KR20190095412A - 세포 게놈에서 상동성 지정 수복 (ｈｄｒ)의 효율을 증가시키는 방법 - Google Patents
세포 게놈에서 상동성 지정 수복 (ｈｄｒ)의 효율을 증가시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
특정 측면에서, 본 개시내용은 (a) 세포 내로 (i) 뉴클레아제; 및 (ii) 게놈 내로 삽입시키고자 하는 변형 서열을 포함하는 공여자 핵산을 도입시키는 단계; 및 (b) 세포에 대해 37℃에서 더 낮은 온도로의 온도 이동을 수행하는 단계를 포함하고, 여기서, 뉴클레아제는 세포의 절단 부위에서 게놈을 절단하고, 공여자 핵산은 증가된 상동성 지정 수복(HDR)률을 통해 변형 서열을 이용하여 게놈 서열의 수복을 유도하는 것인, 세포의 게놈에서 HDR의 효율을 증가시키는 방법을 개시한다.
Description
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2016년 12월 20일 출원된 미국 가출원 번호 62/437,042의 이익을 주장하고, 상기 가출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.
게놈 서열의 DNA 표적화된 절단을 위한 다양한 방법이 관련 기술분야에 기술되어 있다. 상기 표적화된 절단 이벤트는 표적화된 돌연변이유발을 유도하는 데, 세포 DNA 서열의 표적화된 결실을 유도하는 데, 및 미리 결정된 염색체 유전자좌에서의 표적화된 재조합을 촉진시키는 데 사용될 수 있다. 상기 방법들은 대개 표적 DNA 서열에 이중 가닥 파단 (DSB) 또는 닉을 유도하여 오류 매개 프로세스, 예컨대, 비상동 말단 연결 (NHEJ) 또는 상동성 지정 수복 (HDR)에 의한 상기 파단의 수복을 통해 유전자를 불활성화시키거나, 관심 외인성 서열을 삽입할 수 있도록 하기 위해 조작된 절단 시스템을 사용하는 것을 포함한다. 절단은 특이적 뉴클레아제, 예컨대, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)의 사용을 통해, 특이적 절단을 유도하기 위해 조작된 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 사용하는 CRISPR/Cas 시스템을 이용함으로써 이루어질 수 있다.
HDR 프로세스를 통한 특정 표적 위치에서의 게놈 변형의 효율은 세포에서 비교적 낮다. 그러므로, 세포 게놈에서 상동성 지정 수복(HDR)의 효율을 증가시키는 방법이 여전히 요구되고 있다.
특정 측면에서, 본 발명은 (a) 세포 내로 (i) 뉴클레아제; 및 (ii) 게놈 내로 삽입시키고자 하는 변형 서열을 포함하는 공여자 핵산을 도입시키는 단계; 및 (b) 세포에 대해 37℃에서 더 낮은 온도로의 온도 이동을 수행하는 단계를 포함하고, 여기서, 뉴클레아제는 세포의 절단 부위에서 게놈을 절단하고, 공여자 핵산은 증가된 상동성 지정 수복(HDR)률을 통해 변형 서열을 이용하여 게놈 서열의 수복을 유도하는 것인, 세포의 게놈에서 HDR의 효율을 증가시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상동성 지정 수복(HDR)률은 적어도 1.5배만큼 증가된다. 임의적으로, 상동성 지정 수복(HDR)률은 적어도 2배만큼 증가된다.
특정 측면에서, 더 낮은 온도는 28℃ 내지 35℃이다. 임의적으로, 더 낮은 온도는 30℃ 내지 33℃이다. 예를 들어, 세포를 적어도 24시간 또는 적어도 48시간, 예컨대, 1 내지 5일 (1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일) 동안 더 낮은 온도에서 성장시킨다. 임의적으로, 세포를 온도 이동 후 37℃에서 성장시킨다.
특정 측면에서, 세포는 진핵 세포, 예컨대, 포유동물 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 세포는 줄기 세포, 예컨대, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 1차 세포이다.
특정 측면에서, 본 발명에서 사용되는 뉴클레아제로는 모든 DNA 서열 특이적 엔도뉴클레아제 또는 RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다. 임의적으로, 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제 또는 Cpf1 뉴클레아제로부터 선택되는 CRISPR 뉴클레아제이다. 예를 들어, 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이다. 예시하자면, CRISPR 뉴클레아제 (예컨대, Cas9)는 sgRNA와 함께 DNA 포맷으로 (예컨대, Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 DNA 및 sgRNA) 또는 RNA 포맷으로 (예컨대, sgRNA/Cas9 RNP 또는 sgRNA/Cas9 mRNA) 세포 내로 도입된다. 임의적으로, sgRNA는 합성 및 화학적으로 변형된 것이다. 특정 측면에서, 공여자 핵산은 대칭 상동성 아암을 함유한다. 임의적으로, 공여자 핵산은 뉴클레아제에 의해 절단되는 게놈 중 DNA 가닥에 상보적이다.
특정 측면에서, 본 발명에서 사용되는 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)이다. 특정 다른 측면에서, 본 발명에서 사용되는 뉴클레아제는 TALE 뉴클레아제 (TALEN)이다.
특정 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 방법에 의해 제조된 단리된 세포를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 방법에 의해 제조된 단리된 세포를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 (a) 관심 단백질을 코딩하는 공여자 핵산을 상기 기술된 방법에 따라 세포 내로 도입시키는 단계; 및 (b) 세포를 대상체 내로 도입시켜 관심 단백질이 대상체에서 발현되도록 하는 단계를 포함하는, 관심 단백질을 필요로 하는 대상체에게 상기 단백질을 제공하는 방법을 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 세포 내로 (i) 뉴클레아제; 및 (ii) 대칭 상동성 아암을 함유하고, 뉴클레아제에 의해 절단되는 게놈 중 DNA 가닥에 상보적이고, 절단 부위로부터 10개 초과의 염기쌍만큼 이격되어 있는 위치에 게놈 내로 삽입시키고자 하는 변형 서열을 포함하는 공여자 핵산을 도입시키는 단계를 포함하고, 여기서, 뉴클레아제는 세포의 절단 부위에서 게놈을 절단하고, 공여자 핵산은 증가된 상동성 지정 수복(HDR)률을 통해 변형 서열을 이용하여 게놈 서열의 수복을 유도하는 것인, 세포의 게놈에서 HDR의 효율을 증가시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상동성 지정 수복(HDR)률은 적어도 1.5배, 또는 적어도 2배만큼 증가된다. 임의적으로, 상기 방법은 세포에 대해 37℃에서 더 낮은 온도 (예컨대, 28℃ 내지 35℃, 또는 30℃ 내지 33℃)로의 온도 이동을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포를 적어도 24시간 또는 적어도 48시간, 예컨대, 1 내지 5일 (1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일) 동안 더 낮은 온도에서 성장시킨다. 임의적으로, 세포를 온도 이동 후 37℃에서 성장시킨다. 특정 측면에서, 세포는 진핵 세포, 예컨대, 포유동물 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 세포는 줄기 세포, 예컨대, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 1차 세포이다. 특정 측면에서, 본 발명에서 사용되는 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제 또는 Cpf1 뉴클레아제로부터 선택되는 CRISPR 뉴클레아제이다. 예를 들어, 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이다. 예시하자면, CRISPR 뉴클레아제 (예컨대, Cas9)는 sgRNA와 함께 DNA 포맷으로 (예컨대, Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 DNA 및 sgRNA) 또는 RNA 포맷으로 (예컨대, sgRNA/Cas9 RNP 또는 sgRNA/Cas9 mRNA) 세포 내로 도입된다. 특정 측면에서, 본 발명에서 사용되는 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)이다. 특정 다른 측면에서, 본 발명에서 사용되는 뉴클레아제는 TALE 뉴클레아제 (TALEN)이다.
도 1a-1b는 CAMK2D 유전자좌에서의 유전자 편집 및 돌연변이 검출을 위한 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (ssODN) 공여자 디자인, 액적 디지털 PCR 프로브 및 프라이머 디자인을 보여주는 것이다. (a) CAMK2D 엑손2를 특이적으로 표적할 수 있도록 2개의 가이드 RNA (CAMK-CR1 및 CAMK-CR2)를 디자인하였고, CAMK-CR1 및 CAMK-CR2는 14개의 뉴클레오티드만큼 중첩되며, 이는 DNA를 절단하여 HDR에 의해 동일 서열 변경을 도입할 수 있도록 디자인된 것이다. (b) 키나제 기능이 소실된(kinase dead) K43R 돌연변이 (AAA에서 AGG로) 및 4개의 침묵 돌연변이를 CAMK2D 유전자좌의 엑손2 내로 도입할 수 있도록 2개의 ssODN HDR 공여자 (C-CR2 및 C-CR2-Asym)를 디자인하였다. ssODN 공여자 C-CR2는 의도된 돌연변이의 양측 주변에 균형잡힌 상동성 아암 (각각 5'-73 nt 및 3'-72 nt)을 가지는 가이드 RNA 표적화된 절단 가닥에 상보적인 (+) 가닥 HDR 공여자이다. C-CR2-Asym은 길이가 상이한 상동성 아암 (각각 5'-93 nt 및 3'-36 nt)을 가지는 가이드 RNA 비-표적화된 가닥에 상보적인 (-) 가닥 HDR 공여자이다. 후속되는 재절단을 막기 위해, 두 공여자 올리고 C-CR2 및 C-CR2-Asym 모두 가이드 CAMK-CR1 인식 부위 내에 3개의 침묵 돌연변이, 및 PAM 부위 내에 1개의 침묵 돌연변이를 도입한다. C-CR2 및 C-CR2-Asym은 가이드 CAMK-CR2 인식 부위 내에 4개의 침묵 돌연변이 도입한다. 또한, 비변경 야생형 대립유전자 및 돌연변이화된 서열 전환 이벤트를 각각 별개로 검출할 수 있도록 한 쌍의 프라이머 및 Vic 또는 Fam 형광단에 접합된 대립유전자-특이적 프로브 또한 디자인하였다. 확실하게 적절한 유전자좌가 증폭될 수 있도록 하기 위해 정방향 프라이머는 공여자 서열 내에서 어닐링이 이루어지도록 디자인한 반면, 역방향 프라이머는 공여자 서열 밖에서 어닐링이 이루어지도록 디자인하였다.
도 2a-2c는 mc-iPSC 중 CAMK2D 유전자좌에서 HDR을 수행하기 위해 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (ssODN) 공여자 및 sgRNA/Cas9 mRNA를 함께 공동 전달하기 위한 것으로 최적화된 방법을 보여주는 것이다. 에디트프로(EditPro)™ RNA 형질감염 시약을 사용하여 sgRNA CAMK-CR1 또는 CAMK-CR2, Cas9 mRNA 및 ssODN 공여자 C-CR2를 mc-iPSC에 공동 형질감염시켰다. (a) 야생형 대립유전자 특이적 형광 프로브 (VIC) 및 돌연변이체 대립유전자 특이적 형광 프로브 (FAM)를 사용하여 액적 디지털 PCR (ddPCR)에 의해 형질감염된 세포로부터의 야생형 및 돌연변이체 대립유전자(%)를 검출하였고, 샘플 중 각 액적의 형광 강도는 액적 개수 대비로 플롯팅되어 있다. 형광 강도가 핑크색 임계값 라인 위에 있는 액적은 표적 대립유전자에 대해 양성인 것으로 간주된다. 하단 패널 (녹색)은 야생형 대립유전자의 액적을 나타내는 반면, 상단 패널 (청색)은 HDR이 수행된 대립유전자를 나타낸다. 제시된 데이터는 10 pmole인, 최적 농도의 ssOND에서 2개의 sgRNA를 이용한 한 대표 실험으로부터 얻은 것이다. (b) 돌연변이체 대립유전자 빈도의 정량화. 제시된 데이터는 4회 수행된 독립 실험으로부터의 평균 ± SEM이다. sgRNA CAMK-CR2는 일관되게 전체 대립유전자 중 15% 초과로 HDR을 일으켰다. (c) ddPCR 실험을 위해 사용되는 것과 동일한 gRNA 및 공여자를 사용하여 수행된 차세대 서열분석에 의한 의도된 뉴클레오티드 변이의 정량화. 각 막대는 공여자 올리고에 포함된 6개의 뉴클레오티드 변이 중 하나를 나타내다. 데이터는 완전한 서열 전환이 표적화된 영역에 걸쳐서, 그리고 ddPCR 결과와 일치하는 빈도로 진행되었음을 나타낸다. ddPCR에 의해 직접 측정되지 않은 2개의 A에서 G로의 변이 또한, 비록 CRISPR 절단 부위에 더 가까운 상기 변이와 비교하여 빈도가 더 낮기는 하였지만, 도입되었다. 제시된 데이터는 4회 수행된 독립 실험으로부터의 각각의 정확한 게놈 좌표에서의 평균 의도된 염기 변경률(%)이다.
도 3a-3b는 NGS에 의해 측정된 바와 같은, mc-iPSC 중 CAMK2D 유전자좌에서의 '저온 충격' 및 ssODN HDR 공여자 디자인이 HDR 효율에 미치는 효과를 보여주는 것이다. CAMK2D 유전자좌에서 HDR을 달성하기 위해 Cas9 mRNA 및 sgRNA CAMK-CR1 또는 CAMK-CR2와 함께 다양한 양의 ssODN C-CR2 또는 C-CR2-Asym을 mc-iPSC로 전달하였다. 실험은 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 24시간 간격으로 상이한 온도에서 수행하였다: PL1: 37℃-37℃-37℃, PL2: 37℃-32℃-37℃, PL3: 37℃-32℃-32℃. (a) 각 처리 (C-TR2 또는 C-TR2-Asym과 함께 CAMK-CR1, C-TR2 또는 C-TR2-Asym과 함께 CAMK-CR2)에 대하여 10 pmol의 ssODN HDR 공여자를 사용하였을 때의 HDR 이벤트를 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 NGS에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 평균 HDR 이벤트율(%)이다 (C-CR2: 3회 수행된 독립 실험으로부터 8개의 복제본; C-CR2-Asym: 2회 수행된 독립 실험으로부터 6개의 복제본). HDR 유형은 의도된 돌연변이 영역 주변의 생성된 서열에 기초하여 3개 군으로 분류되었다. 완벽한 HDR: 재편집 indels 없이, 의도된 염기 변이가 모두 존재하는 것이다. 편집된 HDR: 재편집 indels와 함께, 의도된 염기 변이 중 하나 이상의 것이 존재하는 것이다. 부분 HDR: indels 없이, 의도된 염기 변이 모두가 아닌 단지 일부만이 존재하는 것이다. 데이터는 HDR 증가는 세포에 '저온 충격'을 가함으로써 달성될 수 있고, 대부분의 증가는 '완벽한 HDR' 카테고리에 있다는 것을 입증한다. 각 gRNA 및 ssODN 처리에 대한 3개의 온도 조건 사이의 전체 HDR 효율 차이의 유의도를 일원 ANOVA에 의해 분석하였다 (모든 gRNA 및 ssODN 처리의 경우, 일원 ANOVA P<0.0001, 후속 던네트(Dunnett's) 다중 비교의 P 값은 도면에 제시되어 있다). 30 pmol ssODN 및 올리고 비처리로부터의 HDR은 표 4에 제시되었다. (b) 각 처리 (C-TR2 또는 C-TR2-Asym과 함께 CAMK-CR1, C-TR2 또는 C-TR2-Asym과 함께 CAMK-CR2)의 완벽한 HDR 이벤트를 플롯팅하여 두 ssODN 디자인 사이의 완벽한 HDR 빈도를 비교하였다. 제시된 데이터는 평균 완벽한 HDR 이벤트율(%) ± SEM이다 (2회 수행된 독립 실험으로부터 6개의 생물학적 복제본). 각 처리군에서 두 ssODN 디자인 사이의 완벽한 HDR 빈도의 차이를 스튜던츠 T 검정에 의해 평가하였고, p 값은 도면에 제시되어 있다. (+) 가닥 ssODN C-CR2가 모든 온도 조건에 걸쳐 (-) 가닥 ssODN C-CR2-Asym보다 더욱 완벽한 HDR을 촉진시킨다.
