JP4567683B2 - ヒトグリオームを阻害するための、ラミニン−８発現のアンチセンス阻害 - Google Patents

Description

本願は、２００３年９月１２日に出願された米国仮特許出願６０／５０２，７２９に基づき、これから優先権を主張する。

（イントロダクション）
神経膠性腫瘍は、小児の癌死亡の主要な原因である［非特許文献１］。概して、神経膠性腫瘍は、すべての癌の１．４％を占め、そしてすべての癌死亡の２．４％を占める。低悪性度星状細胞腫患者または希突起神経膠腫患者の平均的な生存期間は、６年〜８年である。この生存期間は、未分化星状細胞腫を有する患者に関しては、３年に減少し、そして多形性膠芽腫（ＧＢＭ）については、１２カ月〜１８ヶ月に落ちる。現在、これらの腫瘍は、外科手術による除去、放射線療法、化学療法またはこれらの治療法の組み合わせにより処置される。大多数のＧＢＭは、非常に浸潤性であり、そして原発部位（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｉｔｅ）において急速に再発を進展させる。治療に対する腫瘍の予後および応答は、同一の組織学的な診断をした場合でさえ、大幅に異なり得る［非特許文献２］。神経膠細胞性腫瘍についての、予後の改善、処置に対する応答の予測、および新規の有効な治療上のアプローチの開発は、異なるグリオームの発現およびこれらの後の再発に関与する、種々のグリオームおよびその後の再発を伴う新規の特異的マーカーの診療（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）への導入に大きく依存し得るということが一般的に認識されている。

多くのグリオームマーカー（例えば、グリア線維酸性タンパク質、ビメンチン、シナプトフィジンおよびネスチン）を確立し、そして特徴付けるための試みが行われている。しかし、グリオームにおけるこれらのマーカーの特異な発現の決定（イムノフェノタイピング（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ））は、現存する治療上のアプローチ、処置の成功率、または疾患の転帰の予測を変化させなかった［非特許文献２，非特許文献３］。次に、研究者は、強力な遺伝子アレイ技術を用いて、新規のグリオームマーカーを同定しようとした［非特許文献４〜７］。最近、本発明者らのグループは、神経膠細胞性腫瘍の新規の分子マーカー、ラミニン−８（これは、良性腫瘍および正常な脳組織と比較して、悪性腫瘍において差次的に発現された）を記述した［非特許文献５］。

すべてのラミニンは、共有結合された３種の鎖、α、β、γからなる。最近、別個の基底膜（ＢＭ）に存在するこのファミリーの１５のメンバー（イソ型）が記載されている［非特許文献８〜１０］。ラミニンは、種々のレセプターを介して、細胞と相互作用する。これらのレセプターのほとんどは、インテグリンのヘテロダイマーのファミリーに属するが、他の分子（ジストログリカン複合体およびＬｕｔｈｅｒａｎ血液型糖タンパク質）もまた、ラミニンに結合することが示されている。異なる細胞の類型において、インテグリンα_１β_１、α_２β_１、α_３β_１、α_６β_１、α_６β_４、α_７β_１が、ラミニンに結合する能力を有することが報告されている。特定のラミニンのイソ型は、これらの別個のインテグリンのいくつかを結合するが、すべてを結合するわけではなく、そして各インテグリンは、１種より多くのラミニンのイソ型に結合し得る［非特許文献１０，非特許文献１１］。

