CN108603192A - 用于调节潜伏的病毒转录的组合物和方法 - Google Patents

用于调节潜伏的病毒转录的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108603192A
CN108603192A CN201680068434.2A CN201680068434A CN108603192A CN 108603192 A CN108603192 A CN 108603192A CN 201680068434 A CN201680068434 A CN 201680068434A CN 108603192 A CN108603192 A CN 108603192A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
promoters
genome
transcription
viral
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680068434.2A
Other languages
English (en)
Inventor
S·R·奎克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ethiopian Co
Original Assignee
Ethiopian Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ethiopian Co filed Critical Ethiopian Co
Publication of CN108603192A publication Critical patent/CN108603192A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本申请提供了可以用于调节病毒转录的组合物和方法。使用催化失活的核酸酶，例如去活化的Cas9或dCas9，可以将向导RNA设计为在病毒核酸中识别调节元件。所述dCas9可作为RNA依赖的DNA结合蛋白结合至病毒启动子，并上调或下调转录。例如，所述dCas9和病毒启动子特异性的gRNA可以杂交至宿主细胞中的病毒基因组内的启动子，并通过例如空间阻断转录机制的募集来抑制转录。

Description

用于调节潜伏的病毒转录的组合物和方法
相关申请
本申请要求2015年9月29日提交的美国临时专利申请62/234,345的优先权，其全部内容通过引用并入。
发明领域
本发明涉及使用组合物治疗病毒感染，所述组合物包括核酸酶的非切割变体。
背景技术
病毒感染是一个重大的医学问题。例如，疱疹是一种普遍的人类病原体，超过90％的成人都有过被感染的经历。由于感染具有一定的潜伏期，因此宿主一旦被感染，就算不表现症状，也会永久地携带疱疹病毒。同样地，人类乳头瘤病毒(或HPV)是人群中常见的病毒，超过75％的人会被感染。一个特别的问题是病毒感染可能会导致癌症。例如，已知HPV与宿主DNA的整合会导致癌症，特别是宫颈癌。Epstein-Barr病毒(EBV)不仅会引起传染性单核细胞增多症(腺热)，还与霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤等癌症相关。
虽然正在努力开发能靶向病毒蛋白的药物，但是这些努力并未完全成功。例如，当病毒处于潜伏状态，没有活跃表达其蛋白质时，就没有任何可以靶向的目标。另外，不管怎样努力消除病毒感染，如果其会干扰宿主细胞的功能，那么都不是最佳的。例如，对于能够阻止病毒复制的酶，如果其会干扰整个宿主细胞中的基因组复制，那么其也没有任何帮助。
发明概述
本发明提供了用于治疗病毒感染的组合物和方法。本发明提供了一种非切割内切核酸酶，其与病毒的核酸结合并干扰病毒的调节功能。本发明优选的组合物包括可编程核酸酶的非切割变体例如Cas9。Cas9有时也被称为催化失活的Cas9或dCas9，用于特异性靶向病毒启动子或者涉及转录或翻译的其他调控元件。通过使用靶向性的寡核苷酸例如向导RNA(gRNA)来完成靶向过程。可以将靶向性的寡核苷酸设计成识别病毒核酸内的调节元件并将dCas9引导到被靶向的病毒元件上。
在存在gRNA的条件下，可编程核酸酶以序列特异性的方式与靶标结合并上调或下调转录。例如，dCas9和病毒启动子特异性的gRNA可以与宿主细胞病毒基因组内的启动子杂交，并通过例如空间阻断转录机器的募集来抑制转录。另外，或者可选地，dCas9可以与另一转录抑制性蛋白或结构域连接。在病毒基因组中，多个靶标可以各自独立地被靶向，以用于转录抑制。
本发明所述组合物的优选用途是抑制转录，从而阻止病毒蛋白的表达。这可以防止感染的传播或者减慢传播，而其他病毒疗法则是消灭病毒。本发明所述组合物包括可编程核酸酶，其被催化灭活并且特异性靶向病毒靶标。所述可编程核酸酶可以是RNA引导的核酸酶(例如，CRISPR相关核酸酶，例如Cas9或者经修饰的Cas9或Cpfl或者经修饰的Cpfl，Cas9同源物或hi-fi Cas9)。所述可编程核酸酶可以是TALEN或者经修饰的TALEN。在某些实施方案中，所述可编程核酸酶可以是DNA引导的核酸酶(例如，强烈炽热球菌的Argonaute(PfAgo)或格氏黄杆菌的Argonaute(NgAgo)。
可以通过提供特定的gRNA，使用dCas9独立地或同时抑制各种靶标的转录。因此，本发明所述组合物可以包括dCas9(或者编码dCas9的核酸)以及一个或多个gRNA，所述一个或多个gRNA各自靶向病毒基因组内特定的启动子。
另外或者可选地，本发明所述组合物可用于上调转录。例如，可以将dCas9连接到帮助上调转录的转录激活结构域(例如，募集转录因子的转录激活结构域)上。当提供编码在质粒内的抗病毒剂时，上调转录可能是有用的，因为本发明所述组合物可能有助于抗病毒剂的表达。如果质粒上的基因处于正被治疗的病毒的启动子的控制下，那么采用本发明所述蛋白质可以放大正反馈循环，在所述正反馈循环中病毒活性倾向于刺激抗病毒治疗剂的表达。通过抑制病毒基因的转录或者通过上调抗病毒治疗剂的转录，本发明所述组合物可以是治疗病毒感染的有价值且有效的方式。
在某些方面，本发明提供了用于治疗病毒感染的组合物。组合物包括载体，所述载体包含编码Cas9酶的非切割变体(dCas9)的核酸以及与病毒基因组中的靶标互补的靶向性序列。在某些实施方案中，所述核酸可以包括DNA。所述dCas9通过所述靶向性序列与所述病毒基因组中的靶标结合并影响所述病毒基因组的至少一部分的转录。在一些实施方案中，所述复合物抑制所述病毒基因组的至少一部分的转录。
可以使用这样的靶向性序列：其根据预定标准与靶标匹配并且根据所述预定标准不与宿主基因组的任何部分匹配。所述预定标准可以包括在具有20个核苷酸的段内至少有60％互补并且存在与所述具有20个核苷酸的段毗邻的原型间隔序列毗邻基序。在一些实施方案中，所述宿主基因组是人基因组，并且所述靶向性序列根据所述预定标准不与人基因组的任何部分匹配。
在优选的实施方案中，所述病毒能够以潜伏的方式感染人类宿主。合适的靶标包括：乙型肝炎病毒(HBV)基因组中的preC启动子；HBV基因组中的S1启动子；HBV基因组中的S2启动子；以及HBV基因组中的X启动子；Epstein-Barr病毒基因组中的病毒Cp(C启动子)；卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)基因组中的次要转录启动子区域；KSHV基因组中的主要转录启动子；来自单纯疱疹病毒(HSV)的Egr-1启动子；来自HSV-1的ICP4启动子；来自HSV-2的ICP 10启动子；巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件；巨细胞病毒即刻早期启动子；HPV早期启动子；以及HPV晚期启动子。
在一些实施方案中，所述多肽还包含转录抑制结构域。所述转录抑制结构域可以包括例如以下一种或多种：Kox1的Krüppel相关盒结构域；HP1α的染色阴影域；以及Hes l的WRPW结构域。
可以在运载体内提供所述组合物，使得其适合局部应用于人的皮肤。在一些实施方案中，所述核酸存在于质粒内，所述质粒由运载体携带并递送至人的皮肤。
可以靶向任何合适的病毒，例如，腺病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、人乳头瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花、乙型肝炎病毒、人博卡病毒、细小病毒、B19、人星状病毒、诺瓦克病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、严重急性呼吸综合征病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、风疹病毒、戊型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、关纳立特病毒、胡宁病毒、拉沙病毒、马丘坡病毒、沙比亚病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人类间叶病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、狂犬病病毒、丁型肝炎病毒、轮状病毒、环状病毒、科罗拉多蜱传热症病毒或版纳病毒。
