RS62529B1 - Kompozicije koje sadrže sintetičke polinukleotide koji kodiraju proteine povezane sa crispr i sintetičke sgrnk i postupci upotrebe - Google Patents

Kompozicije koje sadrže sintetičke polinukleotide koji kodiraju proteine povezane sa crispr i sintetičke sgrnk i postupci upotrebe

Info

Publication number
RS62529B1
RS62529B1 RS20211363A RSP20211363A RS62529B1 RS 62529 B1 RS62529 B1 RS 62529B1 RS 20211363 A RS20211363 A RS 20211363A RS P20211363 A RSP20211363 A RS P20211363A RS 62529 B1 RS62529 B1 RS 62529B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
synthetic
synthetic polynucleotide
sgrna
region
gene
Prior art date
Application number
RS20211363A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen G Hoge
Eric Yi-Chun Huang
Tirtha Chakraborty
Original Assignee
Modernatx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52280736&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62529(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Modernatx Inc filed Critical Modernatx Inc
Publication of RS62529B1 publication Critical patent/RS62529B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak je usmeren na kompozicije koje sadrže i postupke upotrebe sintetičkih polinukleotida i kratkih vodećih RNK (sgRNK). Sintetički polinukleotidi su, npr. sintetički modifikovana RNK koja kodira proteine povezane sa CRISPR, npr. dCAS9 i dCAS9-efektorski domen fuzione proteine. Sintetičke sgRNK ciljaju gen od interesa. Sintetički polinukleotidi i sintetičke sgRNK mogu se upotrebljavati za modulisanje transkripcije, npr. u terapeuticima i/ili kliničkim i istraživačkim postavkama.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Bakterijski i arhealni sistemi sa grupisanim kratkim palindromskim ponovcima na jednakim rastojanjima (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats -CRISPR) oslanjaju se na CRISPR RNK (crRNK) u kompleksu sa CRISPR-asociranim (CAS) proteinima kako bi usmerili degradaciju komplementarnih sekvenci prisutnih u invazivnoj virusnoj i plazmidnoj DNK (Mali et al. Science.2013. 339:823-826).
[0003] U CRISPR sistemima tipa II, pre-crRNK se obrađuju trans-aktivirajućom crRNK (tracrRNK) komplementarnom ponovljenim sekvencama u pre-crRNK koja pokreće obradu dvolančanom (ds) RNK-specifičnom ribonukleazom RNazom III u prisustvu CAS9 proteina. CAS9 (ranije CSN1) je ključni protein u CRISPR sistemima tipa II i smatra se da je jedini protein odgovoran za crRNK-vođeno utišavanje strane DNK (Jinek et al. Science. 2012.
337:816-821. Takođe se pretpostavlja da je CAS9 protein uključen i u sazrevanje crRNK i u crRNK-vođenu DNK interferenciju (Jinek et al. Science.2012. 337:816-821.
[0004] Porodica CAS9 endonukleaza može se programirati sa pojedinačnim RNK molekulima za isecanje specifičnih DNK mesta koja se mogu upotrebljavati za razvoj svestranog RNK-usmerenog sistema za generisanje dsDNK prekida za ciljno delovanje na i editovanje genoma (Jinek et al. Science. 2012. 337:816-821. Ova upotreba CAS9 mogla bi poboljšati lakoću projektovanja genoma.
[0005] Church Lab je projektovala bakterijski i arhealni CRISPR sistem tipa II da funkcioniše sa prilagođenom vodećom RNK (gRNK) u humanim ćelijama (Mali et al. Science. 2013.
339:823-826).
[0006] Pokazano je da fuzija CRISPR-asociranog katalitički neaktivnog dCas9 proteina za različite efektorske domene (npr. VP64, p65AD, KRAB, i Mxi1) omogućava represiju ili aktivaciju transkripcije u humanim i ćelijama kvasca, pri čemu mesto isporuke određuje isključivo zajedno eksprimirana kratka vodeća RNK (sgRNK). Kuplovanje dCas9 za transkripcioni represorski domen može utišati ekspresiju više endogenih gena, bez detektabilnih nespecifičnosti (off-targets) što je potvrđeno RNK-seq analizom. (Qi et al. Cell.
2013. 152:1173-1183).
[0007] Jedan primer katalitički neaktivnog Cas9 proteina je mutant (D10A, H840A) Streptococcus pyogenes Cas9 proteina, koji se tipično označava kao dCAS9 (Qi et al. Cell.
2013. 152:1173-1183; Gilbert et al. Cell. 2013. 154:1-10). Opisan je Streptococcus thermophiles Cas9 sa 2 endonukleazna domena i jednom amino-kiselinskom supstitucijom (D31A, H858A) koji je takođe rezultovao katalitički neaktivnim Cas9 (Sapranauskas et al. Nucleic Acids Research. 2011. 39:9275-9282).
[0008] Druge publikacije koje opisuju CRISPR sisteme, Cas9, i dCas9 uključuju sledeće Cong et al (2013); Jinek et al (2012); Lei et al (2013); Gilbert et al (2013); Perez-Pinela et al (2013); Maider et al (2013).
[0009] Pokazano je da određene modifikovane mRNK sekvence imaju potencijal kao terapeutici sa koristima izvan samo mimoilaženja, izbegavanja ili umanjivanja imunskog odgovora. Takve studije su detaljno opisane u publikovanim prijavama koje su istovremeno u postupku, međunarodne publikacije br. WO2012019168 koja je podneta 5. avgusta 2011. godine i međunarodne publikacije br. WO2012045075 koja je podneta 3. oktobra 2011. godine, međunarodne publikacije br. WO2013052523 koja je podneta 3. oktobra 2011. godine.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0010] Prethodno navedeni i drugi ciljevi, svojstva i prednosti biće očigledni iz sledećeg opisa, kao što je ilustrovano na priloženim crtežima u kojima slične referentne karakteristike označavaju iste delove u različitim pogledima. Crteži nisu nužno u proporciji, već je naglasak stavljen na ilustrovanje principa različitih primera izvođenja pronalaska.
SL. 1 je šema sintetičkog polinukleotida iz predmetnog pronalaska.
SL. 2 pokazuje rezultate anti-FLAG Western i imunoprecipitacije izvedene na lizatima HeLa ćelija transfektovanih sa FLAG-označenim Cas9 konstruktima ili kontrolama. SL. 3 pokazuje rezultate Western analize HeLa ćelija koje su transfektovane sa HA-označenom Gilbert Cas9 mRNK upotrebom Trilink-HA-označene Cas9 mRNK kao pozitivne kontrole.
SL. 4 pokazuje rezultate LC-PRM kvantifikacije Cas9 peptida u ćelijskim lizatima HeLa ćelija transfektovanih sa Maeder i Gilbert Cas9 konstruktima nasuprot netretiranim HeLa ćelijama. Svaki grafikon pokazuje kvantifikaciju peptidnog fragmenta Cas9 konstrukta. Slika 4A predstavlja kvantifikaciju GNELALPSK peptida (SEQ ID NO: 120). Slika 4B predstavlja kvantifikaciju YFDTTIDR peptida (SEQ ID NO: 121). Slika 4C predstavlja kvantifikaciju IPYYVGPLAR peptida (SEQ ID NO: 122).
SL. 5 pokazuje rezultate anti-FLAG Western i imunoprecipitacije izvedene na lizatima jetre miševa iz životinja doziranih sa 14ug Cas9 LNP (MC3) ili lažno. WCE = ekstrakt celih ćelija. IP = imunoprecipitacija sa M2-agaroza perlama (Sigma). Lestvica (ladder) = See Blue Plus 2™ prethodno obojeni proteinski marker (LifeTech).
DETALJAN OPIS
[0011] Predmetni pronalazak je zasnovan, barem delimično, na iznenađujućem otkriću da se mRNK mogu eksprimirati u citoplazmi i translocirati u nukleus. mRNK tehnologija iz pronalaska je iznenađujuće pogodna za isporuku unutarćelijskih proteina. mRNK tehnologija iz pronalaska je takođe poželjno pogodna za isporuku više mRNK. Metodologije iz pronalaska izbegavaju ili zaobilaze probleme povezane sa konvencionalnim pristupima genske terapije, kao što su toksičnost, integracija DNK u genom domaćina, i slično. Metodologije iz pronalaska su posebno pogodne za isporuku mnoštva mRNK, bez indukovanja urođenog imuniteta i bez neželjenih sporednih efekata povezanih sa konvencionalnim pristupima genske terapije. Posebno, tehnologija isporuke mRNK iz pronalaska olakšava ekspresiju i mRNK koja kodira CRISPR-asocirane proteine, npr. Cas9, dCas9 i njihove varijante, u kombinaciji sa jednom ili više vodećih RNK (sgRNK) kako bi se omogućila regulacija gena in vitro i in vivo. Upotrebom farmaceutske kompozicije zasnovane na mRNK, tehnologija obezbeđuje terapijske primene CRISPR tehnologija koje su ranije bile nedostižne.
[0012] Ovde predstavljeni podaci dokazuju da je moguće postići unutarćelijsku ekspresiju CRISPR-asociranih proteina, uključujući proteine projektovane tako da uključuju regulatornu sekvencu koja olakšava regulaciju ekspresije proteina, i odgovarajuće sekvence za ciljno delovanje na mRNK (tj. sgRNK). Ovde predstavljeni podaci demonstriraju da je moguće postići unutarćelijsku proteinsku ekspresiju CRISPR-asociranih proteina, posebno, putem in vivo primene farmaceutskih kompozicija koje sadrže modifikovane mRNK koje kodiraju takve proteine.
[0013] Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima. Predmetni pronalazak stoga obezbeđuje sintetički polinukleotid pri čemu je uridin zamenjen 100% sa 1-metilpseudouridinom, sintetički polinukleotid sadrži prvi region povezanih nukleozida, navedeni prvi region kodira protein povezan sa CRISPR odabran iz grupe koja se sastoji od proteina povezanih sa CRISPR koji imaju bilo koju od amino-kiselinskih sekvenci SEQ ID NO 61, 7, 8, 9, 62, 63, 64, ili 65 ili koji su kodirani bilo kojom od sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO 1-6, ili 110-112.
Dodatni aspekti pronalaska su takođe definisani u patentnim zahtevima.
[0014] Ovde su opisane kompozicije (uključujući farmaceutske kompozicije) i postupci za dizajn, pripremu, proizvodnju i/ili formulaciju sintetičkih polinukleotida koji kodiraju jedan ili više proteina povezanih sa CRISPR, npr. dCAS9 i/ili dCAS9-efektor fuzione proteine. Ovde su takođe opisane kompozicije (uključujući farmaceutske kompozicije) i postupci za dizajn, pripremu, proizvodnju i/ili formulaciju jedne ili više sintetičkih malih vodećih RNK ("sgRNK") koje ciljno deluju na gen od interesa. I sintetički polinukleotidi i sgRNK se tipično proizvode upotrebom in vitro transkripcije. Sintetički polinukleotid i sgRNK mogu biti modifikovani, npr. sadrže najmanje jedan modifikovani nukleotid. Ovde su takođe opisani postupci modulacije ekspresije gena od interesa upotrebom sintetičkog polinukleotida koji kodira protein povezan sa CRISPR i sgRNK koja ciljno deluje na gen od interesa. Uključeni su in vitro i in vivo postupci, npr. postupci lečenja bolesnog stanja korelisanog sa ekspresijom gena od interesa. Takođe su obezbeđeni sistemi, procesi, uređaji i kompleti za odabir, dizajn i/ili korišćenje sintetičkih polinukleotida i sintetičkih sgRNK koji su ovde opisani.
[0015] Ključno ograničenje do sada opisanih CRISPR/Inhibicija/Aktivacija (CRISPR/I/A) sistema je njihova zavisnost od isporuke DNK pomoću virusnih vektora za pokretanje unutarćelijske transkripcije (sgRNK) i transkripcije i translacije Cas9, dCas9 ili dCas9-fuzionih proteina kao što su dCas9-VP64, i dCas9-KRAB. Postoji nekoliko implikacija ovog ograničenja za in vivo sisteme koji upotrebljavaju transkripcijsku aktivaciju/represiju pošto će to zahtevati ponovljeno doziranje. Prvo, isporuka DNK pomoću pseudo virusa indukovaće merljivu urođenu imunsku aktivaciju (npr. preko TLR) i oni će uticati na efikasnost transfekcije i imati neželjene sporedne efekte. Drugo, ponovljeno doziranje virusnih kapsida moglo bi i verovatno će indukovati adaptivni imunski odgovor na ponovljeno doziranje. Treće, upotreba DNK - i rizik od hronično aktiviranog dCas9 predstavljaju značajan bezbednosni i rizik od toksičnosti za in vivo terapeutike.
[0016] Modifikovani sintetički polinukleotid (npr. modifikovana mRNK) predstavlja idealnu platformu za kliničku translaciju ove prokariotske platforme. Ovde se objavljuju tehnologije za bezbednu isporuku modifikovane mRNK in vivo koja kodira protein povezan sa CRISPR, npr. dCAS9, na vremenski ograničen i - potencijalno način ciljan na ćelijski tip. Pored toga, upotreba modifikovane mRNK će izbeći rizik značajne urođene imunske aktivacije, i smanjiti rizik od adaptivnih odgovora.
I. Sintetički polinukleotidi koji kodiraju proteine povezane sa CRISPR
[0017] Predmetna objava obezbeđuje sintetičke polinukleotide koji kodiraju jedan ili više proteina povezanih sa CRISPR, npr. dCAS9 i dCAS9 fuzione proteine. Termin "polinukleotid", u najširem smislu, uključuje bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja sadrži polimer nukleotida. Primeri polinukleotida iz objave uključuju, ali nisu ograničeni na, ribonukleinske kiseline (RNK), dezoksiribonukleinske kiseline (DNK), treozne nukleinske kiseline (TNA), glikolne nukleinske kiseline (GNA), peptidne nukleinske kiseline (PNA), zaključane nukleinske kiseline (LNA, uključujući LNA koje imaju β-D-ribo konfiguraciju, α-LNA koje imaju α-L-ribo konfiguraciju (dijastereomer LNA), 2'-amino-LNA koja ima 2'-amino funkcionalizaciju, i 2'-amino-α-LNA koja ima 2'-amino funkcionalizaciju) ili njihove hibride.
[0018] Sintetički polinukleotid može biti sintetička informaciona RNK (mRNK). Kao što se ovde upotrebljava, termin "informaciona RNK" (mRNK) označava bilo koji polinukleotid, koji može biti sintetički, koji kodira polipeptid, npr. protein povezan sa CRISPR, i koji je sposoban da bude translatiran da proizvede kodirani polipeptid in vitro, in vivo, in situ ili ex vivo. U predmetnoj objavi, mRNK kodira protein povezan sa CRISPR, npr. dCAS9 i dCAS9-efektor (aktivator ili inhibitor) fuzione proteine. Dopunski opis i sekvence za proteine povezane sa CRISPR su u nastavku.
[0019] Predmetna objava proširuje obim funkcionalnosti tradicionalnih molekula mRNK obezbeđivanjem sintetičkih polinukleotida koji sadrže jednu ili više strukturnih i/ili hemijskih modifikacija ili izmena koje polinukleotidima daju korisna svojstva, uključujući nedostatak značajne indukcije urođenog imunskog odgovora ćelije u koju se introdukuje polinukleotid. Kao što se ovde upotrebljava, "strukturno" svojstvo ili modifikacija je ona u kojoj su dva ili više povezanih nukleotida insertovana, deletirana, duplicirana, invertovana ili randomizirana u sintetičkom polinukleotidu, primarnom konstruktu ili mmRNK bez značajne hemijske modifikacije samih nukleotida. Budući da će hemijske veze nužno biti prekinute i reformisane kako bi se izvršile strukturne modifikacije, strukturne modifikacije su hemijske prirode i stoga su hemijske modifikacije. Međutim, strukturne modifikacije će rezultovati različitom sekvencom nukleotida. Na primer, polinukleotid "ATCG" (SEQ ID NO: 123) može biti hemijski modifikovan u "AT-5meC-G" (SEQ ID NO: 124). Isti polinukleotid može biti strukturno modifikovan iz "ATCG" (SEQ ID NO: 123) u "ATCCCG" (SEQ ID NO: 125). Ovde je insertovan dinukleotid "CC", rezultujući strukturnom modifikacijom polinukleotida.
Proteini povezani sa CRISPR
[0020] Sintetički polinukleotidi iz objave kodiraju protein povezan sa CRISPR. Termin "protein povezan sa CRISPR" uključuje, ali bez ograničavanja na, CAS9, CSY4, dCAS9, i dCAS9-efektorski domen (aktivatorski i/ili inhibitorski domen) fuzione proteine. Primeri polipeptidnih sekvenci i polinukleotidnih sekvenci proteina povezanog sa CRISPR nalaze se u Tabelama u nastavku.
[0021] Protein povezan sa CRISPR može biti iz bilo kojih brojnih vrsta uključujući ali bez ograničavanja na, Streptococcus pyogenes, Listeria innocua, i Streptococcus thermophilus.
[0022] Sintetički polinukleotid može kodirati sekvencu divljeg tipa proteina povezanog sa CRISPR ili varijantu proteina povezanog sa CRISPR. Varijante su ovde detaljnije opisane. Kao što je ovde detaljnije opisano, sintetički polinukleotid može uključivati bilo upotrebu kodona divljeg tipa ili upotrebu kodona optimizovanog za određenu primenu, npr. optimizacija humanog kodona za humane terapeutike.
[0023] U skladu sa predmetnom objavom, sintetički polinukleotidi sadrže najmanje prvi region povezanih nukleozida koji kodira najmanje jedan protein povezan sa CRISPR. Primeri proteina povezanih sa CRISPR navedeni su u Tabelama u nastavku. Za bilo koji određeni protein povezan sa CRISPR može postojati jedna ili više varijanti ili izoformi. Oni koji su iskusni u struci podrazumevaće da su u Tabelama objavljeni potencijalni bočni regioni. Oni su kodirani u svakom transkriptu bilo 5' (uzvodno) ili 3' (nizvodno) od ORF ili kodirajućeg regiona. Kodirajući region se definitivno i specifično objavljuje pomoću učenja proteinske sekvence. Shodno tome, sekvence po učenju bočne onoj koja kodira protein smatraju se bočnim regionima. Takođe je moguće dodatno okarakterisati 5' i 3' bočne regione korišćenjem jedne ili više dostupnih baza podataka ili algoritama. Baze podataka beleže svojstva sadržana u bočnim regionima transkripata i ona su dostupna u struci.
[0024] Protein povezan sa CRISPR može biti dCAS9. Tipične sekvence su uključene u Tabele u nastavku.
[0025] Protein povezan sa CRISPR može biti dCAS9-efektorski domen fuzioni protein. Efektorski domen može biti aktivacioni domen ili inhibicioni domen, u zavisnosti od primene. Primeri efektorskih domena dobro su poznati onima sa iskustvom u struci i uključuju, npr. KRAB, CSD, WRPW, VP64, ili p65AD.
[0026] Proteini povezani sa CRISPR mogu biti dCAS9-KRAB ili dCAS9-VP64 fuzioni proteini. Primeri sekvenci obezbeđeni su u Tabelama u nastavku i listi sekvenci.
[0027] Dodatni konstrukti korisni u različitim aspektima objave uključuju one iznete kao SEQ ID NO: 1-9.
Arhitektura sintetičkog polinukleotida
[0028] Modifikovani sintetički polinukleotidi ili iz predmetne objave razlikuju se od mRNK divljeg tipa po svojim funkcionalnim i/ili strukturnim svojstvima dizajna koja služe da, kao što je ovde dokazano, prevaziđu postojeće probleme efikasne proizvodnje polipeptida upotrebom terapeutika na bazi nukleinskih kiselina.
[0029] Slika 1 pokazuje reprezentativni polinukleotidni primarni konstrukt 100 iz predmetne objave. Kao što se ovde upotrebljava, termin "primarni konstrukt" ili "primarni mRNK konstrukt" označava polinukleotidni transkript koji kodira jedan ili više polipeptida od interesa i koji zadržava dovoljna strukturna i/ili hemijska svojstva da omogući da polipeptid od interesa koji je njime kodiran bude translatiran. Primarni konstrukti mogu biti polinukleotidi iz objave. Kada je strukturno ili hemijski modifikovan, primarni konstrukt se može označiti kao modifikovani sintetički polinukleotid ili mmRNK.
[0030] Vraćajući se na SL. 1, primarni konstrukt 100 ovde sadrži prvi region povezanih nukleotida 102 koji je omeđen prvim bočnim regionom 104 i drugim bočnim regionom 106. Kao što se ovde upotrebljava, "prvi region" se može označiti kao "kodirajući region" ili "region koji kodira" ili jednostavno "prvi region". Ovaj prvi region može uključivati, ali bez ograničavanja na, kodirani polipeptid od interesa, tj. protein povezan sa CRISPR. Polipeptid od interesa može na svom 5' terminusu sadržati jednu ili više signalnih sekvenci kodiranih regionom signalne sekvence 103. Prvi bočni region 104 može sadržati region povezanih nukleotida koji sadrži jednu ili više potpunih ili nepotpunih 5' UTR sekvenci. Prvi bočni region 104 takođe može sadržati 5' terminusni region kape 108. Drugi bočni region 106 može sadržati region povezanih nukleotida koji sadrži jedan ili više potpunih ili nepotpunih 3' UTR. Drugi bočni region 106 takođe može sadržati 3' repnu sekvencu 110.
[0031] Prvi operativni region 105 premošćuje 5' terminus prvog regiona 102 i prvi bočni region 104. Tradicionalno ovaj prvi operativni region sadrži start kodon. Operativni region može alternativno sadržati bilo koju sekvencu ili signal inicijacije translacije uključujući start kodon.
[0032] Drugi operativni region 107 premošćuje 3' terminus prvog regiona 102 i drugi bočni region 106. Tradicionalno, ovaj drugi operativni region sadrži stop kodon. Drugi operativni region može alternativno sadržati bilo koju sekvencu ili signal inicijacije translacije uključujući stop kodon. Takođe se može upotrebljavati više serijskih stop kodona.
[0033] U nekim slučajevima, sintetički polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK uključuje od oko 30 do oko 100.000 nukleotida (npr. od 30 do 50, od 30 do 100, od 30 do 250, od 30 do 500, od 30 do 1.000, od 30 do 1.500, od 30 do 3.000, od 30 do 5.000, od 30 do 7.000, od 30 do 10.000, od 30 do 25.000, od 30 do 50.000, od 30 do 70.000, od 100 do 250, od 100 do 500, od 100 do 1.000, od 100 do 1.500, od 100 do 3.000, od 100 do 5.000, od 100 do 7.000, od 100 do 10.000, od 100 do 25.000, od 100 do 50.000, od 100 do 70.000, od 100 do 100.000, od 500 do 1.000, od 500 do 1.500, od 500 do 2.000, od 500 do 3.000, od 500 do 5.000, od 500 do 7.000, od 500 do 10.000, od 500 do 25.000, od 500 do 50.000, od 500 do 70.000, od 500 do 100.000, od 1.000 do 1.500, od 1.000 do 2.000, od 1.000 do 3.000, od 1.000 do 5.000, od 1.000 do 7.000, od 1.000 do 10.000, od 1.000 do 25.000, od 1.000 do 50.000, od 1.000 do 70.000, od 1.000 do 100.000, od 1.500 do 3.000, od 1.500 do 5.000, od 1.500 do 7.000, od 1.500 do 10.000, od 1.500 do 25.000, od 1.500 do 50.000, od 1.500 do 70.000, od 1.500 do 100.000, od 2.000 do 3.000, od 2.000 do 5.000, od 2.000 do 7.000, od 2.000 do 10.000, od 2.000 do 25.000, od 2.000 do 50.000, od 2.000 do 70.000, i od 2.000 do 100.000).
[0034] Generalno, dužina prvog regiona koji kodira polipeptid od interesa, npr. protein povezan sa CRISPR iz predmetne objave je više od oko 30 nukleotida dugačak (npr. najmanje ili više od oko 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500, i 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000 ili do i uključujući 100.000 nukleotida).
[0035] U skladu sa predmetnom objavom, prvi i drugi bočni region mogu biti u opsegu nezavisno od 15-1.000 nukleotida dugački (npr. više od 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, i 900 nukleotida ili najmanje 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, i 1.000 nukleotida).
[0036] U skladu sa predmetnom objavom, 3' repna sekvenca može biti u opsegu od odsutne do 500 nukleotida dugačka (npr. najmanje 60, 70, 80, 90, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ili 500 nukleotida). Tamo gde je repna sekvenca poliA rep, dužina se može odrediti u jedinicama ili kao funkcija vezivanja poliA vezujućih proteina. U ovom slučaju, poliA rep je dovoljno dugačak da vezuje najmanje 4 monomera poliA vezujućeg proteina. Monomeri poliA vezujućeg proteina vezuju se za nizove od približno 38 nukleotida. Kao takvo, uočeno je da su poliA repovi od oko 80 nukleotida i 160 nukleotida funkcionalni.
[0037] U skladu sa predmetnom objavom, 5' terminusni region kape može sadržati jednu kapu ili seriju nukleotida koji formiraju kapu. Region kape može biti od 1 do 10, npr.2-9, 3-8, 4-7, 1-5, 5-10, ili najmanje 2, ili 10 ili manje nukleotida dugačak. U nekim slučajevima, region kape je odsutan.
[0038] U skladu sa predmetnom objavom, prvi i drugi operativni region mogu biti u opsegu od 3 do 40, npr. 5-30, 10-20, 15, ili najmanje 4, ili 30 ili manje nukleotida dugački i mogu da sadrže, pored start i/ili stop kodona, jednu ili više signalnih i/ili restrikcionih sekvenci.
Ciklični sintetički polinukleotidi
[0039] U skladu sa predmetnom objavom, sintetički polinukleotid može biti ciklizovan, ili konkatemerizovan, kako bi se generisao translaciono kompetentni molekul koji pomaže interakcije između poli-A vezujućih proteina i 5'-kraj vezujućih proteina. Mehanizam ciklizacije ili konkatemerizacije može se desiti preko najmanje 3 različita puta: 1) hemijski, 2) enzimski, i 3) ribozimom katalizovano. Novoformirana 5'-/3'-veza može biti intramolekulska ili intermolekulska.
[0040] U prvom putu, 5'-kraj i 3'-kraj nukleinske kiseline sadrže hemijski reaktivne grupe koje, kada su blizu jedna drugoj, formiraju novu kovalentnu vezu između 5'-kraja i 3'-kraja molekula. 5'-kraj može sadržati NHS-estarsku reaktivnu grupu, i 3'-kraj može sadržati 3'-amino-završeni nukleotid tako da će u organskom rastvaraču 3'-amino-završeni nukleotid na 3'-kraju sintetičkog mRNK molekula izvršiti nukleofilni napad na 5'-NHS-estarski deo formirajući novu 5'-/3'-amidnu vezu.
1
[0041] U drugom putu, T4 RNK ligaza se može upotrebiti za enzimsko povezivanje molekula 5'-fosforilisane nukleinske kiseline za 3'-hidroksilnu grupu nukleinske kiseline formirajući novu fosforodiestarsku vezu. U primeru reakcije, 1 µg molekula nukleinske kiseline se inkubira na 37 °C tokom 1 sata sa 1-10 jedinica T4 RNK ligaze (New England Biolabs, Ipswich, MA) u skladu sa protokolom proizvođača. Reakcija ligacije može se desiti u prisustvu podeljenog oligonukleotida sposobnog za sparivanje baza i sa 5'- i 3'-regionom u jukstapoziciji kako bi se pomogla reakcija enzimske ligacije.
[0042] U trećem putu, bilo 5'- ili 3'-kraj cDNK templata kodira sekvencu ribozim ligaze tako da tokom in vitro transkripcije, rezultujući molekul nukleinske kiseline može sadržati aktivnu sekvencu ribozima sposobnu za ligaciju 5'-kraja molekula nukleinske kiseline za 3'-kraj molekula nukleinske kiseline. Ribozim ligaza može biti poreklom iz introna grupe I, introna grupe I, hepatitis delta virusa, ribozima ukosnice, ili može biti odabrana pomoću SELEX (sistematska evolucija liganda pomoću eksponencijalnog obogaćivanja). Reakcija ribozim ligaze može trajati 1 do 24 sata na temperaturama između 0 i 37 °C.
Sintetički polinukleotidni multimeri
[0043] U skladu sa predmetnom objavom, više različitih sintetičkih polinukleotida može biti povezano zajedno preko 3'-kraja upotrebom nukleotida koji su modifikovani na 3'-terminusu. Hemijska konjugacija se može upotrebljavati za kontrolu stehiometrije isporuke u ćelije. Na primer, enzimi glioksilatnog ciklusa, izocitrat liaza i malat sintaza, mogu se dostaviti u HepG2 ćelije u 1:1 odnosu kako bi se izmenio ćelijski metabolizam masnih kiselina. Ovaj odnos se može kontrolisati hemijskim povezivanjem polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK upotrebom 3'-azido završenog nukleotida na jednom polinukleotidu, primarnom konstruktu ili mmRNK vrsti i nukleotida koji sadrži C5-etinil ili alkinil na suprotnom polinukleotidu, primarnom konstruktu ili mmRNK vrsti. Modifikovani nukleotid se dodaje posttranskripciono upotrebom terminalne transferaze (New England Biolabs, Ipswich, MA) u skladu sa protokolom proizvođača. Posle dodavanja 3'-modifikovanog nukleotida, dva polinukleotida, primarna konstrukta ili mmRNK vrste mogu se kombinovati u vodenom rastvoru, u prisustvu ili odsustvu bakra, kako bi se formirala nova kovalentna veza putem klik hemijskog mehanizma kao što je opisano u literaturi.
[0044] U sledećem primeru, više od dva polinukleotida mogu biti povezana zajedno upotrebom funkcionalizovanog linker molekula. Na primer, funkcionalizovani molekul saharida može biti hemijski modifikovan tako da sadrži više hemijski reaktivnih grupa (SH-, NH2-, N3, itd...) kako bi reagovao sa srodnim delom na 3'-funkcionalizovanom mRNK molekulu (tj. 3'-maleimid estar, 3'-NHS-estar, alkinil). Broj reaktivnih grupa na modifikovanom saharidu može se kontrolisati na stehiometrijski način kako bi se direktno kontrolisao stehiometrijski odnos konjugovanog polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK.
Sintetički polinukleotidni konjugati i kombinacije
[0045] Kako bi se dodatno povećala proizvodnja proteina, sintetički polinukleotidi iz predmetne objave mogu biti dizajnirani tako da budu konjugovani za druge polinukleotide, boje, agense za interkaliranje (npr. akridini), umreživače (npr. psoralen, mitomicin C), porfirine (TPPC4, teksafirin, safirin), policiklične aromatične ugljovodonike (npr. fenazin, dihidrofenazin), veštačke endonukleaze (npr. EDTA), alkilujuće agense, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr. PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radioaktivno obeležene markere, enzime, haptene (npr. biotin), sredstva za olakšavanje transporta/apsorpcije (npr. aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetičke ribonukleaze, proteine, npr. glikoproteine ili peptide, npr. molekule koji imaju specifičan afinitet za koligand, ili antitela, npr. antitelo, koje se vezuje za specificirani tip ćelije kao što je kancerska ćelija, endotelska ćelija, ili koštana ćelija, hormone i receptore hormona, ne-peptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, ili lek.
[0046] Konjugacija može rezultovati povećanom stabilnošću i/ili poluživotom i može biti posebno korisna u ciljnom delovanju polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK na specifična mesta u ćeliji, tkivu ili organizmu.
[0047] Ovde navedeni mmRNK ili primarni konstrukti mogu se primenjivati sa, ili dodatno kodirati jedan ili više RNKi agenasa, siRNK, shRNK, miRNK, miRNK vezujuća mesta, antisens RNK, ribozime, katalitičku DNK, tRNK, RNK koje indukuju formiranje trostrukog heliksa, aptamere ili vektore, i slično.
Bifunkcionalni sintetički polinukleotidi
[0048] Takođe se objavljuju bifunkcionalni polinukleotidi (npr. bifunkcionalni primarni konstrukti ili bifunkcionalna mmRNK). Kao što naziv implicira, bifunkcionalni polinukleotidi su oni koji imaju ili su sposobni za najmanje dve funkcije. Ovi molekuli se takođe mogu konvencionalno označiti kao multifunkcionalni.
[0049] Višestruke funkcionalnosti bifunkcionalnih polinukleotida mogu biti kodirane od strane RNK (funkcija se možda neće manifestovati dok se kodirani proizvod ne translatira) ili mogu biti svojstvo samog polinukleotida. Može biti strukturna ili hemijska. Bifunkcionalno modifikovani polinukleotidi mogu sadržati funkciju koja je kovalentno ili elektrostatički povezana sa polinukleotidima. Dodatno, dve funkcije mogu biti obezbeđene u kontekstu kompleksa mmRNK i drugog molekula.
[0050] Bifunkcionalni polinukleotidi mogu kodirati peptide koji su antiproliferativni. Ovi peptidi mogu biti linearni, ciklični, ograničena ili nasumična zavojnica. Oni mogu funkcionisati kao aptameri, signalni molekuli, ligandi ili mimici ili mimetici istih. Antiproliferativni peptidi mogu, kao što su translatirani, biti dugački od 3 do 50 aminokiselina. Mogu biti dugački 5-40, 10-30, ili približno 15 amino-kiselina. Oni mogu biti jednolančani, višelančani ili razgranati i mogu formirati komplekse, agregate ili bilo koju strukturu sa više jedinica posle translacije.
Nekodirajući polinukleotidi i primarni konstrukti
[0051] Kao što je ovde opisano, obezbeđeni su polinukleotidi i primarni konstrukti koji imaju sekvence koje delimično ili suštinski nisu translatabilne, npr. koje imaju nekodirajući region. Takav nekodirajući region može biti "prvi bočni region" primarnog konstrukta. Alternativno, nekodirajući region može biti region drugi nego prvi region. Takvi molekuli se generalno ne translatiraju, ali mogu imati uticaj na proizvodnju proteina pomoću jednog ili više vezivanja za i sekvestriranja jedne ili više komponenti translacione mašinerije, kao što su ribozomski protein ili transportna RNK (tRNK), čime se efikasno redukuje ekspresija proteina u ćeliji ili modulira jedan ili više puteva ili kaskada u ćeliji što zauzvrat menja nivo proteina. Polinukleotid ili primarni konstrukt mogu sadržati ili kodirati jednu ili više dugih nekodirajućih RNK (lncRNK, ili lincRNK) ili njihov deo, malu nukleolusnu RNK (sno-RNK), mikro RNK (miRNK), malu interferirajuću RNK (siRNK) ili Piwi-interagujuću RNK (piRNK).
Polipeptidi od interesa (proteini povezani sa CRISPR)
[0052] U skladu sa predmetnom objavom, sintetički polinukleotid dizajniran je da kodira jedan ili više polipeptida od interesa ili njegove fragmente. Polipeptidi od interesa uključuju proteine povezane sa CRISPR, npr. CAS9, dCAS9, i dCAS9-efektorski domen (aktivatorski
1
i/ili inhibitorski domen) fuzione proteine. Proteini povezani sa CRISPR su ovde detaljnije opisani.
[0053] Polipeptid od interesa može uključivati, ali bez ograničavanja na, cele polipeptide, mnoštvo polipeptida ili fragmente polipeptida, koji nezavisno mogu biti kodirani jednom ili više nukleinskih kiselina, mnoštvom nukleinskih kiselina, fragmentima nukleinskih kiselina ili varijantama bilo čega od prethodno pomenutog. Kao što se ovde upotrebljava, termin "polipeptidi od interesa" označava bilo koje polipeptide koji su odbrani da budu kodirani u primarnom konstruktu iz predmetne objave. Kao što se ovde upotrebljava, "polipeptid" označava polimer amino-kiselinskih ostataka (prirodnih ili neprirodnih) povezanih zajedno najčešće peptidnim vezama. Termin, kao što se ovde upotrebljava, označava proteine, polipeptide, i peptide bilo koje veličine, strukture, ili funkcije. U nekim slučajevima kodirani polipeptid je manji od oko 50 amino-kiselina i tada se polipeptid naziva peptid. Ukoliko je polipeptid peptid, biće dugačak najmanje oko 2, 3, 4, ili najmanje 5 amino-kiselinskih ostataka. Stoga, polipeptidi uključuju genske proizvode, polipeptide koji se prirodno javljaju, sintetičke polipeptide, homologe, ortologe, paraloge, fragmente i druge ekvivalente, varijante, i analoge prethotno pomenutog. Polipeptid može biti jedan molekul ili može biti multimolekulski kompleks, kao što su dimer, trimer ili tetramer. Oni takođe mogu sadržati jednolančane ili višelančane polipeptide kao što su antitela ili insulin i mogu biti asocirani ili povezani. Najčešće se disulfidne veze nalaze u višelančanim polipeptidima. Termin polipeptid se takođe može odnositi na amino-kiselinske polimere u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka veštački hemijski analog odgovarajuće amino-kiseline koja se javlja u prirodi.
[0054] Termin "polipeptidna varijanta" označava molekule koji se po svojoj aminokiselinskoj sekvenci razlikuju od nativne ili referentne sekvence. Varijante amino-kiselinske sekvence mogu posedovati supstitucije, delecije, i/ili insercije na određenim pozicijama unutar amino-kiselinske sekvence, u poređenju sa nativnom ili referentnom sekvencom. Obično, varijante će posedovati najmanje oko 50% identičnosti (homologije) sa nativnom ili referentnom sekvencom, i poželjno će biti najmanje oko 80%, poželjnije najmanje oko 90% identične (homologne) sa nativnom ili referentnom sekvencom.
[0055] Objavljuju se "varijantni mimici". Kao što se ovde upotrebljava, termin "varijantni mimik" je onaj koji sadrži jednu ili više amino-kiselina koje bi oponašale aktiviranu sekvencu. Na primer, glutamat može poslužiti kao mimik za fosforo-treonin i/ili fosforo-serin. Alternativno, varijantni mimici mogu rezultovati deaktivacijom ili inaktiviranim proizvodom koji sadrži mimik, npr. fenilalanin može delovati kao inaktivirajuća supstitucija za tirozin; ili alanin može delovati kao inaktivirajuća supstitucija za serin.
[0056] "Homologija" kao što se odnosi na amino-kiselinske sekvence definisana je kao procenat ostataka u kandidat amino-kiselinskoj sekvenci koji su identični sa ostacima u amino-kiselinskoj sekvenci druge sekvence posle poravnanja sekvenci i introdukovanja praznina, ukoliko je potrebno, kako bi se postigao maksimalan procenat homologije. Postupci i računarski programi za poravnanje su dobro poznati u struci. Podrazumeva se da homologija zavisi od izračunavanja procenta identičnosti, ali se može razlikovati u vrednosti zbog praznina i penala introdukovanih u proračun.
[0057] Pod "homolozima" kao što se odnosi na polipeptidne sekvence podrazumeva se odgovarajuća sekvenca drugih vrsta koje imaju značajnu identičnost sa drugom sekvencom druge vrste.
[0058] Podrazumeva se da "analozi" uključuju polipeptidne varijante koje se razlikuju po jednoj ili više amino-kiselinskih izmena, npr. supstitucijama, adicijama ili delecijama aminokiselinskih ostataka koje i dalje održavaju jedno ili više svojstava roditeljskog ili početnog polipeptida.
[0059] Predmetna objava razmatra nekoliko tipova kompozicija na bazi polipeptida uključujući varijante i derivate. Oni uključuju supstitucione, insercione, delecione i kovalentne varijante i derivate. Termin "derivat" se upotrebljava sinonimno sa terminom "varijanta" ali generalno označava molekul koji je modifikovan i/ili promenjen na bilo koji način u odnosu na referentni molekul ili početni molekul.
[0060] Kao takve, mmRNK koje kodiraju polipeptide koji sadrže supstitucije, insercije i/ili adicije, delecije i kovalentne modifikacije u odnosu na referentne sekvence, posebno ovde objavljene polipeptidne sekvence, uključene su unutar predmetne objave. Na primer, oznake sekvence ili amino-kiseline, kao što je jedan ili više lizina, mogu se dodati peptidnim sekvencama iz objave (npr. na N-terminusnim ili C-terminusnim krajevima). Oznake sekvence mogu se upotrebljavati za prečišćavanje ili lokalizaciju peptida. Lizini mogu se upotrebljavati za povećanje solubilnosti peptida ili za omogućavanje biotinilacije. Alternativno, amino-kiselinski ostaci koji su locirani na karboksi i amino terminusnim regionima amino-kiselinske sekvence peptida ili proteina mogu se opciono deletirati obezbeđujući skraćene sekvence. Određene amino-kiseline (npr. C-terminusni ili N-terminusni ostaci) mogu se alternativno deletirati u zavisnosti od upotrebe sekvence, kao na primer, ekspresija sekvence kao deo veće sekvence koja je solubilna, ili povezana sa čvrstom podlogom.
1
[0061] "Supstitucione varijante" kada se poziva na polipeptide su one kod kojih je uklonjen najmanje jedan amino-kiselinski ostatak u nativnoj ili početnoj sekvenci i insertovana druga amino-kiselina na njegovo mesto na istoj poziciji. Supstitucije mogu biti pojedinačne, gde je supstituisana samo jedna amino-kiselina u molekulu, ili mogu biti višestruke, gde su dve ili više amino-kiselina supstituisane u istom molekulu.
[0062] Kao što se ovde upotrebljava, termin "konzervativna amino-kiselinska supstitucija" označava supstituciju amino-kiseline koja je normalno prisutna u sekvenci sa drugom aminokiselinom slične veličine, naelektrisanja, ili polarnosti. Primeri konzervativnih supstitucija uključuju supstituciju nepolarnog (hidrofobnog) ostatka, kao što su izoleucin, valin i leucin, sa drugim nepolarnim ostatkom. Slično, primeri konzervativnih supstitucija uključuju supstituciju jednog polarnog (hidrofilnog) ostatka sa drugim, kao što je između arginina i lizina, između glutamina i asparagina, i između glicina i serina. Dodatno, supstitucija baznog ostatka kao što su lizin, arginin ili histidin sa drugim, ili supstitucija jednog kiselog ostatka kao što su asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina sa drugim kiselim ostatkom dodatni su primeri konzervativnih supstitucija. Primeri nekonzervativnih supstitucija uključuju supstituciju nepolarnog (hidrofobnog) amino-kiselinskog ostatka kao što su izoleucin, valin, leucin, alanin, metionin sa polarnim (hidrofilnim) ostatkom kao što su cistein, glutamin, glutaminska kiselina ili lizin i/ili polarnog ostatka sa nepolarnim ostatkom.
[0063] "Insercione varijante" kada se poziva na polipeptide su one sa jednom ili više aminokiselina insertovanih neposredno pored amino-kiseline na određenoj poziciji u nativnoj ili početnoj sekvenci. "Neposredno pored" amino-kiseline znači povezano sa bilo alfa-karboksi ili alfa-amino funkcionalnom grupom amino-kiseline.
[0064] "Delecione varijante" kada se poziva na polipeptide su one sa jednom ili više aminokiselina uklonjenih u nativnoj ili početnoj amino-kiselinskoj sekvenci. Uobičajeno, delecione varijante će imati jednu ili više amino-kiselina deletiranih u određenom regionu molekula.
[0065] "Kovalentni derivati" kada se poziva na polipeptide uključuju modifikacije nativnog ili početnog proteina sa organskim proteinskim ili neproteinskim derivatizacionim agensom, i/ili posttranslacione modifikacije. Kovalentne modifikacije se tradicionalno introdukuju reagovanjem ciljanih amino-kiselinskih ostataka proteina sa organskim derivatizacionim agensom koji je sposoban da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili terminusnim ostacima, ili upotrebom mehanizama posttranslacionih modifikacija koje funkcionišu u odabranim rekombinantnim ćelijama domaćina. Rezultujući kovalentni derivati su korisni u programima usmerenim na identifikaciju ostataka važnih za biološku aktivnost, za imunološke testove, ili za pripremu anti-protein antitela za imunoafinitetno prečišćavanje rekombinantnog
1
glikoproteina. Takve modifikacije su unutar prosečnog iskustva u struci i izvode se bez nepotrebnih eksperimenata.
[0066] Određene posttranslacione modifikacije su rezultat delovanja rekombinantnih ćelija domaćina na eksprimirani polipeptid. Glutaminil i asparaginil ostaci se često posttranslaciono deamiduju do odgovarajućih glutamil i aspartil ostataka. Alternativno, ovi ostaci se deamiduju pod blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka može biti prisutan u polipeptidima proizvedenim u skladu sa predmetnom objavom.
[0067] Druge posttranslacione modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa seril ili treonil ostataka, metilaciju alfa-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina, i histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)).
[0068] "Osobine" kada se poziva na polipeptide definisane su kao različite komponente molekula zasnovane na amino-kiselinskoj sekvenci. Osobine polipeptida kodiranih od strane mmRNK iz predmetne objave uključuju površinske manifestacije, lokalni konformacioni oblik, nabore, petlje, polupetlje, domene, poludomene, mesta, terminuse ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0069] Kao što se ovde upotrebljava kada se poziva na polipeptide termin "površinska manifestacija" označava komponentu proteina zasnovanu na polipeptidu koja se pojavljuje na najspoljašnjijoj površini.
[0070] Kao što se ovde upotrebljava kada se poziva na polipeptide termin "lokalni konformacioni oblik" označava strukturnu manifestaciju proteina zasnovanu na polipeptidu koja je locirana unutar definisanog prostora proteina.
[0071] Kao što se ovde upotrebljava kada se poziva na polipeptide termin "nabor" označava rezultujuću konformaciju amino-kiselinske sekvence nakon minimizacije energije. Nabor se može javiti na sekundarnom ili tercijarnom nivou procesa savijanja. Primeri nabora sekundarnog nivoa uključuju beta ploče i alfa helikse. Primeri tercijarnih nabora uključuju domene i regione formirane zbog agregacije ili razdvajanja energetskih sila. Regioni formirani na ovaj način uključuju hidrofobne i hidrofilne džepove, i slično.
[0072] Kao što se ovde upotrebljava, termin "zaokret" u odnosu na konformaciju proteina označava krivinu koja menja smer okosnice peptida ili polipeptida i može uključivati jedan, dva, tri ili više amino-kiselinskih ostataka.
[0073] Kao što se ovde upotrebljava kada se poziva na polipeptide termin "petlja" označava strukturne osobine polipeptida koje mogu poslužiti za preokretanje smera okosnice peptida ili polipeptida. Tamo gde se petlja nalazi u polipeptidu i menja samo smer okosnice, može
1
sadržati četiri ili više amino-kiselinskih ostataka. Oliva et al. identifikovali su najmanje 5 klasa proteinskih petlji (J. Mol Biol 266 (4): 814-830; 1997). Petlje mogu biti otvorene ili zatvorene. Zatvorene petlje ili "ciklične" petlje mogu sadržati 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više amino-kiselina između premošćujućih delova. Takvi premošćujući delovi mogu sadržati most cistein-cistein (Cys-Cys) tipičan kod polipeptida koji imaju disulfidne mostove ili alternativno premošćujući delovi ne moraju biti na bazi proteina, kao što su ovde upotrebljeni dibromozilil agensi.
[0074] Kao što se ovde upotrebljava kada se poziva na polipeptide termin "polupetlja" označava deo identifikovane petlje koji ima najmanje polovinu broja amino-kiselinskih ostataka kao petlja iz koje je poreklom. Podrazumeva se da petlje ne moraju uvek sadržati paran broj amino-kiselinskih ostataka. Prema tome, u onim slučajevima gde petlja sadrži ili je identifikovano da sadrži neparan broj amino-kiselina, polupetlja petlje sa neparnim brojem će sadržati deo petlje celog broja ili deo petlje sledećeg celog broja (broj amino-kiselina petlje/2 /- 0,5 amino-kiselina). Na primer, petlja identifikovana kao petlja sa 7 amino-kiselina može da proizvede polupetlje od 3 amino-kiseline ili 4 amino-kiseline (7/2 = 3,5 /- 0,5 je 3 ili 4).
[0075] Kao što se ovde upotrebljava kada se poziva na polipeptide termin "domen" označava motiv polipeptida koji ima jednu ili više identifikacionih strukturnih ili funkcionalnih karakteristika ili svojstava (npr. kapacitet vezivanja, služi kao mesto za protein-protein interakcije).
[0076] Kao što se ovde upotrebljava kada se poziva na polipeptide termin "poludomen" označava deo identifikovanog domena koji ima najmanje polovinu broja amino-kiselinskih ostataka kao domen iz kog je poreklom. Podrazumeva se da domeni ne moraju uvek sadržati paran broj amino-kiselinskih ostataka. Prema tome, u onim slučajevima gde domen sadrži ili je identifikovano da sadrži neparan broj amino-kiselina, poludomen domena sa neparnim brojem će sadržati deo domena celog broja ili deo domena sledećeg celog broja (broj aminokiselina domena/2 /- 0,5 amino-kiselina). Na primer, domen identifikovan kao domen sa 7 amino-kiselina može da proizvede poludomene od 3 amino-kiseline ili 4 amino-kiseline (7/2 = 3,5 /- 0,5 je 3 ili 4). Takođe se podrazumeva da se poddomeni mogu identifikovati unutar domena ili poludomena, pri čemu ovi poddomeni poseduju manje od svih strukturnih ili funkcionalnih svojstava identifikovanih u domenima ili poludomenima iz kojih su poreklom. Takođe se podrazumeva da amino-kiseline koje sadrže bilo koji od tipova domena ovde ne moraju biti susedne duž okosnice polipeptida (tj. nesusedne amino-kiseline mogu se strukturno naborati kako bi proizvele domen, poludomen ili poddomen).
1
[0077] Kao što se ovde upotrebljava kada se poziva na polipeptide termin "mesto" što se tiče aspekata zasnovanih na amino-kiselinama upotrebljava se sinonimno sa "amino-kiselinski ostatak" i "bočni lanac amino-kiselina". Mesto predstavlja poziciju unutar peptida ili polipeptida koja se može modifikovati, manipulisati, menjati, derivatizovati ili varirati unutar molekula zasnovanih na polipeptidima iz predmetne objave.
[0078] Kao što se ovde upotrebljava termini "terminusi" ili "terminus" kada se poziva na polipeptide označavaju ekstremitet peptida ili polipeptida. Takav ekstremitet nije ograničen samo na prvo ili krajnje mesto peptida ili polipeptida, već može uključivati dopunske aminokiseline u terminusnim regionima. Molekuli zasnovani na polipeptidima iz predmetne objave mogu se okarakterisati kao da imaju i N-terminus (završen amino-kiselinom sa slobodnom amino grupom (NH2)) i C-terminus (završen amino-kiselinom sa slobodnom karboksilnom grupom (COOH)). Proteini iz objave su u nekim slučajevima sačinjeni od više polipeptidnih lanaca koji se drže zajedno disulfidnim vezama ili nekovalentnim silama (multimeri, oligomeri). Ove vrste proteina će imati više N- i C-terminusa. Alternativno, terminusi polipeptida mogu biti modifikovani tako da oni počinju ili se završavaju, kao što to može biti slučaj, sa delom koji nije zasnovan na polipeptidu, kao što je organski konjugat.
[0079] Jednom kada su neke od osobina identifikovane ili definisane kao željena komponenta polipeptida koji treba da bude kodiran primarnim konstruktom ili mmRNK iz objave, bilo koja od nekoliko manipulacija i/ili modifikacija ovih osobina može se izvesti pomeranjem, zamenom, invertovanjem, delecijom, randomizovanjem ili dupliciranjem. Pored toga, podrazumeva se da manipulacija osobinama može rezultovati istim ishodom kao i modifikacija na molekulima iz objave. Na primer, manipulacija koja uključuje deleciju domena rezultovala bi izmenom dužine molekula baš kao što bi i modifikacija nukleinske kiseline da kodira manje od molekula pune dužine.
[0080] Modifikacije i manipulacije mogu se postići postupcima poznatim u struci, kao što je, ali bez ograničavanja na, mutagenezu usmerenu na mesto. Rezultujući modifikovani molekuli se zatim mogu testirati na aktivnost upotrebom in vitro ili in vivo testova, kao što su oni koji su ovde opisani, ili bilo koji drugi pogodan test pregledanja poznat u struci.
[0081] U skladu sa predmetnom objavom, polipeptidi mogu sadržati konsenzus sekvencu koja se otkriva kroz krugove eksperimentisanja. Kao što se ovde upotrebljava, "konsenzus" sekvenca je jedna sekvenca koja predstavlja kolektivnu populaciju sekvenci koje omogućavaju varijabilnost na jednom ili više mesta.
[0082] Kao što su oni sa iskustvom u struci prepoznali takođe se smatra da su proteinski fragmenti, funkcionalni proteinski domeni, i homologni proteini unutar obima polipeptida od
1
interesa iz ove objave. Na primer, ovde je obezbeđen bilo koji proteinski fragment (misleći na polipeptidnu sekvencu koja je najmanje za jedan amino-kiselinski ostatak kraća od referentne polipeptidne sekvence, ali inače identičnu) referentnog proteina koji je dugačak 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ili više od 100 amino-kiselina. U drugom primeru, bilo koji protein koji uključuje niz od oko 20, oko 30, oko 40, oko 50, ili oko 100 amino-kiselina koje su oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, ili oko 100% identične sa bilo kojom od ovde opisanih sekvenci može se koristiti u skladu sa objavom. Ovde opisani polipeptid može uključivati 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više mutacija kao što je pokazano u bilo kojoj od sekvenci koje su ovde obezbeđene ili na koje se poziva.
Varijantni polipeptidi od interesa
[0083] Sintetički polipeptidi koji su ovde opisani mogu kodirati varijantne polipeptide, npr. varijantne proteine povezane sa CRISPR koji imaju određenu identičnost sa referentnom polipeptidnom sekvencom. Kao što se ovde upotrebljava, "referentna polipeptidna sekvenca" označava početnu polipeptidnu sekvencu. Referentne sekvence mogu biti sekvence divljeg tipa ili bilo koje sekvence na koje se poziva u dizajnu druge sekvence. "Referentna polipeptidna sekvenca" može biti, npr. bilo koja koja kodira CAS9, dCAS9, dCAS9-aktivatorski domen fuzioni protein, dCAS9-inhibitorski domen fuzioni protein, i/ili njihove varijante.
[0084] Termin "identičnost" kao što je poznato u struci, označava odnos između sekvenci dva ili više peptida, kao što je određeno poređenjem sekvenci. U struci, identičnost takođe označava stepen povezanosti sekvenci između peptida, kao što je određeno brojem podudaranja između nizova dva ili više amino-kiselinskih ostataka. Identičnost meri procenat identičnih podudaranja između manje od dve ili više sekvenci sa poravnanjem praznina (ukoliko ih ima) koje obrađuje određeni matematički model ili računarski program (tj. "algoritmi"). Identičnost srodnih peptida može se lako izračunati poznatim postupcima. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, one opisane u Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., i Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. i Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; i Carillo et al., SIAM J. Applied Math.48, 1073 (1988).
2
[0085] Varijanta polipeptida može imati istu ili sličnu aktivnost kao referentni polipeptid. Alternativno, varijanta može imati izmenjenu aktivnost (npr. povećanu ili smanjenu) u odnosu na referentni polipeptid. Generalno, varijante određenog polinukleotida ili polipeptida iz objave imaće najmanje oko 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ali manje od 100% identičnosti sekvence sa onim određenim referentnim polinukleotidom ili polipeptidom kao što je određeno pomoću programa za poravnavanje sekvenci i parametara opisanih ovde i poznatih onima sa iskustvom u struci. Takvi alati za poravnanje uključuju one iz BLAST paketa (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, i David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.) Drugi alati su ovde opisani, specifično u definiciji "Identičnosti".
[0086] Podrazumevani parametri u BLAST algoritmu uključuju, na primer, očekivani prag od 10, veličina reči 28, ocene podudaranja/neusklađenosti 1, -2, troškovi praznine linearni. Može se primeniti bilo koji filter, kao i odabir za ponovke specifične za vrstu, npr. Homo sapiens.
Bočni regioni: netranslatirani regioni (UTR)
[0087] Kao što je ovde opisano, sintetički polinukleotidi iz objave uključuju netranslatirane regione. Netranslatirani regioni (UTR) gena se transkribuju, ali se ne translatiraju. 5'UTR počinje na početnom mestu transkripcije i nastavlja se do start kodona, ali ne uključuje start kodon; dok, 3'UTR počinje odmah nakon stop kodona i nastavlja se do signala završetka transkripcije. Sve je više dokaza o regulatornim ulogama koje imaju UTR u pogledu stabilnosti molekula nukleinske kiseline i translacije. Regulatorne osobine UTR mogu se inkorporisati u polinukleotide, primarne konstrukte i/ili mmRNK iz predmetne objave kako bi se poboljšala stabilnost molekula. Specifične osobine se takođe mogu inkorporisati kako bi se obezbedilo kontrolisano smanjenje ekspresije transkripta u slučaju da je pogrešno usmeren na mesta neželjenih organa.
[0088] Primeri UTR uključuju, ali nisu ograničeni na one koji se nalaze u nastavku.
[0089] Tabele 2 i 3 iz zajedničke nerešene S.A.D. privremene patentne prijave br.61/737.130 koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151666 zahteva pravo prvenstva obezbeđuju spisak primera UTR koji mogu se koristiti u primarnom konstruktu iz predmetne objave kao bočni regioni. Mogu se koristiti varijante 5' ili 3' UTR pri čemu se jedan ili više nukleotida dodaje ili uklanja sa terminusa, uključujući A, T, C ili G.
[0090] Treba razumeti da su oni nabrojani - primeri i da se bilo koji UTR iz bilo kog gena može inkorporisati u odgovarajući prvi ili drugi bočni region primarnog konstrukta. Pored toga, može se koristiti više UTR divljeg tipa bilo kog poznatog gena. Takođe je moguće obezbediti veštačke UTR koji nisu varijante gena divljeg tipa. Ovi UTR ili njihovi delovi mogu biti postavljeni u istoj orijentaciji kao u transkriptu iz kog su odabrani ili im se može izmeniti orijentacija ili lokacija. Stoga 5' ili 3' UTR mogu biti invertovani, skraćeni, produženi, učinjeni himernim sa jednim ili više drugih 5' UTR ili 3' UTR. Kao što se ovde upotrebljava, termin "izmenjen" kao što se odnosi na UTR sekvencu znači da je UTR na neki način promenjen u odnosu na referentnu sekvencu. Na primer, 3' ili 5' UTR može biti izmenjen u odnosu na divlji tip ili nativni UTR promenom orijentacije ili lokacije kao što je prethodno naučeno ili se može izmeniti inkluzijom dodatnih nukleotida, delecijom nukleotida, zamenom ili transpozicijom nukleotida. Bilo koja od ovih promena koje proizvode "izmenjeni" UTR (bilo da je 3' ili 5') sadrži varijantni UTR.
[0091] UTR se može odabrati od UTR opisanih u podužoj Tabeli 21 u zajedničkoj nerešenoj S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/775.509, koja je podneta 9. marta 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2014/164253 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Heterologous Untranslated Regions for mRNA i u podužoj Tabeli 21 i u Tabeli 22 u zajedničkoj nerešenoj S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/829.372, koja je podneta 31. maja 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151666 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Heterologous Untranslated Regions for mRNA.
[0092] U nekim slučajevima može se upotrebljavati dvostruki, trostruki ili četvorostruki UTR, kao što su 5' ili 3' UTR. Kao što se ovde upotrebljava, "dvostruki" UTR je onaj u kome su dve kopije istog UTR kodirane bilo u seriji ili suštinski u seriji. Na primer, dvostruki beta-globin 3' UTR se može upotrebljavati kao što je opisano u S.A.D. patentoj publikaciji 20100129877.
[0093] Takođe je moguće imati UTR sa obrascem. Kao što se ovde upotrebljava "UTR sa obrascem" su oni UTR koji odražavaju ponavljajući ili naizmenični obrazac, kao što su ABABAB ili AABBAABBAABB ili ABCABCABC ili njihove varijante ponovljene jednom, dvaput, ili više od 3 puta. U ovim obrascima, svako slovo, A, B, ili C predstavlja različit UTR na nivou nukleotida.
[0094] Bočni regioni mogu se odabrati iz porodice transkripata čiji proteini dele zajedničku funkciju, strukturu, osobinu svojstva. Na primer, polipeptidi od interesa mogu pripadati porodici proteina koji su eksprimirani u određenoj ćeliji, tkivu ili u neko vreme tokom razvića. UTR iz bilo kog od ovih gena mogu se zameniti za bilo koji drugi UTR iste ili različite porodice proteina kako bi se stvorio novi himerni primarni transkript. Kao što se ovde upotrebljava, "porodica proteina" se upotrebljava u najširem smislu da označi grupu od dva ili više polipeptida od interesa koji dele najmanje jednu funkciju, strukturu, osobinu, lokalizaciju, poreklo, ili obrazac ekspresije.
[0095] Sintetički polinukleotidi iz objave mogu sadržati netranslatiran region koji nije heterologan sa kodiranim proteinom od interesa. Kao neograničavajući primer, netranslatirani region može sadržati ceo ili njegov deo ili fragment jednog ili više netranslatiranih regiona opisanih u zajedničkoj nerešenoj S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/775.509, koja je podneta 9. marta 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2014/164253 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Heterologous Untranslated Regions for mRNA i S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/829.372, koja je podneta 15. marta 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151666 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Heterologous Untranslated Regions for mRNA.
5' UTR i inicijacija translacije
[0096] Sintetički polinukleotidi iz objave tipično uključuju 5' UTR. Prirodni 5' UTR imaju osobine koje igraju ulogu u inicijaciji translacije. Oni nose potpise kao što su Kozak sekvence za koje je opšte poznato da su uključene u postupak kojim ribozom pokreće translaciju mnogih gena. Kozak sekvence imaju konsenzus CCR(A/G)CCAUGG (SEQ ID NO: 126), gde je R purin (adenin ili guanin) tri baze uzvodno od start kodona (AUG), iza kog sledi još jedan 'G'. Takođe je poznato da 5' UTR formira sekundarne strukture koje su uključene u vezivanje faktora elongacije.
[0097] Projektovanjem osobina koje se tipično nalaze u obilno eksprimiranim genima specifičnih ciljnih organa, može se poboljšati stabilnost i proizvodnja proteina sintetičkih polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK iz objave. Na primer, introdukovanje 5' UTR mRNK eksprimirane u jetri, kao što je albumin, serumski amiloid A, apolipoprotein A/B/E, transferin, alfa fetoprotein, eritropoetin, ili faktor VIII, moglo bi se upotrebljavati za poboljšanje ekspresije molekula nukleinske kiseline, kao što je mmRNK, u hepatičkim ćelijskim linijama ili jetri. Slično, upotreba 5' UTR iz drugih tkivno specifičnih mRNK za poboljšanje ekspresije u tom tkivu je moguća - za mišiće (MyoD, Myosin, Myoglobin, Myogenin, Herculin), za endotelske ćelije (Tie-1, CD36), za mijeloidne ćelije (C/EBP, AML1, G-CSF, GM-CSF, CD11b, MSR, Fr-1, i-NOS), za leukocite (CD45, CD18), za masno tkivo (CD36, GLUT4, ACRP30, adiponektin) i za epitelske ćelije pluća (SP-A/B/C/D).
2
[0098] Druge ne-UTR sekvence mogu biti inkorporisane u 5' (ili 3' UTR) UTR. Na primer, introni ili delovi intronskih sekvenci mogu biti inkorporisani u bočne regione polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK iz objave. Inkorporisanje intronskih sekvenci može povećati proizvodnju proteina, kao i nivoe mRNK.
[0099] 5' UTR koji može biti odabran za upotrebu u predmetnoj objavi može biti strukturisani UTR kao što je, ali bez ograničavanja na, 5' UTR za kontrolu translacije. Kao neograničavajući primer, strukturisani 5' UTR može biti koristan kada se upotrebljava bilo koja od terminusnih modifikacija opisanih u zajedničkoj nerešenoj S.A.D. privremenoj prijavi br. 61/758.921 koja je podneta 31. januara 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2014/081507 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs; S.A.D. privremenoj prijavi br.61/781.139 koja je podneta 14. marta 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151666 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs; S.A.D. privremenoj prijavi br.61/729.933 koja je podneta 26. novembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151666 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Terminally Optimized RNAs; S.A.D. privremenoj prijavi br.
61/737.224 koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151666 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Terminally Optimized RNAs i S.A.D. privremenoj prijavi br. 61/829.359 koja je podneta 31. maja 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151666 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Terminally Optimized RNAs.