ＩＶ型コラーゲン、ニドジェンおよびパールカンに加えて、ラミニンファミリーの糖タンパク質は、脳微小血管ＢＭの主要な構成物である［非特許文献８，非特許文献１２，非特許文献１３］。これらのＢＭは、複雑な構造を有し、そして内皮細胞およびグリア細胞の両方により生み出される［非特許文献１３］。内皮細胞は、α４鎖およびα５鎖を含むラミニンがこれらのＢＭに寄与し、その一方で、グリア細胞は、α１鎖およびα２鎖を含むラミニンを合成する［非特許文献１３］。ヒトの脳の毛細血管ＢＭにおいて、本発明者らは、最近、α４鎖を含むラミニン−９の弱い発現を観察した。興味深いことに、ヒトのグリオームの進行の間に、α４鎖を含む毛細血管ＢＭラミニンの発現が、優勢のラミニン−９（α４β２γ１）からラミニン−８（α４β１γ１）へとスイッチする［非特許文献５］。ラミニン−８およびそのレセプター、インテグリンα_３β_１およびα_６β_１は、内皮細胞ＢＭが機能するのに重要であると考えられ、この内皮細胞ＢＭは、血液脳関門の維持に役割を果たす［非特許文献１４，非特許文献１５］。最近、ラミニンα４鎖と新脈管形成との関連が、インビボおよびインビトロで証明された［非特許文献１６］。いくつかの培養されたグリオーム細胞株はまた、α４を含むラミニンを産生し得る。ラミニン−８は、発生の期間、創傷の治癒の期間、および新脈管形成の期間に、細胞移動（ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に役割を果たすと考えられている［非特許文献８，非特許文献１０，非特許文献１４］。
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ（２００３）． Ｓｈａｐｉｒｏ ＷＲ，Ｓｈａｐｉｒｏ ＪＲ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１２：２３３−２４０，１９９８． Ｋａｙｅ ＡＨ，Ｌａｗｓ ＥＲ．（編）．Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ，ｐｐ．９９０.Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，１９９７． Ｌｊｕｂｉｍｏｖａ ＪＹ，Ｋｈａｚｅｎｚｏｎ ＮＭ，Ｃｈｅｎ Ｚ，Ｎｅｙｍａｎ ＹＩ，Ｔｕｒｎｅｒ Ｌ，Ｒｉｅｄｉｎｇｅｒ ＭＳ，Ｂｌａｃｋ ＫＬ．Ｇｅｎｅ ａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉａｌ ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ，１８：２８７−２９５，２００１． Ｌｊｕｂｉｍｏｖａ ＪＹ，Ｌａｋｈｔｅｒ ＡＪ，Ｌｏｋｓｈ Ａ，Ｙｏｎｇ ＷＨ，Ｒｉｅｄｉｎｇｅｒ ＭＳ，Ｍｉｎｅｒ ＪＨ，Ｓｏｒｏｋｉｎ ＭＬ，Ｌｊｕｂｉｍｏｖ ＡＶ，Ｂｌａｃｋ ＫＬ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ α４ ｃｈａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌａｍｉｎｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉａｌ ｔｕｍｏｒｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６１：５６０１−５６１０，２００１． Ｓｅｈｇａｌ Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ，１４：３−１２，１９９８． Ｌａｌ Ａ，Ｌａｓｈ ＡＥ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ Ｖ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，ＭｃＬｅｎｄｏｎ ＲＥ，Ｍａｒｒａ ＭＡ，Ｐｒａｎｇｅ Ｃ，Ｍｏｒｉｎ ＰＪ，Ｐｏｌｙａｋ Ｋ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ Ｎ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ，Ｋｉｎｚｌｅｒ ＫＷ，Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ＲＬ，Ｒｉｇｇｉｎｓ ＧＪ．Ａ ｐｕｂｌｉｃ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５９：５４０３−５４０７，１９９９． Ｍｉｎｅｒ ＪＨ，Ｐａｔｔｏｎ ＢＬ，Ｌｅｎｔｚ ＳＩ，Ｇｉｌｂｅｒｔ ＤＪ，Ｓｎｉｄｅｒ ＷＤ，Ｊｅｎｋｉｎｓ ＮＡ，Ｃｏｐｅｌａｎｄ ＮＧ，Ｓａｎｅｓ ＪＲ．Ｔｈｅ ｌａｍｉｎｉｎ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎｓ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ α１−５，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ ｌａｍｉｎｉｎｓ ８−１１，ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ α３ ｉｓｏｆｏｒｍ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１３７：６８５−７０１，１９９７． Ｃｏｌｏｇｎａｔｏ Ｈ，Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ ＰＤ．Ｆｏｒｍ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｔｈｅ ｌａｍｉｎｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｓ．Ｄｅｖ Ｄｙｎ，２１８：２１３−２３４，２０００． Ｐａｔａｒｒｏｙｏ Ｍ，Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ Ｋ，Ｖｉｒｔａｎｅｎ Ｉ．Ｌａｍｉｎｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ，ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ，１２；１９７−２０７，２００２． Ｂｅｌｋｉｎ ＡＭ，Ｓｔｅｐｐ ＭＡ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ｌａｍｉｎｉｎｓ．Ｍｉｃｒｏｓｃ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈ，５１：２８０−３０１，２０００． Ｋｕｌｌａ Ａ，Ｌｉｉｇａｎｔ Ａ，Ｐｉｉｒｓｏｏ Ａ，Ｒｉｐｐｉｎ Ｇ，Ａｓｓｅｒ Ｔ．Ｔｅｎａｓｃｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｌｉｎｅａｇｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ，１３：５６−６７，２０００． Ｓｉｘｔ Ｍ，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｂ，Ｐａｕｓｃｈ Ｆ，Ｈａｌｌｍａｎｎ Ｒ，Ｗｅｎｄｅｒ Ｏ，Ｓｏｒｏｋｉｎ ＬＭ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌａｍｉｎｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ，ｌａｍｉｎｉｎ ８ ａｎｄ １０，ｐｌａｙ ｄｅｃｉｓｉｖｅ ｒｏｌｅｓ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１５３：９３３−９４６，２００１． Ｔｈｙｂｏｌｌ Ｊ，Ｋｏｒｔｅｓｍａａ Ｊ，Ｃａｏ Ｒ，Ｓｏｉｎｉｎｅｎ Ｒ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｉｉｖａｎａｉｎｅｎ Ａ，Ｓｏｒｏｋｉｎ Ｌ，Ｒｉｓｌｉｎｇ Ｍ，Ｃａｏ Ｙ，Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ Ｋ．Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｍｉｎｉｎ α４ ｃｈａｉｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２２：１１９４−１２０２，２００２． Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｈ，Ｋｉｋｋａｗａ Ｙ，Ｓａｎｚｅｎ Ｎ，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ Ｋ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌａｍｉｎｉｎ−８．Ｌａｍｉｎｉｎ−８ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ α３β１ ａｎｄ α６β１ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６：１７５５０−１７５５８，２００１． Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＡＭ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｍ，Ｈｅｒｒｏｎ ＧＳ，Ｎａｇａｖａｒａｐｕ Ｕ，Ｈｏｐｋｉｎｓｏｎ ＳＢ，Ｔｓｕｒｕｔａ Ｄ，Ｊｏｎｅｓ ＪＣ．Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｌａｍｉｎｉｎ α４ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９：１６０７５−１６０８０，２００２．

（発明の詳細な説明）
ラミニン−８は、インビボでのＧＢＭの再発に関連するので、本発明者らは、ラミニン−８が腫瘍の浸潤に役割を果たし得ると仮説を立てた。インビボでの実験が複雑であるために、本発明者らは、まず、脳の微小血管内皮細胞の、単一培養物および共培養物、正常な胎児の脳の星状細胞ならびにいくつかのＧＢＭを用いて、この可能性をインビトロで調査した。本発明者らは、細胞培養物におけるラミニン鎖発現のパターンが、正常な脳およびグリオームに見られるものと類似するか否か、ならびにアンチセンスアプローチによるラミニン−８の発現の阻害が、再構成されたＢＭ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を介して、グリオームの浸潤に変調をきたすかを分析する。

特定のＲＮＡ配列を結合し、かつこれを不活化するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）は、遺伝子の機能、遺伝子の発現の調節、および遺伝子産物間の相互作用を研究するための最良のツールであり得る。ＲＮＡ産生に関して、相補的ＲＮＡに結合し、そしてタンパク質の翻訳を妨害するための、ＤＮＡテンプレートに擬した非常に特異的なアンチセンスオリゴが使用される［１７，１８］。アンチセンスオリゴは、薬物の開発に関して、治療上の新規の標的を試験するための、最速で、最も単純でかつ最も費用効果の優れたツールである。このアンチセンスアプローチが、本研究において使用され、細胞培養物におけるラミニン−８の発現を阻害した。

発明者らの結果は、正常に培養された星状細胞および内皮細胞が、正常な脳組織において見られるように、ラミニン−９を主として発現する。グリオーム細胞は、ラミニン−８を優勢に発現し、インビボの状況においても同様に発現する。最も重要なことには、ラミニン−８鎖の発現のアンチセンス遮断により、Ｍａｔｒｉｇｅｌを介したグリオームの浸潤が阻害された。これらのデータは、ラミニン−８が、グリオームの浸潤のために重要であり、そして抗腫瘍治療にとって有効な標的であることを示す。つまり、ラミニン−８鎖の発現の違いは、単に悪性の細胞の指標であるだけでなく、悪性腫瘍の浸潤に事実上関連している。

