TW202023605A

TW202023605A - 達成基因組編輯之高特異性的方法

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Publication number: TW202023605A
Application number: TW108124751A
Authority: TW
Inventors: 繼武王; 安德魯Ｍ珈碼仕; 亞歷山大沃德
Original assignee: 美商綠陽生物科技及製藥公司
Priority date: 2018-07-13
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2020-07-01
Also published as: EP3820503A4; WO2020014577A1; US20220195403A1; KR20210031482A; CA3106162A1; EP3820503A1; JP2021530988A

Abstract

本發明揭示一種用於高效DNA序列改變之方法。該方法適用於編輯染色體，經由基因插入來工程改造細胞標記物，或藉由使用cas 9酶融合物產生表觀遺傳變化，其中酶可為DNA表觀遺傳修飾酶或染色質修飾酶等。該技術亦不同於所有先前已知之技術，不同點在於CRISPR/Cas系統可以「乾淨」之方式起作用，亦即其尚未與任何病毒接觸，或攜帶可在非預期位置插入染色體之DNA分子。

Description

達成基因組編輯之高特異性的方法

本發明係關於可用於DNA修飾之方法、組合物及套組以及系統，該等DNA修飾包括以DNA序列特異性方式之DNA序列基因嵌入或基因剔除、DNA突變、DNA表觀遺傳修飾、染色質修飾及其他類型基因組編輯。更特定言之，本發明係關於可在不使用任何載體的情況下遞送群聚且有間隔短回文重複序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)及其組分、突變、融合及變化形式之系統的方法。特定言之，本發明教示一種准許取代單核苷酸(包括與多能幹細胞一樣具有挑戰性之宿主細胞)之具有特異性及精確度之編輯基因之製程。

先前報導之於經培養哺乳動物細胞中之CRISPR/CAS研究依賴於DNA載體或反轉錄病毒/慢病毒用於遞送sgRNA及Cas酶兩者，例如參見美國專利第8,697,359號。質體DNA呈現隨機DNA整合至宿主基因組中之可能性，其在此項技術中廣泛已知(例如參見Valamehr等人2014年Stem Cell Reports )。用於遞送cas 酶基因或gRNA之反轉錄病毒或慢病毒載體需要整合至宿主基因中，之後其可將其攜帶之有效負載作為RNA或蛋白質分子遞送。另外，難以控制來自質體或病毒載體之表現量。儘管此等載體上之編碼基因之表現量與載體之複本數之間存在一般相關性，但關係為非線性及高度可變的。

揭示一種用於高效DNA序列改變之新穎方法。該方法可用於編輯染色體，經由基因插入來工程改造細胞標記物，或藉由使用cas 9酶融合物產生表觀遺傳變化，其中酶可為DNA表觀遺傳修飾酶或染色質修飾酶等。除藉由發明製程顯著提高之基因組編輯之效率以外，新穎技術亦不同於所有先前已知之技術，不同點在於CRISPR/CAS系統可以「乾淨」的方式起作用，亦即其尚未與任何病毒接觸，或攜帶可在非預期位置插入染色體中之DNA分子。亦應注意，所揭示之系統可產生先前不可達到的效率，同時將脫靶變化保持至最小值。本發明之效用可見於涉及DNA編輯或表觀遺傳修飾之幾乎所有區域中。相比之下，8,697,359專利並未教示如何提供一種可在真核細胞中有效獲得CRISPR/Cas同時使非預期基因組變化之潛在問題最小化之系統。

本發明提供一種基於RNA之系統，其提供Cas酶及導引RNA兩者，且在涉及DNA斷裂修復之情況下，提供「修補」模板RNA或DNA，所有均不需要任何外源DNA分子(除了DNA模板為用於DNA斷裂修復之較佳模板時)。本文所揭示之所有RNA CRISPR/Cas (如本文所使用，術語「所有RNA」主要係指CRISPR/Cas機構之組分之遞送且不排除作為模板之DNA)系統不需要任何病毒元件，該等元件對於製程或所得細胞之人類臨床使用可能產生問題。此系統可作為方法、製程或試劑套組提供以經由CRISPR/Cas促進之插入缺失、對單鹼基之精確度的基因組序列編輯或基因置換(在包括胚胎幹細胞(ESC)及誘導多能幹細胞(iPSC)之培養細胞中在CRISPR/Cas處理之後經由斷裂修復及置換)達成基因破裂，與本領域中已展示之效率及特異性相比效率及特異性增強。

本發明之一重要態樣為使用所有RNA遞送方法以在真核細胞中實現多核導引之基因組切割系統，其中設計尤其適用於哺乳動物細胞，以及憑經驗研發用於諸如多能性幹細胞之難以維持細胞之方法，該等細胞在經擾亂之情況下易於脫離多能性狀態。所揭示之方法亦將在諸如但不限於神經祖細胞、寡樹突神經膠質祖細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞等組織幹細胞中起作用。本文提供使用常見核苷三磷酸(NTP)或具有化學修飾之NTP引入gRNA作為活體外轉錄(IVT) RNA及引入Cas酶作為mRNA之方法。

除無佔據面積(不同於可整合至基因組中之質體載體)以外，本發明之另一態樣為使用RNA作為遞送格式使得Cas之酶活性水準更高，其導致更高成功率。在另一揭示內容中，高水準之酶活性可以高度可控制的方式在短時窗口內濃縮。RNA介導之高酶表現量之短暫性提供理想組合物用於染色體修飾之目的。短促的酶表現提供減少脫靶效應之額外益處，因為酶之長期存在，諸如來自質體DNA載體或整合病毒載體之酶可導致持續脫靶效應。

在本發明之另一態樣中，gRNA以各種比率遞送至Cas mRNA，有時涉及經由轉染多次遞送。因為一旦cas 之mRNA翻譯為Cas蛋白，蛋白質可能具有比mRNA及gRNA更長的半衰期。本文揭示內容表明，藉由調節gRNA量，其亦可稱為gRNA/cas mRNA比，除更通常見到的染色體之較長插入或缺失或重排以外，該方法可產生精確的單鹼基編輯。本發明之實例4表明所揭示之方法之精確度增加，其藉由可如何在人類iPSC純系中使用所有RNA方法改變染色體上之單鹼基之成功實例得以展示。

使用mRNA達成細胞培養物中之蛋白質表現延長之障礙為RNA本身可具有高度免疫原性(Kawai及Akira, 2007；Randall及Goodbourn, 2008)。哺乳動物細胞裝備有一組感測器，該等感測器可偵測外源性RNA，且活化抗病毒防禦路徑，其引發細胞生長抑制及細胞凋亡路徑，且經由分泌信號(諸如干擾素α及β)使相鄰細胞警示非常相同之刺激。諸如TLR3及RIG-I之更廣泛表現之感測器主要偵測雙鏈RNA (在許多病毒生命週期中，dsRNA之產生為獨特特徵)，但亦可藉由合成mRNA活化(Kormann等人, 2011)。在用mRNA產生iPSC過程期間，發現技術手段使針對合成mRNA之免疫原性反應降至最低(Warren等人, 2010)。最切實可行的方法涉及在用經修飾之mRNA處理人類細胞時，併入經修飾核鹼基且使培養基補充重組型式之B18R蛋白，由牛痘病毒天然表現以鈍化對於感染的免疫反應的I型干擾素之細胞外誘餌受體。

在一個實施例中，將所有RNA CRISPR/Cas系統遞送至人類細胞中伴隨添加B18R。在另一實施例中，RNA分子可遞送至人類或非人類細胞中，此時RNA分子經充分純化以在活體外轉錄期間移除異常轉錄物。在另一實施例中，所遞送之RNA分子經修飾以避開細胞免疫偵測。總之，新穎CRISPR/Cas系統在此等態樣中為基因組工程改造提供技術支持：多核苷酸導引，不需要對各目標位點進行蛋白質工程改造；經RNA遞送完全控制之製程，不會留下基因組足跡；藉由改變處理時間而易於在不同細胞類型中達成所需修飾效率；相比於ZFN或TALEN或先前報導之CRISPR/CAS方法，由於較短時間窗口中之所設計的較高酶活性而具有較高成功率及較低脫靶效應；高效製程中之精確基因修飾，可在不擾動幹細胞狀態的情況下在多能幹細胞中進行，可至少部分由先前未知及幾乎不可控制之因子實現-gRNA/cas -mRNA比，若使用質體、病毒載體及核糖核蛋白(RNP)，則其並非最佳。與近來公開之CRISPR/CAS系統相比，所揭示之所有RNA格式獨特地實現非吾人所樂見之染色體改變之最小化。

本文所揭示之方法係基於經由cas mRNA調節gRNA及CAS酶之劑量之出人意料的益處。吾人揭示遞送之時間及頻率，以及遞送至人類細胞及藉由簡單擴增遞送至任何哺乳動物細胞中之方法；使用類似方案，本文所描述之CRISPR/CAS系統亦可用於其他類型之細胞中，諸如植物、酵母、細菌之彼等細胞。

在上文所論述之本發明之態樣之實施例中，本文揭示用於基因組編輯之方法，該等方法使用編碼Cas9酶及sgRNA之合成mRNA之組合。在此態樣之實施例中，編碼Cas9及sgRNA之mRNA含有5'二鳥苷帽及多聚(A)尾，以及使mRNA對細胞毒性較小的經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸包含5-甲基-胞嘧啶、2-硫尿嘧啶或假尿嘧啶。在一些實施例中，編碼Cas9之mRNA 連同B18R一起給出。

在本發明之另一態樣中，本文揭示使用Cas9蛋白質之突變形式對DNA或基因組作出精確變化之方法，該等突變形式含有其核酸內切酶基因中之一者或兩者之突變。在此態樣之實施例中，申請人已產生三種非天然產生之突變Cas9蛋白質，在其核酸內切酶活性位點具有突變。此等突變Cas9蛋白質由SEQ ID NO:2、3及4編碼。

本發明之另一態樣為使得能夠極其精確地修復基於使用突變Cas9蛋白質之點突變的方法。在一個實施例中，非天然存在之CRISPR-Cas系統包含編碼突變Cas9蛋白質之mRNA，該突變Cas9蛋白質在其核酸內切酶活性位點中具有突變；及至少一個編碼導引RNA之mRNA，該導引RNA在進入細胞中之後產生突變Cas9蛋白質及導引RNA。在進入之後，Cas9蛋白質及導引RNA靶向具有單點突變之DNA的靶序列且與具有單點突變之DNA的靶序列雜交，在突變Cas9蛋白質與導引RNA起作用後校正該靶序列中之突變。