도 4a-4c는 TGFBR1 유전자좌에서의 유전자 편집을 위한 가이드 RNA 및 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (ssODN) 공여자 디자인을 보여주는 것이다. (a) TGFBR1 엑손 4를 특이적으로 표적하고, HDR에 의해 상이한 서열 변경을 도입할 수 있도록 2개의 가이드 RNA TR-CR2 및 TR-CR3을 디자인하였다. TR-CR3은 TR-CR2 하류의 39개의 뉴클레오티드이다. (b) 가이드 RNA TR-CR2 표적 부위 상류 쪽으로 12 bp만큼의 위치에 침묵 돌연변이를 도입할 수 있도록 2개의 ssODN HDR 공여자 (T-CR2 및 T-CR2-Asym)를 디자인하였고, 여기서, HDR 전환된 서열의 재편집을 막기 위해, 3개의 침묵 돌연변이가 가이드 RNA 인식 서열 내에 존재하였다. T-CR2는 의도된 돌연변이의 양측 주변에 균형잡힌 상동성 아암 (각각 5'-73 nt 및 3'-74 nt)을 가지는 가이드 RNA 표적화된 절단 가닥에 상보적인 (+) 가닥 HDR 공여자이다. T-CR2-Asym은 길이가 상이한 상동성 아암 (각각 5'-93 nt 및 3'-36 nt)을 가지는 가이드 RNA 비-표적화된 가닥에 상보적인 (-) 가닥 HDR 공여자이다. (c) 가이드 RNA TR-CR3 표적 부위 상류 쪽으로 12 bp만큼의 위치에 공지된 SNP를 도입할 수 있도록 2개의 ssODN 공여자 (T-CR3 및 T-CR3-Asym)를 디자인하였고, 여기서, HDR 전환된 서열의 재편집을 막기 위해, 가이드 RNA 인식 서열 내에 2개의 침묵 돌연변이, 및 TR-CR3 PAM 부위 내에 1개의 침묵 돌연변이가 존재하였다. T-CR3은 의도된 돌연변이의 양측 주변에 균형잡힌 상동성 아암 (각각 5'-73 nt 및 3'-72 nt)을 가지는 가이드 RNA 표적화된 절단 가닥에 상보적인 (+) 가닥 HDR 공여자이다. T-CR3-Asym은 의도된 돌연변이의 양측 주변에 길이가 불균형인 상동성 아암 (각각 5'-86 nt 및 3'-36 nt)을 가지는 가이드 RNA 비-표적화된 가닥에 상보적인 (-) 가닥 HDR 공여자이다.
도 5a-5b는 mc-iPSC 중 TGFBR1 유전자좌에서의 '저온 충격' 및 ssODN HDR 공여자 디자인이 HDR 효율에 미치는 효과를 보여주는 것이다. TGFBR1 유전자좌에서 HDR을 달성하기 위해 Cas9 mRNA와 함께 ssODN HDR 공여자 및 sgRNA를 mc-iPSC 세포로 함께 공동 전달하였다. 실험은 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 24시간 간격으로 상이한 온도에서 수행하였다: PL1: 37℃-37℃-37℃, PL2: 37℃-32℃-37℃, PL3: 37℃-32℃-32℃, PL4: 32℃-32℃-32℃. (a) 각 처리 (T-TR2 또는 T-TR2-Asym과 함께 TR-CR2, T-TR3 또는 T-TR3-Asym과 함께 TR-CR3)에 대하여 10 pmol의 ssODN HDR 공여자를 사용하였을 때의 HDR 이벤트를 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 NGS에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 평균 HDR 이벤트율(%)이다 (3회 수행된 독립 실험으로부터 4개의 복제본). HDR 유형은 의도된 돌연변이 영역 주변의 생성된 서열에 기초하여 3개 군으로 분류되었다. 완벽한 HDR: 재편집 indels 없이, 의도된 염기 변이가 모두 존재하는 것이다. 편집된 HDR: 재편집 indels와 함께, 의도된 염기 변이 중 하나 이상의 것이 존재하는 것이다. 부분 HDR: indels 없이, 의도된 염기 변이 모두가 아닌 단지 일부만이 존재하는 것이다. 각 gRNA 및 ssODN 처리에 대한 3개의 온도 조건 사이의 전체 HDR 효율 차이의 유의도를 일원 ANOVA에 의해 분석하였다 (일원 ANOVA P>0.05, 후속 던네트 다중 비교의 P 값은 도면에 제시되어 있다). 30 pmol ssODN 및 올리고 비처리로부터의 HDR은 표 5에 제시되었다. (b) 각 처리 (T-TR2 또는 T-TR2-Asym과 함께 TR-CR2, T-TR3 또는 T-TR3-Asym과 함께 TR-CR3)에 대하여 10 pmol의 ssODN HDR 공여자를 사용하였을 때의 완벽한 HDR 이벤트를 플롯팅하여 두 ssODN 디자인 사이의 완벽한 HDR 빈도를 비교하였다. 제시된 데이터는 평균 완벽한 HDR 이벤트율(%) ± SEM이다 (3회 수행된 독립 실험, 4개의 복제본). 각 처리군에서 두 ssODN 디자인 사이의 완벽한 HDR 빈도의 차이를 스튜던츠 T 검정에 의해 평가하였고, p 값은 도면에 제시되어 있다. 모든 온도 조건에 걸쳐, (+) ssODN 가닥 T-CR2 및 T-CR3이 각각 (-) ssODN 가닥 T-CR2-Asym 및 T-CR3-Asym보다 더욱 완벽한 HDR을 촉진시킨다.
도 6은 '저온 충격'이 HEK293T 세포 중 CAMK2D 유전자좌에서의 HDR 효율을 증진시킨다는 것을 보여주는 것이다. CAMK2D 유전자좌에서 HDR을 달성하기 위해 mc-iPSC에 대한 것과 동일한 형질감염 조건을 사용하여 Cas9 mRNA 및 sgRNA CAMK-CR1 또는 CAMK-CR2와 함께 다양한 양의 ssODN C-CR2를 HEK293T 세포로 전달하였다. 실험은 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 24시간 간격으로 상이한 온도에서 수행하였다: PL1: 37℃-37℃-37℃, PL2: 37℃-32℃-37℃, PL3: 37℃-32℃-32℃. (a) 각 처리에 대하여 10 pmol의 ssODN HDR 공여자를 사용하였을 때의 HDR 이벤트를 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 NGS에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 3개의 복제본으로부터의 평균 HDR 이벤트율(%)이다. HDR 유형은 의도된 돌연변이 영역 주변의 생성된 서열에 기초하여 3개 군으로 분류되었다. 완벽한 HDR: indels 없이, 의도된 염기 변이가 모두 존재하는 것이다. 편집된 HDR: 하나 이상의 의도된 염기 변이가 존재하지만, indels는 존재하지 않는 것이다. 부분 HDR: indels 없이, 의도된 염기 변이 모두가 아닌 단지 일부만이 존재하는 것이다. 각 gRNA 및 ssODN 처리에 대한 3개의 온도 조건 사이의 전체 HDR 효율 차이의 유의도를 일원 ANOVA에 의해 분석하였다 (일원 ANOVA: C-CR2와 CAMK-CR1인 경우, P=0.0041; C-CR2와 CAMK-CR2인 경우, P=0.0469; 후속 던네트 다중 비교의 P 값은 도면에 제시되어 있다). 30 pmol ssODN 및 올리고 비처리로부터의 HDR은 표 7에 제시되었다.
도 7a-7c는 '저온 충격' 이후의 mc-iPSC에서의 다분화능 마커의 발현을 보여주는 것이다. "보충 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 24시간 간격으로 상이한 온도에서 mc-iPSC를 성장시켰다: PL1: 37℃-37℃-37℃, PL2: 37℃-32℃-37℃, PL3: 37℃-32℃-32℃. 이어서, 세포를 "보충 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 다분화능 특이적 항체로 염색하였다: (a) SSEA3 (녹색), (b) 나노그(Nanog) (녹색) 및 (c) OCT4 (녹색). 핵을 표지하기 위해 세포를 또한 훽스트(Hoechst) (청색)로 공동 염색하였다.
도 8은 NGS에 의해 측정된 바와 같이, '저온 충격'이 mc-iPSC 중 CAMK2D 유전자좌에서의 HDR 효율을 증진시킨다는 것을 보여주는 것이다. CAMK2D 유전자좌에서 HDR을 달성하기 위해 Cas9 mRNA 및 sgRNA CAMK-CR1 또는 CAMK-CR2와 함께 30 pmol의 ssODN C-CR2를 mc-iPSC로 전달하였다. 실험은 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 24시간 간격으로 상이한 온도에서 수행하였다: PL1: 37℃-37℃-37℃, PL2: 37℃-32℃-37℃, PL3: 37℃-32℃-32℃, PL4: 32℃-30℃-37℃, PL5: 37℃-30℃-30℃, PL6: 37℃-28℃-37℃, PL7: 37℃-28℃-28℃. (a) 각 처리에 대한 HDR 이벤트를 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 NGS에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 2개의 복제본으로부터의 평균 HDR 이벤트율(%)이다. HDR 유형은 의도된 돌연변이 영역 주변의 생성된 서열에 기초하여 3개 군으로 분류되었다. 완벽한 HDR: 재편집 indels 없이, 의도된 염기 변이가 모두 존재하는 것이다. 편집된 HDR: 재편집 indels와 함께, 의도된 염기 변이 중 하나 이상의 것이 존재하는 것이다. 부분 HDR: indels 없이, 의도된 염기 변이 모두가 아닌 단지 일부만이 존재하는 것이다. 올리고 비처리에서의 낮은 비율의 편집된 HDR 및 부분 HDR 서열은 차세대 서열분석과 연관된 배경 오류율을 나타낸다. 올리고 비처리에서는 완벽한 HDR이 전혀 검출되지 않았다. 데이터는 HDR 증가는 세포에 '저온 충격'을 가함으로써 달성될 수 있고, 대부분의 증가는 '완벽한 HDR' 카테고리에 있다는 것을 입증한다.
도 2a-2c는 mc-iPSC 중 CAMK2D 유전자좌에서 HDR을 수행하기 위해 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (ssODN) 공여자 및 sgRNA/Cas9 mRNA를 함께 공동 전달하기 위한 것으로 최적화된 방법을 보여주는 것이다. 에디트프로(EditPro)™ RNA 형질감염 시약을 사용하여 sgRNA CAMK-CR1 또는 CAMK-CR2, Cas9 mRNA 및 ssODN 공여자 C-CR2를 mc-iPSC에 공동 형질감염시켰다. (a) 야생형 대립유전자 특이적 형광 프로브 (VIC) 및 돌연변이체 대립유전자 특이적 형광 프로브 (FAM)를 사용하여 액적 디지털 PCR (ddPCR)에 의해 형질감염된 세포로부터의 야생형 및 돌연변이체 대립유전자(%)를 검출하였고, 샘플 중 각 액적의 형광 강도는 액적 개수 대비로 플롯팅되어 있다. 형광 강도가 핑크색 임계값 라인 위에 있는 액적은 표적 대립유전자에 대해 양성인 것으로 간주된다. 하단 패널 (녹색)은 야생형 대립유전자의 액적을 나타내는 반면, 상단 패널 (청색)은 HDR이 수행된 대립유전자를 나타낸다. 제시된 데이터는 10 pmole인, 최적 농도의 ssOND에서 2개의 sgRNA를 이용한 한 대표 실험으로부터 얻은 것이다. (b) 돌연변이체 대립유전자 빈도의 정량화. 제시된 데이터는 4회 수행된 독립 실험으로부터의 평균 ± SEM이다. sgRNA CAMK-CR2는 일관되게 전체 대립유전자 중 15% 초과로 HDR을 일으켰다. (c) ddPCR 실험을 위해 사용되는 것과 동일한 gRNA 및 공여자를 사용하여 수행된 차세대 서열분석에 의한 의도된 뉴클레오티드 변이의 정량화. 각 막대는 공여자 올리고에 포함된 6개의 뉴클레오티드 변이 중 하나를 나타내다. 데이터는 완전한 서열 전환이 표적화된 영역에 걸쳐서, 그리고 ddPCR 결과와 일치하는 빈도로 진행되었음을 나타낸다. ddPCR에 의해 직접 측정되지 않은 2개의 A에서 G로의 변이 또한, 비록 CRISPR 절단 부위에 더 가까운 상기 변이와 비교하여 빈도가 더 낮기는 하였지만, 도입되었다. 제시된 데이터는 4회 수행된 독립 실험으로부터의 각각의 정확한 게놈 좌표에서의 평균 의도된 염기 변경률(%)이다.
도 3a-3b는 NGS에 의해 측정된 바와 같은, mc-iPSC 중 CAMK2D 유전자좌에서의 '저온 충격' 및 ssODN HDR 공여자 디자인이 HDR 효율에 미치는 효과를 보여주는 것이다. CAMK2D 유전자좌에서 HDR을 달성하기 위해 Cas9 mRNA 및 sgRNA CAMK-CR1 또는 CAMK-CR2와 함께 다양한 양의 ssODN C-CR2 또는 C-CR2-Asym을 mc-iPSC로 전달하였다. 실험은 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 24시간 간격으로 상이한 온도에서 수행하였다: PL1: 37℃-37℃-37℃, PL2: 37℃-32℃-37℃, PL3: 37℃-32℃-32℃. (a) 각 처리 (C-TR2 또는 C-TR2-Asym과 함께 CAMK-CR1, C-TR2 또는 C-TR2-Asym과 함께 CAMK-CR2)에 대하여 10 pmol의 ssODN HDR 공여자를 사용하였을 때의 HDR 이벤트를 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 NGS에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 평균 HDR 이벤트율(%)이다 (C-CR2: 3회 수행된 독립 실험으로부터 8개의 복제본; C-CR2-Asym: 2회 수행된 독립 실험으로부터 6개의 복제본). HDR 유형은 의도된 돌연변이 영역 주변의 생성된 서열에 기초하여 3개 군으로 분류되었다. 완벽한 HDR: 재편집 indels 없이, 의도된 염기 변이가 모두 존재하는 것이다. 편집된 HDR: 재편집 indels와 함께, 의도된 염기 변이 중 하나 이상의 것이 존재하는 것이다. 부분 HDR: indels 없이, 의도된 염기 변이 모두가 아닌 단지 일부만이 존재하는 것이다. 데이터는 HDR 증가는 세포에 '저온 충격'을 가함으로써 달성될 수 있고, 대부분의 증가는 '완벽한 HDR' 카테고리에 있다는 것을 입증한다. 각 gRNA 및 ssODN 처리에 대한 3개의 온도 조건 사이의 전체 HDR 효율 차이의 유의도를 일원 ANOVA에 의해 분석하였다 (모든 gRNA 및 ssODN 처리의 경우, 일원 ANOVA P<0.0001, 후속 던네트(Dunnett's) 다중 비교의 P 값은 도면에 제시되어 있다). 30 pmol ssODN 및 올리고 비처리로부터의 HDR은 표 4에 제시되었다. (b) 각 처리 (C-TR2 또는 C-TR2-Asym과 함께 CAMK-CR1, C-TR2 또는 C-TR2-Asym과 함께 CAMK-CR2)의 완벽한 HDR 이벤트를 플롯팅하여 두 ssODN 디자인 사이의 완벽한 HDR 빈도를 비교하였다. 제시된 데이터는 평균 완벽한 HDR 이벤트율(%) ± SEM이다 (2회 수행된 독립 실험으로부터 6개의 생물학적 복제본). 각 처리군에서 두 ssODN 디자인 사이의 완벽한 HDR 빈도의 차이를 스튜던츠 T 검정에 의해 평가하였고, p 값은 도면에 제시되어 있다. (+) 가닥 ssODN C-CR2가 모든 온도 조건에 걸쳐 (-) 가닥 ssODN C-CR2-Asym보다 더욱 완벽한 HDR을 촉진시킨다.
