ES2666043T3 - Vectores de CMVH y CMVRh recombinantes y usos de los mismos - Google Patents

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Jay A. Nelson
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Michael A. Jarvis
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Abstract

Un vector de CMVRh o CMVH recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo, en el que el antígeno heterólogo es un antígeno específico de patógeno humano o un antígeno tumoral, en el que el vector es deficiente en replicación y comprende una supresión en el gen de CMVRh Rh110 o CMVH UL82 que codifica pp71.

Description

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SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleótidos del aislado de CMVH AD 169-BAC. SEQ ID NO: 10 es la secuencia de nucleótidos de VIS. SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos de gap-pol de VIS. SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos de la proteína gag de VIS.
5
Descripción detallada de la invención
Paradójicamente, los altos niveles de inmunidad específica de CMV son incapaces de erradicar el virus del individuo infectado sano, o conferir protección del individuo seropositivo para CMV contra reinfección. Se ha creído durante mucho tiempo que esta capacidad de CMV para escapar a la erradicación por el sistema inmunitario, y de reinfectar al hospedador seropositivo está ligada a los múltiples inmunomoduladores víricos codificados por el virus (para una revisión, véase (Mocarski, E. S., Jr. 2002. Trends Microbiol 10: 332-9)). De forma coherente con la reactivación crónica/replicación persistente dentro del hospedador, CMV también induce y mantiene una respuesta inmunitaria de linfocitos T característica y única. Los linfocitos T de memoria inducidos por vacunación o infección pueden
15 caracterizarse ampliamente en linfocitos de memoria efectores (TEM) o centrales (TCM), lo que se deduce a partir de las funciones definidas de estas dos poblaciones de memoria (Cheroutre, H., y L. Madakamutil. 2005. Cell Mol Life Sci 62: 2853-66, Mackay, C. R. et al. 1990. J Exp Med 171: 801-17, Masopust, D. et al. 2001. Science 291: 2413-7, Sallusto, F. et al. 1999. Nature 401: 708-12 y Wherry, E. J. et al. 2003. Nat Immunol 4: 225-34). Se han descrito adicionalmente realizaciones de la invención que se refieren a inmunomoduladores y la respuesta de linfocitos T única inducia por CMVH en el documento PCT/US2011/029930.
Otras realizaciones de la invención se refieren a vacunas de CMV atenuadas que son incapaces de o tienen alterada su capacidad de replicar en células y tejidos asociados con transmisión de CMV y enfermedad. La base de este enfoque de vacuna es la capacidad única de CMVH para inducir respuestas de linfocitos T de memoria efectora 25 (TEM) grandes y duraderas a antígenos víricos que proporciona a vectores basados en CMVH el potencial de generar respuestas de linfocitos T basadas en sitio efector de alta frecuencia que interceptarían y suprimirían la replicación de VIH muy pronto en la infección, cuando el virus es más vulnerable al control inmunitario. La inmunización de macacos rhesus (MR) con vectores de vacuna de CMVRh/VIS competentes para replicación induce una gran respuesta de TEM de larga duración a antígenos del VIS que han proporcionado inmunidad protectora al 50 % de los animales después de exposición rectal a VISmac239 altamente patógeno (Hansen, S.G., Vieville, C., Whizin, N., Coyne-Johnson, L., Siess, D.C., Drummond, D.D., Legasse, A.W., Axthelm, M.K., Oswald, K., Trubey, C.M., et al. 2009. Effector memory T cell responses are associated with protection of rhesus monkeys from mucosal simian immunodeficiency virus challenge. Nat Med 15: 293-299). Tanto la respuesta inmunitaria anti-VIS como la protección mediada por estos vectores de CMVRh/VIS carecían de precedentes en comparación con candidatos de vacuna
35 actuales, y proporciona ahora la base del desarrollo de una vacuna de VIH eficaz.
Además, las realizaciones de la presente invención se refieren a la capacidad única del CMVRh para reinfectar MR sero+ a pesar de la presencia de una respuesta inmunitaria anti-CMVRh significativa. Por el contrario, la mayoría de los vectores de vacuna de VIH actuales (es decir, vectores basados en la viruela y adenovirus) están comprometidos por la inmunidad anti-vector que permite solamente un único uso eficaz de estas plataformas de vacuna. Esta propiedad inherente de vectores de CMV puede atribuirse al repertorio extensivo de genes de evasión inmunitaria codificados por este virus (Hansen, S.G., Powers, C.J., Richards, R., Ventura, A.B., Ford, J.C., Siess, D., Axthelm, M.K., Nelson, J.A., Jarvis, M.A., Picker, L.J., et al. 2010. Evasion of CD8+ T cells is critical for superinfection by cytomegalovirus. Science 328: 102-106). Otra ventaja adicional de vectores basados en CMV es el potencial para
45 insertar casetes grandes que expresan antígenos de VIS/VIH en los que teóricamente más de 50 kB del genoma vírica puede reemplazarse con ADN ajeno. Juntas, estas características de vectores de vacuna basados en CMV han permitido el desarrollo de una vacuna de CMVRh/VIS que es capaz de inducir una respuesta de TEM robusta a múltiples antígenos del VIS y controlar completamente la replicación vírica en MR expuestos a VIS por vía mucosa antes del establecimiento de infección progresiva, sistémica: un logro que no se ha conseguido con enfoques de vacuna previos.
El vector de CMVRh/VIS puede ser una vacuna de VIS eficaz pero el mayor problema del uso de un CMVH competente de replicación completa como un vector de vacuna de VIH es el de seguridad. Ya que CMV establece una infección crónica del hospedador, la ventana para realización de cualquier potencial patógeno de una vacuna 55 basada en CMV se extiende desde el momento de la vacunación durante toda la vida del individuo. Durante esta ventana (potencialmente >80 años) se espera que algunas vacunas encuentren periodos de supresión inmunitaria, sea como consecuencia de acondicionamiento inmunitario yatrógeno antes del trasplante, o sea como una consecuencia de la enfermedad, como con infección por VIH o cáncer. CMVH también se disemina con frecuencia a la saliva, la orina y leche materna de individuos infectados por CMV sanos durante periodos de tiempo que varían de meses a años. Este potencial de la propagación de vacuna de individuos vacunados a no vacunados es una característica de vacunas atenuadas vivas, tales como la vacuna de la polio oral (VPO) (Heymann, D.L., Sutter, R.W., y Aylward, R.B. 2006. A vision of a world without polio: the OPV cessation strategy. Biologicals 34: 75-79). Con el claro precedente de la experiencia con la VPO en la Iniciativa de la Erradicación Global de la Polio, un potencial de propagación ambiental plantea un obstáculo importante adicional para el desarrollo de una vacuna de CMVH/VIH.
65 Estas características de CMV deben abordarse antes de que una vacuna basada en CMV sea aceptable para el uso general en la población humana.
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virus vaccines. Cell Host Microbe 4: 239-248; Lee, C.Y., Rennie, P.S., y Jia, W.W. 2009. MicroRNA regulation of oncolytic herpes simplex virus-1 for selective killing of prostate cancer cells. Clin Cancer Res 15: 5126-5135; Perez, J.T., Pham, A.M., Lorini, M.H., Chua, M.A., Steel, J., y tenOever, B.R. 2009. MicroRNA-mediated species-specific attenuation of influenza A virus. Nat Biotechnol 27: 572-576.).
5 La expresión específica de tejido de miARN se aprovecha para generar una vacuna de la polio atenuada mediante la introducción de múltiples secuencias diana de miARN de miR-124 que se expresa específicamente en el SNC en la 3’UTR del genoma de poliovirus (Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., y Andino, R. 2008. Harnessing endogenous miRNAs to control virus tissue tropism as a strategy for developing attenuated virus vaccines. Cell Host Microbe 4: 239-248). Se ha observado que la adición de las secuencias diana de miR-124 al genoma de poliovirus atenúa significativamente la infección vírica en ratones. De forma similar, se añadieron múltiples secuencias diana de miR-93 que se expresa de forma ubicua en todos los tejidos de mamífero pero no aviares al gen de nucleoproteína de la gripe que da como resultado un mutante de gripe restringido a especie que fue capaz de crecer en huecos de pollo pero no en ratones (Perez, J.T., Pham, A.M., Lorini, M.H., Chua, M.A., Steel, J., y tenOever, B.R.
15 2009. MicroRNA-mediated species-specific attenuation of influenza A virus. Nat Biotechnol 27: 572-576).