3' UTR i elementi bogati sa AU
[0100] Sintetički polinukleotidi iz objave tipično uključuju 3' UTR. Poznato je da 3' UTR imaju u sebe ugrađene bnizove adenozina i uridina. Ovi AU bogati potpisi posebno su zastupljeni u genima sa visokim stopama orbta. Na osnovu osobina svojih sekvenci i funkcionalnih svojstava, elementi bogati sa AU (ARE) mogu se podeliti u tri klase (Chen et al, 1995): ARE klase I sadrže nekoliko dispergovanih kopija AUUUA motiva unutar U-bogatih regiona. C-Myc i MyoD sadrže ARE klase I. ARE klase II poseduju dva ili više preklapajućih UUAUUUA(U/A)(U/A) monomera. Molekuli koji sadrže ovaj tip ARE uključuju GM-CSF i TNF-a. ARE klase III su slabije definisani. Ovi regioni bogati sa U ne sadrže AUUUA motiv. c-Jun i miogenin su dva dobro proučena primera ove klase. Poznato je da većina proteina koji se vezuju za ARE destabilizuju glasnika, dok je za članove ELAV porodice, pre svega HuR, dokumentovano da povećavaju stabilnost mRNK. HuR se vezuje za ARE sve tri klase. Projektovanje HuR specifičnih vezujućih mesta u 3' UTR molekula nukleinske kiseline će dovesti do vezivanja HuR i stoga, stabilizacije poruke in vivo.
[0101] Introdukcija, uklanjanje ili modifikacija 3' UTR elemenata bogatih sa AU (ARE) može se upotrebljavati za modulisanje stabilnosti polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK iz objave. Kada se projektuju specifični polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK, može se introdukovati jedna ili više kopija ARE kako bi se polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz objave učinili manje stabilnim i time se smanjila translacija i smanjila proizvodnja rezultujućeg proteina. Slično, ARE mogu se identifikovati i ukloniti ili mutirati kako bi se povećala unutarćelijska stabilnost i stoga povećala translacija i proizvodnja rezultujućeg proteina. Eksperimenti transfekcije mogu se izvesti u relevantnim ćelijskim linijama, upotrebom polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK iz objave, i proizvodnja proteina može se testirati u različitim vremenskim tačkama posle transfekcije. Na primer, ćelije mogu se transfektovati sa različitim ARE-projektovanim molekulima i upotrebom ELISA kompleta za relevantni protein i testiranjem proteina proizvedenog 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati, i 7 dana posle transfekcije.
3' UTR i mikroRNK vezujuća mesta
[0102] Sintetički polinukleotidi iz objave mogu uključivati miRNK vezujuće mesto u 3' UTR. MikroRNK (ili miRNK) je 19-25 nukleotida dugačka nekodirajuća RNK koja se vezuje za 3' UTR molekula nukleinske kiseline i smanjuje ekspresiju gena bilo redukovanjem stabilnosti molekula nukleinske kiseline ili inhibiranjem translacije. Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz objave mogu sadržati jednu ili više mikroRNK ciljnih sekvenci, mikroRNK sekvenci, mikroRNK vezujućih mesta, ili semena mikroRNK. Takve sekvence mogu odgovarati bilo kojoj poznatoj mikroRNK, kao što su one o kojima se podučava u S.A.D. publikaciji US2005/0261218 i S.A.D. publikaciji US2005/0059005, ili onima nabrojanim u Tabeli 7 zajedničke nerešene prijave USSN 61/758,921 koja je podneta 31. januara 2013. godine (advokatski identifikacioni broj (Attorney Docket Number) 2030.1039).
[0103] Primeri 3' UTR koji sadrže miRNK vezujuća mesta uključuju, ali nisu ograničeni na one koji se nalaze u Tabelama u nastavku.
[0104] MikroRNK sekvenca sadrži region "semena", tj. sekvencu u regionu pozicija 2-8 zrele mikroRNK, čija sekvenca ima savršenu Votson-Krik (Watson-Crick) komplementarnost sa miRNK ciljnom sekvencom. Seme mikroRNK može sadržati pozicije 2-8 ili 2-7 zrele mikroRNK. Seme mikroRNK može sadržati 7 nukleotida (npr. nukleotide 2-8 zrele
2
mikroRNK), pri čemu je mesto komplementarno semenu u odgovarajućem miRNK cilju omeđeno adeninom (A) suprotno mikroRNK poziciji 1. Seme mikroRNK može sadržati 6 nukleotida (npr. nukleotidi 2-7 zrele mikroRNK), pri čemu je mesto komplementarno semenu u odgovarajućem miRNK cilju omeđeno adeninom (A) suprotno mikroRNK poziciji 1. Videti, na primer, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 2007 jul 6; 27(1):91-105. Baze semena mikroRNK imaju potpunu komplementarnost sa ciljnom sekvencom. Projektovanjem mikroRNK ciljnih sekvenci u 3' UTR polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK iz objave može se ciljati molekul radi degradacije ili redukovane translacije, pod uslovom da je dostupna dotična mikroRNK. Ovaj postupak će redukovati opasnost od nespecifičnih efekata nakon isporuke molekula nukleinske kiseline. Saopšteni su identifikacija mikroRNK, mikroRNK ciljnih regiona, i njihovi obrasci ekspresije i uloge u biologiji (Bonauer et al., Curr Drug Targets 201011:943-949; Anand i Cheresh Curr Opin Hematol 201118:171-176; Contreras i Rao Leukemia 2012 26: 404-413 (2011 dec 20. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf et al, Cell, 2007129:1401-1414).
[0105] Na primer, ukoliko je molekul nukleinske kiseline mRNK i nije namenjen da bude isporučen u jetru ali tamo završi, tada miR-122, mikroRNK bogato zastupljena u jetri, može inhibirati ekspresiju gena od interesa ukoliko su jedno ili više ciljnih mesta miR-122 projektovana u 3' UTR polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK. Introdukcija jednog ili više vezujućih mesta za različite mikroRNK može se projektovati da dodatno smanji dugovečnost, stabilnost, i translaciju proteina polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK.
[0106] Kao što se ovde upotrebljava, termin "mikroRNK mesto" označava ciljno mesto mikroRNK ili mesto prepoznavanja mikroRNK, ili bilo koju nukleotidnu sekvencu za koju se mikroRNK vezuje ili asocira. Treba razumeti da "vezivanje" može slediti pravila tradicionalne Votson-Krik hibridizacije ili može odražavati bilo kakvu stabilnu asociranost mikroRNK sa ciljnom sekvencom na ili pored mikroRNK mesta.
[0107] Nasuprot tome, za potrebe polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK iz predmetne objave, mikroRNK vezujuća mesta mogu se projektovati od (tj. ukloniti iz) sekvenci u kojima se prirodno javljaju kako bi se povećala ekspresija proteina u specifičnim tkivima. Na primer, miR-122 vezujuća mesta mogu se ukloniti kako bi se poboljšala ekspresija proteina u jetri. Regulacija ekspresije u više tkiva može se postići introdukovanjem ili uklanjanjem jednog ili nekoliko mikroRNK vezujućih mesta.
2
[0108] Primeri tkiva gde je poznato da mikroRNK reguliše mRNK, i time ekspresiju proteina, uključuju, ali nisu ograničeni na, jetru (miR-122), mišiće (miR-133, miR-206, miR-208), endotelske ćelije (miR-17-92, miR-126), nervni sistem (mir-124a, miR-9), pluripotentne ćelije (miR-302, miR-367, miR-290, miR-371, miR-373), ćelije ostrvaca pankreasa (miR-375), mijeloidne ćelije (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), masno tkivo (let-7, miR-30c), srce (miR-1d, miR-149), bubreg (miR-192, miR-194, miR-204), i epitelske ćelije pluća (let-7, miR-133, miR-126).
[0109] MikroRNK takođe može regulisati složene biološke procese kao što je angiogeneza (miR-132) (Anand i Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176). U polinukleotidima, primarnim konstruktima ili mmRNK iz objave, mikroRNK vezujuća mesta koja su uključena u takve procemogu se se ukloniti ili introdukovati, kako bi se ekspresija polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK prilagodila biološki relevantnim tipovima ćelija ili kontekstu relevantnih bioloških procesa.
[0110] Takođe je poznato da se mikroRNK eksprimiraju u imunskim ćelijama (koje se nazivaju i hematopoetske ćelije), na primer, antigen prezentujućim ćelijama (npr. dendritske ćelije i makrofagi). MikroRNK specifične za imunske ćelije uključene su u imunogenost, autoimunost, imunski odgovor na infekciju, inflamaciju, kao i u neželjeni imunski odgovor posle genske terapije i transplantacije tkiva/organa. Na primer, miR-142 i miR-146 se eksprimiraju isključivo u imunskim ćelijama, posebno su bogato zastupljene u mijeloidnim dendritskim ćelijama. Introdukovanje miR-142 vezujućeg mesta u 3'-UTR polinukleotida ili konstrukta za isporuku gena može selektivno suprimirati ekspresiju gena u antigen prezentujućim ćelijama putem degradacije mRNK posredovane sa miR-142, ograničavajući prezentaciju antigena u profesionalnim APC (npr. dendritske ćelije) i na taj način sprečavajući antigen-posredovani imunski odgovor posle isporuke gena (videti, Annoni A et al., blood, 2009, 114, 5152-5161). U polinukleotidima, primarnim konstruktima ili mmRNK iz predmetne objave, mikroRNK vezujuća mesta koja su uključena u takve procemogu se biti introdukovana, kako bi se redukovala ekspresija polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK iz predmetne objave u APC i da bi se oslabio imunski odgovor posredovan antigenom.
[0111] Konačno, razumevanjem obrazaca ekspresije mikroRNK u različitim tipovima ćelija, polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu se projektovati za ciljaniju ekspresiju u specifičnim tipovima ćelija ili samo pod specifičnim biološkim uslovima. Introdukovanjem tkivno specifičnih mikroRNK vezujućih mesta, mogli bi se dizajnirati polinukleotidi, primarni
2
konstrukti ili mmRNK koji bi bili optimalni za ekspresiju proteina u tkivu ili u kontekstu biološkog stanja.
[0112] Eksperimenti transfekcije mogu se izvesti u relevantnim ćelijskim linijama, upotrebom projektovanih polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK, i proizvodnja proteina može se testirati u različitim vremenskim tačkama posle transfekcije. Na primer, ćelije mogu se transfektovati sa različitim mikroRNK vezujuće mesto-projektovanim polinukleotidima, primarnim konstruktima ili mmRNK i upotrebom ELISA kompleta za relevantni protein i testiranjem proteina proizvedenog 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata i 7 dana posle transfekcije. In vivo eksperimenti se takođe mogu izvesti upotrebom mikroRNK vezujuće mesto-projektovanih molekula kako bi se ispitale promene u tkivno specifičnoj ekspresiji formulisanih polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK.
Virusne sekvence
[0113] Dopunske virusne sekvence, kao što je, ali bez ograničavanja na sekvencu pojačivača translacije virusa žute patuljavosti ječma (BYDV-PAV) mogu se projektovati i insertovati u 3' UTR sintetičkih polinukleotida, polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK iz objave i mogu stimulisati translaciju konstrukta in vitro i in vivo. Eksperimenti transfekcije mogu se izvesti u relevantnim ćelijskim linijama i proizvodnja proteina može se testirati pomoću ELISA na 12 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata i dana 7 posle transfekcije.
Dodavanje 5' kape
[0114] Sintetički polinukleotidi iz objave mogu uključivati region dodavanja 5' kape ili 5' kapu. Struktura 5' kape mRNK uključena je u eksport iz nukleusa, povećavajući stabilnost mRNK i vezuje mRNK kapa vezujući protein (CBP), koji je odgovoran za stabilnost mRNK u ćeliji i kompetenciju za translaciju preko asociranja CBP sa poli(A) vezujućim proteinom kako bi se formirale zrele ciklične mRNK vrste. Kapa dodatno pomaže u uklanjanju 5' proksimalnih introna tokom splajsovanja mRNK.
[0115] Endogenim molekulima mRNK može biti dodata kapa na 5'-kraju generišući 5'-ppp-5'-trifosfatnu vezu između terminusnog ostatka guanozin kape i 5'-terminusnog transkribovanog sens nukleotida molekula mRNK. Ova 5'-guanilat kapa se zatim može metilovati kako bi se generisao N7-metil-guanilat ostatak. Šećeri riboze terminusnih i/ili anteterminusnih transkribovanih nukleotida 5' kraja mRNK mogu opciono takođe biti 2'-O-metilovani.
2
Uklanjanje 5' kape putem hidrolize i isecanje strukture guanilat kape može ciljati molekul nukleinske kiseline, kao što je molekul mRNK, za degradaciju.
[0116] Modifikacije na polinukleotidima, primarnim konstruktima, i mmRNK iz predmetne objave mogu generisati strukturu kape koja se ne može hidrolizovati, sprečavajući uklanjanje kepe i stoga povećavajući poluživot mRNK. Pošto hidroliza strukture kape zahteva isecanje 5'-ppp-5' fosforodiestarskih veza, tokom reakcije dodavanja kape mogu se upotrebljavati modifikovani nukleotidi. Na primer, Vaccinia Capping Enzyme od New England Biolabs (Ipswich, MA) može se upotrebljavati sa α-tio-guanozin nukleotidima u skladu sa uputstvima proizvođača kako bi se kreirale fosforotioatne veze u 5'-ppp-5' kapi. Mogu se upotrebljavati dopunski modifikovani guanozin nukleotidi, kao što su α-metil-fosfonat i seleno-fosfat nukleotidi.
[0117] Dopunske modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, 2'-O-metilaciju šećera riboze 5'-terminusnih i/ili 5'-anteterminusnih nukleotida mRNK (kao što je prethodno pomenuto) na 2'-hidroksilnoj grupi šećernog prstena. Više različitih struktura 5'-kape može se upotrebljavati kako bi se generisala 5'-kapa molekula nukleinske kiseline, kao što je molekul mRNK.
[0118] Analozi kape, koji se ovde takođe označavaju kao sintetički analozi kape, hemijske kape, hemijski analozi kape, ili strukturni ili funkcionalni analozi kape, razlikuju se od prirodnih (tj. endogenih, divljeg tipa ili fizioloških) 5'-kapa po svojoj hemijskoj strukturi, zadržavajući funkciju kape. Analozi kape mogu biti hemijski (tj. neenzimski) ili enzimski sintetisani i/povezani za molekul nukleinske kiseline.
[0119] Na primer, anti-reverzni analog kape (ARCA) sadrži dva guanina povezana pomoću 5'-5'-trifosfatne grupe, pri čemu jedan guanin sadrži N7 metil grupu kao i 3'-O-metil grupu (tj. N7,3'-O-dimetil-guanozin-5'-trifosfat-5'-guanozin (m<7>G-3'mppp-G; koji ekvivalentno može biti označen kao 3' O-Mem7G(5')ppp(5')G). 3'-O atom drugog, nemodifikovanog, guanina postaje vezan za 5'-terminusni nukleotid molekula nukleinske kiseline sa kapom (npr. mRNK ili mmRNK). N7- i 3'-O-metilovani guanin obezbeđuje terminusni deo molekula nukleinske kiseline sa kapom (npr. mRNK ili mmRNK).
[0120] Sledeći primer kape je mCAP, koja je slična sa ARCA ali ima 2'-O-metil grupu na guanozinu (tj. N7,2'-O-dimetil-guanozin-5'-trifosfat-5'-guanozin, m<7>Gm-ppp-G).
[0121] Dok analozi kape omogućavaju istovremeno dodavanje kape molekulu nukleinske kiseline u reakciji in vitro transkripcije, do 20% transkripata ostaje bez dodate kape. Ovo, kao i strukturne razlike analoga kape u odnosu na endogenu strukturu 5'-kape nukleinskih kiselina koje proizvode endogene, ćelijske mašinerije za transkripciju, mogu dovesti do redukovane translacione kompetencije i redukovane ćelijske stabilnosti.
2
[0122] Polinukleotidima, primarnim konstruktima i mmRNK iz objave takođe mogu biti dodate kape posttranskripciono, upotrebom enzima, kako bi se generisale autentičnije strukture 5'-kape. Kao što se ovde upotrebljava, fraza "autentičnije" označava osobinu koja blisko odražava ili oponaša, bilo strukturno ili funkcionalno, endogenu ili osobinu divljeg tipa. To jest, "autentičnija" osobina je bolji predstavnik endogene, divljeg tipa, prirodne ili fiziološke ćelijske funkcije i/ili strukture u poređenju sa sintetičkim osobinama ili analozima, itd. iz stanja tehnike, ili koja nadmašuje odgovarajuće endogene, divljeg tipa, prirodne ili fiziološke osobine u jednom ili više aspekata. Neograničavajući primeri autentičnijih struktura 5' kape iz predmetne objave su oni koji, između ostalog, imaju poboljšano vezivanje kapa vezujućih proteina, produženi poluživot, redukovanu podložnost 5' endonukleazama i/ili redukovano uklanjanje 5' kape, u poređenju sa sintetičkim strukturama 5' kape poznatim u struci (ili sa strukturom 5' kape divljeg tipa, prirodnom ili fiziološkom). Na primer, rekombinantni Vaccinia Virus Capping Enzyme i rekombinantni 2'-O-metiltransferaza enzim mogu kreirati kanonsku 5'-5'-trifosfatnu vezu između 5'-terminusnog nukleotida mRNK i nukleotida guanin kape, pri čemu guanin kapa sadrži N7 metilaciju i 5'-terminusni nukleotid mRNK sadrži 2'-O-metil. Takva struktura se naziva Capl struktura. Ova kapa rezultuje višom translacionom kompetencijom i ćelijskom stabilnošću i redukovanom aktivacijom ćelijskih proinflamatornih citokina, u poređenju, npr. sa drugim analognim strukturama 5' kape poznatim u struci. Strukture kape uključuju 7mG(5')ppp(5')N,pN2p (kapa 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp (kapa 1), i 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (kapa 2).
[0123] Pošto polinukleotidima, primarnim konstruktima ili mmRNK može biti dodata kapa posttranskripciono, i pošto je ovaj postupak efikasniji, skoro 100% polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK može biti sa kapom. Ovo je u suprotnosti sa ~ 80% kada je analog kape povezan za mRNK tokom reakcije in vitro transkripcije.
[0124] U skladu sa predmetnom objavom 5' terminusne kape mogu uključivati endogene kape ili analoge kapa. U skladu sa predmetnom objavom 5' terminusna kapa može sadržati analog guanina. Korisni analozi guanina uključuju inozin, N1-metil-guanozin, 2'fluoro-guanozin, 7-deaza-guanozin, 8-okso-guanozin, 2-amino-guanozin, LNA-guanozin, i 2-azido-guanozin.
IRES sekvence
[0125] Dodatno, obezbeđeni su sintetički polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK koji mogu sadržati unutrašnje mesto ulaska ribozoma (IRES). Prvi put identifikovan kao osobina RNK iz Picorna virusa, IRES igra važnu ulogu u inicijaciji sinteze proteina u odsustvu strukture 5' kape. IRES može delovati kao jedino vezujuće mesto za ribozom, ili može poslužiti kao jedno od više vezujućih mesto za ribozom na mRNK. Sintetički polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK koji sadrže više od jednog funkcionalnog vezujućeg mesta za ribozom mogu kodirati nekoliko peptida ili polipeptida koji se nezavisno translatiraju pomoću ribozoma ("multicistronski molekuli nukleinske kiseline"). Kada su polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK obezbeđeni sa IRES, dodatno opciono je obezbeđen drugi translatabilni region. Primeri IRES sekvenci koje mogu se upotrebljavati u skladu sa pronalaskom uključuju bez ograničavanja na, one iz pikornavirusa (npr. FMDV), virusa štetočina (CFFV), polio virusa (PV), virusa encefalomiokarditisa (ECMV), virusa slinavke i šapa (FMDV), virusa hepatitisa C (HCV), virusa klasične svinjske kuge (CSFV), virusa leukemije miša (MLV), virusa imunodeficijencije simijana (SIV) ili virusa paralize zrikavaca (CrPV).
Stop kodoni
[0126] Primarni konstrukti iz predmetne objave mogu uključivati najmanje dva stop kodona pre 3' netranslatiranog regiona (UTR). Stop kodon se može odabrati između TGA, TAA i TAG. U jednom aspektu, primarni konstrukti iz predmetne objave uključuju stop kodon TGA i jedan dopunski stop kodon. U dodatnom aspektu dopunski stop kodon može biti TAA.
[0127] Primarni konstrukti iz predmetne objave mogu uključivati tri stop kodona pre 3' netranslatiranog regiona (UTR).
Signalne sekvence
[0128] Primarni konstrukti ili mmRNK mogu takođe kodirati dopunske osobine koje olakšavaju transport polipeptida do terapijski relevantnih mesta. Jedna takva osobina koja pomaže u transportu proteina je signalna sekvenca. Kao što se ovde upotrebljava, "signalna sekvenca" ili "signalni peptid" je polinukleotid ili polipeptid, respektivno, koji je dugačak od oko 9 do 200 nukleotida (3-60 amino-kiselina) koji je inkorporisan na 5' (ili N-terminus) kodirajućeg regiona ili kodiranog polipeptida, respektivno. Dodavanje ovih sekvenci rezultuje transportom kodiranog polipeptida u endoplazmin retikulum putem jednog ili više sekretornih puteva. Neki signalni peptidi se isecaju sa proteina pomoću signalne peptidaze pošto su proteini transportovani.
1
[0129] Signalne sekvence mogu se odabrati od bilo kojih od onih nabrojanih u zajedničkim nerešenim patentnim prijavama: S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/618.862, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151666 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Biologics; S.A.D. privremena patentna prijava br.61/681.645, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Biologics; S.A.D. privremena patentna prijava br.
61/737.130, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151666 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Biologics; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/618.866, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/681.647, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies: S.A.D. privremena patentna prijava br.
61/737.134, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151670 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies: S.A.D. privremena patentna prijava br.61/618.868, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/090648 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/681.648, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines: S.A.D. privremena patentna prijava br.
61/737.135, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151670 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/618.870, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/681.649, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/737.139, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151670 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides; S.A.D.
2
privremena patentna prijava br. 61/618.873, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/090648 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins: S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/681.650, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/737.147, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151670 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/618.878, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br.61/681.654, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/737.152, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151670 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/618.885, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br.61/681.658, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br.
61/737.155, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151670 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br.
61/618.896, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br.
61/668.157, koja je podneta 5. jula 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br.
61/681.661, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br.
61/737.160, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151670 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br.
61/618.911, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/681.667, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/737.168, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151670 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/618.922, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br.
61/681.675, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/737.174, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151670, zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/618.935, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; S.A.D. privremena patentna prijava br.61/681.687, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/737.184, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151670 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/618.945, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; S.A.D. privremena patentna prijava br.61/681.696, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified
4
Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/737.191, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151670 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/618.953, koja je podneta 2. aprila 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; S.A.D. privremena patentna prijava br.61/681.704, koja je podneta 10. avgusta 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151736 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; S.A.D. privremena patentna prijava br. 61/737.203, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO 2013/151670 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, međunarodna prijava br. PCT/US2013/030062, koja je podneta 9. marta 2013. godine, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease; međunarodna prijava br. PCT/US2013/030063, koja je podneta 9. marta 2013. godine, pod naslovom Modified Polynucleotides; međunarodna prijava br. PCT/US2013/030064, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; međunarodna prijava br. PCT/US2013/030059, koja je podneta 9. marta 2013. godine, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins; međunarodna prijava br. PCT/US2013/030066, koja je podneta 9. marta 2013. godine, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; međunarodna prijava br. PCT/US2013/030067, koja je podneta 9. marta 2013. godine, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; međunarodna prijava br. PCT/US2013/030060, koja je podneta 9. marta 2013. godine, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; međunarodna prijava br. PCT/US2013/030061, koja je podneta 9. marta 2013. godine, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; međunarodna prijava br. PCT/US2013/030068, koja je podneta 9. marta 2013. godine, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides; i međunarodna prijava br. PCT/US2013/030070, koja je podneta 9. marta 2013. godine, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides; međunarodna patentna prijava br. PCT/US2013/031821, koja je podneta 15. marta 2013. godine, pod naslovom In Vivo Production of Proteins. Proteinske signalne sekvence koje mogu biti inkorporisane za kodiranje od strane polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK iz objave uključuju signalne sekvence iz α-1-antitripsina, G-CSF, faktora IX, prolaktina, albumina, HMMSP38, ornitin karbamoiltransferaze, podjedinice 8A citohrom C oksidaze, tipa III, bakterijskih, virusnih, sekretornih signala, Vrg-6, PhoA, OmpA, STI, STII, amilaze, alfa faktora, endoglukanaze V, sekretornih signala, fungalnih, fibronektina i interleukina (npr. IL12).
[0130] U tabeli zajedničkih nerešenih patenatnih prijava, SS je sekretorni signal i MLS je mitohondrijski lider signal. Primarni konstrukti ili mmRNK iz predmetne objave mogu biti dizajnirani da kodiraju bilo koju od signalnih sekvenci ili njihove fragmente ili varijante. Ove sekvence mogu biti uključene na početku kodirajućeg regiona polipeptida, u sredini ili na terminusu ili alternativno u bočnom regionu.
[0131] Dopunske signalne sekvence koje mogu se koristiti u predmetnoj objavi uključuju one o kojima podučavaju, na primer, baze podataka kao što su one koje mogu se pronaći na http://www.signalpeptide.de/ ili http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/ ili one opisane u S.A.D. patentima 8.124.379; 7.413.875 i 7.385.034.
Signali i mesta isecanja proteina
[0132] Polipeptidi iz predmetne objave mogu uključivati najmanje jedan signal isecanja proteina koji sadrži najmanje jedno mesto isecanja proteina. Mesto isecanja proteina može biti locirano na N-terminusu, C-terminusu, na bilo kom prostoru između N- i C-terminusa, kao što je, ali bez ograničavanja, na pola puta između N- i C-terminusa, između N-terminusa i tačke na pola puta, između tačke na pola puta i C-terminusa, i njihove kombinacije.
[0133] Polipeptidi iz predmetne objave mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, proprotein konvertazu (ili prohormonsku konvertazu), trombin ili signal isecanja faktor Xa proteina. Proprotein konvertaze su porodica od devet proteinaza, koje sadrže sedam serin proteinaza sličnih subtilizinu specifičnih za bazne amino-kiseline srodnih sa keksinom kvasca, poznate kao prohormonska konvertaza 1/3 (PC1/3), PC2, furin, PC4, PC5/6, enzim za isecanje sparenih baznih amino-kiselina 4 (PACE4) i PC7, i dve druge subtilaze koje isecaju na nebaznim ostacima, nazvane subtilizin keksin izozim 1 (SKI-1) i proproteinkonvertaza subtilizin keksin 9 (PCSK9).
[0134] Primarni konstrukti i mmRNK iz predmetne objave mogu biti projektovani tako da primarni konstrukt ili mmRNK sadrži najmanje jedan kodirani signal isecanja proteina. Kodirani signal isecanja proteina može biti lociran pre start kodona, posle start kodona, pre kodirajućeg regiona, unutar kodirajućeg regiona, kao što je, ali bez ograničavanja, na pola puta u kodirajućem regionu, između start kodona i tačke na pola puta, između tačke na pola puta i stop kodona, posle kodirajućeg regiona, pre stop kodona, između dva stop kodona, posle stop kodona, i njihove kombinacije.
[0135] Primarni konstrukti ili mmRNK iz predmetne objave mogu uključivati najmanje jedan kodirani signal isecanja proteina koji sadrži najmanje jedno mesto isecanja proteina. Kodirani signal isecanja proteina može uključivati, ali bez ograničavanja na, proprotein konvertazu (ili prohormonsku konvertazu), trombin i/ili signal isecanja faktor Xa proteina. Osoba sa iskustvom u struci može upotrebiti Tabelu 1 u nastavku ili druge poznate postupke za određivanje odgovarajućeg kodiranog signala isecanja proteina koji treba uključiti u primarne konstrukte ili mmRNK iz predmetne objave. Na primer, počevši od signalne sekvence i uzimajući u obzir kodone iz Tabele 1, može se dizajnirati signal za primarni konstrukt koji može proizvesti proteinski signal u rezultujućem polipeptidu.
[0136] Polipeptidi iz predmetne objave mogu uključivati najmanje jedan signal isecanja proteina i/ili mesto.
[0137] Kao neograničavajući primer, S.A.D. pat. br. 7.374.930 i S.A.D. pub. br.
20090227660, upotrebljavaju furin mesto isecanja za isecanje N-terminusnog metionina sa GLP-1 u produktu ekspresije iz Goldži aparata ćelija. U jednom slučaju, polipeptidi iz predmetne objave uključuju najmanje jedan signal isecanja proteina i/ili mesto pod uslovom da polipeptid nije GLP-1.
[0138] U nekim slučajevima, primarni konstrukti ili mmRNK iz predmetne objave uključuju najmanje jedan kodirani signal isecanja proteina i/ili mesto.
[0139] U nekim slučajevima, primarni konstrukti ili mmRNK iz predmetne objave uključuju najmanje jedan kodirani signal isecanja proteina i/ili mesto pod uslovom da primarni konstrukt ili mmRNK ne kodira GLP-1.
[0140] Primarni konstrukti ili mmRNK iz predmetne objave mogu uključivati više od jednog kodirajućeg regiona. Tamo gde je prisutno više kodirajućih regiona u primarnom konstruktu ili mmRNK iz predmetne objave, više kodirajućih regiona može biti odvojeno kodiranim mestima isecanja proteina. Kao neograničavajući primer, primarni konstrukt ili mmRNK može biti napisana po uređenom obrascu. Takav obrazac sledi AXBY oblik gde su A i B kodirajući regioni koji mogu biti isti ili različiti kodirajući regioni i/ili mogu kodirati iste ili različite polipeptide, i X i Y su kodirani signali isecanja proteina koji mogu kodirati iste ili različite signale isecanja proteina. Drugi takav obrazac sledi oblik AXYBZ gde su A i B kodirajući regioni koji mogu biti isti ili različiti kodirajući regioni i/ili mogu kodirati iste ili različite polipeptide, i X, Y i Z su kodirani signali isecanja proteina koji mogu kodirati iste ili različite signale isecanja proteina. Treći obrazac sledi oblik ABXCY gde su A, B i C kodirajući regioni koji mogu biti isti ili različiti kodirajući regioni i/ili mogu kodirati iste ili različite polipeptide, i X i Y su kodirani signali isecanja proteina koji mogu kodirati iste ili različite signale isecanja proteina.
[0141] Polipeptidi, primarni konstrukti i mmRNK takođe mogu sadržati sekvence koje kodiraju mesta isecanja proteina, tako da se polipeptidi, primarni konstrukti i mmRNK mogu osloboditi iz regiona nosača ili fuzionog partnera tretmanom sa specifičnom proteazom za navedeno mesto isecanja proteina.
Poli-A repovi
[0142] Sintetički polinukleotidi iz objave tipično uključuju 3' repne sekvence, npr. poli-A rep. Tokom RNK obrade, dugačak lanac adenin nukleotida (poli-A rep) može se dodati polinukleotidu, kao što su molekuli mRNK kako bi se povećala stabilnost. Odmah posle transkripcije, 3' kraj transkripta se može iseći kako bi se oslobodio 3' hidroksil. Zatim poli-A polimeraza dodaje lanac adenin nukleotida na RNK. Proces, nazvan poliadenilacija, dodaje poli-A rep koji može biti dugačak između 100 i 250 ostataka.
[0143] Otkriveno je da jedinstvene dužine poli-A repa obezbeđuju određene prednosti polinukleotidima, primarnim konstruktima ili mmRNK iz predmetne objave.
[0144] Generalno, dužina poli-A repa iz predmetne objave je veća od dužine od 30 nukleotida. U drugom slučaju, poli-A rep je veći od dužine od 35 nukleotida (npr. najmanje ili veći od oko 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500, i 3.000 nukleotida). U nekim slučajevima, polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK uključuje od oko 30 do oko 3.000 nukleotida (npr. od 30 do 50, od 30 do 100, od 30 do 250, od 30 do 500, od 30 do 750, od 30 do 1.000, od 30 do 1.500, od 30 do 2.000, od 30 do 2.500, od 50 do 100, od 50 do 250, od 50 do 500, od 50 do 750, od 50 do 1.000, od 50 do 1.500, od 50 do 2.000, od 50 do 2.500, od 50 do 3.000, od 100 do 500, od 100 do 750, od 100 do 1.000, od 100 do 1.500, od 100 do 2.000, od 100 do 2.500, od 100 do 3.000, od 500 do 750, od 500 do 1.000, od 500 do 1.500, od 500 do 2.000, od 500 do 2.500, od 500 do 3.000, od 1.000 do 1.500, od 1.000 do 2.000, od 1.000 do 2.500, od 1.000 do 3.000, od 1.500 do 2.000, od 1.500 do 2.500, od 1.500 do 3.000, od 2.000 do 3.000, od 2.000 do 2.500 i od 2.500, do 3.000).
[0145] U nekim slučajevima, poli-A rep je dizajniran u odnosu na dužinu sveukupnih polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK. Ovaj dizajn može biti zasnovan na dužini kodirajućeg regiona, dužini određene osobine ili regiona (kao što su prvi ili bočni regioni), ili zasnovan na dužini krajnjeg proizvoda eksprimiranog iz polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK.
[0146] U ovom kontekstu poli-A rep može biti 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% veći po dužini od polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK ili njihove osobine. Poli-A rep takođe može biti dizajniran kao frakcija polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK kojima pripada. U ovom kontekstu, poli-A rep može biti 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ili 90% ili više od ukupne dužine konstrukta ili ukupne dužine konstrukta minus poli-A rep. Dodatno, projektovana vezujuća mesta i konjugacija polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK za poli-A vezujući protein mogu poboljšati ekspresiju.
[0147] Dopunski, više različitih polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK mogu biti povezani zajedno za PABP (poli-A vezujući protein) preko 3'-kraja upotrebom modifikovanih nukleotida na 3'-terminusu poli-A repa. Eksperimenti transfekcije mogu se izvesti u relevantnim ćelijskim linijama i proizvodnja proteina može se testirati pomoću ELISA 12 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata i dana 7 posle transfekcije.
[0148] U jednom aspektu, polinukleotidni primarni konstrukti iz predmetne objave su dizajnirani tako da uključuju poliA-G kvartet. G-kvartet je ciklični vodonično vezan niz od četiri guanin nukleotida koji može biti formiran od strane sekvenci bogatih sa G i u DNK i u RNK. U ovom aspektu, G-kvartet je inkorporisan na kraju poli-A repa. Rezultujući mmRNK konstrukt se testira na stabilnost, proizvodnju proteina i druge parametre, uključujući poluživot u različitim vremenskim tačkama. Otkriveno je da poliA-G kvartet rezultuje proizvodnjom proteina ekvivalentnom najmanje 75% od one koja je primećena upotrebom poli-A repa od 120 nukleotida samih.
II. Sintetičke male vodeće RNK (sgRNK)
[0149] Objava takođe uključuje sintetičke male vodeće RNK ili sgRNK. Sintetička sgRNK cilja gen od interesa, npr. gen gde je poželjna modulacija transkripcije. Sintetička sgRNK uključuje sekvencu, tipično dugačku 20-25 nukleotida, koja je komplementarna jednom lancu 5' UTR gena od interesa uzvodno od start mesta transkripcije. Sintetička sgRNK takođe uključuje vodeću sekvencu skele. Tipična vodeća sekvenca skele je sledeća:
[0150] Opis dizajna sgRNK može se pronaći u, npr. Mali et al. Science.2013. 339:823-826.
[0151] Primeri sekvenci sgRNK mogu se pronaći u Tabelama u nastavku.
Geni od interesa
[0152] sgRNK cilja gen od interesa, usmeravajući protein povezan sa CRISPR kodiran sintetičkim polinukleotidom da interaguje sa genom od interesa. Gen od interesa je odabran u zavisnosti od primene. Primeri gena od interesa uključuju VEGF, TPO i/ili gene apoptoze ili gene starenja.
III. Dizajn i sinteza sintetičkih polinukleotida i sgRNK
[0153] Sintetički polinukleotidi i sgRNK iz objave mogu se pripremiti u skladu sa bilo kojom dostupnom tehnikom uključujući, ali bez ograničavanja na hemijsku sintezu; enzimsku sintezu, koja se generalno naziva in vitro transkripcija (IVT); ili enzimsko ili hemijsko isecanje dužeg prekursora itd. Postupci sinteze RNK su poznati u struci (videti, npr. Gait, M.J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: IRL Press, 1984; i Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v.288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005).
[0154] Postupak dizajniranja i sinteze primarnih konstrukata, npr. sintetičkih polinukleotida koji kodiraju protein povezan sa CRISPR ili sintetičke sgRNK, iz objave generalno uključuju korake konstrukcije gena, sintetičke proizvodnje mRNK (bilo sa ili bez modifikacija) i prečišćavanje. U postupku enzimske sinteze, polinukleotidna sekvenca koja kodira protein povezan sa CRISPR ili sgRNK je prvo odabrana za inkorporaciju u vektor koji će biti amplifikovan kako bi se proizveo cDNK templat. Opciono, polinukleotidna sekvenca proteina povezanog sa CRISPR i/ili bilo koje bočne sekvence mogu biti optimizovane za kodon. cDNK templat se zatim upotrebljava za proizvodnju mRNK ili sgRNK preko in vitro transkripcije (IVT). Posle proizvodnje, mRNK ili sgRNK mogu proći postupke prečišćavanja i čišćenja. Njihovi koraci su detaljnije obezbeđeni u nastavku.
Konstrukcija gena sintetičkog polinukleotida koji kodira protein povezan sa CRISPR
4
[0155] Korak konstrukcije gena može uključivati, ali bez ograničavanja na sintezu gena, amplifikaciju vektora, prečišćavanje plazmida, linearizaciju i čišćenje plazmida, i sintezu i čišćenje cDNK templata.
[0156] Kada se za proizvodnju odabere polipeptid od interesa, npr. protein povezan sa CRISPR, npr. dCAS9 ili dCAS9-efektor domen fuzioni protein, dizajnira se primarni konstrukt. Unutar primarnog konstrukta, prvi region povezanih nukleozida koji kodira polipeptid od interesa može se konstruisati upotrebom otvorenog okvira čitanja (ORF) odabranog transkripta nukleinske kiseline (DNK ili RNK). ORF može sadržati ORF divljeg tipa, njegovu izoformu, varijantu ili fragment. Kao što se ovde upotrebljava, "otvoreni okvir čitanja" ili "ORF" treba da označi sekvencu nukleinske kiseline (DNK ili RNK) koja je sposobna da kodira polipeptid od interesa. ORF često počinju start kodonom, ATG i završavaju se nonsens ili terminacionim kodonom ili signalom.
[0157] Dodatno, nukleotidna sekvenca prvog regiona može biti optimizovana za kodon. Postupci optimizacije za kodon su poznati u struci i mogu biti korisni u nastojanjima da se postigne jedan ili više od nekoliko ciljeva. Ovi ciljevi uključuju usklađivanje učestalosti kodona u ciljnim i organizmima domaćina kako bi se osiguralo pravilno nabiranje, pristrasnost GC sadržaja kako bi se povećala stabilnost mRNK ili redukovale sekundarne strukture, minimalizovanje tandem ponovak kodona ili baznih pokreta koji mogu narušiti konstrukciju ili ekspresiju gena, prilagođavanje transkripcionih i translacionih kontrolnih regiona, insertovanje ili uklanjanje sekvenci za transport proteina, ukloniti/dodati posttranslaciona mesta za modifikaciju u kodiranom proteinu (npr. mesta glikozilacije), dodati, ukloniti ili premeštati proteinske domene, inserovati ili deletirati mesta restrikcije, modifikovati vezujuća mesta za ribozome i mRNK mesta degradacije, kako bi se podesile translacione stope da omoguće da se različiti domeni proteina pravilno naboraju, ili da redukuju ili eliminišu problematične sekundarne strukture unutar mRNK. Alati za optimizaciju kodona, algoritmi i usluge poznati su u struci, neograničavajući primeri uključuju usluge od GeneArt (Life Technologies) i/ili DNA2.0 (Menlo Park, CA). U nekim slučajevima, ORF sekvenca je optimizovana upotrebom algoritama za optimizaciju. Opcije kodona za svaku amino-kiselinu date su u Tabeli 1.
Tabela 1. Opcije kodona
[0158] Pošto je sekvenca optimizovana za kodon, može se dodatno proceniti za regione koji sadrže restrikciona mesta. Najmanje jedan nukleotid unutar regiona restrikcionog mesta može biti zamenjen sa drugim nukleotidom kako bi se uklonilo restrikciono mesto iz sekvence ali zamena nukleotida menja amino-kiselinsku sekvencu koja je kodirana nukleotidnom sekvencom optimizovanom za kodon.
[0159] U nekim delovima objave, 5' UTR i/ili 3' UTR mogu biti obezbeđeni kao bočni regioni. Više 5' ili 3' UTR može biti uključeno u bočne regione i mogu biti iste ili različite sekvence. Bilo koji deo bočnih regiona, uključujući nijedan, može biti optimizovan za kodon i bilo koji može nezavisno sadržati jednu ili više različitih strukturnih ili hemijskih modifikacija, pre i/ili posle optimizacije za kodon. Kombinacije osobina mogu biti uključene u prvi i drugi bočni region i mogu biti sadržane unutar drugih osobina. Na primer, ORF može biti omeđen od strane 5' UTR koji može sadržati snažan Kozak translacioni inicijacioni signal i/ili 3' UTR koji može uključivati oligo(dT) sekvencu za dodavanje poli-A repa po templatu.
[0160] Posle optimizacije (po želji), komponente primarnog konstrukta se rekonstituišu i transformišu u vektor kao što su, ali bez ograničavanja na, plazmide, viruse, kozmide, i veštačke hromozome. Na primer, optimizovani konstrukt može biti rekonstituisan i transformisan pomoću ovde opisanih postupaka u hemijski kompetentnu E. coli, kvasac, neurosporu, kukuruz, drozofilu, itd. gde se javljaju plazmidu-slične ili hromozomske strukture u velikom broju kopija.
Amplifikacija vektora
[0161] Vektor koji sadrži primarni konstrukt, koji kodira bilo sintetički polinukleotid koji kodira protein povezan sa CRISPR ili sgRNK, se zatim amplifikuje i plazmid izoluje i prečišćava upotrebom postupaka poznatih u struci, kao što je, ali bez ograničavanja na, maxi prep upotrebom Invitrogen PURELINK™ HiPure Maxiprep kompleta (Carlsbad, CA).
Linearizacija plazmida
[0162] Plazmid se zatim može linearizovati upotrebom postupaka poznatih u struci, kao što su, ali bez ograničavanja na, upotrebu restrikcionih enzima i pufera. Reakcija linearizacije se može prečistiti upotrebom postupaka uključujući, na primer, Invitrogenov PURELINK™ PCR mikro komplet (Carlsbad, CA), i postupaka prečišćavanja zasnovanih na HPLC kao što
4
su, ali bez ograničavanja na, jaku anjonsko izmenjivačku HPLC, slabu anjonsko izmenjivačku HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC) i Invitrogenovog standardnog PURELINK™ PCR kompleta (Carlsbad, CA). Postupak prečišćavanja se može modifikovati u zavisnosti od veličine reakcije linearizacije koja je izvedena. Linearizovani plazmid se zatim upotrebljava za generisanje cDNK za reakcije in vitro transkripcije (IVT).
Sinteza cDNK templata
[0163] cDNK templat se može sintetisati tako što će linearni plazmid proći lančanu reakciju polimerazom (PCR). Tabela 4 iz S.A.D. patentne prijave br. 13/791.922, koja je podneta 9. marta 2013. godine, obezbeđuje listing prajmera i proba koje mogu biti korisne u PCR reakcijama iz predmetne objave. Treba razumeti da listing nije iscrpan i da je dizajn prajmerproba za bilo koju amplifikaciju unutar veština onih sa iskustvom u struci. Probe takođe mogu sadržati hemijski modifikovane baze kako bi se povećala vernost sparivanja baza sa ciljnim molekulom i jačina sparivanja baza.
[0164] cDNK se može podneti na analizu sekvenciranja pre podvrgavanja transkripciji.
Proizvodnja mRNK
[0165] Postupak proizvodnje sintetičkog polinukleotida ili sgRNK može uključivati, ali nije ograničen na, in vitro transkripciju, uklanjanje cDNK templata i čišćenje RNK, i reakcije dodavanja kape i/ili postavljanja repa na RNK. Alternativno, sintetički polinukleotid ili sgRNK mogu se hemijski sintetisati.
In vitro transkripcija
[0166] cDNK proizvedena u prethodnom koraku može se transkribovati upotrebom sistema za in vitro transkripciju (IVT). Sistem tipično sadrži transkripcioni pufer, nukleotid trifosfate (NTP), inhibitor RNaze i polimerazu. NTP se mogu proizvesti u kući, mogu se odabrati od dobavljača, ili se mogu sintetisati kao što je ovde opisano. NTP se mogu odabrati od, ali nisu ograničeni na ovde opisane, uključujući prirodne i neprirodne (modifikovane) NTP. Polimeraza se može odabrati od, ali nije ograničena na, T7 RNK polimerazu, T3 RNK polimerazu i mutant polimeraze kao što su, ali bez ograničavanja na, polimeraze sposobne da inkorporšu modifikovane nukleinske kiseline. Neorganska pirofosfataza može biti uključena u sistem za transkripciju.
RNK polimeraze
[0167] Bilo koji broj RNK polimeraza ili varijanti može se upotrebiti u dizajnu primarnih konstrukata iz predmetne objave.
[0168] RNK polimeraze mogu se modifikovati insertovanjem ili deletiranjem amino-kiselina sekvence RNK polimeraze. Kao neograničavajući primer, RNK polimeraza se može modifikovati tako da pokaže povećanu sposobnost da inkorporiše 2'-modifikovani nukleotid trifosfat u poređenju sa nemodifikovanom RNK polimerazom (videti međunarodnu publikaciju WO2008078180 i S.A.D. patent 8.101.385.
[0169] Varijante se mogu dobiti evolucijom RNK polimeraze, optimizacijom sekvence amino-kiselina i/ili nukleinske kiseline RNK polimeraze i/ili upotrebom drugih postupaka poznatih u struci. Kao neograničavajući primer, varijante T7 RNK polimeraze mogu evoluirati upotrebom sistema kontinuirane usmerene evolucije koji su postavili Esvelt et al. (Nature (2011) 472(7344):499-503) gde klonovi T7 RNK polimeraze mogu kodirati najmanje jednu mutaciju kao što je, ali bez ograničavanja na, lizin na poziciji 93 supstituisan za treonin (K93T), I4M, A7T, E63V, V64D, A65E, D66Y, T76N, C125R, S128R, A136T, N165S, G175R, H176L, Y178H, F182L, L196F, G198V, D208Y, E222K, S228A, Q239R, T243N, G259D, M267I, G280C, H300R, D351A, A354S, E356D, L360P, A383V, Y385C, D388Y, S397R, M401T, N410S, K450R, P451T, G452V, E484A, H523L, H524N, G542V, E565K, K577E, K577M, N601S, S684Y, L699I, K713E, N748D, Q754R, E775K, A827V, D851N ili L864F. Kao drugi neograničavajući primer, varijante T7 RNK polimeraze mogu kodirati najmanje mutaciju kao što je opisano u S.A.D. publikacijama br. 20100120024 i 20070117112. Varijante RNK polimeraze mogu takođe uključivati, ali nisu ograničene na, supstitucione varijante, konzervativnu amino-kiselinsku supstituciju, insercione varijante, delecione varijante i/ili kovalentne derivate.
[0170] Primarni konstrukt može biti dizajniran tako da bude prepoznat od strane RNK polimeraze divljeg tipa ili varijantne. Pritom se primarni konstrukt može modifikovati tako da sadrži mesta ili regione promena sekvence iz divljeg tipa ili roditeljskog primarnog konstrukta.
[0171] Primarni konstrukt može biti dizajniran tako da uključuje najmanje jednu supstituciju i/ili inserciju uzvodno od vezujućeg mesta ili mesta prepoznavanja RNK polimeraze,
4
nizvodno od vezujućeg mesta ili mesta prepoznavanja RNK polimeraze, uzvodno od TATA boks sekvence, nizvodno od TATA boks sekvence primarnog konstrukta ali uzvodno od kodirajućeg regiona primarnog konstrukta, unutar 5'UTR, pre 5'UTR i/ili posle 5'UTR.
[0172] 5'UTR primarnog konstrukta koji se ovde objavljuje može biti zamenjen insercijom najmanje jednog regiona i/ili niza nukleotida iste baze. Region i/ili niz nukleotida može uključivati, ali nije ograničen na, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7 ili najmanje 8 nukleotida i nukleotidi mogu biti prirodni i/ili neprirodni. Kao neograničavajući primer, grupa nukleotida može uključivati 5-8 adenina, citozina, timina, niz bilo kojih drugih nukleotida koji se ovde objavljuje i/ili njihove kombinacije.
[0173] 5'UTR primarnog konstrukta koji se ovde objavljuje može biti zamenjen insercijom najmanje dva regiona i/ili niza nukleotida dve različite baze kao što su, ali bez ograničavanja na, adenin, citozin, timin, bilo koje od drugih nukleotida koji se ovde objavljuju i/ili njihove kombinacije. Na primer, 5'UTR se može zameniti insertovanjem 5-8 adenin baza, nakon čega sledi insercija 5-8 citozin baza. U sledećem primeru, 5'UTR se može zameniti insertovanjem 5-8 citozin baza, nakon čega sledi insercija 5-8 adenin baza.
[0174] Primarni konstrukt može uključivati najmanje jednu supstituciju i/ili inserciju nizvodno od mesta početka transkripcije koje može biti prepoznato od strane RNK polimeraze. Kao neograničavajući primer, najmanje jedna supstitucija i/ili insercija se može javiti nizvodno od mesta početka transkripcije supstituisanjem najmanje jedne nukleinske kiseline u regionu neposredno nizvodno od mesta početka transkripcije (kao što je, ali bez ograničavanja na, 1 do 6). Promene u regionu nukleotida neposredno nizvodno od mesta početka transkripcije mogu uticati na stope inicijacije, povećati očigledne vrednosti konstante reakcije nukleotid trifosfata (NTP), i povećati disocijaciju kratkih transkripata iz kompleksa transkripcije koji započinje inicijalnu transkripciju (Brieba et al, Biochemistry (2002) 41: 5144-5149). Modifikacija, supstitucija i/ili insercija najmanje jedne nukleinske kiseline može uzrokovati tihu mutaciju sekvence nukleinske kiseline ili može uzrokovati mutaciju u aminokiselinskoj sekvenci.
[0175] Primarni konstrukt može uključivati supstituciju najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 12 ili najmanje 13 guanin baza nizvodno od mesta početka transkripcije.
[0176] Primarni konstrukt može uključivati supstituciju najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5 ili najmanje 6 guanin baza u regionu neposredno nizvodno od mesta početka transkripcije. Kao neograničavajući primer, ukoliko su nukleotidi u regionu
4
GGGAGA (SEQ ID NO: 127), guanin baze mogu biti supstituisane sa najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3 ili najmanje 4 adenin nukleotida. U sledećem neograničavajućem primeru, ukoliko su nukleotidi u regionu GGGAGA (SEQ ID NO: 127), guanin baze mogu biti supstituisane sa najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3 ili najmanje 4 citozin baze. U sledećem neograničavajućem primeru, ako su nukleotidi u regionu GGGAGA (SEQ ID NO: 127), guanin baze mogu biti supstituisane sa najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3 ili najmanje 4 timina, i/ili bilo kojim od ovde opisanih nukleotida.
[0177] Primarni konstrukt može uključivati najmanje jednu supstituciju i/ili inserciju uzvodno od start kodona. Radi jasnoće, osoba sa iskustvom u struci bi podrazumevala da je start kodon prvi kodon kodirajućeg regiona proteina, dok je mesto početka transkripcije mesto gde počinje transkripcija. Primarni konstrukt može uključivati, ali nije ograničen na, najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7 ili najmanje 8 supstitucija i/ili insercija nukleotidnih baza. Nukleotidne baze mogu biti insertovane ili supstituisane na 1, najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4 ili najmanje 5 lokacija uzvodno od start kodona. Insertovani i/ili supstituisani nukleotidi mogu biti ista baza (npr. svi A ili svi C ili svi T ili svi G), dve različite baze (npr. A i C, A i T, ili C i T), tri različite baze (npr. A, C i T ili A, C i T) ili najmanje četiri različite baze. Kao neograničavajući primer, guanin baza uzvodno od kodirajućeg regiona u primarnom konstruktu može biti supstituisana sa adeninom, citozinom, timinom, ili bilo kojim od ovde opisanih nukleotida. U sledećem neograničavajućem primeru, supstitucija guanin baza u primarnom konstruktu može biti dizajnirana tako da napusti jednu guanin bazu u regionu nizvodno od mesta početka transkripcije i pre start kodona (videti Esvelt et al. Nature (2011) 472(7344):499-503). Kao neograničavajući primer, najmanje 5 nukleotida može biti insertovano na 1 lokaciju nizvodno od mesta početka transkripcije ali uzvodno od start kodona i najmanje 5 nukleotida mogu biti isti tip baza.
Uklanjanje cDNK templata i čišćenje
[0178] cDNK templat se može ukloniti upotrebom postupaka poznatih u struci, kao što je, ali bez ograničavanja na, tretman dezoksiribonukleazom I (DNaza I). Čišćenje RNK može takođe uključivati postupak prečišćavanja kao što je, ali bez ograničavanja na, AGENCOURT® CLEANSEQ® sistem od Beckman Coulter (Danvers, MA), postupke prečišćavanja zasnovane na HPLC kao što su, ali bez ograničavanja na, jaku anjonsko izmenjivačku HPLC,
4
slabu anjonsko izmenjivačku HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC).
Reakcije dodavanja kape i/ili postavljanja repa
[0179] Primarni konstrukt ili mmRNK takođe mogu proći kroz reakcije dodavanja kape i/ili postavljanja repa. Reakcija dodavanja kape može se izvesti postupcima poznatim u struci za dodavanje 5' kape na 5' kraj primarnog konstrukta. Postupci za dodavanje kape uključuju, ali nisu ograničeni na, upotrebu Vaccinia Capping Enzyme (New England Biolabs, Ipswich, MA).
[0180] Reakcija postavljanja poli-A repa može se izvesti postupcima poznatim u struci, kao što je, ali bez ograničavanja na, 2'O-metiltransferaza i postupcima kao što je ovde opisano. Ukoliko primarni konstrukt generisan iz cDNK ne uključuje poli-T, moglo bi biti korisno izvršiti reakciju postavljanja poli-A-repa pre nego što se očisti primarni konstrukt.
[0181] Uzorci koji prolaze kroz reakcije dodavanja kape mogu imati različite količine struktura sa 5' kapom u opsegu od 0 do 100%. U nekim slučajevima, uzorak sadrži 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99, ili 100% RNK sa 5' kapom.
Prečišćavanje sintetičkog polinukleotida i sgRNK
[0182] Prečišćavanje sintetičkog polinukleotida ili sgRNK može uključivati, ali nije ograničeno na, čišćenje RNK, osiguranje kvaliteta i kontrolu kvaliteta. Čišćenje RNK se može izvesti postupcima poznatim u struci, kao što su, ali bez ograničavanja na, AGENCOURT® perle (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), poli-T perle, LNA™ oligo-T probe za zarobljavanje (EXIQON® Inc, Vedbaek, Danska), postupke prečišćavanja zasnovane na HPLC, kao što su, ali bez ograničavanja na, jaku anjonsko izmenjivačku HPLC, slabu anjonsko izmenjivačku HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC) ili tretitanje RNKazom III (neograničavajući primer tretiranja mRNK sa RNKazom III opisan je od strane Meis et al. u međunarodnoj publikaciji br. WO2013102203). Termin "prečišćen" kada se upotrebljava u odnosu na polinukleotid, kao što je "prečišćena RNK", označava onu koja je odvojena od najmanje jednog kontaminanta. Kao što se ovde upotrebljava, "kontaminant" je bilo koja supstanca koja čini drugu neprikladnom, nečistom ili inferiornom. Stoga, prečišćeni polinukleotid (npr. DNK i RNK) prisutan je u obliku ili postavci različitoj od one u kojoj se nalazi u prirodi, ili u obliku ili
4
postavci različitoj od one koja je postojala pre nego što je podvrgnut postupku tretiranja ili prečišćavanja.
[0183] Provera osiguranja kvaliteta i/ili kontrole kvaliteta mogu se izvesti upotrebom postupaka kao što su, ali bez ograničavanja na, gel elektroforezu, UV apsorbancu, ili analitičku HPLC.
[0184] RNK se može sekvencirati postupcima uključujući, ali bez ograničavanja na PCR nakon reverzne transkripcije.
[0185] mRNK ili mmRNK mogu se kvantifikovati upotrebom postupaka kao što je, ali bez ograničavanja na, ultraviolentnu vidljivu spektroskopiju (UV/Vis). Neograničavajući primer UV/Vis spektrometra je NANODROP® spektrometar (ThermoFisher, Waltham, MA). Kvantifikovana mRNK ili mmRNK mogu se analizirati kako bi se odredilo da li mRNK ili mmRNK mogu biti odgovarajuće veličine, proveriti da nije došlo do degradacije mRNK ili mmRNK. Degradacija mRNK i/ili mmRNK može se proveriti postupcima kao što su, ali bez ograničavanja na, elektroforezu na agaroznom gelu, postupke prečišćavanja zasnovane na HPLC kao što su, ali bez ograničavanja na, jaku anjonsko izmenjivačku HPLC, slabu anjonsko izmenjivačku HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC), tečnu hromatografiju-masenu spektrometriju (LCMS), kapilarnu elektroforezu (CE) i kapilarnu gel elektroforezu (CGE).
IV. Modifikovani sintetički polinukleotidi i sgRNK
[0186] Sintetički polinukleotidi i sgRNK iz objave tipično su modifikovani. Ovde, u polinukleotidu (kao što je sintetički polinukleotid ili sgRNK), termini "modifikacija" ili, prema potrebi, "modifikovani" označavaju modifikaciju u odnosu na A, G, U ili C ribonukleotide. Generalno, ovde, ovi termini nisu namenjeni da označavaju modifikacije ribonukleotida u delovima 5'-terminusne mRNK kape koji se javljaju u prirodi. Primeri modifikacija mogu se pronaći u S.A.D. patentnoj prijavi br. 13/644.072, koja je podneta 03. oktobra 2012. godine i publikovana kao US20130115272.
[0187] Modifikacije mogu biti različite posebne modifikacije. Kodirajući region, bočni regioni i/ili završni regioni mogu sadržati jednu, dve, ili više (opciono različitih) nukleozidnih ili nukleotidnih modifikacija. Modifikovani polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK introdukovan u ćeliju može pokazati redukovanu degradaciju u ćeliji, u poređenju sa nemodifikovanim polinukleotidom, primarnim konstruktom, ili mmRNK.
4
[0188] Polinukleotidi, primarni konstrukti, i mmRNK mogu uključivati bilo koju korisnu modifikaciju, kao što je šećer, nukleobaza, ili internukleozidna veza (npr. za vezujući fosfat / za fosfodiestarsku vezu / za fosfodiestarsku okosnicu). Jedan ili više atoma pirimidinske nukleobaze mogu biti zamenjeni ili supstituisani sa opciono supstituisanim amino, opciono supstituisanim tiolom, opciono supstituisanim alkilom (npr. metilom ili etilom), ili halo (npr. hloro ili fluoro). U određenim slučajevima, modifikacije (npr. jedna ili više modifikacija) su prisutne u svakom od šećera i internukleozidne veze. Modifikacije u skladu sa predmetnom objavom mogu biti modifikacije ribonukleinskih kiselina (RNK) u dezoksiribonukleinske kiseline (DNK), treozne nukleinske kiseline (TNA), glikolne nukleinske kiseline (GNA), peptidne nukleinske kiseline (PNA), zaključane nukleinske kiseline (LNA) ili njihove hibride. Dopunske modifikacije su ovde opisane.
[0189] Kao što se ovde opisuje, polinukleotidi, primarni konstrukti, i mmRNK iz objave suštinski ne indukuju urođeni imunski odgovor ćelije u koju se introdukuje mRNK. Osobine indukovanog urođenog imunskog odgovora uključuju 1) povećanu ekspresiju proinflamatornih citokina, 2) aktivaciju unutarćelijskih PRR (RIG-I, MDA5, itd.) i/ili 3) terminaciju ili redukciju translacije proteina.
[0190] Može biti poželjno unutarćelijski degradirati modifikovani molekul nukleinske kiseline introdukovan u ćeliju. Na primer, degradacija modifikovanog molekula nukleinske kiseline može biti poželjnija ukoliko se želi precizno vreme proizvodnje proteina. Stoga, u nekim slučajevima, objava obezbeđuje modifikovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži domen za degradaciju, na koji se može usmereno delovati unutar ćelije.
[0191] Polinukleotidi, primarni konstrukti, i mmRNK mogu opciono uključivati i druge agense (npr. agense koji indukuju RNKi, RNKi agense, siRNK, shRNK, miRNK, antisens RNK, ribozime, katalitičku DNK, tRNK, RNK koje indukuju formiranje trostrukog heliksa, aptamere, vektore, itd.).
[0192] U nekim slučajevima, polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK (npr. prvi region, prvi bočni region, ili drugi bočni region) uključuje n broj povezanih nukleozida koji imaju bilo koju bazu, šećer, okosnicu, gradivni blok ili drugu strukturu ili formulu, uključujući, ali bez ograničavanja na one Formula I do IX ili bilo koje njihove podstrukture kao što je opisano u međunarodnoj publikaciji br. WO2013052523, koja je podneta 3. oktobra 2012. godine, pod naslovom Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof. Takve strukture uključuju modifikacije na šećeru, nukleobazi, internukleozidnoj vezi, ili njihove kombinacije.
[0193] Kombinacije hemijskih modifikacija uključuju one o kojima podučava uključujući, ali bez ograničavanja na, one opisane u međunarodnoj publikaciji WO2013052523 koja je podneta 3. oktobra 2012. godine, pod naslovom Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof.
[0194] Sinteza polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK iz predmetne objave može biti u skladu sa postupcima opisanim u međunarodnoj publikaciji br. WO2013052523 koja je podneta 3. oktobra 2012. godine, pod naslovom Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof.
[0195] Nukleobaza se može odabrati iz grupe koja se sastoji od citozina, guanina, adenina, i uracila.
[0196] Ovde opisana modifikovana nukleobaza može biti modifikovani uracil. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovan uracil uključuju pseudouridin (ψ), piridin-4-on ribonukleozid, 5-aza-uridin, 6-aza-uridin, 2-tio-5-aza-uridin, 2-tio-uridin (s<2>U), 4-tio-uridin (s<4>U), 4-tio-pseudouridin, 2-tio-pseudouridin, 5-hidroksi-uridin (ho<5>U), 5-aminoalil-uridin, 5-halo-uridin (npr. 5-jodo-uridin ili 5-bromo-uridin), 3-metil-uridin (m<3>U), 5-karboksimetiluridin (cm<5>U), 1-karboksimetil-pseudouridin, 5-karboksihidroksimetil-uridin (chm<5>U), 5-karboksihidroksimetil-uridin metil estar (mchm<5>U), 5-metoksikarbonilmetil-uridin (mcm<5>U), 5-metoksikarbonilmetil-2-tio-uridin (mcm<5>s<2>U), 5-aminometil-2-tio-uridin (nm<5>s<2>U), 5-metilaminometil-uridin (mnm<5>U), 5-metilaminometil-2-tio-uridin (mnm<5>s<2>U), 5-metilaminometil-2-seleno-uridin (mnm<5>se<2>U), 5-karbamoilmetil-uridin (ncm<5>U), 5-karboksimetilaminometil-uridin (cmnm<5>U), 5-karboksimetilaminometil-2-tio-uridin (cmnm<5>s<2>U), 5-propinil-uridin, 1-propinil-pseudouridin, 5-taurinometil-uridin (ιm<5>U), 1-taurinometil-pseudouridin, 5-taurinometil-2-tio-uridin (ιm<5>s<2>U), 1-taurinometil-4-tiopseudouridin, 5-metil-uridin (m<5>U, tj. koji ima nukleobazu dezoksitimin), 1-metilpseudouridin (m<1>ψ), 5-metil-2-tio-uridin (m<5>s<2>U), 1-metil-4-tio-pseudouridin (m<1>s<4>ψ), 4-tio-1-metil-pseudouridin, 3-metil-pseudouridin (m<3>ψ), 2-tio-1-metil-pseudouridin, 1-metil-1-deazapseudouridin, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridin, dihidrouridin (D), dihidropseudouridin, 5,6-dihidrouridin, 5-metil-dihidrouridin (m<5>D), 2-tio-dihidrouridin, 2-tio-dihidropseuduridin, 2-metoksi-uridin, 2-metoksi-4-tio-uridin, 4-metoksi-pseudouridin, 4-metoksi-2-tiopseudouridin, N1-metil-pseudouridin, 3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin (acp<3>U), 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudouridin (acp<3>ψ), 5-(izopentenilaminometil)uridin (inm<5>U), 5-(izopentenilaminometil)-2-tio-uridin (inm<5>s<2>U), α-tio-uridin, 2'-O-metil-uridin (Um), 5,2'-O-dimetil-uridin (m<5>Um), 2'-O-metil-pseudouridin (ψm), 2-tio-2'-O-metil-uridin (s<2>Um), 5-metoksikarbonilmetil-2'-O-metil-uridin (mcm<5>Um), 5-karbamoilmetil-2'-O-metil-uridin
1
(ncm<5>Um), 5-karboksimetilaminometil-2'-O-metil-uridin (cmnm<5>Um), 3,2'-O-dimetil-uridin (m<3>Um), 5-(izopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridin (inm<5>Um), 1-tio-uridin, dezoksitimidin, 2'-F-ara-uridin, 2'-F-uridin, 2'-OH-ara-uridin, 5-(2-karbometoksivinil) uridin, i 5-[3-(1-E-propenilamino)uridin.