在一個實施例中，本文揭示用於基因組編輯之方法，其使用編碼Cas9酶及sgRNA之合成mRNA之組合。在一些實施例中，編碼Cas9及sgRNA之mRNA含有5'二鳥苷帽及多聚(A)尾。在一些實施例中，亦提供促進DNA斷裂之模板。模板可為雙鏈DNA分子或單鏈DNA分子。在一些實施例中，模板為RNA分子。在此方法之一個實施例中，Cas9具有破壞兩個核酸內切酶活性位點中之一者的突變。Cas9蛋白質突變由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3編碼。一個Cas9蛋白質突變在兩個核酸內切酶活性位點中具有突變且由SEQ ID NO:4編碼。在該方法之另一個實施例中，使Cas9與可改變DNA或染色質蛋白上之表觀遺傳標記物的另一種酶融合。在該方法之一些實施例中，Cas9 mRNA:sgRNA之間的莫耳比在1:1,000至1,000:1之間。在該方法之一些實施例中，Cas9 mRNA:sgRNA之間的莫耳比介於1:1,000至1,000:1之間。在一些實施例中，Cas9 mRNA:sgRNA之莫耳比為1:1,000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:150、1:100、1:50、1:40、1:30、1:25、1:20、1:15、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4.75、1:4.5、1:4.25、1:4、1:3.75、1:3.5、1.3.25、1:3、1:2.9、1:2.8、1:2.75、1:2.7、1: 2.6、1:2.5、1:2.4、1:2.3、1:2.25、1:2.2、1:2.1、1:2、1:1.9、1:1.8、1:1.7、1:1.6、1:1.5、1:1.4、1:1.3、1:1.2、1:1.1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.25:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.75:1、2.8:1、2.9:1、3.0:1、3.25:1、3.5:1、3.75:1、4:1、4.25:1、4.5:1、4.75:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、40:1、50:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:1、500:1、550:1、600:1、650:1、700:1、750:1、800:1、850:1、900:1、950:1、1,0000:1或在兩個所述比之間的任何比之範圍。在另一實施例中，將靶向不同位點之多個sgRNA與編碼來自不同物種之一或多個不同Cas9酶或具有不同突變之mRNA分子組合引入至相同細胞中。在本文所揭示之方法中，修復模板經由與sgRNA融合如在一個分子上定位於DNA斷裂位點。在一些實施例中，修復模板經由與結合Cas9之適體融合而定位於DNA斷裂位點。

所揭示方法之精確度賦能性使得所揭示之技術最適合於產生用於治療人類疾病之細胞，該等人類疾病諸如但不限於甲基丙二醯基-CoA變位酶缺乏症、3-甲基巴豆醯基-CoA羧化酶缺乏症、高歇氏病(Gaucher's disease)、奧登症候群(Ogden syndrome)、勒-奈二氏症(Lesch-Nyhan syndrome)、利氏病(Leigh disease)、丙酮酸去氫酶缺乏症、3-羥基-3-甲基戊二醯基-CoA解離酶缺乏症、羧基酶缺乏症、多發性遲發性富馬酸酶缺乏症(multiple, late-onset, fumarase deficiency)、進行性骨化性纖維發育不良、正聚糖酶1缺乏症、思德魯斯型X連鎖智力遲鈍(siderius type X-linked mental retardation)、苯酮尿症、泰-薩二氏症(tay-sachs disease)、α-半乳糖苷酶A缺乏症、鐮狀細胞貧血、楓糖漿尿病。

相關申請

本申請案主張2018年7月13日申請的美國第62/697,955號之優先權，其全文(包括圖式)併入本文中。

當描述本發明時，本文中未定義之全部術語具有其在此項技術中公認之常見含義。在以下描述具有本發明之具體實施例或特定用途的意義上，意欲僅為說明性的且不限制所主張之發明。以下描述意欲涵蓋包括於本發明之精神及範疇中之所有替代方案、修改及等效物。

本領域中之其他工作者已嘗試使用活體外轉錄之cas mRNA及gRNA，但未成功或效果有限。舉例而言，相比於ZFN，Kouranova等人(Hum Gene Ther . 2016年6月1日; 27(6): 464-475.)嘗試將質體、RNA及蛋白質作為Cas之遞送格式。其推斷出「不同於吾人使用ZFN mRNA之經驗，活體外經轉錄之Cas9 mRNA或Cas9表現質體DNA與活體外經轉錄之sgRNA之共轉染很少在大鼠C6細胞株中之目標位點處藉由核轉染引起高效裂解」。Liang等人(Journal of Biotechnology , 第208卷, 2015年8月20日, 44-53)亦比較用於將CRISPR/CAS遞送至各種哺乳動物細胞中之質體、mRNA及蛋白質。儘管其證實mRNA及RNP成型CAS蛋白兩者在產生插入缺失方面起作用，但不執行或呈現，且極不可能在其系統中實現同源定向重組(HDR)，其為用於精確編輯染色體上之鹼基之機制，一項困難得多之任務及經由CRISPR/CAS常常更為需要之結果。其他人已使用RNA分子用於CRISPR/CAS，但僅經由顯微注射用在受精動物卵或胚胎中，結果各不相同(Wu等人Cell Stem cell , 第13卷, 第6期, 2013年12月5日, 659-662；Liang等人Protein & Cell , 2015年5月, 第6卷, 第5期, 第363-372頁；Hruscha等人Development 2013 140: 4982-4987)。此等報導中無一者係基於如本文中所揭示之轉染過程，該轉染過程成功供維持在容器中之哺乳動物細胞培養物所使用，該等哺乳動物細胞培養物包括尤其諸如多能幹細胞之難以維持細胞。

在本發明之一個態樣中，基於mRNA之編碼來自不同細菌物種之野生型cas9 ，例如釀膿鏈球菌、變種鏈球菌、空腸曲桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌 (N. meningitidis) 、大腸桿菌、 新澤西弗朗西斯菌 (Francisella novicida )及已知含有II型CRIPSR系統之其他物種(Fonfara等人, 2013)。此類Cas9酶或其他Cas酶之基因可使用此項技術中已知之選殖技術自細菌基因組DNA或cDNA選殖。

在另一態樣中，在啟動子後方選殖cas9 基因，諸如細菌噬菌體T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或Sp6 RNA聚合酶或其他RNA聚合酶之啟動子。涵蓋啟動子、cas9 編碼DNA、編碼多聚(A)尾為適合於真核細胞中之穩定性及表現之mRNA的片段之卡匣可作為線性模板用於活體外翻譯(IVT)或選殖至載體(諸如質體、噬菌粒或DNA序列之其他載體)中(例如圖1)。此類載體之一個實例為本發明人先前所描述之pIVT質體(Warren等人, 2012)。

本文揭示產生編碼Cas蛋白之mRNA之方法。在一個實施例中，mRNA藉由在如本文所述之最佳化條件下活體外轉錄來產生。本發明之一實施例為合成mRNA轉錄物，其藉由併入5'二鳥苷帽及多聚(A)尾在活細胞中充當翻譯之高效模板。帽及尾可以酶促方式或以共轉錄方式併入IVT轉錄物中。酶加帽之益處包括高RNA產率、低成本及產生幾乎純加帽之RNA的潛能。然而，因為不存簡單方式來檢查酶加帽是否已成功進行，所以較佳使用更穩固之共轉錄加帽方法。在此方案中，合成帽類似物以高濃度包括在IVT反應緩衝液中，該帽基於試劑相應的反應濃度優先在轉錄物之5'端併入代替GTP。另一實施例為使用共轉錄方法聚腺苷酸化轉錄物：在IVT模板末端之聚(dA:dT)道驅動由RNA聚合酶併入尾。本發明之又一實施例為藉由聚腺苷酸化聚合酶將cas9 mRNA之多聚(A)尾添加至編碼區之末端(圖2)。

在一個態樣中，活體外轉錄較佳用諸如5-甲基-胞嘧啶、2-硫尿嘧啶或假尿嘧啶之經修飾之核苷酸三磷酸(NTP)或其他經修飾之核苷酸進行，該等經修飾之核苷酸能夠取代不顯著改變RNA功能之RNA分子中之未經修飾之核苷酸。使用經修飾之核苷酸幫助減少細胞免疫反應，當需要將mRNA重複遞送至宿主細胞中以在宿主細胞中實現所需水準之基因組修飾或宿主細胞對外源性RNA分子超敏感時，此為尤其重要的。

本發明另外關於sgRNA之產生。先前，作為用於CRISPR/CAS之導引之sgRNA經由DNA載體或病毒載體引入，由此編碼sgRNA之DNA置放在可驅動短RNA轉錄之啟動子(例如U6或H1啟動子)後方。作為本發明之一實施例，編碼DNA之sgRNA放置在適用於活體外轉錄之啟動子(例如T7、T3或Sp6啟動子)後方(圖1)。可使用涵蓋啟動子及編碼sgRNA之DNA的卡匣作為線性模板或選殖至諸如質體、噬菌粒或DNA序列之其他載體之載體中。轉錄終止亦可藉由具有轉錄終止子序列來達成。此類載體之一個實例為先前所描述之pIVT質體(Warren等人, 2012)。在本發明之一個實施例中，sgRNA藉由IVT使用修飾或未經修飾之NTP產生(圖2)。

本發明之一個態樣係關於Cas9酶之設計。野生型Cas9酶天然具有兩個核酸內切酶功能性結構域SEQ ID NO:1。藉由如本文中所描述之選擇性點突變，Cas9酶可將dsDNA切割酶轉化為單鏈DNA(ssDNA)切口酶，例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。另外，當兩個此類切口酶位於dsDNA分子之相對鏈上時，仍可產生雙鏈斷裂，但與由野生型Cas9產生之雙鏈斷裂相反，需要兩個sgRNA，由此為製程提供附加的序列特異性(圖4)。在一個實例中，產生mRNA以表現Cas9之此類突變體，該等突變體在由一個sgRNA導引時使一個鏈有切口。在另一個實施例中，cas9 mRNA編碼一個版本Cas9，其經進一步突變以移除其核酸內切酶結構域(SEQ ID NO:4)兩者且與人工核酸酶結構域融合，如限制酶FokI或其他此類限制酶的結構域(圖5)。 Cas9之所得突變體形式需要形成二聚體以充當核酸內切酶，其需要由該對sgRNA序列限定之目標位點靠在一起，較佳具有約5-30個或約10-20個核苷酸(nts)之間或約12-18 nts之間的距離，提供進一步特異性。

本發明的另一態樣係關於對CRISPR/CAS目標位點的選擇。已完全形成真核基因組上之較佳sgRNA匹配位點之設計。在本發明之一個實施例中，為了使染色體嵌入過程期間之目標特異性達到最大(藉由提供DNA模板用另一個序列段置換之一個序列段，其可與單一nt一樣短)，由此揭示：當選擇目標位點時藉由使用切口Cas9突變體或Cas9-FokI融合體來產生兩個雙鏈切割。圖4中說明一實例。