（グリオーム、星状細胞および脳内皮細胞株の共培養）
２つの型のヒトＧＢＭ細胞株（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから；Ｍ０５９ＫおよびＵ−８７ＭＧ）、正常なヒトの脳微小血管内皮細胞株（日本のＤｒ．Ｋｅｎ Ｓａｍｏｔｏから取得したＨＢＭＶＥＣ）、および正常なヒト胎児の脳の星状細胞ＨＡＳＴ ０４０（Ｃｌｏｎｅｘｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから）を使用した。Ｕ−８７ＭＧ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン、炭酸水素ナトリウム、非必須アミノ酸、抗生物質、およびピルビン酸ナトリウムを含有するＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ中で培養した。Ｍ０５９Ｋ細胞株を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＦＣＳ、サプリメントおよび抗生物質は上記の通り）において維持した。星状細胞を通常通り維持する間に、上記ＨＡＳＴ ０４０細胞株を、５％ＦＣＳおよび抗生物質（２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび２．５μｇ／ｍｌのファンギゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ））が補充された５０：５０ ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。この培地を、３日ごとに新しい培地と置き換え、最適な増殖を維持した。ＨＢＭＶＥＣを、１０％ＦＣＳ、１０％ＮＵ−血清、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、および抗生物質を含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。細胞株を、３７℃で維持し、加湿した５％ＣＯ_２インキュベーター中で維持し、そして３日〜４日ごとにトリプシン−ＥＤＴＡで植え継ぎ培養した。細胞株を、４−ウェルチャンバー中で５：１のグリオーム：内皮細胞の比で培養し、そして異なる時点（２４時間、第３日、第５日）で検査した。正常なヒト星状細胞ＨＡＳＴ ０４０細胞およびＨＢＭＶＥＣ細胞の共培養を、４−ウェルチャンバーにおいて、５：１の同一の比率で培養し、そして異なる時点（２４時間、第３日、第５日）で検査した。

（グリオーム−内皮共培養のアンチセンス処理）
ラミニンα 鎖およびラミニンβ１鎖についてＧｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によりカスタムメイドされるＭｏｒｐｈｏｌｉｎｏ^ＴＭ（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー）オリゴは、以下：

の通りであった。

会社の推薦に従って、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓのプロトコールを使用した。新規のＳｐｅｃｉａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎは、Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏオリゴと部分的に相補的なＤＮＡオリゴとの予め対合された二重鎖、および、弱く塩基性の送達試薬、エトキシル化ポリエチレンイミン（ＥＰＥＩ）からなる。モルホリノオリゴは、安定でかつ完全にヌクレアーゼ抵抗性であり、その結果、再送達の必要性がない。グリオーム細胞と正常な脳の内皮細胞との共培養を、選択された時間間隔（３日および６日）で、ラミニン−８（α４鎖およびβ１鎖）のアンチセンスオリゴで、単独でか、または組み合わせて、処理した。送達混合物を作製するために、０．５ｍＭのアンチセンスオリゴ（α４もしくはβ１のラミニン鎖）または０．５ｍＭのセンスオリゴ（ネガティブコントロール）のモルホリノ／ＤＮＡストック溶液（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ）をＨ_２Ｏに添加し、そして混合した。２００μＭのＥＰＥＩ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ溶液を添加し、ボルテックスし、そして２０分間室温でインキュベートし、完全な送達溶液を生成した。培地を、２４時間の共培養物から除去し、そして新鮮な培地中に特定のオリゴを含有する溶液を、細胞に添加し、そしてＣＯ_２インキュベーターへと設置した。３時間後、送達溶液を吸引し、そして新しい血清含有培地で置き換えた。培地を、２日ごとに交換した。各オリゴを、４つのインキュベーション時点にて評価した；第２日、第４日、第６日、第８日（共培養時間は、それぞれ３日、５日、７日、９日であった）。コントロールの別のセットは、内皮細胞のみまたはグリオーム細胞のみを含んだ。

（免疫組織化学）
細胞を、モルホリノを含む培養中またはモルホリノを含まない培養中で培養し、そして選択された時間にて、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過し、そしてラミニン鎖および内皮細胞マーカーについて、免疫染色した。これらのマーカーとしては、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＣＤ３１（クローンＨＣ１／６、Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ、およびクローンＪＣ７０Ａ、Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）、ＣＤ３４（クローンＱＢＥｎｄ １０，Ｄａｋｏ）、ならびにＣＤ１０５（クローンＰ３Ｄ１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）が挙げられた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８−標識アセチル化低密度リポタンパク質（Ａｃ−ＬＤＬ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）をまた、内皮細胞を同定するために使用した。手短に言えば、細胞を、５μｇ／ｍｌの標識化Ａｃ−ＬＤＬを含有する培地中で２４時間インキュベートし、次いで洗浄し、固定し、そして透過した。次いで、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ｓｉｇｍａ）で対比染色し、核を視覚化し、そして選択されたラミニン鎖についてさらに免疫染色した。一次モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を、α４ラミニン鎖（ｍＡｂ ＦＣ１０［１９］、およびｐＡｂ ３７７［５］）、β１ラミニン鎖（ｍＡｂ ＬＴ３；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、ならびにβ２ラミニン鎖（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ Ｃｉｔｙ，ＩＡより取得したｍＡｂ Ｃ４）に使用した。

（Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析）
血清フリーに調整した培地を、同一の期間培養した共培養物に由来する同一容積の培地中の同一数の細胞から得た。共培養物から調製した培地を、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ濾過デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を通して濾過することにより、１０倍に濃縮し、そしてタンパク質を、還元条件下で、３％〜８％勾配のトリス−酢酸ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて分離した。ヒトグリオームＴ９８Ｇの溶解産物（これは、ラミニン−８を発現することが公知である［１５］）を、ポジティブのコントロールとして使用した。このゲルを、ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上にブロットした。この膜を、ｍＡｂでプローブ化し、続いて、アルカリホスファターゼ結合型二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を有するＩｍｍｕｎｅ−Ｓｔａｒキットを用いて化学発光検出を行った。抗体を、ラミニンα４鎖（ｍＡｂ ８Ｂ１２［１５］）およびβ１鎖（ｍＡｂ ＬＴ３）に使用した。第八のフィブロネクチンのＩＩＩ型リピート（ｍＡｂ ５６８［２０］）を使用し、ゲルのレーンの負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）が等しくなるように制御した。