在一些方面，本发明提供了一种用于治疗病毒感染的方法。所述方法包括将组合物和RNA引入宿主细胞，所述组合物包含编码包括Cas9酶的非切割变体多肽的核酸，所述RNA包括与病毒基因组中的靶标互补的部分。在某些实施方案中，所述核酸可以包括DNA。所述多肽与所述RNA结合形成复合物，并且所述复合物通过RNA内的靶向性序列与病毒基因组中的靶标杂交。所述复合物抑制病毒基因组的至少一部分的转录。优选地，病毒感染是潜伏性的感染。将组合物引入宿主细胞的过程可以包括将所述组合物递送到人患者体内的潜在感染的局部储库。病毒基因组中的靶标可以包括下组中的任一种：乙型肝炎病毒(HBV)基因组中的preC启动子；HBV基因组中的S1启动子；HBV基因组中的S2启动子；以及HBV基因组中的X启动子；埃波斯坦-巴尔病毒基因组中的病毒Cp(C启动子)；卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)基因组中的次要转录启动子区；KSHV基因组中的主要转录启动子；来自单纯疱疹病毒(HSV)的Egr-1启动子；来自HSV-1的ICP4启动子；来自HSV-2的ICP 10启动子；巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件；巨细胞病毒即刻早期启动子；HPV早期启动子；以及HPV晚期启动子。所述多肽可以进一步包括转录抑制结构域，例如Kox1的Krüppel相关盒结构域；HP1α的染色阴影域；或者Hes l的WRPW结构域。
在一些实施方案中，所述方法包括使用所述复合物在所述宿主细胞内上调转录。例如，多肽/gRNA复合物可以与核酸拷贝结合并上调其自身的进一步表达，所述核酸拷贝编码这些组分中的任一个或两个。因此，当所述核酸是质粒的一部分且所述多肽与所述RNA结合形成复合物的情况下的一些实施方案中，所述复合物与所述质粒杂交，引起所述质粒的至少一部分的转录上调。在某些实施方案中，所述宿主细胞内所述质粒的初始转录导致产生正反馈循环，在所述正反馈循环中，所述上调的转录接着会增加已经上调的转录。
在一些实施方案中，所述宿主细胞处于宿主内的原位并且所述宿主是带有所述病毒感染的哺乳动物例如人类患者。优选地，通过向宿主中的组织递送而将所述组合物原位引入到细胞中。将所述组合物引入到所述宿主细胞中的过程可以包括以非全身性的方式将所述组合物递送到所述宿主体内的病毒感染局部储库。
可以靶向任何病毒基因组，例如腺病毒基因组、单纯疱疹病毒基因组、水痘-带状疱疹病毒基因组、Epstein-Barr病毒基因组、人巨细胞病毒基因组、人疱疹病毒8型基因组、人乳头瘤病毒基因组、BK病毒基因组、JC病毒基因组、天花基因组、乙型肝炎病毒基因组、人博卡病毒基因组、细小病毒基因组、B19基因组、人星状病毒基因组、诺瓦克病毒基因组、柯萨奇病毒基因组、甲型肝炎病毒基因组、脊髓灰质炎病毒基因组、鼻病毒基因组、严重急性呼吸综合征病毒基因组、丙型肝炎病毒基因组、黄热病病毒基因组、登革热病毒基因组、西尼罗病毒基因组、风疹病毒基因组、戊型肝炎病毒基因组、人免疫缺陷病毒基因组、流感病毒基因组、关纳立特病毒基因组、胡宁病毒基因组、拉沙病毒基因组、马丘坡病毒基因组、沙比亚病毒基因组、克里米亚-刚果出血热病毒基因组、埃博拉病毒基因组、马尔堡病毒基因组、麻疹病毒基因组、腮腺炎病毒基因组、副流感病毒基因组、呼吸道合胞病毒基因组、人类间叶病毒基因组、亨德拉病毒基因组、尼帕病毒基因组、狂犬病病毒基因组、丁型肝炎病毒基因组、轮状病毒基因组、环状病毒基因组、科罗拉多蜱传热症病毒基因组或版纳病毒基因组。
在其他方面，本发明提供了一种用于治疗病毒感染的组合物。所述组合物包括编码包含Cas9酶的非切割变体多肽的核酸；以及RNA，所述RNA包括与所述核酸的一部分互补的靶向性序列。所述核酸可以包括mRNA，所述mRNA包含5'帽子。在某些实施方案中，所述核酸可以包括DNA。当将所述组合物引入到被病毒感染的细胞中时，所述多肽和所述RNA被表达；所述多肽与所述RNA结合形成复合物；以及所述复合物与所述核酸中的靶标杂交并影响所述核酸的转录。所述核酸可以是质粒的一部分，并且所述复合物与质粒的杂交引起所述质粒的至少一部分的转录上调。受感染细胞内核酸的初始转录会产生正反馈循环，其中所述被上调的转录接着会增加已经上调的转录。优选地，所述靶向性序列根据预定标准与所述靶标匹配，并且根据所述预定标准不与宿主基因组的任何部分匹配。所述核酸可以另外编码来自病毒基因组的启动子。在一些实施方案中，所述复合物在被所述病毒感染的宿主细胞内上调转录。
在某些方面，本发明提供了用于治疗病毒感染的组合物，所述组合物包括多肽，所述多肽包含Cas9酶的非切割变体；以及靶向性寡核苷酸，所述靶向性寡核苷酸与病毒基因组中的靶标互补。当被引入到被所述病毒感染的细胞中时，所述多肽与所述靶向性寡核苷酸形成复合物，所述复合物通过所述靶向性寡核苷酸与所述病毒基因组中的靶标杂交，并影响所述病毒基因组的至少一部分的转录。在某些实施方案中，所述靶向性寡核苷酸包括RNA并且与核糖核蛋白(RNP)中的多肽复合。优选地，所述复合物抑制所述病毒基因组的至少一部分的转录。在一些实施方案中，所述靶向性寡核苷酸包含RNA，所述RNA具有根据预定标准与所述靶标匹配并且根据所述预定标准不与宿主基因组的任何部分匹配的部分(例如，所述预定标准可以包括在具有20个核苷酸的段内至少有60％互补并且存在与所述具有20个核苷酸的段毗邻的原型间隔序列毗邻基序)。所述病毒基因组中合适的靶标包括选自下组中的一种或多种：乙型肝炎病毒(HBV)基因组中的preC启动子；所述HBV基因组中的S1启动子；所述HBV基因组中的S2启动子；以及所述HBV基因组中的X启动子；Epstein-Barr病毒基因组中的病毒Cp(C启动子)；卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)基因组中的次要转录启动子区；KSHV基因组中的主要转录启动子；来自单纯疱疹病毒(HSV)的Egr-1启动子；来自HSV-1的ICP4启动子；来自HSV-2的ICP 10启动子；巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件；巨细胞病毒即刻早期启动子；HPV早期启动子；以及HPV晚期启动子。在某些实施方案中，所述多肽进一步包括转录抑制结构域如，例如，Kox1的Krüppel相关盒结构域；HP 1α的染色阴影域；或者Hes l的WRPW结构域。可以在运载体内提供所述组合物，使得其适合局部应用于人体皮肤。
在某些方面，本发明提供了一种用于治疗病毒感染的组合物，所述组合物包含mRNA，所述mRNA包含编码多肽的5'帽，所述多肽包括Cas9酶的非切割变体(dCas9)；以及RNA，所述RNA包括与病毒基因组中的靶标互补的靶向性序列。在某些方面，当将所述组合物引入到被所述病毒感染的细胞中时，所述多肽被表达；所述多肽与所述RNA结合形成复合物；并且所述复合物通过所述靶向性序列与所述病毒基因组中的靶标杂交。
所述dCas9可以通过所述靶向性序列与所述病毒基因组中的靶标结合并影响所述病毒基因组的至少一部分的转录。在一些实施方案中，所述复合物抑制所述病毒基因组的至少一部分的转录。
可以使用这样的靶向性序列：其根据预定标准与所述靶标匹配并且根据所述预定标准不与宿主基因组的任何部分匹配。所述预定标准可以包括在具有20个核苷酸的段内至少有60％互补并且存在与所述具有20个核苷酸的段毗邻的原型间隔序列毗邻基序。在一些实施方案中，所述宿主基因组是人基因组，并且所述靶向性序列根据所述预定标准不与人基因组的任何部分匹配。
在优选的实施方案中，所述病毒能够以潜伏的方式感染人类宿主。合适的靶标包括：乙型肝炎病毒(HBV)基因组中的preC启动子；HBV基因组中的S1启动子；HBV基因组中的S2启动子；以及HBV基因组中的X启动子；Epstein-Barr病毒基因组中的病毒Cp(C启动子)；卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)基因组中的次要转录启动子区域；KSHV基因组中的主要转录启动子；来自单纯疱疹病毒(HSV)的Egr-1启动子；来自HSV-1的ICP4启动子；来自HSV-2的ICP 10启动子；巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件；巨细胞病毒即刻早期启动子；HPV早期启动子；以及HPV晚期启动子。
在一些实施方案中，所述多肽还包含转录抑制结构域。所述转录抑制结构域可以包括例如以下一种或多种：
Kox1的Krüppel相关盒结构域；HP1α的染色阴影域；以及Hes l的WRPW结构域。
可以在运载体内提供所述组合物，使得其适合局部应用于人体皮肤。在一些实施方案中，所述核酸存在于质粒内，所述质粒由运载体携带并递送至人的皮肤。
可以靶向任何合适的病毒，例如，腺病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、人乳头瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花、乙型肝炎病毒、人博卡病毒、细小病毒、B19、人星状病毒、诺瓦克病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、严重急性呼吸综合征病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、风疹病毒、戊型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、关纳立特病毒、胡宁病毒、拉沙病毒、马丘坡病毒、沙比亚病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人类间叶病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、狂犬病病毒、丁型肝炎病毒、轮状病毒、环状病毒、科罗拉多蜱传热症病毒或版纳病毒。
附图简述
图1示意了用于治疗病毒感染的组合物。
图2显示了用于治疗病毒感染的组合物。
图3示意了根据本发明某些实施方案所述的质粒。
图4图解了治疗病毒感染的方法。
图5图解了EBV的参照基因组。
图6图解了HBV基因组。
发明详述
