14日に出願された同時係属米国仮特許出願第61/737,130号明細書に開示のものが挙げられる。
本明細書中の種々の箇所で、本開示の化合物の置換基が、群においてまたは範囲において開示される。本開示は、そのような群および範囲のメンバーのありとあらゆる個々の下位組合せを含むことが具体的に意図される。例えば、用語「C1〜6アルキル」は、メチル、エチル、C3アルキル、C4アルキル、C5アルキル、およびC6アルキルを個々に開示することが具体的に意図される。
組合せで投与される:本明細書において使用される場合、用語「組合せで投与される」または「組合せ投与」は、2つ以上の薬剤が、同時にまたは患者に対するそれぞれの薬剤の効果が重複し得るような間隔内で、対象に投与されることを意味する。一部の実施形態において、それらは、互いに約60、30、15、10、5、または1分以内に投与される。一部の実施形態において、薬剤の投与は、組合せ(例えば、相乗的)効果が達成されるように、互いに十分に近接して間隔を置かれる。
ド(第1の機能)をコードし得る一方、コードRNAを含むヌクレオシドは、それ自体として、細胞傷害性(第2の機能)である。この例において、癌細胞への二機能性修飾RNAの送達は、癌を良化または治療し得るペプチドまたはタンパク質分子をもたらすだけでなく、修飾RNAの翻訳の代わりに分解が生じる場合、ヌクレオシドの細胞傷害性ペイロードも細胞に送達する。
生物学的に活性:本明細書において使用される場合、語句「生物学的に活性」は、生体系および/または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与された場合、その生物に対して生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であるとみなす。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAは、そのポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの一部が生物学的に活性であり、または生物学的に関連するとみなされる活性を模倣する場合であっても、生物学的に活性とみなすことができる。
化学用語:化学用語は、特に本明細書において定義のない限り、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる2012年12月14日に出願された同時係属米国仮特許出願第61/737,130号明細書に提供される化学用語の定義に従う。
本明細書において使用される場合、薬剤の「有効量」は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されている状況に依存する。例えば、癌を治療する薬剤を投与する状況において、有効量の薬剤は、例えば、薬剤の投与なしで得られる応答と比較して、本明細書に定義される癌の治療を達成するのに十分な量である。
ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩錯体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中の化合物の結晶化により、典型的にそれらの構成要素の鏡像異性体または立体異性体に分解することができる。鏡像異性体および立体異性体は、周知の不斉合成法により、立体異性的または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、および触媒から得ることもできる。
本明細書に記載の化合物は、不斉であり得る(例えば、1つ以上の立体中心を有する)。特に記載のない限り、全ての立体異性体、例えば、鏡像異性体およびジアステレオマーが意図される。不斉置換炭素原子を含有する本開示の化合物は、光学活性型またはラセミ型で単離することができる。光学活性型を光学活性の出発物質からどのように調製するかに関する方法は、ラセミ混合物の分解により、または立体選択的合成によるものなど、当分野において公知である。オレフィンの多くの幾何異性体、C=N二重結合なども、本発明に記載の化合物中に存在し得、全てそのような安定な異性体が本開示において企図される。本開示の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が記載され、それは異性体の混合物としてまたは分離した異性型として単離することができる。
方向付けされた:本明細書において使用される場合、用語「方向付けされた」は、細胞を指す場合、細胞が分化経路中に十分存在する場合、通常の環境下で、それが規定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続け、異なる細胞型に分化せず、より分化していない細胞型に戻ることもないことを意味する。
チドまたはアミノ酸より関連する配列間で保存されているものである。
送達剤:本明細書において使用される場合、「送達剤」は、標的化される細胞へのポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAのインビボ送達を少なくとも部分的に容易にする任意の物質を指す。
、それらのマーカ、シグナルまたは部分は、当分野において公知の方法、例として、ラジオグラフィ、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などにより容易に検出される。検出可能な標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、クロモフォア、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドットなどを挙げることができる。検出可能な標識は、本明細書に開示のペプチドまたはタンパク質中の任意の位置において位置させることができる。これらは、アミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質内に存在し、またはNもしくはC末端において位置させることができる。
発生能変更因子:本明細書において使用される場合、「発生能変更因子」は、細胞の発生能を変更し得るタンパク質またはRNAを指す。
障害:本明細書において使用される場合、用語「障害」は、身体の正常な機能または確立した系の破壊または干渉を指す。
用量分割係数(DSF)−用量分割治療のPUDを、総1日用量または単回単位用量のPUDにより割った比。この値は、投薬レジメンの群の比較から導出される。
封入する:本明細書において使用される場合、用語「封入する」は、密封し、包囲し、または包み込むことを意味する。
れらが、構造的か化学的かにかかわらず、出発点、野生型または天然分子から変動する特徴部または特性を有するようにそれらを設計する場合、「エンジニアリングされる」。
発現:本明細書において使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下のイベントの1つ以上を指す:(1)DNA配列からのRNAテンプレートの産生(例えば、転写による);(2)RNA転写物のプロセシング(例えば、スプライシング、編集、5’キャップ形成、および/または3’末端プロセシングによる);(3)RNAのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳;および(4)ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
製剤:本明細書において使用される場合、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAおよび送達剤を含む。
相同性:本明細書において使用される場合、用語「相同性」は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子(例えば、DNA分子および/またはRNA分子)間および/またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。一部の実施形態において、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%同一または類似である場合、互いに「相同的」とみなされる。用語「相同的」は、必然的に少なくとも2つの配列(ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列)間の比較を指す。本発明によれば、2つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが少なくとも約20アミノ酸の少なくとも1つのストレッチについて少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、またはさらには99%である場合、相同的とみなされる。一部の実施形態において、相同的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも4〜5つのユニークに規定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力により特徴付けする。60ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列について、相同性は、典型的には、少なくとも4〜5つのユニークに規定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力により決定する。本発明によれば、2つのタンパク質配列は、タンパク質が少なくとも約20アミノ酸の少なくとも1つのストレッチについて少なくとも約50%、60%、70%、80%、または90%同一である場合、相同的とみなされる。