在一個額外實施例中，Cas9或其切口或鈍突變體與表觀遺傳修飾酶，諸如蛋白質精胺酸甲基轉移酶PRMT1及PRMT4 (CARM1)、DNA甲基轉移酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白醯基轉移酶等框內融合。當連同sgRNA引入靶細胞中時，此類融合Cas9酶將替代或除切割或置換dsDNA序列以外，修飾表觀遺傳資訊，諸如DNA甲基化、組蛋白乙醯化等。

在使用RNA提供sgRNA之一個態樣中，導引RNA、如典型sgRNA中之結構RNA，且必要時連接子RNA可在藉由Cas9酶切割之後進一步與用於局部修復之修補模板RNA融合。此項技術中已知RNA可用於同源DNA斷裂修復，其以引用之方式併入本文中(Storici等人, 2007)。

在另一實施例中，特異性結合於Cas9之DNA或RNA適體連接至序列置換「修補」模板以經由使用模板聚核苷酸實現基因嵌入或剔除。藉由實體上附接至Cas9酶，修補可靠近CRISPR/CAS切割位點遞送。修補模板可為DNA或RNA。

本發明之一個重要實施例係關於在適當絕對及相對劑量下遞送cas mRNA及sgRNA。使用RNA作為遞送遺傳資訊之形式之獨特優點中之一者為其在表現方面比使用DNA更可控制。為了表現蛋白質(諸如酶)，mRNA分子不需要易位至細胞核中，藉此消除通常藉由細胞核進入呈現之瓶頸，以及在DNA與mRNA之間的莫耳比方面具有不確定性之許多層。Cas蛋白可在編碼mRNA藉由轉染或電穿孔過程進入細胞質之後立即高度表現。此外，亦有益的是RNA分子天然地具有相對較短半衰期，因此相較於使用DNA載體或病毒載體，控制CRISPR/CAS系統之脫靶效應更可管理。

與給藥控制相關之本發明之另一實施例係關於調節gRNA Cas與mRNA之間的比。由於cas9 mRNA之劑量可基本上按比例與Cas酶之含量相關，因此特此揭示之所有RNA CRISPR/Cas系統能夠在CRISPR/Cas之兩個組分，亦即Cas酶與gRNA之間直接匹配，以便獲得最高命中目標及最低偏離目標DNA切割。實例實例1-產生cas9 IVT模板

將來自細菌釀膿鏈球菌 之編碼Cas9的DNA密碼子最大化，以在哺乳動物、尤其人類細胞中最佳表現。自經由商業基因合成服務(Gene Oracle)產生之3個片段組裝完整基因；在基因合成期間包括破壞DNA核酸內切酶結構域之突變，產生如在SEQ ID NO:1-4中所敍述之不同型式之cas9 。實例2-產生cas 9 mRNA

使用4:1比之抗-反相帽類似物(anti-reverse cap analog，ARCA)與GTP在IVT反應中產生合成mRNA，以產生高百分比之加帽轉錄物。在核苷酸三磷酸(NTP)混合物中使用20%之5 m-CTP取代CTP及2-硫基-UTP取代UTP以降低RNA產物之免疫原性。ARCA及經修飾之NTP購自Trilink Biotechnologies (San Diego)。製備2.5×NTP混合物(15:15:3.75:3:0.75:3:0.75 mM之ARCA:ATP:GTP:C:5m-CTP:UTP:假UTP)。各20 µL IVT反應物包含8 µL NTP混合物、2 µL 10×T7緩衝液、8 µL DNA模板及2 µL T7酶(Promega)。反應物在37℃下培育4-6小時且隨後在37℃下用1 µL不含核糖核酸酶之去氧核糖核酸酶額外處理30分鐘然後在旋轉管柱上純化，RNA產物在80 µL體積中溶離。添加8 µL 10×PAP緩衝液及8 µL 10 mM ATP及2 µL PAP(NEB)持續10 min以添加多聚(A)尾，隨後添加3 µL南極磷酸酶(Antarctic Phosphatase) (New England Biolabs)持續10 min，以自未加帽之轉錄物及10 µL反應緩衝液移除免疫原性5'三磷酸部分。在37℃下培育磷酸酶反應物30分鐘且必要時再純化IVT產物(圖2)。實例3-藉由IVT產生sgRNA

使用4:1比之ARCA帽類似物與GTP在IVT反應中產生合成sgRNA，以產生高百分比之加帽轉錄物。在核苷酸三磷酸(NTP)混合物中使用20%之5m-CTP取代CTP及2-硫基-UTP取代UTP以降低RNA產物之免疫原性。帽類似物及經修飾之NTP購自Trilink Biotechnologies。製備2.5×NTP混合物(15:15:3.75:3:0.75:3:0.75 mM之ARCA:ATP:GTP:C:5m-CTP:UTP:假UTP)。各20 µL IVT反應物包含8 µL NTP混合物、2 µL 10×T7緩衝液、8 µL DNA模板及2 µL T7酶(Promega)。反應物在37℃下培育4-6小時且隨後在37℃下用1 µL不含核糖核酸酶之去氧核糖核酸酶再處理30分鐘，然後在旋轉管柱上純化，RNA產物在80 µL體積中溶離。添加3 µL 南極磷酸酶(New England Biolabs)持續10分鐘，以自未加帽之轉錄物及10 µL反應緩衝液移除免疫原性5'三磷酸部分。在37℃下培育磷酸酶反應物30分鐘且必要時再純化IVT產物(圖2)。實例4-修飾人類細胞中之報導基因

為了證明所揭示之系統之效用，產生完整的所有RNA CRISPR/CAS系統以破壞在哺乳動物細胞NIH-3T3中永久表現之螢光蛋白(FP) mWasabi (Allele Biotech)。NIH3T3-mWasabi細胞在無血清培養基中以15%匯合度生長，將cas 9 mRNA及sgRNA共轉染至細胞中；2小時之後，添加含血清之培養基。如圖3中所示，自左至右，細胞接受0、0.2或0.8 ng針對mWasabi位點nt43 (W43)之sgRNA，如以下各圖所指示。頂部圖展示細胞所處之位置(相差)；底部圖展示仍為螢光(綠色螢光通道)之細胞。右側底部圖中之三個箭頭指向孔中失去綠色螢光的細胞，該孔連同cas 9 mRNA一起接受較高劑量之sgRNA。0或0.2 ng sgRNA孔中無細胞失去綠色螢光。實例6-用於經由基於mRNA之CRISPR/Cas9系統產生單鹼基對突變之方法實施例。 A.序列設計：

I. sgRNA之序列設計之例示性方法實施例：

1) 圍繞預期突變位點之300 bp序列穿過基於網站之sgRNA設計工具。(「MIT Crispr Design Tool」MIT)。2) 導引RNA選擇藉由2個參數測定：a)對預期突變之接近程度，以及b)潛在偏離目標評分。3) 選擇最少兩個sgRNA位點。(最佳參數為5 bp預期突變內之PAM位點及＞70之sgRNA評分。)

II.用於設計單鏈寡核苷酸供體(ssODN)修復模板之例示性方法實施例：

1) 獲得具有以預期突變為中心之同源臂之60-100 bp序列。2) 視情況：工程改造沉默突變以破壞原型間隔區相鄰基序(PAM)位點(亦即，自NGG至NGT、NGA或NGC)。3) 視情況：工程改造離預期突變＜10 bp之沉默突變以產生限制位點。此可促進篩選過程。4) 經由IDT 「Ultramer」服務(標準脫鹽4奈莫耳)獲得ssODN (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa)。

III.用於基因組DNA擴增之例示性方法實施例：

1) BLAST搜索假基因或其他高度類似基因組序列之基因組區域。2) 設計及測試引子對之多個集合以使用基因組DNA溶解物模板擴增圍繞預期突變為中心的約400-600 bp區域。3) 基於擴增穩固性(亦即高產率及無非特異性條帶)選擇最佳引子對用於篩選經CRISPR處理之細胞。4) 對PCR產物進行測序以驗證擴增子之品質測序讀數。

IV.用於基於qPCR之篩選的例示性引子：

1) 選擇qPCR引子之Tm為約64℃。2) 正向引子離預期突變可為約100 bp，且包含於自步驟III產生之擴增子內。3) 反向引子(突變特異性)可在5'前端具有預期突變。 B.sgRNA 及 Cas9 Wt mRNA 之活體外轉錄 (IVT) 之例示性方法實施例。

I.對於IVT模板產生sgRNA而言。1) 設計且合成具有以下3個元件之正向引子：a) T7啟動子，b)原型間隔區元件序列(步驟A.I.2)及c) crRNA特異性序列。使用通用反向引子(sgRNA_Rev)完成引子對。2), 使用此等引子及pT7sgRNA質體作為模板，進行PCR反應以產生IVT模板(約131 bp)。DpnI分解反應樣品且進行PCR清除，因此其可適用於活體外轉錄反應。

II.用於IVT模板產生Cas9wt之例示性方法實施例 1) 使用pIVT-Cas9wt質體作為模板且使用INS-F + d(T)120-Rev作為引子對，進行PCR反應以產生IVT模板。2) 對所得PCR產物進行PCR清除，使得其適用於活體外轉錄。

III.用於IVT反應以產生CRISPR元件之例示性方法實施例。1) 使用經由PCR產生之模板，進行IVT反應以轉錄該sgRNA及Cas9wt mRNA。2) 經由凝膠成像及生物分析儀(Agilent)純化及QC轉錄物。

IV.用於經由活體外裂解測試來驗證IVT sgRNA之例示性方法實施例。1) 藉由擴增含有靶序列之基因組DNA之片段來產生裂解模板用於驗證IVT轉錄之sgRNA。(步驟A.III.3中製得)。2) 使用來自B.III.1之sgRNA以及重組Cas9核酸酶之組合進行裂解模板之裂解反應(參見下文方案III)。3) 分別呈1:1.2比之複合Cas9及sgRNA。4) 將RNP複合物與裂解模板擴增子以10:1比培育，隨後在瓊脂糖凝膠上進行反應。5) 藉由觀測較低分子量裂解條帶分析凝膠以評估裂解效率。 C.基於 qPCR SYBR Green 之篩選的例示性方法實施例。

I.建構質體及擴增子標準物： 1) 經由吉布森(Gibson)組件，將所關注之區域(使用具有pIVT相容重疊之引子自基因組DNA模板擴增)次選殖至pIVT載體中。插入物在400-600 bp之間。此稱為「WT」載體。2) 使用QuickChange定點突變誘發套組(Agilent)，產生預期之單點突變(遵循設計突變誘發引子及用於熱循環參數之套組程序)。所得構築體稱為「突變」載體。3) 用A.III中設計之引子擴增「WT」及「突變」構築體以產生「WT」及「突變」擴增子。視情況選用：經桑格(Sanger)序列純化之PCR產物以證實WT及突變序列。4) 使用Nanodrop分光光度計定量擴增子，隨後藉由稀釋擴增子降至各為60 fg/µl使濃度標準化。在進行濃度之標準化之後，組合以下比： 0%「突變」，100%「WT」 1%「突變」，99%「WT」 10%「突變」，90%「WT」 50%「突變」，50%「WT」

