KR20210031482A - 고-특이성의 게놈 편집을 달성하는 방법 - Google Patents

고-특이성의 게놈 편집을 달성하는 방법 Download PDF

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지우 왕
앤드류 엠. 참마스
알렉산더 와드
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알렐 바이오테크놀로지 앤 파마슈티칼스, 인크.
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Abstract

고도로 효율적인 DNA 서열 변경을 위한 방법이 개시된다. 이러한 방법은 염색체를 편집하거나, 유전자 삽입을 통해 세포 마커를 조작하거나, 또는 cas9-효소 융합물 (여기서 효소는 DNA 후성유전학적 변형 효소 또는 염색질 변형 효소일 수 있다)을 사용함으로써 후성유전학적 변화를 생성시키는 것 등에 유용하다. 또한 이러한 기술은 CRISPR/Cas 시스템이 "깨끗한" 방식들로 기능할 수 있고, 즉 이들은 어떠한 바이러스와도 접촉되지 않았거나, 또는 의도하지 않은 위치에서 염색체 내로 삽입할 수 있는 DNA 분자를 운반한다는 점에서 모든 기존에 공지된 기술과 상이하다.

Description

고-특이성의 게놈 편집을 달성하는 방법
관련 출원
본 출원은 2018년 7월 13일에 출원된 미국 일련 번호 62/697,955를 우선권 주장하고, 이는 도면을 포함하여 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 DNA 서열 녹-인(knock-in) 또는 녹-아웃(knock-out), DNA 돌연변이, DNA 후성유전학적 변형, DNA 서열-특이적 방식의 염색질 변형, 및 다른 유형의 게놈 편집을 포함하는 DNA 변형에서 사용될 수 있는 방법, 조성물, 및 키트 및 시스템에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 개시내용은 어떠한 운반체 벡터도 사용하지 않으면서 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)의 시스템, 및 이의 성분, 돌연변이, 융합물 및 변이체를 전달할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 만능 줄기 세포만큼 난제인 숙주 세포를 포함하여, 단일 뉴클레오티드를 치환하는 것을 허용하는 특이성 및 정밀도로 게놈을 편집하는 방법을 구체적으로 교시한다.
개시내용의 배경
배양된 포유동물 세포에서의 기존에 보고된 CRISPR/CAS 연구는 sgRNA 및 Cas 효소 양쪽 모두를 전달하기 위해 DNA 벡터 또는 레트로바이러스/렌티바이러스에 의존하고, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,697,359를 참조한다. 플라스미드 DNA는 숙주 게놈 내로의 무작위 DNA 통합의 가능성을 제시하고, 이는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Valamehr et al. 2014 Stem Cell Reports]을 참조한다). cas 효소 유전자 또는 gRNA의 전달을 위한 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터는 RNA 또는 단백질 분자로서 이들이 운반하는 페이로드를 전달할 수 있기 전에 숙주 게놈 내로 통합될 필요가 있다. 추가적으로, 플라스미드 또는 바이러스 벡터로부터 발현 수준을 제어하는 것이 어렵다. 이러한 벡터 상의 코딩되는 유전자의 발현 수준과 벡터의 카피 수 사이에 일반적인 상관관계가 있지만, 관계가 비-선형이고, 고도로 가변적이다.
발명의 개요
고도로 효율적인 DNA 서열 변경을 위한 신규 방법이 개시된다. 이러한 방법은 염색체를 편집하거나, 유전자 삽입을 통해 세포 마커를 조작하거나, 또는 cas9-효소 융합물 (여기서 효소는 DNA 후성유전학적 변형 효소 또는 염색질 변형 효소일 수 있다)을 사용함으로써 후성유전학적 변화를 생성시키는 것 등에 유용하다. 발명된 프로세스에 의한 극적으로 증가된 게놈 편집 효율에 더하여, 이러한 신규 기술은 CRISPR/CAS 시스템이 "깨끗한" 방식들로 기능할 수 있고, 즉 이들은 어떠한 바이러스와도 접촉되지 않았거나, 또는 의도하지 않은 위치에서 염색체 내로 삽입할 수 있는 DNA 분자를 운반한다는 점에서 모든 기존에 공지된 기술과 또한 상이하다. 개시된 시스템은 탈표적 변화를 최소로 유지하면서 기존에 수득할 수 없었던 효율을 생성시킬 수 있다는 것이 또한 주지된다. 실제로 본 발명의 유용성은 DNA 편집 또는 후성유전학적 변형을 수반하는 모든 분야에서 확인될 수 있다. 반면에, 8,697,359 특허는 의도하지 않은 게놈 변화의 잠재적인 문제를 최소화하면서 진핵생물 세포에서 CRISPR/Cas가 효율적으로 달성될 수 있는 시스템을 제공하는 방법을 교시하지 않는다.
본 개시내용은 모두 어떠한 외인성 DNA 분자로 필요로 하지 않으면서 (DNA 주형이 DNA 파손 복구를 위한 바람직한 주형인 경우는 제외함), Cas 효소 및 가이드 RNA 및 양쪽 모두, 그리고 DNA 파손 복구를 수반하는 경우에는 "패치" 주형 RNA 또는 DNA를 제공하는 RNA-기반 시스템을 제공한다. 본원에 개시된 전체-RNA CRISPR/Cas (본원에서 사용된 바와 같이, "전체-RNA"는 주로 CRISPR/Cas 기구의 성분의 전달을 지칭하고, 주형으로서의 DNA를 배제하지 않는다) 시스템은 프로세스 또는 생성된 세포의 인간 임상 용도에 문제를 발생시킬 수 있는 어떠한 바이러스 요소도 필요로 하지 않는다. 이러한 시스템은 관련 기술 분야에서 제시되었던 것에 비교하여 강화된 효율 및 특이성으로, 배아 줄기 세포 (ESC) 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 포함하는 배양 세포에서 CRISPR/Cas-촉진 인델을 통한 유전자 파괴, 단일 염기의 정밀도로의 게놈 서열 편집, 또는 CRISPR/Cas 처리 후의 파손 복구 및 교체를 통한 유전자 교체를 달성하기 위한 방법, 프로세스, 또는 시약 키트로서 제공될 수 있다.
본 개시내용의 중요한 측면은 포유동물 세포에서 특히 유용한 디자인으로, 진핵생물 세포에서의 폴리뉴클레오티드-가이드 게놈 절단 시스템을 가능하게 하기 위한 전체-RNA 전달 방법의 용도, 및 유지하기 어려운 세포 예컨대 교란되는 경우에 만능성 상태를 쉽게 벗어나는 만능 줄기 세포용으로 경험적으로 개발된 프로세스이다. 개시된 방법은 조직 줄기 세포, 예컨대 비제한적으로 신경 전구 세포, 희소돌기아교세포 전구 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 등에서 또한 작용할 수 있다. 통상적인 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP) 또는 화학적 변형이 있는 NTP를 사용하여 시험관내 전사 (IVT) RNA로서의 gRNA 및 mRNA로서의 Cas 효소를 도입하는 방법이 본원에서 제공된다.
(게놈 내로 통합될 수 있는 플라스미드 벡터와 달리) 풋프린트가 없는 것에 더하여 본 개시내용의 또 다른 측면은 RNA를 전달 양식으로 사용하는 것이 Cas의 더 높은 효소 활성 수준을 가능하게 하고 이는 더 높은 성공률을 발생시킨다는 것이다. 또 다른 개시내용에서, 높은 수준의 효소 활성이 고도로 제어가능한 방식으로 단시간 창 내에 집중될 수 있다. RNA가 매개하는 높은 효소 발현 수준의 일시적인 성질이 염색체 변형 목적을 위한 이상적인 조성을 제공한다. 단기-분출 효소 발현은 탈표적 효과를 감소시키는 것에서 추가적인 이점을 제공하는데, 이는 효소, 예컨대 플라스미드 DNA 벡터 또는 통합된 바이러스 벡터로부터의 것이 장기로 존재하면 지속적인 탈표적 효과를 초래할 수 있기 때문이다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, gRNA는 Cas mRNA에 대한 다양한 비로 전달되고, 때때로 형질감염을 통한 다중 전달을 수반한다. cas의 mRNA가 Cas 단백질로 번역되면, 단백질은 mRNA 및 gRNA보다 반감기가 더 길 가능성이 있기 때문이다. 본원의 개시내용은 gRNA 양 (gRNA/cas mRNA 비로 지칭될 수도 있음)을 조정함으로써, 더욱 통상적으로 보이는 염색체의 더 긴 삽입물 또는 결실 또는 재배열에 더하여, 프로세스가 정확한 단일-염기 편집을 발생시킬 수 있다는 것을 입증한다. 본 개시내용의 실시예 4는 어떻게 인간 iPSC 클론에서 전체-RNA 방법을 사용하여 염색체 상의 단일 염기가 변화될 수 있는지의 성공적인 예를 제시하는 것에 의해 개시된 방법의 증가된 정밀도를 입증한다.
세포 배양에서 장기 단백질 발현을 달성하기 위해 mRNA를 사용하는 것의 걸림돌은 RNA 자체가 고도로 면역원성일 수 있다는 것이다 (Kawai and Akira, 2007; Randall and Goodbourn, 2008). 포유동물 세포에는 외인성 RNA를 검출할 수 있고, 세포증식억제성 및 아팝토시스 경로를 준비시키고 분비 신호 예컨대 인터페론 알파 및 베타를 통해 매우 동일한 자극에 대해 이웃 세포에 경고하는 항바이러스 방어 경로를 활성화시킬 수 있는 일련의 센서가 장착된다. 더욱 광범위하게 발현되는 센서 예컨대 TLR3 및 RIG-I는 주로 이중-가닥 RNA를 검출하지만 (dsRNA의 생산은 다수의 바이러스 생활 주기에서의 독특한 특색이다), 합성 mRNA에 의해서 활성화될 수도 있다 (Kormann et al., 2011). mRNA로의 iPSC 생성 과정 동안 합성 mRNA에 대한 면역원성 반응을 최소화하도록 기술적 수단들이 발견되었다 (Warren et al., 2010). 가장 실용적인 접근법은 인간 세포를 변형 mRNA로 처리할 때, 변형 핵염기를 혼입하고, 감염에 대한 면역 반응을 둔화시키기 위해 우두 바이러스에 의해 천연으로 발현되는 I형 인터페론에 대한 세포외 미끼 수용체인 재조합 버전의 B18R 단백질을 배양 배지에 보충하는 것을 수반하였다.
한 실시양태에서, 인간 세포 내로의 전체-RNA CRISPR/Cas 시스템의 전달에 B18R 첨가가 동반되었다. 또 다른 실시양태에서, RNA 분자는 시험관내 전사 동안 비정상적인 전사체를 제거하도록 RNA 분자가 충분히 정제된 경우에 인간 또는 비-인간 세포 내로 전달될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 전달된 RNA 분자는 세포 면역 검출을 회피하도록 변형된다. 요약하면, 신규 CRISPR/Cas 시스템은 하기의 측면에서 게놈 조작을 위한 기술적 가능화를 제공한다: 각각의 표적 부위에 대한 단백질 조작을 필요로 하지 않으면서 폴리뉴클레오티드-가이드됨; 게놈 풋프린트를 남기지 않는 RNA 전달을 통한 완전 제어 프로세스; 처리 시간을 다양하게 하는 것에 의해 상이한 세포 유형들에서 원하는 변형 효율을 달성하기 용이함; 더 짧은 시간 창 동안의 디자인된 더 높은 효소 활성으로 인한 ZFN 또는 TALEN 또는 기존에 보고된 CRISPR/CAS 방법보다 더 높은 성공률 및 더 낮은 탈표적 효과; 줄기 세포 상태를 교란시키지 않으면서 만능 줄기 세포에서 수행될 수 있는 고도로 효율적인 프로세스에서의 정확한 게놈 변형 (적어도 부분적으로, 기존에 공지되지 않았고 거의 제어불가능한 요인인 gRNA/cas-mRNA 비에 의해 가능해졌고, 이는 플라스미드, 바이러스 벡터, 및 리보뉴클레오단백질 (RNP)이 사용되는 경우에 최적이지 않음). 최근에 공개된 CRISPR/CAS 시스템에 비교하여, 개시된 전체-RNA 양식은 원치 않는 염색체 변화를 최소화하는 것을 독특하게 가능하게 한다.
본원에 개시된 방법은 cas mRNA를 통해 gRNA 및 CAS 효소의 용량을 조정하는 것의 뜻밖의 이익을 기초로 한다. 본 발명자들은 인간 세포, 및 단순 확장에 의한 임의의 포유동물 세포 내로의 전달 시간 및 빈도, 및 전달 방법을 개시하고, 유사한 체계를 사용하여 본원에 기술된 CRISPR/CAS 시스템은 다른 유형의 세포, 예컨대 식물, 효모, 박테리아 세포에서 또한 사용될 수 있다.
상기 논의된 개시내용의 측면의 실시양태에서, Cas9 효소를 코딩하는 합성 mRNA 및 sgRNA의 조합을 사용하는 게놈 편집 방법이 본원에서 개시된다. 이러한 측면의 실시양태에서, Cas9를 코딩하는 mRNA 및 sgRNA는 5'디구아노신 캡 및 폴리(A) 꼬리, 및 mRNA를 세포에 덜 독성이게 만드는 변형 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 변형 뉴클레오티드는 5-메틸-시토신, 2-티오-우라실, 또는 슈도우라실을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9를 코딩하는 mRNA는 B18R과 함께 제공된다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 이의 엔도뉴클레아제 유전자 중 하나 또는 양쪽 모두에 대한 돌연변이를 함유하는 돌연변이 형태의 Cas9 단백질을 사용하여 DNA 또는 게놈에 정확한 변화를 만드는 방법이 본원에서 개시된다. 이러한 측면의 실시양태에서, 출원인은 이의 엔도뉴클레아제 활성 부위에 대한 돌연변이가 있는 3개의 비-천연 발생 돌연변이체 Cas9 단백질을 생산하였다. 이러한 돌연변이체 Cas9 단백질은 서열식별번호(SEQ ID NO): 2, 3, 및 4에 의해 코딩된다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 Cas9 단백질을 사용하는 것을 기초로 하는 점 돌연변이의 매우 정확한 복구를 가능하게 하는 방법이다. 한 실시양태에서, 세포 내로의 진입 시 돌연변이된 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 생산하는, 이의 엔도뉴클레아제 활성 부위 내에 돌연변이가 있는 돌연변이된 Cas9 단백질을 코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 mRNA를 포함하는 비-천연 발생 CRISPER-Cas 시스템. 진입 후, Cas9 단백질 및 가이드 RNA는 단일 점 돌연변이가 있는 표적 DNA 서열을 표적화하여 혼성화하고, 이는 돌연변이체 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 작용 시 표적 서열 내의 돌연변이가 수정된다.
