JP2020063286A - 新規免疫化剤および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、どちらもその内容全体があらゆる図面を含めて参照により本明細書に援用される、2014年8月26日に出願された米国仮特許出願第62/070,443号明細書;および2014年10日10月に出願された米国仮特許出願第62/122,088号明細書の優先権を主張する。
本出願は、電子形態の配列表と共に出願される。配列表は、2015年8月25日に作成された、4KBサイズの「VIR2APCT_ST25.txt」と題されたファイルとして提供される。配列表の電子形態情報は、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
現時点で、HIV/AIDSに対して利用できる効果的ワクチンはない。いくつかの観察は、ワクチンが有効であるためには、かなりの細胞性免疫応答を始動しなくてはならないことを示唆する。いくつかのワクチン候補が、臨床試験で試験された。最近の重要な治験は、T細胞応答を誘導するためにウイルスベクターを利用した。有効性をさらに増大させるために、これらの治験はプライムブースト措置もまた実施した。このような第III相試験の1つは、HIV gp120抗原を発現するカナリアポックスのプライミングと、HIVgp120ブーストとの組み合わせを使用した。HIV−1予防に向けた傾向が見られたが、ワクチンは、感染後ウイルス負荷またはCD4+細胞数に対する有益な効果を生じなかった。Draper,S.J.and Heeney,J.L.(2010)Viruses as vaccine vectors for infectious diseases and cancer.Nat.Rev.Microbiology 8:62−73;Kim,J.H.et al.(2012)HIV vaccines−lessions learned and the way forward.Curr.Opin.HIV AIDS 5:428−34。様々なHIVタンパク質を発現する複製能力がないAd5をワクチンとして使用する、別の最近の一連の治験は、いかなる有効性の徴候も示さなかった。後者の経験、ならびに狭いCTL応答がCTL回避変異体の出現をもたらし得るという認識は、将来のワクチン候補には、幅広いCTL応答をはじめとする、完全な免疫応答を誘導できるべきであることを示唆する。Goulder,P.J.R.and Watkins,D.I.(2004)HIV and SIV CTL escape:implications for vaccine design.Nat.Rev.Immunol.4:630−40;Barouch,D.H.et al.(2002)Eventual AIDS vaccine failure in a rhesus monkey by viral escape from cytotoxic lymphocytes.Nature 415:335−9。
(1)哺乳類対象の身体領域への投与時に、複製能を有する制御ウイルスが、活性化不在下において身体領域で本質的に非自己複製のままであり、または代案としては(すなわち、異なる実施形態では)、複製能を有する制御ウイルスと同様の組成物中で、同様の量で、同様の対象の同様の身体領域に投与された複製欠陥比較ウイルスと、同様の低い効率で自己複製する、
(2)身体領域の局在性活性化処置への曝露が、複製能を有する制御ウイルスが、身体領域中で1周期の複製を受けるように活性化させる、
(3)活性化に際して、複製能を有する制御ウイルスは、哺乳類対象において免疫応答を誘導するのに十分な効率で自己複製し、この免疫応答は、複製能を有する制御ウイルスがそれに由来する野性型ウイルスによる感染を低下させ、および/または前記野性型ウイルスによる感染に引き続く疾患重症度、疾患持続期間または死亡率を低下させる上で、複製欠陥比較ウイルスによって同様の対象において誘導される免疫応答よりも、効果的である(複製能を有する制御ウイルスおよび複製欠陥比較ウイルスは、同様の組成物中で、同様の量で、同様の対象の同様の身体領域に投与される)。
