DE60131569T2 - Genetisch veränderter herpes virus für die behandlung von herz- und gefässerkrankungen - Google Patents

Genetisch veränderter herpes virus für die behandlung von herz- und gefässerkrankungen Download PDF

Info

Publication number
DE60131569T2
DE60131569T2 DE60131569T DE60131569T DE60131569T2 DE 60131569 T2 DE60131569 T2 DE 60131569T2 DE 60131569 T DE60131569 T DE 60131569T DE 60131569 T DE60131569 T DE 60131569T DE 60131569 T2 DE60131569 T2 DE 60131569T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
cell
gene
nucleic acid
vector
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60131569T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60131569D1 (de
Inventor
Lewis B. Hinsdale SCHWARTZ
Ralph R. Chicago WEICHSELBAUM
Bernard Chicago ROIZMAN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Chicago
Original Assignee
University of Chicago
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22961266&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE60131569(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by University of Chicago filed Critical University of Chicago
Application granted granted Critical
Publication of DE60131569D1 publication Critical patent/DE60131569D1/de
Publication of DE60131569T2 publication Critical patent/DE60131569T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16643—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16661—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

  • Die Regierung der Vereinigten Staaten kann gewisse Rechte an dieser Erfindung besitzen.
  • Die Priorität der provisorischen US-Patentanmeldung Nr. 60/253 680, angemeldet am 28. November 2000, wird beansprucht.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Gen-Therapie. Insbesondere betrifft sie die Verabreichung eines viralen Herpes Simplex-Vektors, um einen therapeutischen Vorteil im Gefäß- und Herzgewebe herzustellen. In zusätzlichen Gesichtspunkten betrifft die Erfindung die Kombination von Therapien, aufweisend das Verabreichen eines viralen Herpes Simplex-Vektors und Behandlung mit zumindest einem zusätzlichen pharmakologischen Mittel oder einer chirurgischen Prozedur, sowie die Verwendung von chirurgischen Prozeduren und anderen zielgerichteten Hilfsmitteln, um die Zufuhr des Herpes Simplex-Virusvektors zu Gefäßzellen und -Geweben zu vereinfachen.
  • VERWANDTE TECHNOLOGIE
  • Gefäßerkrankung bleibt der führende Grund für Tod und Behinderung in der westlichen Welt [McGovern et al., New Engl. J. Med. 334: 884–890, 1996]. Derzeitige Behandlungsstrategien sind vor allem auf Risikofaktormodifizierung und/oder mechanische Sanierung von kritischen Verletzungen gerichtet. Obwohl diese Strategien oftmals wirksam sind, würde die Möglichkeit, die grundlegenden pathophysiologischen Defekte innerhalb des erkrankten Gefäßgewebes genetisch zu verändern, einen neuen Paradigmus der Therapie offenbaren und die Behandlung von Gefäßerkrankung möglicherweise revolutionieren. Die Machbarkeit von Gefäßgentransfer wurde als erstes 1989 demonstriert, als gezeigt wurde, dass Endothelzellen (ECs), die retroviral übertragenes lacZ-Gen exprimieren, in Schweinehüftarterien anwachsen und funktionieren [Nabel et al., Science 244: 1342–1344, 1989]. Seitdem wurde nahezu eine Milliarde US-Dollar jährlich aufgewendet, um Systeme zum Transfer von Vektoren und Liefersystemen zu verfeinern und zu verbessern [Svensson et al., Curr. Opin. Cardio. 13: 369–374, 1998].
  • Eine Vielzahl von Vektoren wurde mit variablen Ergebnissen verwendet, um Gene in Gefäßgewebe zu transferieren. Jedes der populärsten Vektorsysteme – nackte Plasmid-DNA [Isner et al., Hum. Gene Ther. 7: 989–1011, 1996, Baumgartner et al., Circ. 97: 1114–1123, 1998], Liposom-umschlossene DNA [Armeanu et al., Mol. Ther. 1: 366–375, 2000], Retrovirus [Geary et al., Hum. Gene Ther. 5: 1211–1216, 1994], adeno-assoziierter Virus (AAV) [Lynch et al., Circ. Res. 80: 497–505, 1997] und Adenvirus [Kay, J. Vasc. Surg. 24: 160–161, 1996; Yeh et al., FASEB J. 11: 615–623, 1997] hat abhängig von der Anwendung etwas Erfolg hervorgerufen. Anstrengungen beim Gentransfer unter Verwendung von lediglich nackter Plasmid-DNA haben aufgrund geringer Transfektionseffektivität geringen Erfolg hervorgerufen [Baumgartner et al., Circ. 97: 1114–1123, 1998; Reissen et al., Hum. Gene Ther. 4: 449–458, 1993; Turunen et al., Gene Ther. 6: 6–11, 1999]. DNA, die mit Liposomen umhüllt ist, ist etwas effizienter [Armeanu et al., Mol. Ther. 1: 366–375, 2000; Turunen et al., Gene Ther. 6: 6–11, 1999; Takeshita et al., J. Clin. Invest. 93: 652–661, 1994; Lim et al., Circ. 83: 2007–2011, 1991; Matsumoto et al., J. Vasc. Surg. 27: 135–144, 1998; Matsumura et al., J. Surg. Res. 85: 339–345, 1999], es mangelt jedoch allgemein an vollständiger Durchdringung einer intakten Basalmembran. Retrovirus wurde in frühen Experimenten untersucht [Nabel et al., Science 244: 1342–1344, 1989; Dunn et al., Circ. 99: 3199–3205, 1996], sowie in letzter Zeit, um Antisense-Oligonukleotide zu transferieren [Zhu et al., Circ. 96: 628–635, 1997], leidet jedoch stark unter seiner geringen Effektivität bei sich nicht teilenden Zellen. Von einem relativ neuen Vektorsystem, adeno-assoziierter Virus (AAV), wurde gezeigt, dass er Skelettmuskel wirksam infiziert, ohne eine intensive Immunantwort anzureizen [Muzyczka, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158: 97–129, 1992] und vorläufige Ergebnisse haben gezeigt, dass AAV dazu fähig ist, vaskuläre ECs [Lynch et al., Circ. Res. 80: 497–505, 1997; Rolling et al., Gene Ther. 4: 757–761, 1997; Kotin, Hum. Gene. Ther. 5: 793–801, 1994; Xiao et al., J. Virol. 70: 8098–8108, 1996], glatte Muskelzellen [SMCs, Rolling et al., Gene Ther. 4: 757–761, 1997] und Cardiozyten [Svensson et al., Circ. 99: 201–205, 1999] zu transfizieren. Ein kürzlicher Report zeigt jedoch, dass Gentransfer in Gefäßgewebe mit einem intakten Endothel problematisch sein kann, wobei sich lediglich 1–14% der Zellen nach 30 Tagen positiv färben [Eslami et al., J. Vasc. Surg. 31: 1149–1159, 2000].
  • Zweifellos war der am weitesten untersuchte Vektor für Gefäßgentransfer replikationsdefizienter Adenvirus [Yeh et al., FASEB J. 11: 615–623, 1997]. Adenovirale Vektoren zeigen eine hohe Penetranz in sich nicht teilenden Zellen, können in hoher Konzentration hergestellt werden und können relativ große Transgene beherbergen. Sie wurden experimentell in Gefäßgewebe verwendet, um eine breite Vielzahl von Markern und biologisch aktiven Genen, einschließlich Rb [Chang et al., J. Clin. Invest. 95: 2260–2268, 1995; Smith et al., Circ. 96: 1899–1905, 1997], p21 [Chang et al., J. Clin. Invest. 95: 2260–2268, 1995; Scheinman et al., J. Vasc. Surg. 29: 360–369, 1999], Cythosin-Deaminase [Harell et al., 1997; Fortunato et al., 2000), natriuretische Peptide vom C-Typ (Ueno et al., 1997), Metalloproteinase-Inhibitoren (Cheng et al., 1998; George et al., 2000; Dollery et al., 1999), Hirudin (Bishop et al., 1999), Cyclooxygenase (Zoldhelyi et al., 1996), Gewebefaktorpfad-Inhibitor (tissue factor pathway inhibitor) (Zoldhelyi et al., 2000), Thrombomodolin (Waugh et al., 2000), ecNOS (Varenne et al., 1998; Cable et al., 1999), βARKcr, (Fulton et al., 1996) und Antisense-RNA-zu-bFGF (Hanna et al., 1997; Neschis et al., 1998; Hanna et al., 2000) zu transferieren. Der Erfolg vieler dieser Protokolle beruht zum Teil auf der sehr hohen Konzentration des verwendeten Vektors, sowie der Verwendung des populären Modells der Erzeugung von Verletzung durch Ballonaufblähung, was das Endothel entblößt und die Vektorpenetration erhöht.
  • Gentransfer in intaktes Gefäßgewebe, wie zum Beispiel nicht verletzte Arterien- oder Venenimplantate, hat sich als schwieriger erwiesen (Eslami et al., 2000; Schwartz et al., 1999; Fulton et al., 1996; Hanna et al., 2000; Mann et al., 1995; Fulton et al., 1997; Fulton et al., 1998; Faries et al., 2000). Die Transfereffektivität ist allgemein geringer, die erforderlichen Dosen sind höher und die biologischen Effekte sind weniger ausgeprägt (Schwartz et al., 1999; Fulton et al., 1996; Hanna et al., 2000; Mann et al., 1995; Fulton et al., 1997; Fulton et al., 1998; Faires et al., 2000). Weiterhin und möglicherweise am wichtigsten verbleibt ein intaktes Immunsystem ein ernsthaftes Hindernis für Langzeit-Transgenexpression und die Verwendung eines Adenovirus, da Neutralisierung des cythosolischen Episoms im Allgemeinen nach der ersten Woche vollständig ist (Eslami et al., 2000; Chang et al., 1995). Immunmodulation des Wirtes kann die Lebensdauer des Transgens ausdehnen [Ascher et al., Ann. Vasc. Surg. 14: 385–392, 2000], aber globale Immunsuppression in der älteren Population mit Gefäßerkrankung ist eindeutig unmöglich. Die Probleme, die dem Gentransfer auf Basis von Adenoviren in Gefäßgewebe inhärent sind, werden am besten durch die Tatsache veranschaulicht, dass bis heute lediglich ein einziger Versuch von therapeutischem Gentransfer berichtet wurde [für Angiogenese, Rosengart et al., 1999] und dass bis jetzt noch ein klinischer Versuch unter Verwendung von adenoviralen Vektoren für die Behandlung oder Vorbeugung von proliferativen Gefäßerkrankungen zu veröffentlichen ist.
  • Ein potenzieller Vektor für die Erzeugung von Langzeittransgenexpression ist Herpes Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1). HSV-1 ist der Virus, der für immer wiederkehrende oropharyngeale Fieberbläschen verantwortlich ist. Es ist ein lytischer, nicht integrierender DNA-Virus, der Neurotropismus und die Errichtung von lang andauernden Infektionen gezeigt hat. Wie ein Adenvirus kann HSV-1 in hohem Titer hergestellt werden und enthält eine Vielzahl von nicht essentiellen Genen, die potentiell entfernt und mit Transgenen ersetzt werden können. Dies hat zur Spekulation geführt, dass die Verwendung von HSV ein Verfahren für Gentransfer für systemische Erkrankung werden kann (Culver, 1996, Lachmann und Efstathiou, 1997). Die lytische und hoch infektiöse Natur von HSV und das lebenslange Potential für Latenz können jedoch signifikante genetische Modifikation vor therapeutischer Verwendung notwendig machen (Lachmann und Efstathiou, 1997, Huard et al., 1995, Advani et al., Gene Therapy 5: 160–165, 1998). Dem ersten Satz an rekombinanten Herpes-Viren, die erzeugt werden sollten, mangelte es an einem oder mehreren Genen (z. B. Thymidinkinase oder Ribonukleotidreduktase), was virales Wachstum in sich nicht teilenden Zellen lediglich moderat reduzierte (Martuza et al., 1991, Mineta et al., 1994, Miyatake et al., 1999). HSV-1 wurde intensiv als Therapie für maligne Tumore des zentralen Nervensystems unter Verwendung einer Vielzahl von genetischen Manipulationen untersucht [Advani et al., Gene Therapy 5: 160–165, 1998, Chambers et al., 1995, Andreansky et al., Can. Res. 57: 1502–1509, 1997]. In letzter Zeit wurden Versuche unternommen, um den Virus durch Entfernung von beiden Kopien des γ134.5-Gens (Chou et al., 1990, Chou und Roizman, 1994) nicht-virulent zu machen.
  • Den Erfindern sind jedoch lediglich zwei klinische Phase I-Versuche unter Verwendung von Transfervektoren und Liefersystemen bekannt, die beide auf die Machbarkeit des Transfers von angiogenen Faktoren gerichtet sind [Baumgartner et al., Circ. 1114–1123, 1998, Isner et al., 1995 Symes et al., 1999, Rosengart et al., 1999). Somit gibt es trotz der Fortschritte in der Technik nach wie vor eine Notwendigkeit für effektivere Vektoren und Verfahren der Therapie für eine breitere Anwendung von somatischer Gentherapie, um Gefäßerkrankung zu behandeln.
  • Gene Therapy, Bd. 3, Nr. 7, 1996, Seiten 560–566 offenbart die Verwendung von verschiedenen inaktivierten HSV-Vektoren für Gentransfer in Herzmyocyten in vivo und in Gefäßzellen in vitro.
  • Circulation Research, Bd. 76, 1995, Seiten 161–167 ist auf die Verwendung eines Vektors auf Basis von für die Replikation unbrauchbarem HSV-1 gerichtet, um eine heterologe Nukleinsäure in Zellen zu exprimieren. Die gemäß dieser Referenz infizierten Zellen sind Fibroplastzelllinen und der Herpes Simplex-Virusvektor, der offenbart ist, ist nicht replizierend.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung für das zuvor genannte Problem zur Verfügung, indem ein Weg zum Exprimieren einer heterologen Nukleinsäure in einer Gefäßzelle durch die Verwendung eines rekombinanten Herpes Simplex-Viruses zur Verfügung gestellt wird. Gemäß einem Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Expression einer heterologen Nukleinsäuresequenz in einer Gefäßzelle zur Verfügung, aufweisend das Vermischen eines rekombinanten replizierenden viralen Herpes Simplex-Vektors, dem zumindest ein exprimierbares γ134.5-Gen fehlt und der operabel eine heterologe Nukleinsäure aufweist, wobei der Herpes Simplex-Virus für das Wachstum im Zentralnervensystem geschwächt ist, mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung vorzugsweise zum Behandeln oder Vorbeugen einer kardiovaskulären Erkrankung oder Zustand geeignet ist.
  • Der rekombinante Herpes Simplex-Virus wird für das Wachstum mit einer nicht-stillen Insertion, Substitution oder Deletion einer Nukleotidsequenz in zumindest einem nicht-essenziellen Gen des Herpes Simplex-Viruses geschwächt. In einer verwandten Ausführungsform kann das rekombinante Herpes Simplex-Virus weiterhin eine nicht-stille Insertion, Substitution oder Deletion einer Nukleotidsequenz in zumindest einem essentiellen Gen des Herpes Simplex-Viruses aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform mangelt es dem rekombinanten Herpes Simplex an beiden exprimierbaren γ134.5-Genen.
  • Geeignete Gefäßzellen für die Behandlung durch das vorliegende Verfahren beinhalten eine Endothelzelle, eine glatte Muskelzelle und/oder eine Adventitialzelle. In einer weiteren Ausführungsform codiert die heterologe Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid, d. h. ein antiproliferatives Polypeptid, ein vasodilatorisches Polypeptid und ein angiogenes Polypeptid. In einer zusätzlichen Ausführungsform codiert die heterologe Nukleinsäuesequenz ein Antisense-Oligonukleotid oder ein Antisense-Polynukleotid. In einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Oligonukleotid oder Antisense-Polynukleotid komplementär zu einer RNA, die ein antiproliferatives Polypeptid, vasodilatorisches Polypeptid oder angiogenes Polypeptid codiert. Vorzugsweise ist der rekombinante Herpes Simplex-Virus HSV-1. In einer verwandten Ausführungsform weist der rekombinante Herpes Simplex-Virus weiterhin zumindest ein Gen auf, das für die Behandlung einer Herpes Simplex-Virusinfektion durch ein antivirales Mittel essentiell ist.
  • Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Behandlung oder zur Vorbeugung einer kardiovaskulären Erkrankung oder Zustand in einer Gefäßzelle verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der kardiovaskuläre Zustand Bluthochdruck in einem Gefäßgewebe. Vorzugsweise wird der kardiovaskuläre Zustand ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus chronischem Herzfehler, kardiovaskulärer Bluthochdruck-Erkrankung, ischämischer Herzerkrankung, Herzrhythmusstörung, angeborener Herzerkrankung, Herzklappenerkrankung oder stenotischem Defekt, Cardiomyopathie, Aneurysmus, chronischer Veneninsuffizienz, peripherer Arterienerkrankung oder Restenose.
  • In einer zusätzlichen Ausführungsform wird die heterologe Nukleinsäuresequenz in Gefäßgewebe für eine Zeitdauer exprimiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mehr als 7 Tagen, mehr als 14 Tagen, mehr als 21 Tagen, mehr als 28 Tagen, mehr als 35 Tagen oder mehr als 70 Tagen.
  • Eine weitere Ausführungsform richtet sich auf die heterologe Nukleinsäuresequenz, die einen screenbaren oder selektierbaren Marker codiert. Vorzugsweise ist die heterologe Nukleinsäuresequenz eine antithrombotische Nukleinsäure, eine Angiogenese regulierende Nukleinsäure, ein Immunmodulator, ein Induktor für Zellproliferation, ein Inhibitor für Zellproliferation oder ein Regulator für programmierten Zelltod.
  • In einer verwandten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung weiterhin zumindest ein therapeutisches oder pharmakologisches Mittel auf. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das pharmakologische Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem antihyperlipoproteinämischen Mittel, einem antiarteriosklerotischen Mittel, einem antithrombotischen/fibrinolytischen Mittel, einem Blutkoagulans, einem antiarrhytmischen Mittel, einem Antihypertoniemittel, einem Blutdrucksteigerer, einem Behandlungsmittel für angeborenen Herzfehler, einem antianginösen Mittel und einem Antiinfektionsmittel. Vorzugsweise ist der rekombinante Herpes Simplex-Virus HSV-1. In einer verwandten Ausführungsform weist der rekombinante Herpes Simplex-Virus weiterhin zumindest ein Gen auf, das für die Behandlung einer Herpes Simplex-Virusinfektion durch ein Antivirusmittel essentiell ist.
  • In noch einem weiteren erfindungsgemäßen Gesichtspunkt wird ein Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, um normale Physiologie in einer funktionell abnormalen Gefäßzelle zu induzieren, aufweisend das Vermischen eines rekombinanten replizierenden viralen Herpes Simplex-Vektors, aufweisend eine heterologe Nukleinsäuresequenz, und wobei der Herpes Simplex-Virus für das Wachstum im zentralen Nervensystem geschwächt ist, mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  • Der rekombinante Herpes Simplex-Virus wird für das Wachstum durch nicht-stille Insertion, Substitution oder Deletion einer Nukleotidsequenz in zumindest einem nicht-essentiellen Gen des Herpes Simplex-Viruses geschwächt. Der rekombinante Herpes Simplex-Virus kann weiterhin eine nicht-stille Insertion, Substitution oder Deletion einer Nukleotidsequenz in zumindest einem essentiellen Gen des Herpes Simplex-Viruses aufweisen.
  • Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die eingehende Beschreibung und Beispiele, die nun folgen, besser verstanden.
  • EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Somatischer Gentransfer wurde als ein Verfahren vorgeschlagen, um eine Vielzahl von ischämischen, thrombotischen und proliferativen Gefäßerkrankungen zu behandeln. Fortschritt im Gebiet des Gefäßgentansfers wurde jedoch durch einen Mangel an Vektoren behindert, die wirksam das Endothel penetrieren können und tiefere Zellschichten stabil und dauerhaft transformieren, transfizieren oder infizieren.
  • In letzter Zeit wurde die Neurovirulenz von Herpes Simplex-Virus Typ eins (HSV-1) genetisch abgeschwächt, was in signifikant reduzierter Toxizität resultiert, während seine Fähigkeit zu penetrieren und lang andauernde Infektionen zu erzeugen nach wie vor aufrecht erhalten wird. Deletion von beiden Kopien des γ134.5-Gens verringert potentiell die Virulenz, ermöglicht aber trotzdem die Replikation in sich teilenden Zellen und möglicherweise stabile episomale Infektion. Das Produkt des γ134.5-Gens blockiert die Phosphorylierung der α-Untereinheit des Translations-Initiierungsfaktors eIF-2, der in der viralen Proteinsynthese involviert ist.
  • Um die Nachteile im Stand der Technik zu überwinden, wird eine modifizierte rekombinante Form von HSV-1, bei der beide Kopien des γ134.5-Gens entfernt wurden (Chou et al., 1990, Chou und Roizman, 1994), auf ihre Zuverlässigkeit und Effizienz beim Transfizieren von Gefäßgewebe in vitro und in vivo untersucht. Für den HSV-1-Vektor und Verfahren der Verwendung wurde hierbei gezeigt, dass sie hochwirksam für Gentransfer in Gefäßzellen sind, wobei die Transfektionseffektivität und die Dauer weit diejenigen von traditionellen viralen Vektoren überschreitet. Die Offenbarungen hier demonstrieren, dass ein γ134.5-befreiter HSV-1-Vektor dazu fähig ist, transgene Expression in 50% der arterialisierten venösen Neointima für bis zu vier Wochen bei Tieren mit einem intakten Immunsystem aufrecht zu erhalten. Diese Ergebnisse sind sowohl überraschend als auch unerwartet, da die Dauer und Effektivität, die hierbei demonstriert wird, bei weitem die berichteten Ergebnisse mit anderen Vektoren überschreiten (Eslami et al., 2000, Schwartz et al., 1999, Scheinman et al., 1999, George et al., 2000, Dollery et al., 1999, Waugh et al., 2000, Hanna et al., 2000, Schneider et al., 1999). Weiterhin überraschende und unerwartete Eigenschaften des Vektors und Verfahren der vorliegenden Erfindung werden durch die geringe Dosis gezeigt, die für HSV-1 erforderlich ist, um diese Effekte zu erreichen. Lediglich 108 Plaque bildende Einheiten (pfu) pro ml werden verwendet, um diese Dauer und Effektivität zu erreichen, was eine Dosis ist, die einige Größenordnungen geringer ist als traditionelle Strategien unter Verwendung von Adenvirus (Chang et al., 1995, Smith et al., 1997, Schwartz et al., 1999, Chang et al., 1995, Scheinman et al., 1999, Ueno et al., 1997, Cheng et al., 1998 George et al., 2000, Dollery et al., 1999, Bishop et al., 1999, Zoldhelyi et al., 2000, Waugh et al., 2000, Varenne et al., 1998, Cable et al., 1999, Fulton et al., 1996, Hanna et al., 1997, Neschis et al., 1998, Hanna et al., 2000, Schneider et al., 1999). Zusätzlich gibt es bei dieser geringen Dosis keine offensichtliche Toxizität oder Immunostimulation. Das anscheinende Fehlen von oder die reduzierte Toxizität ist jedoch ebenfall überraschend und unerwartet bei dem gegebenen Hang einer HSV-Infektion, in experimentellen Systemen arterielle Thrombose zu verursachen (Key et al., 1990), sowie der Indikation, dass HSV tatsächlich bei Atherogenese involviert ist [Alber et al., Circ. 102: 779–785, 2000].
  • In gewissen Ausführungsformen besitzen HSV-1-Vektoren und Verfahren zur Verwendung, so wie hier beschrieben, hohe Effektivität (z. B. größer als 40% Transfektion von Zellen) bei geringen Konzentrationen (z. B. weniger als etwa 109 pfu pro ml verabreichtem Vektor). Insbesondere erlauben die hier beschriebenen HSV-1-Vektoren reduzierte virale Beladungen (z. B. eine Gesamtvirusbeladung von weniger als etwa 1010 pfu pro ml).
  • In einigen Ausführungsformen zeigen die HSV-1-Vektoren und Verfahren zur Verwendung, die hier beschrieben sind, lange Andauer (z. B. größer als etwa 28 Tage) der transgenen Expression in einer Wirtszelle, Gewebe oder Organismus. In besonderen Gesichtspunkten ist die transgene Dauer trotz der Tatsache, dass der Wirtsorganismus immunokompetent ist, verlängert.
  • In speziellen Ausführungsformen zeigen die HSV-1-Vektoren und Verfahren zur Verwendung, die hier beschrieben sind, einen hohen Grad an Zellpenetranz (z. B. größer als etwa 40%).
  • In gewissen Ausführungsformen zeigen die HSV-1-Vektoren und Verfahren zur Verwendung, die hier beschrieben sind, eine geringe oder akzeptable Cytotoxizität (z. B. weniger als etwa 10% Cytotoxizität bei einem Mehrfach-Infektionsverhältnis (MOI), ausgedrückt als die gesamten viralen Partikel pro Zelle, von 2).
  • A. NUKLEINSÄURE
  • Gewisse Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen verschiedene Nukleinsäuren, einschließlich Vektoren, Promotorn, therapeutischen Nukleinsäuren und anderen Nukleinsäureelementen, die bei der Transformation und Expression in Zellen involviert sind. In gewissen Gesichtspunkten weist eine Nukleinsäure einen Wildtyp oder eine mutierte Nukleinsäure auf. In besonderen Gesichtspunkten codiert eine Nukleinsäure ein Polypeptid oder weist eine transkribierte Nukleinsäure auf.
  • Die Bezeichnung „Nukleinsäure" ist im Stand der Technik wohl bekannt. Eine „Nukleinsäure", so wie hier verwendet, wird allgemein ein Molekül betreffen (d. h. einen Strang) aus DNA, RNA oder ein Derivat oder Analoges davon, aufweisend ein Nukleotid. Ein Nukleotid beinhaltet zum Beispiel ein natürlich auftretendes Nukleotid, enthaltend eine Purin- oder Pyrimidinbase, die in DNA (z. B. ein Adenin „A", ein Guanin „G", ein Thymin „T" oder ein Cytosin „C") oder RNA (z. B. ein A, ein G, ein Uracil „U" oder ein C) gefunden werden. Die Bezeichnung „Nukleinsäure" beinhaltet die Bezeichnungen „Oligonukleotid" und „Polynukleotid", jeweils als eine Unterart der Bezeichnung „Nukleinsäure". Die Bezeichnung „Oligonukleotid" betrifft ein Molekül von zwischen etwa 3 und etwa 100 Nukleotiden Länge. Die Bezeichnung „Polynukleotid" betrifft zumindest ein Molekül von mehr als etwa 100 Nukleotiden Länge.
  • Diese Definitionen betreffen allgemein ein einsträngiges Molekül, aber in spezifischen Ausführungsformen umfassen sie auch einen zusätzlichen Strang, der teilweise, im Wesentlichen oder vollständig komplementär zu dem einsträngigen Molekül ist. Somit kann eine Nukleinsäure ein doppelsträngiges Molekül oder ein dreisträngiges Molekül umfassen, das einen oder mehrere komplementäre(n) Strang (Stränge) oder „Komplement(e)" einer speziellen Sequenz, aufweisend ein Molekül, aufweist. So wie hier verwendet, kann eine einsträngige Nukleinsäure durch das Präfix "ss" bezeichnet werden, eine doppelsträngige Nukleinsäure durch das Präfix „ds" und eine dreisträngige Nukleinsäure durch das Präfix „ts".
  • In speziellen Gesichtspunkten codiert eine Nukleinsäure eine RNA und/oder ein Protein, Polypeptid und/oder Peptid. In gewissen Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung neue Zusammensetzungen, aufweisend zumindest ein proteinöses Molekül. So wie hier verwendet, betrifft ein „proteinöses Molekül", „proteinöse Zusammensetzung", „proteinöse Verbindung", „proteinöse Kette" oder „proteinöses Material" allgemein ein Protein mit mehr als etwa 200 Aminosäuren oder die volle Länge der endogenen Sequenz, die von einem Gen translatiert wurde, ein Polypeptid von mehr als etwa 100 Aminosäuren und/oder ein Peptid von etwa 3 bis etwa 100 Aminosäuren, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt. Alles diese „proteinösen" Bezeichnungen, die oben beschrieben sind, werden hier austauschbar verwendet.
  • A.1. Herstellung von Nukleinsäuren
  • Eine Nukleinsäure kann durch jede bekannte Technik von einem Fachmann hergestellt werden, so wie zum Beispiel chemische Synthese, enzymatische Produktion oder biologische Produktion. Nicht einschränkende Beispiele einer synthetischen Nukleinsäure (z. B. ein synthetisches Oligonukleotid) beinhalten eine Nukleinsäure, die durch chemische Synthese in vitro unter Verwendung von Phosphortriester, Phosphit oder Phosphoramidit-Chemie und Festphasentechniken, wie zum Beispiel in EP 266 032 beschrieben, oder über Deoxynukleosid-H-Phsophonatintermediate, wie von Froehler et al., 1986 und US-Patent Seriennr. 5 705 629 beschrieben, hergestellt wurden. In dem erfindungsgemäßen Verfahren können ein oder mehrere Oligonukleotide verwendet werden. Verschiedene unterschiedliche Mechanismen der Oligonukleotidsynthese wurden zum Beispiel in US-Patenten 4 659 774 , 4 816 571 , 5 141 813 , 5 264 566 , 4 959 463 , 5 428 148 , 5 554 744 , 5 574 146 , 5 602 244 offenbart.
  • Ein nicht einschränkendes Beispiel einer enzymatisch hergestellten Nukleinsäure beinhaltet eine, die durch Enzyme in Verstärkungsreaktionen, wie zum Beispiel PCRTM (siehe zum Beispiel US-Patent 4 683 202 und US-Patent 4 682 195 ), oder die Synthese eines Oligonukleotids, wie in US-Patent Nr. 5 645 897 beschrieben, hergestellt wurde. Ein nicht einschränkendes Beispiel einer biologisch hergestellten Nukleinsäure beinhaltet eine rekombinante Nukleinsäure, hergestellt (d. h. repliziert) in einer lebenden Zelle, wie zum Beispiel einen rekombinanten DNA-Vektor, repliziert in Bakterien (siehe zum Beispiel Sambrook et al, 1989).
  • A.2. Reinigung von Nukleinsäuren
  • Eine Nukleinsäure kann auf Polyacrylamidgelen, Cäsiumchorid-Zentrifugationsgradienten oder durch irgendwelche anderen Vorrichtungen, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt werden (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989). In bevorzugten Gesichtspunkten ist eine Nukleinsäure eine pharmakologisch akzeptable Nukleinsäure. Pharmakologisch akzeptable Zusammensetzungen sind dem Fachmann bekannt, Beispiele sind hier beschrieben.
  • In einigen Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure, die eine isolierte Nukleinsäure ist. So wie hier verwendet, betrifft die Bezeichnung „isolierte Nukleinsäure" ein Nukleinsäuremolekül (z. B. ein RNA- oder DNA-Molekül), das frei isoliert oder auf andere Art und Weise frei von der Masse der gesamten genomischen und transkribierten Nukleinsäuren von einer oder mehreren Zellen ist. In gewissen Ausführungsformen betrifft „isolierte Nukleinsäure" eine Nukleinsäure, die frei isoliert oder auf andere Art und Weise frei von der gesamten Menge an zellulären Komponenten oder in vitro Reaktionskomponenten ist, so wie zum Beispiel Makromolekülen, wie Lipiden oder Proteinen, kleinen biologischen Molekülen und Ähnlichem.
  • A.3. Nukleinsäuresegmente
  • In gewissen Ausführungsformen ist die Nukleinsäure ein Nukleinsäuresegment. So wie hier verwendet, ist die Bezeichnung „Nukleinsäuresegment" ein kleineres Fragment einer Nukleinsäure, wie zum Beispiel als nicht einschränkendes Beispiel solche, die lediglich einen Teil eines Peptids oder Polypeptidsequenz codieren. Somit kann ein „Nukleinsäuresegment” jeden Teil einer Gensequenz aufweisen, von etwa 2 Nukleotiden und vorzugsweise 50 Nukleotiden bis zur vollen Länge eines Peptid oder Polypeptid codierenden Bereiches.
  • Verschiedene Nukleinsäuresegmente können basierend auf einer speziellen Nukleinsäuresequenz entworfen werden und können jede Länge haben. Indem einer Sequenz numerische Werte zugewiesen werden, zum Beispiel der erste Rest 1 ist, der zweite Rest 2 ist, etc., kann ein Algorithmus erzeugt werden, der alle Nukleinsäuresegmente definiert: n bis n + ywobei n eine ganze Zahl von 1 bis zur letzten Zahl der Sequenz ist und y die Länge des Nukleinsäuresegments minus eins ist, wobei n + y nicht die letzte Zahl der Sequenz überschreitet. Demzufolge korrespondieren für ein 10-mer die Nukleinsäuresegmente zu Basen 1 bis 10, 2 bis 11, 3 bis 12... und so weiter. Für ein 15-mer korrespondieren die Nukleinsäuresegmente zu Basen 1 bis 15, 2 bis 16, 3 bis 17 und so weiter. Für ein 20-mer korrespondieren die Nukleinsäuresegmente zu Basen 1 bis 20, 2 bis 21, 3 bis 22 und so weiter. In gewissen Ausführungsformen kann ein Nukleinsäuresegment eine Probe oder Primer sein. So wie hier verwendet, betrifft eine „Probe" allgemein eine Nukleinsäure, die in einem Detektionsverfahren oder einer Zusammensetzung verwendet wird. So wie hier verwendet, betrifft ein „Primer" allgemein eine Nukleinsäure, die in einem Ausdehnungs- oder Verstärkungsverfahren oder Zusammensetzung verwendet wird.
  • A.4. Nukleinsäurekomplemente
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Nukleinsäure, die zu einer Nukleinsäure komplementär ist. Ein Nukleinsäure- „Komplement" oder ist „komplementär" zu einer anderen Nukleinsäure, wenn sie zur Basenpaarung mit einer anderen Nukleinsäure gemäß den Standard-Watson-Crick-, Hoogsteen- oder umgekehrten Hogsteen-Komplementärregeln fähig ist. So wie hier verwendet kann „eine andere Nukleinsäure" ein getrenntes Molekül oder eine räumlich getrennte Sequenz des gleichen Moleküls betreffen. In bevorzugten Ausführungsformen ist ein Komplement eine gegengleiche (antisense) Nukleinsäure, die verwendet wird, um die Expression (z. B. Translation) eines RNS-Transkripts in vivo zu reduzieren.
  • So wie hier verwendet, betrifft die Bezeichnung „komplementär" oder „Komplement(e)" auch eine Nukleinsäure, aufweisend eine Sequenz von aufeinander folgenden Nukleotiden oder halb aufeinander folgenden Nukleotiden (z. B. ein oder mehrere aufeinander folgende Nukleotide sind in dem Molekül nicht vorhanden), die dazu fähig ist, einen anderen Nukleinsäurestrang oder Doppel davon auch dann zu hybridisieren, wenn weniger als alle Nukleotide nicht mit einem Nukleotidgegenstück Basenpaare bilden. In einigen Antisense-Ausführungsformen sind vollständig komplementäre Nukleinsäuren jedoch bevorzugt.
  • B. VEKTOREN
  • Die Bezeichnung „Vektor" wird verwendet, um ein Trägernukleinsäuremolekül zu bezeichnen, in welches eine Nukleinsäuresequenz zum Einbringen in eine Zelle, wo sie repliziert werden kann, eingesetzt werden kann. So wie hier verwendet betrifft „Vektor" sowohl das Trägermolekül als auch ein rekombinantes Molekül, welches ein Nukleinsäureinsert (typischerweise heterolog) und das Trägermolekül enthält. Die Verwendungen sind dem Fachmann aus dem Zusammenhang einer Darstellung offensichtlich. Ein Nukleinsäuresegment kann „exogen" sein, was bedeutet, dass es nicht eine Sequenz ist, die original aus dem Genom der Zelle stammt, in welche das Segment eingebracht wird. So wie hier verwendet ist eine „heterologe" Nukleinsäure hier so definiert, dass sie ein Nukleinsäuresegment bedeutet, das bezüglich einer anderen Nukleinsäuresequenz fremd ist. Zum Beispiel kann ein Nukleinsäuresegment heterolog gegenüber dem Genom einer Zelle oder zu anderen benachbarten Nukleinsäuresegmenten sein, die zusammen mit dem ersten Nukleinsäuresegment eine größere Nukleinsäure umfassen.