II.用於分析qPCR上之標準物之例示性方法實施例： 1) 用以下各者設定qPCR板：a)模板：步驟I中形成之標準物(包括複製品) b)引子：使用A.IV中所設計之引子。2) 用SYBR green報導子進行標準定量RT-PCR程式且比較各標準點之Ct值。Ct值反映相對突變群體比(較高突變比產生較低Ct值)。3) 當相比於100% 「WT」時，1%「突變」標準物具有約≥2之ΔCt。在ΔCt≥2之情況下，基於qPCR之篩選方法可以可靠地偵測靈敏度為至少1%之突變。 D.用於轉染靶細胞 (iPSC) 之例示性方法實施例。

I.塗覆例示性靶細胞： 1) 細胞在繼代期間在補充有ROCK抑制劑(Y27632)之E8培養基中培養。2) 在轉染前一天，細胞以2.5x10⁵ 個細胞/孔之密度繼代至6孔板中。

II.用於轉染CRISPR元件之例示性方法： 1) 在接種後一天，細胞密度為至少雙倍且展現一至四個細胞之小叢集。2) 使用Messenger Max轉染試劑用B.III.1中產生之IVT RNA CRISPR元件及A.II.4中供應之ssODN轉染細胞。另外，進行僅含有ssODN之陰性對照轉染。為了估算轉染效率，陰性對照亦應含有100 ng mRNA，其編碼諸如mNG之螢光蛋白。3) 在轉染之後四小時用新鮮預溫熱之E8培養基(補充有Y27632)置換轉染培養基。4) 次日(約12-18小時後)，檢查陰性對照孔中之mNG表現。當表現穩固時，在實驗及陰性對照孔中進行sgRNA及ssODN之第二次轉染。Cas9 mRNA可在重複轉染中反覆遞送。在重複轉染之後四小時，用新鮮E8 (含Y27632)置換轉染培養基。5) 使細胞再培養2天，隨後以1:3稀釋度繼代至另一6孔板中。將殘存細胞溶解且分析。 E.用於篩選及選殖經CRISPR處理之細胞之例示性方法實施例。

I.用於溶解經處理細胞及擴增gDNA以用於篩選之例示性方法實施例。1) 自D.II.5實驗及陰性對照孔進行殘存細胞之溶解。細胞再懸浮於對偶基因之小鼠尾部溶解緩衝液(Allele Biotech, San Diego)中且使用溶解程序在熱循環儀中操作樣品。使用Herculase II融合DNA聚合酶(Agilent Technologies)使用A.III.3中所設計之引子擴增所得溶解物(＜26個週期)。對PCR產物進行PCR清除。所得實驗及陰性對照擴增子文庫稱為實驗及陰性對照「大群體」。2) 使用Nanodrop定量PCR產物，進行稀釋以將所有擴增子標準化為60 fg/µl。

II.用於篩選大群體之例示性方法實施例： 1) 進行基於SYBR green之標準定量qPCR篩選，其中使用在前一步驟中製備之大的擴增子文庫及在C.I.4.2中製備的標準物。當實驗與陰性對照文庫之間的ΔCt為≥2時，且根據標準物在1%突變群體之範圍內時，繼續進行單細胞選殖步驟。參見圖7。

III.用於單細胞、96孔板繼代之例示性方法實施例： 1) 使用TrypLE使來自第2代CRISPR實驗細胞之細胞解離。使細胞通過70 µm細胞濾網以產生單細胞懸浮液，隨後測定細胞計數且計算將產生2-3個細胞/100 µl之稀釋度； 2) 在預溫熱之E8 (補充有Y27632)中，在四個經Matrigel塗佈之96孔板中接種2-3個細胞/孔(100 µl/孔)； 3) 次日，藉由顯微鏡快速證實附著細胞之存在。孔應該具有每孔0-3個細胞(不必檢測每個孔)。每日更換一半培養基(抽出50 µl，添加補充有Y27632之50 µl預溫熱之E8)； 4) 在已確立生長成約50-100個細胞叢集之後(通常約七天)，切換至非補充有Y27632之E8且每隔一天更換培養基。

IV.用於製造複製板以用於篩選的例示性方法實施例： 1) 一旦細胞已達到＞70%匯合，則將具有EDTA之經新Matrigel塗佈之96孔板上之1/4細胞繼代至補充有Y27632之E8培養基中。所得板稱為「複製板」。將剩餘3/4之細胞留存在具有新鮮預溫熱的補充有Y27632之E8培養基的源板中(細胞將再附著)。2) 對於複製板及來源板兩者每天用補充有 Y27632之E8 置換培養基。3-5天之後，源板應準備用於溶解及分析。

V.用於篩選純系板之例示性方法實施例：1) 在源板上進行溶解方案(與E.I.1相同)。對具有2個溶解物體積之3個孔進行測試PCR以鑑別最佳溶解物模板體積。2) 對來自源板之細胞溶解物進行板PCR。一旦PCR完成，則使來自板的PCR產物在大型瓊脂糖凝膠上操作以證實擴增且提供擴增產率之任何變化的記錄。3) 使用SurfaceBind Purification Plate (Allele Biotech)，根據方案純化PCR產物。在30 µl溶離緩衝液中溶離。4) 將經純化之PCR產物1:1000稀釋於分子級水中。使用2 ml收集板來維持板格式。擴增子文庫現在在適合用於篩選之濃度下。5) 對來自四個96孔板之擴增子文庫進行基於SYBR green之標準定量qPCR篩選。視情況：包括在對應於板中之空孔的任何孔位置(亦即其中細胞不能附著/生長)中之陽性對照(1%突變標準文庫)及陰性對照(使用陰性對照擴增子文庫)。6) 最左移之qPCR Ct曲線(此「離群值」)表示最有可能含有突變細胞群體(亦即，具有預期HDR事件)之孔。對與.所有離群值孔對應之原始純化擴增子文庫儲備液進行桑格測序分析(Sanger sequencing analysis)。

VI.選擇純系且擴增之例示性方法實施例： 1) 分析來自E.V.6之測序結果以證實預期突變之存在，且基於層析圖中之峰之比測定突變群體之相對大小(亦即在混合群體之情況下)。藉由自E.IV.1中製得之複製板繼代來擴增經證實之離群值孔。在第一輪擴增中，將來自96孔板之單個孔繼代至12孔板中之單個孔。 a) 當測序結果指示混合群體時，執行第二輪單細胞選殖(重複自E.III開始的步驟)。在細胞在12孔板中達到匯合(約10⁵ 個細胞)之後，擴增且凍結所證實之離群值，且繼續進行第二輪單細胞選殖。建議：對任何剩餘細胞進行溶解、擴增及測序以測試在繼代之後是否保留突變。 b) 當測序結果指示純群體(亦即，對應於WT及突變體之層析圖峰之比為1: 1[指示異種接合群體])時，藉由第二輪分析單細胞選殖，分析24至48個孔證實細胞為異種接合的。將細胞擴增至6孔板格式。以10⁶ 個細胞/小瓶之濃度冷凍保存細胞。對一部分細胞進行裂解、擴增及測序以測試在繼代之後何時保留突變。方案

I.用於產生sgRNA IVT模板之例示性方法實施例。材料：-pT7sgRNA質體、sgRNA反向引子、定製sgRNA正向引子、10 mM dNTP、具有5X GC緩衝液之Phusion聚合酶(New England Biolabs)、DpnI限制酶、NucleoSpin®凝膠(Clontech)及PCR清除、分子級H₂ O、1%瓊脂糖凝膠/1 X TAE操作緩衝液、Bioline 1 kb DNA梯度如下表1中組合PCR反應物：表1-PCR反應物之組合

1 µl	pT7sgRNA模板(約50 ng)
2 µl	定製sgRNA正向引子(10 µM)
2 µl	sgRNA 反向引子(10 µM)
8 µl	5×PCR緩衝液(GC)
0.8 µl	10 mM dNTP
0.4 µl	聚合酶(NEB Phusion)
40 µl	總體積

在組合之後，如表2中所描繪操作程式表2-操作程式

95℃	3 min
95℃	30 s
67℃	30 s
72℃	20 s
30 個週期
72℃	5 min
10℃	保持不變

2) 在1%瓊脂糖凝膠上用1 Kb DNA梯度操作2 µl PCR產物，證實131 bp之產率及正確大小。 3) 直接添加1 µl DpnI酶至PCR反應物中且在37℃下培育15 min以分解模板質體。 4) 根據製造商的方案使用NucleoSpin套組來進行PCR清除。 5) 模板準備用於活體外轉錄反應。

II.用於IVT模板產生Cas9WT之例示性方法實施例。材料： -pIVT-Cas9WT質體 -尾120反向引子 - 插入物-F正向引子 - KAPA Biosystems之HiFi HotStart ReadyMix -NucleoSpin®凝膠及PCR清除 -分子級H₂ O -1%瓊脂糖凝膠/1X TAE操作緩衝液 -Bioline 1 kb DNA梯度 1) 如下表3組合PCR反應物：表3-PCR反應物組分

1 µl	pIVT-Cas9wt模板(約10 ng)
12 µl	尾120反向(1 µM)
12 µl	插入物-F (1 µM)
25 µl	Kapa HiFi ReadyMix
50 µl	總體積

2) 在1%瓊脂糖凝膠上用1 Kb DNA梯度操作2 µl PCR產物，證實約4.5 kb之產率及正確大小。 3) 根據製造商的方案使用NucleoSpin套組來進行PCR清除。 4) 模板準備用於活體外轉錄反應。