도 4a-4c는 TGFBR1 유전자좌에서의 유전자 편집을 위한 가이드 RNA 및 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (ssODN) 공여자 디자인을 보여주는 것이다. (a) TGFBR1 엑손 4를 특이적으로 표적하고, HDR에 의해 상이한 서열 변경을 도입할 수 있도록 2개의 가이드 RNA TR-CR2 및 TR-CR3을 디자인하였다. TR-CR3은 TR-CR2 하류의 39개의 뉴클레오티드이다. (b) 가이드 RNA TR-CR2 표적 부위 상류 쪽으로 12 bp만큼의 위치에 침묵 돌연변이를 도입할 수 있도록 2개의 ssODN HDR 공여자 (T-CR2 및 T-CR2-Asym)를 디자인하였고, 여기서, HDR 전환된 서열의 재편집을 막기 위해, 3개의 침묵 돌연변이가 가이드 RNA 인식 서열 내에 존재하였다. T-CR2는 의도된 돌연변이의 양측 주변에 균형잡힌 상동성 아암 (각각 5'-73 nt 및 3'-74 nt)을 가지는 가이드 RNA 표적화된 절단 가닥에 상보적인 (+) 가닥 HDR 공여자이다. T-CR2-Asym은 길이가 상이한 상동성 아암 (각각 5'-93 nt 및 3'-36 nt)을 가지는 가이드 RNA 비-표적화된 가닥에 상보적인 (-) 가닥 HDR 공여자이다. (c) 가이드 RNA TR-CR3 표적 부위 상류 쪽으로 12 bp만큼의 위치에 공지된 SNP를 도입할 수 있도록 2개의 ssODN 공여자 (T-CR3 및 T-CR3-Asym)를 디자인하였고, 여기서, HDR 전환된 서열의 재편집을 막기 위해, 가이드 RNA 인식 서열 내에 2개의 침묵 돌연변이, 및 TR-CR3 PAM 부위 내에 1개의 침묵 돌연변이가 존재하였다. T-CR3은 의도된 돌연변이의 양측 주변에 균형잡힌 상동성 아암 (각각 5'-73 nt 및 3'-72 nt)을 가지는 가이드 RNA 표적화된 절단 가닥에 상보적인 (+) 가닥 HDR 공여자이다. T-CR3-Asym은 의도된 돌연변이의 양측 주변에 길이가 불균형인 상동성 아암 (각각 5'-86 nt 및 3'-36 nt)을 가지는 가이드 RNA 비-표적화된 가닥에 상보적인 (-) 가닥 HDR 공여자이다.
도 5a-5b는 mc-iPSC 중 TGFBR1 유전자좌에서의 '저온 충격' 및 ssODN HDR 공여자 디자인이 HDR 효율에 미치는 효과를 보여주는 것이다. TGFBR1 유전자좌에서 HDR을 달성하기 위해 Cas9 mRNA와 함께 ssODN HDR 공여자 및 sgRNA를 mc-iPSC 세포로 함께 공동 전달하였다. 실험은 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 24시간 간격으로 상이한 온도에서 수행하였다: PL1: 37℃-37℃-37℃, PL2: 37℃-32℃-37℃, PL3: 37℃-32℃-32℃, PL4: 32℃-32℃-32℃. (a) 각 처리 (T-TR2 또는 T-TR2-Asym과 함께 TR-CR2, T-TR3 또는 T-TR3-Asym과 함께 TR-CR3)에 대하여 10 pmol의 ssODN HDR 공여자를 사용하였을 때의 HDR 이벤트를 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 NGS에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 평균 HDR 이벤트율(%)이다 (3회 수행된 독립 실험으로부터 4개의 복제본). HDR 유형은 의도된 돌연변이 영역 주변의 생성된 서열에 기초하여 3개 군으로 분류되었다. 완벽한 HDR: 재편집 indels 없이, 의도된 염기 변이가 모두 존재하는 것이다. 편집된 HDR: 재편집 indels와 함께, 의도된 염기 변이 중 하나 이상의 것이 존재하는 것이다. 부분 HDR: indels 없이, 의도된 염기 변이 모두가 아닌 단지 일부만이 존재하는 것이다. 각 gRNA 및 ssODN 처리에 대한 3개의 온도 조건 사이의 전체 HDR 효율 차이의 유의도를 일원 ANOVA에 의해 분석하였다 (일원 ANOVA P>0.05, 후속 던네트 다중 비교의 P 값은 도면에 제시되어 있다). 30 pmol ssODN 및 올리고 비처리로부터의 HDR은 표 5에 제시되었다. (b) 각 처리 (T-TR2 또는 T-TR2-Asym과 함께 TR-CR2, T-TR3 또는 T-TR3-Asym과 함께 TR-CR3)에 대하여 10 pmol의 ssODN HDR 공여자를 사용하였을 때의 완벽한 HDR 이벤트를 플롯팅하여 두 ssODN 디자인 사이의 완벽한 HDR 빈도를 비교하였다. 제시된 데이터는 평균 완벽한 HDR 이벤트율(%) ± SEM이다 (3회 수행된 독립 실험, 4개의 복제본). 각 처리군에서 두 ssODN 디자인 사이의 완벽한 HDR 빈도의 차이를 스튜던츠 T 검정에 의해 평가하였고, p 값은 도면에 제시되어 있다. 모든 온도 조건에 걸쳐, (+) ssODN 가닥 T-CR2 및 T-CR3이 각각 (-) ssODN 가닥 T-CR2-Asym 및 T-CR3-Asym보다 더욱 완벽한 HDR을 촉진시킨다.
도 6은 '저온 충격'이 HEK293T 세포 중 CAMK2D 유전자좌에서의 HDR 효율을 증진시킨다는 것을 보여주는 것이다. CAMK2D 유전자좌에서 HDR을 달성하기 위해 mc-iPSC에 대한 것과 동일한 형질감염 조건을 사용하여 Cas9 mRNA 및 sgRNA CAMK-CR1 또는 CAMK-CR2와 함께 다양한 양의 ssODN C-CR2를 HEK293T 세포로 전달하였다. 실험은 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 24시간 간격으로 상이한 온도에서 수행하였다: PL1: 37℃-37℃-37℃, PL2: 37℃-32℃-37℃, PL3: 37℃-32℃-32℃. (a) 각 처리에 대하여 10 pmol의 ssODN HDR 공여자를 사용하였을 때의 HDR 이벤트를 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 NGS에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 3개의 복제본으로부터의 평균 HDR 이벤트율(%)이다. HDR 유형은 의도된 돌연변이 영역 주변의 생성된 서열에 기초하여 3개 군으로 분류되었다. 완벽한 HDR: indels 없이, 의도된 염기 변이가 모두 존재하는 것이다. 편집된 HDR: 하나 이상의 의도된 염기 변이가 존재하지만, indels는 존재하지 않는 것이다. 부분 HDR: indels 없이, 의도된 염기 변이 모두가 아닌 단지 일부만이 존재하는 것이다. 각 gRNA 및 ssODN 처리에 대한 3개의 온도 조건 사이의 전체 HDR 효율 차이의 유의도를 일원 ANOVA에 의해 분석하였다 (일원 ANOVA: C-CR2와 CAMK-CR1인 경우, P=0.0041; C-CR2와 CAMK-CR2인 경우, P=0.0469; 후속 던네트 다중 비교의 P 값은 도면에 제시되어 있다). 30 pmol ssODN 및 올리고 비처리로부터의 HDR은 표 7에 제시되었다.
도 7a-7c는 '저온 충격' 이후의 mc-iPSC에서의 다분화능 마커의 발현을 보여주는 것이다. "보충 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 24시간 간격으로 상이한 온도에서 mc-iPSC를 성장시켰다: PL1: 37℃-37℃-37℃, PL2: 37℃-32℃-37℃, PL3: 37℃-32℃-32℃. 이어서, 세포를 "보충 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 다분화능 특이적 항체로 염색하였다: (a) SSEA3 (녹색), (b) 나노그(Nanog) (녹색) 및 (c) OCT4 (녹색). 핵을 표지하기 위해 세포를 또한 훽스트(Hoechst) (청색)로 공동 염색하였다.
도 8은 NGS에 의해 측정된 바와 같이, '저온 충격'이 mc-iPSC 중 CAMK2D 유전자좌에서의 HDR 효율을 증진시킨다는 것을 보여주는 것이다. CAMK2D 유전자좌에서 HDR을 달성하기 위해 Cas9 mRNA 및 sgRNA CAMK-CR1 또는 CAMK-CR2와 함께 30 pmol의 ssODN C-CR2를 mc-iPSC로 전달하였다. 실험은 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 24시간 간격으로 상이한 온도에서 수행하였다: PL1: 37℃-37℃-37℃, PL2: 37℃-32℃-37℃, PL3: 37℃-32℃-32℃, PL4: 32℃-30℃-37℃, PL5: 37℃-30℃-30℃, PL6: 37℃-28℃-37℃, PL7: 37℃-28℃-28℃. (a) 각 처리에 대한 HDR 이벤트를 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 NGS에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 2개의 복제본으로부터의 평균 HDR 이벤트율(%)이다. HDR 유형은 의도된 돌연변이 영역 주변의 생성된 서열에 기초하여 3개 군으로 분류되었다. 완벽한 HDR: 재편집 indels 없이, 의도된 염기 변이가 모두 존재하는 것이다. 편집된 HDR: 재편집 indels와 함께, 의도된 염기 변이 중 하나 이상의 것이 존재하는 것이다. 부분 HDR: indels 없이, 의도된 염기 변이 모두가 아닌 단지 일부만이 존재하는 것이다. 올리고 비처리에서의 낮은 비율의 편집된 HDR 및 부분 HDR 서열은 차세대 서열분석과 연관된 배경 오류율을 나타낸다. 올리고 비처리에서는 완벽한 HDR이 전혀 검출되지 않았다. 데이터는 HDR 증가는 세포에 '저온 충격'을 가함으로써 달성될 수 있고, 대부분의 증가는 '완벽한 HDR' 카테고리에 있다는 것을 입증한다.
특정 측면에서, 본 발명은 예컨대, CRISPR/Cas9 기술을 사용함으로써 세포의 게놈에서 상동성 지정 수복(HDR)의 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 실험 실시예에 기술된 바와 같이, 출원인은 낮은 HDR율 (1-20%)은 세포 (예컨대, iPSC 및 HEK293 세포)에서 형질감염 후 더 낮은 온도에서 세포에 '저온 충격'을 가함으로써 2 내지 10배 증진될 수 있다는 것을 입증하였다. 상기 방법은 또한, CRISPR 절단 부위에 대해 더 먼 거리에 있는 뉴클레오티드는 덜 효율적으로 도입되는 부분 서열 전환 ('부분 HDR')과 반대로, 공여자 서열 간의 완전한 서열 전환, 또는 '완벽한 HDR'이 이루어진 유전자좌의 비율을 증가시킨다. 단일 가닥 DNA 올리고 공여자의 구조가 HDR의 충실도에 크게 영향을 줄 수 있고, 여기서, CRISPR 절단 부위에 대해 대칭이고, 표적 가닥에 상보적인 올리고가 비대칭인 비-표적 가닥 상보적 올리고에 비해 '완벽한 HDR'을 유도하는 데 더 효율적이라는 것 또한 본 실시예에서 입증되었다.
특정 측면에서, 본 발명은 (a) 세포 내로 (i) 뉴클레아제; 및 (ii) 게놈 내로 삽입시키고자 하는 변형 서열을 포함하는 공여자 핵산을 도입시키는 단계; 및 (b) 세포에 대해 37℃에서 더 낮은 온도로의 온도 이동을 수행하는 단계를 포함하고; 여기서, 뉴클레아제는 세포의 절단 부위에서 게놈을 절단하고, 공여자 핵산은 증가된 상동성 지정 수복(HDR)률을 통해 변형 서열을 이용하여 게놈 서열의 수복을 유도하는 것인, 세포의 게놈에서 HDR의 효율을 증가시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상동성 지정 수복(HDR)률은 적어도 1.5배만큼 증가된다. 임의적으로, 상동성 지정 수복(HDR)률은 적어도 2배만큼 증가된다.
특정 측면에서, 더 낮은 온도는 28℃ 내지 35℃이다. 임의적으로, 더 낮은 온도는 30℃ 내지 33℃이다. 예를 들어, 세포를 적어도 24시간 또는 적어도 48시간, 예컨대, 1 내지 5일 (1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일) 동안 더 낮은 온도에서 성장시킨다. 임의적으로, 세포를 온도 이동 후 37℃에서 성장시킨다.
특정 측면에서, 세포는 진핵 세포, 예컨대, 포유동물 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 세포는 줄기 세포 예컨대, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC). 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 1차 세포. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 식물 세포이다.
특정 측면에서, 본 발명에서 사용되는 뉴클레아제로는 모든 DNA 서열 특이적 엔도뉴클레아제 또는 RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다. 임의적으로, 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제 또는 Cpf1 뉴클레아제로부터 선택되는 CRISPR 뉴클레아제이다. 예를 들어, 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이다. 예시하자면, CRISPR 뉴클레아제 (예컨대, Cas9)는 sgRNA와 함께 DNA 포맷으로 (예컨대, Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 DNA 및 sgRNA) 또는 RNA 포맷으로 (예컨대, sgRNA/Cas9 RNP 또는 sgRNA/Cas9 mRNA) 세포 내로 도입된다. 임의적으로, sgRNA는 합성 및 화학적으로 변형된 것이다. 특정 측면에서, 공여자 핵산은 대칭 상동성 아암을 함유한다. 임의적으로, 공여자 핵산은 뉴클레아제에 의해 절단되는 게놈 중 DNA 가닥에 상보적이다.
특정 측면에서, 본 발명에서 사용되는 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)이다. 특정 다른 측면에서, 본 발명에서 사용되는 뉴클레아제는 TALE 뉴클레아제 (TALEN)이다.
특정 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 방법에 의해 제조된 단리된 세포를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 방법에 의해 제조된 단리된 세포를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 (a) 관심 단백질을 코딩하는 공여자 핵산을 상기 기술된 방법에 따라 세포 내로 도입시키는 단계; 및 (b) 세포를 대상체 내로 도입시켜 관심 단백질이 대상체에서 발현되도록 하는 단계를 포함하는, 관심 단백질을 필요로 하는 대상체에게 상기 단백질을 제공하는 방법을 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 세포 내로 (i) 뉴클레아제; 및 (ii) 대칭 상동성 아암을 함유하고, 뉴클레아제에 의해 절단되는 게놈 중 DNA 가닥에 상보적이고, 절단 부위로부터 10개 초과의 염기쌍만큼 이격되어 있는 위치에 게놈 내로 삽입시키고자 하는 변형 서열을 포함하는 공여자 핵산을 도입시키는 단계를 포함하고, 여기서, 뉴클레아제는 세포의 절단 부위에서 게놈을 절단하고, 공여자 핵산은 증가된 상동성 지정 수복(HDR)률을 통해 변형 서열을 이용하여 게놈 서열의 수복을 유도하는 것인, 세포의 게놈에서 HDR의 효율을 증가시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상동성 지정 수복(HDR)률은 적어도 1.5배, 또는 적어도 2배만큼 증가된다. 임의적으로, 상기 방법은 세포에 대해 37℃에서 더 낮은 온도 (예컨대, 28℃ 내지 35℃, 또는 30℃ 내지 33℃)로의 온도 이동을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포를 적어도 24시간 또는 적어도 48시간, 예컨대, 1 내지 5일 (1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일) 동안 더 낮은 온도에서 성장시킨다.