[0197] U nekim slučajevima, modifikovana nukleobaza je modifikovani citozin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovan citozin uključuju 5-aza-citidin, 6-aza-citidin, pseudoizocitidin, 3-metil-citidin (m<3>C), N4-acetil-citidin (ac<4>C), 5-formil-citidin (f<5>C), N4-metil-citidin (m<4>C), 5-metil-citidin (m<5>C), 5-halo-citidin (npr. 5-jodo-citidin), 5-hidroksimetil-citidin (hm<5>C), 1-metil-pseudoizocitidin, pirolo-citidin, pirolo-pseudoizocitidin, 2-tio-citidin (s<2>C), 2-tio-5-metil-citidin, 4-tio-pseudoizocitidin, 4-tio-1-metil-pseudoizocitidin, 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoizocitidin, 1-metil-1-deaza-pseudoizocitidin, zebularin, 5-azazebularin, 5-metil-zebularin, 5-aza-2-tio-zebularin, 2-tio-zebularin, 2-metoksi-citidin, 2-metoksi-5-metil-citidin, 4-metoksi-pseudoizocitidin, 4-metoksi-1-metil-pseudoizocitidin, lizidin (k2C), α-tio-citidin, 2'-O-metil-citidin (Cm), 5,2'-O-dimetil-citidin (m<5>Cm), N4-acetil-2'-O-metil-citidin (ac<4>Cm), N4,2'-O-dimetil-citidin (m<4>Cm), 5-formil-2'-O-metil-citidin (f<5>Cm), N4,N4,2'-O-trimetil-citidin (m<4>2Cm), 1-tio-citidin, 2'-F-ara-citidin, 2'-F-citidin, i 2'-OH-ara-citidin.
[0198] U primerima slučajeva, modifikovana nukleobaza je modifikovani uracil odabran od pseudouridina (ψ) i 1-metilpseudouridina. U nekim slučajevima, modifikovana nukleobaza je modifikovani uracil u kombinaciji sa modifikovanim citozinom, npr.5-metilcitozinom.
[0199] Polinukleotid iz pronalaska je potpuno modifikovan sa 1-metilpseudouridinom (m<1>ψ), opciono u kombinaciji sa 5-metilcitozinom.
[0200] U nekim slučajevima, molekuli mRNK su optimizovani za kodon.
[0201] U nekim slučajevima, modifikovana nukleobaza je modifikovani adenin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovan adenin uključuju 2-amino-purin, 2,6-diaminopurin, 2-amino-6-halo-purin (npr. 2-amino-6-hloro-purin), 6-halo-purin (npr. 6-hloropurin), 2-amino-6-metil-purin, 8-azido-adenozin, 7-deaza-adenin, 7-deaza-8-aza-adenin, 7-deaza-2-amino-purin, 7-deaza-8-aza-2-amino-purin, 7-deaza-2,6-diaminopurin, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurin, 1-metil-adenozin (m<1>A), 2-metil-adenin (m<2>A), N6-metil-adenozin (m<6>A), 2-metiltio-N6-metil-adenozin (ms<2>m<6>A), N6-izopentenil-adenozin (i<6>A), 2-metiltio-N6-izopentenil-adenozin (ms<2>i<6>A), N6-(cis-hidroksiizopentenil)adenozin (io<6>A), 2-metiltio-N6-(cis-hidroksiizopentenil)adenozin (ms<2>io<6>A), N6-glicinilkarbamoil-adenozin (g<6>A), N6-treonilkarbamoil-adenozin (t<6>A), N6-metil-N6-treonilkarbamoil-adenozin (m<6>t<6>A), 2-metiltio-N6-treonilkarbamoil-adenozin (ms<2>g<6>A), N6,N6-dimetil-adenozin (m<6>2A), N6-
2
hidroksinorvalilkarbamoil-adenozin (hn<6>A), 2-metiltio-N6-hidroksinorvalilkarbamoiladenozin (ms<2>hn<6>A), N6-acetil-adenozin (ac<6>A), 7-metil-adenin, 2-metiltio-adenin, 2-metoksiadenin, α-tio-adenozin, 2'-O-metil-adenozin (Am), N6,2'-O-dimetil-adenozin (m<6>Am), N6,N6,2'-O-trimetil-adenozin (m<6>2Am), 1,2'-O-dimetil-adenozin (m<1>Am), 2'-O-riboziladenozin (fosfat) (Ar(p)), 2-amino-N6-metil-purin, 1-tio-adenozin, 8-azido-adenozin, 2'-F-ara-adenozin, 2'-F-adenozin, 2'-OH-ara-adenozin, i N6-(19-amino-pentaoksanonadecil)-adenozin.
[0202] U nekim slučajevima, modifikovana nukleobaza je modifikovani guanin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovan guanin uključuju inozin (I), 1-metil-inozin (m<1>I), viozin (imG), metilviozin (mimG), 4-demetil-viozin (imG-14), izoviozin (imG2), vibutozin (yW), peroksivibutozin (o2yW), hidrokivibutozin (OHyW), nemodifikovani hidroksivibutozin (OHyW<∗>), 7-deaza-guanozin, kueuozin (Q), epoksikueuozin (oQ), galaktozil-kueuozin (galQ), manozil-kueuozin (manQ), 7-cijano-7-deaza-guanozin (preQ0), 7-aminometil-7-deaza-guanozin (preQ1), arheozin (G<+>), 7-deaza-8-aza-guanozin, 6-tioguanozin, 6-tio-7-deaza-guanozin, 6-tio-7-deaza-8-aza-guanozin, 7-metil-guanozin (m<7>G), 6-tio-7-metil-guanozin, 7-metil-inozin, 6-metoksi-guanozin, 1-metil-guanozin (m<1>G), N2-metilguanozin (m<2>G), N2,N2-dimetil-guanozin (m<2>2G), N2,7-dimetil-guanozin (m<2,7>G), N2,N2,7-dimetil-guanozin (m<2,2,7>G), 8-okso-guanozin, 7-metil-8-okso-guanozin, 1-metil-6-tioguanozin, N2-metil-6-tio-guanozin, N2,N2-dimetil-6-tio-guanozin, α-tio-guanozin, 2'-O-metil-guanozin (Gm), N2-metil-2'-O-metil-guanozin (m<2>Gm), N2,N2-dimetil-2'-O-metilguanozin (m<2>2Gm), 1-metil-2'-O-metil-guanozin (m<1>Gm), N2,7-dimetil-2'-O-metil-guanozin (m<2,7>Gm), 2'-O-metil-inozin (Im), 1,2'-O-dimetil-inozin (m<1>Im), i 2'-O-ribozilguanozin (fosfat) (Gr(p)).
[0203] Nukleobaza nukleotida može biti nezavisno odabrana od purina, pirimidina, analoga purina ili pirimidina. Na primer, svaka nukleobaza može biti nezavisno odabrana od adenina, citozina, guanina, uracila, ili hipoksantina. Nukleobaza može takođe uključivati, na primer, prirodne i sintetičke derivate baze, uključujući pirazolo[3,4-d]pirimidine, 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i druge alkil derivate adenina i guanina, 2-propil i druge alkil derivate adenina i guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo (npr. 8-bromo), 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i druge 8-supstituisane adenine i guanine, 5-halo posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i druge 5-supstituisane uracile i citozine, 7-metilguanin i 7-metiladenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, deazaguanin, 7-deazaguanin, 3-deazaguanin, deazaadenin, 7-deazaadenin, 3-deazaadenin, pirazolo[3,4-d]pirimidin, imidazo[1,5-a]1,3,5 triazinone, 9-deazapurine, imidazo[4,5-d]pirazine, tiazolo[4,5-d]pirimidine, pirazin-2-one, 1,2,4-triazin, piridazin; i 1,3,5 triazin. Kada su nukleotidi prikazani upotrebom skraćenica A, G, C, T ili U, svako slovo označava reprezentativnu bazu i/ili njene derivate, npr. A uključuje adenin ili analoge adenina, npr. 7-deaza adenin).
[0204] Modifikovani nukleozidi i nukleotidi (npr. molekuli gradivni blokovi) mogu se pripremiti u skladu sa sintetičkim postupcima opisanim u Ogata et al., J. Org. Chem. 74:2585-2588 (2009); Purmal et al., Nucl. Acids Res. 22(1): 72-78, (1994); Fukuhara et al., Biochemistry, 1(4): 563-568 (1962); i Xu et al., Tetrahedron, 48(9): 1729-1740 (1992).
[0205] Polipeptidi, primarni konstrukti, i mmRNK iz objave mogu ili ne moraju biti uniformno modifikovani duž cele dužine molekula. Na primer, jedan ili više ili svi tipovi nukleotida (npr. purin ili pirimidin, ili bilo koji jedan ili više ili svi od A, G, U, C) mogu ili ne moraju biti uniformno modifikovani u polinukleotidu iz objave, ili u njegovom datom predefinisanom regionu sekvence (npr. jedan ili više regiona sekvence predstavljenih na Slici 1). U nekim slučajevima, svi nukleotidi X u polinukleotidu iz objave (ili u njegovom datom regionu sekvence) mogu biti modifikovani, pri čemu X može biti bilo koji od nukleotida A, G, U, C, ili bilo koja od kombinacija A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C ili A+G+C.
[0206] Različite šećerne modifikacije, nukleotidne modifikacije, i/ili internukleozidne veze (npr. strukture okosnice) mogu postojati na različitim pozicijama u polinukleotidu, primarnom konstruktu, ili mmRNK. Osoba sa prosečnim iskustvom u struci će podrazumevati da nukleotidni analozi ili druga(e) modifikacija(e) mogu biti locirane na bilo kojoj poziciji(ama) polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK tako da funkcija polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK nije suštinski smanjena. Modifikacija takođe može biti modifikacija 5' ili 3' terminusa. Polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK mogu sadržati od oko 1% do oko 100% modifikovanih nukleotida (bilo u odnosu na ukupan sadržaj nukleotida, ili u odnosu na jedan ili više tipova nukleotida, tj. bilo koji jedan ili više od A, G, U ili C) ili bilo koji procenat između ta dva (npr. od 1% do 20%, od 1% do 25%, od 1% do 50%, od 1% do 60%, od 1% do 70%, od 1% do 80%, od 1% do 90%, od 1% do 95%, od 10% do 20%, od 10% do 25%, od 10% do 50%, od 10% do 60%, od 10% do 70%, od 10% do 80%, od 10% do 90%, od 10% do 95%, od 10% do 100%, od 20% do 25%, od 20% do 50%, od 20% do 60%, od 20% do 70%, od 20% do 80%, od 20% do 90%, od 20% do 95%, od 20% do 100%, od 50% do 60%, od 50% do 70%, od 50% do 80%, od 50% do 90%, od 50% do 95%, od 50% do
4
100%, od 70% do 80%, od 70% do 90%, od 70% do 95%, od 70% do 100%, od 80% do 90%, od 80% do 95%, od 80% do 100%, od 90% do 95%, od 90% do 100%, i od 95% do 100%).
[0207] U nekim slučajevima, polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK koji se ovde objavljuju mogu uključivati modifikovani pirimidin (npr. modifikovani uracil/uridin/U ili modifikovani citozin/citidin/C). U nekim slučajevima, uracil ili uridin (generalno: U) u polinukleotidu, primarnom konstruktu, ili molekulu mmRNK može se zameniti sa od oko 1% do oko 100% modifikovanog uracila ili modifikovanog uridina (npr. od 1% do 20 %, od 1% do 25%, od 1% do 50%, od 1% do 60%, od 1% do 70%, od 1% do 80%, od 1% do 90%, od 1% do 95%, od 10% do 20%, od 10% do 25%, od 10% do 50%, od 10% do 60%, od 10% do 70%, od 10% do 80%, od 10% do 90%, od 10% do 95%, od 10% do 100%, od 20% do 25%, od 20% do 50%, od 20% do 60%, od 20% do 70%, od 20% do 80%, od 20% do 90%, od 20% do 95%, od 20% do 100%, od 50% do 60%, od 50% do 70%, od 50% do 80%, od 50% do 90%, od 50 % do 95%, od 50% do 100%, od 70% do 80%, od 70% do 90%, od 70% do 95%, od 70% do 100%, od 80% do 90%, od 80% do 95%, od 80% do 100%, od 90% do 95%, od 90% do 100%, i od 95% do 100% modifikovanog uracila ili modifikovanog uridina). Modifikovani uracil ili uridin mogu se zameniti jedinjenjem koje ima jednu jedinstvenu strukturu ili mnoštvom jedinjenja koja imaju različite strukture (npr. 2, 3, 4 ili više jedinstvenih struktura, kao što je ovde opisano).
[0208] U nekim slučajevima, citozin ili citidin (generalno: C) u polinukleotidu, primarnom konstruktu, ili molekulu mmRNK može se zameniti sa od oko 1% do oko 100% modifikovanog citozina ili modifikovanog citidina (npr. od 1% do 20 %, od 1% do 25%, od 1% do 50%, od 1% do 60%, od 1% do 70%, od 1% do 80%, od 1% do 90%, od 1% do 95%, od 10% do 20%, od 10% do 25%, od 10% do 50%, od 10% do 60%, od 10% do 70%, od 10% do 80%, od 10% do 90%, od 10% do 95%, od 10% do 100%, od 20% do 25%, od 20% do 50%, od 20% do 60%, od 20% do 70%, od 20% do 80%, od 20% do 90%, od 20% do 95%, od 20% do 100%, od 50% do 60%, od 50% do 70%, od 50% do 80%, od 50% do 90%, od 50% do 95%, od 50% do 100%, od 70% do 80%, od 70% do 90%, od 70% do 95%, od 70% do 100%, od 80% do 90%, od 80% do 95%, od 80% do 100%, od 90% do 95%, od 90% do 100% i od 95% do 100% modifikovanog citozina ili modifikovanog citidina). Modifikovani citozin ili citidin mogu se zameniti jedinjenjem koje ima jednu jedinstvenu strukturu ili mnoštvom jedinjenja koja imaju različite strukture (npr.2, 3, 4 ili više jedinstvenih struktura, kao što je ovde opisano).
[0209] U nekim slučajevima, najmanje 25% citozina je zamenjeno jedinjenjem Formule (b10)-(b14) (npr. najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili oko 100%).
[0210] U nekim slučajevima, najmanje 25% uracila može biti zamenjeno jedinjenjem Formule (b1)-(b9) (npr. najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili oko 100%).
[0211] U nekim slučajevima, najmanje 25% citozina je zamenjeno jedinjenjem Formule (b10)-(b14), i najmanje 25% uracila je zamenjeno jedinjenjem Formule (b1)-(b9) (npr. najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili oko 100%).
[0212] U jednom aspektu, sintetički polinukleotid i/ili sgRNK uključuje terminusnu modifikaciju. Terminusna modifikacija može biti modifikacija opisana u S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/729.933, koja je podneta 26. novembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO/2014/081507 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Terminally Optimized RNAs; S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/737.224, koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO/2014/081507 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Terminally Optimized RNAs; S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/758.921, koja je podneta 31. januara 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2014/081507 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs; S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/781.139, koja je podneta 14. marta 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2014/081507 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs; S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/829.359, koja je podneta 31. maja 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2014/081507 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs; S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/839.903, koja je podneta 27. juna 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/081507 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs; S.A.D. privremenoj prijavi br.61/842.709, koja je podneta 3. jula 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2014/081507 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs.
[0213] Hemijska modifikacija može biti modifikacija opisana u međunarodnoj publikaciji br. WO2013052523.
V. Farmaceutske kompozicije: formulacija, primena, isporuka i doziranje
[0214] Objava uključuje sintetičke polinukleotidne i/ili sgRNK kompozicije i komplekse u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Farmaceutske kompozicije mogu opciono sadržati jednu ili više dopunskih aktivnih supstanci, npr. terapijski i/ili profilaktički aktivne supstance. Opšta razmatranja o formulaciji i/ili proizvodnji farmaceutskih agenasa mogu se pronaći, na primer, u Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 synthetic polynucleotides and/or synthetic sgRNAs.
[0215] U jednom aspektu formulisani su sintetički polinukleotid i/ili sgRNK. Kao neograničavajući primer, sintetički polinukleotidi i/ili sintetičke sgRNK mogu se formulisati postupcima opisanim u međunarodnoj publikaciji br. WO2013090648 i/ili zajedničkoj nerešenoj S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/821.406, koja je podneta 14. marta 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2014/152211 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Formulation and Delivery of Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions, S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/821.406, koja je podneta 9. maja 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2014/152211 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Formulation and Delivery of Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions i S.A.D. privremenoj prijavi br. US 61/840.510, koja je podneta 28. juna 2013. godine, iz koje publikovana prijava WO/2014/152211 zahteva pravo prvenstva pod naslovom Formulation and Delivery of Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions.
[0216] Iako su opisi ovde obezbeđenih farmaceutskih kompozicija uglavnom usmereni na farmaceutske kompozicije koje su pogodne za primenu ljudima, onaj sa iskustvom u struci će razumeti da su takve kompozicije generalno pogodne za primenu bilo kojoj drugoj životinji, npr. ne-humanim životinjama, npr. ne-humanim sisarima. Modifikacija farmaceutskih kompozicija pogodnih za primenu ljudima kako bi se kompozicije učinile pogodnim za primenu različitim životinjama dobro je razumljiva, i prosečno iskusni veterinarski farmakolog može dizajnirati i/ili izvesti takvu modifikaciju samo uobičajenim, ukoliko je potrebno, eksperimentisanjem. Subjekti za koje se razmatra primena farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, ljude i/ili druge primate; sisare, uključujući komercijalno relevantne sisare kao što su goveda, svinje, konji, ovce, mačke, psi, miševi, i/ili pacovi; i/ili ptice, uključujući komercijalno relevantne ptice kao što su živina, kokoške, patke, guske, i/ili ćurke.
[0217] Formulacije ovde opisanih farmaceutskih kompozicija mogu se pripremiti bilo kojim poznatim postupkom ili u daljem tekstu razvijenim u struci farmakologije. Uopšteno, takvi pripremni postupci uključuju korak dovođenja aktivnog sastojka u vezu sa ekscipijensom i/ili jednim ili više drugih pomoćnih sastojaka, i zatim, ukoliko je potrebno i/ili poželjno, podelu, oblikovanje i/ili pakovanje proizvoda u željenu jedinicu sa jednom dozom ili višedoznu jedinicu.
[0218] Farmaceutska kompozicija u skladu sa objavom može se pripremiti, upakovati, i/ili prodati u rinfuzi, kao pojedinačna jedinična doza, i/ili kao mnoštvo pojedinačnih jediničnih doza. Kao što se ovde upotrebljava, "jedinična doza" je diskretna količina farmaceutske kompozicije koja sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka. Količina aktivnog sastojka je generalno jednaka dozi aktivnog sastojka koja bi se primenjivala subjektu i/ili pogodnoj frakciji takve doze kao što je, na primer, jedna polovina ili jedna trećina takve doze.
[0219] Relativne količine aktivnog sastojka, farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa, i/ili bilo kojih dopunskih sastojaka u farmaceutskoj kompoziciji u skladu sa objavom će varirati, u zavisnosti od identiteta, veličine, i/ili stanja subjekta koji se leči i dodatno u zavisnosti od puta na koji se kompozicija primenjuje. Na primer, kompozicija može sadržati između 0,1% i 100%, npr. između 0,5 i 50%, između 1-30%, između 5-80%, najmanje 80% (tež./tež.) aktivnog sastojka.
Formulacije
[0220] Sintetički polinukleotidi i/ili sintetičke sgRNK iz objave mogu se formulisati upotrebom jednog ili više ekscipijensa kako bi se: (1) povećala stabilnost; (2) povećala transfekcija ćelija; (3) dozvolilo produženo ili odloženo oslobađanje (npr. iz depo formulacije polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK); (4) promenila biodistribucija (npr. ciljati polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK na specifična tkiva ili tipove ćelija); (5) povećala translacija kodiranog proteina in vivo; i/ili (6) promenio profil oslobađanja kodiranog proteina in vivo. Pored tradicionalnih ekscipijenasa, kao što su bilo koji i svi rastvarači, disperzioni medijumi, razblaživači, ili drugi tečni vehikulumi, pomoćna sredstva za disperziju ili suspenziju, površinski aktivni agensi, izotonični agensi, agensi za zgušnjavanje ili emulgovanje, konzervansi, ekscipijensi iz predmetne objave mogu uključivati, bez ograničavanja na, lipidoide, lipozome, lipidne nanočestice, polimere, lipoplekse, jezgro-ljuska nanočestice, peptide, proteine, ćelije transfektovane sa polinukleotidom, primarnim konstruktom, ili mmRNK (npr. za transplantaciju u subjekta), hijaluronidazu, mimike nanočestica i njihove kombinacije. U skladu sa tim, formulacije iz objave mogu uključivati jedan ili više ekscipijenasa, svaki u količini koja zajedno povećava stabilnost polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK, povećava transfekciju ćelija od strane polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK, povećava ekspresiju proteina kodiranih polinukleotidom, primarnim konstruktom, ili mmRNK i/ili menja profil oslobađanja proteina kodiranih polinukleotidom, primarnim konstruktom, ili mmRNK. Dodatno, primarni konstrukt, i mmRNK iz predmetne objave mogu se formulisati upotrebom samo-asembliranih nanočestica nukleinske kiseline.
[0221] Formulacije ovde opisanih farmaceutskih kompozicija mogu se pripremiti bilo kojim poznatim postupkom ili u daljem tekstu razvijenim u struci farmakologije. Uopšteno, takvi pripremni postupci uključuju korak asocijacije aktivnog sastojka sa ekscipijensom i/ili jednim ili više drugih pomoćnih sastojaka.
[0222] Farmaceutska kompozicija u skladu sa predmetnom objavom može se pripremiti, upakovati, i/ili prodati u rinfuzi, kao pojedinačna jedinična doza, i/ili kao mnoštvo pojedinačnih jediničnih doza. Kao što se ovde upotrebljava, "jedinična doza" označava diskretnu količinu farmaceutske kompozicije koja sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka. Količina aktivnog sastojka može generalno biti jednaka dozi aktivnog sastojka koja bi se primenjivala subjektu i/ili pogodnoj frakciji takve doze uključujući, ali bez ograničavanja na, jednu polovinu ili jednu trećinu takve doze.
[0223] Relativne količine aktivnog sastojka, farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa, i/ili bilo kojih dopunskih sastojaka u farmaceutskoj kompoziciji u skladu sa predmetnom objavom mogu varirati, u zavisnosti od identiteta, veličine, i/ili stanja subjekta koji se leči i dodatno u zavisnosti od puta na koji se kompozicija primenjuje. Na primer, kompozicija može sadržati između 0,1% i 99% (tež./tež.) aktivnog sastojka.
[0224] Ovde opisane formulacije mogu sadržati najmanje jedan sintetički polinukleotid. Kao neograničavajući primer, formulacije mogu sadržati 1, 2, 3, 4 ili 5 mmRNK. Formulacija može sadržati modifikovanu mRNK koja kodira proteine odabrane iz kategorija kao što su, ali nisu ograničene na, humane proteine, veterinarske proteine, bakterijske proteine, biološke proteine, antitela, imunogene proteine, terapijske peptide i proteine, sekretovane proteine, proteine plazma membrane, citoplazmatske i proteine citoskeleta, proteine vezane za unutarćelijske membrane, nukleusne proteine, proteine povezane sa humanom bolešću i/ili proteine povezane sa ne-humanim bolestima. U jednom aspektu, formulacija sadrži najmanje tri modifikovane mRNK koje kodiraju proteine. U jednom aspektu, formulacija sadrži najmanje pet modifikovanih mRNK koje kodiraju proteine.
[0225] Farmaceutske formulacije mogu dopunski sadržati farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, koji, kao što se ovde upotrebljava, uključuje, ali nije ograničen na, bilo koje i sve rastvarače, disperzione medijume, razblaživače, ili druge tečne vehikulume, pomoćna sredstva za disperziju ili suspenziju, površinski aktivne agense, izotonične agense, agense za zgušnjavanje ili emulgovanje, konzervanse i slično, kao što je prikladno za određeni željeni dozni oblik. Različiti ekscipijensi za formulisanje farmaceutskih kompozicija i tehnike za pripremanje kompozicije poznati su u struci (videti Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). Upotreba konvencionalnog ekscipijens medijuma može se razmatrati unutar obima predmetne objave, osim ukoliko bilo koji konvencionalni ekscipijens medijum može biti nekompatibilan sa supstancom ili njenim derivatima, kao što je da proizvodi bilo kakav neželjeni biološki efekat ili na drugi način interaguje na štetan način sa bilo kojom drugom komponentom(ama) farmaceutske kompozicije.
[0226] U nekim slučajevima, veličina čestica lipidne nanočestice može se povećati i/ili smanjiti. Promena veličine čestica može pomoći u suzbijanju biološke reakcije, kao što je, ali bez ograničavanja na inflamaciju, ili može povećati biološki efekat modifikovane mRNK isporučene sisarima.
[0227] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi koji se upotrebljavaju u proizvodnji farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, površinski aktivne agense i/ili emulgatore, konzervanse, agense za puferisanje, agense za lubrikaciju, i/ili ulja. Takvi ekscipijensi mogu opciono biti uključeni u farmaceutske formulacije iz objave.
Lipidoidi
[0228] Sinteza lipidoida opširno je opisana i formulacije koje sadrže ova jedinjenja posebno su prikladne za isporuku polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK (videti Mahon et al., Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454; Schroeder et al., J Intern Med. 2010 267:9-21; Akinc et al., Nat Biotechnol. 200826:561-569; Love et al., Proc Natl Acad Sci USA 2010 107:1864-1869; Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci. USA 2011108:12996-3001).
[0229] Dok su se ovi lipidoidi upotrebljavali za efikasno isporučivanje dvolančanih malih interferirajućih molekula RNK u glodare i ne-humane primate (videti Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Frank-Kamenetsky et al., Proc Natl Acad Sci USA 2008 105:11915-11920; Akinc et al., Mol Ther. 200917:872-879; Love et al., Proc Natl Acad Sci USA 2010 107:1864-1869; Leuschner et al., Nat Biotechnol.2011 29:1005-1010), predmetna objava opisuje njihovu formulaciju i upotrebu u isporuci jednolančanih polinukleotida, primarnih konstrukata, ili mmRNK. Mogu se pripremiti kompleksi, micele, lipozomi ili čestice koje sadrže ove lipidoide i prema tome mogu rezultovati efikasnom isporukom polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK, kao što se procenjuje pomoću proizvodnje kodiranog proteina, nakon injekcije lipidoidne formulacije putem lokalizovanog i/ili sistemskog puta primene. Lipidoidni kompleksi polinukleotida, primarnih konstrukata, ili mmRNK mogu se primenjivati na različite načine uključujući, ali bez ograničavanja na, intravenske, intramuskularne, ili subkutane puteve.
[0230] Na in vivo isporuku nukleinskih kiselina mogu uticati mnogi parametri, uključujući, ali bez ograničavanja na, kompoziciju formulacije, prirodu PEGilacije čestica, udeo aktivne supstance, odnos oligonukleotida prema lipidu, i biofizičke parametre kao što je veličina čestica (Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879). Kao primer, male promene u dužini sidrenog lanca poli(etilen glikol) (PEG) lipida mogu rezultovati značajnim efektima na in vivo efikasnost. Formulacije sa različitim lipidoidima, uključujući, ali bez ograničavanja na, penta[3-(1-laurilaminopropionil)]-trietilentetramin hidrohlorid (TETA-5LAP; takođe poznat kao 98N12-5, videti Murugaiah et al., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010)), C12-200 (uključujući derivate i varijante), i MD1, mogu se testirati na in vivo aktivnost.
[0231] Lipidoid koji se ovde označava kao "98N12-5" objavili su Akinc et al., Mol Ther.
2009 17:872-879. (Videti Sliku 2).
[0232] Lipidoid koji se ovde označava kao "C12-200" objavili su Love et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869 (videti Sliku 2) i Liu i Huang, Molecular Therapy. 2010669-670 (videti Sliku 2). Formulacije lipidoida mogu uključivati čestice koje sadrže 3 ili 4 ili više komponenti pored polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK. Kao primer, formulacije sa određenim lipidoidima uključuju, ali nisu ograničene na, 98N12-5 i mogu sadržati 42% lipidoida, 48% holesterola i 10% PEG (dužina C14 alkil lanca). Kao sledeći primer, formulacije sa određenim lipidoidima uključuju, ali nisu ograničene na, C12-200 i mogu sadržati 50% lipidoida, 10% disteroilfosfatidil holina, 38,5% holesterola, i 1,5% PEG-DMG.
[0233] U jednom aspektu, polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK formulisan sa lipidoidom za sistemsku intravensku primenu može ciljati jetru. Na primer, krajnja optimizovana intravenska formulacija koja upotrebljava polinukleotid, primarni konstrukt, ili
1
mmRNK, i koja sadrži lipidnu molsku kompoziciju od 42% 98N12-5, 48% holesterola, i 10% PEG-lipida sa krajnjim težinskim odnosom od oko 7,5 do 1 ukupnih lipida prema polinukleotidu, primarnom konstruktu, ili mmRNK, i dužinom C14 alkil lanca na PEG lipidu, sa srednjom vrednošću veličine čestice od približno 50-60 nm, može rezultovati time da distribucija formulacije bude veća od 90% u jetru (videti Akinc et al., Mol Ther.2009 17:872-879). U sledećem primeru, intravenska formulacija koja upotrebljava C12-200 (videti S.A.D. privremenu prijavu 61/175.770 iz koje publikovana prijava WO/2010/129709 zahteva pravo prvenstva i publikovanu međunarodnu prijavu WO2010129709) lipidoid može imati molski odnos 50/10/38,5/1,5 C12-200/disteroilfosfatidil holin/holesterol/PEG-DMG, sa težinskim odnosom od 7 prema 1 ukupnih lipida prema polinukleotidu, primarnom konstruktu, ili mmRNK, i srednja vrednost veličine čestice od 80 nm može biti efikasna za isporuku polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK hepatocitima (videti Love et al., Proc Natl Acad Sci USA 2010 107:1864-1869). U sledećem aspektu, formulacija koja sadrži MD1 lipidoid može se upotrebljavati za efikasnu isporuku polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK hepatocitima in vivo. Karakteristike optimizovanih lipidoidnih formulacija za intramuskularne ili subkutane puteve mogu značajno varirati u zavisnosti od tipa ciljne ćelije i sposobnosti formulacija da difunuju kroz vanćelijski matriks u krvotok. Dok veličina čestica manja od 150 nm može biti poželjna za efikasnu isporuku hepatocitima zbog veličine endotelskih fenestara (videti Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879), upotreba lipidoidformulisanog polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK za isporuku formulacije drugim tipovima ćelija uključujući, ali bez ograničavanja na, endotelske ćelije, mijeloidne ćelije, i mišićne ćelije možda nije na sličan način ograničena veličinom. Saopštena je upotreba lipidoidnih formulacija za isporuku siRNK in vivo drugim ćelijama koje nisu hepatociti, kao što su mijeloidne ćelije i endotel (videti Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Leuschner et al., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010; Cho et al. Adv. Funct. Mater. 2009 19:3112-3118; 8th International Judah Folkman Conference, Cambridge, MA 8-9 oktobar 2010). Za efikasnu isporuku mijeloidnim ćelijama, kao što su monociti, lipidoidne formulacije mogu imati sličan molski odnos komponenti. Različiti odnosi lipidoida i drugih komponenti, uključujući, ali bez ograničavanja na, disteroilfosfatidil holin, holesterol i PEG-DMG, mogu se upotrebljavati za optimizaciju formulacije polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK za isporuku različitim tipovima ćelija, uključujući, ali bez ograničavanja na, hepatocite, mijeloidne ćelije, mišićne ćelije, itd. Na primer, molski odnos komponenti može uključivati, ali nije ograničen na, 50% C12-200, 10% disteroilfosfatidil holina, 38,5% holesterola, i 1,5% PEG-DMG (videti Leuschner et al., Nat Biotechnol 201129:1005-1010).
2
Upotreba lipidoidnih formulacija za lokalizovanu isporuku nukleinskih kiselina u ćelije (kao što su, ali bez ograničavanja na, masne ćelije i mišićne ćelije) putem bilo subkutane ili intramuskularne isporuke, možda neće zahtevati sve komponente formulacije koje su potrebne za sistemsku isporuku, i kao takve mogu sadržati samo lipidoid i polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK.
[0234] Kombinacije različitih lipidoida mogu se upotrebljavati da poboljšaju efikasnost proizvodnje proteina koja je usmerena polinukleotidom, primarnim konstruktom, ili mmRNK, pošto lipidoidi mogu biti sposobni da povećaju transfekciju ćelije od strane polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK; i/ili povećaju translaciju kodiranog proteina (videti Whitehead et al., Mol. Ther. 2011, 19:1688-1694).
Lipozomi, lipopleksi, i lipidne nanočestice
[0235] Polinukleotid, primarni konstrukt, i mmRNK iz objave mogu se formulisati upotrebom jednog ili više lipozoma, lipopleksa, ili lipidnih nanočestica. U jednom aspektu, farmaceutske kompozicije polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK uključuju lipozome. Lipozomi su veštački pripremljene vezikule koje se prvenstveno mogu sastojati od lipidnog dvosloja i mogu se upotrebljavati kao vehikulum za isporuku za primenu nutrijenata i farmaceutskih formulacija. Lipozomi mogu biti različitih veličina kao što je, ali bez ograničavanja na, multilamelarnu vezikulu (MLV) koja može imati prečnik od više stotina nanometara i može sadržati seriju koncentričnih dvoslojeva odvojenih uskim vodenim kompartmentima, malu unilamelarnu vezikulu (SUV) koja može biti manja od 50 nm u prečniku, i veliku unilamelarnu vezikulu (LUV) koja može imati prečnik između 50 i 500 nm. Dizajn lipozoma može uključivati, ali nije ograničen na, opsonine ili ligande kako bi se poboljšalo prikačinjanje lipozoma za nezdravo tkivo ili aktivirali događaji kao što je, ali bez ograničavanja na, endocitozu. Lipozomi mogu sadržati nisku ili visoku pH kako bi se poboljšala isporuka farmaceutskih formulacija.
[0236] Formiranje lipozoma može zavisiti od fizičko-hemijskih karakteristika kao što su, ali bez ograničavanja na, zarobljene farmaceutske formulacije i lipozomske sastojke, prirodu medijuma u kojem su lipidne vezikule dispergovane, efektivne koncentracije zarobljene supstance i njenu potencijalnu toksičnost, sve dopunske postupke koji su uključeni tokom primene i/ili isporuke vezikula, veličinu optimizacije, polidisperzivnost i rok trajanja vezikula za predviđenu primenu, i reproducibilnost iz serije u seriju i mogućnost proizvodnje u velikoj razmeri bezbednih i efikasnih lipozomskih proizvoda.
[0237] U jednom aspektu, ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu uključivati, bez ograničavanja, lipozome, kao što su oni formirani od 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetilaminopropan (DODMA) lipozoma, DiLa2 lipozoma od Marina Biotech (Bothell, WA), 1,2-dilinoleiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioksolan (DLin-KC2-DMA), i MC3 (US20100324120) i lipozome koji mogu isporučiti lekove malih molekula kao što je, ali bez ograničavanja na, DOXIL® od Janssen Biotech, Inc. (Horsham, PA).
[0238] U jednom aspektu, ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu uključivati, bez ograničavanja, lipozome, kao što su oni formirani sintezom stabilizovanih plazmid-lipid čestica (SPLP) ili stabilizovanih nukleinska kiselina lipid čestica (SNALP), koje su prethodno opisane i koje su se pokazale kao pogodne za isporuku oligonukleotida in vitro i in vivo (videti Wheeler et al. Gene Therapy. 1999 6:271-281; Zhang et al. Gene Therapy. 1999 6:1438-1447; Jeffs et al. Pharm Res.2005 22:362-372; Morrissey et al., Nat Biotechnol. 2005 2:1002-1007; Zimmermann et al., Nature. 2006441:111-114; Heyes et al., J Contr Rel. 2005 107:276-287; Semple et al. Nature Biotech.2010 28:172-176; Judge et al. J Clin Invest.2009 119:661-673; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132). Originalni postupak proizvodnje od strane Wheeler et al. je postupak dijalize deterdžentom, koji su kasnije poboljšali Jeffs et al. i označava se postupkom spontanog formiranja vezikula. Formulacije lipozoma se sastoje od 3 do 4 lipidne komponente pored polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK. Kao primer, lipozom može sadržati, ali nije ograničen na, 55% holesterola, 20% disteroilfosfatidil holina (DSPC), 10% PEG-S-DSG, i 15% 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetilaminopropana (DODMA), kao što su opisali Jeffs et al. Kao sledeći primer, određene formulacije lipozoma mogu da sadrže, ali nisu ograničene na, 48% holesterola, 20% DSPC, 2% PEG-c-DMA, i 30% katjonskog lipida, gde katjonski lipid može biti 1,2-distearloksi-N,N-dimetilaminopropan (DSDMA), DODMA, DLin-DMA, ili 1,2-dilinoleniloksi-3-dimetilaminopropan (DLenDMA), kao što su opisali Heyes et al.
[0239] Polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNK mogu biti formulisani u lipidnoj vezikuli koja može imati unakrsne veze između funkcionalizovanih lipidnih dvoslojeva.
[0240] Polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNK mogu biti formulisani u lipidpolikatjon kompleksu. Formiranje lipid-polikatjon kompleksa može se postići postupcima poznatim u struci i/ili kao što je opisano u S.A.D. pub. br. 20120178702. Kao neograničavajući primer, polikatjon može uključivati katjonski peptid ili polipeptid kao što je, ali bez ograničavanja na, polilizin, poliornitin i/ili poliarginin. U sledećem slučaju, polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNK mogu biti formulisani u lipid-polikatjon
4
kompleksu koji dodatno može uključivati neutralni lipid kao što je, ali bez ograničavanja na, holesterol ili dioleoil fosfatidiletanolamin (DOPE).
[0241] Na formulaciju lipozoma može uticati, ali bez ograničavanja na, odabir komponente katjonskog lipida, stepen zasićenja katjonskog lipida, prirodu PEGilacije, odnos svih komponenti i biofizičke parametre kao što je veličina. U jednom primeru od strane Semple et al. (Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176), formulacija lipozoma sastojala se od 57,1% katjonskog lipida, 7,1% dipalmitoilfosfatidilholina, 34,3% holesterola, i 1,4% PEG-c-DMA. Kao sledeći primer, promena kompozicije katjonskog lipida mogla bi efikasnije da isporuči siRNK različitim antigen prezentujućim ćelijama (Basha et al. Mol Ther. 2011 19:2186-22003).
[0242] Odnos PEG u LNP formulacijama može se povećati ili smanjiti i/ili se može modifikovati dužina ugljeničnog lanca PEG lipida sa C14 na C18 kako bi se izmenila farmakokinetika i/ili biodistribucija LNP formulacija. Kao neograničavajući primer, LNP formulacije mogu sadržati 1-5% lipidnog molskog odnosa PEG-c-DOMG u poređenju sa katjonskim lipidom, DSPC i holesterolom. U sledećem slučaju, PEG-c-DOMG može biti zamenjen PEG lipidom, kao što je, ali bez ograničavanja na, PEG-DSG (1,2-distearoil-snglicerol, metoksipolietilen glikol) ili PEG-DPG (1,2- dipalmitoil-sn-glicerol, metoksipolietilen glikol). Katjonski lipid može biti odabran od bilo kog lipida poznatog u struci, kao što je, ali bez ograničavanja na, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 i DLin-KC2-DMA.
[0243] Katjonski lipid može biti odabran od, ali bez ograničavanja na, katjonski lipid opisan u međunarodnim publikacijama br. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865 i WO2008103276, S.A.D. patentima br.
7.893.302 i 7.404.969 i S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20100036115. U sledećem slučaju, katjonski lipid može biti odabran od, ali bez ograničavanja na, formulu A opisanu u međunarodnim publikacijama br. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365 i WO2012044638. U još jednom slučaju, katjonski lipid može biti odabran od, ali bez ograničavanja na, formulu CLI-CLXXIX iz međunarodne publikacije br. WO2008103276, formulu CLI-CLXXIX iz S.A.D. patenta br. 7.893.302, formulu CLI-CLXXXXII iz S.A.D. patenta br. 7.404.969 i formule I-VI iz S.A.D. patentne publikacije br. US20100036115. Kao neograničavajući primer, katjonski lipid može biti odabran od (20Z,23Z)-N,N-dimetilnonakoza-20,23-dien-10-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilheksakoza-17,20-dien-9amina, (1 Z, 19Z)-N5N~dimetilpentakoza~16, 19-dien-8-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetildokoza-13J16-dien-5-amina, (12Z,15Z)-NJN-dimetilhenikoza-12,15-dien-4-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltrikoza-14,17-dien-6-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetrakoza-15,18-dien-7-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptakoza-18,21-dien-10-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetrakoza-15,18-dien-5-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltrikoza-14,17-dien-4-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimeihiloktakoza-19,22-dien-9-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptakoza-18,21-dien-8-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilheksakoza-17"20-dien-7-amina, (16Z;19Z)-N,N-dimetilpentakoza-16,19-dien-6-amina, (22Z,25Z)-N,N-dimetilhentriakonta-22,25-dien-10-amina, (21Z,24Z)-N;N-dimetiltriakonta-21, 24-dien-9-amina, (18Z)-N,N-dimetilheptakos-18-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilheksakos-17-en-9-amina, (19Z,22Z)-NJN-dimetiloktakoza-19,22-dien-7-amina, N,N-dimetilheptakosan-10-amina, (20Z,23Z)-N-etil-N-metilnonakoza-20J23-dien-10-amina, 1-[(11Z,14Z)-l-nonilikoza-l 1,14-dien-l-il]pirolidina, (20Z)-N,N-dimetilheptakos-20-en-l 0-amina, (15Z)-N,N-dimetil eptakos-15-en-l 0-amina, (14Z)-N,N-dimetilnonakos-14-en-l 0-amina, (17Z)-N,N-dimetilnonakos-17-en-1 0-amina, (24Z)-N,N-dimetiltritriakont-24-en-1 0-amina, (20Z)-N,N-dimetilnonakos-20-en-1 0-amina, (22Z)-N,N-dimetilhentriakont-22-en-l 0-amina, (16Z)-N,N-dimetilpentakos-16-en-8-amina, (12Z,15Z)-N,N-dimetil-2-nonilheniko sa- 12,15 -dien-1-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetil-3-nonildokoza-l 3, 16-dien-1-amina, N,N-dimetil-l-[(lS,2R)-2-oktilciklopropil] eptadekan-8-amina, 1-[(1S, 2R)-2-heksilciklopropil]-N,N-dimetilnonadekan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1 S, 2R)-2-oktilciklopropil]nonadekan-10-amina, N,N-dimetil-21~[(lS,2R)-2-oktilciklopropil] henikosan-1 0-amina, N,N-dimetil-1-[(1S, 2S)-2- { [(lR,2R)-2-pentilciklopropil]metil} ciklopropil]nonadekan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1 S,2R) -2-oktilciklopropil]heksadekan-8-amina, N,N-dimetiH-[(1R,2S)-2-undecilciklopropil]tetradekan-5-amina, N,N-dimetil-3-{7-[(1 S,2R)-2-oktilciklopropil]heptil}dodekan-1-amina, 1-[(1R,2 S)-2-heptilciklopropi 1] -N,N-dimetiloktadekan-9-amina, 1-[(1 S,2R)-2-decilciklopropil]-N,N-dimetilpentadekan-6-amina, N,N-dimetil-l-[(lS,2R)-2-oktilciklopropil]pentadekan-8-amina, R-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina, S-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-1-[(oktiloksi)metil]etil}pirolidina, (2S)-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-3-[(5Z)-okt-5-en-1-iloksi]propan-2-amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-1-[(oktiloksi)metil]etil}azetidina, (2S)-1-(heksiloksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, (2S)-1-(heptiloksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(noniloksi)-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-[(9Z)-oktadek-9-en-1-iloksi]-3(oktiloksi)propan-2-amina (Jedinjenje 9); (2S)-N,N-dimetil-1-[(6Z,9Z,12Z)-oktadeka-6,9,12-trien-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina, (2S)-1-[(11Z,14Z)-ikoza-11,14-dien-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(pentiloksi)propan-2-amina, (2S)-1-(heksiloksi)-3-[(11Z,14Z)-ikoza-11,14-dien-1-iloksi]-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(11Z,14Z)-ikoza-11,14-dien-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, 1-[(13Z,16Z)-dokoza-13,16-dien-l-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, (2S)-1-[(13Z,16Z)-dokoza-13,16-dien-1-iloksi]-3-(heksiloksi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, (2S)-1-[(13Z)-dokoza-13-en-1-iloksi]-3-(heksiloksi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(13Z)-dokoza-13-en-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, 1-[(9Z)-heksadek-9-en-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, (2R)-N,N-dimetil-H(1-metoiloktil)oksi]-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, (2R)-1-[(3,7-dimetiloktil)oksi]-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(oktiloksi)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciklopropil]metil}ciklopropil]oktil}oksi)propan-2-amina, N,N-dimetil-1-{[8-(2-oklilciklopropil)oktil]oksi}-3-(oktiloksi)propan-2-amina i (1lE,20Z,23Z)-N;N-dimetilnonakoza-l1,20,2-trien-10-amina ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomera.
[0244] Kationski lipid može biti sintetisan postupcima poznatim u struci i/ili kao što je opisano u međunarodnim publikacijama br. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724 i WO201021865.
[0245] LNP formulacije polinukleotida, primarnih konstrukata i/ili mmRNK mogu sadržati PEG-c-DOMG 3% lipidnog molskog odnosa. U sledećem slučaju, LNP formulacije polinukleotida, primarnih konstrukata i/ili mmRNK mogu sadržati PEG-c-DOMG 1,5% lipidnog molskog odnosa.
[0246] Farmaceutske kompozicije polinukleotida, primarnih konstrukata i/ili mmRNK mogu uključivati najmanje jedan od PEGilovanih lipida opisanih u međunarodnoj publikaciji br.
2012099755.
[0247] LNP formulacija može sadržati PEG-DMG 2000 (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol)-2000). LNP formulacija može sadržati PEG-DMG 2000, katjonski lipid poznat u struci i najmanje jednu drugu komponentu. U sledećem slučaju, LNP formulacija može sadržati PEG-DMG 2000, katjonski lipid poznat u struci, DSPC i holesterol. Kao neograničavajući primer, LNP formulacija može sadržati PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC i holesterol. Kao sledeći neograničavajući primer, LNP formulacija može sadržati PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC i holesterol u molskom odnosu 2:40:10:48 (videti Geall et al., Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines, PNAS 2012; PMID: 22908294).
[0248] LNP formulacija može biti formulisana postupcima opisanim u međunarodnim publikacijama br. WO2011127255 ili WO2008103276. Kao neograničavajući primer, ovde opisana modifikovana RNK može biti inkapsulirana u LNP formulacije kao što je opisano u WO2011127255 i/ili WO2008103276.
[0249] Ovde opisane LNP formulacije mogu sadržati polikatjonsku kompoziciju. Kao neograničavajući primer, polikatjonska kompozicija može biti odabrana od formule 1-60 iz S.A.D. patentne publikacije br. US20050222064. U sledećem slučaju, LNP formulacije koje sadrže polikatjonsku kompoziciju mogu se upotrebljavati za isporuku ovde opisane modifikovane RNK in vivo i/ili in vitro.
[0250] Ovde opisane LNP formulacije mogu dopunski sadržati molekul pojačivača permeabilnosti. Neograničavajući molekuli pojačivači permeabilnosti opisani su u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20050222064.
[0251] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane u lipozomima kao što su, ali bez ograničavanja na, DiLa2 lipozome (Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTICLES® (Marina Biotech, Bothell, WA), lipozome zasnovane na neutralnom DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholinu) (npr. isporuka siRNK za kancer jajnika (Landen et al. Cancer Biology & Therapy 2006 5(12)1708-1713)) i lipozome obložene hijaluronanom (Quiet Therapeutics, Izrael).
[0252] Formulacije lipidnih nanočestica mogu se poboljšati zamenom katjonskog lipida biodegradabilnim katjonskim lipidom koji je poznat kao brzo eliminišuća lipidna nanočestica (reLNP). Pokazano je da se jonizabilni katjonski lipidi, kao što su, ali bez ograničavanja na, DLinDMA, DLin-KC2-DMA, i DLin-MC3-DMA, akumuliraju tokom vremena u plazmi i tkivima i mogu biti potencijalni izvor toksičnosti. Brz metabolizam brzo eliminišućih lipida može poboljšati tolerantnost i terapijski indeks lipidnih nanočestica za red veličine od doze od 1 mg/kg do doze od 10 mg/kg kod pacova. Uključivanje enzimski degradirane estarske veze može poboljšati degradaciju i profil metabolizma katjonske komponente, dok se i dalje održava aktivnost reLNP formulacije. Estarska veza može biti internalno locirana unutar lipidnog lanca ili može biti terminusno locirana na terminusnom kraju lipidnog lanca. Internalna estarska veza može zameniti bilo koji ugljenik u lipidnom lancu.
[0253] Internalna estarska veza može biti locirana sa obe strane zasićenog ugljenika. Neograničavajući primeri reLNP uključuju,
[0254] Imunski odgovor može biti izazvan isporukom lipidne nanočestice koja može uključivati nanovrste, polimer i imunogen. (S.A.D. publikacija br. 20120189700 i međunarodna publikacija br. WO2012099805). Polimer može inkapsulirati nanovrste ili delimično inkapsulirati nanovrste.
[0255] Lipidne nanočestice mogu biti projektovane tako da izmene površinska svojstva čestica tako da lipidne nanočestice mogu prodreti kroz mukusnu barijeru. Mukus je lociran na mukoznom tkivu, kao što je, ali bez ograničavanja na, oralno (npr. bukalne i membrane jednjaka i tkivo krajnika), oftalmološko, gastrointestinalno (npr. želudac, tanko crevo, debelo crevo, kolon, rektum), nazalno, respiratorno (npr. nazalne, faringealne, trahealne i bronhijalne membrane), genitalne (npr. vaginalne, cervikalne i uretrusne membrane). Smatralo se da su nanočestice veće od 10-200 nm koje su poželjne za veću efikasnost inkapsulacije leka i sposobnost da obezbede neprekidnu isporuku širokog spektra lekova prevelike kako bi brzo difundovale kroz mukusne barijere. Mukus se kontinuirano sekretuje, izbacuje, odbacuje ili digestuje i reciklira tako da se većina zarobljenih čestica može ukloniti iz mukoznog tkiva unutar nekoliko sekundi ili unutar nekoliko sati. Velike polimerne nanočestice (prečnika 200 nm-500 nm) koje su gusto obložene polietilen glikolom male molekulske mase (PEG) difundovale su kroz mukus samo 4 do 6-struko niže od istih čestica koje difunduju u vodi (Lai et al. PNAS 2007 104(5):1482-487; Lai et al. Adv Drug Deliv Rev. 200961(2): 158-171). Transport nanočestica se može odrediti upotrebom tehnika stopa permeacije i/ili fluorescentne mikroskopije uključujući, ali bez ograničavanja na, oporavak fluorescencije posle fotoizbeljivanja (FRAP) i praćenje više čestica u visokoj rezoluciji (MPT).
[0256] Lipidne nanočestice projektovane da penetriraju kroz mukus mogu sadržati polimerni materijal (tj. polimerno jezgro) i/ili polimer-vitamin konjugat i/ili tri-blok kopolimer. Polimerni materijal može uključivati, ali nije ograničen na, poliamine, polietre, poliamide, poliestre, polikarbamate, poliuree, polikarbonate, poli(stirene), poliimide, polisulfone, poliuretane, poliacetilene, polietilene, polietieneimine, poliizocijanate, poliakrilate, polimetakrilate, poliakrilonitrile, i poliarilate. Polimerni materijal može biti biodegradabilan i/ili biokompatibilan. Neograničavajući primeri specifičnih polimera uključuju poli(kaprolakton) (PCL), etilen vinil acetat polimer (EVA), poli(mlečnu kiselinu) (PLA), poli(L-mlečnu kiselinu) (PLLA), poli(glikolnu kiselinu) (PGA), poli(mlečnu kiselinu-koglikolnu kiselinu) (PLGA), poli(L-mlečnu kiselinu-ko-glikolnu kiselinu) (PLLGA), poli(D, L-laktid) (PDLA), poli(L-laktid) (PLLA), poli(D,L-laktid-ko-kaprolakton), poli(D,L-laktid-kokaprolakton-ko-glikolid), poli(D,L-laktid-ko-PEO-ko-D,L-laktid), poli(D,L-laktid-ko-PPO-ko-D,L-laktid), polialkil cijanoakralat, poliuretan, poli-L-lizin (PLL), hidroksipropil metakrilat (HPMA), polietilenglikol, poli-L-glutaminsku kiselinu, poli(hidroksi kiseline), polanhidride, poliortostre, poli(estarske amide), poliamide, poli(estarske etre), polikarbonate, polialkilene kao što su polietilen i polipropilen, polialkilen glikole kao što je poli(etilen glikol) (PEG), polialkilen okside (PEO), polialkilen tereftalate kao što su poli(etilen tereftalat), polivinil alkohole (PVA), polivinil etre, polivinil estre kao što je poli(vinil acetat), polivinil halogenide kao što je poli(vinil hlorid) (PVC), polivinilpirolidon, polisiloksane, polistiren (PS), poliuretane, derivatizovane celuloze kao što su alkil celuloze, hidroksialkil celuloze, etri celuloze, estri celuloze, nitro celuloze, hidroksipropilceluloza, karboksimetilceluloza, polimere akrilnih kiselina, kao što su poli(metil(met)akrilat) (PMMA), poli(etil(met)akrilat), poli(butil(met)akrilat), poli(izobutil(met)akrilat), poli(heksil(met)akrilat), poli(izodecil(met)akrilat), poli(lauril(met)akrilat), poli(fenil(met)akrilat), poli(metil akrilat), poli(izopropil akrilat), poli(izobutil akrilat), poli(oktadecil akrilat) i kopolimere i njihove smeše, polidioksanon i njegove kopolimere, polihidroksialkanoate, polipropilen fumarat, polioksimetilen, poloksamere, poli(orto)estre, poli(buternu kiselinu), poli(valeričnu kiselinu), poli(laktid-ko-kaprolakton), i trimetilen karbonat, polivinilpirolidon. Lipidne nanočestice mogu biti obložene ili asocirane sa kopolimerom, kao što su, ali bez ograničavanja na, blok kopolimer, i (poli(etilen glikol))-(poli(propilen oksid))-(poli(etilen glikol)) triblok kopolimer (videti S.A.D. publikaciju 20120121718 i S.A.D. publikaciju 201000033370). Kopolimer može biti polimer koji se generalno smatra bezbednim (GRAS) i formiranje lipidne nanočestice može biti na takav način da se ne stvaraju novi hemijski entiteti. Na primer, lipidne nanočestice mogu sadržati poloksamere koji oblažu PLGA nanočestice bez formiranja novih hemijskih entiteta koje su još uvek sposobne da brzo penetriraju kroz humani mukus (Yang et al. Angew. Chem. Int. Ed.
2011 50:2597-2600).
[0257] Vitamin iz polimer-vitamin konjugata može biti vitamin E. Vitaminski deo konjugata može biti supstituisan drugim pogodnim komponentama kao što su, ali bez ograničavanja na, vitamin A, vitamin E, druge vitamine, holesterol, hidrofobni deo, ili hidrofobnu komponentu drugih surfaktanata (npr. lanci sterola, masne kiseline, lanci ugljovodonika i lanci alkilen oksida).
[0258] Lipidne nanočestice projektovane da penetriraju kroz mukus mogu uključivati agense za izmenu površine kao što su, ali bez ograničavanja na, mmRNK, anjonski protein (npr. goveđi serumski albumin), surfaktante (npr. katjonski surfaktanti kao što je na primer dimetildioktadecil-amonijum bromid), šećere ili derivate šećera (npr. ciklodekstrin), nukleinske kiseline, polimere (npr. heparin, polietilen glikol i poloksamer), mukolitičke agense (npr. N-acetilcistein, mugvort, bromelain, papain, klerodendrum, acetilcistein, bromheksin, karbocistein, eprazinon, mesna, ambroksol, sobrerol, domiodol, letostein, stepronin, tiopronin, gelsolin, timozin β4 dornaza alfa, nelteneksin, erdostein) i različite DNaze uključujući rhDNazu. Agens za izmenu površine može biti ugrađen ili upleten u površinu čestice ili odložen (npr. oblaganjem, adsorpcijom, kovalentnom vezom, ili drugim postupkom) na površinu lipidne nanočestice. (videti S.A.D. publikaciju 20100215580 i S.A.D. publikaciju 20080166414).
[0259] Lipidne nanočestice koje penetriraju kroz mukus mogu sadržati najmanje jednu mmRNK koja je ovde opisana. mmRNK može biti inkapsulirana u lipidnu nanočesticu i/ili odložena na površinu čestice. mmRNK može biti kovalentno kuplovana za lipidnu nanočesticu. Formulacije lipidnih nanočestica koje penetriraju kroz mukus mogu sadržati mnoštvo nanočestica. Dodatno, formulacije mogu sadržati čestice koje mogu interagovati sa mukusom i izmeniti strukturna i/ili adhezivna svojstva okolnog mukusa kako bi se smanjila mukoadhezija što može povećati isporuku lipidnih nanočestica koje penetriraju kroz mukus u mukozno tkivo.
[0260] U jednom aspektu, polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK formuliše se kao lipopleks, kao što su, bez ograničavanja, ATUPLEX™ sistem, DACC sistem, DBTC sistem i druga siRNK-lipopleks tehnologija od Silence Therapeutics (London, Ujedinjeno Kraljevstvo), STEMFECT™ od STEMGENT® (Cambridge, MA), i polietilenimina (PEI) ili
1
ciljane i neciljane isporuke nukleinskih kiselina na bazi protamina (Aleku et al. Cancer Res.
2008 68:9788-9798; Strumberg et al. Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel et al., Gene Ther 200613:1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 201023:334-344; Kaufmann et al. Microvasc Res 2010 80:286-293; Weide et al. J Immunother. 2009 32:498-507; Weide et al. J Immunother. 2008 31:180-188; Pascolo Expert Opin. Biol. Ther. 4:1285-1294; Fotin-Mleczek et al., 2011 J. Immunother. 34:1-15; Song et al., Nature Biotechnol.2005, 23:709-717; Peer et al., Proc Natl Acad Sci USA 20076;104:4095-4100; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132).
[0261] Takve formulacije se takođe mogu konstruisati ili kompozicije izmeniti tako da se pasivno ili aktivno usmeravaju na različite tipove ćelija in vivo, uključujući ali bez ograničavanja na hepatocite, imunske ćelije, tumorske ćelije, endotelske ćelije, antigen prezentujuće ćelije, i leukocite (Akinc et al. Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Judge et al., J Clin Invest.2009 119:661-673; Kaufmann et al., Microvasc Res 2010 80:286-293; Santel et al., Gene Ther 200613:1222-1234; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344; Basha et al., Mol. Ther. 201119:2186-2200; Fenske i Cullis, Expert Opin Drug Deliv.
2008 5:25-44; Peer et al., Science. 2008 319:627-630; Peer i Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133). Jedan primer pasivnog ciljnog delovanja formulacija na ćelije jetre uključuje formulacije lipidnih nanočestica na bazi DLin-DMA, DLin-KC2-DMA i MC3 za koje je pokazano da se vezuju za apolipoprotein E i promovišu vezivanje i preuzimanje ovih formulacija u hepatocite in vivo (Akinc et al. Mol Ther. 2010 18:1357-1364). Formulacije se takođe mogu selektivno ciljati preko ekspresije različitih liganada na njihovoj površini, kao što je na primer, ali bez ograničavanja na, folat, transferin, N-acetilgalaktozamin (GalNAc), i pristupe ciljanja antitelima (Kolhatkar et al., Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197-206; Musacchio and Torchilin, Front Biosci. 2011 16:1388-1412; Yu et al., Mol Membr Biol.
2010 27:286-298; Patil et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008 25:1-61; Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Zhao et al., Expert Opin Drug Deliv. 20085:309-319; Akinc et al., Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Srinivasan et al., Methods Mol Biol. 2012 820:105-116; Ben-Arie et al., Methods Mol Biol. 2012 757:497-507; Peer 2010 J Control Release. 20:63-68; Peer et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:4095-4100; Kim et al., Methods Mol Biol. 2011 721:339-353; Subramanya et al., Mol Ther. 2010 18:2028-2037; Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Peer et al., Science. 2008 319:627-630; Peer i Lieberman, Gene Ther.2011 18:1127-1133).
2
[0262] U nekim slučajevima, polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK formuliše se kao čvrsta lipidna nanočestica. Čvrsta lipidna nanočestica (SLN) može biti sferna sa prosečnim prečnikom između 10 do 1000 nm. SLN poseduje čvrsti matriks lipidnog jezgra koji može da solubilizuje lipofilne molekule i koji se može stabilizovati surfaktantima i/ili emulgatorima. Lipidna nanočestica može biti samoasemblirajuća lipid-polimer nanočestica (videti Zhang et al., ACS Nano, 2008, 2 (8), pp.1696-1702).
[0263] Lipozomi, lipopleksi, ili lipidne nanočestice mogu se upotrebljavati da poboljšaju efikasnost proizvodnje proteina koja je usmerena polinukleotidom, primarnim konstruktom, ili mmRNK pošto ove formulacije mogu biti sposobne da povećaju transfekciju ćelije od strane polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK; i/ili povećaju translaciju kodiranog proteina. Jedan takav primer uključuje upotrebu inkapsulacije lipida kako bi se omogućila efikasna sistemska isporuka polipleks plazmidne DNK (Heyes et al., Mol Ther.2007 15:713-720). Lipozomi, lipopleksi, ili lipidne nanočestice mogu se takođe upotrebljavati da povećaju stabilnost polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK.
[0264] Polinukleotidi, primarni konstrukti, i/ili mmRNK iz predmetne objave mogu biti formulisani za kontrolisano oslobađanje i/ili ciljanu isporuku. Kao što se ovde upotrebljava, "kontrolisano oslobađanje" označava farmaceutsku kompoziciju ili profil oslobađanja jedinjenja koji je u skladu sa određenim obrascem oslobađanja kako bi se postigao terapijski ishod. Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu biti inkapsulirani u agens za isporuku ovde opisan i/ili poznat u struci za kontrolisano oslobađanje i/ili ciljanu isporuku. Kao što se ovde upotrebljava, termin "inkapsulirati" znači obuhvatiti, okružiti ili uokviriti. Kada se odnosi na formulaciju jedinjenja iz objave, inkapsulacija može biti suštinska, potpuna ili delimična. Termin "suštinski inkapsuliran" znači da najmanje više od 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,9 ili više od 99,999% farmaceutske kompozicije ili jedinjenja iz objave može biti obuhvaćeno, okruženo ili uokvireno unutar agensa za isporuku. "Delimična inkapsulacija" znači da manje od 10, 10, 20, 30, 40, 50 ili manje farmaceutske kompozicije ili jedinjenja iz objave može biti obuhvaćeno, okruženo ili uokvireno unutar agensa za isporuku. Povoljno, inkapsulacija se može odrediti merenjem bega ili aktivnosti farmaceutske kompozicije ili jedinjenja iz objave upotrebom fluorescencije i/ili elektronske mikrografije. Na primer, najmanje 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 ili više od 99,99% farmaceutske kompozicije ili jedinjenja iz objave su inkapsulirani u agensu za isporuku.
[0265] Polinukleotidi, primarni konstrukti, ili mmRNK mogu biti inkapsulirani u lipidnu nanočesticu ili brzo eliminišuću lipidnu nanočesticu, i lipidne nanočestice ili brzo eliminišuće lipidne nanočestice mogu se zatim inkapsulirati u polimer, hidrogel i/ili hirurški zaptivač ovde opisan i/ili poznat u struci. Kao neograničavajući primer, polimer, hidrogel ili hirurški zaptivač mogu biti PLGA, etilen vinil acetat (EVAc), poloksamer, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego, CA), hirurški zaptivači kao što su fibrinogen polimeri (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), zaptivači na bazi PEG, i COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL).