III.用於表現重組Cas9之例示性方法實施例。材料： -pCold-Cas9Wt質體 -SOC培養基 -2XYT培養基 -卡本西林(Carbenicillin) -LB-瓊脂板 -NEB表現勝任細胞 -1 M IPTG -高密度鈷樹脂 -偶合緩衝液(100 mM磷酸鹽，150 mM NaCl) -溶解緩衝液(50 mM NaPO₄ ，300 mM NaCl，5 mM咪唑) -溶離緩衝液(100 mM NaPO₄ ，150 mM NaCl，200 mM咪唑) -透析緩衝液(300 mM NaCl，10 mM Tris-HCl pH 8.0，0.1% Tween a) 細菌表現： 1) 用pCold-Cas9Wt質體轉化大腸桿菌宿主菌株(NEB表現)且選擇LB-卡本西林選擇板上之轉化子。 2) 在包括(100 µg/ml卡本西林)之5 ml培養基中接種轉化子，且在搖動下在37℃下培養24小時。 3) 次日，將成長的5 ml培養物添加至具有500 ml 2XYT-Carb之2.5 L大燒瓶中。在OD600=0.4-0.5時，將培養液快速冷卻至15℃且使其靜置30分鐘。 4) 添加IPTG，最終濃度為0.1-1.0 mM，且在15℃在搖動下繼續培養24小時。 5) 自搖動恆溫箱移出隔夜培養物。 6) 將培養物倒入乾淨的Oakridge管中。 7) 對於500 mL或更大量之培養物，僅能夠將一半培養物倒入管中。 8) 在Sorvall離心機中在室溫下以5,000 g旋轉Oakridge管10-15分鐘。 9) 確保Oakridge管之接縫不面向旋轉器之中心以免打破管。 10) 當旋轉完成時，自管傾析上澄液。 11) 當處理大量培養物時重複先前3個步驟。 B.細胞溶解 1) 藉由添加25 mL溶解緩衝液且輕緩旋動使存在於Oakridge管中之集結粒再懸浮。 2) 一旦集結粒已完全再懸浮，則將再懸浮液倒入50 mL超高效管中。 3) 使用溶解緩衝液使50 mL管之體積達至50 mL。 4) 將此50 mL體積分至兩個50 mL超高效管中。(各25 mL)。 5) 將兩個管置放於冷凍機(-20℃)中直至完全冷凍(或用於長期儲存)。完全凍結通常耗費1-3小時。 6) 自冷凍機移出管且完全解凍。 7) 添加若干滴去泡劑(2-3)。 8) 將管置放於冰上且音波處理最多3分鐘。 *注意音波器之探針並不觸碰管之底部，而是與其接近。 9) 將管置放於艾本德離心機(Eppendorf centrifuge)中且在4℃及最大速度下旋轉15分鐘。 10) 確保離心機恰當平衡。 11) 在管短暫離心時，將約5 mL鈷漿料倒入50 mL滅菌管中。 12) 將20 mL溶解緩衝液添加至鈷漿料中。 13) 當鈷樹脂沈降至底部時，倒出溶解緩衝液。 13) 旋轉完成後，使用.7 um針筒過濾器過濾溶解物(上澄液)且將其添加至鈷樹脂中。 14) 在4℃下翻轉持續10-30分鐘。 c. His標籤純化 1) 將蛋白質/鈷漿料倒在滴灌管柱上且使其完全排出。沒有必要保存流過物或任何後續洗滌物。 2) 用15 ml溶解緩衝液洗滌先前含有蛋白質之50 ml管。 3) 將此洗滌液倒在滴灌管柱上。 4) 用10-15 mL偶合緩衝液洗滌管柱。使其滴灌。 5) 將15 ml無菌收集管置放於管柱下方。 6) 將15 ml溶離緩衝液倒在管柱上且收集在該管中之溶離蛋白質。 7) 量測蛋白質之濃度且儲存在4℃下直至需要。 d.透析 1) 經由.45 µm針筒過濾器將蛋白質過濾至30 kD旋轉管柱過濾器單元中。將透析緩衝液(視需要)添加至過濾器單元以使總體積達到15 mL。 2) 將過濾器單元置放於離心機(擺動桶旋轉器)中且在室溫下以4000 g旋轉20分鐘，或直至過濾器單元中剩餘之體積為1 mL或更小。 3) 自離心機移除過濾器單元。丟棄流過物。添加適量透析緩衝液以使總體積回至15 mL。倒置過濾器單元以混合。 4) 重複直至已達成至少4,000之稀釋因數。稀釋因數可計算如下：df=(V最終/V初始)。

IV.用於sgRNA及Cas9WT之活體外轉錄之例示性方法實施例。材料： -抗反向帽類似物，ARCA -2-硫基-UTP -5-甲基-CTP -rATP -rUTP -rGTP -rCTP -T7 RNA聚合酶 -轉錄最佳化5X 緩衝液 -DTT 100 mM -1 M MgCl₂ 溶液 -RQ1不含核糖核酸酶之去氧核糖核酸酶 -南極磷酸酶 -10X南極磷酸酶反應緩衝液 -TE緩衝液pH=8.0 -RNA Clean & Concentrator™-25 -TE緩衝液pH=7.0 1) 如下表4中組合IVT反應物：表4-IVT反應物之組分

試劑	體積(µl)
NTP	16
DTT，100 mM	4
轉錄最佳化5X緩衝液	8
MgCl₂ ，1 M	0.34
T7 RNA聚合酶 (20 U/µl)	4
模板DNA(在以上例示性方案I及II中製得)	8 (約500-800 ng)

2) 注意：在將模板DNA添加至1.5 ml無菌微量離心管中之前，將模板DNA添加至PCR管中。將此PCR管置放於已預加熱至37℃之PTC-100可程式化熱控制器中。藉由P200移液管，將32 µl備用母體混合物轉移至各反應物中。用移液管向上及向下吸取5次以充分混合。 3) 在37℃下於T100熱循環器中將此混合物培育4-6小時。 4) 如步驟8.2.3中完成進行活體外轉錄反應之後，向各反應物中添加2 µl RQ1不含核糖核酸酶之去氧核糖核酸酶以便移除DNA模板。 5) 在37℃下於T100熱循環器中培育混合物至少30分鐘。在來自步驟5.2.5之培育期完成之後，將5 µl 10X南極磷酸酶反應緩衝液及3 µl之南極磷酸酶添加至各反應物中。 6) 在37℃下於熱循環器中培育混合物至少30分鐘。 7) 在完成步驟7中之培育之後，檢驗E-凝膠上之mRNA。 i) 對於各樣品，使用P20移液管及適當大小之尖端在單獨PCR管中添加9 µl TE緩衝液pH=8.0與1 µl製備之mRNA。在相同尖端之情況下，使管內含物輕緩地旋動以混合。 ii) 繼續在E-凝膠上將各10 µl混合物裝入各孔。各樣品佔據一個孔。 iii) 操作E-凝膠電泳系統之內建程式8分鐘。關於操作指令參考 E-凝膠iBase Power System Equipment Manual。 iv) 藉由LED光檢查RNA條帶。當清晰RNA條帶已出現在正確大小位置時進行測定：Cas9大小：約4400 nt；sgRNA大小：約150 nt。 v) 當觀測到在正確大小位置處之單一、清晰RNA條帶時，繼續進行至步驟8。 8) 根據製造商的方案用RNA Clean&Concentrator™-25純化mRNA。 9) 對Nanodrop上之RNA產物進行定量。Cas9WT mRNA及sgRNA現準備用於下游使用。

