EA043809B1 - ВЕКТОРНАЯ СИСТЕМА ИЗ АДЕНОВИРУСА 9 ПТИЦ (FAdV-9) И СВЯЗАННЫЕ СПОСОБЫ - Google Patents
ВЕКТОРНАЯ СИСТЕМА ИЗ АДЕНОВИРУСА 9 ПТИЦ (FAdV-9) И СВЯЗАННЫЕ СПОСОБЫ Download PDFInfo
- Publication number
- EA043809B1 EA043809B1 EA201890274 EA043809B1 EA 043809 B1 EA043809 B1 EA 043809B1 EA 201890274 EA201890274 EA 201890274 EA 043809 B1 EA043809 B1 EA 043809B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- fadv
- egfp
- viral vector
- sequence
- seq
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 131
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 131
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 124
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 108
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 85
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 67
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 66
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 38
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 34
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 30
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 claims description 29
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 claims description 29
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 claims description 29
- 101000736076 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YcbR Proteins 0.000 claims description 28
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 claims description 28
- 101000957786 Klebsiella pneumoniae Phosphomannomutase Proteins 0.000 claims description 28
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 claims description 28
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 claims description 28
- 101000818089 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 25.6 kDa protein Proteins 0.000 claims description 27
- 101000770875 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 14.2 kDa protein in PK1-LEF1 intergenic region Proteins 0.000 claims description 27
- 101000736909 Campylobacter jejuni Probable nucleotidyltransferase Proteins 0.000 claims description 27
- 101000748060 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.3 kDa protein in rep-hol intergenic region Proteins 0.000 claims description 27
- 101000623276 Herpetosiphon aurantiacus Uncharacterized 10.2 kDa protein in HgiBIM 5'region Proteins 0.000 claims description 27
- 101000623175 Herpetosiphon aurantiacus Uncharacterized 10.2 kDa protein in HgiCIIM 5'region Proteins 0.000 claims description 27
- 101000626850 Herpetosiphon aurantiacus Uncharacterized 10.2 kDa protein in HgiEIM 5'region Proteins 0.000 claims description 27
- 101000768313 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized membrane protein in cps region Proteins 0.000 claims description 27
- 101000804418 Methanothermobacter thermautotrophicus (strain ATCC 29096 / DSM 1053 / JCM 10044 / NBRC 100330 / Delta H) Uncharacterized protein MTH_1463 Proteins 0.000 claims description 27
- 101000770870 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 claims description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 26
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 claims description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 15
- 101150107982 ORF0 gene Proteins 0.000 claims description 14
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 claims description 14
- 201000009837 laryngotracheitis Diseases 0.000 claims description 14
- 101000743335 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Probable terminase, endonuclease subunit Proteins 0.000 claims description 13
- 101000820589 Homo sapiens Succinate-hydroxymethylglutarate CoA-transferase Proteins 0.000 claims description 13
- 101000790838 Klebsiella pneumoniae UPF0053 protein in cps region Proteins 0.000 claims description 13
- 101000748499 Rhodobacter capsulatus Uncharacterized 104.1 kDa protein in hypE 3'region Proteins 0.000 claims description 13
- 102100021652 Succinate-hydroxymethylglutarate CoA-transferase Human genes 0.000 claims description 13
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 13
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 11
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 11
- 241000351643 Metapneumovirus Species 0.000 claims description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 claims description 8
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 7
- 241000807592 Fowl adenovirus Species 0.000 claims description 6
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 claims description 6
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 6
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 6
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 claims description 5
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 claims description 4
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 claims description 4
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 4
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 claims description 4
- 206010034107 Pasteurella infections Diseases 0.000 claims description 4
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 claims description 4
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N p-menthan-3-ol Chemical compound CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 201000005115 pasteurellosis Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000932729 Fowl aviadenovirus 8 Species 0.000 claims description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 claims description 2
- 210000001669 bursa of fabricius Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims description 2
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 claims 2
- 241000701796 Fowl aviadenovirus 1 Species 0.000 claims 2
- 241000703558 Fowl aviadenovirus 9 Species 0.000 claims 2
- 101150021746 SI gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 84
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 81
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 78
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 61
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 54
- 239000000047 product Substances 0.000 description 40
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 29
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 28
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 21
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 21
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 20
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 16
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 16
- 101100118093 Drosophila melanogaster eEF1alpha2 gene Proteins 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 14
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 14
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 11
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 10
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 7
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 5
- 101710175558 Tomoregulin-2 Proteins 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101150008820 HN gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241001492404 Woodchuck hepatitis virus Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-triaminopyrimidine Chemical compound NC1=CC(N)=NC(N)=N1 JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025230 2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 108010087522 Aeromonas hydrophilia lipase-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000701802 Aviadenovirus Species 0.000 description 1
- 241001519465 Avian metapneumovirus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101100244725 Caenorhabditis elegans pef-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 229940033332 HIV-1 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000908713 Homo sapiens Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000724418 Homo sapiens Neutral amino acid transporter B(0) Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 101150079922 L2R gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701244 Mastadenovirus Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 102100028267 Neutral amino acid transporter B(0) Human genes 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- -1 SEQ ID NO: 6) Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 241001223089 Tremovirus A Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 101150024766 VP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100127591 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR089 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000029754 bordetellosis Diseases 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000013264 cohort analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001424 embryocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005558 fluorometry Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000007485 viral shedding Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Связанная заявка
По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США № 62/190,913, поданной 10 июля 2015 года, содержание которой включено, таким образом, посредством ссылки в полном объеме.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к аденовирусу 9 птиц (FAdV-9) и более конкретно к FAdV-9 векторной системе двойной доставки и связанным способам, а также к их использованию для предотвращения заболевания.
Предпосылки изобретения
Аденовирусы птиц (FAdV) являются повсеместными патогенами домашней птицы и являются членами семейства Adenoviridae.
Аденовирусы (AdV) рода Mastadenovirus исследовали в качестве средств против злокачественных опухолей (Huebner et al. (1956), Cody & Douglas (2009), Yamamoto & Curiel (2010)) и вакцинных векторов (Lasaro & Ertl (2009)).
Проблема предварительно существующего иммунитета против HAdV-5, примером которой является исследование STEP HIV, в котором использовали рекомбинантный HAdV-5 (Buchbinder et al. (2008), McElrath et al. (2008)), вызвала интерес к исследованию менее распространенных серотипов AdV и не относящихся к человеку AdV в качестве как онколитических ((Cody & Douglas (2009), Gallo et al. (2005), Shashkova et al. (2005)), так и вакцинных векторов (Barouch (2008), Lasaro & Ertl, (2009), Sharma et al. (2009)). Аденовирусы птиц (FAdV) рода Aviadenovirus, в том числе виды от FAdV-A до FAdV-E (Adair, В. & Fitzgerald, S. (2008), Benko et al. (2005)), исследовали в качестве вакцинных векторов. Доказана эффективность первого поколения вакцинных векторов на основе FAdV для индукции образования антител против доставляемого трансгена (Corredor & Nagy (2010b), Ojkic & Nagy (2003)), а куры получали защитный иммунитет против вируса инфекционного бурсита (IBDV) (Francois et al. (2004), Sheppard et al. (1998)) и вируса инфекционного бронхита (Johnson et al. (2003)). Анализ полных геномов FAdV-1, летального сиротского вируса куриных эмбрионов (CELO) (Chiocca et al. (1996)) и FAdV-9 (Ojkic & Nagy (2000)) (виды FAdV-A и FAdV-D, соответственно) и концевых геномных областей FAdV-2, -4, -10 и -8 (Corredor et al. (2006), Corredor et al. (2008)) показал, что FAdV имеют общую геномную организацию.
Доказано, что вакцинные векторы на основе аденовирусов являются перспективными инструментами контроля патогенов (Bangari & Mittal (2006), Ferreira et al. (2005)). Первое поколение вакцинных векторов на основе аденовирусов птиц (FAdV) эффективно использовали для того, чтобы индуцировать образование антител против встроенного чужеродного гена (трансгена) (Corredor, & Nagy (2010a), Ojkic & Nagy (2003)), а у кур подтвержден защитный иммунитет против вируса инфекционного бурсита (Francois et al. (2004), Sheppard et al. (1998)) и вируса инфекционного бронхита (Johnson et al. (2003)).
Аденовирусные векторы из уровня техники, в частности, из аденовирусов птиц, стеснены пределом размера для размера вставки чужеродной ДНК в векторной ДНК. Следовательно, невозможно клонировать особенно большие вставки ДНК, представляющие важные части иммуногенных белков в независимо реплицирующемся вирусе. Также невозможно клонировать больше чем один ген. Значение вектора, способного экспрессировать два или даже несколько антигенов, состоит в том, что только одна вакцина будет необходима для того, чтобы защищать от двух или больше заболеваний. Это невозможно при использовании аденовирусных векторов существующего уровня техники из-за недостатка полезной емкости.
Следовательно, сохраняется потребность в новых аденовирусных векторах и, в частности, в новых аденовирусных векторах для двойной доставки, а также их использованиях.
Сущность изобретения
Авторы изобретения разработали новые аденовирусные векторы на основе рекомбинантного аденовируса 9 птиц (FAdV-9). Векторы, в частности, можно использовать для доставки и/или экспрессии экзогенных последовательностей и в качестве аденовирусных векторов для двойной доставки. В новый вектор можно вставлять одну или несколько экзогенных нуклеотидных последовательностей. Необязательно, одна или несколько экзогенных нуклеотидных последовательностей кодируют один или несколько антигенных сайтов заболевания, представляющего интерес.
Соответственно, в одном из аспектов изобретение относится к вирусному вектору из рекомбинантного аденовируса 9 птиц (FAdV-9). В одном из вариантов осуществления рекомбинантный FAdV-9 вирусный вектор представляет собой вирусный вектор для двойной доставки.
В одном из аспектов FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию на левом конце генома. В одном из вариантов осуществления делеция на левом конце генома содержит делецию одной или нескольких из ORF0, ORF1 и ORF2. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию на правом конце генома. В одном из вариантов осуществления делеция на правом конце генома содержит делецию одного или нескольких из ORF19, TR2, ORF17 и ORF11. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делеции как на левом конце, так и на правом конце генома. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию ORF0, ORF1, ORF2, TR2, ORF17 и ORF11. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию ORF1, ORF2,
- 1 043809
TR2, ORF17 и ORF11. В другом варианте осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию ORF1, ORF2, и ORF19. В другом дополнительном варианте осуществления FAdV9-вирусный вектор имеет делецию ORF1, ORF2 и ORF19, TR2 или ORF11.
В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию на левом конце генома приблизительно в 2291 пару оснований, необязательно между приблизительно 1900 и 2500 парами оснований. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию на правом конце генома приблизительно в 3591 пару оснований. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию на правом конце генома между приблизительно 3000 парами оснований и 4000 парами оснований.
В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит нуклеотидную последовательность с по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с последовательностью с двумя делециями, представленными на фиг. 10А. В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID № 1, с одной или несколькими делециями, необязательно одной или несколькими делециями, представленными на фиг. 10А.