複製欠陥比較ウイルスまたは複製能を有する制御ウイルスがそれに由来する野性型ウイルスと比較した、複製能を有する制御ヘルペスウイルスの複製効率は、伝染性ウイルス数(プラーク形成単位またはpfu)またはウイルス粒子数を測定できるようにする、任意の方法によって推定され得る。ウイルス複製効率を推定するための生化学的方法もまた、利用し得る。これらの方法は、ウイルスDNA、RNAまたはタンパク質産物量の定量化を目的とし、適切な組織化学的または免疫組織化学的方法、および増幅の生化学的アッセイおよび核酸検出(例えばリアルタイムPCR、RT−PCR、プローブハイブリダイゼーション)またはウイルスタンパク質産物の検出(例えば、ウエスタンブロットまたはその他の免疫学的アッセイ)を含んでもよい。活性化された複製能を有する制御ウイルスは、比較されるウイルスがそれに由来する野性型ウイルスが本質的に定量的に1回の複製周期を完了する、同数の伝染性ウイルスまたはウイルス粒子接種後の時点で、より高いレベルの伝染性ウイルスまたはウイルス粒子、またはウイルスDNAなどの生化学的相関物が測定されれば、比較ウイルスよりも高い効率で自己複製するとされる。活性化されていない複製能を有する制御ウイルスは、比較されるウイルスがそれに由来する野性型ウイルスが本質的に定量的に1回の複製周期を完了する、同数の伝染性ウイルスまたはウイルス粒子による接種後の時点で、より低いレベルの伝染性ウイルスまたはウイルス粒子、またはウイルスDNAなどの生化学的相関物が測定されれば、複製能を有する制御ウイルスがそれに由来する野性型ウイルスまたは比較ウイルスよりも低い効率で自己複製するとされる。後の時点で行われた測定には、より早期に行われた測定よりも多くの重み付けが与えられるべきであろう(活性化されていない複製能を有する制御ウイルスが関与する比較の場合のみ)。活性化された複製能を有する制御ウイルスの複製効率を判定するための典型的な生体外実験は、一段成長曲線である。この種の実験はまた、実施例セクションでも例示される。
(i)選択された野性型ヘルペスウイルスからの核酸配列を選択された遺伝子内挿入部位の側面に挿入することで、第1の前駆型組換えベクターを調製するステップと、
(ii)熱ショックプロモーターの役割を果たす核酸配列または熱ショックプロモーターならびにトランス活性化因子応答性プロモーターの役割を果たす核酸配列と機能的に連結する、小分子制御因子活性化トランス活性化因子の遺伝子を含んでなる、トランス活性化因子遺伝子カセットを側面のウイルスヌクレオチド配列間の部位にある第1の前駆物質組換えベクター中に挿入することで、第1の組換えベクターを調製するステップと、
(iii)第1の組換えベクターと野性型ビリオンDNAとで同時形質導入された細胞内の組換えによって、野性型ヘルペスウイルスゲノム中に遺伝子カセットを導入し、子孫ウイルスのゲノム内の遺伝子カセットの存在を検出することで第1の組換えウイルスを同定し、それからビリオンDNAを調製するステップと、
(iv)野性型ヘルペスウイルスからの核酸配列を制御のために選択された複製必須ウイルス遺伝子のプロモーター領域側面に挿入することで、第2の前駆型組換えベクターを調製するステップと、
(v)トランス活性化因子応答性プロモーターを側面のウイルスヌクレオチド配列間の部位にある第2の前駆型組換えベクターに挿入することで、第2の組換えベクターを調製するステップと、
(vi)第2の組換えベクターと第1の組換えウイルスのビリオンDNAとの細胞同時形質導入組換えによって、トランス活性化因子応答性プロモーターを第1の組換えウイルスのゲノム内に導入し、子孫ウイルスのゲノム内のトランス活性化因子応答性プロモーターの存在を検出することで、第2の組換えウイルスを同定し、トランス活性化因子遺伝子カセットとトランス活性化因子制御複製必須ウイルス遺伝子との双方を含有する、子孫ウイルスの系統を調製するステップとを含んでなる、複製能を有する制御ヘルペスウイルスを製造する方法が提供される。一実施形態では、トランス活性化因子応答性プロモーターが野性型ヘルペスウイルス中に挿入されて、第1の組換えウイルスが生成され、トランス活性化因子カセットが第1の組換えウイルス中に挿入される。