本发明提供了用于调节病毒基因转录的组合物和方法，所述系统和方法可以，例如，作为病毒感染的疗法，在宿主细胞内应用。本发明使用特异性结合病毒核酸的部分，所述部分调节病毒核酸的转录，并且不影响宿主核酸的转录。本发明的实施方案使用组合物，所述组合物包含催化性失活的核酸酶(例如Cas9)或编码所述催化性失活的核酸酶的核酸。
可以，例如，通过在编码Cas9的基因的催化残基处引入点突变(D10A和H840A)来将Cas9核酸酶改造成催化性失活。此类突变使Cas9不能切割dsDNA，但保留了靶向DNA的能力。这种形式的蛋白质可被称为dCas9，表示失活的Cas9。可以将dCas9与特异性针对病毒基因组内的靶标的向导RNA一起提供。包含dCas9和病毒gRNA的系统提供对宿主内的病毒转录进行调节。在Gilbert et al.,2013,CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation oftranscription in eukaryotes,Cell 154(2):442-51中对催化性失活的dCas9进行了讨论，该文献通过引用并入本文。本发明所述系统可用于抑制或激活病毒遗传物质的转录。
可以使用任何合适的催化性失活的核酸酶。本发明所述组合物和方法可以使用催化性失活的Cas9同源物或另一种经催化失活的CRISPR相关核酸酶(ngAgo，Cpf1或hi-fiCas9)。所述核酸酶可以是例如，催化性失活形式的Cas9、ZFN、TALEN、Cpfl、NgAgo或者经修饰的可编程核酸酶，所述经修饰的可编程核酸酶具有与未修饰形式基本相似的氨基酸序列，例如，具有与Cas9、ZFN、TALEN、Cpfl或NgAgo中的一种，或任何其他可编程核酸酶至少90％相似的氨基酸序列的可编程核酸酶。可编程核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和RNA引导的核酸酶，例如细菌成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas(CRISPR相关)核酸酶或Cpfl。可编程核酸酶还包括PfAgo和NgAgo。可编程核酸酶通常是指裂解核酸的酶，所述酶可以或已经由人类设计或改造，使得所述酶以序列特异性的方式靶向或裂解所述核酸。
本发明所述系统可用于通过例如阻断转录起始或延伸的方法来抑制病毒转录。这是通过设计分别与启动子或外显子序列互补的sgRNA来完成的。对外显子序列的转录抑制水平具有链特异性。相对于与模板链互补的sgRNA，与非模板链互补的sgRNA能更强烈地抑制转录。解释这种效应的一个假设来自于解旋酶的活性，当所述sgRNA与模板链的外显子互补时，所述解旋酶能在RNA pol II的前方解开RNA:DNA异源双链体。本发明所述系统还可以通过效应子结构域来抑制转录。将阻遏域与dCas9融合，可以允许通过诱导染色质凝聚进一步抑制转录。例如，可以将Krüppel相关盒(KRAB)结构域与dCas9融合以抑制靶基因的转录。
例如，本发明所述系统可以通过将转录激活因子与dCas9融合，从而用于激活病毒或载体的转录。例如，转录激活因子VP16可以显著提升基因的表达。
通过使用本发明所述组合物和方法，有可能以高达99.99％或100％的抑制作用使靶基因沉默。由于调节是在sgRNA-DNA的沃森-克里克碱基配对和NGG PAM基序的基础上进行的，因此可以直接并且灵活地选择基因组内的可靶向位点。本文介绍了针对向导RNA而精心确定的方案。多个向导RNA不仅能用于同时控制多个不同的基因(复合地进行基因靶向)，还能提高对同一基因靶标的调节效率。CRISPRi作为一种外源性系统不与内源性机制(例如微小RNA(microRNA)的表达或功能)竞争。此外，由于CRISPRi在DNA水平上发挥作用，因此可以靶向转录物，例如非编码RNA、微小RNA、反义转录物、核定位RNA和聚合酶III转录物。最后，CRISPRi拥有更大的可定位序列空间；也可以靶向启动子，并且从理论上来说也可以靶向内含子。关于背景，参见Larson et al.,2013,CRISPR interference(CRISPRi)forsequence-specific control of gene expression,Nature Protocols 8(11):2180-96，其通过引用并入本文。本文使用的向导RNA或gRNA包括具有反式激活RNA(tracrRNA)的gRNA以及使用单向导RNA(sgRNA)。正如与tracrRNA一起使用的分离的gRNA是一类向导RNA，与tracrRNA一起的gRNA也是如此，并且sgRNA也是一样。与靶标杂交的向导RNA的一部分是向导RNA的靶向性序列的一部分。
图1显示了用于治疗病毒感染的组合物101。所述组合物101包括编码多肽的核酸105，所述多肽包含Cas9酶的非切割变体；以及RNA，所述RNA包含与病毒基因组中的靶标互补的靶向性序列。
图2显示了用于治疗病毒(此处用靶标221表示)感染的组合物201。所述组合物201包括多肽225，所述多肽225包含Cas9酶的非切割变体；以及RNA 205，所述RNA 205包含与核酸221的一部分互补的靶向性序列209。当将所述组合物201引入到被病毒感染的细胞中时，所述多肽225最终与RNA 205结合并与核酸中的靶标杂交并影响核酸221的转录。
图2显示了当将组合物101引入到被病毒感染的细胞中时，所述组合物101的作用。在所述细胞内，多肽225和RNA 205被表达。多肽225与RNA 205结合形成复合物201，并且复合物201通过靶向性序列209与病毒基因组221中的靶标杂交。复合物201影响病毒基因组221的至少一部分的转录。在一些实施方案中，复合物201抑制病毒基因组221的至少一部分的转录。
通过使用本文所述的方法和组合物，有可能调节任何合适的病毒核酸的转录。本发明所述组合物优选用于治疗潜伏性病毒感染。由于潜伏性病毒感染往往不表达能够被抗病毒药物靶向的蛋白质，因此一些抗病毒药物可能无效。然而，通过使用本发明所述的组合物和方法，靶标实际上是核酸序列，并且因此可以靶向潜在的病毒感染。例如，可以设计这样一种gRNA：其结合病毒的复制起点并且可以将dCas9(或dCas9的基因)配置到细胞中。借助于gRNA，dCas9与病毒起点结合并抑制任何转录或复制。因此，潜伏的感染不会有机会重新激活。在与其他抗病毒疗法(例如用于消化病毒遗传物质的Cas9)组合的情况下，用dCas9进行转录抑制可能非常有效。dCas9可以阻止病毒发生转录，从而使得Cas9有时间和机会来充分消化病毒基因组。
向导RNA 205包括靶向性序列209，所述靶向性序列209根据预定标准与所述靶标匹配，并且优选地根据所述预定标准不与宿主基因组的任何部分匹配。因此，设计的所述靶向性序列209特异性针对病毒核酸的一部分。优选地，该相同序列不出现在宿主基因组中。因此，可以在不干扰宿主的遗传物质的条件下调节病毒核酸的转录。当使用本发明所述的其他系统时，优选选择这样的序列：其使得所述系统能结合病毒序列并调节病毒序列中特定特征或靶标的转录但同时不干扰宿主基因组。优选地，所述靶向性多肽对应于病毒序列中原型间隔序列毗邻基序(PAM)旁的核苷酸串(例如，NGG，其中N是任意核苷酸)。优选地，所述宿主基因组缺失任何这样的区域：其(1)根据预定的相似性标准与所述核苷酸串匹配，并且(2)也毗邻所述PAM。所述预定的相似性标准可以包括，例如，在PAM的5'端的20个核苷酸内需要有至少12个匹配的核苷酸，并且还可以包括在PAM的5'端的10个核苷酸内需要有至少7个匹配的核苷酸。可以使用经注释的病毒基因组(例如，来自GenBank的病毒基因组)来鉴定病毒序列的特征并在病毒序列的选定特征(例如，病毒复制起点、末端重复序列、复制因子结合位点、启动子、编码序列或重复区)内寻找病毒序列中在原型间隔序列毗邻基序(PAM)旁边的核苷酸串。所述病毒序列和注释可以从基因组数据库中获得。
当在病毒基因组中发现多个候选靶标时，在选择靶向性多肽的模板序列的过程中，往往倾向于将与被靶向的特征最接近的，或者在其5'最末端的候选靶标用作向导序列。所述选择可以优先倾向于具有中性(例如，40％到60％)的GC含量的序列。在美国公开号2015/0050699；美国公开号20140356958；美国公开号2014/0349400；美国公开号2014/0342457；美国公开号2014/0295556；和美国公开号2014/0273037中，对其他有关用核酸内切酶进行RNA引导的靶向的背景进行了讨论，为所有目的将这些专利的每个都通过引用并入本文。在优选的实施方案中，所述预定相似性标准包括在具有20个核苷酸的段内至少有60％互补并且存在与所述具有20个核苷酸的段毗邻的原型间隔序列毗邻基序。而且，优选地，所述靶向性序列209根据所述预定标准不与人基因组的任何部分匹配。病毒序列221内的能够被靶向性序列209很好地靶向的靶标包括，例如，乙型肝炎病毒(HBV)基因组中的preC启动子；所述HBV基因组中的S1启动子；所述HBV基因组中的S2启动子；以及所述HBV基因组中的X启动子；Epstein-Barr病毒基因组中的病毒Cp(C启动子)；卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)基因组中的次要转录启动子区；KSHV基因组中的主要转录启动子；来自单纯疱疹病毒(HSV)的Egr-1启动子；来自HSV-1的ICP4启动子；来自HSV-2的ICP 10启动子；巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件；巨细胞病毒即刻早期启动子；HPV早期启动子；以及HPV晚期启动子。