I. 정의
본 개시내용이 더욱 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해, 먼저 특정 용어들을 정의한다. 본 출원에서 사용되는 바, 본원에서 달리 명확하게 제공되는 경우를 제외하면, 하기 용어들은 각각 하기 기술되는 의미를 가져야 한다. 추가 정의는 본 출원 전역에 걸쳐 기술된다.
"핵산," "폴리뉴클레오티드," 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 이는 선형 또는 고리형 입체구조, 및 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭한다.
"폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기로 이루어진 중합체를 지칭한다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는, 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이고, 이때 상기 아연 핑거는 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역이다. 아연 핑거 DNA 결합 단백질이라는 용어는 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 반복 도메인은 TALE의 그의 동족 표적 DNA 서열에의 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위" (이는 "반복부"로도 지칭됨)는 길이가 전형적으로 33-35개 아미노산 길이이고, 자연적으로 발생된 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부의 서열 상동성을 나타낸다.
"CRISPR/Cas9 시스템" 또는 "Cas9 시스템"이라는 용어는 다수의 DNA 수복 경로 중 하나에 의해 표적 핵산을 변경시킬 수 있는 시스템을 지칭한다. 특정 측면에서, 본원에 기술된 Cas9 시스템은 HDR 경로를 통해 표적 핵산의 수복을 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, Cas9 시스템은 gRNA 분자 및 Cas9 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 시스템은 제2 gRNA 분자를 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "Cas9 분자" 또는 "Cas9 뉴클레아제"는 Cas9 폴리펩티드, 또는 Cas9 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 지칭한다. "Cas9 폴리펩티드"는 gRNA 분자와 상호작용할 수 있고, gRNA 분자와 협력하여 표적 도메인을 포함하는 부위, 특정 측면에서, PAM 서열로 국재화될 수 있는 폴리펩티드이다. Cas9 분자는 자연적으로 발생된 Cas9 분자, 조작된, 변경된 또는 변형된 Cas9 분자 뿐만 아니라, 예컨대, 적어도 1개의 아미노산 잔기가 참조 Cas9 서열, 예컨대, 자연적으로 발생된 Cas9 분자와 상이한 Cas9 폴리펩티드, 이 둘 모두를 포함한다. 상기 문맥에서 사용되는 바와 같이, "변경된, 조작된 또는 변형된"이라는 용어는 단지 참조 또는 자연적으로 발생된 Cas9 서열과 상이하다는 것을 지칭하며, 구체적인 프로세스 또는 기원에 제한을 두지는 않는다. Cas9 분자는 뉴클레아제 (이중 가닥 핵산의 두 가닥 모두를 절단하는 핵산), 또는 니카제 (이중 가닥 핵산 중 한 가닥을 절단하는 핵산)일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "gRNA 분자" 또는 "gRNA"라는 용어는 Cas9 분자를 표적 핵산으로 표적화할 수 있는 가이드 RNA를 지칭한다. 한 실시양태에서, "gRNA 분자"라는 용어는 가이드 리보핵산을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "gRNA 분자"라는 용어는 gRNA를 코딩하는 핵산을 지칭한다. 한 실시양태에서, gRNA 분자는 비-자연적으로 발생된 것이다. 한 실시양태에서, gRNA 분자는 합성 gRNA 분자이다. 또 다른 실시양태에서, gRNA 분자는 화학적으로 변형된 것이다.
"주형 핵산," "공여자 핵산," 또는 "공여자 폴리뉴클레오티드"란, 표적 위치의 구조를 변경시키기 위해 뉴클레아제 (예컨대, Cas9 분자)와 함께 사용될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 한 실시양태에서, 주형 핵산은 전형적으로 절단 부위(들)에서, 또는 그 부근에서 주형 핵산의 서열 중 일부 또는 그들 모두를 가지도록 변형된다. 한 실시양태에서, 주형 핵산은 단일 가닥이다. 대안적 실시양태에서, 주형 핵산은 이중 가닥이다. 한 실시양태에서, 주형 핵산은 DNA, 예컨대, 이중 가닥 DNA이다. 대안적 실시양태에서, 주형 핵산은 단일 가닥 DNA이다. 한 실시양태에서, 주형 핵산은 RNA, 예컨대, 이중 가닥 RNA 또는 단일 가닥 RNA이다. 한 실시양태에서, 주형 핵산은 외인성 핵산 서열이다. 또 다른 실시양태에서, 주형 핵산 서열은 내인성 핵산 서열, 예컨대, 내인성 상보성 영역이다. 한 실시양태에서, 주형 핵산은 핵산 서열의 (+) 가닥에 상응하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서, 주형 핵산은 핵산 서열의 (-) 가닥에 상응하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다.
"상동성 지정 수복" 또는 "HDR"은 상보성 핵산 (예컨대, 내인성 상보성 서열, 예컨대, 자매 염색분체, 또는 외인성 핵산, 예컨대, 주형 핵산)을 사용하여 세포에서 DNA 손상을 수복시키는 프로세스를 지칭한다. 정규 HDR은 전형적으로 이중 가닥 파단에 상당한 절제가 있고, 이를 통해 DNA의 적어도 하나의 단일 가닥 부위가 형성될 때에 작용한다. 정상 세포에서, HDR은 전형적으로 연속 단계, 예컨대, 파단 인식 단계, 파단 안정화 단계, 절제 단계, 단일 가닥 DNA의 안정화 단계, DNA 교차 중간체 형성 단계, 교차 중간체 분해 단계, 및 라이게이션 단계를 포함한다.
"비상동 말단 연결" 또는 "NHEJ"는 라이게이션 매개 수복 및/또는 비-주형 매개 수복을 지칭하며, 정규 NHEJ (cNHEJ), 대체 NHEJ (altNHEJ), 미세상동성-매개 말단 연결 (MMEJ), 단일 가닥 어닐링 (SSA), 및 합성 의존 미세상동성-매개 말단 연결 (SD-MMEJ)을 포함한다.
"재조합"이란, 두 폴리뉴클레오티드 사이의 유전 정보를 교환하는 프로세스를 지칭하며, 이는 비상동 말단 연결 (NHEJ) 및 상보성 재조합에 의한 공여자 포획을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. "상보성 재조합 (HR)"이란, 예를 들어, 상동성 지정 수복 기전을 통해 세포에서 이중 가닥 파단의 수복이 진행되는 동안 이루어지는 특수화된 형태의 상기 교환을 지칭한다. 이러한 프로세스는 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자의 주형 수복을 위해 "공여자" 분자를 사용하며 유전 정보를 공여자에서 표적으로 전달한다. 상기 전달은 파단 표적과 공여자 사이에 형성되는 이종이중체 DNA의 미스매치 보정, 및/또는 표적의 일부가 되는 유전 정보를 재합성하는 데 공여자가 사용되는 "합성 의존 가닥 어닐링," 및/또는 관련 프로세스를 포함할 수 있다. 상기 특수화된 HR은 종종 공여자 폴리뉴클레오티드의 서열 중 일부 또는 그 모두를 표적 폴리뉴클레오티드 내로 도입시키기 위해 표적 분자의 서열을 변경시킨다.
본 개시내용의 방법에서, 본원에 기술된 뉴클레아제는 미리 결정된 인식 부위에서 표적 서열 (예컨대, 세포 크로마틴)에 이중 가닥 파단을 생성하고, 상기 파단 영역 중의 뉴클레오티드 서열과 상동성을 가지는 "공여자" 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입될 수 있다. 이중 가닥 파단의 존재가 공여자 폴리뉴클레오티드에 의한 게놈 서열의 수복을 촉진시키는 것으로 나타났다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 물리적으로 통합될 수 있거나, 또는 대안적으로 공여자 폴리뉴클레오티드는 상보성 재조합을 통해 파단의 수복을 위한 주형으로서 사용되며, 그 결과로, 공여자에서와 같이 뉴클레오티드 서열 모두 또는 그 일부가 세포 크로마틴 내로 도입된다. 따라서, 세포 크로마틴 내의 제1 서열이 변경될 수 있고, 특정 측면에서, 공여자 폴리뉴클레오티드에 존재하는 서열 (본원에서 "변형 서열"로서 지칭됨)로 전환될 수 있다. 따라서, "치환하다" 또는 "치환"이라는 용어의 사용은 한 뉴클레오티드 서열을 또 다른 것으로 치환하는 것을 나타내는 것으로 이해될 수 있으며, 반드시 한 폴리뉴클레오티드의 또 다른 것으로의 물리적 또는 화학적 치환일 필요는 없다.
II. 뉴클레아제
본 발명의 방법은 주형 핵산 (트랜스진)이 게놈 서열의 수복을 표적화된 방식으로 유도할 수 있도록 세포의 게놈을 전달하기 위해 뉴클레아제를 사용한다. 특정 측면에서, 뉴클레아제는 자연적으로 발생된 것이다. 다른 실시양태에서, 뉴클레아제는 비-자연적으로 발생된 것, 예컨대, 자연적으로 발생된 야생형 뉴클레아제의 조작된 또는 변형된 버전이다.
뉴클레아제로는 Cas 단백질, DNA 서열 특이적 엔도뉴클레아제, RNA 가이드된 DNA 엔도뉴클레아제 (예컨대, Cpf1), 제한 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 호밍 엔도뉴클레아제, TAL 이펙터 뉴클레아제, 및 아연 핑거 뉴클레아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 뉴클레아제로는 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 IV, 및 타입 V 엔도뉴클레아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 뉴클레아제는 CRISPR 뉴클레아제 (예컨대, Cas 뉴클레아제 또는 Cpf1 뉴클레아제)이다. 일부 구체적인 실시양태에서, 뉴클레아제는 Cas9, 예를 들어, 박테리아 (예컨대, S. 피오게네스(S. pyogenes), S. 뉴모니아에(S. pneumoniae), S. 아우레우스(S. aureus), 또는 S. 써모필루스(S. thermophilus))로부터 클로닝 또는 유래된 Cas9이다.
특정 측면에서, 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템이다. 상기 시스템의 RNA 성분을 코딩하는 CRISPR (주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복부) 유전자좌, 및 단백질을 코딩하는 cas (CRISPR-연관) 유전자좌 ([Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575]; [Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496]; [Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7]; [Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1:e60])는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 유전자 서열을 구성한다. 미생물 숙주에서의 CRISPR 유전자좌는 CRISPR-연관 (Cas) 유전자 뿐만 아니라, CRISPR-매개 핵산 절단의 특이성을 프로그램화할 수 있는 비-코딩 RNA 요소의 조합을 함유한다.
타입 II CRISPR은 특징 규명이 가장 잘 이루어져 있는 시스템 중 하나이며, 이는 4개의 연속 단계로 표적화된 DNA 이중 가닥 파단을 수행한다. 제1 단계에서, 프리-crRNA 어레이 및 tracrRNA인 2개의 비-코딩 RNA가 CRISPR 유전자좌로부터 전사된다. 제2 단계에서, tracrRNA는 프리-crRNA의 반복 영역에 하이브리드화되고, 프리-crRNA의, 개별 스페이서 서열을 함유하는 성숙한 crRNA 로의 프로세싱을 매개한다. 제3 단계에서, 성숙한 crRNA:tracrRNA 복합체는 표적 인식을 위한 추가의 필요요건인, crRNA 상의 스페이서와 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 바로 옆의 표적 DNA 상의 프로토스페이스 사이의 왓슨-크릭(Wastson-Crick) 염기쌍 형성을 통해 Cas9를 표적 DNA로 유도한다. 마지막으로, Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에 이중-가닥 파괴를 생성한다.
특정 측면에서, Cas 단백질은 자연적으로 발생된 Cas 단백질의 "기능성 유도체"일 수 있다. 천연 서열 폴리펩티드의 "기능성 유도체"는 천연 서열 폴리펩티드와 정성적으로 공통되는 생물학적 특성을 가지는 화합물이다. "기능성 유도체"는, 상응하는 천연 서열 폴리펩티드과 공통되는 생물학적 활성을 가진다면, 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩티드 및 그의 단편의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 고려되는 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해시킬 수 있는 기능성 유도체의 능력이다. "유도체"라는 용어는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체, 공유 변형물, 및 그의 융합물, 둘 모두를 포함한다. Cas 폴리펩티드 또는 그의 단편의 적합한 유도체로는 Cas 단백질 또는 그의 단편의 돌연변이체, 융합물, 공유 변형물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. Cas 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 Cas 단백질 뿐만 아니라, Cas 단백질 또는 그의 단편의 유도체는 세포로부터 수득될 수 있거나, 또는 화학적으로 또는 상기 두 방법의 조합에 의해 합성될 수 있다. 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하는 세포, 또는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하고, 내인성 Cas 단백질을 더 높은 발현 수준으로 생산하도록, 또는 내인성 Cas와 동일하거나, 또는 상이한 Cas를 코딩하는 핵산인 외래 도입된 핵산으로부터 Cas 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된 세포일 수 있다. 일부 경우에서, 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하지 않고, Cas 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된 것이다.
다른 실시양태에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)일 수 있다. ZFN 및 TALEN은 이종성 DNA-결합 및 절단 도메인을 포함한다. 상기 분자는 널리 공지된 게놈 편집 도구이다. 예컨대, 문헌 [Gai, et al., Trends Biotechnol. 2013 Jul; 31(7): 397-405]를 참조한다.
III. 숙주 세포
게놈이 변형된 임의의 숙주 세포가 본 발명에서 사용될 수 있다. 세포 유형은 세포주 또는 천연 (예컨대, 단리된) 세포, 예컨대, 예를 들어, 1차 세포일 수 있다.
예시하자면, 적합한 세포로는 진핵 (예컨대, 동물, 식물, 포유동물) 세포 및/또는 세포주를 포함한다. 상기 세포 또는 세포주의 비제한적인 예로는 COS, CHO (예컨대, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (예컨대, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), 및 perC6 세포를 포함한다. 특정 측면에서, 세포주는 CHO, MDCK 또는 HEK293 세포주이다. 적합한 세포로는 또한 줄기 세포, 예컨대, 예로서, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 및 중간엽 줄기 세포를 포함한다.
IV. 전달 방법
뉴클레아제, 이들 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 주형 핵산, 및 상기 단백질 및/또는 핵산을 포함하는 조성물은 생체내 또는 생체외에서 임의의 적합한 수단에 의해 임의의 세포 유형 내로 전달될 수 있다.
본원에 기술된 뉴클레아제 및/또는 공여자 구축물 또한 ZFN(들), TALEN(들) 또는 CRIPSR/Cas 시스템 중 하나 이상의 것을 코딩하는 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노 연관 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 또한 미국 특허 번호 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824을 참조할 수 있고, 상기 특허들은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 추가로, 이들 벡터 중 임의의 것은 처리에 필요한 서열들 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 따라서, 하나 이상의 뉴클레아제 및 공여자 구축물이 세포 내로 도입될 때, 뉴클레아제 및/또는 공여자 폴리뉴클레오티드는 동일한 벡터 상에서 또는 상이한 벡터 상에서 운반될 수 있다. 다중 벡터가 사용될 때, 각 벡터는 하나 또는 다중의 뉴클레아제 및/또는 공여자 구축물을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
뉴클레아제 및 공여자 구축물을 코딩하는 핵산을 세포 (예컨대, 포유동물 세포) 및 표적 조직에 도입하는 데 종래 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법이 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 또는 RNA 플라스미드, DNA MC, 네이키드 핵산, 및 전달 비히클, 예컨대, 리포솜 또는 폴록사머와 복합체를 형성한 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은, 세포로의 전달 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 가지는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다.
비-바이러스에 의한 핵산 전달 방법으로는 전기천공, 리포펙션, 미세주사, 바이오리스틱스, 비로좀, 리포솜, 면역리포솜, 다양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 작용제 증진된 DNA 흡수를 포함한다. 예컨대, 소니트론 2000(Sonitron 2000) 시스템 (리치-마(Rich-Mar))을 이용하는 소노포레이션 또한 핵산 전달에 사용될 수 있다.