한 실시양태에서, Cas9 효소를 코딩하는 합성 mRNA 및 sgRNA의 조합을 사용하는 게놈 편집 방법이 본원에서 개시된다. 일부 실시양태에서, Cas9를 코딩하는 mRNA 및 sgRNA는 5'디구아노신 캡 및 폴리(A) 꼬리를 함유한다. 일부 실시양태에서, DNA 파손을 용이하게 하는 주형이 또한 제공된다. 주형은 이중-가닥 DNA 분자 또는 단일-가닥 DNA 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 주형은 RNA 분자이다. 이러한 방법의 한 실시양태에서, Cas9는 2개의 엔도뉴클레아제 활성 부위 중 하나를 파괴하는 돌연변이를 보유한다. 이러한 Cas9 단백질 돌연변이체는 서열식별번호: 2, 또는 서열식별번호: 3에 의해 코딩된다. 한 Cas9 단백질 돌연변이체는 양쪽 엔도뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이가 있고, 서열식별번호: 4에 의해 코딩된다. 방법의 또 다른 실시양태에서, Cas9는 DNA 또는 염색질 단백질 상의 후성유전학적 마커를 변경시킬 수 있는 또 다른 효소에 융합된다. 방법의 일부 실시양태에서, Cas9 mRNA:sgRNA의 몰비는 1:1,000 내지 1,000:1이다. 방법의 일부 실시양태에서, Cas9 mRNA:sgRNA의 몰비는 1:1,000 내지 1,000:1이다.　 일부 실시양태에서, Case9mRNA:sgRNA의 몰비는 1:1,000; 1:950; 1:900; 1:850; 1:800; 1:750; 1:700; 1:650; 1:600; 1:550; 1:500, 1:450; 1:400; 1:350; 1:300; 1:250; 1:200; 1:150; 1:100; 1:50; 1:40; 1:30; 1:25; 1:20; 1:15; 1:10; 1:9; 1:8; 1:7; 1:6; 1:5; 1:4.75; 1:4.5; 1:4.25; 1:4; 1:3.75; 1:3.5; 1.3.25; 1:3; 1:2.9; 1:2.8; 1:2.75; 1:2.7; 1:2.6; 1:2.5; 1:2.4; 1:2.3; 1:2.25; 1:2.2; 1:2.1; 1:2; 1:1.9; 1:1.8; 1:1.7; 1:1.6; 1:1.5; 1:1.4; 1:1.3; 1:1.2; 1:1.1; 1:1; 1.1:1; 1.2:1; 1.3:1; 1.4:1; 1.5:1; 1.6:1; 1.7:1; 1.8:1; 1.9:1; 2:1; 2.1:1; 2.2:1; 2.25:1; 2.3:1; 2.4:1; 2.5:1; 2.6:1; 2.7:1; 2.75:1; 2.8:1; 2.9:1; 3.0:1; 3.25:1; 3.5:1; 3.75:1; 4:1; 4.25:1; 4.5:1; 4.75:1; 5:1; 6:1; 7:1; 8:1; 9:1; 10:1; 15:1; 20:1; 25:1; 30:1; 40:1; 50:1; 100:1; 150:1; 200:1; 250:1; 300:1; 350:1; 400:1; 450:1; 500:1; 550:1; 600:1; 650:1; 700:1; 750:1; 800:1; 850:1; 900:1; 950:1; 1,0000:1, 또는 언급된 비 중 임의의 두 개 사이의 임의의 범위의 비이다. 또 다른 실시양태에서, 상이한 종들로부터의 것이거나 또는 상이한 돌연변이들을 보유하는 하나 이상의 상이한 Cas9 효소를 코딩하는 mRNA 분자와 조합된 상이한 부위들을 표적화하는 다중 sgRNA가 동일한 세포 내로 도입된다. 본원에 개시된 방법에서, 복구 주형은 하나의 분자 상에 있는 것으로서의 sgRNA에 대한 융합을 통해 DNA 파손 부위에 국소화된다. 일부 실시양태에서, 복구 주형은 Cas9에 결합하는 앱타머에 대한 융합을 통해 DNA 파손 부위에 국소화된다.
정밀도를 가능하게 하는 개시된 방법의 성질은 개시된 기술을 인간 질환, 예컨대 비제한적으로 메틸말로닐-CoA 뮤타제 결핍증, 3-메틸크로토닐-CoA 카르복실라제 결핍증, 고셰병, 오그덴 증후군, 레쉬-나이한 증후군, 리병, 피루베이트 데히드로게나제 결핍증, 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리아제 결핍증, 후기 발병 복합 카르복실라제 결핍증, 푸마라제 결핍증, 진행성 골화성 섬유형성이상, n-글리카나제 1 결핍증, 시데리우스 유형 X-연관 정신 지체, 페닐케톤뇨증, 테이-삭스병, 알파-갈락토시다제 A 결핍증, 낫적혈구 빈혈, 단풍당뇨증을 치료하기 위한 세포를 생성시키는 데 가장 적절하게 만든다.
도면의 간단한 설명
이제 본 발명이 하기의 도면을 참조로 기술될 것이다.
도 1. cas9 mRNA sgRNA를 생성시키기 위한 IVT 주형의 생성. 2% 아가로스 겔이 cas9 또는 sgRNA 유전자 코딩 플라스미드를 제한 효소로 절단함으로써 생성된 정제된 선형 DNA의 밴드를 나타낸다.
도 2. Cas9 효소 및 형광 단백질 mWasabi에 대한 sgRNA를 코딩하는 mRNA. 2% 아가로스 겔이 폴리(A) 꼬리가 있는 cas9 mRNA 및 mWasabi에 대한 sgRNA의 밴드를 나타낸다.
도 3. 인간 293 세포의 염색체 내로 통합된 mWasabi 유전자의 발현을 파괴하는 것의 효과. 일정한 양의 cas9 mRNA 및 증가되는 양의 sgRNA를 단일 형질감염에서 293-mWasabi 세포 내로 전달하였다. 대조군 웰은 어떠한 RNA도 제공되지 않았지만, 동일한 형질감염 시약으로 처리되었다.
도 4. 인간 유전자에서 돌연변이를 생성시키는 것에서 전체-RNA CRISPR/CAS 시스템을 사용하는 것의 예. 각각의 dsDNA 파손 지점이 한 쌍의 sgRNA에 의해 지시될 수 있다. 도면에 제시된 바와 같이 1개 또는 2개의 파손 지점으로 서열 교체가 이루어질 수 있다. 교체를 지시하도록 4개의 sgRNA에 의존하는 경우, 특이성이 최대화된다.
도 5. 변형 mRNA에 의해 코딩되는 이량체화 Cas9 효소로 인간 유전자에서 돌연변이를 생성시키는 것에서 전체-RNA CRISPR/CAS 시스템을 사용하는 것의 예. CRISPR/CAS가 매개하는 게놈 편집 특이성이 Cas9를 이량체화시키는 것으로, 특히 코딩 mRNA를 통해 전달되는 경우에, 추가로 강화될 수 있다. 다른 도메인이 후성유전학적 변형을 위해 유사한 방식으로 Cas9에 융합될 수 있다.
도 6. qPCR을 위한 프라이머 디자인. 이러한 디자인은 실시간 PCR에 의한 iPSC 내의 단일 염기 변화의 검출을 가능하게 하였다.
도 7. 증폭 Ct 곡선의 예. 이러한 곡선은 잘 디자인된 qPCR에 의해 어떻게염색체 상의 소정의 위치에서의 돌연변이 비율이 검출되었는지를 나타낸다.
도 8. 클론형 앰플리콘 라이브러리 스크리닝에 대한 샘플 증폭 플롯. 클론형 앰플리콘 라이브러리의 qPCR 스크리닝은 통상적으로 높은 변동을 초래하지만, HDR 효율이 ~1%인 벌크 집단을 고려하여, 소수의 낮은 Ct 이상치 웰이 있을 것이다. 왼쪽으로 이동된 Ct 이상치가 확인되었으면, 상응하는 웰이 중복 플레이트에서 확장되었다.
도 9. 클론형 앰플리콘 라이브러리 스크리닝에 대한 샘플 크로마토그램. T → G의 단일 염기 전환이 단일 iPSC 클론에서 달성되었고, 이는 의도되는 MEF2C 유전자좌에 대해 이형접합이다.
발명의 상세한 설명
본 발명을 기술할 때, 본원에서 정의되지 않은 모든 용어는 관련 기술 분야에서 인식되는 이의 통상적인 의미를 갖는다. 하기의 설명이 본 발명의 구체적인 실시양태 또는 특정 용도의 설명이라는 점에서, 이는 예시적인 것으로만 의도되고, 청구된 발명을 제한하려는 것으로 의도되지 않는다. 하기의 설명은 본 발명의 취지 및 범주 내에 포함되는 모든 대안, 변형 및 등가물을 포괄하도록 의도된다.
관련 기술 분야의 다른 작업자들이 시험관내에서 전사된 cas mRNA 및 gRNA를 사용하려 시도하였지만, 성공하지 못했거나 또는 결과가 제한되었다. 예를 들어, 문헌 [Kouranova et al., Hum Gene Ther. 2016 Jun 1; 27(6): 464-475]에서 ZFN과 비교하여 Cas의 전달 양식으로 플라스미드, RNA, 및 단백질을 시도하였다. 이들은 "ZFN mRNA로의 우리의 경험과 달리, 시험관내에서 전사된 Cas9 mRNA 또는 Cas9-발현 플라스미드 DNA와 시험관내에서 전사된 sgRNA의 공동-형질감염은 뉴클레오펙션(nucleofection)에 의해 래트 C6 세포주에서 표적 부위에서의 효율적인 절단에 거의 이르지 않았다"고 결론지었다. 문헌 [Liang et al., Journal of Biotechnology, Volume 208,　20 August 2015, 44-53] 또한 다양한 포유동물 세포 내로 CRISPR/CAS를 전달하기 위해 플라스미드, mRNA, 및 단백질을 비교하였다. 이들은 mRNA 및 RNP-형성 CAS 단백질 양쪽 모두가 인델을 생성시키는 것에서 작용하였음을 입증한 반면, CRISPR/CAS를 통한 훨씬 더 어려운 작업 및 종종 더욱 요망되는 결과인, 염색체 상의 염기를 정확하게 편집하기 위한 메커니즘인 상동성 지시 재조합 (HDR)이 수행되거나 제시되지 않았고, 이들의 시스템에서 달성될 가능성이 고도로 낮았다. 다른 이들이 CRISPR/CAS를 위해 RNA 분자를 사용하였지만, 수정된 동물 난 또는 배아에서만 미세주입을 통해 그러하였고, 결과가 다양하였다 (Wu et al. Cell Stem cell, Volume 13, Issue 6,　5 December 2013, 659-662; Liang et al. Protein & Cell, May 2015,　Volume 6,　Issue　5,　pp 363-372; Hruscha et al. Development　2013　140:　4982-4987). 이러한 보고서 중 어느 것도 특히 배양이 어려운 세포 예컨대 만능 줄기 세포를 포함하는, 용기에서 유지되는 포유동물 세포 배양물과 함께 사용하는 데 성공적인 본원에 개시된 바와 같은 형질감염 프로세스를 기초로 하지 않았다.
본 개시내용의 한 측면에서, 상이한 박테리아 종들, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피로게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans), 캄필로박테르 제주니(Campylobacter jejuni), 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis), 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 및 II형 CRIPSR 시스템을 함유하는 것으로 공지된 다른 종 (Fonfara et al., 2013)으로부터의 야생형 cas9을 코딩하는 mRNA-기반. 관련 기술 분야에 공지되어 있는 클로닝 기술을 사용하여 이러한 Cas9 효소 또는 다른 Cas 효소의 유전자가 박테리아 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 클로닝될 수 있다.
또 다른 측면에서, cas9 유전자는 프로모터, 예컨대 박테리아 파지 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소, 또는 Sp6 RNA 중합효소, 또는 기타 RNA 중합효소의 것 뒤에 클로닝된다. 프로모터, cas9 코딩 DNA, 진핵생물 세포에서의 안정성 및 발현에 적절한 mRNA에 대한 폴리(A) 꼬리를 코딩하는 단편을 포함하는 카세트가 선형 주형으로서 시험관내 번역 (IVT)에 사용될 수 있거나, 또는 벡터 예컨대 플라스미드, 파지미드, 또는 기타 DNA 서열 운반체 내로 클로닝될 수 있다 (예를 들어 도 1). 이러한 벡터의 한 예는 본 발명자들이 기존에 기술한 pIVT 플라스미드이다 (Warren et al., 2012).
Cas 단백질을 코딩하는 mRNA를 생성시키는 방법이 본원에서 개시된다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 최적화된 조건 하에서의 시험관내 전사에 의해 mRNA가 생산된다. 본 개시내용의 한 실시양태는 5' 디구아노신 캡 및 폴리(A) 꼬리의 혼입에 의해 살아있는 세포에서 번역을 위한 효율적인 주형으로서의 역할을 하는 합성 mRNA 전사체이다. 캡 및 꼬리는 효소에 의해 또는 공동-전사에 의해 IVT 전사체 내로 혼입될 수 있다. 효소 캡핑의 이점은 높은 RNA 효율, 낮은 비용, 및 거의 순수한 캡핑된 RNA를 생산하는 잠재력을 포함한다. 그러나, 효소 캡핑이 성공적으로 진행되었는지를 점검하는 용이한 방법이 없기 때문에, 더욱 강건한 공동-전사 캡핑 접근법을 사용하는 것이 선호된다. 이러한 체계에서는, 합성 캡 유사물이 높은 농도로 IVT 반응 완충제 내에 포함되고, 캡이 시약의 각각의 반응 농도를 기초로 전사체의 5' 말단에 GTP 대신에 우선적으로 혼입된다. 또 다른 실시양태는 전사체를 폴리아데닐화시키도록 공동-전사 접근법을 사용하는 것이다: IVT 주형의 말단의 폴리(dA:dT) 트랙이 RNA 중합효소에 의한 꼬리의 혼입을 구동시킨다. cas9 mRNA의 폴리(A) 꼬리가 폴리아데닐화 중합효소에 의해 코딩 영역의 말단에 부가되는 것 또한 본 개시내용의 실시양태이다 (도 2).
한 측면에서, 시험관내 전사는 바람직하게는 변형 뉴클레오티드 트리포스페이트 (NTP), 예컨대 5-메틸-시토신, 2-티오-우라실, 또는 슈도우라실, 또는 RNA의 기능을 유의하게 변형시키지 않는, RNA 분자 내의 미변형 뉴클레오티드를 치환할 수 있는 다른 변형 뉴클레오티드로 수행된다. 변형 뉴클레오티드를 사용하는 것은 세포 면역 반응을 감소시키는 것을 돕고, 이는 숙주 세포들 사이에서 원하는 수준의 게놈 변형을 달성하도록 mRNA를 숙주 세포 내로 반복하여 전달하는 것이 요구되거나, 또는 숙주 세포가 외인성 RNA 분자에 대해 과민성인 경우에 특히 중요하다.
본 개시내용은 추가로 sgRNA의 생성에 관한 것이다. 기존에는, CRISPR/CAS용 가이드로서의 sgRNA가 DNA 벡터 또는 바이러스 벡터를 통해 도입되고, 이에 의해 sgRNA-코딩 DNA가 짧은 RNA의 전사를 구동시킬 수 있는 프로모터, 예를 들어, U6 또는 H1 프로모터의 뒤에 놓인다. 본 발명의 한 실시양태로서, sgRNA 코딩 DNA는 시험관내 전사에 적절한 프로모터, 예를 들어, T7, T3, 또는 Sp6 프로모터 뒤에 놓인다 (도 1). 프로모터 및 sgRNA 코딩 DNA를 포함하는 카세트는 선형 주형으로서 사용될 수 있거나, 또는 벡터 예컨대 플라스미드, 파지미드, 또는 DNA 서열의 기타 운반체 내로 클로닝될 수 있다. 전사 종결인자 서열이 있는 것에 의해 전사 종결이 또한 달성될 수 있다. 이러한 벡터의 한 예는 기존에 기술된 pIVT 플라스미드이다 (Warren et al., 2012). 본 개시내용의 한 실시양태에서, 변형 또는 미변형 NTP를 사용하여 IVT에 의해 sgRNA가 생성된다 (도 2).
본 개시내용의 한 측면은 Cas9 효소의 디자인에 관한 것이다. 야생형 Cas9 효소는 천연적으로 2개의 엔도뉴클레아제 기능성 도메인을 갖는다: 서열식별번호: 1. 본원에 기술된 바와 같은 선택적 점 돌연변이에 의해, Cas9 효소는 dsDNA 절단 효소에서 단일-가닥 DNA (ssDNA) 닉킹(nicking) 효소, 예를 들어, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3으로 전환될 수 있다. 추가적으로, 2개의 이러한 닉킹 효소가 dsDNA 분자의 마주보는 가닥들 상에 있는 경우, 이중-가닥 파손이 여전히 생성될 수 있지만, 야생형 Cas9에 의해 생성된 이중-가닥 파손과 대조적으로, 2개의 sgRNA가 필요하고, 이에 의해 프로세스에 추가된 서열-특이성을 제공한다 (도 4). 한 예에서, 1개의 sgRNA가 가이드할 때 1개의 가닥을 닉킹하는 Cas9의 돌연변이체를 발현하도록 mRNA가 생성된다. 또 다른 실시양태에서, cas9 mRNA는 이의 엔도뉴클레아제 도메인 양쪽 모두가 제거되도록 추가로 돌연변이되고 (서열식별번호: 4), 인공 뉴클레아제 도메인 예컨대 제한 효소 FokI 또는 다른 이러한 제한 효소의 것에 융합된 Cas9 버전을 코딩한다 (도 5). 생성된 돌연변이체 형태의 Cas9는 엔도뉴클레아제로서 기능하기 위해 이량체를 형성하는 것이 필요하고, 이는 sgRNA 서열의 쌍에 의해 규정되는 표적 부위가 바람직하게는 약 5-30개 또는 약 10-20개의 뉴클레오티드 (nt), 또는 약 12-18개의 nt의 거리로 서로 가까울 것을 요구하여, 추가의 특이성을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 CRISPR/CAS 표적 부위의 선택에 관한 것이다. 진핵생물 게놈 상의 바람직한 sgRNA 매칭 부위의 디자인이 잘 확립되어 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 염색체 녹-인 프로세스 (DNA 주형을 제공하는 것에 의해 염색체의 단일 nt만큼 짧을 수 있는 서열 분절을 또 다른 것으로 교체함) 동안의 표적 특이성을 최대화하기 위해, 표적 부위를 선택할 때 닉킹 Cas9 돌연변이체 또는 Cas9-FokI 융합물을 사용하는 것에 의해 2개의 이중-가닥 절단물이 만들어지는 것이 본원에 개시된다. 한 예가 도 4에서 예시된다.