组合物和方法可用于以任何想要的方式来调节转录。例如，在第一个实施方案中，dCas9通过所述靶向性序列209识别并结合所述病毒核酸，并通过空间位阻下调转录。也就是说，所述dCas9多肽225的体积庞大到足以防止转录机器的成功组装或运转。此外，所述多肽225可以包含一个或多个有助于转录抑制的其他结构域或部分。
在某些实施方案中，所述多肽225包含转录抑制结构域或者与其连接。例如，所述转录抑制结构域可以包括Kox1的Krüppel相关盒结构域、HPlα的染色阴影域或者Hesl的WRPW结构域的一种或多种。
Koxl的Krüppel相关盒结构域(KRAB)是存在于约400种基于人锌指蛋白的转录因子(KRAB锌指蛋白)中的一类转录抑制结构域。KRAB结构域通常由约75个氨基酸残基组成，而最小阻遏模块约为45个氨基酸残基。参见Margolin et al.,1994,Krüppel-associatedboxes are potent transcriptional repression domains,PNAS 91(10):4509-13，其通过引用并入本文。据预测，其经由两个两亲性螺旋通过蛋白质-蛋白质的相互作用而发挥作用。最突出的发生相互作用的蛋白被称为TRIM28，最初被视为SMP1，克隆成KAP1和TIF1-β。已经显示有超过10个独立编码的KRAB结构域是有效的转录抑制因子，这表明该活性是所述结构域的共同特性。KRAB结构域最初被鉴定成是亮氨酸残基的周期性阵列，其由KOX1/ZNF10形成的亮氨酸七肽重复序列的锌指区5'端的6个氨基酸隔开(也称为亮氨酸拉链)。后来，该结构域与C2H2锌指蛋白被关联命名为Krüppel相关盒(KRAB)。KRAB结构域仅限于四足动物的基因组。含有C2H2-ZNF基因的KRAB构成锌指基因的最大亚家族。超过一半的C2H2-ZNF基因与人类基因组中的KRAB结构域相关联。C2H2-ZNF基因更容易发生簇集，并且存在于人类基因组的大簇中。KRAB结构域是人类基因组中最强的抑制因子之一。在KRAB结构域与四环素阻遏物(TetR)的融合下，TetR-KRAB融合蛋白便成为了首个经改造的药物可诱导的阻遏物，其在哺乳动物细胞中起作用。编码KRAB-ZFP的人基因包括KOX1/ZNF10、KOX8/ZNF708、ZNF43、ZNF184、ZNF91、HPF4、HTF10和HTF34。
染色阴影域是一种自我聚集的蛋白质结构域，引起染色质凝聚，从而抑制转录。当处理整合到宿主基因组中的逆转录病毒时，在多肽225中包含染色阴影域可能特别有用。因此在一些实施方案中，本发明所述组合物包含与逆转录病毒基因组(例如HIV)内的靶标相匹配的靶向性序列209和包含dCas9序列以及一个或多个染色阴影域的多肽225。所述靶向性序列209和多肽225在宿主内形成复合物201，并且通过所述靶向性序列209与整合的逆转录病毒序列结合。所述染色阴影域发生聚集，使染色质浓缩，抑制逆转录病毒的转录。对于该实施方案，优选地，所述多肽225可以包含核定位序列(NLS)。因此，在一些实施方案中，本发明提供了编码多肽的载体(例如质粒)，所述多肽以任何合适的顺序包含至少一个dCas9，至少一个染色阴影域和至少一个NLS。所述gRNA可以由该载体或另一载体编码。
Hes1的WRPW结构域是指毛发相关蛋白的Trp-Arg-Pro-Trp基序，所述毛发相关蛋白包括果蝇多毛和分裂蛋白增强子以及哺乳动物Hes蛋白。这些蛋白质是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录抑制子，其控制果蝇和哺乳动物中细胞命运决定。毛发相关蛋白是位点特异性DNA结合蛋白，其被定义为同时存在抑制子特异性bHLH DNA结合结构域和羧基末端WRPW(Trp-Arg-Pro-Trp)基序。这些蛋白质通过与靶基因启动子中的DNA位点结合而起到抑制子的作用，但不是通过干扰激活蛋白，表明这些蛋白质是活跃的抑制子，因此应具有特异性阻遏结构域(参见Fisher et al.,1996,Mol Cell Biol.16:2670，其通过引用并入)。
通过增加具有转录抑制结构域的dCas9，可以加强对本发明所述组合物的转录调控。
所述方法的组合物可以包括(例如，被包装入)合适的载体，包括病毒或非病毒载体。在优选的实施方案中，本发明所述方法和组合物提供了质粒中编码的dCas9和/或gRNA。
图3显示了含有所述核酸101的质粒301。在一些实施方案中，所述核酸101位于所述质粒301内，并由合适的运载体(例如上文所述或所讨论的任一载体)运载并递送到人的皮肤。
另外地或者可选地，可以使用载体如病毒载体提供本发明所述材料。在一些实施方案中，本发明包括使用腺相关病毒载体(AAV)。AAV可用于在体的基因递送，这归因于其较低的免疫原性和允许优先感染某些组织的血清型范围。由于AAV的低包装容量很难将dCas9和gRNA的基因一起(-4.2kb)包装进AAV载体中，在这种情况下，可以将所述dCas9和一种或多种gRNA包装进单独的AAV载体中，从而提升整体包装能力。所述dCas9基因可以包括基于来自嗜热链球菌的StlCas9的原始蛋白质的“收缩”版以及设计合理的截短Cas9。
可以用任何合适的方法递送本发明所述组合物，包括皮下递送、透皮递送、通过流体动力学基因递送、局部递送或任何其他合适的方法。在一些实施方案中，组合物101以运载体形式提供，并且适用于局部施加于人体皮肤。组合物可通过递送至宿主中的组织而原位引入细胞内。将所述组合物引入所述宿主细胞的过程可以包括例如，以局部的方式，将所述组合物非全身性地递送到所述宿主中的病毒感染局部储库中。
可以使用可接受的局部用运载体(例如，能被施用于皮肤表面以用于药物的局部递送、皮肤递送、皮内递送或透皮递送的任何可接受的剂型)中将本发明所述组合物递送到受影响的皮肤区域。可接受的局部用运载体与本文所述组合物的组合称为本发明的局部用剂型。根据本领域公知的方法，例如标准参考文献，如REMINGTON:THE SCIENCE ANDPRACTCE OF PHARMACY 1577-1591，1672-1673，866-885(Alfonso R.Gennaro编)；Ghosh,T.K.等，TRANSDERMAL AND TOPICAL DRUG DELIVERY SYSTEMS(1997)所提供的方法，通过将组合物与局部用运载体混合来制备本发明所述局部用剂型。
可用于局部用递送本文所述化合物的局部用运载体可以是本领域已知的用于局部施用药物的任何运载体，例如但不限于，可接受的溶剂，如多元醇或水；乳剂(水包油或油包水乳剂)，如乳膏或乳液；微乳剂；凝胶；软膏；脂质体；粉末；以及水溶液或悬浮液，如标准眼用制剂。
在某些实施方案中，用于递送本文所述组合物的局部用运载体是乳液、凝胶或软膏。乳剂(例如乳膏和乳液)是适用于根据本发明所述的局部用制剂。乳剂是包含至少两个不混溶相的分散系统，一个相以直径范围为0.1μm至100μm的小滴分散在另一个相中。通常包含乳化剂以改善稳定性。
在另一实施方案中，所述局部用运载体是凝胶，例如，两相凝胶或单相凝胶。凝胶是半固体体系，由液体穿插于其间的无机小颗粒或有机大分子的悬浮液组成。当凝胶块包含小离散无机颗粒的网络时，其被归类为两相凝胶。单相凝胶由均匀分布于整个液体中的有机大分子组成，使得分散的大分子和液体之间不存在明显的界限。REMINGTON：THESCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 1517-1518(Alfonso R.Gennaro编，第19版，1995)中公开了适用于本发明的凝胶。其它适用于本发明的凝胶公开于美国专利号6,387,383(2002年5月14日授权)；6,517,847(2003年2月11日授权)和6,468,989(2002年10月22日授权)中。可使用的聚合物增稠剂(成胶剂)包括本领域技术人员已知的那些，例如在化妆品和制药行业中经常使用的亲水性和水醇性成胶剂。优选地，成胶剂占组合物重量的约0.2％到约4％。所述试剂可以是交联的丙烯酸聚合物，其被赋予通用名称卡波姆。这些聚合物在用苛性物质(如氢氧化钠、氢氧化钾或其它胺碱)中和后溶于水并形成澄清的或轻微混浊的凝胶。
在另一优选的实施方案中，所述局部用运载体是软膏。软膏是含有少量水或不含水的含油半固体。优选地，所述软膏具有烃类基质，例如蜡、凡士林或成胶的矿物油。
在另一实施方案中，用于本发明所述局部用制剂中使用的局部用运载体是水溶液或悬浮液，优选水溶液。众所周知的眼用溶液和悬浮液是适用于本发明的局部用运载体。本发明的水性局部用制剂的pH优选在约6到约8的范围内。为了稳定pH，优选包括有效量的缓冲液。在一个实施方案中，所述缓冲剂以水性局部用制剂重量的约0.05％至约1％的量存在于所述制剂中。本发明的水性局部用制剂中可以包含张力调节剂。合适的张力调节剂的实例包括，但不限于，氯化钠、氯化钾、甘露醇、右旋糖、甘油和丙二醇。张力剂的量可以根据制剂的期望性质而大范围变化。在一个实施方案中，所述张力调节剂以水性局部用制剂重量的约0.5％至约0.9％的量存在于所述制剂中。优选地，本发明的水性局部用剂型具有0.015至0.025Pa.s(约15cps到约25cps)范围内的粘度。可以通过加入粘度调节剂(例如，但不限于，聚乙烯醇、聚维酮、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆、羧甲基纤维素或羟乙基纤维素)来调节本发明所述水溶液的粘度。