  • Die Bezeichnung „Expressionsvektor" betrifft jede Art eines Genkonstrukts, aufweisend eine Nukleinsäure, die für eine RNA codiert, die dazu fähig ist, transkribiert zu werden. In einigen Fällen werden dann RNA-Moleküle in ein Protein, Polypeptid oder Peptid translatiert. In anderen Fällen werden diese Sequenzen nicht translatiert, zum Beispiel bei der Herstellung von Antisense-Molekülen oder Ribozymen. Expressionsvektoren können eine Vielzahl von „Kontrollsequenzen" enthalten, die Nukleinsäuresequenzen betreffen, die für die Transkription und mögliche Translation einer operabel verknüpften Codierungssequenz in einer speziellen Wirtszelle notwendig sind. Zusätzlich zu Steuerungssequenzen, die Transkription und Translation regulieren, können Vektoren und Expressionsvektoren Nukleinsäuresequenzen enthalten, die auch anderen Funktionen dienen und unten beschrieben sind.
  • So wie hier beschrieben und als ein Minimum ist die Expression einer heterologen Nukleinsäuresequenz definiert als Expression eines verwandten RNA-Moleküls (typischerweise einer mRNA und rRNA). Allgemeiner betrifft die Expression einer heterologen Nukleinsäuresequenz die zellulären Prozesse der Transkription und Translation, die ein Polypeptidgenprodukt erzeugen. Obwohl das Polypeptidgenprodukt typischerweise zumindest eine Funktion beinhaltet, die charakteristisch für dieses Polypeptid ist, so wie hier angegeben, wird die Expression einer heterologen Nukleinsäuresequenz weiterhin so betrachtet, dass sie das Produkt eines nicht funktionalen Polypeptids beinhaltet.
  • B.1. Virale HSV-Vektoren
  • Herpes Simplex-Virus (HSV) vom Typ I und Typ II enthält ein doppelsträngiges lineares DNA-Genom von ungefähr 150 kb, enthaltend zumindest 84 exprimierbare offene Leserahmen [siehe Tabelle 1, welche die Funktion der Herpes Simplex-Gene ausführt (Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:11307–11312, Oktober 1996)]. Wildtyp-HSVs sind dazu fähig, Zellen lytisch zu infizieren und eine Latenz in gewissen Zelltypen (z. B. Neuronen) zu etablieren. Ähnlich wie Adenvirus kann HSV eine Vielzahl von Zelltypen infizieren, einschließlich Muskel (Yeung et al., 1999), Ohr (Derby et al., 1999), Auge (Kaufmann et al., 1999), Tumore (Yoon et al., 1999, Howard et al., 1999), Lunge (Kohut et al., 1998), Neuronen (Garrido et al., 1999, Lachmann und Efstathiou, 1999), Leber (Miytake et al., 1999, Kooby et al., 1999) und Pankreasinseln (Rabinovitch et al., 1999).
  • Virale HSV-Gene werden durch zelluläre RNA-Polymerase II transkribiert und temporär reguliert, was in der Transkription und anschließender Synthese von Genprodukten in drei grob unterscheidbaren Phasen oder kinetischen Klassen resultiert. Diese Phasen von Genen werden als die Sofortigen Frühen (Imediate Early, IE) oder α-Gene, Frühen (Early, E) oder β-Gene und Späten (Late, L) oder γ-Gene bezeichnet. Sofort folgend auf die Ankunft des Genoms eines Virus in dem Kern einer neu infizierten Zelle werden die IE-Gene transkribiert. Die effiziente Expression dieser Gene erfordert keine vorhergehende virale Proteinsynthese. Die Produkte von IE-Genen sind erforderlich, um die Transkription zu aktivieren und den Rest des viralen Genoms zu regulieren.
  • HSV kann eine breite Vielzahl von sowohl sich teilenden als auch sich nicht teilenden Wirtszellen infizieren und somit wurde es bei der Herstellung von Herpes-Virusvektoren zur Lieferung von heterologen Nukleinsäuren in Wirtszellen verwendet. In gewissen Ausführungsformen kann ein Herpes Simplex-Virusvektor ein HSV-1- oder HSV-2-Vektor sein. Besonders bevorzugte Vektoren sind virale Vektoren, denen eine oder mehrere Kopien eines γ134.5-Gens oder Ribonukleotid-Reduktasegen (d. h. γ139-Gen, welches ICP6 kodiert, oder das γ140-Gen) fehlt. Vektoren, enthaltend eine einzelne Kopie des γ134.5-Gens, mangelt es an umgekehrter Wiederholung (inverted repeat), die mit Virulenz verknüpft ist. Virale Vektoren können durch die hier offenbarten Verfahren, oder so wie es dem Fachmann bekannt ist, für die Verwendung in hier offenbarten Verfahren mutiert werden, um einen viralen Vektor herzustellen, dem es zumindest an einem γ134.5-Gen und/oder Ribonukleotid-Reduktasegen mangelt. Z. B. sind Verfahren zur Herstellung von Herpes-Virusvektoren, denen ein oder mehr γ134.5-Gene oder ribosomale Reduktasegen fehlen, in US Patent Nrn. 6 120 773 , 6 106 826 , 5 795 713 , 5 585 096 und 5 328 688 offenbart.
  • Ausführungsformen werden die Verwendung (in den erfindungsgemäßen Verfahren) von viralen Herpes Simplex-Vektoren beinhalten, die für das Wachstum innerhalb des Zentralen Nervensystems geschwächt sind. So wie hier verwendet ist ein geschwächter HSV in der folgenden Art und Weise definiert. Ein Wildtypstrang (nicht-rekombinant) erfordert 10 pfu bis 1000 pfu, um eine Maus durch intracerebrale Beimpfung zu töten. Ein geschwächter Virus erfordert zumindest 100 000 pfu, um einen Mäusewirt zu töten. Weiterhin reist ein virulenter Virus in schneller Art und Weise von Zelle zu Zelle, während ein geschwächter Virus stark eingeschränkt ist und nicht sehr effizient von Zelle zu Zelle reist (somit sind mehr Viruspartikel erforderlich, um einen Wirt, wie z. B. eine Maus, zu töten), bis der tierische Wirt der Infektion nicht mehr immunologisch antworten kann.
  • HSV kann für das Wachstum im CNS und geeigneter Weise in den vorliegenden Verfahren durch eine nicht stille Nukleotidinsertion, Substitution oder Deletion in zumindest einem nicht-essentiellen Gen eines Herpes Simplex-Viruses geschwächt werden. Beispiele für nicht-essentielle Gene und ihre Funktionen sind in Tabelle 3 ausgeführt. Ein solcher geschwächter HSV kann alternativ eine nicht-stille Nukleotidinsertion, Substitution oder Deletion in zumindest einem essentiellen Gen eines Herpes Simplex-Viruses aufweisen. Beispiele für essentielle Gene und ihre Funktionen sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • So wie hier verwendet ist ein essentielles Gen definiert als ein Gen, das erforderlich ist, um infektiöse Nachkommen in einer Zelle herzustellen. Z. B. ist das HSV-Gen α4 essentiell, d. h. in seiner Abwesenheit wird der Virus keine infektiösen Nachkommen erzeugen. Jedoch wird ein Fachmann erkennen, dass eine Zelllinie, die das α4-Genprodukt herstellt, es einem Deletionsmutanten (α4') ermöglicht, sich zu replizieren. So wie hier verwendet ist ein nicht-essentielles Gen definiert als ein Gen, das wenn es abwesend oder disfunktionell ist, nicht den Virus daran hindert, sich zu replizieren und Nachkommen in einer Zelllinie zu erzeugen, die nicht das fehlende Genprodukt weiter verteilt. Z. B. wird das HSV-Gen α0 als nicht essentiell angesehen, d. h. ein α0-Deletionsmutant (α0') erzeugt Nachkommen in vielen verschiedenen Zelllinien (in einigen Zelllinien ist der Titer 50- bis 100-fach geringer, während in anderen Zelllinien nahezu normale Ausbeuten erzeugt werden).
  • Um stabile Modifikation von Genen wie z. B. γ134.5 sicher zu stellen, die sich innerhalb der umgekehrten Wiederholung von HSV befinden, wird die umgekehrte Wiederholung selbst ausreichend modifiziert, um Rekonstitution am unmodifizierten Gen zu verhindern. Ohne an Theorie gebunden sein zu wollen wird angenommen, dass die Genwiederbildung oder Genkonversion als ein Ergebnis von umgekehrter durch Wiederholung vermittelter Paarung von duplizierten Genen resultiert, die teilweise oder vollständig innerhalb des Wiederholungsbereiches gefunden werden, wobei eine Kopie eines Gens (z. B. die unmodifizierte Kopie) als ein Templat für die Umwandlung der anderen Kopie des Gens (z. B. der modifizierten Kopie) dient. Demzufolge wird ein Fachmann unter Verwendung von Routineprozeduren eine umgekehrte Wiederholung zusätzlich zu einem darin enthaltenen Gen ausreichend modifizieren, um den effektiven Verlust des modifizierten Gens zu verhindern. Z. B. wird ein Fachmann die Sequenz einer umgekehrten Wiederholung ausreichend modifizieren, um effektive in vivo-Paarung der Wiederholungen und der Gene, welche sie enthalten, zu verhindern, was erwarten lässt, dass der Verlust eines modifizierten Genes, welches in der Wiederholung gefunden wird, verhindert wird, wobei angenommen wird, dass dies aufgrund der Vorbeugung von Genumwandlung geschieht.
  • Figure 00190001
  • Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001
  • Figure 00230001
  • Figure 00240001
  • Figure 00250001
  • So wie hier verwendet „fehlt" einem viralen Vektor ein Gen, wenn es mutiert ist, sodass ein oder mehrere Kopien des mutierten Gens reduzierte oder abwesende Expression oder Aktivität besitzen, die ausreicht, um sein Wachstum im Zentralen Nervensystem (CNS) oder in Neuronen, so wie oben definiert, abzuschwächen. Solche Mutationen können z. B. Leserasterverschiebungsmutationen, Insertionen, Deletionen, Verkürzungen und ähnliches beim Kodieren oder den regulatorischen Sequenzen für ein oder mehrere Gene aufweisen. Das Produkt des γ134.5-Gens trägt zu Neurovirulenz bei (Chou et al., 1994). Ein viraler Vektor, dem ein oder mehrere γ134.5-Gene fehlen, hat abgeschwächte Neurovirulenz, blockiert aber nicht die Proteinsynthese und wird den Tod von normalen Wirtszellen verursachen (natürlich entfernt die Entfernung des γ134.5-Gens typischerweise einen Teil oder alles des überlappenden oder gegenüberliegend orientierten orfp). Virale HSV-Vektoren, denen es an einem oder mehreren Ribonukleotidreduktasegenen mangelt, haben ebenfalls abgeschwächte Neurovirulenz (d. h. Verlust jeder Untereinheit von Ribonukleotidreduktase resultiert in Abschwächung) und sind empfindlich gegen antivirale Arzneimittel, wie z. B. Acyclovir und Ganciclovir, was antivirale Therapie in Fällen ermöglicht, bei denen ein Wirt einen unerwünschten Nebeneffekt der Vektorverabreichung zeigt [z. B. virale Encephalitis, US-Patent 6 106 826 ]. Es wird angenommen, dass ein oder mehrere andere Gene in einem viralen Herpes-Vektor mutiert werden können, um die Effektivität zu verbessern oder die Nebeneffekte eines viralen Herpes-Vektors zu reduzieren. Solche Gene sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten das Thymidinkinase (tk)-Gen oder andere Gene, die für die HSV-Replikation, Infektion oder Latenz erforderlich sind.
  • Zur Verwendung in der therapeutischen Genzufuhr kann HSV replikationsdefekt sein. Protokolle zur Erzeugung von replikationsdefekten virusfreien HSV Hilfszelllinien wurden beschrieben ( US-Patent 5 879 934 , US-Patent 5 851 826 ). Ein IE-Protein, infiziertes Zellpolypeptid 4 (ICP4), codiert durch das α4-Gen, ist absolut erforderlich sowohl für Virusinfektivität als auch die Transition von IE zur späteren Transkription. Somit war aufgrund seiner komplexen, multifunktionellen Natur und zentralen Rolle bei der Regulation der HSV-Genexpression ICP4 typischerweise das Ziel von genetischen HSV-Studien.
  • Phenotypische Studien von HSV-Viren, die von ICP4 befreit sind, zeigen, dass solche Viren potentiell geeignet für Transferzwecke sind (Krisky et al., 1998a). Eine Eigenschaft von Viren, die von ICP4 befreit sind, was sie für Gentransfer wünschenswert macht, ist, dass sie lediglich die fünf anderen IE-Gene exprimieren: US 1.5, ICP0, ICP27, ICP22 und ICP47 (DeLuca et al., 1985), ohne die Expression von viralen Genen, die Proteine codieren, welche die virale DNA-Synthese lenken, sowie die Strukturproteine des Virus. Diese Eigenschaft ist erwünscht zur Minimierung von möglichen schädlichen Effekten auf den Wirtszellmetabolismus oder eine Immunantwort, folgend auf den Gentransfer. Weitere Entfernung von IE-Genen ICP22 und ICP27 zusätzlich zu ICP4 verbessert wesentlich die Reduktion der HSV-Cytotoxizität und beugt früher und später viraler Genexpression vor (Krisky et al., 1998b).
  • Das therapeutische Potential von HSV beim Gentransfer wurde in verschiedenen in vitro-Modellsystemen und in vivo für Erkrankungen, wie z. B. Parkinson (Yamada et al., 1999), Retinoblastom (Hayashi et al., 1999), intracerebrale und intradermale Tumore (Moriuchi et al., 1998), B-Zellen-Malignitäten (Suzuki et al., 1998), Eierstockkrebs (Wang et al., 1998) und Duchenne-Muskeldystrophie (Huard et al., 1997) gezeigt.
  • Somit weist in einigen Ausführungsformen ein viraler Vektor eine Nukleinsäuresequenz auf, die eine therapeutische Nukleinsäure kodiert. In bevorzugten Gesichtspunkten kodiert eine therapeutische Nukleinsäure Antisens-Nukleinsäure oder proteinöse Zusammensetzung, die wirksam ist, um eine Gefäß-, Herz- und/oder kardiovaskuläre Erkrankung oder Störung zu behandeln. Ein Fachmann wird wohl ausgerüstet sein, um einen Vektor durch Standardrekombinationstechniken (siehe z. B. Maniatis et al., 1988 und Ausubel et al., 1994) zu konstruieren. Nicht einschränkende Beispiele von Virusvektoren, die verwendet werden können, um eine Nukleinsäure gemäß vorliegender Erfindung zu liefern, sind unten beschrieben.
  • B.2. Therapeutische Nukleinsäuren
  • In gewissen Ausführungsformen weist ein erfindungsgemäßer Vektor heterologe Nukleinsäure auf. In bevorzugten Gesichtspunkten weist eine heterologe Nukleinsäure eine therapeutische Nukleinsäure auf, die eine proteinöse Zusammensetzung kodiert oder ein Antisensprodukt. Beispielhafte heterologe Nukleinsäuren kodieren ein Nukleotid (z. B. Antisens), Protein, Polypeptid oder Peptidprodukt, welches eine antiproliferative, vasodilatorische oder angiogene Aktivität hat.
  • Das Nukleotid und Protein, Polypeptid und Peptidsequenzen für verschiedene Gene wurde bereits zuvor offenbart und kann in Computerdatenbanken, die dem Fachmann bekannt sind, gefunden werden. Eine solche Datenbank sind die National Center for Biotechnology Information's Genbank and GenPept Databases. Die kodierenden Bereiche für diese bekannten Gene können verstärkt, geklont zu und/oder in den erfindungsgemäßen Vektoren unter Verwendung der hier offenbarten Techniken oder durch jede Technik, die dem Fachmann bekannt ist (siehe z. B. Sambrook et al., 1989) exprimiert werden.
  • In gewissen Ausführungsformen kann ein Vektor mehr als eine solche therapeutische Nukleinsäure aufweisen. Die therapeutischen Nukleinsäuren können von der gleichen funktionellen Gruppe sein (z. B. beide antiproliferativ, vasodilatorisch oder angingen, etc.), oder von unterschiedlichen funktionellen Gruppen (z. B. eine antiproliferative und eine angiogene). Indem einer Zielzelle spezielle Kombinationen von therapeutischen Nukleinsäuren präsentiert werden, kann es möglich sein, den Gesamteffekt von einer oder beiden Nukleinsäuren oder den von ihnen kodierten Produkten auf die Physiologie der Zielzelle zu steigern.
  • Zum Beispiel sind Ablagerungen von extrazellulären Matrixproteinen und Gefäßzellproliferation mit Atherosklerose assoziiert. Gene, wie z. B. saurer Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF), die z. B. in Schweinearterien überexprimiert sind, resultieren in Proliferation von glatten Muskelzellen und resultierender arterieller Wandverdickung, sowie in neuer Bildung von Blutgefäßen in der Arterienwand aufgrund von Endothelzellenmigration (Nabel et al., 1993). TGF-β1 und Überexpression des platelet-derived growth factor B (PDGFB) haben auch zu einer Gefäßwandverdickung geführt. In gewissen Gesichtspunkten wird angenommen, dass in Gefäß- oder kardiovaskulären Zellen Expression von Nukleinsäuren, die RNA binden, die für Proteine kodieren, die zu Atherosklerose beitragen (z. B. aFGF, TGF-β1, PDGFB), das Fortschreiten von Atherosklerose reduziert wird.
  • In einem anderen Beispiel wurde gezeigt, dass Verabreichung eines Vektors, der eine Nukleinsäure exprimiert, deren kodiertes Produkt Zellwachstum inhibiert, Restenose bei einem Patient inhibieren kann. Zum Beispiel verhindert ein adenoviraler Vektor, der Thymidinkinase exprimiert, welche die Zelle empfänglich für ein Töten durch Ganciclovir macht, gekoppelt mit Verabreichung von Ganciclovir, glatte Muskelzellproliferation und Restenose in einem Tiermodellsystem nach Ballonangioplastie (Ohno et al., 1994). Somit wird in bestimmten Gesichtspunkten angenommen, dass Verabreichung von Vektoren, die solche therapeutischen Nukleinsäuren für Blutgefäßverdickung exprimieren, mit Verabreichung eines pharmakologischen Mittels kombiniert werden kann (z. B. einem antihyperlipoproteinämischen, einem antiarteriosklerotischen, einem antithrombotischen/fibrinolytischen Mittel, einem antihypertensiven Mittel) und/oder mit einer chirurgischen Prozedur (z. B. arteriellen Bypassoperation, Ballonangioplastie), die bei der Behandlung von Patienten verwendet wird, die an Atherosklerose oder Restenose leiden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen wird die therapeutische Nukleinsäure wirksam bei der Behandlung einer vaskulären und kardiovaskulären Erkrankung oder Zustand sein. Eine kardiovaskuläre Erkrankung oder Zustand, die von der Verabreichung eines Vektors gemäß vorliegender Erfindung profitiert, beinhaltet, ist aber nicht eingeschränkt auf, chronischen Herzfehler, kardiovaskuläre Bluthochdruckerkrankung, ischämische Herzerkrankung, Herzrhythmusstörung, angeborene Herzerkrankung, Herzklappenerkrankung oder stenotischen Defekt, Kardiomyopathie, Aneurysmus, chronische Veneninsuffizienz, peripherer Arterienerkrankung oder eine Kombination davon.
  • In gewissen Ausführungsformen kann ein erfindungsgemäßer Vektor zumindest eines aus antiproliferativer, vasodilatorischer oder angiogener proteinöser Zusammensetzung kodieren. Zum Beispiel kann ein erfindungsgemäßer Vektor in gewissen Gesichtspunkten eine antithrombotische Nukleinsäure, eine Nukleinsäure, die Angiogenese reguliert (z. B. VEGF, aFGF, bFGF), eine immunomodulatorische Nukleinsäure (z. B. Angiostatin, Endostatin, TNFα, IL-1, IL-10), eine Zellproliferation stimulierende Nukleinsäure (z. B. aus platelet-derived growth factor, ras, c-myc, c-fos), eine Nukleinsäure, die für einen Inhibitor für Zellproliferation kodiert (z. B. p53, p21, Retinoplastom-Protein (Rb)) oder antisensexprimierende Konstrukte von solchen Nukleinsäuren aufweisen.
  • In weiteren Ausführungsformen kann ein erfindungsgemäßer Vektor für ein oder mehrere Enzyme kodieren, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf Angiogenin, nukleares Antigen proliferierender Zellen (proliferating cell nuclear antigen, PCNA), alternder, aus Zellen erhaltener Inhibitor 1 (senescent cell-derived inhibitor 1, sdi1), ein Zellzyklusteilungsprotein (cell cycle division Protein, cdc), eine Cyclin-abhängige Kinase (cdk), natriuretisches Peptid vom C-Typ (CNP), ein Homeoboxgen (homeobox gene), einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, Gax, Thymidinkinase (tk), Cytosindeaminase, Endothelzellstickoxidsynthase (ec-NOS), induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS), Hirudin, ein Zell-Adhäsionsmolekül, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, VCAM, ICAM, PECAM oder E-Selectin, einen Gewebeinhibitor einer Metalloproteinase (TIMP), Analoge zu cAMP, wie z. B. Adrenomedulin, Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPKs), wie z. B. extrazelluläre Antwortkinasen (extracellular response kinases, ERKs) und c-jun N-terminale Kinase (JNK) und ihre Inhibitoren, sowie ihre Antisens-Oligonukleotide oder -Polypeptide. In anderen Ausführungsformen kann ein erfindungsgemäßer Vektor ein oder mehrere Polynukleotide kodieren. In anderen Ausführungsformen kann ein erfindungsgemäßer Vektor ein Onkogen aufweisen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf c-myb.
  • B.2.a. Antithrombotische Nukleinsäuren
  • In gewissen Ausführungsformen kann eine therapeutische Nukleinsäure einen antithrombotischen Effekt erzeugen. Nicht einschränkende Beispiele für solche Nukleinsäuren beinhalten solche, die COX-1, TFPI, PGS, Dp, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, E1A, Hirudin, t-PA oder p300 kodierende Sequenzen kodieren.
  • B.2.b. Angiogense regulierende Nukleinsäuren
  • In anderen Ausführungsformen kann ein erfindungsgemäßer Vektor eine Nukleinsäure kodieren, die Angiogense erhöht oder inhibiert. Nicht einschränkende Beispiele für Nukleinsäuren, die Angionese regulieren können, beinhalten vaskulären Endothelwachstumsfaktor (VEGF), sauren Fibroblastfaktor (aFGF), basischen Fibroblastwachstumsfaktor (bFGF), Thrombospondin, BAI-1, GDAIF, TNFα, oder ihre Rezeptoren.
  • B.2.c. Immunmodulatoren
  • Es wird angenommen, dass Immunmodulatoren in dem Vektor enthalten sein können, um die Antwort einer Zelle oder eines Patienten (z. B. eines Tieres) zu verstärken. Immunomdulatoren können als gereinigte Proteine, Nukleinsäuren kodierende Immunomdulatoren und/oder Zellen, die Immunmodulatoren in einer Vaccinzusammensetzung exprimieren, enthalten sein. Die folgenden Abschnitte listen nicht einschränkende Beispiele von Immunmodulatoren auf, die von Interesse sind, und es wird angenommen, dass verschiedene Kombinationen von Immunmodulatoren in gewissen Ausführungsformen verwendet werden können (z. B. ein Cytokin und ein Chemokin).
  • B.2.c.i. Cytokine
  • Interleukine, Cytokine, Nukleinsäuren, die Interleukine oder Cytokine kodieren, und/oder Zellen, die solche Verbindungen exprimieren, werden als heterologe Nukleinsäuregenprodukte angesehen. Interleukine und Cytokine beinhalten, sind aber nicht eingeschränkt auf Interleukin 1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-18, β-Interferon, α-Interferon, γ-Interferon, Angiostatin, Thrombospondin, Endostatin, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, METH-1, METH-2, Tumornekrosefaktor (TNF, Cachectin), TGFβ, LT, sowie Kombinationen davon.
  • B.2.c.ii. Chemokine
  • Chemokine, Nukleinsäuren, die Chemokine kodieren und/oder Zellen, die solche exprimieren, können ebenfalls als heterologe Nukleinsäuren verwendet werden. Chemokine wirken allgemein als chemische Lockmittel, um Immuneffektorzellen an der Stelle der Chemokinexpression zu rekrutieren. Es kann vorteilhaft sein, eine spezielle Chemokin kodierende Sequenz in Kombination mit z. B. einer Cytokin kodierenden Sequenz zu exprimieren, um das Rekrutieren von anderen Immunsystembestandteilen an einer Stelle der Behandlung zu erhöhen, z. B. in einem Gefäßgewebe. Solche Chemokine beinhalten z. B. RANTES, MCAF, MCP-1, MIP1-alpha, IL-8, MIP1-Beta, IP-10 sowie Kombinationen davon. Der Fachmann wird erkennen, dass gewisse Cytokine auch dafür bekannt sind, chemische Lockmittelwirkung zu haben und auch als Chemokine klassifiziert werden können.
  • B.2.d. Induktoren für Zellproliferation
  • In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird angenommen, dass Antisens-mRNA, die auf einen speziellen Induktor für Zellproliferation gerichtet ist, verwendet wird, um die Expression des Induktors der Zellproliferation zu verhindern. Die Proteine, die Zellproliferation induzieren, fallen weiterhin in verschiedene Kategorien, abhängig von ihrer Funktion. Die Gemeinsamkeit aller dieser Proteine ist ihre Fähigkeit, Zellproliferation zu regulieren.
  • Zum Beispiel ist eine Form von PDGF, das sis-Onkogen, ein sekregierter Wachstumsfaktor. Die Proteine FMS, ErbA, ErbB und neu sind ebenfalls Wachstumsfaktorrezeptoren. Mutationen an diesen Rezeptoren resultieren im Verlust von regulierbarer Funktion. Zum Beispiel resultiert eine Punktmutation, welche die Transmembrandomän des Neu-Rezeptorproteins beeinträchtigt, in neu-Onkogen. Das erbA-Onkogen wird aus dem intrazellularen Rezeptor für Thyroidhormon erhalten. Von dem modifizierten onkogenen ErbA-Rezeptor wird angenommen, dass er mit dem endogenen Thyroidhormonrezeptor konkurriert, was unkontrolliertes Wachstum verursacht.
  • Die größte Klasse von Onkogenen beinhaltet die signalübertragenden Proteine (z. B. Src, Abi und Ras). Das Protein Src ist eine cytoplasmatische Proteintyrosinkinase und ihre Transformation von Proto-Onkogen zu Onkogen resultiert in manchen Fällen über die Mutationen am Tyrosinrest 527. Im Gegensatz dazu resultiert die Transformation des GTPase-Proteins ras von Proto-Onkogen zu Onkogen in einem Beispiel aus einer Valin-zu-Glycin-Mutation an Aminosäure 12 in der Sequenz, was die ras-GTPase-Aktivität reduziert.
  • Andere Proteine, wie z. B. Jun, Fos und Myc, sind Proteine, die direkt ihre Effekte auf nukleare Funktionen als Transkriptionsfaktoren ausüben.
  • B.2.e. Inhibitoren der Zellproliferation
  • In einer gewissen Ausführungsform wird die Wiederherstellung der Aktivität eines Inhibitors der Zellproliferation durch ein genetisches Konstrukt betrachtet. Tumorsuppressoronkogene wirken, um übermäßige Zellproliferation zu inhibieren. Die Inaktivierung dieser Gene zerstört ihre inhibitorische Aktivität, was in unregulierter Proliferation resultiert. Die Tumorsuppressoren p53, p16, p21 und C-CAM sind Beispiele für diese Klasse von Proteinen.
  • Hohe Gehalte an mutiertem p53 wurden in vielen Zellen gefunden, die durch chemische Karzinogenese, Ultraviolettstrahlung und verschiedene Viren transformiert wurden. Das p53-Gen ist ein häufiges Ziel für Mutationsinaktivierung in einer breiten Vielzahl von menschlichen Tumoren und es ist bereits dokumentiert, dass es das häufigste mutierte Gen bei gewöhnlichem menschlichem Krebs ist. Es ist in über 50% des menschlichen NSCLC mutiert (Rollstein et al., 1991), sowie in einem breiten Spektrum von anderen Tumoren.
  • Das p53-Gen kodiert für ein 393-Aminosäurephosphorprotein, welches Komplexe mit Wirtsproteinen, wie z. B. großem T Antigen und E1B, bilden kann. Das Protein wird in normalen Geweben und Zellen gefunden, aber mit Konzentrationen, die im Vergleich zu transformierten Zellen oder Tumorgewebe winzig sind.
  • Wildtyp-p53 ist in vielen Zelltypen als ein wichtiger Wachstumsregulator und ein Signalübertragungsprotein bekannt. Missense-Mutationen sind für das p53-Gen üblich und sind essentiell für die Transformierungsfähigkeit des Onkogens. Eine einzelne genetische Veränderung, die durch Punktmutationen veranlasst wurde, kann karzinogenes p53 erzeugen. Im Gegensatz zu anderen Onkogenen ist von p53-Punktmutationen jedoch bekannt, dass sie in zumindest 30 unterschiedlichen Codons auftreten, wobei sie oftmals dominante Allele erzeugen, die ohne eine Reduktion der Homozygosität Verschiebungen im Zellphänotyp erzeugen. Zusätzlich scheinen viele dieser dominanten negativen Allele im Organismus toleriert zu werden und werden in der Keimbahn weiter gegeben. Verschiedene mutierte Allele scheinen von minimal dysfunktionalen bis stark penetranten, dominanten negativen Allelen zu rangieren (Weinberg, 1991).
  • Ein weiterer Inhibitor für Zellproliferation ist p16. Die Hauptübergänge des eukaryotischen Zellzykluses werden durch Cyclin-abhängige Kinasen oder CDKs hervorgerufen. Eine CDK, Cyclin-abhängige Kinase 4 (CDK4), reguliert die Progression durch G1. Es kann sein, dass die Aktivität dieses Enzyms Rb im der späten G1 phosphoryliert. Die Aktivität von CDK4 wird durch eine Aktivierungsuntereinheit kontrolliert, Cyclin vom D-Typ, sowie durch eine inhibitorische Untereinheit, das p16INK4, das biochemisch als ein Protein charakterisiert wurde, das spezifisch an CDK4 bindet und es inhibiert, und somit Retinoblastom-Protein(Rb)-Phosphorylierung regulieren kann (Serrano et al., 1993, Serrano et al. 1995). Da das p16INK4-Protein ein CDK4-Inhibitor ist (Serrano, 1993) kann Deletion dieses Gens die Aktivität von CDK4 erhöhen, was in einer Hyperphosphorylierung des Retinoblastom-Proteins resultiert. p16 ist auch dafür bekannt, die Funktion von CDK6 zu regulieren.
  • p16INK4 gehört zu einer neu beschriebenen Klasse von CDK-inhibitorischen Proteinen, die auch p16B, p19, p21WAF1 und p27KIP1 beinhalten. Das p16INK4-Gen bildet 9p21 ab, einen Chromosomenbereich, der häufig in vielen Tumorarten entfernt ist. Homozygote Deletionen und Mutationen des p16INK4-Gens sind in menschlichen Tumorzelllinien häufig. Diese Tatsache legt nahe, dass das p16INK4-Gen ein Tumorsuppressor-Gen ist. Diese Interpretation wurde jedoch durch die Beobachtung bezweifelt, dass die Häufigkeit von p16INK4-Genveränderungen in primären nicht kultivierten Tumoren sehr viel geringer als in kultivierten Zelllinen ist (Caldas et al., 1994, Cheng et al., 1994, Hussussian et al., 1994, Kamb et al., 1994, Kamb et al., 1994, Mori et al., 1994, Okamoto et al., 1994, Nobori et al., 1995, Orlow et al., 1994, Arap et al., 1995). Wiederherstellung der Wildtypp16INK4-Funktion durch Transfektion mit einem Plasmidexpressionsvektor reduziert die Koloniebildung durch einige menschlichen Krebszelllinien (Okamoto, 1994, Arap, 1995).
  • Andere Gene, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, beinhalten Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, MMAC1/PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, p27/p16-Fusionen und p21/p27-Fusionen.
  • B.2.f. Regulatoren für programmierten Zelltod
  • In gewissen Ausführungsformen wird in Erwägung gezogen, dass genetische Konstrukte, die im Gegensatz zu Wildtyp-HSV im Wachstum geschwächt sind, Apoptose eher stimulieren als blockieren und somit dazu verwendet werden, um den Tod von erkranktem oder unerwünschtem Gewebe voran zu treiben. Apoptose, oder programmierter Zelltod, ist ein essentieller Prozess für normale embryotische Entwicklung, was Homeostase in ausgewachsenen Geweben aufrecht erhält (Kerr et al., 1972). Von der Bcl-2-Familie von Proteinen und den ICE-ähnlichen Proteasen wurde gezeigt, dass sie in anderen Systemen wichtige Regulatoren und Effektoren für Apoptose sind. Das Bcl-2-Protein, das im Zusammenhang mit follikulärem Lymphom entdeckt wurde, spielt eine herausragende Rolle bei der Kontrolle von Apoptose und der Erhöhung des Überlebens von Zellen als Antwort auf diverse apoptotische Stimuli (Bakhshi et al., 1985, Cleary und Sklar, 1985, Cleary et al., 1986, Tsujimoto et al., 1985, Tsujimoto und Croce, 1986). Das evolutionär bewahrte Bcl-2-Protein ist nun dafür bekannt, ein Mitglied einer Familie von verwandten Proteinen zu sein, die als Todes-Agonisten oder Todes-Antagonisten eingeordnet werden, d. h. Apoptoseregulatoren.
  • Anschließend an diese Entdeckung wurde gezeigt, dass Bcl-2 wirkt, um Zelltod zu unterdrücken, der durch eine Vielzahl von Stimuli ausgelöst wird. Es ist nun auch offensichtlich, dass es eine Familie von Bcl-2-Zelltod-regulierenden Proteinen gibt, die gemeinsame Struktur- und Sequenzhomologien miteinander teilen. Von diesen anderen Familienmitgliedern wurde gezeigt, dass sie entweder ähnliche Funktionen wie Bcl-2 besitzen (z. B. BclXL, BclW, BclS, Mcl-1, A1, Bfl-1), oder den Bcl-2-Funktionen entgegen wirken und Zelltod beschleunigen (z. B. Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri). Wildtyp-HSV blockiert Apoptose durch eine Anzahl von Mechanismen, einschließlich der Modifizierung von proapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2-Familie von Proteinen.
  • B.3. Promotoren und Enhancer
  • Ein „Promotor" ist eine Kontrollsequenz, die ein Bereich einer Nukleinsäuresequenz ist, an welchem Initiierung und Geschwindigkeit der Transkription kontrolliert werden. Sie kann genetische Element enthalten, an die regulatorische Proteine und Moleküle binden können, wie zum Beispiel RNA-Polymerase und andere Transkriptionsfaktoren, um die spezifische Transkription einer Nukleinsäuresequenz zu initiieren. Die Ausdrücke „wirksam positioniert", „wirksam verbunden", „unter Kontrolle" und „unter transkriptionaler Kontrolle" bedeuten, dass ein Promotor in einer korrekten funktionellen Stellung und/oder Orientierung bezüglich einer Nukleinsäuresequenz ist, um Transkription dieser Sequenz zu kontrollieren.
  • Ein Promotor weist allgemein eine Sequenz auf, die so wirkt, dass die Startstelle für die RNA-Synthese in Position gebracht wird. Das am besten bekannte Beispiel dafür ist die TATA-Box, aber bei einigen Promotorn, denen eine TATA-Box fehlt, so wie zum Beispiel dem Promotor für terminales Deoxynukleotidyl-Transfereasegen bei Säugetieren und dem Promotor für die späten SV40-Gene, hilft ein diskretes Element, welches die Startstelle selbst überdeckt dabei, die Stelle der Initiierung festzulegen. Zusätzliche Promotor-Elemente regulieren die Häufigkeit der transkriptionalen Initiierung. Typischerweise sind diese in dem Bereich 30–110 bp stromaufwärts der Startstelle lokalisiert, obwohl von einer Anzahl von Promotorn gezeigt wurde, dass sie auch funktionale Elemente stromabwärts der Startstelle enthalten. Um eine Codierungssequenz „unter die Kontrolle" eines Promotors zu bringen, positioniert man das 5'-Ende der Transkriptionsinitiierungsstelle „stromabwärts" (d. h. 3') vom gewählten Promotor. Der „stromaufwärts"-Promotor stimuliert die Transkription der DNA und beschleunigt die Expression der codierten RNA.