V.用於iPSC培養之例示性方法實施例。材料 - TeSR™-E8™ - Corning® Matrigel® - 經組織培養物處理之培養器皿 - DPBS - Y-27632 (ROCK抑制劑) -PRG-1 EDTA -TrypLE 1X -Costar™無菌一次性試劑儲集器 -組織培養級96孔板 -Mr. Frosty (Thremo Scientific) -DMSO -HSA -Opti-MEM -MessengerMax轉染試劑(Thermo Fisher Scientific) a. )解凍 iPSC 1) 在解凍之前至少一小時，用Corning® Matrigel® (每孔1 mL，在DMEM中使用1:80稀釋度)塗佈6孔板之1孔； 2.) 在5% CO₂ 5% O₂ 細胞培養恆溫箱中用10 µM Y27632預先溫熱2 ml TeSR™-E8™持續30 min。 3. ) 取出一個iPS細胞株之小瓶，該iPS細胞株儲存於LN貯槽中或-80℃下。 4.) 將細胞之小瓶立即在37℃水浴中解凍； 5.) 用70%乙醇完全沖洗小瓶，將小瓶置於細胞培養罩中； 6.) 將細胞逐滴添加至在15 ml管中具有鈣及鎂之10 ml杜氏( Dulbeccos)之磷酸鹽緩衝鹽水(DBPS)中； 7.) 在室溫下以200 g離心2分鐘； 8.) 用70%乙醇完全沖洗管，將小瓶置於細胞培養罩中； 9.) 移除上澄液，添加預溫熱之具有10 µM Y27632之2 ml E8，輕緩地用移液管向上及向下吸取以再懸浮細胞。 10.) 將2 ml細胞懸浮液添加至經Matrigel塗佈之板之單孔中，輕敲板以輕緩地混合細胞。 11.) 用細胞株及繼代之名稱標記板。將燒瓶置於37℃ 5% CO₂ 5% O₂ 細胞培養恆溫箱中； 12.) 每隔一天更換培養基(用10 µM Y27632補充培養基直至群落大小超過50-100個細胞)。 b.)繼代(6孔板) 1.) 在繼代前至少一小時，用Corning® Matrigel® (每孔1 mL，在DMEM中使用1:80稀釋度)塗佈經組織培養物處理之板。 2.) 將足夠的TeSR™-E8™ (StemCell Technologies) (每孔2 mL於6孔板中)等分且升溫至室溫(15-25℃)。 3.) 用1 mL無Ca²⁺ 及Mg²⁺ 之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞且抽吸。注意：不需要移除已分化細胞之區域。 4.) 添加0.3 mL PRG-1，隨後在15 s內抽吸大部分PRG-1，在孔中留下約80 µl (以使得群落曝露於液體之薄膜)。 5.) 在37℃下培育3-5分鐘。 6.) 輕緩地輕敲板以幫助分離。添加1 mL TeSR™-E8™。 7.) 藉由輕移移液管而分離群落。將50-250 µl細胞/培養基混合物及種子加入新Matrigel塗佈之6孔板中。將2 ml補充Y27632之TeSR™-E8™添加至接種孔中。 8.) 將板置放於37℃ 5% CO² 5% O² 細胞培養恆溫箱中。每隔一天更換培養基(用10 µM Y27632補充培養基直至群落大小超過50-100個細胞)。 c.) 繼代單細胞(96孔板) 1.) 在繼代前至少一小時，用Corning®Matrigel® (50 µl/孔，在DMEM中使用1:80稀釋度)塗佈新的96孔板。 2.) 將足夠的TeSR™-E8™等分且升溫至室溫(15-25℃)。各96孔板需要約12 ml TesR-E8。 3.) 用1 mL無Ca²⁺ 及Mg²⁺ 之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞且抽吸。 4.) 添加0.4 mL TrypLE (以解離成單細胞)且在15秒內抽吸，使得群落曝露於液體之薄膜。 5.) 在37℃下培育3-5分鐘。 6.) 輕敲板以幫助分離。添加2 mL補充Y27632 之TeSR™-E8™且用移液管向上及向下吸取。用移液管向上吸取細胞且使用37 µm細胞濾網將其濾至15 ml錐形管中。 7.) 藉由將75 µL來自步驟6之細胞用移液管移至卡匣之填充端口中，使用Moxi Z細胞計數器及Moxi Z卡匣進行細胞計數。讀出單位為細胞/毫升。 8.) 在大多數情況下，細胞計數應在300,000至500,000個細胞/毫升之間。進行連續稀釋以得到補充Y27632之TeSR™-E8™中之2-3個細胞/100 µL濃度。 9.) 在24小時之後，檢查孔之單細胞。 10.) 藉由移除50 µl培養基及添加50 µl新鮮補充Y27632之TeSR™-E8™每天更換一半培養基，直至約50-100細胞群落形成(通常7天)。每隔一天繼續進行全部培養基更換(無Y27632)直至80%之匯合度。板現準備用於複製。 d.) 複製板(96孔板) 1.) 在繼代前至少一小時，用Corning®Matrigel® (50 µl/孔，在DMEM中使用1:80稀釋度)塗佈新96孔板。 2.) 將足夠的TeSR™-E8™等分且升溫至室溫(15-25℃)。各96孔板複製需要20 ml培養基。 3.) 用無Ca²⁺ 及Mg²⁺ 之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) (100 µl/孔)洗滌細胞且抽吸。 4.) 將50 µl PRG-1 EDTA添加至各孔中且抽吸40 µL，使得群落曝露於液體之薄膜。 5.) 在37℃下培育3-5分鐘。 6.) 在培育期間，將75 µl補充Y27632之TeSR™-E8™添加至步驟1中製備之複製96孔板之各孔中。 7.) 輕敲板以幫助分離。添加125 µl補充Y27632之TeSR™-E8™且用移液管向上及向下吸取。 8.) 用移液管吸取125 µl分離細胞中之25 µl至複製96孔板中。確保保存板之定向。源板及複製板現均應具有100 µl培養基。 9.) 將板置放於低氧恆溫箱中。應每隔一天進行全部培養基更換直至源板準備好溶解且分析。 e.) 孔/純系擴增 1.) 在繼代前至少一小時，用Corning®Matrigel® (0.5 ml/孔，在DMEM中使用1:80稀釋度)塗佈新的12孔板。 2.) 將足夠的TeSR™-E8™等分且升溫至室溫(15-25℃)。 3.) 用無Ca²⁺ 及Mg²⁺ 之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) (100 µl/孔)洗滌所選擇之細胞且抽吸。 4.) 將50 µl PRG-1 EDTA添加至各孔中且抽吸40 µL，使得群落曝露於液體之薄膜。 5.) 在37℃下培育3-5分鐘。 6.) 輕敲板以幫助分離。添加100 µl 補充Y27632之TeSR™-E8™且用移液管向上及向下吸取。 7.) 將所有100 µl細胞培養基混合物用移液管吸取至步驟1中製備之12孔板中。額外添加1 ml補充 Y27632之TeSR™-E8™。用適當來源標記孔。 8.) 每隔一天進行全部培養基更換直至80%之匯合度。 9.) 根據V.b中概述之方案將細胞分流至6孔板上。此等細胞可在匯合後繼續冷凍保存步驟。 f.) 冷凍保存 1.) 將足夠的TeSR™-E8™等分且升溫至室溫(15-25℃)。 2.) 用1 mL無Ca²⁺ 及Mg²⁺ 之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞且抽吸。 3.) 添加0.3 mL PRG-1，隨後在15秒內抽吸大部分PRG-1，在孔中留下約80 µl (以使得群落曝露於液體之薄膜)。 4.) 在37℃下培育3-5分鐘。 5.) 輕緩地輕敲板以幫助分離。添加3 mL具有Ca²⁺ 及Mg²⁺ 之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。 6.) 藉由輕移移液管而分離群落。將細胞轉移至15 ml錐形管中。 7.) 在室溫下以300×g離心3分鐘以使細胞集結。抽吸PBS。 8.) 將集結粒再懸浮於冷凍保存培養基(補充Y27632之TeSR™-E8™，10% HSA及10% DMSO)中使得濃度為1-0.5×10⁶ 個細胞/毫升。 9.) 將1 mL細胞聚集體轉移至經標記之冷凍小瓶中。 10.) 使用Mr.Frosty於-80℃之冷凍器中冷凍細胞聚集體，隨後在-135℃(液氮)或更冷之溫度下長期儲存。在-80℃下之短期儲存(＜3個月)為適合的。 g.) 繼代用於轉染 1.) 在轉染前一天，根據以下方案將250,000個細胞/孔接種至Matrigel塗佈之96孔板上： i. 在繼代前至少一小時，用Corning®Matrigel® (1 ml/孔，在DMEM中使用1:80稀釋度)塗佈新的6孔板。 ii. 將足夠的TeSR™-E8™等分且升溫至室溫(15-25℃)。 iii. 用1 mL無Ca²⁺ 及Mg²⁺ 之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞且抽吸。 iv. 添加0.4 mL TrypLE (以解離成單細胞)且在15秒內抽吸，使得群落曝露於液體之薄膜。 v.在37℃下培育3-5分鐘。 vi. 輕敲板以幫助分離。添加2 mL 補充Y27632之TeSR™-E8™且輕緩地用移液管向上及向下吸取。使用37 µm細胞濾網將其濾至15 ml錐形管中。 vii. 使用Moxi Z細胞計數器及Moxi Z卡匣進行細胞計數。 viii. 在已知細胞計數下，添加適當體積之細胞使得每孔接種250,000個細胞。添加適量補充Y27632之TeSR™-E8™以使孔體積達至2 ml。 2.) 在12-18小時之後，細胞應呈小型2-5個細胞叢集。在轉染之前細胞密度應為約70-80%。 h.) 轉染 1.) 在室溫下，將MessengerMAX轉染試劑及5 ml Opti-MEM平衡10分鐘。 2.) 根據表5組合轉染複合物：表5-轉染複合物之組合

	MessengerMAX	Opti-MEM
管1-AM	5 µl	125 µl
管2-AM	1 µl	50 µl
管1-BM	1 µl	25 µl
管2-BM	1 µl	25 µl

3.) 在與根據表6之經稀釋之mRNA混合之前，將經稀釋之MessengerMax培育10分鐘：表6

	Cas9 mRNA	sgRNA	mNG mRNA	Opti-MEM
管1-A	1.5 ug	0.35 ug		125 µl
管2-A			0.20 ug	50 µl

根據表7稀釋ssODN。表7

	ssODN	Opti-MEM
管1-B	在10 µM，1 µl	25 µl
管2-B	在10 µM，1 µl	25 µl

如下表8中混合經稀釋之mRNA及MessengerMax轉染試劑：表8

混合	內含物
管1-A與管-1AM	CRISPR元件
管2-A與管-2AM	FP陰性對照
管1-B與管-1BM	ssODN
管2-B與管-2BM	ssODN

培育複合物5分鐘。 4.) 自兩個待轉染之孔移除培養基，且用1 mL無Ca²⁺ 及Mg²⁺ 之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞且抽吸。 5.) 將轉染複合物混合物添加至各自孔。下表9之板配置：表9

孔1	CRISPR元件及ssODN
孔2 (陰性對照)	FP陰性對照及ssODN

6.) 將補充Y27632之TeSR™-E8™添加至各孔，因此最終體積為600 µl。將板置放於低氧恆溫箱中。 7.) 在4-6小時之後，抽吸轉染培養基且用2 ml 補充Y27632之TeSR™-E8™置換。使細胞培育隔夜。 8.) 在12-18小時之後(或第二天上午)，藉由檢查mNG螢光證實轉染為成功的，隨後繼續進行第二次轉染(僅sgRNA及ssODN)。 9.) 第二輪轉染：根據以下表10-13製備轉染複合物：表10-稀釋MessengerMAX：

	MessengerMAX	Opti-MEM
管1-AM	2 µl	100 µl
管1-BM	1 µl	25 µl
管2-BM	1 µl	25 µl

在與Cas 9 mRNA混合之前，將經稀釋之MessengerMax培育10分鐘表11-稀釋sgRNA：

	Cas9 mRNA	sgRNA	mNG mRNA	Opti-MEM
管1-A	0 ug	0.35 ug		100 µl
管2-A

表12-稀釋ssODN：

	ssODN	Opti-MEM
管1-B	1 µl@10 µM	25 µl
管2-B	1 µl@10 µM	25 µl

10.) 如下表13混合經稀釋之mRNA及MessengerMax轉染試劑。表13

混合	內含物
管1-A與管-1AM	第2劑量sgRNA
管1-B與管-1BM	第2劑量ssODN
管2-B與管-2BM	第2劑量ssODN

培育複合物5分鐘。 11.) 移除培養基，以及用1 mL無Ca²⁺ 及Mg²⁺ 之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞且抽吸。 12.) 將轉染複合物添加至各孔中。下表14中之板配置。表14

孔1	第2劑量sgRNA+ssODN
孔2 (陰性對照)	第2劑量ssODN

13.) 將補充Y27632之TeSR™-E8™添加至各孔中，因此最終體積為600 µl。將板置放於低氧恆溫箱中。 14.) 在4-6小時之後，抽吸轉染培養基且用2 ml 補充Y27632之TeSR™-E8™置換。使細胞培育隔夜。 15.) 在2天之後，經CRISPR處理之細胞準備接受： i. 再次經繼代/分離。 ii. 經由RT-PCR篩選進行分析以評估HDR效率。 iii. 經繼代成單一細胞用於純系篩選。