В одном из вариантов осуществления вирусный вектор имеет инсерционную емкость больше чем 4000 п. о., больше чем 5000 п. о., больше чем 6000 п. о. или необязательно больше чем 7000 п. о.
В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит по меньшей мере одно из следующего:
(a) нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей стью, представленной в SEQ ID № 1, в которой нуклеотиды с 575 до 2753 удалены, (b) нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей стью, представленной в SEQ ID № 1, в которой нуклеотиды с 847 до 2753 удалены, (c) нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей стью, представленной в SEQ ID № 1, в которой нуклеотиды с 38807 до 42398 удалены, (d) нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей с стью, представленной в SEQ ID № 1, в которой нуклеотиды с 34220 до 36443 удалены, (e) нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей с последовательнопоследовательнопоследовательнопоследовательнопоследовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой нуклеотиды с 38807 до 40561 удалены или в которой нуклеотиды с 41461 до 42 3 98 удалены, и (f) нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательностей с нуклеотидными последовательностями, изложенными в (а), (b), (с), (d) или (е).
Например, в одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит, состоит по существу из или состоит из нуклеотидной последовательности с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены нуклеотиды с 575 до 2753, с 847 до 2753 и/или с 38807 до 42398. В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит, состоит по существу из или состоит из нуклеотидной последовательности с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены нуклеотиды с 575 до 2753 и с 38807 до 42398. В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит, состоит по существу из или состоит из нуклеотидной последовательности с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены нуклеотиды с 847 до 2753 и с 38807 до 42398. В другом варианте осуществления вирусный вектор содержит, состоит по существу из или состоит из нуклеотидной последовательности с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены нуклеотиды с 847 до 2753 и с 34220 до 36443. В другом варианте осуществления вирусный вектор содержит, состоит по существу из или состоит из нуклеотидной последовательности с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены нуклеотиды с 847 до 2753, с 34220 до 36443 и с 38807 до 40561 или с 41461 до 42398.
Другой аспект изобретения предусматривает вирусный вектор, в который вставлена одна или несколько экзогенных нуклеотидных последовательностей. В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит одну или несколько экзогенных нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или несколько полипептидов, представляющих интерес, необязательно один или несколько антигенных и/или терапевтических полипептидов. В одном из аспектов, вирусный вектор представляет собой вектор для двойной доставки, способный экспрессировать две или больше экзогенных нуклеотидных последовательностей. В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит экзогенные нуклеотидные последовательности, кодирующие один или несколько антигенных сайтов заболевания, представляющего интерес. В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит последовательность, соответствующую по меньшей мере одному гену, перечисленному в табл. 1, или его гомологу.
Также изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным одним или несколькими вирусными векторами, как раскрыто в настоящем описании.
- 2 043809
Дополнительным аспектом изобретения является способ получения вирусного вектора, как раскрыто в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления способ включает вставку экзогенной нуклеотидной последовательности в рекомбинантный FAdV-9 вирусный вектор, как раскрыто в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор содержит одну или несколько рекомбинантных управляющих последовательностей, таких как один или несколько промоторов. Необязательно, вирусный вектор содержит один или несколько сайтов клонирования для того, чтобы содействовать рекомбинантной инсерции экзогенных нуклеотидных последовательностей в вирусный вектор.
В одном из аспектов предоставлена иммуногенная композиция, содержащая aFAdV-9 вирусный вектор, как раскрыто в настоящем описании, который имеет экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один антигенный сайт заболевания, представляющего интерес, вставленный в него. В одном из вариантов осуществления иммуногенная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. В одном из вариантов осуществления иммуногенная композиция дополнительно содержит адъювант. В одном из вариантов осуществления иммуногенная композиция представляет собой вакцину.
В другом аспекте изобретение относится к способу создания иммуногенного ответа у пациента. В одном из вариантов осуществления способ включает введение пациенту вирусного вектора или иммуногенной композиции, как раскрыто в настоящем описании. Также изобретение относится к вирусному вектору или иммуногенной композиции, как раскрыто в настоящем описании, для применения в создании иммуногенного ответа у пациента. В одном из вариантов осуществления способы и применения, описанные в настоящем описании, предназначены для создания иммуногенного ответа против антигена заболевания, необязательно одного или нескольких заболеваний, перечисленных в табл. 1. В одном из вариантов осуществления способы и применения, описанные в настоящем описании, предназначены для профилактики заболевания и/или вакцинации пациента против одного или нескольких заболеваний.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения видны из следующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и отражают предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации сущности и объема изобретения будут видны специалистам в данной области из подробного описания.
Краткое описание фигур
Новые признаки настоящего изобретения установлены, в частности, в приложенной формуле изобретения. Однако само изобретение, вместе с другими его целями и преимуществами, легче понять из дальнейшего подробного описания конкретного варианта осуществления, в прочтении вместе с приложенными чертежами, на которых:
на фиг. 1 представлена FAdV-9 векторная система (FAd-мида). FAd-мида имеет следующие характеристики: непатогенный штамм FAdV-9, необязательные области на левом и правом конце, рекомбинантные FAdV растут подобно FAdV-9 дикого типа, сниженное вирусовыделение и образование антител к вирусному каркасу, a EGFP (ген-репортер) экспрессируют с использованием этого каркаса, когда используют экзогенный (чужеродный) промотор (CMV) (Corrector, J. С. & Nagy, E. (2010b));
на фиг. 2 представлена последовательность левого конца FAdV-9. Функция ORF1 и 1С: модулирует врожденный и адаптивный иммунный ответ; функция ORF0, 1А, 1В и 2: не известна. Когда удаляют ORF0, нативный ранний промотор не функционирует -экспрессия чужеродных генов отсутствует (например mCherry). Когда удаляют только ORF1 и 2, нативный промотор работает;
на фиг. 3 представлена делеция ORF 0, 1 и 2. (А) Схема создания pFAdV9-A0-1-2-RED: ORF0, ORF1, 1А, 1B, 1С и 2 заменяли на кассету CAT, фланкированную с обеих сторон сайтами SwaI для того, чтобы создавать pFAdV9-A0-1-2CAT посредством гомологичной рекомбинации. Кассету CAT удаляли посредством расщепления SwaI, после чего следовало повторное лигирование для того, чтобы создавать немеченный pFAdV9-A0-1-2SwaI. Затем кодирующую последовательность mCherry клонировали в сайт SwaI для того, чтобы создавать pFAdV9-A0-1-2RED; MLP, главный поздний промотор; ITR, инвертированный концевой повтор; (В) и (D) расщепление NotI и ПЦР амплификация ДНК для того, чтобы верифицировать FAd-миды и соответствующие вирусы. Дорожки Δ0-2; pFAdV9-A0-12-RED или вирус 3 пассирования; дорожки wt: pFAdV9-wt или вирус; М: маркер ДНК 1 т. о. Расщепление ДНК pFAdV9-wt с использованием NotI: размеры фрагментов 26 т. о., 11,4 т. о., 6 т. о., 4 т. о. и 1,4 т. о.; расщепление NotI дорожки Δ0-2; размеры фрагментов составляют 26 т. о.; 11,4 т. о., 5,9 к и 4 т. о.; продукт ПЦР дорожки Δ0-2 1619 п. о. и продукт ПЦР wt 3107 п. о.; (С) цитопатический эффект (СРЕ) и экспрессия mCherry с помощью RecFAdV;
на фиг. 4 представлена делеция ORF1 и 2. (А) схема создания pFAdV9-A1-2-RED: ORF1, 1А, 1B, 1С и 2 заменяли на кассету CAT, фланкированную по обеим сторонам сайтами SwaI для того, чтобы создавать pFAdV9-A1-2CAT посредством гомологичной рекомбинации. Кассету CAT удаляли посредством расщепления SwaI, после чего следовало повторное лигирование для того, чтобы создавать немеченный pFAdV9-A1-2SwaI. Затем кодирующую последовательность mCherry клонировали в сайт SwaI для того,
- 3 043809 чтобы создавать pFAdV9-A1-2RED; MLP, главный поздний промотор; ITR, инвертированный концевой повтор; (В) и (D) расщепление NotI и ПЦР амплификация ДНК для того, чтобы верифицировать FAdмиды и соответствующие вирусы. Дорожки Δ1-2; pFAdV9-A1-2RED или вирус 3 пассирования; дорожки wt: pFAdV9-wt или вирус; М: маркер ДНК 1 т. о. Расщепление ДНК pFAdV9-wt с использованием NotI: размеры фрагментов составляют 26 т. о., 11,4 т. о., 6 т. о., 4 т. о. и 1,4 т. о.; расщепление дорожки Δ1-2 с использованием NotI; размеры фрагментов составляют 26 т. о.; 11,4 т. о., 6,2 к и 4 т. о.; продукт ПЦР дорожки Δ1-2 1912 п. о. и продукт ПЦР wt 3107 п. о.; (С) экспрессия mCherry с помощью RecFAdV;
на фиг. 5 представлена последовательность правого конца FAdV-9. Функция TR-2, ORF17 и ORF11 неизвестна; TR-2: самая длинная область повтора состоит из 13 прилегающих прямых повторов 135 п. о. длиной; ORF17 и 11 вероятно представляют собой мембранные гликопротеины;
на фиг. 6 представлена делеция ORF17. (А) схема создания pFAdV9-A17. ORF17 заменяли на кассету CAT, фланкированную с обеих сторон сайтами SwaI посредством гомологичной рекомбинации для того, чтобы создавать pFAdV9-A17 (В) и (С) расщепление NotI и ПЦР амплификация ДНК для того, чтобы верифицировать FAd-миды и соответствующие вирусы. Дорожки Δ17; pFAdV9-A17 или вирус 3 пассирования; дорожки wt: pFAdV9-wt или вирус; М: маркер ДНК 1 т. о. Расщепление ДНК pFAdV9-wt с использованием NotI: размеры фрагментов составляют 26 т. о., 11,4 т. о., 6 т. о., 4 т. о. и 1,4 т. о.; расщепление дорожки Δ17 с использованием NotI; размеры фрагментов составляют 26381 п. о.; 11485 п. о., 6056 п. о., 4078 п. о. и 1391 п. о.; продукт ПЦР дорожки Δ17 2822 п. о. и ПЦР wt не давала продукта;