（細胞生育可能性アッセイ）
細胞数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、ＭＴＳダイ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩］を用いて、生育可能な細胞の数を決定するために設計された。製造業者の使用説明書に従い、少量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを、培養ウェルに直接的に添加し、そして３時間のインキュベーションの後、４９０ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡ読み取り機、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて記録した。４９０ｎｍの吸収量により測定されるホルマザン産物の量は、培養物中の生きた細胞数に直接的に比例する。すべての細胞株を、「グリオーム−内皮共培養物のアンチセンス処理」の節において上に記載されるように正確に処理した。生育可能性のアッセイについては、モルホリノセンスオリゴおよびアンチセンスオリゴならびに／または送達因子（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆａｃｔｏｒ）を用いた３日間（これは、発明者らの実験に使用する平均的な時点である）の処理の後に、細胞をインキュベートした。各実験が３通りで遂行され、そして２回繰り返された。

（インビトロでの浸潤アッセイ）
浸潤研究が、腫瘍細胞の浸潤の定量的測定のために開発されたＭａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ ＢＭマトリックスアッセイを用いて行われた。インビボで浸潤性かつ転移性とみなされたほとんどの試験済みの細胞は、インビトロでＭａｔｒｉｇｅｌに浸入し得る［２１，２２，２３］。本発明者らは、ＢｉｏＣｏａｔ^ＴＭＭａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ浸潤チャンバー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡからのＭａｔｒｉｇｅｌの一定の層を有する８．０μｍのＰＥＴ膜を含有する１２−ウェル細胞培養挿入物）を使用した。被覆したフィルターを、暖かい血清フリーなＤＭＥＭ（チャンバーあたり２ｍｌ）で再度水和した。上方のチャンバーを、血清フリーの培地中の２．５×１０^４の細胞で満たした。下方のチャンバーを、化学吸引物質（これに向かって上記細胞が移動する）として５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭで満たした。これらのチャンバーを、３７℃で２２時間、５％ＣＯ_２の大気中でインキュベートした。このフィルターの上方表面からの細胞を、綿棒で洗い落とし、そしてこのフィルターの下部表面に移動するものを固定し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。フィルターを通過した細胞の数を、イメージ加工および測定システムに接続されたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（浜松、日本）を用いて、各フィルターの１０の顕微鏡の視野において、×２００の倍率の下で、カウントした。浸潤百分率を、製造者の使用説明書に従って、コントロールチャンバーからの平均細胞数に対する、浸潤チャンバーからの平均細胞数として表現した。アッセイを、３通りに実行した。各類型の共培養物について、４つの独立した実験を、各処理について実行した。

（統計的分析）
細胞の生育可能性のアッセイおよび浸潤の実験からのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３ソフトウェアプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、ＡＮＯＶＡ試験により統計的に評価した。Ｐが０．０５未満である場合に、有意であるとみなした。

（未処理の培養物における内皮マーカーおよびラミニン鎖の発現の免疫組織化学）
最良の内皮マーカーを選択するために、いくつかの内皮マーカーを試験し、この最良の内皮マーカーを、共培養物中の正常星状細胞および悪性星状細胞から内皮細胞を確実に区別するために使用し得た。予備的な実験において、蛍光Ａｃ−ＬＤＬは、抗体がｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ細胞、ＣＤ３１、ＣＤ３４、またはＣＤ１０５に対してするよりも、ずっと均一に内皮細胞を標識した［２４］。

従って、後の実験において、蛍光Ａｃ−ＬＤＬの取り込みを、内皮細胞を同定するために共培養物と共に使用した。純粋な内皮の培養物では、すべての細胞ではなくとも、ほとんどの細胞が、核の周囲に点状の蛍光が優勢に分布するのを示した（図１）。正常な星状細胞およびグリオーム細胞株の培養物は、主としてネガティブであるが（図１）、いくつかの細胞は、低バックグランドの蛍光を示した。Ａｃ−ＬＤＬの取り込みのおかげで、共培養物においても、ポジティブな内皮細胞の同定が可能になった。

次いで、培養物を、ラミニン−８およびラミニン−９の鎖に対して免疫染色した。インビボでの状況に従い、α４およびβ２の鎖に対して陽性に染色されて培養された正常な内皮細胞は、ラミニン−９の存在と矛盾し得ない（図２Ａ）。同時に、ラミニン−８のβ１鎖に対する染色は、大部分がネガティブであった（図２Ａ）。正常な胎児の星状細胞は、試験済みの任意のラミニン鎖に対して、ほとんど染色しなかった（図２Ａ）。対照的に、グリオームＵ−８７ＭＧ（図示せず）およびＭ０５９Ｋ細胞は、ラミニン−８のα４鎖およびβ１鎖に対して陽性であるが、ラミニン−９のβ２鎖に対しては主としてネガティブであった（図２Ａ）。これらの結果を、タンパク質の充填量の等しい培養物から調整された培地をＷｅｓｔｅｒｎブロット分析することにより、十分に確認した（図２Ｂ）。

正常な星状細胞とＨＢＭＶＥＣとの共培養物において、大部分がα４鎖およびβ２鎖が観察され得、β１鎖の発現は非常にわずかしかなかった（図３）。しかし、グリオーム細胞とＨＢＭＶＥＣとの共培養物では、α４鎖およびβ１鎖は、優勢に発現された（図３）。重要な発見は、ＨＢＭＶＥＣが、悪性の星状細胞と共培養された場合に、ラミニンβ１鎖の発現を開始したことであり、これは、内皮細胞単独の場合においてラミニンβ１鎖の発現が存在しない場合または正常な星状細胞と共培養した場合においてラミニンβ１鎖の発現が存在しない場合と対照的であった（図３）。

これらのデータは、正常星状細胞と内皮細胞との共培養物が、発明者らの以前のインビボでの結果［５］に従い、大部分がラミニン−９を発現したことを示している。さらに、インビボでの状況と同様に、グリオーム細胞単独で、および内皮細胞との共培養物は、大部分がラミニン−８を発現した。従って、確立した共培養システムは、正常な脳環境および腫瘍脳環境の両方において、インビボでの場合と類似する。従って、ラミニン発現データは、グリオーム−内皮共培養物が、腫瘍の進行および再発発生に関連する新規のグリオームマーカーとしてのラミニン−８の発現のさらなる阻害を研究するための妥当なモデルであるという仮説を強力に支持する。