VI. 用於細胞溶解及基因組DNA擴增之例示性方法實施例材料 - D-PBS -PRG-1 EDTA -TrypLE 1X -對偶基因小鼠尾部溶解緩衝液(150 mM NaCl，80 mM Tris-HCl pH 8.5，5 mM EDTA，2.5 mM MgCl₂ ，1% NP40，1% Triton X100及4%Tween 20) -Herculase II融合DNA聚合酶套組 -Costar™無菌一次性試劑儲集器 -無側緣之96孔PCR板 -AlumaSeal CS密封膜 -側緣96孔PCR板 -表面結合 PCR板純化套組 -NucleoSpin®凝膠及PCR清除 a.溶解大細胞群體(6孔板) 1.) 用1 mL無Ca²⁺ 及Mg²⁺ 之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞且抽吸。注意：不需要移除已分化細胞之區域。 2.) 添加0.3 mL PRG-1，隨後在15秒內抽吸大部分PRG-1，在孔中留下約80 µl (以使得群落曝露於液體之薄膜)。 3.) 在37℃下培育3-5分鐘。 4.) 輕敲板以幫助分離。添加3 ml磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)及輕緩地自板底部用移液管吸取細胞且轉移至15 ml錐形管中。*視情況 ： 根據方案 V.b. 將分離之細胞之一部分 (＞50,000 個細胞 ) 繼代至新的 Matrigel 塗佈之板上。在 CRISPR 轉染之後進行此視情況選用之步驟且允許群體之一部分生長 ， 同時將剩餘細胞溶解且分析。當主體分析展示 HDR 效率為適合之時 ， 可藉由極限稀釋法將到達匯合後之剩餘細胞選殖至單細胞 ( 參見 V.c) 。 5.) 在室溫下以300×g離心3分鐘以使細胞集結。抽吸PBS。 6.) 將細胞集結粒再懸浮於150 µl溶解緩衝液中。轉移至PCR管中且在熱循環儀中運行以下程式：在65℃下持續15 min，在68℃下持續15 min，以及在95℃下持續15 min。 7.) 在完成熱循環程式之後，溶解物準備用作PCR反應物中之模板。 b.) 溶解純系群體(96孔板) 1.) 移除培養基且各用100 µl無Ca²⁺ 及Mg²⁺ 之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌孔，且抽吸。 2.) 使用多注式移液管將50 µl溶解緩衝液直接添加至孔中。用移液管向上及向下吸取4-5次。 3.) 將溶解緩衝液自細胞培養板轉移至無側緣PCR板上。用AlumaSeal密封板之頂部。使用熱循環儀，在板上運行以下程式：在-65℃ 15 min、68℃ 15 min及95℃： 4.) 在完成熱循環儀程式之後，溶解物準備好用於PCR反應中。 c.) 擴增來自溶解物之基因組DNA模板 1.) 在PCR管中在冰上，如下表15針對6孔板溶解物組合PCR反應物：表15

組分	體積 ( µl )
溶解物	1
正向引子(10 µM)	2
反向引子(10 µM)	2
Herculase II 5X緩衝液	8
10 mM dNTPs	0.8
Herculase II聚合酶	0.4
H₂ O	25.8

2.) 在無側緣PCR板中，針對96孔溶解物之組合PCR反應物如下表16。表16：

組分	體積(µl)
溶解物	5
正向引子(10 µM)	2
反向引子(10 µM)	2
Herculase II 5X緩衝液	8
10 mM dNTP	0.8
Herculase II聚合酶	0.4
H₂ O	21.8

3.) 在表17中運行以下PCR程式：表17

95℃	3 min

95℃	30 s
使用最佳化之黏接溫度。	30 s
72℃	30 s
26 個週期
72℃	5 min
10℃	保持不變

4.) 在程式已完成之後，在1%瓊脂糖凝膠上操作2 µl PCR產物以證實擴增及評估擴增效率。當PCR條帶顯示較弱強度時，可能需要最佳化(黏接溫度及引子設計)。在進行篩選之前需要＜26個週期之穩固擴增。 5.) 根據製造商之方案使用NucleoSpin套組自大的溶解物模板純化PCR產物。為了純化來自96孔板溶解物之PCR產物，根據製造商之方案使用SurfaceBind板純化套組。 6.) 純化的擴增子文庫現適用於基於qPCR之篩選。

VII. 用於活體外Cas9-sgRNA斷裂分析之例示性方法實施例材料： -重組Cas9Wt蛋白(來自III) -活體外轉錄之sgRNA (來自IV) -斷裂模板(由具有sgRNA位點之溶解物產生之擴增子) -10X Cas9核酸酶反應緩衝液(20 mM HEPES，100 mM NaCl，5 mM MgCl₂ ，0.1 mM EDTA) 1.) 在室溫下按如下表18中所示之順序組合反應物：表18

組分	30 µl反應物
無核酸酶之水	22.5 µl
10X Cas9核酸酶反應緩衝液	3 µl
sgRNA (100 ng/µl)	0.5 µl (50 ng)
重組Cas9Wt蛋白(100 µg/ml)	1 µl (0.1 µg)最終)
反應物體積	27 µl
在25℃下預培育10分鐘
100 nM (33 ng/µl)受質DNA	3 µl (100 ng)
總反應物體積	30 µl

2.) 在微量離心機中充分混合且脈衝式旋轉。隨後在37℃下培育45分鐘。 3.) 藉由在0.5%至1%瓊脂糖凝膠上操作樣品進行片段分析。

VIII. 用於基於qPCR之篩選之例示性方法實施例材料 -LightCycler® 480 SYBR Green I母體混合物 - MicroAmp®Fast光學96孔反應板，0.1 mL -吉布森組合母體混合物 -DH5α勝任細胞 -Herculase II融合DNA聚合酶套組 -QuikChange定點突變誘發套組 -NucleoSpin®凝膠及PCR清除 -用於即時PCR之Excel Scientific ThermalSeal®RT™膜 a.) 用於突變擴增子複本數標準物之質體的建構 1.) 根據VIc.中所概述之方案對靶向基因座進行PCR擴增。模板應來自未轉染細胞之溶解物。在此情況下，正向及反向引子與用於吉布森組合之pIVT載體亦應具有重疊區域。例示性引子(n=基因座特異性)：正向：5'-GAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3' (SEQ ID NO: 5) 反向：5'-AGGCAAGCCCCGCAGAAGGCAGCnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3' (SEQ ID NO: 6) pIVT載體亦必須藉由使用pIVT-F及R經由PCR線性化 pIVT-F：GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCT (SEQ ID NO: 7) pIVT-R：GGTGGCTCTTATATTTCTTCTTACTC (SEQ ID NO: 8) 2.) 將插入物(基因組基因座擴增子)及載體(pIVT主結構)與吉布森組合混合物組合。建議吉布森組合配置表19。表19

吉布森母體混合物(內部或來自NEB)	15 µl
pIVT主結構	200 ng
CRISPR目標區域擴增子	200 ng
H₂ O	填充至總計20 µl

將吉布森組合反應物在50℃下培育1小時，隨後轉化成DH5α化學勝任細胞。所得載體將稱為野生型載體。 3.) 使用新組合之野生型載體作為模板，用QuikChange定點突變誘發套組產生你所希望之預期突變以在所關注之區域中篩選。根據製造商之(Agilent)方案進行定點突變誘發。所得構築體將稱為突變載體。 4.) 在完成突變體及野生型pIVT構築體之情況下，繼續製備擴增子標準物。使用野生型及突變pIVT構築體組合獨立PCR反應物作為模板表20。表20

組分	體積(µl)
突變或野生型載體	10 ng
M13-F引子(10 µM)	2
M13-R引子(10 µM)	2
Phusion GC 5X緩衝液	8
10 mM dNTP	0.8
Herculase II融合DNA聚合酶	0.4
H₂ O	21.8

操作以下PCR程式，如表21中所示：表21

95℃	3 min

95℃	30 s
60℃	30 s
72℃	30 s
30 個週期
72℃	5 min
10℃	保持不變

5.) 在1%瓊脂糖凝膠上操作1 µl PCR產物以證實適合產率及正確大小。根據製造商之方案隨後繼續進行NucleoSpin PCR清除程序。 6.) 對所得擴增子進行定量。製造擴增子標準物之稀釋液，因此將其均標準化為60 fg/µl，其將對應於約60,000個擴增子複本/µl。 7.) 在突變及野生型標準物稀釋至工作濃度之情況下，產生以下表22中之野生型：突變比(用於qPCR分析發展中)。表22

比	混合物組分(60 fg/µl)
100%野生型(0%突變)	100 µl野生型擴增子
99%野生型(1%突變)	99 µl野生型擴增子、1 µl突變擴增子
90%野生型(10%突變)	90 µl野生型擴增子、10 µl突變擴增子
50%野生型(50%突變)	50 µl野生型擴增子、50 µl突變擴增子

b.) 用突變擴增子複本數標準物進行qPCR分析發展 1.) 設計最適合於篩選擴增子之正向及反向引子對。設計標準： -≤300 bp產物。 -正向引子應在預期突變之上游約200-300 bp。 -反向引子在前5'端處應具有預期突變鹼基。(參見圖6) 在冰上，如表23中所示，在Fast Optical 96孔反應板中製備qPCR反應物：表23

SYBR Green I母體混合物	7.5 µl
正向引子	1.0 µl
反向引子	1.0 µl
H₂ O	0.5 µl
擴增子標準物模板	5.0 µl (300 fg)

注意：在某些實施例中，因為組合多個反應物，所以最好製備具有SYBR Green、引子對及H₂ O之母體混合物，隨後在最後步驟添加擴增子標準物模板。如表24中所示，在以下定向上分配擴增子標準物模板。表24

	1	2
A	0%突變(100%野生型)	10%突變(90%野生型)
B	0%突變(100%野生型)	50%突變(50%野生型)
C	0%突變(100%野生型)	50%突變(50%野生型)
D	1%突變(99%野生型)	50%突變(50%野生型)
E	1%突變(99%野生型)	100%突變(0%野生型)
F	1%突變(99%野生型)	100%突變(0%野生型)
G	10%突變(90%野生型)	100%突變(0%野生型)
H	10%突變(90%野生型)

3.) 一旦板得以製備，用透明ThermalSeal密封且執行快速旋轉(約3 g持續10秒)。放回冰上同時建立軟體程式。 4.) 運行軟體： i. 打開StepOne Plus軟體，且作為「GUEST」登入。 ii. 藉由點擊在左下方之「Template」按鈕打開模板文件，且選擇「Crispr-Standards」模板文件。(D: \Applied Biosystems\StepOne Software v2.3\config\templates) iii. 轉至「Experiment Properties」頁面且用適當標題填充「Experiment Name」。(例如Crispr_standards_test12-25-18) iv. 接下來轉至「Run Method」頁面，且將黏接溫度改變至對於實驗最佳之溫度。 v. 將所製備板置放在StepOnePlus機器中且關閉抽屜/蓋板。點擊綠色「Start Run」按鈕以起始操作。 c.) 對擴增曲線之分析。 1.) 為證實引子設計針對野生型擴增有效區分，比較不同比之Ct值。 2.) 應觀測劑量反應：Ct值應隨著突變群體之比增加而變得左移(較小)。 3.) 表25中展示之各標準點之一些建議ΔCt值：表25

比	ΔCt
0%突變(100%野生型)	0
1%突變(99%野生型)	≥3
10%突變(90%野生型)	≥6
50%突變(50%野生型)	≥8

實例擴增Ct曲線(參見圖7) 4.) 當擴增子標準物產生適合結果(如上文所例示)時，繼續篩選經CRISPR編輯之細胞。 d.) 大群體之篩選 1.) 在步驟VI.c中產生之擴增子之情況下，將濃度標準化降至60 fg/µl。 2.) 在冰上，如表26中所示，在Fast Optical 96孔反應板中製備qPCR反應物：表26

SYBR Green I母體混合物	7.5 µl
正向引子	1.0 µl
反向引子	1.0 µl
H₂ O	0.5 µl
來自實驗之擴增子或擴增子標準物	5.0 µl (300 fg)