на фиг. 7 представлена делеция TR2, ORF17 и 11. (А) схема создания pFAdV9-ΔTR2-17-11EGFP: TR2, ORF17, ORF11 заменяли на кассету CAT, фланкированную с обеих сторон сайтами SwaI для того, чтобы создавать pFAdV9-ΔTR2-17-11CAT посредством гомологичной рекомбинации. Кассету CAT удаляли посредством расщепления SwaI, после чего следовало повторное лигирование для того, чтобы создавать немеченный pFAdV9-ΔTR2-17-11SwaI. Затем кассету EGFP клонировали в сайт SwaI для того, чтобы создавать pFAdV9-ΔTR2-17-11EGFP; MLP, главный поздний промотор; ITR, инвертированный концевой повтор; кассета EGFP, CMV-EGFP; (В) и (D) расщепление NotI и ПЦР амплификация ДНК для того, чтобы верифицировать FAd-миды и соответствующие вирусы. Дорожки ΔTR2; pFAdV9-ΔTR2-1711EGFP или вирус 3 пассирования; дорожки wt: pFAdV9-wt или вирус; М: маркер ДНК 1 т. о. Расщепление ДНК pFAdV9-wt с использованием NotI: размеры фрагментов составляют 26 т. о., 11,4 т. о., 6 т. о., 4 т. о. и 1,4 т. о.; расщепление дорожки ΔTR2 с использованием NotI; размеры фрагментов составляют 21 т. о.; 11,4 т. о., 6 т. о., 4 т. о., 3 т. о. и 1,4 т. о.; продукт ПЦР дорожки ΔTR2 3014 п. о. и продукт ПЦР wt 4966 п. о.; (С) экспрессия mCherry с помощью RecFAdV;
на фиг. 8 показано, что рекомбинантный FAdV-9 вирусный вектор представляет собой вектор для двойной доставки, способный экспрессировать экзогенные нуклеотидные последовательности на левом конце и правом конце. (А) схема создания pFAdV9-Δ1-2RED/TR2-17-11EGFP. TR2, ORF17 и ORF11 в pFAdV9-Δ1-2RED заменяли на кассету CAT, фланкированную с обеих сторон сайтами SwaI для того, чтобы создавать pFAdV9-Δ1-2REDΔTR2-17-11CAT посредством гомологичной рекомбинации. Кассету CAT заменяли на кассету EGFP посредством расщепления SwaI, после чего следовало лигирование для того, чтобы создавать pFAdV9-Δ1-2RED/TR2-17-11EGFP. MLP, главный поздний промотор; ITR, инвертированный концевой повтор; кассета EGFP, CMV-EGFP; (В) и (D) расщепление NotI и ПЦР амплификация ДНК для того, чтобы верифицировать FAd-миды и соответствующие вирусы. Дорожки ΔDual: pFAdV9-Δ1-2RED/TR2-17-11EGFP или вирусы 3 пассирования. Дорожка М: маркер ДНК 1 т. о. Дорожки wt: pFAdV9-wt или вирус. Расщепление ДНК pFAdV9-wt с использованием NotI: размеры фрагментов составляют 26 т. о.; 11,4 т. о., 6 т. о., 4 т. о. и 1,4 т. о.; расщепление дорожек ΔDual с использованием NotI: размеры фрагментов составляют 21 т. о., 11,4 т. о., 6,2 т. о., 4 т. о. и 3 т. о.; левый продукт ПЦР дорожки ADual 1912 п. о. и продукт ПЦР wt 3017 п. о.; правый продукт ПЦР дорожки ADual 3014 п. о. и wt продукт ПЦР 4966 п. о;
на фиг. 9 представлены rec вирусы на основе FAdV-9 с генами-репортерами;
на фиг. 10(А) представлена нуклеотидная последовательность одного из вариантов осуществления рекомбинантного FAdV-9 вирусного вектора, как раскрыто в настоящем описании, в котором удалены ORF1, ORF2, TR2, ORF17 и ORF11; (В) нуклеотидные последовательности генов, вставленных в рекомбинантные вирусы: усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP, SEQ ID № 2) и mCherry красный (SEQ ID № 3); (С) нуклеотидные последовательности промоторов, вставленных в рекомбинантные гены: предранний промотор цитомегаловируса человека (CMV; SEQ ID № 4), CMV энхансер/промотор β-актина курицы (CAG, SEQ ID № 5), промотор фактора элонгации 1α человека (EF1a, SEQ ID № 6), промотор L2R (SEQ ID № 7) и промотор β-актина (SEQ ID № 8); и (D) нуклеотидная последовательность энхансера/регуляторной последовательности, используемых в рекомбинантных вирусах: посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPER, SEQ ID № 9);
на фиг. 11 приведено схематическое представление pCI-Neo. Плазмиду pCI-Neo (Promega) выбирали для того, чтобы создавать конструкции для двойной экспрессии, благодаря ее уникальным сайтам рестрикционных ферментов в сайте множественного клонирования и перед ним, а также гену устойчивости к неомицину;
- 4 043809 на фиг. 12 представлено создание рекомбинантных FAdV-9A4 вирусов. (А) экспрессирующую кассету EGFP амплифицировали с помощью ПЦР из промежуточной конструкции pHMR или экстрагировали из геля после двойного расщепления с использованием BamHI и BglII. (В) pFAdV-9A4 линеаризовали и расщепляли с использованием SwaI. (С) Как кассету EGFP, так и линеаризованный pFAdV-9A4 совместно трансформировали в клетки Е. coli BJ5183, чтобы подвергать гомологичной рекомбинации. (D) Получаемую плазмиду трансформировали в клетки Е. coli DH5a, размножали, осуществляли скрининг посредством расщепления NotI и в конечном итоге линеаризовали с использованием Pad, чтобы высвобождать вирусный геном из плазмиды. Линейную рекомбинантную вирусную ДНК трансфицировали в клетки CH-SAH. (Е) рекомбинантный вирус собирали в супернатанте. Эту процедуру осуществляли для каждой экспрессирующей кассеты EGFP, что давало вирусы: FAdV-9A4-CMV-EGFP, FAdV-9A4-CMV-EGFPWPRE, FAdV-9A4-CAG-EGFP, FAdV-9A4-CAG-EGFP-WPRE, FAdV-9A4-EF1a-EGFP и FAdV-9A4-EF1aEGFP-WPRE;
на фиг. 13 приведено схематическое представление двойных экспрессирующих EGFP/люциферазу плазмид. (A) EGFP ПЦР амплифицировали из pEGFP-N1 и клонировали в сайт множественного клонирования pCI-Neo. Ген устойчивости к неомицину (NeoR) из pCI-Neo удаляли посредством расщепления рестрикционными ферментами. Люциферазу светлячка ПЦР амплифицировали из pGL-4.17 и клонировали под промотор SV40, что давало к двойную экспрессирующую плазмиду. (В) Плазмиду pCMVEGFP-Luc расщепляли с использованием SpeI и EcoRI для того, чтобы клонировать в промоторы, представляющие интерес, что давало пять векторов с EGFP под управлением различных промоторов и люциферазой под управлением промотора SV40: pCMV-EGFP-Luc, pCAG-EGFP-Luc, pEF1a-EGFP-Luc, рвактин-EGFP-Luc и pL2R-EGFP-Luc. Пять дополнительных плазмид получали посредством ненаправленного клонирования посттранскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита сурков (WPRE) в каждую двойную экспрессирующую плазмиду в сайте NotI, что давало конструкции: pCMV-EGFPWPRE-Luc, pCAG-EGFP-WPRE-Luc, pEF1a-EGFP-WPRE-Luc, рв-актин-EGFP-WPRE-Luc и pL2R-EGFPWPRE-Luc;
на фиг. 14 представлено сравнение EGFP экспрессии с флуоресцентной микроскопией. Клетки CHSAH высевали в 35 мм чашках (1,8х106 клеток/чашка) и трансфицировали с использованием 2 мкг плазмидной ДНК. Флуоресценцию EGFP измеряли посредством микроскопии через 12, 24, 36, 48, 60 и 72 часа после трансфекции. Имитацию трансфекции использовали в качестве отрицательного контроля, тогда как pEGFP-N1 являлся положительным контролем;
на фиг. 15 представлен нормализованная экспрессия EGFP в зависимости от времени. Клетки CHSAH высевали в 35 мм чашки (1,8х106 клеток/чашка) и трансфицировали с использованием 2 мкг плазмидной ДНК. В каждый момент времени трансфицированные клетки промывали, трипсинизировали и ресуспендировали в PBS. После трех циклов замораживания-оттаивания образцы центрифугировали и концентрацию белка в собранном супернатанте измеряли с использованием Nanodrop. Флуоресценцию EGFP измеряли в считывателе микропланшетов при длинах волн возбуждения и испускания 480 и 528 нм, соответственно. Люминесценцию люциферазы измеряли с использованием набора Pierce Firefly Luciferase Glow Assay (Thermo). Двойную экспрессию (флуоресценцию/люминесценцию) каждой конструкции нормализовали по уровню экспрессии pCMV-EGFP-Luc (нормализованному до 1,0) в каждый момент времени. Критерий Стьюдента использовали для того, чтобы определять значимость экспрессии по сравнению с pCMV-EGFP-Luc, которую обозначали звездочкой (*), где Р <0,05;
на фиг. 16 приведено схематическое представление промежуточных конструкций, используемых для того, чтобы создавать recFAdV. (А) ДНК FAdV-9, фланкирующую сайт делеции А4 (VF1 и VF2), ПЦР амплифицировали и направленно клонировали в двойную экспрессирующую плазмиду pCMVEGFP-Luc. Получаемую конструкцию pHMR-CMV-EGFP использовали далее для того, чтобы создавать рекомбинантный вирус FAdV-9A4-CMV-EGFP. (В) Создавали пять дополнительных промежуточных конструкций, что вело к плазмидам: pHMR-CAG-EGFP, pHMR-EF1a-EGFP, pHMR-CMV-EGFP-WPRE, pHMR-CAG-EGFP-WPRE и pHMR-EF1a-EGFP-WPRE;
на фиг. 17 представлен скрининг электрофорезом в агарозном геле для FAd-мид, расщепленных NotI. FAd-миды, полученные гомологичной рекомбинацией плазмид pFAdV-9A4 и pHMR, расщепляли с использованием NotI и осуществляли скрининг получаемых паттернов полос на агарозном геле. Расщепленная pFAdV-9A4 имеет ожидаемый паттерн полос 4 т. о., 5,1 т. о., 13,7 т. о. и 23,8 т. о. Рекомбинантные FAd-миды с экспрессирующей кассетой EGFP содержат дополнительный сайт NotI для скрининга. Диагностические полосы, соответствующие каждой кассете, представляют собой следующее: CMV-EGFP=2,2 т. о., CMV-EGFP-WPRE=2,2 т. о. и 0,55 т. о., CAG-EGFP=2,9 т. о., CAG-EGFP-WPRE=0,55 т. о., EF1aEGFP=2, 7 т. о. и EF1a-EGFP-WPRE=2, 7 т. о. и 0,55 т. о. Белые стрелки указывают на диагностические полосы;
на фиг. 18 представлены кривые роста вирусов. Одностадийные кривые роста для каждого рекомбинантного аденовируса птиц определяли в клетках CH-SAH. Клетки высевали в 35 мм чашки (1,8х106 клеток/чашка) и инфицировали при MOI=5. Внутриклеточный и внеклеточный вирус собирали между 0
- 5 043809 и 72 ч. п. и. Одностадийные кривые роста получали в двух повторениях для каждого образца и весь внеклеточный вирус титровали посредством анализа бляшкообразования;
на фиг. 19 показано, что цитопатический эффект рекомбинантного FAdV совпадает с FAdV-9A4. Клетки CH-SAH высевали в 35 мм чашки (1,8х106 клеток/чашка) и инфицировали при MOI=5. Цитопатический эффект рекомбинантных вирусов сравнивали с контрольным FAdV-9A4 дикого типа. Наблюдали, что все рекомбинантные вирусы (данные не представлены) имели СРЕ, схожий с FAdV-9A4, о чем свидетельствовало округление и отделение клеток при использовании светлопольного микроскопа. Однако флуоресценцию EGFP от recFAdV, например, FAdV-9A4-CAG-EGFP-WPRE, наблюдали с использованием флуоресцентной микроскопии;
на фиг. 20 представлена динамика экспрессии EGFP в клетках CH-SAH. Клетки CH-SAH высевали в 35 мм чашки (1,8х106 клеток/чашка) и инфицировали с использованием recFAdV-9s при MOI=5. В каждый момент времени инфицированные клетки собирали, промывали и ресуспендировали в PBS. После трех циклов замораживания-оттаивания образцы центрифугировали и концентрацию белка в собранном супернатанте измеряли с использованием Nanodrop. Абсолютную флуоресценцию EGFP из 50 мкг цельного клеточного лизата измеряли с использованием считывателя микропланшетов при длинах волн возбуждения и испускания 480 и 528 нм, соответственно. Не инфицированные (имитация) или FAdV-9A4 инфицированные клетки не демонстрировали какой-либо флуоресценции EGFP;
на фиг. 21 представлен вестерн-иммуноблоттинг образования EGFP с течением времени. Экспрессию EGFP с помощью recFAdV-9 в клетках CH-SAH сравнивали в течение 48 ч. п. и., наряду с FAdV-9A4 (отрицательный контроль), неинфицированнои имитацией (отрицательный контроль) и pEGFP-N1 трансфицированными клетками CH-SAH (положительный контроль). Клетки CH-SAH высевали в 35 мм чашки (1,8х106 клеток/чашка) и инфицировали с использованием recFAdV-9 при MOI=5. В каждый момент времени собирали цельные клеточные лизаты и определяли концентрации белка посредством анализа Бредфорда. 6 мкг каждого образца загружали в два геля, один подлежал исследованию антителом против EGFP (1:1000), после чего следовало вторичное антимышиное HRP-конъюгированное антитело (1:5000), другой гель подлежал исследованию антителом против актина (1:200), после чего следовало вторичное антикозье HRP-конъюгированное антитело (1:20000). Все появившиеся полосы имели ожидаемый размер (EGFP=27 кДа и актин=42 кДа), как определяли по маркеру молекулярной массы (не показано);
на фиг. 22 представлен поливалентный рекомбинантный FadV-9 с Н5, Н7 и HN.