Las realizaciones de la presente invención se refieren a este enfoque de atenuación que es eficaz para virus mayores, tales como CMV murino (CMVM). A diferencia de los virus de ARN pequeños, el CMV codifica más de 200 genes de los que aproximadamente el 50 % son esenciales y necesarios para la replicación o codifican proteínas estructurales del virus. Uno de estos genes de CMV esenciales es el gen inmediato temprano (IE) 3 (el equivalente de ratón de IE2 en CMVH o CMVRh) que codifica una proteína reguladora de la transcripción necesaria para activación posterior de genes tempranos y tardíos en el virus. La supresión de este gen bloquea completamente la replicación vírica de células y tejidos de ratón (Angulo, A., Ghazal, P., y Messerle, M. 2000. The major immediate early gene ie3 of mouse cytomegalovirus is essential for viral growth. J Virol 74: 11129-11136). Se describe en el
25 presente documento que la introducción de secuencias diana de miARN específicos de tejido en la 3’UTR de este gen atenuaría la replicación vírica en estas células.
Una realización adicional se refiere a secuencias dianas de miR-142-3p que se expresa solamente en células de linaje mieloide (Brown, B.D., Gentner, B., Cantore, A., Colleoni, S., Amendola, M., Zingale, A., Baccarini, A., Lazzari, G., Galli, C., y Naldini, L. 2007. Endogenous microRNA can be broadly exploited to regulate transgene expression according to tissue, lineage and differentiation state. Nat Biotechnol 25: 1457-1467). Se ha mostrado que células de linaje mieloide representan un depósito de virus latentes, y se cree que albergan y diseminan virus por todo el hospedador (Jarvis, M.A., y Nelson, J.A. 2002. Mechanisms of human cytomegalovirus persistence and latency. Front Biosci 7: d1575-1582). Estudios adicionales con CMVM (Snyder, C.M., Allan, J.E., Bonnett, E.L., Doom, C.M.,
35 y Hill, A.B. Cross-presentation of a spread-defective MCMV is sufficient to prime the majority of virus-specific CD8+ T cells. PLoS One 5:e9681) indican que la sensibilización cruzada es el mecanismo primario por el que las proteínas codificadas por CMV preparan la respuesta inmunitaria, la replicación en células dendríticas mieloides puede tener una influencia sorprendentemente mínima en la inmunogenia del CMV.
Se usa tecnología basada en cromosoma artificial de bacterias (BAC) para generar un virus CMVM recombinante que contiene cuatro secuencias diana repetidas (cuatro 21meros) con complementariedad exacta con el miARN celular, miR-142-3p, dentro de la 3’UTR del gen vírico esencial IE3 (IE3-142). Para confirmar la medida en que la expresión de miR-142-3p podría reprimir la replicación de IE3-142, se realizan ensayos de crecimiento de virus en la línea celular de macrófago, IC-21. El análisis por RT-PCR confirmó que las células IC-21 expresan altos niveles de
45 miR-142-3p (FIG. 21) lo que hace a la línea celular adecuada para ensayar la eficacia de la estrategia. Los experimentos preliminares confirmaron la utilidad del enfoque para atenuación específica de tipo celular de CMV. Aunque IE3-142 se replicó a niveles de tipo silvestre en fibroblastos, el crecimiento se bloqueó completamente en macrófagos IC-21 (FIGs. 22 y 23). Un virus de control, IE3-015, que contiene solamente secuencia de vector dentro del sitio de inserción de IE3, se replica hasta niveles de tipo silvestre en células IC-21. El análisis por RT-PCR indica que la expresión de IE3 se anuló completamente después de infección de células IC-21, pero no después de la infección de fibroblastos (que carecen de expresión de miR-142-3p) lo que indica que la alteración de la expresión de IE3 no se debe a la inserción de la secuencia diana.
Las realizaciones de la invención se refieren a la estrategia para atenuar CMV basándose en la demostración de que
55 los virus pueden atenuarse con respecto al crecimiento específico tisular usando secuencias diana de miARN y la atenuación de CMVM en células mieloides mediante la dirección de miARN específico de células a genes víricos esenciales. Ya que el SNC es una diana principal para la patogenia de CMV en enfermedad tanto congénita como de adultos, se generan vacunas de CMVRh/VIS y CMVH/VIH que contienen secuencias diana de miARN altamente conservados específicamente expresados por neuronas fusionadas con genes de CMV esenciales para evitar la replicación en el SNC. También se usan secuencias diana del miARN mieloide miR-124 para prevenir la replicación y diseminación del vector de CMV en este tipo celular. Juntos, estos virus atenuados proporcionarán un nivel adicional de seguridad que permitirá el uso de esta vacuna en todas las poblaciones diana humanas.
Además de la aplicación a la traducción del uso de expresión específica de tejido de miARN para generar vectores 65 de CMV seguros, están disponibles por primera vez herramientas para plantear cuestiones científicas importantes, más notablemente incluyendo la determinación de qué tipos celulares se requieren para el establecimiento y la
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persistencia de infección por CMV, inducción de la inmunidad de linfocitos T y enfermedad como se describe en el presente documento. Las realizaciones de la invención se refieren a la infección de tipos celulares particulares que pueden ser cruciales para la generación de la inmunidad de linfocitos T sesgada a TEM de alta frecuencia característica de respuestas inducidas por CMV, y la determinación de cómo la restricción del tropismo vírico cambia
5 el carácter de la enfermedad por CMV.
Algunas abreviaturas no limitantes incluyen:
BAC cromosoma artificial bacteriano BAL lavado broncoalveolar CM memoria central CMV citomegalovirus CytoG gen citotóxico Dox doxiciclina
15 ELISA ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas EM memoria efectora CMVH citomegalovirus humano VHC virus de la hepatitis C VIH virus de la inmunodeficiencia humana TCI tinción de citocinas intracelular
i.p. intraperitoneal CMVM citomegalovirus murino MEF fibroblasto embrionario murino MOI multiplicidad de infección
25 PNH primate no humano NP nucleoproteína NE no estructural ORF fase abierta de lectura SP sangre periférica PBMC células mononucleares de sangre periférica PCR reacción en cadena de la polimerasa UFP unidad formadora de placas CMVRh citomegalovirus de rhesus MR macaco rhesus
35 s.c. subcutáneo VIS virus de la inmunodeficiencia de simios Tet tetraciclina WT tipo silvestre
A no ser que se indique de otro modo, los términos técnicos se usan de acuerdo con su uso convencional. Pueden encontrarse definiciones de términos habituales en la biología molecular en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
45 Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la invención, puede usarse la siguiente terminología:
Adyuvante: una sustancia o un vehículo que potencia de forma no específica la respuesta inmunitaria a un antígeno u otra composición. Los adyuvantes pueden incluir una suspensión de minerales (alumbre, hidróxido de aluminio o fosfato) en la que se adsorbe el antígeno; o emulsión de agua en aceite en la que la solución de antígeno se emulsiona en aceite mineral (por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund), en ocasiones con inclusión de micobacterias muertas (adyuvante completo de Freund) para potenciar adicionalmente la antigenicidad. También pueden usarse oligonucleótidos inmunoestimulantes (tales como los que incluyen un motivo de CpG) como adyuvantes (por ejemplo, véase Patentes de Estados Unidos N.º 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371;
55 6.239.116; 6.339.068; 6.406.705; y 6.429.199). Los adyuvantes también incluyen moléculas biológicas tales como moléculas coestimulantes. Los adyuvantes biológicos ejemplares incluyen IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L y 41 BBL.
Administración: la introducción de una composición en un sujeto por una vía seleccionada. Por ejemplo, si la vía seleccionada es intravenosa, la composición se administra introduciendo la composición en una vena del sujeto. La administración puede ser local o sistémica. Los ejemplos de administración local incluyen, pero sin limitación, administración tópica, administración subcutánea, administración intramuscular, administración intratecal, administración intrapericárdica, administración intraocular, administración oftálmica tópica o administración a la mucosa nasal o los pulmones por administración de inhalación. La administración sistémica incluye cualquier vía de 65 administración para distribuir un compuesto activo o una composición ampliamente por todo el cuerpo mediante el sistema circulatorio. Por lo tanto, la administración sistémica incluye, pero sin limitación, administración
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una respuesta CD8+. En otro ejemplo, la respuesta es una respuesta de linfocitos B y da como resultado la producción de anticuerpos específicos para el agente inmunogénico. En algunos ejemplos, dicha respuesta inmunitaria proporciona protección para el sujeto del agente inmunogénico o la fuente del agente inmunogénico. Por ejemplo, la respuesta puede tratar a un sujeto que tiene un tumor, por ejemplo, interfiriendo con la metástasis del
5 tumor o reduciendo el número o tamaño de un tumor. En otro ejemplo, la respuesta inmunitaria puede tratar a un sujeto con una enfermedad infecciosa. Una respuesta inmunitaria puede ser activa e implicar la estimulación del sistema inmunitario del sujeto, o ser una respuesta que resulta de inmunidad adquirida de forma pasiva. Una respuesta inmunitaria “estimulada de forma repetida” es una respuesta inmunitaria a largo plazo que resulta de la estimulación periódica y repetitiva del sistema inmunitario por la producción repetida de un antígeno dentro de un hospedador. En algunos ejemplos, una respuesta inmunitaria aumentada o potenciada es un aumento en la capacidad de un sujeto para combatir una enfermedad, tal como un tumor o una enfermedad infecciosa.