（細胞生育可能性アッセイ）
モルホリノのセンスオリゴおよびアンチセンスオリゴならびに送達因子ＥＰＥＩの潜在的毒性を試験するために、ＭＴＳ−ベースのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６アッセイを用いて、細胞生育可能性を測定した。３種の細胞株（Ｕ−８７ＭＧ、Ｍ０５９ＫおよびＨＢＭＶＥＣ）の生育可能な細胞（これらは、オリゴおよび／または送達因子で処理された）の相対的な数を、いかなる処置もしていない対応する細胞株の複製培養物の細胞数（１００％ととられる）と比較した。２つの別個の実験についてのオリゴ処理後の各細胞株についての細胞の生育可能性は、９０％よりも高かった（図４）。これは、未処理のコントロールとは有意には異ならかった（ｐ＞０．０５）。これらのデータに基づき、本発明者らは、モルホリノオリゴおよび／または送達因子が、任意の重大な毒性効果をいかなる細胞株にも及ぼさないと結論付けた。

（アンチセンス処理培養物におけるラミニン鎖発現の免疫組織化学）
グリオーム−内皮共培養物は、大部分がラミニン−８のα４鎖およびβ１鎖を発現するので（しかし、ラミニン−９のβ２鎖は発現しない）、アンチセンスオリゴを、ラミニン−８発現を遮断する目的でのみ使用した。α４アンチセンスを用いた処理は、この鎖に対する染色の顕著な減少をもたらし、そしてβ１鎖に対する染色の減少をもたらした（図５）。同様の結果が、β１アンチセンス処理を用いて観察され、これは、ラミニンのトリマーの組み立てにおけるこの鎖の役割と矛盾しない。図５の下の列において示されるように、２つのオリゴの組み合わせは、すべての時点において、α４鎖およびβ１鎖に対する染色を劇的に減少した。

（純粋な培養物および共培養物のウェスタンブロット分析）
培養物および共培養された細胞の溶解産物において、ラミニンα４鎖およびβ１鎖のシグナルは、非常に弱く、そして培養または共培養の第５日から第７日にのみ、検出可能であった（データは示さず）。従って、総タンパク質およびフィブロネクチンの含有量により実質的に等倍の濃度に正規化した後、調整した培地中のこれらの鎖の量を、さらに分析した。

図６に示されるように、α４鎖およびβ１鎖の両方を、第３日〜第６日のセンス処理した培養物、およびポジティブコントロール（Ｔ９８Ｇグリオーム細胞溶解産物［１５］）において検出し得る。いずれかの鎖のアンチセンス処理により、両鎖のシグナルが低減した。さらに、両鎖に対する最大阻害を、α４＋β１のアンチセンス処理（各オリゴの濃度０．２５ｍＭにした）の組み合わせにより達成した（図６Ｂ）。これらのデータは、細胞の免疫染色のデータと完全に一致した。

図６Ｃおよび図６Ｄは、フィブロネクチンを検出する膜の、再度のプローブ化を示す。ヒトのフィブロネクチンのみを検出した。Ｔ９８Ｇ、ラミニン−８を発現するＧＢＭ細胞株Ｔ９８Ｇの細胞溶解産物を、ポジティブコントロールとして使用した。酷似した結果を、ＨＢＭＶＥＣと別のグリオーム細胞株、Ｕ−８７ＭＧとの共培養物を用いて得た（データは示さず）。

（Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイ）
Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイを使用して、共培養物の浸潤パラメーターに対する、ラミニン−８のα４鎖およびβ１鎖のアンチセンスオリゴの影響を研究した。コントロールチャンバーにおいて対応するセンスオリゴを使用した。別のセットのコントロールは、内皮細胞を単独でか、またはグリオーム細胞を単独で含んだ。

２種のグリオーム細胞株、Ｕ−８７ＭＧおよびＭ０５９Ｋ（これらには、α４鎖およびβ１鎖に対するセンスオリゴを、単独でかまたは組み合わせてのいずれかで、処理を施したか、または施さなかった）は、それぞれ、９１％および７６％の浸潤ポテンシャルを単独で有した。ＨＭＢＶＥＣ細胞は、１１％の浸潤しか示さなかった。各実験を、３連で３回繰り返した。

次の段階の実験において、グリオーム細胞と内皮細胞との共培養物を、α４アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびβ１アンチセンスオリゴヌクレオチド（単独または組み合わせて）で３日間処理した。この研究で使用した各アンチセンスは、２種の別個の共培養物の類型の浸潤を有意に阻害した（図７）。この研究では、総計６４，２７６個の細胞を有する８４２の顕微鏡視野を評価した。特定の内皮染色は、内皮細胞およびグリオーム細胞の両方が、グリオーム細胞の清澄さが流布した状態で、Ｍａｔｒｉｇｅｌを通して移動することを示した（データは示さず）。ラミニン−８のα４鎖およびβ１鎖のセンスオリゴで処理した共培養物を、１００％であるコントロールとみなした。共培養物をα４アンチセンスオリゴで処理した場合、センスオリゴで処理した培養物に比較して、Ｕ−８７ＭＧ細胞株に関しては、浸潤を４０％だけ遮断し（図７右；、ｐ＜０．０２対コントロール）、Ｍ０５９Ｋ細胞株に関しては、浸潤を４１％だけ遮断した（図７左；ｐ＜０．０３）。β１アンチセンスオリゴはまた、Ｕ−８７ＭＧ共培養物に関しては、浸潤を４０％だけ遮断し（ｐ＜０．０４）、そしてＭ０５９Ｋ共培養物に関しては、浸潤を約４７％だけ遮断した（ｐ＜０．００１）。共培養物をα４鎖に対するアンチセンスオリゴおよびβ１鎖に対するアンチセンスオリゴの両方で処理した場合、浸潤は、Ｕ−８７ＭＧ共培養物に関しては、平均して６２％減少し（ｐ＝０．０００５）、そしてＭ０５９Ｋ共培養物に関しては、５３％減少した（ｐ＜０．０００１）。５つの実験のうち２つの実験において、この阻害は、７５％を超えた（ここには示さず）。