Подробное описание изобретения
Авторы изобретения установили, что рекомбинантный FAdV-9 с делециями на левой и/или правой стороне генома можно использовать в качестве вирусных векторов.
В одном из вариантов осуществления изобретения рекомбинантный FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию на левом конце генома. В одном из вариантов осуществления делеция на левом конце генома содержит делецию одного или нескольких из ORF0, ORF1 и ORF2.
В одном из вариантов осуществления рекомбинантный FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию на правом конце генома. В одном из вариантов осуществления делеция на правом конце генома содержит делецию одного или нескольких из ORF19, TR2, ORF17 и ORF11.
В одном дополнительном варианте осуществления рекомбинантный FAdV-9 вирусный вектор имеет делеции как на левом конце, так и на правом конце генома. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию ORF0, ORF1, ORF2, TR2, ORF17 и ORF11. В одном из вариантов осуществления рекомбинантныи FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию ORF1, ORF2, TR2, ORF17 и ORF11. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию ORF1, ORF2, и ORF19. В одном из вариантов осуществления рекомбинантныи FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию ORF1, ORF2 и ORF19, TR2 или ORF11.
Как показано в примерах, рекомбинантные FAdV-9 вирусные векторы с делециями на левой стороне и правой стороне, включая делецию TR2, стабильны, и их можно использовать для управления экспрессией трансгена.
FAdV вирусные векторы, описанные в настоящем описании, обеспечивают множество преимуществ. Например, в некоторых вариантах осуществления FAdV вирусные векторы делают возможным получение моно- и поливалентных вакцин. Значение вектора, способного экспрессировать двойные или даже поливалентные антигены, состоит в том, что только одна вакцина нужна для того, чтобы защищать против одного или нескольких заболеваний. В одном из вариантов осуществления векторы допускают встраивание больших сегментов чужеродной ДНК, необязательно вплоть до 7,7 т. о. чужеродной ДНК. В одном из вариантов осуществления векторы являются стабильными и безопасными для использования у животных, таких как куры. В одном из вариантов осуществления вирусные векторы легки в получении и образуют высокие вирусные титры. В одном из вариантов осуществления имеют место различные серотипы FAdV. В одном из вариантов осуществления вирусные векторы не имеют предварительно существующего иммунитета у человека, и их можно использовать в генной терапии человека.
В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусные векторы, описанные в настоящем описа
- 6 043809 нии, могут включать одну или несколько экзогенных нуклеотидных последовательностей (также обозначаемых в настоящем описании как трансгены).
В одном из вариантов осуществления изобретения экзогенную нуклеотидную последовательность выбирают из антигенных последовательностей против гриппа, инфекционного ларинготрахеита, инфекционного бронхита, инфекции фабрициевой сумки (Гумборо), гепатита, вирусного ринотрахеита, инфекционного катара, Mycoplasma hyopneumonieae, пастереллеза, респираторно-репродуктивного синдрома свиней (PRRS), цирковируса, бордетеллиоза, парагриппа или какого-либо другого антигена, размер которого допускает его инсерцию в соответствующий вирусный вектор.
В другом варианте осуществления экзогенную нуклеотидную последовательность выбирают из антигенных последовательностей против птичьего гриппа, ларинготрахеита (LT), заболевании Ньюкасла (NDV), инфекционной анемии, телец включения, инфекционного бронхита (IB), метапневмовируса (MPV) или Гумборо.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения экзогенная нуклеотидная последовательность содержит, состоит по существу из или состоит из последовательности, соответствующей по меньшей мере одному гену, раскрытому в табл. 1, или его гомологу. Как используют в настоящем описании, термин гомолог гена предназначен обозначать ген с по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с геном, обладающий биологической активностью той же природы. В одном из вариантов осуществления вектор, описанный в настоящем описании, содержит 2, 3 или 4 последовательности, соответствующих генам, раскрытым в табл. 1, или их гомологам. Необязательно, экзогенные последовательности можно вставлять в вектор в одном сайте инсерции или нескольких различных сайтах инсерции.
Таблица 1
| Заболевание | Ген | Доступ GEN BANK |
| Птичий грипп | Гемагглютинин мексиканского птичьего гриппа H5N2, штамм 435 | FJ864690.1 (SEQ ID № 10) |
| Гемагглютинин птичьего гриппа H7N3 Jalisco 2012 | JX397993.1 (SEQ ID № 11) | |
| Гемагглютинин птичьего гриппа H7N3 Guanajuato 2015 | KR821169 (SEQ ID № 12) | |
| Ларинготрахеит (LT) | Гликопротеин В ларинготрахеита, штамм USDA | EU104965.1 (SEQ ID № 13) |
| Гликопротеин D ларинготрахеита, штамм USDA | JN542534.1|:132317- 133621 (SEQ ID № 14) | |
| Ньюкасл (NDV) | Ген HN, штамм LaSota | KC844235.1|:6412- 8145 (SE ID NO: 15) |
| Ген HN, изолят штамма вируса болезни Ньюкасла Chicken/M083313/Mexico/2008 | KF910962.1 (SEQ ID № 16) | |
| Инфекционная анемия | Ген VP1 из изолята штамма вируса анемии кур CAV-10 | KJ872513.il:832-2181 (SEQ ID № 17) |
| Ген VP2 из изолята штамма вируса анемии кур CAV-10 | AIV09094.1 (SEQ ID № 18) | |
| Тельца включения | Ген коротких волокон аденовируса 4 птиц | AY340863.1 (SEQ ID № 19) |
| Инфекционный бронхит (ТВ) | Полученный из штамма вируса инфекционного бронхита ArkDPI ген | EU359651.1 (SEQ ID № 20) |
| гликопротеина шиповидного отростка коммерческой вакцины D | ||
| Метапневмовирус (MPV) | Изолят метапневмовируса птиц 1Т/Ту/А/259-01/03, ген Г | |JF424833.1|:2943- 45599 (SEQ ID № 21) |
| Гумборо | Гумборо VP2 |
FAdV-9 вирусные векторы, описанные в настоящем описании, можно получать с использованием рекомбинантных технологий, таких как ПЦР амплификация нуклеотидной последовательности, представляющей интерес, посредством идентификации антигенных сайтов, выделив исходный патоген, под
- 7 043809 лежащих дальнейшей вставке, которые амплифицируют в вирусном векторе. Инсерцию можно создавать с использованием стандартных способов молекулярной биологии, таких как рестрикционные ферменты и ДНК лигазы, среди прочего. Инфекционный клон, полученный таким образом, вводят в подходящую клеточную линию для получения рекомбинантного вируса. Например, в одном из вариантов осуществления способы, необходимые для конструирования FAdV-9 вирусных векторов, описаны в настоящих примерах и процедурах, описанных для конструирования FAdV-9 инфекционного клона (FAd-миды) (Ojkic, D. & Nagy, E. (2001), The long repeat region is dispensable for fowl adenovirus replication in vitro. Virology 283, 197-206). В этой процедуре используют гомологичную рекомбинацию между вирусной геномной ДНК и линеаризованной плазмидой, содержащей оба конца генома, фланкирующие вектор каркаса (pWE-Amp со встроенными сайтами Pad). Затем чужеродный ген, представляющий интерес, с промотором для управления его экспрессией вставляют в подходящие геномные области инфекционного клона, которые являются необязательными или несущественными (Corredor и Nagy, 2010a и 2010b), и вводят в подходящую клеточную линию.
Вирусный вектор по настоящему изобретению можно использовать, например, для получения и введения иммуногенных композиций, содержащих по меньшей мере вирусный вектор, как раскрыто в настоящем описании, и экзогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере один антигенный сайт заболевания, представляющего интерес, вставленной в него. Необязательно, вирусный вектор по настоящему изобретению представляет собой вектор для двойной доставки, который можно использовать для управления экспрессией двух или больше экзогенных нуклеотидных последовательностей. В одном из вариантов осуществления две или больше экзогенных нуклеотидных последовательностей находятся под управлением различных промоторов. В одном из вариантов осуществления промоторы выбирают из группы, состоящей из CMV, CAG, EF1a,e-актина и L2R.
В одном из вариантов осуществления аденовирус птиц, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой удалены ORF0, ORF1, ORF2, TR2, ORF17 и ORF11. SEQ ID № 1 соответствует полной геномной последовательности аденовируса D птиц (номер доступа GenBank AC_000013.1). В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор, описанный в настоящем описании, содержит или состоит из нуклеотидной последовательности с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены ORF0, ORF1, ORF2, TR2, ORF17 и ORF11. В предпочтительном варианте осуществления аденовирус птиц, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой полностью или частично удалены ORF1, ORF2, TR2, ORF17 и ORF11. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор, описанный в настоящем описании, содержит или состоит из нуклеотидной последовательности по меньшей мере с 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой удалены ORF1, ORF2, TR2, ORF17 и ORF11.