ウイルスを精製する様々な方法が、開示されている。例えば、Mundle et al.(2013)およびその中の参考文献;Wolf,M.W.and Reichl,U.(2011)Downstream processing of cell culture−derived virus particles.Expert Rev.Vaccines 10:1451−75を参照されたい。
全てのベクターは、骨格として野性型HSV−1 17syn+株を使用して構築された。この株は、完全に毒性であり、特徴がよく分かっており、完全なゲノム配列が入手できる。ウイルス組換え体の生成は、以前記載されたようなリン酸カルシウム沈殿法によって、精製ビリオンDNAと合わせた遺伝子操作プラスミドのウサギ皮膚細胞(RS)への相同組換えによって実施された。Bloom,D.C.1998.HSV Vectors for Gene Therapy.Methods Mol.Med.10:369−386。HSV−1ゲノムへの組換えのためのトランス活性化因子またはGAL4応答性プロモーターの挿入を操作するのに使用された全てのプラスミドは、HSV−1 17syn+株からクローンされた。プラスミドIN994は、次のようにして創造された:HSV−1上流組換えアームは、DB112(5’GAGCTCATCACCGCAGGCGAGTCTCTT3’)およびDB113(5’GAGCTCGGTCTTCGGGACTAATGCCTT3’)による(塩基対95,441〜96,090からの)HSV−1 DNA(17+)の増幅によって、生成された。生成物はSacIで消化され、pBluescriptのSacI制限部位に挿入されて、pUPが創造された。HSV−1下流組換えアームは、プライマーDB115−KpnI(5’GGGGTACCGGTTTTGTTTTGTGTGAC3’)およびDB120−KpnI(5’GGGGTACCGGTGTGTGATGATTTCGC3’)ゲノムDNA配列を使用して生成され、塩基対96,092〜96,538のHSV−1(17+株)が増幅された。PCR産物はKpnIで消化され,KpnI消化pUにクローン化されてpIN994が創造され、それは遺伝子間UL43/44領域でHSV−1と組換えられた。
(a)HSV−GS1の増殖および複製特性
許容(E5)および非許容(RS)細胞の溶菌斑分析
精製HSV−GS1ウイルスの連続希釈が、60mmシャーレ内のウサギ皮膚(RS)またはICP4相補Veroベースヘルパー細胞株(E5)細胞のどちらかのコンフルエントな単層上に播種された。ウイルスは37℃で1時間吸着されて、次に接種材料が除去され、細胞は完全培地(RSまたはE5細胞では、それぞれ5%仔ウシ血清または10%ウシ胎仔血清が添加された、改変イーグル培地)で覆われた。次にシャーレは72時間培養され、クリスタルバイオレットで染色されて、あらゆるウイルス溶菌斑が視覚化された。E5細胞上で10〜100個の溶菌斑をもたらす希釈において、非相補RS細胞上では、溶菌斑は観察されなかった。
60mmシャーレ内のRSまたはE5細胞のどちらかのコンフルエントな単層は、上述されるように、感染多重度(m.o.i.)が5のHSV−GS1で感染され、48時間培養されて、細胞を培地中に掻き取ることで収集され、−80℃で冷凍されて、2サイクルの凍結解凍を受けて、感染性ウイルスについて力価測定された。結果は、表1に示される。
この実験の目的は、HSV−GS1の複製周期を野性型ベクターHSV−1 17syn+株と比較することであった。Vero細胞のコンフルエントな単層は、m.o.i.が3のHSV−1株17+または組換えHSV−GS1のどちらかで感染された。ウイルスは37℃で1時間吸着されて、次に接種材料が除去され、細胞は完全培地(10%ウシ胎仔血清が添加された改変イーグル培地)で覆われた。加熱処置は、吸着の4時間後に、密封されたシャーレを43.5℃の水浴内に30分間浮遊させることで実施された。ミフェプリストン処理(10nM)が、初期感染の時点で開始された。次にシャーレは、37℃で72時間培養された。感染の0、8、16、および28時間後に、2個のシャーレが除去されて、細胞は培地中に掻き取られて収集され、2サイクルの凍結解凍を受けた。次に感染性ウイルスは、コンフルエントなE5細胞の24ウェルプレート上で三連で、各シャーレの溶解産物を力価測定することで判定された。溶菌斑は、クリスタルバイオレットで染色することで、2日後に視覚化された。結果は、選択された実験条件下では、HSV−GS1が、野性型ウイルス17syn+と同程度に効率的に、自己複製することを実証する(図3B)。活性化処置(加熱およびミフェプリストン)の不在下では、HSV−GS1複製は生じないようであった。活性化処置、すなわち、熱曝露およびミフェプリストン存在下の培養は、野性型ウイルス複製にわずかにのみ影響を及ぼしたことにもまた留意されたい。