한 추가적인 실시양태에서, Cas9 또는 이의 닉킹 또는 블런트(blunt) 돌연변이체는 후성유전학적 변형 효소, 예컨대 단백질 아르기닌 메틸트랜스퍼라제 PRMT1 및 PRMT4 (CARM1), DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 아실트랜스퍼라제 등에 인-프레임으로 융합된다. sgRNA와 함께 표적 세포 내로 도입되는 경우에, 이러한 융합 Cas9 효소는, dsDNA 서열을 절단하거나 교체하는 것 대신에 또는 이에 더하여, 후성유전학적 정보 예컨대 DNA 메틸화, 히스톤 아세틸화 등을 변형시킬 것이다.
sgRNA를 제공하기 위해 RNA를 사용하는 것의 한 측면에서, 가이드 RNA, 전형적인 sgRNA에서와 같은 구조 RNA, 및 필요한 경우의 링커 RNA가 Cas9 효소에 의한 절단 후의 국소적인 복구를 위해 패치 주형 RNA에 추가로 융합될 수 있다. RNA가 상동 DNA 파손 복구에 사용될 수 있다는 것이 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다 (Storici et al., 2007).
또 다른 실시양태에서, Cas9에 특이적으로 결합하는 DNA 또는 RNA 앱타머가 주형 폴리뉴클레오티드의 사용을 통해 유전자 녹-인 또는 녹-아웃을 달성하기 위해 서열 교체 "패치" 주형에 연결된다. Cas9 효소에 물리적으로 부착되는 것에 의해, 패치가 CRISPR/CAS 절단 부위에 가깝게 전달될 수 있다. 패치 주형은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
본 개시내용의 한 유의한 실시양태는 cas mRNA 및 sgRNA를 적합한 절대 및 상대 용량으로 전달하는 것에 관한 것이다. RNA를 유전 정보 전달의 형태로 사용하는 것의 독특한 장점 중 하나는 이것이 DNA를 사용하는 것보다 발현 면에서 더욱 제어가능하다는 것이다. 단백질 예컨대 효소의 발현을 위해, mRNA 분자가 핵 내로 전위될 필요가 없고, 이에 의해 핵 진입이 전형적으로 제시하는 병목 현상, 뿐만 아니라 DNA와 mRNA 사이의 몰비의 관점에서의 다층적인 불확실성을 제거한다. 형질감염 또는 전기천공 프로세스에 의해 코딩 mRNA가 세포질에 진입한 직후에 Cas 단백질이 고도로 발현될 수 있다. 추가로, RNA 분자는 천연적으로 상대적으로 더 짧은 반감기를 갖고, 따라서 DNA 벡터 또는 바이러스 벡터를 사용하는 것보다 CRISPR/CAS 시스템의 탈표적 효과의 제어를 더욱 관리하기 쉽게 만든다는 것이 또한 이롭다.
투약 제어와 관련된 본 개시내용의 추가 실시양태는 gRNA와 Cas mRNA 사이의 비를 조정하는 것에 관한 것이다. cas9 mRNA의 용량은 본질적으로 Cas 효소의 수준과 비례적으로 상호관련되기 때문에, 가장 높은 적중 및 가장 낮은 탈표적의 DNA 절단을 수득하기 위해, 본원에 개시된 전체-RNA CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR/Cas의 2가지 성분, 즉 Cas 효소와 gRNA 사이의 직접적인 매칭을 가능하게 한다.
실시예
실시예 1 - cas9 IVT 주형 생성
스트렙토코쿠스 피로게네스 박테리아로부터의 Cas9를 코딩하는 DNA를 포유동물, 특히 인간 세포에서의 최적의 발현을 위해 코돈-최대화하였다. 상업적인 유전자 합성 서비스 (진 오라클(Gene Oracle))를 통해 생성된 3개의 단편으로부터 완전한 유전자가 어셈블리되었다; DNA 엔도뉴클레아제 도메인을 파괴하는 돌연변이가 유전자 합성 동안 포함되어, 서열식별번호: 1-4에서 서술된 바와 같은 여러 버전의 cas9가 생성되었다.
실시예 2 - cas9 mRNA 생산
높은 백분율의 캡핑된 전사체가 생성되도록 4:1 비의 항-역전 캡 유사물 (ARCA) 대 GTP를 사용하여 IVT 반응에서 합성 mRNA가 생성되었다. 뉴클레오티드 포스페이트 (NTP) 믹스 내의 CTP에 대한 5m-CTP 및 UTP에 대한 2-티오-UTP의 20 퍼센트 치환을 사용하여 RNA 생성물의 면역원성을 감소시켰다. ARCA 및 변형 NTP는 트리링크 바이오테크놀러지즈(Trilink Biotechnologies) (샌디에고)로부터 구입하였다. 2.5× NTP 믹스를 제조하였다 (15:15:3.75:3:0.75:3:0.75 mM의 ARCA:ATP:GTP:C:5m-CTP:UTP:슈도-UTP). 각각 20 ㎕의 IVT 반응물은 8 ㎕ NTP 믹스, 2 ㎕ 10× T7 완충제, 8 ㎕ DNA 주형 및 2 ㎕ T7 효소 (프로메가(Promega))를 포함하였다. 반응물을 4-6시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 1 ㎕ RNAse-프리 DNase로 추가 30분 동안 37℃에서 처리하고 나서, 스핀 칼럼에서 정제하여, RNA 생성물이 80 ㎕의 부피로 용출되었다. 8 ㎕ 10× PAP 완충제 및 8 ㎕ 10 mM ATP 및 2 ㎕ PAP (NEB)를 10분 동안 첨가하여 폴리(A) 꼬리를 부가한 후, 10분 동안 면역원성 5' 트리포스페이트 모이어티를 캡핑되지 않은 전사체로부터 제거하기 위한 3 ㎕ 앤타르크틱 포스파타제(Antarctic Phosphatase) (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 및 10 ㎕의 반응 완충제를 첨가하였다. 포스파타제 반응물을 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 필요하다면 IVT 생성물을 다시 정제하였다 (도 2).
실시예 3 - IVT에 의한 sgRNA 생산
높은 백분율의 캡핑된 전사체가 생성되도록 4:1 비의 ARCA 캡 유사물 대 GTP를 사용하여 IVT 반응에서 합성 sgRNA가 생성되었다. 뉴클레오티드 포스페이트 (NTP) 믹스 내의 CTP에 대한 5m-CTP 및 UTP에 대한 2-티오-UTP의 20 퍼센트 치환을 사용하여 RNA 생성물의 면역원성을 감소시켰다. 캡 유사물 및 변형 NTP는 트리링크 바이오테크놀러지즈로부터 구입하였다. 2.5× NTP 믹스를 제조하였다 (15:15:3.75:3:0.75:3:0.75 mM의 ARCA:ATP:GTP:C:5m-CTP:UTP:슈도-UTP). 각각 20 ㎕의 IVT 반응물은 8 ㎕ NTP 믹스, 2 ㎕ 10× T7 완충제, 8 ㎕ DNA 주형 및 2 ㎕ T7 효소 (프로메가)를 포함하였다. 반응물을 4-6시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 1 ㎕ RNAse-프리 DNase로 추가 30분 동안 37℃에서 처리하고 나서, 스핀 칼럼에서 정제하여, RNA 생성물이 80 ㎕의 부피로 용출되었다. 면역원성 5' 트리포스페이트 모이어티를 캡핑되지 않은 전사체로부터 제거하기 위한 3 ㎕ 앤타르크틱 포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스) 및 10 ㎕의 반응 완충제를 10분 동안 첨가하였다. 포스파타제 반응물을 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 필요하다면 IVT 생성물을 다시 정제하였다 (도 2).
실시예 4 - 인간 세포 내의 리포터 유전자를 변형시킴
개시된 시스템의 유용성을 입증하기 위해, 포유동물 세포 NIH-3T3에서 영구적으로 발현되는 형광 단백질 (FP) mWasabi (얼리얼 바이오테크(Allele Biotech))를 파괴하도록 완전한 전체-RNA CRISPR/CAS 시스템이 생성되었다. NIH3T3-mWasabi 세포를 무혈청 배지에서 15% 전면성장으로 성장시키고, cas9 mRNA 및 sgRNA를 세포 내로 공동-형질감염시켰다; 2시간 후, 혈청-함유 배지를 첨가하였다. 도 3에 도해된 바와 같이, 왼쪽에서 오른쪽으로, 각각의 패널 아래에 지시된 바와 같이, 0, 0.2, 또는 0.8 ng의 mWasabi 부위 nt43 (W43)에 대한 sgRNA가 세포에 제공되었다. 상부 패널은 세포가 존재하는 곳을 나타내고 (상 대비); 하부 패널은 여전히 형광인 세포를 나타낸다 (녹색 형광 채널). 오른쪽 하부 패널의 3개의 화살표는 cas9 mRNA와 함께 더 높은 용량의 sgRNA가 제공된 웰 내의 녹색 형광을 상실한 세포를 가리킨다. 0 또는 0.2 ng sgRNA 웰 내의 세포는 녹색 형광을 상실하지 않았다.
실시예 6- mRNA-기반 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 단일 염기쌍 돌연변이를 생성시키기 위한 방법 실시양태.
A. 서열 디자인:
I. sgRNA의 서열 디자인을 위한 예시적인 방법 실시양태:
1) 의도되는 돌연변이 부위를 에워싸는 300 bp 서열을 웹-기반 sgRNA 디자인 툴을 통해 실행한다. ("MIT Crispr 디자인 툴" MIT). 2) 2개의 파라미터에 의해 가이드 RNA 선집을 결정한다: a) 의도되는 돌연변이에 대한 근접성, 및 b) 잠재적인 탈표적 점수. 3) 최소 2개의 sgRNA 부위를 선택한다. (최적의 파라미터는 의도되는 돌연변이로부터 5 bp 이내이고 sgRNA 점수가 >70인 PAM 부위일 것이다.)
II. 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 공여자 (ssODN) 복구 주형의 디자인에 대한 예시적인 방법 실시양태:
1) 의도되는 돌연변이 상에 중심이 있는 상동성 팔이 있는 60-100 bp 서열을 수득한다. 2) 임의적으로, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 부위를 파괴하도록 침묵 돌연변이를 조작한다 (즉, NGG → NGT, NGA, 또는 NGC). 3) 임의적으로, 제한 부위를 생성시키도록 의도되는 돌연변이로부터 <10 bp 떨어진 침묵 돌연변이를 조작한다. 이는 스크리닝 프로세스를 용이하게 할 수 있다. 4) IDT "울트라머(Ultramer)" 서비스 (표준 탈염 4 nmole) (인터그레이티드 DNA 테크놀러지즈(Integrated DNA Technologies), 아이오와주 코랄빌)를 통해 ssODN을 수득한다.
III. 게놈 DNA 증폭에 대한 예시적인 방법 실시양태:
1) 슈도 유전자 또는 다른 고도로 유사한 게놈 서열에 대한 게놈 영역을 BLAST 검색한다. 2) 게놈 DNA 용해물 주형을 사용하여 의도되는 돌연변이 주변에 중심이 있는 ~400-600 bp 영역을 증폭시키도록 다중 세트의 프라이머 쌍을 디자인하고 테스트한다. 3) 증폭의 강건성 (즉, 높은 수율 및 비-특이적 밴드 없음)을 기초로 CRISPR 처리 세포를 스크리닝하기 위한 최상의 프라이머 쌍을 선택한다. 4) PCR 생성물을 시퀀싱하여, 앰플리콘의 품질 시퀀싱 판독물을 확인한다.
IV. qPCR 기반 스크리닝을 위한 예시적인 프라이머:
1) qPCR 프라이머에 대한 Tm을 ~64℃이도록 선택한다. 2) 정방향 프라이머는 의도되는 돌연변이로부터 ~100 bp 떨어질 수 있고, 단계 III으로부터 생성된 앰플리콘 내에 함유될 수 있다. 3) 역방향 프라이머 (돌연변이 특이적)는 5' 선도 말단에 의도되는 돌연변이가 있을 수 있다.
B. sgRNA 및 Cas9 Wt mRNA의 시험관내 전사 (IVT)에 대한 예시적인 방법 실시양태
I. sgRNA의 IVT 주형 생산을 위해, 1) 하기의 3개의 요소로 정방향 프라이머를 디자인하고 합성한다: a) T7 프로모터, b) 프로토스페이서 요소 서열 (단계 A.I.2), 및 c) crRNA 특이적 서열. 범용 역방향 프라이머 (sgRNA_Rev)를 사용하여 프라이머 쌍을 완성시킨다. 2) 이러한 프라이머 및 주형으로서의 pT7sgRNA 플라스미드를 사용하여, IVT 주형 (~ 131bp)이 생성되도록 PCR 반응을 수행한다. 반응 샘플을 DpnI로 소화시키고, 시험관내 전사 반응에 적절할 수 있도록 PCR 클린업을 수행한다.
II. Cas9wt의 IVT 주형 생산에 대한 예시적인 방법 실시양태. 1) 주형으로서의 pIVT-Cas9wt 플라스미드 및 프라이머 쌍으로서의 INS-F + d(T)120-Rev를 사용하여, IVT 주형이 생성되도록 PCR 반응을 수행한다. 2) 시험관내 전사에 적절할 수 있도록 생성된 PCR 생성물에 PCR 클린-업을 수행한다.
III. CRISPR 요소를 생산하기 위한 IVT 반응에 대한 예시적인 방법 실시양태. 1) PCR을 통해 생성된 주형을 사용하여, sgRNA 및 Cas9wt mRNA를 전사하도록 IVT 반응을 수행한다. 2) 겔 영상화 및 바이오애널라이저(Bioanalyzer) (애질런트(Agilent))를 통해 전사체를 정제하고 품질 관리한다.
IV. 시험관내 절단 테스트를 통한 IVT sgRNA의 검증에 대한 예시적인 방법 실시양태. 1) 표적 서열을 함유하는 게놈 DNA의 단편을 증폭시킴으로써 IVT 전사 sgRNA를 검증하기 위해 절단 주형을 생성시킨다. (단계 A.III.3에서 제조됨). 2) 재조합 Cas9 뉴클레아제와 조합된 B.III.1로부터의 sgRNA를 사용하여 절단 주형의 절단 반응을 수행한다 (하기 프로토콜 III 참조). 3) Cas9 및 sgRNA를 각각 1:1.2 비로 복합시킨다. 4) RNP 복합체를 10:1 비로 절단 주형 앰플리콘과 함께 인큐베이션한 후, 아가로스 겔 상에서 반응물을 러닝시킨다. 5) 더 낮은 분자량의 절단 밴드를 관찰하는 것에 의해 절단 효율을 평가하도록 겔을 분석한다.