[0266] Lipidna nanočestica može biti inkapsulirana u bilo koji polimer ili hidrogel poznat u struci koji može formirati gel kada se injektira u subjekta. Kao sledeći neograničavajući primer, lipidna nanočestica može biti inkapsulirana u polimerni matriks koji može biti biodegradabilan.
[0267] Polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK formulacija za kontrolisano oslobađanje i/ili ciljanu isporuku takođe može uključivati najmanje jednu oblogu za kontrolisano oslobađanje. Obloge za kontrolisano oslobađanje uključuju, ali nisu ograničene na, OPADRY®, polivinilpirolidon/vinil acetat kopolimer, polivinilpirolidon, hidroksipropil metilcelulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksietil celulozu, EUDRAGIT RL®, EUDRAGIT RS® i derivate celuloze kao što su etil-celuloza vodene disperzije (AQUACOAT® i SURELEASE®).
[0268] Formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem i/ili ciljanom isporukom može sadržati najmanje jedan degradabilni poliestar koji može sadržati polikatjonske bočne lance. Degradabilni poliestri uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar), i njihove kombinacije. U sledećem slučaju, degradabilni poliestri mogu uključivati PEG konjugaciju kako bi se formirao PEGilovani polimer.
[0269] Polinukleotidi, primarni konstrukti, i/ili mmRNK iz predmetne objave mogu biti inkapsulirani u terapijske nanočestice. Terapijske nanočestice mogu biti formulisane postupcima koji su ovde opisani i poznati u struci, kao što su, ali bez ograničavanja na, međunarodne publikacije br. WO2010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, WO2012054923, S.A.D. publikacije br. US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, i S.A.D. pat. br.
8.206.747). U sledećem slučaju, terapijske polimerne nanočestice mogu se identifikovati postupcima opisanim u S.A.D. pub. br. US20120140790.
[0270] Terapijska nanočestica može biti formulisana za neprekidno oslobađanje. Kao što se ovde upotrebljava, "neprekidno oslobađanje" označava farmaceutsku kompoziciju ili jedinjenje koje odgovara stopi oslobađanja tokom specifičnog vremenskog perioda.
4
Vremenski period može uključivati, ali nije ograničen na, sate, dane, nedelje, mesece i godine. Kao neograničavajući primer, nanočestice sa neprekidnim oslobađanjem mogu sadržati polimer i terapijski agens kao što su, ali bez ograničavanja na, polinukleotide, primarne konstrukte, i mmRNK iz predmetne objave (videti međunarodnu pub. br. 2010075072 i S.A.D. publikacije br. US20100216804 i US20110217377.
[0271] Terapijske nanočestice mogu biti formulisane da budu specifične za cilj. Kao neograničavajući primer, terapijske nanočestice mogu uključivati kortikosteroid (videti međunarodnu pub. br. WO2011084518). Terapijske nanočestice mogu biti formulisane da budu specifične za kancer. Kao neograničavajući primer, terapijske nanočestice mogu biti formulisane u nanočesticama opisanim u međunarodnim publikacijama br. WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 i S.A.D. publikacijama br. US20100069426, US20120004293 i US20100104655.
[0272] Nanočestice mogu sadržati polimerni matriks. Kao neograničavajući primer, nanočestice mogu sadržati dva ili više polimera kao što su, ali bez ograničavanja na, polietilene, polikarbonate, polianhidride, polihidroksikiseline, polipropilfumerate, polikaprolaktone, poliamide, poliacetale, polietre, poliestre, poli(ortoestre), policijanoakrilate, polivinil alkohole, poliuretane, polifosfazene, poliakrilate, polimetakrilate, policijanoakrilate, poliuree, polistirene, poliamine, polizin, poli(etilen imin), poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4- hidroksi-L-prolin estar) ili njihove kombinacije.
[0273] Diblok kopolimer može uključivati PEG u kombinaciji sa polimerom, kao što su, ali bez ograničavanja na, polietilene, polikarbonate, polianhidride, polihidroksikiseline, polipropilfumerate, polikaprolaktone, poliamide, poliacetale, polietre, poliestre, poli(ortoestre), policijanoakrilate, polivinil alkohole, poliuretane, polifosfazene, poliakrilate, polimetakrilate, policijanoakrilate, poliuree, polistirene, poliamine, polizin, poli(etilen imin), poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4- hidroksi-L-prolin estar) ili njihove kombinacije.
[0274] U jednom aspektu, terapijska nanočestica sadrži diblok kopolimer. Kao neograničavajući primer, terapijska nanočestica sadrži PLGA-PEG blok kopolimer (videti S.A.D. pub. br. US20120004293 i S.A.D. pat. br.8.236.330). U sledećem neograničavajućem primeru, terapijska nanočestica je stelt nanočestica koja sadrži diblok kopolimer PEG i PLA ili PEG i PLGA (videti S.A.D. pat. br.8.246.968).
[0275] Terapijska nanočestica može sadržati najmanje jedan akrilni polimer. Akrilni polimeri uključuju, ali nisu ograničani na, akrilnu kiselinu, metakrilnu kiselinu, kopolimere akrilne kiseline i metakrilne kiseline, metil metakrilat kopolimere, etoksietil metakrilate, cijanoetil metakrilat, amino alkil metakrilat kopolimer, poli(akrilnu kiselinu), poli(metakrilnu kiselinu), policijanoakrilate i njihove kombinacije.
[0276] Terapijske nanočestice mogu sadržati najmanje jedan katjonski polimer koji je opisan ovde i/ili poznat u struci.
[0277] Terapijske nanočestice mogu sadržati najmanje jedan polimer koji sadrži amin, kao što su, ali bez ograničavanja na, polizin, polietilen imin, poli(amidoamin) dendrimere i njihove kombinacije.
[0278] Terapijske nanočestice mogu sadržati najmanje jedan degradabilni poliestar koji može sadržati polikatjonske bočne lance. Degradabilni poliestri uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar), i njihove kombinacije. U sledećem slučaju, degradabilni poliestri mogu uključivati PEG konjugaciju kako bi se formirao PEGilovani polimer.
[0279] Terapijska nanočestica može uključivati konjugaciju najmanje jednog ciljno delujućeg liganda.
[0280] Terapijska nanočestica može biti formulisana u vodenom rastvoru koji se može upotrebljavati za ciljanje kancera (videti međunarodnu pub. br. WO2011084513 i S.A.D. pub. br. US20110294717).
[0281] Polinukleotidi, primarni konstrukti, ili mmRNK mogu biti inkapsulirani u, povezani za i/ili asocirani sa sintetičkim nanonosačima. Sintetički nanonosači mogu biti formulisani upotrebom postupaka poznatih u struci i/ili opisanih ovde. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosači mogu biti formulisani postupcima opisanim u međunarodnim publikacijama br. WO2010005740, WO2010030763 i S.A.D. publikacijama br. US20110262491, US20100104645 i US20100087337. Formulacije sintetičkih nanonosača mogu biti liofilizovane postupcima opisanim u međunarodnoj pub. br. WO2011072218 i S.A.D. pat. br.8.211.473.
[0282] Sintetički nanonosači mogu sadržati reaktivne grupe za oslobađanje polinukleotida, primarnih konstrukata i/ili mmRNK koji su ovde opisani (videti međunarodnu pub. br. WO20120952552 i S.A.D. pub. br. US20120171229).
[0283] Sintetički nanonosači mogu sadržati imunostimulatorni agens za poboljšavanje imunskog odgovora od isporuke sintetičkog nanonosača. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosač može sadržati Th1 imunostimulatorni agens koji može poboljšati Th1-zasnovani odgovor imunskog sistema (videti međunarodnu pub. br. WO2010123569 i S.A.D. pub. br. US20110223201).
[0284] Sintetički nanonosači mogu biti formulisani za ciljano oslobađanje. Sintetički nanonosač može biti formulisan za oslobađanje polinukleotida, primarnih konstrukata i/ili mmRNK pri specificiranoj pH i/ili posle željenog vremenskog intervala. Kao neograničavajući primer, sintetičke nanočestice mogu biti formulisane tako da oslobađaju polinukleotide, primarne konstrukte i/ili mmRNK posle 24 sata i/ili pri pH 4,5 (videti međunarodne publikacije br. WO2010138193 i WO2010138194 i S.A.D. publikacije br. US20110020388 i US20110027217).
[0285] Sintetički nanonosači mogu biti formulisani za kontrolisano i/ili neprekidno oslobađanje ovde opisanih polinukleotida, primarnih konstrukata i/ili mmRNK. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosači za neprekidno oslobađanje mogu biti formulisani postupcima poznatim u struci, opisanim ovde i/ili kao što je opisano u međunarodnoj pub. br. WO2010138192 i S.A.D. pub. br.20100303850.
[0286] Objava polimera, biodegradabilnih nanočestica, i jezgro-ljuska nanočestica [0287] Polinukleotid, primarni konstrukt, i mmRNK iz objave mogu biti formulisani upotrebom prirodnog i/ili sintetičkog polimera. Neograničavajući primeri polimera koji se mogu upotrebljavati za isporuku uključuju, ali nisu ograničeni na, Dynamic POLYCONJUGATE™ formulacije od MIRUS® Bio (Madison, WI) i Roche Madison (Madison, WI), PHASERX™ polimerne formulacije, kao što su, bez ograničavanja, SMARTT POLYMER TECHNOLOGY™ (Seattle, WA), DMRI/DOPE, poloksamer, VAXFECTIN® adjuvans od Vical (San Diego, CA), hitozan, ciklodekstrin od Calando Pharmaceuticals (Pasadena, CA), dendrimeri i poli(laktil-ko-glikolna kiselina) (PLGA)polimeri. RONDEL™ (isporuka nanočestica RNKi/oligonukleotid) polimeri (Arrowhead Research Corporation, Pasadena, CA) i ko-blok polimeri koji odgovaraju na pH, kao što je, ali bez ograničavanja na, PHASERX™ (Seattle, WA).
[0288] Neograničavajući primeri PLGA formulacija uključuju, ali nisu ograničeni na, PLGA injektabilne depoe (npr. ELIGARD® koji se formira rastvaranjem PLGA u 66% N-metil-2-pirolidonu (NMP) i ostatak je vodeni rastvarač i leuprolid. Nakon injektiranja, PLGA i leuprolidni peptid talože se u subkutanom prostoru).
[0289] Mnogi od ovih polimernih pristupa pokazali su efikasnost u isporuci oligonukleotida in vivo u ćelijsku citoplazmu (pregledno prikazano u deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132). Dva polimerna pristupa koja su dala robustnu in vivo isporuku nukleinskih kiselina, u ovom slučaju sa malom interferirajućom RNK (siRNK), su dinamički polikonjugati i nanočestice na bazi ciklodekstrina. Prvi od ovih pristupa isporuke upotrebljava dinamičke polikonjugate i pokazano je in vivo kod miševa da efikasno isporučuje siRNK i utišava endogenu ciljnu mRNK u hepatocitima (Rozema et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:12982-12887). Ovaj poseban pristup je višekomponentni polimerni sistem čije ključne osobine uključuju membranski aktivan polimer za koji je nukleinska kiselina, u ovom slučaju siRNK, kovalentno kuplovana putem disulfidne veze i gde su i PEG (za maskiranje naelektrisanja) i N-acetilgalaktozamin (za ciljno delovanje na hepatocit) grupe povezane putem pH osetljivih veza (Rozema et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007104:12982-12887). Po vezivanju za hepatocit i ulasku u endozom, polimerni kompleks se deasemblira u okruženju sa niskom pH, pri čemu polimer izlaže svoje pozitivno naelektrisanje, što dovodi do bega iz endozoma i oslobađanja u citoplazmu siRNK iz polimera. Preko zamene N-acetilgalaktozamin grupe sa manoza grupom, pokazano je da se može izmeniti ciljno delovanje sa hepatocita koji eksprimiraju asijaloglikoproteinske receptore na sinusoidni endotel i Kupferove (Kupffer) ćelije. Sledeći polimerni pristup uključuje upotrebu polikatjonskih nanočestica koje sadrže ciklodekstrin koje ciljaju transferin. Ove nanočestice su demonstrirale ciljano utišavanje produkta EWS-FLI1 gena u tumorskim ćelijama Juingovog (Ewing) sarkoma koje eksprimiraju transferinski receptor (Hu-Lieskovan et al., Cancer Res.
2005 65: 8984-8982) i siRNK formulisana u ovim nanočesticama je dobro tolerisana kod nehumanih primata (Heidel et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21). Obe ove strategije isporuke inkorporišu racionalne pristupe upotrebom i mehanizama ciljane isporuke i bega iz endozoma.
[0290] Polimerna formulacija može dozvoliti neprekidno ili odloženo oslobađanje polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK (npr. nakon intramuskularne ili subkutane injekcije). Izmenjeni profil oslobađanja polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK može rezultovati, na primer, translacijom kodiranog proteina tokom produženog vremenskog perioda. Polimerna formulacija se takođe može upotrebljavati da poveća stabilnost polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK. Biodegradabilni polimeri su prethodno upotrebljavani za zaštitu nukleinskih kiselina drugih nego mmRNK od degradacije i pokazano je da rezultuju neprekidnim oslobađanjem korisnog tereta in vivo (Rozema et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007104:12982-12887; Sullivan et al., Expert Opin Drug Deliv.2010 7:1433-1446; Convertine et al., Biomacromolecules. 2010 Oct 1; Chu et al., Acc Chem Res.2012 Jan 13; Manganiello et al., Biomaterials. 201233:2301-2309; Benoit et al., Biomacromolecules.
2011 12:2708-2714; Singha et al., Nucleic Acid Ther. 2011 2:133-147; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132; Schaffert i Wagner, Gene Ther. 2008 16:1131-1138; Chaturvedi et al., Expert Opin Drug Deliv.2011 8:1455-1468; Davis, Mol Pharm.2009 6:659-668; Davis, Nature 2010464:1067-1070).
[0291] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulacije sa neprekidnim oslobađanjem. Formulacije sa neprekidnim oslobađanjem mogu biti za subkutanu isporuku. Formulacije sa neprekidnim oslobađanjem mogu uključivati, ali nisu ograničene na, PLGA mikrosfere, etilen vinil acetat (EVAc), poloksamer, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA), hirurške zaptivače kao što su fibrinogen polimeri (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), zaptivače na bazi PEG, i COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL).
[0292] Kao neograničavajući primer, modifikovana mRNK može biti formulisana u PLGA mikrosfere pripremanjem PLGA mikrosfera sa podesivim stopama oslobađanja (npr. dani i nedelje) i inkapsuliranjem modifikovane mRNK u PLGA mikrosfere uz održavanje integriteta modifikovane mRNK tokom postupka inkapsulacije. EVAc su nebiodegradabilni, biokompatibilni polimeri koji se uveliko upotrebljavaju u predkliničkim primenama implantata sa neprekidnim oslobađanjem (npr. proizvodi sa neprekidnim oslobađanjem Ocusert pilokarpinski oftalmološki insert za glaukom ili progestasert intrauterusni uređaj sa neprekidnim oslobađanjem progesterona; sistemi za transdermalnu isporuku Testoderm, Duragesic i Selegiline; kateteri). Poloksamer F-407 NF je hidrofilni, nejonski surfaktant triblok kopolimer polioksietilen-polioksipropilen-polioksietilena koji ima nisku viskoznost na temperaturama manjim od 5 °C i formira čvrsti gel na temperaturama većim od 15 °C. Hirurški zaptivači na bazi PEG sadrže dve sintetičke PEG komponente pomešane u uređaju za isporuku koji se može pripremiti za jedan minut, zapečatiti za 3 minuta i reapsorbovati unutar 30 dana. GELSITE® i prirodni polimeri sposobni su da želiraju in situ na mestu primene. Pokazano je da interaguju sa proteinskim i peptidnim terapijskim kandidatima preko jonske interakcije kako bi obezbedili stabilizujući efekat.
[0293] Polimerne formulacije se takođe mogu selektivno ciljati preko ekspresije različitih liganada, kao što je na primer, ali bez ograničavanja na, folat, transferin i N-acetilgalaktozamin (GalNAc) (Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Rozema et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:12982-12887; Davis, Mol Pharm. 2009 6:659-668; Davis, Nature 2010464:1067-1070).
[0294] Polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNK iz objave mogu biti formulisani sa ili u polimernom jedinjenju. Polimer može uključivati najmanje jedan polimer kao što su, ali bez ograničavanja na, polietene, polietilen glikol (PEG), poli(l-lizin) (PLL), PEG graftovan na PLL, katjonski lipopolimer, biodegradabilni katjonski lipopolimer, polietilenimin (PEI), umreženi razgranati poli(alkilen imine), derivat poliamina, modifikovani poloksamer, biodegradabilni polimer, biodegradabilni blok kopolimer, biodegradabilni nasumični kopolimer, biodegradabilni poliestarski kopolimer, biodegradabilni poliestarski blok kopolimer, biodegradabilni poliestarski blok nasumični kopolimer, linearni biodegradabilni kopolimer, poli[α-(4-aminobutil)-L-glikolna kiselina) (PAGA), biodegradabilne umrežene katjonske multi-blok kopolimere, polikarbonate, polianhidride, polihidroksikiseline, polipropilfumerate, polikaprolaktone, poliamide, poliacetale, polietre, poliestre, poli(ortoestre), policijanoakrilate, polivinil alkohole, poliuretane, polifosfazene, poliakrilate, polimetakrilate, policijanoakrilate, poliuree, polistirene, poliamine, polizin, poli(etilen imin), poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4- hidroksi-L-prolin estar), akrilne polimere, polimere koji sadrže amin ili njihove kombinacije.
[0295] Kao neograničavajući primer, polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNK iz objave mogu biti formulisani sa polimernim jedinjenjem PEG graftovanim sa PLL kao što je opisano u S.A.D. pat. br.6.177.274. Formulacija se može upotrebljavati za transfekciju ćelija in vitro ili za in vivo isporuku polinukleotida, primarnih konstrukata i/ili mmRNK. U sledećem primeru, polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNK mogu biti suspendovani u rastvoru ili medijumu sa katjonskim polimerom, u suvoj farmaceutskoj kompoziciji ili u rastvoru koji se može osušiti kao što je opisano u S.A.D. publikacijama br. 20090042829 i 20090042825.
[0296] Kao sledeći neograničavajući primer, polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz objave mogu biti formulisani sa PLGA-PEG blok kopolimerom (videti S.A.D. pub. br. US20120004293 i S.A.D. pat. br. 8.236.330). Kao neograničavajući primer, polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz objave mogu biti formulisani sa diblok kopolimerom PEG i PLA ili PEG i PLGA (videti S.A.D. pat. br.8.246.968).
[0297] Derivat poliamina se može upotrebljavati za isporuku nukleinskih kiselina ili za lečenje i/ili preveniranje bolesti ili da se uključi u implantabilni ili injektabilni uređaj (S.A.D. pub. br. 20100260817). Kao neograničavajući primer, farmaceutska kompozicija može uključivati modifikovane nukleinske kiseline i mmRNK i derivat poliamina opisan u S.A.D. pub. br.20100260817.
[0298] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz objave mogu biti formulisani sa najmanje jednim akrilnim polimerom. Akrilni polimeri uključuju, ali nisu ograničeni na, akrilnu kiselinu, metakrilnu kiselinu, kopolimere akrilne kiseline i metakrilne kiseline, metil metakrilat kopolimere, etoksietil metakrilate, cijanoetil metakrilat, amino alkil metakrilat kopolimer, poli(akrilnu kiselinu), poli(metakrilnu kiselinu), policijanoakrilate i njihove kombinacije.
[0299] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz predmetne objave mogu biti formulisani sa najmanje jednim polimerom opisanim u međunarodnim publikacijama br. WO2011115862, WO2012082574 i WO2012068187. Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu biti formulisani sa polimerom formule Z kao što je opisano u WO2011115862. Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu biti formulisani sa polimerom formule Z, Z' ili Z" kao što je opisano u WO2012082574 ili WO2012068187. Polimeri formulisani sa modifikovanom RNK iz predmetne objave mogu se sintetisati postupcima opisanim u WO2012082574 ili WO2012068187.
[0300] Formulacije polinukleotida, primarnih konstruktata ili mmRNK iz objave mogu uključivati najmanje jedan polimer koji sadrži amin, kao što su, ali bez ograničavanja na, polizin, polietilen imin, poli(amidoamin) dendrimere ili njihove kombinacije.
[0301] Na primer, polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNK iz objave mogu biti formulisani u farmaceutskom jedinjenju koje uključuje poli(alkilen imin), biodegradabilni katjonski lipopolimer, biodegradabilni blok kopolimer, biodegradabilni polimer, ili biodegradabilni nasumični kopolimer, biodegradabilni poliestarski blok kopolimer, biodegradabilni poliestarski polimer, biodegradabilni poliestarski nasumični kopolimer, linearni biodegradabilni kopolimer, PAGA, biodegradabilni umreženi katjonski multi-blok kopolimer ili njihove kombinacije. Biodegradabilni katjonski lipopolimer se može napraviti pomoću postupaka poznatih u struci i/ili kao što je opisano u S.A.D. pat. br. 6.696.038, S.A.D. prijavama br. 20030073619 i 20040142474. Poli(alkilen imin) se može napraviti upotrebom postupaka poznatih u struci i/ili kao što je opisano u S.A.D. pub. br.20100004315. Biodegradabilni polimer, biodegradabilni blok kopolimer, biodegradabilni nasumični kopolimer, biodegradabilni poliestarski blok kopolimer, biodegradabilni poliestarski polimer, ili biodegradabilni poliestarski nasumični kopolimer mogu se napraviti upotrebom postupaka poznatih u struci i/ili kao što je opisano u S.A.D. patentima br. 6.517.869 i 6.267.987. Linearni biodegradabilni kopolimer se može napraviti upotrebom postupaka poznatih u struci i/ili kao što je opisano u S.A.D. pat. br. 6.652.886. PAGA polimer se može napraviti upotrebom postupaka poznatih u struci i/ili kao što je opisano u S.A.D. pat. br. 6.217.912. PAGA polimer može biti kopolimerizovan da formira kopolimer ili blok kopolimer sa polimerima kao što su, ali bez ograničavanja na, poli-L-lizin, poliarginin, poliornitin, histone, avidin, protamine, polilaktide i poli(laktid-ko-glikolide). Biodegradabilni umreženi katjonski multi-blok kopolimeri se mogu napraviti pomoću postupaka poznatih u struci i/ili kao što je opisano u S.A.D. pat. br. 8.057.821 ili S.A.D. pub. br. 2012009145. Na primer, multi-blok kopolimeri se mogu sintetisati upotrebom linearnih polietilenimin (LPEI) blokova koji imaju
1
različite obrasce u poređenju sa razgranatim polietileniminima. Dodatno, kompozicija ili farmaceutska kompozicija se mogu napraviti pomoću postupaka poznatih u struci, opisanih ovde, ili kao što je opisano u S.A.D. pub. br.20100004315 ili S.A.D. patentima br.6.267.987 i 6.217.912.
[0302] Polinukleotidi, primarni konstrukti, i mmRNK iz objave mogu biti formulisani sa najmanje jednim degradabilnim poliestrom koji može sadržati polikatjonske bočne lance. Degradabilni poliestri uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar), i njihove kombinacije. U sledećem slučaju, degradabilni poliestri mogu uključivati PEG konjugaciju da formiraju PEGilovani polimer.
[0303] Ovde opisani polimeri mogu biti konjugovani za PEG koji se završava lipidom. Kao neograničavajući primer, PLGA može biti konjugovan za PEG koji se završava lipidom koji formira PLGA-DSPE-PEG. Kao sledeći neograničavajući primer, PEG konjugati za upotrebu sa predmetnom objavom opisani su u međunarodnoj publikaciji br. WO2008103276.
[0304] Ovde opisani polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNK mogu biti konjugovani sa drugim jedinjenjem. Neograničavajući primeri konjugata opisani su u S.A.D. patentima br.
7.964.578 i 7.833.992. U sledećem slučaju, polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNK iz predmetne objave mogu biti konjugovani sa konjugatima formule 1-122 kao što je opisano u S.A.D. patentima br.7.964.578 i 7.833.992.
[0305] Kao što je opisano u S.A.D. pub. br. 20100004313, kompozicija za isporuku gena može uključivati nukleotidnu sekvencu i poloksamer. Na primer, polinukleotid, primarni konstrukt i/ili mmRNK iz predmetne objave mogu se upotrebljavati u kompoziciji za isporuku gena sa poloksamerom opisanim u S.A.D. pub. br.20100004313.
[0306] Polimerna formulacija može biti stabilizovana dovođenjem u kontakt polimerne formulacije, koja može uključivati katjonski nosač, sa katjonskim lipopolimerom koji može biti kovalentno povezan za holesterol i polietilen glikol grupe. Polimerna formulacija može biti dovedena u kontakt sa katjonskim lipopolimerom upotrebom postupaka opisanih u S.A.D. pub. br.20090042829. Katjonski nosač može uključivati, ali nije ograničen na, polietilenimin, poli(trimetilenimin), poli(tetrametilenimin), polipropilenimin, aminoglikozid-poliamin, dideoksi-diamino-b-ciklodekstrin, spermin, spermidin, poli(2-dimetilamino)etil metakrilat, poli(lizin), poli(histidin), poli(arginin), katjonizovani želatin, dendrimere, hitozan, 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan (DOTAP), N-[1-(2,3-dioleoiloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA), 1-[2-(oleoiloksi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroksietil)imidazolinijum hlorid (DOTIM), 2,3-dioleiloksi-N-[2(sperminkarboksamido) etil]-N,N-dimetil-1-propanaminiumtrifluoroacetat (DOSPA), 3B-[N-(N',N'-dimetilaminoetan)
2
-karbamoil]holesterol hidrohlorid (DC-holesterol HCl) diheptadecilamidoglicil spermidin (DOGS), N,N-distearil-N,N-dimetilamonijum bromid (DDAB), N-(1,2-dimiristiloksiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroksietil amonijum bromid (DMRIE), N,N-dioleil-N,N-dimetilamonijum hlorid DODAC) i njihove kombinacije.
[0307] Polinukleotid, primarni konstrukt, i mmRNK iz objave mogu takođe biti formulisani kao nanočestice upotrebom kombinacije polimera, lipida, i/ili drugih biodegradabilnih agenasa, kao što je, ali bez ograničavanja na, kalcijum fosfat. Komponente mogu biti kombinovane u jezgro-ljuska, hibrid, i/ili sloj po sloj arhitekturu, kako bi se omogućilo fino podešavanje nanočestice tako da isporuka polinukleotida, primarnog konstrukta i mmRNK može biti poboljšana (Wang et al., Nat Mater. 2006 5:791-796; Fuller et al., Biomaterials.
2008 29:1526-1532; DeKoker et al., Adv Drug Deliv Rev. 2011 63:748-761; Endres et al., Biomaterials. 2011 32:7721-7731; Su et al., Mol Pharm.2011 Jun 6;8(3):774-87).
[0308] Pokazano je da biodegradabilne nanočestice kalcijum fosfata u kombinaciji sa lipidima i/ili polimerima isporučuju polinukleotide, primarne konstrukte i mmRNK in vivo. Nanočestica kalcijum fosfata obložena lipidom, koja takođe može sadržati ciljno delujući ligand kao što je anisamid, može se upotrebljavati za isporuku polinukleotida, primarnog konstrukta i mmRNK iz predmetne objave. Na primer, za efikasnu isporuku siRNK u metastatskom modelu pluća miša, upotrebljena je nanočestica kalcijum fosfata obložena lipidom (Li et al., J Contr Rel. 2010142:416-421; Li et al., J Contr Rel. 2012 158:108-114; Yang et al., Mol Ther. 2012 20:609-615). Ovaj sistem za isporuku kombinuje i ciljnu nanočesticu i komponentu za poboljšanje bega iz endozoma, kalcijum fosfat, kako bi se poboljšala isporuka siRNK.
[0309] Kalcijum fosfat sa PEG-polianjon blok kopolimerom može se upotrebljavati za isporuku polinukleotida, primarnih konstrukata i mmRNK (Kazikawa et al., J Contr Rel.2004 97:345-356; Kazikawa et al., J Contr Rel.2006 111:368-370).
[0310] PEG-konvertovanog naelektrisanja polimer (Pitella et al., Biomaterials.2011 32:3106-3114) može se upotrebljavati za formiranje nanočestice za isporuku polinukleotida, primarnih konstrukata i mmRNK iz predmetne objave. PEG-konvertovanog naelektrisanja polimer može biti poboljšan u odnosu na PEG-polianjon blok kopolimere tako što se iseca u polikatjon pri kiseloj pH, pojačavajući tako beg iz endozoma.
[0311] Upotreba jezgro-ljuska nanočestica dopunski je fokusirana na pristup visoke propusnosti za sintezu katjonskih umreženih nanogel jezgara i različitih ljuski (Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011 108:12996-13001). Kompleksovanje, isporuka, i internalizacija polimernih nanočestica mogu se precizno kontrolisati izmenom hemijske kompozicije i u komponenti jezgra i u komponenti ljuske nanočestice. Na primer, jezgroljuska nanočestice mogu efikasno isporučiti siRNK u hepatocite miša pošto kovalentno prikače holesterol na nanočesticu.
[0312] Šuplje lipidno jezgro koje sadrži srednji PLGA sloj i spoljni neutralni lipidni sloj koji sadrži PEG može se upotrebljavati za isporuku polinukleotida, primarnog konstrukta i mmRNK iz predmetne objave. Kao neograničavajući primer, kod miševa koji imaju tumor koji eksprimira luciferazu, utvrđeno je da lipid-polimer-lipid hibridna nanočestica značajno suprimira ekspresiju luciferaze, u poređenju sa konvencionalnim lipopleksom (Shi et al, Angew Chem Int Ed.2011 50:7027-7031).
Peptidi i proteini
[0313] Sintetički polinukleotidi i/ili sintetičke sgRNK mogu biti formulisane sa peptidima i/ili proteinima kako bi se povećala transfekcija ćelija od strane polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK. Peptidi kao što su, ali bez ograničavanja na, peptide koji penetriraju u ćeliju i proteini i peptidi koji omogućavaju unutarćelijsku isporuku mogu se upotrebljavati za isporuku farmaceutskih formulacija. Neograničavajući primer peptida koji penetrira u ćeliju i koji se može upotrebljavati sa farmaceutskim formulacijama iz predmetne objave uključuje peptidnu sekvencu koja penetrira u ćeliju prikačenu za polikatjone što olakšava isporuku u unutarćelijski prostor, npr. TAT peptid poreklom iz HIV, penetrante, transportante, ili peptidi koji penetriraju u ćeliju poreklom iz hCT (videti, npr. Caron et al., Mol. Ther.
3(3):310-8 (2001); Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL, 2002); El-Andaloussi et al., Curr. Pharm. Des. 11(28):3597-611 (2003); i Deshayes et al., Cell. Mol. Life Sci. 62(16):1839-49 (2005)). Kompozicije takođe mogu biti formulisane tako da uključuju agens za penetriranje u ćeliju, npr. lipozome, koji poboljšavaju isporuku kompozicija u unutarćelijski prostor. Polinukleotidi, primarni konstrukti, i mmRNK iz objave mogu biti kompleksovani za peptide i/ili proteine, kao što su, ali bez ograničavanja na, peptide i/ili proteine iz Aileron Therapeutics (Cambridge, MA) i Permeon Biologics (Cambridge, MA) kako bi se omogućila unutarćelijska isporuka (Cronican et al., ACS Chem. Biol. 2010 5:747-752; McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009 106:6111-6116; Sawyer, Chem Biol Drug Des. 2009 73:3-6; Verdine i Hilinski, Methods Enzymol. 2012;503:3-33).
[0314] Polipeptid koji penetrira u ćeliju može sadržati prvi domen i drugi domen. Prvi domen može sadržati supernaelektrisani polipeptid. Drugi domen može sadržati protein-vezujućeg
4
partnera. Kao što se ovde upotrebljava, "protein-vezujući partner" uključuje, ali nije ograničen na, antitela i njihove funkcionalne fragmente, proteine skele, ili peptide. Polipeptid koji penetrira u ćeliju može dodatno sadržati unutarćelijskog vezujućeg partnera za proteinvezujućeg partnera. Polipeptid koji penetrira u ćeliju može biti sposoban da se sekretuje iz ćelije u koju se polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK može introdukovati.
[0315] Formulacije uključujućih peptida ili proteina mogu se upotrebljavati za povećanje transfekcije ćelija od strane polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK, izmenu biodistribucije polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK (npr. pomoću ciljnog delovanja na specifična tkiva ili tipove ćelija), i/ili povećanje translacije kodiranog proteina.
Ćelije
[0316] Polinukleotid, primarni konstrukt, i mmRNK iz objave mogu biti transfektovani ex vivo u ćelije, koje se zatim transplantiraju u subjekta. Kao neograničavajući primeri, farmaceutske kompozicije mogu uključivati crvena krvna zrnca za isporuku modifikovane RNK u jetru i mijeloidne ćelije, virozome za isporuku modifikovane RNK u čestice slične virusu (VLP), i elektroporisane ćelije, kao što su, ali bez ograničavanja, iz MAXCYTE® (Gaithersburg, MD) i iz ERYTECH® (Lion, Francuska) za isporuku modifikovane RNK. Dokumentovani su primeri upotrebe crvenih krvnih zrnaca, virusnih čestica i elektroporisanih ćelija za isporuku korisnog tereta drugog nego što je mmRNK (Godfrin et al., Expert Opin Biol Ther. 2012 12:127-133; Fang et al., Expert Opin Biol Ther. 201212:385-389; Hu et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011 108:10980-10985; Lund et al., Pharm Res. 2010 27:400-420; Huckriede et al., J Liposome Res. 2007;17:39-47; Cusi, Hum Vaccin. 2006 2:1-7; de Jonge et al., Gene Ther. 2006 13:400-411).
[0317] Polinukleotidi, primarni konstrukti i mmRNK mogu biti isporučeni u sintetičke VLP sintetisane postupcima opisanim u međunarodnoj pub. br. WO2011085231 i S.A.D. pub. br.
20110171248.
[0318] Formulacije polinukleotida, primarnog konstrukta, i mmRNK iz objave na bazi ćelija mogu se upotrebljavati za obezbeđivanje transfekcije ćelija (npr. u ćelijskom nosaču), izmenu biodistribucije polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK (npr. pomoću ciljnog delovanja ćelijskog nosača na specifična tkiva ili tipove ćelija), i/ili povećanje translacije kodiranog proteina.
[0319] Različiti postupci su poznati u struci i pogodni su za introdukciju nukleinske kiseline u ćeliju, uključujući virusno i nevirusno posredovane tehnike. Primeri tipičnih nevirusno posredovanih tehnika uključuju, ali nisu ograničeni na, elektroporaciju, transfer posredovan kalcijum fosfatom, nukleofekciju, sonoporaciju, toplotni šok, magnetofekciju, transfer posredovan lipozomima, mikroinjekciju, transfer posredovan mikroprojektilima (nanočestice), transfer posredovan katjonskim polimerom (DEAE-dekstran, polietilenimin, polietilen glikol (PEG) i slično) ili ćelijsku fuziju.
[0320] Tehnika sonoporacije, ili ćelijske sonikacije je upotreba zvuka (npr. ultrazvučnih frekvencija) za modifikovanje permeabilnosti ćelijske plazma membrane. Postupci sonoporacije su poznati onima u struci i upotrebljavaju se za isporuku nukleinskih kiselina in vivo (Yoon i Park, Expert Opin Drug Deliv. 2010 7:321-330; Postema i Gilja, Curr Pharm Biotechnol. 2007 8:355-361; Newman i Bettinger, Gene Ther. 2007 14:465-475). Postupci sonoporacije su poznati u struci i takođe se o njima podučava na primer kada se odnose na bakterije u S.A.D. patentnoj publikaciji 20100196983 i kada se odnose na druge tipove ćelija u, na primer, S.A.D. patentnoj publikaciji 20100009424.
[0321] Tehnike elektroporacije su takođe dobro poznate u struci i upotrebljavaju se za isporuku nukleinskih kiselina in vivo i klinički (Andre et al., Curr Gene Ther. 201010:267-280; Chiarella et al., Curr Gene Ther. 201010:281-286; Hojman, Curr Gene Ther. 201010: 128-138). Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu biti isporučeni pomoću elektroporacije kao što je opisano u Primeru 26.
Hijaluronidaza
[0322] Intramuskularna ili subkutaka lokalizovana injekcija polinukleotida, primarnog konstrukta, ili mmRNK iz objave može uključivati hijaluronidazu, koja katalizuje hidrolizu hijaluronana. Katalizujući hidrolizu hijaluronana, konstituenta intersticijumske barijere, hijaluronidaza smanjuje viskoznost hijaluronana, time povećavajući premeabilnost tkiva (Frost, Expert Opin. Drug Deliv. (2007) 4:427-4403). Korisno je ubrzati njihovu disperziju i sistemsku distribuciju kodiranih proteina proizvedenih od strane transfektovanih ćelija. Alternativno, hijaluronidaza se može upotrebljavati za povećanje broja ćelija izloženih polinukleotidu, primarnom konstruktu, ili mmRNK iz objave primenjenih intramuskularno ili subkutano.
Mimici nanočestica
[0323] Polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK iz objave mogu biti inkapsulirani unutar i/ili apsorbovani u mimik nanočestice. Mimik nanočestica može oponašati funkcije isporuke organizama ili čestica kao što su, ali bez ograničavanja na, patogene, viruse, bakterije, gljivice, parazite, prione i ćelije. Kao neograničavajući primer, polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK iz objave može biti inkapsuliran u nevirusnu česticu koja može oponašati funkciju isporuke koju ima virus (videti međunarodnu pub. br. WO2012006376).
Nanotube
[0324] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz objave mogu biti prikačeni ili na drugi način vezani za najmanje jednu nanotubu kao što su, ali bez ograničavanja na, rozeta nanotube, rozeta nanotube koje imaju dvostruke baze sa linkerom, ugljenične nanotube i/ili ugljenične nanotube sa jednim zidom. Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu biti vezani za nanotube silama kao što su, ali bez ograničavanja na, steričke, jonske, kovalentne i/ili druge sile.
[0325] U nekim slučajevima nanotuba može otpustiti jedan ili više polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK u ćelije. Veličina i/ili površinska struktura najmanje jedne nanotube može biti izmenjena tako da upravlja interakcijom nanotuba unutar tela i/ili da se prikači ili veže za polinukleotide, primarne konstrukte ili mmRNK koji su ovde objavljeni. Gradivni blok i/ili funkcionalne grupe prikačene za gradivni blok najmanje jedne nanotube mogu biti izmenjene kako bi se prilagodile dimenzije i/ili svojstva nanotuba. Kao neograničavajući primer, dužina nanotuba može biti izmenjena da spreči nanotube da prođu kroz otvore u zidovima normalnih krvnih sudova, ali da još uvek budu dovoljno male da prođu kroz veće otvore u krvnim sudovima tumorskog tkiva.
[0326] Najmanje jedna nanotuba takođe može biti obložena jedinjenjima koja poboljšavaju isporuku, uključujući polimere, kao što je, ali bez ograničavanja na, polietilen glikol. U sledećem slučaju, najmanje jedna nanotuba i/ili polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu se pomešati sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima i/ili vehikulumima za isporuku.
[0327] U jednom aspektu, polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK su prikačeni i/ili na drugi način vezani za najmanje jednu rozeta nanotubu. Rozeta nanotube mogu biti formirane postupkom poznatim u stuci i/ili postupkom opisanim u međunarodnoj publikaciji br. WO2012094304. Najmanje jedan polinukleotid, primarni konstrukt i/ili mmRNK može biti prikačen i/ili na drugi način vezan za najmanje jednu rozeta nanotubu postupkom kao što je opisano u međunarodnoj publikaciji br. WO2012094304, gde se rozeta nanotube ili moduli koji formiraju rozeta nanotube mešaju u vodenom medijumu sa najmanje jednim polinukleotidom, primarnim konstruktom i/ili mmRNK pod uslovima koji mogu uzrokovati da se najmanje jedan polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK prikači ili na drugi način veže za rozeta nanotube.
Konjugati
[0328] Polinukleotidi, primarni konstrukti, i mmRNK iz objave uključuju konjugate, kao što je polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK kovalentno povezan za nosač ili ciljno delujuću grupu, ili koji uključuje dva kodirajuća regiona koji zajedno proizvode fuzioni protein (npr. koji nosi ciljno delujuću grupu ili terapijski protein ili peptid).
[0329] Konjugati iz objave uključuju supstance koje se prirodno javljaju, kao što su protein (npr. humani serumski albumin (HSA), lipoprotein male gustine (LDL), lipoprotein visoke gustine (HDL), ili globulin); ugljeni hidrat (npr. dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin ili hijaluronska kiselina); ili lipid. Ligand može takođe biti rekombinantni ili sintetički molekul, kao što je sintetički polimer, npr. sintetička poliamino kiselina, oligonukleotid (npr. aptamer). Primeri poliamino kiselina uključuju poliamino kiselinu su polilizin (PLL), poli L-asparaginsku kiselinu, poli L-glutaminsku kiselinu, kopolimer stirenanhidrid maleinske kiseline, poli(L-laktid-ko-glikolid) kopolimer, kopolimer divinil etaranhidrid maleinske kiseline, N-(2-hidroksipropil)metakrilamid kopolimer (HMPA), polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli(2-etilakrilna kiselina), N-izopropilakrilamidni polimeri, ili polifosfazin. Primeri poliamina uključuju: polietilenimin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, peptidomimetički poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternarnu so poliamina, ili alfa helijačni peptid.
[0330] Reprezentativni S.A.D. patenti koji podučavaju o pripremi polinukleotidnih konjugata, posebno za RNK, uključuju, ali nisu ograničeni na, S.A.D. patente br. 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717. 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241; 5.391.723; 5.416.203; 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 i 5.688.941; 6.294.664; 6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297; 7.037.646.
[0331] Konjugat može funkcionisati kao nosač za polinukleotide, primarne konstrukte i/ili mmRNK iz predmetne objave. Konjugat može sadržati katjonski polimer kao što su, ali bez ograničavanja na, poliamin, polilizin, polialkilenimin, i polietilenimin koji može biti graftovan sa poli(etilen glikolom). Kao neograničavajući primer, konjugat može biti sličan polimernom konjugatu i postupku sinteze polimernog konjugata opisanom u S.A.D. pat. br.
6.586.524.
[0332] Konjugati takođe mogu uključivati ciljno delujuće grupe, npr. agens za ciljno delovanje na ćeliju ili tkivo, npr. lektin, glikoprotein, lipid ili protein, npr. antitelo, koje se vezuje za specifični tip ćelije, kao što je ćelija bubrega. Ciljno delujuća grupa može biti tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, surfaktant protein A, mucin ugljeni hidrat, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-glukozamin multivalentna manoza, multivalentna fukoza, glikozilovane poliamino kiseline, multivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipid, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitamin B12, biotin, RGD peptid, mimetik RGD peptida ili aptamer.
[0333] Ciljno delujuće grupe mogu biti proteini, npr. glikoproteini, ili peptidi, npr. molekuli koji imaju specifičan afinitet za ko-ligand, ili antitela, npr. antitelo, koje se vezuje za specifičan tip ćelije, kao što su kancerska ćelija, endotelska ćelija, ili koštana ćelija. Ciljno delujuće grupe mogu takođe uključivati hormone i receptore za hormone. One takođe mogu uključivati ne-peptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-glukozamin multivalentna manoza, multivalentna fukoza, ili aptameri. Ligand može biti, na primer, lipopolisaharid, ili aktivator p38 MAP kinaze.
[0334] Ciljno delujuća grupa može biti bilo koji ligand koji može da ciljno deluje na specifični receptor. Primeri uključuju, bez ograničavanja, folat, GalNAc, galaktozu, manozu, manozu-6P, aptamere, ligande receptora integrina, ligande receptora hemokina, transferin, biotin, ligande receptora serotonina, PSMA, endotelin, GCPII, somatostatin, LDL, i HDL ligande. U posebnom slučaju, ciljno delujuća grupa je aptamer. Aptamer može biti nemodifikovan ili imati bilo koju kombinaciju modifikacija koje su ovde objavljene.
[0335] Farmaceutske kompozicije mogu uključivati hemijske modifikacije kao što su, ali bez ograničavanja na, modifikacije slične zaključanim nukleinskim kiselinama.
[0336] Reprezentativni S.A.D. patenti koji podučavaju o pripremi zaključane nukleinske kiseline (LNA), kao što su one iz Santarisa, uključuju, ali nisu ograničene na, sledeće: S.A.D. patenti br.6.268.490; 6.670.461; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.084.125; i 7.399.845.
[0337] Reprezentativni S.A.D. patenti koji podučavaju o pripremi PNA jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na, S.A.D. patente br. 5.539.082; 5.714.331; i 5.719.262. Dodatno podučavanje o PNA jedinjenjima može se pronaći, na primer, u Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
[0338] Objava uključuje polinukleotide, primarne konstrukte ili mmRNK sa fosforotioatnim okosnicama i oligonukleozide sa drugim modifikovanim okosnicama, i posebno --CH2--NH--CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2- [poznata kao metilen (metilimino) ili MMI okosnica], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, -CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- i --N(CH3)--CH2--CH2-- [gde je nativna fosfodiestarska okosnica predstavljena kao --O—P(O)2--O--CH2--] iz S.A.D. pat. br.
5.489.677 na koji je prethodno pozivano, i amidne okosnice iz S.A.D. pat. br. 5.602.240 na koji je prethodno pozivano. U nekim slučajevima, ovde prikazani polinukleotidi imaju strukture morfolino okosnice iz S.A.D. pat. br.5.034.506 na koji je prethodno pozivano.
[0339] Modifikacije na 2' poziciji takođe mogu pomoći u isporuci. Poželjno, modifikacije na 2' poziciji nisu locirane u sekvenci koja kodira polipeptid, tj. nisu u translatabilnom regionu. Modifikacije na 2' poziciji mogu biti locirane u 5'UTR, 3'UTR i/ili u repnom regionu. Modifikacije na 2' poziciji mogu uključivati jedno od sledećeg na 2' poziciji: H (tj. 2'-dezoksi); F; O-, S-, ili N-alkil; O-, S-, ili N-alkenil; O-, S-, ili N-alkinil; ili O-alkil-O-alkil, pri čemu alkil, alkenil i alkinil mogu biti supstituisani ili nesupstituisani C1do C10alkil ili C2do C10alkenil i alkinil. Primeri pogodnih modifikacija uključuju O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, i O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, gde su n i m od 1 do oko 10. U drugom slučaju, polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK uključuju jedno od sledećeg na 2' poziciji: C1do C10niži alkil, supstituisani niži alkil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, grupa RNK isecanja, reporterska grupa, interkalator, grupa za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava, ili grupa za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava, i drugi supstituenti koji imaju slična svojstva. U nekim slučajevima, modifikacija uključuje 2'-metoksietoksi (2'-O-CH2CH2OCH3, takođe poznat kao 2'-O-(2-metoksietil) ili 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) tj. alkoksi-alkoksi grupa. Sledeći primer modifikacije je 2'-dimetilaminooksietoksi, tj. O(CH2)2ON(CH3)2grupa, takođe poznata kao 2'-DMAOE, kao što je opisano u navedenim primerima u nastavku, i 2'dimetilaminoetoksietoksi (takođe poznata u struci kao 2'-O-dimetilaminoetoksietil ili 2'-DMAEOE), tj. 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2, takođe opisana u navedenim primerima u nastavku. Druge modifikacije uključuju 2'-metoksi (2'-OCH3), 2'-aminopropoksi (2'-OCH2CH2CH2NH2) i 2'-fluoro (2'-F). Slične modifikacije mogu se napraviti i na drugim pozicijama, posebno na 3' poziciji šećera na 3' terminusnom nukleotidu ili u 2'-5' povezanoj dsRNK i na 5' poziciji 5' terminusnog nukleotida. Polinukleotidi iz pronalaska mogu takođe imati mimetike šećera kao što su ciklobutil delovi umesto pentofuranozil šećera. Reprezentativni S.A.D. patenti koji podučavaju o pripremi takvih modifikovanih struktura šećera uključuju, ali nisu ograničeni na, S.A.D. patente br. 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; i 5.700.920.
[0340] U još nekim primerima izvođenja, polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK kovalentno su konjugovani za polipeptid koji penetrira u ćeliju. Peptid koji penetrira u ćeliju može takođe uključivati signalnu sekvencu. Konjugati iz pronalaska mogu biti dizajnirani tako da imaju povećanu stabilnost; povećanu transfekciju ćelije; i/ili izmenjenu biodistribuciju (npr. ciljano na specifična tkiva ili tipove ćelija).
Samo-asemblirane nanočestice nukleinske kiseline
[0341] Samo-asemblirane nanočestice imaju dobro definisanu veličinu koja se može precizno kontrolisati pošto se lanci nukleinske kiseline mogu lako reprogramirati. Na primer, optimalna veličina čestica za nosač za nanoisporuku koji ciljno deluje na kancer je 20-100 nm pošto se prečnikom većim od 20 nm izbegava bubrežni klirens i poboljšava isporuka do određenih tumora preko povećane permeabilnosti i efekta zadržavanja. Upotrebom samoasembliranih nanočestica nukleinske kiseline jedne uniformne populacije po veličini i obliku koja ima precizno kontrolisanu prostornu orijentaciju i gustinu liganada koji ciljno deluju na kancer za poboljšanu isporuku. Kao neograničavajući primer, nanočestice oligonukleotida se pripremaju upotrebom programabilnog samo-asembliranja kratkih DNK fragmenata i terapijskih siRNK. Ove nanočestice su molekulski identične sa kontrolisanom veličinom čestica i lokacijom i gustinom ciljnog liganda. Fragmenti DNK i siRNK su se samoasemblirali u reakciji u jednom koraku kako bi generisali DNK/siRNK tetraedarske nanočestice za ciljnu in vivo isporuku. (Lee et al., Nature Nanotechnology 20127:389-393).
1
Ekscipijensi
[0342] Farmaceutske formulacije mogu dopunski sadržati farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, koji, kao što se ovde upotrebljava, uključuje bilo koje i sve rastvarače, disperzione medijume, razblaživače, ili druge tečne vehikulume, pomoćna sredstva za disperziju ili suspenziju, površinski aktivne agense, izotonične agense, agense za zgušnjavanje ili emulgovanje, konzervanse, čvrsta veziva, lubrikante i slično, kao što je prigodno za posebni dozni oblik koji je željen. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) objavljuje različite ekscipijense koji se upotrebljavaju u formulisanju farmaceutskih kompozicija i poznate tehnike za njihovu pripremu. Osim ukoliko je bilo koji konvencionalni ekscipijensni medijum nekompatibilan sa supstancom ili njenim derivatima, tako što na primer proizvodi bilo kakav neželjeni biološki efekat ili interaguje na drugi štetan način sa bilo kojom drugom komponentom(ama) farmaceutske kompozicije, njegova upotreba se smatra da je unutar obima ovog pronalaska.
[0343] U nekim primerima izvođenja, farmaceutski prihvatljiv ekscipijens je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% čist. U nekim primerima izvođenja, ekscipijens je odobren za upotrebu kod ljudi i za veterinarsku upotrebu. U nekim primerima izvođenja, ekscipijens je odobren od strane Uprave za hranu i lekove Sjedinjenih Država (United States Food and Drug Administration). U nekim primerima izvođenja, ekscipijens je farmaceutskog kvaliteta. U nekim primerima izvođenja, ekscipijens zadovoljava standarde Farmakopeje Sjedinjenih Država (USP), Evropske farmakopeje (EP), Britanske farmakopeje, i/ili Međunarodne farmakopeje.
[0344] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi koji se upotrebljavaju u proizvodnji farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, dispergujuće i/ili granulišuće agense, površinski aktivne agense i/ili emulgatore, agense za dezintegraciju, vezujuće agense, konzervanse, agense za puferisanje, agense za lubrikaciju, i/ili ulja. Takvi ekscipijensi mogu opciono biti uključeni u farmaceutske kompozicije.
[0345] Primeri razblaživača uključuju, ali nisu ograničeni na, kalcijum karbonat, natrijum karbonat, kalcijum fosfat, dikalcijum fosfat, kalcijum sulfat, kalcijum hidrogen fosfat, natrijum fosfat laktozu, saharozu, celulozu, mikrokristalnu celulozu, kaolin, manitol, sorbitol, inozitol, natrijum hlorid, suvi skrob, kukuruzni skrob, šećer u prahu, itd. i/ili njihove kombinacije.
2
[0346] Primeri granulišućih i/ili dispergujućih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, krompirov skrob, kukuruzni skrob, tapioka skrob, natrijum skrob glikolat, gline, alginsku kiselinu, guar gumu, pulpu citrusa, agar, bentonit, celulozu i proizvode od drveta, prirodni sunđer, katjonsko-izmenjivačke smole, kalcijum karbonat, silikate, natrijum karbonat, umreženi poli(vinilpirolidon) (krospovidon), natrijum karboksimetil skrob (natrijum skrob glikolat), karboksimetil celulozu, umreženu natrijum karboksimetil celulozu (kroskarmeloza), metilcelulozu, preželatinizovani skrob (skrob 1500), mikrokristalni skrob, skrob koji je nesolubilan u vodi, kalcijum karboksimetil celulozu, magnezijum aluminijum silikat (VEEGUM®), natrijum lauril sulfat, kvaternarna amonijum jedinjenja, itd. i/ili njihove kombinacije.
[0347] Primeri površinski aktivnih agenasa i/ili emulgatora uključuju, ali nisu ograničeni na, prirodne emulgatore (npr. akacija, agar, alginska kiselina, natrijum alginat, tragakant, hondruks, holesterol, ksantan, pektin, želatin, žumance, kazein, mast vune, holesterol, vosak, i lecitin), koloidne gline (npr. bentonit [aluminijum silikat] i VEEGUM<®>[magnezijum aluminijum silikat]), derivate amino-kiselina dugog lanca, alkohole velike molekulske mase (npr. stearil alkohol, cetil alkohol, oleil alkohol, triacetin monostearat, etilen glikol distearat, gliceril monostearat, i propilen glikol monostearat, polivinil alkohol), karbomere (npr. karboksi polimetilen, poliakrilna kiselina, polimer akrilne kiseline, i karboksivinil polimer), karagenan, derivate celuloze (npr. karboksimetilceluloza natrijum, celuloza u prahu, hidroksimetil celuloza, hidroksipropil celuloza, hidroksipropil metilceluloza, metilceluloza), estre masnih kiselina sorbitana (npr. polioksietilen sorbitan monolaurat [TWEEN<®>20], polioksietilen sorbitan [TWEEN<®>60], polioksietilen sorbitan monooleat [TWEEN<®>80], sorbitan monopalmitat [SPAN<®>40], sorbitan monostearat [SPAN<®>60], sorbitan tristearat [SPAN<®>65], gliceril monooleat, sorbitan monooleat [SPAN<®>80]), polioksietilen estre (npr. polioksietilen monostearat [MYRJ<®>45], polioksietilen hidrogenisano ricinusovo ulje, polietoksilovano ricinusovo ulje, polioksimetilen stearat, i SOLUTOL<®>), estre masnih kiselina saharoze, estre polietilen glikol masnih kiselina (npr. CREMOPHOR<®>), polioksietilen etre (npr. polioksietilen etar [BRIJ<®>30]), poli(vinilpirolidon), dietilen glikol monolaurat, trietanolamin oleat, natrijum oleat, kalijum oleat, etil oleat, oleinsku kiselinu, etil laurat, natrijum lauril sulfat, PLUORINC<®>F 68, POLOXAMER<®>188, cetrimonijum bromid, cetilpiridinijum hlorid, benzalkonijum hlorid, dokusat natrijum, itd. i/ili njihove kombinacije.
[0348] Primeri vezujućih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, skrob (npr. kukuruzni skrob i skrobna pasta); želatin; šećere (npr. saharoza, glukoza, dekstroza, dekstrin, melasa, laktoza, laktitol, manitol); prirodne i sintetičke gume (npr. akacija, natrijum alginat, ekstrakt irske mahovine, panwar guma, ghatti guma, sluz izapol ljuske, karboksimetilceluloza, metilceluloza, etilceluloza, hidroksietilceluloza, hidroksipropil celuloza, hidroksipropil metilceluloza, mikrokristalna celuloza, celuloza acetat, poli(vinil-pirolidon), magnezijum aluminijum silikat (Veegum<®>), i arabogalaktan ariša); alginate; polietilen oksid; polietilen glikol; neorganske soli kalcijuma; silicijumovu kiselinu; polimetakrilate; voskove; vodu; alkohol; itd.; i njihove kombinacije.
[0349] Primeri konzervansa mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, antioksidanse, helatne agense, antimikrobne konzervanse, antigljivične konzervanse, alkoholne konzervanse, kisele konzervanse, i/ili druge konzervanse. Primeri antioksidanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, alfa tokoferol, askorbinsku kiselinu, akorbil palmitat, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, monotioglicerol, kalijum metabisulfit, propansku kiselinu, propil galat, natrijum askorbat, natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit, i/ili natrijum sulfit. Primeri helatnih agenasa uključuju etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (EDTA), monohidrat limunske kiseline, dinatrijum edetat, dikalijum edetat, edetičnu kiselinu, fumarnu kiselinu, jabučnu kiselinu, fosfornu kiselinu, natrijum edetat, vinsku kiselinu, i/ili trinatrijum edetat. Primeri antimikrobnih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, benzil alkohol, bronopol, cetrimid, cetilpiridinijum hlorid, hlorheksidin, hlorobutanol, hlorokrezol, hloroksilenol, krezol, etil alkohol, glicerin, heksetidin, imidureu, fenol, fenoksetanol, feniletil alkohol, fenil živa nitrat, propilen glikol, i/ili timerosal. Primeri antigljivičnih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, butil paraben, metil paraben, etil paraben, propil paraben, benzoevu kiselinu, hidroksibenzoevu kiselinu, kalijum benzoat, kalijum sorbat, natrijum benzoat, natrijum propionat, i/ili sorbinsku kiselinu. Primeri alkoholnih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, etanol, polietilen glikol, fenol, fenolna jedinjenja, bisfenol, hlorobutanol, hidroksibenzoat, i/ili feniletil alkohol. Primeri kiselih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, vitamin A, vitamin C, vitamin E, betakaroten, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, dehidrosirćetnu kiselinu, askorbinsku kiselinu, sorbinsku kiselinu, i/ili fitinsku kiselinu. Drugi konzervansi uključuju, ali nisu ograničeni na, tokoferol, tokoferol acetat, deteroksim mezilat, cetrimid, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), etilendiamin, natrijum lauril sulfat (SLS), natrijum lauril etar sulfat (SLES), natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit, kalijum sulfit, kalijum metabisulfit, GLYDANT PLUS<®>, PHENONIP<®>, metilparaben, GERMALL<®>115, GERMABEN<®>II, NEOLONE™, KATHON™, i/ili EUXYL<®>.
[0350] Primeri agenasa za puferisanje uključuju, ali nisu ograničeni na, rastvore citratnog pufera, rastvore acetatnog pufera, rastvore fosfatnog pufera, amonijum hlorid, kalcijum
4
karbonat, kalcijum hlorid, kalcijum citrat, kalcijum glubionat, kalcijum gluceptat, kalcijum glukonat, D-glukonsku kiselinu, kalcijum glicerofosfat, kalcijum laktat, propansku kiselinu, kalcijum levulinat, pentansku kiselinu, dvobazni kalcijum fosfat, fosfornu kiselinu, trobazni kalcijum fosfat, kalcijum hidroksid fosfat, kalijum acetat, kalijum hlorid, kalijum glukonat, smeše kalijuma, dvobazni kalijum fosfat, jednobazni kalijum fosfat, smeše kalijum fosfata, natrijum acetat, natrijum bikarbonat, natrijum hlorid, natrijum citrat, natrijum laktat, dvobazni natrijum fosfat, monobazni natrijum fosfat, smeše natrijum fosfata, trometamin, magnezijum hidroksid, aluminijum hidroksid, alginsku kiselinu, vodu bez pirogena, izotonični fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, etil alkohol, itd. i/ili njihove kombinacije.
[0351] Primeri agenasa za lubrikaciju uključuju, ali nisu ograničeni na, magnezijum stearat, kalcijum stearat, stearinsku kiselinu, silicijum dioksid, talk, slad, gliceril behanat, hidrogenizovana biljna ulja, polietilen glikol, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid, leucin, magnezijum lauril sulfat, natrijum lauril sulfat, itd. i njihove kombinacije.
[0352] Primeri ulja uključuju, ali nisu ograničeni na ulja badema, jezgra koštice kajsije, avokada, babase, bergamota, semenke crne ribizle, boražine, kleke, kamilice, kanole, kima, karnaube, ricinusa, cimeta, kakao butera, kokosa, jetre bakalara, kafe, kukuruza, semena pamuka, emua, eukaliptusa, noćurka, ribe, lanenog semena, geraniola, tikve, semenke grožđa, lešnika, miloduha, izopropil miristata, jojobe, kukui oraha, lavandina, lavande, limuna, Litsea cubeba, makadamije, sleza, semena manga, semena livadske pene, minka, muskatnog oraščića, masline, pomorandže, dubokog morskog smuđa, palme, jezgra semena palme, jezgra koštice breskve, kikirikija, maka, semena bundeve, uljane repice, pirinčane mekinje, ruzmarina, šafranike, sandalovine, saskvane, satureje, vučjeg trna, susama, šia butera, silikona, soje, suncokreta, čajevca, čička, cubakija, vetivera, oraha, i pšeničnih klica. Primeri ulja uključuju, ali nisu ograničeni na, butil stearat, kaprilni triglicerid, kaprinski triglicerid, ciklometikon, dietil sebakat, dimetikon 360, izopropil miristat, mineralno ulje, oktildodekanol, oleil alkohol, silikon ulje, i/ili njihove kombinacije.
[0353] Ekscipijensi kao što su kakao buter i voskovi za supozitorije, agensi za bojenje, agensi za oblaganje, zaslađivači, arome, i/ili agensi za parfemisanje mogu biti prisutni u kompoziciji, u skladu sa procenom formulatora.
Isporuka
[0354] Predmetna objava obuhvata isporuku polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK za bilo koju terapijsku, farmaceutsku, dijagnostičku isporuku ili za isporuku za snimanje bilo kojim odgovarajućim putem uzimajući u obzir verovatni napredak u nauci o isporuci leka. Isporuka može biti gola ili formulisana.
Gola isporuka
[0355] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz predmetnog pronalaska mogu biti isporučeni ćeliji goli. Kao što se ovde upotrebljava, "goli" označava isporuku polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK bez agenasa koji promovišu transfekciju. Na primer, polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK isporučeni ćeliji ne moraju sadržati nikakve modifikacije. Goli polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu biti isporučeni ćeliji upotrebom puteva primene poznatih u struci i opisanih ovde.
Formulisana isporuka
[0356] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz predmetnog pronalaska mogu biti formulisani, upotrebom ovde opisanih postupaka. Formulacije mogu sadržati polinukleotide, primarne konstrukte ili mmRNK koji mogu biti modifikovani i/ili nemodifikovani. Formulacije mogu dodatno uključivati, ali nisu ograničene na, agense za penetraciju u ćeliju, farmaceutski prihvatljiv nosač, agens za isporuku, bioerodibilni ili biokompatibilni polimer, rastvarač, i depo za isporuku sa neprekidnim oslobađanjem. Formulisani polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu biti isporučeni ćeliji upotrebom puteva primene poznatih u struci i opisanih ovde.
[0357] Kompozicije takođe mogu biti formulisane za direktnu isporuku organu ili tkivu na bilo koji od nekoliko načina u struci uključujući, ali bez ograničavanja na, direktno natapanje ili kupanje, putem katetera, gelovima, praškom, mastima, kremama, gelovima, losionima, i/ili kapima, upotrebom supstrata kao što su tkanina ili biodegradabilni materijali obloženi ili impregnirani sa kompozicijama, i slično.
Primena
[0358] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz predmetnog pronalaska mogu biti primenjeni bilo kojim putem koji rezultuje terapijski efikasnim ishodom. Ovi uključuji, ali nisu ograničeni na enteralno, gastroenteralno, epiduralno, oralno, transdermalno, epiduralno (periduralno), intracerebralno (u veliki mozak), intracerebroventrikularno (u moždane komore), epikutano (nanošenje na kožu), intradermalno, (u samu kožu), subkutano (ispod kože), nazalnu primenu (kroz nos), intravenski (u venu), intraarteriski (u arteriju), intramuskularno (u mišić), intrakardijalno (u srce), intraosealnu infuziju (u kostnu srž), intratekalno (u kičmeni kanal), intraperitonealno (infuzija ili injekcija u peritoneum), intravezikalnu infuziju, intravitrealno (kroz oko), intrakavernoznu injekciju (u bazu penisa), intravaginalnu primenu, intrauterinu, ekstraamnionsku primenu, transdermalno (difuzija kroz intaktnu kožu radi sistemske distribucije), transmukozno (difuzija kroz mukuznu membranu), insuflacijom (udisanjem), sublingvalno, sublabijalno, klistir, kapi za oči (na konjunktivu), ili u kapima za uši. U specifičnom slučaju, kompozicije se mogu primenjivati na način koji im omogućava da prođu krvno-moždanu barijeru, vaskularnu barijeru, ili drugu epitelsku barijeru. Neograničavajući putevi primene za polinukleotide, primarne konstrukte ili mmRNK iz predmetne objave su opisani u nastavku.