るヌクレオチドを比較する。第1の配列中のある位置が第2の配列中の対応する位置と同一のヌクレオチドにより占有されている場合、分子はその位置において同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数、およびそれぞれのギャップの長さを考慮し、配列により共有される同一位置の数の関数である。配列の比較および2つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、「計算分子生物学(Computational Molecular Biology)」、レスク,A.M.(Lesk,A.M.)編、オックスフォード大学プレス(Oxford University Press)、ニューヨーク、1988年;「生物計算科学:情報科学およびゲノムプロジェクト(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)」、スミス,D.W.(Smith,D.W.)編、アカデミックプレス(Academic Press)、ニューヨーク、1993年;「分子生物学における配列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)」、フォンハインチェ,G.(von Heinje,G.)著、アカデミックプレス(Academic Press)、1987年;「配列データのコンピュータ分析、第I部(Computer Analysis of Sequence Data,Part I)」、グリフィン,A.M.(Griffin,A.M.)、およびグリフィン,H.G.(Griffin、H.G.)編、ヒュマーナプレス(Humana Press)、ニュージャージ、1994年;ならびに「配列分析プライマー(Sequence Analysis Primer)」、グリプスコフ,M.(Gribskov,M.)およびデブルー,J.(Devereux,J.)編、Mストックトンプレス(M Stockton Press)、ニューヨーク、1991年(それらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる)に記載のものなどの方法を使用して決定することができる。例えば、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、例えば、メイヤーズ(Meyers)およびミラー(Miller)(コンピュータ・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシズ(CABIOS)、1989年、第4巻、p.11〜17)のアルゴリズムを使用して決定することができ、これはALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれており、PAM120加重残基表(weight residue table)、ギャップ長さペナルティ12およびギャップペナルティ4を使用する。あるいは、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、NWSgapdna.CMPマトリックスを使用するGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムを使用して決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般に用いられる方法としては、限定されるものではないが、参照により本明細書に組み込まれるカリッロ,H(Carillo,H)、およびリップマン,D.(Lipman,D.)著、SIAMジャーナル・オン・アプライド・マスマティクス(SIAM J Applied Math.)、第48巻、p.1073(1988年)に開示のものが挙げられる。同一性を決定するための技術は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにコード化されている。2つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアとしては、限定されるものではないが、GCGプログラムパッケージ、デベロー,J.(Devereux,J.)ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)、第12巻(第1号)、p.387(1984年))、BLASTP、BLASTN、およびFASTA アルツシュール,S.F.(Altschul,S.F.)ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Molec.Biol)、第215巻、p.403(1990年))が挙げられる。
ら翻訳されるポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、mRNAまたはタンパク質を計測するための標準的技術を使用して決定することができる。
−)またはアゾ結合(−N=N−)などが挙げられる。選択的に開裂可能な結合の非限定的な例としては、例えば、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、もしくは他の還元剤の使用、および/または光分解により開裂させることができるアミド結合、ならびに例えば、酸または塩基加水分解により開裂させることができるエステル結合が挙げられる。
複能性:本明細書において使用される場合、「複能性」または「部分分化細胞」は、細胞を指す場合、1つ以上の胚葉の細胞に分化するが、3つ全ての胚葉に分化しない発生能を有する細胞を指す。
非ヒト脊椎動物:本明細書において使用される場合、「非ヒト脊椎動物」は、ヒト(Homo sapiens)を除く全ての脊椎動物、例として、野生および飼育種を含む。非ヒト脊椎動物の例としては、限定されるものではないが、哺乳動物、例えば、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、スイギュウ、およびヤクが挙げられる。
オープンリーディングフレーム:本明細書において使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、所与のリーディングフレーム中に終止コドンを含有しない配列を指す。
場合により、置換されている」)と同等であることが意図される。特徴部「X」(例えば、アルキル)自体が任意選択であることを意味することは意図されない。
患者:本明細書において使用される場合、「患者」は、治療を求め得、もしくは必要とされ得、治療を要求し、治療を受けており、治療を受ける対象、または特定の疾患もしくは病態についての熟練専門家による治癒中の対象を指す。
塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉相酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオン、例として、限定されるものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の慣用の非毒性塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、慣用の化学的方法により、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、それらの化合物の遊離酸または塩基形態を、化学量論量の適切な塩基または酸と、水中で、または有機溶媒中で、またはそれら2つの混合物中で反応させることにより調製することができ;一般に、非水性媒体、例えば、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルが好ましい。好適な塩のリストは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれるレミントンの薬科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)、第17版、マック・パブリッシング社(Mack Publishing Company)、イーストン、ペンシルベニア、1985年、p.1418、「薬学的塩:特性、選択、および使用(Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use)」、P.H.シュタール(P.H.Stahl)およびC.G.ウェルムス(C.G.Wermuth)(編)、ウィリー−VCH(Wiley−VCH)、2008年、およびベルジ(Berge)ら著、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス(Journal of Pharmaceutical Science)、第66巻、p.1〜19(1977年)に見出される。