C. qPCR SYBR 그린 기반 스크리닝에 대한 예시적인 방법 실시양태
I. 플라스미드 및 앰플리콘 표준물질의 구축: 1) 깁슨 어셈블리를 통해, 관심 영역 (pIVT 상용성 중첩이 있는 프라이머를 사용하여 게놈 DNA 주형으로부터 증폭됨)을 pIVT 벡터 내로 서브-클로닝한다. 삽입물은 400-600 bp이다. 이는 "WT' 벡터로 지정된다. 2) 퀵체인지(QuickChange) 부위 지정 돌연변이유발 키트 (애질런트)를 사용하여, 의도되는 단일 점 돌연변이를 생성시킨다 (돌연변이유발 프라이머를 디자인하는 것 및 열 사이클링 파라미터에 대해 키트 절차를 따른다). 생성된 구축물이 "돌연변이체" 벡터로 지정된다. 3) "WT" 및 "돌연변이체" 구축물을 A.III에서 디자인된 프라이머로 증폭시켜, "WT" 및 "돌연변이체" 앰플리콘을 생성시킨다. 임의적으로, 정제된 PCR 생성물을 생어(Sanger) 시퀀싱하여, WT 및 돌연변이체 서열을 확인한다. 4) 나노드랍(Nanodrop) 분광광도계를 사용하여 앰플리콘을 정량한 후, 앰플리콘을 각각 60 fg/㎕로 희석함으로써 농도를 표준화한다. 농도 표준화를 수행한 후, 하기 비로 어셈블리한다:
0% "돌연변이체", 100% "WT"
1% "돌연변이체", 99% "WT"
10% "돌연변이체" 90% "WT"
50% "돌연변이체", 50% "WT"
II. qPCR 상에서 표준물질을 검정하는 것에 대한 예시적인 방법 실시양태: 1) qPCR 플레이트에 하기를 설정한다: a) 주형: 단계 I에서 생성된 표준물질 (중복물을 포함함). b) 프라이머: A.IV에서 디자인된 프라이머를 사용함. 2) SYBR 그린 리포터로 표준 정량 RT-PCR 프로그램을 실행하고, 각각의 표준물질 지점의 Ct 값을 비교한다. Ct 값은 상대적인 돌연변이체 집단 비를 반영한다 (더 높은 돌연변이체 비에서 더 낮은 Ct 값이 산출된다). 3) 1% "돌연변이체" 표준물질은 100% "WT에 비교하여 대략적인 ΔCt가 ≥2이다. ≥2의 ΔCt로, qPCR-기반 스크리닝 방법은 적어도 1%의 감도로 돌연변이를 신뢰할 수 있게 검출할 수 있다.
D. 표적 세포 (iPSC)의 형질감염에 대한 예시적인 방법 실시양태
I. 예시적인 표적 세포를 플레이팅한다: 1) 세포를 계대 동안 ROCK 억제제 (Y27632)가 보충된 E8 배지에서 배양한다. 2) 형질감염 전날, 세포를 2.5×105개의 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트 내로 계대시킨다.
II. CRISPR 요소의 형질감염을 위한 예시적인 방법: 1) 시딩 다음날, 세포 밀도가 최소 배가되고, 1 내지 4개의 세포의 소형 클러스터를 나타낸다. 2) 메신저 맥스(Messenger Max) 형질감염 시약을 사용하여, 세포에 B.III.1에서 생산된 IVT RNA CRISPR 요소 및 A.II.4에서 주문된 ssODN를 형질감염시킨다. 추가적으로, ssODN만 함유하는 음성 대조군 형질감염을 수행한다. 형질감염 효율을 측정하기 위해, 음성 대조군은 형광 단백질 예컨대 mNG를 코딩하는 100 ng mRNA를 또한 함유하여야 한다. 3) 형질감염 4시간 후, 형질감염 배지를 미리 가온된 신선한 E8 배지 (Y27632가 보충됨)로 교체한다. 4) 다음날 (~12-18시간 후), 음성 대조군 웰에서의 mNG 발현을 점검한다. 발현이 강건한 경우, 실험 및 음성 대조군 웰에서 sgRNA 및 ssODN의 2차 형질감염을 진행한다. 반복 형질감염에서 Cas9 mRNA가 반복적으로 전달될 수 있다. 반복 형질감염 4시간 후, 형질감염 배지를 신선한 E8 (+Y27632)로 교체한다. 5) 세포를 2일 더 배양한 후, 1:3 희석으로 또 다른 6웰 플레이트 내로 계대시킨다. 잔여 세포를 용해시키고, 분석한다.
E. CRISPR 처리 세포의 스크리닝 및 클로닝을 위한 예시적인 방법 실시양태
I. 처리된 세포의 용해 및 스크리닝을 위한 gDNA의 증폭에 대한 예시적인 방법 실시양태. 1) D.II.5 실험 및 음성 대조군 웰로부터의 잔여 세포의 용해를 수행한다. 세포를 얼리얼의 마우스 꼬리 용해 완충제 (얼리얼 바이오테크, 샌디에고)에 재현탁시키고, 써모사이클러에서 용해 프로그램을 사용하여 샘플을 러닝시킨다. 생성된 용해물을 허큘라제(Herculase) II 융합 DNA 중합효소 (애질런트 테크놀러지즈(Agilent Technologies))를 사용하여 A.III.3에서 디자인된 프라이머를 사용하여 증폭시킨다 (<26 사이클). PCR 생성물 상에서 PCR 클린업을 수행한다. 생성된 실험 및 음성 대조군 앰플리콘 라이브러리가 실험 및 음성 대조군 "벌크 집단"으로 지정된다. 2) PCR 생성물을 정량하기 위한 나노드랍을 사용하여, 모든 앰플리콘을 60 fg/㎕로 표준화하도록 희석을 수행한다.
II. 벌크 집단을 스크리닝하기 위한 예시적인 방법 실시양태: 1) 이전 단계에서 제조된 벌크 앰플리콘 라이브러리 및 C.I.4에서 제조된 표준물질로, SYBR 그린 기반 표준 정량 qPCR 스크리닝을 수행한다. 2. 실험 라이브러리와 음성 대조군 라이브러리 사이의 ΔCt가 ≥2이고, 표준물질에 따른 1% 돌연변이체 집단의 범위 내인 경우에, 단일 세포-클로닝 단계로 진행한다. 도 7을 참조한다.
III. 단일 세포, 96웰 플레이트 계대에 대한 예시적인 방법 실시양태: 1) 계대 2 CRISPR 실험 세포로부터 TrypLE를 사용하여 세포를 해리시킨다. 단일 세포 현탁액이 생산되도록 세포를 70 ㎛ 세포 스트레이너에 통과시킨 후, 세포 수를 결정하고, 2-3개의 세포/100 ㎕를 생성할 희석을 계산한다; 2) 미리 가온된 E8 (Y27632가 보충됨)에서, 4개의 매트리겔(Matrigel)-코팅 96웰 플레이트 내에 2-3개의 세포/웰 (100 ㎕/웰)을 시딩한다; 3) 다음날, 부착된 세포의 존재를 현미경에 의해 신속하게 확인한다. 웰에는 웰 당 0-3개의 세포가 있어야 한다 (모든 웰을 검사하는 것은 불필요하다). 절반 배지 교환을 매일 수행한다 (50 ㎕를 흡인하고, 50 ㎕의 미리-가온된 Y27632가 보충된 E8을 첨가한다); 4) ~50-100개의 세포 클러스터로의 성장이 확립된 후 (전형적으로, 약 7일), Y27632가 보충되지 않은 E8로 전환시키고, 격일로 배지를 교환한다.
IV. 스크리닝을 위한 중복 플레이트를 제조하는 것에 대한 예시적인 방법 실시양태:
1) 세포가 >70% 전면성장에 도달하였으면, 세포의 1/4을 EDTA와 함께 새로운 매트리겔 코팅 96웰 플레이트 상에서 Y27632이 보충된 E8 배지 내로 계대시킨다. 생성된 플레이트가 "중복 플레이트"로 지정된다. 세포의 나머지 3/4은 미리-가온된 신선한 Y27632 보충 E8 배지와 함께 소스 플레이트에 둔다 (세포가 재부착될 것이다). 2) 중복 및 소스 플레이트 양쪽 모두에 대해 배지를 매일 Y27632 보충 E8로 교체한다. 3-5일 후, 소스 플레이트가 용해 및 분석용으로 준비될 것이다.
V. 클론 플레이트의 스크리닝에 대한 예시적인 방법 실시양태: 1) 소스 플레이트 상에서 용해 프로토콜을 수행한다 (E.I.1과 동일함). 2개의 용해물 부피로 3개의 웰 상에서 테스트 PCR을 수행하여, 최적의 용해물 주형 부피를 확인한다. 2) 소스 플레이트로부터의 세포 용해물의 플레이트 PCR을 수행한다. PCR이 완료되면, 플레이트로부터의 PCR 생성물을 대형 양식의 아가로스 겔 상에 러닝시켜, 증폭을 확인하고, 증폭 수율의 임의의 변동에 대한 기록을 제공한다. 3) 서피스바인드(SurfaceBind) 정제 플레이트 (얼리얼 바이오테크)를 사용하여, 프로토콜에 따라 PCR 생성물을 정제한다. 30 ㎕ 용출 완충제에 용출시킨다. 4) 정제된 PCR 생성물을 분자 등급 물 내로의 1:1000 희석을 수행한다. 2 ml 수집 플레이트를 사용하여 플레이트 양식을 유지한다. 이제 앰플리콘 라이브러리가 스크리닝을 위한 적절한 농도이다. 5) 4개의 96웰 플레이트로부터의 앰플리콘 라이브러리에 SYBR 그린 기반 표준 정량 qPCR 스크리닝을 수행한다. 임의적으로, 플레이트 내의 빈 웰에 상응하는 임의의 웰 위치 (즉, 세포가 부착/성장하지 못한 곳)에서 양성 대조군 (1% 돌연변이체 표준물질 라이브러리) 및 음성 대조군 (음성 대조군 앰플리콘 라이브러리를 사용함)이 포함된다. 6) 가장 왼쪽으로 이동된 qPCR Ct 곡선 ("이상치")은 돌연변이체 세포 집단 (즉, 의도되는 HDR 이벤트가 있음)을 함유할 가능성이 가장 높은 웰을 나타낸다. 모든 이상치 웰에 상응하는 원래의 정제된 앰플리콘 라이브러리 스톡에서 생어 시퀀싱 분석을 수행한다.
VI. 클론 및 확장물의 선택에 대한 예시적인 방법 실시양태: 1) E.V.6으로부터의 시퀀싱 결과를 분석하여, 의도되는 돌연변이의 존재를 확인하고, 크로마토그램 내의 피크의 비를 기초로 돌연변이체 집단의 상대적인 크기 (즉, 혼합 집단의 경우)를 결정한다. 확인된 이상치 웰을 E.IV.1에서 제조된 중복 플레이트로부터 계대시킴으로써 확장시킨다. 1차 확장 라운드에서, 96웰 플레이트로부터의 단일 웰을 12웰 플레이트 내의 단일 웰로 계대시킨다.
a) 시퀀싱 결과가 혼합 집단을 가리키는 경우, 단일-세포 클로닝의 2차 라운드를 수행한다 (E.III으로부터 시작하여 단계를 반복한다). 세포가 12웰 플레이트에서 전면성장에 도달한 후 (~105개의 세포), 확인된 이상치를 확장 및 냉동시키고, 단일-세포 클로닝의 2차 라운드로 진행한다. 권장: 임의의 나머지 세포를 용해, 증폭 및 시퀀싱하여, 계대 후에 돌연변이가 보존되는지 여부를 테스트한다.
b) 시퀀싱 결과가 순수한 집단을 가리키면 (즉, WT 및 돌연변이체에 상응하는 크로마토그램 피크의 비가 1:1임 [이형접합 집단을 가리킴]), 24 내지 48개의 웰을 분석함으로써 단일-세포 클로닝의 2차 분석 라운드를 수행하는 것에 의해 세포가 이형접합이라는 것을 확인한다. 세포를 6웰 플레이트 양식으로 확장시킨다. 세포를 106개의 세포/바이알의 농도로 냉동보존한다. 세포의 일부분을 용해, 증폭 및 시퀀싱하여, 계대 후에 돌연변이가 보존되는 경우를 테스트한다.
프로토콜
I. sgRNA IVT 주형의 생산에 대한 예시적인 방법 실시양태
물질: - pT7sgRNA 플라스미드; sgRNA 역방향 프라이머; 맞춤 sgRNA 정방향 프라이머; 10 mM dNTP; 퓨전(Phusion) 중합효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스) + 5× GC 완충제; DpnI 제한 효소; 뉴클레오스핀(NucleoSpin)® 겔 (클론테크(Clontech)) 및 PCR 클린-업(Clean-up); 분자 등급 H2O; 1% 아가로스 겔/1× TAE 러닝 완충제; 바이오라인(Bioline) 1 kb DNA 래더(Ladder)
하기 표 1에서와 같이 PCR 반응을 어셈블리한다:
<표 1> PCR 반응의 어셈블리
Figure pct00001
어셈블리 후, 표 2에 서술된 바와 같이 프로그램을 실행한다.
<표 2> 실행 프로그램
Figure pct00002
2) 2 ㎕의 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에 1 Kb DNA 래더와 함께 러닝시켜, 수율 및 131 bp의 정확한 크기를 확인한다.
3) 1 ㎕의 DpnI 효소를 PCR 반응에 직접 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하여, 주형 플라스미드를 소화시킨다.
4) 제조사의 프로토콜에 따라 뉴클레오스핀 키트를 사용하여 PCR 클린업을 수행한다.
5) 주형이 시험관내 전사 반응에 대해 준비된다.
II. Cas9WT의 IVT 주형 생산에 대한 예시적인 방법 실시양태
물질:
- pIVT-Cas9WT 플라스미드
- 꼬리 120 역방향 프라이머
- 삽입-F 정방향 프라이머
- 카파 바이오시스템즈(KAPA Biosystems)의 하이파이 핫스타트 레디믹스(HiFi HotStart ReadyMix)
- 뉴클레오스핀® 겔 및 PCR 클린-업
- 분자 등급 H2O
- 1% 아가로스 겔/1× TAE 러닝 완충제
- 바이오라인 1 kb DNA 래더
1) 하기 표 3에서와 같이 PCR 반응을 어셈블리한다:
<표 3> PCR 반응 성분
Figure pct00003
2) 2 ㎕의 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에 1 Kb DNA 래더와 함께 러닝시켜, 수율 및 ~4.5 kb의 정확한 크기를 확인한다.
3) 제조사의 프로토콜에 따라 뉴클레오스핀 키트를 사용하여 PCR 클린업을 수행한다.
4) 주형이 시험관내 전사 반응에 대해 준비된다.
III. 재조합 Cas9의 발현에 대한 예시적인 방법 실시양태
물질:
- pCold-Cas9Wt 플라스미드
- SOC 배지
- 2×YT 배지
- 카르베니실린
- LB-한천 플레이트
- NEB 익스프레스(NEB Express) 수용성 세포
- 1 M IPTG
- 고밀도 코발트 수지
- 커플링 완충제 (100 mM 포스페이트, 150 mM NaCl)
- 용해 완충제 (50 mM NaPO4, 300 mM NaCl, 5 mM 이미다졸)
- 용출 완충제 (100 mM NaPO4, 150 mM NaCl, 200 mM 이미다졸)
- 투석 완충제 (300 mM NaCl, 10 mM 트리스(Tris)-HCl pH 8.0, 0.1% 트윈
a) 박테리아 발현:
1) 이. 콜라이(E. coli) 숙주 균주 (NEB 익스프레스)를 pCold-Cas9Wt 플라스미드로 형질전환시키고, LB-카르베니실린 선별 플레이트 상에서 형질전환체를 선별한다.
2) 형질전환체를 5 ml 배지 (100 ㎍/ml의 카르베니실린을 포함함)에 접종하고, 진탕하면서 24시간 동안 37℃에서 배양한다.
3) 다음날, 성장 중인 5 ml 배양물을 500 ml 2×YT-카르베니실린이 있는 대형 2.5 L 플라스크에 첨가한다. OD600= 0.4 - 0.5에서, 배양 용액을 신속하게 15℃로 냉각하고, 30분 동안 방치한다.
4) IPTG를 0.1 - 1.0 mM의 최종 농도로 첨가하고, 진탕하면서 15℃에서 24시간 동안 계속 배양한다.
5) 철야 배양물을 진탕 인큐베이터로부터 제거한다.
6) 배양물을 깨끗한 오크리지(Oakridge) 튜브 내로 붓는다.
7) 500 mL 이상의 배양물의 경우, 배양물의 절반만 튜브 내로 부을 수 있다.
8) 오크리지 튜브를 실온에서 10-15분 동안 5,000 g로 소발(Sorvall) 원심분리기에서 스피닝시킨다.
9) 오크리지 튜브의 이음매가 로터의 중앙을 향하지 않도록 하여 튜브 파손을 방지한다.
10) 스핀이 완료되면 튜브로부터 상청액을 따라낸다.
11) 대형 배양물로 작업하는 경우 이전의 3개의 단계를 반복한다.
B. 세포 용해
1) 25 mL의 용해 완충제를 첨가하고 부드럽게 와동시킴으로써 오크리지 튜브 내에 존재하는 펠릿을 재현탁시킨다.
2) 펠릿이 완전히 재현탁되었으면, 재현탁액을 50 mL 초고성능 튜브 내로 붓는다.
3) 용해 완충제를 사용하여 50 mL 튜브의 부피를 최대 50 mL에 이르게 한다.