Parenteralna i injektabilna primena
[0359] Tečni dozni oblici za oralnu i parenteralnu primenu uključuju, ali nisu ograničeni na, farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe, i/ili eliksire. Pored aktivnih sastojaka, tečni dozni oblici mogu sadržati inertne razblaživače koji se uobičajeno upotrebljavaju u struci, kao što su, na primer, voda ili drugi rastvarači, agense za solubilizaciju i emulgatore kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja (posebno, ulje semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, masline, ricinusa, i susama), glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikole i estre masnih kiselina sorbitana, i njihove smeše. Osim inertnih razblaživača, oralne kompozicije mogu uključivati adjuvanse kao što su agensi za vlaženje, agensi za emulgovanje i suspendovanje, zaslađivači, arome, i/ili agensi za parfemisanje. U određenim slučajevima za parenteralnu primenu, kompozicije se mešaju sa agensima za solubilizaciju kao što su CREMOPHOR®, alkoholi, ulja, modifikovana ulja, glikoli, polisorbati, ciklodekstrini, polimeri, i/ili njihove kombinacije.
[0360] Injektabilni preparati, na primer, sterilne injektabilne vodene ili uljne suspenzije mogu biti formulisane u skladu sa poznatom strukom upotrebom pogodnih agenasa za dispergovanje, agenasa za vlaženje, i/ili agenasa za suspendovanje. Sterilni injektabilni preparati mogu biti sterilni injektabilni rastvori, suspenzije, i/ili emulzije u netoksičnim parenteralno prihvatljivim razblaživačima i/ili rastvaračima, na primer, kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim vehikulumima i rastvaračima koji se mogu koristiti su voda, Ringerov rastvor, USP, i izotonični rastvor natrijum hlorida. Sterilna, fiksna ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U tu svrhu može se koristiti bilo koje blago fiksno ulje, uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Masne kiseline, kao što je oleinska kiselina, mogu se upotrebljavati u pripremi injekcija.
[0361] Injektabilne formulacije mogu biti sterilisane, na primer, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije, i/ili inkorporisanjem agenasa za sterilizaciju u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje se mogu rastvoriti ili dispergovati u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom injektabilnom medijumu pre upotrebe.
[0362] Kako bi se produžio efekat aktivnog sastojka, često je poželjno usporiti apsorpciju aktivnog sastojka iz subkutane ili intramuskularne injekcije. Ovo se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala sa slabom solubilnošću u vodi. Stopa apsorpcije leka tada zavisi od njegove stope rastvaranja koja, pak, može zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog oblika leka se postiže rastvaranjem ili suspendovanjem leka u uljanom vehikulumu. Injektabilni depo oblici se prave formiranjem mikroinkapsuliranih matriksa leka u biodegradabilnim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa leka prema polimeru i prirode određenog polimera koji se koristi, može se kontrolisati stopa oslobađanja leka. Primeri drugih biodegradabilnih polimera uključuju poli(ortoestre) i poli(anhidride). Injektabilne depo formulacije se pripremaju zarobljavanjem leka u lipozome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa tkivima u telu.
Rektalna i vaginalna primena
[0363] Kompozicije za rektalnu ili vaginalnu primenu su tipično supozitorije koje se mogu pripremiti mešanjem kompozicija sa pogodnim neiritirajućim ekscipijensima kao što su kakao buter, polietilen glikol ili vosak za supozitorije koji su čvrsti na temperaturi okoline, ali tečni na telesnoj temperaturi i prema tome se tope u rektumu ili vaginalnoj šupljini i oslobađaju aktivni sastojak.
Oralna primena
[0364] Čvrsti dozni oblici za oralnu primenu uključuju kapsule, tablete, pilule, praškove, i granule. U takvim čvrstim doznim oblicima, aktivni sastojak je pomešan sa najmanje jednim inertnim, farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, kao što su natrijum citrat ili dikalcijum fosfat i/ili fileri ili ekstenderi (npr. skrobovi, laktoza, saharoza, glukoza, manitol, i silicijumova kiselina), veziva (npr. karboksimetilceluloza, alginati, želatin, polivinilpirolidinon, saharoza, i akacija), ovlaživači (npr. glicerol), agensi za dezintegraciju (npr. agar, kalcijum karbonat, krompirov ili tapioka skrob, alginska kiselina, određeni silikati, i natrijum karbonat), agensi za usporavanje rastvora (npr. parafin), ubrzivači apsorpcije (npr. kvaternarna amonijum jedinjenja), agensi za vlaženje (npr. cetil alkohol i glicerol monostearat), apsorbanti (npr. kaolin i bentonit glina), i lubrikanti (npr. talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat), i njihove smeše. U slučaju kapsula, tableta i pilula, dozni oblik može sadržati agense za puferisanje.
Topikalna ili transdermalna primena
[0365] Kao što je ovde opisano, kompozicije koje sadrže polinukleotide, primarne konstrukte ili mmRNK iz objave mogu biti formulisane za topikalnu primenu. Koža može biti idealno ciljno mesto za isporuku pošto je lako dostupna. Ekspresija gena može biti ograničena ne samo na kožu, čime se potencijalno izbegava nespecifična toksičnost, već i na specifične slojeve i tipove ćelija unutar kože.
[0366] Mesto kutane ekspresije isporučenih kompozicija zavisiće od puta isporuke nukleinske kiseline. Tri puta se uobičajeno razmatraju za isporuku polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK u kožu: (i) topikalna aplikacija (npr. za lokalno/regionalno lečenje i/ili kozmetičke aplikacije); (ii) intradermalna injekcija (npr. za lokalno/regionalno lečenje i/ili kozmetičke aplikacije); i (iii) sistemska isporuka (npr. za lečenje dermatoloških bolesti koje utiču i na kutane i na ekstrakutane regione), polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu biti isporučeni u kožu pomoću nekoliko različitih pristupa poznatih u struci. Pokazano je da većina pristupa topikalne isporuke funkcioniše za isporuku DNK, kao što su, ali bez ograničavanja na, topikalnu aplikaciju nekatjonskog lipozom-DNK kompleksa, katjonskog lipozom-DNK kompleksa, transfekciju gena posredovanu česticama (genski pištolj), posredovanu punkcijom, i pristupe virusne isporuke. Posle isporuke nukleinske kiseline, genski proizvodi su detektovani u brojnim različitim tipovima ćelija kože, uključujući, ali bez ograničavanja na, bazalne keratinocite, ćelije lojnih žlezda, dermalne fibroblaste i dermalne makrofage.
[0367] Objava obezbeđuje različite obloge (npr. obloge za rane) ili zavoje (npr. lepiljve zavoje) za zgodno i/ili efikasno izvođenje postupaka iz predmetne objave. Tipično obloge ili zavoji mogu sadržati dovoljne količine farmaceutskih kompozicija i/ili polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK koji su ovde opisani kako bi se korisniku omogućilo da izvede više tretmana subjekta(ata).
[0368] Objava obezbeđuje da se polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK kompozicije isporučuju u više od jedne injekcije.
[0369] Pre topikalne i/ili transdermalne primene najmanje jedno područje tkiva, kao što je koža, može biti podvrgnuto uređaju i/ili rastvoru koji mogu povećati permeabilnost. Tkivo može biti podvrgnuto abrazivnom uređaju kako bi se povećala permeabilnost kože (videti S.A.D. patentnu publikaciju br. 20080275468). U sledećem slučaju, tkivo može biti podvrgnuto ultrazvučnom uređaju za poboljšanje. Ultrazvučni uređaj za poboljšanje može uključivati, ali nije ograničen na, uređaje opisane u S.A.D. publikaciji br. 20040236268 i S.A.D. patentima br. 6.491.657 i 6.234.990. Postupci za poboljšanje permeabilnosti tkiva opisani su u S.A.D. publikacijama br. 20040171980 i 20040236268 i S.A.D. pat. br.
6.190.315.
[0370] Uređaj se može upotrebljavati kako bi se povećala permeabilnost tkiva pre isporuke formulacija polinukleotida, primarnih konstrukata i mmRNK koji su ovde opisani. Permeabilnost kože se može izmeriti postupcima poznatim u struci i/ili opisanim u S.A.D. patentu br. 6.190.315. Kao neograničavajući primer, modifikovana formulacija mRNK može biti isporučena postupcima za isporuku leka koji su opisani u S.A.D. patentu br.6.190.315.
[0371] U sledećem neograničavajućem primeru, tkivo može biti tretirano eutektičkom smešom kreme lokalnih anestetika (EMLA) pre, tokom i/ili pošto tkivo može biti podvrgnuto uređaju koji može povećati permeabilnost. Katz et al. (Anesth Analg (2004); 98:371-76) pokazali su da se upotrebom EMLA kreme u kombinaciji sa niskom energijom, pojavila površinska kutana analgezija već 5 minuta posle pretretmana sa ultrazvukom niske energije.
[0372] Poboljšivači mogu biti naneti na tkivo pre, tokom i/ili pošto je tkivo tretirano kako bi se povećala permeabilnost. Poboljšivači uključuju, ali nisu ograničeni na, poboljšivače transporta, fizičke poboljšivače, i poboljšivače kavitacije. Neograničavajući primeri poboljšivača opisani su u S.A.D. patentu br.6.190.315.
[0373] Uređaj može biti upotrebljen za povećanje permeabilnosti tkiva pre isporuke formulacija polinukleotida, primarnih konstrukata i/ili mmRNK koji su ovde opisani, koje mogu dodatno sadržati supstancu koja izaziva imunski odgovor. U sledećem neograničavajućem primeru, formulacija koja sadrži supstancu koja izaziva imunski odgovor može biti isporučena postupcima opisanim u S.A.D. publikacijama br. 20040171980 i 20040236268.
1
[0374] Dozni oblici za topikalnu i/ili transdermalnu primenu kompozicije mogu uključivati masti, paste, kreme, losione, gelove, praškove, rastvore, sprejeve, inhalante i/ili flastere. Generalno, aktivni sastojak se meša u sterilnim uslovima sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom i/ili bilo kojim potrebnim konzervansima i/ili puferima kao što može biti potrebno.
[0375] Pored toga, predmetna objava razmatra upotrebu transdermalnih flastera, koji često imaju dodatnu prednost u obezbeđivanju kontrolisane isporuke jedinjenja u telo. Takvi dozni oblici mogu biti pripremljeni, na primer, rastvaranjem i/ili dispenzijom jedinjenja u odgovarajućem medijumu. Alternativno ili dopunski, stopa se može kontrolisati bilo obezbeđivanjem membrane za kontrolu stope i/ili dispergovanjem jedinjenja u polimernom matriksu i/ili gelu.
[0376] Formulacije pogodne za topikalnu primenu uključuju, ali nisu ograničene na, tečne i/ili polutečne preparate kao što su linimenti, losioni, emulzije ulje u vodi i/ili voda u ulju kao što su kreme, masti i/ili paste, i/ili rastvori i/ili suspenzije. Formulacije za topikalnu primenu mogu, na primer, sadržati od oko 0,1% do oko 10% (tež./tež.) aktivnog sastojka, mada koncentracija aktivnog sastojka može biti toliko visoka kolika je granica solubilnosti aktivnog sastojka u rastvaraču. Formulacije za topikalnu primenu mogu dodatno sadržati jedan ili više od dopunskih sastojaka koji su ovde opisani.
Depo primena
[0377] Kao što je ovde opisano, kompozicija može biti formulisana u depoima za produženo oslobađanje. Generalno, specifični organ ili tkivo ("ciljno tkivo") je ciljano za primenu.
[0378] U nekim aspektima objave, polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK prostorno se zadržavaju unutar ili u blizini ciljnog tkiva. Obezbeđeni su postupci obezbeđivanja kompozicije ciljnom tkivu subjekta sisara dovođenjem u kontakt ciljnog tkiva (koje sadrži jednu ili više ciljnih ćelija) sa kompozicijom pod takvim uslovima da se kompozicija, posebno komponenta(e) nukleinske kiseline kompozicije, suštinski zadržava u ciljnom tkivu, što znači da se najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 ili više od 99,99% kompozicije zadržava u ciljnom tkivu. Povoljno, zadržavanje se određuje merenjem količine nukleinske kiseline prisutne u kompoziciji koja ulazi u jednu ili više ciljnih ćelija. Na primer, najmanje 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 ili više od 99,99% nukleinskih kiselina koje su primenjene subjektu je prisutno unutar ćelije u vremenskom periodu nakon primene. Na primer, intramuskularna
1 1
injekcija subjektu sisaru izvodi se upotrebom vodene kompozicije koja sadrži ribonukleinsku kiselinu i reagens za transfekciju, i zadržavanje kompozicije se određuje merenjem količine ribonukleinske kiseline prisutne u mišićnim ćelijama.
[0379] Aspekti pronalaska su usmereni na postupke obezbeđivanja kompozicije ciljnom tkivu subjekta sisara, dovođenjem u kontakt ciljnog tkiva (koje sadrži jednu ili više ciljnih ćelija) sa kompozicijom pod takvim uslovima da se kompozicija suštinski zadrži u ciljnom tkivu. Kompozicija sadrži efikasnu količinu polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK tako da se polipeptid od interesa proizvodi u najmanje jednoj ciljnoj ćeliji. Kompozicije generalno sadrže agens za penetraciju u ćeliju, mada se takođe razmatra "gola" nukleinska kiselina (kao što su nukleinske kiseline bez agensa za penetraciju u ćeliju ili drugog agensa), i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0380] U nekim okolnostima, količina proteina koju proizvode ćelije u tkivu je poželjno povećana. Poželjno, ovo povećanje proizvodnje proteina je prostorno ograničeno na ćelije unutar ciljnog tkiva. Stoga, obezbeđeni su postupci povećanja proizvodnje proteina od interesa u tkivu subjekta sisara. Obezbeđena je kompozicija koja sadrži polinukleotide, primarne konstrukte ili mmRNK, okarakterisana time što je jedinična količina kompozicije određena tako da proizvede polipeptid od interesa u značajnom procentu ćelija sadržanih unutar unapred određene zapremine ciljnog tkiva.
[0381] U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje mnoštvo različitih polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK, gde jedan ili više od jednog polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK kodira polipeptid od interesa. Opciono, kompozicija takođe sadrži agens za penetraciju u ćeliju koji pomaže u unutarćelijskoj isporuci kompozicije. Određuje se doza kompozicije potrebna za proizvodnju polipeptida od interesa u značajnom procentu ćelija sadržanih unutar unapred određene zapremine ciljnog tkiva (generalno, bez indukovanja značajne proizvodnje polipeptida od interesa u susednom tkivu do unapred određenog volumena, ili distalno od ciljnog tkiva). Nakon ovog određivanja, određena doza se introdukuje direktno u tkivo subjekta sisara.
[0382] U jednom aspektu, obezbeđuje se za polinukleotide, primarne konstrukte ili mmRNK da budu isporučeni u više od jedne injekcije ili injekcijama podeljene doze.
[0383] U jednom aspektu, polinukleotid može biti zadržan u blizini ciljnog tkiva upotrebom malog rezervoara za lek za jednokratnu upotrebu ili pač (patch) pumpe. Neograničavajući primeri pač pumpi uključuju one koje proizvode i/ili prodaju BD® (Franklin Lakes, NJ), Insulet Corporation (Bedford, MA), SteadyMed Therapeutics (San Francisco, CA), Medtronic
1 2
(Minneapolis, MN), UniLife (York, PA), Valeritas (Bridgewater, NJ), i SpringLeaf Therapeutics (Boston, MA).
Pulmonarna primena
[0384] Farmaceutska kompozicija može biti pripremljena, upakovana, i/ili prodata u formulaciji pogodnoj za pulmonarnu primenu putem bukalne šupljine. Takva formulacija može sadržati suve čestice koje sadrže aktivni sastojak i koje imaju prečnik u opsegu od oko 0,5 nm do oko 7 nm ili od oko 1 nm do oko 6 nm. Takve kompozicije su pogodno u obliku suvih praškova za primenu upotrebom uređaja koji sadrži rezervoar suvog praška u koji se može usmeriti mlaz propelanta za dispergovanje praška i/ili upotrebom samopropelantnog rastvarača/kontejnera za dispergovanje praška, kao što je uređaj koji sadrži aktivni sastojak rastvoren i/ili suspendovan u propelantu sa niskom tačkom ključanja u zapečaćenom kontejneru. Takvi praškovi sadrže čestice u kojima najmanje 98% čestica po težini ima prečnik veći od 0,5 nm, i najmanje 95% čestica po broju ima prečnik manji od 7 nm. Alternativno, najmanje 95% čestica po težini ima prečnik veći od 1 nm, i najmanje 90% čestica po broju ima prečnik manji od 6 nm. Kompozicije suvog praška mogu uključivati čvrsti razblaživač u prašku kao što je šećer i pogodno se obezbeđuju u jediničnom doznom obliku.
[0385] Propelanti sa niskom tačkom ključanja generalno uključuju tečne propelante koji imaju tačku ključanja ispod 65 °F pri atmosferskom pritisku. Generalno, propelant može činiti 50% do 99,9% (tež./tež.) kompozicije, i aktivni sastojak može činiti 0,1% do 20% (tež./tež.) kompozicije. Propelant može dodatno sadržati dopunske sastojke kao što su tečni nejonski i/ili čvrsti anjonski surfaktant i/ili čvrsti razblaživač (koji mogu imati veličinu čestica istog reda veličine kao i čestice koje sadrže aktivni sastojak).
[0386] Farmaceutske kompozicije formulisane za pulmonarnu isporuku mogu obezbediti aktivni sastojak u obliku kapljica rastvora i/ili suspenzije. Takve formulacije mogu biti pripremljene, upakovane, i/ili prodate kao vodeni i/ili razblaženi alkoholni rastvori i/ili suspenzije, opciono sterilne, koje sadrže aktivni sastojak, i mogu se pogodno primenjivati upotrebom bilo kog uređaja za nebulizaciju i/ili atomizaciju. Takve formulacije mogu dodatno sadržati jedan ili više dopunskih sastojaka uključujući, ali bez ograničvanja na, agens za aromu kao što je natrijum saharin, isparljivo ulje, agens za puferisanje, površinski aktivni agens, i/ili konzervans kao što je metilhidroksibenzoat. Kapljice koje se obezbeđuju ovim putem primene mogu imati prosečan prečnik u opsegu od oko 0,1 nm do oko 200 nm.
1
Intranazalna, nazalna i bukalna primena
[0387] Formulacije koje su ovde opisane kao korisne za pulmonarnu isporuku su korisne za intranazalnu isporuku farmaceutske kompozicije. Sledeća formulacija pogodna za intranazalnu primenu je grubi prašak koji sadrži aktivni sastojak i ima prosečne čestice od oko 0,2 µm do 500 µm. Takva formulacija se primenjuje na način na koji se uzima burmut, tj. brzim udisanjem kroz nazalni prolaz iz kontejnera sa praškom koji se drži blizu nosa.
[0388] Formulacije pogodne za nazalnu primenu mogu, na primer, sadržati od oko samo 0,1% (tež./tež.) i čak 100% (tež./tež.) aktivnog sastojka, i mogu sadržati jedan ili više dopunskih sastojaka koji su ovde opisani. Farmaceutska kompozicija može biti pripremljena, upakovana, i/ili prodata u formulaciji pogodnoj za bukalnu primenu. Takve formulacije mogu, na primer, biti u obliku tableta i/ili lozengi napravljenih upotrebom konvencionalnih postupaka, i mogu, na primer, sadržati 0,1% do 20% (tež./tež.) aktivnog sastojka, gde ostatak sadrži oralno rastvorljivu i/ili degradabilnu kompoziciju i, opciono, jedan ili više od dopunskih sastojaka koji su ovde opisani. Alternativno, formulacije pogodne za bukalnu primenu mogu sadržati prašak i/ili aerosolizovan i/ili atomizovan rastvor i/ili suspenziju koja sadrži aktivni sastojak. Takve praškaste, aerosolizovane, i/ili aerosolizovane formulacije, kada se disperguju, mogu imati prosečnu veličinu čestica i/ili kapljica u opsegu od oko 0,1 nm do oko 200 nm, i mogu dodatno sadržati jedan ili više od bilo kojih dopunskih sastojaka koji su ovde opisani.
Oftalmološka primena
[0389] Farmaceutska kompozicija može biti pripremljena, upakovana, i/ili prodata u formulaciji pogodnoj za oftalmološku primenu. Takve formulacije mogu, na primer, biti u obliku kapi za oči uključujući, na primer, 0,1/1,0% (tež./tež.) rastvor i/ili suspenziju aktivnog sastojka u vodenom ili uljanom tečnom ekscipijensu. Takve kapi mogu dodatno sadržati agense za puferisanje, soli, i/ili jedan ili više drugih od bilo kojih dopunskih sastojaka koji su ovde opisani. Druge oftalmološki primenljive formulacije koje su korisne uključuju one koje sadrže aktivni sastojak u mikrokristalnom obliku i/ili u lipozomskom preparatu. Razmatraju se kapi za uši i/ili kapi za oči.
Primena korisnog tereta: Detektabilni agensi i terapijski agensi
1 4
[0390] Ovde opisani polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu se upotrebljavati u brojnim različitim scenarijima u kojima je poželjna isporuka supstance ("korisni teret") biološkom cilju, na primer isporuka detektabilnih supstanci radi detektovanja cilja, ili isporuka terapijskog agensa. Postupci detekcije mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, postupke i in vitro i in vivo snimanja, npr. imunohistohemiju, snimanje bioluminescencijom (BLI), snimanje magnetnom rezonancom (MRI), pozitronsku emisionu tomografiju (PET), elektronsku mikroskopiju, rendgensku kompjuterizovanu tomografiju, Raman snimanje, optičku koherentnu tomografiju, apsorpciono snimanje, termičko snimanje, fluorescentno refleksiono snimanje, fluorescentnu mikroskopiju, snimanje fluorescentnom molekskom tomografijom, snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom, rendgensko snimanje, ultrazvučno snimanje, fotoakustičko snimanje, laboratorijske testove, ili u bilo kojoj situaciji u kojoj je potrebno označavanje/bojenje/snimanje.
[0391] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu biti dizajnirani tako da uključuju i linker i korisni teret u bilo kojoj korisnoj orijentaciji. Na primer, linker koji ima dva kraja se upotrebljava kako bi se jedan kraj prikačio za korisni teret, i drugi kraj za nukleobazu, kao što je na C-7 ili C-8 pozicijama deaza-adenozina ili deaza-guanozina ili za N-3 ili C-5 pozicije citozina ili uracila. Polinukleotid iz objave može uključivati više od jednog korisnog tereta (npr. obeleživač i inhibitor transkripcije), kao i linker koji se može isecati. U jednom aspektu, modifikovani nukleotid je modifikovani 7-deaza-adenozin trifosfat, gde je jedan kraj linkera koji se može isecati prikačen za C7 poziciju 7-deaza-adenina, i drugi kraj linkera je prikačen za inhibitor (npr. na C5 poziciji nukleobaze na citidinu), i obeleživač (npr. Cy5) je prikačen za centar linkera (videti, npr. jedinjenje 1 od A<∗>pCp C5 Parg Capless na Sl.5 i u kolonama 9 i 10 S.A.D. pat. br. 7.994.304). Nakon inkorporacije modifikovanog 7-deaza-adenozin trifosfata u kodirajući region, rezultujući polinukleotid će imati linker koji se može isecati prikačen za obeleživač i inhibitor (npr. inhibitor polimeraze). Nakon isecanja linkera (npr. sa reduktivnim uslovima za redukovanje linkera koji ima disulfidni deo koji se može isecati), obeleživač i inhibitor se oslobađaju. Dopunski linkeri i korisni tereti (npr. terapijski agensi, detektabilni obeleživači, i korisni tereti koji penetriraju u ćeliju) su ovde opisani.
[0392] Na primer, ovde opisani polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu se upotrebljavati u indukovanim pluripotentnim matičnim ćelijama (iPS ćelijama), koji mogu direktno pratiti ćelije koje su transfektovane u poređenju sa ukupnim ćelijama u klasteru. U sledećem primeru, lek koji može biti prikačen za polinukleotide, primarne konstrukte ili mmRNK putem linkera i može biti fluorescentno obeležen može se upotrebljavati za praćenje
1
leka in vivo, npr. unutarćelijski. Drugi primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, upotrebu polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK u reverzibilnoj isporuci leka u ćelije.
[0393] Ovde opisani polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu se upotrebljavati u unutarćelijskom ciljnom delovanju korisnog tereta, npr. detektibilnog ili terapijskog agensa, na specifičnu organelu. Primeri unutarćelijskih ciljeva mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, nukleusnu lokalizaciju za naprednu mRNK obradu, ili nukleusnu lokalizacionu sekvencu (NLS) povezanu za mRNK koja sadrži inhibitor.
[0394] Pored toga, ovde opisani polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu se upotrebljavati za isporuku terapijskih agenasa u ćelije ili tkiva, npr. kod živih životinja. Na primer, polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK prikačeni za terapijski agens preko linkera mogu olakšati permeaciju člana omogućavajući terapijskom agensu da putuje u ćeliju da dođe do unutarćelijskog cilja.
[0395] Korisni teret može biti terapijski agens kao što je citotoksin, radioaktivni jon, hemioterapeutik, ili drugi terapijski agens. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji može biti štetan za ćelije. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenipozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksiantracindion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, puromicin, majtansinoide, npr. majtansinol (videti S.A.D. pat. br. 5.208.020), rahelmicin (CC-1065, videti S.A.D. patente br. 5.475.092, 5.585.499, i 5.846.545), i njihove analoge ili homologe. Radioaktivni joni uključuju, ali nisu ograničeni na jod (npr. jod 125 ili jod 131), stroncijum 89, fosfor, paladijum, cezijum, iridijum, fosfat, kobalt, itrijum 90, samarijum 153, i praseodimijum. Drugi terapijski agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilujuće agense (npr. mehloretamin, tiotepa hlorambucil, rahelmicin (CC-1065), melfalan, karmustin (BSNU), lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr. daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)), i antimitotičke agense (npr. vinkristin, vinblastin, taksol i majtansinoidi).
[0396] Korisni teret može biti detektabilni agens, kao što su različiti mali organski molekuli, neorganska jedinjenja, nanočestice, enzimi ili supstrati enzima, fluorescentni materijali, luminescentni materijali (npr. luminol), bioluminescentni materijali (npr. luciferaza, luciferin, i ekuorin), hemiluminescentni materijali, radioaktivni materijali (npr.<18>F,<67>Ga,<81m>Kr,<82>Rb,
1
<111>In,<123>I,<133>Xe,<201>Tl,<125>I,<35>S,<14>C,<3>H ili<99m>Tc (npr. kao pertehnetat (tehnetat (VII), TcO4-)), i kontrastni agensi (npr. zlato (npr. nanočestice zlata), gadolinijum (npr. helirani Gd), oksidi gvožđa (npr. superparamagnetni oksid gvožđa (SPIO), monokristalne nanočestice oksida gvožđa (MION), i ultramali superparamagnetni oksid gvožđa (USPIO)), helati mangana (npr. Mn-DPDP), barijum sulfat, jodirani kontrastni medijumi (joheksol), mikromehurići, ili perfluorougljenici). Takvi optički detektabilni obeleživači uključuju, na primer, bez ograničavanja, 4-acetamido-4'-izotiocijanatostilben-2,2'disulfonsku kiselinu; akridin i derivate (npr. akridin i akridin izotiocijanat); 5-(2'-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfonsku kiselinu (EDANS); 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimid-3,5 disulfonat; N-(4-anilino-1-naftil)maleimid; antranilamid; BODIPY; briljantno žutu; kumarin i derivate (npr. kumarin, 7-amino-4-metilkumarin (AMC, kumarin 120), i 7-amino-4-trifluorometilkumarin (kumarin 151)); cijanin boje; cijanozin; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5'5"-dibromopirogalolsulfonaftalein (bromopirogalol crvenu); 7-dietilamino-3-(4'-izotiocijanatofenil)-4-metilkumarin; dietilentiamin pentaacetat; 4,4'-diizotiocijanatodihidro-stilben-2,2'-disulfonsku kiselinu; 4,4'-diizotiocijanatostilben-2,2'-disulfonsku kiselinu; 5-[dimetilamino]-naftalen-1-sulfonil hlorid (DNS, dansilhlorid); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-izotiocijanat (DABITC); eozin i derivate (npr. eozin i eozin izotiocijanat); eritrozin i derivate (npr. eritrozin B i eritrozin izotiocijanat); etidijum; fluorescein i derivate (npr. 5-karboksifluorescein (FAM), 5-(4,6-dihlorotriazin-2-il) aminofluorescein (DTAF), 2',7'-dimetoksi-4'5'-dihloro-6-karboksifluorescein, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, X-rodamin-5-(i-6)-izotiocijanat (QFITC ili XRITC), i fluoreskamin); 2-[2-[3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-iliden]etiliden]-2-[4-(etoksikarbonil)-1-piperazinil]-1-ciklopenten-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulforpropil)-1H-benz[e]indolijum hidroksid, unutrašnju so, jedinjenje sa n,n-dietiletanaminom (1:1) (IR144); 5-hloro-2-[2-[3-[(5-hloro-3-etil-2(3H)-benzotiazoliliden)etiliden]-2-(difenilamino)-1-ciklopenten-1-il]etenil]-3-etil benzotiazolijum perhlorat (IR140); malahit zeleno izotiocijanat; 4-metilumbeliferon ortokrezolftalein; nitrotirozin; pararozanilin; fenol crvenu; B-fikoeritrin; o-ftaldialdehid; piren i derivate (npr. piren, piren butirat, i sukcinimidil 1-piren); butiratne kvantne tačke; reaktivnu crvenu 4 (CIBACRON™ brilijantno crvena 3B-A); rodamin i derivate (npr. 6-karboksi-X-rodamin (ROX), 6-karboksirodamin (R6G), lizamin rodamin B sulfonil hlorid rodamin (Rhod), rodamin B, rodamin 123, rodamin X izotiocijanat, sulforodamin B, sulforodamin 101, sulfonil hlorid derivat sulforodamina 101 (Texas Red), N,N,N',N'tetrametil-6-karboksirodamin (TAMRA) tetrametil rodamin i tetrametil rodamin, izotiocijanat (TRITC)); riboflavin; rozolnu kiselinu;
1
derivate terbijum helata; cijanin-3 (Cy3); cijanin-5 (Cy5); cijanin-5,5 (Cy5,5), cijanin-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Aleksa 647; La Jolta Blue; ftalo cijanin; i naftalo cijanin.
[0397] Detektabilni agens može biti nedetektabilni prekursor koji postaje detektabilan nakon aktivacije (npr. fluorogeni tetrazin-fluorofora konstrukti (npr. tetrazin-BODIPY FL, tetrazin-Oregon zelena 488, ili tetrazin-BODIPY TMR-X) ili fluorogeni agensi koji se mogu aktivirati enzimom (npr. PROSENSE® (VisEn Medical))). In vitro testovi u kojima se mogu upotrebljavati enzimski obeležene kompozicije uključuju, ali nisu ograničeni na, enzimske imunosorbent testove (ELISA), testove imunoprecipitacije, imunofluorescenciju, enzimske imunotestove (EIA), radioimunotestove (RIA), i Westarn blot analizu.
Kombinacije
[0398] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK mogu se upotrebljavati u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapijskih, profilaktičkih, dijagnostičkih, ili agenasa za snimanje. Pod "u kombinaciji sa", ne namerava se implicirati da se agensi moraju primenjivati u isto vreme i/ili formulisati za isporuku zajedno, iako su ovi postupci isporuke unutar obima predmetne objave. Kompozicije se mogu primenjivati istovremeno sa, pre, ili posle, jednog ili više drugih željenih terapeutika ili medicinskih procedura. Generalno, svaki agens će se primenjivati u dozi i/ili u vremenskom rasporedu koji je određen za taj agens. Ovde se objavljuje primena farmaceutskih, profilaktičkih, dijagnostičkih, ili kompozicija za snimanje u kombinaciji sa agensima koji mogu poboljšati njihovu bioraspoloživost, redukovati i/ili modifikovati njihov metabolizam, inhibirati njihovu ekskreciju, i/ili modifikovati njihovu distribuciju unutar tela. Kao neograničavajući primer, polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNK mogu se upotrebljavati u kombinaciji sa farmaceutskim agensom za lečenje kancera ili za kontrolu hiperproliferativnih ćelija. U S.A.D. pat. br. 7.964.571, opisana je kombinovana terapija za lečenje čvrstog primarnog ili metastaziranog tumora upotrebom farmaceutske kompozicije koja uključuje DNK plazmid koji kodira za interleukin-12 sa lipopolimerom i takođe primenom najmanje jednog antikancerskog agensa ili hemioterapeutika. Dodatno, polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNK iz predmetne objave koji kodiraju antiproliferativne molekule mogu biti u farmaceutskoj kompoziciji sa lipopolimerom (videti npr. S.A.D. pub. br. 20110218231, koja patentno štiti farmaceutsku kompoziciju koja sadrži DNK plazmid koji kodira antiproliferativni molekul i lipopolimer) kojs se može primeniti sa najmanje jednim hemioterapeutikom ili antikancerskim agensom.
1
Doziranje
[0399] Predmetna objava obezbeđuje postupke koji sadrže primenu polinukleotida, primarnih konstrukata i/ili mmRNK i njihovih kodiranih proteina ili kompleksa u skladu sa objavom subjektu kome je to potrebno, nukleinske kiseline, proteini ili kompleksi, ili farmaceutske, za snimanje, dijagnostičke, ili profilaktičke kompozicije toga, mogu biti primenjene subjektu upotrebom bilo koje količine i bilo kojim putem primene koji je efikasan za preveniranje, lečenje, dijagnostikovanje, ili snimanje bolesti, poremećaja, i/ili stanja (npr. bolesti, poremećaja, i/ili stanja povezanih sa deficitima radne memorije). Tačna potrebna količina variraće od subjekta do subjekta, u zavisnosti od vrste, starosti, i opšteg stanja subjekta, težine bolesti, određene kompozicije, njenog načina primene, njenog načina aktivnosti, i slično. Kompozicije u skladu sa pronalaskom se tipično formulišu u jediničnom doznom obliku radi lakše primene i uniformnosti doze. Razumeće se, međutim, da ordinirajući lekar može da odluči o ukupnoj dnevnoj upotrebi kompozicija iz predmetnog pronalaska u okviru zdrave medicinske procene. Specifični terapijski efikasan, profilaktički efikasan, ili odgovarajući nivo doze za snimanje za svakog određenog pacijenta zavisiće od različitih faktora, uključujući poremećaj koji se leči i težinu poremećaja; aktivnost specifičnog jedinjenja koje se koristi; specifičnu kompoziciju koja se koristi; starost, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol i ishranu pacijenta; vreme primene, put primene, i stopu ekskrecije specifičnog jedinjenja koje se koristi; trajanje lečenja; lekove koji se upotrebljavaju u kombinaciji ili koincidentno sa specifičnim jedinjenjem koje se koristi; i slične faktore dobro poznate u medicinskoj struci.
[0400] U nekim primerima izvođenja, kompozicije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti primenjene pri nivoima doza dovoljnim da isporuče od oko 0,0001 mg/kg do oko 100 mg/kg, od oko 0,001 mg/kg do oko 0,05 mg/kg, od oko 0,005 mg/kg do oko 0,05 mg/kg, od oko 0,001 mg/kg do oko 0,005 mg/kg, od oko 0,05 mg/kg do oko 0,5 mg/kg, od oko 0,01 mg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 0,1 mg/kg do oko 40 mg/kg, od oko 0,5 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 0,1 mg/kg do oko 10 mg/kg, ili od oko 1 mg/kg do oko 25 mg/kg telesne težine subjekta dnevno, jedan ili više puta dnevno, kako bi se postigao željeni terapijski, dijagnostički, profilaktički, ili efekat za snimanje. Željena doza može bitit isporučena tri puta dnevno, dva puta dnevno, jednom dnevno, svaki drugi dan, svaki treći dan, svake nedelje, svake dve nedelje, svake tri nedelje, ili svake četiri nedelje. U nekim primerima izvođenja, željena doza može biti isporučena upotrebom više primena (npr. dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, ili više primena).
1
[0401] U skladu sa predmetnim pronalaskom, otkriveno je da primena mmRNK u režimima podeljenih doza proizvodi više nivoe proteina kod subjekata sisara. Kao što se ovde upotrebljava, "podeljena doza" je podela pojedinačne jedinične doze ili ukupne dnevne doze na dve ili više doza, npr. dve ili više primena pojedinačne jedinične doze. Kao što se ovde upotrebljava, "pojedinačna jedinična doza" je doza bilo kog terapeutika koji se primenjuje u jednoj dozi/u jednom trenutku/jednim putem/na jednoj tački kontakta, tj. događaj pojedinačne primene. Kao što se ovde upotrebljava, "ukupna dnevna doza" je količina koja se daje ili propisuje u periodu od 24 sata. Može se primeniti kao pojedinačna jedinična doza. U jednom primeru izvođenja, mmRNK iz predmetnog pronalaska se primenjuje subjektu u podeljenim dozama. mmRNK može biti formulisana u puferu samom ili u formulaciji koja je ovde opisana.
Dozni oblici
[0402] Ovde opisana farmaceutska kompozicija može biti formulisana u ovde opisanom doznom obliku, kao što je topikalni, intranazalni, intratrahealni, ili injektabilni (npr. intravenski, intraokularni, intravitrealni, intramuskularni, intrakardijalni, intraperitonealni, subkutani).
Tečni dozni oblici
[0403] Tečni dozni oblici za parenteralnu primenu uključuju, ali nisu ograničeni na, farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe, i/ili eliksire. Pored aktivnih sastojaka, tečni dozni oblici mogu sadržati inertne razblaživače koji se uobičajeno upotrebljavaju u struci uključujući, ali bez ograničavanja na, vodu ili druge rastvarače, agense za solubilizaciju i emulgatore kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja (posebno, ulje semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, masline, ricinusa, i susama), glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikole i estre masnih kiselina sorbitana, i njihove smeše. U nekim primerima izvođenja za parenteralnu primenu, kompozicije se mogu mešati sa agensima za solubilizaciju kao što su CREMOPHOR®, alkoholi, ulja, modifikovana ulja, glikoli, polisorbati, ciklodekstrini, polimeri, i/ili njihove kombinacije.
11
Injektabilni
[0404] Injektabilni preparati, na primer, sterilne injektabilne vodene ili uljne suspenzije mogu biti formulisane u skladu sa poznatom strukom i mogu uključivati pogodne agense za dispergovanje, agense za vlaženje, i/ili agense za suspendovanje. Sterilni injektabilni preparati mogu biti sterilni injektabilni rastvori, suspenzije, i/ili emulzije u netoksičnim parenteralno prihvatljivim razblaživačima i/ili rastvaračima, na primer, rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim vehikulumima i rastvaračima koji se mogu koristiti uključujući, ali bez ograničavanja na, su voda, Ringerov rastvor, USP, i izotonični rastvor natrijum hlorida. Sterilna, fiksna ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U tu svrhu može se koristiti bilo koje blago fiksno ulje uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Masne kiseline, kao što je oleinska kiselina, mogu se upotrebljavati u pripremi injekcija.
[0405] Injektabilne formulacije mogu biti sterilisane, na primer, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije, i/ili inkorporisanjem agenasa za sterilizaciju u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje se mogu rastvoriti ili dispergovati u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom injektabilnom medijumu pre upotrebe.
[0406] Kako bi se produžio efekat aktivnog sastojka, može biti poželjno usporiti apsorpciju aktivnog sastojka iz subkutane ili intramuskularne injekcije. Ovo se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala sa slabom solubilnošću u vodi. Stopa apsorpcije polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK tada zavisi od njegove stope rastvaranja koja, pak, može zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK može biti postignuta rastvaranjem ili suspendovanjem polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK u uljanom vehikulumu. Injektabilni depo oblici se prave formiranjem mikroinkapsuliranih matriksa polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK u biodegradabilnim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK prema polimeru i prirode određenog polimera koji se koristi, može se kontrolisati stopa oslobađanja polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK. Primeri drugih biodegradabilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(ortoestre) i poli(anhidride). Injektabilne depo formulacije mogu biti pripremljene zarobljavanjem polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK u lipozome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa tkivima u telu.
Pulmonarni
[0407] Formulacije koje su ovde opisane kao korisne za pulmonarnu isporuku mogu se takođe upotrebljavati za intranazalnu isporuku farmaceutske kompozicije. Sledeća formulacija pogodna za intranazalnu primenu može biti grubi prašak koji sadrži aktivni sastojak i ima prosečne čestice od oko 0,2 µm do 500 µm. Takva formulacija se može primeniti na način na koji se uzima burmut, tj. brzim udisanjem kroz nazalni prolaz iz kontejnera sa praškom koji se drži blizu nosa.
[0408] Formulacije pogodne za nazalnu primenu mogu, na primer, sadržati od oko samo 0,1% (tež./tež.) i čak 100% (tež./tež.) aktivnog sastojka, i mogu sadržati jedan ili više od dopunskih sastojaka koji su ovde opisani. Farmaceutska kompozicija može biti pripremljena, upakovana, i/ili prodata u formulaciji pogodnoj za bukalnu primenu. Takve formulacije mogu, na primer, biti u obliku tableta i/ili lozengi napravljenih upotrebom konvencionalnih postupaka, i mogu, na primer, sadržati oko 0,1% do 20% (tež./tež.) aktivnog sastojka, gde ostatak može sadržati oralno rastvorljivu i/ili degradabilnu kompoziciju i, opciono, jedan ili više od dopunskih sastojaka koji su ovde opisani. Alternativno, formulacije pogodne za bukalnu primenu mogu sadržati prašak i/ili aerosolizovan i/ili atomizovan rastvor i/ili suspenziju koja sadrži aktivni sastojak. Takve praškaste, aerosolizovane, i/ili aerosolizovane formulacije, kada se disperguju, mogu imati prosečnu veličinu čestica i/ili kapljica u opsegu od oko 0,1 nm do oko 200 nm, i mogu dodatno sadržati jedan ili više od bilo kojih dopunskih sastojaka koji su ovde opisani.
[0409] Opšta razmatranja o formulaciji i/ili proizvodnji farmaceutskih agenasa mogu se pronaći, na primer, u Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
Obloge ili ljuske
[0410] Čvrsti dozni oblici tableta, dražeja, kapsula, pilula, i granula mogu biti pripremljeni sa oblogama i ljuskama, kao što su enteričke obloge i druge obloge dobro poznate u struci farmaceutske formulacije. Oni mogu opciono sadržati agense za zamućivanje i mogu biti od kompozicije koje oslobađaju samo aktivni sastojak(ke), ili poželjno, u određenom delu intestinalnog trakta, opciono, na odložen način. Primeri kompozicija za ugradnju koje se mogu upotrebljavati uključuju polimerne supstance i voskove. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu se koristiti kao fileri u mekim i tvrdim želatinskim kapsulama upotrebom takvih ekscipijenasa kao što su laktoza ili mlečni šećer kao i polietilen glikoli velike molekulske mase i slično.
Svojstva farmaceutskih kompozicija
[0411] Ovde opisani farmaceutski preparati mogu biti okarakterisani pomoću jednog ili više od bioraspoloživosti, terapijskog okvira i/ili zapremine distribucije.
Bioraspoloživost
[0412] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK, kada su formulisani u kompoziciju sa agensom za isporuku kao što je ovde opisano, mogu pokazati povećanje bioraspoloživosti u poređenju sa kompozicijom kojoj nedostaje agens za isporuku kao što je ovde opisano. Kao što se ovde upotrebljava, termin "bioraspoloživost" označava sistemsku dostupnost date količine polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK primenjenih sisaru. Bioraspoloživost se može proceniti merenjem površine ispod krive (AUC) ili maksimalne koncentracije u serumu ili plazmi (Cmax) nepromenjenog oblika jedinjenja nakon primene jedinjenja sisaru. AUC je određivanje površine ispod krive koja grafički prikazuje koncentraciju u serumu ili plazmi jedinjenja duž ordinate (Y-osa) u odnosu na vreme duž apscise (X-osa). Uopšteno, AUC za određeno jedinjenje može biti izračunata upotrebom postupaka poznatih onima sa prosečnim iskustvom u struci i kao što je opisano u G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, New York, Inc., 1996.
[0413] Cmaxvrednost je maksimalna koncentracija jedinjenja postignuta u serumu ili plazmi sisara nakon primene jedinjenja sisaru. Cmaxvrednost određenog jedinjenja može se izmeriti upotrebom postupaka poznatih onima sa prosečnim iskustvom u struci. Fraze "povećanje bioraspoloživosti" ili "poboljšanje farmakokinetike", kao što se ovde upotrebljava znače da je sistemska dostupnost prvog polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK, izmerena kao AUC, Cmax, ili Cminkod sisara veća, kada se primenjuje zajedno sa agensom za isporuku kao što je ovde opisano, nego kada se ne vrši takva istovremena primena. U nekim slučajevima, bioraspoloživost polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK može se povećati za najmanje oko 2%, najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko
11
65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili oko 100%.
Terapijski okvir
[0414] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK, kada su formulisani u kompoziciju sa agensom za isporuku kao što je ovde opisano, mogu pokazati povećanje terapijskog okvira primenjene kompozicije polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK u poređenju sa terapijskim okvirom primenjene kompozicije polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK kojoj nedostaje agens za isporuku kao što je ovde opisano. Kao što se ovde upotrebljava, "terapijski okvir" označava opseg koncentracija u plazmi, ili opseg nivoa terapijski aktivne supstance na mestu delovanja, sa visokom verovatnoćom izazivanja terapijskog efekta. U nekim slučajevima, terapijski okvir polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK, kada se primenjuje zajedno sa agensom za isporuku, kao što je ovde opisano, može se povećati za najmanje oko 2%, najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili oko 100%.
Zapremina distribucije
[0415] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK, kada su formulisani u kompoziciju sa agensom za isporuku kao što je ovde opisano, mogu pokazati poboljšanu zapreminu distribucije (Vdist), npr. redukovanu ili ciljanu, u odnosu na kompoziciju kojoj nedostaje agens za isporuku, kao što je ovde opisano. Zapremina distribucije (Vdist) povezuje količinu leka u telu sa koncentracijom leka u krvi ili plazmi. Kao što se ovde upotrebljava, termin "zapremina distribucije" označava zapreminu tečnosti koja bi bila potrebna da sadrži ukupnu količinu leka u telu u istoj koncentraciji kao u krvi ili plazmi: Vdistje jednaka količini leka u telu/koncentracija leka u krvi ili plazmi. Na primer, za dozu od 10 mg i koncentraciju u plazmi od 10 mg/l, zapremina distribucije bi bila 1 litar. Zapremina distribucije odražava stepen do kojeg je lek prisutan u izvanvaskularnom tkivu. Velika zapremina distribucije odražava tendenciju jedinjenja da se vezuje za komponente tkiva u poređenju sa vezivanjem za proteine plazme. U kliničkoj postavci, Vdistse može upotrebljavati za određivanje doze opterećenja radi postizanja stanja stabilne koncentracije. U nekim slučajevima, zapremina distribucije polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK, kada se primenjuje zajedno sa agensom za isporuku, kao što je ovde opisano, može se smanjiti za najmanje oko 2%, najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%.
Biološki efekat
[0416] Biološki efekat modifikovane mRNK isporučene životinjama može biti kategorizovan analizom ekspresije proteina kod životinja. Reprogramirana ekspresija proteina može biti određena analizom biološkog uzorka sakupljenog od sisara kome je primenjena modifikovana mRNK iz predmetne objave. Ekspresioni protein kodiran modifikovanom mRNK koja je primenjena sisaru od najmanje 50 pg/ml može biti poželjan. Na primer, ekspresija proteina od 50-200 pg/ml za protein kodiran modifikovanom mRNK isporučenom sisaru može biti posmatrana kao terapijski efikasna količina proteina kod sisara.
Kvantifikacija
[0417] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz predmetne objave mogu biti kvantifikovani u egzozomima poreklom iz jedne ili više telesnih tečnosti. Kao što se ovde upotrebljava, "telesne tečnosti" uključuju perifernu krv, serum, plazmu, ascites, urin, cerebrospinalnu tečnost (CSF), sputum, pljuvačku, kostnu srž, sinovijalnu tečnost, očnu vodicu, amnionsku tečnost, cerumen, majčino mleko, tečnost bronhoalveolarne lavaže, spermu, prostatičnu tečnost, Cowpers tečnost ili preejakulatornu tečnost, znoj, fekalne materije, kosu, suze, tečnost ciste, pleuralnu i peritonealnu tečnost, perikardijalnu tečnost, limfu, himus, hiloznu tečnost, žuč, intersticijumsku tečnost, menstruaciju, gnoj, sebum, povraćku, vaginalni sekret, mukusnu sekreciju, vodu iz stolice, pankreasni sok, lavažnu tečnost iz sinusnih šupljina, bronhopulmonalne aspirate, tečnost iz blastocelne šupljine, i krv iz pupčane vrpce. Alternativno, egzozomi se mogu uzeti iz organa odabranog iz grupe koja se sastoji od pluća, srca, pankreasa, želuca, creva, bešike, bubrega, jajnika, testisa, kože, debelog creva, dojke, prostate, mozga, jednjaka, jetre, i placente.
11
[0418] U postupku kvantifikacije, uzorak od ne više od 2 ml dobija se od subjekta i egzozomi se izoluju ekskluzionom hromatografijom, centrifugiranjem na gradijentu gustine, diferencijalnim centrifugiranjem, nanomembranskom ultrafiltracijom, imunoapsorbent hvatanjem, afinitetnim prečišćavanjem, mikrofluidnim odvajanjem, ili njihovim kombinacijama. U analizi, nivo ili koncentracija polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK može biti nivo ekspresije, prisustvo, odsustvo, skraćivanje ili izmena primenjenog konstrukta. Povoljno je korelisati nivo sa jednim ili više kliničkih fenotipova ili sa testom za biomarker humane bolesti. Test se može izvesti upotrebom proba specifičnih za konstrukt, citometrije, qRT-PCR, PCR u realnom vremenu, PCR, protočne citometrije, elektroforeze, masene spektrometrije, ili njihovih kombinacija, dok se egzozomi mogu izolovati upotrebom imunohistohemijskih postupaka kao što su enzimski imunosorbent test (ELISA) postupci. Egzozomi se takođe mogu izolovati pomoću ekskluzione hromatografije, centrifugiranja na gradijentu gustine, diferencijalnog centrifugiranja, nanomembranske ultrafiltracije, imunoapsorbent hvatanja, afinitetnog prečišćavanja, mikrofluidnog odvajanja, ili njihovih kombinacija.
[0419] Ovi postupci daju istraživaču mogućnost da u realnom vremenu prati nivo polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK koji su preostali ili isporučeni. Ovo je moguće pošto se polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz predmetne objave razlikuju od endogenih oblika zbog strukturnih ili hemijskih modifikacija.
Detekcija modifikovanih polinukleotida pomoću masene spektrometrije
[0420] Masena spektrometrija (MS) je analitička tehnika koja može obezbediti strukturne i informacije o molekulskoj masi/koncentraciji molekula posle njihove konverzije u jone. Molekuli se prvo jonizuju da bi stekli pozitivna ili negativna naelektrisanja i zatim putuju kroz maseni analizator kako bi došli do različitih oblasti detektora u skladu sa svojim masa/naelektrisanje (m/z) odnosom.
[0421] Masena spektrometrija se izvodi upotrebom masenog spektrometra koji uključuje izvor jona za jonizaciju frakcionisanog uzorka i kreiranje naelektrisanih molekula za dodatnu analizu. Na primer, jonizacija uzorka se može izvesti elektrosprej jonizacijom (ESI), hemijskom jonizacijom na atmosferskom pritisku (APCI), fotojonizacijom, elektron jonizacijom, brzim bombardovanjem atoma (FAB)/tečnom sekundarnom jonizacijom (LSIMS), matriksom potpomognutom laserskom desorpcijom/jonizacijom (MALDI), jonizacijom polja, desorpcijom polja, termosprej/plazmasprej jonizacijom, i jonizacijom
11
snopa čestica. Iskusni stručnjak će razumeti da se izbor postupka jonizacije može odrediti na osnovu analita koji se meri, tipa uzorka, tipa detektora, izbora pozitivnog nasuprot negativnom režimu, itd.
[0422] Posle jonizacije uzorka, time kreirani pozitivno naelektrisani ili negativno naelektrisani joni mogu biti analizirani kako bi se odredio odnos mase prema naelektrisanju (tj. m/z). Pogodni analizatori za određivanje odnosa mase prema naelektrisanju uključuju kvadropolne analizatore, analizatore jonske zamke, i analizatore vremena leta. Joni mogu biti detektovani upotrebom nekoliko režima detekcije. Na primer, odabrani joni mogu biti detektovani (tj. upotrebom režima praćenja odabranih jona (SIM)), ili alternativno, joni mogu biti detektovani upotrebom režima skeniranja, npr. praćenje više reakcija (MRM) ili praćenje odabranih reakcija (SRM).
[0423] Tečna hromatografija-praćenje više reakcija (LC-MS/MRM) zajedno sa razblaženjem peptidnih standarda obeleženih stabilnim izotopom pokazala se kao efikasan postupak za verifikaciju proteina (npr. Keshishian et al., Mol Cell Proteomics 20098: 2339-2349; Kuhn et al., Clin Chem 200955: 1108-1117; Lopez et al., Clin Chem 201056: 281-290). Za razliku od neciljane masene spektrometrije koja se često upotrebljava u studijama otkrivanja biomarkera, ciljani MS postupci su režimi MS zasnovani na sekvenci peptida koji fokusiraju puni analitički kapacitet instrumenta na desetine do stotine odabranih peptida u složenoj smeši. Ograničavanjem detekcije i fragmentacije na samo one peptide poreklom od proteina od interesa, osetljivost i reproducibilnost se dramatično poboljšavaju u poređenju sa MS postupcima u režimu otkrivanja. Ovaj postupak kvantifikacije proteina zasnovan na masenoj spektrometriji praćenjem više reakcija (MRM) može dramatično uticati na otkrivanje i kvantifikaciju biomarkera putem brzog, ciljanog, multipleksnog profilisanja proteinske ekspresije kliničkih uzoraka.
[0424] Biološki uzorak koji može sadržati najmanje jedan protein kodiran najmanje jednom modifikovanom mRNK može se analizirati postupkom MRM-MS. Kvantifikacija biološkog uzorka može dodatno uključivati, ali nije ograničena na, izotopski obeležene peptide ili proteine kao unutrašnje standarde.
[0425] U skladu sa predmetnom objavom, biološki uzorak, jednom dobijen od subjekta, može biti podvrgnut enzimskoj digestiji. Kao što se ovde upotrebljava, termin "digestija" znači rastaviti na kraće peptide. Kao što se ovde upotrebljava, fraza "tretiranje uzorka radi digestije proteina" znači manipulisanje uzorkom na takav način da se razgrade proteini u uzorku. Ovi enzimi uključuju, ali nisu ograničeni na, tripsin, endoproteinazu Glu-C i himotripsin. Biološki
11
uzorak koji može sadržati najmanje jedan protein kodiran najmanje jednom modifikovanom mRNK može biti digestiran upotrebom enzima.
[0426] Biološki uzorak koji može sadržati protein kodiran modifikovanom mRNK može biti analiziran na protein upotrebom elektrosprej jonizacije. Elektrosprej jonizacija (ESI) masena spektrometrija (ESIMS) upotrebljava električnu energiju za pomoć pri prenosu jona iz rastvora u gasovitu fazu pre nego što se oni analiziraju pomoću masene spektrometrije. Uzorci mogu biti analizirani upotrebom postupaka poznatih u struci (npr. Ho et al., Clin Biochem Rev. 2003 24(1):3-12). Jonske vrste sadržane u rastvoru mogu se prevesti u gasnu fazu raspršivanjem finog spreja naelektrisanih kapljica, isparavanjem rastvarača i izbacivanjem jona iz naelektrisanih kapljica kako bi se stvorila magla visoko naelektrisanih kapljica. Magla visoko naelektrisanih kapljica može biti analizirana upotrebom najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3 ili najmanje 4 masena analizatora, kao što je, ali nije ograničeno na, kvadrupol maseni analizator. Dodatno, postupak masene spektrometrije može uključivati korak prečišćavanja. Kao neograničavajući primer, prvi kvadrupol može biti podešen da odabere jedan m/z odnos tako da može propuštati druge molekulske jone koji imaju drugačiji m/z odnos što može eliminisati komplikovane i dugotrajne procedure prečišćavanja uzorka pre MS analize.
[0427] Biološki uzorak koji može sadržati protein kodiran modifikovanom mRNK može biti analiziran na protein u tandem ESIMS sistemu (npr. MS/MS). Kao neograničavajući primeri, kapljice mogu biti analizirane upotrebom skeniranja proizvoda (ili skeniranja ćerke), skeniranja prekursora (skeniranja roditelja), praćenjem neutralnog gubitka ili više reakcija.
[0428] Biološki uzorak koji može sadržati protein kodiran modifikovanom mRNK može biti analiziran upotrebom matriksom potpomognute laserske desorpcije/jonizacije (MALDI) masene spektrometrije (MALDIMS). MALDI obezbeđuje nedestruktivno isparavanje i jonizaciju i velikih i malih molekula, kao što su proteini. U MALDI analizi, analit se prvo kristališe zajedno sa velikim molskim viškom matriks jedinjenja, koje takođe može uključivati, ali nije ograničeno na, slabu organsku kiselinu koja apsorbuje ultraljubičasto zračenje. Neograničavajući primeri matriksa koji se upotrebljavaju u MALDI su α-cijano-4-hidroksicimetna kiselina, 3,5-dimetoksi-4-hidroksicimetna kiselina i 2,5-dihidroksibenzoeva kiselina. Lasersko zračenje smeše analit-matriks može rezultovati isparavanjem matriksa i analita. Desorpcija indukovana laserom obezbeđuje visoke prinose jona intaktnog analita i omogućava merenje jedinjenja sa velikom tačnošću. Uzorci mogu biti analizirani upotrebom postupaka poznatih u struci (npr. Lewis, Wei i Siuzdak, Encyclopedia of Analitical Chemistry 2000:5880-5894). Kao neograničavajući primeri, maseni analizatori koji se upotrebljavaju u
11
MALDI analizi mogu uključivati linearno vreme leta (TOF), TOF reflektron ili Furije (Fourier) transformisani maseni analizator.
[0429] Smeša analit-matriks može biti formirana upotrebom postupka osušenih kapljica. Biološki uzorak se pomeša sa matriksom kako bi se dobio zasićeni rastvor matriksa gde je odnos matriksa prema uzorku približno 5000:1. Alikvot (približno 0,5-2,0 μl) zasićenog rastvora matriksa se zatim ostavlja da se osuši kako bi se formirala smeša analit-matriks.
[0430] Smeša analit-matriks može biti formirana upotrebom postupka tankog sloja. Prvo se formira matriksni homogeni film i zatim se nanosi uzorak i matriks ga može apsorbovati kako bi se formirala smeša analit-matriks.
[0431] Smeša analit-matriks može biti formirana upotrebom postupka debelog sloja. Matriksni homogeni film se formira sa nitro-celuloznim matriks aditivom. Jednom kada se dobije uniformni sloj nitro-celuloznog matriksa, uzorak se nanosi i apsorbuje u matriks kako bi se formirala smeša analit-matriks.
[0432] Smeša analit-matriks može biti formirana upotrebom sendvič postupka. Priprema se tanak sloj kristala matriksa kao u postupku tankog sloja, nakon čega sledi dodavanje kapljica vodene trifluorosirćetne kiseline, uzorka i matriksa. Uzorak se zatim apsorbuje u matriks kako bi se formirala smeša analit-matriks.
VI. Upotrebe sintetičkih polinukleotida i/ili sintetičkih sgRNK
[0433] Sintetički polinukleotidi i/ili sintetičke sgRNK iz predmetne objave mogu se upotrebljavati za izmenu fenotipa ćelija. Polinukleotidi, primarni konstrukti i mmRNK iz objave mogu kodirati peptide, polipeptide ili više proteina kako bi se proizveli polipeptidi od interesa. Polipeptidi od interesa mogu se upotrebljavati u terapeuticima i/ili kliničkim i istraživačkim postavkama. Kao neograničavajući primer, polipeptidi od interesa mogu uključivati faktore reprogramiranja, faktore diferencijacije i faktore dediferencijacije.
Terapijski agensi
[0434] Polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNK iz predmetne objave, kao što su modifikovane nukleinske kiseline i modifikovane RNK, i proteini translatirani iz njih koji su ovde opisani mogu se upotrebljavati kao terapijski ili profilaktički agensi. Oni su obezbeđeni za upotrebu u medicini, terapiji i preventivnim lečenjima. Na primer, ovde opisani polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK (npr. modifikovana mRNK koja kodira
11
polipeptid ili protein povezan sa CRISPR) može biti primenjen subjektu, pri čemu se polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK translatira in vivo kako bi se proizveo terapijski ili profilaktički polipeptid kod subjekta. Slično, i opciono u kombinaciji sa prethodno navedenim, polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK koji su ovde opisani (npr. modifikovana sgRNK ili mnoštvo iste) može se primeniti subjektu, pri čemu polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK vodi editovanje gena pomoću polipeptida ili proteina povezanih sa CRISPR. Obezbeđene su kompozicije, postupci, kompleti, i reagensi za dijagnostikovanje, lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja kod ljudi i drugih sisara. Aktivni terapijski agensi iz objave uključuju polinukleotide, primarne konstrukte ili mmRNK, ćelije koje sadrže polinukleotide, primarne konstrukte ili mmRNK ili polipeptide translatirane iz polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK.
[0435] Ovde se objavljuju kombinovani terapeutici koji sadrže jedan ili više polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK koji sadrže translatabilne regione koji kodiraju protein ili proteine. U određenim slučajevima, ovde su obezbeđeni kombinovani terapeutici koji sadrže jedan ili više polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK koji sadrže netranslatabilne regione, na primer, regione komplementarne sekvencama ciljnih gena, npr. sgRNK.
[0436] Ovde su obezbeđeni postupci indukovanja translacije rekombinantnog polipeptida u ćelijskoj populaciji upotrebom ovde opisanog polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK. Takva translacija može biti in vivo, ex vivo, in culture, ili in vitro. Ćelijska populacija se dovodi u kontakt sa efikasnom količinom kompozicije koja sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje jednu nukleozidnu modifikaciju, i translatabilni region koji kodira rekombinantni polipeptid. Ćelijska populacija se opciono takođe dovodi u kontakt sa efikasnom količinom kompozicije koja sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje jednu nukleozidnu modifikaciju, i koja ima komplementarnost sa sekvencom ciljnog gena, npr. sgRNK. Populacija se dovodi u kontakt pod takvim uslovima da se nukleinska kiselina lokalizouje u jednu ili više ćelija ćelijske populacije i rekombinantni polipeptid se translatira u ćeliji iz nukleinske kiseline i ili se sgRNK (ili mnoštvo njih) takođe lokalizuje u jednu ili više ćelija ćelijske populacije.
[0437] "Efikasna količina" kompozicije se obezbeđuje, barem delimično, na osnovu ciljnog tkiva, tipa ciljne ćelije, načina primene, fizičkih karakteristika nukleinske kiseline (npr. veličine, i obima modifikovanih nukleozida) i drugih determinanti. Generalno, efikasna količina kompozicije obezbeđuje efikasnu proizvodnju proteina u ćeliji, poželjno efikasniju nego kompozicija koja sadrži odgovarajuću nemodifikovanu nukleinsku kiselinu. Povećana efikasnost može biti demonstrirana povećanom transfekcijom ćelija (tj. procentom ćelija
12
transfektovanih sa nukleinskom kiselinom), povećanom translacijom proteina iz nukleinske kiseline, smanjenom degradacijom nukleinske kiseline (kao što je demonstrirano, npr. povećanjem trajanja translacije proteina iz modifikovane nukleinske kiseline), ili redukovanim urođenim imunskim odgovorom ćelije domaćina.