この実験の目的は、加熱およびミフェプリストンによるHSV−GS1組換えの活性化が、双方の要求に起因するかどうか、そしてミフェプリストンのみまたは加熱のみが複製を誘導するのに十分でないかを判定することであった。実験は、加熱処置が吸着直後に施されたことを除いて、先行するセクションに記載されるように実施された。データは、宿主細胞が、ミフェプリストン存在下で加熱に曝露されない限り、HSV−GS1の複製が生じなかったことを示す(図3A)。
HSV−GS3の複製効率
この実験の目的は、HSV−GS3組換え体の複製周期を野性型ベクターHSV−1 17syn+と比較することであった。E5細胞のコンフルエントな単層(しかし下記も参照されたい)は、m.o.i.が3のHSV−1株17+または組換えHSV−GS3のどちらかで感染された。ウイルスは37℃で1時間吸着されて、次に接種材料が除去され、細胞は完全培地(10%ウシ胎仔血清が添加された改変イーグル培地)で覆われた。加熱処置は、感染の4時間後に、密封されたシャーレを43.5℃の水浴内に30分間浮遊させることで、吸着後に実施された。ミフェプリストン処理(10nM)が、初期感染の時点で開始された。HSV−GS3 No Tx(処理なし)セットでは、E5細胞が、感染の12時間前に発現可能ICP8遺伝子を含有するプラスミドで形質移入された。次にシャーレは、37℃でさらに培養された。感染の0、4、12、および24時間後に、2個のシャーレが除去されて、細胞は培地中に掻き取られて収集され、2サイクルの凍結解凍を受けた。次に感染性ウイルスは、あらかじめICP8発現プラスミドで形質移入された、コンフルエントなE5細胞の24ウェルプレート上で三連で、各シャーレの溶解産物を力価測定することで判定された。溶菌斑は、クリスタルバイオレットで染色することで、2日後に視覚化された。結果は、HSV−GS3が、選択された実験条件下で、野生型ウイルスHSV−117syn+に近い効率で複製されたことを示す(図4A)。
一段成長実験が実施されて、加熱およびミフェプリストンによるHSV−GS3の活性化が、双方の要件に起因するかどうか、そしてミフェプリストンのみまたは加熱単のみが複製を誘導するのに十分でないかが判定された。図4Bに示される実験は、Vero細胞が使用されおよび加熱処置が吸着直後に施されたことを除いては、先行するセクションに記載されるようにして実施された。力価測定は、ICP8発現プラスミドであらかじめ形質移入されたE5細胞内で実施された。同様の実験が、ヒト扁平細胞腫瘍系SCC−15で実施された(図4C)。後者の実験の結果は、HSV−GS3の複製が厳密に制御されることを示す。それは、ミフェプリストン存在下における感染細胞の熱曝露によってのみ引き起こされる。
この実験の目的は、加熱および小分子制御因子不在下で、GSベクターが、細胞培養においてそのようであるように、マウスにおいて厳密に「オフ」であることを示すことであった。4〜6週齢の非近交系ND4Swiss Websterメスマウス(Harlan Sprague−Dawley,Inc.)は、生理食塩水前処理に続いて、軽く擦過された両後肢の足底表面で、同様の量のHSV−GS1または17syn+野性型ウイルスに感染された。感染の4、8、および21日後の時点で、4匹のマウスを安楽死させ、肢および後根神経節(DRG)が採取されて、TRIzol中で均質化され、DNAおよびRNAが抽出された。DNAは、HSV−1 DNAの定量分析のために、TaqmanリアルタイムPCRに供され;RNAは、ICP4および糖タンパク質C(gC)転写物の存在について、以前記載されたように、TaqmanリアルタイムPCRによって、RTに続いて分析された。Kubat,N.J.et al.2004.The herpes simplex virus type 1 latency−associated transcript(LAT)enhancer/rcr is hyperacetylated during latency independently of LAT transcription.J.Virol.78:12508−18。リアルタイムプライマー/プローブ配列は、表3で開示される。