추가의 예시적인 핵산 전달 시스템으로는 아막사 바이오시스템즈(Amaxa Biosystems: 독일 쾰른), 맥스사이트, 인크.(Maxcyte, Inc.: 미국 메릴랜드주 록빌), BTX 몰레큘러 딜리버리 시스템즈(BTX Molecular Delivery Systems: 미국 매사추세츠주 홀리스튼) 및 코페르니쿠스 쎄타퓨틱스 인크.(Copernicus Therapeutics Inc.) (예를 들어, 미국 특허 번호 6,008,336 참조)에 의해 제공되는 것을 포함한다. 리포펙션은 예컨대, 미국 특허 번호 5,049,386; 4,946,787; 및 4,897,355에 기술되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매되고 있다 (예컨대, 트랜스펙탐(Transfectam).TM. 및 리포펙틴(Lipofectin).TM.). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온 및 중성 지질로는 페이그너(Feigner), WO 91/17424, WO 91/16024의 것을 포함한다.
예컨대, 면역지질 복합체와 같은, 표적화된 리포솜을 비롯한, 지질:핵산 복합체 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [Crystal, Science 270:404-410 (1995)]; [Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995)]; [Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)]; [Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994)]; [Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995)]; [Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 번호 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787 참조).
조작된 ZFP, TALE 및/또는 CRISPR/Cas 시스템을 코딩하는 핵산 전달을 위해 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템을 사용하는 것은 바이러스를 체내 특정 세포로 표적화하고, 바이러스 페이로드를 핵으로 수송하는 데 고도로 진화된 프로세스를 이용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접 투여될 수 있거나 (생체내), 시험관내에서 세포를 처리하는 데 사용될 수 있고, 변형된 세포는 환자에게 투여된다 (생체외).
뉴클레아제 및/또는 공여자 구축물을 함유하는 벡터 (예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포솜 등) 또한 생체내 세포 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 보통 분자가 최종적으로는 혈액 또는 조직 세포와 접촉하도록 하는 데 사용되는 경로들 중 임의의 경로에 의해 이루어진다. 상기 핵산에 대한 적합한 투여 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능하고, 널리 공지되어 있고, 비록 특정 조성물을 투여하는 1 초과의 경로가 사용될 수 있지만, 대개는 특정 경로가 다른 경로보다 더욱 즉각적이고, 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
뉴클레아제 코딩 서열 및 공여자 구축물은 동일한 또는 상이한 시스템을 사용하여 전달될 수 있다는 것은 자명할 것이다. 예를 들어, 뉴클레아제 및 공여자는 동일한 DNA MC에 의해 운반될 수 있다. 대안적으로, 공여자 폴리뉴클레오티드는 MC에 의해 운반될 수 있고, 하나 이상의 뉴클레아제는 표준 플라스미드 또는 AAV 벡터에 의해 운반될 수 있다. 추가로, 상이한 벡터는 동일한 또는 상이한 경로 (근육내 주사, 꼬리 정맥 주사, 다른 정맥내 주사, 복강내 투여 및/또는 근육내 주사)에 의해 투여될 수 있다. 벡터는 동시에 또는 임의의 순차적인 순서로 전달될 수 있다.
본원에 개시된 방법을 사용한 유전자 조작의 효과는 예를 들어, 관심 조직으로부터 단리된 RNA (예컨대, mRNA)의 노던 블롯에 의해 관찰될 수 있다. 전형적으로, mRNA가 존재하거나, 또는 mRNA 양이 증가하였다면, 상응하는 트랜스진이 발현하였다고 추정할 수 있다. 유전자 및/또는 코딩 폴리펩티드 활성을 측정하는 다른 방법이 사용될 수 있다. 사용되는 기질, 및 반응 생성물 또는 부산물의 증가 또는 감소를 검출하는 방법에 따라, 상이한 유형의 효소 검정법이 사용될 수 있다. 추가로, 폴리펩티드 발현 수준은 면역화학적으로, 즉, ELISA, RIA, EIA 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 항체 기반 검정법에 의해, 예컨대, (염색 또는 웨스턴 블롯팅을 이용하는) 전기영동 검출 검정법에 의해 측정될 수 있다.
V. 온도 이동
본 발명은 뉴클레아제(들) 및/또는 공여자 핵산 도입 후, 숙주 세포에 저온 충격의 기간을 가하는 단계를 포함한다. 세포는 형질감염 후 수분 이내에 37℃에서 더 낮은 온도로 이동될 수 있거나 (저온 충격), 더 낮은 온도로 이동시키기 전에 단기간 동안 (예를 들어, 1일) 37℃에서 유지될 수 있다.
세포에 저온 충격을 가하는 기간은 그 범위가 수시간 내지 수일일 수 있다. 특정 측면에서, 세포는 1 내지 4일 동안 저온 충격을 받는다. 저온 충격 기간 또한 뉴클레아제의 도입이 이루어지는 세포 유형에 따라 달라지게 된다는 것도 자명할 것이다.
유사하게, 세포가 저온 충격을 받게 되는 온도는 세포 분열은 감소시키지만, 그 온도에서 뉴클레아제(들)가 발현되고/거나, 활성을 띠는 임의의 온도이다. 적합한 온도는 숙주 세포 유형에 따라 달라질 것이다. 포유동물 세포의 경우, 저온 충격 온도는 35℃, 34℃, 33℃, 32℃, 31℃, 30℃, 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 및 심지어 더 낮은 온도를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가로, 온도는, 세포가 분열하지 않거나, 또는 감소된 속도로 분열하도록 하는 데 충분히 낮은 온도로 유지되는 한, 저온 충격을 가하는 기간 동안 달라질 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전역에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원들의 내용은 본원에서 참조로 명확하게 포함된다.
실시예
실시예 1
저온 충격이 유도 만능 줄기 세포의 유전자 편집을 위한 상동성 지정 수복의 빈도를 증가시킨다.
도입
주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복부 (CRISPR) 기술의 가장 유망한 적용 중 하나는 인간 질환의 유전적 모델 생성에서의 그의 사용이다. CRISPR 기술은 질환 표현형 연구를 위해 정상적인 개체로부터 단리된 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 상에서, 또는 추정의 질환 유발 돌연변이를 야생형으로 복귀시키기 위해 질환을 앓는 환자로부터 유래된 IPSC 상에서 사용될 수 있다 (1, 2). 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)와 비교하여 CRISPR 접근법은 비교적 강건하기 때문에, 그러한 이유에서 시험은 단백질 코딩 돌연변이 뿐만 아니라, 게놈 와이드 연관 연구에 의해 생성된 실험적 데이터 및 다른 비-코딩 돌연변이에 쉽게 접근할 수 있었다 (3, 4). 수많은 성공에도 불구하고, CRISPR 유도 이중 가닥 파단을 수복시키는 데 외인성 공여자 DNA가 사용되는 프로세스인 상동성 지정 수복 (HDR)은 형질전환된 암 세포주보다 iPSC에서 덜 효율적이라는 사실에 기인하여 iPSC에서의 유전자 편집은 도전과제가 된다 (5-8).
낮은 HDR율을 극복하기 위해, 연구원들은, 예컨대, 효과적이지만, 외래 DNA를 게놈 내로 삽입시키는 원치않는 결과를 남기는 CRISPR 플라스미드 및/또는 공여자 DNA 상의 항생제 내성 유전자 (9)를 비롯한, 여러 전략법을 채택하였다. 양성 선별 마커와, 선별가능한 마커의 절제를 허용하는 기술, 예컨대, Cre/lox 시스템 또는 풋프린트-프리 피기BAC(PiggyBAC) 트랜스포존과의 조합은 주목할 만한 개선을 나타내지만, 클론 선별은 2 단계 프로세스가 되기 때문에, 타임라인을 연장시킨다 (2, 10). 단일 가닥 올리고 DNA 뉴클레오티드 (ssODN) 공여자 분자를 사용하는 방법은 무작위 통합 및 원치않는 '풋프린트'와 관련하여, 더욱 큰 이중 가닥 DNA 분자가 제시하는 문제들을 피하지만, 상기 방법에서는 다시 비교적 낮은 빈도의 성공적인 수복 및 이중 가닥 파단 부위 주변의 서열 전환이 쉽게 이루어진다 (7, 11). 희귀 클론의 단리가 어렵다는 장애와 싸우기 위해, 미야오카(Miyaoka)와 동료들은 극도록 희귀한 클론을 농축시키기 위해 액적 디지털 PCR, 클론 풀, 및 친계 선별을 이용하는 전략법을 고안하였다 (12). HDR율을 증가시키는 추가 전략법으로는 세포 주기 진행을 억제시키는 공지된 화학적 억제제를 이용하여 세포 주기 동기화를 유도함으로써 Cas9 RNP 복합체의 뉴클레아제로의 전달을 타이밍하는 것을 포함한다 (13). 여기서, 동기화된 HEK293 세포에서는 최대 38%까지 HDR의 주목할 만한 증가가 달성될 수는 있지만, 인간 1차 섬유모세포 또는 H9 인간 배아 줄기 세포에서는 동기화가 최소 효과를 보였다. ssODN 구조 및 조성에 관한 세부 사항들 또한 HDR율에 영향을 주는 것으로 나타났다. 린(Lin) 등은 적어도 60개의 뉴클레오티드로 이루어진 상동성 아암을 가지는 올리고가 가장 효과적이었지만, 가닥 상보성이 요인은 아니라는 것을 발견하게 되었다. 리차드슨(Richardson) 등에 의해 진행된, 공여자 올리고의 구조가 HEK293 세포에서 HDR에 어떻게 영향을 주는지에 관한 더욱 상세한 연구는 Cas9 RNP-dsDNA 복합체에 관한 시험관내 결합 연구로부터 얻은 식견을 이용하였다. 그들은 GFP 리포터 검정법을 이용하여, PAM 부위와 비교하여 더 짧고, (+) 가닥 (즉, 비-표적 가닥)과 상보적인 비대칭 공여자 올리고가 HDR을 촉진시키는 데 있어서 대칭 공여자 올리고보다 더 효과적이었다는 것을 입증하였다 (14). 파켓(Paquet) 등에 의한 iPSC에서 HDR을 최적화시키는 것에 관한 연구에서는 표적 가닥 (-)에 상보적인 올리고를 이용함으로써 의도된 돌연변이의 효율적인 삽입이 달성될 수 있고, 의도된 돌연변이 통합 빈도는 CRISPR 절단 부위로부터의 거리에 의존하였다는 것이 밝혀졌다. HDR의 충실도 또한 CRISPR 인식 서열을 파괴시킨 올리고 내로 침구 염기 변이를 도입시킴으로써 증가될 수 있다 (15).
본 발명자들은 전달, CRISPR 모달리티, 및 공여자 올리고 디자인의 최적의 조합을 결정하기 위해 iPSC에서 유전자 편집 단계에 관한 체계적인 평가를 수행하였다. 이어서, 본 발명자들은 중간 정도의 '저온 충격'이 HDR을 수행할 수 있는 세포의 능력에 미치는 효과를 시험하였다. 본 발명자들의 최적화된 방법은, Cas9 코딩 mRNA, 표적 가닥 (-)에 상보적인 대칭 공여자 올리고, 및 재편집을 막는 침묵 변이와 함께, 큰 RNA 분자 전달을 위해 디자인된, 지질로 이루어진, 본 발명자들의 신규한 조합을 통해 10-30% 효율로 원하는 유전자 변경을 게놈 내로 성공적으로 도입시킬 수 있다. 세포를 32℃의 단기간의 '저온 충격'에 추가로 노출시키는 것은 완벽한 HDR의 양을 증가시킬 수 있고, 37℃에서 수복율이 낮게 관찰되는 경우에는 2 내지 10배 정도까지 증가시킬 수 있다.
방법 및 물질
1) 세포주 및 세포 배양물
인간 mc-iPS 세포는 시스템 바이오사이언시스(System Biosciences)로부터 입수한 것이고 (SC301A-1), 이를 매일 배지를 교체해주면서, mTeSR 배지 (스템 셀 테크놀러지즈(Stem Cell Technologies)) 및 50 유니트/ml 페니실린-스트렙토카이신 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)) 중 마트리겔(Matrigel) (BD 바이오사이언스(BD Bioscience) 코팅된 플레이트 상에서 유지시켰다 (Ludwig, T. E., et al. (2006). "Feeder-independent culture of human embryonic stem cells." Nat Methods 3(8): 637-646). 계대접종을 위해, 세포를 PBS로 세척하고, 37℃에서 5 min 동안 어큐타제(Accutase) (써모 피셔 사이언티픽)로 처리하였다. 세포를 mTeSR 배지 중에 재현탁시키고, 80 g로 5 min 동안 원심분리시키고, 세포 펠릿을, 10 μM ROCK 억제제(ROCK Inhibitor) Y-27632 (케이만 케미컬(Cayman Chemical))로 보충된 mTeSR 배지 중에 다시 플레이팅시켰다.
2) CRISPR 및 Cas9 시약.
도엔히(Doench) 알고리즘 (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/) 및 장(Zhang) 실험실 CRISPR 디자인 도구 (http://crispr.mit.edu)를 이용하여 CRISPR 가이드 RNA를 디자인하였다. 가이드 서열을 플라스미드 pX458 (진스크립트(GenScript))로 서브클로닝하거나, 또는 IVT sgRNA (써모 피셔 사이언티픽)로서 합성하였다. 진아트(GeneArt)™ 플래티넘(Platinum)™ Cas9 뉴클레아제는 써모 피셔 사이언티픽으로부터 입수하였고, Cas9 mRNA (5 meC, Ψ)는 트리링크 바이오테크놀러지즈(TriLink BioTechnologies)로부터 입수하였다. 돌연변이 양측 모두에 상보성 게놈 측면 서열과 함께, 올리고뉴클레오티드 가운데 표적 돌연변이를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (ssODN)로서 수복 주형 (울트라머(Ultramer), IDT)을 디자인하였다 ([Miyaoka, Chan et al. 2014], [Richardson, Ray et al. 2016]). 일부 ssODN 디자인에서는 침묵 돌연변이 또한 가이드 RNA 결합 서열 및 PAM 부위에 도입하였다. 프라이머(PRIMER) 3을 사용하여 PCR 프라이머를 디자인하였고, 프라이머는 시그마(Sigma)로부터 구입하였다. 프라이머, 프로브 및 올리고뉴클레오티드 공여자의 서열에 대해서는 표 1을 참조한다.
<표 1>
본 연구에서 사용된 gRNA 및 올리고뉴클레오티드
3) 형질감염
mc-iPSC에서의 Cas9 mRNA 및 IVT gRNA의 지질 기반 형질감염의 경우, 방법은 최소로 변형된 IVT gRNA 및 Cas9 단백질 형질감염과 유사하였다 (보충 방법 참조). 구체적으로, 480 ng의 IVT gRNA 및 2 ㎍의 Cas9 mRNA를 먼저 50 ㎕의 옵티MEM(OptiMEM) 배지 중에서 혼합한 후, 2.5 ㎕의 mRNA-인 스템(mRNA-In Stem) 또는 에디트-프로(Edit-Pro)™ (MTI-글로벌스템(MTI-GlobalStem))를 첨가하였다. 상동성 지정 수복 실험을 위해, 지질 첨가 이전에 다양한 양의 ssODN을 복합체에 첨가하였다. 형질감염 효율을 모니터링하기 위해 100 ng의 GFP mRNA 또한 각 혼합물에 스파이킹하였다. 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 48 h 동안 인큐베이션시킨 후, 이어서, 세포를 게놈 DNA 추출을 위해 수거하였다.