本发明所述局部用剂型可以包括可接受的赋形剂，例如保护剂、吸附剂、缓和剂、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、保湿剂、缓冲剂、增溶剂、皮肤渗透剂和表面活性剂。合适的保护剂和吸附剂包括，但不限于，除尘粉、硬脂酸锌、火棉胶、二甲聚硅氧烷、硅酮、碳酸锌、芦荟凝胶和其他芦荟产品、维生素E油、尿囊素、甘油、凡士林和氧化锌。合适的缓和剂包括，但不限于，安息香、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯醇。合适的润滑剂包括，但不限于，动物和植物脂肪和油、肉豆蔻醇、明矾和醋酸铝。合适的防腐剂包括，但不限于，季铵化合物，例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、地喹氯铵和西吡氯铵；汞剂，例如硝酸苯汞、乙酸苯汞和硫柳汞；醇类试剂，例如氯丁醇、苯乙醇和苯甲醇；抗菌酯，例如对羟基苯甲酸酯；以及其他抗微生物试剂如氯己定、氯甲酚、苯甲酸和多粘菌素。二氧化氯(ClO2)(优选稳定的二氧化氯)是用于本发明局部用制剂的优选防腐剂。合适的抗氧化剂包括，但不限于，抗坏血酸及其酯、亚硫酸氢钠、丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、生育酚和螯合剂，如EDTA和柠檬酸。合适的保湿剂包括，但不限于，甘油、山梨糖醇、聚乙二醇、尿素和丙二醇。适用于本发明的缓冲剂包括，但不限于，乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乳酸缓冲液和硼酸盐缓冲液。合适的增溶剂包括，但不限于，季铵氯化物、环糊精、苯甲酸苄酯、卵磷脂和聚山梨醇酯。合适的皮肤渗透剂包括，但不限于，乙醇、异丙醇、辛基苯基聚乙二醇、油酸、聚乙二醇400、丙二醇、N-癸基甲基亚砜、脂肪酸酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯、月桂酸甲酯、甘油单油酸酯和丙二醇单油酸酯)；以及N-甲基吡咯烷酮。
图4表示用于治疗病毒感染的方法401。所述方法401包括向宿主细胞中引入组合物101，所述组合物101包含核酸105(所述核酸105编码多肽225，所述多肽225包含Cas9酶的非切割变体)和RNA 205(所述RNA 205包含与病毒基因组221中的靶标互补的部分209)。优选地，所述多肽225与所述RNA 205结合形成复合物201，并且所述复合物通过所述RNA内的靶向性序列209与所述病毒基因组221内的靶标杂交。在优选的实施方案中，所述宿主细胞在宿主的原位并且所述宿主是哺乳动物。
优选地，靶向性序列209根据指定的相似性标准与所述靶标匹配并且根据所述相似性标准不与宿主基因组的任何部分匹配。例如，所述相似性标准可以规定，所述靶向性序列与所述靶标在具有20个核苷酸的段内至少60％互补，其中所述靶标具有毗邻20个核苷酸的段的原型间隔序列毗邻基序(PAM)。所述方法401会导致所述复合物201抑制所述病毒基因组的至少一部分的转录。
使用所述方法401可以靶向任何合适的病毒基因组。例如，所述病毒基因组可能来自于病毒，例如腺病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、人乳头瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花、乙型肝炎病毒、人博卡病毒、细小病毒、B19、人星状病毒、诺瓦克病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、严重急性呼吸综合征病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、风疹病毒、戊型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、关纳立特病毒、胡宁病毒、拉沙病毒、马丘坡病毒、沙比亚病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人类间叶病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、狂犬病病毒、丁型肝炎病毒、轮状病毒、环状病毒、科罗拉多蜱传热症病毒和版纳病毒。在优选的实施方案中，所述病毒基因组221是能够潜伏感染人宿主的病毒的基因组。在某些实施方案中，将所述组合物引入宿主细胞的过程包括将所述组合物递送到人患者内的潜伏感染的局部储库。病毒基因组中的靶标可以包括诸如以下的靶标：乙型肝炎病毒(HBV)基因组中的preC启动子；所述HBV基因组中的S1启动子；所述HBV基因组中的S2启动子；或者所述HBV基因组中的X启动子。在优选的实施方案中，所述病毒基因组中的靶标包括Epstein-Barr病毒(EBV)基因组中的病毒Cp(C启动子)。
图5显示了EBV参考基因组。要设计出靶向EBV基因组的向导RNA，可以参考如图5所示的EBV参考基因组。可以将向导RNA设计成靶向如EBNA 1的重要区域。EBNA1对许多EBV功能(包括基因调控和潜伏的基因组复制)来说至关重要。使向导RNA靶向EBNA1编码区两端中的任一端都能显著干扰转录。如图5所示，向导RNA sgEBV1、2和6落入重复区，从而提升了被复合物201结合的可能性。这些“结构性”靶标使得能够系统性地干扰对病毒功能非常重要的蛋白质的表达。
在某些实施方案中，所述病毒基因组中的所述靶标包括卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)基因组中的次要转录启动子区；所述KSHV基因组中的主要转录启动子；或这两者都包括。在一些实施方案中，所述病毒基因组中的靶标包括以下一种或多种：来自单纯疱疹病毒(HSV)的Egr-1启动子；来自HSV-1的ICP4启动子；来自HSV-2的ICP10启动子。在其他实施方案中，所述病毒基因组中的所述靶标包括选自下组中的一种：巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件和巨细胞病毒即刻早期启动子。在实施方案中，所述病毒基因组中的靶标包括HPV早期启动子或HPV晚期启动子。
在本发明的一些实施方案中，本发明所述组合物或者至少部分由其编码的复合物用于，例如，在感染病毒的宿主细胞内上调转录。所述组合物101包括编码多肽的核酸105，所述多肽包含Cas9酶的非切割变体；以及RNA，所述RNA包含与病毒基因组中的靶标互补的靶向性序列，例如，在图1或图3中所示的靶向性序列。在某些实施方案中，当核酸105是质粒301的一部分时，复合物201与质粒301杂交，导致质粒301的至少一部分的转录上调。其可以用于核酸105在受感染细胞内的初始转录从而有助于产生正反馈循环，在所述正反馈循环中，上调的转录随后会进一步提升上调的转录。优选地，所述靶向序列209根据预定标准与所述靶标匹配，并且根据所述预定标准不与宿主基因组的任何部分匹配。在一些实施方案中，所述核酸105(例如质粒301内的核酸105)还编码来自病毒基因组的启动子。通过这种方式，所述复合物225上调病毒感染的宿主细胞内的转录。
在一些方面和实施方案中，本发明通过提供形成复合物的dCas9和gRNA，提供了使用dCas9来调控转录的组合物和方法，其中所述复合物上调宿主细胞内的转录。例如，可以提供质粒301，其中所述多肽225与所述RNA 205结合形成复合物201，并且所述复合物201与所述质粒301杂交，导致所述质粒301的至少一部分的转录上调。质粒301可以含有图3中未示出的其他元件，例如调控序列，转录因子或其他酶的基因，其他基因或其组合。在一些实施方案中，所述宿主细胞内质粒的初始转录导致产生正反馈循环，在所述正反馈循环中，上调的转录随后提升上调的转录。
参考并入
在本公开的全部内容中已经参考和引用了其他文件，例如专利、专利申请、专利公开物、期刊、书籍、论文、网页内容。出于所有目的，所有这些文件在此都通过引用整体并入本文。
等同内容
从本文的全部内容(包括对本文中引用的科学文献和专利文献的参考)来看，本领域技术人员应当理解除了本文所示和所述的实施方案以外的本发明各种修改及其许多其他实施方案是显而易见的。本文的主题包含了重要的信息，范例和指导，其可用于调整用于本发明的各种实施例及其等同物的实施。
实施例
实施例1：靶向EBV
伯基特氏淋巴瘤细胞系Raji、Namalwa和DG-75可以获自ATCC并且根据ATCC的推荐，在补充有10％FBS和PSA的RPMI 1640中培养。人类原代肺成纤维细胞IMR-90可从Coriell获得并在补充有10％FBS和PSA的Advanced DMEM/F-12中培养。
可以获得由U6启动子驱动的嵌合向导RNA(sgRNA)和广泛存在的启动子驱动的dCas9组成的质粒。融合在dCas9蛋白后面的EGFP标记使得能够选择dCas9阳性细胞。经修饰的嵌合的向导RNA设计物导致更有效的Pol-III转录和更稳定的茎环结构(Chen B et al.(2013)Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an OptimizedCRISPR/Cas System.Cell 155:1479-1491)。
从Lonza对照质粒pmax-GFP中PCR扩增出带有合成内含子的经修饰的CMV启动子(pmax)。从IDT订购得到经修饰的向导RNA sgRNA(F+E)。从经B95-8转化的类淋巴母细胞系GM12891中PCR扩增出EBV复制起点oriP。可以使用标准的克隆步骤将pmax、sgRNA(F+E)和oriP克隆到pX458中，以取代原始的CAG启动子、sgRNA和f1起点。可以基于图5所示的EBV基因组来设计EBV的sgRNA。从IDT订购得到DNA寡核苷酸。pX458中的原始sgRNA占位片段用作阴性对照。
已知淋巴细胞对脂质转染具有抗性，因此可用核转染将DNA递送到Raji细胞中。选择了Lonza的pmax启动子来驱动dCas9的表达，这是因为其能在Raji细胞内强烈表达。使用Lonza Nucleofector II进行了DNA的递送。在每100-μl反应物中，用5μg质粒转染500万个Raji细胞或DG-75细胞。根据Lonza的推荐，使用了细胞系试剂盒V和M-013程序。对于IMR-90，使用T-030或X-005程序，在100μl溶液V中用5μg质粒转染了1百万个细胞。