  • Der Abstand zwischen Promotorelementen ist häufig flexibel, so dass Promotorfunktion gewahrt wird, wenn Elemente invertiert oder relativ zueinander bewegt werden. Im tk-Promotor kann der Abstand zwischen Promotorelementen auf 50 bp voneinander entfernt erhöht werden, bevor die Aktivität zu fallen beginnt. Abhängig vom Promotor scheint es, dass individuelle Elemente entweder kooperativ oder unabhängig voneinander funktionieren können, um die Transkription zu aktivieren. Ein Promotor kann zusammen mit einem „Enhancer" verwendet werden, was eine cis-wirkende regulatorische Sequenz bezeichnet, die bei der transkriptionalen Aktivierung einer Nukleinsäuresequenz involviert ist, oder auch nicht.
  • Ein Promotor kann ein solcher sein, der natürlich mit einer Nukleinsäuresequenz assoziiert ist, so wie er durch Isolation der 5'-nicht-codierenden Sequenzen erhalten werden kann, die sich stromaufwärts des codierenden Segments und/oder Exons befinden. Ein solcher Promotor wird als „endogen" bezeichnet. Ähnlich kann ein Enhancer ein solcher sein, der natürlich mit einer Nukleinsäuresequenz assoziiert ist, die sich entweder stromabwärts oder stromaufwärts dieser Sequenz befindet. Alternativ werden gewisse Vorteile erreicht, indem das codierende Nukleinsäuresegment unter der Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promotors positioniert wird, was sich auf einen Promotor bezieht, der normalerweise nicht mit einer Nukleinsäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung assoziiert ist. Ein rekombinanter oder heterologer Enhancer betrifft ebenfalls einen Enhancer, der normalerweise nicht mit einer Nukleinsäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung assoziiert ist. Solche Promotoren oder Enhancer können Promotoren oder Enhancer von anderen Genen und Promotoren oder Enhancer, die aus irgendeinem anderen Virus oder prokaryotischer oder eukaryotischer Zelle isoliert wurden, und Promotoren oder Enhancer, die nicht „natürlich auftreten", beinhalten, d. h. andere Elemente oder andere transkriptionale regulatorische Bereiche, Konsensus-Sequenzen und/oder Mutationen enthalten, welche die Expression verändern. Zum Beispiel beinhalten prokaryotische Promotoren, die am häufigsten in rekombinanten DNA-Konstruktionen gebraucht werden, die β-Lactamase-(Penicillinase), Lactose- und Typtophan(trp)-Promotorsysteme.
  • Bevorzugte Promotoren und andere Expressionskontrollelemente, wie zum Beispiel Enhancer, Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungssignale, Terminatoren, Ribosom-Bindungsstellen und Ähnliches (siehe unten), sind eukaryotische Elemente, die in Vaskularzellen funktional sind. Zusätzlich zur synthetischen Herstellung von Nukleinsäuresequenzen von Promotoren und Enhancern können Sequenzen hergestellt werden unter Verwendung von rekombinanter Klonierung und/oder Nukleinsäureverstärkungstechnologie, einschließlich PCRTM, im Zusammenhang mit den hier offenbarten Zusammensetzungen (siehe US-Patent Nrn. 4 683 202 und 5 928 906 ). Darüber hinaus wird angenommen, dass die Kontrollsequenzen, welche Transkription und/oder Expression von Sequenzen innerhalb von nicht-nukleären Organellen, wie zum Beispiel Mitochondrien, Chloroplasten und Ähnlichem, steuern, ebenfalls eingesetzt werden können.
  • Natürlich wird es wichtig sein, einen Promotor und/oder Enhancer einzusetzen, der wirksam die Expression des DNA-Segments in der Organelle, dem Zelltyp, dem Gewebe, Organ oder Organismus, der für die Expression gewählt wurde, steuert. Der Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie kennt allgemein die Verwendung von Promotorn, Enhancern und Zelltypkombinationen für die Proteinexpression (siehe zum Beispiel Sambrook et al. 1989). Die eingesetzten Promotoren können grundlegend, gewebespezifisch, induzierbar und/oder geeignet unter den entsprechenden Bedingungen sein, um hochwertige Expression des eingebrachten DNA-Segments zu steuern, so wie es zum Beispiel bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen und/oder Peptiden im großen Maßstab vorteilhaft ist. Der Promotor kann heterolog oder endogen sein.
  • In einigen Ausführungsformen ist der Promotor grundlegend. In anderen Ausführungsformen ist der Promotor gewebespezifisch. In besonderen Gesichtspunkten ist der Promotor gefäß- oder gewebespezifisch. Die Identität des gewebespezifischen Promotors oder anderer Elemente, sowie Assays, um ihre Aktivität zu charakterisieren, sind dem Fachmann wohl bekannt. Nicht einschränkende Beispiele von solchen Elementen, die in eukaryotischen Zellen geeignet sind (z. B. Säugetierzellen), beinhalten den SM22-Genbeschleuniger (Kuhbandner et al., 2000), humanes LIMK2-Gen (Nomoto et al. 1999), das Somatostatin-Rezeptor-2-Gen (Kraus et al., 1998), murinepididymales retinotisches säurebindendes Gen (Lareyre et al., 1999), humanes CD4 (Zhao-Emonet et al., 1998), Mause-alpha 2 (XI)-Kollagen (Tsumaki et al., 1998), D1A-Dopaminrezeptor-Gen (Lee et al., 1997), insulinähnlichen Wachstumsfaktor II (Wu et al., 1997) und humanes Plättchenendothel-Zell-Adhäsionsmolekül-1 (Almendro et al., 1996).
  • Zusätzlich kann jede Promotor/Enhancer-Kombination (zum Beispiel die eukaryotische Promotor-Datenbasis EPDB, abgerufen über das Internet) ebenfalls verwendet werden, um die Expression voranzutreiben. Verwendung eines T3-, T7- oder SP6-cytoplasmatischen Expressionssystems ist eine weitere mögliche Ausführungsform. Eukaryotische Zellen können cytoplasmatische Transkription von gewissen bakteriellen Promotoren unterstützen, wenn die geeignete bakterielle Polymerase zur Verfügung gestellt wird, entweder als ein Teil des liefernden Komplexes oder als ein Teil eines zusätzlichen genetischen Expressionskonstrukts.
  • Tabelle 4 listet nicht-einschränkende Beispiele von Elementen/Promotoren auf, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um die Expression eines Gens zu regulieren. Tabelle 5 stellt nicht-einschränkende Beispiele von induzierbaren Elementen zur Verfügung, die Bereiche einer Nukleinsäuresequenz sind, die als Antwort auf einen spezifischen Stimulus aktiviert werden können.
    TABELLE 4 Promotor und/oder Enhancer
    Promotor/Enhancer Referenzen
    Schwere Immunoglobulinkette Banerji et al., Cell 35: 729, 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et al., 1990
    Leichte Immunoglobulinkette Queen et al., 1983; Picard et al., 1984
    T-Zellen-Rezeptor Luria et al., 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al., 1990
    HLA DQ a und/oder DQ β Sullivan et al., 1987
    β-Interferon Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn et al., 1988
    Interleukin-2 Greene et al., 1989
    Interleukin-2-Rezeptor Greene et al., 1989; Lin et al., 1990
    MHC Klasse II 5 Koch et al., 1989
    MHC Klasse II HLA-Dra Sherman et al., 1989
    β-Actin Kawamoto et al., 1988; Ng et al., 1989
    Muskelkreatinkinase (MCK) Jaynes et al., 1988; Horlick et al., 1989; Johnson et al., 1989
    Prealbumin (Transthyretin) Costa et al., 1988
    Elastase I Omitz et al., 1987
    Metallothionein (MTII) Karin et al., 1987; Culotta et al., 1989
    Kollagenase Pinkert et al., 1987; Angel et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2256, 1987]
    Albumin Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989, 1990
    α-Fetoprotein Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989
    γ-Globin Bodine et al., 1987; Perez-Stable et al., 1990
    β-Globin Trudel et al., 1987
    c-fos Cohen et al., 1987
    d-HA-ras Triesmann, 1986; Deschamps et al., 1985
    Insulin Edlund et al., 1985
    Neurales Zelladhäsionsmolekül (NCAM) Hirsh et al., 1990
    α1-Antitrypsin Latimer et al., 1990
    H2B (TH2B)-Histon Hwang et al., 1990
    Mause- und/oder Typ I-Kollagen Ripe et al., 1989
    Glucoseregulierte Proteine (GRP94 und GRP78) Chang et al., 1989
    Rattenwachstumshormon Larsen et al., 1986
    Menschliches Serum-Amyloid A (SAA) Edbrooke et al., 1989
    Troponin I (TN I) Yutzey et al., 1989
    Von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) Pech et al., 1989
    Duchenne-Muskeldystrophie Klamut et al., 1990,
    SV40 Banerji et al., Cell 27: 299, 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffner et al., 1988
    Poyloma Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell und/oder Villarreal, 1988
    Retroviren Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Chol et al., 1988; Reisman et al., 1989
    Papillomavirus Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos und/oder Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens et al., 1987; Glue et al., 1988
    Hepatitis B-Virus Bulla et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988
    Humaner Immundefekt-Virus Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., Cell 59: 273, 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989
    Cytomegalovirus (CMV) Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986
    Gibbonaffen-Leukämie-Virus Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989
    TABELLE 5 Induzierbare Elemente
    Element Induktor Referenzen
    MT II Phorbolester (TFA) Schwermetalle Palmiter et al., 1982; Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987; Karin et al., 1987; Angel et al., Cell 49: 729, 1987; McNeall et al., 1989
    MMTV (Mäusebrusttumorvirus) Glucokortikoide Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Ponta et al., 1985; Sakai et al., 1988
    β-Inteferon Poly(rI)x Poly(rc) Tavernier et al., 1983
    Adenovirus 5 E2 E1A Imperiale et al., 1984
    Kollagenase Phorbolester (TPA) Angel et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2256, 1987
    Stromelysin Phorbolester (TPA) Angel et al., Cell 49: 729, 1987
    SV40 Phorbolester (TPA) Angel et al., Cell 49: 729, 1987
    Murin MX-Gen Interferon, Newcastle-Krankheits-Virus Hug et al., 1988
    GRP78-Gen A23187 Resendez et al., 1988
    α-2-Makroglobulin IL-6 Kunz et al., 1989
    Vimentin Serum Rittling et al., 1989
    MHC Klasse I Gen H-2Kb Interferon Blanar et al., 1989
    HSP70 E1A, SV40 großes T-Antigen Taylor et al., 1989, 1990a, 1990b
    Proliferin Phorbolester-TPA Mordacq et al., 1989
    Tumornekrosefaktor α PMA Hensel et al., 1989
    Thyroid stimulierendes Hormon α-Gen Thyroidhormon Chatterjee et al., 1989
  • B.4. Initiierungssignale und interne Ribosom-Bindungsstellen
  • Ein spezifisches Initiierungssignal kann auch für wirksame Translation der Codierungssequenzen erforderlich sein. Diese Signale beinhalten das ATG-Startcodon oder benachbarte Sequenzen. Es kann notwendig sein, dass exogene translationale Kontrollsignale, einschließlich des ATG-Startcodons, zur Verfügung gestellt werden müssen. Der Fachmann wird leicht dazu fähig sein, dies zu bestimmen und die notwendigen Signale zur Verfügung zu stellen. Es ist wohl bekannt, dass das Startcodon „in-frame" mit dem Leserahmen der gewünschten codierenden Sequenz sein muss, um Translation des vollständigen Inserts sicherzustellen. Die exogenen translationalen Kontrollsignale und Startcodons können entweder natürlich oder synthetisch sein.
  • In gewissen erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird die Verwendung von internen Ribosomeintrittstellen (IRES)-Elementen dazu verwendet, um multigene oder polycistronische Botschaften zu erzeugen. IRES-Elemente sind dazu fähig, das Ribosomabtastmodell der 5'-methylierten Cap-abhängigen Translation zu umgehen und die Translation an internen Stellen zu beginnen (Pelletier und Sonenberg, 1988). IRES-Elemente von zwei Mitgliedern der Picornavirusfamilie (Polio und Encephalomyocarditis) wurden beschrieben (Pelletier und Sonenberg, 1988), sowie ein IRES aus einer Säugetiermessage (Macejak und Sarnow, 1991). IRES-Elemente können mit heterologen offenen Leserahmen verknüpft sein. Mehrere offene Leserahmen können zusammen transkribiert werden, jeweils durch ein IRES getrennt, was polycistronische Messages erzeugt. Mittels des IRES-Elements kann jeder offene Leserahmen für Ribosomen zur wirksamen Translation zugänglich sein. Mehrere Gene können wirksam unter Verwendung eines einzelnen Promotors/Enhancers exprimiert werden, um eine einzelne Nachricht zu transkribieren (siehe US-Patent Nrn. 5 925 565 und 5 935 819 ).
  • B.5. Multiple Cloning Sites
  • Vektoren können eine multiple cloning site (MCS) beinhalten, die ein Nukleinsäurebereich ist, der mehrere Schnittstellen für ein Restriktionsenzym enthält, von denen jede im Zusammenhang mit rekombinanter Standard-Technologie verwendet werden kann, um den Vektor zu verdauen (siehe zum Beispiel Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998 und Cocea, 1997). „Restriktionsenzymverdau" betrifft katalytische Spaltung eines Nukleinsäuremoleküls mit einer Typ II-Restriktionsendonuklease, die lediglich an spezifischen Stellen in einem Nukleinsäuremolekül funktioniert. Viele von diesen Restriktionsenzymen sind kommerziell erhältlich. Die Verwendung von solchen Enzymen ist vom Fachmann weitgehend verstanden. Häufig wird unter Verwendung eines Restriktionsenzyms, welches innerhalb des MCS schneidet, ein Vektor linearisiert oder fragmentiert, um zu ermöglichen, dass exogene Sequenzen an den Vektor ligiert werden. „Ligation" betrifft den Prozess der Bildung von Phosphordiesterbindungen zwischen zwei Nukleinsäurefragmenten. Techniken, die Restriktionsenzyme und Ligationsreaktionen beinhalten, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Rekombinationstechnologie wohl bekannt.
  • B.6. Spleißstellen
  • Die meisten transkribierten eukaryotischen RNA-Moleküle unterliegen RNA-Spleißung, um Introns von den primären Transkripten zu entfernen. Da HSV die RNA-Spleißung blockiert, sind cDNAs die bevorzugte Form von eukaryotischem Insert in den Vektor, obwohl genomische Sequenzen, die richtig exprimierbar sind (z. B. Intron-frei) ebenfalls betrachtet werden. Vektoren, denen die Fähigkeit zur RNA-Spleißblockierung von Wildtyp-HSV fehlt, können dennoch Donor- und/oder Akzeptorspleißstellen erfordern, um korrekte Prozessierung des Transkripts für die Proteinexpression sicherzustellen (siehe zum Beispiel Chandler et al., 1997).
  • B.7. Terminationssignale
  • Die Vektoren oder Konstrukte der vorliegenden Erfindung weisen allgemein zumindest ein Terminationssignal auf. Ein „Terminationssignal" oder „Terminator" weist die DNA-Sequenzen auf, die in spezifischer Termination eines RNA-Transkripts durch eine RNA-Polymerase involviert sind. Somit wird in gewissen Ausführungsformen ein Terminationssignal, welches die Herstellung eines RNA-Transkripts beendet, betrachtet. Ein Terminator kann in vivo notwendig sein, um gewünschte Messagelevel zu erreichen.
  • In eukaryotischen Systemen kann der Terminatorbereich auch spezifische DNA-Sequenzen aufweisen, die stellenspezifische Spaltung des neuen Transkripts erlauben, um eine Polyadenylierungsstelle freizulegen. Dies signalisiert einer spezialisierten endogenen Polymerase, einen Strang von etwa 200 A Resten (PolyA) an das 3'-Ende des Transkripts anzufügen. RNA-Moleküle, die mit diesem PolyA-Schwanz modifiziert sind, scheinen stabiler zu sein und werden wirksamer translatiert. Somit ist es in anderen Ausführungsformen, bei denen Eukaryoten beteiligt sind bevorzugt, dass der Terminator ein Signal für die Abspaltung der RNA aufweist, und es ist stärker bevorzugt, dass das Terminatorsignal Polyadenylierung der Nachricht beschleunigt. Die Terminator- und/oder Polyadenylierungsstellenelemente können dazu dienen, um die Messagelevel zu erhöhen und das Darüberhinauslesen über einer Kassette, enthaltend eine heterologe Nukleinsäure, in andere Sequenzen zu minimieren.
  • Terminatoren, die für die Verwendung in der Erfindung betrachtet werden, beinhalten irgendeinen bekannten Terminator zur hier beschriebenen Transkription oder der dem Fachmann bekannt ist, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, die Terminationssequenzen von Genen, so wie zum Beispiel den bovinen Wachstumsfaktor-Terminator oder virale Terminationssequenzen, wie zum Beispiel den SV40-Terminator. In gewissen Ausführungsformen kann die Termination auf einem Mangel an transkribierbarer oder translatierbarer Sequenz beruhen, wie zum Beispiel auf einer Sequenzverkürzung.
  • B.8. Polyadenylierungssignale
  • Bei der Expression, insbesondere eukaryotischer Expression, wird man typischerweise ein Polyadenylierungssignal einschließen, um saubere Polyadenylierung des Transkripts zu bewirken. Die Art des Polyadenylierungssignals wird als nicht kritisch angesehen für die erfolgreiche Durchführung der Erfindung und jede solche Sequenz kann eingesetzt werden. Bevorzugte Ausführungsformen beinhalten das SV40-Polyadenylierungssignal oder bovines Wachstumshormon-Polyadenylierungssignal, die bequem und dafür bekannt sind, gut in verschiedenen Zielzellen zu funktionieren. Polyadenylierung kann die Stabilität des Transkripts erhöhen oder cytoplasmatischen Transport ermöglichen.
  • B.9. Ausgangspunkte der Replikation
  • Um einen Vektor in einer Wirtszelle zu vermehren, kann der Vektor einen oder mehrere Origins von Replikationsstellen (oftmals „Ori" genannt) enthalten, was eine spezifische Nukleinsäuresequenz ist, an der die Replikation initiiert wird. Alternativ wird eine autonom replizierende Sequenz (ARS) eingesetzt, wenn die Wirtszelle Hefe ist.
  • B.10. Selektierbare und screenbare Marker
  • In gewissen erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Zellen, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsaurekonstrukt enthalten, in vitro oder in vivo identifiziert werden, indem ein Marker in den Expressionsvektor eingeschlossen wird. Solche Marker verleihen der Zelle eine identifizierbare phenotypische Änderung, die leichte Identifikation von Zellen erlaubt, welche den Expressionsvektor enthalten. Zum Beispiel kann ein screenbarer Marker (z. B. β-Galactosidase) verwendet werden, um transformierte Zellen zu identifizieren.
  • Allgemein ist ein screenbarer Marker ein solcher, der eine Eigenschaft verleiht, die selektive Überwachung erlaubt. Ein positiv selektierbarer Marker ist einer, in welchem die Gegenwart des Markers das Überleben unter gewissen bekannten Bedingungen ermöglicht (z. B. antibiotischer Herausforderung), während ein negativ selektierbarer Marker einer ist, bei dem seine Gegenwart das Überleben verhindert. Ein Beispiel für einen positiv selektierbaren Marker ist ein Arzneimittel (z. B. ein antibiotischer)-Resistenzmarker.
  • Üblicherweise hilft das Einbringen eines Arzneimittelselektionsmarkers bei der Klonierung und Identifizierung von Transformanten. Zum Beispiel sind Gene, die Resistenz gegen Neomycin, Puromycin, Hygromycin, DHFR, GPT, Zeocin und Histidinol verleihen, geeignete selektierbare Marker. Zusätzlich zu Marker, die einen Phenotyp übertragen, der die Unterscheidung von Transformanten basierend auf der Implementierung von Bedingungen ermöglicht, werden andere Arten von Marker, einschließlich screenbaren Marker, wie zum Beispiel GFP, dessen Basis colorimetrische Analyse ist, ebenfalls betrachtet. Alternativ können screenbare Enzyme, wie zum Beispiel Herpes Simlex-Virus-Thymidinkinase (tk) oder Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), ebenfalls verwendet werden. Der Fachmann wird auch wissen, wie immunologische Marker, möglicherweise im Zusammenhang mit FACS-Analyse, eingesetzt werden. Es wird nicht angenommen, dass der Marker wichtig ist, solange er dazu fähig ist, gleichzeitig mit der heterologen Nukleinsäure, welche ein Genprodukt codiert, exprimiert zu werden. Weitere Beispiele von selektierbaren und screenbaren Markern sind dem Fachmann wohl bekannt.
  • C. VEKTORLIEFERUNG UND ZELLTRANSFORMATION
  • Von geeigneten Verfahren für Nukleinsäurelieferung zur Transformation einer Organelle, einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismuses zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung wird angenommen, dass sie nahezu jedes Verfahren beinhalten, durch welches ein Herpes Simplex-Virusvektor in eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus eingebracht werden kann, so wie hier beschrieben, oder wie es einem Fachmann bekannt ist. Solche Verfahren beinhalten, sind aber nicht eingeschränkt auf, direkte Lieferung einer Nukleinsäure, wie zum Beispiel durch ex vivo-Transfektion (Wilson et al., 1989, Nabel et al., 1989), Injektion ( US-Patent Nrn. 5 994 624 , 5 981 274, 5 945 100 , 5 780 448 , 5 736 524 , 5 702 32 , 5 656 610 , 5 589 466 und 5 580 859 ), einschließlich Mikroinjektion (Harlan und Weintraub, 1985, US-Patent Nr. 5 789 215 ), durch Elektroporation ( US-Patent Nr. 5 384 253 , Tur-Kaspa et al., 1986, Potter et al., 1984), durch Kalziumphosphatfällung (Graham und Van der Eb, 1973, Chen und Okayama, 1987, Rippe et al., 1990), unter Verwendung von DEAE-Dextran, gefolgt von Polyethylenglykol (Gopal, 1985) durch direkte Beschallung (Fechheimer et al., 1987), durch Liposom-vermittelte Transfektion (Nicolau und Sene, 1982, Fraley et al., 1979, Nicolau et al., 1987, Wong er al., 1980, Kaneda et al., 1989, Kato et al., 1991), sowie Rezeptor-vermittelte Transfektion (Wu und Wu, 1987, Wu und Wu, 1988), durch Mikroprojektilbombardement (PCT-Patentanmeldung Veröffentlichungsnrn. WO 94/09699 und 95/06128 , US-Patent Nrn. 5 610 042 , 5 322 783 , 5 563 055 , 5 550 318 , 5 538 877 und 5 538 880 ), sowie jede Kombination von solchen Verfahren. Durch die Anwendung von Techniken wie diesen können Organelle(n), Zelle(n), Gewebe oder Organismus (Organismen) stabil oder transient transformiert werden.
  • C.1. Ex vivo-Transformation
  • Verfahren zur Transfektion von Vaskularzellen und Geweben, die aus einem Organismus in einer ex vivo-Anordnung entfernt wurden, sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel wurden Hundeendothelzellen genetisch durch retroviralen Gentransfer in vitro genetisch verändert und in einen Hund transplantiert (Wilson et al., 1989). In einem anderen Beispiel wurden Yucatan-Minischwein-Endothelzellen mit einem Retrovirus in vitro transfiziert und unter Verwendung eines doppelten Ballonkatheters in eine Arterie transplantiert (Nabel et al., 1989). Somit wird angenommen, dass Zellen oder Gewebe entfernt und ex vivo unter Verwendung eines Herpes-Virusvektors gemäß vorliegender Erfindung transfiziert werden können. In speziellen Gesichtspunkten können die transplantierten Zellen oder Gewebe in einen Organismus eingebracht werden. In bevorzugten Aspekten wird eine therapeutische Nukleinsäure in den transplantierten Zellen oder Geweben exprimiert.
  • C.2. Injektion
  • In gewissen Ausführungsformen kann eine Nukleinsäure in eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus über eine oder mehrere Injektionen (z. B. eine Nadelinjektion), so wie zum Beispiel subkutan, intradermal, intramuskulär, intravenös, intraperitoneal und Ähnliches, geliefert werden. Verfahren zur Injektion sind dem Fachmann wohl bekannt (z. B. Injektion einer Zusammensetzung, aufweisend eine Kochsalzlösung) und zusätzliche Beispiele sind hier beschrieben.
  • C.3. Liposom-vermittelte Transfektion
  • In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann eine Nukleinsäure in einem Lipidkomplex, so wie zum Beispiel einem Liposom, eingefangen sein. Liposome sind Vesikularstrukturen, charakterisiert durch eine Phosphorlipid-Doppelschichtmembran und ein inneres wässriges Medium. Multilamellare Liposomen haben mehrere Lipidschichten, die durch wässriges Medium getrennt sind. Sie bilden sich spontan, wenn Phosphorlipide in einem Überschuss einer wässrigen Lösung suspendiert werden. Die Lipidkomponenten unterliegen vor der Bildung von geschlossenen Strukturen einer Selbstneuanordnung und schließen Wasser und gelöste Stoffe zwischen die Lipiddoppelschichten ein (Gosh und Bachhawat, 1991). Ebenfalls betrachtet wird eine Nukleinsäure, die mit Lipofectamin (Gibco BRL) oder Superfect (Quiagen) komplexiert ist.
  • Liposom-vermittelte Nukleinsäurelieferung und -expression von fremder DNA in vitro ist sehr erfolgreich gewesen (Nicolau und Sene, 1982, Fraley et al., 1979, Nicolau et al., 1987). Die Machbarkeit von Liposom-vermittelter Lieferung und Expression von fremder DNA in kultivierten Hühnerembryo-, HeLa- und Hepatom-Zellen wurde ebenfalls gezeigt (Wong et al., 1908).
  • In gewissen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann ein Liposom mit einem Parainfluenzavirus I (hemagglutinating virus) (HVJ) komplexiert werden. Es wurde gezeigt, dass dies die Fusion mit der Zellmembran vereinfacht und den Eintritt von Liposom-verkapselter DNA in die Zelle beschleunigt (Kaneda et al., 1989). In anderen Ausführungsformen kann ein Liposom komplexiert oder im Zusammenhang mit nukleären nicht-histonen Chromosomal-Proteinen eingesetzt werden (HMG-1) (Kato et al., 1991). In noch weiteren Ausführungsformen kann ein Liposom komplexiert oder im Zusammenhang mit sowohl HVJ als auch HMG-1 eingesetzt werden. In anderen Ausführungsformen kann ein Liefervehikel einen Liganden und ein Liposom aufweisen. Ein bevorzugtes Liefervehikel weist ein Liposom und einen Liganden auf, der selektiv oder stärker bevorzugt spezifisch für einen vaskulären zellspezifischen Bindungspartner, wie zum Beispiel einen Rezeptor, ist.
  • C.4. Rezeptor-vermittelte Transfektion
  • Noch weiter kann eine Nukleinsäure durch Rezeptor-vermittelte Liefervehikel in eine Zielzelle geliefert werden. Dies zieht einen Vorteil aus der selektiven Aufnahme von Makromolekülen durch Rezeptor-vermittelte Endocytose, die in einer Zielzelle auftreten wird. Im Hinblick auf die Zelltypen-spezifische Verteilung von verschiedenen Rezeptoren fügt dieses Lieferungsverfahren einen weiteren Grad von Spezifität zur vorliegenden Erfindung hinzu.
  • Gewisse Rezeptor-vermittelte auf Gene ziehlende Vehikel weisen einen Zellrezeptorspezifischen Liganden und ein Nukleinsäurebindemittel auf. Andere weisen einen Zellrezeptor-spezifischen Liganden auf, an den die Nukleinsäure, die geliefert werden soll, wirksam angeheftet ist. Einige Liganden wurden für Rezeptor-vermittelten Gentransfer verwendet (Wu und Wu, 19987, Wagner et al., 1990, Perales et al., 1994, Myers, EPO 0273085 ), was die Durchführbarkeit der Technik untermauert. Spezifische Lieferung im Zusammenhang mit einem weiteren Säugetierzelltyp wurde beschrieben (Wu und Wu, 1993). In gewissen erfindungsgemäßen Gesichtspunkten wird ein Ligand ausgewählt, um mit einem Rezeptor zu korrespondieren, der spezifisch auf der Zielzellpopulation exprimiert wird.
  • In anderen Ausführungsformen kann eine Nukleinsäure-Liefervehikelkomponente eines zellspezifischen, auf eine Nukleinsäure zielenden Vehikels einen spezifischen Bindungsliganden in Kombination mit einem Liposom, wie oben beschrieben, aufweisen. Die zu liefernde(n) Nukleinsäure(n) sind innerhalb des Liposoms untergebracht und der spezifische Bindungsligand ist funktionell in die Liposommembran eingebaut. Das Liposom wird somit spezifisch an den (die) Rezeptor(en) einer Zielzelle binden und den Inhalt in eine Zelle liefern. Von solchen Systemen wurde gezeigt, dass sie unter Verwendung von Systemen funktionieren, bei denen z. B. epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) bei der Rezeptor-vermittelten Lieferung einer Nukleinsäure in Zellen verwendet wird, die eine Aufregulierung des EGF-Rezeptors zeigen.
  • In noch weiteren Ausführungsformen ist das Nukleinsäureliefervehikel ein Liposom selbst, welches vorzugsweise ein oder mehrere Lipide oder Glycoproteine aufweist, die eine zellspezifische Bindung lenken. Zum Beispiel wurde Lactosyl-Ceramid, ein Galactoseterminales Asialgangliosid, in Liposome eingebaut und es wurde beobachtet, dass dies in einem Anstieg bei der Aufnahme des Insulingens durch Hepatozyten resultiert (Nicolau et al., 1987). Es wird angenommen, dass die gewebespezifischen Transformierungskonstrukte der vorliegenden Erfindung in einer ähnlichen Art und Weise spezifisch in eine Zielzelle geliefert werden.
  • D. WIRTSZELLEN
  • So wie hier verwendet können die Bezeichnungen „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" austauschbar verwendet werden. Alle diese Bezeichnungen beinhalten auch ihre Nachkommen, was alles und alle nachfolgenden Generationen betrifft. Es soll verstanden werden, dass alle Nachkommen aufgrund von absichtlichen oder versehentlichen Mutationen nicht identisch sein müssen. Im Zusammenhang mit der Expression einer heterologen Nukleinsäuresequenz betrifft „Wirtszelle" eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle (bevorzugt, wobei Vaskularzellen besonders bevorzugt sind) und es beinhaltet jeden transformierbaren Organismus, der dazu fähig ist, einen Vektor zu replizieren und/oder eine heterologe Nukleinsäure, die durch einen Vektor codiert ist, zu exprimieren. Eine Wirtszelle kann und wurde als ein Empfänger für Vektoren verwendet. Eine Wirtszelle kann „infiziert", „transfiziert" oder „transformiert" werden, was einen Prozess betrifft, bei dem exogene Nukleinsäure übertragen oder in die Wirtszelle eingebracht wird. Eine transformierte Zelle schließt die primäre Subjektzelle und ihre Nachkommenschaft ein. So wie hier verwendet sind die Bezeichnungen „manipulierte" und „rekombinante" Zellen oder Wirtszellen dazu gedacht, eine Zelle zu betreffen, in die eine exogene Nukleinsäuresequenz, wie zum Beispiel ein Vektor, eingebracht wurde. Daher sind rekombinante Zellen von natürlich auftretenden Zellen unterscheidbar, die nicht eine zugewanderte eingebrachte Nukleinsäure enthalten.
  • Einige Vektoren können Kontrollsequenzen verwenden, die es ermöglichen, dass er entweder oder sowohl als auch in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen repliziert und/oder exprimiert wird. Ein Fachmann wird weiterhin die Bedingungen verstehen, unter denen alle die oben beschriebenen Wirtszellen inkubiert werden müssen, um sie zu erhalten und Replikation eines Vektors zu erlauben (z. B. eines erfindungsgemäßen Herpes-Virusvektor). Ebenfalls verstanden und bekannt sind Techniken und Bedingungen, die Herstellung von Vektoren in großem Maßstab ermöglichen, ebenso wie Herstellung der Nukleinsäuren, die durch Vektoren codiert werden und ihre verwandten Polypeptide, Proteine oder Peptide.
  • Eine Vielzahl von Zelllinien und Kulturen sind für die Verwendung als eine Wirtszelle verfügbar und sie können über die American Type Culture Collection (ATCC) erhalten werden. Ein geeigneter Wirt kann von einem Fachmann basierend auf dem Vektorrückgrat (d. h. dem Träger) und dem gewünschten Ergebnis bestimmt werden. Beispiele von eukaryotischen Wirtszellen zur Replikation und/oder Expression eines Vektors beinhalten, sind aber nicht eingeschränkt auf Hela, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos, sowie PC12-Zellen. Viele Wirtszellen verschiedener Zelltypen und Organismen sind verfügbar und dem Fachmann bekannt.
  • In gewissen Ausführungsformen wird in Erwägung gezogen, dass RNAs oder proteinöse Sequenzen mit oder ohne ausgewählte RNAs oder proteinöse Sequenzen in der gleichen Wirtszelle coexprimiert werden können. Coexpression kann durch CoTransfektion der Wirtszelle mit zwei oder mehr verschiedenen rekombinanten Vektoren erreicht werden.
  • Alternativ kann ein einzelner rekombinanter Vektor konstruiert werden, so dass er mehrere unterschiedliche Kodierungsbereiche für RNAs beinhaltet, die dann in Wirtzellen exprimiert werden können, die mit dem einzelnen Vektor transfiziert wurden.
  • Ein Gewebe kann eine Wirtszelle oder Zellen aufweisen, die mit einem Vektor gemäß vorliegender Erfindung transformiert werden sollen. Dieses Gewebe kann ein Teil von oder abgetrennt (z. B. durch Chirurgie) von einem Organismus sein. In gewissen Gesichtspunkten können Zellen oder ein Gewebe von einem Wirt entfernt, mit einem Vektor und/oder einem Mittel in Kontakt gebracht und dann in das Gewebe oder den Organismus reimplantiert werden, wobei Spezifität im Vektortargeting von Wirtszellen durch mechanische Mittel, wie zum Beispiel chirurgischen Eingriff, erreicht wird. In gewissen Ausführungsformen kann ein Gewebe Adipozyten, Alveolar, Ameloplasten, Axon-, Basalzellen, Blut- (z. B. Lymphozyten), Blutgefäß-, Knochen-, Knochenmark-, Hirn-, Brust-, Knorpel-, Zervix-, Colon-, Hornhaut-, embryotische, Endometrium-, Endothel-, Epithel-, Speiseröhren-, Gesichts-, Fibroplast-, Follikular-, Ganglionzellen, Glialzellen, Becherzellen, Nieren-, Leber-, Lungen-, Lymphknoten-, Muskel-, Neuron-, Eierstock-, Bauspeicheldrüsen-, periphere Blut-, Prostata-, Haut-, Haut-, Dünndarm-, Milz-, Stammzellen, Magen-, Hodenzellen und alle Krebsarten davon aufweisen, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
  • Die ausgedehnte Dauer der Expression einer Nukleinsäure, die in einem Herpes-Virusvektor gemäß vorliegender Erfindung enthalten ist, in einem vaskulären oder einem kardiovaskulären Gewebe ist ein vorteilhafter Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung. In besonderen Ausführungsformen weist ein vaskuläres oder kardiovaskuläres Gewebe Endothelzellen, glatte Muskelzellen oder Adventitialzellen auf. In besonderen Gesichtspunkten kann ein Vektor gemäß vorliegender Erfindung in einem, zwei, drei oder mehr vaskulären oder kardiovaskulären Zelltypen (z. B. Endothelzellen, glatten Muskelzellen oder Adventitialzellen), sowie in jede Kombination von Zelltypen exprimiert werden. In gewissen Ausführungsformen kann eine heterologe Nukleinsäuresequenz in einem vaskulären oder kardiovaskulären Gewebe oder Zelltyp für eine Zeit exprimiert werden, die größer ist oder gleich als etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9, etwa 10, etwa 11, etwa 12, etwa 13, etwa 14, etwa 15, etwa 16, etwa 17, etwa 18, etwa 19, etwa 20, etwa 21, etwa 22, etwa 23, etwa 24, etwa 25, etwa 26, etwa 27, etwa 28, etwa 29, etwa 30, etwa 31, etwa 32, etwa 33, etwa 34, etwa 35, etwa 36, etwa 37, etwa 38, etwa 39, etwa 40, etwa 41, etwa 42, etwa 43, etwa 44, etwa 45, etwa 46, etwa 47, etwa 48, etwa 49, etwa 50, etwa 51, etwa 52, etwa 53, etwa 54, etwa 55, etwa 56, etwa 57, etwa 58, etwa 59, etwa 60, etwa 61, etwa 62, etwa 63, etwa 64, etwa 65, etwa 66, etwa 67, etwa 68, etwa 69, etwa 70, etwa 71, etwa 72, etwa 73, etwa 74, etwa 75, etwa 76, etwa 77, etwa 78, etwa 79, etwa 80, etwa 81, etwa 82, etwa 83, etwa 84, etwa 85, etwa 86, etwa 87, etwa 88, etwa 89, etwa 90, etwa 91, etwa 92, etwa 93, etwa 94, etwa 95, etwa 96, etwa 97, etwa 98, etwa 99, etwa 100 oder mehr Tage, sowie in jedem darin ableitbaren Bereich.