Ｕ−８７ＭＧ細胞において、α４アンチセンス＋β１アンチセンスの組み合わせは、α４アンチセンスまたはβ１アンチセンスよりも効率的にラミニンの発現を阻害し、そしてＭ０５９Ｋ細胞におけるβ１アンチセンスとほぼ等しかった。興味深いことに、α４鎖およびβ１鎖の発現を、より低濃度のアンチセンスオリゴ（０．２５＋０．２５ｍＭ）で、より高濃度のアンチセンスオリゴ（０．５＋０．５ｍＭ）より効率的に阻害した。これは、モルホリノオリゴの濃度を注意深く最適化することが、インビトロおよびインビボの研究において重要であることを示している。生きた細胞のみが浸潤アッセイにおいてＭａｔｒｉｇｅｌを通過し得るという事実を強調することもまた重要である。

（考察）
これは、この複合三量体タンパク質の合成を遮断するアンチセンスインヒビターを用いて、ヒト腫瘍細胞におけるラミニン−８の役割を試験するための最初の研究である。本発明者らは、正常な脳の内皮細胞が、ラミニン−９の少量の鎖、α４およびβ２を発現することを示した。しかし、ラミニン−８の鎖、β１の発現は、検出されなかった。正常な星状細胞は、これらの鎖のいずれをも発現しなかった。このインビトロでの系は、インビボでの正常な脳に類似しており、正常な脳では、優勢なラミニン−９の発現が低かった［５］。同時に、グリオーム細胞は、培養物中で、本発明者らの以前のインビボのデータ［５］に従い、ラミニン−８の鎖を発現した。さらに、グリオーム細胞との共培養物において、脳内皮細胞はまた、（ラミニン−８の産生と両立する）ラミニンβ１鎖の発現を開始し、これは、インビボでのＧＢＭにおけるラミニン−８の過剰発現の発見と一致した（図３）。

これらのデータは、α４鎖を含むラミニンのイソ型発現の、正常なパターンおよび腫瘍のパターンが、培養物のセッティングにおいて保持されたことを明確に示している。従って、発明者らは、インビボ（正常な脳組織において、そしてグリオームの増殖の間の両方）で観察される発現パターンに系として類似する、ラミニン鎖の発現のパターンに関するそれぞれの共培養物を確証し得た。グリオームの進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）に関連するいくつかの新規の、十分に特徴付けられたタンパク質（例えば、テネイシン−Ｃ、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９、［５，１２，２５−２９］）と組み合わせれば、ラミニン−８は、グリオームの潜在的な診断または処置のための有力なツールである。以前、ラミニン−５のみが、黒色腫の浸潤に役割を果たすことが示された［３０］。現在の本発明者らのデータは、「脈管性」ラミニン−８もまた、グリオーム細胞の浸潤性に重要な役割を果たすことを示す。マトリックス−崩壊プロテイナーゼはまた、グリオームの浸潤にとって重要であり［３１］、将来のリサーチは、ラミニンのタンパク質分解が、グリオームの浸潤にとって必要とされるか否かを探求するべきである。

グリオームの浸潤におけるラミニン−８の役割を精査するために、本発明者らは、ラミニン−８の発現を遮断するためにアンチセンスオリゴを使用した。アンチセンスの潜在的可能性は、広く認識されているが、大部分は、十分に力を発揮していないままであり、なぜなら、つい最近まで、利用可能なオリゴは、乏しい特異性、不安定性、および望ましくない非アンチセンス効果を被ったからである［３２，３３］。これらの問題は、種々の疾患（癌を含む）に対して安全でかつ有効な治療を提供するアンチセンスオリゴの新規の生成により、主として解決されている［３３，３４］。最も有望な類型のオリゴは、モルホリノおよびペプチド核酸（ＰＮＡ；これは、中性の「ペプチド様」バックボーンに結合された核酸塩基）オリゴである［３２，３４］。モルホリノオリゴは、ＲＮａｓｅＨとは独立して機能し、そして水性溶液中で可溶性である。これらは、血清の存在下または非存在下で十分に作用し、そしてヌクレアーゼに対して完全に抵抗性であり、培養培地および細胞中で無期限にインタクトなままである。モルホリノオリゴは、ＲＮＡに対して高い親和性を有し、そしてｍＲＮＡのまったく安全な二次構造をさえ効果的に浸潤する。モルホリノオリゴは、非常に広範な濃度範囲にわたって、すべてのアンチセンスの類型の、最も高い配列特異性を有し、そして非アンチセンス効果はないと考えられる［３４，３５］。モルホリノオリゴは、細胞フリーの翻訳系を有し、そして培養細胞における標的タンパク質の産生を遮断し得る［３６］。モルホリノはまた、インビボにおいても有効である［３７］。これらの特性を考慮し、モルホリノは、ラミニン−８鎖の発現を阻害するために本発明に選択された。特別の実験は、モルホリノ処理が、使用されたいかなる細胞株の生育可能性にも影響しなかったことを示した。

最近、グリオーム細胞においてアンチセンステクノロジーの使用に関する前途有望なデータが得られた。マトリックスメタロプロテナーゼ−９のブロッキングが、インビトロでのグリオーム細胞の浸潤性を減少した［３１，３８］。インビトロでのグリオームの増殖および（ヌードマウスの異種移植片としての）インビボでのグリオームの増殖を、テロメラーゼに対するアンチセンスにより阻害し得た［３９］。最近のパイロット研究は、ＩＧＦ−１レセプターのアンチセンスが、グリオーム細胞のアポトーシスを誘導し、そして患者の臨床的改善をもたらしたことを示した［４０］。いくつかの臨床的試行は、現在、他の癌の処置についてのアンチセンスオリゴを用いる［４１］。

グリオーム浸潤におけるラミニン−８の関与を試験するために、本発明者らは、浸潤速度を定量化し得、かつアンチセンスラミニンオリゴの投薬量を最適化し得る確実なシステムを必要とした。本発明者らは、細胞培養システムを使用し、これらの重要な必要性を満たした。グリオーム培養物は、潜在的に使用され得る。しかし、インビボの状況をよりよく模倣するために、そしてラミニン−８がグリオーム細胞および内皮細胞の両方により産生されると考えられる［１５，図３］ので、本発明者らは、グリオーム細胞と脳の内皮とを共培養物中で組み合わせる必要があった［４４］。このような状況において、内皮細胞は、毛細血管様の構造を発達させ、そしてこのプロセスは、内皮細胞を腫瘍星状細胞とともに培養する場合には、正常な胚の脳の星状細胞とともに培養する場合よりも迅速である［４５］。本発明者らは、グリオーム−内皮共培養物において、ラミニン−８がより多く産生されること、およびこのラミニンが、Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイにおいてグリオームの浸潤を増加し得ることを仮定した。これらの問題への調査は、脳腫瘍患者の、ＧＢＭ診断および予後の両方を促進し、そして脳腫瘍患者の生存を増加する。

Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイが、ＢＭマトリックスを通した腫瘍細胞の浸潤の定量的測定のために開発された。インビボにおいて浸潤性かつ転移性とみなされたほとんどの試験済みの細胞は、インビトロでＭａｔｒｉｇｅｌを浸潤し得、このＭａｔｒｉｇｅｌは、マウスのＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍からのＢＭ様材料である［２１，２２］。

グリオーム−内皮共培養物を、アンチセンスにより処置した場合、Ｍａｔｒｉｇｅｌに対する浸潤性の阻害は、Ｕ−８７Ｇ＋ＨＢＭＶＥＣについては、対応するセンスオリゴヌクレオチドで処理されたコントロール細胞において観察されるものの６２％であり、そしてＭ０５９Ｋ＋ＨＢＭＶＥＣについては、５３％であった。本発明者らの実験では、低濃度のアンチセンスオリゴ（０．２５＋０．２５ｍＭ）で阻害した場合に、より高濃度のアンチセンスオリゴ（０．５＋０．５ｍＭ）で阻害した場合より効率的に、α４およびβ１の発現を阻害したが、いずれの濃度においても、明らかな毒性は認められなかった。これらのデータは、前の発見により説明され得、ここで、ＨｅｐＧ２細胞の膜上のオリゴヌクレオチドレセプターが遮断された。比較的高いオリゴヌクレオチド濃度では、これらのレセプターは飽和され、そして飲作用のプロセスがより大きな重要性を帯びることが示された［４６］。類似のメカニズムが、本発明の系に生じ得、これが、得られた結果を説明し得る。

アンチセンス技術の使用は、その効率、特異性および腫瘍細胞への送達の容易性のために、有効な将来の腫瘍処置法を提供する［４２，４３］。この技術は、薬物の検証および診断の目的のためだけではなく、将来の処置法の開発を目的として、持続的に開発され、そして能率化される。本発明の結果は、ラミニン−８を脳グリオームの処置のための標的として使用するアンチセンスアプローチの有効性を実証する。ラミニン−８アンチセンスによる腫瘍浸潤の減少は、攻撃的なＧＢＭの増殖および伝播を遅延する。他の処置方法または他の標的（ＥＧＦＲ、ＭＭＰ）のブロッキングと組み合わせて、それは、疾患フリーの期間を延長し、そしてグリオーム患者の生存を増加する。治療上の目的のためのラミニン−８のブロッキングはまた、特定のモノクローナル抗体および／または小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および／またはラミニン−８の産生に特異的な他の薬物の使用を含む。

ラミニン−８がグリオーム浸潤をいかに促進するかが立証されないままである。可能性のある一つの機序が、細胞移動の刺激化であり得る。ラミニン−８を含むα４Ａスプライス改変体の少なくとも一つの形態は、非常に弱く細胞接着を支持し、そしてラミニン−５またはラミニン−１０／１１と比較して、拡延性（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）であることが示された［１５，４７］。同時に、ラミニン−８は、いくつかの他のラミニンのイソ型よりも細胞移動をより良好に刺激した［１５］。グリオーム細胞およびグリオーム隣接毛細血管内皮細胞の両方におけるラミニン−８の発現の増加［５，１５、本明細書］は、グリア細胞の接着を減少し得、そして移動を増強し得る。これは、腫瘍の局所的な浸潤性のために必要である。

多くの変更および改変が、当業者によりなされ得る。従って、この例示された実施形態が、例示の目的でのみ記載されていること、および例示された実施形態が、添付の特許請求の範囲により規定される通りに本発明を限定するものとしてみなされてはならないことが理解されねばならない。本発明およびその種々の実施形態を記載するために本明細書中で使用される用語は、一般的に規定される意味の意味で理解されるだけではなく、一般的に規定される意味の範囲を超えて、この明細書中の構造、材料または作用の特別の定義により包含されるべきである。従って、ある要素が、この明細書の文脈において、一つより多くの意味を包含するものとして理解され得る場合、特許請求におけるその要素の使用は、本明細書およびその単語自体により支持される、すべての可能な意味に包括的なものとして理解されねばならない。特許請求される要素の等価物に加えて、現在公知であるか、または後に当業者に公知になる明白な置換物は、規定された要素の範囲内であることが規定される。従って、特許請求の範囲は、上に具体的に例示し、そして記載したもの、概念的に等価であるもの、および明らかに置換され得るものを包含するものと理解されるべきである。