4) 이러한 50 mL 부피를 2개의 50 mL 초고성능 튜브 내로 분할한다 (각각 25 mL).
5) 양쪽 모두의 튜브를 완전히 냉동될 때까지 (또는 장기 보관을 위해) 냉동기 (-20) 내에 놓는다. 완전 냉동은 일반적으로 1-3시간이 걸린다.
6) 냉동기로부터 튜브를 제거하고, 완전히 해동시킨다.
7) 몇 방울의 소포제 (2-3)를 첨가한다.
8) 튜브를 얼음 위에 놓고, 3분 동안 최대로 초음파처리한다.
* 초음파 처리기의 프로브가 튜브의 바닥에 닿지 않지만, 이에 가깝게 있도록 주의한다.
9) 튜브를 에펜도르프 원심분리기 내에 놓고, 15분 동안 4℃ 및 최대 속도에서 스피닝시킨다.
10) 원심분리기가 올바르게 균형을 이루고 있는지를 확인한다.
11) 튜브가 스피닝되는 동안, 약 5 mL의 코발트 슬러리를 멸균 50 mL 튜브 내로 붓는다.
12) 20 mL의 용해 완충제를 코발트 슬러리에 첨가한다.
13) 코발트 수지가 바닥으로 침강하면, 용해 완충제를 부어 낸다.
13) 스핀이 완료되면, 0.7 um 주사기 필터를 사용하여 용해물을 여과하고 (상청액), 이를 코발트 수지에 첨가한다.
14) 4℃에서 10-30분 동안 텀블링시킨다.
c. His-태그 정제
1) 단백질/코발트 슬러리를 점적 칼럼에 붓고, 이를 완전히 배수되도록 한다. 관통물 또는 임의의 후속 세정물을 저장할 필요는 없다.
2) 이전에 단백질을 함유한 50 ml 튜브를 15 ml의 용해 완충제로 세정한다.
3) 이러한 세정물을 점적 칼럼에 붓는다.
4) 칼럼을 10-15 mL의 커플링 완충제로 세정한다. 이를 점적시킨다.
5) 15 ml 멸균 수집 튜브를 칼럼(들) 아래에 놓는다.
6) 15 ml의 용출 완충제를 칼럼에 붓고, 용출된 단백질을 상기 튜브 내에 수집한다.
7) 단백질 농도를 측정하고, 필요할 때까지 4℃에서 보관한다.
d. 투석
1) 단백질을 0.45 ㎛ 주사기 필터를 통해 30 kD 스핀 칼럼 필터 유닛 내로 여과한다. 투석 완충제 (필요한 경우)를 필터 유닛에 첨가하여, 총 부피를 15 mL로 만든다.
2) 필터 유닛을 원심분리기 (스윙 버킷 로터) 내로 놓고, 실온에서 20분 동안 4000 g로, 또는 필터 유닛에 잔존하는 부피가 1 mL 이하일 때까지 스피닝시킨다.
3) 필터 유닛을 원심분리기에서 제거한다. 관통물을 폐기한다. 적합한 양의 투석 완충제를 첨가하여, 총 부피를 다시 15 mL가 되게 한다. 필터 유닛을 뒤집어서 혼합시킨다.
4) 적어도 4,000의 희석 인자가 달성되었을 때까지 반복한다. 하기와 같이 희석 인자를 계산할 수 있다: df= (V최종/V초기).
IV. sgRNA 및 Cas9WT의 시험관내 전사에 대한 예시적인 방법 실시양태
물질:
- 항-역전 캡 유사물, ARCA
- 2-티오-UTP
- 5-메틸-CTP
- rATP
- rUTP
- rGTP
- rCTP
- T7 RNA 중합효소
- 전사 최적화 5× 완충제
- DTT 100 mM
- 1 M MgCl2 용액
- RQ1 RNase-프리 DNase
- 앤타르크틱 포스파타제
- 10× 앤타르크틱 포스파타제 반응 완충제
- TE 완충제 pH=8.0
- RNA 클린 & 컨센트레이터(Clean & Concentrator)™-25
- TE 완충제 pH=7.0
1) 하기 표 4에서와 같이 IVT 반응을 어셈블리한다:
<표 4> IVT 반응의 성분
Figure pct00004
2) 주: 주형 DNA를 1.5 ml 멸균 미세원심분리 튜브에 첨가하기 전에, 주형 DNA를 PCR 튜브에 첨가한다. 이러한 PCR 튜브를 37℃로 미리 가열된, 프로그래밍이 가능한 PTC-100 열 제어기 내에 놓는다. P200 파이펫으로, 32 ㎕의 바로 사용가능한 마스터 믹스를 각각의 반응으로 옮긴다. 잘 혼합되도록 위아래로 5회 파이펫팅한다.
3) 이러한 혼합물을 T100 열 사이클러에서 4-6시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다.
4) 단계 8.2.3에서 완료된 바와 같이 시험관내 전사 반응을 수행한 후, DNA 주형을 제거하기 위해 2 ㎕의 RQ1 RNase-프리 DNase를 각각의 반응에 첨가한다.
5) 혼합물을 T100 열 사이클러에서 적어도 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 단계 5.2.5로부터의 인큐베이션 기간이 완료된 후, 5 ㎕의 10× 앤타르크틱 포스파타제 반응 완충제 및 3 ㎕의 앤타르크틱 포스파타제를 각각의 반응에 첨가한다.
6) 혼합물을 열 사이클러에서 적어도 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한다.
7) 단계 7에서의 인큐베이션이 완료된 후, E-겔에서 mRNA를 점검한다.
i) 각각의 샘플에 대해, P20 파이펫 및 적합한 크기의 팁을 사용하여 9 ㎕의 TE 완충제 pH=8.0을 1 ㎕의 제조된 mRNA와 함께 별도의 PCR 튜브에 첨가한다. 동일한 팁으로, 튜브 내용물을 부드럽게 와동시켜 혼합한다.
ii) 각각의 10 ㎕ 혼합물을 E-겔의 각각의 웰로 로딩하도록 진행한다. 각각의 샘플은 1개의 웰을 차지한다.
iii) E-겔 전기영동 시스템의 내장 프로그램을 8분 동안 실행한다. 작동 설명서에 대해 <E-gel iBase Power System Equipment Manual>을 참조한다.
iv) LED 광으로 RNA 밴드를 점검한다. 명확한 RNA 밴드가 정확한 크기 위치에서 나타난 경우를 결정한다. Cas9 크기: ~4400 nt; sgRNA 크기: ~150 nt
v) 정확한 크기 위치에서의 단일한 명확한 RNA 밴드가 관찰되면, 단계 8로 진행한다.
8) 제조사의 프로토콜에 따라 RNA 클린 & 컨센트레이터™ 25로 mRNA를 정제한다.
9) 나노드랍에서 RNA 생성물을 정량한다. 이제 Cas9WT mRNA 및 sgRNA가 하류 용도에 대해 준비된다.
V. iPSC 배양에 대한 예시적인 방법 실시양태
물질
- TeSR™-E8™
- 코닝(Corning)® 매트리겔(Matrigel)®
- 조직 배양-처리 배양 용기
- DPBS
- Y-27632 (ROCK 억제제)
- PRG-1 EDTA
- TrypLE 1×
- 코스타(Costar)™ 멸균 1회용 시약 저장기
- 조직 배양 등급 96웰 플레이트
- 미스터 프로스티(Mr. Frosty) (써모 사이언티픽(Thremo Scientific))
- DMSO
- HSA
- 옵티(Opti)-MEM
- 메신저맥스 형질감염 시약 (써모 피셔 사이언티픽)
a) iPSC 해동
1) 적어도 해동 1시간 전에, 6웰 플레이트의 1개의 웰을 코닝® 매트리겔® (DMEM 내의 1:80 희석을 사용하여 웰 당 1 mL)로 코팅한다.
2) 5% CO2 5% O2 세포 배양 인큐베이터 내의 2 ml TeSR™-E8™ + 10 μM Y27632를 30분 동안 예비-가온한다.
3) LN 탱크 또는 -80℃에서 보관된 장소로부터 iPS 세포주의 1개의 바이알을 꺼낸다.
4) 즉각적으로 세포 바이알을 37℃ 수조에서 해동시킨다.
5) 바이알을 70% 에탄올로 완전히 헹구고, 바이알을 세포 배양 후드 내에 놓는다.
6) 세포를 15 ml 튜브 내의 10 ml 둘베코 포스페이트-완충 염수 (DBPS) + 칼슘 및 마그네슘에 적가한다.
7) 실온에서 2분 동안 200g로 원심분리한다.
8) 튜브를 70% 에탄올로 완전히 헹구고, 바이알을 세포 배양 후드 내에 놓는다.
9) 상청액을 제거하고, 미리 가온된 2 ml E8 배지 + 10 uM Y27632를 첨가한다. 부드럽게 위아래로 파이펫팅하여, 세포를 재현탁시킨다.
10) 2 ml 세포 현탁액을 매트리겔-코팅 플레이트의 단일 웰 내로 첨가하고, 세포를 부드럽게 혼합하도록 플레이트를 탭핑한다.
11) 플레이트를 세포주 이름 및 계대로 표지한다. 플라스크를 37℃ 5% CO2 5% O2 세포 배양 인큐베이터 내에 놓는다.
12) 격일로 배지를 교환한다 (콜로니 크기가 50-100개의 세포를 초과할 때까지 배지 + 10 uM Y27632을 보충한다).
b) 계대 (6웰 플레이트)
1) 적어도 계대 1시간 전에, 조직 배양 처리 플레이트를 코닝® 매트리겔® (DMEM 내의 1:80 희석을 사용하여 웰 당 1 mL)로 코팅한다.
2) 충분한 TeSR™-E8™ (스템셀 테크놀러지즈(StemCell Technologies))을 분취하고 (6웰 플레이트에서 2 mL/웰), 실온 (15-25℃)으로 가온한다.
3) 세포를 1 mL의 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세정하고, 흡인한다. 주: 분화된 세포의 영역을 제거할 필요가 없다.
4) 0.3 mL의 PRG-1을 첨가한 후, 대부분의 PRG-1을 15초 이내에 흡인하여, 웰에 ~80 uL를 남긴다 (콜로니가 얇은 액체 필름에 노출되도록).
5) 37℃에서 3-5분 동안 인큐베이션한다.
6) 플레이트를 부드럽게 탭핑하여 탈착을 보조한다. 1 mL의 TeSR™-E8™을 첨가한다.
7) 가벼운 파이펫팅에 의해 콜로니를 탈착시킨다. 50-250 ㎕의 세포/배지 혼합물을 취하고, 새로운 매트리겔 코팅 6웰 플레이트 내로 시딩한다. 시딩된 웰에 2 ml의 Y27632 보충 TeSR™-E8™을 첨가한다.
8) 플레이트를 37℃ 5% CO2 5% O2 세포 배양 인큐베이터 내에 놓는다. 격일로 배지를 교환한다 (콜로니 크기가 50-100개의 세포를 초과할 때까지 배지 + 10 μM Y27632을 보충한다).
c) 단일 세포 계대 (96웰 플레이트)
1) 적어도 계대 1시간 전에, 새로운 96 플레이트를 코닝® 매트리겔® (DMEM 내의 1:80 희석을 사용하여 50 ㎕/웰)로 코팅한다.
2) 충분한 TeSR™-E8™을 분취하고, 실온 (15-25℃)으로 가온한다. 각각의 96웰 플레이트에 대해 약 12 ml의 TesR-E8이 필요하다.
3) 세포를 1 mL의 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세정하고, 흡인한다.
4) 0.4 mL의 TrypLE를 첨가하고 (단일-세포를 해리시키도록), 15초 이내에 흡인하여, 콜로니를 얇은 액체 필름에 노출시킨다.
5) 37℃에서 3-5분 동안 인큐베이션한다.
6) 플레이트를 탭핑하여 탈착을 보조한다. 2 mL의 Y27632 보충 TeSR™-E8™을 첨가하고, 위아래로 파이펫팅한다. 세포를 파이펫팅으로 들어올리고, 37 ㎛ 세포 스트레이너를 사용하여 이를 15 ml 원뿔형 튜브 내로 스트레이닝한다.
7) 목시(Moxi) Z 세포 계수기 및 목시 Z 카세트를 사용하여 단계 6으로부터의 75 ㎕의 세포를 카세트의 충전 포트 내로 파이펫팅함으로써 세포 계수를 수행한다. 판독값은 세포/mL일 것이다.
8) 대부분의 경우에, 세포수는 300,000 내지 500,000개의 세포/ml일 것이다. Y27632 보충 TeSR™-E8™에서 2-3개의 세포/100 ㎕ 농도를 얻도록 연속 희석을 수행한다.
9) 24시간 후, 단일 세포에 대해 웰을 점검한다.
10) ~50-100개의 세포 콜로니가 형성될 때까지 (일반적으로 7일), 50 ㎕의 배지를 제거하고 50 ㎕의 신선한 Y27632 보충 TeSR™-E8™을 첨가함으로써 배지 절반 교환을 매일 수행한다. 80% 전면성장까지 격일로 전체 배지 교환 (Y27632 없음)을 진행한다. 이제 플레이트가 중복에 대해 준비된다.
d) 중복 플레이트 (96웰 플레이트)
1) 적어도 계대 1시간 전에, 새로운 96 플레이트를 코닝® 매트리겔® (DMEM 내의 1:80 희석을 사용하여 50 ㎕/웰)로 코팅한다.
2) 충분한 TeSR™-E8™을 분취하고, 실온 (15-25℃)으로 가온한다. 각각의 96웰 플레이트 중복에 대해 20 ml의 배지가 필요하다.
3) 세포를 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세정하고 (웰 당 100 ㎕), 흡인한다.
4) 50 ㎕의 PRG-1 EDTA를 각각의 웰에 첨가하고, 40 ㎕를 흡인하여, 콜로니를 얇은 액체 필름에 노출시킨다.
5) 37℃에서 3-5분 동안 인큐베이션한다.
6) 인큐베이션 동안, 75 ㎕ Y27632 보충 TeSR™-E8™을 단계 1에서 제조된 중복 96웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가한다.
7) 플레이트를 탭핑하여 탈착을 보조한다. 125 ㎕의 Y27632 보충 TeSR™-E8™을 첨가하고, 위아래로 파이펫팅한다.
8) 125 ㎕의 탈착된 세포 중 25 ㎕를 중복 96웰 플레이트 내로 파이펫팅한다. 플레이트의 배향이 보존되는지를 확인한다. 이제 소스 및 중복 플레이트 양쪽 모두에 100 ㎕의 배지가 있을 것이다.
9) 플레이트를 저산소 인큐베이터 내에 놓는다. 소스 플레이트가 용해 및 분석될 준비가 될 때가지 전체 배지 교환을 격일로 수행하여야 한다.
e) 웰/클론 확장
1) 적어도 계대 1시간 전에, 새로운 12웰 플레이트를 코닝® 매트리겔® (DMEM 내의 1:80 희석을 사용하여 0.5 ml/웰)로 코팅한다.
2) 충분한 TeSR™-E8™을 분취하고, 실온 (15-25℃)으로 가온한다.
3) 선택된 웰을 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세정하고 (웰 당 100 ㎕), 흡인한다.
4) 50 ㎕의 PRG-1 EDTA를 각각의 웰에 첨가하고, 40 ㎕를 흡인하여, 콜로니를 얇은 액체 필름에 노출시킨다.
5) 37℃에서 3-5분 동안 인큐베이션한다.
6) 플레이트를 탭핑하여 탈착을 보조한다. 100 ㎕의 Y27632 보충 TeSR™-E8™을 첨가하고, 위아래로 파이펫팅한다.
7) 100 ㎕의 세포 배지 혼합물 모두를 단계 1에서 제조된 12웰 플레이트 내로 파이펫팅한다. 추가적인 1 ml의 Y27632 보충 TeSR™-E8™을 첨가한다. 웰을 적합한 소스로 표지한다.
8) 80% 전면성장까지 격일로 전체 배지 교환을 수행한다.
9) V.b.에 개요된 프로토콜에 따라 세포를 6웰 플레이트 상에서 분할한다. 전면성장 시 이러한 세포들이 냉동보존 단계로 진행될 수 있다
f) 냉동보존
1) 충분한 TeSR™-E8™을 분취하고, 실온 (15-25℃)으로 가온한다.
2) 세포를 1 mL의 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세정하고, 흡인한다.
3) 0.3 mL의 PRG-1을 첨가한 후, 대부분의 PRG-1을 15초 이내에 흡인하여, 웰에 ~80 uL를 남긴다 (콜로니가 얇은 액체 필름에 노출되도록).