Inmunidad: el estado de poder montar una respuesta protectora tras exposición a un agente inmunogénico. Las respuestas protectoras pueden ser mediadas por anticuerpos o mediadas por células inmunitarias, y pueden dirigirse
15 hacia un patógeno o antígeno tumoral particular. La inmunidad puede adquirirse de forma activa (tal como por exposición a un agente inmunogénico, bien de forma natural o bien en una composición farmacéutica) o de forma pasiva (tal como mediante administración de anticuerpos o linfocitos T estimulados y expandidos in vitro). En algunas realizaciones desveladas en el presente documento, la inmunidad se adquiere por administración (tal como por administración intraperitoneal o intravenosa) de un vector de CMV recombinante que expresa un antígeno particular, tal como un antígeno específico de patógeno o un antígeno tumoral.
Enfermedad infecciosa: una enfermedad provocada por un patógeno, tal como un hongo, parásito, protozoo, bacteria o virus.
25 Inhibición o tratamiento de una enfermedad: inhibición del desarrollo completo o reaparición de una enfermedad o afección. El “tratamiento” se refiere a una intervención terapéutica que alivia una señal o un síntoma de una enfermedad o afección patológica después de haber comenzado a desarrollarse. El término “aliviar”, en referencia a una enfermedad o afección patológica, se refiere a cualquier efecto beneficioso observable del tratamiento. El efecto beneficioso puede demostrarse, por ejemplo, por una aparición o reparación retardada de síntomas clínicos de la enfermedad en un sujeto susceptible, una reducción en la gravedad de algunos o todos de los síntomas clínicos de la enfermedad, una progresión más lenta de la enfermedad, una reducción en el número de metástasis (sin la enfermedad es cáncer), una reducción en el título de un patógeno (si la enfermedad es una enfermedad infecciosa), una mejora en la salud general o el bienestar del sujeto, o por otros parámetros bien conocidos en la técnica que son específicos para la enfermedad particular. Un tratamiento “profiláctico” es un tratamiento administrado a un sujeto
35 que no muestra señales de una enfermedad o muestra solamente señales tempranas para el fin de reducir el riesgo de desarrollar patología.
Aislado o de origen no natural. Un componente biológico “aislado” o “de origen no natural” (tal como una molécula de ácido nucleico, proteína u orgánulo) se ha separado o purificado sustancialmente de al menos otro componente biológico en la célula del organismo en el que el componente aparece de forma natural, por ejemplo, otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y proteínas que son “de origen no natural” o se han “aislado” incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados por métodos de purificación convencionales. La expresión también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados por expresión recombinante en una célula hospedadora así como ácidos nucleicos sintetizados de forma química.
45 Unido operativamente: una primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. En general, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, están en la misma fase de lectura.
Fase abierta de lectura (ORF): una serie de tripletes de nucleótidos (codones) que codifican aminoácidos sin ningún codón de terminación interno. Estas secuencias son habitualmente traducibles a un péptido.
55 Patógeno: un agente biológico que provoca enfermedad o dolencia a su hospedador. Los patógenos incluyen, por ejemplo, bacterias, virus, hongos y protozoos. Los patógenos también se denominan agentes infecciosos.
Los ejemplos de virus patógenos incluyen, pero sin limitación, los que están en las siguientes familias de virus: Retroviridae (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de leucemia de linfocitos T humana; Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis C, enterovirus, virus coxsackie humanos, rinovirus, echovirus, virus de la fiebre aftosa); Caliciviridae (tales como cepas que provocan gastroenteritis, incluyendo virus de Norwalk); Togaviridae (por ejemplo, alfavirus (incluyendo virus de chikungunya, virus de la encefalitis equina, virus del bosque de Semliki, virus de Sindbis, virus del Río Ross), virus de la rubeola); 65 Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental, virus de la encefalitis de St. Louis, virus de la encefalitis japonesa, virus Powassan y otros virus de encefalitis); Coronaviridae (por
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ejemplo, coronavirus, virus del síndrome respiratorio agudo grave (SRAG); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del Ébola, virus de Marburg); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus paragripal, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Bunyaviridae (por ejemplo, virus de Hantaan, virus Sin Nombre, virus de la fiebre del
5 Valle del Rift, bunyavirus, flebovirus y Nairovirus); Arenaviridae (tales como virus de la fiebre de Lassa y otros virus de fiebre hemorrágica, virus, Machupo, virus de Junín); Reoviridae (por ejemplo, reoviruses, orbivirus, rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma, virus BK); Adenoviridae (adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simple (VHS)-1 y VHS-2; citomegalovirus; virus de Epstein-Barr; virus de la varicela zóster; y otros virus del herpes, incluyendo VHS-6); Poxviridae (virus variola, virus vaccinia, virus de la viruela); e Iridoviridae (tal como virus de la fiebre porcina africana); Astroviridae; y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiológicos de encefalopatías espongiformes, el agente de la hepatitis delta (que se cree que es un satélite defectuoso del virus de la hepatitis B).
Los ejemplos de patógenos bacterianos incluyen, pero sin limitación: Helicobacter pylori, Escherichia coli, Vibrio
15 cholerae, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (tales como. M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus del Grupo A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus del Grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (especies anaeróbicas), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp. patógena, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Bordetella pertussis, Shigella flexnerii, Shigella dysenteriae y Actinomyces israelli.
25 Los ejemplos de patógenos fúngicos incluyen, pero sin limitación, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.
Los ejemplos de patógenos tales como patógenos parasitarios/protozoarios incluyen, pero sin limitación: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Trypanosoma cruzi y Toxoplasma gondii. La invención se refiere a un parásito que puede ser un organismo u organismos protozoarios que provocan enfermedades que incluyen, pero sin limitación, Acanthamoeba, Babesiosis, Balantidiasis, Blastocistosis, Coccidios, Dientamebiasis, Amebiasis, Giardia, Isosporiasis, Leishmaniosis, meningoencefalitis amébica primaria (PAM), Malaria, Rhinosporidiosis, Toxoplasmosis – neumonía parasitaria, Trichomoniasis, enfermedad del sueño y enfermedad de Chagas. El parásito puede ser un organismo helminto o gusano u organismos que provocan enfermedades que incluyen, pero sin limitación, 35 Ancilostomiasis/Ancilostoma, Anisaquiosis, Ascáride – neumonía parasitaria, Ascáride - Bailisascariasis, Cestodo – infección por cestodo, Clonorquiasis, infección por Dioctophyme renale, Difilobotriasis – cestodo, gusano de Guinea -Dracunculiasis, Equinococosis -cestodo, gusano alfiler - Enterobiasis, duela del hígado - Fasciolosis, Fasciolopsiasis
– dístoma intestinal, Gnatostomiasis, Himenolepiasis, filariasis por Loa loa, tumores de Calabar, Mansoneliasis, Filariasis, Metagonimiasis – duela intestinal, oncocercosis, duela del hígado china, Paragonimiasis, duela pulmonar, esquistosomiasis -bilharzia, bilharziosis o esquistosomiasis (todos los tipos), esquistosomiasis intestinal, esquistosomiasis urinaria, esquistosomiasis por Schistosoma japonicum, esquistosomiasis intestinal asiática, Esparganosis, Estrongiloidiasis – neumonía parasitaria, cestodo de la ternera, cestodo del cerdo, Toxocariasis, Triquinosis, dermatitis por esquistosomiasis, tricocéfalo y elefantiasis filariasis linfática. El parásito puede ser un organismo u organismos que provocan enfermedades que incluyen, pero sin limitación, gusano parasitario,
45 Síndrome de Halzoun, Miasis, Nigua, Dermatobia hominis y Candirú. El parásito puede ser un ectoparásito u organismos que provocan enfermedades que incluyen, pero sin limitación, Chinche, Piojo -Pediculosis, piojo del cuerpo - Pediculosis, ladilla - Pediculosis, Demodex - Demodicosis, Sarna, mosca carnicera y Cochliomyia.
Vehículos farmacéuticamente aceptables: los vehículos farmacéuticamente aceptables útiles con la presente divulgación son convencionales. Martin, Remington’s Pharmaceutical Sciences, publicado por Mack Publishing Co., Easton, PA, 19ª Edición, 1995, describe composiciones y formulaciones adecuadas para suministro farmacéutico de los nucleótidos y proteínas desveladas en el presente documento.