これらの実験では、マウスモデルにおけるウイルス複製は、ウイルスDNA定量およびウイルス遺伝子発現の生化学的方法によって推定された。DNA量およびウイルス転写物量は、肢(ウイルス接種部位)および後根神経節(DRG)(HSV急性複製および潜伏部位)の双方で測定された。このような一実験は、表5に要約されるデザインを有した。この実験はまた、ウリプリスタルの最低生体内有効量を判定することを目的とする。
この種の実験の目的は、誘発条件下におけるHSV−GS3ウイルスによるマウスの免疫化が、致死性用量の野生型HSV−1による後続の攻撃に対する、強力な防御免疫応答を引き起こすことを示すことであった。
模擬処置群のマウスは、早くも攻撃の6日後に後肢麻痺およびCNS感染の徴候を示し始めた一方で、全ての3つの免疫化群は、攻撃の8〜9日後まで完全に健康なようであった。表7は、実験終了時に生存したマウスの数を描写する(マウスは攻撃の30日後まで追跡された)。結果は、全ての処置が、20倍致死量のHSV−1攻撃から、少なくともいくらかのマウスを保護できた一方で、誘導HSV−GS3ウイルス処置のみがマウスに実質的保護をもたらし得たことを実証する。
a)免疫化:マウスは、最初に、表6に示される実験群で免疫化された。各群は、10匹のマウス(ND4 Swiss Websterメス、4〜6週間)を含んだ。各ベクターは、生理食塩水前処理に続いて、軽く擦過された両後肢の足底表面に塗布された。
表9は、実験終了時に生存したマウスの数を描写する(マウスは攻撃の30日後まで追跡された)。結果は、全ての処置が、2倍致死量のHSV−1攻撃から、少なくともいくらかのマウスを保護できた一方で、誘導HSV−GS3ウイルス処置のみがマウスに実質的保護をもたらし得たことを実証する。
実験デザイン:
a)免疫化:マウスは、表6に示されるように免疫化された。各群は、5匹のマウス(ND4 Swissメス、4〜6週間)を含んだ。各ベクターは、生理食塩水前処理に続いて、軽く擦過された両後肢の足底表面に塗布された。
表10は、力価測定データの結果を描写する。これらの結果は、全ての免疫化処置が、HSV−1による攻撃に続いて、脚において複製を(模擬と比較して)ある程度低下できた一方で、HSV−GS3(誘導)マウスが、攻撃の4日後にはるかにより低い(模擬より約2桁低い)攻撃ウイルス力価を示したことを例証する。
(a)複製能を有する制御ウイルスのトランス活性化因子によって活性化される複製必須遺伝子を有するアデノウイルス
rAd3は、E3を包含するヌクレオチド28,130−30,820を欠く。アデノウイルス5型ゲノムに関するヌクレオチド番号は、GI:33694637で定義されるようである。Davison et al.2003.J.Gen.Virol.84,2895−2908。さらに、それは、最小プロモーターを含有するGAL4部位と機能的に連結する、完全なE1遺伝子を含有する。
E1A−欠損Ad5(rAd4)は、次のようにして調製される:pShuttleの右アーム相同性領域は、より長いAdE1配列で置換される。最初に、pShuttle DNAはNotIおよびPmeIで消化され、ベクターフラグメントはゲル精製される。次に、Ad496−5780を含有するフラグメントが、プラスミドpXC1(Microbix Corporation,Toronto,ON)からのPCR増幅によって得られる。後者のPCR増幅は、NotI制限部位を含有する順方向プライマー(E1遺伝子への読み取り)と、PmeI制限部位を含有する逆方向プライマーとを使用して実施される。得られたPCRフラグメントは、Not1およびPmeIで消化される。後者の末端消化PCRフラグメントは、pShuttleベクターフラグメントにライゲートされる。制限分析によって証明されるように後者の3つのフラグメントを含有するプラスミドは、pShuttle−E1と称される。