4) 37℃에서 3-5분 동안 인큐베이션한다.
5) 플레이트를 부드럽게 탭핑하여 탈착을 보조한다. 3 mL의 포스페이트-완충 염수 (PBS) + Ca2+ 및 Mg2+를 첨가한다.
6) 가벼운 파이펫팅에 의해 콜로니를 탈착시킨다. 세포를 15 ml 원뿔형 튜브로 옮긴다.
7) 300×g로 3분 동안 실온에서 원심분리하여, 세포를 펠릿화시킨다. PBS를 흡인한다.
8) 농도가 1-0.5×106개의 세포/ml이도록 펠릿을 냉동보존 배지 (Y27632 보충 TeSR™-E8™, 10% HSA, 및 10% DMSO)에 재현탁시킨다.
9) 1 mL의 세포 응집물을 표지된 냉동바이알로 옮긴다.
10) -80℃ 냉동기에서 미스터 프로스티를 사용하여 세포 응집물을 냉동시킨 후, -135℃ (액체 질소) 또는 더 낮은 온도에서 장기 보관한다. -80℃에서의 단기 보관 (<3개월)이 적절하다.
g) 형질감염을 위한 계대
1) 형질감염 전날, 하기의 프로토콜에 따라 250,000개의 세포/웰을 매트리겔 코팅 96웰 플레이트 상에 시딩한다:
i. 적어도 계대 1시간 전에, 새로운 6웰 플레이트를 코닝® 매트리겔® (DMEM 내의 1:80 희석을 사용하여 1 ml/웰)로 코팅한다.
ii. 충분한 TeSR™-E8™을 분취하고, 실온 (15-25℃)으로 가온한다.
iii. 세포를 1 mL의 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세정하고, 흡인한다.
iv. 0.4 mL의 TrypLE를 첨가하고 (단일-세포를 해리시키도록), 15초 이내에 흡인하여, 콜로니를 얇은 액체 필름에 노출시킨다.
v. 37℃에서 3-5분 동안 인큐베이션한다.
vi. 플레이트를 탭핑하여 탈착을 보조한다. 2 mL의 Y27632 보충 TeSR™-E8™을 첨가하고, 부드럽게 위아래로 파이펫팅한다. 37 ㎛ 세포 스트레이너를 사용하여 세포를 15 ml 원뿔형 튜브 내로 스트레이닝한다.
vii. 목시 Z 세포 계수기 및 목시 Z 카세트를 사용하여 세포 계수를 수행한다.
viii. 공지된 세포수로, 웰 당 250,000개의 세포가 시딩되도록 적합한 부피의 세포를 첨가한다. 웰 부피를 최대 2 ml로 만들도록 적합한 양의 Y27632 보충 TeSR™-E8™을 첨가한다.
2) 12-18시간 후, 세포는 소형의 2-5개의 세포의 클러스터일 것이다. 형질감염 전에 세포 밀도는 약 70-80%이어야 한다.
h) 형질감염
1) 메신저맥스 형질감염 시약 및 및 5 ml의 옵티-MEM을 실온에서 10분 동안 평형화시킨다.
2) 표 5에 따라 형질감염 복합체를 어셈블리한다:
<표 5> 형질감염 복합체의 어셈블리
Figure pct00005
3) 희석된 메신저맥스를 10분 동안 인큐베이션한 후, 표 6에 따라 희석된 mRNA와 혼합한다:
<표 6>
Figure pct00006
표 7에 따라 ssODN을 희석한다.
<표 7>
Figure pct00007
하기 표 8에서와 같이 희석된 mRNA 및 메신저맥스 형질감염 시약을 혼합한다:
<표 8>
Figure pct00008
복합체를 5분 동안 인큐베이션한다.
4) 형질감염될 2개의 웰에서 배지를 제거하고, 세포를 1 mL의 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세정하고, 흡인한다.
5) 형질감염 복합체 혼합물을 각각의 웰에 첨가한다. 하기 표 9에서 플레이트가 설정된다:
<표 9>
Figure pct00009
6) 최종 부피가 600 ㎕이도록 Y27632 보충 TeSR™-E8™을 각각의 웰에 첨가한다. 플레이트를 저산소 인큐베이터 내에 놓는다.
7) 4-6시간 후, 형질감염 배지를 흡인하고, 2 ml Y27632 보충 TeSR™-E8™으로 교체한다. 세포를 철야로 인큐베이션한다.
8) 12-18시간 후 (또는 다음날 아침), mNG 형광을 검사함으로써 형질감염이 성공적이었는지를 확인한 뒤, 2차 형질감염 (sgRNA 및 ssODN 단독)으로 진행한다.
9) 2차 라운드 형질감염: 하기 표 10-13에 따라 형질감염 복합체를 제조한다:
<표 10> 메신저맥스 희석
Figure pct00010
희석된 메신저맥스를 10분 동안 인큐베이션한 후, Cas 9 mRNA와 혼합한다.
<표 11> sgRNA 희석
Figure pct00011
<표 12> ssODN 희석
Figure pct00012
10) 희석된 mRNA 및 메신저맥스 형질감염 시약을 하기 표 13과 같이 혼합한다:
<표 13>
Figure pct00013
복합체를 5분 동안 인큐베이션한다
11) 배지를 제거하고, 세포를 1 mL의 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세정하고, 흡인한다.
12) 형질감염 복합체 혼합물을 각각의 웰에 첨가한다. 하기 표 14에서 플레이트가 설정된다:
<표 14>
Figure pct00014
13) 최종 부피가 600 ㎕이도록 Y27632 보충 TeSR™-E8™을 각각의 웰에 첨가한다. 플레이트를 저산소 인큐베이터 내에 놓는다.
14) 4-6시간 후, 형질감염 배지를 흡인하고, 2 ml Y27632 보충 TeSR™-E8™으로 교체한다. 세포를 철야로 인큐베이션한다.
15) 2일 후, CRISPR 처리 세포가 하기에 대해 준비된다:
i. 계대/재분할됨.
ii. RT-PCR 스크리닝을 통해 분석하여 HDR 효율을 평가함.
iii. 클론 스크리닝을 위해 단일 세포로 계대됨.
VI. 세포 용해 및 게놈 DNA 증폭에 대한 예시적인 방법 실시양태
물질
- D-PBS
- PRG-1 EDTA
- TrypLE 1×
- 얼리얼 마우스 꼬리 용해 완충제 (150 mM NaCl, 80 mM 트리스-HCl pH 8.5, 5 mM EDTA, 2.5 mM MgCl2, 1% NP40, 1% 트리톤(Triton) ×100, 및 4% 트윈 20)
- 허큘라제 II 융합 DNA 중합효소 키트
- 코스타™ 멸균 1회용 시약 저장기
- 비-스커트형 96웰 PCR 플레이트
- 알루마실(AlumaSeal) CS 밀봉 필름
- 스커트형 96웰 PCR 플레이트
- 서피스 바인드 PCR 플레이트 정제 키트
- 뉴클레오스핀® 겔 및 PCR 클린-업
a. 벌크 세포 집단의 용해 (6웰 플레이트)
1) 세포를 1 mL의 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세정하고, 흡인한다. 주: 분화된 세포의 영역을 제거할 필요가 없다.
2) 0.3 mL의 PRG-1을 첨가한 후, 대부분의 PRG-1을 15초 이내에 흡인하여, 웰에 ~80 ㎕를 남긴다 (콜로니가 얇은 액체 필름에 노출되도록).
3) 37℃에서 3-5분 동안 인큐베이션한다.
4) 플레이트를 탭핑하여 탈착을 보조한다. 3 mL의 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 첨가하고, 세포를 부드럽게 플레이트 바닥으로부터 파이펫팅하여 15 ml 원뿔형 튜브로 옮긴다. *임의적으로: 탈착된 세포의 일부분 (>50,000개의 세포)을 프로토콜 V.b.에 따라 새로운 매트리겔 코팅 플레이트 상으로 계대시킨다. 이러한 임의적인 단계는 CRISPR 형질감염 후에 수행되고, 나머지 세포가 용해 및 분석되는 동안 집단의 일부분이 성장하도록 허용한다. 벌크 분석이 HDR 효율이 적절함을 나타내면, 전면성장에 도달 시의 나머지 세포를 제한 희석에 의해 단일 세포로 클로닝할 수 있다 (V.c 참조).
5) 300×g로 3분 동안 실온에서 원심분리하여, 세포를 펠릿화시킨다. PBS를 흡인한다.
6) 세포 펠릿을 150 ㎕ 용해 완충제에 재현탁시킨다. PCR 튜브 내로 옮기고, 써모사이클러에서 하기의 프로그램을 실행한다: 15분 동안 65℃, 15분 동안 68℃, 및 15분 동안 95℃.
7) 써모사이클러 프로그램의 완료 후, 용해물이 PCR 반응에서 주형으로 사용하는 것에 대해 준비된다.
b) 클론 집단의 용해 (96웰 플레이트)
1) 배지를 제거하고, 웰을 각각 100 ㎕의 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세정하고, 흡인한다.
2) 멀티채널 파이펫을 사용하여, 50 ㎕의 용해 완충제를 웰에 직접 첨가한다. 위아래로 4-5회 파이펫팅한다.
3) 용해 완충제를 세포 배양 플레이트에서 비-스커트형 PCR 플레이트로 옮긴다. 플레이트 상부를 알루마실로 밀봉한다. 써모사이클러를 사용하여, 플레이트에서 하기 프로그램을 실행한다 - 15분 동안 65℃, 15분 동안 68℃, 및 95℃.
4) 써모사이클러 프로그램의 완료 후, 용해물이 PCR 반응에서 사용되는 것에 대해 준비된다.
c) 용해물로부터의 게놈 DNA 주형의 증폭
1) 얼음 위의 PCR 튜브에서, 하기 표 15에서와 같이 6웰 플레이트 용해물에 대해 PCR 반응을 어셈블리한다:
<표 15>
Figure pct00015
2) 비-스커트형 PCR 플레이트에서, 하기 표 16에서와 같이 96웰 용해물에 대해 PCR 반응을 어셈블리한다:
<표 16>
Figure pct00016
3) 하기 표 17의 PCR 프로그램을 실행한다:
<표 17>
Figure pct00017
4) 프로그램이 완료된 후, 2 ㎕의 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에 러닝시켜, 증폭을 확인하고 증폭 효율을 평가한다. PCR 밴드가 약한 강도를 나타내는 경우 최적화가 필요할 수 있다 (어닐링 온도, 및 프라이머 디자인). 스크리닝으로 진행하기 전에 <26 사이클에서의 강건한 증폭이 필요하다.
5) 제조사의 프로토콜에 따라 뉴클레오스핀 키트를 사용하여 PCR 생성물을 벌크 용해물 주형으로부터 정제한다. 96웰 플레이트 용해물로부터의 PCR 생성물의 정제를 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 서피스바인드 플레이트 정제 키트를 사용한다.
6) 정제된 앰플리콘 라이브러리가 이제 qPCR 기반 스크리닝에 적절하다.
VII. 시험관내 Cas9-sgRNA 절단 검정법에 대한 예시적인 방법 실시양태
물질:
- 재조합 Cas9Wt 단백질 (III으로부터의 것)
- 시험관내에서 전사된 sgRNA (IV로부터의 것)
- 절단 주형 (sgRNA 부위가 있는 용해물로부터 생성된 앰플리콘)
- 10× Cas9 뉴클레아제 반응 완충제 (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA)
1) 표 18에 나타난 바와 같이 하기 순서로 실온에서 반응을 어셈블리한다:
<표 18>
Figure pct00018
2) 철저하게 혼합하고, 마이크로퓨즈(microfuge)에서 펄스-스피닝시킨다. 그 후, 37℃에서 45분 동안 인큐베이션한다.
3) 샘플을 0.5% 내지 1% 아가로스 겔 상에 러닝시킴으로써 단편 분석으로 진행한다.
VIII. qPCR 기반 스크리닝에 대한 예시적인 방법 실시양태
물질
- 라이트사이클러(LightCycler)® 480 SYBR 그린 I 마스터 믹스
- 마이크로앰프(MicroAmp)® 급속 광학용 96웰 반응 플레이트, 0.1 mL
- 깁슨 어셈블리 마스터 믹스
- DH5α 수용성 세포
- 허큘라제 II 융합 DNA 중합효소 키트
- 퀵체인지 부위-지정 돌연변이유발 키트
- 뉴클레오스핀®겔 및 PCR 클린-업
- 엑셀 사이언티픽(Excel Scientific)의 실시간 PCR용 써멀실(ThermalSeal)®RT™ 필름
a) 돌연변이체 앰플리콘 카피 수 표준물질에 대한 플라스미드의 구축
1) 표적화된 유전자좌를 VI.c에 개요된 프로토콜에 따라 PCR 증폭시킨다. 주형은 형질감염되지 않은 세포의 용해물로부터의 것이어야 한다. 이러한 경우에, 정방향 및 역방향 프라이머 또한 깁슨 어셈블리를 위해 pIVT 벡터와의 중첩 영역이 있어야 한다.
예시적인 프라이머 (n= 유전자좌 특이적):
정방향: 5'- GAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3' (서열식별번호: 5)
역방향: 5'- AGGCAAGCCCCGCAGAAGGCAGCnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3' (서열식별번호: 6)
pIVT 벡터 또한 pIVT-F 및 R을 사용함으로써 PCR을 통해 선형화되어야 한다.
pIVT-F: GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCT (서열식별번호: 7)
pIVT-R: GGTGGCTCTTATATTTCTTCTTACTC (서열식별번호: 8)
2) 삽입물 (게놈 유전자좌 앰플리콘) 및 벡터 (pIVT 백본)를 깁슨 어셈블리 믹스와 조합한다. 제안된 깁슨 어셈블리가 표 19에서 설정된다.
<표 19>
Figure pct00019
깁슨 어셈블리 반응을 1시간 동안 50℃에서 인큐베이션한 후, DH5α 화학적 수용성 세포 내로 형질전환시킨다. 생성된 벡터는 야생형 벡터로 지정될 것이다.
3) 새롭게 어셈블리된 야생형 벡터를 주형으로 사용하여, 퀵체인지 부위-지정 돌연변이유발 키트로 관심 영역 내에 스크리닝하기를 원하는 의도되는 돌연변이를 생성시킨다. 제조사 (애질런트)의 프로토콜에 따라 부위 지정 돌연변이유발을 수행한다. 생성된 구축물은 돌연변이체 벡터로 지정될 것이다.
4) 완성된 돌연변이체 및 야생형 pIVT 구축물로, 앰플리콘 표준물질을 제조하도록 진행한다. 야생형 및 돌연변이체 pIVT 구축물을 주형으로 사용하여 별개의 PCR 반응을 어셈블리한다 (표 20).
<표 20>
Figure pct00020
표 21에 제시된 바와 같이 PCR 프로그램을 실행한다:
<표 21>
Figure pct00021
5) 적절한 수율 및 정확한 크기를 확인하기 위해 1 ㎕의 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔에 러닝시킨다. 그 후, 제조사의 프로토콜에 따라 뉴클레오스핀 PCR 클린-업 절차로 진행한다.
6) 생성된 앰플리콘을 정량한다. 양쪽 모두 60 fg/㎕로 표준화되도록 앰플리콘 표준물질의 희석물을 제조하고, 이는 ㎕당 ~60,000개의 앰플리콘 카피에 상응할 것이다.
7) 작업 농도로 희석된 돌연변이체 및 야생형 표준물질로, (qPCR 검정법 개발에서 사용하기 위해) 하기의 야생형:돌연변이체 비를 제조한다 (표 22).
<표 22>
Figure pct00022
b) 돌연변이체 앰플리콘 카피 수 표준물질로의 qPCR 검정법 개발
1) 앰플리콘 스크리닝에 최상으로 적절한 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 디자인한다. 디자인에 대한 기준:
- ≤300 bp 생성물.
- 정방향 프라이머는 의도되는 돌연변이의 약 200-300 bp 상류이어야 한다.
- 역방향 프라이머는 선도 5' 말단에 의도되는 돌연변이 염기(들)이 있어야 한다. (도 6 참조)
얼음 위에서, 표 23에 제시된 바와 같이 급속 광학용 96웰 반응 플레이트에서의 qPCR 반응을 제조한다:
<표 23>
Figure pct00023
앰플리콘 표준물질 주형을 표 24에 제시된 바와 같이 하기 배향으로 할당한다.