  • In gewissen Ausführungsformen kann die Wirtszelle oder -gewebe in zumindest einem Organismus gefunden werden. In gewissen Ausführungsformen kann der Organismus ein Eukaryote (zum Beispiel ein Tier, ein Mensch) sein, sowie es von einem Fachmann verstanden wird, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
  • E. THERAPEUTISCHE MITTEL
  • Um die Effektivität eines Herpes-Virusvektors gemäß vorliegender Erfindung zu erhöhen, kann es erwünscht sein, diese Zusammensetzungen und Verfahren gemäß Erfindung mit einem Mittel zu kombinieren, das bei der Behandlung von vaskulärer oder kardiovaskulärer Erkrankung oder Störung wirksam ist. In einigen Ausführungsformen ist beabsichtigt, dass eine herkömmliche Therapie oder Mittel, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, ein pharmakologisches therapeutisches Mittel, eine chirurgische Prozedur oder eine Kombination davon, mit der Vektorverabreichung kombiniert werden kann. In einem nicht einschränkenden Beispiel weist ein therapeutischer Vorteil reduzierten Bluthochdruck in einem Vaskulargewebe auf oder reduzierte Restenose, folgend auf vaskuläre oder kardiovaskuläre Intervention, wie es während einer medizinischen oder chirurgischen Prozedur auftritt. Somit kann in gewissen Ausführungsformen ein erfindungsgemäßes therapeutisches Verfahren die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Vektors in Kombination mit einem anderen therapeutischen Mittel aufweisen.
  • Dieses Verfahren kann das in Kontakt bringen der Zelle(n) mit (einem) Mittel(n) und dem Vektor zur gleichen Zeit (d. h. im Wesentlichen gleichzeitig) oder innerhalb eines Zeitraums, in welchem getrennte Verabreichungen des Vektors und eines Mittels in eine Zelle, Gewebe oder Organismus einen gewünschten therapeutischen Vorteil erzeugt, beinhalten. Die Bezeichnungen „in Kontakt gebracht" und „ausgesetzt", wenn sie auf eine Zelle, Gewebe oder Organismus angewendet werden, werden hier verwendet, um das Verfahren zu beschreiben, durch welches ein erfindungsgemäßes therapeutisches Konstrukt und/oder therapeutisches Mittel in einer Zielzelle, Gewebe oder Organismus geliefert werden oder in direkten Kontakt mit der Zielzelle, Gewebe oder Organismus gebracht werden. Die Zelle, Gewebe oder Organismus können mit einer einzelnen Zusammensetzung oder pharmakologischen Formulierungen in Kontakt gebracht werden (zum Beispiel durch Verabreichen), die sowohl einen erfindungsgemäßen Vektor als auch ein oder mehrere Mittel beinhaltet, oder indem die Zelle mit zwei oder mehreren unterschiedlichen Zusammensetzungen oder Formulierungen in Kontakt gebracht wird, wobei eine Zusammensetzung einen Vektor beinhaltet und die andere ein oder mehrere Mittel beinhaltet.
  • Der Herpes-Virusvektor kann vorausgehend, zusammen mit und/oder dem (den) anderen Mittel(n) in Intervallen folgend, rangierend von Minuten bis zu Wochen, verabreicht werden. In Ausführungsformen, bei denen der Vektor und andere Mittel getrennt einer Zelle, Gewebe oder Organismus zugeführt werden, wird man allgemein sicherstellen, dass ein nicht signifikanter Zeitraum zwischen der Zeit jeder Zugabe abläuft, so dass Vektor und Mittel noch dazu fähig sind, ein vorteilhaften kombinierten Effekt auf die Zelle, Gewebe oder Organismus auszuüben. Zum Beispiel wird in solchen Fällen angenommen, dass man die Zelle, Gewebe oder Organismus mit zwei, drei, vier oder mehr Modalitäten im Wesentlichen gleichzeitig (d. h. innerhalb von weniger als etwa einer Minute) mit dem Vektor in Kontakt bringen kann. In anderen Gesichtspunkten können ein oder mehrere Mittel im Wesentlichen gleichzeitig mit oder etwa 1 Minute, etwa 5 Minuten, etwa 10 Minuten, etwa 20 Minuten, etwa 30 Minuten, etwa 45 Minuten, etwa 60 Minuten, etwa 2 Stunden, etwa 3 Stunden, etwa 4 Stunden, etwa 5 Stunden, etwa 6 Stunden, etwa 7 Stunden, etwa 8 Stunden, etwa 9 Stunden, etwa 10 Stunden, etwa 11 Stunden, etwa 12 Stunden, etwa 13 Stunden, etwa 14 Stunden, etwa 15 Stunden, etwa 16 Stunden, etwa 17 Stunden, etwa 18 Stunden, etwa 19 Stunden, 20 Stunden, etwa 21 Stunden, etwa 22 Stunden, etwa 22 Stunden, etwa 23 Stunden, etwa 24 Stunden, etwa 25 Stunden, etwa 26 Stunden, etwa 27 Stunden, etwa 28 Stunden, etwa 29 Stunden, etwa 30 Stunden, etwa 31 Stunden, etwa 32 Stunden, etwa 33 Stunden, etwa 34 Stunden, etwa 35 Stunden, etwa 36 Stunden, etwa 37 Stunden, etwa 38 Stunden, etwa 39 Stunden, etwa 40 Stunden, etwa 41 Stunden, etwa 42 Stunden, etwa 43 Stunden, etwa 44 Stunden, etwa 45, Stunden, etwa 46 Stunden, etwa 47 Stunden, etwa 48 Stunden, etwa 1 Tag, etwa 2 Tage, etwa 3 Tage, etwa 4 Tage, etwa 5 Tage, etwa 6 Tage, etwa 7 Tage, etwa 8 Tage, etwa 9 Tage, etwa 10 Tage, etwa 11 Tage, etwa 12 Tage, etwa 13 Tage, etwa 14 Tage, etwa 15 Tage, etwa 16 Tage, etwa 17 Tage, etwa 18 Tage, etwa 19 Tage, etwa 20 Tage, etwa 21 Tage, etwa 1 Woche, etwa 2 Wochen, etwa 3 Wochen, etwa 4 Wochen, etwa 5 Wochen, etwa 6 Wochen, etwa 7 Wochen, etwa 8 Wochen, etwa 1 Monat, etwa 2 Monate, etwa 3 Monate, etwa 4 Monate, etwa 5 Monate, etwa 6 Monate, etwa 7 Monate, etwa 8 Monate, etwa 9 Monate, etwa 10 Monate, etwa 11 Monate, oder etwa 12 Monate, sowie jedem darin erreichbaren Bereich vor und/oder nach Verabreichung des erfindungsgemäßen Vektors verabreicht werden.
  • Verschiedene Kombinationssysteme des erfindungsgemäßen Herpes-Virusvektors und ein oder mehrerer Mittel können eingesetzt werden. Nicht einschränkende Beispiele für solche Kombinationen sind unten gezeigt, wobei eine Zusammensetzung, aufweisend einen Vektor „A" und ein Mittel „B", ist:
    A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
  • Verabreichung der Zusammensetzung, aufweisend einen Vektor, in eine Zelle, Gewebe oder Organismus kann allgemeinen Protokollen für die Verabreichung von vaskulären oder kardiovaskulären Therapeutika folgen, wobei die Toxizität des Therapeutikums in Betracht gezogen wird, sofern vorhanden. Es wird erwartet, dass die Behandlungszyklen wie notwendig wiederholt werden. Es wird angenommen, dass verschiedene zusätzliche Mittel in jeder Kombination mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden können.
  • E.1. Pharmakologische therapeutische Mittel
  • Pharmakologische therapeutische Mittel und Verfahren zur Verabreichung, Dosierungen und ähnlichem sind dem Fachmann wohl bekannt (siehe hier zum Beispiel die „Physicians Desk Reference", Goodman & Gilman's „The Pharmacological Basis of Therapeutics", „Remington's Pharmaceutical Sciences" und „The Merck Index, Eleventh Edition") und können mit der Erfindung im Lichte der Offenbarungen hier kombiniert werden. Einige Variation in der Dosierung wird notwendigerweise abhängig von der Bedingung des behandelten Subjekts auftreten. Die für die Verabreichung verantwortliche Person wird in jedem Falle die geeignete Dosis für das individuelle Subjekt bestimmen und solche individuelle Bestimmungen sind innerhalb der Fähigkeit des Fachmanns.
  • Nicht einschränkende Beispiele für ein pharmakologisches therapeutisches Mittel, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, beinhalten ein antihyperlipoproteinämisches Mittel, ein antiarteriosklerotisches Mittel, ein antithrombotisches/fibrinolytisches Mittel, ein Blutkoagulans, ein Mittel gegen Herzrhythmusstörungen, ein Mittel gegen Bluthochdruck, einen Blutdrucksteigerer, ein Mittel zur Behandlung von chronischer Herzinsuffizienz, ein antianginales Mittel, ein Antiinfektionsmittel (z. B. ein antibakterielles Mittel, ein Antipilzmittel, ein Antivirusmittel), oder eine Kombination davon.
  • E.1.a. Antihyperlipoproteinämika
  • In gewissen Ausführungsformen kann Verabreichung eines Mittels, welches die Konzentration von einem oder mehreren Blutlipiden und/oder Lipoproteinen senkt, hier bekannt als ein „Antihyperlipoproteinämikum", mit der Verabreichung eines Vektors für Kardiovaskulartherapie kombiniert werden, insbesondere bei der Behandlung von Atherosklerose und Verdickungen oder Blockaden von Vaskulargeweben. In gewissen Gesichtspunkten kann ein antihyperlipoproteinämisches Mittel ein aryloxyalkanoisches/faseriges Säurederivat, ein Harz/Gallensäuresequestrant, einen HMG-CoA-Reduktaseinhibitor, ein Nikotinsäurederivat, ein Thyroidhormon oder ein Thyroidhormonanaloges, ein sonstiges Mittel (siehe unten), welches sich von den anderen im Stand der Technik bekannten Antihyperlipoproteinämika unterscheidet, oder eine Kombination davon aufweisen.
  • E.1.a.i. Aryloxyalkansäure-/Fibrinsäurederivate
  • Nicht einschränkende Beispiele für Aryloxyalkan-/Fibrinsäurederivate beinhalten Beclobrat, Enzafibrat, Binifibrat, Ciprofibrat, Clinofibrat, Clofibrat (Atromide-S), Clofibrinsäure, Etofibrat, Fenofibrat, Gemfibrozil (Lobid), Nicofibrat, Pirifibrat, Ronifibrat, Simfibrat und Theofibrat.
  • E.1.a.ii. Harze/Gallensäuresequestranten
  • Nicht einschränkende Beispiele für Harze/Gallensäuresequestranten beinhalten Cholestyramin (Cholybar, Questran), Colestipol (Colestid) und Polidexid.
  • E.1.a.iii. HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren
  • Nicht einschränkende Beispiele für HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren beinhalten Lovastatin (Mevacor), Pravastatin (Pravochol) oder Simvastatin (Zocor).
  • E.1.a.iv. Nikotinsäurederivate
  • Nicht einschränkende Beispiele von Nikotinsäurederivaten beinhalten Nicotinat, Acepimox, Niceritrol, Nicoclonat, Nicomol und Oxiniansäure.
  • E.1.a.v. Thyroidhormone und Analoge
  • Nicht einschränkende Beispiele für Thyroidhormone und ihre Analoge beinhalten Etoroxat, Thyropropionensäure und Thyroxin.
  • E.1.a.vi. Sonstige Antihyperlipoproteinämika
  • Nicht einschränkende Beispiele für sonstige Antihyperlipoproteinämika beinhalten Acifran, Azacosterol, Benfluorex, β-Benzalbutyramid, Carnitin, Chondroitinsulfat, Clomestron, Detaxtran, Detaxtransulfatnatrium, 5,8,11,14,17-Eicosapentaensäure, Eritadenin, Furazabol, Meglutol, Melinamid, Mytatriendiol, Ornithin, γ-Oryzanol, Pantethin, Pentaerythrit-tetraacetat, α-Phenylbutyramid, Pirozadil, Probucol (Lorelco), β-Sitosterol, Sultosilylsäure-piperazinsalz, Tiadenol, Triparanol und Xenbucin.
  • E.1.b. Antiarteriosklerotika
  • Ein nicht einschränkendes Beispiel eines Antiarteriosklerotikums ist Pyridinolcarbamat.
  • E.1.c. Antithrombotische/fibrinolytische Mittel
  • In gewissen Ausführungsformen kann die Verabreichung eines Mittels, welches bei Entfernung oder Verhinderung von Blutgerinnseln behilflich ist, mit der Verabreichung eines Vektors zur kardiovaskulären Therapie kombiniert werden, insbesondere bei der Behandlung von Atherosklerose und vaskulatorischen (z. B. arteriellen) Blockaden. Nicht einschränkende Beispiele für antithrombotische und/oder fibrinolytische Mittel beinhalten Antikoagulanzien, Antikoagulanz-Antagonisten, Antiplättchenmittel, thrombolytische Mittel, Antagonisten für thrombolytische Mittel oder Kombinationen davon.
  • In gewissen Gesichtspunkten sind antithrombotische Mittel, die oral verabreicht werden können, wie zum Beispiel Aspirin und Warfarin (Coumadin), bevorzugt.
  • E.1.c.i. Antikoagulanzien
  • Nicht einschränkende Beispiele für Antikoagulanzien beinhalten Acenocoumarol, Ancrod, Anisindion, Bromindion, Clorindion, Coumetarol, Cyclocumarol, Dextransulfat-natrium, Dicumarol, Diphenadion, Ethylbiscoumacetat, Ethylidendicoumarol, Fluindion, Heparin, Hirudin, Lyapolat-natrium, Oxazidion, Pentosanpolysulfat, Phenindion, Phenprocoumon, Phosvitin, Picotamid, Tioclomarol und Warfarin.
  • E.1.c.ii. Antiplättchenmittel
  • Nicht einschränkende Beispiele für Antiplättchenmittel beinhalten Aspirin, ein Dextran, Dipyridamol (Persantin), Heparin, Sulfinpyranon (Anturan) und Ticlopidin (Ticlid).
  • E.1.c.iii. Thrombolytische Mittel
  • Nicht einschränkende Beispiele für thrombolytische Mittel beinhalten Gewebeplasminogen-Aktivator (Aktivase), Plasmin, Pro-Urokinase, Urokinase (Abbokinase), Streptokinase (Streptase) und Anistreplase/APSAC (Eminase).
  • E.1.d. Blutkoagulanzien
  • In gewissen Ausführungsformen, bei denen ein Patient unter einer Blutung oder einer erhöhten Wahrscheinlichkeit für eine Blutung leidet, kann ein Mittel, das die Blutkoagulation erhöht, verwendet werden. Nicht einschränkende Beispiele für ein Blutkoagulation beschleunigendes Mittel beinhalten Antagonisten für thrombolytische Mittel und Antikoagulanz-Antagonisten.
  • E.1.d.i. Anitkoagulanz-Antagonisten
  • Nicht einschränkende Beispiele für Antikoagulanz-Antagonisten beinhalten Protamin und Vitamin K1.
  • E.1.d.ii. Antagonisten für thrombolytische Mittel und Antithrombotika
  • Nicht einschränkende Beispiele für Antagonisten für thrombolytische Mittel beinhalten Aminocapronsäure (Amicar) und Transexaminsäure (Amstat). Nicht einschränkende Beispiele für Antithrombotika beinhalten Anagrelid, Argatroban, Cilstazol, Daltroban, Defibrotid, Enoxaparin, Fraxiparin, Indobufen, Lamoparan, Ozagrel, Picotamid, Plafibrid, Tedelparin, Ticlopidin und Triflusal.
  • E.1.e. Antiarrhythmische Mittel
  • Nicht einschränkende Beispiele für antiarrhythmische Mittel beinhalten antiarrhythmische Mittel der Klasse I (Natriumkanalblocker), antiarrhythmische Mittel der Klasse II (beta-adrenergische Blocker), antiarrhythmische Mittel der Klasse III (Erregungsrückbildung verlängernde Arzneimittel), antiarrhythmische Mittel der Klasse IV (Kalziumkanalblocker) und sonstige antiarrhythmische Mittel (siehe unten).
  • E.1.e.i. Natriumkanalblocker
  • Nicht einschränkende Beispiele für Natriumkanalblocker beinhalten antiarrhythmische Mittel der Klasse IA, Klasse IB und Klasse IC. Nicht einschränkende Beispiele für antiarrhythmische Mittel der Klasse IA beinhalten Disppyramid (Norpas), Procainamid (Pronestyl) und Quinidin (Quinidex). Nicht einschränkende Beispiele für antiarrhythmische Mittel der Klasse IB beinhalten Lidocain (Xylocain), Tocainidin (Tonocard) und Mexiletin (Mexitil). Nicht einschränkende Beispiele für antiarrhythmische Mittel der Klasse IC beinhalten Encainid, (Enkaid) und Flecainid (Tambocor).
  • E.1.e.ii. Betablocker
  • Nicht einschränkende Beispiele für einen Betablocker, andererseits bekannt als ein β-adrenergischer Blocker, ein β-adrenergischer Antagonist oder ein antiarrhythmisches Mittel der Klasse II, beinhalten Acebutolol (Sectral), Alprenolol, Amosulalol, Arotinolol, Atenolol, Befunolol, Betaxolol, Bevantolol, Bisoprolol, Bopindolol, Bucumolol, Bufetolol, Bufuralol, Bunitrolol, Bupranolol, Butiridinhydrochlorid, Butofilolol, Carazolol, Carteolol, Carvedilol, Celiprolol, Cetamolol, Cloranolol, Dilevalol, Epanolol, Esmolol (Brevibloc), Indenolol, Labetalol, Levobunolol, Mepindolol, Metipranolol, Metoprolol, Moprolol, Nadolol, Nadoxolol, Nifenalol, Nipradilol, Oxprenolol, Penbutolol, Pindolol, Practolol, Pronethalol, Propanolol (Inderal), Sotalol (Betapace), Sulfinalol, Talinolol, Tertalolol, Timolol, Toliprolol und Xibinolol. In gewissen Gesichtspunkten weisen die Betablocker ein Aryloxypropanololaminderivat auf. Nicht einschränkende Beispiele für Aryloxypropanolaminderivate beinhalten Acebutolol, Alprenolol, Arotinolol, Atenolol, Betaxolol, Bevantolol, Bisoprolol, Bopindolol, Bunitrolol, Butofilolol, Carazolol, Carteolol, Carvedilol, Celiprolol, Cetamolol, Epanolol, Indenolol, Mepindolol, Metipranolol, Metoprolol, Moprolol, Nadolol, Nipradilol, Oxprenolol, Penbutolol, Pindolol, Propanolol, Talinolol, Tertatolol, Timolol und Toliprolol.
  • E.1.e.iii. Erregungsrückbildung verlängernde Mittel
  • Nicht einschränkende Beispiele für ein Mittel, welches die Erregungsrückbildung verlängert, auch bekannt als ein antiarrhythmisches Mittel der Klasse III, beinhalten Amiodaron (Cordarone) und Sotalol (Betapace).
  • E.1.e.iv. Kalziumkanalblocker/Antagonist
  • Nicht einschränkende Beispiele für einen Kalziumkanalblocker, andererseits bekannt als ein antiarrhythmisches Mittel der Klasse IV, beinhalten ein Arylalkylamin (z. B. Bepridil, Diltiazem, Fendilin, Gallopamil, Prenylamin, Terodilin, Verapamil), ein Dihydropyridinderivat (Felodipin, Isradipin, Nicardipin, Nifedipin, Nimodipin, Nisoldipin, Nitrendipin), ein Piperazinderivat (z. B. Cinnarizin, Flunarizin, Lidoflazin) oder einen anderen Kalziumkanalblocker, wie zum Beispiel Bencyclan, Etafenon, Magnesium, Mibefradil oder Perhexilin. In gewissen Ausführungsformen weist ein Kalziumkanalblocker einen lang wirkenden Dihydropiridin (nifedipinartigen) -Kalziumantagonisten auf.
  • E.1.e.v. Andere antiarrhythmische Mittel
  • Nicht einschränkende Beispiele für andere antiarrhythmische Mittel beinhalten Adenosin (Adenocard), Digoxin (Lanoxin), Acecainid, Ajmalin, Amoproxan, Aprindin, Bretyliumtosylat, Bunaftin, Butobendin, Capobensäure, Cifenlin, Disopyranid, Hydrochinidin, Indecainid, Ipatropiumbromid, Lidocain, Lorajmin, Lorcainid, Meobentin, Moricizin, Pirmenol, Prajmalin, Propafenone, Pyrinolin, Chinidinpolygalacturonat, Chinidinsulfat und Viquidil.
  • E.1.f. Antihypertensive Mittel
  • Nicht einschränkende Beispiele für antihypertensive Mittel beinhalten Sympatholytika, Alpha/Betablocker, Alphablocker, Antiangiotensin II-Mittel, Betablocker, Kalziumkanalblocker, Vasodilatoren und verschiedene Antihypertensiva.
  • E.1.f.i. Alphablocker
  • Nicht einschränkende Beispiele für einen Alphablocker, auch bekannt als ein α-adrenergischer Blocker oder ein α-adrenergischer Antagonist, beinhalten Amosulalol, Arotinolol, Dapiprazol, Doxazosin, Ergoloidmesylate, Fenspirid, Indoramin, Labetalol, Nicerogolin, Prazosin, Terazosin, Tolazolin, Trimazosin und Yohimbin. In gewissen Ausführungsformen kann ein Alphablocker ein Chinazolinderivat aufweisen. Nicht einschränkende Beispiele für Chinazolinderivate beinhalten Afluzosin, Bunazosin, Doxazosin, Prazosin, Terazosin und Trimazosin.
  • E.1.f.ii. Alpha-Betablocker
  • In gewissen Ausführungsformen ist ein antihypertensives Mittel sowohl ein alpha- als auch ein beta-adrenergischer Antagonist. Ein nicht einschränkendes Beispiel eines Alpha-/Betablockers ist Labetalol (Normodyn, Trandat).
  • E.1.f.iii. Anti-Angiotensin II-Mittel
  • Nicht einschränkende Beispiele für Anti-Angiotensin II-Mittel beinhalten Angiotensin umsetzende Enzyminhibitoren und Angiotensin II-Rezeptorantagonisten. Nicht einschränkende Beispiele für Angiotensin umsetzende Enzyminhibitoren (ACE-Inhibitoren) beinhalten Alacepril, Enalapril (Vasotec), Captopril, Cilazapril, Delapril, Enalaprilat, Fosinopril, Lisinopril, Moveltopril, Perindopril, Chinapril und Ramipril. Nicht einschränkende Beispiele für einen Angiotensin II-Rezeptorblocker, auch bekannt als ein Angiotensin II-Rezeptorantagonist, ein ANG-Rezeptorblocker oder ein ANG-II-Rezeptorblocker vom Typ1 (ARBS), beinhalten Angiocandesartan, Eprosartan, Irbesartan, Losartan und Valsartan.
  • E.1.f.iv. Sympatholytika
  • Nicht einschränkende Beispiele für ein Sympatholytikum beinhalten ein zentral wirkendes Sympatholytikum oder ein peripher wirkendes Sympatholytikum. Nicht einschränkende Beispiele für ein zentral wirkendes Sympatholytikum, auch bekannt als ein Zentralnervensystem (CNS)-Sympatholytikum, beinhalten Clonidin (Catapres), Guanabenz (Wytensin), Guanfacin (Tenex) und Methyldopa (Aldomet). Nicht einschränkende Beispiele für ein peripher wirkendes Sympatholytikum beinhalten ein ganglionblockierendes Mittel, ein adrenergisches Neuronen blockierendes Mittel, ein β-adrenergisches blockierendes Mittel oder ein alpha-1-adrenergisches blockierendes Mittel. Nicht einschränkende Beispiele für ein ganglionblockierendes Mittel beinhalten Mecamylamin (Inversin) und Trimethaphan (Arfonad). Nicht einschränkende Beispiele für ein adrenergisches Neuronen blockierendes Mittel beinhalten Guanethidin (Ismelin) und Reserpin (Serpasil). Nicht einschränkende Beispiele eines β-adrenergischen Blockers beinhalten Acenitolol (Sectral), Atenolol (Tenormin), Betaxolol (Kerlon), Carteolol (Cartrol), Labetalol (Normodyn, Trandat), Metoprolol (Lopressor), Nadanol (Corgard), Penbutolol (Levatol), Pindolol (Visken), Propanolol (Inderal) und Timolol (Blocadren). Nicht einschränkende Beispiele für alpha 1-adrenergische Blocker beinhalten Prazosin (Minipress), Doxazocin (Cardura) und Terzosin (Hytrin).
  • E.1.f.v. Vasodilatoren
  • In gewissen Ausführungsformen kann ein kardiovaskuläres therapeutisches Mittel einen Vasodilator aufweisen (z. B. einen zerebralen Vasodilator, einen koronaren Vasodilator oder einen peripheren Vasodilator). In gewissen bevorzugten Ausführungsformen weist ein Vasodilator einen koronaren Vasodilator auf. Nicht einschränkende Beispiele für einen koronaren Vasodilator beinhalten Amotriphen, Bendazol, Benfurodilhemisuccinat, Benziodaron, Chloracizin, Chromonar, Clobenfurol, Clonitrat, Dilazep, Dipyridamol, Droprenilamin, Efloxat, Erythrityltetranitran, Etafenon, Fendilin, Floredil, Ganglefen, Herestrol-bis(β-diethylaminoethylether), Hexobendin, Itramintosylat, Khellin, Liloflanin, Mannitolhexanitran, Medibazin, Nicorglycerin, Pentaerythrittetranitrat, Pentrinitrol, Perhexilin, Pimefyllin, Trapidil, Tricromyl, Trimetazidin, Trolnitratphosphat und Visnadin.
  • In gewissen Gesichtspunkten kann ein Vasodilator einen Vasodilator für chronische Therapie oder einen Vasodilator für Bluthochdrucknotfall aufweisen. Nicht einschränkende Beispiele eines Vasodilators für chronische Therapie beinhalten Hydralazin (Apresolin) und Minoxidil (Loniten). Nicht einschränkende Beispiele für einen Vasodilator bei Bluthochdrucknotfall beinhalten Nitroprussid (Niprid), Diazoxid (Hyperstat IV), Hydralazin (Apresolin), Minoxidil (Loniten) und Verapamil.
  • E.1.f.vi. Verschiedene Antibluthochdruckmittel
  • Nicht einschränkende Beispiele für verschiedene Antibluthochdruckmittel beinhalten Ajmalin, γ-Aminobuttersäure, Bufeniod, Cicletainin, Ciclosidomin, ein Cryptenamintannat, Fenoldopam, Flosequinan, Ketanserin, Mebutamat, Mecamylamin, Methyldopa, Methyl-4-pyridylketon-thiosemicarbazon, Muzolimin, Pargylin, Pempidin, Pinacidil, Piperoxan, Primaperon, ein Protoveratrin, Raubasin, Rescimetol, Rilmeniden, Saralasin, Natriumnitroprussid, Ticrynafen, Trimethaphancamsylat, Tyrosinase und Urapidil.
  • In gewissen Gesichtspunkten kann ein Antibluthochdruckmittel ein Arylethanolaminderivat (siehe unten), ein Benzothiadiazinderivat, ein N-Carboxyalkyl(peptidelactam)-Derivat, ein Dihydropyridinderivat, ein Guanidinderivat, ein Hydrazine/Phthalazin, ein Imidazolderivat, eine quaternäre Ammoniumverbindung, ein Reserpinderivat oder ein Sulfonamidderivat aufweisen.
  • E.1.f.vi.a. Arylethanolaminderivate
  • Nicht einschränkende Beispiele für Arylethanolaminderivate beinhalten Amosulalol, Bufuralol, Dilevalol, Labetalol, Pronethalol, Sotalol und Sulfinalol.
  • E.1.f.vi.b. Benzothiadiazinderivate
  • Nicht einschränkende Beispiele für Benzothiadiazinderivate beinhalten Althizid, Bendroflumethiazid, Benzthiazid, Benzylhydrochlorothiazid, Buthiazid, Chlorthiazid, Chlorthalidon, Cyclopenthiazid, Cyclothiazid, Diazoxid, Epithiazid, Ethiazid, Fenchizon, Hydrochlorthizid, Hydroflumethizid, Methyclothiazid, Meticran, Metolazon, Paraflutizid, Polythizid, Tetrachlormethiazid und Trichlormethiazid.
  • E.1.f.vi.c. N-Carboxylalkyl(peptid/lactam)-Derivate
  • Nicht einschränkende Beispiele für N-Carboxylalkyl(peptid/lactam)-Derivate beinhalten Alacepril, Captopril, Cilazapril, Delapril, Enalapril, Enalaprilat, Fosinopril, Lisinopril, Moveltipril, Perindopril, Chinapril und Ramipril.
  • E.1.fvi.d. Dihydropyridinderivate
  • Nicht einschränkende Beispiele für Dihydropyridinderivate beinhalten Amlodipin, Felodipin, Isradipin, Nicardipin, Nifedipin, Nilvadipin, Nisoldipin und Nitrendipin.
  • E.1.f.vi.e. Guanidinderivate
  • Nicht einschränkende Beispiele für Guanidinderivate beinhalten Bethanidin, Debrisochin, Guanabenz, Guanaclin, Guanadrel, Guanazodin, Guanaethidin, Guanfacin, Guanochlor, Guanoxabenz und Guanoxan.
  • E.1.fvi.f Hydrazine/Phthalazine
  • Nicht einschränkende Beispiele für Hydrazine/Phthalazine beinhalten Budralazin, Cadralazin, Dihydralazin, Endralazin, Hydracarbazin, Hydralazin, Pheniprazin, Pildralazin und Todralazin.
  • E.1.f.vi.g. Imidazolderivate
  • Nicht einschränkende Beispiele für Imidazolderivate beinhalten Clonidin, Lofexidin, Phentolamin, Tiamenidin und Tolonidin.
  • E.1.fvi.h. Quaternäre Ammoniumverbindungen
  • Nicht einschränkende Beispiele für quaternäre Ammoniumverbindungen beinhalten Azamethoniumbromid, Chlorisondaminchlorid, Hexamethonium, Pentacynium-bis(methylsulfat), Pentamethoniumbromid, Pentoliniumtartrat, Phenactropiniumchlorid und Trimethidiniummethosulfat.
  • E.1.fvi.i. Rerserpinderivate
  • Nicht einschränkende Beispiele für Reserpinderivate beinhalten Bietaserpin, Deserpidin, Rescinnamin, Reserpin und Syrosingopin.
  • E.1.fvi.j. Sulfonamidderivate
  • Nicht einschränkende Beispiele für Sulfonamidderivate beinhalten Ambusid, Clopamid, Furosemid, Indapamid, Chinethazon, Tripamid und Xipamid.
  • E.1.g. Vasopressoren
  • Vasopressoren werden allgemein verwendet, um den Blutdruck während Schock zu erhöhen, was während einer chirurgischen Prozedur auftreten kann. Nicht einschränkende Beispiele eines Vasopressors, auch bekannt als ein Antihypotensivum, beinhalten Ameziniummethylsulfat, Angiotensinamid, Dimetofrin, Dopamin, Etifelmin, Etilefrin, Gepefrin, Metaraminol, Midodrin, Norepinephrin, Pholedrin und Synephrin.
  • E.1.h. Behandlungsmittel für chronische Herzinsuffizienz
  • Nicht einschränkende Beispiele für Mittel für die Behandlung von chronischer Herzinsuffizienz beinhalten Antiangiontensin II-Mittel, Nachbelastungs-Vorbelastungs-Reduktionsbehandlung (siehe unten), Diuretika und inotrope Mittel.
  • E.1.h.i. Nachbelastungs-Vorbelastungs-Reduktionsbehandlung
  • In gewissen Ausführungsformen kann ein Tier (Patient), der einen Angiotensionsantagonisten nicht tolerieren kann, mit einer Kombinationstherapie behandelt werden. Eine solche Therapie kann die Verabreichung von Hydralazin (Apresolin) und Isosorbiddinitrat (Isordil, Sorbitrat) kombinieren.
  • E.1.h.ii. Diuretika
  • Nicht einschränkende Beispiele eines Diuretikums beinhalten ein Thiazid oder Benzothiadiazinderivat (z. B. Althiazid, Bendroflumethazid, Benzthiazid, Benzylhydrochlorothiazid, Buthiazid, Chlorthiazid, Chlorthiazid, Chlorthalidon, Cyclopenthiazid, Epithiazid, Ethiazid, Ethiazid, Fenchizon, Hydrchlorothiazid, Hydroflumethiazid, Methylclothiazid, Meticran, Metolazon, Paraflutizid, Polythizid, Tetrachlormethiazid, Trichlormethiazid), eine Organoquecksilberverbindung (z. B. Chlormerodrin, Merallurid, Mercamphamid, Mercaptomerinnatrium, Mercumallylsäure, Mercumatillinnatrium, Quecksilberchlorid, Mersalyl) ein Pteridin (z. B. Furteren, Triamteren), Purine (z. B. Acefyllin, 7-Morpholinomethyltheophyllin, Pamobrom, Protheobromin, Theobromin), Steroide, einschließlich Aldosteronantagonisten (z. B. Canrenon, Oleandrin, Spironolacton), ein Sulfonamidderivat (z. B. Acetazolamid, Ambusid, Azosemid, Bumetanid, Butazolamid, Chloraminophenamid, Clofenamid, Clopamid, Clorexolon, Diphenylmethan-4,4'-disulfonamid, Disulfamid, Ethoxazolamid, Furosemid, Indapamid, Mefrusid, Methazolamid, Piretanid, Chinethazon, Torasemid, Tripamid, Xipamid), ein Uracil (z. B. Aminometradin, Amisometradin), einen Kalium einsparenden Antagonisten (z. B. Amilorid, Triamteren) oder ein anderes Diuretikum, wie zum Beispiel Aminozin, Arbutin, Chlorazanil, Ethacrynsäure, Etozolin, Hydracarbazin, Isosorbid, Mannitol, Metochalcone, Muzolimin, Perhexilin, Ticrnafen und Harnstoff.
  • E.1.h.iii. Inotrope Mittel
  • Nicht einschränkende Beispiele für ein positives inotropes Mittel, auch bekannt als ein herzstärkendes Mittel, beinhalten Acefyllin, ein Acetyldigitoxin, 2-Amino-4-picolin, Amrinon, Benfurodil-hemisuccinat, Bucladesin, Cerberosin, Camphotamid, Convallatoxin, Cymarin, Denopamin, Deslanosid, Digitalin, Digitalis, Digitoxin, Digoxin, Dobutamin, Dopamin, Dopexamin, Enoximon, Erythrophlein, Fenalcomin, Gitalin, Gitoxin, Glycocyamin, Heptaminol, Hydrastinin, Ibopamin, ein Lanatosid, Metamivam, Milrinon, Nerifolin, Oleandrin, Ouabain, Oxyfedrin, Prenalterol, Proscillaridin, Resibufogenin, Scillaren, Scillarenin, Strphanthin, Sulmazol, Theobromin und Xamoterol.