[0438] Aspekti objave usmereni su na postupke indukovanja in vivo translacije rekombinantnog polipeptida kod subjekta sisara kome je to potrebno, npr. rekombinantnog proteina povezanog sa CRISPR. Dodatni aspekti objave usmereni su na postupke indukovanja editovanja gena in vivo kod subjekta sisara kome je to potrebno. Pri tome, efikasna količina kompozicije koja sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje jednu strukturnu ili hemijsku modifikaciju i translatabilni region koji kodira rekombinantni polipeptid, opciono u kombinaciji sa efikasnom količinom kompozicije koja sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina koje imaju najmanje jednu strukturnu ili hemijsku modifikaciju i/ili imaju komplementarnost sekvence sa ciljnim genom, npr. jednu ili više sgRNK, primenjuje se subjektu upotrebom ovde opisanih postupaka isporuke. Nukleinska kiselina se obezbeđuje u količini i pod drugim uslovima tako da se nukleinska kiselina lokalizujr u ćeliji subjekta i (1) rekombinantni polipeptid se translatira u ćeliji iz nukleinske kiseline i/ili (2) sgRNK vezuju komplementarne sekvence unutar ciljnih gena. Ćelija u koju se lokalizuje nukleinska kiselina iz objave, ili tkivo u kome je ćelija prisutna, može biti ciljano sa jednim ili više od jednog kruga primene nukleinske kiseline.
[0439] Primenjeni polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK može usmeriti proizvodnju jednog ili više rekombinantnih polipeptida i/ili regulatorne RNK, npr. sgRNK, koja obezbeđuje funkcionalnu aktivnost koja je suštinski odsutna u ćeliji, tkivu ili organizmu u kome se rekombinantni polipeptid translatira, npr. aktivnost editovanja gena. Primenjeni polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK može usmeriti proizvodnju jednog ili više rekombinantnih polipeptida i/ili regulatorne RNK, npr. sgRNK, uključene u editovanje gena, i primenjuje se u kombinaciji sa jednim ili više dopunskih polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNK koji usmeravaju proizvodnju jednog ili više dopunskih rekombinantnih polipeptida koji imaju terapijsku korisnost, npr. obezbeđujući funkcionalnu aktivnost koja je suštiniski odsutna u ćeliji, tkivu ili organizmu u kome se rekombinantni polipeptid translatira. Na primer, funkcionalna aktivnost koja nedostaje može biti enzimske, strukturne, ili gensko regulatorne prirode. Primenjeni polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK može usmeriti proizvodnju jednog ili više rekombinantnih polipeptida koji povećavaju (npr. sinergistički) funkcionalnu aktivnost koja je prisutna, ali suštinski deficijentna u ćeliji u kojoj se translatira rekombinantni polipeptid.
[0440] Primenjeni polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK može usmeriti proizvodnju jednog ili više rekombinantnih polipeptida koji zamenjuju polipeptid (ili više polipeptida) koji je suštinski odsutan u ćeliji u kojoj se rekombinantni polipeptid translatira. Takvo odsustvo može biti zbog genetičke mutacije kodirajućeg gena ili njegovog regulatornog puta. Rekombinantni polipeptid može povećati nivo endogenog proteina u ćeliji na željeni nivo; takvo povećanje može dovesti nivo endogenog proteina sa subnormalnog nivoa na normalan nivo ili sa normalnog nivoa na super-normalan nivo.
[0441] Alternativno, rekombinantni polipeptid funkcioniše tako da antagonizira aktivnost endogenog proteina prisutnog u, na površini, ili sekretovanog iz ćelije. Uobičajeno, aktivnost endogenog proteina štetna je za subjekta; na primer, zbog mutacije endogenog proteina koja rezultuje izmenjenom aktivnošću ili lokalizacijom. Dopunski, rekombinantni polipeptid antagonizuje, direktno ili indirektno, aktivnost biološkog dela prisutnog u, na površini, ili sekretovanog iz ćelije. Primeri antagonizovanih bioloških delova uključuju lipide (npr. holesterol), lipoprotein (npr. lipoprotein male gustine), nukleinsku kiselinu, ugljene hidrate, metabolit (npr. bilirubin), proteinski toksin kao što su šiga i tetanus toksini, ili toksin malog molekula kao što su toksini botulinum, kolere i difterije. Dopunski, antagonizovani biološki molekul može biti endogeni protein koji pokazuje neželjenu aktivnost, kao što je citotoksična ili citostatička aktivnost.
[0442] Bez da bude vezano teorijom, predloženo je da proces editovanja gena CRISPR može preokrenuti simptome bolesti in vivo. Kao takva, ova metodologija ima potencijal za lečenje mnogih genetičkih poremećaja.
[0443] U određenim slučajevima, mmRNK koja kodira polipeptid ili protein povezan sa CRISPR primenjuje se u kombinaciji sa jednom ili više sgRNK, opciono u kombinaciji sa korigovanim DNK templatom. DNK templat uključuje ispravnu sekvencu koja odgovara mutiranom genu povezanom sa bolešću. Primeri DNK templata odgovaraju genima koji uzrokuju bolest sa jednom mutacijom. Ćelija u koju se introdukuju potrebne komponente popravlja oštećeni gen upotrebom proteina povezanog sa CRISPER. Pritom, on kopira iz templata, introdukujući novi genetički materijal u genom.
[0444] Ovde prikazani podaci demonstriraju efikasno unošenje u jetru komponenti iz ove objave. Kao takva, ovde opisana metodologija je posebno prigodno za lečenje metaboličkih bolesti, npr. metaboličkih bolesti uzrokovanih urođenim genetičkim greškama, npr. bolesti povezanih sa nedostatkom ornitin transkarbamilaze. Postupci iz objave takođe mogu poslužiti za usporavanje progresije bolesti. Takođe se predlaže da intramuskularna isporuka, npr. putem više injekcija u mišić, može poslužiti za lečenje mišićnih bolesti, na primer, mišićne distrofije, uključivanjem odgovarajućih korigovanih DNK templata. U još sledećim slučajevima, predviđaju se ex vivo pristupi koji uključuju, na primer, primenu agenasa hematopoetskim ćelijama ex vivo (npr. putem elektroporacije), nakon čega sledi odabir ćelija koje eksprimiraju prave komponente, nakon čega sledi primena tretiranih ćelija, gde se naknadno može dogoditi rekolonizacija.
[0445] Rekombinantni proteini, mmRNK koje kodiraju iste, i/ili sgRNK, koji su ovde opisani mogu biti projektovani za lokalizaciju unutar ćelije, potencijalno unutar specifičnog kompartmenta kao što je nukleus, ili se projektuju za sekreciju iz ćelije ili translokaciju u plazma membranu ćelije. U primerima aspekata, rekombinantni proteini, mmRNK koje kodiraju iste, i/ili sgRNK, mogu biti projektovani za nukleusnu lokalizaciju.
[0446] Drugi aspekti predmetne objave odnose se na transplantaciju ćelija koje sadrže polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK subjektu sisaru. Primena ćelija subjektima sisarima poznata je onima sa prosečnim iskustvom u struci, i uključuje, ali nije ograničena na, lokalnu implantaciju (npr. topikalnu ili subkutanu primenu), isporuku u organ ili sistemsku injekciju (npr. intravenska injekcija ili inhalacija), i formulaciju ćelija u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Takve kompozicije koje sadrže polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNK mogu biti formulisane za primenu intramuskularno, transarterijski, intraperitonealno, intravenski, intranazalno, subkutano, endoskopski, transdermalno, ili intratekalno. Kompozicija može biti formulisana za produženo oslobađanje.
[0447] Subjekt kome terapijski agens može biti primenjen pati od ili može biti u riziku od razvoja bolesti, poremećaja, ili štetnog stanja. Obezbeđeni su postupci identifikovanja, dijagnostikovanja, i klasifikovanja subjekata na ovim osnovama, koji mogu uključivati kliničku dijagnozu, nivoe biomarkera, studije asocijacije na nivou genoma (GWAS), i druge postupke poznate u struci.
VII. Kompleti i uređaji
[0448] Objava obezbeđuje niz kompleta za zgodno i/ili efikasno izvođenje postupaka iz predmetne objave. Tipično kompleti će sadržati dovoljne količine i/ili broj komponenti da omoguće korisniku da izvede više tretmana subjekta(ata) i/ili da izvede više eksperimenata, i da dovede u kontakt ćelije i/ili populacije ćelija najmanje jednom.
[0449] U jednom aspektu, predmetna objava obezbeđuje komplete koji sadrže molekule (polinukleotide, primarne konstrukte ili mmRNK) iz objave. U jednom aspektu, komplet sadrži jedno ili više funkcionalnih antitela ili njihovih funkcionalnih fragmenata.
12
[0450] Kompleti i uređaji koji su korisni u kombinaciji sa polinukleotidima, primarnim konstruktima ili mmRNK iz objave uključuju one objavljene u zajedničkoj nerešenoj S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi br. 61/737.130 koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151666 zahteva pravo prvenstva.
VIII. Definicije
[0451] Na različitim mestima u predmetnoj specifikaciji, supstituenti jedinjenja iz predmetne objave se objavljuju u grupama ili u opsezima. Specifično je namenjeno da predmetna objava uključi svaku i sve pojedinačne podkombinacije članova takvih grupa i opsega. Na primer, termin "C1-6alkil" je specifično namenjen da pojedinačno objavi metil, etil, C3alkil, C4alkil, C5alkil, i C6alkil.
[0452] Oko: Kao što se ovde upotrebljava, termin "oko" znači /- 10% navedene vrednosti.
[0453] Primenjeno u kombinaciji: Kao što se ovde upotrebljava, termin "primenjeno u kombinaciji" ili "kombinovana primena" znači da se dva ili više agenasa primenjuju subjektu u isto vreme ili unutar intervala tako da može doći do preklapanja efekta svakog agensa kod pacijenta. U nekim slučajevima, primenjuju se unutar oko 60, 30, 15, 10, 5, ili 1 minuta jedan od drugog. U nekim slučajevima, primene agenasa su međusobno dovoljno blizu tako da se postiže kombinatorni (npr. sinergistički) efekat.
[0454] Životinja: Kao što se ovde upotrebljava, termin "životinja" označava bilo kog člana životinjskog carstva. U nekim slučajevima, "životinja" označava ljude u bilo kojoj fazi razvića. U nekim slučajevima, "životinja" označava ne-humane životinje u bilo kojoj fazi razvića. U određenim slučajevima, ne-humana životinja je sisar (npr. glodar, miš, pacov, zec, majmun, pas, mačka, ovca, govedo, primat, ili svinja). U nekim slučajevima, životinje uključuju, ali nisu ograničene na, sisare, ptice, gmizavce, vodozemce, ribe, i crve. U nekim slučajevima, životinja je transgena životinja, genetički-projektovana životinja, ili klon.
[0455] Približno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "približno" ili "oko", primenjen na jednu ili više vrednosti od interesa, označava vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim slučajevima, termin "približno" ili "oko" označava opseg vrednosti koje se nalaze unutar 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ili manje u oba smera (veće od ili manje od) navedene referentne vrednosti, osim ukoliko nije drugačije navedeno ili nije drugačije evidentno iz konteksta (osim gde bi takav broj premašio 100% moguće vrednosti).
[0456] Asocirano sa: Kao što se ovde upotrebljava, termini "asocirano sa", "konjugovano", "povezano", "prikačeno", i "privezano", kada se upotrebljavaju u odnosu na dva ili više dela, znače da su delovi fizički asocirani ili povezani jedan sa drugim, bilo direktno ili putem jednog ili više dopunskih delova koji služe kao povezujući agens, kako bi formirali strukturu koja je dovoljno stabilna tako da delovi ostaju fizički asocirani pod uslovima u kojima se struktura upotrebljava, npr. fiziološkim uslovima. "Asocijacija" ne mora biti striktno preko direktnog kovalentnog hemijskog vezivanja. Takođe može sugerisati jonsko ili vodonično vezivanje ili povezivanje zasnovano na hibridizaciji dovoljno stabilno tako da "asocirani" entiteti ostaju fizički asocirani.
[0457] Bifunkcionalno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "bifunkcionalno" označava bilo koju supstancu, molekul ili deo koji je sposoban da ili održava najmanje dve funkcije. Funkcije mogu uticati na isti ishod ili na različit ishod. Struktura koja proizvodi funkciju može biti ista ili različita. Na primer, bifunkcionalne modifikovane RNK iz predmetne objave mogu kodirati citotoksični peptid (prva funkcija), dok su oni nukleozidi koji sadrže kodirajuću RNK sami po sebi citotoksični (druga funkcija). U ovom primeru, isporuka bifunkcionalne modifikovane RNK u kancersku ćeliju ne bi proizvela samo molekul peptida ili proteina koji bi mogao olakšati ili lečiti kancer već bi takođe isporučio citotoksični korisni teret nukleozida u ćeliju ukoliko se dogodi degradacija, umesto translacije modifikovane RNK.
[0458] Biokompatibilno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "biokompatibilno" znači kompatibilno sa živim ćelijama, tkivima, organima ili sistemima što predstavlja mali ili nikakav rizik od povrede, toksičnosti ili odbacivanja od strane imunskog sistema.
[0459] Biodegradabilno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "biodegradabilno" znači da se može razgraditi na bezopasne proizvode dejstvom živih bića.
[0460] Biološki aktivno: Kao što se ovde upotrebljava, fraza "biološki aktivno" označava karakteristiku bilo koje supstance koja ima aktivnost u biološkom sistemu i/ili organizmu. Na primer, supstanca koja, kada je primenjena organizmu, ima biološki efekat na taj organizam, smatra se biološki aktivnom. U posebnim slučajevima, polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK iz predmetne objave mogu se smatrati biološki aktivnim ukoliko je samo deo polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK biološki aktivan ili oponaša aktivnost koja se smatra biološki relevantnom.
[0461] Matične ćelije kancera: Kao što se ovde upotrebljava, "matične ćelije kancera" su ćelije koje mogu biti podvrgnute samoobnavljanju i/ili abnormalnoj proliferaciji i diferencijaciji kako bi formirale tumor.
12
[0462] Hemijski termini: Hemijski termini koji ovde nisu drugačije definisani, biće u skladu sa definicijama hemijskih termina obezbeđenim u zajedničkoj nerešenoj S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi br. 61//3/, 130 koja je podneta 14. decembra 2012. godine, iz koje publikovana prijava WO/2013/151666 zahteva pravo prvenstva.
[0463] Termin "dijastereomer", kao što se ovde upotrebljava označava stereoizomere koji nisu slika u ogledalu jedan drugog i međusobno nisu preslikani.
[0464] Termin "efikasna količina" agensa, kao što se ovde upotrebljava, je ona količina dovoljna za postizanje korisnih ili željenih rezultata, na primer, kliničkih rezultata, i kao takva, "efikasna količina" zavisi od konteksta u kom se primenjuje. Na primer, u kontekstu primene agensa koji leči kancer, efikasna količina agensa je, na primer, količina dovoljna za postizanje lečenja, kao što je ovde definisano, kancera, u poređenju sa odgovorom dobijenim bez primene agensa.
[0465] Termin "enantiomer", kao što se ovde upotrebljava, označava svaki pojedinačni optički aktivni oblik jedinjenja iz objave, koji ima optičku čistoću ili enantiomerni višak (kao što je određeno postupcima standardnim u struci) od najmanje 80% (tj. najmanje 90% jednog enantiomera i najviše 10% drugog enantiomera), poželjno najmanje 90% i poželjnije najmanje 98%.
[0466] Termin "izomer", kao što se ovde upotrebljava, označava bilo koji tautomer, stereoizomer, enantiomer, ili dijastereomer bilo kog jedinjenja iz objave. Prepoznato je da jedinjenja iz objave mogu imati jedan ili više hiralnih centara i/ili dvostrukih veza i, prema tome, postoje kao stereoizomeri, kao što su izomeri sa dvostrukom vezom (tj. geometrijski E/Z izomeri) ili dijastereomeri (npr. enantiomeri (tj. (+) ili (-)) ili cis/trans izomeri). U skladu sa objavom, ovde prikazane hemijske strukture, i samim tim i jedinjenja iz objave, obuhvataju sve odgovarajuće stereoizomere, to jest, i stereomerno čist oblik (npr. geometrijski čist, enantiomerno čist, ili dijastereomerno čist) i enantiomerne i stereoizomerne smeše, npr. racemate. Enantiomerne i stereoizomerne smeše jedinjenja iz objave tipično mogu biti razdvojene na svoje sastavne enantiomere ili stereoizomere dobro poznatim postupcima, kao što je gasna hromatografija na hiralnoj fazi, tečna hromatografija visokih performansi na hiralnoj fazi, kristalizacija jedinjenja kao kompleks hiralne soli, ili kristalizacija jedinjenja u hiralnom rastvaraču. Enantiomeri i stereoizomeri se takođe mogu dobiti iz stereomerno ili enantiomerno čistih intermedijera, reagenasa, i katalizatora dobro poznatim asimetričnim sintetičkim postupcima.
[0467] Termin "stereoizomer", kao što se ovde upotrebljava, označava sve moguće različite izomerne kao i konformacione oblike koje jedinjenje može da poseduje (npr. jedinjenje bilo
12
koje formule opisane ovde), posebno sve moguće stereohemijske i konformacione izomerne oblike, sve dijastereomere, enantiomere i/ili konformere osnovne molekulske strukture. Neka jedinjenja iz predmetne objave mogu postojati u različitim tautomernim oblicima, od kojih su sva ova obuhvaćena unutar obima predmetnog pronalaska.
[0468] Jedinjenje: Kao što se ovde upotrebljava, termin "jedinjenje" je zamišljeno da uključuje sve stereoizomere, geometrijske izomere, tautomere, i izotope prikazanih struktura.
[0469] Ovde opisana jedinjenja mogu biti asimetrična (npr. da imaju jedan ili više stereocentara). Svi stereoizomeri, kao što su enantiomeri i dijastereomeri, su predviđeni ukoliko nije drugačije naznačeno. Jedinjenja iz predmetne objave koja sadrže asimetrično supstituisane atome ugljenika mogu biti izolovana u optički aktivnim ili racemskim oblicima. Postupci kako pripremiti optički aktivne oblike od optički aktivnih polaznih materijala poznati su u struci, kao što su razdvajanjem racemskih smeša ili stereoselektivnom sintezom. Mnogi geometrijski izomeri olefina, C = N dvostruke veze, i slično mogu takođe biti prisutni u ovde opisanim jedinjenjima, i svi takvi stabilni izomeri razmatraju se u predmetnoj objavi. Cis i trans geometrijski izomeri jedinjenja iz predmetne objave su opisani i mogu biti izolovani kao smeša izomera ili kao odvojeni izomerni oblici.
[0470] Jedinjenja iz predmetne objave takođe uključuju tautomerne oblike. Tautomerni oblici rezultuju iz zamene jednostruke veze susednom dvostrukom vezom i istovremenom migracijom protona. Tautomerni oblici uključuju prototropne tautomere koji su izomerna protonaciona stanja koja imaju istu empirijsku formulu i ukupno naelektrisanje. Primeri prototropnih tautomera uključuju parove keton - enol, parove amid - imidinska kiseline, parove laktam - laktim, parove amid - imidinska kiselina, parove enamin – imin, i prstenaste oblike gde proton može zauzeti dve ili više pozicija heterocikličnog sistema, kao što je, 1H- i 3H-imidazol, 1H-, 2H- i 4H-1,2,4-triazol, 1H- i 2H-izoindol, i 1H- i 2H-pirazol. Tautomerni oblici mogu biti u ravnoteži ili sterički zaključani u jedan oblik pomoću odgovarajuće supstitucije.
[0471] Jedinjenja iz predmetne objave takođe uključuju sve od izotopa atoma koji se javljaju u intermedijarnim ili u krajnjim jedinjenjima. "Izotopi" označavaju atome koji imaju isti atomski broj, ali različite masene brojeve koji rezultuju iz različitog broja neutrona u jezgrima. Na primer, izotopi vodonika uključuju tricijum i deuterijum.
[0472] Jedinjenja i soli iz predmetne objave mogu biti pripremljene u kombinaciji sa molekulima rastvarača ili vode kako bi se formirali solvati i hidrati pomoću rutinskih postupaka.
12
[0473] Opredeljeno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "opredeljeno" znači, kada se poziva na ćeliju, kada je ćelija dovoljno daleko na putu diferencijacije, gde će, pod normalnim okolnostima, nastaviti da se diferencira u specifični tip ćelije ili podskup tipova ćelija umesto u drugi tip ćelije ili vraćanje na manje diferenciran tip ćelije.
[0474] Konzervirano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "konzervirano" označava nukleotide ili amino-kiselinske ostatke polinukleotidne sekvence ili polipeptidne sekvence, respektivno, koji su oni koji se javljaju neizmenjeni u istoj poziciji dve ili više sekvenci koje se upoređuju. Nukleotidi ili amino-kiseline koje su relativno konzervirane su one koje su konzervirane među srodnijim sekvencama nego što su nukleotidi ili amino-kiseline koje se pojavljuju na drugim mestima u sekvencama.
[0475] U nekim slučajevima, kaže se da su dve ili više sekvenci "potpuno konzervirane" ukoliko su 100% identične jedna drugoj. U nekim slučajevima kaže se da su dve ili više sekvenci "visoko konzervirane" ukoliko su najmanje 70% identične, najmanje 80% identične, najmanje 90% identične, ili najmanje 95% identične jedna drugoj. U nekim slučajevima kaže se da su dve ili više sekvenci "visoko konzervirane" ukoliko su oko 70% identične, oko 80% identične, oko 90% identične, oko 95%, oko 98%, ili oko 99% identične jedna drugoj. U nekim slučajevima, kaže se da su dve ili više sekvenci "konzervirane" ukoliko su najmanje 30% identične, najmanje 40% identične, najmanje 50% identične, najmanje 60% identične, najmanje 70% identične, najmanje 80% identične, najmanje 90% identične, ili najmanje 95% identične jedna drugoj. U nekim slučajevima, kaže se da su dve ili više sekvenci "konzervirane" ukoliko su oko 30% identične, oko 40% identične, oko 50% identične, oko 60% identične, oko 70% identične, oko 80% identične, oko 90 % identične, oko 95% identične, oko 98% identične, ili oko 99% identične jedna drugoj. Konzerviranje sekvence može se primeniti na celu dužinu oligonukleotida ili polipeptida ili se može primeniti na njihov deo, region ili osobinu.
[0476] Kontrolisano oslobađanje: Kao što se ovde upotrebljava, termin "kontrolisano oslobađanje" označava profil oslobađanja farmaceutske kompozicije ili jedinjenja koji je u skladu sa određenim obrascem oslobađanja kako bi se postigao terapijski ishod.
[0477] Ciklično ili ciklizovano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "ciklično" označava prisustvo kontinuirane petlje. Ciklični molekuli ne moraju biti kružni, samo su spojeni da formiraju neprekinut lanac podjedinica. Ciklični molekuli kao što je projektovana RNK ili mRNK iz predmetne objave mogu biti pojedinačne jedinice ili multimeri ili sadržati jednu ili više komponenti složene strukture ili strukture višeg reda.
12
[0478] Citostatično: Kao što se ovde upotrebljava, "citostatično" označava inhibiranje, redukovanje, suzbijanje rasta, deobe, ili umnožavanja ćelije (npr. ćelije sisara (npr. humane ćelije)), bakterije, virusa, gljivice, protozoe, parazita, priona, ili njihove kombinacije.
[0479] Citotoksično: Kao što se ovde upotrebljava, "citotoksično" označava ubijanje ili uzrokovanje štetnih, toksičnih, ili smrtonosnih efekata na ćeliju (npr. ćeliju sisara (npr. humanu ćeliju)), bakteriju, virus, gljivicu, protozou, parazit, prion, ili njihovu kombinaciju.
[0480] Isporuka: Kao što se ovde upotrebljava, "isporuka" označava čin ili način isporučivanja jedinjenja, supstance, entiteta, dela, tereta ili korisnog tereta.
[0481] Agens za isporuku: Kao što se ovde upotrebljava, "agens za isporuku" označava bilo koju supstancu koja olakšava, barem delimično, in vivo isporuku polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNK do ciljanih ćelija.
[0482] Destabilizovano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "destabilan", "destabilisati", ili "destabilizujući region" označava region ili molekul koji je manje stabilan od početnog, oblika divljeg tipa ili nativnog oblika istog regiona ili molekula.
[0483] Detektabilni obeleživač: Kao što se ovde upotrebljava, "detektabilni obeleživač" označava jedan ili više markera, signala, ili delova koji su prikačeni, inkorporisani ili asocirani sa drugim entitetom koji se lako detektuje pomoću postupaka poznatih u struci uključujući radiografiju, fluorescenciju, hemiluminescenciju, enzimsku aktivnost, apsorbancu i slično. Detektabilni obeleživači uključuju radioizotope, fluorofore, hromofore, enzime, boje, jone metala, ligande kao što su biotin, avidin, streptavidin i hapteni, kvantne tačke, i slično. Detektabilni obeleživači mogu biti locirani na bilo kojoj poziciji u peptidima ili proteinima koji se ovde objavljuju. Oni mogu biti unutar amino-kiselina, peptida, ili proteina, ili locirani na N- ili C-terminusima.
[0484] Razvojni potencijal: Kao što se ovde upotrebljava, "razvojni potencijal" ili "razvojna potencija" označava sve razvojne ćelijske sudbine ili tipove ćelija koje ćelija može da dostigne nakon diferencijacije.
[0485] Faktor izmene razvojnog potencijala: Kao što se ovde upotrebljava, "faktor izmene razvojnog potencijala" označava protein ili RNK koji mogu da izmene razvojni potencijal ćelije.
[0486] Digestija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "digestija" znači da se rastavi na manje komade ili komponente. Kada se poziva na polipeptide ili proteine, digestija rezultuje proizvodnjom peptida.
12
[0487] Diferencirana ćelija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "diferencirana ćelija" označava bilo koju somatsku ćeliju koja u svom izvornom obliku nije pluripotentna. Diferencirana ćelija takođe obuhvata ćelije koje su delimično diferencirane.
[0488] Diferencijacija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "faktor diferencijacije" označava faktor izmene razvojnog potencijala, kao što su protein, RNK ili mali molekul koji mogu indukovati ćeliju da se diferencira do željenog tipa ćelije.
[0489] Diferencirati: Kao što se ovde upotrebljava, "diferencirati" označava postupak gde neopredeljena ili manje opredeljena ćelija stiče osobine opredeljene ćelije.
[0490] Bolest: Kao što se ovde upotrebljava, termin "bolest" označava abnormalno stanje koje utiče na telo organizma koji često pokazuje specifične telesne simptome.
[0491] Poremećaj: Kao što se ovde upotrebljava, termin "poremećaj" označava poremećaj ili ometanje normalnih funkcija ili uspostavljenih sistema tela.
[0492] Distalno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "distalno" znači koji se nalazi daleko od centra ili daleko od tačke ili regiona od interesa.
[0493] Faktor podele doze (Dose splitting factor - DSF)-odnos PUD doze podeljenog lečenja podeljen sa PUD ukupne dnevne doze ili pojedinačne jedinične doze. Vrednost je izvedena iz poređenja grupa doznog režima.
[0494] Embrionalna matična ćelija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "embrionalna matična ćelija" označava pluripotentne matične ćelije unutrašnje ćelijske mase embrionalnog blastocista koje se javljaju u prirodi.
[0495] Inkapsulirati: Kao što se ovde upotrebljava, termin "inkapsulirati" znači obuhvatiti, okružiti ili uokviriti.
[0496] Kodirani signal isecanja proteina: Kao što se ovde upotrebljava, "kodirani signal isecanja proteina" označava nukleotidnu sekvencu koja kodira signal isecanja proteina.
[0497] Projektovano: Kao što se ovde upotrebljava, polinukleotidi su "projektovani" kada su dizajnirani da imaju osobinu ili svojstvo, bilo strukturno ili hemijsko, koje se razlikuje od početne tačke, molekula divljeg tipa ili nativnog molekula.
[0498] Egzozom: Kao što se ovde upotrebljava, "egzozom" je vezikula koju sekretuju ćelije sisara ili kompleks uključen u degradaciju RNK.
[0499] Ekspresija: Kao što se ovde upotrebljava, "ekspresija" sekvence nukleinske kiseline označava jedan ili više od sledećih događaja: (1) proizvodnja RNK templata iz sekvence DNK (npr. transkripcijom); (2) obrada RNK transkripta (npr. splajsovanjem, editovanjem, formiranjem 5' kape, i/ili obradom 3' kraja); (3) translacija RNK u polipeptid ili protein; i (4) posttranslaciona modifikacija polipeptida ili proteina.
1
[0500] Osobina: Kao što se ovde upotrebljava, "osobina" označava karakteristiku, svojstvo, ili prepoznatljiv element.
[0501] Formulacija: Kao što se ovde upotrebljava, "formulacija" uključuje najmanje polinukleotid, primarni konstrukt ili mmRNK i agens za isporuku.
[0502] Fragment: "Fragment", kao što se ovde upotrebljava, označava deo. Na primer, fragmenti proteina mogu sadržati polipeptide dobijene digestijom proteina pune dužine izolovanog iz kultivisanih ćelija.
[0503] Funkcionalno: Kao što se ovde upotrebljava, "funkcionalni" biološki molekul je biološki molekul u obliku u kojem pokazuje svojstvo i/ili aktivnost po kojoj se karakteriše.
[0504] Homologija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "homologija" označava ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između molekula nukleinskih kiselina (npr. DNK molekula i/ili RNK molekula) i/ili između molekula polipeptida. U nekim slučajevima, polimerni molekuli smatraju se "homolognim" jedni drugima ukoliko su njihove sekvence najmanje 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% identične ili slične. Termin "homologan" nužno označava poređenje između najmanje dve sekvence (polinukleotidne ili polipeptidne sekvence). U skladu sa objavom, smatra se da su dve polinukleotidne sekvence homologne ukoliko su polipeptidi koje kodiraju najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ili čak 99% identični za najmanje jedan niz od najmanje oko 20 amino-kiselina. U nekim slučajevima, homologne polinukleotidne sekvence karakteriše sposobnost da kodiraju niz od najmanje 4-5 jedinstveno specificiranih amino-kiselina. Za polinukleotidne sekvence dužine manje od 60 nukleotida, homologija se određuje sposobnošću kodiranja niza od najmanje 4-5 jedinstveno specificiranih aminokiselina. U skladu sa objavom, smatra se da su dve proteinske sekvence homologne ukoliko su proteini najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% identični za najmanje jedan niz od najmanje oko 20 amino-kiselina.
[0505] Identičnost: Kao što se ovde upotrebljava, termin "identičnost" označava ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između molekula oligonukleotida (npr. DNK molekula i/ili RNK molekula) i/ili između molekula polipeptida. Izračunavanje procenta identičnosti dve polinukleotidne sekvence, na primer, može se izvesti poravnanjem dve sekvence radi optimalnih poređenja (npr. praznine se mogu introdukovati u jednu ili obe prve i druge sekvence nukleinske kiseline radi optimalnog poravnanja i neidentične sekvence se mogu zanemariti radi poređenja). U određenim slučajevima, dužina sekvence poravnate radi poređenja je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 100% dužine referentne sekvence. Zatim se
1 1
upoređuju nukleotidi na odgovarajućim pozicijama nukleotida. Kada poziciju u prvoj sekvenci zauzima isti nukleotid kao na odgovarajućoj poziciji u drugoj sekvenci, tada su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje su zajedničke za sekvence, uzimajući u obzir broj praznina, i dužinu svake praznine, koju je potrebno introdukovati za optimalno poravnanje dve sekvence. Upoređivanje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može biti postignuto upotrebom matematičkog algoritma. Na primer, procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može biti određen upotrebom postupaka kao što su oni opisani u Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., i Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; i Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. i Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991. Na primer, procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može biti određen upotrebom Majersovog (Meyers) i Milerovog (Miller) algoritma (CABIOS, 1989, 4:11-17), koji je inkorporisan u ALIGN program (verzija 2.0) upotrebom tabele mase ostataka PAM120, kazne za dužine praznine 12 i kazne za prazninu 4. Procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence alternativno može biti određen upotrebom GAP programa u GCG softverskom paketu upotrebom NWSgapdna.CMP matriksa. Postupci koji se uobičajeno koriste za određivanje procenta identičnosti između sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na one objavljene u Carillo, H. i Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Tehnike za određivanje identičnosti kodirane su u javno dostupnim računarskim programima. Primeri računarskog softvera za određivanje homologije između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, GCG programski paket, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, i FASTA Altschul, S. F., et al., J. Molec. Biol, 215, 403 (1990)).
[0506] Inhibira ekspresiju gena: Kao što se ovde upotrebljava, fraza "inhibira ekspresiju gena" znači da uzrokuje redukovanje količine proizvoda ekspresije gena. Proizvod ekspresije može biti RNK transkribovana iz gena (npr. mRNK) ili polipeptid translatiran iz mRNK transkribovane iz gena. Tipično redukovanje nivoa mRNK rezultuje redukovanjem nivoa polipeptida koji se iz nje translatira. Nivo ekspresije može biti određen upotrebom standardnih tehnika za merenje mRNK ili proteina.
1 2
[0507] In vitro: Kao što se ovde upotrebljava, termin "in vitro" označava događaje koji se događaju u veštačkom okruženju, npr. u epruveti ili reakcionoj posudi, u ćelijskoj kulturi, u Petri šolji, itd. pre nego unutar organizma (npr. životinje, biljke, ili mikroba).
[0508] In vivo: Kao što se ovde upotrebljava, termin "in vivo" označava događaje koji se događaju unutar organizma (npr. životinje, biljke ili mikroba ili njihove ćelije ili tkiva).
[0509] Izolovano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "izolovano" označava supstancu ili entitet koji je odvojen od najmanje nekih komponenti sa kojima je bio asociran (bilo u prirodi ili u eksperimentalnoj postavci). Izolovane supstance mogu imati različite nivoe čistoće u odnosu na supstance sa kojima su bile asocirane. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu biti odvojeni od najmanje oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, ili više drugih komponenti sa kojima su bili inicijalno asocirani. U nekim primerima izvođenja, izolovani agensi su više od oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99% čisti. Kao što se ovde upotrebljava, supstanca je "čista" ukoliko je suštinski bez drugih komponenti.
[0510] Suštinski izolovano: Pod "suštinski izolovano" podrazumeva se da je jedinjenje suštinski odvojeno od okruženja u kome je bilo formirano ili detektovano. Delimično odvajanje može uključivati, na primer, kompoziciju obogaćenu jedinjenjem iz predmetne objave. Znatno odvajanje može uključivati kompozicije koje sadrže najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% po težini jedinjenja iz predmetne objave, ili njegove soli. Postupci za izolovanje jedinjenja i njihovih soli su rutinski u struci.
[0511] Linker: Kao što se ovde upotrebljava, linker označava grupu atoma, npr. 10-1.000 atoma, i može se sastojati od atoma ili grupa kao što su, ali bez ograničavanja na, ugljenik, amino, alkilamino, kiseonik, sumpor, sulfoksid, sulfonil, karbonil, i imin. Linker može biti prikačen za modifikovani nukleozid ili nukleotid na nukleobazi ili šećernom delu na prvom kraju, i za korisni teret, npr. detektibilni ili terapijski agens, na drugom kraju. Linker može biti dovoljne dužine da ne ometa inkorporaciju u sekvencu nukleinske kiseline. Linker se može upotrebljavati u bilo koju korisnu svrhu, kao što je formiranje mmRNK multimera (npr. preko povezivanja dva ili više polinukleotida, primarna konstrukta, ili mmRNK molekula) ili mmRNK konjugata, kao i za primenu korisnog tereta, kao što je ovde opisano. Primeri hemijskih grupa koje mogu biti inkorporisane u linker uključuju, ali nisu ograničene na, alkil, alkenil, alkinil, amido, amino, etar, tioetar, estar, alkilen, heteroalkilen, aril, ili heterociklil, od kojih svaka može biti opciono supstituisana, kao što je ovde opisano. Primeri linkera
1
uključuju, ali nisu ograničeni na, nezasićene alkane, polietilen glikole (npr. monomerne jedinice etilen ili propilen glikola, npr. dietilen glikol, dipropilen glikol, trietilen glikol, tripropilen glikol, tetraetilen glikol, ili tetraetilen glikol), i dekstran polimere. Drugi primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, delove unutar linkera koji se mogu iseći, kao što su, na primer, disulfidna veza (-S-S-) ili azo veza (-N=N-), koje se mogu iseći upotrebom redukcionog agensa ili fotolize. Neograničavajući primeri selektivno isecive veze uključuju amido vezu koja se može iseći na primer pomoću upotrebe tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP), ili drugih redukcionih agenasa, i/ili fotolize, kao i estarsku vezu koja se može iseći na primer pomoću kisele ili bazne hidrolize.
[0512] MikroRNK (miRNK) vezujuće mesto: Kao što se ovde upotrebljava, mikroRNK (miRNK) vezujuće mesto predstavlja lokaciju nukleotida ili region transkripta nukleinske kiseline za koju se vezuje barem "seme" region miRNK.
[0513] Modifikovano: Kao što se ovde upotrebljava, "modifikovano" označava promenjeno stanje ili strukturu molekula iz pronalaska. Molekuli mogu biti modifikovani na mnogo načina, uključujući hemijski, strukturno, i funkcionalno. mRNK molekuli iz predmetne objave mogu biti modifikovani introdukovanjem neprirodnih nukleozida i/ili nukleotida, npr. kao što se odnosi na prirodne ribonukleotide A, U, G, i C. Nekanonski nukleotidi, kao što je struktura kape, ne smatraju se "modifikovanim" iako se razlikuju od hemijske strukture A, C, G, U ribonukleotida.
[0514] Mukus: Kao što se ovde upotrebljava, "mukus" označava prirodnu supstancu koja je viskozna i sadrži mucin glikoproteine.
[0515] Multipotentno: Kao što se ovde upotrebljava, "multipotentna" ili "delimično diferencirana ćelija" kada se poziva na ćeliju označava ćeliju koja ima razvojni potencijal da se diferencira u ćelije jednog ili više klicinih listova, ali ne sva tri klicina lista.
[0516] Koji se javlja prirodno: Kao što se ovde upotrebljava, "koji se javlja prirodno" znači da postoji u prirodi bez veštačke pomoći.
[0517] Ne-humani vertebrati: Kao što se ovde upotrebljava, "ne-humani vertebrati" uključuju sve vertebrate osim Homo sapiens, uključujući divlje i pripitomljene vrste. Primeri nehumanih vertebrata uključuju, ali nisu ograničeni na, sisare, kao što su alpaka, banteng, bizon, kamila, mačka, govedo, jelen, pas, magarac, gajal, koza, zamorac, konj, lama, mazga, svinja, zec, irvas, ovca, vodeni bizon, i jak.
[0518] Nespecifično (Off-target): Kao što se ovde upotrebljava, "nespecifično" označava bilo koji nenamenjeni efekat na bilo koji jedan ili više ciljeva, gena ili ćelijskih transkripata.
1 4
[0519] Oligopotentno: Kao što se ovde upotrebljava, "oligopotentno" kada se poziva na ćeliju znači dovesti do ograničenijeg podskupa ćelijskih loza od multipotentnih matičnih ćelija.
[0520] Otvoreni okvir čitanja: Kao što se ovde upotrebljava, "otvoreni okvir čitanja" ili "ORF" označava sekvencu koja ne sadrži stop kodon u datom okviru čitanja.
[0521] Operativno povezano: Kao što se ovde upotrebljava, fraza "operativno povezano" označava funkcionalnu vezu između dva ili više molekula, konstrukata, transkripata, entiteta, delova ili slično.
[0522] Opciono supstituisano: Ovde je fraza oblika "opciono supstituisan X" (npr. opciono supstituisani alkil) namenjena da bude ekvivalentna sa "X, pri čemu je X opciono supstituisan" (npr. "alkil, pri čemu je navedeni alkil opciono supstituisan"). Nije namenjeno da znači da je osobina "X" (npr. alkil) sama po sebi opciona.
[0523] Peptid: Kao što se ovde upotrebljava, "peptid" je dugačak manje od ili jednako 50 amino-kiselina, npr. dugačak je oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 amino-kiselina.
[0524] Paratop: Kao što se ovde upotrebljava, "paratop" označava antigen vezujuće mesto antitela.
[0525] Pacijent: Kao što se ovde upotrebljava, "pacijent" označava subjekta koji može tražiti ili mu je potrebno lečenje, zahteva lečenje, prima lečenje, primaće lečenje, ili subjekt koji je pod nadzorom obučenog stručnjaka za određenu bolest ili stanje.
[0526] Farmaceutski prihvatljiv: Fraza "farmaceutski prihvatljiv" ovde se koristi da označi ona jedinjenja, materijale, kompozicije, i/ili dozne oblike koji su, u okviru zdrave medicinske procene, pogodni za upotrebu u dodiru sa tkivima ljudskih bića i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, ili drugih problema ili komplikacija, srazmerno razumnom korist/rizik odnosu.
[0527] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi: Fraza "farmaceutski prihvatljiv ekscipijens", kao što se ovde upotrebljava, označava bilo koji sastojak osim ovde opisanih jedinjenja (na primer, vehikulum sposoban da suspenduje ili rastvara aktivno jedinjenje) i koji ima svojstva da bude suštinski netoksičan i neinflamatoran za pacijenata. Ekscipijensi mogu uključivati, na primer: antiadherente, antioksidanse, veziva, obloge, agense za komprimovanje, dezintegrante, boje (kolorante), emolijense, emulgatore, filere (razblaživače), agense za formiranje filma ili obloge, arome, mirise, glidante (pojačivače protoka), lubrikante, konzervanse, štamparske boje, sorbente, agense za suspendovanje ili dispergovanje, zaslađivače, i vode za hidrataciju. Primeri ekscipijenasa uključuju, ali nisu ograničeni na: butilisani hidroksitoluen (BHT), kalcijum karbonat, kalcijum fosfat (dvobazni), kalcijum stearat, kroskarmelozu, umreženi polivinilpirolidon, limunsku kiselinu, krospovidon, cistein,
1
etilcelulozu, želatin, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metilcelulozu, laktozu, magnezijum stearat, maltitol, manitol, metionin, metilcelulozu, metil paraben, mikrokristalnu celulozu, polietilen glikol, polivinilpirolidon, povidon, preželatinizovani skrob, propil paraben, retinil palmitat, šelak, silicijum dioksid, natrijum karboksimetil celulozu, natrijum citrat, natrijum skrob glikolat, sorbitol, skrob (kukuruzni), stearinsku kiselinu, saharozu, talk, titanijum dioksid, vitamin A, vitamin E, vitamin C, i ksilitol.
[0528] Farmaceutski prihvatljive soli: Predmetna objava takođe uključuje farmaceutski prihvatljive soli ovde opisanih jedinjenja. Kao što se ovde upotrebljava, "farmaceutski prihvatljive soli" označavaju derivate objavljenih jedinjenja pri čemu je roditeljsko jedinjenje modifikovano konvertovanjem postojećeg kiselog ili baznog dela u njegov oblik soli (npr. reagovanjem slobodne bazne grupe sa pogodnom organskom kiselinom). Primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju, ali nisu ograničeni na, soli mineralnih ili organskih kiselina baznih ostataka kao što su amini; alkalne ili organske soli kiselih ostataka kao što su karboksilne kiseline; i slično. Reprezentativne kisele adicione soli uključuju soli acetata, adipata, alginata, askorbata, aspartata, benzensulfonata, benzoata, bisulfata, borata, butirata, kamforata, kamforsulfonata, citrata, ciklopentanpropionata, diglukonata, dodecilsulfata, etansulfonata, fumarata, glukoheptonata, glicerofosfata, hemisulfata, heptonata, heksanoata, hidrobromida, hidrohlorida, hidrojodida, 2-hidroksi-etansulfonata, laktobionata, laktata, laurata, lauril sulfata, malata, maleata, malonata, metansulfonata, 2-naftalensulfonata, nikotinata, nitrata, oleata, oksalata, palmitata, pamolata, pektinata, persulfata, 3-fenilpropionata, fosfata, pikrata, pivalata, propionata, stearata, sukcinata, sulfata, tartarata, tiocijanata, toluensulfonata, undekanoata, valerata, i slično. Reprezentativne soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala uključuju natrijum, litijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, i slično, kao i netoksični amonijum, kvaternarni amonijum, i aminske katjone, uključujući, ali bez ograničavanja na, amonijum, tetrametilamonijum, tetraetilamonijum, metilamin, dimetilamin, trimetilamin, trietilamin, etilamin, i slično. Farmaceutski prihvatljive soli iz predmetne objave uključuju konvencionalne netoksične soli roditeljskog jedinjenja formirane, na primer, od netoksičnih neorganskih ili organskih kiselina. Farmaceutski prihvatljive soli iz predmetne objave mogu biti sintetisane iz roditeljskog jedinjenja koje sadrži bazni ili kiseli deo pomoću konvencionalnih hemijskih postupaka. Generalno, takve soli se mogu pripremiti reagovanjem slobodnih kiselih ili baznih oblika ovih jedinjenja sa stehiometrijskom količinom odgovarajuće baze ili kiseline u vodi ili u organskom rastvaraču, ili u smeši ova dva; generalno, poželjni su nevodeni medijumi kao što su etar, etil acetat, etanol, izopropanol, ili acetonitril. Liste pogodnih soli nalaze se u Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed.,
1
Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl i C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, i Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977).
[0529] Farmakokinetika: Kao što se ovde upotrebljava, "farmakokinetika" označava bilo koje jedno ili više svojstava molekula ili jedinjenja pošto se odnosi na određivanje sudbine supstanci primenjenih živom organizmu. Farmakokinetika je podeljena u nekoliko oblasti uključujući opseg i stopu apsorpcije, distribuciju, metabolizam i ekserciju. Ovo se uobičajeno označava kao ADME gde: (A) Apsorpcija je proces ulaska supstance u krvnu cirkulaciju; (D) Distribucija je disperzija ili širenje supstanci po fluidima i tkivima tela; (M) Metabolizam (ili biotransformacija) je ireverzibilna transformacija roditeljskih jedinjenja u ćerke metabolite; i (E) Eksercija (ili eliminacija) označava uklanjanje supstanci iz tela. U retkim slučajevima, neki lekovi se ireverzibilno akumuliraju u tkivu tela.
[0530] Farmaceutski prihvatljiv solvat: Termin "farmaceutski prihvatljiv solvat", kao što se ovde upotrebljava, znači jedinjenje iz objave pri čemu su molekuli pogodnog rastvarača inkorporisani u kristalnu rešetku. Pogodan rastvarač je fiziološki podnošljiv u primenjenoj dozi. Na primer, solvati mogu biti pripremljeni kristalizacijom, rekristalizacijom, ili taloženjem iz rastvora koji uključuje organske rastvarače, vodu, ili njihovu smešu. Primeri pogodnih rastvarača su etanol, voda (na primer, mono-, di- i tri-hidrati), N-metilpirolidinon (NMP), dimetil sulfoksid (DMSO), N,N'-dimetilformamid (DMF), N,N'-dimetilacetamid (DMAC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinon (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinon (DMPU), acetonitril (ACN), propilen glikol, etil acetat, benzil alkohol, 2-pirolidon, benzil benzoat, i slično. Kada je voda rastvarač, solvat se označava kao "hidrat".
[0531] Fizičko-hemijsko: Kao što se ovde upotrebljava, "fizičko-hemijski" znači za ili koja se odnosi na fizička i/ili hemijska svojstva.
[0532] Pluripotentno: Kao što se ovde upotrebljava, "pluripotentno" označava ćeliju sa razvojnim potencijalom, pod različitim uslovima, za diferenciranje u tipove ćelija karakteristične za sva tri klicina lista.
[0533] Pluripotencija: Kao što se ovde upotrebljava, "pluripotencija" ili "pluripotentno stanje" označava razvojni potencijal ćelije gde ćelija ima sposobnost da se diferencira u sva tri embrionalna klicina lista (endoderm, mezoderm i ektoderm).
[0534] Preveniranje: Kao što se ovde upotrebljava, termin "preveniranje" označava delimično ili potpuno odlaganje početka infekcije, bolesti, poremećaja i/ili stanja; delimično ili potpuno odlaganje početka jednog ili više simptoma, osobina, ili kliničkih manifestacija određene infekcije, bolesti, poremećaja, i/ili stanja; delimično ili potpuno odlaganje početka jednog ili
1
više simptoma, osobina, ili manifestacija određene infekcije, bolesti, poremećaja, i/ili stanja; delimično ili potpuno odlaganje progresije infekcije, određene bolesti, poremećaja, i/ili stanja; i/ili smanjenje rizika od razvoja patologije povezane sa infekcijom, bolešću, poremećajem, i/ili stanjem.
[0535] Prolek: Predmetna objava takođe uključuje prolekove jedinjenja koja su ovde opisana. Kao što se ovde upotrebljava, "prolekovi" označavaju bilo koju supstancu, molekul ili entitet koji je u obliku predikta za tu supstancu, molekul ili entitet da deluje kao terapeutik nakon hemijske ili fizičke izmene. Prolekovi mogu biti kovalentno vezani ili sekvestrirani na neki način i koji oslobađaju ili se konvertuju u aktivni deo leka pre, nakon ili posle primene subjektu sisaru. Prolekovi se mogu pripremiti modifikovanjem funkcionalnih grupa prisutnih u jedinjenjima na takav način da se modifikacije isecaju, bilo rutinskom manipulacijom ili in vivo, do roditeljskih jedinjenja. Prolekovi uključuju jedinjenja u kojima su hidroksilne, amino, sulfhidrilne, ili karboksilne grupe vezane za bilo koju grupu koja se, kada se primeni subjektu sisaru, iseca tako da formira slobodnu hidroksilnu, amino, sulfhidrilnu, ili karboksilnu grupu, respektivno. Priprema i upotreba prolekova se razmatra u T. Higuchi i V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol.14 of the A.C.S. Symposium Series, i u Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.
[0536] Proliferisati: Kao što se ovde upotrebljava, termin "proliferisati" znači rasti, proširivati ili povećavati ili uzrokovati brzi rast, proširivanje ili povećavanje. "Proliferativno" znači imati sposobnost proliferacije. "Anti-proliferativno" znači imati svojstva suprotna ili nepogodna proliferativnim svojstvima.
[0537] Progenitorska ćelija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "progenitorska ćelija" označava ćelije koje imaju veći razvojni potencijal u odnosu na ćeliju koju može dati diferencijacijom.
[0538] Mesto isecanja proteina: Kao što se ovde upotrebljava, "mesto isecanja proteina" označava mesto gde se može postići kontrolisano isecanje lanca amino-kiselina hemijskim, enzimskim ili fotohemijskim sredstvima.
[0539] Signal isecanja proteina: Kao što se ovde upotrebljava, "signal isecanja proteina" označava najmanje jednu amino-kiselinu koja obeležava ili markira polipeptid za isecanje.
[0540] Protein od interesa: Kao što se ovde upotrebljava, termini "proteini od interesa" ili "željeni proteini" uključuju one koji su ovde obezbeđeni i njihove fragmente, mutante, varijante, i alternacije.
1
[0541] Proksimalno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "proksimalno" znači da se nalazi bliže centru ili tački ili regionu od interesa.
[0542] Prečišćeno: Kao što se ovde upotrebljava, "prečistiti", "prečišćeno", "prečišćavanje" znači učiniti suštinski čistim ili očišćenim od neželjenih komponenti, prljavštine od materijala, primesa ili nesavršenosti.
[0543] Ponovna transfekcija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "ponovna transfekcija" označava transfekciju iste ćelijske kulture sa polinukleotidom, primarnim konstruktom ili mmRNK mnogo puta. Ćelijska kultura može biti transfektovana najmanje dva puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, najmanje 10 puta, najmanje 11 puta, najmanje 12 puta, najmanje 13 puta, najmanje 14 puta, najmanje 15 puta, najmanje 16 puta, najmanje 17 puta, najmanje 18 puta, najmanje 19 puta, najmanje 20 puta, najmanje 25 puta, najmanje 30 puta, najmanje 35 puta, najmanje 40 puta, najmanje 45 puta, najmanje 50 puta ili više.
[0544] Reprogramiranje: Kao što se ovde upotrebljava, "reprogramiranje" označava proces koji preokreće razvojni potencijal ćelije ili populacije ćelija.
[0545] Faktor reprogramiranja: Kao što se ovde upotrebljava, termin "faktor reprogramiranja" označava faktor izmene razvojnog potencijala kao što su protein, RNK ili mali molekul, čija ekspresija doprinosi reprogramiranju ćelije u manje diferencirano ili nediferencirano stanje.
[0546] Uzorak: Kao što se ovde upotrebljava, termin "uzorak" ili "biološki uzorak" označava podskup njegovih tkiva, ćelija ili sastavnih delova (npr. telesne tečnosti, uključujući, ali bez ograničavanja na krv, mukus, limfnu tečnost, sinovijalnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, pljuvačku, amnionsku tečnost, krv amnionske vrpce, urin, vaginalnu tečnost i spermu). Uzorak dodatno može uključivati homogenat, lizat ili ekstrakt pripremljen iz celog organizma ili podskupa njegovih tkiva, ćelija ili sastavnih delova, ili njegove frakcije ili dela, uključujući, ali bez ograničavanja na, na primer, plazmu, serum, spinalnu tečnost, limfnu tečnost, spoljne delove kože, respiratornog, crevnog i genitourinarnog trakta, suze, pljuvačku, mleko, krvne ćelije, tumore, organe. Uzorak dodatno označava medijum, kao što je hranljivi bujon ili gel, koji može sadržati ćelijske komponente, kao što su proteini ili molekul nukleinske kiseline.
[0547] Signalne sekvence: Kao što se ovde upotrebljava, fraza "signalne sekvence" označava sekvencu koja može usmeriti transport ili lokalizaciju proteina.
1
[0548] Pojedinačna jedinična doza: Kao što se ovde upotrebljava, "pojedinačna jedinična doza" je doza bilo kog terapeutika koji se primenjuje u jednoj dozi/u jednom trenutku/jednim putem/na jednoj tački kontakta, tj. događaj pojedinačne primene.
[0549] Sličnost: Kao što se ovde upotrebljava, termin "sličnost" označava ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između molekula polinukleotida (npr. DNK molekula i/ili RNK molekula) i/ili između molekula polipeptida. Proračun procenta sličnosti polimernih molekula jedog sa drugim može se izvesti na isti način kao i izračunavanje procenta identičnosti, s tim što proračun procenta sličnosti uzima u obzir konzervativne supstitucije kao što je poznato u struci.
[0550] Somatska ćelija: Kao što se ovde upotrebljava, "somatske ćelije" označavaju bilo koju ćeliju osim germinativne ćelije, ćelije prisutne u ili dobijene iz preimplantacionog embriona, ili ćelije koja rezultuje iz proliferacije takve ćelije in vitro.
[0551] Somatska matična ćelija: Kao što se ovde upotrebljava, "somatska matična ćelija" označava bilo koju pluripotentnu ili multipotentnu matičnu ćeliju poreklom iz neembrionalnog tkiva, uključujući fetalno, juvenilno i adultno tkivo.
[0552] Somatska pluripotentna ćelija: Kao što se ovde upotrebljava, "somatska pluripotentna ćelija" označava somatsku ćeliju kojoj je razvojni potencijal izmenjen u odnosu na pluripotentno stanje.
[0553] Podeljena doza: Kao što se ovde upotrebljava, "podeljena doza" je podela pojedinačne jedinične doze ili ukupne dnevne doze na dve ili više doza.
[0554] Stabilno: što se ovde upotrebljava, "stabilno" označava jedinjenje koje je dovoljno robustno da preživi izolaciju do korisnog stepena čistoće iz reakcione smeše, i poželjno je sposobno da se formuliše u efikasni terapijski agens.
[0555] Stabilizovano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "stabilizovati", "stabilizovano", "stabilizovan region" znači učiniti stabilnim ili postati stabilno.
[0556] Matična ćelija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "matična ćelija" označava ćeliju u nediferenciranom ili delimično diferenciranom stanju koja ima svojstvo samoobnavljanja i ima razvojni potencijal da se diferencira u više tipova ćelija, bez specifičnog razvojnog potencijala. Matične ćelije mogu biti sposobne za proliferaciju i stvaranje više takvih matičnih ćelija uz održavanje svog razvojnog potencijala.
[0557] Subjekt: Kao što se ovde upotrebljava, termin "subjekt" ili "pacijent" označava bilo koji organizam na koji se kompozicija u skladu sa pronalaskom može primeniti, npr. u eksperimentalne, dijagnostičke, profilaktičke, i/ili terapijske svrhe. Tipični subjekti uključuju životinje (npr. sisare kao što su miševi, pacovi, zečevi, ne-humani primati, i ljudi) i/ili biljke.
14
[0558] Suštinski: Kao što se ovde upotrebljava, termin "suštinski" označava kvalitativni uslov za iskazivanje ukupnog ili skoro ukupnog obima ili stepena karakteristike ili svojstva od interesa. Osoba sa prosečnim iskustvom u biološkoj struci će podrazumevati da biološki i hemijski fenomeni retko, ako ikad, dođu do završetka i/ili do potpunog završavanja ili postignu ili izbegnu apsolutni rezultat. Termin "suštinski" se prema tome ovde upotrebljava za hvatanje potencijalnog nedostatka potpunog završetka svojstvenog mnogim biološkim i hemijskim fenomenima.
[0559] Suštinski jednako: Kao što se ovde upotrebljava kada se odnosi na vremenske razlike između doza, termin znači plus/minus 2%.
[0560] Suštinski istovremeno: Kao što se ovde upotrebljava kada se odnosi na mnoštvo doza, termin znači unutar 2 sekunde.
[0561] Pati od: Pojedincu koji "pati od" od bolesti, poremećaja, i/ili stanja dijagnostikovan je ili pokazuje jedan ili više simptoma bolesti, poremećaja, i/ili stanja.
[0562] Podložno: Pojedincu koji je "podložan" bolesti, poremećaju, i/ili stanju nije dijagnostikovan i/ili možda ne pokazuje simptome bolesti, poremećaja, i/ili stanja, ali ima sklonost ka razvoju bolesti ili njenih simptoma. U nekim primerima izvođenja, pojedinac koji je podložan bolesti, poremećaju, i/ili stanju (na primer, kanceru) može biti okarakterisan jednim ili više od sledećeg: (1) genetička mutacija povezana sa razvojem bolesti, poremećaja, i/ili stanja; (2) genetički polimorfizam povezan sa razvojem bolesti, poremećaja, i/ili stanja; (3) povećana i/ili smanjena ekspresija i/ili aktivnost proteina i/ili nukleinske kiseline povezane sa bolešću, poremećajem, i/ili stanjem; (4) navike i/ili stilovi života povezani sa razvojem bolesti, poremećaja, i/ili stanja; (5) porodična istorija bolesti, poremećaja, i/ili stanja; i (6) izloženost i/ili infekcija mikroorganizmom povezanim sa razvojem bolesti, poremećaja, i/ili stanja. U nekim slučajevima, pojedinac koji je podložan bolesti, poremećaju, i/ili stanju razviće bolest, poremećaj, i/ili stanje. U nekim slučajevima, pojedinac koji je podložan bolesti, poremećaju, i/ili stanju neće razviti bolest, poremećaj, i/ili stanje.
[0563] Neprekidno oslobađanje: Kao što se ovde upotrebljava, termin "neprekidno oslobađanje" označava profil oslobađanja farmaceutske kompozicije ili jedinjenja koji je u skladu sa stopom oslobađanja tokom specifičnog vremenskog perioda.
[0564] Sintetičko: Termin "sintetički" znači proizveden, pripremljen, i/ili napravljen čovekovom rukom. Sinteza polinukleotida ili polipeptida ili drugih molekula iz predmetne objave može biti hemijska ili enzimska.
[0565] Ciljane ćelije: Kao što se ovde upotrebljava, "ciljane ćelije" označavaju bilo koju jednu ili više ćelija od interesa. Ćelije se mogu naći in vitro, in vivo, in situ ili u tkivu ili organu organizma. Organizam može biti životinja, poželjno sisar, poželjnije čovek i najpoželjnije pacijent.
[0566] Terapijski agens: Termin "terapijski agens" označava bilo koji agens koji, kada se primenjuje subjektu, ima terapijski, dijagnostički, i/ili profilaktički efekat i/ili izaziva željeni biološki i/ili farmakološki efekat.
[0567] Terapijski efikasna količina: Kao što se ovde upotrebljava, termin "terapijski efikasna količina" znači količinu agensa koji treba da se isporuči (npr. nukleinska kiselina, lek, terapijski agens, dijagnostički agens, profilaktički agens itd.) koja je dovoljna, kada se primenjuje subjektu koji pati od ili je podložan infekciji, bolesti, poremećaju, i/ili stanju, da leči, poboljša simptome, dijagnostikuje, prevenira, i/ili odloži početak infekcije, bolesti, poremećaja, i/ili stanja.
[0568] Terapijski efikasan ishod: Kao što se ovde upotrebljava, termin "terapijski efikasan ishod" znači ishod koji je dovoljan kod subjekta koji pati od ili je podložan infekciji, bolesti, poremećaju, i/ili stanju, da leči, poboljša simptome, dijagnostikuje, prevenira, i/ili odloži početak infekcije, bolesti, poremećaja, i/ili stanja.
[0569] Ukupna dnevna doza: Kao što se ovde upotrebljava, "ukupna dnevna doza" je količina koja se daje ili propisuje u periodu od 24 sata. Može se primeniti kao pojedinačna jedinična doza.
[0570] Totipotentnost: Kao što se ovde upotrebljava, "totipotentnost" označava ćeliju sa razvojnim potencijalom da napravi sve ćelije koje se nalaze u telu odraslih kao i vanembrionalna tkiva, uključujući placentu.
[0571] Transkripcioni faktor: Kao što se ovde upotrebljava, termin "transkripcioni faktor" označava DNK vezujući protein koji reguliše transkripciju DNK u RNK, na primer, pomoću aktivacije ili potiskivanja transkripcije. Neki transkripcioni faktori utiču sami na regulaciju transkripcije, dok drugi deluju zajedno sa drugim proteinima. Neki transkripcioni faktor može i aktivirati i potisnuti transkripciju pod određenim uslovima. Generalno, transkripcioni faktori vezuju specifičnu ciljnu sekvencu ili sekvence veoma slične specifičnoj konsenzus sekvenci u regulatornom regionu ciljnog gena. Transkripcioni faktori mogu regulisati transkripciju ciljnog gena sami ili u kompleksu sa drugim molekulima.
[0572] Transkripcija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "transkripcija" označava postupke za introdukovanje egzogenih nukleinskih kiselina u ćeliju. Postupci transfekcije uključuju, ali nisu ograničeni na, hemijske postupke, fizičke tretmane i katjonske lipide ili smeše.
[0573] Transdiferencijacija: Kao što se ovde upotrebljava, "transdiferencijacija" označava sposobnost diferenciranih ćelija jednog tipa da izgube identifikacione karakteristike i da promene svoj fenotip u onaj drugih potpuno diferenciranih ćelija.
[0574] Lečiti: Kao što se ovde upotrebljava, termin "lečiti" označava delimično ili potpuno ublažavanje, oporavljanje, poboljšanje, olakšanje, odlaganje početka, sprečavanje progresije, redukovanje težine, i/ili redukovanje incidence jednog ili više simptoma ili osobina određene infekcije, bolesti, poremećaja, i/ili stanja. Na primer, "lečiti" kancer može označavati inhibiciju preživljavanja, rasta, i/ili širenja tumora. Lečenje se može primeniti na subjekta koji ne pokazuje znake bolesti, poremećaja, i/ili stanja i/ili na subjekta koji pokazuje samo rane znake bolesti, poremećaja, i/ili stanja u svrhu smanjenja rizika razvoja patologije povezane sa bolešću, poremećajem, i/ili stanjem.
[0575] Nemodifikovano: Kao što se ovde upotrebljava, "nemodifikovano" označava bilo koju supstancu, jedinjenje ili molekul pre nego što se na bilo koji način promeni. Nemodifikovan može, ali ne uvek, označavati divlji tip ili nativni oblik biomolekula. Molekuli mogu biti podvrgnuti nizu modifikacija pri čemu svaki modifikovani molekul može poslužiti kao "nemodifikovani" početni molekul za naknadnu modifikaciju.
Ekvivalenti i obim
[0576] Oni sa iskustvom u struci će prepoznati, ili moći da utvrde upotrebom samo rutinskog eksperimentisanja, mnoge ekvivalente specifičnim primerima izvođenja u skladu sa ovde opisanim pronalaskom. Obim predmetnog pronalaska nije namenjen da bude ograničen na prethodni Opis, već je kao što je izneto u priloženim patentnim zahtevima.
[0577] U patentnim zahtevima, neodređeni i određeni članovi mogu značiti jedan ili više od jednog, osim ukoliko nije naznačeno suprotno ili na drugi način očigledno iz konteksta. Patentni zahtevi ili opisi koji uključuju "ili" između jednog ili više članova grupe smatraju se zadovoljenim ukoliko je jedan, više od jednog, ili su svi članovi grupe prisutni u, korišćeni u, ili na neki drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak osim ukoliko nije naznačeno suprotno ili na drugi način očigledno iz konteksta. Pronalazak uključuje primere izvođenja u kojima je tačno jedan član grupe prisutan u, korišćen u, ili na neki drugi način relevantan za dati proizvod ili postupak. Pronalazak uključuje primere izvođenja u kojima je više od jednog, ili su svi članovi grupe prisutni u, korišćeni u, ili na neki drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak.