En general, la naturaleza del vehículo dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo,
55 las formulaciones parenterales habitualmente comprenden líquidos inyectables que incluyen líquidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, formas de polvo, píldora, comprimido o cápsula), los vehículos sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o extracto de magnesio. Además de vehículos biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas para administrar pueden contener cantidades menores de sustancias adyuvantes no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponantes del pH y similares, por ejemplo, acetato sódico o monolaurato de sorbitano.
Unidades formadoras de placas (UFP): una medida de la dosis o el título del virus, determinada por su capacidad 65 para formar placas en una línea celular permisiva.
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Cercopitecino 8. En ejemplos particulares, el CMVRh comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntica a SEQ ID NO: 1. El vector de CMVRh también puede ser BAC que codifica genoma de CMVRh. En algunas realizaciones, el vector de CMVRh incluye una supresión de uno o más genes que codifican una proteína
5 inmunomoduladora. En algunos ejemplos, la supresión comprende una supresión de Rh182-189 o Rh158-166, o ambos.
En algunas realizaciones, el CMVH comprende la cepa de laboratorio AD169, la cepa de tipo silvestre Merlin, el aislado de CMVH Towne BAC, aislado de CMVH Toledo-BAC, aislado de CMVH TR-BAC, aislado de CMVH FIX-BAC, aislado de CMVH AD169-BAC o cepa de CMVH Davis. En ejemplos particulares, el vector de CMVH comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9. En ciertas realizaciones, puede usarse una variante de un vector de CMVH o CMVRh, por ejemplo, una variante que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO 2-9, pero que conserva la capacidad para
15 actuar como un vector.
Están públicamente disponibles y/o se han descrito previamente vectores de CMVRh y CMVH recombinantes. Por ejemplo, están disponibles varios vectores de CMV de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA), incluyendo CMVH AD169 (ATCC VR-538), CMVH Towne (ATCC VR-977) y CMVH Davis (ATCC VR-807). También se ha descrito la cepa de CMVH Toledo (véase Quinnan et al., Ann Intern Med 101: 478-83, 1984). También se describen CMVH y CMVRh recombinantes, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º 2009/029755 y Publicación de PCT N.º WO 2006/031264.
En algunas realizaciones, el vector de CMVRh o CMVH recombinante comprende una supresión en un gen de
25 CMVRh o CMVH que es esencial para o aumenta la replicación. Se han descrito bien en la técnica genes esenciales y de aumento de CMV (véase, por ejemplo, Dunn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(24): 14223-14228, 2003; y Dong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(21): 12396-12401, 2003). Los genes de CMV esenciales incluyen, pero sin limitación, UL32, UL34, UL37, UL44, UL46, UL48, UL48.5, UL49, UL50, UL51, UL52, UL53, UL54, UL55, UL56, UL57, UL60, UL61, UL70, UL71, UL73, UL75, UL76, UL77, UL79, UL80, UL82, UL84, UL85, UL86, UL87, UL89, UL90, UL91, UL92, UL93, UL94, UL95, UL96, UL98, UL99, UL100, UL102, UL104, UL105, UL115 y UL122. En algunas realizaciones, el gen esencial o de aumento de CMV es UL82, UL94, UL32, UL99, UL115 o UL44, o un homólogo de los mismos (es decir, el gen homólogo en CMVRh). Se conocen en la técnica y se describen en el presente documento otros genes esenciales o de aumento. En ejemplos particulares, el gen esencial es UL82, o un homólogo del mismo. En algunas realizaciones, los vectores de CMVRh o CMVH recombinantes no incluyen un
35 antígeno heterólogo. En otras realizaciones, el vector de CMVRh o CMVH recombinante que tiene una supresión en un gen esencial o de aumento incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo, tal como un antígeno específico de patógeno o un antígeno tumoral. También se proporcionan composiciones que comprenden vectores de CMVRh o CMVH recombinantes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichos vectores y composiciones pueden usarse, por ejemplo, en un método de tratamiento de un sujeto con una enfermedad infecciosa, o en riesgo de infectarse con una enfermedad infecciosa, o con cáncer, o en riesgo de desarrollar cáncer. Los vectores de CMV que tienen una supresión de al menos un gen esencial o de aumento están en general atenuados y por lo tanto pueden usarse como vacunas para el tratamiento o la prevención de CMV (en cuyo caso, el vector recombinante no codifica un antígeno heterólogo).
45 En algunas realizaciones, los vectores de CMVRh o CMVH recombinantes comprenden un medio de suicidio o seguridad para evitar la replicación adicional del virus. Por ejemplo, los vectores de CMV recombinantes pueden incluir sitios LoxP que flanquean un gen o una región esencial del genoma de CMVRh o CMVH (se han enumerado anteriormente y se conocen en la técnica genes de CMV esenciales), así como la secuencia codificante de Crerecombinasa. Cre-recombinasa está generalmente bajo el control de un promotor inducible para regular la expresión de Cre, controlando de este modo la retirada del gen esencial y la inhibición de la replicación vírica. En ejemplos particulares, Cre es una Cre regulada por Tet y la expresión de Cre está controlada por la presencia de Dox.
También se proporcionan composiciones que comprenden un vector de CMVRh o CMVH recombinante desvelado en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
55 Se proporciona además un método para tratar a un sujeto con una enfermedad infecciosa, o en riesgo de infectarse con una enfermedad infecciosa, o con cáncer, o en riesgo de desarrollar cáncer, seleccionando un sujeto que necesite tratamiento y administrando al sujeto un vector de CMVRh o CMVH recombinante, o composición del mismo, desvelado en el presente documento. En algunas realizaciones, la selección de un sujeto que necesite tratamiento incluye seleccionar un sujeto al que se ha diagnosticado una enfermedad infecciosa, tal como una enfermedad vírica, una enfermedad bacteriana, una enfermedad fúngica o una enfermedad protozoaria. En otras realizaciones, la selección de un sujeto que necesite tratamiento incluye seleccionar un sujeto que se ha expuesto o probablemente se exponga a un agente infeccioso. En otras realizaciones, la selección de un sujeto que necesite tratamiento incluye seleccionar un sujeto al que se ha diagnosticado cáncer. En otras realizaciones, la selección de
65 un sujeto que necesite tratamiento incluye seleccionar un sujeto que está en riesgo de desarrollar cáncer, tal como un sujeto que se ha expuesto a un carcinógeno, un sujeto que tiene cáncer asociado con mutaciones genéticas o un
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En segundo lugar, el CMV tiene la capacidad de reinfectar hospedadores inmunitarios y generar nuevas respuestas inmunitarias con dichas reinfecciones. Para confirmar este fenómeno directamente con CMVRh, se construyó un vector de CMVRh particular que codifica gag de VIS (FIG. 7). Este vector mostró expresión de gag inequívoca tanto por inmunotransferencia como por transferencia de Western (FIG. 8), y demostró cinética de crecimiento in vitro 5 indistinguible de la del virus de tipo silvestre. Cuando se administraron por vía subcutánea (5 x 106 UFP) a 4 MR CMVRh seropositivos (224 días después de la infección primaria), se observó un refuerzo similar (clínicamente asintomático) de la respuesta de linfocitos T y anticuerpos específicos de CMVRh como se describe en la FIG. 6. Como se ha observado previamente en la reinfección (FIG. 6), la PCR en tiempo real no identificó CMVRh, de tipo silvestre o gag recombinante, en células mononucleares de sangre o lavado pulmonar en ningún punto temporal después de la inoculación vírica. Sin embargo, la orina del día 127 después de la reinfección fue débilmente positiva para expresión de gag por ELISA, lo que sugiere la presencia de vector de CMVRh-gag. Estas muestras se cocultivaron para aislar CMVRh, y estas preparaciones víricas obtenidas in vivo se evaluaron con respecto a expresión de gag por transferencia de Western. Como se muestra en la FIG. 8, los cocultivos de CMVRh de los 4 animales expresaron gag inmunorreactivo, estableciendo de forma definitiva la presencia del virus recombinante 15 administrado en sitios secretores. El análisis retrospectivo de orina en puntos temporales después de la reinfección más tempranos reveló la presencia de vector de CMVRh que expresa gag el día 7 en un MR y el día 21 en los otros
3. Además, el vector de CMVRh que expresa gag también se ha detectado en saliva, y permanece presente en orina al menos hasta el día 237 después de la reinfección.
Estos datos tienen dos implicaciones críticas. En primer lugar, demuestran inequívocamente que CMV es capaz de reinfectar sujetos inmunitarios, compitiendo eficazmente con virus de tipo silvestre preexistente, y dirigiéndose de algún modo a su nicho “ecológico” habitual a pesar de inmunidad celular y humoral fuertemente reforzada dirigida al CMV. En segundo lugar, demuestran la estabilidad in vivo de vectores de CMVRh que expresan neoAg exógenos, lo que indica que estos vectores son capaces de infectar de forma persistente sujetos inoculados y mantener de forma
25 indefinida la expresión de los genes codificantes de antígenos exógenos, insertados.