В другом варианте осуществления аденовирус птиц, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены ORF1, ORF2 и ORF19. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор, описанный в настоящем описании, содержит или состоит из нуклеотидной последовательности с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены ORF1, ORF2 и ORF19.
В другом варианте осуществления аденовирус птиц, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены ORF1, ORF2 и ORF19, TR2 или ORF11. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор, описанный в настоящем описании, содержит или состоит из нуклеотидной последовательности с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены ORF1, ORF2 и ORF19, TR2 или ORF11.
В другом варианте осуществления аденовирус птиц, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены нуклеотиды с 575 до 2753. Эта последовательность (нуклеотиды с 575 до 2753) содержит ORF0, ORF1A, ORF1B, ORF1C и ORF2. В другом варианте осуществления FAdV-9 вирусный вектор, описанный в настоящем описании, содержит или состоит из нуклеотидной последовательности с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой удалены нуклеотиды с 575 до 2753. В другом варианте осуществления аденовирус птиц, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность с идентично
- 8 043809 стью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены нуклеотиды с 847 до 2753. Эта нуклеотидная последовательность (нуклеотиды с 847 до 2753) содержит ORF1A, ORF1B, ORF1C и ORF2. В другом варианте осуществления FAdV-9 вирусный вектор, описанный в настоящем описании, содержит или состоит из нуклеотидной последовательности с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены нуклеотиды с 847 до 2753.
В другом варианте осуществления аденовирус птиц, описанный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены нуклеотиды с 38807 до 42398. Эта нуклеотидная последовательность (нуклеотиды с 38807 до 42398) содержит TR-2, ORF17 и ORF11. В другом варианте осуществления FAdV-9 вирусный вектор, описанный в настоящем описании, содержит или состоит из нуклеотидной последовательности с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой целиком или частично удалены нуклеотиды с 38807 до 42398.
В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит или состоит из нуклеотидной последовательности с идентичностью последовательностей с последовательностью, содержащей или состоящей из SEQ ID № 1, в которой удалены по меньшей мере 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 или 5000 нуклеотидов, соответствующих целиком или частично нуклеотидам с 575 до 2753 и/или с 38807 до 42398 в SEQ ID № 1.
В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит или состоит из нуклеотидной последовательности с идентичностью последовательностей с последовательностью, содержащей или состоящей из SEQ ID № 1, в которой удалены по меньшей мере 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 или 5000 нуклеотидов, соответствующих целиком или частично нуклеотидам с 847 до 2753 и/или с 38807 до 42398 в SEQ ID № 1.
В другом варианте осуществления вирусный вектор содержит или состоит из нуклеотидной последовательности с идентичностью последовательностей с последовательностью, содержащей или состоящей из SEQ ID № 1, в которой удалены по меньшей мере 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 или 5000 нуклеотидов, соответствующих целиком или частично нуклеотидам с 847 до 2753 и с 34220 до 36443.
В другом варианте осуществления вирусный вектор содержит или состоит из нуклеотидной последовательности с идентичностью последовательностей с последовательностью, содержащей или состоящей из SEQ ID № 1, в которой удалены по меньшей мере 500, 1000, 1500, 2000, 250θ, 3000, 3500, 4000, 4500 или 5000 нуклеотидов, соответствующих целиком или частично нуклеотидам с 847 до 2753, с 34220 до 36443 и с 38807 до 40561 или с 41461 до 42398.
По меньшей мере одну экзогенную нуклеотидную последовательность необязательно вставляют в FAdV-9 вирусный вектор, описанный в настоящем описании. Соответственно, в одном из вариантов осуществления FAdV-9 нуклеотидная последовательность с делециями, описанными в настоящем описании, присутствует в векторе не в виде одной непрерывной последовательности, но скорее включает куски непрерывных последовательностей, прерываемые по меньшей мере одной и необязательно по меньшей мере двумя, тремя или четырьмя, экзогенными нуклеотидными последовательностями. Следовательно, в одном из вариантов осуществления аденовирус птиц, описанный в настоящем описании, содержит одну или несколько нуклеотидных последовательностей с идентичностью последовательностей с одной или несколькими последовательностями, представленными в SEQ ID № 1, в которых удалено по меньшей мере одно из ORF0, ORF1, ORF2, TR2, ORF17 и ORF11, и нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере две, три, четыре или пять непрерывных последовательностей.
Число нуклеотидов, удаленных из FAdV-9, варьирует. В одном из вариантов осуществления удаляют от 1000 до 7000 нуклеотидов, необязательно разделенных между левым и правым концом генома. В других вариантах осуществления удаляют от 1500 до 6000 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления удаляют по меньшей мере 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 50 0 0 или 6000 нуклеотидов.
Размер экзогенной нуклеотидной последовательности (ей), вставленной в вирусный вектор, описанных в настоящем описании, также варьирует. В одном из вариантов осуществления на основе правила стабильности аденовируса 105%, емкость вектора составляет вплоть до 7751 п. о. В других вариантах осуществления вставляют от 1000 до 7000 нуклеотидов, необязательно разделенных между левым и правым концом генома. Например, один чужеродный ген можно вставлять в левый конец, а второй чужеродный ген можно вставлять в другой конец. В других вариантах осуществления вставляют от 1500 до 6000 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления вставляют по меньшей мере 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 6000 экзогенных нуклеотидов.
В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию на левом конце генома приблизительно в 2291 пару оснований, необязательно между приблизительно 1900 и 2500 парами оснований. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию на правом
- 9 043809 конце генома приблизительно в 3591 пару оснований. В одном из вариантов осуществления FAdV-9 вирусный вектор имеет делецию на правом конце генома между приблизительно 3000 парами оснований и 4000 парами оснований.
Идентичность последовательностей обычно оценивают с помощью расширенного поиска программой BLAST версии 2.1 (стандартные параметры по умолчанию; Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403_410). BLAST представляет собой ряд программ, которые доступны онлайн в U.S. National Center for Biotechnology Information(National Library of MedicineBuilding 38ABethesda, MD 20894). В расширенном поиске Blast задают параметры по умолчанию. Ссылки на программы Blast включают: Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. (1993) Identification of protein coding regions by database similarity search. Nature Genet. 3:266272.; Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. (1996) Applications of network BLAST server Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402); Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation. Genome Res. 7:649-656).
Как используют в настоящем описании, вирусный вектор относится к рекомбинантному аденовирусу, который способен доставлять экзогенную нуклеотидную последовательность в клетку-хозяина. Например, в одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит участки рестрикции, которые подходят для вставки экзогенной нуклеотидной последовательности в вектор. В одном из вариантов осуществления в нуклеотидной последовательности вирусного вектора удаляют одну или несколько нуклеотидных последовательностей, которые не необходимы для репликации или передачи FAdV-9, описанного в настоящем описании. Например, в одном из вариантов осуществления в рекомбинантном FAdV-9 вирусном векторе удаляют нуклеотидные последовательности на левом и/или правом конце генома FAdV-9. В одном из вариантов осуществления в рекомбинантном FAdV-9 вирусном векторе удаляют нуклеотидные последовательности, соответствующие одному или нескольким из ORF 0-2, ORF19, TR2, ORF17 и ORF11. В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит одну или несколько экзогенных управляющих последовательностей, таких как промоторы или сайты клонирования, которые можно использовать для управления экспрессией трансгенов. В одном из вариантов осуществления промоторы выбирают из группы, состоящей из CMV (SEQ ID № 4), CAG (SEQ ID № 5), EF1a (SEQ ID № 6), β-актина (SEQ ID № 8) и L2R (SEQ ID № 7).
В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, представляющий интерес. В одном из вариантов осуществления полипептид, представляющий интерес, представляет собой антиген заболевания, представляющего интерес. Например, в одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один антигенный сайт заболевания, представляющего интерес. Экзогенные нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, представляющий интерес, можно легко получать известными в данной области способами, например, посредством химического синтеза, скрининга подходящих библиотек или посредством извлечения последовательности гена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В отношении настоящего раскрытия, заболевания, представляющие интерес, включают, но не ограничиваясь этим, грипп, инфекционный ларинготрахеит (ILT), инфекционный бронхит (IB), инфекционный бурсит (Гумборо), гепатит, вирусный ринотрахеит, инфекционный катар, Mycoplasma hyopneumonieae, пастереллез, респираторно-репродуктивный синдром свиней (PRRS), цирковирус, бордетеллиоз, парагрипп, птичий грипп, заболевание Ньюкасла (NDV), инфекционную анемию, гепатит с тельцами включения (IBH) и метапневмовирус (MPV).
В одном из вариантов осуществления вирусный вектор адаптируют для того, чтобы экспрессировать экзогенную нуклеотидную последовательность в клетке-хозяине. Например, в одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит управляющие последовательности, способные влиять на экспрессию экзогенной нуклеотидной последовательности у хозяина. Например, вирусные векторы, описанные в настоящем описании, могут содержать одну или несколько управляющих последовательностей, таких как транскрипционный промотор, энхансер, необязательная последовательность оператора, чтобы управлять транскрипцией, последовательность, кодирующая подходящие мРНК участки связывания рибосомы, сайты альтернативного сплайсинга, трансляционные последовательности или последовательности, которые управляют терминацией транскрипции и трансляции. Необязательно, вирусный вектор содержит различные управляющие последовательности на левом конце и правом конце векторов. В одном из вариантов осуществления промоторы выбирают из группы, состоящей из CMV (SEQ ID № 4), CAG (SEQ ID № 5), EF1a (SEQ ID № 6), β-актина (SEQ ID № 8) и L2R (SEQ ID № 7), а энхансером может быть WPRE (SEQ ID № 9).
В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит одну или несколько экзогенных нуклеотидных последовательностей, функционально связанных с одной или несколькими управляющи
- 10 043809 ми последовательностями. В одном из вариантов осуществления вирусный вектор содержит сайт инсерции смежно с одной или несколькими управляющими последовательностями так, что, когда экзогенную нуклеотидную последовательность вставляют в вектор, экзогенная нуклеотидная последовательность функционально связана с управляющими последовательностями. Как используют в настоящем описании, нуклеотидные последовательности функционально связаны, когда они находятся в функциональных отношениях друг к другу. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он управляет транскрипцией последовательности; участок связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы делать возможной трансляцию. Необязательно, последовательности, которые функционально связаны, представляют собой непрерывные последовательности в вирусном векторе.
В одном из вариантов осуществления вирусный вектор, описанный в настоящем описании, содержит последовательность, подходящую для биологического отбора организмов-хозяев, содержащих вирусный вектор, например, позитивный или негативный селективный ген.
Другие известные в данной области способы, такие как рекомбинантные технологии, включая в качестве неограничивающих примеров те, которые раскрыты в Sambrook et al. (Sambrook J et al. 2000. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-е издание), Cold Spring Harbor Laboratory Press), также подходят для получения нуклеотидных последовательностей и вирусных векторов, как раскрыто в настоящем описании.