14
[0578] Takođe se napominje da je termin "koji sadrži" namenjen da bude otvoren i dozvoljava ali ne zahteva inkluziju dopunskih elemenata ili koraka. Kada se ovde upotrebljava termin "koji sadrži", termin "koji se sastoji od" je stoga takođe obuhvaćen i objavljen.
[0579] Tamo gde su dati opsezi, krajnje tačke su uključene. Pored toga, treba razumeti da, osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili drugačije očigledno iz konteksta i razumevanja onih sa prosečnim iskustvom u struci, vrednosti izražene kao opsezi mogu pretpostaviti bilo koju specifičnu vrednost ili podopseg unutar navedenih opsega u različitim primerima izvođenja pronalaska, do desetine jedinice donje granice opsega, osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.
PRIMERI
Primer 1. DNK konstrukti za proizvodnju sintetičkog polinukleotida i sgRNK
[0580] Sintetički polinukleotidi i sgRNK iz objave su proizvedeni putem kreiranja DNK konstrukta; PCR amplifikacije cDNK templata; in vitro transkripcije cDNK templata (upotrebom, u nekim slučajevima, modifikovanih nukleotida); ukoliko je potrebno, post-in vitro transkripcije enzimskog dodavanja poli-A repa i/ili dodavanja 5' kape; i prečišćavanja i analize.
[0581] DNK konstrukt za sintetički polinukleotid uključuje otvoren okvir čitanja. Otvoren okvir čitanja (ORF) koji kodira protein povezan sa CRISPR, npr. dCAS9 ili dCAS9-aktivator fuzioni protein, može biti omeđen 5' netranslatiranim regionom (UTR) koji može sadržati snažan Kozak translacioni signal inicijacije i/ili alfa-globin 3' UTR koji može uključivati oligo(dT) sekvencu za dodavanje poli-A repa po templatu.
[0582] ORF može takođe uključivati različite uzvodne ili nizvodne adicije (kao što su, ali nije ograničeno na, β-globin, oznake itd.) koje se mogu naručiti iz servisa za optimizacije, kao što je, ali ograničeno na, DNA2.0 (Menlo Park, CA) i mogu sadržati više klonirajućih mesta koja mogu imati XbaI prepoznavanje.
[0583] DNK konstrukt za sgRNK iz objave napravljen je upotrebom sličnih postupaka. Plazmidni konstrukt uključuje insert sa sgRNK sekvencom koja uključuje N(20-25) vodeću sekvencu i vodeću sekvencu skele omeđeno na 5' kraju sa RNK polimeraza specifičnim 5' UTR, npr. T7 polimeraza 5' UTR.
[0584] DNK konstrukt za sintetički polinukleotid i/ili sgRNK je transformisan u E. coli. Za predmetnu objavu upotrebljene su NEB DH5-alfa kompetentne E. coli. Transformacije su izvedene u skladu sa uputstvima NEB upotrebom 100 ng plazmida. Protokol je sledeći:
1. Odmrznuti tubu NEB 5-alfa kompetentnih E. coli ćelija na ledu tokom 10 minuta. 2. Dodati 1-5 µl koji sadrže 1 pg-100 ng plazmidne DNK u ćelijsku smešu. Pažljivo protresti tubu 4-5 puta kao bi se izmešale ćelije i DNK. Ne vrtložiti.
3. Staviti smešu na led tokom 30 minuta. Ne mešati.
4. Toplotni udar na 42 °C tokom tačno 30 sekundi. Ne mešati.
5. Staviti na led 5 minuta. Ne mešati.
6. Pipetirati 950 µl SOC na sobnoj temperaturi u smešu.
7. Staviti na 37 °C tokom 60 minuta. Snažno mućkati (250 o/min) ili rotirati.
8. Zagrejati selekcione ploče na 37 °C.
9. Temeljno promešati ćelije protresanjem tube i okretanjem.
[0585] Alternativno, inkubirati na 30 °C tokom 24-36 sati ili 25 °C tokom 48 sati.
[0586] Jedna kolonija se zatim upotrebljava za inokulaciju 5 ml LB medijuma za rast upotrebom odgovarajućeg antibiotika i zatim se omogući da raste (250 o/min, 37 °C) tokom 5 sati. Ovo se zatim upotrebljava za inokulaciju 200 ml medijuma za kulturu i omogućava se da raste preko noći pod istim uslovima.
[0587] Kako bi se izolovao plazmid (do 850 µg), izvodi se maxi prep upotrebom Invitrogen PURELINK™ HiPure Maxiprep kompleta (Carlsbad, CA), prateći uputstva proizvođača.
[0588] Kako bi se generisala cDNK za in vitro transkripciju (IVT), plazmid se prvo linearizuje upotrebom restrikcionog enzima kao što je XbaI. Tipična restrikciona digestija sa XbaI će sadržati sledeće: plazmid 1,0 µg; 10x pufer 1,0 µl; XbaI 1,5 µl; dH2O do 10 µl; inkubirano na 37 °C tokom 1 sata. Ukoliko se izvodi u laboratorijskoj razmeri (<5 μg), reakcija se čisti upotrebom Invitrogen PURELINK™ PCR mikro kompleta (Carlsbad, CA) prema uputstvima proizvođača. Prečišćavanja većih razmera će možda morati da se urade sa proizvodom koji ima veći kapacitet punjenja, kao što je Invitrogen standardni PURELINK™ PCR komplet (Carlsbad, CA). Nakon čišćenja, linearizovani vektor je kvantifikovan upotrebom NanoDrop i analiziran kako bi se potvrdila linearizacija upotrebom elektroforeze na agaroznom gelu.
Primer 2. PCR za proizvodnju cDNK
14
[0589] Linearizovani plazmid (koji kodira sintetički polinukleotid koji kodira protein povezan sa CRISPR ili koji kodira sgRNK) je amplifikovan upotrebom PCR za pripremu cDNK, npr. transkripcionog templata. PCR procedure za pripremu cDNK su izvedene upotrebom 2x KAPA HIFI™ HotStart ReadyMix kompanije Kapa Biosystems (Woburn, MA). Ovaj sistem uključuje 2x KAPA ReadyMix12,5 µl; nizvodni prajmer (10 uM); 0,75 μl; uzvodni prajmer (10 uM) 0,75 µl; Templat cDNK; 100 ng; i dH2O razblaženu na 25,0 µl. Reakcioni uslovi su na 95 °C tokom 5 minuta i 25 ciklusa od 98 °C tokom 20 sekundi, zatim 58 °C tokom 15 sekundi, zatim 72 °C tokom 45 sekundi, zatim 72 °C tokom 5 minuta zatim 4 °C do završetka.
[0590] U nekim primerima izvođenja, uzvodni prajmer iz trenutnog pronalaska inkorporiše poli-T120za poli-A120u mRNK. Drugi uzvodni prajmeri sa dužim ili kraćim poli(T) traktovima mogu se upotrebljavati za podešavanje dužine poli(A) repa u mRNK.
[0591] Reakcija je očišćena upotrebom Invitrogen PURELINK™ PCR mikro kompleta (Carlsbad, CA) prema uputstvima proizvođača (do 5 µg). Veće reakcije će zahtevati čišćenje upotrebom proizvoda sa većim kapacitetom. Nakon čišćenja, cDNK je kvantifikovana upotrebom NanoDrop i analizirana elektroforezom na agaroznom gelu kako bi se potvrdilo da je cDNK očekivane veličine. cDNK je zatim podvrgnuta analizi sekvenciranja pre nego što se prešlo na reakciju in vitro transkripcije.
Primer 3. In vitro transkripcija (IVT)
[0592] Amplifikovani cDNK proizvod je upotrebljen kao templat za in vitro transkripciju kako bi se generisali sintetički polinukleotidi i/ili sintetičke sgRNK. Ulazna smeša nukleotid trifosfata (NTP) je napravljena u kući upotrebom prirodnih i neprirodnih NTP. Reakcija in vitro transkripcije generiše modifikovane sintetičke polinukleotide i/ili sgRNK.
[0593] Tipična reakcija in vitro transkripcije uključuje sledeće:
Templat cDNK 1,0 µg
10x transkripcioni pufer (400 mM Tris-HCl pH 8,0, 190 mM MgCl2, 50 mM
DTT, 10 mM spermidin) 2,0 µl
Prilagođeni NTP (25 mM svakog) 7,2 µl
Inhibitor RNaze 20 U
14
T7 RNK polimeraza 3000 U
dH2O Do 20,0 µl
Inkubacija na 37 °C tokom 3 h-5 h.
[0594] Sintetički polinukleotid i/ili sintetička sgRNK mogu biti modifikovani da redukuju urođeni ćelijski imunski odgovor. Modifikacije za redukovanje ćelijskog odgovora mogu uključivati one ovde opisane, npr. pseudouridin (ψ) i 5-metil-citidin (5meC, 5mc ili m<5>C). (Videti, Kariko K et al. Immunity 23:165-75 (2005), Kariko K et al. Mol Ther 16:1833-40 (2008), Anderson BR et al. NAR (2010).
[0595] Sirova IVT smeša može biti skladištena na 4 °C preko noći za čišćenje sledećeg dana.
1 U DNaze bez RNaze je zatim upotrebljena za digestiju originalnog templata. Posle 15 minuta inkubacije na 37 °C, mRNK je prečišćena upotrebom Ambion MEGACLEAR™ kompleta (Austin, Texas) prateći uputstva proizvođača. Ovaj komplet može prečistiti do 500 µg RNK. Nakon čišćenja, RNK je kvantifikovana upotrebom NanoDrop i analizirana elektroforezom na agaroznom gelu kako bi se potvrdilo da je RNK odgovarajuće veličine i da nije došlo do degradacije RNK.
Primer 4. Reakcija dodavanja poliA repa
[0596] U nekim primerima izvođenja, sintetički polinukleotid je sintetisan bez poli-A repa, tj. cDNK konstrukt je amplifikovan bez poli-T. Bez poli-T u cDNK, mora se izvesti reakcija dodavanja poli-A repa pre čišćenja krajnjeg proizvoda. Ovo je postignuto mešanjem IVT RNK sa kapom (100 µl); inhibitora RNaze (20 U); 10x pufera za dodavanje repa (0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 2,5 M NaCl, 100 mM MgCl2) (12,0 µl); 20 mM ATP (6,0 μl); poli-A polimeraze (20 U); dH2O do 123,5 µl i inkubiranjem na 37 °C tokom 30 minuta. Ukoliko je poli-A rep već u transkriptu, tada se reakcija dodavanja repa može preskočiti i nastaviti direktno do čišćenja sa Ambion MEGACLEAR™ kompletom (Austin, Texas) (do 500 µg). Poli-A polimeraza je poželjno rekombinantni enzim eksprimiran u kvascu.
[0597] Za ovde izvedene i opisane studije, poli-A rep je kodiran u IVT templatu tako da bude dugačak 160 nukleotida. Međutim, trebalo bi razumeti da procesnost ili integritet reakcije dodavanja poliA repa ne mora uvek rezultovati sa tačno 160 nukleotida. Dakle, poliA repovi od približno 160 nukleotida, npr. oko 150-165, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 ili 165 su unutar obima pronalaska.
14
Primer 5. Dodavanje 5' kape sintetičkom polinukleotidu
[0598] Dodavanje 5' kape sintetičkom polinukleotidu (modifikovana RNK) može biti dovršeno istovremeno tokom reakcije in vitro-transkripcije ili alternativno enzimski dodata kapa posle transkripcije.
[0599] Dodavanje 5' kape sintetičkom polinukleotidu (modifikovana RNK) može biti dovršeno istovremeno tokom reakcije in vitro-transkripcije upotrebom sledećih hemijskih analoga RNK kape za generisanje strukture 5'-guanozin kape u skladu sa protokolima proizvođača: 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5') G [ARCA kapa];G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA).
[0600] Dodavanje 5' kape modifikovanoj RNK može biti dovršeno posttranskripciono upotrebom Vaccinia Virus Capping Enzyme kako bi se generisala "Kapa 0" struktura: m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). Struktura kape 1 može biti generisana upotrebom i Vaccinia Virus Capping Enzyme i 2'-O metil-transferaze kako bi se generisala: m7G(5')ppp(5')G-2'-O-metil. Struktura kape 2 može biti generisana iz strukture kape 1 praćeno 2'-O-metilacijom 5'-pretposlednjeg nukleotida upotrebom 2'-O metiltransferaze. Struktura kape 3 može biti generisana iz strukture kape 2, praćeno 2'-O-metilacijom 5'-pre-pretposlednjeg nukleotida upotrebom 2'-O metil-transferaze. Enzimi su poželjno poreklom iz rekombinantnog izvora.
[0601] Posttranskripciono dodavanje kape sintetičkom polinukleotidu izvedeno je na sledeći način. Reakciona smeša uključuje: IVT RNK 60 µg-180 µg i dH2O do 72 µl. Smeša je inkubirana na 65 °C tokom 5 minuta kako bi se denaturisala RNK, i zatim je odmah preneta na led.
[0602] Protokol zatim uključuje mešanje 10x pufera za dodavanje kape (0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 60 mM KCl, 12,5 mM MgCl2) (10,0 µl); 20 mM GTP (5,0 μl); 20 mM S-adenozil metionina (2,5 μl); inhibitora RNaze (100 U); 2'-O-metil-transferaze (400 U); Vaccinia Capping Enzyme (guanilil transferaza) (40 U); dH2O (do 28 µl); i inkubiranje na 37 °C tokom 30 minuta za 60 µg RNK ili do 2 sata za 180 µg RNK.
[0603] Sintetički polinukleotid sa kapom je zatim prečišćen upotrebom Ambion MEGACLEAR™ kompleta (Austin, TX) prateći uputstva proizvođača. Nakon čišćenja, sintetički polinukleotid sa kapom je kvantifikovan upotrebom NANODROP™ (ThermoFisher, Waltham, MA) i analiziran elektroforezom na agaroznom gelu kako bi se potvrdilo da je RNK odgovarajuće veličine i da nije došlo do degradacije RNK. RNK
14
proizvod može takođe biti sekvenciran pokretanjem PCR nakon reverzne transkripcije kako bi se generisala cDNK za sekvenciranje.
[0604] Efikasnost dodavanja kape sintetičkom polinukleotidu je testirana upotrebom brojnih eksperimentalnih tehnika. Sintetički polinukleotid sa kapom je transfektovan u ćelije i količina proteina povezanog sa CRISPR je analizirana upotrebom, npr. ELISA. Viši nivoi ekspresije proteina koreliraju sa višom efikasnošću dodavanja kape. Sintetički polinukleotid sa kapom je pušten na elektroforezu na agaroza i urea gelu; sintetički polinukleotid sa jednom, konsolidovanom trakom pomoću elektroforeze odgovara proizvodu više čistoće u poređenju sa sintetičkim polinukleotidom sa više traka ili prugastih traka. Sintetički polinukleotid sa kapom je pušten na HPLC koloni; sintetički polinukleotid sa jednim HPLC pikom odgovara proizvodu više čistoće. Sintetički polinukleotid sa kapom je transfektovan u humane primarne keratinocite u više koncentracija. Na 6, 12, 24 i 36 sati posle transfekcije, testirana je pomoću ELISA količina proinflamatornih citokina, kao što su TNF-alfa i IFN-beta sekretovanih u medijum za kulturu. Sintetičke mRNK koje sekretuju viši nivo proinflamatornih citokina u medijum odgovaraju sintetičkoj mRNK koja sadrži imunoaktivirajuću strukturu kape. Sintetički polinukleotid sa kapom je analiziran na efikasnost reakcije dodavanja kape pomoću LC-MS posle tretmana mRNK sa kapom nukleazom. Tretman nukleazom mRNK sa kapom daje smešu slobodnih nukleotida i strukturu 5'-5-trifosfatne kape koja se može detektovati pomoću LC-MS. Količina proizvoda sa kapom na LC-MS spektrima je izražena kao procenat ukupne mRNK iz reakcije i odgovarala bi efikasnosti reakcije dodavanja kape. Struktura kape sa višom efikasnošću reakcije dodavanja kape imala bi višu količinu proizvoda sa kapom pomoću LC-MS.
Primer 6. Postupci za analizu sintetičkih polinukleotida i sintetičke sgRNK
[0605] Elektroforeza na agaroznom gelu modifikovane RNK ili RT PCR proizvoda: Pojedinačne modifikovane RNK (200-400 ng u zapremini od 20 µl) ili reverzno transkribovani PCR proizvodi (200-400 ng) su postavljeni u bunarić na nedenaturišućem 1,2% Agaroza E-Gelu (Invitrogen, Carlsbad, CA) i pušteni tokom 12-15 minuta u skladu sa protokolom proizvođača.
[0606] Kvantifikacija Nanodrop modifikovane RNK i UV spektralni podaci: Modifikovane RNK u TE puferu (1 µl) su upotrebljene za očitavanja Nanodrop UV apsorbance za kvantifikaciju prinosa svake modifikovane RNK iz reakcije in vitro transkripcije.
14
Primer 7. Postupak pregleda za ekspresiju proteina
[0607] Posle transfekcije ćelija sa sintetičkim polinukleotidom koji kodira protein povezan sa CRISPR, analizirana je ekspresija proteina.
A. Elektrosprej jonizacija
[0608] Biološki uzorak koji može sadržati proteine kodirane sintetičkim polinukleotidima koji se primenjuju ćelijama ili subjektu pripremljen je i analiziran u skladu sa protokolom proizvođača za elektrosprej jonizaciju (ESI) upotrebom 1, 2, 3 ili 4 masena analizatora. Biološki uzorak može takođe biti analiziran upotrebom tandem sistema ESI masena spektrometrija.
[0609] Obrasci proteinskih fragmenata, ili celih proteina, upoređeni su sa poznatim kontrolama za dati protein i identičnost je određena poređenjem.
B. Matriksom potpomognuta laserska desorpcija/jonizacija
[0610] Biološki uzorak koji može sadržati proteine kodirane sintetičkim polinukleotidima koji se primenjuju ćelijama ili subjektu pripremljen je i analiziran u skladu sa protokolom proizvođača za matriksom potpomognutu lasersku desorpciju/jonizaciju (MALDI).
[0611] Obrasci proteinskih fragmenata, ili celih proteina, upoređeni su sa poznatim kontrolama za dati protein i identičnost je određena poređenjem.
C. Tečna hromatografija-masena spektrometrija-masena spektrometrija
[0612] Biološki uzorak, koji može sadržati proteine kodirane sintetičkim polinukleotidima, može biti tretiran enzimom tripsinom za digestiju proteina sadržanih unutar njega. Rezultujući peptidi su analizirani pomoću tečne hromatografije-masene spektrometrije-masene spektrometrije (LC/MS/MS). Peptidi su fragmentisani u masenom spektrometru kako bi se dobili dijagnostički obrasci koji se mogu upariti sa bazama podataka sekvenci proteina putem računarskih algoritama. Digestirani uzorak može biti razblažen kako bi se postigao 1 ng ili manje početnog materijala za dati protein. Biološki uzorci koji sadrže jednostavnu pufersku pozadinu (npr. voda ili isparljive soli) podložni su direktnoj digestiji u rastvoru; složenije
1
pozadine (npr. deterdžent, neisparljive soli, glicerol) zahtevaju dopunski korak čišćenja kako bi se olakšala analiza uzorka.
[0613] Obrasci proteinskih fragmenata, ili celih proteina, upoređeni su sa poznatim kontrolama za dati protein i identičnost je određena poređenjem.
Primer 8. Mikrofiziološki sistemi
[0614] Sintetički polinukleotidi koji kodiraju proteine povezane sa CRISPR formulirani su upotrebom jednog od ovde opisanih postupaka, kao što su u puferu, lipidnim nanočesticama i PLGA. Ove formulacije su zatim primenjene na ili dovedene u kontakt sa mikrofiziološkim sistemima kreiranim od čipova organa kao što je opisano u međunarodnim publikacijama br. WO2013086502, WO2013086486 i WO2013086505.
Primer 9: Dizajn DNK templata za sintetičke polinukleotide koji kodiraju Cas9 i dCas9-efektorski domen fuzione proteine
[0615] Plazmidi su dizajnirani za upotrebu kao in vitro transkripcioni templati za proizvodnju hemijski sintetičkih polinukleotida kao što je ovde opisano. Dva plazmida su dizajnirana da sadrže Cas9 optimizovan za kodon kao što je opisano od strane Cong i Mali, respektivno (Science (2013) 339:819-23 i Science (2013) 339:823-6.) Prvi plazmid je kodirao FLAG označeni Cas9 i drugi plazmid je kodirao neoznačen Cas9. Dva plazmida su dizajnirana da sadrže dcas9 optimizovan za kodon koji je fuzionisan za različite efektorske domene (videti Cell (2013) 154:442-51 i Nature Methods (2013) 10:977-979). Kodirajuće sekvence su stavljene pod kontrolu promotora T7 polimeraze za in vitro transkripciju modifikovane mRNK.
[0616] Sekvence Cas9, dCAS9 gena i efektorskih domena nalaze se u Tabelama u nastavku.
[0617] Upotrebljene su sledeće 5'UTR i 3'UTR sekvence:
1 1
[0618] Kreirani su sledeći konstrukti: (3) dCas9-HA tag-2xSV40NLS-KRAB i (4) dCas9-NLS-FLAG-VP64.
[0619] U drugim primerima izvođenja, sekvenca-kodirajući Streptococcus pyogenes dCas9 gen optimizovan za kodon može biti fuzionisan sa HA-oznakom, jednim ili više NLS (npr. SV40 NLS, na primer, jedan ili dva NLS, opciono na N- i/ili C-terminusu) i/ili oznakom za detekciju (npr. HA oznaka, FLAG oznaka, tagBFP, ili slično). Bilo šta od prethodno navedenog može biti predstavljeno samo ili u kombinaciji sa efektorskim domenom (KRAB, CSD, WRPW, VP64, ili p65AD domeni) u Cas9 konstruktima iz pronalaska, na primer, radi lakšeg povećanja ili smanjenja ekspresije). Sekvence različitih Cas9, dCAS9 gena i efektorskih domena nalaze se u Tabelama u nastavku.
[0620] Ekspresija Cas9 ili dCas9 može biti regulisana dodatno projektovanjem miR regulatornih sekvenci u UTR različitih konstrukata. Dva konstrukta koji sadrže regulatornu sekvencu miR-122 napravljeni su zamenom standardnog 3' UTR sa 3' UTR koji sadrži miR-122 regulatorno mesto. miR-122 je visoko eksprimiran u hepatocitima i ne u drugim tkivima; prema tome je translacija mRNK koja sadrži miR-122 regulatorna (vezujuća) mesta u svom 3' UTR selektivno smanjena u hepatocitima ali ne u drugim ćelijama.
[0621] Dizajnirani su sledeći konstrukti: (5) dCas9-KRAB-miR-122 i (6) dCas9-NLS-FLAG-VP64-miR-122).
[0622] Konstrukti 1-4 (DNK kasete) su sintetisani i insertovani u vektor (pJ364 iz DNA2.0, Inc., Menlo Park, CA). Plazmid je transfektovan u E. coli kao što je prethodno opisano, plazmidna DNK je prečišćena i linearizovana upotrebom restrikcionog enzima (XbaI). Linearizovani plazmid je PCR amplifikovan i upotrebljen kao templat za in vitro transkripciju za proizvodnju sintetičkih polinukleotida iz pronalaska.
Primer 10: Dizajn DNK templata za sintetičke sgRNK koji ciljno deluju na VEGF.
[0623] Četiri konstrukta od kojih svaki kodira sgRNK koja ciljno deluje na gen od interesa, tj. VEGF gen, kreirana su za upotrebu kao templati za in vitro transkripciju.
[0624] Svaki konstrukt je uključivao 5'UTR (T7), GGG, sekvencu od 20-25 nukleotida komplementarnu sekvenci uzvodno od transkripcionog starta VEGF gena, i sekvencu skele vodeće RNK. Sekvence VEGF sgRNK zasnovane su na Maeder et al.
[0625] Sledeća sekvenca je upotrebljena kao 5'UTR sekvenca:
1 2
[0626] Kreirana su sledeća četiri sgRNK konstrukta; boldovane sekvence u kurzivu su one koje su komplementarne sa VEGF genom.
Sekvenca VEGF V1 sgRNK konstrukta
Sekvenca VEGF V3 sgRNK konstrukta
[0627] Četiri konstrukta (DNK kasete) su sintetisana i insertovana u vektor (pJ224 iz DNA2.0, Inc., Menlo Park, CA). Plazmid je transfektovan u E. coli kao što je prethodno opisano i plazmidna DNK je prečišćena i linearizovana upotrebom restrikcionog enzima (XbaI). Linearizovani plazmid je PCR amplifikovan kao što je ovde opisano i upotrebljen je kao templat za in vitro transkripciju za proizvodnju sintetičke sgRNK.
Primer 11: Proizvodnja sintetičkih polinukleotida i sgRNK putem in vitro transkripcije.
1
[0628] Upotrebom ovde opisanih postupaka, dva sintetička polinukleotida koji kodiraju Cas9, dva sintetička polinukleotida koji kodiraju dCAS9-efektorski gen fuzione proteine, i četiri sintetičke sgRNK koje ciljno deluju na VEGF sintetisane su upotrebom in vitro transkripcije konstrukata koji su prethodno opisani. Sintetisani su sintetički polinukleotidi i sintetičke sgRNK sa sledećim sekvencama.
mRNK sekvenca dCas9-HA tag-2xSV40NLS-KRAB
1 4
1
�
1
mRNK sekvenca dCas9-VP64-miR122
1
�
1
11
��
VEGF V1 sgRNK
VEGF V3 sgRNK
In vitro ekspresija proteina povezanih sa CRISPR iz mRNK konstrukata
1
[0629] HeLa ćelije su transfektovane sa različitim označenim dCas9 mRNK i ćelijski ekstrakti su podvrgnuti Western, imunoprecipitaciji, i LC/MS analizi kako bi se detektovala ekspresija proteina eksprimiranih od strane navedenih mRNK.
[0630] FLAG označeni Cas9 mRNK konstrukti koji sadrže Cong Cas9 (SEQ ID NO: 55), neoznačeni Cas9 mRNK konstrukt koji sadrži Mali Cas9 (SEQ ID NO: 56), HA-označeni dCas9 konstrukt koji sadrži Gilbert dCas9 (SEQ ID NO: 55), FLAG-označeni Cas9 konstrukt koji sadrži Maeder dCas9 (SEQ ID NO: 52), i HA-označeni Trilink Cas9 konstrukt (Trilink) su transfektovani u HeLa ćelije u skladu sa sledećim protokolom:
[0631] 3 × 10<6>HeLa ćelija je zasejano na ploče od 10 cm na dan pre transfekcije. 30 µl lipofektamina 2000 je razblaženo u tubi koja sadrži 200 µl Opti-MEM za svaki uzorak koji će se transfektovati i držano je na sobnoj temperaturi tokom 2-5 minuta. 7,5 µg Cas9 mRNK je razblaženo u drugu tubu koja sadrži 200 µl Opti-MEM. Zatim su dva razblaženja kombinovana za svaki uzorak i pomešana. Krajnjem rastvoru je omogućeno da stoji na sobnoj temperaturi tokom 20-25 minuta pre nego što su rastvorom za transfekciju prekrivene zasejane HeLa ćelije.
[0632] Posle sedam sati posle transfekcije, ćelije su lizirane sa puferom za lizu u prisustvu 1x HALT inhibitora proteaze (Pierce). Protein iz ćelijskih lizata je izolovan i rezervisan za Western, imunoprecipitaciju, ili LC-MS testove.
[0633] Za imunoprecipitaciju, lizati normalizovani na koncentraciju proteina dodati su u Sigma M2 agaroza perle i isprani. Imunoprecipitacija je izvedena na 4 °C preko noći. Perle su zatim isprane i resuspendovane u IX LDS puferu za uzorke proteina. Uzorci su zatim pušteni na 4-12% Bis-Tris gelu sa MES puferom (Life Technologies) upotrebom See BluePlus 2™ prethodno obojenih proteinskih standarda (Life Technologies). Nitroceluloza je blokirana sa 5% mleka u PBS tokom jednog sata, zatim je blotovana sa 1:2000 anti-FLAG (Cell Signaling Technologies) (Slika 2) ili 1:1000 anti-HA (Covance HA.11 ascites) (Slika 3) u PBS 0,05% Tween tokom 4 sata preko noći na 4 °C. Membrane su zatim isprane i inkubirane sa antizečjim (Sigma) ili anti-mišjim (Sigma) konjugovanim za HRP tokom 45 minuta na sobnoj temperaturi i detektovane sa Pierce Super Signal West Femto (Pierce) u skladu sa uputstvima proizvođača.
[0634] Cong Cas9-FLAG protein je detektovan u HeLa ćelijama transfektovanim sa Cong Cas9-FLAG mRNK (SEQ ID NO: 55) putem i direktnog anti-FLAG Western i imunoprecipitacija anti-FLAG Western (Slika 2). Maeder Cas9-FLAG protein je detektovan u HeLA ćelijama transfektovanim sa Maeder Cas9-FLAG mRNK (SEQ ID NO: 52) putem
1 4
imunoprecipitacija anti-FLAG Western (Slika 2). I Mali Cas9 i Gilbert Cas9-HA nisu imali FLAG domen i stoga se nisu pojavili na anti-FLAG Western ili imunoprecipitaciji (Slika 2).
[0635] Gilbert dCas9-HA protein je detektovan u HeLA ćelijama transfektovanim sa Gilbert dCas9-HA mRNK (SEQ ID NO: 51) putem direktnog anti-HA Western (Slika 3). Trilink Cas9-HA je upotrebljen kao pozitivna kontrola za dCas9 ekspresiju.
[0636] Proteinski ekstrakti HeLa ćelija transfektovanih sa Gilbert dCas9-HA mRNK (SEQ ID NO: 51) i Maeder dCas9-FLAG (SEQ ID NO: 52) analizirani su na ekspresiju proteina Cas9 konstrukata putem LC-PRM peptidne kvantifikacije i upoređeni sa proteinskim ekstraktima netretiranih kontrolnih HeLa ćelija.
[0637] Svi rastvarači su bili HPLC-kvaliteta iz Sigma-Aldrich, i sve hemikalije gde nije navedeno drugačije dobijene su iz Sigma-Aldrich.
[0638] Uzorci su pripremljeni u puferu za lizu ćelija koji sadrži 8 M ureu i 0,1 M amonijum bikarbonat. Izvedeni su BCA testovi za određivanje sadržaja ukupnog proteina. Uzorci sa 30 µg proteina su redukovani upotrebom i digestirani preko noći sa tripsinom. C18 čišćenje za masenu spektrometriju izvedeno je upotrebom kolona MICROSpin™ (The Nest group) u skladu sa uputstvima proizvođača. Peptidi su osušeni ponovo rastvoreni u 30 µl do krajnje koncentracije od 1 µg/µl u LC rastvaraču A (1% acetonitril u vodi sa 0,1% mravlje kiseline (FA)) koji sadrži smešu kontrolnih peptida za kalibraciju vremena zadržavanja.
[0639] Peptidi (1 µg po uzorku) su analizirani na C18 hromatografskim kolonama na Thermo Scientific Easy nLC sistemu za nano-tečnu hromatografiju za sve analize masene spektrometrije. LC rastvarači su bili A: 1% acetonitril u vodi sa 0,1% FA; B: 3% voda u acetonitrilu sa 0,1% FA (gradijentno eluiranje).
[0640] LC-MS/MS ciklusi za otkrivanje peptida izvedeni su na Thermo Scientific Q Exactive™ masenom spektrometru opremljenom standardnim nano-elektrosprej izvorom.
[0641] LC-PRM je izveden upotrebom unapred određene liste inkluzije koja sadrži mase prekursora ciljnih peptida na Thermo Scientific Q Exactive™ masenom spektrometru opremljenom standardnim nano-elektrosprej izvorom kao što je ranije opisano (gradijentno eluiranje).
[0642] LC gradijent za LC-PRM je bio 5-35% rastvarač B u 50 minuta praćeno sa 35-100% B za 2 minuta i 100% B tokom 8 minuta (ukupna dužina gradijenta je bila 60 minuta).
[0643] LC-MS/MS skupovi podataka su analizirani upotrebom MaxQuant softverskog paketa, i pretrage su izvršene prema UniProt HUMAN bazi podataka i drugim bazama podataka. Za sve peptide ciljnih proteina koji su uspešno detektovani u LC-MS/MS, LC-PRM testovi su
1
generisani upotrebom jona najintenzivnijih fragmenata iz LC-MS/MS analize. Odabrano je 10 najintenzivnijih testova.
[0644] Podaci su obrađeni upotrebom SpectroDive™ softvera (Biognosys) za analizu LC-MRM i LC-PRM podataka na osnovu mProphet (Reiter, Rinner et al., Nature Methods 8 (2011), 430-435). 10 peptida koji predstavljaju housekeeping proteine kvantifikovano je u svakom uzorku kako bi se procenilo opterećenje uzorka na koloni.
[0645] Relativna kvantifikacija peptidnih segmenata Cas9 izvedena je za svaki od proteinskih ekstrakata putem LC-PRM. Kvantifikacija Cas9 peptidnih segmenata: "GNELALPSK" (SEQ ID NO: 120), "YFDTTIDR" (SEQ ID NO: 121), i "IPYYVGPLAR" (SEQ ID NO: 122) pokazana je na Slikama 4A, 4B, i 4C, respektivno. Tabela 2 pokazuje relativnu kvantifikaciju za svaki:
Tabela 2: LC-PRM kvantifikacija Cas9 peptida u uzorcima ćelijskih lizata
In vivo
[0646] Miševima (n=1) (8 nedelja stare ženke BalbC) je primenjeno 350 μl intravenski 0,04 mg/ml (14 µg) FLAG-Cas9 Cong mRNK kao što je opisano kao što je izneto u SEQ ID NO: 55_ (poliA rep od približno 140 nukleotida nije pokazan u sekvenci; 5'kapa, kapa1; potpuno modifikovana sa 1-metilpseudouridinom) formulisane u lipidnoj nanočestici koja sadrži lipid DLin-MC3-DMA opisan u Tabeli 3 ili kontrola PBS (lažno).
1
Tabela 3: Formulacija lipidne nanočestice
[0647] 6 sati posle primene miševi su humano eutanazirani. Jetre su sakupljene iz miševa i ekspresija Cas9 je određena pomoću imunoprecipitacije kao što je detaljno opisano u nastavku.
[0648] Tkivo jetre je lizirano u formulaciji za lizu tkiva u prisustvu inhibitora proteaze. Protein je ekstrahovan i kvantifikovan upotrebom BCA protein testa (Pierce). Uzorci su normalizovani pomoću kvantifikacije ukupnog proteina. Približno 88 mg proteinskog ekstrakta je dodato u M2 agaroza perle (Sigma) za imunoprecipitaciju. Posle laganog mešanja tokom 3-4 sata na 4 °C, perle su aspirirane i isprane sa RIPA puferom kako bi se uklonio supernatant. RIPA pufer suplementovan sa 200 µg/ml 3X FLAG peptida (Sigma) dodat je perlama i inkubiran na 4 °C tokom 30 minuta uz mućkanje pri 1100 o/min u termomikseru. Elucija peptida je zatim izvedena centrifugiranjem perli i uklanjanjem supernatanta. Uzorci su inkubirani na 72 °C tokom 12 minuta na 4-12% Bis Tris gelu upotrebom MES pufera (LifeTech) zajedno sa prethodno obojenim proteinskim standardima (LifeTech). Gel je prebačen na nitrocelulozu upotrebom iBlot™ aparature tokom 6 minuta u skladu sa uputstvima proizvođača. Membrana je uklonjena i stavljena u posudu pogodnu za blotovanje i isprana 2x sa ddH2O. Nitroceluloza je zatim blokirana tokom 45 minuta sa 5% nemasnog mleka u prahu u PBS. Nitroceluloza je zatim blotovana sa anti-M2 HRP pri 1:15,000 u 1% mleko PBS 0,05% Tween tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Rastvor primarnog antitela je zatim uklonjen i nitroceluloza je isprana sa PBS 00,05% Tween. FLAG-Cas9 peptidi su detektovani sa Pierce Super Signal Femto™. Zatim je nitrocelulozna membrana izložena za snimanje.
[0649] Rezultati imunoprecipitacije pokazani su na Slici 5. Kao što je pokazano na Slici 5, traka je prisutna na 150 kD samo u Cas9 LNP uzorku i ne u kontrolom uzorku tretiranom sa PBS. Ovi podaci obezbeđuju dokaz o ekspresiji Cas9 proteina iz LNP formulisane sintetičke mRNK in vivo kod miševa koji su dozirani sa Cas9-LNP.
Primer 12: In vitro modulacija transkripcije sa sintetičkim polinukleotidima koji kodiraju dCas9-efektor fuzione proteine i sintetičkom sgRNK
1
[0650] VEGF (faktor rasta vaskularnog endotela), jedan od najpotentnijih angiogenih faktora, nedavno je identifikovan kao inducer neoangiogeneze u mnogim tumorima, uključujući gliome. U-87 MG i A-172 su dve uspostavljene ćelijske linije glioblastoma. Bazalna ekspresija VEGF bila je za red veličine veća u U-87 MG u poređenju sa A-172. (Int J Dev Neurosci. 1999. avg-okt; 17(5-6):565-77). Ovo obezbeđuje sistem za testiranje genske regulacije od strane dCas9-KRAB i dCas9-VP64 sa sgRNK usmerenom na 5' bočnu genomsku sekvencu VEGF.
Inhibicija transkripcije sa dCas9-KRAB
[0651] Gilbert 2013 je opisao smanjenje genske ekspresije upotrebom dCas9-kRAB fuzionog proteina. KRAB je kategorija transkripcionih represivnih domena prisutnih u približno 400 transkripcionih faktora na bazi humanog proteina cinkanog prsta (KRAB proteini cinkanih prstiju) (Huntley 2006). Pokazano je da us KRAB domeni efikasni represori transkripcije.
[0652] U-87MG ćelijska linija proizvodi endogeni VEGF. Sintetički polinukleotid dCas9-kRAB zajedno sa 4 sintetičke sgRNK koje ciljno deluju na VEGF prethodno opisane upotrebljeni su za inhibiranje transkripcije VEGF gena u U-87MG ćelijama. Upotrebljen je sledeći eksperimentalni protokol.
1. U-87MG su održavane u Dulbekovom (Dulbecco's) modifikovanom Eagle medijumu (DMEM) u 10% FBS, 2 mM glutamin, 100 jedinica/ml streptomicina, i 100 mg/ml penicilina.
2. Sve transfekcije su izvedene u triplikatu upotrebom lipofektamina i upotrebom protokola za transfekciju opisanog u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US 2013/0259924 (S.A.D. patentna prijava br.13/791,922, koja je podneta 9. marta 2013. godine).
3. 160.000 ćelija je zasejano u ploče sa 24 bunarića dan pre transfekcije.
4. Transfektovati U-87MG ćelije sa 100 ng dCas9-KRAB mRNK i 100 ng VEGF V1-V4 sgRNK. Za eksperimente sinergije, transfektovati 100 ng dCas9-KRAB mRNK sa po 25 ng svake od VEGF V1-V4 sgRNK (ukupno 100 ng četiri različite VEGF sgRNK) 5. Inkubirati ćelije tokom 8 sati i isprati ćelije kako bi se uklonio agens za transfekciju.
6. Nastaviti sa inkubacijom ćelija u DMEM.
7. Medijum za kulturu U-87MG transfektovanih sa mRNK koja kodira VEGFA-ciljno delujuću sgRNK i dCas9-KRAB je sakupljen 0 h, 12 h, 24 h, 48 h posle transfekcije
1
8. Ekspresija proteina VEGFA je izmerena pomoću ELISA.
[0653] Introdukcija sintetičkih polinukleotida koji kodiraju dCas9-KRAB sa sgRNK koja ciljno deluje na VEGF genomsku sekvencu inhibira VEGF transkripciju u poređenju sa netretiranim ćelijama.
Aktivacija transkripcije sa dCas9-VP64
[0654] Maeder 2013 i Perez-Pinera 2013 opisuju RNK-vođen transkripcioni aktivator, kreiran fuzionisanjem dCas9 (D10A, H840A) za domen transaktivacije VP64. dCas9-VP64 prepoznaje genomska ciljna mesta preko hibridizacije sgRNK sa ciljnom sekvencom.
[0655] HEK293 ćelijska linija ne proizvodi endogeni VEGF. Sintetički polinukleotid dCas9-VP-64 zajedno sa 4 sintetičke sgRNK koje ciljno deluju na VEGF prethodno opisane upotrebljeni su za aktiviranje transkripcije VEGF gena u HEK293 ćelijama. Upotrebljen je sledeći eksperimentalni protokol.
1. HEK293 su održavane u Dulbekovom modifikovanom Eagle medijumu (DMEM) u 10% FBS, 2 mM glutamin, 100 jedinica/ml streptomicina, i 100 mg/ml penicilina.
2. Sve transfekcije su izvedene u triplikatu upotrebom lipofektamina i upotrebom protokola za transfekciju opisanog u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US 2013/0259924 (S.A.D. patentna prijava br.13/791,922, koja je podneta 9. marta 2013. godine).
3. 160.000 ćelija je zasejano u ploče sa 24 bunarića dan pre transfekcije.
4. HEK 293 su transfektovane sa 100 ng dCas9-VP64 mRNK i 100 ng VEGF V1-V4 sgRNK. Za eksperimente sinergije, transfektovati 100 ng dCas9-VP64 mRNK sa po 25 ng svake od VEGF V1-V4 sgRNK (ukupno 100 ng četiri različite VEGF sgRNK) 5. Inkubirati ćelije tokom 8 sati i isprati ćelije kako bi se uklonio agens za transfekciju.
6. Nastaviti sa inkubacijom ćelija u DMEM.
7. Medijum za kulturu HEK293 transfektovanih sa mRNK koja kodira VEGFA-ciljno delujuću sgRNK i dCas9-VP64 je sakupljen 0 h, 12 h, 24 h, 48 h posle transfekcije 8. Ekspresija proteina VEGFA je izmerena pomoću ELISA.
9. VEGFA mRNK je izmerena pomoću RT-PCR ili Taqman ili q-PCR.
1
[0656] Introdukcija sintetičkih polinukleotida koji kodiraju dCas9-VP64 sa sgRNK koja ciljno delujue na VEGF genomsku sekvencu aktivira VEGF transkripciju u HEK293 ćelijama u poređenju sa netretiranim ćelijama.
Primer 13: Tkivno specifična modulacija in vitro ekspresije proteina
[0657] miR-122 je prisutan u primarnim humanim hepatocitima i nije prisutan u ćelijskim linijama hepatocelularnog karcinoma kao što su HepG2, Hep3B, i SK-Hep-1 ćelije. Pokazano je da miR-122 može smanjiti proizvodnju proteina kodiranih od strane mRNK koja sadrži miR-122 vezujuća mesta u 3' UTR u primarnim hepatocitima, ali ne u HepG2 i Hep3B.
[0658] Primarni hepatociti i HepG2 ćelije su transfektovane sa dCas9-KRAB, dCas9-KRAB-miR122, dCas9-VP64, dCas9-VP64-miR122 sintetičkim polinukleotidima zajedno sa kombinacijom četiri sintetičke sgRNK koje ciljno deluju na VEGF.
[0659] Transfekcija primarnih hepatocita izvedena je kao što je ovde opisano. Tabele 4 i 5 obezbeđuju rezultate.
Tabela 4: Rezultati transfekcije primarnih hepatocita.
1
11
[0660] Transfekcija HEpG2 ćelija izvedena je kao što je ovde opisano. Sledeća tabela obezbeđuje rezultate.
1 2
Tabela 5: Rezultati transfekcije HEpG2.
1
Primer 14: Modulacija in vivo ekspresije proteina sa dCas9
[0661] Isporuka sintetičkih polinukleotida koji kodiraju dCAS9-efektor fuzione proteine i sintetičke sgRNK koja ciljno deluje na gen od interesa u jetru upotrebom lipid-nukleinska kiselina formulacije čestica izvedena je prateći procedure opisane u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US 2013/0259924 (S.A.D. patentna prijava br. 13/791,922, koja je podneta 9. marta 2013. godine). Isporuka sintetičkih polinukleotida koji kodiraju dCAS9-efektor fuzione proteine i sintetičke sgRNK koja ciljno deluje na gen od interesa u mišićne ćelije putem intramuskularne injekcije izvedena je kao što je opisano u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US 2013/0259924 (S.A.D. patentna prijava br. 13/791,922, koja je podneta 9. marta 2013. godine).
a. In vivo inhibicija transkripcije TPO gena sa dCas9-KRAB
[0662] Trombopoetin (TPO) uglavnom proizvodi jetra. Sintetički polinukleotidi koji kodiraju dCas9-KRAB ili dCas9-KRAB-miR122 zajedno sa sgRNK koja ciljno deluje na 5' bočnu sekvencu trombopoetina formulisani su u LNP formulaciji. 0,005 mg/kg do 0,5 mg/kg LNP formulisane dCas9-KRAB i TPO sgRNK primenjeno je intravenski miševima. Uzorci krvi i jetre sakupljeni su 8 h, 24 h, 48 h, 72 h posle primene. Nivo TPO proteina je izmeren pomoću ELISA, i TPO mRNK je izmerena pomoću RT-PCR ili q-PCR.
[0663] Sa dCas9-KRAB posredovanom supresijom sa TPO sgRNK, TPO protein i ekspresija mRNK će se smanjiti. Međutim, zbog prisustva miR-122, grupe tretirane sa dCas9-KRAB-miR122 TPO sgRNK neće pokazati značajno smanjenje proizvodnje TPO proteina i ekspresije mRNK.
1 4
b. In vivo inhibicija transkripcije reporterskog gena sa dCas9-KRAB
[0664] Egzogeni DNK plazmid koji sadrži reporterski molekul, kao što je luciferaza, GFP, ili humani VEGF, i specifičnu 5' bočnu sekvencu koja sadrži VEGF V1-V4 sgRNK sekvence i konstitutivno aktivan promotor za pokretanje ekspresije proteina primenjen je zajedno sa sintetičkim polinukleotidom koji kodira dCas9-KRAB/dCas9-KRAB-miR122 i sa 4 sintetičke sgRNK koje ciljno deluju na VEGF. Polinukleotidi su LNP formulisani i primenjeni kao što je ovde opisano.
[0665] Postoji smanjenje ekspresije reporterskog molekula u grupama tretiranim sa dCas9-KRAB/VEGF sgRNK. Nema značajnog smanjenja ekspresije reporterskog molekula u grupama tretiranim sa dCas9-KRAB-mir122/VEGF sgRNK.
c. In vivo aktivacija transkripcije LDHC gena sa dCas9-VP64
[0666] Kako bi se demonstrirala aktivacija transkripcije i ekspresija proteina upotrebom sintetičkog polinukleotida koji kodira dCas9-VP64, ciljaju se proteini koji se tipično ne eksprimiraju u jetri. Laktat dehidrogenaza C (LDHC) je enzim specifičan za testise. Primena LNP formulisanog sintetičkog polinukleotida koji kodira dCas9-VP64 zajedno sa sintetičkom sgRNK koja ciljno deluje na 5' genomsku sekvencu mišje LDHC indukuje ekspresiju LDHC u jetri. LDHC mRNK transkript je izmeren pomoću RT-PCR ili q-PCR, i ekspresija proteina je izmerena pomoću ELISA ili Western blota. Primena LNP formulisanog sintetičkog polinukleotida koji kodira dCas9-VP64-miR122 i sgRNK koja ciljano deluje na 5' genomsku sekvencu mišje LDHC ne aktivira ekspresiju LDHC zbog prisustva miR-122 u ćelijama jetre.
d. In vivo aktivacija transkripcije reporterskog gena sa dCas9-VP64
[0667] Egzogeni DNK plazmid koji sadrži reporterski molekul, kao što je luciferaza, GFP, ili humani VEGF, i specifičnu 5' bočnu sekvencu koja sadrži VEGF V1-V4 sgRNK sekvence i konstitutivno neaktivan promotor primenjen je zajedno sa sintetičkim polinukleotidom koji kodira dCas9-VP64/dCas9-VP64-miR122 sa sintetičkom sgRNK koja ciljno deluje na VEGF. Postoji povećanje ekspresije reporterskog molekula u grupama tretiranim sa dCas9-VP64/VEGF sgRNK. Nema značajnog povećanja ekspresije reporterskog molekula u grupama tretiranim sa dCas9-VP64-mir122/VEGF sgRNK.
1
e. Tkivno specifična in vivo modulacija transkripcije LDHC gena
[0668] Kao što je ovde opisano, mikroRNK može obezbediti tkivnu specifičnost. Kako bi se demonstrirala tkivna selektivnost dCas9 sistema upotrebom mikroRNK 122, jednoj grupi miševa je doziran intravenski i sledećij grupi je doziran intramuskularno LNP formulisani sintetički polinukleotid koji kodira dCas9-VP64-mir122 i sintetička sgRNK koja ciljno deluje na LDHC. Zbog prisustva miR-122 u ćelijama jetre, sintetički polinukleotid koji kodira dCas9-VP64 neće biti eksprimiran; stoga, nema dCas9-VP64 posredovane aktivacije ekspresije LDHC. Pošto mišićne ćelije ne sadrže miR-122, grupa koja je primala intramuskularnu injekciju dCas9-VP64-miR122 i LDHC sgRNK pokazaće ekspresiju proteina specifičnog za testis.
f. Tkivno specifična in vivo modulacija transkripcije reporterskog gena
[0669] Sledeći primer je zajednička primena DNK plazmida opisana u Gilbert et al. kao cilja za gensku supresiju dCas9-KRAB. Formulisana LNP koja nosi 1) SV40-GFP DNK plazmid (opisan u Gilbert et al), 2) sgGFP-NT1 sgRNK (opisana u Gilbert et al), i 3) mRNK koja kodira bilo dCas9-KRAB ili dCas9-KRAB-miR122 je primenjena putem IV u jetru, koja sadrži miR-122. Grupa koja je primala dCas9-KRAB pokazaće redukovanu ekspresiju GFP u poređenju sa kontrolnom grupom koja nije primila dCas9-KRAB mRNK kao što je mereno pomoću protočne citometrije ili imunohistohemije pošto translacija dCas9-KRAB neće biti redukovana od strane miR122. Grupa koja je primila dCas9-KRAB-miR122 pokazaće ekspresiju GFP sličnu kontrolnoj grupi koja nije primila dCas9-KRAB-miR122 mRNK zbog prisustva miR-122 u hepatocitima koji inhibira translaciju dCas9-KRAB-miR122 mRNK. Kako bi se uporedila IM isporuka u mišićne ćelije koje ne sadrže miR-122, formulisana LNP koja nosi 1) SV40-GFP DNK plazmid (opisan u Gilbert et al), 2) sgGFP-NT1 sgRNK (opisana u Gilbert et al), i 3) mRNK koja kodira bilo dCas9-KRAB ili dCas9-KRAB-miR122 je primenjena putem IM injekcije. Očekujemo da će i dCas9-KRAB i dCas9-KRAB-miR122 grupe pokazati ekspresiju GPF u mišićnim ćelijama kao što je mereno pomoću protočne citometrije ili imunohistohemije.
[0670] Sledeći primer je zajednička primena DNK plazmida opisana u Gilbert et al. kao cilja za gensku aktivaciju dCas9-VP64. Formulisana LNP koja nosi 1) GAL4 UAS GFP DNK plazmid (opisan u Gilbert et al), 2) sgGAL4-1 sgRNK (opisana u Gilbert et al), i 3) mRNK
1
koja kodira bilo dCas9-VP64 ili dCas9-VP64-miR122 je primenjena putem IV u jetru. Grupa koja je primila dCas9-VP64 mRNK pokazaće ekspresiju GFP kao što je mereno pomoću protočne citometrije ili imunohistohemije, dok grupa koja je primila dCas9-VP64-miR122 neće pokazati ekspresiju GFP zbog prisustva miR-122 u hepatocitima koji suprimiraju translaciju dCas9-VP64-miR122 mRNK. Kako bi se uporedila IM isporuka u mišićne ćelije koje ne sadrže miR-122, formulisana LNP koja nosi 1) GAL4 UAS GFP DNK plazmid (opisan u Gilbert et al), 2) sgGAL4-1 sgRNK (opisana u Gilbert et al), i 3) mRNK koja kodira bilo dCas9-VP64 ili dCas9-VP64-miR12 je primenjena putem IM injekcije. Očekujemo da će i dCas9-VP64 i dCas9-VP64-miR122 grupe aktivirati ekspresiju GPF u mišićnim ćelijama kao što je mereno pomoću protočne citometrije ili imunohistohemije.
Primer 15: Upotreba 3 različita sistema isporuke
[0671] Kombinacija ciljno delujućeg mehanizma upotrebljava se da omogući značajan bezbednosni okvir pri primeni sintetičkih polinukleotida koji kodiraju protein povezan sa CRISPR i sgRNK.
[0672] Prvo, sintetički polinukleotid koji kodira dCAS9-efektorski domen fuzioni protein je dizajniran upotrebom miR-142.3p ciljanog 3'UTR za sprečavanje ekspresije u APC.
[0673] Drugo, sintetički polinukleotid je formulisan u LNP koja se može jonizovati koja cilja LDL-R posredovan unos u hepatocite. Ovo dovodi do ekspresije dCAS9-efektorski domen fuzionog proteina u jetri.
[0674] Treće, sintetička sgRNK koja ciljno deluje na hepatički gen od interesa je konjugovana sa, npr. GalNac konjugatom ili sličnim ciljno delujućim delom koji prvenstveno preuzimaju hepatociti. Sintetička sgRNK se može primenjivati odvojeno i posle 2-3 sata odlaganja.
[0675] Kombinacija ciljno delućih mehanizama (u ovom slučaju 3: mir-3'UTR, LNP, GalNac) i odsustvo DNK omogućilo bi značajan bezbednosni okvir.
[0676] Rezultat bi mogao biti transkripciona aktivacija ili inhibicija bilo kog proteinskog cilja (naši prvi in vivo eksperimenti fokusiraće se na IHC kako bi potvrdili lokalizaciju dCas9 fuzije u jetri i funkcionalno očitavanje upotrebom reportera kao što su luciferaza i/ili GFP.
DRUGI PRIMERI IZVOĐENJA
[0677] Treba razumeti da su reči koje su upotrebljene više opisne nego ograničavajuće.
1
[0678] Dok je predmetni pronalazak opisan do nekih detalja i sa određenom konkretnošću u odnosu na nekoliko opisanih primera izvođenja, nije namenjeno da bude ograničen na bilo koje takve pojedinosti ili primere izvođenja ili bilo koji posebni primer izvođenja, već ga treba tumačiti sa pozivanjem na priložene patentne zahteve kako bi se obezbedilo najšire moguće tumačenje takvih patentnih zahteva s obzirom na stanje tehnike i, prema tome, da efikasno obuhvati predviđeni obim pronalaska.
[0679] U slučaju sukoba, predmetna specifikacija, uključujući definicije, će imati prevlast. Osim toga, naslovi odeljaka, materijali, postupci, i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni da budu ograničavajući.
Tabele sekvenci
[0680]
Tabela 5: Proteini povezani sa CRISPR
1
Opis Sekvenca SEQ
1
Opis Sekvenca SEQ
1
Opis Sekvenca SEQ
11
Opis Sekvenca SEQ
12
Opis Sekvenca SEQ
1
Opis Sekvenca SEQ
14
Opis Sekvenca SEQ
1
Opis Sekvenca SEQ
1
1
1 Opis Sekvenca SEQ
1
Opis Sekvenca SEQ
1
Tabela 6: 5'UTR
11
Tabela 7: 3'UTR
12
1
14
1
1
Tabela 8: DNK konstrukti koji kodiraju sintetičke polinukleotide (iRNK) koji kodiraju za proteine povezane sa CRISPR
1
Opis Sekvenca SEQ
1
Opis Sekvenca SEQ
1
Opis Sekvenca SEQ
2
Opis Sekvenca SEQ
21
22 Opis Sekvenca SEQ
Tabela 9: sgRNK konstrukti
2
Opis Sekvenca SE
24
Opis Sekvenca SE
Tabela 10: Sintetički polinukleotidi koji kodiraju protein povezan sa CRISPR i sintetičku sgRNK
2
Opis Sekvenca SEQ
2
Opis Sekvenca SEQ
2
2 Opis Sekvenca SEQ
2
21 Opis Sekvenca SE
Tabela 12: Dopunske sekvence kao što su deponovane u Addgene bazi podataka (repozitorijum plazmida, Cambridge, MA)
21
21
21
21
21
21
22
22

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Sintetički polinukleotid naznačen time što je uridin zamenjen 100% sa 1-metilpseudouridinom, sintetički polinukleotid sadrži prvi region povezanih nukleozida, navedeni prvi region kodira protein povezan sa CRISPR odabran iz grupe koja se sastoji od proteina povezanih sa CRISPR koji imaju bilo koju od amino-kiselinskih sekvenci SEQ ID NO 61, 7, 8, 9, 62, 63, 64, ili 65 ili koji su kodirani bilo kojom od sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO 1-6, ili 110-112.
2. Sintetički polinukleotid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što sintetički polinukleotid sadrži najmanje dve modifikacije, poželjno pri čemu
(a) najmanje dve modifikacije locirane su na jednom ili više nukleozida i/ili vezi okosnici između nukleozida; ili
(b) najmanje dve modifikacije locirane su i na nukleozidu i na vezi okosnici; ili (c) najmanje jedna modifikacija locirana je na vezi okosnici; ili
(d) jedna ili više veza okosnice modifikovane su zamenom jednog ili više atoma kiseonika; ili
(e) najmanje jedna modifikacija sadrži zamenu najmanje jedne veze okosnice fosforotioatnom vezom; ili
(f) najmanje jedna modifikacija locirana je na jednom ili više nukleozida; ili (g) jedna ili više modifikacija su na šećeru jednog ili više nukleozida; ili (h) najmanje jedna modifikacija locirana je na jednoj ili više nukleobaza odabranih iz grupe koja se sastoji od citozina, guanina, adenina, timina i uracila.
3. Kompozicija koja sadrži sintetički polinukleotid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2, poželjno
(a) dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, poželjnije dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens odabran iz grupe koja se sastoji od rastvarača, vodenog rastvarača, nevodenog rastvarača, disperzionog medijuma, razblaživača, pomoćnog sredstva za disperziju, suspenziju, površinski aktivnog agensa, izotoničnog agensa, agensa za zgušnjavanje ili emulgovanje, konzervansa, lipida,
22
lipidoida, lipozoma, lipidne nanočestice, jezgro-ljuska nanočestica, polimera, lipopleksa, peptida, proteina, ćelije, hijaluronidaze, i njihovih smeša;
(b) dodatno sadrži lipid odabran od DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, reLNP, PLGA, PEG, PEG-DMA i PEGilovanih lipida i njihovih smeša; ili
(c) dodatno sadrži lipidne nanočestice.
4. In vitro postupak za proizvodnju proteina povezanog sa CRISPR sadrži dovođenje u kontakt ćelije ili tkiva sa sintetičkim polinukleotidom prema patentnom zahtevu 1 ili kompozicijom prema patentnom zahtevu 3.
5. Sintetički polinukleotid prema patentnom zahtevu 1 ili kompozicija prema patentnom zahtevu 3 za upotrebu u terapijskom postupku u kom se proizvodi protein povezan sa CRISPR, navedeni postupak sadrži primenu organizmu sintetičkog polinukleotida ili kompozicije, poželjno naznačeno time što se sintetički polinukleotid
(a) primenjuje u ukupnoj dnevnoj dozi od između 1 pg i 1 mg;
(b) primenjuje u jednoj dozi;
(c) primenjuje u više od jedne doze;
(d) primenjuje prenatalnom primenom, neonatalnom primenom i postnatalnom primenom;
(e) primenjuje oralno, injekcijom, oftalmološkom primenom, ili intranazalnom primenom; ili
(f) primenjuje injekcijom i navedena injekcija je odabrana iz grupe koja se sastoji od intravenske, intraarterijske, intraperitonealne, intradermalne, subkutane i intramuskularne.
6. Sintetički polinukleotid kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, za upotrebu u terapijskom postupku za modulisanje transkripcije gena od interesa u ćeliji koji sadrži dovođenje u kontakt ćelije sa sintetičkim polinukleotidom prema patentnom zahtevu 1 i sintetičkom sgRNK pod uslovima dovoljnim za modulisanje transkripcije gena od interesa, prvi region sintetičkog polinukleotida dodatno sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira efektorski domen i prvi region sgRNK sekvencu komplementarnu sa genom od interesa;
pri čemu je sintetička sgRNK sintetička sgRNK za ciljno delovanje na gen od interesa, pri čemu je u navedenoj sintetičkoj sgRNK uridin zamenjen 100% sa 1-metilpseudouridinom, sgRNK sadrži:
(a) prvi region od 20-25 povezanih nukleozida komplementaran sa bilo kojim lancem 5' UTR gena od interesa, poželjno pri čemu prvi region sadrži ciljnu sekvencu kao što je objavljeno u SEQ ID NO: 91, 92, 93 ili 94; i
(b) drugi bočni region lociran na 3' terminusu navedenog prvog regiona koji sadrži sekvencu skele vodeće RNK kao što se nalazi u SEQ ID NO: 90,
poželjno pri čemu:
(i) sintetički polinukleotid i sintetička sgRNK nisu pojedinačni polinukleotid;
(ii) sintetički polinukleotid je sintetički polinukleotid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2;
(iii) gen od interesa je odabran iz grupe koja se sastoji od VEGF, TPO, i LDHC;
(iv) sintetički polinukleotid prema patentnom zahtevu 1 sadrži miR sekvencu specifičnu za ćeliju; ili
(v) gen od interesa je VEGF i ćelija je U-97MG ćelija, HEK293 ćelija, primarni humani hepatocit, ili HepG2 ćelija, postupak sadrži dovođenje u kontakt ćelije sa jednim od sintetičkih polinukleotida prema patentnom zahtevu 1 ili 2 i jednom od sgRNK pod uslovima dovoljnim za modulisanje transkripcije VEGF gena.
7. Sintetički polinukleotid kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, za upotrebu u terapijskom postupku za modulisanje transkripcije gena od interesa kod subjekta, koji sadrži primenu subjektu prve doze sintetičkog polinukleotida prema patentnom zahtevu 1 i druge doze sintetičke sgRNK pod uslovima dovoljnim za modulisanje transkripcije gena od interesa, prvi region sintetičkog polinukleotida dodatno sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira efektorski domen i prvi region sgRNK sekvencu komplementarnu sa genom od interesa,
22
pri čemu je sintetička sgRNK sintetička sgRNK za ciljno delovanje na gen od interesa, pri čemu je u navedenoj sintetičkoj sgRNK uridin zamenjen 100% sa 1-metilpseudouridinom, sgRNK sadrži:
(a) prvi region od 20-25 povezanih nukleozida komplementaran sa bilo kojim lancem 5' UTR gena od interesa, poželjno pri čemu prvi region sadrži ciljnu sekvencu kao što je objavljeno u SEQ ID NO: 91, 92, 93 ili 94; i
(b) drugi bočni region lociran na 3' terminusu navedenog prvog regiona koji sadrži sekvencu skele vodeće RNK kao što se nalazi u SEQ ID NO: 90,
poželjno pri čemu:
(i) sintetički polinukleotid je sintetički polinukleotid prema patentnom zahtevu 2;
(ii) subjekt je čovek;
(iii) sintetički polinukleotid i/ili sintetička sgRNK su formulisani u formulaciju lipidnih nanočestica;
(iv) sintetički polinukleotid je formulisan u formulaciju lipidnih nanočestica i sgRNK nije formulisana u formulaciju lipidnih nanočestica;
(v) gen od interesa je odabran iz grupe koja se sastoji od VEGF, TPO, i LDHC;
(vi) sintetički polinukleotid prema patentnom zahtevu 1 sadrži miR sekvencu specifičnu za ćeliju; ili
(vii) gen od interesa je TPO i subjekt je miš, postupak sadrži primenu mišu 0,0005 mg/kg-0,5 mg/kg sintetičkog polinukleotida koji sadrži SEQ ID NO: 51 i 0,0005 mg/kg-0,5 mg/kg sgRNK koja sadrži prvi region koji sadrži sekvencu komplementarnu sa jednim lancem 5' UTR TPO gena.
8. Sintetički polinukleotid za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time što
(a) prva doza je 0,0005 mg/kg do 0,5 mg/kg sintetičkog polinukleotida; i/ili (b) druga doza je između 0,0005 mg/kg-0,5 mg/kg sgRNK; i/ili
(c) sintetički polinukleotid i sgRNK primenjuju se zajedno ili se primenjuju odvojeno; i/ili
22
(d) sintetički polinukleotid i/ili sgRNK primenjuju se u jednoj dozi ili u više doza; i/ili
(e) sintetički polinukleotid i/ili sgRNK primenjuju se jednom dnevno ili više od jednom dnevno; i/ili
(f) sintetički polinukleotid i/ili sgRNK primenjuju se prenatalno, neonatalno, postnatalno, oralno, oftalmološki, intranazalnom, i/ili intravenskom, intraarterijskom, intraperitonealnom, intradermalnom, subkutanom ili intramuskularnom injekcijom.