4) 게놈 DNA 추출 및 편집된 영역의 PCR 증폭
형질감염된 세포로부터의 게놈 DNA 추출을 위해, 각 웰로부터 배지를 흡인시키고, 세포를 37℃에서 10 min 동안 250 ㎕의 어큐타제 (써모 피셔 사이언티픽)로 처리하였다. 750 ㎕의 mTeSR 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포 현탁액을 1.5 ml 에펜도르프(Eppendorf) 튜브로 옮기고, 1,000 g로 5 min 동안 회전시켰다. DN이지 블러드 & 티슈 키트(DNeasy Blood & Tissue Kit) (퀴아젠(QIAGEN))를 사용하여 게놈 DNA를 추출하고, Q5 폴리머라제 (NEB) 및 표적 특이적 프라이머를 사용하는 PCR을 위해 100 ng의 게놈 DNA를 사용하였다 (표 1). 구체적으로, 프라이머 Camk2D-F 및 Camk2D-R을 사용하여 CAMK2D 유전자좌의 PCR 증폭을 수행하였다. TGFBR1 유전자좌의 PCR 증폭은 프라이머 TGFβR1-F 및 TGFβR1-R을 사용하여 수행하였다. 써모사이클러 조건은 98℃에서 30s 동안 1 사이클, 98℃에서 10s 동안, 63℃에서 30s 동안, 72℃에서 1분 동안 31 사이클, 및 72℃에서 1 min 동안 1 사이클로 세팅하였다. 마지막으로, PCR 반응을 4℃에서 유지시켰다.
5) 차세대 서열분석 및 분석
라이브러리 제조를 위해 2 단계 클린업으로 고분자 (HMW) 게놈 DNA 및 잔류 프라이머를 제거함으로써 PCR 앰플리콘(Amplicon)을 세정하였다. 세정된 상청액은 새 플레이트로 옮겨 놓으면서, 0.6 v/v 비로 앰퓨어 XP(Ampure XP) 비드 (베크만 쿨터(Beckman Coulter))를 첨가함으로써 HMW DNA를 제거하였다. 0.2 v/v 앰퓨어 XP 비드를 옮겨 놓은 상청액에 첨가하여 프라이머를 제거하고, 다시 투명해질 때까지 자석 위에 배치시킨 후, 상청액을 폐기하였다. 비드를 80% EtOH로 2x 세척하고, 대기 건조시키고, 20 ㎕ H2O 중에 재현탁시켜 DNA를 용출시켰다. 생성물을 테이프스테인션 HSD5000(Tapestation HSD5000) (애질런트 테크놀러지즈(Agilent Technologies))에 의해 그 크기에 대하여 모니터링하고, 큐비트 HS DNA(Qubit HS DNA) (인비트로겐(Invitrogen))를 이용하여 정량화하였다. 제조사의 표준 시약 부피의 절반량의 용법에 따르기 위해 변형된 텍스테라 XT(Nextera XT) 키트 (일루미나(Illumina))에 대해 세정된 PCR 생성물을 사용하였다. 샘플을 일루미나 표준 인덱싱 키트를 이용하여 최대 384개의 고유 i5/i7 조합으로 고유하게 인덱싱하였다. 가열된 리드를 이용하여 72℃에서 3 min 동안, 98℃에서 1 min 동안, 이어서, 98℃에서 30s 동안, 55℃에서 30s 동안, 72℃에서 1min 동안 12-14 사이클, 이어서, 72℃에서 5 min 동안 최종 신장으로 증폭을 수행한 후, 이어서, 4℃로 냉각시켰다. 상기 기술된 바와 같이, 동일한 앰퓨어 XP 비드 프로토콜에 따라 라이브러리를 크기 선별하고, 15 ㎕ H2O 중에서 용출시켰다. 생성물을 테이프스테인션 HSD1000 (애질런트(Agilent)) 상에서 전개시키고, ABI용 KAPA 라이브러리 정량화(KAPA Library Quantification) 키트 (카파 바이오시스템즈(Kapa Biosystems))를 사용하여 qPCR에 의해 정량화하였다. 일루미나용 KAPA 라이브러리 정량화 데이터 분석 템플레이트(KAPA Library Quantification Data Analysis Template) (카파 바이오시스템즈)에 따라 라이브러리를 각각 TE (pH 8.0) 중 4 nM으로 정규화시키고, 부피에 의해 적절한 비율로 풀링하였다. 라이브러리를 변성시키고, 표준 일루미나 프로토콜에 따라 12 pM으로 희석시키고, 1% v/v PhiX 컨트롤을 그 안에 스파이킹하였다. 전개 파라미터는 각각 8 bp의 이중 인덱스부착된 150 bp 쌍 형성 단부로 설정하였고, MiSeq 300v2 시약 키트 (일루미나)를 사용하였다. MiSeq 리포터(MiSeq Reporter) v2.6 또는 bcl2fastq v2.17을 사용하여 샘플을 역다중화시켰다. 리드의 역이중화 후의 가이드 부위에서의 표적 커버리지를 클론 샘플에 대해서는 ~300x, 및 다양한 비클론 집단 평가를 위해서는 3,000x 최소로 설정하였다.
사내 개발된 파이프라인을 이용하여 NGS 데이터 분석을 수행하였다. 간략하면, PRINSEQ를 사용하여 쌍 형성 단부 리드에 대한 품질 필터링을 수행하였다. 이어서, 필터링된 리드를 BWA를 이용하여 참조 게놈에 대해 정렬시킨 후, indel 검출을 증진시키기 위해 ABRA (어셈블리 기반 재정렬기)를 이용하여 재정렬하였다. 품질 보증을 위해, 본 발명자들은 앰플리콘에서의 커버리지 깊이를 연구하였고, 삽입 및 결실 빈도에 대해 전체 앰플리콘 영역을 조사하였다. CRISPR 부위에서의 indel 빈도 계산을 위해, 본 발명자들은 표적 윈도우로서 sgRNA 서열 (18-20개의 염기)을 사용하여 상기 윈도우에 걸쳐 있는 야생형 리드 및 indel 리드의 개수를 계수하였다. 추가로, 점 돌연변이와 상관없이 indel 리드는 상기 윈도우 내부에 적어도 하나의 삽입된 또는 결실된 염기를 가져야 하는 반면, 야생형 리드는 상기 윈도우 내에 indel을 가지지 않는다. 전체 indel 백분율(%) 이외에도, 프레임내 indel의 백분율(%)을 계산하여 indel의 파괴성도 사정하였다 (Mose, L. E., et al. (2014). "ABRA: improved coding indel detection via assembly-based realignment." Bioinformatics 30(19): 2813-2815). Indel 길이 히스토그램 뿐만 아니라, 모든 다른 차트도 R을 사용하여 플롯팅하였다. 본 발명자들은 또한 sgRNA 가이드 영역 및 그의 측면 영역에서의 점 돌연변이 빈도도 조사하였다. 상동성 지정 수복 (HDR) 프로젝트를 위해, 본 발명자들은 올리고 타입을 분류하여 HDR 효율을 사정하였다.
6) CAMK2D 야생형 및 돌연변이 서열을 검출하기 위한 ddPCR 검정법
QX200TM 액적 디지털 PCR 시스템 (바이오-래드 라보라토리즈(Bio-Rad laboratories: 미국 캘리포니아주))을 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 프라이머 익스프레스(Primer Express)를 사용하여 CAMK2D 야생형 및 돌연변이 서열 검출을 위한 ddPCR 검정법을 디자인하고, 라이프 테크놀러지즈(Life Technologies) (라이프 테크놀러지즈: 미국 캘리포니아주)로부터 주문하였다. 표준 프로토콜을 사용하여 하기와 같이 ddPCR 반응물을 어셈블리하였다. 프로브용 ddPCR 슈퍼(ddPCR Super) 믹스 (dUTP 부재) (바이오-래드 라보라토리즈: 미국 캘리포니아주)를 160 ng의 샘플 게놈 DNA, 1 ㎕의 20x FAM 검정 및 1 ㎕의 20x VIC 검정 (1x CAMK2D-ddPCR 프라이머 F & CAMK2D-ddPCR 프라이머 R 각각 900 nM, 1x 프로브 각각 250 nM), 5 유니트의 제한 효소 BamHI-HF® (뉴잉글랜드 바이오랩스(뉴잉글랜드: 미국 매사추세츠주)), 및 최종 반응 부피 20 ㎕의 물과 함께 조합하였다. QX200 액적 발생기(QX200 Droplet Generator)를 이용하여 반응물을 대략 20,000개의 1-나노리터 액적으로 전환시키고, 상기 슈퍼 믹스에 대한 제조사의 권고 사항에 따라 열 사이클링하기 위해 96-웰 플레이트로 옮겨 놓았다. 열 사이클링 후, QX200 액적 판독기(QX200 Droplet Reader) 상에서 액적을 판독하고, 형광 진폭에 기초하여 양성 또는 음성으로 배정하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 1에 열거되어 있다.
7) 형질감염된 세포에 대한 "저온 충격" 실험
형질감염 하루 전, mc-IPSC를 형질감염 섹션에 기술되어 있는 바와 같이 24 웰 플레이트에 시딩하고, 4개 군으로 나누고 (P1-P4), P1 군 내지 P3 군은 37℃에서 유지시키고, P4 군은 32℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 기술된 바와 같이, '에디트-프로(Edit-Pro)'를 이용하여 IVT gRNA/Cas9 mRNA 및 ssODN으로 형질감염시켰다. 형질감염 후, P1 군은 수거할 때까지 37℃에서 유지시키고, 나머지 군들은 수거할 때까지 32℃로 옮겨 놓았고, 단, 예외적으로 P3 군은 형질감염 후 24시간째에 37℃로 다시 이동시켰다. 세포를 기술된 바와 같이, 48시간 경과 후 게놈 DNA 단리를 위해 수거하고, ddPCR 또는 NGS에 의해 Indel 형성 또는 HDR을 측정하였다.
8) 추가의 형질감염 방법
mc-iPSC에서의 DNA의 지질 기반 형질감염을 위해, 형질감염 하루 전, 세포를 마드리갈(Madrigal) 코팅된 24-웰 플레이트에 웰당 1x105개로 시딩하였다. 형질감염 당일, 1 ㎍의 pX458-CRISPR DNA를 50 ㎕의 옵티MEM 배지 중에 희석한 후, 2 ㎕의 DNA-인® 스템 형질감염 시약 (MTI-글로벌스템)을 첨가하였다. 상동성 지정 수복 실험을 위해, 지질 첨가 이전에 다양한 양의 ssODN을 혼합물에 첨가하였다. 샘플을 온화하게 혼합하고, 실온에서 15 min 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 전체 혼합물을 세포에 한 방울씩 적가하였다. 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 48 h 동안 인큐베이션시킨 후, 이어서, 세포를 게놈 DNA 추출을 위해 수거하였다.
mc-iPSC에서의 IVT gRNA 및 Cas9 뉴클레아제의 지질 기반 형질감염의 경우, 방법은 최소로 변형된 DNA 형질감염과 유사하였다 (Liang, X., et al. (2015). "Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection." J Biotechnol 208: 44-53). 구체적으로, 480 ng의 IVT gRNA 및 2 ㎍의 Cas9 뉴클레아제를 먼저 50 ㎕의 옵티MEM 배지 중에서 혼합하고, 실온에서 10 min 동안 유지시켜 안정적인 RNP 복합체를 형성한 후, 2.5 ㎕의 mRNA-인 스템 또는 에디트-프로 (MTI-글로벌스템)를 첨가하였다. 상동성 지정 수복 실험을 위해, 지질 첨가 이전에 다양한 양의 ssODN을 복합체에 첨가하였다. 형질감염 효율을 모니터링하기 위해 100 ng의 GFP mRNA 또한 각 혼합물에 스파이킹하였다. 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 48 h 동안 인큐베이션시킨 후, 이어서, 세포를 게놈 DNA 추출을 위해 수거하였다.
ssODN 포함 또는 부재의 pX458 CRISPR 플라스미드의 뉴클레오펙션을 위해, 전면생장률이 60-70%에 도달할 때까지, mc-iPSC를 먼저 마트리겔 코팅된 10 mm 디쉬에서 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 모든 세포가 해리될 때까지, 37℃에서 5-8 min 동안 3 ml의 어큐타제 (써모 피셔 사이언티픽)로 처리하였다. 세포를 mTeSR 배지 중에 재현탁시키고, 계수하였다. 이어서, 세포를 15 ml 튜브로 옮겨 놓고, 80 g로 5 min 동안 스핀 다운시켰다. 상청액을 제거한 후, 세포를 P3 또는 P4 뉴클레오펙션 용액 (론자(Lonza: 스위스 바젤)) 중에 1x107/ml로 재현탁시켰다. 20 ㎕의 세포 현탁액을 튜브로 옮겨 놓고, 1 ㎍의 pX458-CRISPR을 각 튜브에 첨가하였다. 상동성 지정 수복 실험을 위해, 다양한 양의 ssODN 또한 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 기포가 발생하지 않도록 주의를 기울이면서, 현탁액을 8 웰 스트립 (론자: 스위스 바젤)의 각 웰로 옮겨 놓고, 프로그램 CM-113 또는 CE-118을 이용하여 아막사™ 4D-뉴클레오펙터™ (론자: 스위스 바젤) 사용하여 전기천공시켰다. 뉴클레오펙션된 세포를, 각 웰에 10 μM의 ROCK 억제제 Y-27632와 함께 500 ㎕의 미리 가온된 mTeSR 배지를 함유한 마트리겔 코팅된 24-웰 플레이트의 개별 웰 내로 직접 플레이팅하였다. 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 48 h 동안 인큐베이션시킨 후, 이어서, 세포를 게놈 DNA 추출을 위해 수거하였다.
mc-iPSC에서의 IVT gRNA 및 Cas9 단백질의 뉴클레오펙션의 경우, 방법은 최소로 변형된 DNA 뉴클레오펙션과 유사하였다. 구체적으로, 480 ng의 IVT gRNA 및 2 ㎍의 Cas9 단백질을 먼저 최종 부피 5 ㎕로 옵티MEM 배지 중에서 함께 혼합하고, 실온에서 10 min 동안 유지시켜 안정적인 RNP 복합체를 형성하였다. 상동성 지정 수복 실험을 위해, 다양한 양의 ssODN 또한 복합체에 첨가하였다. 복합체를 P3 또는 P4 뉴클레오펙션 용액 중 20 ㎕의 세포 현탁액으로 옮겨 놓고, 상기 기술된 바와 같이, 프로그램 CM-113 또는 CE-118을 이용하여 아막사™ 4D-뉴클레오펙터™ (론자: 스위스 바젤) 사용하여 전기천공시켰다.
결과
I.
CRISPR
/
Cas9
RNA
모달리티
및 지질
전달 사용시
iPSC에서의
효율적인 HDR.