为了设计靶向EBV基因组的向导RNA，可以使用来自B95-8菌株的EBV参考基因组(参见图5)。用于不同的转录调控目的，可以使用七种向导RNA设计靶向六个区域。EBNA1对于许多EBV功能(包括基因调节和潜伏的基因组复制)至关重要。可以使向导RNA sgEBV4和sgEBV5靶向EBNA1编码区的两端，以干扰基因组的整个该区域的转录。向导RNA sgEBV1、2和6落在重复区域中，从而提升与dCas9结合的成功率。EBNA3C和LMP1是宿主细胞转化所必需的，并且分别将向导RNA sgEBV3和sgEBV7设计成靶向这两种蛋白的5’端外显子。
实施例2：靶向乙型肝炎病毒(HBV)
本发明所述方法和材料可用于调节特定遗传物质(例如潜伏病毒基因组如乙型肝炎病毒(HBV))的转录。本发明还提供将核酸(例如DNA质粒)有效且安全地递送到靶细胞(例如，肝细胞)中。在一个实施方案中，本发明所述方法使用流体动力学的基因递送方式来靶向HBV。
图6显示了HBV的基因组。最好按照HBV基因组的注释(即识别基因组的重要特征的注释)选择用以被dCas9靶向的候选基因，这些基因位于这些特征(例如病毒复制起点、末端重复序列、复制因子结合位点、启动子、编码序列和重复区域)中的一个里。
作为嗜肝DNA病毒家族原型成员的HBV是42nm的具有部分双链DNA病毒，其由含有表面抗原(HBsAg)的外部脂蛋白外壳(也称为包膜)包围的27nm的核衣壳核心(HBcAg)组成。该病毒包含包膜病毒粒子，其中含有3至3.3kb的松弛环状的部分双链DNA和病毒粒子相关的DNA依赖性聚合酶，该酶可修复病毒粒子DNA模板中的缺口并具有逆转录酶活性。HBV是一种约3200bp的环状的部分双链DNA病毒，具有编码聚合酶(P)、核心(C)、表面(S)和X蛋白的四个重叠ORF。在感染过程中，病毒核衣壳进入细胞并到达细胞核，将病毒基因组递送到细胞核。在细胞核中，完成第二链DNA的合成并且修复两条链中的缺口以产生共价闭合的环状DNA分子，其充当四种病毒RNA的转录模板，所述四种病毒RNA长度为3.5、2.4、2.1和0.7kb。这些转录物被多聚腺苷酸化并被转运到细胞质，在所述细胞质中其被翻译成病毒核衣壳和前核抗原(C，pre-C)、聚合酶(P)、L(大)包膜、M(中)包膜、S(小)包膜，和转录反式激活蛋白(X)。包膜蛋白将其自身作为整合膜蛋白插入到内质网(ER)的脂质膜中。跨越整个基因组并且被称为前基因组RNA(pgRNA)的3.5kb类型与HBV聚合酶和蛋白激酶一起被包装到核心颗粒中，在所述核心颗粒中其充当负链DNA的逆转录模板。RNA向DNA的转换发生在颗粒内部。
在HBV基因组上碱基对的编号基于限制酶EcoR1的切割位点或在同源位点处(如果EcoRI位点不存在)。然而，也使用其他编号方法，这些方法基于核心蛋白的起始密码子或RNA前基因组的第一个碱基。HBV基因组中的每个碱基对都参与编码至少一种HBV蛋白。然而，基因组还含有调节转录水平、确定聚腺苷酸化位点甚至标记核衣壳包封的特定转录物的遗传元件。四个ORF通过使用不同的框内起始密码子引起七种不同HBV蛋白的转录和翻译。例如，当核糖体在adw基因组155位的ATG处开始翻译时，产生乙型肝炎病毒表面小蛋白。当核糖体在第3211位的上游ATG开始时，会产生乙型肝炎病毒表面中蛋白，导致在蛋白质的5’端添加55个氨基酸。
ORF P占据大部分基因组并编码乙型肝炎聚合酶蛋白。ORF S编码三种表面蛋白。ORF C编码肝炎e蛋白和核心蛋白。ORF X编码乙型肝炎X蛋白。HBV基因组含有病毒复制发生所必需的许多重要的启动子和信号区域。四种ORF的转录由四个启动子元件(preS1，preS2，核心和X)和两个增强子元件(Enh I和Enh II)控制。所有HBV转录物都有一个共同的腺苷酸化信号，其位于基因组中跨越1916-1921的区域。所得到的转录物长度范围从3.5个核苷酸到0.9个核苷酸。鉴于核心/前基因组启动子的位置，可以以不同的方式利用聚腺苷酸化位点。不同于经典的真核生物聚腺苷酸化信号序列(AATAAA)，聚腺苷酸化位点是六核苷酸序列(TATAAA)。已知TATAAA效率比较低下，适合被HBV进行差异使用。
基因组编码四种已知的基因，称为C，X，P和S。核心蛋白由基因C(HBcAg)编码，并且其起始密码前存在上游的框内AUG起始密码子，前核心蛋白就是从所述框内AUG起始密码子产生的。HBeAg由前核心蛋白的蛋白水解加工而产生的。DNA聚合酶由基因P编码。基因S是编码表面抗原(HBsAg)的基因。HBsAg基因是一个长开放阅读框，但含有将基因分成pre-S1、pre-S2和S三部分的三个框内起始(ATG)密码子。由于存在多个起始密码子，因此产生了具有三种不同大小的多肽，称为大多肽，中多肽和小多肽(pre-S1+pre-S2+S，pre-S2+S，或S)。虽然由基因X编码的蛋白质的功能尚未完全了解，但是其与肝癌的发展有关。它刺激促进细胞生长的基因并使生长调节分子失活。
参考图6，HBV通过结合具有PreS1的宿主细胞开始其感染周期。针对PreS1的向导RNA(“sgHBV-PreS1”)位于编码序列的5'末端。dCas9的结合干扰任何聚合酶活性。HBV通过长RNA的形式复制其基因组，并且在两端都具有相同的重复序列DR1和DR2，并且在5'末端具有RNA衣壳化信号epsilon。聚合酶基因的逆转录酶结构域(RT)将RNA转化成DNA。Hbx蛋白是病毒复制以及宿主细胞功能的关键性调控因子。由针对RT的RNA(“sgHBV-RT”)引导的转录调控会干扰RT的转录或翻译。向导RNA sgHbx和sgCore会干扰Hbx和HBV核心蛋白以及含有DR2-DR1-Epsilon的整个区域的转录。将所述四种sgRNA组合起来也会导致HBV基因组不能发生转录。
HBV通过逆转录RNA中间体来复制其基因组。首先将RNA模板转化为单链DNA类型(负链DNA)，随后将其用作合成正链DNA的模板。HBV中的DNA合成使用RNA引物来进行正链DNA的合成，其主要起始于单链DNA的内部位置。通过RNase H的切割作用生成引物，该切割是从RNA模板的5'末端开始的不依赖序列的长度测量。这个具有18个核苷酸的RNA引物退火到负链DNA的3'末端，并且引物的3'末端位于具有12个核苷酸的直接重复序列DR1内。由于引物易位，大部分正链DNA合成起始于位于负链DNA另一端附近的具有12个核苷酸的直接重复序列DR2。正链启动的位置会产生影响。原位启动产生双链线性(DL)DNA基因组，而自DR2启动会导致在第二次模板转换完成后合成松弛环状(RC)DNA基因组。虽然目前仍不清楚为何嗜肝DNA病毒在引发正链DNA合成方面具有这种增加的复杂性，但是引物易位的机制是潜在的治疗靶点。由于病毒复制对于维持嗜肝病毒(包括人类病原体，乙型肝炎病毒)的慢性携带状态是必需的，因此理解复制过程和揭示治疗靶点对于在携带者中限制疾病来说是至关重要的。
在一些实施方案中，本发明所述系统和方法通过在例如Pre S1等特征内寻找核苷酸串来靶向HBV基因组。针对PreS 1的向导RNA位于编码序列的5'末端。因此其是很好的靶向候选，因为其代表了编码序列中5'最末端的一个靶点并且dCas9可以阻止任何转录。
HBV通过长RNA形式复制其基因组，在两端都具有相同的重复序列DR1和DR2，并且在5'末端具有RNA衣壳化信号epsilon。聚合酶基因的逆转录酶结构域(RT)将RNA转化成DNA。Hbx蛋白是病毒复制以及宿主细胞功能的关键性调控因子。当dCas9由RNA引导针对RT时，RT的转录/翻译会受到干扰。图6显示了被CRISPR向导RNA靶向的HBV基因组中的关键部分。为了在细胞中实现转录调控，将编码dCas9和向导RNA的表达质粒递送到目标细胞(例如携带HBV DNA的细胞)。

Claims (23)

1.一种用于治疗病毒感染的组合物，所述组合物包含：
核酸，所述核酸编码
多肽，所述多肽包含可编程核酸酶的非切割变体，以及
靶向性寡核苷酸，所述靶向性寡核苷酸包括与病毒基因组中的靶标互补的靶向性序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述可编程核酸酶是Cas9并且所述靶向性寡核苷酸是向导RNA。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中当将所述组合物引入被所述病毒感染的细胞中时：
所述多肽和所述向导RNA被表达；
所述多肽与所述向导RNA结合形成复合物；以及
所述复合物通过所述靶向性序列与所述病毒基因组中的所述靶标杂交。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述复合物影响所述病毒基因组的至少一部分的转录。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述复合物抑制所述病毒基因组的至少一部分的转录。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述靶向性序列根据预定标准与所述靶标匹配，并且根据所述预定标准不与宿主基因组的任何部分匹配。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述宿主基因组是人基因组并且所述靶向性序列根据所述预定标准不与所述人基因组的任何部分匹配。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述病毒基因组中的所述靶标包括选自下组中的至少一种：乙型肝炎病毒(HBV)基因组中的preC启动子；所述HBV基因组中的S1启动子；所述HBV基因组中的S2启动子；以及所述HBV基因组中的X启动子；Epstein-Barr病毒基因组中的病毒Cp(C启动子)；卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)基因组中的次要转录启动子区；KSHV基因组中的主要转录启动子；来自单纯疱疹病毒(HSV)的Egr-1启动子；来自HSV-1的ICP4启动子；来自HSV-2的ICP 10启动子；巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件；巨细胞病毒即刻早期启动子；HPV早期启动子；以及HPV晚期启动子。