多能:本明細書において使用される場合、「多能」は、様々な条件下で、3つ全ての胚葉を特徴とする細胞型に分化するための発生能を有する細胞を指す。
Delivery Systems)」、A.C.S.シンポジウムシリーズ(A.C.S.Symposium Series)の第14巻、および薬物設計における生体可逆性担体(Bioreversible Carriers in Drug Design)、エドワード B.(Edward B.)編、ロシュ(Roche)、米国医薬協会(American Pharmaceutical Association)およびペルガモンプレス(Pergamon Press)、1987年において考察されている。
タンパク質開裂部位:本明細書において使用される場合、「タンパク質開裂部位」は、化学的、酵素的または光化学的手段によりアミノ酸鎖の制御された開裂が達成され得る部位を指す。
ル」は、開裂のためにポリペプチドにフラグまたはマークを付ける少なくとも1つのアミノ酸を指す。
精製された:本明細書において使用される場合、「精製する」、「精製された」、「精製」は、実質的に純粋とし、または不所望な構成要素、物質の汚染物、混合物もしくは不完全物を取り除くことを意味する。
リプログラミング因子:本明細書において使用される場合、用語「リプログラミング因子」は、発現があまり分化していない状態または未分化状態への細胞のリプログラミングに寄与する発生能変更因子、例えば、タンパク質、RNAまたは小分子を指す。
単一単位用量:本明細書において使用される場合、「単一単位用量」は、1用量/1回/単一経路/単一の接触点で、すなわち、単一投与イベントで投与される任意の治療物の用量である。
体性多能性細胞:本明細書において使用される場合、「体性多能性細胞」は、発生能が多能状態に変更された体細胞を指す。
安定的:本明細書において使用される場合、「安定的」は、反応混合物から有用な純度の程度で単離後に残るほど十分にロバストであり、好ましくは、有効な治療剤に製剤化することができる化合物を指す。
幹細胞:本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」は、自己再生の特性を有し、複数の細胞型に分化するための発生能を有し、規定の発生能を有さない未分化または部分分化状態の細胞を指す。幹細胞は、増殖し、より多くのそのような幹細胞を生じさせ得る一方、その発生能を維持する。
実質的に同時に:本明細書において使用される場合、および複数の用量に関する場合、この用語は、典型的には、2秒以内を意味する。
に対して感受性である:疾患、障害、および/または病態「に対して感受性である」個体は、その疾患、障害、および/または病態の症状が診断されておらず、および/またはそれを示し得ないが、疾患またはその症状を発症する傾向を保有する。一部の実施形態において、疾患、障害、および/または病態(例えば、癌)に対して感受性である個体は、以下の1つ以上により特徴付けすることができる:(1)その疾患、障害、および/または病態の発症に関連する遺伝子突然変異;(2)その疾患、障害、および/または病態の発症に関連する遺伝子多型;(3)その疾患、障害、および/または病態に関連するタン
パク質および/または核酸の発現および/または活性の増加および/または減少;(4)その疾患、障害、および/または病態の発症に関連する習慣および/または生活様式;(5)その疾患、障害、および/または病態の家族の既往歴;ならびに(6)その疾患、障害、および/または病態の発症に関連する微生物への曝露および/またはそれによる感染。一部の実施形態において、疾患、障害、および/または病態に対して感受性である個体は、その疾患、障害、および/または病態を発症する。一部の実施形態において、疾患、障害、および/または病態に対して感受性である個体は、その疾患、障害、および/または病態を発症しない。
合成:用語「合成」は、手作業により産生、調製、および/または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であり得る。
たは他の分子との複合体で調節し得る。
当業者は、単に定型的な実験を使用して、本明細書に記載の本発明による具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、または確認することができる。本発明の範囲は、上記の詳細な説明に限定されるものではなく、付属の特許請求の範囲に記載されるものである。
(実施例)
実施例1
合成ポリヌクレオチドおよびsgRNA産生のためのDNA構築物
本発明の合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAは、DNA構築物の作出;cDNAテンプレートのPCR増幅;cDNAテンプレートのインビトロ転写(一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドを使用する);必要により、インビトロ転写後酵素的ポリAテーリングおよび/または5’キャッピング;ならびに精製および分析を介して産生する。
1.氷上のNEB5−アルファコンピテント大腸菌(E.coli)細胞のチューブを10分間解凍する。
2.1pg〜100ngのプラスミドDNAを含有する1〜5μlを細胞混合物に添加する。チューブを慎重に4〜5回振り、細胞とDNAを混合する。ボルテックスしないこと。
3.混合物を氷上に30分間置く。混ぜないこと。
4.42℃において正確に30秒間熱ショックを与える。混ぜないこと。
5.氷上に5分間置く。混ぜないこと。
6.室温のSOCの950μlを混合物中にピペッティングする。
7.37℃において60分間置く。激しく振盪させ(250rpm)、または回転させる。
8.選択プレートを37℃に加温する。
9.チューブを振り、反転させることにより完全に細胞を混合する。
次いで、単一コロニーを使用し、適切な抗生物質を使用して5mlのLB成長培地を接種し、5時間成長させる(250RPM、37℃)。次いで、これを使用して200mlの培養培地を接種し、同一条件下で一晩成長させる。
cDNA産生のためのPCR
線形化プラスミド(CRISPR関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドをコードし、またはsgRNAをコードする)は、cDNA、例えば、転写テンプレートの調製のためのPCRを使用して増幅させる。cDNAの調製のためのPCR手順は、カパ・バイオシステムズ(Kapa Biosystems)(ウォーバン、マサチューセッツ)による2×カパ ハイファイ(2×KAPA HIFI)(商標)ホットスタート・レディミックス(HotStart ReadyMix)を使用して実施する。この系は、2×カパ レディーミックス(KAPA ReadyMix)12.5μl;順方向プライマー(10uM)0.75μl;逆方向プライマー(10uM)0.75μl;テンプレートcDNA;100ng;および25.0μlに希釈したdH2Oを含む。反応条件は、95℃において5分間、98℃において20秒間を25サイクル、次いで58℃において15秒間、次いで72℃において45秒間、次いで72℃において5分間、次いで4℃において終了までである。
インビトロ転写(IVT)
合成ポリヌクレオチドおよび/または合成sgRNAを生成するためのインビトロ転写のためのテンプレートとして、増幅産物cDNAを使用する。インプットヌクレオチド三リン酸(NTP)混合物は、天然および非天然のNTPを使用してインハウスで作製する。インビトロ転写反応は、修飾合成ポリヌクレオチドおよび/またはsgRNAを生成する。
テンプレートcDNA 1.0μg
10×転写緩衝液(400mMのトリス−HCl pH8.0、190mMのMgCl2、50mMのDTT、10mMのスペルミジン)2.0μl
カスタムNTP(それぞれ25mM) 7.2μl
RNアーゼ阻害剤 20U
T7 RNAポリメラーゼ 3000U
dH2O 最大20.0μl
37℃における3時間〜5時間のインキュベーション。
ポリAテーリング反応
一部の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、ポリAテールなしで合成し、すなわち、cDNA構築物は、ポリTなしで増幅させる。cDNA中にポリTがない場合、最
終産物のクリーニング前にポリAテーリング反応を実施しなければならない。これは、キャッピングされたIVT RNA(100μl);RNアーゼ阻害剤(20U);10×テーリング緩衝液(0.5Mのトリス−HCl(pH8.0)、2.5MのNaCl、100mMのMgCl2)(12.0μl);20mMのATP(6.0μl);ポリAポリメラーゼ(20U);dH2O最大123.5μlを混合し、37℃において30分間インキュベートすることにより行う。ポリAテールが既に転写物中に存在する場合、テーリング反応を省略し、アンビオン(Ambion)のメガクリア(MEGACLEAR)(商標)キット(オースティン、テキサス)(最大500μg)によるクリーンアップを直接進行させることができる。ポリAポリメラーゼは、好ましくは、酵母中で発現される組換え酵素である。
合成ポリヌクレオチドの5’キャッピング