図１は、種々の培養および共培養によるＡｃ−ＬＤＬの取り込みを示し；内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣ）は、ポジティブ（緑色蛍光）であるが、グリオーム細胞（Ｍ５９Ｋ）および正常な星状細胞（ＨＡＳＴ ０４０）は、ネガティブであり；共培養（ＨＢＭＶＥＣ＋Ｍ０５９Ｋ、およびＨＢＭＶＥＣ＋ＨＡＳＴ０４０）においては、内皮細胞は、ポジティブであるが、他の細胞は、ネガティブである（ＤＡＰＩを、細胞核を染色するために使用した（青色蛍光））。 図２は、細胞および調整された培地の純粋な培養物の中でのラミニンのα４鎖、β１鎖、およびβ２鎖の発現を示す：図２Ａ 細胞内のラミニン鎖の免疫局在決定（ここで、正常な脳の内皮（ＨＢＭＶＥＣ）は、α４鎖およびβ２鎖（ラミニン−９、α４β２γ１と一致）を発現し、その一方で、星状細胞（ＨＡＳＴ ０４０）は、これらのラミニン鎖を発現しない；しかし、Ｍ０５９Ｋグリオーム細胞は、ラミニン−８（α４β１γ１）と一致するα４鎖およびβ１鎖を発現する）。間接免疫染色法。 図２は、細胞および調整された培地の純粋な培養物の中でのラミニンのα４鎖、β１鎖、およびβ２鎖の発現を示す：図２Ｂ 調整された培地のＷｅｓｔｅｒｎブロット分析は、内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣ）が、ラミニン−９の鎖（α４およびβ２）を分泌し、星状細胞（ＨＡＳＴ ０４０）が、まったく無し〜ごくわずかの量の、任意の研究された鎖の分泌を示し、そしてＭ０５９Ｋグリオーム細胞が、ラミニン−８の鎖（α４およびβ１）を分泌する（Ｔ９８Ｇ、ラミニン−８の鎖（α４およびβ１）のみを発現するＴ９８Ｇグリオーム細胞の溶解産物を、ポジティブのコントロールとして使用した；等量の調整された培地タンパク質を、各レーンにアプライした。免疫染色の結果（図２Ａ）とＷｅｓｔｅｒｎブロッティングの結果（図２Ｂ）との完全な一致に注目すること）ことを示す。 図３は、共培養物のラミニンα４鎖、β１鎖、およびβ２鎖の染色を示す；生きた共培養物を、Ａｃ−ＬＤＬ（緑色、内皮細胞を明らかにする）に曝し、次いで、固定し、そして選択したラミニン鎖（赤色）および核（ＤＡＰＩ、青色）に対して同時に染色した；内皮−星状細胞共培養物（ＨＢＭＶＥＣ＋ＨＡＳＴ０４０）のα４鎖およびβ２鎖が、Ａｃ−ＬＤＬポジティブ内皮細胞においてのみ発現され、Ａｃ−ＬＤＬネガティブ星状細胞（矢印）は発現されず；β１鎖は、大部分が存在せず；内皮−グリオーム共培養物（ＨＢＭＶＥＣ＋Ｍ０５９Ｋ）において、α４鎖は、両方の細胞の類型により発現され、そしてβ２鎖は、内皮細胞によってのみ発現された；重要なことに、β１鎖は、Ａｃ−ＬＤＬネガティブなグリオーム細胞（矢印）により発現されるだけでなく、Ａｃ−ＬＤＬ−ポジティブな内皮細胞によってもまた発現される。 図４は、細胞生育可能アッセイを示し；モルホリノセンスオリゴまたはモルホリノアンチセンスオリゴおよび送達因子を用いた処理の後のグリオーム細胞株Ｍ０５９ＫおよびＵ−８７ＭＧならびに正常な内皮細胞株ＨＢＭＶＥＣの生育可能性は９０％よりも高く；いかなる処置をしても、対応する未処理のコントロールの培養物から、有意な差異が、検出されなかった（処理なしの場合の細胞生育性を１００％とみなし、細胞数を、ＭＴＳアッセイを用いて決定した）ことを示す。 図５は、アンチセンス処理した共培養物のラミニンのα４およびβ１の間接免疫蛍光染色を示し；ラミニンのα４鎖およびβ１鎖のセンスオリゴで５日間処理した、Ｍ０５９ＫまたはＵ−８７ＭＧとＨＢＭＶＥＣとの共培養物、ならびにラミニン鎖の発現パターンは、未処理の培養物と類似している（上列、図３を参照のこと）一方で、ラミニンα４鎖（アンチセンスα４鎖）またはラミニンβ１鎖（アンチセンスβ１鎖）のいずれかアンチセンスオリゴを用いた処理は、α４鎖およびβ１鎖の両方の発現を部分的に阻害した（中列）；最終的に、両鎖についてのアンチセンスオリゴ（アンチセンスα４＋β１）を用いた処理は、染色を台無しにする（下列）。 図６は、共培養されたＭ０５９Ｋ細胞およびＨＢＭＶＥＣ細胞の調整された培地中での、ラミニン−８のα４鎖およびβ１鎖のＷｅｓｔｅｒｎブロット分析を示し、ここで、モルホリノセンスオリゴおよびモルホリノアンチセンスオリゴを用いたインキュベーションは、３日間または６日間であった。図６Ａ 第３日および第６日の、ラミニンα４鎖に対応する２００−ｋＤａのバンドであり、免疫反応性のα４ラミニンの量は、アンチセンスオリゴ（α４もしくはβ１のいずれか、または、特にα４＋β１）により減少した。図６Ｂ 第３日および第６日の、共培養物中のラミニンβ１鎖に対応する２３０−ｋＤａのバンド、ならびにアンチセンスオリゴの組み合わせ（α４＋β１）は、両時点での免疫反応性のβ１鎖のバンドの量を減少させるのに効率的であった。図６Ｃおよび図６Ｄ フィブロネクチンに関して、各膜をα４鎖およびβ１鎖の検出ならびにこれらの再プローブ化から取り去った後の、第６日のフィブロネクチン（２４０ｋＤａのバンド）のＷｅｓｔｅｒｎブロット（これらのレーンは、コントロールの目的でローディングする目的で示される）、ヒトのフィブロネクチン（血清ではない）のみがこの抗体により検出された：レーン１、α４鎖＋β１鎖についてのセンスオリゴ；レーン２、α４鎖のセンスオリゴ；レーン３、β１鎖のアンチセンスオリゴ；レーン４、α４鎖＋β１鎖のアンチセンスオリゴ。 図７は、アンチセンス処理した培養物において、Ｍａｔｒｉｇｅｌを通って浸潤した細胞の画分の有意な減少を実証する、Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイを用いたアンチセンス処理後の共培養物中の浸潤の測定を示す（より一層明白な効果は、アンチセンスオリゴの組み合わせを用いて見られる；類似の結果が、Ｍ０５９ＫおよびＵ−８７ＭＧグリオーム細胞株を用いて得られた；センス処理した培養物における浸潤を１００％とみなす場合に、ＡＮＯＶＡにより^＊，ｐ＜０．０４；^＊＊ｐ＜０．００１）。

Claims (4)

1. ヒトグリオームの浸潤性を減少させるための薬学的組成物であって、該組成物は、ラミニン−８の発現を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドを含み、ここで、該アンチセンスポリヌクレオチドは、
   ５’〜３’配列ＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＣ、
   ５’〜３’配列ＣＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＴＧＣＣ、ならびに、
   ５’〜３’配列ＣＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＴＧＣＣと
   ５’〜３’配列ＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＣとの組み合わせ、
   からなる群から選択される、
   組成物。
2. 請求項１に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記アンチセンスポリヌクレオチドが、５’〜３’配列ＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＣを含む、組成物。
3. 請求項１に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記アンチセンスポリヌクレオチドが、５’〜３’配列ＣＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＴＧＣＣを含む、組成物。
4. 請求項１に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記アンチセンスポリヌクレオチドが、５’〜３’配列ＣＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＴＧＣＣおよび５’〜３’配列ＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＣを含むポリヌクレオチドを含む、組成物。

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