注意：因為組合多個反應物，所以最好製備具有SYBR Green、引子對及H₂ O之母體混合物，隨後在最後步驟添加擴增子模板。 3.) 在步驟VIII.b.2 .A中概述之定向中分配擴增子標準物。一式三份，將來自大群體之標準化擴增子文庫分配至板中。確保包括陰性對照(僅ssODN轉染之細胞)。 4.) 一旦板得以製備後，用透明ThermalSeal密封且執行快速旋轉(約3 g持續10秒)。放回冰上同時建立軟體程式。 5. ) 運行如步驟VIII.b.4中所概述之軟體。在開始之前，根據其在「Plate Setup」窗口中如何反應板中劃分，確保分配來自實驗之CRISPR擴增子文庫及陰性對照。當所有事物恰當地配置時運行程式。 e.) 對主體篩選之分析 1.) 在qPCR結果來自VIII.d之情況下，可將擴增子文庫彼此比較(經CRISPR處理之細胞及未經轉染之細胞)且與標準物進行比較。應藉由獲取陰性對照Ct值及減去經CRISPR處理之細胞Ct值來計算經CRISPR處理之細胞的ΔCt值。經CRISPR處理之細胞應展示與1%標準物相當之ΔCt。(注意：已觀測到ΔCt在一次繼代後增加)。 2.) 當大群體之ΔCt為約1%時，如步驟V中所概述繼續進行單細胞選殖程序 f.) 自96孔板qPCR篩選純系 1.) 經SurfaceBind純化之純系擴增子文庫板(如步驟VI.c.5中所描述)將用作qPCR篩選之模板。 2.) 在96孔2 ml收集板中進行純系擴增子庫之1:1000稀釋。使用AlumaSeal來密封板且渦旋以混合。 3.) 在冰上，如表27中所示，如下在Fast Optical 96孔反應板中製備qPCR反應物：表27

SYBR Green I母體混合物	7.5 µl
正向引子	1.0 µl
反向引子	1.0 µl
H₂ O	0.5 µl
1:1000稀釋之擴增子文庫	5.0 µl

注意：因為進行多個反應，所以製備含有SYBR Green、引子對及H₂ O之母體混合物，隨後最後添加經稀釋之擴增子文庫。確保保持板定向。 4.) 一旦板得以製備，用透明ThermalSeal將其密封且執行快速旋轉(約3 g持續10秒)。放回冰上同時建立軟體程式。 5.) 如步驟VIII.b.4中所概述用「96_well_screen」模板文件(D:\Applied Biosystems\StepOne Software v2.3\config\templates) 運行軟體。(確保「 Run Setup」窗口及其參數與主體qPCR篩選分析法中相同)。 g.) 純系qPCR篩選之分析。 1.) 純系擴增子文庫之qPCR篩選通常導致高變化，然而考慮到具有約1%之HDR效率的大群體，將存在1-3個低Ct離群值孔。樣品資料參見下文：(參見圖8) 2.) 在鑑別左偏移之Ct離群值後，根據V.e中概述之方案擴增複製板中之對應孔。 3.) 一旦所選孔得以擴增且匯合，溶解一部分細胞且製備擴增子文庫。傳送此等以經由桑格測序來測序。分析層析圖結果中之預期突變位點。異型接合突變將展示預期位點處之雙峰，而同型接合將僅具有突變鹼基對峰。經編輯及未經編輯細胞之混合群體亦可展示為雙峰。此外，CRISPR介導之插入及缺失(插入缺失)將在接近PAM位點之整個區域中產生額外峰。對層析圖之詳細分析為理解細胞群體之遺傳學所必需的。參見圖9 序列表

SEQ ID NO: 1: cas9_wt

SEQ ID NO: 2- cas9_D10A

SEQ ID NO: 3- cas9_H840A

SEQ ID NO: 4- cas9_D10A_H840A

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本申請案中所引用之所有參考文獻均以引用之方式併入本文中。

當提供一系列值時，應理解的是，除非上下文另外明確指明為下限之單位的十分之一，否則彼範圍之上限與下限之間的各中間值及彼陳述範圍內之任何其他所陳述之值或中間值均涵蓋於本發明內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內，且亦涵蓋於本發明內，在所陳述範圍內受到任何特定排他性限制。當所陳述之範圍包括一個或兩個限度時，排除彼等所包括之限度中之任一者或兩者之範圍亦包括於本發明中。

已描述多個本發明之多個實施例。儘管如此，應理解可在不背離本發明的精神及範疇的情況下進行各種修改。因此，其他實施例係在以下申請專利範圍之範疇內。

現將關於圖式描述本發明，其中：

圖1.用於形成Cas9 mRNA sgRNA 2%瓊脂糖凝膠之IVT模板之產生展示藉由用限制酶切割編碼質體之cas9 或sgRNA基因產生之經純化線性化DNA之條帶。

圖2.編碼Cas9酶之mRNA及針對螢光蛋白mWasabi之sgRNA。2%瓊脂糖凝膠展示具有多聚(A)尾之cas9 mRNA及針對mWasabi之sgRNA之條帶。

圖3.破壞整合於人類293細胞之染色體中之mWasabi基因之表現的作用。將恆定量之cas 9 mRNA及增加量之sgRNA在單一轉染中遞送至293-mWasabi細胞中。對照孔不接受任何RNA，但用相同轉染試劑處理。

圖4.在人類基因中產生突變中使用所有RNA CRISPR/CAS系統之實例。各dsDNA斷裂點可由一對sgRNA引導。可用如圖中所示之一個或兩個斷裂點進行序列置換。當依賴於4個sgRNA來引導置換時，特異性最大化。圖4分別按照出場順序揭示SEQ ID NOS 10-13。

圖5.使用所有RNA CRISPR/CAS系統在人類基因中產生之突變的實例，其中二聚Cas9酶由經修飾之mRNA編碼。CRISPR/CAS介導之基因組編輯特異性可用二聚Cas9進一步增強，尤其當經由編碼mRNA遞送時。其他結構域可以類似於表觀遺傳修飾的方式與Cas9融合。

圖6. qPCR之引子設計。此設計使得能夠藉由即時PCR偵測iPSC中之單鹼基變化。

圖7.擴增Ct曲線之實例。此曲線展示染色體上之既定位置處之突變率如何藉由設計良好的qPCR偵測。

圖8.純系擴增子文庫篩選之樣品擴增曲線。純系擴增子文庫之qPCR篩選通常導致高變化，然而考慮到具有約1%之HDR效率的大群體，將存在少量低Ct離群值孔。一旦鑑別左偏移之Ct離群值，且相應孔在複製板中擴增。

圖9.純系擴增子文庫篩選之樣品層析圖。在單一iPSC純系中達成T至G之單鹼基轉換，該單一iPSC純系對於既定MEF2C基因座為異型接合的。圖9揭示SEQ ID NOS 14。

Claims

一種用於基因組編輯之方法，其使用編碼Cas9酶及sgRNA之合成mRNA之組合。
如請求項1之方法，其中編碼Cas9及sgRNA之mRNA含有5’二鳥苷帽及多聚(A)尾。
如請求項1之方法，其中額外提供促進DNA斷裂之模板。
如請求項3之方法，其中該模板為雙鏈DNA分子。
如請求項2之方法，其中該模板為單鏈DNA分子。
如請求項2之方法，其中該模板為RNA分子。
如請求項1之方法，其中Cas9具有破壞兩個核酸內切酶活性位點SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中之一者的突變。
如請求項1之方法，其中Cas9具有破壞兩個核酸內切酶活性位點之突變SEQ ID NO:4。
如請求項1之方法，其中將Cas9與可改變DNA或染色質蛋白上之表觀遺傳標記物的另一酶融合。
如請求項1之方法，其中Cas9 mRNA含有經修飾之核苷酸。
如請求項1之方法，其中sgRNA含有經修飾之核苷酸。
如請求項9或10之方法，其中該經修飾之核苷酸包含5-甲基-胞嘧啶、2-硫尿嘧啶或假尿嘧啶。
如請求項1之方法，其中Cas9 mRNA:sgRNA之間的莫耳比在1:1,000至1,000:1之間。
如請求項1之方法，其將靶向不同位點之多個sgRNA與編碼來自不同物種之一或多個不同Cas9酶或具有不同突變之mRNA分子之組合引入至相同細胞中。
如請求項2之方法，其中修復模板經由與sgRNA融合如同在一個分子上而定位於DNA斷裂位點。
如請求項2之方法，其中修復模板經由與結合Cas9之適體融合而定位於DNA斷裂位點。
如請求項1之方法，其中該方法亦包括添加B18R。
一種Cas9蛋白質，其為非天然存在的且具有破壞兩個核酸內切酶活性位點中之一者的突變，其中該突變Cas9蛋白質係由SEQ ID NO:2之DNA編碼。
一種Cas9蛋白質，其為非天然存在的且具有破壞兩個Cas9核酸內切酶活性位點中之一者的突變，其中該突變Cas9蛋白質係由SEQ ID NO:3之DNA編碼。
一種Cas9蛋白質，其為非天然存在的且具有破壞兩個CAS9核酸內切酶活性位點之突變，其中該突變Cas9蛋白質係由SEQ ID NO:4編碼。
一種非天然存在之CRISPR-Cas系統，該系統包含編碼突變Cas9蛋白質之mRNA，該突變Cas9蛋白質在其核酸酶基因中具有突變；及至少一個編碼導引RNA之mRNA，該導引RNA在進入細胞中之後產生突變Cas9蛋白質及導引RNA，該突變Cas9蛋白質及導引RNA靶向具有單點突變之DNA的靶序列且與具有單點突變之DNA的靶序列雜交，在突變Cas9蛋白質及導引RNA起作用後校正該靶序列中之突變。
如請求項22之方法，其中該cas9 mRNA含有一或多個經修飾之核苷酸。
如請求項22之方法，其中將該cas9 mRNA及導引mRNA轉染至細胞中。
如請求項24之方法，其中該轉染係在B18R存在下進行。
一種如根據SEQ ID NO:2-4所闡述之Cas 9變體。
一種用於基因編輯之經工程改造、非天然存在之所有RNA、不含載體、不含病毒之CRISPR/Cas系統，其包含如請求項25之cas 9變體。
一種改變至少一個基因產物之表現的方法，其包含向真核細胞中引入經工程改造之非天然存在之所有RNA群聚且有間隔短回文重複序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)-與CRISPR相關之(Cas) (CRISPR-Cas)系統，該真核細胞含有具有靶序列且編碼該基因產物之DNA分子且表現該DNA分子，該系統不含載體且不含病毒。
如請求項19之方法，其進一步包含seq ID No:2-4之cas 9變體。
一種套組，其包含經工程改造、可程式化、非天然存在之所有RNA CRISPR-Cas系統及使用說明書，該系統包含如序列ID No:1-4中所闡述之Cas 9蛋白。