Esta cohorte reinfectada con CMVRh-gag también se usó para evaluar la capacidad de vectores de CMVRh para iniciar una respuesta inmunitaria de novo frente al refuerzo de memoria específico de CMV masivo asociado con la reinfección.
Como se muestra en las FIGs. 9 y 10, todos los MR inoculados desarrollaron respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ específicas de gag en la sangre, tan pronto como el día 7 después de la reinfección. Estas respuestas sanguíneas alcanzaron un máximo el primer mes después de la reinfección a 0,2 %-0,6 % de células de memoria, reduciéndose posteriormente hasta un nivel estable en el intervalo de 0,1 %-0,2 %. También se indujeron
35 anticuerpos específicos de gag de VIS el día 14 después de la infección, aumentando hasta el día 91 después de la infección, antes de conseguir un nivel estable (FIG. 12). La readministración del mismo vector de CMVRh-gag (el día 238 después de la reinfección) reforzó drásticamente ambos examinados, estas respuestas permanecieron mayores que los “puntos establecidos” previos, lo que sugiere el establecimiento de mayores niveles estables. Significativamente, como se ha mostrado previamente para respuestas de linfocitos T específicos de CMVRh, las frecuencias sanguíneas de estas respuestas de linfocitos T específicas de gag con vector de CMV sustancialmente infraestimaron (>10X) la frecuencia de linfocitos T específicos de VIS en un sitio efector tisular, el pulmón (FIGs. 10 y 11). Se descubrieron linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos de gag en líquido de lavado pulmonar el día 7 después de la reinfección por CMVRh (gag) inicial en todos los MR, alcanzando un máximo con frecuencias de hasta 10 % (día 42-56 después de la reinfección) antes de conseguir niveles estables en el intervalo de 1 %-3 %. El refuerzo (la
45 segunda reinfección) dio como resultado un fuerte aumento en estas frecuencias con vuelta al nivel estable previo en 2 MR, y lo que parece ser (el día 70 después de la reinfección n.º 2) niveles estables ligeramente mayores en los otros 2 animales. Significativamente, la frecuencia y distribución de linfocitos T específicos de gag en estos MR inmunizados con CMVRh (gag) son comparables a lo que se ha observado en MR “inmunizados” con VISmac239(Δnef) atenuado que controló eficazmente la exposición I.V. con VISmac239 de tipo silvestre (FIG. 13). Debería observarse también que en todos los MR estudiados, las respuestas específicas de gag observadas se produjeron en el escenario de refuerzo significativo de respuestas específicas de CMVRh (FIG. 9); de hecho, es posible que estas respuestas específicas de CMV de recuerdo actuaran como un adyuvante para la nueva respuesta específica de gag. Significativamente, estos datos demuestran la capacidad de CMVRh para actuar eficazmente como un vector para neoAg en MR inmunes a CMVRh.
55 De acuerdo con aspectos particulares de la presente divulgación, la capacidad única de CMV para actuar eficazmente como vector de respuestas de neoAg en sujetos inmunes a CMV tiene varias implicaciones altamente significativas para su utilidad en una vacuna. En primer lugar, en virtud del hecho de que cualquier sujeto CMV+ sano ha demostrado operativamente su capacidad para controlar la infección por CMV de tipo silvestre, se esperaría que su riesgo de morbilidad después de la administración de vectores de CMV, incluso vectores basados en un genoma de CMV por lo demás no modificado, fuera mínimo. Aunque los fetos de madres CMV+ pueden infectarse en algunas circunstancias, este riesgo puede evitarse simplemente no proporcionando vacunas basadas en CMV a mujeres embarazadas. Se esperaría que la incorporación de mecanismos de seguridad (por ejemplo, suicidio inducible) y/o supresión génica estratégica (para reducir el potencial patógeno sin sacrificar la inmunogenia y
65 persistencia) redujera la posibilidad de morbilidad por la vacuna aún más. También debería observarse que otros herpesvirus bien estudiados que podrían usarse potencialmente como vectores persistentes y quizás con capacidad
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También se desvelan en el presente documento vectores de CMV recombinantes, tales como vectores de CMVRh y CMVH, que tienen una supresión en uno o más genes que son esenciales para o aumentan la replicación, diseminación o propagación de CMV. Por lo tanto, estos vectores se denominan vectores de CMV “deficientes en replicación”. Como se usa en el presente documento, “deficientes en replicación” abarca vectores de CMV que son
5 incapaces de experimentar ninguna replicación en una célula hospedadora, o tienen una capacidad significativamente reducida capaz de experimentar replicación vírica. En algunos ejemplos, los vectores de CMV deficientes en replicación son capaces de replicar, pero son incapaces de diseminar ya que son incapaces de infectar células adyacentes. En algunos ejemplos, los vectores de CMV deficientes en replicación son capaces de replicar, pero son incapaces de propagarse ya que no se secretan de hospedadores infectados.
Se conocen bien en la técnica genes esenciales y de aumento de CMV (véase, por ejemplo, Dunn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(24): 14223-14228, 2003; y Dong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(21): 1 2396-12401, 2003), y se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, el vector de CMVRh o CMVH recombinante incluye una supresión en un gen que es esencial para o aumenta la replicación, diseminación o
15 propagación del virus. En otras realizaciones, el vector de CMVRh o CMVH recombinante incluye una supresión en múltiples (tales como, pero sin limitación, dos, tres o cuatro) genes esenciales para o que aumentan la replicación, diseminación o propagación de CMV. No es necesario que la supresión sea una supresión de la fase abierta de lectura completa del gen, sino que incluye cualquier supresión que elimine la expresión de la proteína funcional.
En algunas realizaciones, el vector de CMVRh o CMVH recombinante incluye una supresión en uno o más genes seleccionados de UL82 (que codifica pp71) (véase FIGs. 36-38), UL94 (que codifica la proteína UL94), UL32 (que codifica pp150), UL99 (que codifica pp28), UL115 (que codifica gL) y UL44 (que codifica p52), o un homólogo de los mismos (es decir, el homólogo de CMVRh de estos genes de CMVH).
25 Los vectores de CMVRh o CMVH deficientes en replicación desvelados en el presente documento pueden incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo, tal como un antígeno específico de patógeno
o un antígeno tumoral. Como se desvela para otros vectores de CMVRh o CMVH recombinantes descritos en el presente documento, pueden usarse vectores de CMVRh o CMVH deficientes en replicación para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto contra el antígeno heterólogo codificado.
Un vector de CMVRh recombinante que tiene una supresión en el gen UL82 (que codifica la proteína pp71) está gravemente alterado en su capacidad para crecer in vitro y propagarse in vivo, pero aún induce una respuesta inmunitaria de linfocitos T robusta contra CMV. Por lo tanto, se contempla en el presente documento usar dicho vector deficiente en replicación como una vacuna contra CMV en sí mismo (véase FIGs. 36-38).
35 En realizaciones ventajosas de la presente invención, un vector de CMV recombinante, tal como un vector de CMVRh o un vector de CMVH puede tener supresiones en regiones génicas no esenciales para el crecimiento in vivo. Dichas regiones génicas incluyen, pero sin limitación, la familia RL11, la familia pp65, la familia US 12 y la familia US28. En particular, las regiones génicas de CMVRh que pueden suprimirse incluyen regiones génicas Rh13-Rh29, Rh111-RH112, Rh191-Rh202 y Rh214-Rh220. Más particularmente, las regiones génicas de CMVRh que pueden suprimirse incluyen Rh13.1, Rh19, Rh20, Rh23, Rh24, Rh112, Rh190, Rh192, Rh196, Rh198, Rh199, Rh200, Rh201, Rh202 y Rh220. En otra realización, las regiones génicas de CMVH que pueden suprimirse incluyen las regiones génicas RL11 (L), UL6, UL7 (L), UL9 (L), UL11 (E), UL83 (L) (pp65), US12 (E), US13 (E), US14 (E), US17 (E), US18 (E), US19 (E), US20 (E), US21 y UL28.
45 Pueden administrarse vectores de CMV recombinantes, o composiciones de los mismos, a un sujeto por cualquiera de las vías normalmente usadas para introducir virus recombinante o vectores víricos en un sujeto. Los métodos de administración incluyen, pero sin limitación, intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, parenteral, intravenoso, subcutáneo, vaginal, rectal, intranasal, inhalación u oral. La administración parenteral, tal como administración subcutánea, intravenosa o intramuscular, se realiza en general por inyección. Pueden prepararse inyectables en formas convencionales, bien como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Las soluciones y suspensiones de inyección pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo previamente descrito. La administración puede ser sistémica o local.