Claims (10)
- ヘルペス性疾患に対する免疫化のための組成物であって、前記組成物が複製能を有する制御ヘルペスウイルスの有効量を含み、
前記複製能を有するヘルペスウイルスが、そのゲノム中に挿入された、熱ショックプロモーターに加えてトランス活性化因子応答性プロモーターの役割を果たす核酸配列又は熱ショックプロモーターの役割を果たす核酸配列と機能的に連結された、小分子制御因子により活性化されるトランス活性化因子の遺伝子と、前記複製能を有するヘルペスウイルスの1つ又は複数の複製必須遺伝子と機能的に連結された、1つ又は複数のトランス活性化因子応答性プロモーターとを含む組み換え体ヘルペスウイルスであり、
(a)前記組成物が、前記ヘルペス性疾患の治療又は予防を必要とする哺乳類対象の身体の接種部位領域に投与され、(b)前記哺乳類対象の前記接種部位領域が、前記接種部位領域における、トランス活性化因子を活性化する小分子制御因子の有効濃度の存在下での、活性化熱線量の投与からなる局所的活性化治療に曝露され、
前記局所的活性化治療が、前記組み換えヘルペスウイルスの前記接種部位領域における1回の複製周期を引き起こし、前記免疫化が、前記ヘルペス性疾患の重症度、持続期間又は死亡率を、複製欠陥を有する弱毒型ヘルペスウイルスを用いた免疫化よりも効率的に低下させることを特徴とする、組成物。 - 請求項1に記載の免疫化のための組成物において、前記接種部位領域が、皮膚領域若しくは皮下領域、又は粘膜であることを特徴とする、組成物。
- 請求項1又は2に記載の免疫化のための組成物において、前記組み換え体ヘルペスウイルスが、ヘルペスウイルスの1つ又は複数の複製必須遺伝子と機能的に連結された、1つ又は複数の熱ショックプロモーターをさらに含むことを特徴とする、組成物。
- 請求項1乃至3の何れか一項に記載の免疫化のための組成物において、前記複製能を有する制御ヘルペスウイルスが、HSV−1、HSV−2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、及びバラ疹ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来することを特徴とする、組成物。
- 請求項1乃至3の何れか一項に記載の免疫化のための組成物において、前記複製能を有する制御ヘルペスウイルスが、HSV−1又はHSV−2に由来し、前記トランス活性化因子応答性プロモーターと機能的に連結された前記複製必須ウイルス遺伝子が、少なくともICP4遺伝子又はICP8遺伝子の全コピーを含むことを特徴とする、組成物。
- 請求項1乃至5の何れか一項に記載の免疫化のための組成物において、前記複製能を有する制御ヘルペスウイルスが、別の病原体からの遺伝子、免疫調節性ポリペプチドをコードする異種遺伝子、及び別のポリペプチドをコードする異種遺伝子の少なくとも1つをさらに含むことを特徴とする、組成物。
- 請求項6に記載の免疫化のための組成物において、前記別の病原体からの遺伝子が、インフルエンザウイルス表面抗原、インフルエンザウイルス内部タンパク質、又は後者タンパク質の部分をコードし、免疫化がインフルエンザウイルス媒介性の疾患に対するものであることを特徴とする、組成物。
- 請求項6に記載の免疫化のための組成物において、前記別の病原体からの遺伝子が、HIV表面抗原、HIV内部タンパク質、又は後者タンパク質の部分をコードすることを特徴とする、組成物。
- 請求項1乃至8の何れか一項に記載の免疫化のための組成物において、前記小分子制御因子により活性化されるトランス活性化因子が、切断されたプロゲステロン受容体からのリガンド結合ドメインを含有し、トランス活性化因子を活性化できるプロゲステロン受容体拮抗薬によって活性化されることを特徴とする、組成物。
- 請求項1に記載の免疫化のための組成物において、前記複製能を有する制御ヘルペスウイルスが、HSV−GS1、HSV−GS2、HSV−GS3、及びHSV−GS4からなる明細書に記載のウイルス組み換え体の群から選択されることを特徴とする、組成物。
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