  • In speziellen Gesichtspunkten ist ein inotropes Mittel ein Herzglycosid, ein beta-adrenergischer Agonist oder ein Phosphordiesterase-Inhibitor. Nicht einschränkende Beispiele für ein Herzglycosid beinhalten Digoxin (Lanoxin) und Digitoxin (Crystodigin). Nicht einschränkende Beispiele für einen beta-adrenergischen Agonisten beinhalten Albuterol, Bambuterol, Bitolterol, Carbuterol, Clenbuterol, Clorprenalin, Denopamin, Dioexethedrin, Dobutamin (Dobutrex), Dopamin (Intropin), Dopexamin, Ephedrin, Etafedrin, Ehtylnorepinephrin, Fenoterol, Formoterol, Hexoprenalin, Ibopamin, Isoetharin, Isoproterenol, Mabuterol, Metaproterenol, Methoxyphenamin, Oxyfedrin, Pirbuterol, Procaterol, Protokylol, Reproterol, Rimiterol, Ritrodrin, Soterenol, Terbutalin, Tretochinol, Tulobuterol und Xamoterol. Ein nicht einschränkendes Beispiel für einen Phosphordiesterase-Inhibitor ist Amrinon (Inocor).
  • E.1.i. Antianginale Mittel
  • Antianginale Mittel können Organonitrate, Kalziumkanalblocker, Betablocker und Kombinationen davon aufweisen.
  • Nicht einschränkende Beispiele für Organnitrate, auch bekannt als Nitrovasodilatoren, beinhalten Nitroglycerin (Nitro-bid, Nitrostat), Isosorbiddinitrat (Isordil, Sorbitrat) und Amylnitrat (Aspirol, Vaporol).
  • E.1.j. Anti-Infektionsmittel
  • Anti-Infektionsmittel (z. B. Antibakterika, Antipilzmittel, Antivirusmittel) werden allgemein verwendet, um Infektionen zu reduzieren oder vorzubeugen. Nicht einschränkende Beispiele für Antibakterika beinhalten antibakterielle Antibiotika, synthetische Antibakterika, leprostatische Antibakterika, Rickettsia-Antibakterika, tuberkulostatische Antibakterika oder eine Kombination davon.
  • E.1.j.i. Antibiotische Antibakterika
  • Nicht einschränkende Beispiele für antibiotische Antibakterika beinhalten ein Aminoglycosid (z. B. Amikacin, Apramycin, Arbekacin, ein Bambermycin, Butirosin, Dibekacin, Dihydrostreptomycin, ein Fortimicin, Gentamicin, Isepamicin, Kanamycin, Micronomicin, Neomycinundecylenat, Netilmicin, Paromomycin, Ribostamycin, Sisomicin, Spectinomycin, Streptomycin, Streptonicozid, Tobramycin), ein Amphenol (z. B. Azidamfenicol, Chloramphenicol, Chloramphenicolpalmitat, Chloramphenicolpantothenat, Florfenicol, Thiamphenicol), ein Ansamycin (z. B. Rifamid, Rifampin, Rifamycin, Rifaximin), ein β-Lactam (z. B. ein Carbapenem, ein Cephalosporin, ein Cephamycin, ein Monobactam, ein Oxacephem, ein Penicillin), ein Lincosamid (z. B. Clindamycin, Lincomycin), ein Macrolid (z. B. Azithromycin, Carbomycin, Clarithromycin, Erythromycinacistrat, Erythromycinestolat, Erythromycinglucoheptonat, Erythromycinlactobionat, Erythromycinlactobionat, Erythromycinpropionat, Erythromycinstearat, Josamycin, Leucomycin, Midecamycin, Miokamycin, Oleandomycin, Primycin, Primycin, Rokitamycin, Rosaramicin, Roxithromycin, Spiramycin, Troleandomycin), Polypeptide (z. B. Amphomycin, Bacitracin, Capreomycin, Colistin, Enduracidin, Enviomycin, Fusagungin, ein Gramicidin, ein Gramicidin S, Mikamycin, Polymyxin, Polymyxin B-methansulfonsäure, Pristinamycin, Ristoceitin, Teicoplanin, Thiostrepton, Tuberactinomycin, Tyrocidin, Tyrothricin, Vancomycin, Viomycin, Viomycinpantothenat, Virginiamycin, Zinkbacitracin), Tetracyclin (z. B. Apicyclin, Chlortetracyclin, Clomocyclin, Demeclocyclin, Doxycyclin, Guamecyclin, Lymecyclin, Meclocyclin, Methacyclin, Minocyclin, Oxytetracyclin, Penimepicyclin, Pipacyclin, Rolitetracyclin, Sancyclin, Senociclin, Tetracyclin) oder ein anderes antibiotisches Antibakterikum (z. B. Cycloserin, Mupirocin, Tuberin).
  • Ein nicht einschränkendes Beispiel eines Carbapenem-β-lactams ist Imipenem. Nicht einschränkende Beispiele für ein Cephalosporin-β-lactam beinhalten Cefaclor, Cefadroxil, Cefamandol, Cefatrizin, Cefazedon, Cefazolin, Cefixim, Cefmenoxim, Cefodizim, Cefonicid, Cefoperazon, Ceforanid, Cefotaxim, Cefotiam, Cefpimizol, Cefpiramid, Cefpodoxim proxetil, Cefroxadin, Cefsulodin, Ceftazidim, Cefteram, Ceftezol, Ceftibuten, Ceftizoxim, Ceftriaxon, Cefuroxim, Cefuzonam, Cephacetrilnatrium, Cephalexin, Cephaloglycin, Cephaloridin, Cephalosporin C, Cephalothin, Cephapirinnatrium, Cephradin und Pivcefalexin. Nicht einschränkende Beispiele für ein Cephamycin-β-lactam beinhalten Cefbuperazon, Cefmethazon, Cefminox, Cefotetan und Cefoxitin. Nicht einschränkende Beispiele für ein Monobactam-β-lactam beinhalten Aztreonam, Carumonam und Tigemonam. Nicht einschränkende Beispiele für ein Oxacephem-β-lactam beinhalten Flomoxef und Moxolactam. Nicht einschränkende Beispiele für ein Penicillin-β-lactam beinhalten Amidinocillin, Amidinocillin pivoxil, Amoxicillin, Ampicillin, Apalcillin, Aspoxicillin, Azidocillin, Azlocillin, Bacampicillin, Benzylpenicillinsäure, Benzylpenicillinnatrium, Carbenicillin, Carfecillinnatrium, Carindacillin, Clometocillin, Cloxacellin, Cyclacillin, Dicloxacillin, Diphenicillinnatrium, Epicillin, Fenbenicillin, Floxacillin, Hetacillin, Lenampicillin, Metampicillin, Methicillinnatrium, Mezlocillin, Nafcillinnatrium, Mezlocillin, Nafcillinnatrium, Oxacillin, Penamecillin, Penethamathydrid, Penicillin G-bbenethiamin, Penicillin G-benzathin, Penicillin G-benzhydrylamin, Penicillin G-calcium, Penicillin G-hydrabamin, Penicillin G-kalium, Penicillin G-procain, Penicillin N, Penicillin O, Penicillin V, Penicillin V-benzathin, Penicillin V-hydrabamin, Penimepicyclin, Phenethicillinkalium, Piperacillin, Pivampicillin, Propicillin, Chinacillin, Sulbenicillin, Talamipicillin, Temocillin und Ticarcillin.
  • E.1.j.ii. Synthetische Antibakterika
  • Nicht einschränkende Beispiele für synthetische Antibakterika beinhalten 2,4-Diaminopyrimidine (z. B. Brodimoprim, Tetroxoprim, Trimethoprim), Nitrofurane (z. B. Furaltadon, Furazoliumchlorid, Nifuraden, Nifuratel, Nifurfolin, Nifurpirinol, Nifurprazin, Nifurtoinol, Nitrofurantion), Chinolone und Chinonanaloga (z. B. Amifoxacin, Cinoxacin, Ciprofloxacin, Difloxacin, Enoxacin, Fleroxacin, Flumequin, Lomefloxacin, Miloxacin, Nalidixinsäure, Norfloxacin, Ofloxacin, Oxolinsäure, Pefloxacin, Pipemidinsäure, Piromidinsäure, Rosoxacin, Temafloxacin, Tosulfoxacin), Sulfonamide (z. B. Acetylsulfamethoxypraxin, Acetylsulfisoxazol, Azosulfamid, Benzylsulfamid, Chloramin-B, Chloramin-T, Dichloramin-T, Formosulfathiazol, N2-Formylsulfisomidin, N4-β-D-Glucosysulfanilamid, Mafenid, 4'-(Methylsulfanoyl)sulfanilamid, p-Nitrosulfathiazol, Phthalylsulfacetamid, Phthalylsulfathiazol, Salazosulfadimidin, Succinylsulfathiazol, Sulfabenzamid, Sulfacetamid, Sulfachlorpyridazin, Sulfachrysoidin, Sulfacytin, Sulfadiazin, Sulfadicramid, Sulfadimethoxin, Sulfadoxine, Sulfaethidol, Sulfaguanidin, Sulfaguanol, Sulfalen, Sulfaloensäure, Sulfamerazin, Sulfameter, Sulfamethazin, Sulfamethizol, Sulfamethomidin, Sulfamethoxazol, Sulfamethoxypyridiazin, Sulfametrol, Sulfamidochrysoidin, Sulfamoxol, Sulfanilamid, Sulfanilamidomethansulfonsäure-triethanolaminsalz, 4-Sulfanilamidosalicylsäure, N4-Sulfanilylsufanilamid, Sulfanilylharnstoff, N-Sulfanilyl-3,4-xylamid, Sulfanitran, Sulfaperin, Sulfaphenazol, Sulfaproxylin, Sulfapyrazin, Sulfapyridin, Sulfasomizol, Sulfasymazin, Sulfathiazol, Sulfathioharnstoff, Sulfatolamid, Sulfisomidin, Sulfisoxazol), Sulfone (Acedapson, Adeciasulfon, Acetosulfonnatrium, Dapson, Diathymosulfon, Glucosulfonnatrium, Solasulfon, Succisulfon, Sulfanilsäure, p-Sulfanilylbenzylamin, p,p'-Sulfonyldianilin-N,N'-diagalactosid, Sulfoxonnatrium, Thiazolsulfon) und verschiedene synthetische Antibakterika (z. B. Clofoctol, Hexedin, Methenamin, Methenaminanhydromethylencitrat, Methenaminhippurat, Methenaminmandelat, Methenaminsulfosalicylat, Nitroxolin und Xibornol).
  • E.1.j.iii. Liprostatische Antibakterika
  • Nicht einschränkende Beispiele für leprostatische Antibakterika beinhalten Acedapson, Acetosulfonnatrium, Clofazimine, Dapson, Diathymosulfon, Glukosulfonnatrium, Hydnocarpinsäure, Solasulfon, Succisulfon und Sulfoxonnatrium.
  • E.1.j.iv. Rickettsia-Antibakterika
  • Nicht einschränkende Beispiele für Rickettsia-Antibakterika, auch bekannt als Antirickettsias, beinhalten p-Aminobenzoesäure, Chloramphenicol, Chloramphenicolpalmitat, Chloramphenicolpanthotenat und Tetracyclin.
  • E.1.j.v. Tuberkulostatische Antibakterika
  • Nicht einschränkende Beispiele für tuberkulostatische Antibakterika beinhalten p-Aminosalicylsäure, p-Aminosalicylsäurehydrazin, Benzoylpas, 5-Bromsalicylhydroxaminsäure, Capreomycin, Clofazimin, Cyacetacid, Cycloserin, Dihydrostreptomycin, Enviomycin, Ethambutol, Ethionamid, 4'-Formylsuccinanillinsäurethiosemicarbazon, Furonazid, Glyconiazid, Isobutol, Isoniazid, Isozianidmethansulfonat, Morphazinamid, Opiniazid, Parsiniazid, Phenylaminosalicylat, Protionamid, Pyrazinamid, Rifampin, Salinazid, Streptomycin, Subathizon, Sulfonazid, Thiacetazon, Tiocarlid, Tuberactinomycin, Tubercidin, Tuberinverazid, Viomycin und Vicmycinpanthotenat.
  • E.1.j.vi. Antipilzmittel
  • Beispiele für Antipilzmittel beinhalten antibiotische Antipilzmittel und synthetische Antipilzmittel. Nicht einschränkende Beispiele für antibiotische Antipilzmittel beinhalten Polyene, wie zum Beispiel Amphotericin B, Candicidin, Dermostatin, Filipin, Fungichromin, Hachimycin, Hamycin, Lucensomycin, Mepartricin, Natamycin, Nystatin, Pecilocin und Perimycin, sowie sonstige antibiotische Antipilzmittel wie zum Beispiel Azaserin, Grisofulvin, ein Oligomycin, Neomycinundecylenat, Pyrrolnitrin, Siccanin, Tubercidin und Viridin. Beispiele für synthetische Antipilzmittel beinhalten Allylamine, Imidazole, Triazole und sonstige synthetische Antipilzmittel. Nicht einschränkende Beispiele für Allyamine beinhalten Naftifin und Terbinafin. Nicht einschränkende Beispiele für Imidazole beinhalten Bifonazol, Butoconazol, Chlordantoin, Chlormidazol, Cloconazol, Clotrimazol, Econazol, Enilconazol, Fenticonazol, Isoconazol, Ketoconazol, Miconazol, Omoconazol, Oxiconazolnitrat, Sulconazol und Ticonazol. Nicht einschränkende Beispiele für Trizole beinhalten Fluconazol, Itraconazol und Terconazol. Nicht einschränkende Beispiele für sonstige synthetische Antipilzmittel beinhalten Acrisorcin, Amorolfin, Biphenamin, Bromsalicylchloranilid, Buclosamid, Calciumpropionat, Chlorphenesin, Ciclopirox, Cloxychin, Coparaffinat, Diamthazoldihydrochlorid, Exalamid, Flucytosin, Halethazol, Hexedtidin, Loflurcarban, Nifuratel, Kaliumjodid, Propionsäure, Pyrithion, Salicylanilid, Natriumproprionat, Sulbentin, Tenonitozol, Tolciclat, Tolindat, Tolnaftat, Triacetin, Ujothion, Undecylensäure und Zinkproprionat.
  • E.1.j.vii. Antivirenmittel
  • Nicht einschränkende Beispiele für Antivirenmittel beinhalten gewisse Purine und Pyrimidinone, wie zum Beispiel Acyclovir, Cytarabin, Dideoxyadenosin, Dideoxycytidin, Dideoxyinosin, Edoxudin, Floxuridin, Ganciclovir, Idoxuridin, Inosinpranobex, MADU, Trifluridin, Vidarabin und Zidovudin. Sonstige Antivirenmittel beinhalten Acetylleucinmonoethanolamin, Amantadin, Amidinomycin, Cuminaldehyd, Thiosemicarbazon, Foscametnatrium, Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ, Kethoxal, Lysozym, Methisazon, Moroxydin, Podophyllotoxin, Ribavirin, Rimantadin, Stallimycin, Statolon, Tromantadin und Xenazonsäure.
  • E.2. Chirurgische Prozeduren
  • In gewissen Gesichtspunkten können chirurgische Prozeduren zusammen mit der Verabreichung des HSV-Vektors ausgeführt werden, oder um das Targeting des Vektors in vaskuläre Zellen, Gewebe und Organe zu vereinfachen. Chirurgische Prozeduren werden zum Beispiel präventative, diagnostische oder einstufende, kurative und lindernde Chirurgie beinhalten. Chirurgie, und insbesondere kurative Chirurgie, kann in Zusammenhang mit anderen Therapien verwendet werden, wie zum Beispiel Verabreichung eines Wachstum geschwächten (CNS) HSV-Vektors und einem oder mehreren anderen Mitteln.
  • Solche chirurgische Prozeduren für vaskuläre und kardiovaskuläre Erkrankungen und Störungen sind dem Fachmann wohl bekannt und beinhalten, sind aber nicht eingeschränkt auf, Ausführen von Chirurgie an einem Organismus, zur Verfügung stellen einer kardiovaskulären mechanischen Prothese, Angioplastie, koronare Arterienreperfusion, Katheterablation, zur Verfügung stellen eines implantierbaren Kardioverter-Defibrillators für ein Subjekt, mechanische Kreislaufunterstützung, oder eine Kombination davon. Nicht einschränkende Beispiele einer mechanischen Kreislaufunterstützung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, weisen eine Intra-Aortaballon-Gegenpulsation, linke Kammer unterstützende Vorrichtung oder Kombination davon auf.
  • Natürlich kann weitere Behandlung im Bereich der Chirurgie durch Perfusion, direkte Injektion, systemische Injektion oder lokale Anwendung des Bereiches mit zumindest einem zusätzlichen therapeutischen Mittel (z. B. einem Vektor für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren, einem pharmakologischen therapeutischen Mittel) ausgeführt werden, wie es dem Fachmann bekannt oder hier beschrieben ist.
  • F. PHARMAZEUTISCHE ZUBEREITUNGEN
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung weisen eine wirksame Menge von einem oder mehreren Herpes-Virusvektor(en) oder zusätzliche(m) Mittel(n) auf, die in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger aufgelöst oder dispergiert sind. Die Ausdrücke „pharmazeutisch oder pharmazeutisch akzeptabel" betreffen molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die keine nachteilige, allergische oder andere unpassende Reaktion erzeugen, wenn sie einem Tier, so wie zum Beispiel einem Mensch, sofern geeignet, verabreicht werden. Die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthält zumindest einen Herpes-Virusvektor oder zusätzlichen aktiven Bestandteil, der dem Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein wird, wie in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Mack Printing Company, 1990, hiermit durch Bezug eingeschlossen, beispielhaft veranschaulicht. Darüber hinaus wird man für eine Verabreichung an ein Tier (z. B. Mensch) verstehen, dass Präparationen Sterilitäts-, Pyrogenitäts-, allgemeine Sicherheits- und Reinheitsstandards, so wie vom U.S. FDA Office of Biological Standards oder einer äquivalenten Regierungsregulierung in anderen Ländern erforderlich, erfüllen sollten, sofern anwendbar.
  • So wie hier verwendet beinhaltet „pharmazeutisch akzeptabler Träger" alles und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, Tenside, Antioxidantien, Konservierungsstoffe (z. B. antibakterielle Mittel, Antipilzmittel), isotonische Mittel, absorptionsverzögernde Mittel, Salze, Konservierungsmittel, Arzneimittel, Arzneimittelstabilisatoren, Gele, Bindemittel, Arzneiträger, Auflösungsmittel, Gleitmittel, Süßungsmittel, Geschmacksmittel, Farbstoffe und ähnliche Materialien und Kombinationen davon, wie sie dem Fachmann bekannt sind (siehe z. B, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Mack Printing Company, 1990, Seiten 1289–1329, hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen). Mit der Ausnahme insofern, dass irgendein herkömmlicher Träger mit dem aktiven Bestandteil inkompatibel ist, wird seine Verwendung in den therapeutischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen beabsichtigt.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung, aufweisend einen Herpes-Virusvektor und/oder zusätzliche(s) Mittel, kann verschiedene Arten von Trägern verwerten, abhängig davon, ob sie in fester, flüssiger oder Aerosolform verabreicht werden sollen, und ob sie steril für solche Verabreichungsrouten wie Injektion sein müssen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können intravenös, intradermal, intraarteriell, eingepfropft, intraperitoneal, intraläsional, intracranial, intraartikulär, intraprostatikal, intrapleural, intratracheal, intranasal, intravitreal, intravaginal, intrarektal, topisch, intratumoral, intramuskulär, intraperitoneal, subkutan, subkonjunktiv, intravesikulär, mukosal, intraperikardial, intraumbilikal, intraokular, oral, topisch, lokal, inhalativ (z. B. Aerosolinhalation), durch Injektion, Infusion, kontinuierliche Infusion, lokalisiertes Perfusionsbad, welches Zellen direkt anspricht (z. B. in autogenem Transplantatgewebe), über einen Katheter, durch Waschen, in Cremes, in Lipidzusammensetzungen (z. B. Liposomen) oder durch irgend ein anderes Verfahren oder jede Kombination der vorhergehenden, wie es einem Fachmann bekannt ist, verabreicht werden (siehe zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Mack Printing Company, 1990).
  • Die tatsächliche Dosierungsmenge der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die einem tierischen Patienten verabreicht wird, kann durch physikalische und physiologische Faktoren, wie zum Beispiel Körpergewicht, Ernsthaftigkeit des Zustandes, die Art der zu behandelnden Erkrankung, vorhergehende und einhergehende therapeutische Eingriffe, Idiopathie des Patienten und geplante Route der Verabreichung bestimmt werden. Der für die Verabreichung verantwortliche Durchführende wird in jedem Fall die Konzentration des (der) aktiven Bestandteils(e) in einer pharmazeutischen Zusammensetzung und angebrachte Dosierung(en) für das jeweilige Subjekt unter Verwendung von Routineprozeduren bestimmen.
  • In gewissen Ausführungsformen können pharmazeutische Zusammensetzungen zum Beispiel zumindest etwa 0,1% einer aktiven Verbindung (z. B. einen Herpes-Virusvektor, ein therapeutisches Mittel) aufweisen. In anderen Ausführungsformen kann die aktive Verbindung zwischen etwa 2% bis etwa 75% des Gewichts der Einheit oder zum Beispiel zwischen etwa 25% bis etwa 60% und jeden darin erreichbaren Bereich aufweisen. In anderen nicht einschränkenden Beispielen kann eine Dosis auch von etwa 1 Mikrogramm/kg Körpergewicht, etwa 5 Mikrogramm/kg Körpergewicht, etwa 10 Mikrogramm/kg Körpergewicht, etwa 50 Mikrogramm/kg Körpergewicht, etwa 100 Mikrogramm/kg Körpergewicht, etwa 200 Mikrogramm/kg Körpergewicht, etwa 350 Mikrogramm/kg Körpergewicht, etwa 500 Mikrogramm/kg Körpergewicht, etwa 1 Milligramm/kg Körpergewicht, etwa 5 Milligramm/kg Körpergewicht, etwa 10 Milligramm/kg Körpergewicht, etwa 50 Milligramm/kg Körpergewicht, etwa 100 Milligramm/kg Körpergewicht, etwa 200 Milligramm/kg Körpergewicht, etwa 350 Milligramm/kg Körpergewicht, etwa 500 Milligramm/kg Körpergewicht, bis etwa 1000 Milligramm/kg Körpergewicht oder mehr pro Verabreichung und jeden darin erreichbaren Bereich aufweisen. In nicht einschränkenden Beispielen eines erreichbaren Bereiches aus den hier zur Verfügung gestellten Werten kann ein Bereich von etwa 5 mg/kg Körpergewicht bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht, etwa 5 Milligramm/kg Körpergewicht bis etwa 500 Milligramm/kg Körpergewicht, etc. verabreicht werden, basierend auf den offenbarten Werten.
  • In jedem Fall kann die pharmazeutische Zusammensetzung verschiedenen Antioxidantien aufweisen, um Oxidation von einem oder mehreren Bestandteilen zu verzögern. Zusätzlich kann die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen eingebracht werden durch Konservierungsstoffe, wie zum Beispiel verschiedene antibakterielle und Antipilzmittel, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, Parabene (z. B. Methylparabene, Propylparabene), Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal oder Kombinationen davon.
  • Ein Herpes-Virusvektor und/oder ein Mittel kann in einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Form einer freien Base, neutral oder als Salz formuliert werden.
  • Pharmazeutisch akzeptable Salze beinhalten die Säureadditionssalze, z. B. solche, die mit den freien Aminogruppen einer proteinösen Zusammensetzung gebildet werden, oder die mit anorganischen Säuren, so wie zum Beispiel Salz- oder Phosphorsäuren, gebildet werden, oder solchen organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Wein- oder Mandelsäure. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch mit anorganischen Basen, wie zum Beispiel Natrium, Kalium, Ammonium, Kalzium oder Eisenhydroxiden, erhalten werden, oder solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin oder Procain.
  • In Ausführungsformen, bei denen die pharmazeutische Zusammensetzung in einer flüssigen Form vorliegt, kann ein Träger ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglycol, flüssiges Polyethylenglykol, etc.), Lipide (z. B. Triglyceride, Gemüseöle, Liposome), sowie Kombinationen davon. Die geeignete Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung einer Beschichtung, wie zum Beispiel Lecithin, durch die Einhaltung der erforderlichen Teilchengröße durch Dispersion in Trägern, so wie zum Beispiel Flüssigkeit, Polyol oder Lipide, durch die Verwendung von Tensiden, so wie zum Beispiel Hydroxypropylcellulose, oder Kombinationen davon aufrecht erhalten werden. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein, isotonische Mittel, wie zum Beispiel Zucker, Natriumchlorid oder Kombinationen davon, einzubringen.
  • In anderen Ausführungsformen kann man Augentropfen, Nasenlösungen oder -sprays und Aerosole oder Inhalationsmittel in der vorliegenden Erfindung verwenden. Solche Zusammensetzungen sind allgemein so ausgelegt, dass sie mit dem Zielgewebetyp kompatibel sind. In einem nicht einschränkenden Beispiel sind Nasenlösungen üblicherweise wässrige Lösungen, die so ausgelegt sind, dass sie in die Nasengänge als Tropfen oder Sprays verabreicht werden können. Nasenlösungen werden so hergestellt, dass sie ähnlich bezüglich Nasenabscheidungen sind, so dass normale Ciliarwirkung aufrechterhalten wird. Somit sind in bevorzugten Ausführungsformen die wässrigen Nasallösungen üblicherweise isotonisch oder leicht gepuffert, um einen pH von etwa 5,5 bis etwa 6,5 einzuhalten. Zusätzlich können antimikrobielle Konservierungsmittel, ähnlich zu denjenigen, die in ophthalmischen Präparationen verwendet werden, Arzneimittel oder geeignete Arzneimittelstabilisatoren, falls erforderlich, in der Formulierung eingeschlossen sein. Zum Beispiel ist von verschiedenen kommerziellen Nasenpräparationen bekannt, dass sie Arzneimittel, wie zum Beispiel Antibiotika oder Antihistamine, enthalten.
  • In gewissen Ausführungsformen kann die virale Vektorkonzentration, die verabreicht wird, etwa 102, etwa 103, etwa 104, etwa 105, etwa 106, etwa 107, etwa 108, etwa 109 bis etwa 1010 PFU/ml sein, sowie jede ganze Zahl, die darin erreichbar ist und jeder darin erreichbare Bereich. In einigen Ausführungsformen kann der Konzentrationsbereich von viralen Vektoren, die einem Gewebe oder Organismus verabreicht werden können, von etwa 103 etwa 104 etwa 105 etwa 106, etwa 107 etwa 108 etwa 109 etwa 1010 etwa 1011, etwa 1012 bis etwa 1013 PFU/kg beinhalten, sowie jede ganze Zahl, die darin erreichbar ist und jeden Konzentrationsbereich, der darin erreichbar ist. In anderen Ausführungsformen kann der Konzentrationsbereich von viralen Vektoren, die einer Zelle verabreicht werden können (MOI) von etwa 0,1, etwa 0,2, etwa 0,3, etwa 0,4, etwa 0,5, etwa 0,6, etwa 0,7, etwa 0,8, etwa 0,9, etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9, etwa 10, etwa 11, etwa 12, etwa 13, etwa 14, etwa 15, etwa 16, etwa 17, etwa 18, etwa 19, etwa 20, etwa 21, etwa 22, etwa 22, etwa 23, etwa 24, etwa 25, etwa 26, etwa 27, etwa 28, etwa 29, etwa 30, etwa 31, etwa 32, etwa 33, etwa 34, etwa 35, etwa 36, etwa 37, etwa 38, etwa 39, etwa 40, etwa 41, etwa 42, etwa 43, etwa 44, etwa 45, etwa 46, etwa 47, etwa 48, etwa 49, etwa 50, etwa 51, etwa 52, etwa 53, etwa 54, etwa 55, etwa 56, etwa 57, etwa 58, etwa 59, etwa 60, etwa 61, etwa 62, etwa 63, etwa 64, etwa 65, etwa 66, etwa 67, etwa 68, etwa 69, etwa 70, etwa 71, etwa 72, etwa 73, etwa 74, etwa 75, etwa 76, etwa 77, etwa 78, etwa 79, etwa 80, etwa 81, etwa 82, etwa 83, etwa 84, etwa 85, etwa 86, etwa 87, etwa 88, etwa 89, etwa 90, etwa 91, etwa 92, etwa 93, etwa 94, etwa 95, etwa 96, etwa 97, etwa 98, etwa 99 bis etwa 100 PFU/Zelle beinhalten, sowie jeden Bereich, der darin erreichbar ist.
  • In gewissen Ausführungsformen wird die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung durch solche Routen wie orale Aufnahme verabreicht. In diesen Ausführungsformen kann die feste Zusammensetzung zum Beispiel Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tabletten, Pillen, Kapseln (z. B. hart- oder weichschalige Gelatinekapseln), Formulierungen mit verzögerter Freisetzung, buccale Zusammensetzungen, Pastillen, Elixiere, Suspensionen, Sirups, Waffeln oder Kombinationen davon aufweisen. Orale Zusammensetzungen können direkt in das Essen oder die Diät eingebracht werden. Bevorzugte Träger für orale Verabreichung weisen inerte Verdünnungsmittel auf, assimilierbare essbare Träger oder Kombinationen davon. In anderen Gesichtspunkten der vorliegenden Erfindung kann die orale Zusammensetzung als ein Sirup oder Elixier hergestellt werden. Ein Sirup oder Elixier kann zum Beispiel zumindest ein aktives Mittel aufweisen und wahlweise ein Süßungsmittel, ein Konservierungsmittel, ein Geschmacksmittel, einen Farbstoff, ein Konservierungsmittel oder Kombinationen davon.
  • In gewissen Ausführungsformen kann eine orale Zusammensetzung ein oder mehrere Bindemittel, Arzneiträger, Auflösungsmittel, Gleitmittel, Geschmacksmittel und Kombinationen davon aufweisen. Die Zusammensetzung kann eines oder mehrere des Folgenden aufweisen: Ein Bindemittel, wie zum Beispiel Tragantgummi, Akazie, Maisstärke, Gelatine oder Kombinationen davon, einen Arzneiträger, wie zum Beispiel Dikalziumphosphat, Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Zellulose, Magnesiumcarbonat oder Kombinationen davon, ein Auflösungsmittel, wie zum Beispiel Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure oder Kombinationen davon, ein Gleitmittel, wie zum Beispiel Magnesiumstearat, ein Süßungsmittel, wie zum Beispiel Rohrzucker, Laktose, Saccharin oder Kombinationen davon, ein Geschmacksmittel, wie zum Beispiel Pfefferminz, Öl von Immergrün (wintergreen), Kirschgeschmack, Orangengeschmack und Ähnliches, oder Kombinationen davon. Wenn die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu Materialien des oben angegebenen Typs Träger, wie zum Beispiel einen flüssigen Träger, enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungen vorhanden sein, oder um die physikalische Form der Dosierungseinheit auf andere Art und Weise zu modifizieren. Zum Beispiel können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beidem beschichtet sein.
  • Zusätzliche Formulierungen, die für andere Arten der Verabreichung geeignet sind, beinhalten Suppositorien. Suppositorien sind Festdosierungsformen mit verschiedenen Gewichten und Formen, üblicherweise medizinisch behandelt, um sie in das Rektum, Vagina oder Harnröhre einzusetzen. Nach Einsetzen erweichen, schmelzen oder lösen sich Suppositorien in den Hohlraumflüssigkeiten auf. Im Allgemeinen können Suppositorien herkömmliche Träger, zum Beispiel Polyalkylenglykole, Triglyceride oder Kombinationen davon, beinhalten. In gewissen Ausführungsformen können Suppositorien aus Mischungen gebildet werden, zum Beispiel dem aktiven Bestandteil in dem Bereich von etwa 0,5 bis etwa 10% und vorzugsweise etwa 1% bis etwa 2%.
  • Sterile injizierbare Lösungen werden hergestellt durch Einbringen der aktiven Verbindungen in der erforderlichen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit verschiedenen anderen Bestandteilen, wie oben offenbart, so wie erforderlich, gefolgt von Filtersterilisation. Allgemein werden Dispersionen hergestellt durch Einbringen der verschiedenen sterilisierten aktiven Bestandteile in ein steriles Vehikel, welches das Dispersionsbasismedium und/oder die anderen Bestandteile enthält. Im Falle von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung Vakuumtrocknungs- oder Gefriertrocknungstechniken, die ein Pulver des aktiven Bestandteils ergeben, wahlweise mit irgendwelchen zusätzlichen erwünschten Bestandteilen in fester oder flüssiger Form. Das flüssige Medium kann, sofern angebracht, in geeigneter Weise gepuffert sein und die flüssige Zusammensetzung wird mit ausreichender Kochsalzlösung oder Glukose isotonisch gemacht, wenn Injektion die Art der Verabreichung ist. Die Herstellung von hochkonzentrierten Zusammensetzungen für direkte Injektion wird ebenfalls betrachtet, wobei die Verwendung von DMSO als Lösungsmittel dafür vorgesehen ist, in extrem schneller Penetration bei der Lieferung von hohen Konzentrationen von aktiven Mitteln in einen kleinen Bereich zu resultieren.
  • Die Zusammensetzung ist unter den Herstellungsbedingungen und bei Lagerung vorzugsweise stabil und wird vorzugsweise gegen die Verunreinigungswirkung von Mikroorganismen, wie zum Beispiel Bakterien und Pilzen, geschützt. Es wird angenommen, dass Endotoxinverunreinigung wünschenswerterweise minimal auf einem sicheren Level gehalten wird, zum Beispiel weniger als 0,5 ng/mg Protein.
  • In besonderen Ausführungsformen kann verlängerte Absorption einer injizierbaren Zusammensetzung bewirkt werden, indem in den Zusammensetzungen Mittel verwendet werden, welche die Absorption verzögern, wie zum Beispiel Aluminiummonostearat, Gelatine oder Kombinationen davon.
  • G. KITS
  • Jede der hier beschriebenen Zusammensetzungen kann in einem Kit formuliert werden. In einem nicht einschränkenden Beispiel kann ein Vektor (z. B. ein Herpes-Virusvektor, aufweisend eine therapeutische Nukleinsäure für eine vaskuläre oder kardiovaskuläre Erkrankung oder Störung) und wahlweise ein zusätzliches Mittel in einem Kit formuliert werden. Die Kits werden somit in geeigneten Containervorrichtungen einen Vektor und wahlweise ein zusätzliches Mittel enthalten.
  • Die Kits können eine Zusammensetzung aus einem geeigneten aliquoten Vektor und wahlweise zusätzlichem Mittel aufweisen, egal ob markiert oder unmarkiert, die verwendet werden können, z. B. um eine Standardkurve für einen Detektionsassay herzustellen. Die Bestandteile der Kits können entweder in wässrigem Medium oder in fester Form, z. B. lyophilisierter Form, verpackt sein. Die Behältervorrichtungen der Kits werden allgemein zumindest eine Ampulle, Testrohr, Kolben, Flasche, Spritze oder andere Containervorrichtungen beinhalten, in die eine Komponente eingebracht werden kann, und vorzugsweise geeigneter Weise anteilig. Wenn sich mehr als eine Komponente in dem Kit befindet, wird das Kit im Allgemeinen auch einen zweiten, dritten oder weiteren zusätzlichen Behälter beinhalten, in welchen die zusätzlichen Bestandteile getrennt eingebracht werden können. Verschiedene Kombinationen von Bestandteilen können jedoch in einer Ampulle enthalten sein. Die Kits der vorliegenden Erfindung werden typischerweise auch eine Vorrichtung beinhalten, um den Vektor und optionale zusätzliche Mittel zu enthalten, sowie jeden anderen Reagenzbehälter, die für den kommerziellen Verkauf streng getrennt sind. Solche Behälter können spritzgieß- oder blasgeformte Kunststoffbehälter beinhalten, in denen die gewünschten Ampullen aufbewahrt werden.
  • Wenn die Bestandteile des Kits in einer oder mehreren flüssigen Lösungen zur Verfügung gestellt werden, ist die flüssige Lösung eine wässrige Lösung, wobei eine sterile wässrige Lösung besonders bevorzugt ist. Die Zusammensetzung aus Vektor und optionalem zusätzlichem Mittel kann auch in einer mit einer Spritze verabreichbaren Zusammensetzung formuliert werden. Im Falle von mit einer Spritze verabreichbaren Zusammensetzungen kann die Behältervorrichtung selbst eine Spritze, Pipette und/oder andere ähnliche Apparatur sein, aus welcher die Formulierung in einen Bereich des Körpers eingebracht werden kann, in ein Tier injiziert werden kann, oder in die anderen Komponenten des Kits eingebracht und/oder mit ihnen vermischt werden kann.