55 Se administran composiciones que incluyen vectores de CMV recombinantes de cualquier manera adecuada, tal como con vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administre, así como por el método particular usado para administrar la composición. En consecuencia, hay una amplia diversidad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente divulgación.
Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas y no acuosas estériles. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como etil oleato. Los vehículos acuosos incluyen agua, 65 soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medio tamponado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer con
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expresaba gag en saliva, y permaneció presente en orina al menos hasta el día 237 después de la reinfección. De forma significativa, la reinfección de este clon de CMVRh/VISmac239gag indujo una respuesta de linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos de gag, orientada a la mucosa, así como una respuesta de anticuerpos específicos de gag (véase FIGs. 10, 11 y 12). Estos datos demuestran inequívocamente que CMV es capaz de reinfectar sujetos
5 inmunitarios, compitiendo eficazmente con virus WT preexistentes, y estableciendo infección en sitios normales dentro del hospedador, a pesar de una inmunidad celular y humoral fuertemente reforzada dirigida a CMV. También demuestran la alta estabilidad in vivo de vectores de CMVRh que expresan antígenos heterólogos exógenos, lo que sugiere que estos vectores pueden ser capaces de infectar de forma persistente sujetos inoculados y mantener indefinidamente la expresión de los genes codificantes de antígeno exógeno, insertados. Finalmente, demuestran que CMVRh recombinante puede inducir respuestas tanto de linfocitos T como de Ab a proteínas exógenas en el escenario de reinfección, y por lo tanto tiene el potencial de actuar como un vector de vacuna eficaz en individuos con inmunidad a CMV pre-existente.
Ejemplos 3: Vectores de CMV que codifican VP1 de poliovirus, tétanos C, hemaglutinina de gripe H5N1 y15 nucleoproteína (NP) del virus del Ébola.
Este ejemplo describe la expresión in vitro de antígenos heterólogos codificados por un vector de CMV murino (CMVM) recombinante e inducción de linfocitos CD8+ específicos de antígeno en animales vacunados. Los CMV muestran especificidad de especie estricta con la mayoría de especies de mamífero que tienen su propio CMV único. Sin embargo, todos los CMV comparten características comunes de crecimiento, citopatología, tropismo tisular y una capacidad para establecer infección persistente y latente. La similitud en la biología de CMV ha permitido el uso de infección por CMV de animales no humanos, tal como infección por CMV murina de ratones e infección por CMV de rhesus de macacos rhesus, como modelos in vivo de enfermedad humana. Por lo tanto, el modelo de ratón de CMVM se usa habitualmente como un modelo in vivo para CMVH. En consecuencia, este
25 ejemplo proporciona prueba de concepto para uso de vectores de CMV recombinantes (tales como vectores de CMVRh y CMVH) para la expresión de antígenos heterólogos y uso de los vectores para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto.
Se ha descrito el plásmido de BAC de CMVM usado en los siguientes experimentos para generar vectores de CMVM recombinantes que codifican un antígeno heterólogo (Wagner et al., J. Virol. 73: 7056-7060, 1999).
Se amplificó por PCR ADN que codificaba VP1 de poliovirus a partir de ácido nucleico de poliovirus y se clonó en el plásmido de BAC de CMVM para generar pCMVM-VP1. La proteína VP1 también se marcó con un epítopo pequeño en el extremo carboxilo terminal para facilitar la detección. El pCMVM-VP1 se transfectó en fibroblastos embrionarios
35 murinos (MEF) para reconstituir virus CMVM-VP1. Se infectaron MEF con virus CMVM-VP1. Después de aproximadamente 3 días, las células se recogieron y se separó proteína aislada en un gel de poliacrilamida. Se realizó transferencia de Western usando un anticuerpo contra el marcador epitópico. Basándose en la reactividad del marcador epitópico y el peso molecular predicho, los resultados demostraron que VP1 de polivirus se expresaba eficazmente en MEF infectados con CMVM-VP1. Se describen adicionalmente aspectos de esta realización de la invención en el Ejemplo 6.
La HA de gripe aviar (cepa Viet04) H5N1 se clonó en el plásmido de BAC de CMVM para generar pCMVM-HA. La proteína HA se marcó con epítopo para facilitar el análisis de la expresión. El virus CMVM-HA se reconstituyó como se ha descrito anteriormente. Se usó virus CMVM-HA para infectar MEF. Después de aproximadamente 3 días, las
45 células se recogieron y se separó la proteína aislada en un gel de poliacrilamida. Se realizó transferencia de Western usando un anticuerpo contra el marcador epitópico. Basándose en la reactividad del marcador epitópico y el peso molecular predicho, los resultados demostraron que HA se expresaba eficazmente en MEF infectados con CMVM-HA.
Se fusionó un epítopo de linfocitos T de NP de virus del Ébola con el gen no esencial IE2 de CMVM para generar la construcción pCMVM-EBOV-NPCTL. El virus CMVM-EBOV-NPCTL se reconstituyó en MEF. Se inmunizaron diez ratones i.p. con CMVM-EBOV-NPCTL el día 1 y se reforzaron en la semana 4. Se recogieron esplenocitos en la semana 8 para evaluar el número de linfocitos T CD8+ específicos de NP usando tinción con citocina intracelular (TCI). Brevemente, se incubaron esplenocitos en presencia de antígeno diana (NP) y brefeldina A durante 6 horas.
55 El porcentaje de linfocitos T CD8+ específicos de NP se determinó mediante citometría de flujo basándose en la expresión de citocinas efectoras. Para ratones individuales, el porcentaje de linfocitos T CD8+ totales específicos para NP varió de aproximadamente 1-10 %, lo que demuestra que la inmunización con CMVM-EBOV-NPCTL era extremadamente eficaz para inducir una respuesta inmunitaria de linfocitos T específica de NP. Esta realización de la invención se describe adicionalmente en el Ejemplo 7.
Sumario: estos resultados demuestran que los vectores de CMV recombinantes que codifican un antígeno heterólogo (bien la proteína de longitud completa entera o un epítopo individual) son capaces de expresar eficazmente el antígeno heterólogo en células infectadas, e inducir una respuesta inmunitaria de linfocitos T fuerte al antígeno heterólogo.
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de vectores con múltiples tropismos modificados basándose en vectores de un único tropismo que muestran tropismo modificado in vitro o in vivo deseado. Después de determinar vectores con un único tropismo modificado inmunogénicos MR adultos y que muestran el tropismo tisular in vivo deseado en el modelo fetal, se analizarán in vivo vectores de tropismo múltiple construidos en estos fondos genéticos, que muestran el tropismo in vitro
5 multitisular deseado, de una manera comparable a los vectores de un único tropismo. Este grupo de vectores de tropismo múltiple comprende cuatro construcciones que son deficientes para replicación en los siguientes tejidos múltiples: células epiteliales y mieloides [CMVRhΔEpiCMAXΔH/VIS(gag) y (retanef)], células epiteliales y SNC [CMVRhΔEpiCMAXΔC/VIS(gag) y (retanef)], células epiteliales y SNC [CMVRhΔHΔC/VIS(gag) y (retanef)], y los tres tejidos diana [CMVRhΔEpiCMAXΔHΔC/VIS(gag) y (retanef)] (Tabla 3).
Aspectos de la invención se refieren a la evaluación de la inmunogenia del vector de CMVRh/VIS. El análisis inmunológico inicial se realiza en grupos de 3 MR/vector (FIG. 26). Cada grupo recibe versiones tanto gag como retanef de cada vector como una mezcla en un único inóculo. La vacunación de MR sero+ con vectores de CMVRh/VIS de tipo silvestre da como resultado la inducción de una respuesta de linfocitos T detectable contra el
15 transgén de VIS en el 100 % de los animales a las 3 semanas después de la infección como se ha descrito previamente. Se considerará que cualquier par de vectores (que codifican individualmente gag y retanef) que no consiga inducir una respuesta de linfocitos T detectable contra VISgag o retanef en el momento de refuerzo en la semana 15 habrá “fracasado” en la inmunogenia y no es necesario que se caracterice adicionalmente. Para vectores inmunogénicos, los 3 MR se refuerzan en la semana 15 con el vector de expresión de gag solamente, permitiendo de este modo la caracterización de respuestas tanto “reforzadas” (gag) como no reforzadas (retanef). Al mismo tiempo, se reclutan 3 MR más en la cohorte y se trata de una manera idéntica a los 3 primeros animales, para aportar suficiente potencia estadística para la caracterización inmunológica completa. Todos los MR se siguen inmunológicamente y virológicamente durante un total de 45 semanas después de la vacunación inicial (véase FIG. 2 y posteriores).