<표 24>
Figure pct00024
3) 플레이트가 제조되었으면, 투명한 써멀실로 밀봉하고, 급속 스핀을 수행한다 (10초 동안 ~3g). 소프트웨어 프로그램을 설정하면서 다시 얼음 위에 놓는다.
4) 소프트웨어를 실행한다:
i. 스텝원 플러스(StepOne Plus) 소프트웨어를 열고, "게스트"로 로그인한다.
ii. 왼쪽 아래의 "주형" 버튼을 클릭하여 주형 파일을 열고, "Crispr-표준물질" 주형 파일을 선택한다. (D:＼Applied Biosystems＼StepOne Software v2.3＼config＼templates)
iii. "실험 성질" 페이지로 가서, 적합한 제목으로 "실험명"을 작성한다. (예를 들어, Crispr_standards_test12-25-18)
iv. 다음으로, "방법 실행" 페이지로 가서, 어닐링 온도를 실험에 최적인 온도로 변화시킨다.
v. 제조된 플레이트를 스텝원플러스 기구에 놓고, 서랍/덮개를 닫는다. 녹색 "실행 시작" 버튼을 클릭하여 실행을 개시시킨다.
c) 증폭 곡선의 분석
1) 프라이머 디자인이 효과적으로 야생형의 증폭에 대해 구별하는지를 확인하기 위해, 상이한 비의 Ct 값들을 비교한다.
2) 용량 반응이 관찰되어야 한다: 돌연변이체 집단의 비가 증가하면 Ct 값이 왼쪽으로 이동하여야 한다 (더 작아져야 한다).
3) 각각의 표준물질 지점에 대한 일부 제안된 ΔCt 값이 표 25에서 제시된다:
<표 25>
Figure pct00025
증폭 Ct 곡선을 예시한다 (도 7 참조)
4) 앰플리콘 표준물질이 적절한 결과를 생성한 경우 (상기 예시된 바와 같이), CRISPR 편집 세포의 스크리닝으로 진행한다.
d) 벌크 집단의 스크리닝
1) 단계 VI.c에서 생산된 앰플리콘으로, 농도를 60 fg/ul로 하향 표준화한다.
2) 얼음 위에서, 표 26에 제시된 바와 같이 급속 광학용 96웰 반응 플레이트에서 하기와 같이 qPCR 반응을 제조한다:
<표 26>
Figure pct00026
3) 앰플리콘 표준물질을 단계 VIII.b.2에 개요된 배향으로 할당한다. A. 삼중으로, 벌크 집단으로부터의 표준화된 앰플리콘 라이브러리를 플레이트 내로 할당한다. 음성 대조군 (ssODN으로만 형질감염된 세포)을 포함하여야 한다.
4) 플레이트가 제조되었으면, 투명한 써멀실로 밀봉하고, 급속 스핀을 수행한다 (10초 동안 ~3g). 소프트웨어 프로그램을 설정하면서 다시 얼음 위에 놓는다.
5) 단계 VIII.b.4에 개요된 바와 같이 소프트웨어를 실행한다. 시작 전에, "플레이트 설정" 창에서 어떻게 반응 플레이트에 배치되었는지에 따라 실험으로부터의 CRISPR 앰플리콘 라이브러리 및 음성 대조군을 할당하여야 한다. 모든 것이 올바르게 설정되면 프로그램을 실행한다.
e) 벌크 스크린의 분석
1) VIII.d로부터의 qPCR 결과로, 앰플리콘 라이브러리를 서로 (CRISPR 처리 세포 및 비-형질감염 세포), 그리고 표준물질과 비교할 수 있다. 음성 대조군 Ct 값을 취하고, CRISPR 처리 세포 Ct 값을 차감함으로써, CRISPR 처리 세포에 대한 ΔCt가 계산될 것이다. CRISPR 처리 세포는 1% 표준물질에 필적하는 ΔCt를 나타낼 것이다. (주: 1회의 계대 후 ΔCt가 증가하는 것이 관찰되었다).
2) 벌크 집단에 대한 ΔCt가 ~1%인 경우, 단계 V에 개요된 바와 같이 단일 세포 클로닝 절차로 진행한다.
f) 96웰 플레이트로부터의 클론의 qPCR 스크리닝
1) 서피스바인드로 정제된 클론형 앰플리콘 라이브러리 플레이트 (단계 VI.c.5에서 기술된 바와 같음)가 qPCR 스크리닝용 주형으로 사용될 것이다.
2) 96웰 2 ml 수집 플레이트에서 클론형 앰플리콘 라이브러리의 1:1000 희석을 수행한다. 알루마실을 사용하여 플레이트를 밀봉하고, 혼합되도록 와동시킨다.
3) 얼음 위에서, 표 27에 제시된 바와 같이 급속 광학용 96웰 반응 플레이트에서 하기와 같이 qPCR 반응을 제조한다:
<표 27>
Figure pct00027
4) 플레이트가 제조되었으면, 이를 투명한 써멀실로 밀봉하고, 급속 스핀을 수행한다 (10초 동안 ~3g). 소프트웨어 프로그램을 설정하면서 다시 얼음 위에 놓는다.
5) "96웰_스크린" 주형 파일로 단계 VIII.b.4에 개요된 바와 같이 소프트웨어를 실행한다 (D:＼Applied Biosystems＼StepOne Software v2.3＼config＼templates). ("실행 설정" 창 및 이의 파라미터가 벌크 qPCR 스크린 검정법에서의 것과 동일하여야 한다).
g) 클론 qPCR 스크리닝의 분석
1) 클론형 앰플리콘 라이브러리의 qPCR 스크리닝은 통상적으로 높은 변동을 초래하지만, HDR 효율이 ~1%인 벌크 집단을 고려하면, 1-3개의 낮은 Ct 이상치 웰이 있을 것이다. 샘플 데이터에 대해 하기를 참조한다: (도 8 참조)
2) 왼쪽으로 이동된 Ct 이상치가 확인되면, 상응하는 웰을 V.e에서 개요된 프로토콜에 따라 중복 플레이트에서 확장시킨다.
3) 선택된 웰이 확장되고 전면성장이면, 세포의 일부분을 용해시키고, 앰플리콘 라이브러리를 제조한다. 이들을 전송하여 생어 시퀀싱을 통해 시퀀싱한다. 크로마토그램 결과에서 의도되는 돌연변이 부위를 분석한다. 이형접합 돌연변이는 의도되는 부위에서 이중 피크를 나타낼 것인 한편, 동형접합은 돌연변이체 염기 쌍 피크만 있을 것이다. 편집 및 비편집 세포의 혼합 집단 또한 이중 피크로 나타날 수 있다. 추가로, CRISPR-매개 삽입 및 결실 (인델)이 PAM 부위에 인접한 영역 전체에 걸쳐 추가적인 피크를 생산할 것이다. 세포 집단의 유전학을 이해하기 위해 크로마토그램의 상세한 분석이 필요하다. 도 9를 참조한다.
서열 목록
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
참고 문헌
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
본 출원에서 인용된 모든 참고문헌은 본원에 참조로 포함된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 이러한 범위의 상한 및 하한과 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 또는 개재되는 값 사이의 각각의 개재 값 (문맥적으로 명확하게 달리 지시되지 않는 한 하한 단위의 1/10까지)이 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있고, 언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 배제된 한계에 적용되어, 본 발명에 또한 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 양쪽 모두를 포함하는 경우, 이러한 포함된 한계 중 하나 또는 양쪽 모두를 배제하는 범위 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 다수의 실시양태가 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시양태들이 하기 청구범위의 범주 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> ALLELE BIOTECHNOLOGY AND PHARMACEUTICALS, INC. <120> METHODS OF ACHIEVING HIGH SPECIFICITY OF GENOME EDITING <130> F6035-00136 <140> PCT/US2019/041551 <141> 2019-07-12 <150> 62/697,955 <151> 2018-07-13 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 atggccccaa agaaaaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc cgacaagaaa 60 tacagcatcg gcctggacat cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat caccgacgag 120 tacaaggtgc ccagcaagaa attcaaggtg ctgggcaaca ccgacagaca cagcatcaag 180 aagaacctga tcggagccct gctgttcgac agcggcgaaa cagccgaggc cacccggctg 240 aagagaaccg ccagacggag atacaccaga cggaagaacc ggatctgcta tctgcaagag 300 atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacagact ggaagagtcc 360 ttcctggtgg aagaggataa gaagcacgag cggcacccca tcttcggcaa catcgtggac 420 gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa actggtggac 480 agcaccgaca aggccgacct gcggctgatc tatctggccc 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420 gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa actggtggac 480 agcaccgaca aggccgacct gcggctgatc tatctggccc tggcccacat gatcaagttc 540 cggggccact tcctgatcga gggcgacctg aaccccgaca acagcgacgt ggacaagctg 600 ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccccat caacgccagc 660 ggcgtggacg ccaaggccat cctgtctgcc agactgagca aaagcagacg gctggaaaat 720 ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aatggcctgt tcggcaacct gattgccctg 780 agcctgggcc tgacccccaa cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga tgccaaactg 840 cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca gatcggcgac 900 cagtacgccg acctgtttct ggccgccaag aacctgtccg acgccatcct gctgagcgac 960 atcctgagag tgaacaccga gatcaccaaa gccccactga gcgcctctat gatcaagaga 1020 tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaagctc tcgtgcggca gcagctgcct 1080 gagaagtaca aagagatttt cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg ctacattgac 1140 ggcggagcca gccaggaaga gttctacaag ttcatcaagc ccatcctgga aaagatggac 1200 ggcaccgagg aactgctcgt gaagctgaac agagaggacc tgctgcggaa gcagcggacc 1260 ttcgacaacg gcagcatccc ccaccagatc cacctgggag agctgcacgc cattctgcgg 1320 cggcaggaag atttttaccc attcctgaag gacaaccggg aaaagatcga gaagatcctg 1380 accttccgca tcccctacta cgtgggccct ctggccaggg gaaacagcag attcgcctgg 1440 atgaccagaa agagcgagga aaccatcacc ccctggaact tcgaggaagt ggtggacaag 1500 ggcgcttccg cccagagctt catcgagaga atgaccaact tcgataagaa cctgcccaac 1560 gagaaggtgc tgcccaagca cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta taacgagctg 1620 accaaagtga aatacgtgac cgagggaatg agaaagcccg ccttcctgag cggcgagcag 1680 aaaaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaacagga aagtgaccgt gaagcagctg 1740 aaagaggact acttcaagaa aatcgagtgc ttcgactccg tggaaatctc cggcgtggaa 1800 gatcggttca acgcctccct gggcacatac cacgatctgc tgaaaattat caaggacaag 1860 gacttcctgg acaatgagga aaacgaggac attctggaag atatcgtgct gaccctgaca 1920 ctgtttgagg acagagagat gatcgaggaa cggctgaaaa cctatgccca cctgttcgac 1980 gacaaagtga tgaagcagct gaagcggcgg agatacaccg gctggggcag gctgagccgg 2040 aagctgatca acggcatccg ggacaagcag tccggcaaga caatcctgga tttcctgaag 2100 tccgacggct tcgccaacag aaacttcatg cagctgatcc acgacgacag cctgaccttt 2160 aaagaggaca tccagaaagc ccaggtgtcc ggccagggcg atagcctgca cgagcacatt 2220 gccaatctgg ccggcagccc cgccattaag aagggcatcc tgcagacagt gaaggtggtg 2280 gacgagctcg tgaaagtgat gggccggcac aagcccgaga acatcgtgat cgaaatggcc 2340 agagagaacc agaccaccca gaagggacag aagaacagcc gcgagagaat gaagcggatc 2400 gaagagggca tcaaagagct gggcagccag atcctgaaag aacaccccgt ggaaaacacc 2460 cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga atgggcggga tatgtacgtg 2520 gaccaggaac tggacatcaa ccggctgtcc gactacgatg tggaccacat cgtgcctcag 2580 agctttctga aggacgactc catcgacaac aaggtgctga ccagaagcga caagaaccgg 2640 ggcaagagcg acaacgtgcc ctccgaagag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcgg 2700 cagctgctga acgccaaact gattacccag agaaagttcg acaatctgac caaggccgag 2760 agaggcggcc tgagcgaact ggataaggcc ggcttcatca agagacagct ggtggaaacc 2820 cggcagatca caaagcacgt ggcacagatc ctggactccc ggatgaacac taagtacgac 2880 gagaatgaca agctgatccg ggaagtgaaa gtgatcaccc tgaagtccaa gctggtgtcc 2940 gatttccgga aggatttcca gttttacaaa gtgcgcgaga tcaacaacta ccatcacgcc 3000 catgacgcct acctgaacgc cgtcgtggga accgccctga tcaaaaagta ccctaagctg 3060 gaaagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat gatcgccaag 3120 agcgagcagg aaatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac 3180 tttttcaaga ccgagattac cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc tctgatcgag 3240 acaaacggcg aaaccgggga gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc caccgtgcgg 3300 aaagtgctga gcatgcccca agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca gacaggcggc 3360 ttcagcaaag agtctatcct gcccaagagg aacagcgata agctgatcgc cagaaagaag 3420 gactgggacc ctaagaagta cggcggcttc gacagcccca ccgtggccta ttctgtgctg 3480 gtggtggcca aagtggaaaa gggcaagtcc aagaaactga agagtgtgaa agagctgctg 3540 gggatcacca tcatggaaag aagcagcttc gagaagaatc ccatcgactt tctggaagcc 3600 aagggctaca aagaagtgaa aaaggacctg atcatcaagc tgcctaagta ctccctgttc 3660 gagctggaaa acggccggaa gagaatgctg gcctctgccg gcgaactgca gaagggaaac 3720 gaactggccc tgccctccaa atatgtgaac ttcctgtacc tggccagcca ctatgagaag 3780 ctgaagggct cccccgagga taatgagcag aaacagctgt ttgtggaaca gcataagcac 3840 tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agagagtgat cctggccgac 3900 gctaatctgg acaaagtgct gtccgcctac aacaagcatc gggataagcc catcagagag 3960 caggccgaga atatcatcca cctgtttacc ctgaccaatc tgggagcccc tgccgccttc 4020 aagtactttg acaccaccat cgaccggaag aggtacacca gcaccaaaga ggtgctggac 4080 gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga cacggatcga cctgtctcag 4140 ctgggaggtg acaagcgtcc tgctgctact aagaaagctg gtcaagctaa gaaaaagaaa 4200 tga 4203 <210> 3 <211> 4203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 atggccccaa agaaaaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc cgacaagaaa 60 tacagcatcg gcctggacat cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat caccgacgag 120 tacaaggtgc ccagcaagaa attcaaggtg ctgggcaaca ccgacagaca cagcatcaag 180 aagaacctga tcggagccct gctgttcgac agcggcgaaa cagccgaggc cacccggctg 240 aagagaaccg ccagacggag atacaccaga cggaagaacc ggatctgcta tctgcaagag 300 atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacagact ggaagagtcc 360 ttcctggtgg aagaggataa gaagcacgag cggcacccca tcttcggcaa catcgtggac 420 gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa actggtggac 480 agcaccgaca aggccgacct gcggctgatc tatctggccc tggcccacat gatcaagttc 540 cggggccact tcctgatcga gggcgacctg aaccccgaca acagcgacgt ggacaagctg 600 ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccccat caacgccagc 660 ggcgtggacg ccaaggccat cctgtctgcc agactgagca aaagcagacg gctggaaaat 720 ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aatggcctgt tcggcaacct gattgccctg 780 agcctgggcc tgacccccaa cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga tgccaaactg 840 cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca gatcggcgac 900 cagtacgccg acctgtttct ggccgccaag aacctgtccg acgccatcct gctgagcgac 960 atcctgagag tgaacaccga gatcaccaaa gccccactga gcgcctctat gatcaagaga 1020 tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaagctc tcgtgcggca gcagctgcct 1080 gagaagtaca aagagatttt cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg ctacattgac 1140 ggcggagcca gccaggaaga gttctacaag ttcatcaagc ccatcctgga aaagatggac 1200 ggcaccgagg aactgctcgt gaagctgaac agagaggacc tgctgcggaa gcagcggacc 1260 ttcgacaacg gcagcatccc ccaccagatc cacctgggag agctgcacgc cattctgcgg 1320 cggcaggaag atttttaccc attcctgaag gacaaccggg aaaagatcga gaagatcctg 1380 accttccgca tcccctacta cgtgggccct ctggccaggg gaaacagcag attcgcctgg 1440 atgaccagaa agagcgagga aaccatcacc ccctggaact tcgaggaagt ggtggacaag 1500 ggcgcttccg cccagagctt catcgagaga atgaccaact tcgataagaa cctgcccaac 1560 gagaaggtgc tgcccaagca cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta taacgagctg 1620 accaaagtga aatacgtgac cgagggaatg agaaagcccg ccttcctgag cggcgagcag 1680 aaaaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaacagga aagtgaccgt gaagcagctg 1740 aaagaggact acttcaagaa aatcgagtgc ttcgactccg tggaaatctc cggcgtggaa 1800 gatcggttca acgcctccct gggcacatac cacgatctgc tgaaaattat caaggacaag 1860 gacttcctgg acaatgagga aaacgaggac attctggaag atatcgtgct gaccctgaca 1920 ctgtttgagg acagagagat gatcgaggaa cggctgaaaa cctatgccca cctgttcgac 1980 gacaaagtga tgaagcagct gaagcggcgg agatacaccg gctggggcag gctgagccgg 2040 aagctgatca acggcatccg ggacaagcag tccggcaaga caatcctgga tttcctgaag 2100 