  • Die Komponenten des Kits können auch als (ein) getrocknete(s) Pulver zur Verfügung gestellt werden. Wenn Reagenzien und/oder Komponenten als ein trockenes Pulver zur Verfügung gestellt werden, kann das Pulver durch die Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels oder flüssigen Trägers in diesem Fall der Mischungen wieder gebildet werden. Es ist vorgesehen, dass das Lösungsmittel auch in einer anderen Behältervorrichtung zur Verfügung gestellt werden kann.
  • Unabhängig von der Anzahl und der Art der Behälter können die erfindungsgemäßen Kits auch ein Instrument aufweisen und damit verpackt sein, welches bei der Injektion/Verabreichung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in ein Gewebe, Organ oder Körper eines Tieres behilflich ist. Ein solches Instrument kann eine Spritze, Pipette, Zange oder jede medizinisch anerkannte Verabreichungsvorrichtung sein.
  • Die folgenden Beispiele sind enthalten, um erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsformen zu demonstrieren. Im Licht der vorliegenden Offenbarung wird jedoch der Fachmann erkennen, dass viele Veränderungen in den spezifischen Ausführungsformen vorgenommen werden können, die hier offenbart sind, ohne vom Geist und Umfang der beanspruchten Erfindung abzuweichen.
  • BEISPIEL 1
  • VEKTORHERSTELLUNG
  • R3616 und R849
  • Hier beschrieben ist die Konstruktion eines replikationskompetenten Neurovirulenz abgeschwächten (geschwächt für das Wachstum innerhalb des zentralen Nervensystems), rekombinanten γ134.5-deletierten HSV-1-Viruses, enthaltend das lacZ-Gen, unter der Kontrolle des γ134.5-Promoters (HSVlacZ oder R849). Die folgenden Verfahren und Vektoren sind in US-Patent Nrn. 5 238 688 und 6 120 773 ausgeführt.
  • Obwohl der HSV-Vektor R3616 einen wachstumsgeschwächten HSV durch Spaltung in ein nichtessentielles Gen oder Gene beispielhaft veranschaulicht, werden die Fachleute erkennen, dass andere nichtessentielle HSV-Gene gespalten werden können (z. B. Insertion, Substitution oder Deletion), um einen ähnlichen wachstumsgeschwächten HSV zu erhalten (siehe Tabellen 1 und 3). Weiterhin werden die Fachleute auch erkennen, dass ein solches gespaltenes Gen ein essentielles Gen sein kann (siehe Tabellen 1 und 2).
  • Ein rekombinanter Virus R3617, dem 1 Kbp an DNA in jeder Kopie des γ134.5-Gens fehlt, wird durch gemeinsames Einbringen von intakter R4002-DNA und der DNA von Plasmid pRB3616 in Kaninchenhautzellen erzeugt. In Plasmid pRB3616 wurden die Sequenzen, welche das meiste des codierenden Bereiches eines γ134.5-Genes enthalten, d. h. solche, die sich zwischen den BstEII- und StuI-Stellen innerhalb des BamHI S-Fragments von HSV-1-Stamm F befinden, entfernt. Um pRB3616 zu erzeugen, wird Plasmid pRB143 [Post et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 7., 7, 4201 (1980)] mit BstEII und StuI verdaut, mit T4-Polymerase stumpf beendet und religiert. Die Nachkommen der Transformation werden auf 143 tk– (Thymidinkinase)-Zellen, die mit Medium, enthaltend BUdR (Bromdeoxyuridin), überschichtet sind, plattiert, um nach tk–-Viren zu selektieren. Da das tk-Gen in beiden Kopien des γ134.5-Genes in R4002 vorhanden ist, enthalten die selektierten Nachkommen Deletionen in beiden Kopien. Der slektierte tk–-Virus, bezeichnet als R3617, wird auf die Gegenwart der Deletionen in beiden Kopien des γ134.5-Genes analysiert. Ein intaktes γ134.5-Gen ist nicht vorhanden.
  • Für Assays auf Neurovirulenz musste die Deletion des nativen tk–-Genes von R3617, welches seinen Origin aus HSV-1(F)Δ305 herleitet, repariert werden. Dies wird erreicht durch gemeinsames Einbringen von intakter R3617-DNA und Bam-HI-Q-Fragment, enthaltend das tk-Gen, in Kaninchenhautzellen (Chou und Roizman, 1994). Der Virus, der für einen tk+-Phenotyp in 143tk–-Zellen selektiert wird, wird R3616 genannt (Chou et al., 1990). Der rekombinante R849 (HSVlacZ)-Virus, der die β-Galctosidasereporterkasette an Stelle des γ134.5-Gens trägt, wird wie folgt erzeugt. Kaninchenhautzellen werden mit intakter R4002-DNA und einem Plasmid mit dem BstEII-StuI-DNA-Fragment des γ134.5, ersetzt durch ein BstEII-StuI-Fragment, enthaltend die codierende Domain des β-Galctosidase-Gens, transfiziert. Rekombination tritt durch die flankierenden Sequenzen auf. Die Nachkommen der Transfektion werden in 143tk–-Zellen in der Gegenwart von BUdR slektiert. Ein Klon wird gereinigt, auf die Sequenz des offenen β-Galactosidase-Leserahmens hin getestet, und dann mit BamHI-Q-DNA-Fragmenten cotransfiziert, um das Thymidinkinase-Gen zu retten. In dem R849 (HSVlacZ)-rekombinanten Virus wird die β-Galactosidase codierende Sequenz im Rahmen mit dem γ134.5-Gen, welches für die ersten 28 Aminosäuren des Genomprodukts codiert, fusioniert. Das chimäre Gen wird vom γ134.5-Promoter aus exprimiert. Virale Titer werden in Verozellen gemessen. R3616 wird unter Zugangsnummer ATCC VR2280 bei der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, am 14. Aug. 1990 hinterlegt.
  • Adeno-assoziierte virale Vektoren
  • Für Kontrollen in Vergleichsexperimenten werden adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) erzeugt und wie zuvor beschrieben gereinigt (Svenson et al., 1999). Kurz, das AAV-Helferplasmid, pAd14, enthält die AAV-rep- und ap-Gene, kloniert in die Xba-I-Stelle, und den SV40-Origin der Replikation, kloniert in die BamHI-Stelle des pBluescript. Der Virus wird durch CsCl-Gradientenzentrifugation gereinigt, gegen PBS dialysiert und in Aliqouts bei –80°C gelagert. Virustiter wird unter Verwendung eines Tüpfelpunkt-Hybridisierungsassays bestimmt, um die Anzahl von viralen Genomen/ml zu bestimmen. HeLa-Zellen werden mit dem Virus infiziert und detektiert, indem sie mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galctopyranosid (X-gal) gefärbt werden, um 3-Galactosidase (lacZ)-Aktivität 24 Stunden nach Infizierung offen zu legen.
  • BEISPIEL 2
  • ZELLKULTUR UND MTT-ASSAY
  • Um die geeignete Dosis für vaskulären Gentransfer zu bestimmen, werden menschliche Nabelvenenendothelzellen (HUVECs) mit abgestuften Konzentrationen von HSV-1 120 Min. in Kontakt gebracht und die Lebensfähigkeit wird unter Verwendung eines Standard-72-Stunden-MTT-Assays wie unten beschrieben bestimmt.
  • Menschliche Nabelvenenendothelzellen (HUVECs, Bio Whittaker/Clonetics) werden in vollständigem Medium EBM-2 (Bio Whittaker #CC3156) und Einzelanteilen von EGM-2 (#CC4176) suspendiert und zu 100% Konfluenz in P75-Kolben in einen 37°C-Inkubator mit befeuchteten 5% CO2 wachsen lassen. Für die Passage von Zellen werden alle Reagenzpackungsinhalte (HBSS, Trypsin/EDTA, TNS, Bio Whittaker CC-5034) in einem 37°C-Wasserbad aufgetaut und verbrauchte Medien werden entfernt und weggeworfen. HUVECs werden mit ausreichend HBSS gewaschen, um sie zu bedecken, Trypsin/EDTA wird hinzugefügt und die Kolben werden behutsam unter einem inversen Mikroskop geschüttelt. Nach dem Verlust der Haftung der Zellen wird Trypsin mit einem gleichen Volumen TNS inaktiviert. Die Zellen werden bei 1200 Upm 5 Minuten zentrifugiert und das Pellet wird in vollständigem EBM-2-Medium und Einzelaliquots EGM-2 resuspendiert.
  • Ein modifizierter colorimetrischer Assay, basierend auf der selektiven Fähigkeit von lebenden Zellen, das gelbe Salz MTT (3-[4,5-Dimethylthiozol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, Sigma Chemical Co.) zu Formazan zu reduzieren, wird verwendet, um die HUVEC-Lebensfähigkeit nach viraler Behandlung zu quantifizieren. HUVECs werden im Medium suspendiert und in 96-Well-Flachboden-Mikrotiterplatten mit einer Dichte von 5 × 103 pro ml in einem Volumen von 0,1 ml eingebracht. Die Zellen werden über Nacht inkubieren lassen und dann mit HSV R3616, suspendiert in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (HBS), 2 Stunden bei 37°C mit befeuchtetem 5% CO2 behandelt. Das Überstehende wird aspiriert und 0,1 ml des vollständigen Mediums EBM-2 werden in jede Vertiefung zugegeben. Die Nullplatte wird 60 Min. inkubieren lassen. Das Überstehende wird wiederum aspiriert und MTT (5 mg/ml) werden in jede Vertiefung der Nullplatte für 4 Stunden bei 37°C zugegeben. Nach Bildung von Formazankristallen wird das Überstehende aspiriert, wobei aufgepasst wird, dass die darunter liegende Zellschicht nicht gestört wird. Die Formazankristalle werden in 0,1 ml DMSO (Sigma) aufgelöst und die Absorption bei 515 nm unter Verwendung eines Mikroplattenspektrophotometers (SpectraMax 340 004), der an einen Personal-Computer (Apple Macintosh) angeschlossen ist, gemessen. Dieser Prozess wird nach 72 Stunden wiederholt und das relative Zellüberleben wird berechnet. Das Experiment wird insgesamt dreimal wiederholt.
  • HUVECs, infiziert mit R3616 bei MOI = 1 überleben über 72 Stunden mit einer Rate von 92 ± 19%. Wie erwartet überlebt ein abnehmender Anteil von Zellen mit ansteigenden Viruskonzentrationen, wobei lediglich 4 ± 2% Zellen bei einem MOI = 50 überleben. Nachfolgende virale Dosierungen werden nach Abschätzung von Zellzahl im gesamten Gewebevolumen mit MOIs im Bereich von 1–2 ausgewählt.
  • BEISPIEL 3
  • INFEKTION VON MENSCHLICHEN SCHENKELVENEN
  • IN VOLLSTÄNDIGER ORGANKULTUR
  • Um in vitro-Gentransfer in ruhendem Vaskulargewebe zu testen, werden menschliche Schenkelvenen, die bei der Operation weggeworfen wurden, bei 120 mmHg 10 Min. mit Träger, HSVlacZ (R849) oder einem adeno-assoziierten Kontrollvirus, enthaltend das lacZ-Gen (AAVlacZ) infiziert.
  • Segmente der Schenkelvene werden von Patienten bei einer koronaren oder peripheren Bypassoperation unter einem bewährten Protokoll entnommen. Kein Patient hat irgendeine Vorgeschichte einer venösen Erkrankung. Menschliche Schenkelvenensegmente mit Durchmessern im Bereich von 3,5 bis 5,5 mm werden durch den operierenden Chirurgen auf gute Qualität bewertet. Menschliche Schenkelvenen werden infiziert und vollständig kultiviert.
  • Segmente werden behutsam mit Saline gespült, um jegliche restliche Fremdkörper zu entfernen und überschüssiges Adventitia wird scharf abgeschnitten. Venensegmente werden zu Ringen geschnitten und in getrennte Kulturvertiefungen mit RPMI-1640-Medium/15% FBS gegeben und bei 37°C inkubiert. Die Vene wird in benachbarte Kontroll- und experimentelle Segmente unterteilt und getrennt doppelt mit 22-Gauge-Kathetern an beiden Enden zur Vektorinfusion und Drucküberwachung kanüliert (Hewlett-Packard 78534B, Palo Alto, CA). Die Venen werden jeweils mit Träger (n = 4), AAVlacZ 4 × 1011 pfu/ml (n = 2), oder HSVlacZ (R849) 6,5 × 108 pfu/ml 10 Min. bei 120 mmHg mit eingeschränktem Ausfluss und geringer Scherspannung gedehnt. Der Hauptkanal der Vene wird dann mit Saline gespült und die Vene zu Ringen von 0,5 cm Länge geschnitten.
  • Der erste Ring wird sofort in 1,25% Glutaraldehyd 10 Min. fixiert, in PBS gewaschen und über Nacht bei 37°C mit X-gal in einer dunklen Umgebung für chromogene Überprüfung inkubiert. Die verbleibenden Ringe (4–7, abhängig von der verfügbaren Menge an Vene) werden jeweils in getrennte Kulturvertiefungen mit 6 ml Medium (RPMI-1640 mit 15% FBS) gegeben und bei 37°C inkubiert. Das Medium wird alle zwei Tage gewechselt. Venensegmente werden aus dem Medium nach 3, 5, 10, 14, 20, 28, 32, 34, 40, 48 und 55 Tagen entnommen, fixiert und wie oben mit X-gal gefärbt.
  • Alle Segmente, die HSVlacZ (R849) ausgesetzt sind, exprimieren β-Galactosidase. Expression ist nicht sofort nach Behandlung aller Venen vorhanden, aber nach 20 Tagen (z. B. 34 Tagen) zeigen alle Venen signifikante Expression in der Intima und Adventitia und zu einem geringeren Ausmaß in der Media. Segmente werden mit Eosin gegengefärbt. HSV-vermittelte Transgenexpression wird nicht durch die EC-Schicht beschränkt, sondern ist in allen Zellschichten vorhanden, einschließlich einer signifikanten Menge an Expression in der Medialschicht, welche diejenige zu überschreiten scheint, die mit adenoviral-vermittelter Infektion beobachtet wird. Die Fähigkeit von HSV, die EC-Schicht wirksam zu durchdringen und Zellen tief innerhalb der Venenwand zu infizieren, ist ebenso überraschend, wie es zuvor nicht gezeigt wurde. Expression besteht 55 Tage fort, dem Endpunkt bei dieser Untersuchung. Dies ist in starkem Kontrast zu advenoviral-vermitteltem Gentransfer, der allgemein nach sieben Tagen abbaut.
  • Expression nach AAVlacZ-Behandlung ist minimal, wobei Schenkelvenen, die AAVlacZ ausgesetzt waren, inkonsistente Färbung im Intima und Adventitia zeigen, die sehr viel weniger ausgeprägt ist als mit HSVlacZ (R849). Expression ist in keinem Venensegment offensichtlich, das lediglich dem Träger ausgesetzt war.
  • Abschnitte werden auch mit einem Kaninchen-anti-human-Antikörper gegen von-Willebrand-Faktor (vWF) gefärbt, um die Gegenwart und Integrität des Endothels durch Immunohistochemie zu untersuchen. 4 μm-Abschnitte von in Paraffin eingebetteten Geweben werden auf Poly-L-lysin beschichteten Objektträgern befestigt und durch sequentielles 5 minütiges Waschen mit Xylol und abnehmenden Konzentrationen von Ethanol und dH2O entparaffiniert. Abschnitte werden dann in vorgewärmter 10 mM EDTA (pH 6,0) 60 Minuten bei 70°C inkubiert, dreimal mit dH2O gewaschen und in vorgewärmte Proteinase K (20 μg/ml in PBS) 20 Mm. bei 37°C inkubiert. Nach Blockieren mit 10%iger Lösung aus normalem Ziegenserum (Vector, Burlingame, CA) in 0,5% Kasein (Sigma) und PBS wird endogenes Avidin und Biotin unter Verwendung eines Blockierungskits (Vector) gequencht. Die Objektträger werden dreimal mit 0,5% Kasein/0,01% Tween 20 in PBS gewaschen und über Nacht bei 4°C mit Kaninchen-anti-human-vWF (DAKO, Dänemark), eingestellt auf einen Titer von 0,8 μg/ml in 0,5% Kasein, inkubiert. Geeignete negative Kontrollen (Kaninchen IgG-Isotyp, DAKO) werden ebenfalls verwendet. Die Objektträger werden dreimal gewaschen und mit sekundärem biotinyliertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (2 μg/ml in PBS, 0,5% Kasein und 10% normales menschliches Serum) 25 Min. bei 37°C inkubiert. Endogene Peroxidase wird mit 3% H2O2 (20 Min. bei Raumtemperatur (RT)) gequencht und die Objektträger werden gewaschen und mit Vectastain Standard Elite (ABC) 25 Min. bei RT inkubiert. Gewebe werden mit dem Vector DAB-Kit entwickelt und mit einer 0,03% Lösung light green SF yellowish (Fisher, Hanover Park, IL) gegengefärbt. Die Abschnitte werden in Alkohol und Xylol dehydriert, mit Permount und Deckgläsern befestigt und mittels Lichtmikroskopie untersucht.
  • Behandlung mit HSVlacZ (R849) beeinträchtigt die Integrität der EC-Schicht nicht merklich, wie qualitativ durch vWF-Färbung in kultivierten menschlichen Venen 34 Tage nach Behandlung mit Träger oder HSVlacZ (R849) qualitativ festgestellt wird.
  • BEISPIEL 4
  • INFEKTION VON EXTERNEN KANINCHENHALSADERSTÜCKEN
  • Um den in vivo-Gentransfer von proliferierendem Vaskulargewebe zu zeigen, wird die externe Halsader von männlichen weißen Neuseeland-Kaninchen mit Träger, HSVlacZ (R849) oder AAVlacZ behandelt.
  • Weiße männliche Neuseeland-Kaninchen (3,5–4 kg) werden durch intramuskuläre (1 m) Injektion mit Ketaminhydrochlorid (40 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg), erweitert mit Halothan über endotracheale Intubation, anästhesiert. Antibiotische Prophylaxe wird mit Enrofloxacin 10 mg/kg IM täglich zur Verfügung gestellt. Unter Verwendung von steriler Technik wird die externe Halsader frei gelegt und zwei Zweige mit 24-Gauge-Kathedern kanüliert. Eine Kanüle wird für Spülung und Infektion verwendet und die andere zur intralumenalen Drucküberwachung. Der Hauptkanal wird jeweils mit Träger (n = 6), AAVlacZ 4 × 1011 pfu/ml (n = 2) oder HSVlacZ (R849) 4 y 108 pfu/ml (n = 4) 10 Minuten bei 100 mmHg infiziert.
  • Folgend auf die Infektion wird die Vene mit Kochsalzlösung gespült, herausgeschnitten und mit zwei Klappen versehen. Die ipsilaterale allgemeine Carotidarterie (CCA) wird dann durch den gleichen Schnitt frei gelegt und das Tier systematisch mit Heparin (200 U/kg) intravenös antikoaguliert. Die CCA wird doppelt abgeklemmt und eine 1,5 cm Längsarteriotomie in der Nähe des cranialen Schilddrüsenzweiges durchgeführt. Die Arteriotomie wird mit externer Halsadervenenpatch-Angioplastie unter Verwendung von laufender 8–0 Polypropylennaht (Davis-Geck TE-145, Manatee, PR) unter 4,5-facher Lupenvergrößerung wieder verschlossen. Mit Ultraschall wird die Durchflusszeit durch das Transplantat gemessen (Transonics Systems Inc. HT207, Ithaca, NY) und unter Verwendung eines digitalen Datensammelsystems (Lab Master D. M. A., Scientific Solutions, Inc., Solon, OH) aufgezeichnet. Alle Arbeitsschritte zur Implantation von externen Halsaderstücken in Kaninchen werden ohne Komplikation abgeschlossen. Es gibt keinen signifikanten Unterschied im Hauptblutfluss in den mit Träger behandelten gegenüber viral infizierten Stücken zur Zeit der Implantation (Träger 15,0 ± 1,2 gegen viral 18 ± 1,0 ml/Min., p = NS). Der Schnitt wird verschlossen und das Tier sich erholen lassen. Antikoagulation wird nicht reversiert.
  • Nach vier Wochen werden die Venenstücke entnommen und auf Durchgängigkeit und β-Galactosidase-Expression unter Verwendung von X-gal überprüft. Die Tiere werden reanästhesiert und die Venenstücke wieder frei gelegt. Intraarterieller Druck und Blutfluss durch das Stück wird wiederum gemessen und aufgezeichnet. Alle Venenstücke sind zur Zeit der Entnahme nach vier Wochen (n = 12) offen.
  • Das Venenstück wird in drei Abschnitte geteilt, beginnend ein mm distal zum Beginn des Stückes und endend ein mm proximal seines Endpunktes. Die geEntnahmeten Gefäße werden in 1,25% Glutaraldehyd 10 Min. fixiert, in PBS gewaschen und über Nacht bei 37°C mit X-gal inkubiert. Fünf-μm-Sektionen werden von jedem der Teile des Stückes geschnitten und unter Verwendung von Eosin, Hematoxylin und Eosin (H & E) und Weigert van Gieson gefärbt. Zehn Hochleistungsfelder (40X) jedes Gewebeabschnitts werden unter Verwendung eines Mikroskops (Nikon Microphoto-FX), ausgerüstet mit einer Digitalkamera (Song PowerHAD 3CCD), untersucht. Gefärbte Zellen/Kerne werden unter Verwendung von bildgebender Standardsoftware (ImagePro Plus 3.0.1) gezählt. Die Gesamtanzahl von β-Galactosidase-positiven Zellen wird im Neointima, Media und Adventitia, welches sich umlaufend um das Lumen herum befindet, gezählt. Die Gesamtanzahl Zellen wird auf den H- & E-Abschnitten im Neointima, Media und Adventitia gezählt. Die mittlere Anzahl positiver Zellen wird als Prozentanteil der Gesamtanzahl Zellen ausgedrückt, was die Infektionseffektivität widerspiegelt.
  • Alle Venenstücke, die HSVlacZ (R849, n = 4) ausgesetzt waren, zeigen signifikante β-Galactosidase-Expression in allen Schichten der Venenwand 4 Wochen nach Behandlung (d. h. Infektion), insbesondere innerhalb der glatten Muskelzellen (SMCs), aufweisend das Neointima (48 ± 2% Infektionseffektivität). Alle Objektträger werden mit Eosin gegengefärbt. Die berechneten Infektionseffektivitäten in dem Adventitia, Media und Neointima sind 42 ± 1%, 58 ± 3% bzw. 48 ± 2%. Interessanterweise gibt es auch moderate Expression im arteriellen Segment (der äußeren Wand der Rekonstruktion), insbesondere in der Nähe der Ränder, welche den Nahtgegenstand umgeben. Im Gegensatz dazu zeigen Stücke, die mit AAVlacZ infiziert wurden, inkonsistente Transgenexpression, meist beschränkt auf die Adventitia. Expression ist in den Träger-behandelten Stücken oder in irgendeiner entnommenen externe Halsvene oder CCAs, die zu HSVlacZ (R849)-infiziertem Venenstück oder einem AAV-infizierten Venenstück contralateral sind, nicht offensichtlich.
  • BEISPIEL 5
  • EFFEKTE VON R849 AUF KULTIVIERTE MENSCHLICHE ZELLEN
  • Um die Wirkung von HSV R849 (HSVlacZ) auf kultivierte menschliche Zellen zu zeigen, werden menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs, Bio Whittaker/Clonetics #CC2517) und glatte Nabelarterien-Muskelzellen (#CC2579) getrennt in vollständigem Medium EGM bullet kit (#CC3182) suspendiert und auf 100% Konfluenz in P75-Kolben in einem 37°C Inkubator mit befeuchtetem 5% CO2 wachsen lassen. Ein modifiziertes colorimetrisches Essay, basierend auf der selektiven Fähigkeit von lebenden Zellen, das gelbe Salz MTT (3-[4,5-Dimethylthiozol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolinbromid, Sigma Chemical Co.) zu Formazan zu reduzieren wird verwendet, um HUVEC- und UASMC-Lebensfähigkeit, folgend auf Virusbehandlung und Rettung mit Acyclovir (Abbott Laboratories), zu quantifizieren.
  • HUVECs, infiziert mit R849 (HSVlacZ) bei einem MOI = 1, haben relatives Zellüberleben von 102 ± 10% bzw. 81 ± 4% Zellen nach 48 bzw. 72 Stunden. Ähnlich haben infizierte UASMCs relatives Zellüberleben von 92 ± 10% bzw. 73 ± 6%. Wie erwartet überlebt ein abnehmender Teil an Zellen mit ansteigenden Viruskonzentrationen, wobei lediglich 12 ± 3% HUVECs und 5 ± 10% UASMCs nach Infektion mit einem MOI = 25 Überleben (relatives Zellüberleben nach 72 Stunden ist mit Acyclovir (0,25 μg/ml) 45 ± 5%, mit Acyclovir (0,5 μg/ml) 85 ± 9%), während ähnlich infizierte UASMCs sogar mit 10 μg/ml Acyclovir nicht gerettet werden konnten. Diese Ergebnisse zeigen, dass (1) R849 (HSVlacZ) in geringen Dosen relativ nicht-toxisch ist, (2) R849 (HSVlacZ) bei höheren Dosen gegenüber SMCs toxischer ist als gegenüber Endothelzellen (ECs) und (3) ein Hauptteil an ECs, die einem MOI = 25 ausgesetzt werden, mit therapeutischen Dosen von Acyclovir gerettet werden können, während dies bei SMCs nicht möglich ist. Somit zeigt R849 (HSVlacZ) Selektivität für SMCs, der Zielzellpopulation in dieser therapeutischen Strategie.
  • BEISPIEL 6
  • WIRKUNGEN VON R849 AUF VOLLSTÄNDIGE MENSCHLICHE VENEN
  • Wirkungen von R849 (HSVlacZ) auf vollständige menschliche Venen werden nochmals untersucht (wie oben in Beispiel 3 beschrieben). Nicht verwendete Stücke von Schenkelvenen, entnommen während koronarem oder periphärem Bypass, werden mit 22-Gauge-Kathetern an beiden Enden kanüliert und 10 Min. bei 120 mmHg mit entweder Träger oder 1 × 106 PFU/ml R849 (HSVlacZ, n = 8) gedehnt. Der erste Ring wird sofort in 1,25% Glutaraldehyd 10 Min. fixiert, in PBS gewaschen und über Nacht bei 37°C mit X-gal in einer dunklen Umgebung inkubiert. Die verbleibenden Ringe werden jeweils in getrennten Kulturvertiefungen mit 6 ml Medium (RPMI-1640 mit 30% FBS) eingebracht und bei 37°C inkubiert. Venensegmente werden aus dem Medium entnommen, fixiert und mit X-gal nach 2–55 Tagen gefärbt.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass R849 (HSVpacZ)-infizierte Segmente β-Galactosidase-Expression bis zu 55 Tage folgend auf die Infektion zeigen. Interessanterweise ist die transgene Expression nicht auf die ECs eingeschränkt, sondern ist in allen Zellschichten vorhanden, einschließlich einer signifikanten Menge an Expression in der Media, was das zu überschreiten scheint, was mit adenoviral-vermittelter Infektion beobachtet wird.
  • Offensichtlich darf keine Strategie, die dazu gedacht ist, Restenose einzuschränken, die antithrombotische Endothelschicht stören. Um mögliche negative Effekte von HSV auf das Endothel zu untersuchen, werden kultivierte menschliche Schenkelvenen mit R849 (HSVlacZ) behandelt und dann auf den endothelen Marker hin, von-Willebrand-Faktor (vWF), durch Immunofärbung untersucht. Venen werden entweder mit Träger oder R849 (HSVlacZ, 6,5 × 108 pfu/ml) 10 Min. bei 120 mmHg wie oben beschrieben gedehnt. Die Venensegmente werden aus dem Medium entfernt, fixiert und gefärbt. Vier-μm-Abschnitte von in Paraffin eingebetteten Geweben werden auf mit Poly-L-lysin beschichtete Objektträger montiert und durch aufeinander folgendes 5 minütiges Waschen mit Xylol und abnehmenden Konzentrationen von Ethanol und dH2O entparaffiniert. Die Objektträger werden drei mal mit 0,5% Kasein/0,01% Tween 20 in PBS gewaschen und über Nacht bei 4°C mit Kaninchen-anti-human-vWF (DAKO, Dänemark), eingestellt auf einen Titer von 0,8 μg/ml in 0,5% Kasein, inkubiert. Geeignete Negativkontrollen (Kaninchen-lgG-Isotyp, DAKO) werden ebenfalls verwendet. Die Objektträger werden drei mal gewaschen und mit sekundärem biotinyliertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (2 μg/ml in PBS, 0,5% Kasein und 10% normales menschliches Serum) für 25 Min. bei 37°C inkubiert. Die Gewebe werden mit dem Vector-DA-Kit entwickelt und mit einer 0,03%igen Lösung von light green SF yellowish (Fisher, Hanover Park, IL) gegengefärbt. Gentransfer wird durchweg über die Vaskulärwand hinweg gezeigt, wobei das Endothel zum größten Teil in Takt verbleibt, wie durch die Gegenwart von vWF entschieden werden kann.
  • BEISPIEL 7
  • R849-INFEKTION IN VENENIMPLANTATEN IN IMMUNOKOMPETENTEN TIEREN
  • Experimente im Kaninchenvenenpatchmodell werden nochmals durchgeführt (wie in Beispiel 4 beschrieben), um den Zeitablauf der R849 (HSVlacZ)-vermittelten Infektion mit dem Potential für langzeitprogrammierte Expression zu untersuchen.
  • Männliche weiße Neuseeland-Kaninchen (3,5–4 kg) werden anästhesiert und die externe Halsvene wird chirurgisch freigelegt. Der Hauptkanal wird jeweils mit Träger (n = 6), R849 (HSVlacZ) 4 × 108 pfu/ml (n = 8) oder R3616 3 × 108 pfu/ml (Kontrollvirus, n = 2) 10 Min. bei 120 mmHg infiziert. Folgend auf die Infektion wird die Vene herausgeschnitten und wie eine übliche Carotidvenenstückangioplastie unter Verwendung von laufender 8-0-Polypropylennaht hergestellt. Diese Venenpatchtechnik hat den Vorteil, dass ein arterielles Venensegment mit minimalem chirurgischem Trauma erzeugt wird. Nach vier Wochen werden die Tiere reanästhesiert und die Venenstücke wieder frei gelegt. Es gibt keinen signifikanten Unterschied im Hauptblutfluss in der Kontrolle (31 ± 2 ml/Min.) gegenüber viral infizierten Stücken (34 ± 3 ml/Min.) zur Zeit der Implantation. Alle Venenstücke sind während der Zeit der Entnahme bei vier Wochen frei. Stücke, die mit R849 (HSVlacZ) mit 4 × 108 pfu/ml behandelt wurden, zeigen markante β-Galactosidase-Färbung in allen Teilen der Gefäßwand, am stärksten bemerkbar innerhalb der medialen Schicht. Berechnete Infektionseffektivitäten (Prozent infizierte Zellen) sind 42 ± 2% in der Adventitia, 44 ± 9% in der Media und 45 ± 6% in der Neointima. Moderate β-Galactosidase-Färbung wird auch in dem unbehandelten arteriellen Segment, welches dem Venenstück benachbart ist, festgestellt, sowie in den weiter entfernteren Abschnitten der nativen Carotidarterie. Diese gleichmäßigen Infektionsraten, gekoppelt mit stabiler und dauerhafter Transgenexpression, überschreiten die berichteten Ergebnisse mit anderen Vektoren bei weitem. [Moawad et al., Ann. Vasc. Surg. 15: 367–73, 2001, Schwartz et al., J. Vasc. Surg. 29: 874–83, 1999, Hanna et al., J. Vasc. Surg. 31: 770–80, 2000, George et al., Circ. 101: 296–304, 2000, Eslaim et al., J. Vasc. Surg. 31: 1149–59, 2000, Dollery et al., Circ. 99: 3199–205, 1999, Scheinman et al., J. Vasc. Surg. 29: 360–9, 1999, Schneider et al., J. Vasc. Surg. 29: 543–50, 1999 und Waugh et al., Circ. 102: 332–7, 2000]. Weiterhin ist die Dosis von R849 (HSVlacZ), die erforderlich ist, um diese Ergebnisse zu erreichen, nicht größer als 108 pfu/ml, um einige Größenordnungen geringer als traditionelle Strategien unter Verwendung von Adenovirus (siehe oben).
  • BEISPIEL 8
  • WIRKUNG VON R849 AUF NEOINTIMALE HYPERPLASIE IN IMMUNOKOMPETENTEN TIEREN
  • Ein neues Modell für hämodynamisch beeinträchtigte Venenstückangioplastie wird verwendet, um die Wirkungen von R849 (HSVlacZ) auf SMC-Proliferation und Neointimalhyperplasie zu untersuchen. Beeinträchtigung des Blutflusses, zusammen mit seinen begleitenden Reduktionen in der Scherspannung, ist ein wohlbekannter Stimulator für SMC-Proliferation [Rectenwald et al., Circ. 102, 2000 und Kumar et al., Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 17: 2238–44, 1997] und ist ein wichtiger Prädispositionsfaktor zu Venenimplantatversagen [Meyerson et al., J. Vasc. Surg. 34: 90–7, 2001]. Daher wird ein Modell für venöse Transplantation unter profund reduziertem Fluss entwickelt, um versagende Bypass-Implantate zu simulieren.
  • Allgemein werden Kaninchen chirurgischer Venenfreilegung, R849 (HSVlacZ)-Infektion und Venenpatchangioplastie, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, unterzogen. Vor dem Wundverschluss wird der Hauptzweig der Angioplastierekonstruktion (die allgemeine Carotidarterie) abgebunden, was lediglich den Ausfluss über eine kleine craniale Schilddrüsenarterie frei lässt. Das hat den reproduzierbaren Effekt der Verringerung des Blutflusses auf ungefähr 5% der Basislinienwerte, ein Zustand der bis zum Verlust bestehen bleibt.
  • Das resultierende Venenstück wird grob verdickt und kontrahiert, das dickste jeweils berichtete für ein Venenimplantat im Tiermodell. Die histologischen Charakteristiken sind sehr ähnlich zu jenen beim Versagen von menschlichen Bypass-Implantaten, einschließlich der Gegenwart von laminarem Thrombus und flusseinschränkender lumenaler Stenose.
  • Insbesondere wird dieses Modell verwendet, um die Wirkungen von R849 (HSVlacZ) auf SMC-Proliferation in vivo zu untersuchen. Externe Kaninchenhalsvenen werden mit sowohl R849 (HSVlacZ, n = 8) als auch Träger (PBSS, n = 6) 10 Minuten infiziert und dann als Carotidvenenstücke mit eingeschränktem Ausfluss hergestellt. Hauptblutfluss und Scherspannung zur Zeit der Implantation sind bei R849 (HSVlacZ) infizierten (2,8 ± 0,3 ml/Min., 0,17 ± 0,03 dyne/cm2) und Träger (2,6 ± 1,7 ml/Min., 0,32 ± 0,1 dyne/cm2)-gruppen ähnlich. Nach vier Wochen werden die Venenstücke wieder freigelegt, mit dem zuletzt aufgezeichneten Blutdruck infusionsfixiert und morphometrisch auf neointimale Hyperplasie untersucht. Fünf-μm-Abschnitte werden geschnitten, gefärbt unter Verwendung der Weigert-van-Gieson-Technik, um die innere elastische Lamina hervor zu heben, und unter Verwendung von digitaler Planimetrie analysiert (Adobe Photoshop, Adobe Systems, Inc., San Jose, CA). R849 (HSVlacZ)-infizierte Stücke sind weitgehend durchlässig, mit signifikant geringerer neointimaler Hyperplasie als trägerbehandelte Kontrollen (R849 (HSVlacZ) 280 ± 28 gegenüber Träger 410 ± 38 um, p = 0,003). Behandlung mit R849 (HSVlacZ) bringt die „niedrig-fluss"-Patchmorphologie im Wesentlichen wieder zur „hoch-fluss"-Physiologie zurück.