25 Se realizan autopsias de todos los MR en la semana 48 para cuantificación sistémica de respuestas de linfocitos T específicas de VIS. Están disponibles un total de 24 MR para ensayo de inmunogenia de vectores de tropismo modificado (además de una cohorte de control de 6 MR a los que se proporcionó CMVRh wt/gag x 2 y CMVRh/retanef x 1). Este número de MR se traduce en varios escenarios de ensayo in vivo diferentes potenciales dependiendo del número final de vectores de tropismo modificado que “pasan revisión” y necesitan evaluación completa. Por ejemplo, 5 vectores pueden ensayarse inicialmente en 3 MR cada uno, de los que 3 se seleccionan para ensayo inmunológico completo en 3 MR adicionales (para proporcionar un complemento completo de 6 MR para cada uno de los 3 vectores). Como alternativa, 6 vectores pueden ensayarse inicialmente en 3 MR cada uno, de los que 2 de 6 (los más prometedores con respecto a inmunogenia y/o atenuación) se seleccionan después para
35 ensayo inmunológico completo en 3 MR adicionales (para realizar un complemento completo de 6 MR para cada uno de los 2 vectores).
Se cuantifican respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ a las proteínas de VIS (gag y rev/nef/tat), proteínas de control negativo (proteína TB Ag85B) y CMVRh IE (control +) por citometría de flujo de citocinas (CFC) usando mezclas de péptidos de 15 unidades consecutivos, solapantes, que comprenden estas proteínas como se ha descrito previamente en Hansen, S.G., Vieville, C., Whizin, N., Coyne-Johnson, L., Siess, D.C., Drummond, D.D., Legasse, A.W., Axthelm, M.K., Oswald, K., Trubey, C.M., et al. 2009. Effector memory T cell responses are associated with protection of rhesus monkeys from mucosal simian immunodeficiency virus challenge. Nat Med 15: 293-299.
45 Este ensayo se aplica a PBMC, ganglio linfático (LN) y linfocitos de lavado broncoalveolar [BAL, un sitio efector fácilmente accesible, donde están altamente enriquecidas respuestas inducidas por vector de CMVRh] según el protocolo de animal (FIG. 26) y en la necropsia a preparaciones celulares obtenidas de al menos 6 grupos de LN periféricos diferentes, 3 grupos de LN mesentéricos, BAL, médula ósea, bazo, hígado, mucosa del yeyuno/íleon/colon, mucosa genital y amígdalas/adenoides. La evaluación rutinaria usa combinación de tinción n.º 1 (Tabla 4) en la que las células sensibles se delinean por regulación positiva de CD69 y expresión intracelular de TNF, IFN-γ e IL-2 (solos o en cualquier combinación) y simultáneamente se clasifican en su estado de diferenciación por la expresión de CD28 frente a CCR7 (Picker, L.J., Reed-Inderbitzin, E.F., Hagen, S.I., Edgar, J.B., Hansen, S.G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Jr., Lifson, J.D., Maino, V.C., et al. 2006. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest 116: 1514-1524.). La combinación de
55 tinción n.º 2 se diseña para detectar cambios en el estado de activación y proliferativo de linfocitos T específicos de Ag (definidos por inducción de CD69, TNF e IFN-γ) y se usa para seguir con precisión la respuesta de poblaciones de linfocitos T específicos de VIS establecidas a exposición de Ag in vivo después del refuerzo. La combinación de tinción n.º 3 analiza MIP-1β y desgranulación citotóxica (externalización de CD107) en el contexto de subconjuntos de memoria, y se usa de forma selectiva para extender el análisis funcional de la respuesta en PBMC al menos una vez para cada respuesta antes de la necropsia.
Realizaciones de la invención se refieren al desarrollo de ensayos CFC y además se refieren a la respuesta de linfocitos T específicos de gag y rev/nef/tat que pueden analizarse de forma transcripcional en PBCM y en necropsia en tejidos seleccionados mediante análisis de micromatrices estimuladas por Ag. En este enfoque, se comparan 65 cambios transcripcionales asociados con Ag específico frente a estimulación de control a las 3 y 12 después de la estimulación para proporcionar una evaluación detallada de los programas funcionales de linfocitos T sensibles a Ag.
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expresa un antígeno diana protector del poliovirus de tipo 1 para inducir inmunidad protectora contra poliovirus en ratones. Se construye un CMVM recombinante que expresa de forma estable proteína vírica 1 (VP1) de longitud completa del poliovirus de tipo 1 (CMVM/VP1PV1) (Figura 27). Después de la caracterización inmunológica de CMVM/VP1PV1, se determinará la eficacia protectora de CMVM/VP1PV1 contra poliovirus de tipo 1 en el modelo de
5 exposición de ratón transgénico (Tg) del receptor de poliovirus de ratón (PVR). Una vacuna de la polio basada en CMVM se usa solamente como "prueba de concepto" para el desarrollo de una vacuna de poliovirus basada en CMV humana para su uso en seres humanos.
La Figura 27 muestra que VP1 en CMVM/VP1PV1 está marcado con epítopo (V5) para facilitar su detección. CMVM/VP1PV1 se pasó en serie múltiples veces en fibroblastos de embrión murino (MEF). Las células se recogen en el momento de máximo efecto citopático (CPE) para análisis de la expresión de VP1 basándose en la reactividad anti-V5. Se indican números de pase en serie encima de la imagen del gel.
Otras realizaciones de la invención se refieren a la evaluación de la capacidad de una versión defectuosa en
15 diseminación de CMVM/VP1PV1 para inducir inmunidad protectora contra poliovirus de tipo 1 en el modelo de Tg de PVR. Una versión defectuosa en diseminación de CMVM/VP1PV1 (por ejemplo, CMVMΔgL/VP1PV1) se reparará por supresión de un gen de CMVM esencial (glucoproteína L, gL) por recombinación de cromosoma artificial bacteriano (BAC) convencional. Se ha mostrado que esta estrategia, seguida de complementación en una línea celular que expresa gL, es una técnica sencilla para preparar virus de CMV defectuosos en diseminación (Snyder, C. M., J. E. Allan, E. L. Bonnett, C. M. Doom, y A. B. Hill. 2010. Cross-presentation of a spread-defective CMVM is sufficient to prime the majority of virus-specific CD8+ T cells. PLoS One 5:e9681.) (Bowman, J. J., J. C. Lacayo, P. Burbelo, E. R. Fischer, y J. I. Cohen. 2011. Rhesus and human cytomegalovirus glycoprotein L are required for infection and cell-to-cell spread of virus but cannot complement each other. J Virol 85:2089-99). La inmunogenia y eficacia protectora de CMVMΔgL/VP1PV1 contra exposición a poliovirus de tipo 1 se determinan como se ha
25 descrito anteriormente.
Los vectores de CMV pueden expresar una diversidad de antígenos diana diferentes lo que sugiere que los vectores de CMV/VP1PV1 inducirán respuestas de linfocitos T CD4 y CD8 específicos de VP1 de alta duración y sustanciales. La capacidad de VPO, pero no VPI, para prevenir el establecimiento de infección por poliovirus en el intestino subraya la importancia de la inmunidad celular para el control de poliovirus. Los vectores de CMV/VP1PV1 pueden inducir niveles duraderos de anticuerpos específicos de VP1 y estos vectores se ensayan adicionalmente para determinar si estos anticuerpos son neutralizantes. Los péptidos tanto proteicos como sintéticos de VP1 son capaces de inducir niveles biológicamente significativos de anticuerpos neutralizantes (aunque a niveles menores que los inducidos por virus intacto). La respuesta de anticuerpos inducida por vectores de CMV/VP1PV1 puede ser
35 neutralizante, pero quizás hasta un nivel menor que el observado con vacunación por VPO o VPI. Ya que se espera que los vectores de CMV/VP1PV1 induzcan altos niveles de linfocitos T (sistémicos así como en la mucosa) y un nivel biológicamente significativo de anticuerpos neutralizantes específicos de VP1, tanto CMV/VP1PV1 como CMVΔgL/VP1PV1 pueden proteger contra exposición a poliovirus de tipo 1.