9.根据权利要求5所述的组合物，其中所述多肽还包含转录抑制结构域。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述转录抑制结构域包括选自下组中的一种：Kox1的Krüppel相关盒结构域；HP1α的染色阴影域；以及Hesl的WRPW结构域。
11.根据权利要求4所述的组合物，其中所述复合物在宿主细胞内上调转录。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述病毒基因组来自选自下组的病毒：腺病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、人乳头瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花、乙型肝炎病毒、人博卡病毒、细小病毒、B 19、人星状病毒、诺瓦克病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、严重急性呼吸综合征病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、风疹病毒、戊型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、关纳立特病毒、胡宁病毒、拉沙病毒、马丘坡病毒、沙比亚病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人类间叶病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、狂犬病病毒、丁型肝炎病毒、轮状病毒、环状病毒、科罗拉多蜱传热症病毒和版纳病毒。
13.一种用于治疗病毒感染的组合物，所述组合物包含：
多肽，所述多肽包含Cas9酶的非切割变体，以及
靶向性寡核苷酸，所述靶向性寡核苷酸与病毒基因组中的靶标互补。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中当将所述组合物引入被所述病毒感染的细胞中时：
所述多肽与所述靶向性寡核苷酸形成复合物；并且
所述复合物通过所述靶向性寡核苷酸与所述病毒基因组中的所述靶标杂交。
15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述靶向性寡核苷酸包括RNA并且与核糖核蛋白中的所述多肽复合。
16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述复合物影响所述病毒基因组的至少一部分的转录。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述病毒基因组中的所述靶标包括选自下组中的至少一种：乙型肝炎病毒(HBV)基因组中的preC启动子；所述HBV基因组中的S1启动子；所述HBV基因组中的S2启动子；以及所述HBV基因组中的X启动子；Epstein-Barr病毒基因组中的病毒Cp(C启动子)；卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)基因组中的次要转录启动子区；KSHV基因组中的主要转录启动子；来自单纯疱疹病毒(HSV)的Egr-1启动子；来自HSV-1的ICP4启动子；来自HSV-2的ICP 10启动子；巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件；巨细胞病毒即刻早期启动子；HPV早期启动子；以及HPV晚期启动子。
18.一种用于治疗病毒感染的组合物，所述组合物包含：
mRNA，所述mRNA包含编码多肽的5'帽，所述多肽包括可编程核酸酶的非切割变体；以及
靶向性寡核苷酸，所述靶向性寡核苷酸包括与病毒基因组中的靶标互补的靶向性序列。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述可编程核酸酶是Cas9并且所述靶向性寡核苷酸是向导RNA。
20.根据权利要求18所述的组合物，其中所述可编程核酸酶选自下组：NgAgo、Cas9、argonaute、Cas9同系物和Cpfl。
21.根据权利要求18所述的组合物，其中当将所述组合物引入被所述病毒感染的细胞中时：
所述多肽被表达；
所述多肽与所述RNA结合形成复合物；以及
所述复合物通过所述靶向性序列与所述病毒基因组中的所述靶标杂交。
22.根据权利要求18所述的组合物，其中所述复合物影响所述病毒基因组的至少一部分的转录。
23.根据权利要求18所述的组合物，其中所述病毒基因组中的所述靶标包括选自下组中的至少一种：乙型肝炎病毒(HBV)基因组中的preC启动子；所述HBV基因组中的S1启动子；所述HBV基因组中的S2启动子；以及所述HBV基因组中的X启动子；Epstein-Barr病毒基因组中的病毒Cp(C启动子)；卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)基因组中的次要转录启动子区；KSHV基因组中的主要转录启动子；来自单纯疱疹病毒(HSV)的Egr-1启动子；来自HSV-1的ICP4启动子；来自HSV-2的ICP 10启动子；巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件；巨细胞病毒即刻早期启动子；HPV早期启动子；以及HPV晚期启动子。
CN201680068434.2A 2015-09-29 2016-09-27 用于调节潜伏的病毒转录的组合物和方法 Pending CN108603192A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562234345P 2015-09-29 2015-09-29
US62/234,345 2015-09-29
PCT/US2016/053965 WO2017058795A1 (en) 2015-09-29 2016-09-27 Compositions and methods for latent viral transcription regulation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108603192A true CN108603192A (zh) 2018-09-28

Family

ID=58408682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680068434.2A Pending CN108603192A (zh) 2015-09-29 2016-09-27 用于调节潜伏的病毒转录的组合物和方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20170087225A1 (zh)
EP (1) EP3356528A4 (zh)
JP (1) JP2018534258A (zh)
CN (1) CN108603192A (zh)
AU (1) AU2016332706A1 (zh)
CA (1) CA2999923A1 (zh)
WO (1) WO2017058795A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593774A (zh) * 2019-01-08 2019-04-09 清华大学 一种抑制马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体
CN109943563A (zh) * 2019-03-08 2019-06-28 内蒙古大学 CRISPR-Cas9系统介导的狂犬病病毒基因组敲除的方法
CN111308091A (zh) * 2020-02-28 2020-06-19 首都医科大学附属北京儿童医院 基于Cas9-sgRNA的病毒LTR免疫沉淀筛选调控病毒转录靶标

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
EP3177718B1 (en) 2014-07-30 2022-03-16 President and Fellows of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
EP3365356B1 (en) 2015-10-23 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
GB2568182A (en) 2016-08-03 2019-05-08 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
KR102622411B1 (ko) 2016-10-14 2024-01-10 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
EP3601562A1 (en) 2017-03-23 2020-02-05 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
EP3676376A2 (en) 2017-08-30 2020-07-08 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