  • BEISPIEL 9
  • AUSROTTUNG VON BESTEHENDER R849-INFEKTION MIT ACYCLOVIR UND SYSTEMISCHE TOXIZITÄT VON R849 INFEKTION VON R849
  • Die Möglichkeit, die Infektion nach Vervollständigung des gewünschten biologischen Effekts des Vektors abzuschwächen oder zu eliminieren, wäre eine signifikante Verbesserung von Gentherapiestrategien und würde dazu dienen, die Toxizität und das Potential für Langzeitfolgeerkrankungen einzuschränken. Acyclovirnatrium (12-Amino-1,9-dihydro-9-[(2-hydroxyethoxy)methyl]-6H-purin-6-on, Markenname Zovirax, Alphaparm USPD, Inc.) ist ein synthetisches Purinnukleosidanaloges mit einem antiviralen Spektrum, das auf Herpes-Viren, einschließlich Herpes Simplex, Herpes Zoster (Gürtelrose), Varizellen (Windpocken), Epstein-Barr-Virus und Cytomegalovirus eingeschränkt ist. Klinisch ist seine Verwendung eingeschränkt auf die Behandlung von Herpes Simplex-, Genitalis- und Zoster-Infektionen.
  • Es wird angenommen, dass sein Wirkungsmechanismus das intrazelluläre Eindringen, anfängliche Umwandlung zu Monophosphat durch virale Thymidinkinasen, dann zum Diphosphat durch zellulare Guanylatkinase und letztendlich zu Triphosphat durch verschiedene andere zelluläre Enzyme beinhaltet. Voll aktives Acyclovirtriphosphat konkurriert mit dem natürlichen Substrat Deoxyguanosintriphosphat um eine Position in der DNA-Kette des Herpes-Virus. Einmal eingebaut beendet es die DNA-Synthese mittels (1) kompetitiver Hemmung der viralen DNA-Polymerase, (2) Einbau in und Beendung der wachsenden viralen DNA-Kette und (3) Inaktivierung der viralen DNA-Polymerase. Uninfizierte Zellen zeigen lediglich minimale Aufnahme und Phosphorylierung von Acyclovir. Die HSV-Stämme, die in diesem Beispiel verwendet werden, behalten ihre tk-Aktivität bei und sind somit hoch empfindliche gegenüber Neutralisation durch Acyclovir. Um zu untersuchen, ob eine bestehende HSV-1-Infektion nach Vervollständigung des gewünschten therapeutischen Effekts (des rekombinanten HSV) in vivo ausgerottet werden kann, wird ein Kaninchenmodell verwendet. Folgend auf die chirurgische Freilegung wird die externe Halsvene mit R849 (HSVlacZ) mit 4 × 108 pfu/ml (n = 8, 0,2–4,0 ml) 10 Minuten bei 120 mmHg infiziert und dann als ein Venenstück oberhalb der allgemeinen Carotidarterie wie zuvor beschrieben hergestellt (Venenpatchangioplastie). Folgend auf eine Woche der Erholung erhält die Hälfte der Kaninchen (n = 4) Acyclovir (Abbott Laboratories), 75 mg/kg Körpergewicht intravenös für insgesamt fünf Tage. Beginnend am gleichen post-operativen Tag werden die Kaninchen gleichzeitig oral mit Acyclovir behandelt (Alphaparm USPD Inc., 3 mg/cc H2O), was bis zum Verlust aufrechterhalten wird. Basislinienwerte für Serum, Acyclovir, Elektrolyt, Blutharnstoff-Stickstoff und Creatinin werden vor Beginn der Acyclovirbehandlung, an den Tagen 2, 5 und 10 nach Beginn der Behandlung und beim Verlust gemessen. Während der Acyclovirtherapie werden die Serumlevel für Acyclovir innerhalb des therapeutischen Bereiches (9 ± 4 μg/ml) gehalten. Es gab keine signifikante systemische Toxizität, gemessen durch Serum-Elektrolyte, Blutharnstoff-Stickstoff und Creatininwerte, über die Studie hinweg. Nach vier Wochen werden die Tiere wieder anästhesiert und die Venenstücke werden wiederum freigelegt und entnommen. Die Gefäße werden in 1,25% Glutaraldehyd 10 Min. fixiert, in PBS gewaschen und über Nacht bei 37°C mit X-gal inkubiert. 5 μm-Abschnitte werden geschnitten und mit Eosin gegengefärbt. Untersuchung der Abschnitte ergab, dass Acyclovirbehandlung vollständig die Reportergen (lacZ)-Expression eliminiert, mit einer β-Galactosidase-Aktivität, die in < 1% der Zellen (p < 0,55) offenkundig ist. Der therapeutische antiproliferative Effekt scheint dadurch bewahrt zu bleiben, dass behandelte Venenstücke weitgehend offen bleiben, auch nachdem die R849 (HSVlacZ)-Infektion ausgerottet war.
  • Es gab keine signifikanten Abweichungen in Blutzählungen, Plättchenfunktion, Koagulierung, hepatischer oder Nierenfunktion mit HSV-Infektion (siehe Tabelle 6). Die Infektion war lokalisiert an der doppelt abgeklemmten Vene, so dass die systemische Belastung lediglich minimal war.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung bezüglich bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde ist beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung alle Modifikationen und Variationen umfasst, die dem Fachmann bei Berücksichtigung der hier gemachten Offenbarung erscheinen, und insbesondere jenen Ausführungsformen, die innerhalb der breitesten möglichen Interpretation der Ansprüche und ihrer Erfordernisse liegen. Tabelle 6
    WBC HÄMOGLOBIN PLÄTTCHEN
    HSV-infiziert
    Tag 0 (n = 3) 4,8, 10,6, 6,5 12,0, 11,1, 13,4 209, 90, 309
    Tag 1 (n = 2) 10,6, 9,3 10,2, 9,4 115, 260
    Tag 7 (n = 2) 7,4, 12,9 8,7, 10,7 220, 209
    Tag 14 (n = 1) 3,5 11,1 313
    Träger-infiziert
    Tag 0 (n = 1) 8,7 11,6 41
    Tag 1 (n = 1) 9,5 7,3 136
    Tag 7 (n = 1) 9,0 9,7 134
    Tag 14 (n = 1) 9,4 10 188
    PT PTT
    HSV-infiziert
    Tag 0 (n = 3) 8,1, 5,9, 6,9 18,9, 23,4 (ein Klumpen)
    Tag 1 (n = 2) 5,9, 6,4 6,9, 20,2
    Tag 7 (n = 2) 6,4, 5,6 12,9, 12,9
    Tag 14 (n = 1) 6,4 19,7
    Träger-infiziert
    Tag 0 (n = 1) 7,0 21,2
    Tag 1 (n = 1) 6,2 18,6
    Tag 7 (n = 1) 6,0 12,9
    Tag 14 (n = 1) 6,4 19,7
    Tbili SGOT SGPT
    HSV-infiziert
    Tag 0 (n = 4) 0,3, 0,2, 0,2, 0,1 94, 23, 10, 11 42, 14, 41, 3
    Tag 1 (n = 2) 0,2, 0,2 72, 104 85, 71
    Tag 7 (n = 2) 0,3, 0,2 12 48
    Tag 14 (n = 1) 0,0 9 24
    Träger-infiziert
    Tag 0 (n = 1) 0,2 11 31
    Tag 1 (n = 1) 0,2 95 60
    Tag 7 (n = 1) 0,3 14 30
    Tag 14 (n = 1) 0,2 11 23
    BUN CREATININ
    HSV-infiziert
    Tag 0 (n = 4) 16, 18, 19, 23 1,7, 1,6, 1,3, 1,9
    Tag 1 (n = 2) 13, 30 1,4, 1,7
    Tag 7 (n = 1) 15 1,2
    Tag 14 (n = 1) 24 1,3
    Träger-infiziert
    Tag 0 (n = 1) 13 1,6
    Tag 1 (n = 1) 21 0,0
    Tag 7 (n = 1) 16 1,5
    Tag 14 (n = 1) 15 1,4
  • REFERENZEN
    • Advani, Sibley, Song, Hallahan, Kataoka, Roizman, Weichselbaum, Enhancement of replication of genetically engineered herpes simplex viruses by ionizing radiation: a new paradigm for destruction of therapeutically intractable tumors, Gene Ther., 5: 160–165, 1998.
    • Alber, Powell, Vallance, Goodwin, Grahame-Clarke, "Herpesvirus infection accelerates atherosclerosis in the apolipoprotein E-deficient mouse", Circ., 102: 779–785, 2000.
    • Andreansky, Soroceanu, Flotte, Chou, Markert, Gillespie, Roizman, Whitley, "Evaluation of genetically engineered herpes simplex viruses as oncolytic agents for human malignant brain tumors", Can. Res., 57: 1502–1509, 1997.
    • Angel, Bauman, Stein, Dellus, Rahmsdorf und Herrlich, "12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate Induction of the Human Collagenase Gene is Mediated by an Inducible Enhancer Element Located in the 5' Flanking Region", Mol. Cell. Biol., 7: 2256, 1987a.
    • Angel, Bauman, Stein, Dellus, Rahmsdorf und Herrlich, "12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate induction of the human collagenase gene is mediated by an inducible enhancer element located in the 5' flanking region", Mol. Cell. Biol., 7: 2256, 1987a.
    • Angel, Imagawa, Chiu, Stein, Imbra, Rahmsdorf, Jonat, Herrlich und Karin, "Phorbol Ester-Inducible Genes Contain a Common cis Element Recognized by a TPA-Modulated Trans-acting Factor", Cell, 49: 729, 1987b
    • Angel, Imagawa, Chiu, Stein, Imbra, Rahmsdorf, Jonat, Herrlich und Karin, "phorbol ester-inducible genes contain a common cis element recognized by a TPA-modulated trans-acting factor", Cell, 49: 729, 1987b
    • Armeanu, Pelisek, Krausz, Fuchs, Groth, Curth, Keil, Quilici, Rolland, Reszka, Nikol, "Optimization of nonviral gene transfer of vascular smooth muscle cells in vitro and in vivo", Molec. Ther., 1: 366–375, 2000.
    • Ascher, Scheinman, Hingorani, Seth, Marella, Jacob, "Effect of p53 gene therapy combined with CTLA4Ig selective immunosuppression on prolonged neointima formation reduction in a rat model", Ann. Vasc. Surg., 14: 385–392, 2000.
    • Atchison und Perry, "Tandem Kappa Immunglobulin Promoters are Equally Active in the Presence of the Kappa Enhancer: Implications for Model of Enhancer Function", Cell, 46: 253, 1986.
    • Atchison und Perry, "The role of the kappa enhancer and its binding factor nf-kappa b in the developmental regulation of kappa gene transcription", Cell, 48: 121, 1987.
    • Banerji et al., "Expression of a Beta-Globin Gene is Enhanced by Remote SV40 DNA Sequences", Cell, 27: 299, 1981.
    • Banerji, Olson und Schaffner, "A lymphocyte-specific cellular enhancer is located downstream of the joining region in immunoglobulin heavy-chain genes", Cell, 35: 729, 1983.
    • Baumgartner, Pieczek, Manor, Blair, Kearney, Walsh, Isner, "Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia", Circ., 97: 1114–1123, 1998.
    • Berkhout, Silverman und Jeang, "Tat Trans-activates the Human Immunodeficiency Virus Through a Nascent RNA Target", Cell, 59: 273, 1989.
    • Bishop, Wiegman, McNamara, Din, Sanders, Hesselbacher et al., "Local adenovirus-mediated delivery of hirudin in a rabbit arterial injury model", J. Vasc. Res., 36: 343–352, 1999.
    • Blanar, Baldwin, Flavell und Sharp, "A gamma-interferon-induced factor that binds the interferon response sequence of the MHC class I gene, H-2Kb", EMBO J., 8: 1139, 1989.
    • Bodine und Ley, "An enhancer element lies 3' to the human a gamma globin gene", EMBO J., 6: 2997, 1987.
    • Boshart, Weber, Jahn, Dorsch-Hasler, Fleckenstein und Schaffner, "A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus", Cell, 41: 521, 1985.
    • Bosze, Thiesen und Charnay, "A transcriptional enhancer with specificity for erythroid cells is located in the long terminal repeat of the friend murine leukemia virus", EMBO J., 5: 1615, 1986.
    • Braddock, Chambers, Wilson, Esnouf, Adams, Kingsman und Kingsman, "HIV-I Tat activates presynthesized RNA in the nucleus", Cell, 58: 269, 1989.
    • Bulla und Siddiqui, "The hepatitis B virus enhancer modulates transcription of the hepatitis B virus surface-antigen gene from an internal location", J. Virol., 62: 1437, 1986.
    • Cable, Caccitolo, Caplice, O'Brien, Simari, Daly, Dearani, Mullany, Orszulak, Schaff, "The role of gene therapy for intimal hyperplasia of bypass grafts", Circ., 100 (suppl. II): II392-II6, 1999.
    • Campbell und Villarreal, "Functional analysis of the individual enhancer core sequences of polyoma virus: cell-specific uncoupling of DNA replication from transcription", Mol. Cell. Biol., 8: 1993, 1988.
    • Campere und Tilghman, "Postnatal repression of the alpha-fetoprotein gene is enhancer independent", Genes and Dev., 3: 537, 1989.
    • Campo, Spandidos, Lang, Wilkie, "Transcriptional control Signals in the genome of bovine papilloma virus type 1", Nature, 303: 77, 1983.
    • Carbonelli et al. "A plasmid vector for isolation of strong Promoters in E. coli", FEMS Microbiol. Lett., 177(1): 75–82, 1999.
    • Celander und Haseltine, "Glucocorticoid Regulation of Murine Leukemia Virus Transcription Elements is Specified by Determinants Within the Viral Enhancer Region", J. Virology, 61: 269, 1987.
    • Celander, Hsu und Haseltine, "Regulatory Elements Within the Murine Leukemia Virus Enhancer Regions Mediate Glucocorticoid Responsiveness", J. Virology, 62: 1314, 1988.
    • Chambers, Gillespic, Soroceanu, Andreansky, Chatterjee, Chou, Roizman, Whitley, "Comparison of genetically engineered herpes simplex virus for the treatment of brain tumors in SCID mouse model of human glioma", PNAS, 92: 1411–1415, 1995.
    • Chandler et al., "RNA splicing specificity determined by the coordinated action of RNA recognition motifs in SR proteins", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(8): 3596–3601, 1997.
    • Chandler, Maler und Yamamoto, "DNA sequences bound specifically by glucocorticoid receptor in vitro render a heterlogous promoter hormone responsive in vivo", Cell, 33: 489, 1983.
    • Chang, Barr, Lu, Barton, Leiden, "Adenvirus-mediated over-expression of the cyclin/cyclin-dependent kinase inhibitor, p21 inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation in the rat carotid artery model of balloon angioplasty", J. Clin. Invest., 95: 2260–2268, 1995.
    • Chang, Barr, Seltzer, Jiang, Nabel, Nabel, Parmacek, Leiden, "Cytostatic gene therapy for vascular proliferative disorders with a constitutively active form of the retinoblastoma gene product", Science, 267: 518–522, 1995.
    • Chang, Erwin und Lee, "Glucose-regulated Protein (GRP94 and GRP78) Genes Share Common Regulatory Domains and are Coordinately Regulated by Common Transacting Factors", Mol. Cell. Biol., 9: 2153, 1989.
    • Chatterjee, Lee, Rentoumis und Jameson, "Negative regulation of the thyroid-stimulating hormone alpha gene by thyroid hormone: receptor interaction adjacent to the TATA Box", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 9114, 1989.
    • Chen und Okayama, "High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA", Mol. Cell. Biol., 7: 2745–2752, 1987
    • Cheng, Mantile, Pauly, Nater, Felici, Monticone, Bilato, Gluzband, Crow, Stetler-Stevenson, Capogrossi, "Adenovirus-mediated gene transfer of the human tissue inhibitor of metalloproteinase-2 blocks vascular smooth muscle cell invasiveness in vitro and modulates neointimal development in vivo", Circ., 98: 2195–2201, 1998.
    • Choi, Chen, Kriegler und Roninson, "An altered pattern of cross-resistance in multi-drug-resistant human cells results from spontaneous mutations in the mdr-1 (p-glycoprotein) gene", Cell, 53: 519, 1988.
    • Chou und Roizman, "Herpes simplex virus 1 gamma-1 34.5 gene function, which blocks the host response to infection, maps in the homologous domain of the genes expressed during growth arrest and DNA damage", Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 5247–5251, 1994.
    • Chou, Kern, Whitley, Roizman, "Mapping of herpes simplex virus-1 neurovirulence to gamma134.5, a gene nonessential for growth in culture", Science, 250: 1261–1266, 1990.
    • Cocea, "Duplication of a region in the multiple cloning site of a plasmid vector to enhance cloning-mediated addition of restriction sites to a DNA fragment", Biotechniques, 23: 814–816, 1997.
    • Cohen, Walter und Levinson, "A Repetitive Sequence Element 3' of the Human c-Ha-ras1 Gene Has Enhancer Activity", J. Cell. Physiol., 5: 75, 1987.
    • Costa, Lai, Grayson und Darnell, "The Cell-Specific Enhancer of the Mouse Transthyretin (Prealbumin) Gene Binds a Common Factor at One Site and a Liver-Specific Factor(s) at Two Other Sites", Mol. Cell. Biol., 8: 81, 1988.
    • Cripe, Haugen, Turk, Tabatabai, Schmid, Durst, Gissmann, Roman und Turek, "Transcriptional Regulation of the Human Papilloma Virus-16 E6–E7 Promoter by a Keratinocyte-Dependent Enhancer, and by Viral E2 Trans-Activator and Repressor Gene Products: Implications for Cervical Carcinogenesis", EMBO J., 6: 3745, 1987.
    • Culotta und Hamer, "Fine Mapping of a Mouse Metallothionein Gene Metal-Response Element", Mol. Cell. Biol., 9: 1376, 1989.
    • Culver, "Methods for gene transfer and repair. In: Gene therapy: A primer for physicians Culver (Hrsg.), Larchmont, N. Y.: Mary Ann Liebert, Inc., 3–45, 1996.
    • Dandolo, Blangy und Kamen, "Regulation of Polyma Virus Transcription in Murine Embryonal Carcinoma Cells", J. Virology, 47: 55, 1983.
    • De Villiers, Schaffner, Tyndall, Lupton und Kamen, "Polyoma Virus DNA Replication Requires an Enhancer", Nature, 312: 242, 1984.
    • Deschamps, Meijlink und Verma, "Identification of a Transcriptional Enhancer Element Upstream From the Proto-Oncogene Fos", Science, 230: 1174, 1985.
    • Dollery, Humphries, McClelland, Latchman, McEwan, "Expression of tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 1 by use of an adenoviral vector inhibits smooth muscle cell migration and reduces neointima hyperplasia in the rat model of vascular balloon injury", Circ., 99: 3199–3205, 1999.
    • Dunn, Newman, Jones, Yamada, Shayani, Virmani, Dichek, "Seeding of vascular grafts with genetically modified endothelial cells: Secretion of recombinant tPA results in decreased seeded cell retention in vitro and in vivo", Circ., 1439–1446, 1996
    • Edbrooke, Burt, Cheshire und Woo, "Identification of cis-acting sequences responsible for phorbol ester induction of human serum amyloid a gene expression via a nuclear-factor-kappa β-like transcription factor", Mol. Cell. Biol., 9: 1908, 1989.
    • Edlund, Walker, Barr und Rutter, "Cell-specific expression of the rat insulin gene: evidence for role of two distinct 5' flanking elements", Science, 230: 912, 1985.
    • EPO 0273085
    • Eslami, Gangadharan, Sui, Rhynhart, Snyder, Conte, "Gene delivery to in situ veins: Differential effects of adenovirus and adeno-associated viral vectors", J. Vasc. Surg., 31: 1149–1159, 2000.
    • Faries, Pomposelli, Quist, LoGerfo, "Assessing the role of gene therapy in the treatment of vascular disease", Ann. Vasc. Surg., 14: 181–188, 2000.
    • Fechheimer, Boylan, Parker, Sisken, Patel und Zimmer, "Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading", Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84: 8463–8467, 1987
    • Feng und Holland, "HIV-I Tat Trans-Activation Requires the Loop Sequence Within Tar", Nature, 334: 6178, 1988.
    • Firak und Subramanian, "Minimal Transcription Enhancer of Simian Virus 40 is a 74-Base-Pair Sequence that Has Interacting Domains", Mol. Cell. Biol., 6: 3667, 1986.
    • Foecking und Hofstetter, "Powerful and Versatile Enhancer-Promoter Unit for Mammalian Expression Vectors", Gene, 45(1): 101–105, 1986.
    • Fortunato, Mauceri, Kocharyan, Song, Salloum, Vosicky et al., "Gene therapy enhances the antiproliferative effect of radiation in intimal hyperplasia", J. Surg. Res., 89: 155–162, 2000.
    • Fraley, Fomari, Kaplan, "Entrapment of a bacterial plasmid in phospholipid vesicles: potential for gene transfer", Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 76:3348–3352, 1979
    • Fujita, Shibuya, Hotta, Yamanishi und Taniguchi, "Interferon-Beta Gene Regulation: Tandemly Repeated Sequences of a Synthetic 6-bp Oligomer Function as a Virus-Inducible Enhancer", Cell, 49: 357, 1987.
    • Fulton, Davies, Barber, Svendsen, Hagen, "Locally applied antisense oligonucleotide to proliferating cell nuclear antigen inhibits intimal thickening in experimental vein grafts", Ann. Vasc. Surg., 12: 412–417, 1998.
    • Fulton, Davies, Koch, Dalen, Svendsen, Hagen, "Antisense oligonucleotide to protooncogene c-myb inhibits the formation of intimal hyperplasia in experimental vein grafts", J. Vasc. Surg., 25: 453–463, 1997.
    • Fulton, Davies, Lefkowitz, Svendsen, Koch, Hagen, "Transfection with βARKCT reduces intimal hyperplasia in experimental vein grafts", Surg. Forum, 47: 341–345, 1996.
    • Geary, Clowes, Lau, Vergel, Dale, Osborne, "Gene transfer in baboons using prosthetic vascular grafts seeded with retrovirally transduced smooth muscle cells: A model for local and systemic gene therapy", Human Gene Therapy, 5: 1211–1216, 1994.
    • George, Lloyd, Angelini, Newby, Baker, "Inhibition of late vein graft neointima formation in human and porcine models by adenovirus-mediated overexpression of tissue inhibitor of metalloproteinase-3", Circ., 101: 296–304, 2000.
    • Ghosh und Bachhawat, "Targeting of liposomes to hepatocytes," In: Liver Diseases, Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands, Wu und Wu (Hrsg.), Marcel Dekker, New York, S. 87–104, 1991.
    • Gilles, Morris, Oi und Tonegawa, "A tissue-specific transcription enhancer element is located in the major intron of a rearranged immunoglobulin heavy-chain gene", Cell, 33: 717, 1983.
    • Gloss, Bernard, Seedorf und Klock, "The Upstream Regulatory Region of the Human Papilloma Virus-16 Contains an E2 Protein-Independent Enhancer Which is Specific for Cervical Carcinoma Cells and Regulated by Glucocorticoid Hormons", EMBO J., 6: 3735, 1987.
    • Godbout, Ingram und Tilghman, "Fine-Structure Mapping of the Three Mouse Alpha-Fetoprotein Gene Enhancers", Mol. Cell. Biol., 8: 1169, 1988.
    • Goodbourn und Maniatis, "Overlapping Positive and Negative Regulatory Domains of the Human β-Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1447, 1988.
    • Goodbourn, Burstein und Maniatis, "The Human Beta-Interferon Gene Enhancer is Under Negative Control", Cell, 45: 601, 1986.
    • Goodman and Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8. Ausg., 18–32, 43–61, 66–78, 1990.
    • Graham und Van Der Eb, "A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA", Virology 52: 456–467, 1973
    • Greene, Bohrlein und Ballard, "HIV-1, and Normal T-Cell Growth: Transcriptional Strategies and Surprises", Immunology Today, 10: 272, 1989
    • Grosschedl und Baltimore, "Cell-Type Specificity of Immunglobulin Gene Expression is Regulated by at Least Three DNA Sequence Elements", Cell, 41: 885, 1985.
    • Hanna, Durán, Leconte, Fox, Neschis, Hobson II, Golden, "Adenoviral-mediated expression of antisense RNA to basic fibroblast growth factor reduces tangential stress in arterialized vein grafts", J. Vasc. Surg., 31: 770–780, 2000.
    • Hanna, Fox, Neschis, Safford, Swain, Golden, "Antisense basic fibroblast growth factor gene transfer reduces neointimal thickening after arterial injury", J. Vasc. Surg., 25: 320–325, 1997.
    • Harland und Weintraub, "Translation of mRNA injected into Xenopus oocytes is specifically inhibited by antisense RNA", J. Cell Biol., 101: 1094–1099, 1985.
    • Harrell, Rajanayagam, Doanes, Guzman, Hirschowitz, Crystal, Epstein, Finkel, "Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal accumulation by adenovirus-mediated gene transfer of cytosine deaminase", Circ., 96: 621–627, 1997.
    • Haslinger und Karin, "Upstream Promoter Element of the Human Metallothionein-II Gene Can Act Like an Enhancer Element", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 8572, 1985.
    • Hauber und Cullen, "Mutational Analysis of the Trans-Activiation-Responsive Region of the Human Immunodeficiency Virus Type I Long Terminal Repeat", J. Virology, 62: 673, 1988.
    • Hensel, Meichle, Pfizenmaier und Kronke, "PMA-Responsive 5' Flanking Sequences of the Human TNF Gene", Lymphokine Res., 8: 347, 1989.
    • Herr und Clarke, "The SV40 Enhancer is Composed of Multiple Functional Elements That Can Compensate for One Another", Cell, 45: 461, 1986.
    • Hirochika, Browker und Chow, "Enhancers and Trans-Acting E2 Transcriptional Factors of Papilloma Viruses", J. Virol., 61: 2599, 1987.
    • Hirsch, Gaugler, Deagostini-Bauzin, Bally-Cuif und Gordis, "Identification of Positive and Negative Regulatory Elements Governing Cell-Type-Specific Expression of the Neural-Cell-Adhesion-Molecule Gene", Mol. Cell. Biol., 10: 1959, 1990.
    • Holbrook, Gulino und Ruscetti, "cis-Acting Transcriptional Regulatory Sequences in the Gibbon Ape Leukemia Virus (GALV) Long Terminal Repeat", Virology, 157: 211, 1987.
    • Horlick und Benfield, "The Upstream Muscle-Specific Enhancer of the Rat Muscle Creatine Kinase Gene is Composed of Multiple Elements", Mol. Cell. Biol., 9: 2396, 1989.
    • Huang, Ostrowski, Berard und Hagar, "Glucocorticoid regulation of the ha-musv p21 gene conferred by sequences from mouse mammary tumor virus", Cell, 27: 245, 1981.
    • Huard, Goins, Fink, "Herpes simplex virus type I vector mediated gene transfer to muscle", Gene Ther., 2: 385–392, 1995.
    • Hug, Costas, Staeheli, Aebi und Weissmann, "Organization of the Murine Mx Gene and Characterization of its Interferon- and Virus-Inducible Promoter", Mol. Cell. Biol., 8: 3065, 1988.
    • Hwang, Lim und Chae, "Characterization of the S-Phase-Specific Transcription Regulatory Elements in a DNA-Replication-Independent Testis-Specific H2B (TH2B) Histone Gene", Mol. Cell. Biol., 10: 585, 1990.
    • Imagawa, Chiu und Karin, "Transcription Factor AP-2 Mediates Induction by Two Different Signal-Transduction Pathways: Protein Kinase C and cAMP", Cell, 51: 251, 1987.
    • Imbra und Karin, "Phorbol Ester Induces the Transcriptional Stimulatory Activity of the SV40 Enhancer", Nature, 323: 555, 1986.
    • Imler, Lemaire, Wasvlyk und Waslyk, "Negative regulation contributes to tissue specificity of the immunoglobulin heavy-chain enhancer", Mol. Cell. Biol., 7: 2558, 1987.
    • Imperiale und Nevins, "Adenovirus 5 E2 Transcription Unit: an E1A-Inducible Promoter with an Essential Element that Functions Independently of Position or Orientation", Mol. Cell. Biol., 4: 875, 1984.
    • Isner, Walsh, Rosenfield, Schainfeld, Asahara, Hogan, Pieczek, "Arterial gene therapy for restenosis", Hum. Gene Ther., 7: 989–1011, 1996.
    • Isner, Walsh, Symes, Pieczek, Takeshita, Lowry, Rossow, Rosenfield, Weir, Brogi, Schainfeld, "Arterial gene therapy for therapeutic angiogenesis in patients with peripheral artery disease", Circ., 91: 2687–2692, 1995.
    • Jakobovits, Smith, Jakobovits und Capon, "A Discrete Element 3' of Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) and HIV-2 mRNA Initiation Sites Mediates Transcriptional Activation by an HIV Trans-Activator", Mol. Cell. Biol., 8: 2555, 1988.
    • Jameel und Siddiqui, "The Human Hepatitis B Virus Enhancer Requires Transacting Cellular Factor(s) for Activity", Mol. Cell. Biol., 6: 710, 1986.
    • Jaynes, Johnson, Buskin, Gartside und Hauschka, "The Muscle Creatine Kinase Gene is Regulated by Multiple Upstream Elements, Including a Muscle-Specific Enhancer", Mol. Cell. Biol., 8: 62, 1988.
    • Johnson, Wold und Hauschka, "Muscle creatine kinase sequence elements regulating skeletal and cardiac muscle expression in transgenic mice", Mol. Cell. Biol., 9: 3393, 1989.
    • Kadesch und Berg, "Effects of the Position of the Simian Virus 40 Enhancer on Expression of Multiple Transcription Units in a Single Plasmid", Mol. Cell. Biol., 6: 2593, 1986.
    • Kaneda et al., "Increased expression of DNA cointroduced with nuclear protein in adult rat liver", Science, 243: 375–378, 1989.
    • Kaneda et al., "Introduction and expression of the human insulin gene in adult rat liver", J. Biol. Chem., 264(21): 12126–12129, 1989.
    • Karin, Haslinger, Heguy, Dietlin und Cooke, "Metal-Responsive Elements Act as Positive Modulators of Human Metallothionein-IIA Enhancer Activity", Mol. Cell. Biol., 7: 606, 1987.
    • Karin, Haslinger, Heguy, Dietlin und Cooke, "Metal-Responsive Elements Act as Positive Modulators of Human Metallothionein-IIA Enhancer Activity" Mol. Cell. Biol., 7: 606, 1987.
    • Katinka, Vasseur, Montreau, Yaniv und Blangy, "Polyoma DNA sequences involved in the control of viral gene expression in murine embryonal carcinoma cells", Nature, 290: 720, 1981.
    • Katinka, Yaniv, Vasseur und Blangy, "Expression of polyoma early functions in mouse embryonal carcinoma cells depends on sequence rearrangements in the beginning of the late region", Cell, 20: 393, 1980.
    • Kato et al., "Expression of hepatitis β virus surface antigen in adult rat liver. Cointroduction of DNA and nuclear protein by a simplified liposome method", J. Biol. Chem., 266(6): 3361–3364, 1991.
    • Kawamoto, Makino, Niw, Sugiyama, Kimura, Anemura, Nakata und Kakunaga, "Identification of the Human Beta-Actin Enhancer and its Binding Factor", Mol. Cell. Biol., 8: 267, 1988.
    • Kay, "Adenoviral vectors: Promises and pitfalls", J. Vase. Surg., 24: 160–161, 1996.
    • Key, Vercellotti, Winkehnann, Moldow, Goodman, Esmon, Esmon, Jacob, "Infection of vascular endothelial cells with herpes simplex virus enhances tissue factor activity and reduces thrombomodulin expression", Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 7095–7099, 1990.
    • Kiledjian, Su, Kadesch, "Identification and characterization of two functional domains within the murine heavy-chain enhancer", Mol. Cell. Biol., 8: 145, 1988.
    • Klamut, Gangopadyhay, Worton und Ray, "Molecular and Functional Analysis of the Muscle-Specific Promoter Region of the Duchenne Muscular Dystrophy Gene", Mol. Cell. Biol., 10: 193, 1990.
    • Koch, Benoist und Mathis, "Anatomy of a new β-cell-specific enhancer", Mol. Cell. Biol., 9: 303, 1989.
    • Kotin, "Prospects for the use of adeno-associated virus as a vector for human gene therapy", Hum. Gene Ther., 5: 793–801, 1994.
    • Kriegler und Botchan, "A retrovirus LTR contains a new type of eukaryotic regulatory element", In: Eukaryotic Viral Vectors, Gluzman (Hrsg.), Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982.
    • Kriegler und Botchan, "Enhanced transformation by a simian virus 40 recombinant virus containing a Harvey murine sarcoma virus long terminal repeat", Mol. Cell. Biol., 3: 325, 1983.
    • Kriegler et al., "Promoter Substitution and enhancer augmentation increases the penetrance of the sv40 a gene to levels comparable to that of the harvey murine sarcoma virus ras gene in morphologic transformation", In: Gene Expression, Alan Liss (Hrsg.), Hamer und Rosenberg, New York, 1983.
    • Kriegler et al., "Viral Integration and Early Gene Expression Both Affect the Efficiency of SV40 Transformation of Murine Cells: Biochemical and Biological Characterization of an SV40 Retrovirus", In: Cancer Cells 2/Oncogenes and Viral Genes, Van de Woude et al. (Hrsg.), Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984.
    • Kriegler, Perez, Defay, Albert und Liu, "A Novel Form of TNF/Cachectin Is a Cell-Surface Cytotoxix Transmembrane Protein: Ramifications for the Complex Physiology of TNF", Cell, 53: 45, 1988.
    • Kriegler, Perez, Hardy und Botchan, "Transformation mediated by the sv40 t antigens: separation of the overlapping sv40 early genes with a retroviral vector", Cell, 38: 483, 1984.
    • Kuhbandner et al., "Temporally controlled somatic mutagenesis in smooth muscle", Genesis 28(1): 15–22, 2000
    • Kuhl, De La Fuenta, Chaturvedi, Parinool, Ryals, Meyer und Weissman, "Reversible Silencing of Enhancers by Sequences Derived From the Human IFN-alpha Promoter", Cell, 50: 1057, 1987.
    • Kunz, Zimmerman, Heisig und Heinrich, "Identification of the Promoter Sequences Involved in the Interleukin-6-Dependent Expression of the Rat Alpha-2-Macroglobulin Gene", Nucl. Acids Res., 17: 1121, 1989.
    • Lachmann und Efstathiou, "The use of herpes simplex virus-based vectors for gene delivery to the nervous system", Molec. Med. Today, 3: 404–411, 1997.
    • Larsen, Harney und Moore, "Repression medaites cell-type-specific expression of the rat growth hormone gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8283, 1986.
    • Laspia, Rice und Mathews, "HFV-1 Tat protein increases transcriptional initiation and stabilizes elongation", Cell, 59: 283, 1989.
    • Latimer, Berger und Baumann, "Highly conserved upstream regions of the alpha..sub.1-antitrypsin gene in two mouse species govern liver-specific expression by different mechanisms", Mol. Cell. Biol., 10: 760, 1990.
    • Lee, Mulligan, Berg und Ringold, "Glucocorticoids Regulate Expression of Dihydrofolate Reductase cDNA in Mouse Mammary Tumor Virus Chimaeric Plasmids", Nature, 294: 228, 1981.
    • Levenson et al., "Internal ribosomal entry site-containing retroviral vectors with green fluorescent Protein and drug resistance markers", Human Gene Therapy, 9: 1233–1236, 1998.
    • Levinson, Khoury, VanDeWoude und Gruss, "Activation of SV40 Genome by 72-Base-Pair Tandem Repeats of Moloney Sarcoma Virus", Nature, 295: 79, 1982.
    • Lim, Chapman, Gammon, Muhlestein, Bauman, Stack, Swain, "Direct in vivo gene transfer into the coronary and peripheral vasculatures of the intact dog", Circ., 83: 2007–2011, 1991.
    • Lin, Cross, Halden, Dragos, Toledano und Leonard, "Delineation of an enhancerlike positive regulatory element in the interleukin-2 receptor .alpha.-chain gene", Mol. Cell. Biol., 10: 850, 1990.
    • Luria, Gross, Hornwitz und Givol, "Promoter Enhancer Elements in the Rearranged Alpha-Chain Gene of the Human T-Cell Receptor", EMBO J., 6: 3307, 1987.