9. Sintetički polinukleotid kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, za upotrebu u postupku lečenja bolesti kod subjekta koji sadrži primenu subjektu prve doze sintetičkog polinukleotida prema patentnom zahtevu 1 i druge doze sintetičke sgRNK pod uslovima dovoljnim za modulisanje transkripcije gena od interesa, prvi region sintetičkog polinukleotida dodatno sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira efektorski domen i prvi region sgRNK sekvencu komplementarnu sa 5' UTR jednog lanca gena od interesa, pri čemu je ekspresija gena povezana sa bolešću,
pri čemu je sintetička sgRNK sintetička sgRNK za ciljno delovanje na gen od interesa, pri čemu je u navedenoj sintetičkoj sgRNK uridin zamenjen 100% sa 1-metilpseudouridinom, sgRNK sadrži:
(a) prvi region od 20-25 povezanih nukleozida komplementaran sa bilo kojim lancem 5' UTR gena od interesa, poželjno pri čemu prvi region sadrži ciljnu sekvencu kao što je objavljeno u SEQ ID NO: 91, 92, 93 ili 94; i
(b) drugi bočni region lociran na 3' terminusu navedenog prvog regiona koji sadrži sekvencu skele vodeće RNK kao što se nalazi u SEQ ID NO: 90,
poželjno pri čemu:
(i) bolest je kancer i gen je gen apoptoze ili starenja;
(ii) sintetički polinukleotid je sintetički polinukleotid prema patentnom zahtevu 2;
(iii) subjekt je čovek;
(iv) sintetički polinukleotid i/ili sintetička sgRNK su formulisani u formulaciju lipidnih nanočestica;
22
(v) sintetički polinukleotid je formulisan u formulaciju lipidnih nanočestica i sgRNK nije formulisana u formulaciju lipidnih nanočestica;
(vi) gen od interesa je odabran iz grupe koja se sastoji od VEGF, TPO, i LDHC; ili
(vii) sintetički polinukleotid prema patentnom zahtevu 1 sadrži miR sekvencu.
10. Sintetički polinukleotid za upotrebu ili sintetička sgRNK prema patentnom zahtevu 9, naznačeno time što
(a) prva doza je 0,0005 mg/kg do 0,5 mg/kg sintetičkog polinukleotida; i/ili (b) druga doza je između 0,0005 mg/kg-0,5 mg/kg sgRNK; i/ili
(c) sintetički polinukleotid i sgRNK primenjuju se zajedno ili se primenjuju odvojeno; i/ili
(d) sintetički polinukleotid i/ili sgRNK primenjuju se u jednoj dozi ili u više doza; i/ili
(e) sintetički polinukleotid i/ili sgRNK primenjuju se jednom dnevno ili više od jednom dnevno; i/ili
(f) sintetički polinukleotid i/ili sgRNK primenjuju se prenatalno, neonatalno, postnatalno, oralno, oftalmološki, intranazalnom, i/ili intravenskom, intraarterijskom, intraperitonealnom, intradermalnom, subkutanom ili intramuskularnom injekcijom.
11. Sintetički polinukleotid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što prvi region:
(i) kodira SEQ ID NO: 61;
(ii) dodatno kodira efektorski domen;
(iii) dodatno kodira efektorski domen odabran iz grupe koja se sastoji od KRAB, VP64, p65AD, i Mxi;
(iv) dodatno kodira KRAB ili VP64 kao što je objavljeno u Tabeli 6; ili (v) dodatno kodira efektorski domen i sadrži nukleotidnu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od efektorskih domena objavljenih u Tabeli 6.
2
12. Sintetički polinukleotid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što sintetički polinukleotid sadrži prvi bočni region lociran na 5' terminusu navedenog prvog regiona koji sadrži sekvencu povezanih nukleozida odabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci 5' netranslatiranog regiona (UTR) SEQ ID NO 71, 72, i 15-18; pri čemu, opciono, prvi bočni region sadrži SEQ ID NO: 71.
13. Sintetički polinukleotid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što sintetički polinukleotid sadrži drugi bočni region lociran na 3' terminusu navedenog prvog regiona koji sadrži sekvencu povezanih nukleozida odabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci 3' netranslatiranog regiona (UTR) SEQ ID NO 81, 82, i 19-35; pri čemu, opciono, drugi bočni region:
(i) sadrži SEQ ID NO: 81;
(ii) sadrži SEQ ID NO: 82;
(iii) dodatno sadrži 3' repnu sekvencu povezanih nukleozida;
(iv) dodatno sadrži poli-A rep;
(v) dodatno sadrži poli-A rep dužine 80 do 140 nukleotida; ili
(vi) dodatno sadrži poli-A rep od 100 nukleotida.
14. Sintetički polinukleotid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što sintetički polinukleotid:
(i) je modifikovani RNK polinukleotid;
(ii) od sekvence odabrane od SEQ ID NO: 51-56;
(iii) dodatno sadrži najmanje jednu strukturu 5' kape;
(iv) sadrži najmanje jedan 5'-metil citidin;
(v) je suštinski prečišćen; ili
(vi) je proizveden upotrebom postupka in vitro transkripcije ili upotrebom postupka hemijske sinteze.
2 1
RS20211363A 2013-07-11 2014-07-11 Kompozicije koje sadrže sintetičke polinukleotide koji kodiraju proteine povezane sa crispr i sintetičke sgrnk i postupci upotrebe RS62529B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361844890P 2013-07-11 2013-07-11
US201361886545P 2013-10-03 2013-10-03
PCT/US2014/046434 WO2015006747A2 (en) 2013-07-11 2014-07-11 Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use.
EP14823392.7A EP3019619B1 (en) 2013-07-11 2014-07-11 Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62529B1 true RS62529B1 (sr) 2021-11-30

Family

ID=52280736

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211363A RS62529B1 (sr) 2013-07-11 2014-07-11 Kompozicije koje sadrže sintetičke polinukleotide koji kodiraju proteine povezane sa crispr i sintetičke sgrnk i postupci upotrebe

Country Status (17)

Country Link
US (2) US11027025B2 (sr)
EP (2) EP3971287A1 (sr)
JP (4) JP7019233B2 (sr)
AU (2) AU2014287009B2 (sr)
CA (1) CA2917348A1 (sr)
CY (1) CY1124740T1 (sr)
DK (1) DK3019619T3 (sr)
ES (1) ES2896755T3 (sr)
HR (1) HRP20211563T1 (sr)
HU (1) HUE056760T2 (sr)
LT (1) LT3019619T (sr)
PL (1) PL3019619T3 (sr)
PT (1) PT3019619T (sr)
RS (1) RS62529B1 (sr)
SI (1) SI3019619T1 (sr)
SM (1) SMT202100691T1 (sr)
WO (1) WO2015006747A2 (sr)

Families Citing this family (212)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2782676C (en) 2009-12-01 2021-06-15 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Pharmaceutical compositions for intracellular delivery of nucleic acids and proteins and uses thereof for treatment of ureca cycle metabolic disorders
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RS63430B1 (sr) 2010-10-01 2022-08-31 Modernatx Inc Ribonukleinske kiseline koje sadrže n1-metil-pseudouracile i njihove primene
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
EP2691101A2 (en) 2011-03-31 2014-02-05 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
CN103748078B (zh) 2011-06-08 2016-11-09 夏尔人类遗传性治疗公司 可裂解脂质
CA3107288A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
DE12858350T1 (de) 2011-12-16 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte mrna zusammensetzungen
US9546128B2 (en) 2012-03-29 2017-01-17 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Ionizable cationic lipids
CA2868030C (en) 2012-03-29 2021-05-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipid-derived neutral nanoparticles
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
HK1206601A1 (en) 2012-04-02 2016-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
EP2859102A4 (en) 2012-06-08 2016-05-11 Shire Human Genetic Therapies NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF
JP6561378B2 (ja) 2012-06-08 2019-08-21 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド 非肺標的細胞へのｍＲＮＡの経肺送達
EP2885419A4 (en) 2012-08-14 2016-05-25 Moderna Therapeutics Inc ENZYMES AND POLYMERASES FOR RNA SYNTHESIS
HRP20220607T1 (hr) 2012-11-26 2022-06-24 Modernatx, Inc. Terminalno modificirana rna
EP4299741A3 (en) 2012-12-12 2024-02-28 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
ES2701749T3 (es) 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
CN113005148A (zh) 2013-01-16 2021-06-22 爱默蕾大学 Cas9-核酸复合物及其相关用途
US20160024181A1 (en) 2013-03-13 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
EA201591229A1 (ru) 2013-03-14 2016-01-29 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы очистки матричной рнк
RS62565B1 (sr) 2013-03-14 2021-12-31 Translate Bio Inc Metode i kompozicije za isporuku antitela kodiranih od strane irnk
MX365409B (es) 2013-03-14 2019-05-31 Shire Human Genetic Therapies Composiciones de ácido ribonucleico mensajero del regulador transmembrana de fibrosis quística y métodos y usos relacionados.
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
HUE071526T2 (hu) 2013-03-15 2025-09-28 Translate Bio Inc Nukleinsavak bejuttatásának szinergista fokozása kevert kiszerelésekkel
US10077439B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
EP2971033B8 (en) 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
US11377470B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Modernatx, Inc. Ribonucleic acid purification
US9828582B2 (en) 2013-03-19 2017-11-28 Duke University Compositions and methods for the induction and tuning of gene expression
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
AU2014281026B2 (en) 2013-06-17 2020-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3011033B1 (en) 2013-06-17 2020-02-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
BR112015031608A2 (pt) 2013-06-17 2017-08-22 Massachusetts Inst Technology Aplicação e uso dos sistemas crispr-cas, vetores e composições para direcionamento e terapia hepáticos
BR122021009076B1 (pt) 2013-06-17 2024-02-15 The Broad Institute Inc. Vetor viral contendo molécula(s) de ácido nucleico heterólogo, composição, uso e métodos do mesmo
RS62529B1 (sr) 2013-07-11 2021-11-30 Modernatx Inc Kompozicije koje sadrže sintetičke polinukleotide koji kodiraju proteine povezane sa crispr i sintetičke sgrnk i postupci upotrebe
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
CN120574876A (zh) 2013-08-22 2025-09-02 纳幕尔杜邦公司 使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
WO2015040402A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 Kymab Limited Methods. cells & organisms
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
WO2015051169A2 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
EP3871696B1 (en) 2013-10-22 2025-03-19 Translate Bio, Inc. Lipid formulations for delivery of messenger rna
CA2928040A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cns delivery of mrna and uses thereof
EP3060303B1 (en) 2013-10-22 2018-11-14 Translate Bio, Inc. Mrna therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
MX2016005239A (es) 2013-10-22 2016-08-12 Shire Human Genetic Therapies Tratamiento con acido ribonucleico mensajero para la fenilcetonuria.
CN111218447B (zh) 2013-11-07 2024-10-11 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
WO2015089486A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
SG10201804975PA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for HBV and Viral Diseases and Disorders
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
EP3653703A1 (en) 2013-12-12 2020-05-20 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
WO2015089462A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing
EP3080259B1 (en) 2013-12-12 2023-02-01 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
HUE066611T2 (hu) 2014-02-11 2024-08-28 Univ Colorado Regents CRISPR-aktivált multiplex genommérnökség
DK3134131T3 (en) 2014-04-23 2022-02-07 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines
KR20250005450A (ko) 2014-04-25 2025-01-09 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 메신저 rna 의 정제 방법
BR112016027705A2 (pt) 2014-05-30 2018-01-30 Shire Human Genetic Therapies lipídios biodegradáveis para distribuição de ácidos nucleicos
US10286086B2 (en) 2014-06-19 2019-05-14 Modernatx, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
PE20171238A1 (es) 2014-06-24 2017-08-24 Shire Human Genetic Therapies Composiciones enriquecidas estereoquimicamente para administracion de acidos nucleicos
CN114146063A (zh) 2014-07-02 2022-03-08 川斯勒佰尔公司 信使rna的包封
EP3169335B8 (en) 2014-07-16 2019-10-09 ModernaTX, Inc. Circular polynucleotides
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
WO2016090262A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Messenger rna therapy for treatment of articular disease
WO2016094880A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
CA2970370A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Crispr having or associated with destabilization domains
WO2016130600A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
US12129471B2 (en) 2015-02-23 2024-10-29 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
US20180030438A1 (en) 2015-02-23 2018-02-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
PL3064587T3 (pl) 2015-03-06 2020-03-31 Leibniz-Institut Für Pflanzenbiochemie (Ipb) Biblioteka syntetycznych promotorów do koordynowanej ekspresji genów w komórkach lub organizmach eukariotycznych
JP6895892B2 (ja) 2015-03-19 2021-06-30 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド ポンペ病のｍＲＮＡ治療
WO2016154596A1 (en) * 2015-03-25 2016-09-29 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods, compositions and components
WO2016164356A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chemically modified guide rnas for crispr/cas-mediated gene regulation
EP3087974A1 (en) * 2015-04-29 2016-11-02 Rodos BioTarget GmbH Targeted nanocarriers for targeted drug delivery of gene therapeutics
EP3294896A1 (en) * 2015-05-11 2018-03-21 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
US10626393B2 (en) 2015-06-04 2020-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Delivering CRISPR therapeutics with lipid nanoparticles
US20180245074A1 (en) 2015-06-04 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
JP7107683B2 (ja) 2015-06-18 2022-07-27 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド オフターゲット効果を低下させるｃｒｉｓｐｒ酵素突然変異
EP4545544A3 (en) 2015-06-29 2025-10-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
US12150980B2 (en) 2015-07-30 2024-11-26 Modernatx, Inc. Concatemeric peptide epitope RNAs
WO2017024047A1 (en) * 2015-08-03 2017-02-09 Emendobio Inc. Compositions and methods for increasing nuclease induced recombination rate in cells
CN105002198B (zh) * 2015-08-07 2018-07-06 北京蛋白质组研究中心 用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的成套产品及其应用
CA2998370A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a stabilizing tail region
US11434486B2 (en) 2015-09-17 2022-09-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
EP3352795B1 (en) * 2015-09-21 2020-08-12 The Regents of The University of California Compositions and methods for target nucleic acid modification
CN108603192A (zh) * 2015-09-29 2018-09-28 埃吉诺维亚公司 用于调节潜伏的病毒转录的组合物和方法
CA3001003A1 (en) 2015-10-05 2017-04-13 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
WO2017066497A2 (en) * 2015-10-13 2017-04-20 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
ES2862412T3 (es) 2015-10-14 2021-10-07 Translate Bio Inc Modificación de enzimas relacionados con el ARN para producción mejorada
WO2017068077A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and products for genetic engineering
EP3718565B1 (en) 2015-10-22 2022-04-27 ModernaTX, Inc. Respiratory virus vaccines
US12043852B2 (en) 2015-10-23 2024-07-23 President And Fellows Of Harvard College Evolved Cas9 proteins for gene editing
ES2942309T3 (es) 2015-11-04 2023-05-31 Vertex Pharma Materiales y métodos para el tratamiento de hemoglobinopatías
EP3384055B1 (en) 2015-11-30 2025-07-16 Duke University Therapeutic targets for the correction of the human dystrophin gene by gene editing and methods of use
FI3390632T3 (fi) * 2015-12-18 2025-11-25 Danisco Us Inc Menetelmät ja koostumukset polymeraasi ii (pol-ii) -pohjaisen opas-rna:n ilmentämiseen
US11518994B2 (en) 2016-01-30 2022-12-06 Bonac Corporation Artificial single guide RNA and use thereof
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
CN109714954A (zh) 2016-04-02 2019-05-03 全国儿童医院研究所 用于组织特异性表达的修饰的u6启动子系统
CA3020343A1 (en) 2016-04-08 2017-10-12 Translate Bio, Inc. Multimeric coding nucleic acid and uses thereof
US20190127713A1 (en) 2016-04-13 2019-05-02 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
US12128113B2 (en) 2016-05-18 2024-10-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding JAGGED1 for the treatment of Alagille syndrome
CN109312313A (zh) 2016-06-13 2019-02-05 川斯勒佰尔公司 用于治疗鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症的信使rna疗法
JP7160465B2 (ja) 2016-06-20 2022-10-25 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 植物細胞における標的化ｄｎａ変更のための方法
AU2017280353B2 (en) 2016-06-24 2021-11-11 Inscripta, Inc. Methods for generating barcoded combinatorial libraries
US12385034B2 (en) 2016-06-24 2025-08-12 Modernatx, Inc. Methods and apparatus for filtration
US20190256830A1 (en) * 2016-06-27 2019-08-22 Kyoto University Method for cell-specifically controlling nuclease
US10927383B2 (en) * 2016-06-30 2021-02-23 Ethris Gmbh Cas9 mRNAs
US20190161730A1 (en) 2016-07-07 2019-05-30 Rubius Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to therapeutic cell systems expressing exogenous rna
EP3487523B1 (en) 2016-07-19 2023-09-06 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
GB2568182A (en) 2016-08-03 2019-05-08 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
BR112019003124A2 (pt) * 2016-08-19 2019-10-01 Toolgen Incorporated sistema regulador de angiogênse artificialmente engendrado
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
ES2928475T3 (es) 2016-09-14 2022-11-18 Modernatx Inc Composiciones de ARN de alta pureza y métodos para su preparación
US11306305B2 (en) 2016-09-23 2022-04-19 Board Of Trustees Of Southern Illinois University Tuning CRISPR/Cas9 activity with chemically modified nucleotide substitutions
US11566237B2 (en) * 2016-09-23 2023-01-31 University Of Massachusetts Silencing of DUX4 by recombinant gene editing complexes
GB2573062A (en) 2016-10-14 2019-10-23 Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
EP3538146A4 (en) 2016-11-11 2020-07-15 ModernaTX, Inc. INFLUENZA VACCINE
WO2018115389A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Keygene N.V. Methods of targeted genetic alteration in plant cells
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
JP7688478B2 (ja) 2017-02-15 2025-06-04 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 植物細胞における標的遺伝子変化の方法
EA201991747A1 (ru) 2017-02-27 2020-06-04 Транслейт Био, Инк. НОВАЯ КОДОН-ОПТИМИЗИРОВАННАЯ мРНК CFTR
WO2018165631A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cancer vaccine
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
CN110914310A (zh) 2017-03-10 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 胞嘧啶至鸟嘌呤碱基编辑器
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
WO2018172556A1 (en) * 2017-03-24 2018-09-27 Curevac Ag Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof
WO2018183808A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Agenovir Corporation Antiviral therapeutic
KR101852718B1 (ko) * 2017-04-04 2018-05-18 주식회사 제네웰 외과수술 후 절개부위 통증 감소를 위한 키트
US11905525B2 (en) 2017-04-05 2024-02-20 Modernatx, Inc. Reduction of elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
CA3063531A1 (en) 2017-05-16 2018-11-22 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr
EP3638215A4 (en) 2017-06-15 2021-03-24 Modernatx, Inc. RNA FORMULATIONS
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
JP2020534795A (ja) 2017-07-28 2020-12-03 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物
EP3668977A4 (en) 2017-08-18 2021-04-21 Modernatx, Inc. HPLC ANALYTICAL PROCESSES
US11912982B2 (en) 2017-08-18 2024-02-27 Modernatx, Inc. Methods for HPLC analysis
MA49913A (fr) 2017-08-18 2021-05-05 Modernatx Inc Variants d'arn polymérase
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
JP7275111B2 (ja) 2017-08-31 2023-05-17 モデルナティエックス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子の生成方法
EP3679134A1 (en) 2017-09-08 2020-07-15 Keygene N.V. Balanced indels
AR113154A1 (es) 2017-09-29 2020-01-29 Intellia Therapeutics Inc Polinucleótidos, composiciones y métodos para edición del genoma
KR20250042147A (ko) * 2017-09-29 2025-03-26 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 제제
CA3082251A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
IL321714A (en) 2017-10-19 2025-08-01 CureVac SE Novel artificial nucleic acid molecules
KR102061251B1 (ko) 2017-10-31 2019-12-31 주식회사 에이치유비바이오텍 내인성 폴리펩타이드 생산을 위한 재조합 세포 및 방법
US20210180053A1 (en) 2017-11-01 2021-06-17 Novartis Ag Synthetic rnas and methods of use
US12406749B2 (en) 2017-12-15 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
US20200325532A1 (en) 2017-12-15 2020-10-15 Novartis Ag Polya tail length analysis of rna by mass spectrometry
AU2018392716B2 (en) 2017-12-20 2025-03-13 Translate Bio, Inc. Improved composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
EP3746090A4 (en) 2018-01-29 2021-11-17 ModernaTX, Inc. RSV RNA Vaccines
US11268077B2 (en) 2018-02-05 2022-03-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
EP3755792A4 (en) 2018-02-23 2021-12-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. NEW CASE ORTHOLOGISTS9
WO2019204750A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Cellino Biotech, Inc. Directed cell fate specification and targeted maturation
EP3799603A4 (en) 2018-05-11 2022-03-02 Beam Therapeutics, Inc. METHODS OF PATHOGENIC AMINO ACID SUBSTITUTION USING PROGRAMMABLE BASE EDITOR SYSTEMS
AU2019271132A1 (en) * 2018-05-15 2020-11-12 Translate Bio, Inc. Subcutaneous delivery of messenger RNA
CN108642055B (zh) * 2018-05-17 2021-12-03 吉林大学 能有效编辑猪miR-17-92基因簇的sgRNA
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
TW202023605A (zh) * 2018-07-13 2020-07-01 美商綠陽生物科技及製藥公司 達成基因組編輯之高特異性的方法
US12496311B2 (en) 2018-07-17 2025-12-16 Aronora, Inc. Methods for safely reducing thrombopoietin
EP3841208A1 (en) 2018-08-24 2021-06-30 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
US12383508B2 (en) 2018-09-19 2025-08-12 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
JP7526168B2 (ja) 2018-09-19 2024-07-31 モデルナティエックス インコーポレイテッド Ｐｅｇ脂質及びそれらの使用
US12090235B2 (en) 2018-09-20 2024-09-17 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
US20220010321A1 (en) 2018-11-01 2022-01-13 Keygene N.V. Dual guide rna for crispr/cas genome editing in plants cells
EP3877748A4 (en) 2018-11-06 2022-11-09 Cellino Biotech, Inc. Systems for cell control
MX2021005969A (es) 2018-11-21 2021-09-14 Translate Bio Inc Tratamiento de la fibrosis quística mediante el suministro de arnm que codifica cftr nebulizado.
US10934536B2 (en) 2018-12-14 2021-03-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. CRISPR-CAS systems for genome editing
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
WO2020163379A1 (en) 2019-02-05 2020-08-13 Emendobio Inc. Crispr compositions and methods for promoting gene editing of ribosomal protein s19 (rps19) gene
MA55037A (fr) 2019-02-20 2021-12-29 Modernatx Inc Variants d'arn polymérase pour le coiffage co-transcriptionnel
CN113874502A (zh) 2019-03-11 2021-12-31 摩登纳特斯有限公司 补料分批体外转录方法
MA55321A (fr) 2019-03-15 2022-01-19 Modernatx Inc Vaccins à base d'arn contre le vih
AU2020240109A1 (en) 2019-03-19 2021-09-30 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
US11827926B2 (en) 2020-03-23 2023-11-28 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for the diagnosis and treatment of COVID 19
JP2023522958A (ja) 2020-04-22 2023-06-01 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 核酸を検出するための等温法、組成物、キット、およびシステム
BR112022022603A2 (pt) 2020-05-08 2023-01-17 Broad Inst Inc Métodos e composições para edição simultânea de ambas as fitas de sequência alvo de nucleotídeos de fita dupla
AU2021271317A1 (en) 2020-05-15 2023-01-19 Crispr Therapeutics Ag Messenger RNA encoding Cas9 for use in genome-editing systems
JPWO2022004765A1 (sr) * 2020-06-30 2022-01-06
EP4225946A4 (en) 2020-10-06 2024-10-30 President And Fellows Of Harvard College METHODS, COMPOSITIONS, KITS AND SYSTEMS FOR SIGNAL-BASED DETECTION OF NEUTRALIZATION TARGETS
US12329811B2 (en) 2021-01-11 2025-06-17 Modernatx, Inc. Seasonal RNA influenza virus vaccines
CN112877368B (zh) * 2021-01-25 2023-05-16 华中农业大学 一种用于成熟植物的基因编辑系统及基因编辑方法
IL304969A (en) 2021-02-11 2023-10-01 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Curing disease by transcription regulatory gene editing
US20220363937A1 (en) 2021-05-14 2022-11-17 Armstrong World Industries, Inc. Stabilization of antimicrobial coatings
US20240384277A1 (en) 2021-06-15 2024-11-21 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression
CN118974256A (zh) 2022-03-29 2024-11-15 锐正基因(苏州)有限公司 用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性的组合物和方法
CN119731321A (zh) 2022-06-24 2025-03-28 图恩疗法股份有限公司 通过靶向基因阻遏减少低密度脂蛋白的组合物、系统和方法
WO2024023067A1 (en) 2022-07-25 2024-02-01 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Curing disease by transcription regulatory gene editing
EP4562163A1 (en) 2022-07-26 2025-06-04 ModernaTX, Inc. Engineered polynucleotides for temporal control of expression
CN119948162A (zh) 2022-09-22 2025-05-06 锐正基因(苏州)有限公司 用于治疗高胆固醇血症和/或心血管疾病的组合物和方法
AU2024215535A1 (en) 2023-01-31 2025-08-28 Synplogen Co., Ltd. Artificially synthesized nucleic acid for increasing protein expression
AU2024270764A1 (en) 2023-05-15 2025-12-04 Nchroma Bio, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of hbv gene expression
WO2025108148A1 (zh) * 2023-11-24 2025-05-30 山东舜丰生物科技有限公司 一种活性改善的cas蛋白及其应用
WO2025194138A1 (en) 2024-03-14 2025-09-18 Tessera Therapeutics, Inc. St1cas9 compositions and methods for modulating a genome
CN120290555A (zh) * 2024-12-04 2025-07-11 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种基于CRISPR/Cas12a技术检测双等位基因编辑细胞的方法

Family Cites Families (399)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5759802A (en) 1988-10-26 1998-06-02 Tonen Corporation Production of human serum alubumin A
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
CA2067194C (en) 1989-10-05 2003-03-18 Glenn Kawasaki Cell-free synthesis and isolation of novel genes and polypeptides
AU658562B2 (en) 1989-10-24 1995-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
CA2028849A1 (en) 1990-03-08 1991-09-09 Michinao Mizugaki Monoclonal antibodies, assay method, reagent kit, sarching method and drug missiles using them
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
CA2095212A1 (en) 1990-11-08 1992-05-09 Sudhir Agrawal Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
US5426180A (en) 1991-03-27 1995-06-20 Research Corporation Technologies, Inc. Methods of making single-stranded circular oligonucleotides
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5437976A (en) 1991-08-08 1995-08-01 Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
EP0618925B2 (en) 1991-12-24 2012-04-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE69231123T2 (de) 1992-03-25 2001-02-15 Immunogen Inc Konjugaten von Zell-bindender Mittel und Derivaten von CC-1065
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
ATE198253T1 (de) 1992-09-17 2001-01-15 Dsm Nv Hefederivate und verfahren zum verbessern der brotqualität
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
DK0691968T3 (da) 1993-03-30 1998-02-23 Sanofi Sa Acykliske nukleosid-analoge og oligonukleotidsekvenser indeholdende disse
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
FR2733762B1 (fr) 1995-05-02 1997-08-01 Genset Sa Methode de couplage specifique de la coiffe de l'extremite 5' d'un fragment d'arnm et preparation d'arnm et d'adnc complet
US5808039A (en) 1995-10-18 1998-09-15 Beckman Instruments, Inc. 2'-OMe CAC phosphoramidite and methods for preparation and use thereof
US5871697A (en) 1995-10-24 1999-02-16 Curagen Corporation Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing
US6022737A (en) 1995-11-02 2000-02-08 Amgen Inc. Formulations for non-viral in vivo transfection in the lungs
US5789578A (en) 1996-01-11 1998-08-04 Massey University Methods for the preparation of resins with ligands attached thereto through a linking group comprising sulfide, sulfoxide or sulfone functionality
US7291463B2 (en) 1996-01-23 2007-11-06 Affymetrix, Inc. Nucleic acid labeling compounds
EP0925088A2 (en) 1996-06-28 1999-06-30 Sontra Medical, L.P. Ultrasound enhancement of transdermal transport
US6475388B1 (en) 1996-11-13 2002-11-05 Transgenomic, Inc. Method and system for RNA analysis by matched ion polynucleotide chromatography
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
GB2324370B (en) 1997-04-14 1999-03-03 Stuart Harbron Detection of hybrid double-stranded DNA with antibody after enzyme degradation of excess single-standed DNA
US5989911A (en) 1997-05-09 1999-11-23 University Of Massachusetts Site-specific synthesis of pseudouridine in RNA
US20030073640A1 (en) 1997-07-23 2003-04-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Novel compositions for the delivery of negatively charged molecules
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
JP2001520889A (ja) 1997-10-24 2001-11-06 バレンティス，インコーポレイティド ポリヌクレオチドトランスフェクション複合体を調製する方法
US6548633B1 (en) 1998-12-22 2003-04-15 Genset, S.A. Complementary DNA's encoding proteins with signal peptides
US6517869B1 (en) 1997-12-12 2003-02-11 Expression Genetics, Inc. Positively charged poly(alpha-(omega-aminoalkyl)lycolic acid) for the delivery of a bioactive agent via tissue and cellular uptake
WO1999029758A1 (en) 1997-12-12 1999-06-17 Samyang Corporation Positively-charged poly[alpha-(omega-aminoalkyl)glycolic acid] for the delivery of a bioactive agent via tissue and cellular uptake
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
JP2002500075A (ja) 1998-01-08 2002-01-08 ソントラ メディカル， インコーポレイテッド 超音波伝達で増強される経皮輸送
US8287483B2 (en) 1998-01-08 2012-10-16 Echo Therapeutics, Inc. Method and apparatus for enhancement of transdermal transport
US5955310A (en) 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
US6177274B1 (en) 1998-05-20 2001-01-23 Expression Genetics, Inc. Hepatocyte targeting polyethylene glyco-grafted poly-L-lysine polymeric gene carrier
TR200100254T2 (tr) 1998-07-13 2001-06-21 Expression Genetics, Inc. Eriyebilir ve bakterilerle ayrışabilir bir gen iletim taşıyıcısı olarak poly-l-lysine benzeri bir poliyester.
US6248268B1 (en) 1998-11-16 2001-06-19 Xc Corporation Process of making microparticles of a thermally-gelled polysaccharide
US20040171980A1 (en) 1998-12-18 2004-09-02 Sontra Medical, Inc. Method and apparatus for enhancement of transdermal transport
CA2361201A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
US8410248B2 (en) 1999-03-12 2013-04-02 Human Genome Sciences Inc. HWBAO62 polypeptides
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
JP2002543214A (ja) 1999-05-04 2002-12-17 エクシコン エ／エス Ｌ−リボ−ｌｎａ類縁体
US6270970B1 (en) 1999-05-14 2001-08-07 Promega Corporation Mixed-bed solid phase and its use in the isolation of nucleic acids
CA2311201A1 (en) 1999-08-05 2001-02-05 Genset S.A. Ests and encoded human proteins
EP1083232B1 (en) 1999-09-09 2005-02-23 CureVac GmbH Transfer of mRNA using polycationic compounds
ES2302701T3 (es) 1999-09-10 2008-08-01 Geron Corporation N3'-p5' tiofosforamidatos oligonucleotidicos: su sintesis y uso.
US6511832B1 (en) 1999-10-06 2003-01-28 Texas A&M University System In vitro synthesis of capped and polyadenylated mRNAs using baculovirus RNA polymerase
CA2325169A1 (en) 1999-12-03 2001-06-03 Ndsu Research Foundation Somatostatins and method
CA2393002A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055306A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2001075166A2 (en) 2000-03-31 2001-10-11 Genentech, Inc. Compositions and methods for detecting and quantifying gene expression
AU2001266787A1 (en) 2000-06-07 2002-01-08 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
EP1328636A2 (en) 2000-09-01 2003-07-23 Nuvelo Inc. Nucleic acids and polypeptides
US20040142474A1 (en) 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
US6696038B1 (en) 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
US6521411B2 (en) 2000-09-28 2003-02-18 Transgenomic, Inc. Method and system for the preparation of cDNA
DE60119562T2 (de) 2000-10-04 2007-05-10 Santaris Pharma A/S Verbesserte synthese von purin-blockierten nukleinsäure-analoga
AU2002236524A1 (en) 2000-11-28 2002-06-11 Rosetta Inpharmatics, Inc. In vitro transcription method for rna amplification
US20020130430A1 (en) 2000-12-29 2002-09-19 Castor Trevor Percival Methods for making polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins and other products
US20040142433A1 (en) 2001-02-02 2004-07-22 Padgett Hal S. Polynucleotide sequence variants
US6652886B2 (en) 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
US7211654B2 (en) 2001-03-14 2007-05-01 Regents Of The University Of Michigan Linkers and co-coupling agents for optimization of oligonucleotide synthesis and purification on solid supports
US20050235369A1 (en) 2001-03-28 2005-10-20 Yen Choo Gene regulation II
WO2002085434A1 (de) 2001-04-21 2002-10-31 Curevac Gmbh Injektionsgerät für rna applikation
EP1383887A4 (en) 2001-05-03 2004-07-07 Rensselaer Polytech Inst NEW PROCEDURES FOR DIRECTED EVOLUTION
US20030170891A1 (en) 2001-06-06 2003-09-11 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
ES2356934T3 (es) 2001-06-05 2011-04-14 Curevac Gmbh ARNm ESTABILIZADO CON UN CONTENIDO DE G/C AUMENTADO QUE CODIFICA PARA UN ANTÍGENO VIRAL.
US7235358B2 (en) * 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US6586524B2 (en) 2001-07-19 2003-07-01 Expression Genetics, Inc. Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
EP2428568B1 (en) 2001-09-28 2018-04-25 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Microrna molecules
CA2464626A1 (en) 2001-11-05 2003-05-15 Janssen Pharmaceutica N.V. Method for the in vitro synthesis of short double stranded rnas
AU2002351077A1 (en) 2001-11-05 2003-05-19 Exiqon A/S Oligonucleotides modified with novel alpha-l-rna analogues
US20040076978A1 (en) 2001-11-14 2004-04-22 Catherine Verfaillie Method to identify genes associated with chronic myelogenous leukemia
AU2002359732A1 (en) 2001-12-17 2003-06-30 Ribapharm Inc. Substituted purine nucleoside libraries and compounds by solid-phase combinatorial strategies
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
AU2002366713A1 (en) 2001-12-20 2003-07-09 Incyte Genomics, Inc. Nucleotide polymorphisms associated with osteoarthritis
US20050222064A1 (en) 2002-02-20 2005-10-06 Sirna Therapeutics, Inc. Polycationic compositions for cellular delivery of polynucleotides
DE60310697D1 (de) 2002-03-15 2007-02-08 Epigenomics Ag Entdeckungs- und diagnoseverfahren mit 5-methylcytosin-dna-glycosylase
US7374930B2 (en) 2002-05-21 2008-05-20 Expression Genetics, Inc. GLP-1 gene delivery for the treatment of type 2 diabetes
ATE432347T1 (de) 2002-06-24 2009-06-15 Exiqon As Methoden und systeme zur detektion und isolation von nucleinsäuresequenzen
AU2003264041A1 (en) 2002-08-09 2004-02-25 California Institute Of Technology Method and compositions relating to 5'-chimeric ribonucleic acids
JP4339852B2 (ja) 2002-08-12 2009-10-07 ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド 遺伝子サイレンシングに関する方法および組成物
CN1684978A (zh) 2002-08-31 2005-10-19 希杰株式会社 糖基化的人粒细胞集落刺激因子(g－csf)同种型
AU2003264844A1 (en) 2002-09-24 2004-04-19 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Methods of determining the effect of an agent on diploid cells and/or on the pattern of expression of polypeptides expressed therewith
WO2004042054A1 (ja) 2002-10-23 2004-05-21 Hubit Genomix, Inc. 歯周疾患に関連する遺伝的多型
EP1576126A3 (en) 2002-10-30 2005-10-26 Pointilliste, Inc. Systems for capture and analysis of biological particles and methods using the systems
WO2004064782A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
AU2004222451A1 (en) 2003-03-20 2004-09-30 Keiichi Fukuda Combined use of G-CSF and factors having angiogenic action
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
EP1631676A4 (en) 2003-06-10 2006-12-20 Toolgen Inc TRANSDUCIBLE DNA BINDING PROTEINS
EP2530157B1 (en) 2003-07-31 2016-09-28 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of miRNAs
JP4567683B2 (ja) 2003-09-12 2010-10-20 セダーズ−シナイ メディカル センター ヒトグリオームを阻害するための、ラミニン−８発現のアンチセンス阻害
CA2536139A1 (en) 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
DK1699924T3 (da) 2003-12-03 2019-10-21 Ocunexus Therapeutics Inc Connexin 43-målrettede hæmmende forbindelser og fremgangsmåder til anvendelse deraf i behandling af hornhindetraume
WO2005068664A2 (en) 2004-01-09 2005-07-28 The Regents Of The University Of California Cell-type-specific patterns of gene expression
EP1713514B1 (en) 2004-01-28 2021-11-24 Johns Hopkins University Drugs and gene carrier particles that rapidly move through mucous barriers
US20080103053A1 (en) 2005-11-22 2008-05-01 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for sequencing a nucleic acid
US7527947B2 (en) 2004-06-14 2009-05-05 Novozymes A/S Signal peptide for producing a polypeptide
DE102004035227A1 (de) 2004-07-21 2006-02-16 Curevac Gmbh mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen
EP1791567B1 (en) 2004-08-10 2015-07-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemically modified oligonucleotides
CA2576280A1 (en) 2004-08-13 2006-02-16 Barry J. Marshall Helicobacter pylori-based delivery system
EP1789447B1 (en) 2004-08-16 2012-04-25 Immune Disease Institute, Inc. Method of delivering rna interference and uses thereof
US7361903B2 (en) 2004-09-01 2008-04-22 Koninklijke Philips Electronics N.V. Image system with non-circular patient aperture
EP1797183B1 (en) 2004-09-02 2012-08-01 Yale University Regulation of oncogenes by micrornas
US8057821B2 (en) 2004-11-03 2011-11-15 Egen, Inc. Biodegradable cross-linked cationic multi-block copolymers for gene delivery and methods of making thereof
JP2008519602A (ja) 2004-11-11 2008-06-12 モジュラー ジェネティクス， インコーポレイテッド 多様性を生じるためのラダーアセンブリおよびシステム
US7964571B2 (en) 2004-12-09 2011-06-21 Egen, Inc. Combination of immuno gene therapy and chemotherapy for treatment of cancer and hyperproliferative diseases
CA2590098C (en) 2004-12-10 2015-03-31 Justin Hanes Functionalized poly (ether-anhydride) block copolymers
FR2880345A1 (fr) 2004-12-30 2006-07-07 Adisseo Ireland Ltd Synthese et applications de l'acide 2-oxo-4-methylthiobutyrique, ses tels et ses derives
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
JP5042863B2 (ja) 2005-02-14 2012-10-03 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 生物学的に活性な分子をデリバリーするための脂質ナノ粒子系組成物および方法
MX2007016561A (es) 2005-06-30 2008-03-10 Archemix Corp Materiales y metodos para la generacion de transcriptos de acido nucleico completamente modificados en la posicion 2.
US8101385B2 (en) 2005-06-30 2012-01-24 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides
WO2007024778A2 (en) 2005-08-22 2007-03-01 Applera Corporation Device, system and method for depositing processed immiscible-fluid-discrete-volumes
EP4174179B1 (en) 2005-08-23 2025-05-07 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
US9012219B2 (en) 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
US9157066B2 (en) 2005-12-13 2015-10-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Transcriptome transfer produces cellular phenotype conversion
US20070161031A1 (en) 2005-12-16 2007-07-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Functional arrays for high throughput characterization of gene expression regulatory elements
WO2007092182A2 (en) 2006-01-26 2007-08-16 University Of Massachusetts Rna interference agents for therapeutic use
US7399845B2 (en) 2006-01-27 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
WO2007120863A2 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Epicentre Technologies Kits and methods for generating 5' capped rna
DE602007013559D1 (de) 2006-07-07 2011-05-12 Univ Aarhus Nanoteilchen zur abgabe von nukleinsäure
EP2049665A2 (en) 2006-07-28 2009-04-22 Applera Corporation Dinucleotide mrna cap analogs
WO2008017473A2 (en) 2006-08-08 2008-02-14 Gunther Hartmann Structure and use of 5' phosphate oligonucleotides
DE602007012559D1 (de) 2006-09-08 2011-03-31 Univ Johns Hopkins H die schleimhaut
GB2445441B (en) 2006-09-26 2010-06-30 Ge Healthcare Bio Sciences Nucleic acid purification method
CA2668818C (en) 2006-10-10 2018-06-26 Xenomics, Inc. Compositions, methods and kits for isolating nucleic acids from body fluids using anion exchange media
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
DE102006061015A1 (de) 2006-12-22 2008-06-26 Curevac Gmbh Verfahren zur Reinigung von RNA im präparativen Maßstab mittels HPLC
WO2008078180A2 (en) 2006-12-22 2008-07-03 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
JP2010519203A (ja) 2007-02-16 2010-06-03 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 生物活性分子の活性を強化するための組成物及び方法
EP2135080A4 (en) 2007-03-08 2010-12-01 Switchgear Genomics FUNCTIONAL NETWORKS FOR THE CHARACTERIZATION OF TREATMENT OF REGULATORY ELEMENTS IN NON-TRANSLATED REGIONS OF GENES
GB0706243D0 (en) 2007-03-30 2007-05-09 Univ Southampton Modified nucleic acids
AU2008245585B2 (en) 2007-04-27 2011-10-06 Echo Therapeutics, Inc. Skin permeation device for analyte sensing or transdermal drug delivery
US7682789B2 (en) 2007-05-04 2010-03-23 Ventana Medical Systems, Inc. Method for quantifying biomolecules conjugated to a nanoparticle
US20080311140A1 (en) 2007-05-29 2008-12-18 Baylor College Of Medicine Antigen specific immunosuppression by dendritic cell therapy
US20090042825A1 (en) 2007-08-06 2009-02-12 Majed Matar Composition, method of preparation & application of concentrated formulations of condensed nucleic acids with a cationic lipopolymer
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
CA2715078C (en) * 2007-09-26 2019-07-23 Intrexon Corporation Synthetic 5'utrs, expression vectors, and methods for increasing transgene expression
JP5410434B2 (ja) 2007-09-28 2014-02-05 バインド セラピューティックス インコーポレイテッド ナノ粒子を用いた癌細胞の標的化
WO2009058911A2 (en) 2007-10-31 2009-05-07 Applied Biosystems Inc. Preparation and isolation of 5' capped mrna
US7871985B2 (en) 2007-12-10 2011-01-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of factor VII gene
WO2009074968A2 (en) 2007-12-12 2009-06-18 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Method for predicting the efficacy of cancer therapy
WO2009117167A1 (en) 2008-01-02 2009-09-24 Blood Cell Storage, Inc. Devices and processes for nucleic acid extraction
SI2176408T1 (sl) 2008-01-31 2015-05-29 Curevac Gmbh Nukleinske kisline, ki vsebujejo formulo (NuGiXmGnNv)a in njeni derivati kot imunostimulirajoča sredstva/adjuvanse
WO2009108891A2 (en) 2008-02-29 2009-09-03 Egen, Inc. Modified poloxamers for gene expression and associated methods
US20100004315A1 (en) 2008-03-14 2010-01-07 Gregory Slobodkin Biodegradable Cross-Linked Branched Poly(Alkylene Imines)
WO2009120878A2 (en) 2008-03-26 2009-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Non-natural ribonucleotides, and methods of use thereof
PL2279254T3 (pl) 2008-04-15 2017-11-30 Protiva Biotherapeutics Inc. Nowe preparaty lipidowe do dostarczania kwasów nukleinowych
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
PL215513B1 (pl) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka
WO2009147519A1 (en) 2008-06-06 2009-12-10 Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs- Use of endo-lysosomal system and secreted vesicles (exosome-like) in treatments and diagnostics based on small rna and experimental study of small rna
HUE035770T2 (en) 2008-06-16 2018-05-28 Pfizer Process for the preparation of diblock copolymers functionalized with targeting material for use in the preparation of therapeutic nanoparticles
WO2010005725A2 (en) 2008-06-16 2010-01-14 Bind Biosciences, Inc. Therapeutic polymeric nanoparticles comprising vinca alkaloids and methods of making and using same
DK2774608T3 (da) 2008-06-16 2020-01-13 Pfizer Lægemiddelladede polymere nanopartikler og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse deraf
US8613951B2 (en) 2008-06-16 2013-12-24 Bind Therapeutics, Inc. Therapeutic polymeric nanoparticles with mTor inhibitors and methods of making and using same
US20100009424A1 (en) 2008-07-14 2010-01-14 Natasha Forde Sonoporation systems and methods
MX2011000023A (es) 2008-07-24 2011-03-30 Meiji Seika Kaisha Gen biosintetico de piripiropeno a.
EP2304026A4 (en) 2008-07-31 2013-12-18 Belrose Pharma Inc NANOPARTICLE COMPOSITIONS FOR A NUCLEIC ACID DELIVERY SYSTEM
CN105030809A (zh) 2008-08-01 2015-11-11 协和发酵麒麟株式会社 抑制靶基因表达的组合物
US20110201103A1 (en) 2008-08-07 2011-08-18 University Of Southern California System For Synergetic Expression Of Multiple Small Functional RNA Elements
EP2326331A4 (en) 2008-08-18 2013-05-15 Merck Sharp & Dohme NEW LIPID NANOPARTICLES AND NEW COMPONENTS FOR THE RELEASE OF NUCLEIC ACIDS
WO2010030763A2 (en) 2008-09-10 2010-03-18 Bind Biosciences, Inc. High throughput fabrication of nanoparticles
US20100075072A1 (en) 2008-09-25 2010-03-25 Tsung-Wei Chen Decorative structure of tree-shaped bells
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
JP6087504B2 (ja) 2008-11-07 2017-03-01 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー アミノアルコールリピドイドおよびその使用
EA201100765A1 (ru) 2008-12-15 2012-04-30 Бинд Биосаиэнсис Наночастицы длительной циркуляции для замедленного высвобождения терапевтических средств
US8367330B2 (en) 2008-12-22 2013-02-05 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting TCR-gamma gene rearrangement
WO2010080724A1 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
US8669085B2 (en) 2009-02-05 2014-03-11 Ut-Battelle, Llc Transformation of gram positive bacteria by sonoporation
KR101800833B1 (ko) 2009-03-20 2017-11-23 씨엘에스엔 래버러토리스, 인코퍼레이티드 폴리아민 유도체
CN102439047B (zh) 2009-03-24 2014-05-07 科学与工业研究会 用于从海藻提取物制备琼脂糖聚合物的方法
US20100261228A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 California Institute Of Technology Multiplexed sites for polymer synthesis
US20110223201A1 (en) 2009-04-21 2011-09-15 Selecta Biosciences, Inc. Immunonanotherapeutics Providing a Th1-Biased Response
WO2010123501A1 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
EP3028707A1 (en) 2009-05-01 2016-06-08 Ophthotech Corporation Methods for treating or preventing ophthalmological diseases
KR102229618B1 (ko) 2009-05-05 2021-03-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 지질 조성물
WO2010138193A2 (en) 2009-05-27 2010-12-02 Selecta Biosciences, Inc. Targeted synthetic nanocarriers with ph sensitive release of immunomodulatory agents
SG10201912450XA (en) * 2009-06-10 2020-03-30 Arbutus Biopharma Corp Improved lipid formulation
US8765370B2 (en) 2009-06-11 2014-07-01 Scinopharm Taiwan, Ltd Inhibition-based high-throughput screen strategy for cell clones
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
EP3058953A1 (en) 2009-07-07 2016-08-24 The Research Foundation Of State University Of New York Lipidic compositions for induction of immune tolerance
WO2011008260A2 (en) 2009-07-13 2011-01-20 President And Fellows Of Harvard College Bifunctional stapled polypeptides and uses thereof
EP3581197A1 (de) 2009-07-31 2019-12-18 ethris GmbH Rna mit einer kombination aus unmodifizierten und modifizierten nucleotiden zur proteinexpression
US8598327B2 (en) 2009-08-18 2013-12-03 Baxter International Inc. Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics
US9181295B2 (en) 2009-08-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids with various head groups for oligonucleotide delivery
GB2473814B (en) 2009-09-16 2014-06-11 Spheritech Ltd Hollow particulate support
EP2485770A4 (en) 2009-10-08 2013-04-10 Merck Sharp & Dohme Novel cationic lipids with short lipid chains for oligonucleotide delivery
EP2496700B1 (en) * 2009-11-04 2017-03-01 The University Of British Columbia Nucleic acid-containing lipid particles and related methods
CA2782676C (en) 2009-12-01 2021-06-15 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Pharmaceutical compositions for intracellular delivery of nucleic acids and proteins and uses thereof for treatment of ureca cycle metabolic disorders
LT3287525T (lt) 2009-12-07 2020-02-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rnr preparatai, apimantys išgrynintą modifikuotą rnr, skirti ląstelių reprogramavimui
US8357401B2 (en) 2009-12-11 2013-01-22 Bind Biosciences, Inc. Stable formulations for lyophilizing therapeutic particles
WO2011084518A2 (en) 2009-12-15 2011-07-14 Bind Biosciences, Inc. Therapeutic polymeric nanoparticles comprising corticosteroids and methods of making and using same
US9295649B2 (en) 2009-12-15 2016-03-29 Bind Therapeutics, Inc. Therapeutic polymeric nanoparticle compositions with high glass transition temperature or high molecular weight copolymers
EP2512459A4 (en) 2009-12-15 2013-08-07 THERAPEUTIC POLYMERIC NANOPARTICLES COMPRISING EPOTHILONE AND METHODS OF MAKING AND USING SAME
WO2011078037A1 (ja) 2009-12-21 2011-06-30 国立大学法人広島大学 老化マーカー、老化抑制物質の評価方法および癌抑制剤
JP2011130725A (ja) 2009-12-25 2011-07-07 Contig I:Kk Ｌｎａオリゴヌクレオチドとそれを含有する化粧品
WO2011085231A2 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic virus-like particles conjugated to human papillomavirus capsid peptides for use as vaccines
EP2526113B1 (en) 2010-01-22 2016-08-10 Sirna Therapeutics, Inc. Post-synthetic chemical modification of rna at the 2'-position of the ribose ring via "click" chemistry
WO2011104027A1 (en) 2010-02-26 2011-09-01 Qiagen Gmbh Process for parallel isolation and/or purification of rna and dna
US20110218170A1 (en) 2010-03-02 2011-09-08 Southern Research Institute Use of 2'-deoxy-4'-thiocytidine and its analogues as dna hypomethylating anticancer agents
EP2547345A1 (en) 2010-03-18 2013-01-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Endosomolytic poly(amidoamine) disulfide polymers for the delivery of oligonucleotides
EP2558074B1 (en) 2010-04-08 2018-06-06 The Trustees of Princeton University Preparation of lipid nanoparticles
US20110262491A1 (en) 2010-04-12 2011-10-27 Selecta Biosciences, Inc. Emulsions and methods of making nanocarriers
CA3122219A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 The Children's Hospital Corporation Sustained polypeptide expression from synthetic, modified rnas and uses thereof
WO2011127933A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
EP2377938A1 (en) 2010-04-16 2011-10-19 Eukarys Capping-prone RNA polymerase enzymes and their applications
US20130260460A1 (en) 2010-04-22 2013-10-03 Isis Pharmaceuticals Inc Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides
JP2013531634A (ja) 2010-05-24 2013-08-08 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション オリゴヌクレオチド送達のための新規なアミノアルコールカチオン性脂質
KR20190067277A (ko) 2010-05-28 2019-06-14 제넨테크, 인크. 락테이트 데히드로게나제 및 피루베이트 데히드로게나제 키나제의 발현의 하향조절에 의한 락테이트 수준의 감소 및 폴리펩티드 생산의 증가
DK2575767T3 (en) 2010-06-04 2017-03-13 Sirna Therapeutics Inc HOWEVER UNKNOWN LOW MOLECULAR CATIONIC LIPIDS TO PROCESS OIGONUCLEOTIDES
FI4005592T3 (fi) 2010-07-06 2023-01-13 Virionin kaltaisia kuljetuspartikkeleita itsereplikoituville rna-molekyyleille
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
PT3981427T (pt) * 2010-08-31 2022-06-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lipossomas peguilados para entrega de arn codificador de imunogénio
JP5961170B2 (ja) 2010-09-20 2016-08-02 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． オリゴヌクレオチドの送達のための新規な低分子量カチオン性脂質
JP2013545723A (ja) 2010-09-30 2013-12-26 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション オリゴヌクレオチドの送達のための低分子量カチオン性脂質
RS63430B1 (sr) 2010-10-01 2022-08-31 Modernatx Inc Ribonukleinske kiseline koje sadrže n1-metil-pseudouracile i njihove primene
US10078075B2 (en) 2011-12-09 2018-09-18 Vanderbilt University Integrated organ-on-chip systems and applications of the same
US8898864B1 (en) 2010-10-08 2014-12-02 David Porter Integrated rockably released leverage snap fastening system
US9029590B2 (en) 2010-10-21 2015-05-12 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
EA201390600A1 (ru) 2010-10-22 2013-09-30 Байнд Терапьютикс, Инк. Терапевтические наночастицы с сополимерами с большим молекулярным весом
CA2816977C (en) 2010-11-05 2019-10-29 The Johns Hopkins University Compositions and methods relating to reduced mucoadhesion
US9067882B2 (en) 2010-11-05 2015-06-30 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cyclic amine containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
US8987377B2 (en) 2010-11-19 2015-03-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Poly(amide) polymers for the delivery of oligonucleotides
US8901101B2 (en) 2010-12-17 2014-12-02 Sirna Therapeutics, Inc. Membrane lytic poly(amido amine) polymers for the delivery of oligonucleotides
US20120171229A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarriers with reactive groups that release biologically active agents
US10364440B2 (en) 2011-01-04 2019-07-30 Brown University Nanotubes as carriers of nucleic acids into cells
US9999673B2 (en) 2011-01-11 2018-06-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. PEGylated lipids and their use for drug delivery
DE102011082231A1 (de) 2011-01-12 2012-07-12 Robert Bosch Gmbh Zündspule, insbesondere für kleinbauende Motoren
WO2012099805A2 (en) 2011-01-19 2012-07-26 Ocean Nanotech, Llc Nanoparticle based immunological stimulation
EP2691101A2 (en) 2011-03-31 2014-02-05 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2012138530A1 (en) 2011-04-04 2012-10-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services 2'-o-aminooxymethyl nucleoside derivatives for use in the synthesis and modification of nucleosides, nucleotides and oligonucleotides
CN103687957A (zh) 2011-05-17 2014-03-26 现代治疗公司 工程化核酸及其用于非人类脊椎动物的方法
US8691750B2 (en) 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
US20140113376A1 (en) * 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
US20130046083A1 (en) 2011-08-16 2013-02-21 Tom Brown Oligonucleotide ligation
US8846883B2 (en) 2011-08-16 2014-09-30 University Of Southhampton Oligonucleotide ligation
US20130058970A1 (en) 2011-09-06 2013-03-07 Selecta Biosciences, Inc. Induced tolerogenic dendritic cells to reduce systemic inflammatory cytokines
US20130066063A1 (en) 2011-09-09 2013-03-14 John Cooke Hodges Bicyclo[6.1.0]non-4-yne regents for chemical modification of oligonucleotides
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2755986A4 (en) 2011-09-12 2015-05-20 Moderna Therapeutics Inc MANIPULATED NUCLEIC ACIDS AND METHOD OF APPLICATION THEREFOR
WO2013039861A2 (en) 2011-09-12 2013-03-21 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DK3682905T3 (da) 2011-10-03 2022-02-28 Modernatx Inc Modificerede nukleosider, nukleotider og nukleinsyrer og anvendelser deraf
US9579338B2 (en) * 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
KR102046968B1 (ko) 2011-11-04 2019-12-02 닛토덴코 가부시키가이샤 지질-핵산입자를 멸균생성을 위한 단일 용도 시스템
WO2013071047A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for in vitro transcription of rna
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
CA2856742A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
WO2013086486A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 President And Fellows Of Harvard College Integrated human organ-on-chip microphysiological systems
US10087422B2 (en) 2011-12-09 2018-10-02 President And Fellows Of Harvard College Organ chips and uses thereof
CA2858884A1 (en) 2011-12-12 2013-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Proteins comprising mrsa pbp2a and fragments thereof, nucleic acids encoding the same, and compositions and their use to prevent and treat mrsa infections
WO2013130161A1 (en) 2011-12-14 2013-09-06 modeRNA Therapeutics Methods of responding to a biothreat
EP2791159A4 (en) 2011-12-14 2015-10-14 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED NUCLEIC ACIDS AND ACUTE TREATMENT USES THEREOF
WO2013090897A1 (en) 2011-12-15 2013-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Using adaptive immunity to detect drug resistance
DE12858350T1 (de) 2011-12-16 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte mrna zusammensetzungen
WO2013096709A2 (en) 2011-12-21 2013-06-27 modeRNA Therapeutics Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant
WO2013101690A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 modeRNA Therapeutics Modified mrnas encoding cell-penetrating polypeptides
HUE047947T2 (hu) 2011-12-30 2020-05-28 Cellscript Llc In vitro szintetizált ssRNS elõállítása és alkalmazása emlõssejtekbe történõ bevezetésre biológiai vagy biokémiai hatás indukálására
WO2013103659A1 (en) 2012-01-04 2013-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Stabilizing rna by incorporating chain-terminating nucleosides at the 3'-terminus
US20150030576A1 (en) 2012-01-10 2015-01-29 Moderna Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeting agents into and across the blood-brain barrier
WO2013113326A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
WO2013113325A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Negatively charged nucleic acid comprising complexes for immunostimulation
CN103325662B (zh) 2012-03-21 2016-03-30 清华大学 半导体性单壁碳纳米管的制备方法
HK1206601A1 (en) 2012-04-02 2016-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
CN104411338A (zh) 2012-04-02 2015-03-11 现代治疗公司 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US20150050354A1 (en) 2012-04-02 2015-02-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions
EP2647426A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
US20150150996A1 (en) 2012-06-06 2015-06-04 Northwestern University Compositions and methods for antigen-specific tolerance
JP6561378B2 (ja) 2012-06-08 2019-08-21 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド 非肺標的細胞へのｍＲＮＡの経肺送達
EP2885419A4 (en) 2012-08-14 2016-05-25 Moderna Therapeutics Inc ENZYMES AND POLYMERASES FOR RNA SYNTHESIS
HRP20220607T1 (hr) 2012-11-26 2022-06-24 Modernatx, Inc. Terminalno modificirana rna
IL239344B2 (en) * 2012-12-12 2024-06-01 Broad Inst Inc Systems engineering, methods and optimal guiding components for sequence manipulation
EP4299741A3 (en) * 2012-12-12 2024-02-28 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
EP2931319B1 (en) 2012-12-13 2019-08-21 ModernaTX, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
WO2014093574A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for altering cell phenotype
WO2014113089A2 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
US20160022840A1 (en) 2013-03-09 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Heterologous untranslated regions for mrna
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
WO2014160243A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and purity assessment of rna molecules synthesized with modified nucleosides
CN105026411A (zh) 2013-03-14 2015-11-04 夏尔人类遗传性治疗公司 含4’-硫代修饰的核苷酸的核糖核酸及相关方法
WO2014160284A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of stroke
US20160032273A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US11377470B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Modernatx, Inc. Ribonucleic acid purification
WO2014144711A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
US20140273230A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
US10077439B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
EP2971033B8 (en) 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
JP2016522679A (ja) 2013-04-04 2016-08-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたゲノム編集の治療的使用
JP2016528890A (ja) 2013-07-09 2016-09-23 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集の治療用の使用
RS62529B1 (sr) 2013-07-11 2021-11-30 Modernatx Inc Kompozicije koje sadrže sintetičke polinukleotide koji kodiraju proteine povezane sa crispr i sintetičke sgrnk i postupci upotrebe
MX2016002044A (es) 2013-08-16 2016-08-17 Rana Therapeutics Inc Composiciones y metodos para modular el acido ribonucleico.
US20160194625A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
US9925277B2 (en) 2013-09-13 2018-03-27 Modernatx, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
GB201317301D0 (en) 2013-09-30 2013-11-13 Linnarsson Sten Method for capturing and encoding nucleic acid from a plurality of single cells
WO2015051169A2 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
EP3052479A4 (en) 2013-10-02 2017-10-25 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015051214A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
WO2015058069A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods for tolerizing cellular systems
WO2015070413A1 (zh) 2013-11-14 2015-05-21 深圳智慧能源技术有限公司 陶瓷热屏蔽片及耐热结构
WO2015085318A2 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Moderna Therapeutics, Inc. Targeted adaptive vaccines
EP2918275B1 (en) 2013-12-13 2016-05-18 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
CN105874072A (zh) 2013-12-30 2016-08-17 库瑞瓦格股份公司 人工核酸分子
EP3092250A4 (en) 2014-01-08 2017-05-24 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides for the in vivo production of antibodies
DK3134131T3 (en) 2014-04-23 2022-02-07 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines
WO2015196118A1 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
US10286086B2 (en) 2014-06-19 2019-05-14 Modernatx, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
WO2015196130A2 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
EP3169335B8 (en) 2014-07-16 2019-10-09 ModernaTX, Inc. Circular polynucleotides
CN106794141B (zh) 2014-07-16 2021-05-28 诺华股份有限公司 将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法
AU2015289583A1 (en) 2014-07-16 2017-02-02 Modernatx, Inc. Chimeric polynucleotides
US20170348415A1 (en) 2014-09-03 2017-12-07 Moderna Therapeutics, Inc. Tolerogenic compositions and methods
EP3461904A1 (en) 2014-11-10 2019-04-03 ModernaTX, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
EP3247363A4 (en) 2015-01-21 2018-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
US20180085474A1 (en) 2015-01-23 2018-03-29 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
EP3294885B1 (en) 2015-05-08 2020-07-01 CureVac Real Estate GmbH Method for producing rna
CA3002922A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EP3718565B1 (en) 2015-10-22 2022-04-27 ModernaTX, Inc. Respiratory virus vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
US20220111079A1 (en) 2022-04-14
ES2896755T3 (es) 2022-02-25
US20160367702A1 (en) 2016-12-22
LT3019619T (lt) 2021-12-10
US11027025B2 (en) 2021-06-08
JP2022164843A (ja) 2022-10-27
AU2021200486A1 (en) 2021-02-25
PT3019619T (pt) 2021-11-11
JP7019233B2 (ja) 2022-02-15
EP3019619A4 (en) 2017-01-11
AU2021200486B2 (en) 2023-08-31
EP3971287A1 (en) 2022-03-23
DK3019619T3 (da) 2021-10-11
HRP20211563T1 (hr) 2022-01-07
JP2022115896A (ja) 2022-08-09
JP2016523564A (ja) 2016-08-12
SI3019619T1 (sl) 2021-12-31
AU2014287009B2 (en) 2020-10-29
AU2014287009A1 (en) 2016-02-11
EP3019619B1 (en) 2021-08-25
CY1124740T1 (el) 2022-07-22
WO2015006747A2 (en) 2015-01-15
PL3019619T3 (pl) 2022-01-10
JP7225456B2 (ja) 2023-02-20
EP3019619A2 (en) 2016-05-18
HUE056760T2 (hu) 2022-03-28
CA2917348A1 (en) 2015-01-15
SMT202100691T1 (it) 2022-01-10
JP2020108379A (ja) 2020-07-16
WO2015006747A3 (en) 2015-04-23
JP7136826B2 (ja) 2022-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7225456B2 (ja) ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡを含む組成物ならびに使用方法
EP2970987B1 (en) Compositions and methods of altering cholesterol levels
US9790531B2 (en) Enzymes and polymerases for the synthesis of RNA
US20180291335A1 (en) Modified polynucleotides for altering cell phenotype
EP3434774A1 (en) Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
US20170210788A1 (en) Modified polynucleotides for the production of intrabodies
RS63237B1 (sr) Terminalno modifikovana rnk
WO2014159813A1 (en) Long-lived polynucleotide molecules
US20140378538A1 (en) Methods of responding to a biothreat
HK40070836A (en) Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
HK1224700B (en) Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
HK40005169A (en) Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
HK1220489B (en) Compositions and methods of altering cholesterol levels