tccgacggct tcgccaacag aaacttcatg cagctgatcc acgacgacag cctgaccttt 2160 aaagaggaca tccagaaagc ccaggtgtcc ggccagggcg atagcctgca cgagcacatt 2220 gccaatctgg ccggcagccc cgccattaag aagggcatcc tgcagacagt gaaggtggtg 2280 gacgagctcg tgaaagtgat gggccggcac aagcccgaga acatcgtgat cgaaatggcc 2340 agagagaacc agaccaccca gaagggacag aagaacagcc gcgagagaat gaagcggatc 2400 gaagagggca tcaaagagct gggcagccag atcctgaaag aacaccccgt ggaaaacacc 2460 cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga atgggcggga tatgtacgtg 2520 gaccaggaac tggacatcaa ccggctgtcc gactacgatg tggacgccat cgtgcctcag 2580 agctttctga aggacgactc catcgacaac aaggtgctga ccagaagcga caagaaccgg 2640 ggcaagagcg acaacgtgcc ctccgaagag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcgg 2700 cagctgctga acgccaaact gattacccag agaaagttcg acaatctgac caaggccgag 2760 agaggcggcc tgagcgaact ggataaggcc ggcttcatca agagacagct ggtggaaacc 2820 cggcagatca caaagcacgt ggcacagatc ctggactccc ggatgaacac taagtacgac 2880 gagaatgaca agctgatccg ggaagtgaaa gtgatcaccc tgaagtccaa gctggtgtcc 2940 gatttccgga aggatttcca gttttacaaa gtgcgcgaga tcaacaacta ccatcacgcc 3000 catgacgcct acctgaacgc cgtcgtggga accgccctga tcaaaaagta ccctaagctg 3060 gaaagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat gatcgccaag 3120 agcgagcagg aaatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac 3180 tttttcaaga ccgagattac cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc tctgatcgag 3240 acaaacggcg aaaccgggga gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc caccgtgcgg 3300 aaagtgctga gcatgcccca agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca gacaggcggc 3360 ttcagcaaag agtctatcct gcccaagagg aacagcgata agctgatcgc cagaaagaag 3420 gactgggacc ctaagaagta cggcggcttc gacagcccca ccgtggccta ttctgtgctg 3480 gtggtggcca aagtggaaaa gggcaagtcc aagaaactga agagtgtgaa agagctgctg 3540 gggatcacca tcatggaaag aagcagcttc gagaagaatc ccatcgactt tctggaagcc 3600 aagggctaca aagaagtgaa aaaggacctg atcatcaagc tgcctaagta ctccctgttc 3660 gagctggaaa acggccggaa gagaatgctg gcctctgccg gcgaactgca gaagggaaac 3720 gaactggccc tgccctccaa atatgtgaac ttcctgtacc tggccagcca ctatgagaag 3780 ctgaagggct cccccgagga taatgagcag aaacagctgt ttgtggaaca gcataagcac 3840 tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agagagtgat cctggccgac 3900 gctaatctgg acaaagtgct gtccgcctac aacaagcatc gggataagcc catcagagag 3960 caggccgaga atatcatcca cctgtttacc ctgaccaatc tgggagcccc tgccgccttc 4020 aagtactttg acaccaccat cgaccggaag aggtacacca gcaccaaaga ggtgctggac 4080 gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga cacggatcga cctgtctcag 4140 ctgggaggtg acaagcgtcc tgctgctact aagaaagctg gtcaagctaa gaaaaagaaa 4200 tga 4203 <210> 4 <211> 4203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 atggccccaa agaaaaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc cgacaagaaa 60 tacagcatcg gcctggccat cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat caccgacgag 120 tacaaggtgc ccagcaagaa attcaaggtg ctgggcaaca ccgacagaca cagcatcaag 180 aagaacctga tcggagccct gctgttcgac agcggcgaaa cagccgaggc cacccggctg 240 aagagaaccg ccagacggag atacaccaga cggaagaacc ggatctgcta tctgcaagag 300 atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacagact ggaagagtcc 360 ttcctggtgg aagaggataa gaagcacgag cggcacccca tcttcggcaa catcgtggac 420 gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa actggtggac 480 agcaccgaca aggccgacct gcggctgatc tatctggccc tggcccacat gatcaagttc 540 cggggccact tcctgatcga gggcgacctg aaccccgaca acagcgacgt ggacaagctg 600 ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccccat caacgccagc 660 ggcgtggacg ccaaggccat cctgtctgcc agactgagca aaagcagacg gctggaaaat 720 ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aatggcctgt tcggcaacct gattgccctg 780 agcctgggcc tgacccccaa cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga tgccaaactg 840 cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca gatcggcgac 900 cagtacgccg acctgtttct ggccgccaag aacctgtccg acgccatcct gctgagcgac 960 atcctgagag tgaacaccga gatcaccaaa gccccactga gcgcctctat gatcaagaga 1020 tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaagctc tcgtgcggca gcagctgcct 1080 gagaagtaca aagagatttt cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg ctacattgac 1140 ggcggagcca gccaggaaga gttctacaag ttcatcaagc ccatcctgga aaagatggac 1200 ggcaccgagg aactgctcgt gaagctgaac agagaggacc tgctgcggaa gcagcggacc 1260 ttcgacaacg gcagcatccc ccaccagatc cacctgggag agctgcacgc cattctgcgg 1320 cggcaggaag atttttaccc attcctgaag gacaaccggg aaaagatcga gaagatcctg 1380 accttccgca tcccctacta cgtgggccct ctggccaggg gaaacagcag attcgcctgg 1440 atgaccagaa agagcgagga aaccatcacc ccctggaact tcgaggaagt ggtggacaag 1500 ggcgcttccg cccagagctt catcgagaga atgaccaact tcgataagaa cctgcccaac 1560 gagaaggtgc tgcccaagca cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta taacgagctg 1620 accaaagtga aatacgtgac cgagggaatg agaaagcccg ccttcctgag cggcgagcag 1680 aaaaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaacagga aagtgaccgt gaagcagctg 1740 aaagaggact acttcaagaa aatcgagtgc ttcgactccg tggaaatctc cggcgtggaa 1800 gatcggttca acgcctccct gggcacatac cacgatctgc tgaaaattat caaggacaag 1860 gacttcctgg acaatgagga aaacgaggac attctggaag atatcgtgct gaccctgaca 1920 ctgtttgagg acagagagat gatcgaggaa cggctgaaaa cctatgccca cctgttcgac 1980 gacaaagtga tgaagcagct gaagcggcgg agatacaccg gctggggcag gctgagccgg 2040 aagctgatca acggcatccg ggacaagcag tccggcaaga caatcctgga tttcctgaag 2100 tccgacggct tcgccaacag aaacttcatg cagctgatcc acgacgacag cctgaccttt 2160 aaagaggaca tccagaaagc ccaggtgtcc ggccagggcg atagcctgca cgagcacatt 2220 gccaatctgg ccggcagccc cgccattaag aagggcatcc tgcagacagt gaaggtggtg 2280 gacgagctcg tgaaagtgat gggccggcac aagcccgaga acatcgtgat cgaaatggcc 2340 agagagaacc agaccaccca gaagggacag aagaacagcc gcgagagaat gaagcggatc 2400 gaagagggca tcaaagagct gggcagccag atcctgaaag aacaccccgt ggaaaacacc 2460 cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga atgggcggga tatgtacgtg 2520 gaccaggaac tggacatcaa ccggctgtcc gactacgatg tggacgccat cgtgcctcag 2580 agctttctga aggacgactc catcgacaac aaggtgctga ccagaagcga caagaaccgg 2640 ggcaagagcg acaacgtgcc ctccgaagag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcgg 2700 cagctgctga acgccaaact gattacccag agaaagttcg acaatctgac caaggccgag 2760 agaggcggcc tgagcgaact ggataaggcc ggcttcatca agagacagct ggtggaaacc 2820 cggcagatca caaagcacgt ggcacagatc ctggactccc ggatgaacac taagtacgac 2880 gagaatgaca agctgatccg ggaagtgaaa gtgatcaccc tgaagtccaa gctggtgtcc 2940 gatttccgga aggatttcca gttttacaaa gtgcgcgaga tcaacaacta ccatcacgcc 3000 catgacgcct acctgaacgc cgtcgtggga accgccctga tcaaaaagta ccctaagctg 3060 gaaagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat gatcgccaag 3120 agcgagcagg aaatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac 3180 tttttcaaga ccgagattac cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc tctgatcgag 3240 acaaacggcg aaaccgggga gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc caccgtgcgg 3300 aaagtgctga gcatgcccca agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca gacaggcggc 3360 ttcagcaaag agtctatcct gcccaagagg aacagcgata agctgatcgc cagaaagaag 3420 gactgggacc ctaagaagta cggcggcttc gacagcccca ccgtggccta ttctgtgctg 3480 gtggtggcca aagtggaaaa gggcaagtcc aagaaactga agagtgtgaa agagctgctg 3540 gggatcacca tcatggaaag aagcagcttc gagaagaatc ccatcgactt tctggaagcc 3600 aagggctaca aagaagtgaa aaaggacctg atcatcaagc tgcctaagta ctccctgttc 3660 gagctggaaa acggccggaa gagaatgctg gcctctgccg gcgaactgca gaagggaaac 3720 gaactggccc tgccctccaa atatgtgaac ttcctgtacc tggccagcca ctatgagaag 3780 ctgaagggct cccccgagga taatgagcag aaacagctgt ttgtggaaca gcataagcac 3840 tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agagagtgat cctggccgac 3900 gctaatctgg acaaagtgct gtccgcctac aacaagcatc gggataagcc catcagagag 3960 caggccgaga atatcatcca cctgtttacc ctgaccaatc tgggagcccc tgccgccttc 4020 aagtactttg acaccaccat cgaccggaag aggtacacca gcaccaaaga ggtgctggac 4080 gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga cacggatcga cctgtctcag 4140 ctgggaggtg acaagcgtcc tgctgctact aagaaagctg gtcaagctaa gaaaaagaaa 4200 tga 4203 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (27)..(44) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 5 gagtaagaag aaatataaga gccaccnnnn nnnnnnnnnn nnnn 44 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (24)..(41) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 6 aggcaagccc cgcagaaggc agcnnnnnnn nnnnnnnnnn n 41 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 gctgccttct gcggggcttg cct 23 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 ggtggctctt atatttcttc ttactc 26 <210> 9 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 tcagcatctt tccatttcac tgg 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 tcagcatctt tccatttcac tgg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 gggtaagata aggagagttc gga 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 ggggtgtttc ttgggaaacg ttt 23 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 aaacagggaa gggaaga 17

Claims (29)

  1. Cas9 효소를 코딩하는 합성 mRNA 및 sgRNA의 조합물을 사용하는 게놈 편집 방법.
  2. 제1항에 있어서, Cas9를 코딩하는 mRNA 및 sgRNA가 5'디구아노신 캡 및 폴리(A) 꼬리를 함유하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, DNA 파손을 용이하게 하는 주형이 추가적으로 제공되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 주형이 이중-가닥 DNA 분자인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 주형이 단일-가닥 DNA 분자인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 주형이 RNA 분자인 방법.
  7. 제1항에 있어서, Cas9가 2개의 엔도뉴클레아제 활성 부위 중 하나를 파괴하는 돌연변이, 서열식별번호(SEQ ID NO): 2, 또는 서열식별번호: 3을 보유하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, Cas9가 양쪽 모두의 엔도뉴클레아제 활성 부위를 파괴하는 돌연변이, 서열식별번호: 4를 보유하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, Cas9가 DNA 또는 염색질 단백질 상의 후성유전학적 마커를 변경시킬 수 있는 또 다른 효소에 융합된 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, Cas9 mRNA가 변형 뉴클레오티드를 함유하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, sgRNA가 변형 뉴클레오티드를 함유하는 것인 방법.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 변형 뉴클레오티드가 5-메틸-시토신, 2-티오-우라실, 또는 슈도우라실을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, Cas9 mRNA:sgRNA의 몰비가 1:1,000 내지 1,000:1인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상이한 종들로부터의 것이거나 또는 상이한 돌연변이들을 보유하는 하나 이상의 상이한 Cas9 효소를 코딩하는 mRNA 분자와 조합된 상이한 부위들을 표적화하는 다중 sgRNA가 동일한 세포 내로 도입되는 것인 방법.
  15. 제2항에 있어서, 복구 주형이 하나의 분자 상에 있는 것으로서의 sgRNA에 대한 융합을 통해 DNA 파손 부위에 국소화되는 것인 방법.
  16. 제2항에 있어서, 복구 주형이 Cas9에 결합하는 앱타머에 대한 융합을 통해 DNA 파손 부위에 국소화되는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 방법이 B18R을 추가하는 것을 또한 포함하는 방법.
  18. 비-천연 발생이고, 2개의 엔도뉴클레아제 활성 부위 중 하나를 파괴하는 돌연변이를 갖는 Cas9 단백질이며, 여기서 상기 돌연변이된 Cas9 단백질이 서열식별번호: 2의 DNA에 의해 코딩되는 것인 Cas9 단백질.
  19. 비-천연 발생이고, 2개의 Cas9 엔도뉴클레아제 활성 부위 중 하나를 파괴하는 돌연변이를 갖는 Cas9 단백질이며, 여기서 상기 돌연변이된 Cas9 단백질이 서열식별번호: 3의 DNA에 의해 코딩되는 것인 Cas9 단백질.
  20. 비-천연 발생이고, 양쪽 모두의 CAS9 엔도뉴클레아제 활성 부위를 파괴하는 돌연변이를 갖는 Cas9 단백질이며, 여기서 상기 돌연변이된 Cas9 단백질이 서열식별번호: 4에 의해 코딩되는 것인 Cas9 단백질.
  21. 뉴클레아제 유전자 내에 돌연변이가 있는 돌연변이된 Cas9 단백질을 코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 mRNA를 포함하는 비-천연 발생 CRISPER-Cas 시스템이며, 세포 내로의 진입 시 돌연변이된 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 생산하고, 돌연변이된 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 작용 시 표적 서열 내의 돌연변이가 수정되는 단일 점 돌연변이가 있는 DNA의 표적 서열을 표적화하고 이에 혼성화하는 시스템.
  22. 제22항에 있어서, cas9 mRNA가 하나 이상의 변형 뉴클레오티드를 함유하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, cas9 mRNA 및 가이드 mRNA가 세포 내로 형질감염되는 것인 방법.
  24. 제24항에 있어서, 형질감염이 B18R의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
  25. 서열식별번호: 2-4에 따라 기재된 바와 같은 Cas 9 변이체.
  26. 제25항의 cas 9 변이체를 포함하는, 유전자 편집을 위한 조작된 비-천연 발생의 전체-RNA, 무벡터, 무바이러스 CRISPR/Cas 시스템.
  27. 표적 서열을 갖고 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 분자를 함유 및 발현하는 진핵생물 세포 내로 벡터가 없고 바이러스가 없는, 조작된 비-천연 발생의 전체-RNA 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)―CRISPR 연관 (Cas) (CRISPR-Cas) 시스템을 도입하는 것을 포함하는, 적어도 하나의 유전자 생성물의 발현을 변경시키는 방법.
  28. 제19항에 있어서, 서열식별번호: 2-4의 cas 9 변이체를 추가로 포함하는 방법.
  29. 서열식별번호: 1-4에 기재된 바와 같은 Cas 9 단백질을 포함하는, 조작된, 프로그래밍가능한, 비-천연 발생의 전체-RNA CRISPR-Cas 시스템, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
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