Las realizaciones de la invención se refieren al establecimiento de que un vector basado en CMV defectuoso en diseminación, seguro, puede inducir inmunidad protectora contra poliovirus de tipo 1, determinar si el vector basado en CMV replicante (CMVM/VP1PV1) es inmunogénico y eficaz contra exposición a poliovirus de tipo 1 y usar CMVMΔgL/VP1PV1 para establecer que no se requiere diseminación para inmunogenia o eficacia de una vacuna de la polio basada en CMV. Realizaciones adicionales se refieren a demostrar que un vector basado en CMV 45 defectuoso en diseminación induce inmunidad protectora contra poliovirus de tipo 1, estableciendo de este modo que no se requiere diseminación de CMV para eficacia de la vacuna. Este hallazgo facilita el desarrollo de una vacuna de la polio basada en CMV segura para su uso en todas las poblaciones diana humanas potenciales en todo el mundo. Los modelos de poliovirus de primates no humanos fueron cruciales durante el desarrollo de VPO y VPI, y serán críticos para mover la vacuna de la polio basada en CMV hacia ensayos humanos. Las realizaciones adicionales también se refieren a determinar la inmunogenia y eficacia protectora de CMVRhΔgL/VP1PV1 defectuoso en diseminación en MR y determinar si vectores de CMVRhΔgL/VP1 monovalentes que expresan cada uno un gen de VP1 de uno de los tres serotipos de poliovirus, o un único CMVRhΔgL/VP1 multivalente que expresa los 3 serotipos pueden inducir juntos protección contra los 3 serotipos de poliovirus. La construcción de una versión de CMVRhΔgL/VP1 humana de vacuna trivalente más eficaz para ensayos en Fase I humanos también está
55 abarcada en la presente invención.
Ejemplos 7: Una vacuna basada en Citomegalovirus que Codifica un único Virus del Ébola. El Epítopo deNucleoproteína de CTL Confiere Protección contra el Virus del Ébola. Este ejemplo demuestra la capacidad de un enfoque de vacuna basada en CMV para proteger contra un patógeno humano altamente virulento.
Sumario: En el presente ejemplo los Solicitantes han construido un vector de EBOV basado en CMVM que expresa un único epítopo de CTL de NP de ebolavirus Zaire ZEBOV (CMVM/ZEBOV-NPctl). Se ha mostrado que CMVM/ZEBOV-NPCTL es altamente inmunogénico, induciendo respuestas de CTL CD8+ multifuncionales, duraderas, contra NP de ZEBOV en múltiples cepas de ratones. Es importante que CMVM/ZEBOV-NPCTL confiere protección 65 contra exposición a ZEBOV letal hasta un nivel comparable a una vacuna de EBOV “de referencia” convencional. La ausencia de anticuerpos neutralizantes en animales protegidos identificó que la protección estaba mediada por
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respuesta inmunitaria celular a CMVRh se supervisó en lavados broncoalveolares (BAL) y en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a intervalos semanales usando tinción con citocinas intracelular como se ha descrito (Hansen et al., Science 328(5974): 102-106, 2010; Hansen et al., Nat Med 15: 293-299, 2009). Sorprendentemente, ambos animales desarrollaron una respuesta inmunitaria significativa a CMV en un periodo de dos semanas de
5 infección que es comparable con animales de control históricos infectados con CMVRh-WT (FIG. 20).
La FIG. 37 (panel superior) muestra además que la respuesta de linfocitos T permaneció estable durante 245 días. Se inocularon dos macacos rhesus (MR) seronegativos s.c. con 107 unidades formadoras de placas (UFP) de CMVRh ΔRh110 el día 0. La respuesta de linfocitos T CD8+ y CD4+ específica de CMV contra lisado de CMVRh se mide por ICCS en PBMC y BAL en los intervalos indicados. La respuesta inmunitaria es comparable a la de animales infectados con CMVRH WT (líneas negras). Estos resultados indican que a pesar de su atenuación grave, el virus con supresión de pp71 fue capaz de generar una respuesta inmunitaria de tipo WT de larga duración.
La FIG. 37 (paneles inferiores) demuestra que no se secreta CMVRh con alteración de la replicación de animales
15 infectados. Para determinar si se secretó CMVRh con supresión de pp71 de los dos animales negativos para CMV infectados con CMVRhΔRh110 (Δpp71) se concentró virus a partir de muestras de orina y se co-cultivó con fibroblastos que expresan pp71. Para el control, se infectaron dos animales positivos para CMV con CMVRh WT que expresaba CMVRhgag. La expresión de VISgag, proteína IE de CMVRH o la proteína celular GAPDH (incluida como control de carga) se determina a partir de cocultivos víricos mediante inmunotransferencia usando anticuerpos específicos (S. G. Hansen et al. Science 328, 5974 (2010)). Los dos animales infectados con CMVRh(gag) secretaron CMVRh (como se muestra por expresión de IE) debido a que son positivos para CMV al inicio del experimento. El día 56, estos animales también secretan CMVRh que expresa VISgag lo que indica infección. Por el contrario, los dos MR negativos para CMV infectados con ΔRh110 no secretaron CMVRh como se indica por la ausencia de cocultivos positivos para IE hasta el último punto temporal ensayado hasta el momento (día 231). Esto
25 indica que ΔRh110 está atenuado in vivo pero conserva la misma inmunogenicidad durante todo el tiempo del experimento (245 días). Este resultado indica adicionalmente que es poco probable que el virus con supresión de pp71 se transmita de un animal a otro. Por lo tanto, los vectores con supresión de pp71 tienen alteración de la replicación y son deficientes en propagación.
Este ejemplo se refiere además a un CMVRh con replicación alterada que expresa un antígeno heterólogo que fue capaz de superinfectar animales positivos para CMV e inducir una respuesta inmunitaria específica para el antígeno heterólogo. Para demostrar si los vectores con supresión de pp71 son capaces de superinfectar MR positivos para CMV e inducir una respuesta de linfocitos T de memoria efectora a largo plazo a un antígeno heterólogo, dos elementos esenciales de vacunas con vectores de CMV, se inoculan cuatro MR con vector con supresión de pp71
35 que expresan los antígenos de VIS rev/tat/nef junto con un vector WT que expresa el antígeno de VIS pol. Esta coinoculación permite la determinación de si existen diferencias en la cinética y duración de la respuesta de linfocitos T a los antígenos de VIS expresados por WT frente a vectores con replicación alterada.
La FIG. 38 muestra que los factores de CMV con supresión de pp71 que expresan un antígeno heterólogo son capaces de superinfectar animales infectados por CMV e inducir una respuesta inmunitaria de larga duración al antígeno heterólogo pero no se secretan. Panel superior: frecuencias medias (+/- ETM) de VISrev/tat/nef y linfocitos T CD8+ específicos de VISpol de linfocitos de sangre y lavado broncoalveolar (BAL) de 4 MR positivos para CMV inoculados simultáneamente con CMVRh que carece de pp71 y que expresa VISretanef (Δpp71 CMVRh/rtn, en rojo) y vectores de tipo silvestre que expresan VISpol (CMVRh/pol wt, en azul). Se muestran respuestas específicas de
45 VISrev/nef/tat de 6 MR a los que se proporcionó CMVRh/retanef wt como un control adicional para comparación (en negro). Las frecuencias de respuesta se determinaron por expresión de TNFα y/o IFN-γ intracelular después de estimulación con péptidos rev/tat/nef o pol solapantes. También se analizaron linfocitos T CD8+ que respondían a VISpol o VISretanef de sangre el día 133 después de la inoculación con respecto a fenotipo de memoria, se muestran la fracción de la respuesta específica de retanef o pol de VIS total con un fenotipo de linfocitos T de memoria central, TCM (D28+/CCR7+), linfocitos T transicionales, TTransꞏ EM (CD28+/CCR7-) y linfocitos T de memoria efectora, TEM (CD28-/CCR7-). Estos datos muestran claramente que los vectores con supresión de pp71 conservan la capacidad para superinfectar animales ya infectados con CMV e inducen una respuesta de linfocitos T de memoria efectora a largo plazo a un antígeno heterólogo.
55 Panel inferior: cocultivo de orina después de inoculación de MR positivos para CMVRh con vectores de Δpp71 CMVRh/ retanef (MR3/MR4) frente a CMVRh wt/retanef (Con), respectivamente. Se recoge orina en los puntos temporales designados y se detecta la expresión de IE de CMVRh (infección primaria) o VISrev/tat/nef marcado con V5 (superinfección) mediante inmunotransferencia de lisados de cocultivo. Estos datos muestran que el vector con supresión de pp71 no se secreta de animales infectados lo que es coherente con la deficiencia en propagación. Tomados juntos, estos datos demuestran que la inmunogenicidad de vectores de CMV no está comprometida incluso cuando los vectores están gravemente alterados en su capacidad para replicar in vivo e in vitro.
Ejemplo 9: los Solicitantes observaron que pueden eliminarse múltiples genes de CMV sin comprometer los elementos que los Solicitantes consideren esenciales para la eficacia del vector, específicamente la capacidad para 65 superinfectar y establecer expresión de antígenos a largo plazo y por lo tanto la inducción de respuesta de linfocitos T de memoria efectora (TEM) duraderas. Los datos de los Solicitantes revelaron un número sorprendentemente
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