본 발명자들은 CAMK2D 유전자 내에서 HDR을 생성하는 데 최적인 조건을 찾기 위해 유전자 편집 프로토콜의 여러 측면을 평가하였다. 먼저, 본 발명자들은 PCR 앰플리콘 차세대 서열분석 (NGS)에 의해 검출되는 바에 따르면, 어떤 CRISPR 모달리티 (예컨대, 일체형 플라스미드 DNA, sgRNA 및 Cas9 mRNA, 또는 sgRNA 시험관내 전사 (IVT)/Cas9 리보뉴클레오단백질) 및 전달 방법 (예컨대, 뉴클레오펙션 또는 큰 DNA 및 RNA 분자의 전달 증진을 위해 제제화된 지질)이 CAMK2D 유전자 (도 1a) 내의 2개의 특이적인 위치에서 이중 가닥 파단 개수를 가장 많이 생성하였는지를 측정하였다. 각 모달리티 및 전달 방법에 대한 최상의 NHEJ-유도 indel율은 표 2에 제시되어 있다. 이어서, 최적의 indel 형성을 결정하는 데 사용된 조건의 완전 행렬을 재시험하여 HDR을 촉진시키는 데 최상인 모달리티와 전달의 조합을 결정할 수 있었고, 이 또한 표 2에 제시되어 있다. 본 발명자들은 다중화된 ddPCR 검정법을 이용하여 CRISPR 인식 서열을 파괴시키도록 디자인된 4개의 염기 변이의 도입, 및 대리로, 동일한 올리고 상의 키나제 기능이 소실된 버전의 CAMK2D를 생성하도록 디자인된 특이적 돌연변이의 도입을 측정하였다 (도 1b). 비-HDR 야생형 대립유전자를 특이적으로 검출하는 상이한 프로브를 이용하여 야생형인 편집되지 않은 서열의 양을 측정하였다 (도 1b). 공여자 올리고 디자인은 상동성 아암의 길이와 관련하여 대칭이었고, CRISPR 절단 부위는 가능한 한 의도된 키나제 기능이 소실된 돌연변이에 가깝게 위치하였다. 공여자 서열은 또한 비-표적화 CRISPR 절단 가닥 (+)과 상보적이었다. 올리고에 의해 도입된 4개의 침묵 돌연변이는 4개 위치에서 가이드 CAMK-CR2에 대한 CRISPR 인식 서열을 변경시켰고, 가이드 CAMK-CR1에서 PAM 서열을 돌연변이화시키고, 3개의 서열 변이를 도입하였다. 본 검정법은 상이한 DNA 서열의 두 합성된 단편 모두를 사용하여, 및 HDR 공여자 올리고 서열에 대해 이형접합성 및 동형접합성인 것으로 공지된 HEK293 세포에서 미리 제조된 클론 상에서 입증되었다 (데이터는 제시되지 않음). 모든 비교에 대한 최상의 HDR율은 표 2에 제시되어 있고, 최상의 조합에 대한 데이터는 도 2a에 제시되어 있다. IVT sgRNA/Cas9 mRNA 및 에디트프로TM 지질의 경우, 본 발명자들은 CAMK-CR1에 대해서 전체 대립유전자 중 9%가 공여자 올리고 서열을 도입하였고, CAMK-CR2에 대해서는 상기 대립유전자 중 19%가 도입하였다는 것을 관찰하였다 (도 2b). ddPCR 결과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 형질감염된 iPSC 집단으로부터의 PCR 앰플리콘에 대해 NGS를 수행하였다 (도 2c). CAMK-CR1 및 CAMK-CR2 둘 모두와 함께 진행된 IVT sgRNA/Cas9 mRNA의 경우, 유전자좌로의 성공적인 HDR을 시사하는 것일 수 있는 의도된 염기 변이가 그의 정확한 게놈 좌표에서, 및 ddPCR 검정법에 의해 직접 측정되지 않은 2개의 구아닌 치환을 포함하여, ddPCR에 의해 측정된 것과 가깝게 매칭된 빈도로 관찰되었다. sgRNA 어닐링을 파괴시키도록 디자인된 침묵 변이보다 CRISPR 절단 부위에 더 먼 거리에 있는 상기 두 치환은 더 낮은 빈도로 관찰되었다.
<표 2>
상이한 전달 및 CRISPR 모달리티 조건의 최상의 Indel율 및 HDR율
*** Indel율이 극도로 낮았기 때문에 시험되지 않음.
*** Indel율이 극도로 낮았기 때문에 시험되지 않음.
a. sgRNA CAMK-CR1
b. sgRNA CAMK-CR2
c. sgRNA CAMK-CR1 및 ssODN C-CR2
d. 본 실험에서는 오직 sgRNA CAMK-CR1만 시험되었다.
e. sgRNA CAMK-CR2 및 ssODN C-CR2
f. sgRNA CAMK-CR1은 25.8%의 Indel율을 보였다.
II. '저온 충격'이
HDR율을
증가시킨다.
37℃에서 성장된 유사 세포주보다 32℃에서 성장되고, 유지된 T-항원 온도감수성 불멸화 세포주에서 더욱 효율적으로 HDR이 이루어졌다는 이전 관찰 결과 (데이터는 제시되지 않음)에 기초하여, 본 발명자들은 다양한 32℃ 간격으로 mc-iPS 세포주에 노출시키는 것이 HDR 효율에 영향을 미치는지 여부를 시험하였다. 본 실험의 디자인 및 각 온도에서 ddPCR에 의해 측정된 바에 따른, HDR이 이루어진 결과적인, 전체 대립유전자 대비의 상대적인 백분율이 표 3에 제시되어 있다. HDR에 대한 기준으로서 37℃에서의 일반 배양 조건을 사용하였을 때 (PL1 군), 각각 10 pmole 및 30 pmole 농도에서 HDR 빈도는 가이드 CAMK-CR1의 경우, 7.50% 및 5.0%, 및 가이드 CAMK-CR2의 경우, 16.16% 및 8.86%인 것으로 관찰되었다. 형질감염 후 즉시 세포를 32℃로 옮기고, 상기 조건에서 24시간 동안 유지시킨 후, 이어서, 추가의 24시간 동안 그때까지 37℃로 이동시켰을 때 (PL2 군), 본 발명자들은 HDR이 1.8 내지 2.3배로 통계학상 유의적으로 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 효과는 30 pmole 농도에서 더욱 뚜렷하게 나타났고, 이때 상기 농도의 경우, 기준선에서는 HDR 효율이 더 낮은 것으로 관찰되었다. 형질감염 후 48시간째에 세포를 32℃에 노출시켰을 때에도 (PL3 군) HDR을 2.0 내지 3.6배 증가시키면서, HDR에 대해 통계학상 유의적인 영향을 미쳤고, 이 또한, 상기 효과는 HDR이 기준선에서 더 낮은 조건에서 더욱 뚜렷하게 나타났다.
<표 3>
CAMK2D 유전자좌에서 다양한 온도에서의 CRISPR/ssODN의 HDR 효율
본 실험은 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 상이한 온도에서 수행하였고, HDR 효율은 CAMK2D 유전자좌에서 야생형 및 돌연변이체 서열에 특이적인 프로브를 이용하여 ddPCR에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 3회 수행된 독립 실험 및 8개의 복제본으로부터의, 돌연변이체 대립유전자를 함유하는 액적의 평균 백분율(%) ± 표준 오차이다. 각 gRNA 및 ssODN 처리에 대한 3개의 온도 조건 사이의 HDR 효율 차이의 유의도를 일원 ANOVA에 의해 분석하였다 (a,b,c,d: 일원 ANOVA P<0.0001, 후속 던네트 다중 비교, PL2 대 PL1: P=0.0001, PL3 대 PL1: P=0.0001).
III. '저온 충격' 및 대안적 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 공여자 디자인이 HDR의 효율에 영향을 미친다.
최근 데이터는 정확한 공여자 올리고 디자인이 공여자 올리고 HDR에 극적인 효과를 미칠 수 있다고 제안한다. 더욱 구체적으로, CRISPR 절단 부위와 관련하여 길이가 비대칭이고 (상기 절단 부위에 인접한 쪽이 더 짧고), 비-표적화된 가닥 (초기에 Cas9에 의해 절단되지 않은 가닥)에 대하여 서열 상보성을 가지는 올리고가, CAMK2D 유전자좌 편집을 위해 본 발명자들이 사용한 디자인, 즉, CRISPR 절단 부위 주변에서 대칭이고, 표적화된 가닥에 상보성인 디자인보다 더욱 효율적인 HDR 촉진자이다 (14). 두 디자인을 직접 비교하고, 저온 충격이 HDR에 미치는 효과를 추가로 시험하기 위해, 본 발명자들은 유전자 편집 실험을 디자인하였고, 그에 의해 본 발명자들은 대칭 표적화된 가닥 올리고 공여자 이용시 관찰된 HDR의 양을, 동일한 서열 변경을 도입하기 위해 디자인된 비대칭 비-표적화된 가닥 올리고 공여자 디자인 이용시 관찰된 것과 비교하였다 (도 1b). 본 발명자들은 앰플리콘 기반 NGS에 의해 HDR의 양을 측정하고, 생성된 서열 데이터를 하기와 같은 여러 방식으로 분석하였다: 1) 유전자좌에서의 전체 HDR의 양, 즉, 의도된 변이 모두 또는 그 일부가 존재하는지 여부와 상관없이, 올리고 지정 수복의 양; 2) 6개의 의도된 염기 변이 모두가 무손상인 것인 올리고 지정 수복인 '완벽한 HDR'을 나타낸 HDR의 비율(%); 3) indels에 의해 일단 수복된 후, 재편집된 것으로 추정되는 서열이 전환된 서열 내로 재도입된 경우의 HDR의 비율(%); 및 4) 부분 올리고 지정 수복이 이루어졌고, 이로써, 2 초과의 원위 서열 변이 (의도된 CAMK2 키나제 기능이 소실된 돌연변이)와 같은 서열 손실이 진행된 HDR의 비율(%) (도 3a 및 표 4).
초기에 ddPCR에 의해 관찰된 바와 같이, 기준선 조건에서, 즉, 37℃에서 형질감염되고, 유지된 세포에서는 비록 전반적인 HDR이 더 낮기는 하였지만, 전체 HDR을 촉진시키는 데 있어서 가이드 CAMK-CR1보다는 가이드 CAMK-CR2가 더 효율적이었다 (도 2b 및 도 3a). 모든 온도 조건 및 올리고 농도 간의 전체 HDR의 양 또한 가이드 CAMK-CR1의 경우 유사하였다. 일반적으로, 온도, 가이드 및 올리고 디자인의 모든 비교에 걸쳐서 전체 HDR의 통계학상 유의적인 증가가 관찰되었다 (도 3a 및 표 4). 가이드 CAMK-CR1의 경우, 3개의 온도 조건 간에 걸쳐서 두 올리고 모두에 대한 전체 HDR의 양은 본질적으로 동일하였고, 여기서, 두 올리고 디자인 모두 PL3 온도 조건하에서 전체 HDR은 대략 2.9배 증가한 것이 관찰되었다 (도 3a). CAMK-CR2의 경우, 대칭 올리고, C-CR2에 대한 전체 HDR의 증가 배수는 대략 2.4배였지만, 반응 규모는 대립유전자 중 40%에서 일부 유형의 HDR가 이루어진 것으로 나타났다 (도 3a). 비대칭 디자인, C-CR2의 경우, PL1과 PL3 사이에서 HDR은 총 3.5배 증가한 것이 관찰되었지만, 반응 규모는 대칭 가이드에서 관찰된 것의 대략 절반 정도였다 (도 3a). 그러나, 오직 '저온 충격'의 결과로서 관찰되는 '완벽한' HDR의 양만을 고려하였을 때, 사용된 올리고 유형이 극적인 효과를 미쳤고, 특히, 가이드 CAMK-CR2의 경우에 그러하였고, 여기서, 처음에 두 디자인 사이에 전체 HDR의 차이는 더 높았고, 여기서, 대칭 올리고 디자인이 6개의 뉴클레오티드 변이 모두의 전환을 유도하는 데 우수하였다 (도 3b 및 표 4). 전체 HDR의 양이 모든 온도 조건에 걸쳐 두 올리고 타입에 대해 유사한 가이드 CAMK-CR1의 경우, '완벽한' HDR의 양은 다시 대칭 올리고에 대해 더 컸지만, 차이는 오직 PL3 조건하에서 통계학상 유의적이었다 (도 3b 및 표 4).
<표 4>
NGS에 의해 측정된 바에 따른, mc-iPSC 중 CAMK2D 유전자좌에서의 '저온 충격' 및 ssODN HDR 공여자 디자인이 HDR 효율에 미치는 효과
상기 관찰 결과를 또 다른 유전자좌로 확장시키기 위해, 그리고 '저온 충격' 및 올리고 디자인이 HDR에 미치는 효과를 추가 시험하기 위해, 본 발명자들은 침묵 변이 및 SNP를 TGFRB1 유전자좌 내로 삽입하는 유전자 편집 실험을 디자인하였다. 시험된 두 가이드의 위치는 도 4a에 제시되어 있고, 4개의 공여자 올리고의 서열, 의도된 서열 변경의 위치, 및 그의 가이드 위치와의 관계는 도 4b 및 4c에 제시되어 있다. 가이드 TR-CR2는 의도된 A에서 C로의 서열 변이에 대해 3'으로 대략 31 bp의 절단을 유도하도록 디자인하였다 (도 4b). 대칭 및 비대칭 공여자 올리고 또한 유전자좌에서 가이드 인식 및 재편집을 파괴하도록 디자인된 3개의 추가의 서열 변이를 함유하였다. 상동성 아암의 길이 또한 도 4b에 열거되어 있다. 가이드 TR-CR3은 의도된 C에서 T로의 서열 변이로부터 3'으로 대략 30 bp의 절단을 유도하도록 디자인하였다 (도 4c). TR-CR2 및 그의 ssODN에서와 같이, 전환된 유전자좌의 재편집을 막기 위해 3개의 추가의 침묵 서열 변경 또한 포함시켰다. 상동성 아암의 길이는 가능한 한 가이드 TR-CR2에 대해 사용된 ssODN에 가깝도록 디자인하였다 (도 4c).
IVT sgRNA/Cas9 RNA 지질 포맷을 사용하였을 때, 두 CRISPR 모두 mc-iPSC 세포주에서 indels를 생성하는 데 있어 효율적이었고, 여기서, 수복 올리고 부재시, NGS에 의해 측정된 바에 따르면, indels를 포함하는 대립 유전자의 비율(%)은 TR-CR2의 경우, 92%이고, TR-CR3의 경우, 64%였다. 두 수복 올리고 모두 존재할 때, 가이드 TR-CR2를 통해, 조건 PL1, 37℃에서 대칭 올리고 T-CR2의 경우, 60%, 및 비대칭 디자인의 경우, 42%로 매우 효율적인 전체 HDR율을 얻었다 (도 5a 및 표 5). 가이드 TR-CR3의 경우, 37℃에서 대칭 및 비대칭 디자인에 대해 각각 전체 HDR 백분율(%)은 41% 및 34%인 것으로 관찰되었다 (도 5a 및 표 5).
CAMK2D에 대해 관찰된 바와 같이, 세포를 32℃에서 24시간 (PL2 군) 또는 48시간 (PL3 군) 동안 배양하였을 때, HDR은 증가하였지만; 그러나, 처음에 37℃에서는 HDR율이 비교적 높았지만, 대개는 통계적 유의도에 도달하지 못하였다는 점을 고려해 볼 때, 그 효과는 일반적으로는 극히 작은 것이었다 (도 5a 및 표 5). 그러나, '저온 충격' 효과는 비대칭 올리고 경우에 더욱 뚜렷하게 나타났는데, 여기서, 37℃에서의 '완벽한 HDR'의 양은 대칭 올리고보다 더 적었다. 여기서, 가이드 TR-CR2 및 비대칭 공여자 T-CR2의 경우, 37℃에서 관찰된 전체 HDR의 양 (PL1)이 세포를 32℃에서 48시간 동안 배양하였을 때 관찰된 양 (PL3)과 유사하였을 때, 및 가이드 TR-CR3 및 비대칭 가이드 T-CR3의 경우, PL2 및 PL3 조건, 둘 모두에서 통계적 유의도가 달성되었다 (도 5a 및 표 5). 그러나, 오직 '저온 충격'의 결과로서 뿐만 아니라, 기준선 조건에서 관찰되는 '완벽한' HDR의 양만을 고려하였을 때, 사용된 올리고 유형이 극적인 효과를 미쳤다 (도 5b 및 표 5). 하나 (TR-CR2/PL3)를 제외하면, 모든 비교에 걸쳐, 대칭 공여자 올리고가 '완벽한' HDR 수복을 유도하는 데 있어서 그의 비대칭 카운터파트보다 통계학상 유의적으로 더 우수하였다 (도 5b 및 표 5).