合成ポリヌクレオチド(修飾RNA)の5’キャッピングは、インビトロ転写反応の間に同時に完了させ、または転写後に酵素的にキャッピングすることができる。
mMのGTP(5.0μl);20mMのS−アデノシルメチオニン(2.5μl);RNアーゼ阻害剤(100U);2’−O−メチルトランスフェラーゼ(400U)、ワクシニアキャッピング酵素(グアニリルトランスフェラーゼ)(40U);dH2O(最大28μl)の混合;および60μgのRNAについては37℃における30分間のインキュベーションまたは180μgのRNAについては最大2時間のインキュベーションを含む。
合成ポリヌクレオチドおよび合成sgRNAを分析する方法
修飾RNAまたはRT PCR産物のアガロースゲル電気泳動:個々の修飾RNA(20μlの容量中200〜400ng)または逆転写されたPCR産物(200〜400ng)を、非変性1.2%アガロースE−ゲル(インビトロジェン(Invitrogen)、カールスバッド、カリフォルニア)のウェル中にロードし、製造業者のプロトコルに従って12〜15分間ランする。
タンパク質発現をスクリーニングする方法
CRISPR関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドによる細胞の形質移入後、タンパク質発現を分析する。
細胞または対象に投与された合成ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を含有し得る生体試料を調製し、1、2、3、または4つの質量分析器を使用して、エレクトロスプレーイオン化(ESI)のための製造業者のプロトコルに従って分析する。生体試料は、タンデムESI質量分析系を使用して分析することもできる。
B.マトリックス支援レーザ脱離/イオン化
細胞または対象に投与された合成ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を含有し得る生体試料を調製し、マトリックス支援レーザ脱離/イオン化(MALDI)のための製造業者のプロトコルに従って分析する。
C.液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析
合成ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、トリプシン酵素により処理して、中に含有されるタンパク質を消化することができる。得られるペプチドは、液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析(LC/MS/MS)により分析する。ペプチドは断片化して質量分析計中に入れ、コンピュータアルゴリズムを介してタンパク質配列データベースとマッチさせることができる診断パターンを生じさせる。消化された試料は、希釈して所与のタンパク質について1ng以下の出発物質を得ることができる。単純な緩衝液のバックグラウンド(例えば、水または揮発性塩)を含有する生体試料は、直接的な溶液中消化に適しており;より複雑なバックグラウンド(例えば、界面活性剤、不揮発性塩、グリセロール)は、試料分析を容易にするための追加のクリーンアップステップを要求する。
実施例8
マイクロ生理学システム
CRISPR関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法の1つを使用して、例えば、緩衝液、脂質ナノ粒子およびPLGA中で製剤化する。次いで、これらの製剤は、それぞれの内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第2013086502号パンフレット、国際公開第2013086486号パンフレットおよび国際公開第2013086505号パンフレットに記載のとおり、臓器チップから作出されたマイクロ生理学システムに投与し、またはそれと接触させる。
Cas9およびdCas9エフェクタードメイン融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドのためのDNAテンプレートの設計
プラスミドは、本明細書に記載の化学合成ポリヌクレオチドを製造するためのインビトロ転写テンプレートとしての使用のために設計した。コング(Cong)およびマリ(Mali)によりそれぞれ記載されるコドン最適化Cas9を含有するように2つのプラスミドを設計した(サイエンス(Science)、2013年、第339巻、p.819
〜23およびサイエンス(Science)、2013年、第339巻、p.823〜6)。第1のプラスミドはFLAGタグ付きCas9をコードし、第2のプラスミドはタグなしCas9をコードした。異なるエフェクタードメインに融合しているコドン最適化dcas9を含有するように2つのプラスミドを設計した(セル(Cell)、2013年、第154巻、p.442〜51およびネイチャー・メソッズ(Nature Methods)、2013年、第10巻、p.977〜979参照)。コード配列は、修飾mRNAのインビトロ転写のためのT7ポリメラーゼプロモータの制御下に置いた。
以下の5’UTRおよび3’UTR配列を使用した。
他の実施形態において、配列コードコドン最適化化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)dCas9遺伝子は、HAタグ、1つ以上のNLS(例えば、SV40NLS、例えば、1または2つのNLS、場合により、Nおよび/またはC末端において)および/または検出タグ(例えば、HAタグ、FLAGタグ、タグBFPなど)と融合することもできる。上記のいずれかは、例えば、上方または下方調節を容易にするために本発明のCas9構築物中で単独で、またはエフェクタードメイン(KRAB、CSD、WRPW、VP64、またはp65ADドメイン)との組合せで取り上げることができる)。種々のCas9、dCAS9遺伝子およびエフェクタードメインの配列は、以下の表中に見出される。
構築物1〜4(DNAカセット)を合成し、ベクター(DNA2.0、メンロパーク、
カリフォルニアからのpJ364)中に挿入した。プラスミドを上記のとおり大腸菌(E.coli)中に形質移入し、プラスミドDNAを精製し、制限酵素(XbaI)を使用して線形化した。線形化プラスミドをPCR増幅させ、インビトロ転写のためのテンプレートとして使用して本発明の合成ポリヌクレオチドを産生した。
VEGFを標的化する合成sgRNAのためのDNAテンプレートの設計。
インビトロ転写のためのテンプレートとして使用される、目的遺伝子、すなわち、VEGF遺伝子を標的化するsgRNAをそれぞれコードする4つの構築物を作出した。
VEGF V1 sgRNA構築物配列
インビトロ転写を介する合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAの産生。
本明細書に記載の方法を使用して、上記の構築物のインビトロ転写を使用してCas9をコードする2つの合成ポリヌクレオチド、dCAS9エフェクター遺伝子融合タンパク質をコードする2つの合成ポリヌクレオチド、およびVEGFを標的化する4つの合成sgRNAを合成した。以下の配列を有する合成ポリヌクレオチドおよび合成sgRNAを合成した。
種々のタグ付きdCas9mRNAによりHeLa細胞を形質移入し、細胞抽出物をウエスタン、免疫沈降、およびLC/MS分析に供して前記RNAにより発現されたタンパク質の発現を検出した。
腹水)(図3)によりPBS+0.05%ツイーン(Tween)中で4℃において4時間一晩ブロットした。次いで、膜を洗浄し、HRPにコンジュゲートしている抗ウサギ(シグマ(Sigma))または抗マウス(シグマ(Sigma))と室温において45分間インキュベートし、ピエス・スーパ・シグナル・ウェスト・フェムト(Pierce
Super Signal West Femto)(ピエス(Pierce))により製造業者の指示書に従って検出した。
FLAG mRNA(配列番号55)により形質移入されたHeLa細胞中で、直接抗FLAGウエスタンおよび免疫沈降抗FLAGウエスタンを介して検出した(図2)。メーダ(Maeder)Cas9−FLAGタンパク質は、メーダ(Maeder)Cas9−FLAG mRNA(配列番号52)により形質移入されたHeLA細胞中で、免疫沈降抗FLAGウエスタンを介して検出した(図2)。マリ(Mali)Cas9およびギルバート(Gilbert)Cas9−HAは両方とも、FLAGドメインを有さず、したがって、抗FLAGウエスタンについても免疫沈降についても出現しなかった(図2)。
マウス(n=1)(8週齢雌BalbC)に、表3に記載の脂質DLin−MC3−DMAを含む脂質ナノ粒子中に製剤化された配列番号55_に記載のとおり、記載の0.04mg/mL(14μg)のFLAG−Cas9コング(Cong)mRNA(およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中に示していない;5’キャップ、キャップ1;1−メチルシュードウリジンにより完全に修飾されている)を350ulまたは対照PBS(モック)を静脈内投与した。