Необязательно, вирусные векторы и способы, описанные в настоящем описании, можно использовать для генной терапии у пациентов животных, нуждающихся в этом. Например, в одном из вариантов осуществления вирусные векторы, описанные в настоящем описании, можно использовать для доставки и экспрессии терапевтической нуклеотидной последовательности или нуклеотида, кодирующего терапевтический белок. В одном из вариантов осуществления предоставлен способ генной терапии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, вирусного вектора или композиции, как раскрыто в настоящем описании, где вирусный вектор содержит экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую терапевтическую нуклеотидную последовательность или белок.
Другой аспект настоящего раскрытия включает иммуногенную композицию, содержащую рекомбинантный FAdV-9 вирусный вектор, как раскрыто в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления иммуногенные композиции можно получать известными способами для получения композиций для введения животным, включая в качестве неограничивающих примеров человека, сельскохозяйственных животных, домашнюю птицу и/или рыбу. В одном из вариантов осуществления эффективное количество вирусного вектора, описанного в настоящем описании, объединяют в смесь с фармацевтически приемлемым носителем. Подходящие носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA) или Handbook of Pharmaceutical Additives (составители Michael и Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, England (1995). Исходя из этого, композиции включают, хотя не исключительно, растворы вирусных векторов, описанных в настоящем описании, ассоциированные с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, и могут содержаться в буферных растворах с подходящим рН и/или быть изоосмотическими физиологическим жидкостям. В одном из вариантов осуществления иммуногенная композиция содержит адъювант.
Новые FAdV-9 вирусные векторы, связанные способы и использования более ясно проиллюстрированы в следующем описании конкретных примеров.
Пример 1. Материалы и способы.
1.1. Клеточная культура и вирусы.
Клетки гепатомы кур (клеточную линию CH-SAH) поддерживали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла/смеси питательных веществ F-12 Ham (DMEM-F12) (Sigma) плюс 2 00 мМ Lглутамина и 100 Ед./мл пенициллина-стрептомицина (PenStrep, Sigma) с 10% не инактивированной теплом эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), как описано (Alexander, H.S., Huber, P., Cao, J., Krell, P.J., Nagy, E. 1998. Growth Characteristics of Fowl Adenovirus Type 8 in a Chicken Hepatoma Cell Line. J. Virol. Methods. 74, 9-14.). Рекомбинантные FAdV создавали с использованием вируса с делецией FAdV-9A4, описанного у Corredor и Nagy (2010b), в качестве основы. Размножение всех вирусов осуществляли в клетках CH-SAH, как описано у Alexander et al. (1998).
1.2. Основные манипуляции с ДНК.
1.2.1. Бактериальные культуры и выделение плазмид Клетки Escherichia coli DH5a представляли собой бактериальный организм-хозяин для всех описанных плазмид, тогда как клетки Е. coli BJ5183 использовали для гомологичной рекомбинации, чтобы создавать рекомбинантные FAd-миды.
Бактериальные культуры выращивали на селективной жидкой или агаровой (16 мг/мл) среде ЛуриаБертани (LB) для выращивания, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), при 37°С. Собирали отдельные колонии Е. coli, инокулировали их в 5 мл среды LB с добавлением 0,1% ампициллина для того, чтобы отбирать по росту бактерии, содержащие трансформированную плазмиду с устойчивостью к ампициллину. Инкубация и рост проходили в течение приблизительно 16 часов. Химически (CaCl2) получали ком
- 11 043809 петентные Е. coli DH5a и трансформировали их с использованием или 10 мкл продукта лигирования или 1 мкл очищенной плазмидной ДНК (Sambrook, J., Russel, D.W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, том 1, 3-е изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, New York, USA). Все плазмиды выделяли с использованием или набора EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Mini-prep (Bio Basic) или набора PureLink HiPure Plasmid Midiprep (Invitrogen) (для плазмид размером больше 40 т. о. или когда необходима высокая концентрация ДНК) по протоколу производителя.
1.2.2. ПЦР и расщепление рестрикционными ферментами.
ДНК амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) во время клонирования всех двойных экспрессирующих конструкций и рекомбинантных вирусов. Для всего клонирования ПЦР амплификацию проводили с использованием набора Kod Hot Start Polymerase (Novagen). Однако, Taq полимеразу использовали при скрининге плазмиды с помощью ПЦР. Если не установлено иное, условия ПЦР для полимераз Kod и Taq сведены в табл. 2. Все ПЦР реакции осуществляли с использованием Mastercycler Pro (Eppendorf).
Расщепление рестрикционными ферментами (RE) осуществляли как для ферментов Fast Digest (Fermentas), так и для ферментов из New England BioLabs (NEB). Все реакции проводили по протоколу производителя (для каждого фермента). Реакции расщепления всегда проводили при 37°С, и образцы инактивировали теплом в термоциклере Mastercycler Pro (Eppendorf).
Если не указано иное, все образцы ДНК подвергали электрофорезу при 100 В в 0,8% агарозных гелях, содержащих 1х RedSafe™ (iNtRON Biotechnology). Для электрофореза образцов ДНК использовали 6х ДНК загрузочный буфер [0,25% (масс./об.) бромфеноловый синий, 40% сахароза (масс./об.) в воде] и 1х буфер трис-ацетат-EDTA (ТАЕ).
1.2.3. Конструирование плазмиды и трансформация.
После RE расщепления и очистки в геле, ПЦР амплифицированную ДНК и плазмиду лигировали вместе с Т4 ДНК лигазой (Invitrogen). Если не установлено иное, лигирование осуществляли при молярном соотношении вставки и вектора 1:1 в течение ночи при 16°С. 50 мкл CaCl2 компетентных Е. coli DH5a смешивали с 10 мкл продукта лигирования или 1 мкл очищенной плазмидной ДНК. Компетентные клетки и ДНК инкубировали на льду в течение 30 мин, затем осуществляли тепловой шок при 42°С в течение 1 мин. Клетки восстанавливали на льду в течение 3 мин и 500 мкл супероптимального бульона со средой для катаболитной репрессии (SOC) добавляли в каждую микропробирку для центрифуги. Клетки инкубировали при 37°С в течение 1 ч при встряхивании, затем центрифугировали и ресуспендировали в 100 мкл бульона LB. Весь объем распространяли по чашке с LB агаром, содержащим ампициллин.
Гомологичную рекомбинацию проводили в клетках Е. coli BJ5183. 2 мкг как промоторных кассет, так и линейной FAdV-9A4 ДНК смешивали в 100 мкл химически компетентных клеток BJ5183. Смеси оставляли на льду в течение 15 мин, после чего следовал тепловой шок при 42°С в течение 1 мин. Клетки восстанавливали на льду в течение 20 мин, и 1 мл среды SOC добавляли в каждую микропробирку для центрифуги и переносили в 5 мл стеклянную культуральную пробирку. Клетки инкубировали в течение 2 ч при 37°С при встряхивании, затем центрифугировали и ресуспендировали в 100 мкл бульона LB. Весь объем клеток распространяли по чашке с LB агаром, содержащим ампициллин.
1.2.4. Секвенирование.
Все продукты ПЦР и плазмиды очищали и секвенировали с помощью ДНК секвенатора ABI 3730 (Laboratory Services Division, Guelph, ON). Данные о последовательностях анализировали с использованием SnapGene Viewer (GSL Biotech).
1.3. Анализ промоторной экспрессии.
1.3.1. Создание двойных экспрессирующих плазмидных конструкций.
Активность пяти промоторов (CMV, CAG, EF1a, β-актин и L2R) и одного энхансерного элемента (WPRE) сравнивали посредством измерения экспрессии EGFP в сравнении с люциферазой светлячка под управлением промотора SV40 в трансфицированных клетках CH-SAH. Плазмиды pCI-Neo (Promega), pCAG-Puro и pEF1a-Puro предоставлены доктором Sarah Wootton (University of Guelph). Двойные экспрессирующие плазмиды создавали с использованием плазмиды pCI-Neo в качестве каркаса (фиг. 11), которая содержала промотор CMV наряду с несколькими уникальными сайтами RE. Оба промотора CAG и EF1a субклонировали из pCAG-Puro и pEF1a-Puro, соответственно, в pCI-Neo с использованием SpeI и EcoRI. Присутствие каждого промотора подтверждали посредством секвенирования с использованием праймера pCI-Neo-F (табл. 3). EGFP амплифицировали с помощью ПЦР из pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, Inc) с использованием праймеров EGFP-F и EGFP-R (табл. 3) при температуре отжига 60°С. Получаемый продукт ПЦР экстрагировали в геле с использованием набора Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification (Promega). Как продукт ПЦР EGFP, так и плазмиды на основе pCI-Neo (содержащие промотор CMV, CAG или EF1a) подвергали двойному расщеплению с использованием EcoRI и NotI в течение 1 ч при 37°С. Затем расщепленную плазмиду и продукт ПЦР разделяли в геле и экстрагировали с использованием набора Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification (Promega) и проводили лигирование в течение
- 12 043809 ночи при 4°С. После трансформации в клетки Е. coli DH5a и роста на чашках с LB-ампициллином, колонии подвергали ПЦР скринингу на присутствие Фрагмента EGFP с использованием праймеров EGFP-F и EGFP-R. Все положительные колонии подтверждали посредством секвенирования с использованием праймера EGFP-I-F (табл. 3), что приводило к плазмидам pCMV-EGFP, pCAG-EGFP и pEF1a-EGFP.
Промотор β-актина амплифицировали с помощью ПЦР из pCAG-Puro, используя праймеры вактинF и вактин-R (табл. 3), при температуре отжига 60°С. Получаемый продукт ПЦР экстрагировали в геле с использованием набора Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification (Promega). Продукт ПЦР β-актина и pCAG-EGFP подвергали двойному расщеплению с использованием EcoRI и NotI в течение 1 ч при 37°С. Затем расщепленную плазмиду и продукт ПЦР разделяли в геле и экстрагировали с использованием набора Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification (Promega) и проводили лигирование в течение ночи при 4°С. После трансформации в клетки Е. coli DH5a и роста на чашках с LB-ампициллином, осуществляли скрининг колоний с использованием RE на присутствие β-актина. Все положительные колонии подтверждали посредством секвенирования с использованием праймеров pCI-Neo-F и EGFP-I-F (табл. 3), что приводило к плазмиде рвактин-EGFP.