CN109468318A (zh) * 2017-09-08 2019-03-15 中山大学 用于抑制HSV-1复制和/或靶标序列表达的CRISPR/Cas9系统、方法、试剂盒及其应用
CN109468319A (zh) * 2017-09-08 2019-03-15 中山大学 用于抑制HSV-1复制和/或靶标序列表达的CRISPR/Cas9系统、方法、试剂盒及其应用
KR20200121782A (ko) 2017-10-16 2020-10-26 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 아데노신 염기 편집제의 용도
BR112021018606A2 (pt) 2019-03-19 2021-11-23 Harvard College Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos
WO2021087232A1 (en) * 2019-10-31 2021-05-06 William Marsh Rice University Engineered cells for controlled production
CN115485305A (zh) * 2020-02-28 2022-12-16 杰克逊实验室 癌细胞中裂解基因的激活
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
CN112750498B (zh) * 2020-12-30 2022-06-24 同济大学 靶向逆转录引物结合位点从而抑制hiv病毒复制的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7019233B2 (ja) * 2013-07-11 2022-02-15 モデルナティエックス インコーポレイテッド ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡを含む組成物ならびに使用方法
WO2015089465A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for hbv and viral diseases and disorders
SG11201606819QA (en) * 2014-02-18 2016-09-29 Univ Duke Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593774A (zh) * 2019-01-08 2019-04-09 清华大学 一种抑制马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体
CN109943563A (zh) * 2019-03-08 2019-06-28 内蒙古大学 CRISPR-Cas9系统介导的狂犬病病毒基因组敲除的方法
CN111308091A (zh) * 2020-02-28 2020-06-19 首都医科大学附属北京儿童医院 基于Cas9-sgRNA的病毒LTR免疫沉淀筛选调控病毒转录靶标

Also Published As

Publication number Publication date
EP3356528A1 (en) 2018-08-08
EP3356528A4 (en) 2019-08-28
JP2018534258A (ja) 2018-11-22
CA2999923A1 (en) 2017-04-06
US20170087225A1 (en) 2017-03-30
WO2017058795A1 (en) 2017-04-06
AU2016332706A1 (en) 2018-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108603192A (zh) 用于调节潜伏的病毒转录的组合物和方法
US20170088828A1 (en) Compositions and methods for treatment of latent viral infections
Berkhout et al. TAR-independent activation of the HIV-1 LTR: evidence that tat requires specific regions of the promoter
EP1285004B1 (en) method of producing synthetic peptides
CN103930551B (zh) 猴腺病毒和杂合腺病毒载体
US5707618A (en) Adenovirus vectors for gene therapy
EP3362571A2 (en) Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
JP2018516596A (ja) 抗ウイルスの方法および組成物
Hatfield et al. Redundant elements in the adenovirus type 5 inverted terminal repeat promote bidirectional transcriptionin Vitro and are important for virus growthin Vivo
JPH07509121A (ja) ｍＲＮＡの阻害／不安定領域の除去方法
WO2001039797A3 (en) Artificial chromosome constructs containing nucleic acid sequences capable of directing the formation of a recombinant rna-virus
Bohan et al. Mutational analysis of sodium butyrate inducible elements in the human immunodeficiency virus type I long yerminal repeat
Lin et al. MAR characteristic motifs mediate episomal vector in CHO cells
AU657698B2 (en) Method for modifying the cell, tissue or host tropism of a microorganism; recombinant microorganisms obtained in this way and use thereof in medicine and veterinary medicine
KR20010031762A (ko) 유전자요법을 위한 과열 유도 발현 벡터 및 그의 이용 방법
DE60117053D1 (de) Herstellung rekombinanter künstlicher hefe-chromosome, welche das genom des humanen cytomegalovirus enthalten
Schwartz Cis-acting negative RNA elements on papillomavirus late mRNAs
CN106794243A (zh) 新型免疫剂及其使用方法
Ramachandran et al. Novel Sp family-like transcription factors are present in adult insect cells and are involved in transcription from the polyhedrin gene initiator promoter
BR0211178A (pt) Cadeias nucleotìdicas quiméricas, proteìnas quiméricas, preparação farmacêutica, e, método diagnóstico
Berkhout et al. Control over HIV-1 replication by an antibiotic; a novel vaccination strategy with a drug-dependent virus
Kisstoth et al. A downstream regulatory element activates the bovine leukemia virus promoter
US20060019381A1 (en) Hyperthermic inducible expression vectors for gene therapy and methods of use thereof
Lagenaur et al. Regulation of Epstein-Barr virus promoters in oral epithelial cells and lymphocytes
Bigeriego et al. Heterotypic inhibition of foot-and-mouth disease virus infection by combinations of RNA transcripts corresponding to the 5′ and 3′ regions

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180928

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication