CN106794243A - 新型免疫剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含有效量的复制能力受控的重组病毒的疫苗组合物。进一步包括使用包含本发明的复制能力受控的重组病毒的组合物在免疫中的用途和免疫方法。

Description

新型免疫剂及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年8月26日提交的美国临时申请号62/070,443；和于2014年10月10号提交的美国临时申请号62/122,088的权益，两者通过引用以其全文结合在此；包括任何附图。
序列表的引用
本申请是连同电子格式的序列表提交的。序列表被提供为题为“VIR2A PCT_ST25.txt”的文件，创建于2015年8月25日，它是4KB大小。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文结合在此。
技术领域
本发明涉及某些复制能力受控的病毒以及它们用于免疫的用途。
发明背景
疫苗接种最可能是最具成本效益的医疗干预，在其二百多年的历史中已挽救了无数人的生命。在其中最巨大的成功认为是消灭天花以及白喉、破伤风和麻痹性脊髓灰质炎的实质消失。安德烈F.E.(Andre,F.E.)(2003)疫苗学：过去的成就、现在的障碍和未来的希望(Vaccinology:past achievements,present roadblocks and future promises).疫苗(Vaccine)21:593-5。另外，疫苗接种在世界的至少一部分中控制了黄热病、百日咳、乙型流感嗜血杆菌、麻疹、腮腺炎、风疹、伤寒和狂犬病。然而，重要的感染仍然是无法预防的，也不能通过治疗性疫苗治疗。此外，许多疫苗的有效性低于所期望的。显然，新疫苗的产生尚未变得常规，针对某些疾病的免疫剂的开发可能需要新的方法。以下实例说明了当前的一些挑战。
大约50％的十岁的美国和欧洲儿童对于单纯疱疹病毒HSV-1是呈血清阳性的。斯坦伯里L.R.(Stanberry,L.R.)单纯疱疹病毒疫苗(Herpes simplex virus vaccines).疫苗(Vaccines)(普洛特S.A.(Plotkin,S.A.)等人编)第五版2008.桑德斯·爱思唯尔(Saunders Elsevier)。在六十岁和七十岁患病率增加到70％-80％。在青少年期期间单纯疱疹病毒HSV-2的患病率上升，在欧洲和美国分别达到20％和30％的峰值。潜在的危及生命的感染可发生在患有皮肤病的受试者中。眼睛的HSV感染可影响结膜、角膜或视网膜，并可导致失明。围产期疱疹感染可以包括脑炎或播散性感染。免疫受损的受试者(例如HIV患者)中的感染也可能是危及生命的。HSV感染有许多并发症，导致显著的发病率和死亡率。值得注意的是，急性生殖器疱疹感染显著增加了HIV获得的风险。HSV-1和HSV-2感染涉及在病毒沿着神经纤维进入和扩散到感觉性神经节的部位处的复制，在感觉性神经节处建立潜伏期。病毒可以周期性/偶发性地再激活，迁移回外周并在外周复制。许多预防性和治疗性候选疫苗被开发，并在临床上进行测试。斯坦伯里L.R.(Stanberry,L.R.)(2008)。此时，没有有效的治疗性或预防性疫苗可用。有人认为成功的治疗性或预防性疫苗应该引发有力的抗体应答以及T细胞(Th-1)应答。坎宁安A.L.(Cunningham,A.L.)和米科罗斯卡Z.(Mikloska,Z.)(2001)精华之作：人类单纯疱疹病毒感染和疾病的免疫控制(The holy grail:immunecontrol of human herpes simplex virus infection and disease).疱疹8(增刊1)：6A-10A。
已经表明，开发预防性HSV-1或HSV-2疫苗的目标可能过于雄心勃勃，并且应该将焦点放在产生治疗性疫苗上。在这方面，令人鼓舞的是，能够开发出在预防带状疱疹(带状疱疹)中显示有效性的疫苗。约翰逊R.(Johnson,R.)等人(2007)带状疱疹的预防及其痛苦和使人衰弱的后果(Prevention of herpes zoster and its painful and debilitatingconsequences).国际感染病杂志(Int.J.Infect.Dis.)11(增刊2)：S43-S48。后一种疾病是由在感觉神经节中水痘带状疱疹病毒(VZV)的再激活引起的，VZV是另一种α疱疹病毒。由减毒活Oka株制备的疫苗在减少疾病负担或带状疱疹后遗神经痛方面是>60％有效的。这种保护与增强的细胞介导的免疫应答相关。该Oka株也用于开发用于预防水痘(chicken pox/varicella)的高效减毒活疫苗。格申A.A.(Gershon,A.A.)等人，水痘疫苗(Varicellavaccine).疫苗(Vaccines)(普洛特金S.A.(Plotkin S.A.)等人编)第5版，2008.桑德斯·爱思唯尔(Saunders Elsevier)。因此，可认为产生有效的单纯疱疹疫苗不应是不可能的。应注意，甚至更有效的带状疱疹疫苗(或不能重新激活的水痘疫苗)的开发将是一个有价值的目标。
流感的特征通常是突然发烧、喉咙痛、咳嗽、头痛、肌痛、发冷、厌食和疲劳。布里奇斯C.B.(Bridges，C.B.)等人，灭活的流感疫苗(Inactivated influenza vaccines).疫苗(Vaccines)(普洛特金S.A.(Plotkin S.A.)等人编)第5版，2008.桑德斯·爱思唯尔(Saunders Elsevier)；贝尔希R.B.(Belshe,R.B.)等人，流感活疫苗(Influenza vaccine-live).疫苗(Vaccines)(普洛特金S.A.(Plotkin S.A.)等人编)第5版，2008.桑德斯·爱思唯尔(Saunders Elsevier)。流感是一种高发病率但死亡率相对较低的疾病。季节性发生率通常在5％和20％之间。这种疾病的并发症造成的死亡人数相当可观。根据WHO，全世界每年的死亡人数可能在250,000和500,000之间。流感病毒是包膜的并且包含分段的负义RNA基因组。球形病毒颗粒具有由血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)组成的刺突。HA是宿主抗体应答针对的主要抗原。甲型流感病毒基于它们包膜蛋白HA和NA的性质被分为多个亚组。目前已知十六种H(A)和九种N(A)亚型。目前，H1N1、H1N2和H3N2亚型的流感病毒在人类中流行。甲型流感还感染鸟类(包括家禽)、猪、马、狗和甚至海洋哺乳动物。所有已知的HA和NA亚型可以从野生水生鸟类分离，该野生水生鸟类构成流行性甲型病毒的天然储库和基因来源。由于宿主中易错的复制和选择模式，甲型和乙型流感病毒在它们两种表面抗原(HA和NA蛋白)中经历了逐步的抗原改变。这种称为抗原漂移的现象使得持续警觉性和用于疫苗生产的株系的每年审查/更新成为必需。流行病是由抗原转移引起，即将仅含有新型HA亚型或既含有新型HA亚型又含有NA亚型的新型甲型流感病毒引入人群中。
自1945年以来已经使用全病毒灭活的流感疫苗。典型地，疫苗病毒已在鸡胚的尿囊腔中被繁殖。最近，此类疫苗还已经从在哺乳动物细胞系中扩增的病毒制得。自20世纪70年代以来，大多数灭活疫苗是亚病毒或裂解疫苗。使用的典型疫苗是三价的，包含来自H1N1和H3N2亚型甲型流感株和乙型流感株(称为TIV)的HA。灭活病毒疫苗(TIV)的可变效力、短的保护持续时间、对肠胃外给药(所用的主要途径)的不良反应和不存在有效细胞免疫的诱导已导致减毒活流感病毒疫苗(LAIV)的开发。鼻内疫苗是基于温度敏感性的和冷适应的甲型和乙型流感病毒株来制得。
不久前，疫苗效力和有效性数据的最新系统评价和元分析被发表。奥斯特霍尔姆M.T.(Osterholm,M.T.)等人(2012)流感疫苗的效力和有效性：系统评价和元分析(Efficacy and effectiveness of influenza vaccines:a systematic review andmeta-analysis).柳叶刀传染病(Lancet Infect.Dis.)12:36-44。该分析聚焦于在美国进行并在1967年和2011年之间发表的研究。研究是基于一系列旨在确保科学严谨并尽可能排除偏差的标准被选择。所有标准是通过17个显示疫苗效力(95％CI>0)的随机对照试验满足，其中8个与TIV相关，9个与LAIV相关。这些试验涵盖24个流感季节并且包括近54,000名参与者。在揭示针对TIV显著效力的试验中，6个涉及18-64岁的参与者，一个涉及6-23个月的儿童并且一个包括所有年龄组，并报告联合效力。这些试验揭示的疫苗效力均值是62％。应当注意，没有一项试验专门测试在65岁和超过65岁成人或2-17岁儿童中的疫苗效果。特别感兴趣的是在两个季节对幼儿进行的研究，在这两个季节中疫苗和流行株之间存在良好匹配。霍伯曼A.(Hoberman,A.)等人(2003)灭活流感疫苗在预防幼儿急性中耳炎方面的有效性：随机对照试验(Effectiveness of inactivated influenza vaccine inpreventing acute otitis media in young children:a randomized controlledtrial).JAMA290:1608-16。第一个季节中的疫苗效力是66％，第二个季节下降7％。关于LAIV，对6个月至7岁儿童的8项研究的平均效力是78％。奥斯特霍尔姆M.T.(Osterholm,M.T.)等人(2012)，对18-49岁的受试者进行的三项研究揭示没有显著的保护。一项对超过60岁的人的研究显示总体效力是42％，但60-69岁的人中的效力显现远低于超过70岁的人中的效力。没有合格的研究涉及8-17岁的儿童或50和59岁之间的成年人。
满足纳入标准的14项观察性研究的九项报告了季节性流感疫苗的有效性。奥斯特霍尔姆M.T.(Osterholm,M.T.)等人(2012)，这些研究包括17个嵌入或群组分析。17项分析中的六项(35％)显示出针对医学参与的、实验室确认的流感的显著有效性。在6-59个月的儿童中，在8个季节中的3个(38％)中发现显著的疫苗有效性。两个这样的研究中的一个报道了65岁及以上受试者的疫苗有效性。基于这些数据，可以得出结论，当前可用的流感疫苗提供针对病毒学确认的疾病的中度保护，该保护不是持久的。在一些季节可能不获得保护。保护最高风险群体，即65岁或超过65岁的人的证据确实很薄弱。显然需要更有效的疫苗。目前的疫苗主要依赖于用于保护作用的HA抗体的诱导。已经提出未来的流感疫苗应当能够诱导有力的(效应)T细胞应答，即应诱导更完全的免疫应答。奥斯特豪斯A.(Osterhaus,A.)等人，(2011)面向通用流感疫苗(Towards universal influenza vaccines).英国皇家学会哲学学报(Phil.Trans.R.Soc.B)366:2766-73；托马斯P.G.(Thomas,P.G.)等人(2006)细胞介导的流感感染保护(Cell-mediated protection in influenza infection).新发传染病(Emerging Infectious Diseases)12:48-54。
HIV/AIDS是撒哈拉沙漠以南的非洲国家的主要死亡原因，也是全世界死亡的重要原因。HIV是慢病毒，是引起特征性缓慢感染的逆转录病毒，在存在激活的宿主免疫应答的情况下在长潜伏期后产生疾病。HIV包括HIV-1和HIV-2，HIV-1是更具攻击性和更快速传播的病毒。作为感染过程的第一步，病毒包膜蛋白gp120结合至CD4受体，并然后结合至在靶细胞表面上的CCR-5或CXCR-4共受体。CD4存在于T辅助淋巴细胞、单核细胞-巨噬细胞、滤泡DC、皮肤中的朗格汉斯细胞和中枢神经系统中的小胶质细胞中。
目前，没有有效的针对HIV/AIDS的疫苗。许多观察结果表明，为了有效，疫苗必须触发实质性的细胞免疫应答。许多候选疫苗在临床试验中被测试。最近的关键试验利用病毒载体诱导T细胞应答。为了进一步增加效力，这些试验还实施初免-加强方案。一个这样的III期试验使用表达HIV gp120抗原的引发性金丝雀痘病毒和HIV gp120加强的组合。尽管发现了预防HIV-1的趋势，但是该疫苗对感染后病毒载量或CD4+细胞计数没有产生有益效果。德雷珀S.J.(Draper,S.J.)和长希尼J.L.(Heeney,J.L.)(2010)病毒作为用于传染病和癌症的疫苗载体(Viruses as vaccine vectors for infectious diseases andcancer).微生物自然评论(Nat.Rev.Microbiology)8:62-73；基姆J.H.(Kim,J.H.)等人(2012)HIV疫苗-经验教训和前进之路(HIV vaccines–lessions learned and the wayforward).当前HIV AIDS观点(Curr.Opin.HIV AIDS)5:428-34。使用表达多种HIV蛋白作为疫苗的不能复制的Ad5的另一个最近的多系列试验没有揭示任何效力的迹象。后来的经验以及窄CTL应答可以导致CTL逃逸突变体的出现的实现表明未来的候选疫苗应当能够诱导包括广泛的CTL应答的完全免疫应答。古尔德P.J.R.(Goulder,P.J.R.)和沃特金斯D.I.(Watkins,D.I.)(2004)HIV和SIV CTL逃逸：对疫苗设计的影响(HIV and SIV CTL escape:implications for vaccine design).免疫学自然评论(Nat.Rev.Immunol.)4:630-40；布鲁斯D.H.(Barouch,D.H.)等人(2002)最终的AIDS疫苗在恒河猴中通过病毒从细胞毒性淋巴细胞逃逸而失败(Eventual AIDS vaccine failure in a rhesus monkey by viralescape from cytotoxic lymphocytes).自然(Nature)415:335-9。
结核病是由结核分支杆菌引起的。史密斯K.C.(Smith,K.C.)等人(2008)结核病疫苗(Tuberculosis vaccines).疫苗(Vaccines)(普洛特金S.A.(Plotkin S.A.)等人编)第5版，2008.桑德斯·爱思唯尔(Saunders Elsevier)。该疾病代表了巨大的公共卫生问题，大约三分之一的世界人口感染该生物体，尽管有广泛的疫苗接种计划。潜伏性结核病感染是该疾病的临床前状态。疾病的爆发可以在建立潜伏感染时的数周或数十年内发生。每年的结核病死亡人数范围在百万。构成人类对结核分支杆菌抗性的确切免疫机制仍有待阐明。然而，已知进行性疾病与Th2或混合Th1/Th2应答相关，而纯Th1应答与保护相关。苏切尔H-M.(Surcel,H-M.)等人(1994)基于血液淋巴细胞对分支杆菌抗原的增殖和细胞因子应答在结核病中的Th1/Th2特征(Th1/Th2profiles in tuberculosis,based on theproliferation and cytokine response of blood lymphocytes to mycobacterialantigens).免疫学(Immunology)81:171-6；绍夫V.(Schauf,V.)等人(1993)细胞因子基因激活和改变对结核病患者血液中白细胞介素-2的响应性(Cytokine gene activation andmodified responsiveness to interleukin-2in the blood of tuberculosispatients).传染病杂志(J.Infect.Dis.)168:1056-9。卡介苗(BCG)疫苗是目前使用的最古老的疫苗。不幸的是，该疫苗是否发挥作用的问题尚未得到明确答复。已经报道了0和80％之间的效力。由BCG疫苗接种引发的确切免疫应答以及在宿主内的作用机制尚不清楚。史密斯K.C.(Smith,K.C.)等人(2008)。动物研究很少。史密斯D.W.(Smith,D.W.)(1985)BCG在实验性结核病中的保护作用(Protective effect of BCG in experimentaltuberculosis).结核病研究进展(Adv.Tuberc.Res.)22:1-97。然而，可用的信息指示保护作用可以随CD4T-细胞转移，但不随血清转移。此外，该T细胞应答在接种疫苗的动物中更快，导致更快的巨噬细胞激活。
显然需要新的且更有效的疫苗。本发明涉及包含复制能力受控的病毒的疫苗组合物以及利用该疫苗组合物进行免疫的方法。
具有复制能力的病毒和由安全开关(SafeSwitch)或安全开关样基因开关控制的病毒对总体上披露于美国专利号7,906,312和8,137,947中。
发明概述
在一个实施例中，本发明提供了改良的疫苗，该改良的疫苗包含含有有效量的复制能力受控的疱疹病毒的组合物。当与包含等量的复制缺陷型减毒疱疹病毒的对比疫苗相比时，该改良疫苗在哺乳动物激发模型中诱导优良的保护性免疫，条件是该减毒疱疹病毒和该复制能力受控的疱疹病毒来源于相同的野生型病毒。后一种野生型病毒也是哺乳动物激发模型中的激发病毒，即评估的保护性免疫是针对这个野生型病毒的。应当注意，利用相关哺乳动物激发模型建立的改进，作为人类数据还不可用。合适的哺乳动物激发模型是这样一种模型：在该模型中将选择的哺乳动物物种的动物用感兴趣的野生型病毒感染可重复地在动物中导致在人宿主中通过用相同或相似的野生型病毒感染诱导的疾病或病症的相关方面的表现。当可用时，优选小的哺乳动物模型，并且最优选小鼠模型。“保护性免疫”理解为免疫应答，该免疫应答预防或减轻/降低通过用野生型病毒接种诱导的疾病或病症的一个方面的免疫应答表现的严重性或持续时间或者降低由其导致的死亡率。
本发明的复制能力受控的疱疹病毒具有以下一系列性质：
(1)向哺乳动物受试者的身体区域给予时，该复制能力受控的病毒在没有激活的情况下，在该身体区域中保持基本上不复制，或者(即，在不同的实施例中)以与复制缺陷型对比病毒相似的低效率复制，该复制缺陷型对比病毒与该复制能力受控的病毒一样以相似的组合物、以相似的量以及向相似的身体区域给予至相似的受试者，
(2)将身体区域暴露于局部激活处理激活了该复制能力受控的病毒在身体区域中经历一轮复制，以及
(3)当激活时，该复制能力受控的病毒以足以在哺乳动物受试者中诱导免疫应答的效率复制，该免疫应答比通过复制缺陷型对比病毒在相似的受试者中诱导的免疫应答(复制能力受控的病毒和复制缺陷型对比病毒以相似的组合物、以相似的量和向相似受试者的相似身体区域给予)在减少衍生出复制能力受控的病毒的野生型病毒的感染和/或降低所述野生型病毒感染后的疾病严重性、疾病持续时间或死亡率方面更有效。
该复制缺陷型对比病毒与复制能力受控的重组疱疹病毒一样是衍生自相同的野生型病毒的病毒，该复制缺陷型对比病毒用作比较。这样的复制缺陷型对比病毒在该复制能力受控的病毒中经受有意调节的基因中的至少一个中将是有缺陷的。有缺陷的是指使该基因不能表达功能性基因产物的操作或事件的结果。野生型病毒是已经从受试者或环境中分离的病毒，并且虽然在体外或在动物中繁殖，但没有经历任何有意的选择或突变过程。
相对于复制缺陷型对比病毒或衍生出该复制能力受控的病毒的野生型病毒，复制能力受控的疱疹病毒的复制效率可以通过任何允许测定感染性病毒数目(空斑形成单位或pfu)或病毒颗粒数目的方法来估算。还可以使用用于估算病毒复制效率的生物化学方法。这些方法目的在于对病毒DNA、RNA或蛋白质产物的量进行定量，并且可以包括合适的组织化学或免疫组织化学方法和核酸扩增和检测的生物化学测定(例如，实时PCR、RT-PCR、探针杂交)或病毒蛋白质产物的检测(例如，蛋白质印迹或其他免疫测定)。如果在接种等量的感染性病毒或病毒颗粒之后的一个时间点测量到更高水平的感染性病毒或病毒颗粒或生物化学相关物(例如病毒DNA)，则激活的复制能力受控的病毒将被认为以比对比病毒更高的效率复制，在该时间点处(时间点)正在被比较的衍生出这些病毒的野生型病毒已基本上定量地完成一个复制周期。如果在接种等量的感染性病毒或病毒颗粒之后的一个时间点测量到更低水平的感染性病毒或病毒颗粒或生物化学相关物(例如病毒DNA)，则未激活的复制能力受控的病毒将被认为以比衍生出该复制能力受控的病毒的野生型病毒或对比病毒更低的效率复制，在该时间点处野生型病毒已基本上定量地完成至少一个复制周期。在稍后时间点进行的测量将比在较早时间进行的测量给予更多的权重(仅在涉及未激活的复制能力受控病毒的比较的情况下)。用于测定激活的复制能力受控的病毒的复制效率的典型体外实验是单步生长曲线。这种类型的实验也在实例部分中说明。
用于表征未激活的复制能力受控的病毒的体内复制行为的术语“基本上不复制”意指该未激活的复制能力受控的病毒以比衍生出该复制能力受控的病毒的野生型病毒的复制效率低至少10倍的效率复制。更优选地，未激活的复制能力受控的病毒的复制效率比衍生出该复制能力受控的病毒的野生型病毒的复制效率低至少25倍。甚至更优选地，未激活的复制能力受控的病毒的复制效率比衍生出该复制能力受控的病毒的野生型病毒的复制效率低至少100倍。
术语“与复制缺陷型对比病毒一样以相似地低效率进行复制”是指未激活的复制能力受控的病毒的复制效率，该未激活的复制能力受控的病毒的复制效率不超过对比病毒的复制效率的10倍，优选不超过对比病毒的复制效率的5倍，更优选不超过对比病毒的复制效率的两倍，并且最优选检测不到比对比病毒的复制效率高。复制效率高五倍是指与在已给予该病毒的身体区域中针对该对比病毒确定的复制效率相比，未激活的复制能力受控的病毒数量高5倍或其生物化学相关物水平高5倍的测定，从而该测定是在衍生出这些正被比较的病毒的野生型病毒已完成(基本上定量地)至少一个复制周期的时间点后的时间进行。
“相似的受试者”是指来自相同物种、相同性别和约相同年龄的受试者。术语可以被理解为具有统计意义，在这种情况下，接受对比病毒的相似受试者是相同哺乳动物物种、相同性别或性别混合并且大约相同年龄或年龄分布作为接受复制能力受控的病毒的受试者组的一组受试者。
“以相似的组合物、以相似的量以及向相似的身体区域中”是指与其相比较的组合物、量或身体区域相同的或以合理的努力可以实现的非常相似的组合物、量或身体区域。
在具体实施例中，疫苗组合物包含复制能力受控的重组疱疹病毒，该重组疱疹病毒的基因组包含小分子调节剂激活的反式激活因子的基因，该基因功能性地连接到充当热激启动子的核酸序列或充当热激启动子和反式激活因子应答启动子的核酸序列以及一个或多个反式激活因子应答启动子，该一个或多个反式激活因子应答启动子功能性地连接到一个或多个有效复制所需的病毒基因(也称为复制必需基因)上。在向哺乳动物受试者的身体区域给予该病毒后，在该身体区域中存在有效浓度的适当的小分子调节剂的情况下，可以使该病毒经受激活热剂量来激活。这种激活处理导致一轮病毒复制。为了方便，后面复制能力受控的疱疹病毒在本文中称为热-和小分子调节剂-激活的病毒。该复制能力受控的疱疹病毒可进一步包含来自另一种病原体的可表达异源基因(除了编码(异源)反式激活因子的基因)、编码免疫调节多肽的可表达异源基因或编码另一种多肽的可表达异源基因，或这些基因的任何组合。这样的异源基因可以在反式激活因子应答启动子或另一启动子(例如，组成型活性启动子)的控制下表达。例如，免疫调节多肽的异源基因可以是编码细胞因子或趋化因子的基因。异源基因也可以是编码促进病毒的局部扩散、感染或复制的蛋白质的基因，例如像基质金属蛋白酶的基因。特定的异源基因可以是另一种病原体的蛋白质(抗原)的基因(即除了复制能力受控的病毒或衍生出该复制能力受控的病毒的野生型病毒之外的病原体)。例如，本发明的复制能力受控的疱疹病毒可以包含在其基因组中插入的流感表面抗原HA和/或NA的可表达基因。作为另一个实例，异源基因可以编码缺少末端重复序列的逆转录病毒的修饰的基因组RNA，并且当表达时产生复制缺陷的病毒颗粒。可以想到这样的病毒颗粒将是比单独表达的病毒蛋白更有力的免疫原。
在其他具体实施例中，疫苗组合物包含复制能力受控的重组疱疹病毒，该重组疱疹病毒的基因组包含小分子调节剂激活的反式激活因子的基因，该基因功能性地连接到充当组成型活性的或反式激活因子增强的启动子的核酸序列，充当功能性地连接到第一复制必需病毒基因的热激启动子和功能性地连接到第二复制必需病毒基因的反式激活因子应答启动子的核酸序列上。在向哺乳动物受试者的身体区域给予该病毒后，在该身体区域中存在有效浓度的适当的小分子调节剂的情况下，可以使该病毒经受激活热剂量来激活。这种激活处理导致一轮病毒复制。该复制能力受控的重组病毒可进一步包含来自另一种病原体的异源基因、编码免疫调节多肽的异源基因或编码另一种多肽的异源基因，或两者。这样的异源基因可以在反式激活因子应答启动子或另一启动子(例如，组成型活性启动子)的控制下表达。后面复制能力受控的疱疹病毒在本文中还称为热-和小分子调节剂-激活的病毒。术语“反式激活因子增强的启动子”是指在不存在反式激活因子的情况下势必具有一定残余活性并且其活性随着反式激活因子水平的增加而增加的启动子(也称为自激活启动子)。“反式激活因子应答启动子”是理想地在不存在激活其的反式激活因子的情况下无活性的启动子。
在又其他实施例中，疫苗组合物包含复制能力受控的重组疱疹病毒，该重组疱疹病毒的基因组包含小分子调节剂激活的反式激活因子的基因，该基因功能性连接到充当组成型活性的或反式激活因子增强的启动子的核酸序列以及反式激活因子应答启动子，该反式激活因子应答启动子功能性地连接到复制必需病毒基因上。在向哺乳动物受试者的身体区域给予该病毒后，通过使该身体区域经受适当的小分子调节剂的有效浓度，可以使该病毒激活。这种激活处理导致至少一轮病毒复制。该复制能力受控的病毒可进一步包含来自另一种病原体的异源基因、编码免疫调节多肽的异源基因或编码另一种多肽的异源基因，或两者。这样的异源基因可以在反式激活因子应答启动子或另一启动子(例如，组成型活性启动子)的控制下表达。为了方便，后面复制能力受控的病毒在本文中称为小分子调节剂激活的病毒。
在一个实施例中，提供了复制能力受控的疱疹病毒，该复制能力受控的疱疹病毒的基因组包含小分子调节剂激活的反式激活因子的基因，该基因功能性地连接到充当热激启动子的核酸序列或充当热激启动子和反式激活因子应答启动子的核酸序列以及一个或多个反式激活因子应答启动子，该一个或多个反式激活因子应答启动子功能性地连接到一个或多个复制必需病毒基因上，其中如果该复制能力控制的疱疹病毒衍生自另一种疱疹病毒，如果该复制能力受控的疱疹病毒衍生自HSV-1或HSV-2或这些基因的功能类似物或直向同源物，那么复制必需病毒基因中的一个是ICP4基因或ICP8基因或复制必需病毒基因中的两个是ICP4和ICP8基因。还提供了包含这种疱疹病毒的疫苗组合物。
在一个实施例中，提供了复制能力受控的疱疹病毒，该复制能力受控的疱疹病毒的基因组包含小分子调节剂激活的反式激活因子的基因，该基因功能性地连接到充当组成型活性的或反式激活因子增强的启动子的核酸序列，充当功能性地连接到第一复制必需病毒基因的热激启动子和功能性地连接到第二复制必需病毒基因的反式激活因子应答启动子的核酸序列上，其中如果该复制能力控制的疱疹病毒衍生自另一种疱疹病毒，如果该复制能力受控的疱疹病毒衍生自HSV-1或HSV-2或这个基因的功能类似物或直向同源物，那么该第二复制必需病毒基因是ICP4基因。还提供了包含这种疱疹病毒的疫苗组合物。
在一个实施例中，提供了包含有效量的复制能力受控的疱疹病毒的组合物，该复制能力受控的疱疹病毒用于在哺乳动物受试者中诱导针对衍生出复制能力受控的疱疹病毒的野生型病毒的保护性免疫，借此该复制能力受控的疱疹病毒的基因组包含小分子调节剂激活的反式激活因子的基因，该基因功能性连接到充当热激启动子的核酸序列或充当热激启动子以及反式激活因子应答启动子和一个或多个反式激活因子应答启动子的核酸序列上，这些核酸序列功能性连接到一个或多个复制必需病毒基因上，并且通过将组合物给予哺乳动物受试者的皮肤或粘膜内或紧靠其下的区域、向哺乳动物受试者给予包含有效量的小分子调节剂的组合物、并使所述区域经受导致该复制能力受控的疱疹病毒的的激活的热处理来诱导保护性免疫。
本发明的复制能力受控的病毒衍生自疱疹病毒科的病毒。在更具体的实施例中，该复制能力受控的重组疱疹病毒衍生自选自HSV-1、HSV-2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒和玫瑰疹病毒的病毒。
具体实施例涉及包含热-和小分子调节剂-激活的病毒或小分子调节剂激活的病毒的疫苗组合物，借此该病毒衍生自HSV-1或HSV-2，并且反式激活因子控制的复制必需病毒基因是ICP4基因或ICP8基因的所有拷贝。在更具体的实施例中，该病毒与HSV-GS1相同或衍生自HSV-GS1。另一个实施例涉及包含热-和小分子调节剂-激活的病毒或小分子调节剂激活的病毒的组合物，借此该病毒衍生自HSV-1或HSV-2并且第一反式激活因子控制的复制必需病毒基因是ICP4基因的所有拷贝，并且第二反式激活因子控制的或热激启动子驱动的复制必需病毒基因是ICP8基因。在更具体的实施例中，该病毒与HSV-GS3相同或衍生自HSV-GS3。在其他实施例中，热-和小分子调节剂-激活的病毒或小分子调节剂激活的病毒衍生自HSV-1或HSV-2，并且缺乏功能性ICP47基因。该病毒可以与HSV-GS4相同或衍生自HSV-GS4。
在包含热-和小分子调节剂-激活的病毒或小分子调节剂激活的病毒的疫苗组合物的具体实施例中，该小分子调节剂激活的反式激活因子包含来自孕酮受体的配体结合结构域，并且通过孕酮受体拮抗剂或能够与配体结合结构域相互作用并能够激活该反式激活因子的其他分子激活。可替代地，它含有来自蜕皮激素受体的配体结合结构域，并且通过蜕皮类固醇、二酰基肼或能够与配体结合结构域相互作用并能够激活该反式激活因子的其他分子激活。在又另一个替代方案中，它含有来自细菌四环素阻遏物的配体结合结构域，并且通过四环素或能够与四环素阻遏物结构域相互作用并能够激活该反式激活因子的其他分子激活。在包含热-和小分子调节剂-激活的病毒或小分子调节剂激活的病毒的组合物的又另一个实施例中，该小分子调节剂激活的反式激活因子包含来自雌激素受体的配体结合结构域，并且通过雌激素受体或能够与配体结合结构域相互作用并能够激活该反式激活因子的其他分子激活。在另一个实施例中，该小分子调节剂激活的反式激活因子是含有FKBP12序列的多肽和含有来自mTOR的FRB序列的多肽的复合物，并且该反式激活因子通过雷帕霉素、雷帕霉素衍生物或能够与两种多肽相互作用并能够激活该反式激活因子的其他分子激活。
包含热-和小分子调节剂-激活的疱疹病毒或小分子调节剂激活的疱疹病毒的本发明的疫苗组合物可以进一步包含具有与复制能力受控的病毒的宿主范围重叠的宿主范围的、并且具有功能性地连接到反式激活因子应答启动子上的复制必需基因的第二病毒，以使得该复制能力受控的病毒的该反式激活因子的表达和激活还导致共感染的第二病毒的受控复制必需基因的表达，从而使得第二病毒能够复制。通过后面的组合物引发的免疫应答被期望不仅针对该复制能力受控的病毒，而且针对该第二病毒。第二病毒可以是腺病毒，并且功能性地连接到反式激活因子应答启动子上的复制必需基因(该第二病毒的)可以是E1基因或E4基因或这两种基因。
可替代地，包含热-和小分子调节剂-激活的疱疹病毒或小分子调节剂激活的疱疹病毒的本发明的组合物可以进一步包含具有与复制能力受控的病毒的宿主范围重叠的宿主范围的第二病毒，借此该第二病毒缺少复制必需基因或仅含有其非功能性形式，因此，如果该复制必需基因的所缺失的功能产物以反式被提供，则该第二病毒只能复制。在该组合物中，该复制能力受控的病毒包含后面的复制必需基因(第二病毒的)的功能性形式，该基因功能性地连接到反式激活因子应答启动子上，以使得该复制能力受控的病毒的反式激活因子的表达和激活也导致第二病毒的受控的复制必需基因的表达，从而补充第二病毒。通过后面的组合物引发的免疫应答应当不仅针对该复制能力受控的病毒，而且针对第二病毒。第二病毒可以是具有非功能性E1基因和/或E4基因的腺病毒，并且从该复制能力受控的病毒表达的复制必需基因可以是E1基因和/或E4基因。
其他实施例涉及疫苗组合物，这些疫苗组合物包含有效量的热-和小分子调节剂-激活的疱疹病毒或小分子调节剂激活的疱疹病毒和有效量的能够激活该反式激活因子的小分子调节剂，该反式激活因子控制热-和小分子调节剂-激活的疱疹病毒或小分子调节剂激活的疱疹病毒的复制。
本发明还涉及包含有效量的复制能力受控的疱疹病毒的疫苗组合物在免疫中的用途。在具体实施例中，本发明涉及包含有效量的热-和小分子调节剂-激活的疱疹病毒或小分子调节剂激活的疱疹病毒的组合物在免疫中的用途。该病毒可以包含一种或多种来自另一种病原体的异源基因、编码免疫调节多肽的异源基因或编码另一种多肽的异源基因。这样的异源基因可以在反式激活因子应答启动子或另一启动子(例如，组成型活性启动子)的控制下表达。有效量的病毒和小分子调节剂可以存在于相同的组合物中。后面的组合物能够在给予它的并随后经受激活处理的哺乳动物受试者中诱导免疫应答，该免疫应答比通过复制缺陷型对比病毒在相似的受试者中诱导的免疫应答(复制能力受控的病毒和对比病毒以相似的组合物、以相似的量和向相似受试者的相似身体区域给予)在减少衍生出复制能力受控的病毒的野生型病毒的感染和/或降低所述野生型病毒感染后的疾病严重性、疾病持续时间或死亡率方面更有效。
本发明还包括免疫的方法，在其中向受试者给予本发明的组合物。免疫方法的一个实施例包括(1)向哺乳动物受试者的身体区域给予本发明的组合物，该组合物包含有效量的热-和小分子调节剂-激活的疱疹病毒，该疱疹病毒还可包含可表达的异源基因，并且(2)在该身体区域中存在有效浓度的适当的小分子调节剂(其是能够激活该热-和小分子调节剂-激活的疱疹病毒的反式激活因子的小分子调节剂)的情况下，将所述身体区域暴露于激活热剂量。在相关的方法中，有效量的病毒和小分子调节剂在单一组合物中共同给予，并且该身体区域暴露于激活热剂量。
在相关的方法中，将包含有效量的还可含有可表达异源基因的小分子调节剂激活的疱疹病毒的本发明组合物给予至身体区域，并将该身体区域暴露于有效浓度的小分子调节剂。在另一个相关方法中，有效量的病毒和小分子调节剂在单一组合物中共同给予。在上面描述的方法的衍生的方法中，在存在有效浓度的小分子调节剂的情况下，热-和小分子调节剂-激活的疱疹病毒可以通过将该身体区域(接种区域)第二次或进一步暴露于激活热剂量而被激活第二次或更多次，或小分子调节剂激活的病毒可以通过将该身体区域第二次或进一步暴露于有效浓度的小分子调节剂来重新激活(条件是第二次或进一步的激活发生在病毒清除之前)。
给予本发明的组合物的该身体区域(接种部位区域)可以是受试者身体表面上或体内的任何区域，其中向该区域可以给予激活处理，例如热剂量和/或有效量的适当的小分子调节剂。该身体区域可以是位于该受试者的躯干或四肢上的任何地方的皮肤或皮下区域。优选地，组合物的给予可以是向位于该受试者的上肢的皮肤或皮下区域给予。还可以给予到受试者的肺或气道，或孔中的粘膜。另一个优选的身体区域是受试者的鼻粘膜。
在一个实施例中，提供了免疫的方法，该方法包括(1)向哺乳动物受试者的身体区域给予组合物，该组合物包含有效量的热-和小分子调节剂-激活的病毒，并且(2)在该身体区域中存在有效浓度的适当的小分子调节剂(其是能够激活该热-和小分子调节剂-激活的病毒的反式激活因子的小分子调节剂)的情况下，将所述身体区域暴露于激活热剂量。在一个实施例中，将有效量的病毒和小分子调节剂是在单一组合物中共同给予，并且将该身体区域暴露于激活热剂量。在一个实施例中，将有效量的病毒和小分子调节剂分开地共同给予，并且将该身体区域暴露于激活热剂量。在一个实施例中，该组合物是本文描述的任何疫苗组合物。在一个实施例中，该病毒是包含本文描述的复制能力受控的疱疹病毒的任何病毒组合物。在一个实施例中，该方法是对受试者针对疱疹性疾病或病症进行免疫的方法。在一个实施例中，将步骤(1)和(2)重复进行一个、两个或更多个另外的循环，可任选地间隔至少一周、一个月等。可任选地，该组合物的给予可以向位于受试者的肢端的皮肤或皮下区域给予。
在一个实施例中，提供了在受试者中实现病毒的基本一轮复制的方法，该方法包括(1)向哺乳动物受试者的身体区域给予组合物，该组合物包含有效量的热-和小分子调节剂-激活的疱疹病毒，并且(2)在该身体区域中存在有效浓度的适当的小分子调节剂(其是能够激活该热-和小分子调节剂-激活的疱疹病毒的反式激活因子的小分子调节剂)的情况下，将所述身体区域暴露于激活热剂量。可任选地，可以通过在前面的激活处理后的一至几天内重复步骤2来实现多轮复制。在一个实施例中，将有效量的病毒和小分子调节剂是在单一组合物中共同给予，并且将该身体区域暴露于激活热剂量。在一个实施例中，将有效量的病毒和小分子调节剂分开地共同给予，并且将该身体区域暴露于激活热剂量。在一个实施例中，该组合物是本文描述的任何疫苗组合物。在一个实施例中，该病毒是包含本文描述的复制能力受控的疱疹病毒的任何病毒组合物。在一个实施例中，该方法是对受试者针对疱疹性疾病或病症进行免疫的方法。可任选地，该组合物的给予可以是向位于该受试者的肢端的皮肤或皮下区域给予。
在一个实施例中，提供了制备复制能力受控的疱疹病毒的方法，该方法包括：
(i)通过插入来自选定的野生型疱疹病毒的位于选定的基因内插入位点侧翼的核酸序列来制备第一前体重组载体，
(ii)通过将反式激活因子基因盒在侧翼病毒核苷酸序列之间的位点中插入第一前体重组载体中来制备第一重组载体，该反式激活因子基因盒包含小分子调节剂激活的反式激活因子的基因，该基因功能性连接到充当热激启动子的核酸序列或者充当热激启动子和反式激活因子应答启动子的核酸序列上，
(iii)通过在用第一重组载体和野生型病毒粒子DNA共转导的细胞中重组而将该基因盒引入野生型疱疹病毒基因组中，通过检测在子代病毒基因组中该基因盒的存在鉴定第一重组病毒并从其制备病毒粒子DNA，
(iv)通过插入来自该野生型疱疹病毒的核酸序列制备第二前体重组载体，这些核酸序列位于选定的用于调节的复制必需病毒基因启动子区域的侧翼，
(v)通过在这些侧翼病毒核苷酸序列之间的位点将反式激活因子应答启动子插入第二前体重组载体中来制备第二重组载体，
(vi)通过在用第二重组载体和第一重组病毒的病毒粒子DNA共转导的细胞中重组将反式激活因子应答启动子引入第一重组病毒的基因组中，通过检测在子代病毒基因组中该反式激活因子应答启动子的存在鉴定第二重组病毒并且制备既含有反式激活因子基因盒又含有反式激活因子调节的复制必需病毒基因的子代病毒的原种。在一个实施例中，将该反式激活因子应答启动子插入该野生型疱疹病毒中以产生第一重组病毒，并且将该反式激活因子盒插入第一重组病毒中。
这些方法中的任何一个可以进一步表征为包括本申请中描述的任何步骤，特别包括在“本发明的详述”中的任何步骤。本发明进一步涉及鉴定、测试和/或制备本文描述的组合物的方法。本披露进一步涉及本文披露的组合物的药物(特别是疫苗)配制品。本披露进一步涉及在治疗或预防疾病例如疱疹疾病或病症的方法中使用这些组合物的方法。
附图简要说明
图1显示了控制荧光素酶靶基因的抗孕激素(米非司酮)辅助的和热激活(或热激活和抗孕激素(米非司酮)激活的)的安全开关(SafeSwitch)。复制自比拉沃阿N.(Vilaboa,N.)和瓦尔米R.(Voellmy,R.)(2009)治疗性转基因的有意调节(Deliberate regulationof therapeutic transgenes).基因和细胞疗法:治疗机制和策略(Gene and CellTherapy：Therapeutic Mechanisms and Strategies)，第三版(史密斯坦普尔曼N.(SmythTempleton,N.)编)CRC出版社(CRC Press)，博卡拉顿市(Boca Raton)，FL，第619-36页。
图2涉及在稳定地转染的人类细胞系中的安全开关性能。上图：在43℃激活热处理(HS)后一天的靶基因活性。下图：在米非司酮(Mif)存在下热激活后(43℃/2小时)1天(1d)和6天(6天)的基因活性以及激活的可逆性。*在HS后一天，Mif被洗掉。复制自比拉沃阿N.(Vilaboa,N.)和瓦尔米R.(Voellmy,R.)(2009)。
图3涉及在Vero细胞中使用HSV-GS1的单步生长实验。(A)复制的可控性。四种基本条件被测试：(1)在10nM米非司酮(激活处理)存在的情况下43.5℃热处理30分钟，(2)单独热处理，(3)单独米非司酮暴露以及(4)无处理。在感染后立即(即，在去除病毒接种物后立即)给予热处理。(B)野生型株系17syn+和HSV-GS1在有或没有激活处理的情况下的复制效率的比较。感染后4小时应用热处理。Mif：米非司酮。示出PFU/ml值和标准偏差。
图4涉及使用HSV-GS3的单步生长实验。(A)野生型株系17syn+和HSV-GS3在E5细胞(17syn+)或用ICP8表达质粒(HSV-GS3)转染的E5细胞中进行或不进行激活处理的复制效率的比较。(B)在Vero细胞中HSV-GS3的复制的调节。有关测试的四种基本条件的描述，请参见图3的图例(C)在SCC-15细胞中的类似实验。在这些实验中，在感染后立即给予热处理。示出PFU/ml值和标准偏差。
图5涉及在感染HSV-GS3的Vero细胞中病毒DNA复制和转录的调节。将多个感染的培养物经受图中所指示的处理。感染后4小时给予热处理(43.5℃持续30分钟)，并且在1小时、4小时、12小时和24小时后收获培养物组，并且提取DNA和RNA，并分别通过qPCR和RT-qPCR分析。Uli：乌利司他(ulipristal)。(A)HSV DNA。(B)ICP4RNA。(C)gC RNA。将值和标准偏差相对于每个图中的最高值进行标准化。
图6涉及HSV-GS3DNA复制和转录的调节，以及该小鼠足垫模型中HSV-GS3和KD6之间的复制产率的比较。将成年远系繁殖的小鼠用1x 105PFU的HSV-GS3或KD6接种在其后腿轻微擦伤的足垫上。在感染时腹膜内地给予指示剂量的乌利司他。在病毒给予后3小时，在45℃下进行10分钟的局部热处理。在热处理后24小时(图A-C)或4天(图D)处死小鼠，并且从足和背根神经节(DRG)分离DNA和RNA，并分别通过qPCR和RT-qPCR分析。(A)HSV DNA。(B)ICP4RNA。(C)gC RNA。(D)热处理后4天的HSV DNA。将值和标准偏差相对于每个图中的最高值进行标准化。ND：未检出。
详细说明
除非下文或本说明书中的其他地方另有定义，否则所有术语应具有相关领域中的普通含义。
“病毒的复制”或“病毒/病毒的复制”应理解为是指病毒颗粒的增殖。通常通过测定感染性病毒的数量(例如病毒的空斑形成单位(pfu))来测量复制。然而，也可以通过生物化学方法例如通过实时PCR程序确定病毒DNA的量，例如通过基因转录物的RT-PCR确定病毒基因表达的水平的方法等来评估复制。然而，应当理解，由于阈值效应，病毒DNA或病毒基因转录物或蛋白质产物的水平的边际增加可能不会在病毒复制的相应边际增加中转化。
“蛋白质毒性应激”是物理或化学损伤，该物理或化学损伤导致增加的蛋白质解折叠，减少新合成的多肽的成熟或引起不能合适地折叠的蛋白质的合成。
“小分子调节剂”应理解为与本发明结合使用的反式激活因子的低分子量配体。小分子调节剂能够激活该反式激活因子。小分子调节剂通常但并非必需小于约1000道尔顿(1kDa)。
术语“反式激活因子”在本文中用于指代非病毒的并且通常是工程改造的转录因子，该转录因子当被小分子调节剂激活时，可以正面影响由反式激活因子应答启动子控制的基因的转录。
“激活的”当与反式激活的基因结合使用时意指该基因的表达速率在激活后比激活前经测量变得更大。当与反式激活因子结合使用时，“活性”或“激活的”是指反式激活因子的有反式激活能力的形式。
“热激基因的启动子”、“热激基因启动子”和“热激启动子”同义使用。“充当热激启动子的核酸”可以是热激启动子或包含存在于热激启动子中的该类型的序列元件的核酸，这些元件赋予在功能性地连接的基因上的热激活。
本文中，其基因组包括外来(异源)非病毒或病毒基因的病毒被称为“病毒”或“病毒载体”。
“复制能力受控的病毒”是其复制能力在基因开关的控制下可以有意地被激活的重组病毒。
“重组病毒”确切地指代经实验者改变的病毒。通常，“重组病毒”简称为“病毒”。
“复制必需基因”或“有效复制所需的基因”在本文中任意地被定义为病毒基因，该病毒基因的功能的丧失将复制效率降低十倍或更多倍。复制效率可以例如在单步生长实验中被估算。对于许多病毒，众所周知它们的基因是复制必需基因。对于疱疹病毒参见例如，西山Y.(Nishiyama,Y.)(1996)疱疹病毒基因：病毒复制和致病性的分子基础(Herpesvirusgenes:molecular basis of viral replication and pathogenicitiy).名古屋L.(Nagoya L.)医疗科学(Med.Sci.)59:107-19。
“有效量的复制能力受控的病毒”是一定量的这种病毒，当该病毒单次或重复给予受试者后，随后激活可检测地增强了该受试者对衍生出该复制能力受控的病毒的野生型病毒的感染的抗性，和/或可检测地降低了所述野生型病毒感染后的疾病严重性、疾病持续时间或死亡率。以相似的组合物和向相似的受试者的相似身体区域给予的对应量的复制缺陷型对比病毒诱导较低水平的此类功能性免疫。
“小分子调节剂的有效量”是当通过期望的途径给予受试者时能够共激活(与热处理组合)热-和小分子调节剂-激活的病毒或者能够激活小分子调节剂激活的病毒的量，该受试者同时用所述病毒、已经或将要用所述病毒在接种部位区域中接种以经历一轮复制(或在小分子调节剂激活的病毒的情况下至少一轮复制)。
“受试者”或“哺乳动物受试者”是哺乳动物或人类。
“热激基因”在本文中定义为来自任何真核生物的任何基因，当含有该基因的细胞暴露于高于其正常生长温度的温度时，该基因活性增强。通常，当细胞正常暴露的温度升高3-10℃时，此类基因被激活。热激基因包括“经典”热激蛋白即Hsp110、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和Hsp20-30的基因。它们还包括其他热诱导基因，例如MDR1、泛素、FKBP52、血红素氧化酶和其他蛋白的基因。这些基因的启动子“热激启动子”包含称为热激元件(HSE)的特征序列元件，该热激元件由NGAAN或AGAAN类型的完美或不完美序列模块组成，所述模块以交替取向排列(艾米J.(Amin)，J.等人(1988)热激调节元件的关键特征(Key features ofheat shock regulatory elements).分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol)8:3761-3769；肖H.(Xiao,H.)和利斯J.T.(Lis,J.T.)(1988)种系转化用于定义热激应答元件的关键特征(Germline transformation used to define key features of heat-shock responseelements).科学(Science)239:1139-1142；费尔南德斯M.(Fernandes,M.)等(1994)果蝇和酵母热激因子-热激元件相互作用的精细结构分析(Fine structure analyses of theDrosophila and Saccharomyces heat shock factor–heat shock elementinteractions).核酸研究(Nucleic Acids Res.)22:167-173)。这些元件在所有真核细胞中高度保守，使得例如来自果蝇的热激启动子在蛙细胞中是功能性的和热调节的(瓦尔米R.(Voellmy,R.)和伦格尔D.(Rungger,D.)(1982)在爪蟾卵母细胞中果蝇热激基因的转录被热诱导(Transcription of a Drosophila heat shock gene is heat-induced inXenopus oocytes).美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)79:1776-1780)。HSE序列是热激转录因子的结合位点(HSF；综述于吴,C.(1995)热激转录因子：结构和调节(Heat shock transcription factors:structure and regulation).细胞发育生物学年度评论(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.)11，441-469)中。在暴露于热或蛋白毒性应激的脊椎动物细胞中主要负责热激基因激活的因子是热激转录因子1(在本文中称为“HSF1”)(巴莱尔R.(Baler,R.)等人(1993)人类热激基因的激活伴随着热激因子HSF1的寡聚化、修饰和快速易位(Activation of human heat shock genes is accompanied by oligomerization,modification,and rapid translocation of heat shock factor HSF1).分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)13:2486-2496；麦克米伦D.R.(McMillan,D.R.)等人(1998)热激因子1的靶向破坏消除了热耐受性和对抗热诱导性细胞凋亡的保护(Targeted disruption ofheat shock factor 1abolishes thermotolerance and protection against heat-inducible apoptosis).生物化学杂志(J.Biol.Chem.)273,7523-7528)。用于本文讨论的复制能力受控的病毒的优选启动子是来自可诱导hsp70基因的那些启动子。特别优选的热激启动子是人hsp70B基因的启动子(瓦尔米R.(Voellmy,R.)等人(1985)人类70,000道尔顿热激蛋白基因片段的分离和功能分析(Isolation and functional analysis of a human70,000-dalton heat shock protein gene fragment).美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82,4949-4953)。
“疫苗”通常是指包含被杀死的、复制缺陷或以其他方式减毒的微生物的组合物。本文中，该术语被扩展为还包括包含能够在给予它们的受试者中诱导免疫应答的复制能力受控的病毒的组合物。
如在背景技术中所暗示的，郑重地，目前的想法显现是为了有效或更有效，改良的用于预防或治疗疾病例如疱疹、HIV、结核病或流感的候选疫苗需要引发平衡的也包括有力的效应T细胞应答的免疫应答。本发明涉及复制能力受控的病毒，该复制能力受控的病毒在激活时以接近对应野生型病毒的效率复制。诸位发明人假设这些重组病毒和它们表达的任何异源蛋白质将是引发平衡的免疫应答的有力免疫原。
提出的用于免疫的新方法旨在以仔细控制的方式支撑所选择的病毒载体的未减弱的复制潜能。基本概念可以通过参考被称为人痘接种的天花预防的历史方法来说明。弗劳尔D.R.(Flower,D.R.)(2008)疫苗学的生物信息学(Bioinformatics forvaccinology).约翰·威利出版社(John Wiley&Sons)；亨德森D.A.(Henderson,D.A.)等人(2008)天花和牛痘(Smallpox and vaccinia).疫苗(Vaccines)(普洛特金S.A.(PlotkinS.A.)等人，编)第5版，2008桑德斯·爱思唯尔(Saunders Elsevier)。早于第一疫苗的程序涉及通常皮下地用来自从天花恢复的人的干痂或脓疱液接种健康人。当它常规地实施(直到19世纪初在欧洲和美国，并且直到至少在20世纪下半叶在非洲和亚洲偏远地区)，该程序与由疾病引起的约20％-30％的死亡率相比较有利地具有约0.5％-2％的感染后致死率。人痘接种对于使人针对天花进行免疫是有效的。虽然可能有几个原因使得该程序运作的如同它事实上一样好，一个原因显现与接种位点的选择有关：天花(即天花病毒)通常以小气溶胶液滴的形式进入肺。从那里该病毒迅速传播。当皮下接种时，进展不太快速，允许该免疫系统在早期阶段追上疾病。由于感染后致死率很高，当爱德华·詹纳(Edward Jenner)的疫苗接种方法变得普遍可用时，该人痘接种程序被所述疫苗接种方法迅速取代。进一步注意到，人痘接种遭受另一个严重的问题。经人经痘接种的人持续一定时间段是感染的。在这一时期，尤其因为他们通常没有或只有轻微的生病，所以他们能够四处移动并传播病毒给未感染人。
如果(1)可以确保免疫病毒剂的增殖被有效地限制到选择的接种区域，并且在时间上受到严格的限制，并且(2)在接种部位或其他地方显著的病毒复制的复发的可能性可以被防止并且(3)被免疫受试者传播致病病毒的可能性可以被排除，那么通过将引起疾病的微生物剂给予无害的局部部位并允许该试剂局部地大力增殖持续定义的一段时间以便触发强烈的先天性和适应性免疫应答，在受试者中通过诱导免疫的人痘接种来举例说明的一般程序可以是安全的。涉及本文讨论的复制能力受控的病毒的新型免疫方法已经被开发，具体目的是提供这种所需的安全性。野生型病毒通过将至少一种选择的复制必需基因置于具有宽动态范围的基因开关(即基本上用作开/关开关)的控制下被遗传改变。最优选的是被讨论的热-和小分子调节剂-激活的(双重应答)基因开关，例如，在比拉沃阿N.(Vilaboa,N.)等人(2011)用于有意调节转基因表达的基因开关：系统开发及其使用的最新进展(Gene switches for deliberate regulation of transgene expression:recentadvances in system development and uses).遗传综合征与基因治疗杂志(J.Genet.Syndr.Gene Ther.)2:107中。这种类型的特定基因开关，称为安全开关(通过热和抗孕激素共激活)已经用于实例中，并在图1中示出。除非特别指出，以下的描述涉及其复制已经在这种双重应答基因开关的控制下的病毒。然而，该描述也与本发明的其他复制能力受控的病毒(即，其他热-和小分子调节剂-激活的病毒和小分子调节剂激活的病毒)相关。
这样修饰的病毒(复制能力受控的(重组)病毒)的复制仅在当双重应答基因开关由适当的小分子调节剂配备时并且由瞬时热处理(在低于引起烧伤或疼痛但高于可能在发烧的患者中遇到的水平)触发而发生。一旦该基因开关被激活，该病毒表达病毒蛋白的全长量(或期望的病毒蛋白和任选地异源RNA或蛋白质的全长量)，并以接近野生型病毒的效率复制。
热量可以很容易集中。对已经给予复制能力受控的病毒(即，接种部位)以触发双重应答基因开关的激活(在存在小分子调节剂的情况下)的身体区域给予集中热将导致病毒复制，该病毒复制严格限制在加热区域。热和小分子调节剂的双重需求旨在提供对抗意外病毒复制的高水平安全性。在没有小分子调节剂的情况下，病毒的激活/再激活实际上是不可能的。相似地，在没有伴随的热处理的情况下，病毒复制通常不被激活。
配备的小分子调节剂需要满足一些标准。最重要的是物质是安全的；不良反应最多应以极低的比率发生，并且一般应具有温和的性质。理想地，所选择的小分子调节剂将属于在人类治疗中不使用的化学基团。然而，在没有另外开发用于人类治疗的任何物质可以在免疫接种程序中用作小分子调节剂之前，它必须已经历广泛的临床前和临床测试。选择以其他方式并非目标为用于免疫的给予至特定群体的已知和良好表征的药品可能更有效。可替代地，已知的药品可以被选择为(1)不需要在免疫后的至少前几周内给予受试者，和(2)仅指示用于短期、散发性给药，优选在医学监督下。因此，潜在的低水平风险通过避免在免疫病毒全身性存在的期间给予药品被进一步降低。在医学监督下偶尔使用该药品将确保免疫病毒的任何显著的无意的复制将被快速诊断，并且可以采取抗病毒措施而无耽搁。在本文描述的实例系统中，配备的小分子调节剂是孕酮受体(PR)拮抗剂或抗孕激素，例如米非司酮或乌利司他。米非司酮和乌利司他满足后面的要求：通常不需要在免疫后不久给药，并且仅较少使用(并且仅在人群的特定部分中)，并且仅在医学监督下。米非司酮和乌利司他具有优良的安全记录。
该新型免疫方法如何实施在以下具体实例中说明。将包含有效量的复制能力受控的病毒和有效量的小分子调节剂的组合物皮内地或皮下地给予受试者。给药后不久，加热贴片被激活并由受试者或医生施用至接种部位。约43.5℃-45.5℃(与皮肤接触的贴片表面的温度)的加热将持续约10-60min的时间。后者热处理将触发病毒复制的一个周期。如果需要另一轮复制，则在适当的稍后时间将另一个激活的贴片施用至接种部位。如果免疫程序涉及连续热处理，小分子调节剂也需要连续给予。可替代地，可以使用缓释配制品，其确保在期望的病毒复制期间在接种部位区域中存在有效浓度的小分子调节剂。
更一般地，可以通过任何合适的方法加热给予本发明的复制能力受控的病毒的身体区域，即该接种部位区域。可以通过包括与加热表面或加热液体、超声波、红外辐射或微波或射频辐射直接接触的不同方式在目标区域中传递或产生热。如在上面具体实例中提出的，可通过加热含有过冷液体的贴片(或其他形状的相似装置，例如圆筒或锥体，用于加热鼻子的粘膜表面等)来提供实用且廉价的解决方案，该过冷液体可以通过机械扰动被触发以结晶、在使用的化学品的熔化温度下释放热。有用的化学品可以是具有约48℃的熔化温度的五水合硫代硫酸钠。美国专利号3,951,127、4,379,448和4,460,546。该技术容易获得并且已经在许多保健产品中使用。
“激活热剂量”是引起接种位点区域内的细胞中HSF1的瞬时激活的热剂量。这个转录因子的激活是通过热诱导型热激基因的RNA转录物的可检测地增加的水平(高于在未暴露于热剂量的细胞中存在的水平)来证明。可替代地，它可以被证实为这种热激基因的蛋白质产物可检测地增加的量。此外，激活热剂量可以通过在存在有效浓度的适当的小分子调节剂的情况下复制能力受控的病毒的复制的发生来证明。
激活热剂量可以在约41℃和约47℃之间的温度下持续约1min和约180min之间的一段时间被递送至该目标区域。注意，热剂量既是温度又是暴露时间的函数。因此，相似的热剂量可以通过在该温度范围的下限的暴露温度和在该时间范围的上限的暴露时间的组合或在该温度范围的上限的暴露温度和在该时间范围的下限的暴露时间的组合来实现。优选地，热暴露将在约42℃和约46℃之间的温度下持续约5min和约150min之间的一段时间。最优选地，热处理是在约43.5℃和约45.5℃之间的温度下持续约10min和约60min之间的一段时间被给予。
在该接种部位区域中小分子调节剂的有效浓度是使得在也已接受适当热剂量的那个区域的感染细胞中的复制能力受控的病毒能够复制(一轮)的浓度。有效浓度的多少取决于该小分子调节剂对它的靶反式激活因子的亲和力。如何实现这样的有效浓度以及保持多长时间还取决于具体小分子调节剂的药物代谢动力学，这进而取决于该小分子调节剂的给药途径、该小分子调节剂的代谢和消除的途径、正在被检查的受试者(即受试者(人或其他哺乳动物)的类型，其年龄、状况、体重等)。它进一步取决于给予的组合物的类型，即组合物是否允许即时释放或缓慢释放调节剂。对于许多良好表征的小分子调节剂-反式激活因子系统，在某些实验受试者中的有效浓度已经被估算，并且可从文献中获得。这适用于基于孕酮受体、蜕皮激素受体、雌激素受体和四环素抑制剂的系统以及二聚体系统，即由雷帕霉素或类似物(包括非免疫抑制性类似物)或FK506或类似物激活的反式激活因子。例如，在大鼠中米非司酮的有效浓度可以通过i.p.(腹膜内)给予仅仅5μg/kg体重(5μg/kg)米非司酮达到。如果该小分子调节剂是口服给药的话，用量须大约加倍(至约10μg/kg)。王Y.(Wang,Y.)等人(1994)用于基因转移的调节系统(A regulatory system for use in genetransfer).美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91:8180-84。在通过所选择的途径给予后导致有效浓度的小分子调节剂的此类量被称为讨论的小分子调节剂的有效量。如何可以确定导致有效浓度的小分子调节剂的有效量是在本领域技术人员的技能之内，并且也在实例部分中进行了论述。
在如何实施该新型免疫方法的上述具体实例中，将本发明的复制能力受控的病毒(热-和小分子调节剂-激活的病毒)和适当的小分子调节剂在单一组合物中共同给予。复制能力受控的病毒和小分子调节剂也可以在分开的组合物中给予。免疫病毒和小分子调节剂的局部共同给予显现是有利的，原因有几个，包括最小化了该小分子调节剂的潜在次级效应，进一步减少了病毒在免疫期间可全身性复制的已经很小的可能性并且最小化了消除小分子调节剂的环境影响。尽管有这些优点，如果已经被针对特定给药途径测试的所选择的药品的配制品已经可用，该小分子调节剂可以通过全身途径给药，例如口服，可能是优选的。接种复制能力受控的病毒、给予适当的热剂量和给予有效量的小分子调节剂的相对时间安排是双重应答基因开关控制的操作需求的衍生物。通常，免疫病毒的接种将在热处理之前。这是因为热激转录因子(HSF1)的热激活是瞬时的，并且激活的因子在激活后至多几个小时内恢复到无活性状态。在因子活性的后面的短间隔期间，存在于病毒基因组中的双重应答反式激活因子基因必须可用于HSF1介导的转录。对于可用于转录的后者一种或多种基因，该免疫病毒将不得不吸附到宿主细胞上，进入该细胞并解开以将其基因组呈递给细胞转录机制。尽管不是优选的，但是可能的是在该免疫病毒给予之后立即(或甚至不久之前)将该接种位点区域加热暴露。通常，在病毒给予后约30min至约10h之间的时间，该接种部位区域被热暴露，但可以甚至稍后给予热处理。关于该小分子调节剂的给予，通常将具有更大的灵活性，因为有可能在该接种部位区域中全身地或特异性地维持有效浓度持续一至数天。因此，可以在病毒给予之前、当时或之后给予小分子调节剂，唯一的要求是该调节剂在接种部位区域中以有效浓度存在持续该靶反式激活因子发挥其使病毒复制的作用所需的时间。通常，这个时间将对应于完成一轮诱导的病毒复制所需的时间。通常，一轮病毒复制将在约一天内完成。
如前所述，在该新型免疫方法中，复制能力受控的病毒可以被诱导复制一次或数次。复制可以在上一轮复制后一至数天再次诱导。这种重复复制将用于增加在受试者中的病毒载量。对于发生任何一轮复制，受复制能力受控的病毒感染的靶细胞需要接受激活热剂量，而后者细胞所在的组织(接种区域)必须含有有效浓度的小分子调节剂。
免疫可以通过任何合适的途径，条件是给予的复制能力受控的病毒的一部分感染可以经受集中/局部热处理的狭窄限定区域内的细胞，并且该病毒在后者细胞中的复制触发所需的免疫应答(不引起疾病或不适当的不适)。给予免疫病毒的该身体区域(接种部位区域)可以是位于受试者的躯干或四肢上的任何地方的皮肤或皮下区域。优选地，包含复制能力受控的病毒的本发明的组合物的给予可以是位于该受试者的上肢的皮肤或皮下区域。还可以给予到肺或气道，或受试者的孔中的粘膜。这包括受试者的鼻粘膜。
双重应答基因开关由(1)小分子调节剂激活的反式激活因子的基因，该基因功能性地连接到对热和反式激活因子应答的启动子或启动子盒上，和(2)响应于控制感兴趣基因的反式激活因子的启动子组成。比拉沃阿N.(Vilaboa,N.)等人(2005)用于感兴趣的蛋白的靶向和定时表达的新型基因开关(Novel gene switches for targeted and timedexpression of proteins of interest).分子理论(Mol.Ther.)12:290-8。图1示出掺入米非司酮(和乌利司他)-依赖性嵌合反式激活因子GLp65(或glp65)的示例双重应答基因开关(该特定基因开关称为“安全开关”)。该反式激活因子包括来自酵母转录因子GAL4的DNA结合结构域、来自人孕酮受体的截短的配体结合结构域和来自人RelA蛋白的反式激活结构域。布尔钦M.M.(Burcin,M.M.)等人(1999)腺病毒介导的可调节靶基因在体内的表达(Adenovirus-mediated regulable target gene expression in vivo).美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)96:355-60；叶X.(Ye,X.)等人(2002)用于基因疗法的配体诱导型转基因调节(Ligand-inducible transgene regulation for gene therapy).酶学方法(Meth.Enzymol.)346:551-61。在含有基因开关和靶基因的细胞中，该靶基因被预期在不存在小分子调节剂(例如米非司酮)或激活热处理的情况下不表达。当该细胞经受适当强度的热处理时，(内源性)热激转录因子1(HSF1)被激活，并且开始从反式激活因子基因转录。短时间后，HSF1去激活，并且HSF1驱动的反式激活因子的表达停止。在不存在小分子调节剂的情况下，合成的反式激活因子保持无活性，并最终通过降解被去除。然而，在存在小分子调节剂的情况下，反式激活因子被激活并介导其自身基因以及该靶基因的表达。因此，只要小分子调节剂保持存在，某种反式激活因子水平就被维持并且靶蛋白继续合成(理论上)。它的撤除/去除引起反式激活因子的失活。靶基因以及反式激活因子基因表达将减少并最终停止，并且该系统将重置自身。
在瞬时转染和稳定细胞系形式中在体外广泛测试了米非司酮辅助的和热激活的安全开关，并且在将基因开关和靶基因电穿孔进入小鼠腓肠肌后在体内进行了广泛测试。比拉沃阿(Vilaboa)等人(2005)。从稳定地含有该基因开关和荧光素酶靶基因的细胞系的实验获得的结果再现于图2中。数据揭示该系统按预期执行。在没有米非司酮的情况下，甚至当细胞经受激活热处理时基本上没有靶蛋白表达。在存在热处理但米非司酮不缺乏的情况下导致靶基因表达的激活。注意到热阈值相对升高：即使在43℃下1小时的热处理仅导致次于最大的激活。靶基因表达的激活显然是热剂量依赖性的。单一热处理诱导维持目标基因表达持续至少6天，但只有在米非司酮持续存在的情况下。在激活后除去米非司酮导致靶基因表达的停止(由该不稳定靶基因产物的消失所证明的)。
还开发了在雷帕霉素或非免疫抑制性雷帕霉素衍生物存在下通过热处理激活的类似双重应答基因开关。马丁-萨维德拉F.M.(Martin-Saavedra,F.M.)等人(2009)用于严格控制转基因表达的热激活的雷帕霉素依赖性基因开关(Heat-activated,rapamycin-dependent gene switches for tight control of transgene expression).人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)20:1060-1。制备了两种不同的能够反式激活由含有ZFHD1结合位点的启动子(如最初地描述在里韦拉V.M.(Rivera,V.M.)等人(1996)用于基因表达的药理学控制的人源化系统(A humanized system for pharmacologic control of geneexpression).自然医学(Nat.Med.)2:1028-32)或GAL4启动子分别驱动的靶基因的形式。
可以并入双重应答性基因开关或相关基因开关中的小分子调节剂激活的反式激活因子的其他实例包括四环素/多西环素调节的tet-on阻遏子(苟森M.(Gossen,M.)和比雅尔H.(Bujard,H.)(1992)通过四环素应答启动子紧密控制哺乳动物细胞中的基因表达(Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters).美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89,5547-5551；苟森M.(Gossen,M.)等人(1996)哺乳动物细胞中通过四环素的转录激活(Transcriptionalactivation by tetracyclines in mammalian cells).科学(Science)268,1766-1769)和含有昆虫蜕皮激素受体的配体结合结构域的反式激活因子(No,D.等人(1996)在哺乳动物细胞和转基因小鼠中蜕皮激素诱导的基因表达(Ecdysone-inducible gene expressionin mammalian cells and transgenic mice).美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93,3346-3351)。后面类型的严格配体依赖性反式激活因子是由帕利(Palli)和同事开发的RheoSwitch反式激活因子。帕利S.R.(Palli,S.R.)等人(2003)改进的基于蜕皮激素受体的诱导型基因调节系统(Improved ecdysone receptor-based inducible gene regulation system).欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)270:1308-15；古玛M.B.(Kumar,M.B.)等人(2004)高度灵活的蜕皮激素受体配体结合口袋(Highly flexible ligand binding pocket of ecdysone receptor).单个氨基酸变化导致两组非甾体蜕皮激素激动剂之间的鉴别.生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279:27211-18。该RheoSwitch反式激活因子可以通过蜕皮类固醇(例如松甾酮A或米乐甾酮A)或通过合成的二酰基肼例如RSL-1(也称为RH-5849，首先由罗门哈斯公司合成)激活。达迪拉T.S.(Dhadialla,T.S.)等人(1998)具有蜕皮类固醇和保幼激素活性的新型杀虫剂(Newinsecticides with ecdysteroidal and juvenile hormone activity).昆虫学年度评论(Annu.Rev.Entomol.)43:545-69。可以使用其他小分子调节的反式激活因子，条件是它们可用于控制靶基因的活性还不引起宿主细胞的基因的广泛失调，并且进一步的条件是相关的小分子调节剂在其有效浓度下对于宿主具有可接受的低毒性。
与上面讨论的双重应答基因开关相关的基因开关由(1)小分子调节剂激活的反式激活因子的基因，该基因功能性地连接到热应答启动子上，和(2)响应于控制感兴趣基因的反式激活因子的启动子组成。与上述讨论的双重应答基因开关不同，该反式激活基因不是自激活的。因此，在单一激活热处理之后的这种基因开关的活性周期基本上短于包含自激活反式激活因子基因的相应的双重应答基因开关的活性周期，
该新型免疫方法在本文中由HSV-1衍生的病毒举例说明。包括其他类型的疱疹病毒的其他病毒可以用作本发明的复制能力受控的病毒的骨架。这些包括α疱疹病毒HSV2和水痘带状疱疹病毒(VZV)、β疱疹病毒(包括巨细胞病毒(CMV)和玫瑰疹病毒(HSV6和HSV7))和γ疱疹病毒(如艾伯斯坦-巴尔病毒病毒(EBV))以及卡波西氏肉瘤相关的疱疹病毒(KSHV)。本发明优选的复制能力受控的病毒衍生自HSV-1、HSV2或水痘带状疱疹病毒(VZV)。
在不同的实施例中，复制能力受控的病毒的两个复制必需基因不受将它们置于热和小分子调节剂的双重控制下的双重应答基因开关控制，但是由热激启动子和反式激活因子应答启动子单独控制(至少一个复制必需基因被热激启动子控制并且至少一个复制必需基因被反式激活因子应答启动子控制)。反式激活因子是从组成型启动子或自身激活的(反式激活因子增强的)启动子表达。如果一个复制必需基因由热激启动子控制，另一个由响应于激活的反式激活因子的启动子控制，则复制也通过热和小分子调节剂双重控制。然而，这种类型的复制能力受控的病毒由于几个原因而不太优选。首先，激活的HSF1以及因此的热激启动子倾向于在几小时时间内失活。因此，如果在热激启动子控制下表达，某些病毒基因可能不能在该病毒复制周期中实现其正常作用。第二，也与热激应答的瞬时性质相关，如果在该病毒生命周期的不同时间需要两种不同调节的病毒基因的表达(即分别由热激或反式激活因子调节)，激活热处理和小分子调节剂可需要在不同时间给予，对免疫程序增加了相当不便之处。只有展现出非常相似的表达谱的基因被选择用于调节，该要求会对受控病毒的设计表现出显著的限制。最后，在存在激活刺激物之一，即热或小分子调节剂的情况下，两种不同地调节的复制必需基因中的一种将被激活，削弱该复制块。在两个复制必需基因被双重调节的情况下，这些基因都不会在存在配体或者如果该宿主细胞暴露于热的情况下变得有活性。因此，即使在存在激活刺激之一的情况下，也将保持该严格的复制抑制。关于激活的适当热剂量，反式激活因子的本质和性质，以及病毒和小分子调节剂的性质和有效浓度等，读者可参考本说明书的前面部分。
在另一个较不优选的实施例中，复制能力受控的病毒的一个或多个复制必需基因不受热和小分子调节剂双重控制，而是由小分子调节剂单独控制。小分子调节剂激活的反式激活因子的基因是从组成型启动子或自激活启动子表达。为了实现病毒复制的定位程度，小分子调节剂也与免疫病毒一起或分开给予至接种部位。可以使用缓释配制品，其确保在期望的病毒复制期间在接种部位区域中存在有效浓度的小分子调节剂。关于反式激活因子的本质和性质，以及病毒和小分子调节剂的性质和有效浓度等，读者可参考本说明书的前面部分。
本发明的复制能力受控的病毒也可以用作载体以递送来自另一种感染剂的抗原。疱疹病毒科的病毒可以在其基因组中容纳相当大的DNA插入，这些插入预期不会显著降低复制效率。编码例如流感病毒表面抗原或内部蛋白、HIV包膜或内部抗原等的插入基因可经受热和/或小分子调节剂控制。这将使抗原表达与病毒复制相连并将其限制在接种部位区域。可替代地，插入的基因可以置于其他启动子(例如组成型启动子)的控制下，允许在非生产性感染的细胞中表达，这将导致更长时间的抗原表达以及在接种部位区域外的病毒感染的细胞中表达。
病毒长期以来被用作用于递送另一种病原体的抗原的运载体。史密斯G.L.(Smith,G.L.)等人(1983)表达乙型肝炎病毒表面抗原的传染性牛痘病毒重组体(Infectious vaccinia virus recombinants that express hepatitis B virussurface antigen).自然(Nature)302:490-5；莫斯B.(Moss,B.)等人(1984)活的重组牛痘病毒保护黑猩猩免受乙型肝炎(Live recombinant vaccinia virus protectschimpanzees against hepatitis B).自然(Nature)311:67-9。使用的减毒病毒载体包括复制缺陷型病毒以及保留一些复制能力的病毒。德雷珀S.J.(Draper,S.J.)和希尼J.L.(Heeney,J.L.)(2010).病毒作为传染病和癌症的疫苗载体(Viruses as vaccine vectorsfor infectious diseases and cancer).自然评论(Nat.Rev.)8:62-71。研究的病毒载体包括疱疹病毒。有证据表明与复制缺陷型病毒相比，减毒的有复制能力的病毒诱导更好的和更平衡的针对表达的抗原的免疫应答。彭B.(Peng,B.)等人(2005)复制型而不是非复制型腺病毒-人类免疫缺陷病毒重组疫苗在引发有力的细胞免疫和引发高滴度抗体方面更佳(Replicating rather than non-replicating adenovirus-human immunodeficiencyvirus recombinant vaccines are better at eliciting potent cellular immunityand priming high-titer antibodies).病毒学杂志(J.Virol.)79:10200-9；哈尔福德W.P.(Halford,W.P.)等人(2006)ICP0拮抗单纯疱疹病毒的Stat I依赖性抑制：对病毒潜伏期的调节的影响(ICP0antagonizes Stat I-dependent repression of herpes simplexvirus:implications for the regulation of viral latency).病毒学杂志(Virol.J.)3:44；黄X.(Huang,X.)等人(2009)新型具有复制能力的牛痘载体MVTT优于MVA用于通过粘膜疫苗接种诱导高水平的中和抗体(A novel replication-competent vaccinia vectorMVTT is superior to MVA for inducing high levels of neutralizing antibody viamucosal vaccination).公共科学图书馆期刊(PLoS One)4:e4180。我们假设以接近野生型效率复制的本发明的该复制能力受控的病毒将是与减毒病毒相似地强大的或甚至比减毒病毒更强大的“佐剂”。
最终涉及病毒负载疫苗的有效性。一个问题是疫苗载体是否与转基因产物竞争诱导免疫应答。矛盾的是，对载体抗原的强免疫应答可以增强对来自另一种病原体的载体表达的一种或多种抗原的免疫应答。德肯米勒M.E.(Truckenmiller,M.E.)、诺伯里C.C.(Norbury,C.C.)(2004)用于诱导CD8T细胞应答的病毒载体(Viral vectors for inducingCD8T cell responses).生物疗法的专家观点(Exp.Opin.Biol.Ther.)4:861-8。如果以足够的数量存在，CD8T细胞可以为其他应答性CD8+细胞提供帮助。王B.(Wang,B.)等人(2001)激活原初CD8+T细胞的多个路径：不依赖CD4的帮助(Multiple paths for activation ofCD8+T cells:CD4-independent help).免疫学杂志(J.Immunol.)167:1283-9。
另一个问题是对病毒的预先存在的免疫是否会阻碍其作为疫苗载体的使用。这个问题不仅涉及地方性的病毒例如腺病毒和疱疹病毒，而且涉及通常不感染人但重复用作疫苗载体的病毒。可能存在关于预先存在的对腺病毒(5型)的免疫力的影响比对任何其他载体的影响更严重的问题。德雷珀S.J.(Draper,S.J.)，希尼J.L.(Heeney,J.L.)(2010)。最近的研究表明，用异源抗原表达型修饰的Ad5载体接种后，预先存在的免疫力不干扰记忆CD8T细胞的产生，为有效的回忆应答和防护随后的挑战提供了基础。斯特芬森M.A.(Steffensen,M.A.)等人(2012)预先存在的载体免疫力不会阻止复制缺陷型腺病毒诱导有效的CD8T细胞记忆和回忆应答(Pre-existing vector immunity does not preventreplication-deficient adenovirus from inducing efficient CD8T-cell memory andrecall responses).公共科学图书馆期刊(PLoS One)7:e34884。此外，该转基因产物特异性应答可以通过进行疫苗再接种来加强。已经在多个研究中检查了预先存在的对疱疹病毒的免疫力的问题。布罗克曼M.A.(Brockman,M.A.)和奈普D.M.(Knipe,D.M.)(2002)单纯疱疹病毒载体在预先存在的宿主免疫力存在下引发持久的免疫应答(Herpes simplex virusvectors elicit durable immune responses in the presence of preexisting hostimmunity).病毒学杂志(J.Virol.)76:3678-87；查哈维A.(Chahlavi,A.)等人(1999)先前暴露于单纯疱疹病毒1对免疫活性小鼠中病毒载体介导的肿瘤疗法的影响(Effect ofprior exposure to herpes simplex virus 1on viral vector-mediated tumortherapy in immunocompetent mice).基因疗法(Gene Ther.)6:1751-58。德尔曼K.A.(Delman,K.A.)等人(2000)预先存在的免疫力对基于单纯疱疹的溶瘤疗法的反应的影响(Effects of preexisting immunity on the response to herpes simplex-basedoncolytic therapy).人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)11:2465-72；霍克奈尔P.K.(Hocknell,P.K.)等人(2002)来自单纯疱疹病毒1型衍生的扩增子的人免疫缺陷病毒1型gp120的表达导致有力的、特异性的且持久的细胞和体液免疫应答(Expression of humanimmunodeficiency virus type 1gp120from herpes simplex virus type 1-derivedamplicons result in potent,specific,and durable cellular and humoral immuneresponses).病毒学杂志(J.Virol.)76:5565-80；兰布赖特E.S.(Lambright,E.S.)等人(2000)在鼠腹膜内肿瘤模型中预先存在的抗疱疹免疫力对单纯疱疹病毒疗法的效力的影响(Effect of preexisting anti-herpes immunity on the efficacy of herpessimplex viral therapy in a murine intraperitoneal tumor model).分子疗法(Mol.Ther.)2:387-93；赫林格U.(Herrlinger,U.)等人(1998)预先存在的单纯疱疹病毒1(HSV-1)免疫力减少但不消除通过HSV-1载体向实验性脑肿瘤的基因转移(Pre-existingherpes simplex virus 1(HSV-1)immunity decreases but does not abolish,genetransfer to experimental brain tumors by a HSV-1vector).基因疗法(Gene Ther.)5:809-19。劳特巴赫H.(Lauterbach,H.)等人(2005)在抗病毒免疫力的存在下用重组单纯疱疹病毒1型载体接种后降低的免疫应答(Reduced immune responses aftervaccination with a recombinant herpes simplex virus type 1vector in thepresence of antiviral immunity).普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)86:2401-10；瓦塔纳贝D.(Watanabe,D.)等人(2007)单纯疱疹病毒多重即刻早期基因缺失重组体作为疫苗载体的性质(Properties of a herpes simplex virus multiple immediate-early gene-deleted recombinant as a vaccine vector).病毒学(Virology)357:186-98。大多数这些研究报道对疱疹病毒递送的异源抗原的免疫应答或对溶瘤性疱疹病毒的抗肿瘤效力的影响很小或仅有相对较小的影响。布罗克曼M.A.(Brockman,M.A.)和奈普D.M.(Knipe,D.M.)(2002)；查哈维A.(Chahlavi,A.)等人(1999)；德尔曼(Delman,K.A.)等人(2000)；霍克奈尔P.K.(Hocknell,P.K.)等人(2002)；兰布赖特E.S.(Lambright,E.S.)等人(2000)；瓦塔纳贝D.(Watanabe,D.)等人(2007)。确定了两项报道免疫应答实质性减少的研究。赫林格U.(Herrlinger,U.)等人(1998)；劳特巴赫H.(Lauterbach,H.)等人(2005)。然而，显现这些研究的结果可能不被推广，因为采用了折衷模型。这些研究之一使用了只是仅可用使用的突变体HSV株系感染的肿瘤模型。赫林格U.(Herrlinger,U.)等人(1998)。另一项研究使用嵌合小鼠免疫模型与严格地减毒的HSV株系(ICP4-、ICP22-、ICP27-、vhs-)的组合作为测试疫苗。劳特巴赫H.(Lauterbach,H.)等人(2005)。所有研究一致认为，即使在存在先前存在的免疫力的情况下，也可能使用疱疹病毒的疫苗。可以补充的是，预先存在的免疫力(例如，针对疱疹病毒)可能不是儿童接种疫苗的一般问题。
本发明的复制能力受控的病毒还可用于控制共感染的第二免疫病毒(或其他微生物)的复制/繁殖。在后者共调节病毒中，至少一种复制必需基因可以置于对复制能力受控病毒的小分子激活反式激活因子应答的启动子的控制下。为了提供实例，可以通过用反式激活因子-应答启动子替换E1和/或E4启动子来构建共调节的腺病毒。可能通过本发明的复制能力受控的疱疹病毒以这种方式共同调节的病毒是乳头瘤病毒(其还感染皮肤角质形成细胞)、某些多瘤病毒(感染皮肤成纤维细胞和角质形成细胞)和细小病毒B19(第五病；感染皮肤成纤维细胞)。应当注意，共调节的病毒可以天然地具有与调节病毒的重叠向性。在某些情况下，也可能通过假型化产生“匹配向性”。可以通过本发明的复制能力受控的病毒共同调节的病毒组可以进一步扩展，并且如果还考虑通过调节互补的共调节，甚至可以包括RNA病毒。一对病毒(具有重叠向性)可以例如由对复制必需基因有缺陷的共调节病毒和在反式激活因子应答启动子控制下表达后者复制必需基因的复制能力受控的病毒组成。
病毒已经演变出许多避开免疫检测和避免破坏的机制。托尔托雷拉D.(Tortorella,D.)等人(2000)免疫系统的病毒破坏(Viral subversion of the immunesystem).免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)18:861-926。消除或削弱这些机制中的一些可以进一步增强免疫病毒或病毒载体的免疫原性。例如，HSV-1和HSV-2表达蛋白质ICP47。这个蛋白质结合TAP1和TAP2两者的细胞质表面，TAP1和TAP2是与抗原加工TAP相关的转运蛋白的组分。阿德瓦尼S.J.(Advani,S.J.)和罗伊兹曼B.(Roizman,B.)(2005)征服策略(The strategy of conquest).单纯疱疹病毒与其宿主的相互作用(The interactionof herpes simplex virus with its host).由病毒调节宿主基因表达和先天免疫(Modulation of Host Gene Expression and Innate Immunity by Viruses)(P.帕莱塞(P.Palese)主编)，第141-161页，施普林格出版社(Springer Verlag)中。ICP47通过结合至竞争性抑制抗原肽结合的TAP的抗原结合位点上特异性地干扰MHC I类负载。预期病毒感染的人细胞在该MHC I类背景中的抗原肽的呈递中受损，并因此对CD8+CTL的杀伤具有抗性。编码ICP47的基因的缺失或失效应该显著地增加免疫病毒的免疫原性。
ICP47在啮齿动物模型中的作用很难研究，因为该蛋白质是比人类TAP抑制剂弱得多的小鼠TAP抑制剂。再者，一项研究能够证明HSV-1ICP47-突变体比相应的野生型株系具有更少的神经毒性，并且这种减少的神经毒性是由于保护性CD8T细胞应答。戈德史密斯K.(Goldsmith,K.)等人(1998)感染的细胞蛋白(ICP)47通过阻断CD8+T细胞应答增强单纯疱疹病毒神经毒性(Infected cell protein(ICP)47enhances herpes simplex virusneurovirulence by blocking the CD8+T cell response).实验医学杂志(J.Exp.Med.)187:341-8。潜在感染的神经元可展现出少有但可检测的病毒蛋白表达。费尔德曼L.T.(Feldman,L.T.)等人(2002)小鼠中单纯疱疹病毒1型潜伏期的自发分子再激活(Spontaneous molecular reactivation of herpes simplex virus type 1latency inmice).美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)99:978-83这些蛋白质可以由MHCI类呈递到特异性CD8T细胞，其作用可以是防止病毒再激活。康纳K.M.(Khanna,K.M.)等人(2004)潜伏期期间单纯疱疹病毒的免疫控制(Immune control of herpes simplex virusduring latency).当前免疫学观点(Curr.Opin.Immunol.)16:463-69。已经观察到CD8T细胞与在三叉神经节中感染的细胞的共定位。康纳K.M.(Khanna,K.M.)等人(2003)单纯疱疹病毒特异性记忆CD8T细胞被选择性地激活并保留在潜在感染的感觉神经节中(Herpessimplex virus-specific memory CD8T cells are selectively activated andretained in latently infected sensory ganglia).免疫力(Immunity)18:593-603。该CD8T细胞控制病毒从潜伏期的再激活，并且这个控制依赖于MHC I类呈递，这些在使用表达巨细胞病毒MHC I类抑制剂的HSV-1重组体的小鼠研究中得到证实。奥尔M.T.(Orr,M.T.)等人(2007)来自潜伏期的HSV再激活的CD8T细胞控制是通过MHC I类的病毒抑制而消除(CD8Tcell control of HSV reactivation from latency is abrogated by viralinhibition of MHC class I).细胞宿主微生物(Cell Host Microbe)2:172-80。因此，预期ICP47的缺失不仅增强复制能力受控的病毒的免疫原性，而且大大降低其无意地从潜伏期再激活的已经很低的概率。
免疫病毒(即本发明的复制能力受控的病毒)的免疫原性还可以通过在病毒基因组中包括细胞因子或免疫系统的其他组分的可表达基因来增强。在其中对表达各种细胞因子的复制缺陷型疱疹病毒重组体进行比较的小鼠中的疫苗接种研究证明病毒表达的IL-4和IL-2具有佐剂效应。奥西奥里约Y.(Osiorio,Y.)、吉亚斯H.(Ghiasi,H.)(2003)表达TH1和TH2细胞因子基因的单纯疱疹病毒1型重组病毒的佐剂效力的比较(Comparison ofadjuvant efficacy of herpes simplex virus type 1recombinant virusesexpressing TH1and TH2cytokine genes).病毒学杂志(J.Virol.)77:5774-83。另外，通过GM-CSF调节树突状细胞功能显示增强由BCG诱导的保护性免疫并克服对乙型肝炎疫苗的无应答性。比亚尔J.K.(Nambiar,J.K.)等人(2009)通过疫苗编码的GM-CSF调节肺的DC功能增强了针对结核分支杆菌感染的保护性免疫(Modulation of pulmonary DC function byvaccine-encoded GM-CSF enhances protective immunity against mycobacteriumtuberculosis infection).欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)40:153-61；周H.Y.(Chou,H.Y.)等人(2010)水凝胶递送的GM-CSF通过募集和激活树突细胞来克服对乙型肝炎疫苗的非应答性(Hydrogel-delivered GM-CSF overcomes nonresponsiveness to hepatitis Bvaccine through recruitment and activation of dendritic cells).免疫学杂志(J.Immunol.)185:5468-75。
本发明的复制能力受控的病毒的有效量是在给予受试者并并在其中诱导复制后导致该受试者的可检测增强的功能性免疫力(其优于由复制缺陷型对比病毒诱导的免疫)的量。这种增强的功能性免疫力自身可以表现为对循环(野生型)病毒的感染或再感染的增强的抗性，或者可以涉及增强的对当前感染的抑制/消除。因此，它自身还可以通过在所述野生型病毒感染后降低的疾病严重性、疾病持续时间或死亡率来表现。可替代地或另外，在表达外源抗原的免疫病毒的情况下，免疫力可涉及针对表达和/或展示后者外源抗原的病原体的预防性或治疗性免疫力。应注意，许多因素将影响什么构成有效量的复制能力受控的病毒，在一定程度上包括病毒给予至受试者的部位和途径以及所用的激活方案(即，加热和小分子调节剂给予的相对时间安排、递送到接种部位区域的一个或多个热剂量、诱导的复制循环的数目等)。在剂量探索实验中将确定复制能力受控的病毒的有效量。通常，本发明的复制能力受控的病毒的有效量将是从约102至约108空斑形成单位(pfu)的病毒。更优选地，有效量将是从约103至约107pfu的病毒，并且甚至更优选从约103至约106pfu的病毒。可以想到的是，本发明的复制能力受控的病毒的有效量可以在上述范围之外。
本发明的疫苗组合物将包含有效量的复制能力受控的病毒，并且如果小分子调节剂也作为组合物的一部分给予，则包含有效量的小分子调节剂。尽管在某些情况下可以以细粉的形式给予(例如在美国专利申请公开号20080035143中披露的)，但是本发明的组合物通常是包含本发明的病毒和小分子调节剂(视情况而定)的水溶液。它可以作为水溶液给予受试者(肠胃外地)，或者在向粘膜给药的情况下，作为其气雾剂给予。参见例如美国专利号5,952,220。本发明的组合物将通常包括缓冲剂组分。这些组合物将具有与预期用途兼容的pH，并且通常是约6和约8之间。可以使用多种常规缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、Tris、Bis-Tris、碳酸氢盐等及其混合物。缓冲剂的浓度一般范围是从约0.01％至约0.25％w/v(重量/体积)。
包含复制能力受控的病毒的本发明组合物可以进一步包括例如防腐剂、病毒稳定剂、张力剂和/或增粘物质。如前所述，它们还可以包括适当的小分子调节剂或包含这种小分子调节剂的配制品。
肠胃外产品中使用的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯和苯氧乙醇。苯氧乙醇是疫苗中发现使用最广泛的防腐剂。防腐剂通常以从约0.002％至约1％w/v的浓度范围使用。迈耶B.K.(Meyer,B.K.)2007.肠胃外使产品中使用的抗微生物防腐剂：过去和现在(Antimicrobial preservative use in parenteral products:past and present).药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)96:3155-67。防腐剂可以存在于包含复制能力受控的病毒的组合物中，其浓度使得它们不会或仅最低限度地干扰病毒的复制效率。
体积摩尔渗透压浓度可以用张力剂调节到与组合物的预期用途兼容的值。例如，可以将渗透压调节至大约相当于约0.9％w/v的氯化钠水溶液的正常生理流体的渗透压。合适的张力调节剂的实例包括但不限于钠、钾、钙和镁的氯化物盐、右旋糖、甘油、丙二醇、甘露醇、山梨醇等及其混合物。优选地，该一种或多种张力剂的用量为可提供150至450mOsm/kg，更优选约220和约350mOsm/kg之间，并且最优选约270和约310mOsm/kg之间的最终渗透压值。
如果指明，本发明的组合物可以进一步包括一种或多种粘度调节剂，例如纤维素聚合物，包括羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、甘油、卡波姆、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸盐、角叉菜胶、瓜尔胶、刺梧桐胶、琼脂糖、槐豆胶、黄芪胶和黄原胶。这种粘度调节组分通常以提供所需程度的增稠的有效量使用。粘度调节剂可以存在于包含复制能力受控的病毒的组合物中，其浓度使得它们不会或仅最低限度地干扰病毒的感染性和复制效率。
如果该组合物还含有小分子调节剂，则有效量的这种小分子调节剂可以以粉末、溶液、乳液或颗粒的形式包含在该组合物中。如前所提供的，与有效量的复制能力受控的病毒共同递送的小分子调节剂的有效量将是在接种部位区域产生有效浓度的小分子调节剂的量，该有效浓度使得能够在那个区域的感染细胞中进行至少一轮复制能力受控的病毒的复制。为了在更长的时间内维持有效浓度的小分子调节剂，即如果病毒(热-和小分子调节剂-激活的病毒)的复制通过接种位点的第二次或第三次的热处理重新开始，那么该小分子调节剂可以以缓释配制品的形式包含(也见下文)。
用于扩增病毒的方法在实验室领域是众所周知的。工业规模也已实现。对于疱疹病毒，参见亨特W.D.(Hunter,W.D.)(1999)减毒的、具有复制能力的单纯疱疹病毒1型突变体G207：非人灵长类动物脑内注射的安全性评价(Attenuated,replication-competentherpes simplex virus type 1mutant G207:safety evaluation of intracerebralinjection in nonhuman primates).病毒学杂志(J.Virol.)73:6319-26；兰普林R.(Rampling,R.)等人(2000)具有复制能力的单纯疱疹病毒(ICP34.5无效突变体1716)在患有复发性恶性胶质瘤的患者中的毒性评价(Toxicity evaluation of replication-competent herpes simplex virus(ICP34.5null mutant 1716)in patients withrecurrent malignant glioma).基因疗法(Gene Ther.)7:859-866。蒙德尔S.T.(Mundle,S.T.)等人(2013)HSV-2疫苗候选物ACAM529的高纯度制剂在体内是免疫原性的和有效的(High-purity preparation of HSV-2vaccine candidate ACAM529is immunogenic andefficacious in vivo).公共科学图书馆期刊(PLoS One)8(2):e57224。
用于纯化病毒的各种方法已经被披露。参见，例如，蒙德尔(Mundle)等人(2013)和其中引用的参考文献；沃尔夫M.W.(Wolf,M.W.)和赖希尔U.(Reichl,U.)(2011)细胞培养衍生的病毒颗粒的下游处理(Downstream processing of cell culture-derived virusparticles).疫苗专家评论(Expert Rev.Vaccines)10:1451-75。
尽管小分子调节剂可以在单一组合物中与复制能力受控的病毒共同给予，但是也可以分开给予包含复制能力受控的病毒的组合物和包含小分子调节剂的组合物。后者组合物将包含有效量的与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂一起配制的小分子调节剂。
包含小分子调节剂的组合物可经口服、肠胃外地、经吸入喷雾、局部地、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入式储药器进行给药，优选地通过口服给药或通过注射给药。这些组合物可以包含任何常规的非毒性的药学上可接受的载体、佐剂或运载体。在一些情况下，可以用药学上可接受的酸、碱或缓冲剂调节配制品的pH以增强配制的小分子调节剂或其递送形式的稳定性。如在此使用的术语肠胃外包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、以及颅内注射或输注技术。
用于口服给予的小分子调节剂的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。另外，液体剂型可包括本领域通常使用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂、增溶剂以及乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(具体地，棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻、以及芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇以及山梨聚糖的脂肪酸酯，以及它们的混合物。除了惰性稀释剂，这些口服组合物还可以包含例如，润湿剂、乳化剂和混悬剂、甜味剂、调味剂、以及芳香剂。
可以根据已知技术，使用适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可以是在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如，如在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的运载体和溶剂是水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、非挥发油通常用作一种溶剂或悬浮介质。为了这一目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的单酸甘油酯或二酸甘油酯。另外，还使用脂肪酸(如油酸)来制备可注射制剂。可注射的配制品可例如通过细菌阻挡滤膜过滤、或将灭菌剂以无菌的固体组合物(它们在使用前可溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中)的形式加入而进行杀菌。
为了延长小分子调节剂的作用，可希望的是减缓从例如皮下(或可能是皮内)或肌内注射的该化合物的吸收。这可通过使用水溶性不佳的结晶或非晶态物质的液体悬浮液来实现。然后，该小分子调节剂的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又可取决于晶体大小以及晶型。可替代地，通过将肠胃外给予的小分子调节剂溶解或悬浮于油运载体中来实现该化合物的延迟吸收。可注射的长效形式为通过在生物可降解的聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成该化合物的微胶囊基质而实现。根据化合物与聚合物的比率以及所利用的具体聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将该化合物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备长效可注射配制品。
直肠或阴道给予的组合物优选是栓剂，其可通过将该小分子调节剂与适当的非刺激性赋形剂或载体(例如，可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡，它们在环境温度下为固体但在体温下为液体并且因此可在直肠或阴道空腔中融化并释放出该小分子调节剂)相混合来制备。
用于口服给予的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末、以及颗粒。在此类固体剂型中，该小分子调节剂与至少一种惰性、药学上可接受的赋形剂或载体(如柠檬酸钠或磷酸氢钙)和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂例如，如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，如甘油，d)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂，如石蜡；f)吸收加速剂，如季铵化合物，g)润湿剂例如，如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，如高岭土和膨润土，以及i)润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，以及它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可以包括缓冲剂。
一种相似类型的固体组合物还可以在使用这样的赋形剂如乳糖或奶糖以及高分子量的聚乙二醇等的软和硬填充胶囊中被用作填充剂。
片剂、糖衣片、胶囊、丸剂、以及颗粒剂的固体剂型可用包衣和外壳(如肠溶包衣和药物配制领域中所熟知的其他包衣)来制备。它们可以任选地包含遮光剂，并且还可以具有一种组合物使得它们仅释放该小分子调节剂，或优选地，在肠道的某一部分中，任选地以延迟的方式释放。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
小分子调节剂局部的和/或经皮给药的剂型包括软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片。该小分子调节剂与药学上可接受的载体和任何防腐剂或可能需要的缓冲剂进行混合。
除小分子调节剂之外，这些软膏剂、糊剂、霜剂以及凝胶还可以包含赋形剂，如动物和植物脂肪、油类、蜡类、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石以及氧化锌或其混合物。
除小分子调节剂之外，粉剂和喷雾剂还可以包含赋形剂，如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外地含有常规推进剂，例如氯氟烃及其替代物。
经皮贴剂具有另外的优点，即提供化合物至身体的受控递送。此类剂型可以通过将化合物溶解或分散于适当介质中来制备。吸收促进剂还可以用来增加该化合物穿过皮肤的流量。
对于肺部递送，将包含有效量的本发明的小分子调节剂的组合物以固体或液体颗粒形式进行配制并通过直接给药(例如，吸入呼吸系统)给予至受试者。为实施本发明而制备的该小分子调节剂的固体或液体颗粒形式包括可吸入尺寸的颗粒：即尺寸足够小以在吸入时通过嘴和喉而进入肺的支气管和肺泡的颗粒。气雾化治疗剂，特别是气雾化抗生素的递送是本领域已知的(参见，例如美国专利号5,767,068和5,508,269，和WO 98/43650)。对抗生素的肺部递送的讨论也发现于美国专利号6,014,969中。
小分子调节剂的有效量的多少将取决于使用的具体小分子调节剂的活性、给药途径、给药时间、具体小分子调节剂的稳定性和排泄速率，以及给予的特定组合物的性质。它还可以取决于受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、与所使用的特定小分子调节剂组合或同时使用的其他药物、以及医学领域中熟知的类似因素。
最后，在剂量探索实验中必须确定小分子调节剂的有效量是多少，其中在接种部位区域中经实验评估病毒复制。一旦在动物实验中确定了有效量，就可以估算人类有效量。“工业指导(Guidance for Industry).在成人健康志愿者中估算治疗剂的初始临床试验的最大安全起始剂量(Estimating the maximum safe starting dose for initialclinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers)”,美国FDA，药物评价和研究中心，2005年7月，药理学和毒理学(Pharmacology and Toxicology)。例如，如从大鼠数据估算的，口服给予的米非司酮(用于实现病毒复制的单个周期)的人类有效量将在约1和约100μg/kg体重之间。
如果仅需要本发明的复制能力受控的病毒的单轮复制，可以将小分子调节剂作为单一剂量给予受试者。然而，也可以以分开的剂量给予受试者相同的量。如前所述，如果期望在相对短的时间内诱导多轮病毒复制，则可以以缓慢释放配制品给予有效量的小分子调节剂(一次)，该缓慢释放配制品在所讨论的时期期间能够维持小分子调节剂的有效浓度。可替代地，可以重复给予有效量的小分子调节剂(其能够维持单轮病毒复制)，借此每次给药与病毒复制的热激活协调(在热-和小分子调节剂-激活的病毒的情况下)。
在此引证数值的范围仅旨在用作单独地提及每个单独的数值落在该范围内的速记的方法，除非本文另外说明，并且每个单独的数值被结合到本说明书中就像它被单独地在此引证一样。
除非另外陈述或与上下文明显矛盾，否则在此对于使用了例如涉及一种或多种要素的术语的本发明的任何方面或实施例的描述，旨在提供对“由那一种或多种特定要素组成”、“基本上由那一种或多种特定要素组成”或“基本上包含那一种或多种特定要素”的本发明的类似方面或实施例的支持(例如，除非另外陈述或与上下文明显矛盾，否则在此所述的包含特定要素的组合物应理解为也描述由那个要素组成的组合物)。
本发明包括在此提出的被可适用法律最大程度允许的多个方面或权利要求中引证的主题的所有变更和等效物。
通过参照以下实例将更容易地了解由此总体上描述的本发明，这些实例是通过说明方式提供并且并非旨在成为本发明的限制。
实例
实例1：复制能力受控的病毒的构建
使用野生型HSV-1株系17syn+作为骨架构建所有载体。这个株系是完全毒性的，被良好表征，并且完整的基因组序列是可获得的。该病毒重组体的产生是通过如前所述的磷酸钙沉淀方法将工程化质粒与纯化的病毒粒子DNA一起同源重组到兔皮肤细胞(RS)中进行的。布鲁姆D.C.(Bloom,D.C.)1998.用于基因疗法的HSV载体(HSV Vectors for GeneTherapy).分子医学方法(Methods Mol.Med.)10:369-386。所有用于对反式激活因子或GAL4应答启动子的插入进行工程化以用于重组到HSV-1基因组中的质粒是克隆自HSV-1株系17syn+。如下产生质粒IN994：通过用DB112(5'GAG CTC ATC ACC GCA GGC GAG TCTCTT3')和DB113(5'GAG CTC GGT CTT CGG GAC TAA TGC CTT3')扩增HSV-1DNA(17+)(从碱基对95,441至96,090)产生HSV-1上游重组臂。将产物用SacI消化并插入pBluescript的SacI限制位点以产生pUP。使用引物DB115-KpnI(5'GGG GTA CCG GTT TTG TTT TGT GTGAC3')和DB120-KpnI(5'GGG GTA CCG GTG TGT GAT GAT TTC GC3')产生HSV-1下游重组臂以在碱基对96,092和96,538之间扩增HSV-1(17+株系)基因组DNA序列。将PCR产物用KpnI消化，并克隆到KpnI消化的pUP中以产生pIN994，pIN994与HSV-1在基因间UL43/44区域处重组。
HSV-GS1含有插入到UL43和UL44之间的基因间区域中的反式激活因子(TA)基因盒。另外，在短重复序列的两个拷贝中，ICP4启动子被GAL4应答启动子(含有GAL4结合位点的最小启动子)取代。通过将含有glp65基因的DNA区段(在启动子盒的控制下)插入位于HSV-1UL43和UL44基因的侧翼序列之间的质粒pIN994的多克隆位点中来构建第一重组质粒pIN:TA1，该启动子盒将人hsp70B启动子和GAL4应答启动子(在比拉沃阿(Vilaboa)等人2005中描述)组合。该TA盒是从质粒Hsp70/GAL4-GLP65(比拉沃阿(Vilaboa)等人，2005)中分离，并通过3段连接被克隆以使通过PCR扩增的区域最小化。对于左插入片段，将Hsp70/GAL4-GLP65用BamHI和BstX1消化，并对得到的2875bp条带进行凝胶纯化。这个片段含有Hsp70/GAL4启动子盒以及GAL4DNA结合结构域、孕酮受体配体结合结构域和反式激活因子GLP65的p65激活结构域的一部分。通过用引物TA.2803-22823.正向(5'TCG ACA ACT CCGAGT TTC AGC3')(SEQ ID NO:1)和BGHpA.反向(5'CTC CTC GCG GCC GCA TCG ATC CAT AGAGCC CAC CGC ATC C3')(SEQ ID NO:2)扩增pHsp70/GAL4-GLP65的一部分来产生右插入片段。将763bp的PCR产物用BstX1和NotI消化，并对所得的676bp条带进行凝胶纯化。这个条带含有p65激活结构域的3'末端和BGHpA。对于载体，将pIN994用BamHI和NotI消化，并对得到的4099bp片段进行凝胶纯化并用虾碱性磷酸酶(SAP)处理。然后将两个插入片段同时连接到该载体中，产生完整的TA盒。转化后，扩增14号集落，并且通过限制酶分析然后通过序列分析来验证该质粒。
通过磷酸钙沉淀将1μg pIN:TA1与2μg纯化的HSV-1(17+)病毒粒子DNA共转染到RS细胞中。通过挑取空斑，在RS细胞的96孔板上扩增这些空斑，并用通过随机六聚体引发来标记TA片段所制备的32P标记的DNA探针进行斑点印迹杂交，来针对重组体筛选得到的病毒库。将阳性孔重新形成空斑并重新探测5次，并通过PCR和序列分析验证含有TA。这个中间重组体称为HSV-17GS43。
第二重组质粒pBS-KS:GAL4-ICP4被构建，其包含GAL4应答启动子，该启动子是通过将其克隆在质粒pBS-KS:ICP4Δ启动子中的HSV-1ICP4重组臂之间而替代天然ICP4启动子而插入。这使ICP4转录物处于外源GAL4启动子的控制下。这个特定启动子盒包括酵母GAL4UAS(上游激活序列)的6个拷贝、腺病毒E1b TATA序列和合成内含子Ivs8。用AatII和HindIII从质粒pGene/v5-HisA(英杰公司)中切出该盒，并对所得的473bp片段进行凝胶纯化。对于载体，将pBS-KS:ICP4Δ启动子用AatII和HindIII消化，并对得到的3962bp片段进行凝胶纯化并用SAP处理。这两个片段的连接将GAL4启动子置于ICP4转录起始位点之前。转化后，将5号集落扩增、测试消化并通过测序验证。
通过磷酸钙沉淀，将1μg pBS-KS:GAL4-ICP4与4μg纯化的HSV-17GS43病毒粒子DNA共转染到ICP4补充细胞系E5的细胞中(德卢卡N.A.(DeLuca,N.A.)和谢弗P.A.(Schaffer,P.A.)1987.指定无义肽的单纯疱疹病毒1型(HSV-1)ICP4基因的活性Activities ofherpes simplex virus type 1(HSV-1)ICP4genes specifying nonsense peptides.核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:4491-4511)。通过挑取空斑，在E5细胞的96孔板上扩增这些空斑，并用通过随机六聚体引发来标记GAL4-应答启动子片段所制备的32P标记的DNA探针进行斑点印迹杂交，来针对重组体筛选得到的病毒库。将阳性孔重新形成空斑并重新探测7次，并通过PCR和序列分析验证含有在短重复序列的两个拷贝中的GAL4应答启动子。这个重组体称为HSV-GS1。
为了获得pBS-KS:ΔSacI，通过用SacI消化质粒，从质粒载体pBluescript-KS+的多接头缺失SacI位点。对所得的2954bp片段进行凝胶纯化，用T4 DNA聚合酶处理以产生平端、再环化和自连接。重组质粒BS-KS:ICP4Δ启动子构建如下：为了产生第一插入片段，将粘粒COS48(L.费尔德曼(L.Feldman)赠送)用引物HSV1.131428-131404(5'CTC CTC AAGCTT CTC GAG CAC ACG GAG CGC GGC TGC CGA CAC G3')(SEQ ID NO:3)和HSV1.130859-130880(5'CTC CTC GGT ACC CCA TGG AGG CCA GCA GAG CCA GC3')(SEQ ID NO:4)进行PCR。对应地，这些引物将HindIII和XhoI位点置于该区域的5'末端上并且将NcoI和KpnI位点置于3'末端上。将600bp的初级PCR产物用HindIII和KpnI消化，并对所得的587bp条带进行凝胶纯化。将载体pBS-KS:ΔSacI用HindIII和KpnI消化，并对得到的2914bp片段进行凝胶纯化并用SAP处理。连接将第一个插入片段置于载体的多接头中，产生pBS-KS:ICP4-3'末端。为了产生第二插入片段，将粘粒COS48用引物HSV1.132271-132250(5'CTC CTC GCG GCCGCA CTA GTT CCG CGT GTC CCT TTC CGA TGC3')(SEQ ID NO:5)和HSV1.131779-131800(5'-CTC CTC CTC GAG AAG CTT ATG CAT GAG CTC GAC GTC TCG GCG GTA ATG AGA TACGAG C3')(SEQ ID NO:6)进行PCR。对应地，这些引物将NotI和SpeI位点置于该区域的5'末端上并且将AatII、SacI、NsiI、HindIII和XhoI位点置于3'末端上。将549bp初级PCR产物用NotI和XhoI消化，并对所得的530bp条带进行凝胶纯化。这个片段还含有45bp OriS发夹。将质粒BS-KS:ICP4-3'末端用NotI和XhoI消化，并对所得的3446bp条带进行凝胶纯化和SAP处理。连接产生的pBS-KS:ICP4Δ启动子。通过序列分析验证pBS-KS:ICP4Δ启动子中的插入片段。
HSV-GS2含有插入到UL37和UL38之间的基因间区域中的反式激活因子(TA)基因盒。另外，在短重复序列的两个拷贝中，ICP4启动子被GAL4应答启动子(含有GAL4结合位点的最小启动子)取代。通过将含有glp65基因的DNA区段(在启动子盒控制下)插入位于HSV-1UL37和UL38基因的侧翼序列之间的质粒pBS-KS:UL37/38的BspE1/AflII位点中来构建重组质粒pUL37/38:TA，该启动子盒将人hsp70B启动子和GAL4应答启动子组合。该TA盒是从质粒Hsp70/GAL4-GLP65(比拉沃阿(Vilaboa)等人，2005)中分离，并通过3段连接被克隆以使通过PCR扩增的区域最小化。对于左插入片段，将pHsp70/GAL4-GLP65用BamHI(填充)和BstX1消化，并对得到的2875bp条带进行凝胶纯化。这个片段含有Hsp70/GAL4启动子盒以及GAL4DNA结合结构域、孕酮受体配体结合结构域和反式激活因子GLP65的p65激活结构域的一部分。通过用引物TA.2803-2823.正向和BGHpA.反向来扩增pHsp70/GAL4-GLP65的一部分产生右插入片段。将763bp的PCR产物用BstX1和NotI(填充)消化，并对所得的676bp条带进行凝胶纯化。这个条带含有p65激活结构域的3'末端和BGHpA。对于载体，将pBS-KS:UL37/38用BspE1和AflII消化，并将得到的3,772bp片段用T4 DNA聚合酶填充、凝胶纯化并用SAP处理。然后将两个插入片段同时连接到该载体中，产生完整的TA盒。转化后，通过限制性消化筛选集落。扩增29号集落，并且通过限制酶分析然后通过序列分析来验证该质粒。
通过磷酸钙沉淀将1μg pUL37/38:TA与2μg纯化的HSV-1(17+)病毒粒子DNA共转染到RS细胞中。通过挑取空斑，在RS细胞的96孔板上扩增这些空斑，并用通过随机六聚体引发来标记TA片段所制备的32P标记的DNA探针进行斑点印迹杂交，来针对重组体筛选得到的病毒库。将阳性孔重新形成空斑并重新探测6次，并通过PCR和序列分析验证含有TA。这个中间重组体称为HSV-17GS38。
通过磷酸钙沉淀将1μg pBS-KS:GAL4-ICP4与5μg纯化的HSV-17GS38病毒粒子DNA共转染到E5细胞中。通过挑取空斑，在E5细胞的96孔板上扩增这些空斑，并用通过随机六聚体引发来标记GAL4-应答启动子片段所制备的32P标记的DNA探针进行斑点印迹杂交，来针对重组体筛选得到的病毒库。将阳性孔重新形成空斑并重新探测7次，并通过PCR和序列分析验证含有在短重复序列的两个拷贝中的GAL4应答启动子。这个重组体称为HSV-GS2。
HSV-GS3含有插入到UL43和UL44之间的基因间区域中的反式激活因子(TA)基因盒。另外，在短重复序列的两个拷贝中，ICP4启动子被GAL4应答启动子(含有GAL4结合位点的最小启动子)取代。此外，用GAL4应答启动子替换该ICP8启动子。这个重组病毒的构建涉及将第二HSV-1复制必需基因(ICP8)置于GAL4应答启动子的控制下。HSV-GS1用作用于构建这个重组体的“骨架”。构建ICP8重组质粒pBS-KS:GAL4-ICP8。这个质粒含有GAL4应答启动子，该启动子是通过将其克隆在质粒pBS-KS:ICP8Δ启动子中的HSV-1ICP8重组臂之间而替代天然ICP8启动子而插入。这使该ICP8转录物置于外源GAL4应答启动子的控制下。这个特定启动子盒由酵母GAL4UAS(上游激活序列)的6个拷贝、腺病毒E1b TATA序列和合成内含子Ivs8组成。用AatII和HindIII从质粒pGene/v5-HisA(英杰公司)中切出该盒，并对所得的473bp片段进行凝胶纯化。对于载体，将pBS-KS:ICP8Δ启动子用AatII和HindIII消化，并对得到的4588bp片段进行凝胶纯化并用SAP处理。后者两个DNA片段的连接将GAL4应答启动子盒置于ICP8转录起始位点之前。转化后，将10号集落扩增、测试消化并通过测序验证。
通过磷酸钙沉淀将1μg pBS-KS:GAL4-ICP8与10μg纯化的HSV-GS1病毒粒子DNA共转染到E5细胞中。在向培养基中加入米非司酮后，将转染的细胞暴露于43.5℃下持续30分钟，然后在37℃孵育。随后在第2天和第3天，将这些细胞再次在43.5℃下孵育30分钟，然后回到37℃。挑取空斑并在补充有米非司酮的培养基中的E5细胞的96孔板上扩增。在感染后1小时，将这些板在43.5℃下孵育30分钟，然后在37℃下孵育。随后在第2天和第3天，将这些板也转移到43.5℃下持续30分钟，然后回到37℃。在孔显示90％-100％CPE后，将这些板进行斑点印迹，并将斑点印迹膜与通过标记缺失的HSV-1ICP8启动子片段制备的32P标记的DNA探针杂交。将微阳性孔重新形成空斑，并重新探测8次，并通过PCR和序列分析验证已丢失ICP8启动子并在其位置含有GAL4应答启动子。这个重组体称为HSV-GS3。
使用基本上与上面描述的用于产生pBS-KS:ICP4Δ启动子相同的策略构建重组质粒pBS-KS:ICP8Δ启动子：使用引物HSV1.61841-61865(5'CTC CTC AGA ACC CAG GAC CAGGGC CAC GTT GG3')(SEQ ID NO:7)和HSV1.62053-62027(5'CTC CTC ATG GAG ACA AAGCCC AAG ACG GCA ACC3')(SEQ ID NO:8)从HSV-1 17syn+病毒粒子DNA经PCR扩增第一插入片段，并且进行亚克隆以产生中间载体pBS-KS:ICP8-3'端。使用引物HSV1.62173-62203(5'CTC CTC GGA GAC CGG GGT TGG GGA ATG AAT CCC TCC3')(SEQ ID NO:9)和HSV1.62395-62366(5'CTC CTC GCG GGG CGT GGG AGG GGC TGG GGC GGA CC3')(SEQ ID NO:10)相似地获得第二插入片段并且将其亚克隆到pBS-KS:ICP8-3'末端以产生pBS-KS:ICP8Δ启动子。
HSV-GS4：含有插入到UL43和UL44之间的基因间区域中的反式激活因子(TA)基因盒。另外，在短重复序列的两个拷贝中，ICP4启动子被GAL4应答启动子(含有GAL4结合位点的最小启动子)取代，并且ICP8启动子已经被GAL4应答启动子取代。此外，US12基因已经突变以使其蛋白质产物(ICP47)无功能。ICP47氨基酸残基K31改变为G31，并且R32改变为G32。诺伊曼L.(Neumann,L.)等人(1997)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)272:484-92；加洛查B.(Galocha,B.)等人(1997)实验医学杂志(J.Exp.Med.)185:1565-72。从株系17syn+的病毒粒子DNA经PCR扩增500bp的含有ICP47编码序列的片段。使用两个引物对，将片段PCR扩增为两个片段(“左手”片段和“右手”片段)。通过用于右手片段的5'PCR引物引入突变。将所得扩增的左手片段和突变的右手片段亚克隆到载体pBS中，并通过序列分析证实亚克隆中的序列。含有在ICP47密码子31和32中具有所需突变的500bp片段的亚克隆称为pBS:mut-ICP47。
通过磷酸钙沉淀将1μg pBS:mut-ICP47与10μg纯化的HSV-GS3病毒粒子DNA共转染到E5细胞中。在向培养基中加入米非司酮后，将转染的细胞暴露于43.5℃下持续30分钟，然后在37℃孵育。随后在第2天和第3天，将这些细胞再次在43.5℃下孵育30分钟，然后回到37℃。挑取空斑并在补充有米非司酮的培养基中的E5细胞的96孔板上扩增。在感染后1小时，将这些板在43.5℃下孵育30分钟，然后在37℃下孵育。随后在第2天和第3天，将这些板也转移到43.5℃下持续30分钟，然后回到37℃。在孔显示90％-100％CPE后，将这些板进行斑点印迹，并将斑点印迹膜与32P标记的寡核苷酸探针杂交到突变的ICP47区域。将阳性孔重新形成空斑并重新探测数次，并且通过序列分析验证包含所预期的突变的ICP47基因序列。这个重组体称为HSV-GS4。
HSV-GS5含有插入UL43和UL44之间的基因间区域中的可表达(自激活)反式激活因子(TA)基因。另外，在短重复序列的两个拷贝中，ICP4启动子被GAL4应答启动子(含有GAL4结合位点的最小启动子)取代。通过将包含自激活的glp65基因的DNA片段插入在HSV-1UL43和UL44基因的侧翼序列之间的质粒pIN994多克隆位点中来构建重组质粒pIN:TA2。分别从pHsp70/GAL4-GLP65(比拉沃阿(Vilaboa)等人2005)和pSwitch(英杰生命技术)中分离可表达的TA基因，并通过3片段连接进行克隆以使通过PCR扩增的区域最小化。对于左插入片段，将pSwitch用SspI和BstX1消化，并对得到的2425bp条带进行凝胶纯化。这个片段含有自激活启动子以及GAL4DNA结合结构域、孕酮受体配体结合结构域和反式激活因子GLP65的p65激活结构域的一部分。通过用引物TA.2803-2823.正向和BGHpA.反向来扩增pHsp70/GAL4-GLP65的一部分产生右插入片段。将763bp的PCR产物用BstX1和NotI消化，并对所得的676bp条带进行凝胶纯化。这个条带含有p65激活结构域的3'末端和BGHpA。对于载体，将pIN994首先用BamHI消化，用Klenow DNA聚合酶填充末端，并用NotI进一步消化DNA。对得到的4099bp片段进行凝胶纯化。然后将两个插入片段同时连接到该载体中，产生完整的可表达的TA基因。转化后，扩增几个集落并对质粒DNA进行限制性酶切，然后进行序列分析以鉴定pIN:TA2。
通过磷酸钙沉淀将1μg pIN:TA2与2μg纯化的HSV-1病毒粒子DNA共转染到RS细胞中。通过挑取空斑，在RS细胞的96孔板上扩增这些空斑，并用通过随机六聚体引发来标记TA片段所制备的32P标记的DNA探针进行斑点印迹杂交，来针对重组体筛选得到的病毒库。将阳性孔重新形成空斑并重新探测数次，并通过PCR和序列分析验证含有TA。这个中间重组体称为HSV-17GS43A。
通过磷酸钙沉淀将1μg pBS-KS:GAL4-ICP4与4μg纯化的HSV-17GS43A病毒粒子DNA共转染到ICP4补充细胞系E5中。通过挑取空斑，在E5细胞的96孔板上扩增这些空斑，并用通过随机六聚体引发来标记GAL4-应答启动子片段所制备的32P标记的DNA探针进行斑点印迹杂交，来针对重组体筛选得到的病毒库。将阳性孔重新形成空斑并重新探测数次，并通过PCR和序列分析验证含有在短重复序列的两个拷贝中的GAL4应答启动子。这个重组体称为HSV-GS5。
HSV-GS6含有插入UL43和UL44之间的基因间区域中的自激活反式激活因子(TA)基因。另外，在短重复序列的两个拷贝中，ICP4启动子被GAL4应答启动子(含有GAL4结合位点的最小启动子)取代。此外，用人hsp70B启动子替换该ICP8启动子。这个重组病毒的构建涉及将第二HSV-1复制必需基因(ICP8)置于Hsp70B启动子的控制下。HSV-GS5用作构建这个重组体的“骨架”。ICP8重组质粒pBS-KS:Hsp70B-ICP8被构建，该重组质粒包含hsp70B启动子，该启动子是通过将其克隆在质粒pBS-KS:ICP8Δ启动子中的HSV-1ICP8重组臂之间而替代天然ICP8启动子而插入。为了分离人hsp70B启动子片段，用BamHI消化构建体p17，用KlenowDNA聚合酶填充末端，并用HindIII进一步消化该DNA。对450bp的启动子片段进行凝胶纯化(瓦尔米R.(Voellmy,R.)等人(1985)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82:4949-53)。对于载体，将pBS-KS:ICP8Δ启动子用ZraI和HindIII消化。对得到的4588bp片段进行凝胶纯化。后者两个DNA片段的连接将hsp70B启动子置于ICP8转录起始位点之前。转化后，扩增几个集落并对质粒DNA进行限制性酶切，然后进行序列分析以鉴定pBS-KS:Hsp70B-ICP8。
通过磷酸钙沉淀将1μg pBS-KS:Hsp70B-ICP8与10μg纯化的HSV-GS5病毒粒子DNA共转染到E5细胞中。将转染的细胞暴露于43.5℃下持续30分钟，然后在37℃孵育。随后在第2天和第3天，将这些细胞再次在43.5℃下孵育30分钟，然后回到37℃。挑选空斑并在E5细胞的96孔板上扩增。在感染后数小时，将这些板在43.5℃下孵育30分钟，并且然后在37℃下孵育。随后在第2天和第3天，将这些板也转移到43.5℃下持续30分钟，然后回到37℃。在孔显示90％-100％CPE后，将这些板进行斑点印迹，并将斑点印迹膜与通过随机六聚体引发来标记hsp70B启动子片段而制备的32P标记的DNA探针杂交。将阳性孔重新形成空斑，并重新探测数次，并通过PCR和序列分析验证已丢失ICP8启动子并在其位置含有hsp70B启动子。这个重组体称为HSV-GS6。
使用通常已知的分子生物学和生物化学方法。分子生物学方法被描述于例如“分子生物学中的当前方案(Current protocols in molecular biology)”，奥苏贝尔F.M.(Ausubel，F.M.)等人编，约翰·威利出版社(John Wiley and Sons,Inc.).ISBN:978-0-471-50338-5。
实例2：复制能力受控的病毒的复制的调节
(a)HSV-GS1的生长和复制性质
在容许(E5)和非容许(RS)细胞上的空斑分析
将纯化的HSV-GS1病毒的系列稀释物铺板在60mm培养皿中的兔皮肤(RS)或ICP4补充的基于Vero的辅助细胞系(E5)细胞的汇合单层上。使病毒在37℃下吸附1小时，然后除去该接种物，并用完全培养基(对应地，补充有5％小牛血清或10％胎牛血清的改良伊格尔培养基用于RS或E5细胞)覆盖这些细胞。然后将这些培养皿培养72小时并用结晶紫染色以显现任何病毒空斑。在E5细胞上导致10-100个空斑的稀释度下，在非补充RS细胞上没有观察到空斑。
HSV-GS1的生长分析
如上描述的，用感染复数(m.o.i)为5的HSV-GS1感染60mm培养皿中的RS或E5细胞的汇合单层，孵育48小时，通过将细胞刮入培养基中收获，在-80℃下冷冻，进行2轮冻融，并滴定感染性病毒。结果显示在表1中。
表1：RS和E5细胞中病毒的滴定
病毒 RS细胞 E5细胞
17syn+ 8.3x108pfu/ml 1.2x107pfu/ml
HSV-GS1 ND* 4.0x107pfu/ml
*ND＝未检出。(本实验中的检测限是约100PFU。)
热暴露和米非司酮对HSV-GS1在Vero细胞中的复制的影响分析
这个实验的目的是比较HSV-GS1与野生型载体HSV-1株系17syn+的复制周期。将Vero细胞的汇合单层用HSV-1株系17+或重组HSV-GS1(m.o.i为3)感染。使病毒在37℃下吸附1小时，然后除去该接种物，并用完全培养基(补充有10％胎牛血清的改良伊格尔培养基)覆盖这些细胞。吸附后4小时，通过将该密封的培养皿在43.5℃水浴中漂浮30分钟进行热处理。在初始感染时开始米非司酮治疗(10nM)。然后将这些培养皿在37℃下孵育72小时。在感染后0小时、8小时、16小时和28小时，去除两个培养皿，将这些细胞刮入培养基中收获，并进行2个冻融循环。然后通过在汇合的E5细胞的24孔板上一式三份的滴定每个培养皿的裂解物来测定该感染性病毒。2天后通过用结晶紫染色显示空斑。结果证明，在所选择的实验条件下，HSV-GS1与野生型病毒17syn+一样有效地复制(图3B)。在不存在激活处理(热和米非司酮)的情况下显现不发生HSV-GS1的复制。还注意到，激活处理，即在米非司酮存在下的热暴露和孵育，仅轻微影响野生型病毒复制。
分析HSV-GS1复制对宿主细胞的热暴露和小分子调节剂的存在两者的依赖性
这个实验的目的是确定通过热和米非司酮激活HSV-GS1重组体是否是由于两者都需要，以及单独的米非司酮或单独的热不足以诱导复制。该实验如前面部分描述的进行，不同的是在吸附后立即进行热处理。数据显示HSV-GS1的复制不发生，除非宿主细胞在米非司酮的存在下暴露于热(图3A)。
(b)HSV-GS3的生长和复制性质
HSV-GS3的复制效率
这个实验的目的是比较该HSV-GS3重组体与该野生型载体HSV-117syn+的复制周期。E5细胞的汇合单层(但见于下文)用HSV-1株系17+或重组HSV-GS3(m.o.i为3)感染。使病毒在37℃下吸附1小时，然后除去该接种物，并用完全培养基(补充有10％胎牛血清的改良伊格尔培养基)覆盖这些细胞。吸附后，在感染后4小时,通过将该密封的培养皿在43.5℃水浴中漂浮30分钟进行热处理。在初始感染时开始米非司酮治疗(10nM)。对于HSV-GS3无处理(无处理)组，在感染前12小时用含有可表达的ICP8基因的质粒转染这些E5细胞。然后将这些培养皿进一步在37℃下孵育。在感染后0小时、4小时、12小时和24小时，去除两个培养皿，将这些细胞刮入培养基中收获，并进行2个冻融循环。然后通过在预先用ICP8表达质粒转染的汇合E5细胞的24孔板上一式三份的滴定每个培养皿的裂解物来测定该感染性病毒。2天后通过用结晶紫染色显示空斑。结果指示HSV-GS3在所选择的实验条件下几乎与野生型病毒HSV-1 17syn+一样有效地复制(图4A)。
分析HSV-GS3复制对宿主细胞的热暴露和小分子调节剂的存在两者的依赖性
进行单步生长实验以确定通过热和米非司酮激活HSV-GS3是否是由于两者都需要，以及单独的米非司酮或单独的热不足以诱导复制。如图4B所示的实验是如前面部分描述的进行，不同的是使用Vero细胞并且在吸附后立即给予热处理。滴定是在先前用ICP8表达质粒转染的E5细胞中。用人鳞状细胞肿瘤细胞系SCC-15进行相似的实验(图4C)。后者实验的结果证明HSV-GS3的复制受到严格调节。它只是通过在米非司酮存在下受感染的细胞的热暴露触发的。
在其他实验中，通过感染性病毒的滴定来测量病毒复制被病毒DNA或病毒基因表达的定量方法替代。在这些实验中，测试米非司酮和/或乌利司他(小分子调节剂)。一个这样的实验具有总结在表2中的设计。
表2：治疗组
用HSV-GS3载体以m.o.i.为3感染35mm培养皿的汇合Vero细胞。每个处理组由3个重复培养皿组成(对于每个时间点)。使病毒在37℃下吸附1小时，除去该接种物，并用完全培养基(补充有10％胎牛血清的改良伊格尔培养基)覆盖这些细胞。在初始感染时开始药物(即米非司酮或乌利司他)治疗。吸附后，通过在下潜平台上将密封的培养皿在43.5℃水浴中漂浮30分钟进行热处理(在感染后4小时开始)。将培养皿进一步在37℃下孵育。在热处理后1小时、4小时、12小时和24小时，除去三个培养皿，除去培养基，并使用TRIzol提取DNA和RNA。将提取的DNA进行TaqMan实时荧光PCR，以用于HSV-1DNA的定量分析(使用HSV DNA聚合酶引物/探针)。通过Taqman RT-PCR分析所提取的RNA中ICP4和糖蛋白C(gC)转录物的存在。DNA和RNA量相对于细胞基因APART被标准化，并以相对量呈现。使用的引物示于下表3中。
表3：用于qPCR的引物和探针
F：正向；R：反向；P：探针。
所得结果示于图5中。图5A显示病毒DNA复制既依赖热处理又依赖小分子调节剂。对于乌利司他，证明DNA复制依赖于调节剂剂量。获得了ICP4基因(调节的基因)和晚期gC基因(不经过有意调节)表达的相容数据(图5B和5C)。
实例3：在没有有意激活的情况下，复制能力受控的病毒明显不能在体内复制
这个实验的目的是证明，在不存在热和小分子调节剂的情况下，这些GS载体在小鼠中与它们在细胞培养物中显现的一样紧紧“关闭”。在盐水预处理之后，在两个后脚的轻微磨蚀的足底表面上用相似量的HSV-GS1或17syn+野生型病毒感染四到六周龄的远系繁殖的ND4瑞士韦伯斯特(Swiss Webster)雌性小鼠(哈伦斯普拉格-道利(Harlan Sprague-Dawley)公司)。在感染后4天、8天和21天，每个时间点对4只小鼠实施安乐死，并且收获足和背根神经节(DRG)，在TRIzol中匀浆，并提取DNA和RNA。将DNA进行TaqMan实时PCR以用于HSV-1DNA的定量分析；在RT后通过TaqMan实时PCR分析RNA中如前描述的ICP4和糖蛋白C(gC)转录物的存在。库巴特N.J.(Kubat,N.J.)等人2004。单纯疱疹病毒1型潜伏相关转录物(LAT)增强子/rcr是独立于LAT转录在潜伏期期间高度乙酰化的。病毒学杂志(J.Virol.)78:12508-18。实时引物/探针序列披露于表3中。
结果显示在足和DRG中HSV-GS1基因表达完全不存在(表4)。与暗示HSV-GS1不能复制的结果一致的是以下发现：HSV-GS1的DNA量比野生型病毒HSV 17syn+的DNA量低几个数量级。8天时的复制效率差异分别是：在足中是151倍以及在DRG中是200倍。
表4：HSV-GS1和野生型HSV-1：复制和病毒基因表达足：
*ND＝低于检测限。
DRG:
*ND＝低于检测限。
实例4：本发明的复制能力受控的病毒的体内激活
在这些实验中，通过病毒DNA和病毒基因表达的定量的生物化学方法来估算小鼠模型中的病毒复制。既在足(病毒接种部位)又在背根神经节(DRG)(HSV急性复制和潜伏期的部位)处测量DNA量和病毒转录物量。一个这样的实验具有总结在表5中的设计。这个实验还旨在确定在体内乌利司他的最低有效剂量。
表5：治疗组
在两个后足垫的盐水预处理和轻度磨损之后，用1x 105pfu的HSV-GS3载体接种远系繁殖的瑞士韦伯斯特(Swiss-webster)雌性小鼠(4-6周龄)。每个处理组由5只小鼠组成。在感染时IP给予药物治疗(乌利司他)。在病毒给予后3小时，在45℃下进行热处理10分钟(通过将后足浸入水浴中)。使小鼠在37℃恢复15分钟。在热诱导后24小时处死小鼠，并将足和DRG解剖，并在RNAlater(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))中快速冷冻。通过在TRIzol(生命技术(Life Technologies))中研磨组织提取DNA和RNA，并从界面反提取该DNA。将DNA进行TaqMan实时荧光PCR以用于HSV-1DNA的定量分析。逆转录(RT)后，通过TaqManPCR分析RNA中ICP4和糖蛋白C(gC)转录物的存在。DNA和RNA量相对于细胞基因APART被标准化。
结果示于图6中。图6A显示在足中的复制既依赖热处理又依赖小分子调节剂。此外，DNA复制依赖于调节剂剂量。获得了ICP4基因(调节的基因)和晚期gC基因(不经过有意调节)表达的相容数据(图6B和6C)。单独的小分子调节剂(在不存在热处理的情况下)基本上不刺激DNA复制，并且最多稍微增加ICP4和gC转录物的表达。
在图6D中所示的实验中比较HSV-GS3和复制缺陷型病毒KD6(ICP4-)的复制产量。这个实验如先前实验一样进行，除了在热诱导后24小时处死小鼠。结果示出病毒DNA基本上只能在已接受热处理和乌利司他的HSV-GS3感染的动物的足的样品中检测到。在DRG中发现非常少的DNA，并且在KD-6感染的动物或未激活的HSV-GS3感染的动物中基本上没有。
实例5：比较本发明的复制能力受控的病毒与复制缺陷型对比病毒(KD6)的免疫/激发实验
这种类型的实验的目的是证明在诱导条件下用HSV-GS3病毒免疫小鼠引发针对随后用致死剂量的野生型HSV-1激发的强保护性免疫应答。
(a)存活
实验设计：
表6.免疫治疗组
*所有Tx的体积是0.050ml/小鼠。
a)免疫：将小鼠最初在表6所示的实验组中进行免疫。每组包含20只小鼠(ND4瑞士韦伯斯特雌性，4-6周)。在盐水预处理后，将每个载体施用至两个后足的轻微磨蚀的足底表面。
b)诱导：在“HSV-GS3(诱导的)”组中如下诱导HSV-GS3载体：在免疫时和再次在24小时后，腹膜内给予米非司酮(0.5mg/kg)。在免疫后3小时通过将两个后足浸入43.5℃水浴中持续30分钟来施加热。浸泡后，将后肢干燥，将小鼠用加热灯保温直至干燥和温热。
c)激发：免疫后22天，在盐水预处理后，用20倍致死剂量的野生型HSV-1株系17syn+施用于两只后脚的轻微磨损的足底表面激发这些小鼠。然后通过修改的终点测定来评价每种免疫治疗的效力。注意，该修改的终点测定涉及对基于临床评估(小鼠显示出双侧后肢麻痹和CNS受损、抽搐，并且不能独自移动以摄取食物或水的迹象)被认为垂死(将不能存活)的小鼠进行安乐死。
结果：
模拟对照治疗组中的小鼠早在激发后6天开始显示后肢麻痹和CNS感染的迹象，而直到激发后8-9天，所有三个免疫组出现完全健康。表7描述了在该实验结束时存活的小鼠的数目(激发后30天跟踪小鼠)。结果证明，虽然所有治疗能够保护至少一些小鼠对抗HSV-1的20倍致死激发，但是仅诱导的HSV-GS3病毒治疗能够在小鼠中提供实质性保护。
表7：免疫/激发实验的结果
下面给出另一个实验。
实验设计：
a)免疫：将小鼠最初在表6所示的实验组中进行免疫。每组包含10只小鼠(ND4瑞士韦伯斯特雌性，4-6周)。在盐水预处理后，将每个载体施用至两个后足的轻微磨蚀的足底表面。
b)诱导：在“HSV-GS3(诱导2次)”组中如下诱导该HSV-GS3载体：在免疫时，腹膜内给予乌利司他(50μg/kg)。在免疫后3小时通过将两个后足浸入45℃水浴中持续10分钟来施加热。浸泡后，将后肢干燥，将小鼠用加热灯保温直至干燥和温热。24小时后重复后面的激活过程。
c)激发：免疫后约三周，在盐水预处理后，用2倍致死剂量的野生型HSV-1株系17syn+施用于两只后脚的轻微磨损的足底表面激发这些小鼠。然后通过修改的终点测定来评价每种免疫治疗的效力。注意，该修改的终点测定涉及对基于临床评估(小鼠显示出双侧后肢麻痹和CNS受损、抽搐，并且不能独自移动以摄取食物或水的迹象)被认为垂死(将不能存活)的小鼠进行安乐死。
表8：免疫治疗组
*所有Tx的体积是0.050ml/小鼠。
结果：
表9描述了在该实验结束时存活的小鼠的数目(激发后30天跟踪小鼠)。结果证明，虽然所有治疗能够保护至少一些小鼠对抗HSV-1的2倍致死激发，但是仅诱导的HSV-GS3病毒治疗能够在小鼠中提供实质性保护。
表9：免疫/激发实验的结果
组 存活者数(来自10只动物的组)
HSV-GS3诱导2次 8
KD6 4
HSV-GS3 3
模拟 2
(b)激发病毒的复制
实验设计：
a)免疫：如表6所示对小鼠免疫。每组包含5只小鼠(ND4瑞士(Swiss)雌性，4-6周)。在盐水预处理后，将每个载体施用至两个后足的轻微磨蚀的足底表面。
b)诱导：在“HSV-GS3(诱导的)”组中如下诱导HSV-GS3载体：在免疫时和再次在24小时后，腹膜内给予米非司酮(0.5mg/kg)。在免疫后3小时通过将两个后足浸入43.5℃水浴中持续30分钟来施加热。浸泡后，将后肢干燥，并且将小鼠用加热灯保温直至干燥和温热。
c)激发：免疫后22天，在盐水预处理后，用20倍致死剂量的野生型HSV-1株系17syn+施用于两只后脚的轻微磨损的足底表面激发这些小鼠。在激发后4天，对这些小鼠实施安乐死，并且将足解剖并均质化。然后将组织匀浆稀释并在兔皮肤细胞(RS)上针对感染性(17syn+)病毒进行滴定。
结果：
表10描述了滴定数据的结果。这些结果说明，虽然所有免疫处理能够在用HSV-1激发后在足中减少一定程度的复制(相对于模拟)，但是激发后第四天，HSV-GS3(诱导的)小鼠显示出迄今为止最低的激发病毒滴度(比模拟低约两个数量级)。
表10.激发后第4天在小鼠足中检测到的感染性病毒(pfu)
实例6：与复制能力受控的病毒共复制的腺病毒载体
(a)具有由复制能力受控的病毒的反式激活因子激活的复制必需基因的腺病毒
rAd3缺少包含E3的核苷酸28,130-30,820。与腺病毒5型基因组相关的核苷酸数目是如在GI：33694637中所定义。戴维森(Davison)等人2003.普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)84,2895-2908。进一步，它含有功能性地连接到含有GAL4位点的最小启动子的完整E1基因。
何(He)等人(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95:2509-2514(1998))开发的用于产生重组腺病毒的简化系统被用来构建rAd3。这个系统已由加利福尼亚州拉荷亚的Stratagene公司(Stratagene Corp)商业化。该公司向其客户分销名为“AdEasyTM腺病毒载体系统”的手册(修订号060002)也可在该公司网站上获得。
诱变是在由Stratagene公司分销的转移载体pShuttle(何(He)等人(1998))中进行。对于这个质粒的完整核苷酸序列，参见美国专利号7,906,312的图7。根据Stratagene的名为“AdEasyTM腺病毒载体系统”的手册(修订号060002)，pShuttle含有以下腺病毒序列元件：左反向末端重复、衣壳化信号(Ad 1-331)、“右臂同源区”(3,534-5790)、“左臂同源区”(34,931-35,935)和右反向末端重复。
除了该同源区外，pShuttle的右臂同源区被还包含E1区起始部的Ad序列替换。首先，用NotI和PmeI消化pShuttle DNA，并将载体片段进行凝胶纯化。接下来，通过PCR扩增从质粒pXC1(Microbix公司，多伦多，安大略省(ON))获得含有Ad 496-5780的片段。这种质粒的核苷酸序列示于例如美国专利号7,906,312的图9中。后者PCR扩增是使用含有SbfI限制性位点的正向引物(读入E1基因)和含有PmeI限制性位点的反向引物进行。将所得PCR片段用Sbf1和PmeI消化。此外，使用含有NotI限制性位点的适当的正向引物和含有SbfI限制性位点的反向引物，PCR扩增包含质粒pGene/V5-His(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)的核苷酸4634至323的DNA片段。将PCR扩增的片段用NotI和SbfI消化。将后面两个末端消化的PCR片段连接到pShuttle载体片段上。如通过限制性分析证明的，将含有后面三个片段的质粒称为pShuttle-E1-GAL4。
为了制备重组Ad，将pShuttle-E1-GAL4DNA通过PmeI消化来线性化，并用pAdEasy-1DNA(何(He)等人，1998)将pShuttle-E1-GAL4 DNA共电穿孔到大肠杆菌BJ5183细胞中。BJ5183细胞(Stratagene目录号200154)具有在引入的病毒序列之间进行同源重组所必需的细胞组分。用于产生重组Ad质粒和随后生产重组Ad病毒的详细方法在何(He)等人(1998)和Stratagene手册“AdEasyTM腺病毒载体系统”(修订号060002)中讨论。简言之，重组Ad质粒通过限制性消化来表征。在制备正确重组体的足够量DNA后，用PacI消化该DNA以分离质粒序列和包含Ad序列的插入序列。为了产生重组Ad病毒，将消化的DNA转染到293细胞中。使用标准技术(简要地描述于何(He)等人(1998)；还参见格雷厄姆(Graham)和普瑞为(Prevec.)1991.腺病毒载体的操纵(Manipulation of adenovirus vectors).分子生物学方法、基因转移和表达方案(Methods in Molecular Biology,Gene Transfer and ExpressionProtocols)，第7卷，默里(Murray)编，Humana出版社公司，克利夫顿，NJ，第109-127页)分离病毒空斑并制备rAd3储液。病毒储液可以通过CsCl梯度离心或色谱程序纯化。
在哺乳动物细胞例如与rAd3和HSV-GS3病毒共感染的人成纤维细胞中，在存在有效浓度的小分子调节剂例如米非司酮或乌利司他的情况下给予适当的热剂量导致两种病毒的复制的激活。
(b)缺少复制必需基因的腺病毒由条件性地表达该Ad复制必需基因的HSV-GS病毒补充
如下制备E1A缺陷型Ad5(rAd4)：用较长的Ad E1序列替换pShuttle的右臂同源区。首先，用NotI和PmeI消化pShuttle DNA，并将载体片段进行凝胶纯化。接下来，通过PCR扩增从质粒pXC1(Microbix公司，多伦多，安大略省(ON))获得含有Ad 496-5780的片段。后者PCR扩增是使用含有NotI限制性位点的正向引物(读入E1基因)和含有PmeI限制性位点的反向引物进行。将所得PCR片段用Not1和PmeI消化。将后面末端消化的PCR片段连接到该pShuttle载体片段上。如通过限制性分析证明的，将含有后面三个片段的质粒称为pShuttle-E1。
为了制备重组Ad，将pShuttle-E1DNA通过PmeI消化来线性化，并用pAdEasy-1将pShuttle-E1DNA共电穿孔到大肠杆菌BJ5183细胞中。重组Ad质粒通过限制性消化来表征。在制备正确重组体的足够量DNA后，用PacI消化该DNA以分离质粒序列和包含Ad序列的插入序列。为了产生重组Ad，将消化的DNA转染到293细胞中。使用标准技术，分离病毒空斑，并制备rAd4储液。病毒储液可以通过CsCl梯度离心或色谱程序纯化。
为了制备HSV-GS7，将来自质粒pShuttle-E1-GAL4的GAL4启动子-E1区使用两种已经用于构建后面质粒的相同引物进行PCR扩增：使用已经用于扩增pGene/V5-His启动子片段的相同正向引物作为正向引物，并且使用已经用于从pXC1扩增E1片段的相同反向引物作为反向引物。(引物被磷酸化)。将PCR片段进行凝胶纯化。对于载体，将pBS-KS:UL37/38用BspE1和AflII消化，并将得到的3,772bp片段用T4 DNA聚合酶处理、凝胶纯化并用SAP处理，并且然后与上述PCR片段连接。转化后，通过限制性消化来筛选集落，并且扩增一个集落，该集落含有具有正确插入的质粒，如通过限制性酶分析以及然后通过序列分析验证的。这个质粒称为pUL37/38:GAL4-E1。
通过磷酸钙沉淀将1μg pUL37/38:GAL4-E1与10μg纯化的HSV-GS3病毒粒子DNA共转染到E5细胞中。在向培养基中加入米非司酮后，将转染的细胞暴露于43.5℃下持续30分钟，然后在37℃孵育。随后在第2天和第3天，将这些细胞再次在43.5℃下孵育30分钟，然后回到37℃。挑选空斑并在补充有米非司酮的培养基中的E5细胞的96孔板上扩增。在感染后1小时，将这些板在43.5℃下孵育30分钟，然后在37℃下孵育。随后在第2天和第3天，将这些板也转移到43.5℃下持续30分钟，然后回到37℃。在孔显示90％-100％CPE后，将这些板进行斑点印迹，并将斑点印迹膜与32P标记的寡核苷酸探针杂交到腺病毒E1区域。将阳性孔重新形成空斑并重新探测几次并且通过序列分析验证包含所预期的突变的GAL4-Ad5E1基因序列。这个重组体称为HSV-GS7。
在哺乳动物细胞例如与rAd4和HSV-GS7病毒共感染的人成纤维细胞中，在存在有效浓度的小分子调节剂例如米非司酮或乌利司他的情况下给予适当的热剂量导致两种病毒的复制的激活。
本申请中引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，应被视为以其全文结合在此。
序列表
<110> 哈斯福制药公司
<120> 新型免疫剂及其使用方法
<130> VIR2A-WO
<150> US 62/070,443
<151> 2014-08-26
<150> US 62/122,088
<151> 2014-10-10
<160> 22
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
tcgacaactc cgagtttcag c 21
<210> 2
<211> 39
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<213> 智人
<400> 2
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<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 单纯疱疹病毒1
<400> 3
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<211> 35
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<213> 单纯疱疹病毒1
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<213> 单纯疱疹病毒1
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<213> 单纯疱疹病毒1
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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<212> DNA
<213> 小家鼠
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ccccacacac acctc 15

Claims (19)

1.一种改良疫苗，该改良疫苗包含含有有效量的复制能力受控的疱疹病毒的组合物，其中当与包含相似量的复制缺陷型减毒疱疹病毒的疫苗相比时，该改良疫苗在哺乳动物激发模型中诱导优良的保护性免疫，该减毒疱疹病毒和该复制能力受控的疱疹病毒来源于相同的野生型病毒。
2.如权利要求1所述的疫苗，其中该复制能力受控的重组疱疹病毒的特征在于
(a)在向哺乳动物受试者的身体区域给予之后，该复制能力受控的病毒在没有激活的情况下，在该身体区域中保持基本上不复制，并且
(b)将该身体区域暴露于局部激活处理激活了该病毒在该身体区域中经历一轮复制。
3.如权利要求1-2所述的疫苗，其中该复制能力受控的疱疹病毒的基因组包含(a)小分子调节剂激活的反式激活因子的基因，该基因功能性地连接到充当热激启动子的核酸序列或充当热激启动子和反式激活因子应答启动子的核酸序列以及一个或多个反式激活因子应答启动子，该一个或多个反式激活因子应答启动子功能性地连接到一个或多个复制必需病毒基因上，或者(b)小分子调节剂激活的反式激活因子的基因，该基因功能性地连接到充当组成型活性的或反式激活因子增强的启动子的核酸序列，充当功能性地连接到第一复制必需病毒基因的热激启动子和功能性地连接到第二复制必需病毒基因的反式激活因子应答启动子的核酸序列上。
4.如权利要求3所述的疫苗，其中该复制能力受控的疱疹病毒进一步包含来自另一种病原体的基因、编码免疫调节多肽的异源基因和编码另一种多肽的异源基因中的至少一种。
5.如权利要求3-4所述的疫苗，其中该复制能力受控的疱疹病毒衍生自选自下组的病毒，该组由以下各项组成：HSV-1、HSV-2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒和玫瑰疹病毒。
6.如权利要求3-5中任一项所述的疫苗，其中该复制能力受控的疱疹病毒衍生自HSV-1或HSV-2，并且功能性地连接到反式激活因子应答启动子上的这些复制必需病毒基因包括ICP4基因或ICP8基因的至少所有拷贝。
7.如权利要求3-6中任一项所述的疫苗，其中该复制能力受控的疱疹病毒衍生自HSV-1或HSV-2，并缺乏功能性ICP47基因。
8.如权利要求3-7中任一项所述的疫苗，其中该小分子调节剂激活的反式激活因子包含来自孕酮受体的配体结合结构域，并且通过孕酮受体拮抗剂或能够与该配体结合结构域相互作用并激活该反式激活因子的其他分子激活。
9.如权利要求8所述的疫苗，其中该复制能力受控的疱疹病毒与HSV-GS1相同或衍生自HSV-GS1。
10.如权利要求8所述的疫苗，其中该复制能力受控的疱疹病毒与HSV-GS3相同或衍生自HSV-GS3。
11.如权利要求8所述的疫苗，其中该复制能力受控的疱疹病毒与HSV-GS4相同或衍生自HSV-GS4。
12.如权利要求3-8中任一项所述的疫苗，进一步包含第二病毒，该第二病毒具有与该复制能力受控的病毒的宿主范围重叠的宿主范围，该第二病毒具有功能性地连接到反式激活因子应答启动子上的复制必需基因。
13.如权利要求12所述的疫苗，其中该第二病毒是腺病毒。
14.如权利要求13所述的疫苗，其中功能性地连接到反式激活因子应答启动子上的该复制必需基因是E1和E4基因之一或两者。
15.如权利要求4所述的疫苗，进一步包含第二病毒，该第二病毒具有与该复制能力受控的病毒的宿主范围重叠的宿主范围，其中来自该第二病毒的复制必需基因是由在反式激活因子应答启动子控制下的该复制能力受控的病毒表达，并且该第二病毒在所述复制必需基因中有缺陷。
16.如权利要求15所述的疫苗，其中该第二病毒是具有非功能性E1和/或E4基因的腺病毒，并且从该复制能力受控的病毒表达的该复制必需基因是该E1和/或E4基因。
17.如权利要求3-16中任一项所述的疫苗，进一步包含有效量的能够激活该反式激活因子的小分子调节剂。
18.一种免疫方法，该方法包括
(a)向哺乳动物受试者的身体区域给予如权利要求3-16中任一项所述的疫苗，并且
(b)在该身体区域中存在有效浓度的小分子调节剂的情况下，将所述身体区域暴露于激活热剂量，该小分子调节剂能够激活包含在该疫苗中的该复制能力受控的疱疹病毒的该反式激活因子。
19.一种免疫方法，该方法包括
(a)向哺乳动物受试者的身体区域给予如权利要求17所述的疫苗，并且
(b)将所述身体区域暴露于激活热剂量。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019170871A1 (en) 2018-03-08 2019-09-12 Hsf Pharmaceuticals Localized activation of virus replication boosts herpesvirus-vectored vaccines
EP3653716A1 (en) * 2018-11-19 2020-05-20 HSF Pharmaceuticals Replication-competent controlled alpha-herpesvirus virus vectors and uses therefore
EP4138898A1 (en) * 2020-04-24 2023-03-01 HSF Pharmaceuticals Replication-competent controlled herpesviruses expressing a sars cov-2 antigen

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1446102A (zh) * 2000-06-02 2003-10-01 健方公司 模仿天然病毒感染并诱导对病原体的持久免疫力的遗传疫苗
WO2005056806A2 (en) * 2003-12-10 2005-06-23 Hsf, Pharmaceuticals, S.A. Viral vectors controlled by a gene switch
WO2008008276A2 (en) * 2006-07-10 2008-01-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Tetracycline repressor regulated oncolytic viruses
CN102666843A (zh) * 2009-12-21 2012-09-12 布里格海姆妇女医院公司 单纯疱疹病毒疫苗
CN103534355A (zh) * 2011-03-04 2014-01-22 英特瑞克斯顿股份有限公司 条件性表达蛋白质的载体
WO2014043189A1 (en) * 2012-09-14 2014-03-20 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Conditionally replication deficient herpes viruses and use thereof in vaccines

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3951127A (en) 1973-06-28 1976-04-20 Kay Laboratories, Inc. Constant temperature device
US4379448A (en) 1980-01-18 1983-04-12 Kapralis Imants P Trigger to initiate crystallization
US4460546A (en) 1980-08-11 1984-07-17 Kapralis Imants P Trigger to controllably initiate crystallization
US5497763A (en) 1993-05-21 1996-03-12 Aradigm Corporation Disposable package for intrapulmonary delivery of aerosolized formulations
FR2711523B1 (fr) 1993-10-26 1996-02-16 Transgene Sa Procédé de préparation d'un aérosol viral.
US5508269A (en) 1994-10-19 1996-04-16 Pathogenesis Corporation Aminoglycoside formulation for aerosolization
US6083922A (en) 1996-04-02 2000-07-04 Pathogenesis, Corp. Method and a tobramycin aerosol formulation for treatment prevention and containment of tuberculosis
US5767068A (en) 1997-02-13 1998-06-16 Pathogenesis Corporation Pure biologically active colistin, its components and a colistin formulation for treatment of pulmonary infections
US7419964B2 (en) * 1999-09-16 2008-09-02 Cytogenix, Inc. Treatment of HSV-related pathologies using ssDNA
US7906312B2 (en) 2003-12-10 2011-03-15 Richard Voellmy Viral vectors whose replication and, optionally, passenger gene are controlled by a gene switch activated by heat in the presence or absence of a small-molecule regulator
WO2008021451A2 (en) 2006-08-14 2008-02-21 Aktiv-Dry Llc Human-powered dry powder inhaler and dry powder inhaler compositions

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1446102A (zh) * 2000-06-02 2003-10-01 健方公司 模仿天然病毒感染并诱导对病原体的持久免疫力的遗传疫苗
WO2005056806A2 (en) * 2003-12-10 2005-06-23 Hsf, Pharmaceuticals, S.A. Viral vectors controlled by a gene switch
WO2008008276A2 (en) * 2006-07-10 2008-01-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Tetracycline repressor regulated oncolytic viruses
CN102666843A (zh) * 2009-12-21 2012-09-12 布里格海姆妇女医院公司 单纯疱疹病毒疫苗
CN103534355A (zh) * 2011-03-04 2014-01-22 英特瑞克斯顿股份有限公司 条件性表达蛋白质的载体
WO2014043189A1 (en) * 2012-09-14 2014-03-20 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Conditionally replication deficient herpes viruses and use thereof in vaccines

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NURIA VILABOA等: "Novel Gene Switches for Targeted and Timed Expression of Proteins of Interest", 《MOLECULAR THERAPY》 *
R ARGNANI等: "Replication-competent herpes simplex vectors:design and applications", 《GENE THERAPY》 *

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Publication number Publication date
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US11497806B2 (en) 2022-11-15

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