    • Lusky und Botchan, "Transient Replication of Bovine Papilloma Virus Type 1 Plasmids: cis and trans Requirements", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 3609, 1986.
    • Lusky, Berg, Weiher und Botchan, "Bovine Papilloma Virus Contains an Activator of Gene Expression at the Distal End of the Early Transcription Unit", Mol. Cell. Biol., 3: 1108, 1983.
    • Lynch, Hara, Leonard, Williams, Dean, Geary, "Adeno-associated virus vectors for vascular gene delivery", Circ. Res., 80: 497–505, 1997.
    • Macejak und Sarnow, "Internal initiation of translation mediated by the 5' leader of a cellular mRNA", Nature, 353: 90–94, 1991.
    • Macejak und Sarnow, "Internal initiation of translation mediated by the 5' leader of a cellular mRNA", Nature, 353: 90–94, 1991.
    • Majors und Varmus, "A Small Region of the Mouse Mammary Tumor Virus Long Terminal Repeat Confers Glucocorticoid Hormone Regulation an a Linked Heterologous Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 5866, 1983.
    • Mann, Gibbons, Kernoff, Diet, Tsao, Cooke, Kaneda, Dzau, "Genetic engineering of vein grafts resistant to atherosclerosis", Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 4502–4506, 1995.
    • Martuza, Malick, Markert, Ruffner, Coen, "Experimental therapy of human glioma by means of a genetically engineered virus mutant", Science, 252: 854–856, 1991.
    • Matsumoto, Komori, Yonemitsu, Morishita, Sueishi, Kaneda, Sugimachi, "Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene transfer of endothelial cell nitric oxide synthase inhibits intimal hyperplasia of canine vein grafts under conditions of poor runoff", J. Vasc. Surg., 27: 135–144, 1998.
    • Matsumura, Kim, Shively, MacDonald, Pearce, "Characterization of vascular gene transfer using a novel cationic lipid", J. Surg. Res., 85: 339–345, 1999.
    • McGovern, Pankow, Shahar, Doliszny, Folsom, Blackburn, Luepker, "Recent trends in acute coronary heart disease – mortality, morbidity, medical care, and risk factors", N. Engl. J. Med., 334: 884–890, 1996.
    • McNeall, Sanchez, Gray, Chesterman und Sleigh, "Hyperinducible Gene Expression From a Metallotionein Promoter Containing Additional Metal-Responsive Elements", Gene, 76: 81, 1989.
    • Miksicek, Heber, Schmid, Danesch, Posseckert, Beato und Schutz, "Glucocorticoid Responsiveness of the Transcriptional Enhancer of Moloney Murine Sarcoma Virus", Cell, 46: 203, 1986.
    • Mineta, Rabkin, Martuza, "Treatment of malignant gliomas using ganciclovir-hypersensitive, ribonucleotide reductase-deficient herpes simplex viral mutant", Cancer Res., 54: 3963–3966, 1994.
    • Miyatake, Yukawa, Toda, Matsuoka, Takahashi, Hashimoto, "Inhibition of rat vascular smooth muscle cell proliferation in vitro and in vivo by recombinant replication-competent herpes simplex virus", Stroke, 30: 2431–2438, 1999.
    • Mordacq und Linzer, "Co-localization of Elements Required for Phorbol Ester Stimulation and Glucocorticoid Repression of Proliferin Gene Expression", Genes and Dev., 3: 760, 1989.
    • Moreau, Hen, Wasylyk, Everett, Gaub und Chambon, "The SV40 base-repair repeat has a striking effect on gene expression both in sv40 and other chimeric recombinants", Nucl. Acids Res., 9: 6047, 1981.
    • Muesing, Smith und Capon, "Regulation of mRNA Accumulation by a Human Immunodeficiency Virus Trans-Activator Protein", Cell, 48: 691, 1987.
    • Muzyczka, "Use of adeno-associated virus as a general transduction vector for mammalian cells", Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97–129, 1992.
    • Nabel et al., "Recombinant fibroblast growth factor-1 promotes intimal hyperplasia and angiogenesis in arteries in vivo", Nature, 362: 844–846, 1993.
    • Nabel et al., "Recombinant gene expression in vivo within endothelial cells of the arterial wall", Science, 244: 1342–1344, 1989.
    • Neschis, Safford, Hanna, Fox, Golden, "Antisense basic fibroblast growth factor gene transfer reduces early intimal thickening in a rabbit femoral artery balloon injury model", J. Vasc. Surg., 27: 126–134, 1998.
    • Nicolau und Sene, "Liposome-mediated DNA transfer in eukaryotic cells: dependence of the transfer efficiency upon the type of liposomes used and the host cell cycle stage", Biochem. Biophys. Acta, 721: 185–190, 1982.
    • Nicolau et al., "Liposomes as carriers for in vivo gene transfer and expression", Methods Enzymol., 149: 157–176, 1987.
    • Nicolau, LePape, Soriano, Fargette, Juhel, "In vivo expression of rat insulin after intravenous administration of the liposome-entrapped gene for rat insulin I", Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 1068–1072, 1983.
    • Ohno et al., "Gene therapy for the treatment of brain tumors using intra-tumoral transduction with the thymidine kinase gene and intravenous ganciclovir", Hum. Gene Ther., 4: 39–69, 1993.
    • Omitz, Hammer, Davison, Brinster und Palmiter, "Promoter and enhancer elements from the rat elastase i gene function independently of each other and of heterologous enhancers", Mol. Cell. Biol., 7: 3466, 1987.
    • Ondek, Sheppard und Herr, "Discrete Elements Within the SV40 Enhancer Region Display Different Cell-Specific Enhancer Activities", EMBO J., 6: 1017, 1987.
    • Palmiter, Chen und Brinster, "Differential regulation of metallothionein-thymidine kinase fusion genes in transgenic mice and their offspring", Cell, 29: 701, 1982.
    • PCT-Anmeldung Nr. WO 94/09699
    • PCT-Anmeldung Nr. WO 95/06128
    • Pech, Rao, Robbins und Aaronson, "Functional identification of regulatory elements within the promoter region of platelet-derived growth factor 2", Mol. Cell. Biol., 9: 396, 1989.
    • Pelletier und Sonenberg, "Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA", Nature, 334: 320–325, 1988.
    • Perales et al., "Gene transfer in vivo: sustained expression and regulation of genes introduced into the liver by receptor-targeted uptake", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 4086–4090, 1994.
    • Perez-Stable und Constantini, "Roles of fetal γ-globin promoter elements and the adult β-globin 3' enhancer in the stage-specific expression of globin genes", Mol. Cell. Biol., 10: 1116, 1990.
    • Picard und Schaffner, "A Lymphocyte-Specific Enhancer in the Mouse Immunoglobulin Kappa Gene", Nature, 307: 83, 1984.
    • Pinkert, Omitz, Brinster und Palmiter, "An albumin enhancer located 10 kb upstream functions along with its promoter to direct efficient, liver-specific expression in transgenic mice", Genes and Dev., 1: 268, 1987.
    • Ponta, Kennedy, Skroch, Hynes und Groner, "Hormonal Response Region in the Mouse Mammary Tumor Virus Long Terminal Repeat Can Be Dissociated From the Proviral Promoter and Has Enhancer Properties", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 1020, 1985.
    • Porton, Zaller, Lieberson und Eckhardt, "Immunoglobulin heavy-chain enhancer is required to maintain transfected .gamma.2a gene expression in a pre-b-cell line", Mol. Cell. Biol., 10: 1076, 1990.
    • Potter et al., "Enhancer-dependent expression of human k immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation", Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 81: 7161–7165, 1984.
    • Queen und Baltimore, "Immunoglobulin gene transcription is activated by downstream sequence elements", Cell, 35: 741, 1983.
    • Quinn, Farina, Gardner, Krutzsch und Levens, "Multiple components are required for sequence recognition of the ap1 site in the gibbon ape leukemia virus enhancer", Mol. Cell. Biol., 9: 4713, 1989.
    • Redondo, Hata, Brocklehurst und Krangel, "A T-Cell-Specific Transcriptional Enhancer Within the Human T-Cell Receptor .delta. Locus", Science, 247: 1225, 1990.
    • Reisman und Rotter, "Induced Expression From the Moloney Murine Leukemia Virus Long Terminal Repeat During Differentiation of Human Myeloid Cells is Mediated Through its Transcriptional Enhancer", Mol. Cell. Biol., 9: 3571, 1989.
    • Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg. Mack Printing Company, 1990.
    • Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Kapitel 61, Seiten 1289–1329, 1990.
    • Resendez Jr., Wooden und Lee, "Identification of highly conserved regulatory domains and protein-binding sites in the promoters of the rat and human genes encoding the stress-inducible 78-kilodalton glucose-regulated protein", Mol. Cell. Biol., 8: 4579, 1988.
    • Riessen, Rahimizadeh, Blessing, Takeshita, Barry, Isner, "Arterial gene transfer using pure DNA applied directly to a hydrogel-coated angioplasty balloon", Hum. Gene Ther., 4: 749–458, 1993.
    • Ripe, Lorenzen, Brenner und Breindl, "Regulatory elements in the 5' flanking region and the first intron contribute to transcriptional control of the mouse alpha-1-type collagen gene", Mol. Cell. Biol., 9: 2224, 1989.
    • Rippe, Brenner und Leffert, "DNA-mediated gene transfer into adult rat hepatocytes in primary culture", Mol. Cell Biol., 10: 689–695, 1990.
    • Rittling, Coutinho, Amarm und Kolbe, "AP-1/jun-binding Sites Mediate Serum Inducibility of the Human Vimentin Promoter", Nuc. Acids Res., 17: 1619, 1989.
    • Rolling, Nong, Pisvin, Collen, "Adeno-associated virus-mediated gene transfer into rat carotid arteries", Gene Ther., 4: 757–761, 1997.
    • Rosen, Sodroski und Haseltine, "The location of cis-acting regulatory sequences in the human t-cell lymphotropic virus type III (HTLV-111/LAV) long terminal repeat", Cell, 41: 813, 1988.
    • Rosengart, Lee, Patel, Sanborn, Parikh, Bergman et al., "Angiogenesis gene therapy: phase I assessment of direct intramyocardial administration of an adenovirus vector expressing VEGF121 cDNA to individuals with clinically significant severe coronary artery disease", Circ., 100: 468–474, 1999.
    • Sakai, Helms, Carlstedt-Duke, Gustafsson, Rottman und Yamamoto, "Hormone-Mediated Repression: A Negative Glucocorticoid-Response Element From the Bovine Prolactin Gene", Genes and Dev., 2: 1144, 1988.
    • Satake, Furukawa und Ito, "Biological activities of oligonucleotides spanning the f9 point mutation within the enhancer region of polyoma virus DNA", J. Virology, 62: 970, 1988.
    • Schaffner, Schirm, Muller-Baden, Wever und Schaffner, "Redundancy of Information in Enhancers as a Principle of Mammalian Transcription Control", J. Mol. Biol., 201: 81, 1988.
    • Scheinman, Asher, Levi, Hingorani, Shirazian, Seth, "p53 gene transfer to the injured rat carotid artery decreases neointimal formation", J. Vasc. Surg., 29: 360–369, 1999.
    • Schneider, Sassani, Vassalli, Driscoll, Dichek, "Adventitial delivery minimizes the proinflammatory effects of adenoviral vectors", J. Vasc. Surg., 29: 543–550, 1999.
    • Schwartz und Moawad, "Gene therapy for vascular disease", Ann. Vasc. Surg., 11: 189–99, 1997.
    • Schwartz, Moawad, Svensson, Tufts, Meyerson, Baunoch, Leiden, "Adenoviral-mediated transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts", J. Vasc. Surg., 29: 874–883, 1999.
    • Searle, Stuart und Palmiter, "Building a metal-responsive promoter with synthetic regulatory elements", Mol. Cell. Biol., 5: 1480, 1985.
    • Sharp und Marciniak, "HIV Tar: an RNA Enhancer?", Cell, 59: 229, 1989.
    • Shaul und Ben-Levy, "Multiple Nuclear Proteins in Liver Cells are Bound to Hepatitis B Virus Enhancer Element and its Upstream Sequences", EMBO J., 6: 1913, 1987.
    • Sherman, Basta, Moore, Brown und Ting, "Class II Box Consensus Sequences in the HLA-DR.alpha. Gene: Transcriptional Function and Interaction with Nuclear Proteins", Mol. Cell. Biol., 9: 50, 1989.
    • Sleigh und Lockett, "SV40 Enhancer Activation During Retinoic-Acid-Induced Differentiation of F9 Embryonal Carcinoma Cells", J. EMBO, 4: 3831, 1985.
    • Smith, Wills, Antelman et al., "Adenoviral constructs encoding phosphorylation-competent full-length and truncated forms of the human retinoblastoma protein inhibit myocyte proliferation and neointima formation", Circ., 96: 1899–1905, 1997.
    • Spalholz, Yang und Howley, "Transactivation of a Bovine Papilloma Virus Transcriptional Regulatory Element by the E2 Gene Product", Cell, 42: 183, 1985.
    • Spandau und Lee, "Trans-Activation of Viral Enhancers by the Hepatitis B Virus X Protein", J. Virology, 62: 427, 1988.
    • Spandidos und Wilkie, "Host-Specificities of Papilloma Virus, Moloney Murine Sarcoma Virus and Simian Virus 40 Enhancer Sequences", EMBO J., 2: 1193, 1983.
    • Stephens und Hentschel, "The Bovine Papilloma Virus Genome and its Uses as a Eukaryotic Vector", Biochem. J., 248: 1, 1987.
    • Stuart, Searle und Palmiter, "Identification of Multiple Metal Regulatory Elements in Mouse Metallothionein-I Promoter by Assaying Synthetic Sequences", Nature, 317: 828, 1985.
    • Sullivan und Peterlin, "Transcriptional Enhancers in the HLA-DQ Subregion", Mol. Cell. Biol., 7: 3315, 1987.
    • Svensson und Schwartz, "Gene therapy for vascular disease", Curr. Opin. Cardiol., 13: 369–374, 1998.
    • Svensson, Marshall, Woodard, Lin, Jiang, Chu, Leiden, "Efficient and stable transduction of cardiomyocytes alter intramyocardial injection or intracoronary perfusion with recombinant adeno-associated virus vectors", Circ., 99: 201–205, 1999.
    • Swartzendruber und Lehman, "Neoplastic Differentiation: Interaction of Simian Virus 40 and Polyoma Virus with Murine Teratocarcinoma Cells", J. Cell. Physiology, 85: 179, 1975.
    • Symes, Losordo, Vale, Lathi, Esakof, Mayskiy, Isner, "Gene therapy with vascular endothelial growth factor for inoperable coronary artery disease", Ann. Thor. Surg., 68: 830–836, 1999.
    • Takebe, Seiki, Fujisawa, Hoy, Yokota, Arai, Yoshida und Arai, "SR.alpha. Promoter: An Efficient and Versatile Mammalian cDNA Expression System Composed of the Simian Virus 40 Early Promoter and the R-U5 Segment of Human T-Cell Leukemia Virus Type 1 Long Terminal Repeat", Mol. Cell. Biol., 8: 466, 1988.
    • Takeshita, Gal, Leclerc, Pickering, Riessen, Weir, Isner, "Increased gene expression after liposome-mediated arterial gene transfer associated with intimal smooth muscle cell proliferation", J. Clin. Invest., 93: 652–661, 1994.
    • Tavernier, Gheysen, Duerinck, Can Der Heyden und Fiers, "Deletion Mapping of the Inducible Promoter of Human IFN-beta Gene", Nature, 301: 634, 1983.
    • Taylor und Kingston, "E1A Trans-Activation of Human HSP70. Gene Promoter Substitution Mutants is Independent of the Composition of Upstream and TATA Elements", Mol. Cell. Biol., 10: 176, 1990.
    • Taylor und Kingston, "Factor Substitution in a Human HSP70 Gene Promoter: TATA-Dependent and TATA-Independent Interactions", Mol. Cell. Biol., 10: 165, 1990.
    • Taylor, Solomon, Weiner, Paucha, Bradley und Kingston, "Stimulation of the Human Heat-Shock Protein 70 Promoter in vitro by Simian Virus 40 Large T Antigen", J. Biol. Chem., 264: 15160, 1989.
    • Thiesen, Bosze, Henry und Charnay, "A DNA Element Responsible for the Different Tissue Specificities of Friend and Moloney Retroviral Enhancers", J. Virology, 62: 614, 1988.
    • Treisman, "Transient Accumulation of c-fos RNA Following Serum Stimulation Requires a Conserved 5' Element and c-fos 3' Sequences", Cell, 42: 889, 1985.
    • Tronche, Rollier, Bach, Weiss und Yaniv, "The Rat Albumin Promoter: Cooperation with Upstream Elements is Required When Binding of APF/HNF 1 to the Proximal Element is Partially Impaired by Mutation or Bacterial Methylation", Mol. Cell. Biol., 9: 4759, 1989.
    • Trudel und Constantini, "A 3' Enhancer Contributes to the Stage-Specific Expression of the human Beta-Globin Gene", Genes and Dev., 6: 954, 1987.
    • Tur-Kaspa, Teicher, Levine, Skoultchi und Shafritz, "Use of electroporation to introduce biologically active foreign genes into primary rat hepatocytes", Mol. Cell Biol., 6: 716–718, 1986.
    • Turunen, Hiltunen, Ruponen, Virkamäki, Szoka, Jr., Urtti, Ylä-Herttuala, "Efficient adventitial gene delivery to rabbit carotid artery with cationic polymer-plasmid complexes", Gene Ther., 6: 6–11, 1999.
    • Tyndall, La Mantia, Thacker, Favaloro und Kamen, "A Region of the Polyoma Virus Genome Between the Replication Origin and Late Protein-Coding Sequences is Required in cis for Both Early Gene Expression and Viral DNA Replication", Nuc. Acids. Res., 9: 6231, 1981.
    • US-Patent Nr. 5 322 783
    • US-Patent Nr. 5 384 253
    • US-Patent Nr. 5 538 877
    • US-Patent Nr. 5 538 880
    • US-Patent Nr. 5 550 318
    • US-Patent Nr. 5 563 055
    • US-Patent Nr. 5 580 859
    • US-Patent Nr. 5 589 466
    • US-Patent Nr. 5 610 042
    • US-Patent Nr. 5 656 610
    • US-Patent Nr. 5 702 932
    • US-Patent Nr. 5 736 524
    • US-Patent Nr. 5 780 448
    • US-Patent Nr. 5 789 215
    • US-Patent Nr. 5 925 565
    • US-Patent Nr. 5 935 819
    • US-Patent Nr. 5 945 100
    • US-Patent Nr. 5 981 274
    • US-Patent Nr. 5 994 624
    • Ueno, Haruno, Morisaki, Furuya, Kangawa, Takeshita, Saito, "Local expression of C-type natriuretic peptide markedly suppresses neointimal formation in rat injured arteries through an autocrine/paracrine loop", Circ., 96: 2272–2279, 1997.
    • Vannice und Levinson, "Properties of the Human Hepatitis B Virus Enhancer: Position Effects and Cell-Type Nonspecificity", J. Virology, 62: 1305, 1988.
    • Varenne, Pislaru, Gillikns, Van Pelt, Gerard, Zoldhelyi, Van de Werf, Collen, Janssens, "Local adenovirus-mediated transfer of human endothelial nitric oxide synthase reduces luminal narrowing after coronary angioplasty in pigs", Circ., 98: 919–926, 1998.
    • Vasseur, Kress, Montreau und Blangy, "Isolation and characterization of polyoma virus mutants able to develop in multipotential murine embryonal carcinoma cells", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 1068, 1980.
    • Wagner et al., Science, 260: 1510–1513, 1990.
    • Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87(9): 3410–3414, 1990.
    • Wang et al., Biochimica et Biophysica Acta 888(2): 225–36, 1986.
    • Waugh, Li-Hawkins, Yuksel, Kuo, Cifra, Hilfiker et al., "Thrombomodulin overexpression to limit neointima formation", Circ., 02: 332–337, 2000.
    • Weber, De Villiers und Schaffner, "An SV40 'Enhancer Trap' Incorporates Exogenous Enhancers or Generates Enhancers From its Own Sequences", Cell, 36: 983, 1984.
    • Weinberger, Jat und Sharp, "Localization of a repressive sequence contributing to b-cell specificity in the immunoglobulin heavy-chain enhancer", Mol. Cell. Biol., 8: 988, 1984.
    • Wilson et al., "Implantation of vascular grafts lined with genetically modified endothelial cells", Science, 244: 1344–1346, 1989.
    • Wilson et al., "Implantation of vascular grafts lined with genetically modified endothelial cells", Science, 244: 1344–1346, 1989.
    • Winoto und Baltimore, "αβ-lineage-specific Expression of the a T-Cell Receptor Gene by Nearby Silencers", Cell, 59: 649, 1989.
    • Wong et al., "Appearance of β-lactamase activity in animal cells upon liposome mediated gene transfer", Gene, 10: 87–94, 1980.
    • Wu und Wu, "Receptor-mediated in vitro gene transfections by a soluble DNA carrier System", J. Biol. Chem., 262: 4429–4432, 1987.
    • Wu und Wu, Biochem., 27: 887–892, 1988.
    • Xiao, Li, Samulski, "Efficient long-term gene transfer into muscle tissue of immunocompetent mice by adeno-associated virus vector", J. Virol., 70: 8098–8108, 1996.
    • Yen und Perricaudet, "Advances in adenoviral vectors: from genetic engineering to their biology", FASEB J., 11: 615–623, 1997.
    • Yutzey, Kline und Konieczny, "An Internal Regulatory Element Controls Troponin I Gene Expression", Mol. Cell. Biol., 9: 1397, 1989.
    • Zhu, Wu, Liu, Gordon, Anderson, Starnes, Hall, "Downregulation of cyclin G1 expression by retrovirus-mediated antisense gene transfer inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation", Circ., 96: 628–635, 1997.
    • Zoldhelyi, McNatt, Shelat, Yamamoto, Chen, Willerson, "Thromboresistance of ballooninjured porcine carotid arteries after local gene transfer of human tissue factor pathway inhibitor", Circ., 101: 289–295, 2000.
    • Zoldhelyi, McNatt, Xu, Loose-Mitchell, Meidell, Clubb, Buja, Willerson, Wu, "Prevention of arterial thrombosis by adenoviral-mediated transfer of cyclooxygenase gene", Circ., 93: 10–17, 1996.

Claims (22)

  1. Ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Exprimieren einer heterologen Nukleinsäuresequenz in einer Gefäßzelle, aufweisend Vermischen eines rekombinanten replizierenden viralen Herpes Simplex-Vektors, dem zumindest ein exprimierbares γ1 34.5-Gen fehlt und funktionsfähig eine heterologe Nukleinsäure aufweisend, wobei der Herpes Simplex-Virus für das Wachstum im Zentralnervensystem geschwächt wird, mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung vorzugsweise zum Behandeln oder Vorbeugen einer kardio-vaskulären Erkrankung oder Zustand geeignet ist.
  2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei dem rekombinanten Herpes Simplex-Virusvektor zwei exprimierbare γ1 34.5-Gene fehlen.
  3. Das Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, wobei der Herpes Simplex-Virus durch nicht stille Insertion, Substitution oder Deletion einer Nukleotidsequenz in zumindest einem nicht essentiellen Gen des Herpes Simplex-Viruses geschwächt wird.
  4. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Herpes Simplex-Virus weiterhin eine nicht stille Insertion, Substitution oder Deletion einer Nukleotidsequenz in zumindest einem essentiellen Gen des Herpes Simplex-Viruses aufweist.
  5. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die vaskuläre Zelle eine Endothelzelle ist, eine glatte Muskelzelle und/oder eine Adventitialzelle.
  6. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die heterologe Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem antiproliferativen Polypeptid, einem vasodilatorischen Polypeptid und einem angiogenen Polypeptid.
  7. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die heterologe Nukleinsäuresequenz ein Antisens-Oligonukleotid oder ein Antisens-Polynukleotid codiert, wobei das Antisens-Oligonukleotid oder das Antisens-Polynukleotid vorzugsweise komplementär zu einer RNA ist, die ein antiproliferatives Polypeptid, vasodilatorisches Polypeptid oder angiogenes Polypeptid codiert.
  8. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Herpes Simplex-Virus Herpes Simplex-Virus-1 oder Herpes Simplex-Virus-2 ist.
  9. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der rekombinante Herpes Simplex-Virus über einen Katheder verabreicht werden soll.
  10. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Herpes Simplex-Virus weiterhin zumindest ein Gen aufweist, das für die Behandlung einer Herpes Simplex-Virusinfektion durch ein Antivirenmittel essentiell ist.
  11. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der kardio-vaskuläre Zustand Hypertonie in einem Gefäßgewebe ist.
  12. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die heterologe Nukleinsäuresequenz in Gefäßgewebe für eine Dauer exprimiert wird, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus mehr als 7 Tagen, mehr als 14 Tagen, mehr als 21 Tagen, mehr als 28 Tagen, mehr als 35 Tagen oder mehr als 70 Tagen.
  13. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die heterologe Nukleinsäuresequenz einen screenbaren oder selektierbaren Marker codiert.
  14. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die heterologe Nukleinsäuresequenz eine antithrombotische Nukleinsäure, eine Angiogenese regulierende Nukleinsäure, ein Immunmodulator, ein Induktor für Zellproliferation, ein Inhibitor für Zellproliferation oder ein Regulator für den programmierten Zelltod ist.
  15. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die kardio-vaskuläre Erkrankung oder Zustand ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus chronischem Herzfehler, kardio-vaskulärer Bluthochdruck-Erkrankung, ischämischer Herzerkrankung, Herzrhythmusstörung, angeborener Herzerkrankung, Herzklappenerkrankung oder stenotischem Defekt, Kardiomyopathie, Aneurysmus, chronischer Veneninsuffizienz, peripherer Arterienerkrankung oder Restenose.
  16. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung weiterhin zumindest ein pharmakologisches Mittel aufweist.
  17. Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei das genannte pharmakologische Mittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem antihyperlipoproteinämischen Mittel, einem antiarteriosklerotischen Mittel, einem antithrombotischen/fibrinolytischen Mittel, einem Blutkoagulans, einem antiarrhytmischen Mittel, einem Antihypertonie-Mittel, einem Blutdrucksteigerer, einem Behandlungsmittel für angeborene Herzerkrankung, einem antianginösen Mittel und einem Anti-Infektionsmittel.
  18. Ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Erzeugen von normaler Physiologie in einer funktionell abnormalen Gefäßzelle, aufweisend Vermischen von einem der Vektoren wie in Ansprüchen 1 bis 17 definiert mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  19. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung auf eine Gefäßzelle in einer Halsvene, einer Saphenavene und/oder einem Herzgefäßgewebe wirkt.
  20. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Gefäßzelle eine Neointimalzelle ist.
  21. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei etwa 109 pfu pro ml des Vektors verabreicht werden.
  22. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei etwa 108 pfu pro ml des Vektors verabreicht werden.
DE60131569T 2000-11-28 2001-11-28 Genetisch veränderter herpes virus für die behandlung von herz- und gefässerkrankungen Expired - Lifetime DE60131569T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25368000P 2000-11-28 2000-11-28
US253680P 2000-11-28
PCT/US2001/044279 WO2002045431A2 (en) 2000-11-28 2001-11-28 Genetically engineered herpes virus for the treatment of cardiovascular disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60131569D1 DE60131569D1 (de) 2008-01-03
DE60131569T2 true DE60131569T2 (de) 2008-10-23

Family

ID=22961266

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60131569T Expired - Lifetime DE60131569T2 (de) 2000-11-28 2001-11-28 Genetisch veränderter herpes virus für die behandlung von herz- und gefässerkrankungen

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6846670B2 (de)
EP (1) EP1356071B1 (de)
JP (1) JP4004952B2 (de)
AU (1) AU1788502A (de)
CA (1) CA2430341A1 (de)
DE (1) DE60131569T2 (de)
WO (1) WO2002045431A2 (de)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003052121A2 (en) * 2001-12-17 2003-06-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Method of reducing angiogenesis
US7592169B2 (en) * 2003-04-25 2009-09-22 Medimmune, Llc Methods and compositions for treatment and prevention of HSV-2 infections and conditions
US20090088482A1 (en) * 2003-10-14 2009-04-02 The Trustees Of Columbia University In The City New York Compositions and Methods For Treating Heart Failure
US20080305181A1 (en) * 2004-04-20 2008-12-11 Kontos Christopher D Compositions and Methods for Treatment of Vascular Grafts
US9273326B2 (en) 2004-04-30 2016-03-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Tetracycline-regulated gene expression in HSV-1 vectors
EP1750862B1 (de) 2004-06-04 2011-01-05 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Irbesartan enthaltende pharmazeutische zusammensetzung
US7731952B2 (en) * 2004-06-24 2010-06-08 New York University Avirulent oncolytic herpes simplex virus strains engineered to counter the innate host response
WO2006050274A2 (en) * 2004-11-02 2006-05-11 Uab Research Foundation Methods and compositions for cytokine expression and treatment of tumors
ES2490610T3 (es) * 2004-12-08 2014-09-04 Shire Regenerative Medicine, Inc. Materiales y métodos para la administración mínimamente invasiva de una composición fluida que contiene células
US20060211021A1 (en) * 2005-02-28 2006-09-21 Yeomans David C Methods and compositions for evaluating cell function in sensory neurons
WO2007008855A2 (en) * 2005-07-12 2007-01-18 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method of treating human volume expansion mediated hypertension employing resibufogenin
US20100221228A1 (en) * 2006-01-24 2010-09-02 The University Of Chicago y134.5 Deficient HSV and the MAPK Pathway
CA2687301C (en) * 2007-05-09 2016-08-23 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Synthetic herpes simplex viruses type-1 for treatment of cancers
US20110274661A1 (en) * 2008-08-11 2011-11-10 The University Of Chicago Attentuated Herpesvirus Encoding a Mek Pathway Polypeptide
US9675673B2 (en) * 2009-04-24 2017-06-13 Ingeneron Incorporated Transluminal delivery of oncoltyic viruses for cancer therapy
SI2516629T1 (sl) 2009-12-21 2016-10-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Cepiva proti virusu herpes simplex
US11020444B2 (en) 2010-04-23 2021-06-01 Scicotec Gmbh Transluminal delivery of viruses for treatment of diseased tissue
DK2864496T4 (da) 2012-06-22 2021-01-04 Gentium S R L Euglobulin-baseret fremgangsmåde til bestemmelse af den biologiske aktivitet af defibrotid
US9410186B2 (en) * 2012-07-11 2016-08-09 Nubad Llc Methods and compositions related to nucleic acid binding assays
EP3026122A1 (de) * 2014-11-27 2016-06-01 Gentium S.p.A. Zellenbasiertes Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit von Defibrotid
EP3377637B1 (de) * 2016-04-08 2020-03-18 Krystal Biotech, LLC Zusammensetzungen zur verwendung in einem verfahren zur behandlung von wunden, erkrankungen und leiden der haut
WO2019152821A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Recombinant herpes simplex virus-2 expressing glycoprotein b and d antigens
AU2019252658B2 (en) 2018-04-12 2023-09-14 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of autosomal recessive congenital ichthyosis
MX2020011257A (es) 2018-04-27 2021-01-15 Krystal Biotech Inc Ácidos nucleicos recombinantes que codifican una o más proteínas cosméticas para usos estéticos.
AU2019346549A1 (en) 2018-09-24 2021-04-15 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of netherton syndrome
EP3921334A1 (de) 2019-02-08 2021-12-15 Krystal Biotech, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von cftr-polypeptiden
EP4314028A1 (de) 2021-04-02 2024-02-07 Krystal Biotech, Inc. Virale vektoren für die krebstherapie
CN114574523B (zh) * 2022-03-14 2024-06-21 宜明（济南）生物科技有限公司 用于aav病毒包装用的辅助质粒载体、其构建方法和应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1282721C (en) 1984-06-04 1991-04-09 Bernard Roizman Herpes simplex virus as a vector
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US4859587A (en) 1984-06-04 1989-08-22 Institut Merieux Recombinant herpes simplex viruses, vaccines and methods
US5328688A (en) 1990-09-10 1994-07-12 Arch Development Corporation Recombinant herpes simplex viruses vaccines and methods
US5879934A (en) 1992-07-31 1999-03-09 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Herpes simplex virus strains for gene transfer
ES2191681T3 (es) 1992-12-23 2003-09-16 Arch Dev Corp Promotores sinteticos de virus de herpes simple.
US5728379A (en) 1994-06-23 1998-03-17 Georgetown University Tumor- or cell-specific herpes simplex virus replication
US5585096A (en) 1994-06-23 1996-12-17 Georgetown University Replication-competent herpes simplex virus mediates destruction of neoplastic cells
US5837262A (en) 1994-07-27 1998-11-17 Bio-Virus Research Incorporated Pharmaceutical compositions against several herpes virus infections and/or atherosclerotic plaque
US5851826A (en) 1995-07-26 1998-12-22 Children's Medical Center Corporation Helper virus-free herpesvirus vector packaging system
US5824318A (en) 1996-07-24 1998-10-20 American Cyanamid Company Avirulent herpetic viruses useful as tumoricidal agents and vaccines
GB9615794D0 (en) * 1996-07-26 1996-09-04 Medical Res Council Mutant herpes simplex virus strains and uses thereof
US5795713A (en) 1997-02-04 1998-08-18 Arch Development Corporation Methods for identifying inducers and inhibitors of programmed cell death
US6509020B1 (en) * 1997-03-27 2003-01-21 The University Of Cincinnati Replication-competent herpes simplex virus
US6106826A (en) 1997-12-17 2000-08-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Replication competent, avirulent Herpes simplex virus as a vector for neural and ocular gene therapy

Also Published As

Publication number Publication date
US20020155432A1 (en) 2002-10-24
US6846670B2 (en) 2005-01-25
WO2002045431A2 (en) 2002-06-06
WO2002045431A3 (en) 2003-04-24
AU1788502A (en) 2002-06-11
JP4004952B2 (ja) 2007-11-07
DE60131569D1 (de) 2008-01-03
JP2004528820A (ja) 2004-09-24
CA2430341A1 (en) 2002-06-06
EP1356071A2 (de) 2003-10-29
EP1356071B1 (de) 2007-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60131569T2 (de) Genetisch veränderter herpes virus für die behandlung von herz- und gefässerkrankungen
AU2016206692B2 (en) RNA guided eradication of herpes simplex type I and other related herpesviruses
US9636354B2 (en) Methods for sustained and regulatable gene expression using viral based expression vectors
KR102150027B1 (ko) 종양 선택적 ｅ１ａ 및 ｅ１ｂ 돌연변이
JPH10503361A (ja) 組換えｐ５３アデノウイルス方法と組成物
EA024878B1 (ru) Ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, отличающуюся увеличенной стабильностью, и его применение для контроля глюкозы в крови или предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена
KR20120095450A (ko) 단순 헤르페스 바이러스 백신
WO2019036086A1 (en) CARDIAC REPAIR BY REPROGRAMMING CARDIAC FIBROBLASTS ADULT TO CARDIOMYOCYTES
US11497806B2 (en) Immunization agents and methods of use
Goldenberg et al. The abundant latency-associated transcripts of herpes simplex virus type 1 are bound to polyribosomes in cultured neuronal cells and during latent infection in mouse trigeminal ganglia
CA2323112A1 (en) Multigene vectors
US20210069294A1 (en) Serum response factor regenerates senescent cells
US20210401968A1 (en) Localized activation of virus replicatio boosts herpesvirus-vectored vaccines
SK110897A3 (en) Medicinal combination useful for in vivo exogenic transfection and expression
Cheng et al. Transcutaneous immunization by lipoplex-patch based DNA vaccines is effective vaccination against Japanese encephalitis virus infection
US6200799B1 (en) Somatic gene therapy to suppress secondary cataract formation following eye surgery
AU2002217885B2 (en) Genetically engineered herpes virus for the treatment of cardiovascular disease
AU2002217885A1 (en) Genetically engineered herpes virus for the treatment of cardiovascular disease
EP1279739A1 (de) Rekombinante, TAM67 exprimierende, von Adeno-assoziierte Viren abgeleitete Vektoren zur Gentherapie
US8431119B2 (en) Pharmaceutical compositions and utilization thereof particularly for the treatment of neurodegenerative diseases
Burton et al. Virus-based vectors for gene expression in mammalian cells: herpes simplex virus

Legal Events

Date Code Title Description
8363 Opposition against the patent