Промотор L2R вируса куриной оспы ПЦР амплифицировали из pE68 (Zantinge, J.L., Krell, P.J., Derbyshire, J.B., Nagy, E. 1996. Partial transcriptional mapping of the fowlpox virus genome and analysis of the EcoRI L fragment. J. Gen. Virol. 77(4), 603-614) с использованием праймеров L2R-F и L2R-R (табл. 3) при температуре отжига 60°С. Получаемый продукт ПЦР экстрагировали в геле с использованием набора Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification (Promega). Продукт ПЦР L2R и pCMV-EGFP подвергали двойному расщеплению с использованием EcoRI и NotI в течение 1 ч при 37°С. Затем расщепленные плазмиду и продукт ПЦР разделяли в геле и экстрагировали с использованием набора Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification (Promega) и проводили лигирование в течение ночи при 4°С. После трансформации в клетки Е. coli DH5a и роста на чашках с LB-ампициллином, осуществляли скрининг колоний с использованием RE на присутствие L2R. Все положительные колонии подтверждали посредством секвенирования с использованием праймеров pCI-Neo-F и EGFP-I-F (табл. 3), что приводило к получению плазмиды pL2R-EGFP.
Люциферазу светлячка ПЦР амплифицировали из pGL4.17 (Promega) с использованием праймеров Luc-F и Luc-R (табл. 3) при температуре отжига 55°С. Получаемый продукт ПЦР (1,6 т. о.) экстрагировали в геле с использованием набора Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification (Promega). Продукт ПЦР люциферазы и промоторные плазмиды подвергали двойному расщеплению с использованием AvrII и BstBI в течение 1 ч при 37°С. Затем расщепленные плазмиду и продукту ПЦР разделяли в геле, удаляя кассету устойчивости к неомицину (NeoR) из каждой плазмиды, и экстрагировали с использованием набора Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification (Promega) и проводили лигирование в течение ночи при 4°С. После трансформации в клетки Е. coli DH5a и роста на чашках с LB-ампициллином, колонии подвергали ПЦР скринингу на присутствие люциферазы. Все положительные колонии подтверждали посредством секвенирования с использованием праймера SV40-F (табл. 3).
Пять дополнительных двойных экспрессирующих плазмид создавали для того, чтобы включать энхансерный элемент WPRE. Элемент WPRE ПЦР амплифицировали из pWPRE (доктор Sarah Wootton, University of Guelph) с использованием праймеров WPRE-F и WPRE-R (табл. 2.2) при температуре отжига 55°С. Продукт ПЦР экстрагировали в геле с использованием набора Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification (Promega). Продукт ПЦР WPRE и промотор подвергали расщеплению с использованием NotI в течение 1 ч при 37°С. После расщепления плазмиды обрабатывали щелочной фосфатазой (кишечной теленка, New England BioLabs) по протоколу производителя для того, чтобы предотвращать повторное лигирование. Затем расщепленные/дефосфорилированные плазмиду и продукт ПЦР разделяли в геле и экстрагировали ДНК с использованием набора Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification (Promega) и проводили лигирование в течение ночи при 4°С. После трансформации в клетки Е. coli DH5a и роста на чашках с LB-ампициллином, колонии подвергали ПЦР скринингу на присутствие WPRE. Все положительные колонии подтверждали посредством секвенирования с использованием EGFP-I-F (табл. 3). Список всех плазмид, созданных в этом исследовании, и их предназначения приведен в табл. 4.
1.3.2. Трансфекция клеток гепатомы курицы.
Экспрессию EGFP измеряли посредством трансфекции клеток CH-SAH двойными экспрессирующими плазмидами. Клетки высевали в 35 мм чашки при плотности 1,2x106 клеток/чашка и инкубировали при 37°С с 5% СО2. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) использовали для того, чтобы трансфицировать все конструкции в соответствии с рекомендациями производителя. В кратком изложении, 2 мкг двойной экспрессирующей плазмиды и 5 мкл липофектамина инкубировали в отдельных 50 мкл аликвотах среды Opti-Mem (Gibco) в течение 5 минут, затем перемешивали и инкубировали вместе в течение 20 минут. В течение этого периода времени среду удаляли из каждой чашки и монослои клеток промывали два раза фосфатно-солевым буфером (PBS). В каждую чашку добавляли 2 мл DMEM-F12 (5% FBS) без антибиотиков. Через 20 минут смеси плазмида-липофектамин добавляли в 35 мм чашки и инкубировали в течение 6 ч при 37°С в присутствии 5% СО2. Это повторяли для всех 10 двойных экспрессирующих плазмид.
- 13 043809
После 6 ч удаляли среду и добавляли свежую DMEM-F12 (5% FBS). Каждые 12 часов после трансфекции (ч. п. т.) экспрессию EGFP подтверждали посредством флуоресцентной микроскопии и собирали цельный клеточный лизат. Монослои промывали с использованием PBS, добавляли трипсин и ресуспендировали клетки в DMEM-F12 (10% FBS). Затем клетки центрифугировали в 15 мл конических пробирках (Nunc®), удаляли супернатант и ресуспендировали клеточный пеллет в 500 мкл PBS и замораживали при -80°С. Образцы трансфицированных клеток, замороженные при -80°С, замораживали-оттаивали три раза. Клеточный детрит осаждали центрифугированием на 12000 об./мин в микроцентрифуге в течение 10 минут при 4°С. Супернатант переносили в свежую микропробирку для центрифуги и определяли концентрацию белка при 280 нм с использованием Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Все образцы корректировали до концентрации белка 1 мкг/мкл.
1.3.3. Флуоресцентная микроскопия.
Осуществляли мониторинг как трансфицированных, так и инфицированных клеток CH-SAH посредством флуоресцентной микроскопии с использованием флуоресцентного микроскопа Zeiss (Carl Zeiss) с FITC-оптикой.
1.3.4. Измерение экспрессии гена-репортера.
Экспрессию EGFP количественно определяли посредством спектрофлюорометрии с использованием считывателя микропланшетов GloMax®-Multi (Promega). В кратком изложении, 50 мкг лизата белка добавляли в трех повторениях в плоскодонный черный 96-луночный планшет (Corning). Флуоресценцию EGFP измеряли в считывателе микропланшетов GloMax®-Multi (Promega) при длинах волн возбуждения 480 нм и испускания 528 нм. Для каждого образца три показания усредняли для получения одного значения флуоресценции.
Экспрессию люциферазы определяли с использованием набора Pierce Firefly Luciferase Glow Assay (Thermo Fisher Scientific) по протоколу производителя. В кратком изложении, 25 мкг белкового лизата добавляли в трех повторениях в плоскодонный черный 96-луночный планшет (Corning). В каждом повторении вручную добавляли 50 мкл субстрата для анализа люциферазы, хорошо перемешивали и инкубировали в течение 15 минут, защищая от света, прежде чем измерять люминесценцию в считывателе микропланшетов GloMax®-Multi (Promega). Для каждого образца показания усредняли для получения одного значения люминесценции.
1.3.5. Нормализация промоторной экспрессии.
Нормализацию двойных экспрессирующих конструкций осуществляли для того, чтобы удалять вариабельность эффективности трансфекции от образца к образцу (Schagat, Т., Paguio, A., Kopish, K. 2007. Normalizing Genetic Reporter Assays: Approaches and Considerations for Increasing Consistency and Statistical Significance. Cell Notes. 17, 9-12). Кратность изменения активности определяли между промоторными конструкциями и pCMV-EGFP-Luc. В начале для каждого конкретного момента времени и повторения усредненную значение флуоресценции и люминесценции определяли для каждой плазмидной конструкции, где вычисляли соотношение флуоресценции и люминесценции (F/R). Уровень активности сравнивают с промотором CMV, в настоящее время используемым в recFAdV, следовательно значение соотношения F/R для CMV принимали равным 1,0 (делили соотношение F/R на само себя). Каждое оставшееся значение F/R конструкции также делили на значение F/R для CMV, что вело к значению, представляющему нормализованную кратность изменения активности (кратность А). Усредненную кратность изменения между повторениями сравнивали между всеми конструкциями в каждый момент времени.
1.4. Создание и определение характеристик рекомбинантных вирусов.
1.4.1. Конструирование промежуточных конструкций.
Дополнительный анализ экспрессии EGFP in vitro осуществляли с использованием recFAdV, содержащих экспрессирующие кассеты на основе CMV, CAG и Ef1a. В предыдущих исследованиях recFAdV получали посредством гомологичной рекомбинации между pFAdV-9A4 и амплифицированной ПЦР экспрессирующей кассетой, содержащей вирусные фланкирующие области, выделенные из промежуточной конструкции. Плазмида pleftA491-2,782 (pLA2.4) содержит сайт делеции Δ4 на левом конце (Δ491-2,782 н.) FAdV-9 с RE сайтом SwaI для тупого клонирования трансгена (Corredor and Nagy, 2010b). В этом исследовании разрабатывали новую систему промежуточной конструкции посредством клонирования вирусных фланкирующих областей непосредственно в двойные экспрессирующие плазмиды, таким образом создавая плазмиды, готовые для рекомбинации (pHMR). Вирусные геномные области, фланкирующие сайт делеции Δ4 в FAdV-9, амплифицировали с помощью ПЦР из промежуточной конструкции pLΔ2.4. Область слева от сайта делеции (VF1) ПЦР амплифицировали с использованием 100 нг pLΔ2.4 и праймеров VF1-F и VF1-R (табл. 3) при температуре отжига 52°С. Получаемый продукт ПЦР экстрагировали в геле с использованием набора EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Mini-prep (Bio Basic). Продукт ПЦР VF1 и все двойные экспрессирующие векторы расщепляли с использованием SpeI в течение 1 ч, после чего следовало расщепление с использованием BglII. Затем расщепленные плазмиду и продукт ПЦР разделяли в геле и экстрагировали с использованием набора QIAEX II Gel Extraction (Qiagen) и проводили лигирование в течение ночи при 16°С. После трансформации в клетки Е. coli DH5a и роста на чашках с LB-ампициллином, колонии подвергали ПЦР скринингу на присутствие фрагмента VF1 с ис
- 14 043809 пользованием праймеров VF1-F и VF1-R. Все положительные колонии подтверждали посредством секвенирования. Затем область справа от сайта делеции (VF2) ПЦР амплифицировали с использованием 100 нг pLA2.4 и праймеров VF2-F и VF2-R (табл. 3) при температуре отжига 52°С. Получаемый продукт ПЦР экстрагировали в геле с использованием набора EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Mini-prep (Bio Basic). Продукт ПЦР VF2 и все двойные экспрессирующие векторы, положительные по фрагменту VF1, расщепляли с использованием KpnI в течение 1 ч, после чего следовало расщепление с использованием MfeI. Затем расщепленные плазмиду и продукт ПЦР разделяли в геле и экстрагировали с использованием набора QIAEX II Gel Extraction (Qiagen) и проводили лигирование в течение ночи при 16°С. После трансформации в клетки Е. coli DH5a и роста на чашках с LB-ампициллином, колонии подвергали ПЦР скринингу на присутствие фрагмента VF2 с использованием праймеров VF1-F и VF2-R (табл. 3) при температуре отжига 52°С, при ожидаемом размере 2 т. о. плюс размер каждой экспрессирующей кассеты EGFP. Список всех шести промежуточных плазмид pHMR приведен в табл. 4. 1.4.2 Создание рекомбинантных аденовирусов птиц Рекомбинантные FAdV создавали для того, чтобы включать экспрессирующие кассеты CMV, CMV-WPRE, CAG, CAG-WPRE, EF1a и EF1a-WPRE, используя модифицированный способ Corredor и Nagy (2010b) (фиг. 12). Экспрессирующие кассеты, фланкированные вирусной ДНК, в плазмидах pHMR рекомбинировали с pFAdV-9A4 для того, чтобы создавать новые рекомбинантные FAdмиды, содержащие промотор, представляющий интерес, и EGFP. Для получения промоторных кассет EGFP, фланкированных последовательностями вирусной ДНК, промежуточные конструкции pHMR подвергали ПЦР или RE расщеплению с использованием BglII/BamHI. Кассеты, содержащие промотор CMV (pHMR-CMV-EGFP и pHMR-CMV-EGFP-WPRE) и промотор EF1a (pHMR-EF1a-EGFP и pHMR-EF1aEGFP-WPRE), ПЦР амплифицировали. ПЦР осуществляли с использованием 200 нг плазмиды и праймеров E1-F и E1-R (табл. 3) при температуре отжига 52°С, и получаемый продукт ПЦР экстрагировали в геле с использованием набора QIAEX II Gel Extraction (Qiagen). Кассеты, содержащие промотор CAG (pHMR-CAG-EGFP и pHMR-CAG-EGFP-WPRE), подвергали двойному расщеплению с использованием BglII/BamHI. В кратком изложении, 5 мкг плазмиды расщепляли с использованием обоих ферментов в течение 1 ч при 37°С. Образцы разделяли посредством электрофореза в геле, и полосы, соответствующие кассете CAG (4,5 т. о.) или кассете CAG-WPRE (5 т. о.), экстрагировали в геле, используя набор EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction (Bio Basic). Затем 5 мкг pFAdV-9A4 линеаризовали с использованием SwaI и преципитировали этанолом. Концентрацию всей ДНК, полученной посредством продуктов ПЦР и RE расщепления, измеряли с использованием Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Для каждой конструкции 2 мкг промоторной кассеты EGFP и 2 мкг расщепленной SwaI pFAdV-9A4 совместно трансформировали в клетки Е. coli BJ5183. Осуществляли скрининг рекомбинации всех получаемых конструкций посредством расщепления NotI, после чего следовала трансформация в Е. coli DH5a. Эти конструкции выращивали в среде LB, выделяли с использованием набора PureLink HiPure Plasmid Midiprep (Invitrogen), расщепляли с использованием Pad и экстрагировали посредством преципитации этанолом. Клетки CHSAH высевали в 25 см колбы при плотности 4,3x106 клеток/колба. 5 мкг ДНК, расщепленной PacI, трансфицировали в клетки CH-SAH с использованием 25 мкл Lipofectamine 2000 (Invitrogen). После 6 ч трансфекции смесь удаляли и добавляли свежую DMEM-F12 (5% FBS), клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. В течение следующей недели осуществляли мониторинг клеток на проявление цитопатического эффекта (СРЕ). В этот момент клеточные культуры замораживали и оттаивали три раза, центрифугировали и осветленный супернатант, содержащий рекомбинантный FAdV-9A4, хранили в качестве стока Р0 при -80°С. Впоследствии вирус пассировали три раза для того, чтобы получать сток Р4 с высоким титром. Список recFAdV приведен в табл. 4.