プロテアーゼ阻害剤の存在下でティシュライザ(Tissue lyser)製剤中で、肝組織を溶解させた。タンパク質を抽出し、BCAタンパク質アッセイ(ピエス(Pierce))を使用して定量した。試料は、総タンパク質定量により正規化した。免疫沈降のためにM2アガロースビーズ(シグマ(Sigma))におよそ88mgのタンパク質抽出物を添加した。4℃において3〜4時間穏やかに混合した後、ビーズを吸引し、RIPA緩衝液により洗浄して上清を除去した。200μg/mLの3×FLAGペプチド(シグマ(Sigma))が補給されたRIPA緩衝液をビーズに添加し、1100rpmにおいて振盪させながらサーモミキサ(thermomixer)中で4℃において30分間インキュベートした。次いで、ビーズを回転降下させ、上清を除去することによりペプチド溶出を実施した。プレステインドタンパク質スタンダード((ライフ・テック(LifeTech))とともにMESランニング緩衝液((ライフ・テック(LifeTech))を使用して試料を4〜12%のビストリスゲル上で72℃において12分間インキュベートした。iBlot(商標)装置を製造業者の指示書に従って6分間使用してゲルをニトロセルロース上に転写した。膜を取り出し、ブロッティングに好適な容器中に置き、2×ddH2Oにより洗浄した。次いで、PBS中5%脱脂粉乳によりニトロセルロースを45分間ブロッキングした。次いで、抗M2HRPにより1:15,000において1%のミルクPBS0.05%のツイーン(Tween)中で室温においてニトロセルロースを30分間ブロッティングした。次いで、一次抗体溶液を除去し、ニトロセルロースをPBS00.05%のツイーン(Tween)により洗浄した。ピエス・スーパ・シグナル・フェムト(Pierce Super Signal Femto)(商標)によりFLAG−Cas9ペプチドを検出した。次いで、ニトロセルロース膜をイメージングのために露光した。
dCas9エフェクター融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび合成sgRNAによる転写のインビトロモジュレーション
VEGF(血管内皮成長因子)は、最も強力な血管新生因子の1つであり、多くの腫瘍、例として、神経膠腫における血管新生の誘導因子として近年同定された。U−87MGおよびA−172は、2つの樹立された膠芽細胞腫細胞系統である。基底VEGF発現は
、A−172と比較してU−87MGにおいて1桁大きかった(インターナショナル・ジャーナル・オブ・デベロップメンタル・ニューロサイエンス(Int J Dev Neurosci.)、1999年、8月〜10月、第17巻(第5−6号)、p.565〜77)。これは、VEGFの5’フランキングゲノム配列に指向されるsgRNAを用いるdCas9−KRABおよびdCas9−VP64による遺伝子調節を試験するための系を提供する。
ギルバート(Gilbert)、2013年は、dCas9−kRAB融合タンパク質を使用する遺伝子下方調節を記載している。KRABは、およそ400個のヒト亜鉛フィンガータンパク質ベース転写因子(KRAB亜鉛フィンガータンパク質)中に存在する転写抑制ドメインのカテゴリーである(ハントリー(Huntley)、2006年)。KRABドメインは、転写の有効なリプレッサーであることが示されている。
2.全ての形質移入は、リポフェクタミン(Lipofectamine)を使用し、参照により組み込まれる米国特許出願公開第2013/0259924号明細書(2013年3月9日に出願された米国特許出願第13/791,922号明細書)に記載の形質移入プロトコルを使用してトリプリケートで実施する。
3.形質移入前日に24ウェルプレート中に160,000個の細胞を播種する。
4.100ngのdCas9−KRAB mRNAおよびl00ngのVEGF V1〜V4 sgRNAによりU−87MG細胞を形質移入する。相乗効果実験のため、100ngのdCas9−KRAB mRNAと、25ngのVEGF V1〜V4 sgRNAのそれぞれ(合計100ngの4つの異なるVEGF sgRNA)を形質移入する
5.細胞を8時間インキュベートし、細胞を洗浄して形質移入剤を除去する。
6.DMEM中で細胞をインキュベートし続ける
7.形質移入0時間、12時間、24時間、48時間後、VEGFA標的化sgRNAおよびdCas9−KRABをコードするmRNAにより形質移入されたU−87MGの培養培地を回収した
8.ELISAによりVEGFAタンパク質発現を計測する。
dCas9−VP64による転写の活性化
メーダ(Maeder)、2013年およびペレ−ピネラ(Perez−Pinera)、2013年は、dCas9(D10A、H840A)をVP64トランス活性化ドメインに融合することにより作出されるRNAガイド型転写活性化因子を記載している。dCas9−VP64は、標的配列へのsgRNAのハイブリダイゼーションを介してゲノム標的部位を認識する。
1.10%のFBS、2mMのグルタミン、100単位/mlのストレプトマイシン、お
よび100mg/mlのペニシリン中でダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中でHEK293を維持する。
2.全ての形質移入は、リポフェクタミン(Lipofectamine)を使用し、参照により組み込まれる米国特許出願公開第2013/0259924号明細書(2013年3月9日に出願された米国特許出願第13/791,922号明細書)に記載の形質移入プロトコルを使用してトリプリケートで実施する。
3.形質移入前日に24ウェルプレート中に160,000個の細胞を播種する。
4.100ngのdCas9−VP64 mRNAおよび100ngのVEGF V1〜V4 sgRNAによりHEK293細胞を形質移入する。相乗効果実験のため、100ngのdCas9−VP64 mRNAと、25ngのVEGF V1〜V4 sgRNAのそれぞれ(合計100ngの4つの異なるVEGF sgRNA)を形質移入する
5.細胞を8時間インキュベートし、細胞を洗浄して形質移入剤を除去する。
6.DMEM中で細胞をインキュベートし続ける。
7.形質移入0時間、12時間、24時間、48時間後、VEGFA標的化sgRNAおよびdCas9−VP64をコードするmRNAにより形質移入されたHEK293の培養培地を回収する
8.ELISAによりVEGFAタンパク質発現を計測する。
9.RT−PCRまたはタックマン(Taqman)またはQ−PCRによりVEGFA
mRNAを計測する
dCas9−VP64をコードする合成ポリヌクレオチドとVEGFゲノム配列を標的化するsgRNAの導入は、未処理細胞と比較してHEK293細胞中のVEGF転写を活性化する。
インビトロタンパク質発現の組織特異的モジュレーション
miR−122は初代ヒト肝細胞中に存在し、肝細胞癌腫細胞系、例えば、HepG2、Hep3B、およびSK−Hep−1細胞中には存在しない。miR−122は、初代肝細胞中で3’UTR中のmiR−122結合部位を含有するmRNAによりコードされるタンパク質産生を下方調節し得るが、HepG2およびHep3B中では下方調節し得ないことが示されている。
表4:一次肝細胞形質移入の結果
表5.HEpG2形質移入の結果
dCas9によるインビボタンパク質発現のモジュレーション
脂質−核酸粒子製剤を使用するdCAS9エフェクター融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび目的遺伝子を標的化する合成sgRNAの肝臓への送達は、米国特許出願公開第2013/0259924号明細書(2013年3月9日に出願された米国特許出願第13/791,922号明細書)に記載の手順に従って実施する。筋肉内注射を介するdCAS9エフェクター融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび目的遺伝子を標的化する合成sgRNAの筋肉細胞への送達は、米国特許出願公開第2013/0259924号明細書(2013年3月9日に出願された米国特許出願第13/791,922号明細書)に記載のとおり実施する。
トロンボポエチン(TPO)は、主として肝臓により産生される。dCas9−KRABまたはdCas9−KRAB−miR122をコードする合成ポリヌクレオチドは、トロンボポエチンの5’フランキング配列を標的化するsgRNAとともに、LNP製剤中で製剤化する。0.005mg/kg〜0.5mg/kgのLNP製剤化dCas9−KRABおよびTPO sgRNAは、マウスに静脈内投与する。血液および肝試料は、投与8時間、24時間、48時間、72時間後において回収する。TPOタンパク質レベルはELISAにより計測し、TPO mRNAはRT−PCRまたはq−PCRにより計測する。
レポータ分子、例えば、ルシフェラーゼ、GFP、またはヒトVEGFおよび特異的5’フランキング配列含有VEGF V1〜V4 sgRNA配列およびタンパク質発現をドライブするための構成的に活性なプロモータを含む外因性DNAプラスミドは、dCas9−KRAB/dCas9−KRAB−miR122をコードする合成ポリヌクレオチドと、およびVEGFを標的化する4つの合成sgRNAと同時投与する。ポリヌクレオチドはLNP製剤化し、本明細書に記載のとおり投与する。
dCas9−VP64をコードする合成ポリヌクレオチドを使用して転写の活性化およびタンパク質発現を決定するため、典型的には肝臓により発現されないタンパク質を標的化する。乳酸デヒドロゲナーゼC(LDHC)は、精巣特異的酵素である。dCas9−VP64をコードするLNP製剤化合成ポリヌクレオチドの、マウスLDHCの5’ゲノム配列を標的化する合成sgRNAと同時の投与は、肝臓中のLDHCの発現を誘導する。LDHC mRNA転写物はRT−PCRまたはqPCRにより計測し、タンパク質発現はELISAまたはウエスタンブロットにより計測する。dCas9−VP64−miR122をコードするLNP製剤化合成ポリヌクレオチドおよびマウスLDHCの5’ゲノム配列を標的化するsgRNAの投与は、肝細胞中のmiR−122の存在のためLDHC発現を活性化しない。
レポータ分子、例えば、ルシフェラーゼ、GFP、またはヒトVEGFおよび特異的5’フランキング配列含有VEGFV1〜V4 sgRNA配列および構成的に不活性なプロモータを含む外因性DNAプラスミドは、dCas9−VP64/dCas9−VP64−miR122をコードする合成ポリヌクレオチドと、およびVEGFを標的化する合成sgRNAと同時投与する。dCas9−VP64/VEGF sgRNAにより処理された群においてレポータ分子の発現の増加が存在する。dCas9−VP64−mir122/VEGF sgRNAにより処理された群においてレポータ分子の発現の有意な増加は存在しない。
本明細書に記載のとおり、マイクロRNAは組織特異性を提供し得る。マイクロRNA122を使用してdCas9系の組織選択性を実証するため、マウスのある群に、dCas9−VP64−mir122をコードするLNP製剤化合成ポリヌクレオチドおよびLDHCを標的化する合成sgRNAを静脈内投与し、別の群に筋肉内投与する。肝細胞中のmiR−122の存在に起因して、dCas9−VP64をコードする合成ポリヌクレオチドは発現されず;したがって、dCas9−VP64はLDHC発現の活性化を媒介しない。筋肉細胞はmiR−122を含有しないため、dCas9−VP64−miR122およびLDHC sgRNAの筋肉内注射を受ける群は、精巣特異的タンパク質の発現を示す。
別の例は、dCas9−KRABの遺伝子抑制のための標的としてギルバート(Gilbert)らに記載のDNAプラスミドを同時投与することである。1)SV40−GFP DNAプラスミド(ギルバート(Gilbert)らに記載)、2)sgGFP−NT1 sgRNA(ギルバート(Gilbert)らに記載)、および3)dCas9−KRABまたはdCas9−KRAB−miR122のいずれかをコードするmRNAを
担持する製剤化LNPは、IVを介してmiR−122を含有する肝臓に投与する。dCas9−KRABを受ける群は、フローサイトメトリまたは免疫組織化学検査による計測としてdCas9−KRAB mRNAを受けなかった対照群と比較して低減したGFP発現を示す。それというのも、dCas9−KRABの翻訳はmiR122により低減されないためである。dCas9−KRAB−miR122を受ける群は、dCas9−KRAB−miR122 mRNAを受けない対照群と類似のGFP発現を示す。それというのも、dCas9−KRAB−miR122 mRNAの翻訳を阻害する肝細胞中のmiR−122の存在のためである。miR−122を含有しない筋肉細胞へのIM送達を比較するため、1)SV40−GFP DNAプラスミド(ギルバート(Gilbert)らに記載)、2)sgGFP−NT1 sgRNA(ギルバート(Gilbert)らに記載)、および3)dCas9−KRABまたはdCas9−KRAB−miR122のいずれかをコードするmRNAを担持する製剤化LNPは、IM注射を介して投与する。本発明者らは、dCas9−KRABおよびdCas9−KRAB−miR122群の両方が、フローサイトメトリまたは免疫組織化学検査による計測として筋肉細胞中のGPF発現を示すことを確認することを予測する。
mRNAを受ける群がフローサイトメトリまたは免疫組織化学検査による計測としてGFP発現を示す一方、dCas9−VP64−miR122を受ける群は、GFP発現を示さない。それというのも、dCas9−VP64−miR122 mRNAの翻訳を抑制する肝細胞中のmiR−122の存在のためである。miR−122を含有しない筋肉細胞へのIM送達を比較するため、1)GAL4 UAS GFP DNAプラスミド(ギルバート(Gilbert)らに記載)、2)sgGAL4−1 sgRNA(ギルバート(Gilbert)らに記載)、および3)dCas9−VP64またはdCas9−VP64−miR12のいずれかをコードするmRNAを担持する製剤化LNPは、IM注射を介して投与する。本発明者らは、dCas9−VP64およびdCas9−VP64−miR122群の両方が、フローサイトメトリまたは免疫組織化学検査による計測として筋肉細胞中のGPF発現を活性化することを確認することを予測する。
3つの異なる送達系の使用
CRISPR関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAを投与する場合に有意な安全域を可能とするため、標的化機序の組合せを使用する。
。
結果は、任意のタンパク質標的の転写活性化または阻害であり得る(本発明者らの最初のインビボ実験は、肝臓中のdCas9融合物の局在化を確認するためのIHCおよびレポータ、例えば、ルシフェラーゼおよび/またはGFPを使用する機能的リードアウトにフォーカスする。
使用されてきた単語は、限定するものではなく説明のための単語であり、広範な態様において本発明の真の範囲および趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更がなされ得ることを理解されたい。
表5.CRISPR関連タンパク質
コードするDNA構築物
Claims (92)
- 合成ポリヌクレオチドであって、
(a)表6に見出されるCRISPR関連タンパク質からなる群から選択されるCRISPR関連タンパク質をコードする、結合ヌクレオシドの第1の領域;
(b)表7に見出される5’非翻訳領域(UTR)からなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列を含む前記第1の領域の5’末端に位置する第1のフランキング領域;
(c)表8に見出される3’非翻訳領域(UTR)からなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列を含む前記第1の領域の3’末端に位置する第2のフランキング領域
を含む合成ポリヌクレオチド。 - 修飾RNAポリヌクレオチドである、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 配列番号51〜56から選択される配列からなる、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第1の領域が、ヒトコドン最適化dCAS9をコードする配列を含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第1の領域が、配列番号61をコードする、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第1の領域が、エフェクタードメインをさらにコードする、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第1の領域が、KRAB、VP64、p65ADおよびMxiからなる群から選択されるエフェクタードメインをさらにコードする、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第1の領域が、表6に開示のKRABまたはVP64をさらにコードする、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第1の領域が、エフェクタードメインをさらにコードし、表6に開示のエフェクタードメインからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第1のフランキング領域が、配列番号71を含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第2のフランキング領域が、配列番号81を含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第2のフランキング領域が、少なくとも1つのmiR結合部位または1つのmiR結合部位シードを含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第2のフランキング領域が、miR−122またはmiR−142またはmiR−146結合部位を含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第2のフランキング領域が、配列番号82のmIR−122結合部位からなるmiR−122結合部位を含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第2のフランキング領域が、配列番号82を含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第2のフランキング領域が、結合ヌクレオシドの3’テーリング配列を含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第2のフランキング領域が、ポリAテールを含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第2のフランキング領域が、80〜140ヌクレオチド長のポリAテールを含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記第2のフランキング領域が、100ヌクレオチドのポリAテールを含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載の合成ポリヌクレオチドをコードする第2の合成ポリヌクレオチド。
- DNAポリヌクレオチドである、請求項20に記載の第2の合成ポリヌクレオチド。
- ベクターをさらに含む、請求項20に記載の第2の合成ポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つの5’キャップ構造をさらに含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記結合ヌクレオシドの第1の領域が、少なくとも第1の修飾ヌクレオシドを含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 前記結合ヌクレオシドの第1の領域が、少なくとも1つの1−メチル−シュードウリジンを含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 少なくとも2つの修飾を含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つの1−メチル−シュードウリジンおよび少なくとも1つの5’−メチルシチジンを含む、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- a.前記少なくとも2つの修飾が、ヌクレオシドの1つ以上およびヌクレオシド間の骨格結合上の少なくとも一方に位置し;または
b.前記少なくとも2つの修飾が、ヌクレオシドおよび骨格結合上の両方に位置し;または
c.少なくとも1つの修飾が、骨格結合上に位置し;または
d.1つ以上の骨格結合が、1つ以上の酸素原子の置き換えにより修飾されており;または
e.少なくとも1つの修飾が、ホスホロチオエート結合による少なくとも1つの骨格結合の置き換えを含み;または
f.少なくとも1つの修飾が、1つ以上のヌクレオシド上に位置し;または
g.1つ以上の修飾が、1つ以上のヌクレオシドの糖上に存在し;または
h.少なくとも1つの修飾が、シトシン、グアニン、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群から選択される1つ以上の核酸塩基上に位置する、
請求項26に記載の合成ポリヌクレオチド。 - インビトロ転写法を使用して、または化学合成法を使用して産生される、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 実質的に精製されている、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 請求項1〜30のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチドを含む組成物。
- 薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項31に記載の組成物。
- 溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒体、希釈剤、分散液、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、脂質、リピドイド リポソーム、脂質ナノ粒子、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物からなる群から選択される薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項31に記載の組成物。
- DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、reLNP、PLGA、PEG、PEG−DMAおよびPEG化脂質ならびにそれらの混合物から選択される脂質をさらに含む、請求項31に記載の組成物。
- 脂質ナノ粒子をさらに含む、請求項31に記載の組成物。
- 細胞または組織を、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチドまたは請求項31に記載の組成物と接触させることを含む、CRISPR関連タンパク質を産生する方法。
- 生物に、請求項1に記載の合成ポリヌクレオチドまたは請求項31に記載の組成物を投与することを含む、CRISPR関連タンパク質を産生する方法。
- 1pg〜1mgの総1日用量において前記合成ポリヌクレオチドを投与する、請求項37に記載の方法。
- 単回用量で前記合成ポリヌクレオチドを投与する、請求項37に記載の方法。
- 単回用量を超えて前記合成ポリヌクレオチドを投与する、請求項37に記載の方法。
- 投与が、出生前投与、新生児投与および出生後投与からなる群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 投与が、経口投与、注射による投与、眼内投与による投与および鼻腔内投与による投与からなる群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 投与が、注射による投与であり、前記注射が、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下および筋肉内注射からなる群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 目的遺伝子を標的化するための合成sgRNAであって、
(a)前記目的遺伝子の5’UTRのいずれかの鎖に対して相補的な20〜25結合ヌクレオシドの第1の領域;
(b)配列番号90に見出されるガイドRNA足場配列を含む、前記第1の領域の3’末端に位置する第2のフランキング領域
を含む合成sgRNA。 - 配列番号91、92、93または94から選択される配列からなる、請求項44に記載のsgRNA。
- 前記標的遺伝子が、VEGFを含む、請求項44に記載のsgRNA。
- 前記第1の領域が、配列番号91、92、93または94に開示の標的配列を含む、請求項44に記載のsgRNA。
- 配列番号90を含む、請求項44に記載のsgRNA。
- 請求項44に記載のsgRNAをコードする第2の合成ポリヌクレオチド。
- DNAポリヌクレオチドである、請求項49に記載の第2の合成ポリヌクレオチド。
- ベクターをさらに含む、請求項49に記載の第2の合成ポリヌクレオチド。
- 5’UTRをさらに含む、請求項49に記載の第2の合成ポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、少なくとも1つの5’キャップ構造をさらに含む、請求項44に記載のsgRNA。
- 前記結合ヌクレオシドの第1の領域が、少なくとも第1の修飾ヌクレオシドを含む、請求項44に記載のsgRNA。
- 前記sgRNAが、少なくとも2つの修飾を含む、請求項44に記載のsgRNA。
- a.前記少なくとも2つの修飾が、ヌクレオシドの1つ以上およびヌクレオシド間の骨格結合上の少なくとも一方に位置し;または
b.前記少なくとも2つの修飾が、ヌクレオシドおよび骨格結合上の両方に位置し;または
c.少なくとも1つの修飾が、骨格結合上に位置し;または
d.1つ以上の骨格結合が、1つ以上の酸素原子の置き換えにより修飾されており;または
e.少なくとも1つの修飾が、ホスホロチオエート結合による少なくとも1つの骨格結合の置き換えを含み;または
f.少なくとも1つの修飾が、1つ以上のヌクレオシド上に位置し;または
g.1つ以上の修飾が、1つ以上のヌクレオシドの糖上に存在し;または
h.少なくとも1つの修飾が、シトシン、グアニン、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群から選択される1つ以上の核酸塩基上に位置する、
請求項55に記載のsgRNA。 - 血清中の安定化を増加させる少なくとも1つの非翻訳修飾を含む、請求項44に記載のsgRNA。
- インビトロ転写法を使用して、または化学合成法を使用して産生される、請求項44に記載のsgRNA。
- 実質的に精製されている、請求項44に記載のsgRNA。
- 請求項44〜59のいずれか一項に記載のsgRNAを含む組成物。
- 薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項60に記載の組成物。
- 溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒体、希釈剤、分散液、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、脂質、リピドイド リポソーム、脂質ナノ粒子、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物からなる群から選択される薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項60に記載の組成物。
- DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、reLNP、PLGA、PEG、PEG−DMAおよびPEG化脂質ならびにそれらの混合物から選択される脂質をさらに含む、請求項60に記載の組成物。
- 脂質ナノ粒子(LNP)をさらに含む、請求項60に記載の組成物。
- LNPを含まない、請求項60に記載の組成物。
- 細胞中の目的遺伝子の転写をモジュレートする方法であって、請求項1に記載のCRISPR関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび請求項44に記載の合成sgRNAと、前記目的遺伝子の転写をモジュレートするために十分な条件下で前記細胞を接触させることを含み、前記合成ポリヌクレオチドの第1の領域が、エフェクタードメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記sgRNAの第1の領域配列が、前記目的遺伝子に対して相補的である方法。
- 前記合成ポリヌクレオチドおよび前記合成sgRNAが、単一ポリヌクレオチドでない、請求項66に記載の方法。
- 前記合成ポリヌクレオチドが、請求項1〜30のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチドである、請求項66に記載の方法。
- 前記sgRNAが、請求項44〜59のいずれか一項に記載のsgRNAである、請求項66に記載の方法。
- 前記目的遺伝子が、VEGF、TPO、およびLDHCからなる群から選択される、請求項66に記載の方法。
- 請求項1に記載の合成ポリヌクレオチドが、前記細胞に特異的なmiR配列を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記目的遺伝子が、VEGFであり、前記細胞が、U−97MG細胞、HEK293細胞、一次ヒト肝細胞、またはHepG2細胞であり、請求項2に記載の合成ポリヌクレオチドの1つおよび請求項45に記載のsgRNAの1つと、前記VEGF遺伝子の転写をモジュレートするために十分な条件下で前記細胞を接触させることを含む、請求項66に記載の方法。
- 対象中の目的遺伝子の転写をモジュレートする方法であって、前記対象に、第1の投薬量の請求項1に記載の合成ポリヌクレオチドおよび第2の投薬量の請求項44に記載の合
成sgRNAを、前記目的遺伝子の転写をモジュレートするために十分な条件下で投与することを含み、前記合成ポリヌクレオチドの第1の領域が、エフェクタードメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記sgRNAの第1の領域配列が、前記目的遺伝子に対して相補的である方法。 - 前記合成ポリヌクレオチドが、請求項1〜30のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチドである、請求項73に記載の方法。
- 前記sgRNAが、請求項44〜59のいずれか一項に記載のsgRNAである、請求項73に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項73に記載の方法。
- 前記合成ポリヌクレオチドおよび前記合成sgRNAの少なくとも一方が、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されている、請求項73に記載の方法。
- 前記合成ポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されており、前記sgRNAが、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されていない、請求項73に記載の方法。
- 前記目的遺伝子が、VEGF、TPO、およびLDHCからなる群から選択される、請求項73に記載の方法。
- 請求項1に記載の合成ポリヌクレオチドが、前記細胞に特異的なmiR配列を含む、請求項73に記載の方法。
- 請求項73に記載の方法であって、
a.前記第1の投薬量が、0.0005/mg/kg〜0.5mg/kgの合成ポリヌクレオチドであり;ならびに
b.前記第2の投薬量が、0.0005/mg/kg〜0.5mg/kgのsgRNAであり;ならびに
c.前記合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAを一緒に投与し、もしくは別個に投与し;ならびに
d.単回用量で、もしくは複数回用量で前記合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAの少なくとも一方を投与し;ならびに
e.1日1回もしくは1日2回以上、前記合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAの少なくとも一方を投与し;ならびに
f.前記合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAの少なくとも一方を、出生前、新生児、出生後、経口、眼内、鼻腔内投与、および、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下もしくは筋肉内注射の少なくとも1つにより投与する
の少なくとも1つである、方法。 - 前記目的遺伝子がTPOであり、前記対象がマウスであり、前記マウスに、配列番号51を含む0.0005/mg/kg〜0.5mg/kgの合成ポリヌクレオチドおよび前記TPO遺伝子の5’UTRの一方の鎖に対して相補的な配列を含む第1の領域を含む0.0005/mg/kg〜0.5mg/kgのsgRNAを投与することを含む、請求項73に記載の方法。
- 対象中の疾患を治療する方法であって、前記対象に、第1の投薬量の請求項1に記載の合成ポリヌクレオチドおよび第2の投薬量の請求項44に記載の合成sgRNAを、目的遺伝子の転写をモジュレートするために十分な条件下で投与することを含み、前記合成ポ
リヌクレオチドの第1の領域が、エフェクタードメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記sgRNAの第1の領域配列が、前記目的遺伝子5’UTRの一方の鎖に対して相補的であり、前記遺伝子の発現が、前記疾患に結び付く方法。 - 前記疾患が癌であり、前記遺伝子が、アポトーシスまたは老化遺伝子である、請求項83に記載の方法。
- 前記合成ポリヌクレオチドが、請求項1〜30のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチドである、請求項83に記載の方法。
- 前記sgRNAが、請求項44〜59のいずれか一項に記載のsgRNAである、請求項83に記載の方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項83に記載の方法。
- 前記合成ポリヌクレオチドおよび前記合成sgRNAの少なくとも一方が、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されている、請求項83に記載の方法。
- 前記合成ポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されており、前記sgRNAが、脂質ナノ粒子製剤中で製剤化されていない、請求項83に記載の方法。
- 前記目的遺伝子が、VEGF、TPO、およびLDHCからなる群から選択される、請求項83に記載の方法。
- 請求項1に記載の合成ポリヌクレオチドが、miR配列を含む、請求項83に記載の方法。
- a.前記第1の投薬量が、0.0005/mg/kg〜0.5mg/kgの合成ポリヌクレオチドであり;ならびに
b.前記第2の投薬量が、0.0005/mg/kg〜0.5mg/kgのsgRNAであり;ならびに
c.前記合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAを一緒に投与し、もしくは別個に投与し;ならびに
d.単回用量で、もしくは複数回用量で前記合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAの少なくとも一方を投与し;ならびに
e.1日1回もしくは1日2回以上、前記合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAの少なくとも一方を投与し;ならびに
f.前記合成ポリヌクレオチドおよびsgRNAの少なくとも一方を、出生前、新生児、出生後、経口、眼内、鼻腔内投与し、および静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下もしくは筋肉内注射の少なくとも1つにより投与する
の少なくとも1つである、請求項83に記載の方法。
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