<표 5>
NGS에 의해 측정된 바에 따른, mc-iPSC 중 TGFBR1 유전자좌에서의 '저온 충격' 및 ssODN HDR 공여자 디자인이 HDR 효율에 미치는 효과
IV. '저온 충격'은 기본
HDR율이
더 낮을 때에 더욱 효과적이다.
'저온 충격'이 연구 중인 특정 mc-iPSC 세포주 이외의 세포 유형에서 효과적인지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 표 3의 데이터를 얻는 데 사용된 동일한 CAMK2D 유전자 편집 실험을 HEK293 세포에서 반복하였고, ddPCR을 사용하여 HDR 수준 (표 6) 및 NGS에 의한 특정 HDR 카테고리 (도 6 및 표 7)를 측정하였다. 둘 모두의 CAMK2D sgRNA 및 2개의 공여자 올리고 농도에 대한 기준선 전체 HDR 수준은 37℃에서 대략 1%였다 (표 6, 표 7, 및 도 6). 본 결과는 독립 실험으로 플라스미드 기반 일체형 CRISPR 모달리티 (데이터는 제시되지 않음) 뿐만 아니라, iPSC에 대해 사용된 IVT sgRNA/Cas9RNA 모달리티, 둘 모두를 사용하여 얻었다. 비록 HEK293 세포주가 동일한 상대적인 효율로 형질감염되기는 하였지만 (도 3a 및 데이터는 제시되지 않음), 이는, 전체 HDR 수준이 10 pmole 농도에서 CAMK-CR1 및 CR2에 대해 각각 10% 및 20%를 초과하였던 mc-iPSC 세포주에서 관찰된 것과 대조를 이룬다. 유전자좌 및 세포 유형이 유전자 편집 수준을 결정지을 수 있는 정도는 다른 연구원들에 의해 기술된 바 있다 (8). 그러나, 37℃에서 관찰된 낮은 HDR율에도 불구하고, 24시간 (PL2) 및 48시간 (PL3)인 두 조건 세트 모두, 그러한 조건하에서의 '저온 충격'은 ddPCR에 의해 측정된 바에 따르면, 최상의 sgRNA, CAMK-CR2의 경우, 24시간 및 48시간 조건 둘 모두에서 전체 HDR을 통계학상 유의적으로 6.9배 증가시켰다 (표 6). 두 가이드 모두 및 모든 조건은 '저온 충격'에 대한 반응으로 전체 HDR을 통계학상 유의적으로 증가시켰다 (도 6 및 표 7).
앰플리콘 기반 NGS 및 분석을 통해, 가이드 CAMK-CR2의 경우, PL1 vs PL3 비교를 제외하면, '저온 충격'이 두 가이드 모두에 대하여 전체 HDR을 통계학상 유의적으로 증가시켰다는 것을 확인할 수 있었다. 일반적으로, 두 가이드 모두 및 모든 조건에 대해 '완벽한' HDR의 증가는 5 내지 20배를 초과하였다 (도 6 및 표 7).
<표 6>
HEK293T 세포 중 CAMK2D 유전자좌에서 다양한 온도에서의 sgRNA/ssODN의 HDR 효율
본 실험은 상이한 온도에서 수행하였고, HDR 효율은 CAMK2D 유전자좌에서 야생형 및 돌연변이체 서열에 특이적인 프로브를 이용하여 ddPCR에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 3개의 복제본으로부터의, 돌연변이 함유 액적의 평균 백분율(%) ± SEM이다. 각 gRNA 및 ssODN 처리에 대한 3개의 온도 조건 사이의 HDR 효율 차이의 유의도를 일원 ANOVA에 의해 분석하였다 (a,b,c,d: 일원 ANOVA P<0.0001, 후속 던네트 다중 비교, PL2 대 PL1: P=0.0001, PL3 대 PL1: P=0.0001).
<표 7>
NGS에 의해 측정된 바에 따르면, '저온 충격'이 HEK293T 세포 중 CAMK2D 유전자좌에서의 HDR 효율을 증진시킨다.
V. "저온 충격'은
다분화능
마커의
발현에 영향을 주지 않는다.
mc-IPSC를 저온 기간에 노출시키는 것이 세포가 다양한 세포 계통으로 분화될 수 있는 능력에 영향을 줄 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 '저온 충격' 프로토콜이 HDR율에 영향을 주었는지 여부를 측정하는 데 사용된 것과 동일한 프로세스를 수행하였고, 세포를, 그의 발현이 다분화능을 나타내는 것인 단백질 항원을 인식하는 항체로 염색하였다. 본 연구 결과는 세포를 24 hrs 또는 48 hrs 32℃ 온도 조건에 노출시킴에 따른 결과로, 마커 SSEA3, 나노그 및 OCT4의 발현이 변화하지는 않는다는 것을 입증한다 (도 7a-c).
VI. '저온 충격'은 광범위한 온도 조건에 걸쳐
HDR율을
증가시키는 데 효과적이다.
세포를 32℃ 미만의 온도 조건에 노출시키는 것이 HDR 효율에 미치는 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 앞서 기술된 세포 배양 프로토콜을 반복 실행하되, 단, mc-IPSC를 30℃, 28℃ 뿐만 아니라, 32℃에서 24 h 및 48 hr, 두 기간 모두 그에 노출시켰다.
ddPCR 및 NGS, 둘 모두에 의해 생성된 PCR 앰플리콘을 분석하였다 (표 8, 표 9, 및 도 8). 일반적으로, 전체 HDR의 증가 (표 9 및 도 8) 및 '완벽한' HDR의 증가 (도 8)는 시험된 3개의 온도에 걸쳐 유사하였고, 상기 데이터는 HDR 증가가 32℃ 온도 조건에 의존하지 않는다는 것을 입증한다.
<표 8>
ddPCR에 의해 측정된 바에 따른, mc-iPSC 중 CAMK2D 유전자좌에서의 다양한 온도에서의 HDR 효율.
본 실험은 "물질 및 방법"에 기술되어 있는 바와 같이 상이한 온도에서 수행하였고, HDR 효율은 CAMK2D 유전자좌에서 야생형 및 돌연변이체 서열에 특이적인 프로브를 이용하여 ddPCR에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 2개의 복제본으로부터의, 돌연변이체 대립유전자를 함유하는 액적의 평균 백분율(%) ± 표준 오차이다.
<표 9>
NGS에 의해 측정된 바에 따르면, '저온 충격'이 mc-iPSC 세포 중 CAMK2D 유전자좌에서의 HDR 효율을 증진시킨다.
논의
CRISPR-기반 게놈 조작 방법의 빠른 발전은 상기 기술로부터 최대의 이익을 얻기 위해 애그노스틱하고, 체계적인 평가 프로세스를 필요로 한다. 여기서, 본 발명자들은 mc-iPSC 세포주에서 HDR을 촉진시키는 데 고도로 효과적인 최적화된 CRISPR 모달리티/전달 조합을 보고한다. 이어서, 본 발명자들은 더 낮은 온도에의 노출이 HDR의 효율을 증가시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해 상기 방법을 사용하였고, 24 또는 48시간 동안의 32℃ 또는 '저온 충격'에의 노출이 HDR율을 2배 이상 증가시킬 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 수복 프로세스를 DNA 수복 효소의 화학적 억제하에 비상동 말단 연결로부터 HDR로 '유도하고' (16), 다른 억제제를 사용하여 G2/M 경계에서 세포를 차단하고, 동기화하는 것 (13)을 포함하는, HDR율을 증가시키는 방법을 찾기 위해 상당한 노력을 기울이고 있다는 점을 고려해 볼 때, 본 발명자들의 방법은 적용 범위가 더 광범위할 수 있는, 특히, 유전자 편집이 치료적 환경에서 적용될 수 있는, 더욱 '생리적인" 접근법을 제공한다.
흥미롭게도, '저온 충격' 효과는 더 낮은 HDR율이 관찰될 때 (대립유전자 중 1-20%), 더욱 극적이고, 기본 HDR율이 30% 이상보다 높게 증가함에 따라 감소된다. 이는 적어도 본 접근법으로 변경될 수 있는 대립유전자의 개수에 대한 이론적 한계를 제안하는 것이다. '저온 충격'이 HDR을 증가시키게 하는 정확한 기전에 대해서는 현재 연구되고 있다. 아연 핑거 뉴클레아제가 indel 형성을 증가시키는 것과 유사한 기전이 타당하게 보일 수 있다 (17). 본 발명자들은 매우 효율적인 CRISPR 사용시, CAMK2D 가이드 CAMK-CR1 및 TGFBR1 가이드 TR-CR2 사용시에 관찰된 것과 같이, '저온 충격'이 indel 형성에 미치는 효과는 특히 작다는 것을 관찰하게 된다. 반대로, 절단율 및 indel 형성이 더 낮을 때, HEK293 세포 중 CAMK2D 유전자좌에서 관찰된 것과 같이, 절단율 및 indel 형성 증가는 더욱 뚜렷하게 나타난다. indel 형성 증가는 명백하게 더 높은 HDR율에 기여할 수 있지만, '저온 충격'시 관찰되는 모든 증가에 대한 원인이 될 수 없거나, '완벽한 HDR'이 저온 조건하에서 선호되는 이유를 해명할 수는 없다. HDR율 증가에 기여할 수 있는 것으로서 가능한 기전은 32℃에서 세포를 성장시키는 것이 세포 주기에 영향을 준다는 것이며, 여기서, 더 많은 세포가 G2/M에서 축적되는데; 그러나, 본 발명자들의 초기 관찰 결과는 현재까지 상기 가설을 뒷받침할 수 있는 어떤 세포 주기 효과도 밝혀내지 못했다 (데이터는 제시되지 않음). 제3 및 그 이상의 가능한 기여 인자는 저온이 재조합 중간체를 안정화시키는 작용을 하는 열역학적 효과를 발휘한다는 점이다. 상기 기전을 상세하게 이해하기 위해 현재 연구가 진행되고 있다. 한 가지 잠재된 우려 사항은 '저온 충격'이 다분화능에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 점이다. 다분화능에 대한 3가지 표준 마커인 Oct4, SSEA3, 및 나노그를 검토한 예비 분석 (18,19)은, 비록 장기간 저온에 노출된 경우에는 나노그 발현이 일부 손실될 수 있지만 (도 7), 저온 충격은 문제가 되지 않는다는 것을 시사하고 있다. '저온 충격'이 효과적이며, 세포주 및 적용 전역에 걸쳐 일반화될 수 있다는 것을 보장하기 위해서는 명백하게 더 많은 연구가 요구된다.
본 발명자들은 또한 HDR을 촉진시키는 데 사용되는 공여자 올리고의 구조가 발생하는 HDR의 전반적인 빈도 및 그 유형, 둘 모두에 지대한 영향을 미칠 수 있다고 제시하고 있다. 시험된 두 유전자좌에 걸쳐, 두 올리고 디자인, 대칭 표적 가닥 및 비대칭 비-표적 가닥, 모두 전체 HDR을 높은 수준으로 일으킬 수 있지만, 특히, '저온 충격' 조건하에서는 대칭, 표적 가닥 올리고가 비대칭 비-표적 가닥 올리고보다 더욱 효율적으로 '완벽한 HDR'을 일으켰다. 상기 데이터는 리차드슨 등의 데이터 (14)와는 일치하지 않지만, 본 발명자들의 데이터는, 공여자 올리고가 동일한 가닥으로 디자인된 것인 파켓 등의 데이터 (15)와는 일치한다.
요약하면, 본 발명자들은 HDR 프로세스에 의해 지정 게놈 서열 변경이 효율적으로 이루어진 세포 집단을 수득하기 위해 뉴클레오펙션 또는 선별을 사용할 필요가 없는, iPSC에서 유전자 편집을 수행하기 위한 프로토콜을 개발하였다. 본 발명자들은 또한 더 낮은 온도에의 간단하고, 단기간이며, 생리적인 노출을 도입함으로써 HDR을 효과적으로 증가시킬 수 있으며, 이는 다수의 게놈 조작 적용 전역에 걸쳐 광범위한 유용성을 가지게 될 것이라고 밝혔다.
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ggtttaccat tgcttgttca gag 23
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ctttaggttt accattgctt gttcagagaa caattgcgag aactattgtg ttacaagaaa 60
gcattggcaa aggccgattt ggagaagttt ggaggggcaa atggcgggga gaagaagttg 120
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gaatatctta acagcaactt cttctccccg ccatttgccc ctccaaactt ctccaaatcg 120
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gcattggcaa aggtcgattt ggagaagttt ggagaggaaa gtggcgggga gaagaagttg 60
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Claims (20)
- 세포의 게놈에서 상동성 지정 수복(HDR)의 효율을 증가시키는 방법이며,
(a) 세포 내로 (i) 뉴클레아제; 및 (ii) 게놈 내로 삽입시키고자 하는 변형 서열을 포함하는 공여자 핵산을 도입시키는 단계; 및
(b) 세포에 대해 37℃에서 더 낮은 온도로의 온도 이동을 수행하는 단계를 포함하고,
여기서, 뉴클레아제는 세포의 절단 부위에서 게놈을 절단하고, 공여자 핵산은 증가된 HDR률을 통해 변형 서열을 이용하여 게놈 서열의 수복을 유도하는 것인,
방법. - 제1항에 있어서, 더 낮은 온도가 28℃ 내지 35℃인 방법.
- 제1항에 있어서, 더 낮은 온도가 30℃ 내지 33℃인 방법.
- 제1항에 있어서, 세포를 적어도 24시간 동안 더 낮은 온도에서 성장시키는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
- 제5항에 있어서, 세포가 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 또는 1차 세포로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 뉴클레아제가 Cas 뉴클레아제 또는 Cpf1 뉴클레아제로부터 선택되는 CRISPR 뉴클레아제인 방법.
- 제7항에 있어서, 뉴클레아제가 Cas9 뉴클레아제인 방법.
- 제7항에 있어서, CRISPR 뉴클레아제가 sgRNA와 함께 DNA 포맷 또는 RNA 포맷으로 세포 내로 도입되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, sgRNA가 합성 및 화학적으로 변형된 것인 방법.
- 제9항에 있어서, Cas9 뉴클레아제 및 sgRNA를 코딩하는 DNA가 세포 내로 도입되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, sgRNA/Cas9 RNP가 세포 내로 도입되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, sgRNA/Cas9 mRNA가 세포 내로 도입되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 공여자 핵산이 대칭 상동성 아암을 함유하고, 뉴클레아제에 의해 절단되는 게놈 중 DNA 가닥에 상보적인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상동성 지정 수복(HDR)률이 적어도 1.5배만큼 증가되는 것인 방법.
- 제1항의 방법에 의해 제조된 세포.
- 제16항의 세포를 포함하는 제약 조성물.
- (a) 관심 단백질을 코딩하는 공여자 핵산을 제1항의 방법에 따라 세포 내로 도입시키는 단계; 및
(b) 세포를 대상체 내로 도입시켜 관심 단백질이 대상체에서 발현되도록 하는 단계를 포함하는, 관심 단백질을 필요로 하는 대상체에게 관심 단백질을 제공하는 방법. - 세포 내로 (i) 뉴클레아제; 및 (ii) 대칭 상동성 아암을 함유하고, 뉴클레아제에 의해 절단되는 게놈 중 DNA 가닥에 상보적이고, 절단 부위로부터 10개 초과의 염기쌍만큼 이격되어 있는 위치에 게놈 내로 삽입시키고자 하는 변형 서열을 포함하는 공여자 핵산을 도입시키는 단계를 포함하고, 여기서, 뉴클레아제는 세포의 절단 부위에서 게놈을 절단하고, 공여자 핵산은 증가된 상동성 지정 수복(HDR)률을 통해 변형 서열을 이용하여 게놈 서열의 수복을 유도하는 것인, 세포의 게놈에서 HDR의 효율을 증가시키는 방법.
- 제19항에 있어서, 세포에 대해 37℃에서 더 낮은 온도로의 온도 이동을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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