1.4.3. Кривые роста вируса.
Одностадийные кривые роста для всех вирусов получали, как описано в Alexander et al. (1998). В кратком изложении, всего 1,8x106 клеток CH-SAH высевали в 35 мм чашки и инкубировали при 37°С с 5% СО2. Клетки инфицировали с использованием recFAdV при множественности заражения (MOI), равной 5. После адсорбции в течение 1 часа при комнатной температуре, клетки промывали три раза в PBS и добавляли свежую DMEM-F12 (5% FBS). Клеточную культуральную среду и клетки собирали через 0, 12, 18, 24, 30, 36, 48, 60 и 72 часа после инфекции (ч. п. и.). Среду удаляли и замораживали при -80°С в качестве внеклеточного вируса, а клетки промывали три раза в PBS, на монослой помещали 1 мл среды и чашку замораживали при -80°С в качестве внутриклеточного вируса. Внеклеточный вирус титровали в каждый момент времени. Клетки CH-SAH высевали в 6-луночные планшеты при плотности 1,8x106 клеток/лунка и инкубировали в течение ночи. Внеклеточный вирус в каждый момент времени серийно разводили (10-1-10’7), и 100 мкл каждой аликвоты инокулировали в двух повторениях и оставляли адсорбироваться в течение 1 ч при комнатной температуре. Инокулят удаляли, а монослой промывали в PBS. В каждую лунку добавляли 3 мл агарового слоя, состоящего из 0,6% агарозы SeaKem LE (Lonza), DMEMF12 (5% FBS, L-глутамин и PenStrep), и планшеты инкубировали при 37°С с 5% СО2. После пяти суток в каждую лунку добавляли 1,5 мл нейтрального красного (0,015%) и после 24 ч считали бляшки.
- 15 043809
1.4.4. Обнаружение экспрессии EGFP.
Всего 1,8х106 клеток CH-SAH высевали в 35 мм чашки и инкубировали при 37°С с 5% СО2. Клетки инфицировали с использованием recFAdV при MOI=5. Неинфицированные и инфицированные FAdV9Δ4 клетки представляли собой отрицательные контроли, тогда как клетки, трансфицированные с использованием 6 мкг pEGFP-N1, представляли собой положительный контроль. Клетки собирали через 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36 и 48 ч. п. и. и центрифугировали их на 5000 об./мин в течение 5 минут. Каждый образец ресуспендировали в 500 мкл PBS и разделяли на две аликвоты 250 мкл. Первую аликвоту хранили замороженной при -80°С для дальнейшего измерения посредством спектрофлюорометрии. Вторую аликвоту снова центрифугировали, чтобы вымывать FBS. Супернатант удаляли и клеточный пеллет ресуспендировали в 200 мкл лизирующего буфера RIPA (50 мМ Tris HCl рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1% Triton X100, 0,1% SDS, 10 мМ EDTA и 1% дезоксихолат натрия). Образцы инкубировали на льду в течение 20 минут и повторно центрифугировали на 12000 об./мин при 4°С в течение 20 минут. Супернатант собирали и хранили при -80°С.
Экспрессию EGFP измеряли посредством спектрофлюорометрии в каждый момент времени. Образцы инфицированных клеток, замороженные при -80°С, замораживали-оттаивали три раза. Клеточный детрит осаждали центрифугированием на 12000 об./мин в течение 10 минут при 4°С. Супернатант переносили в свежую микропробирку для центрифуги и определяли концентрацию белка на 280 нм с использованием Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Все образцы корректировали до концентрации белка 1 мкг/мкл. Для каждого образца, 50 мкг белкового экстракта добавляли в трех повторениях в плоскодонный черный 96-луночный планшет (Corning) и проводили анализ с использованием считывателя микропланшетов GloMax®-Multi (Promega) для того, чтобы обнаруживать флуоресценцию EGFP, используя длины волн возбуждения и испускания 480 и 528 нм, соответственно.
1.4.5. Анализ Бредфорда и SDS-PAGE.
Концентрацию белка определяли с использованием набора BioRad Protein Assay по протоколу производителя. В кратком изложении, получали разведение 1:5 концентрированного окрашивающего реактива в дистиллированной Н2О. 10 мкл BSA белковых стандартов с концентрацией в диапазоне от 100 мкг/мл до 1 мг/мл вместе с образцами цельных клеточных лизатов (разведенных 1:10) пипетировали в 96-луночный планшет в трех повторениях. В каждый образец добавляли 200 мкл разведенного окрашивающего реактива и перемешивали, после 5 минут инкубации поглощение измеряли на 595 нм в считывателе микропланшетов (BioTek Powerwave XS2). Создавали калибровочную кривую, используя значения поглощения BSA стандартов, и уравнение линии тенденции использовали для экстраполяции концентраций неизвестных клеточных лизатов. Значения для каждого образца усредняли для того, чтобы создавать усредненную общую концентрацию белка, учитывая коэффициент разведения. Все образцы разводили до конечной концентрации 0,67 мкг/мкл в дистиллированной Н2О.
Белки разделяли через SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). 10% акриламидные гели получали в соответствии с рецептами, полученными из Roche Lab FAQs Handbook (4-е изд.). Для всех экспериментов 15 мкл каждого клеточного лизата (0,67 мкг/мкл) смешивали с 4 мкл 4х SDSPAGE загрузочного буфера (с добавлением 2-меркаптоэтанола). Образцы инкубировали при 95°С в течение 10 минут перед загрузкой в гели. В индивидуальные дорожки загружали всего 10 мкг на образец, а также 5 мкл белкового маркера (Precision Plus Protein Dual Colour, BioRad). Когда загружали все образцы, гели прогоняли при 100 В в течение приблизительно 1,5 часа в подвижном буфере (25 мМ Tris, 190 мМ глицин, 0,1% SDS, рН 8,3).
1.4.6. Вестерн-иммуноблоттинг.
После SDS-PAGE белки переносили на поливинилидендифторидные (PVDF) мембраны в Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (BioRad) по протоколу производителя. Образцы прогоняли при 100 В в течение 1 часа в буфере для переноса (25 мМ Tris, 190 мМ глицин, 20% метанол, рН 8,3). После переноса мембраны споласкивали в Tris-буферном физиологическом растворе с добавлением 0,1% Tween 20 (TBS-T) и блокировали с использованием 5% снятого молока (в TBS-T) в течение 1 часа при комнатной температуре и встряхивании. В блокирующий раствор добавляли первичное антитело и мембраны инкубировали в течение ночи при 4°С. Для анализа EGFP использовали первичное моноклональное антитело мыши против GFP (Molecular Probes) в разведении 1:1000. Для анализа актина использовали первичное поликлональное антитело козы против актина (Santa Cruz Biotechnology) в разведении 1:1000. На следующий день все блоты промывали три раза в TBS-T в течение 10 минут каждый при встряхивании. Затем блоты инкубировали во вторичном антителе, разведенном в блокирующем растворе, в течение 1 часа при встряхивании. Использовали следующие поликлональные вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP): антимышиное козы (Invitrogen, в разведении 1:5000) и антикозье осла (Jackson, в разведении 1:20000). Затем блоты промывали еще три раза в TBS-T и инкубировали в реактиве Western. Lightning Plus-ECL (Perkin Elmer Inc) в течение 5 минут перед проявкой с использованием ChemiDoc XRS (BioRad).
- 16 043809
Таблица 2
Условия ПЦР при использовании полимеразы Kod или Taq по протоколу производителя. Полимераза Kod
| Стадия | Целевой размер | |||
| <500 п. о. | 500-1000 п. | 1000-3000 п. о. | >3000 п. о. | |
| Активация | 95°С в течение 2 мин | |||
| Денатурация | 95°С в течение 20 с | |||
| Отжиг | Тт°С наименьшего праймера в течение 10 с | |||
| Элонгация | 70°С в течение 10 с/т. о. | 70°С в течение 15 с/т. о. | 70°С в течение 20 с/т. о. | 70°С в течение 25 с/т. о. |
| Повторение стадий 2-4 | 25 циклов |
Полимераза Taq
| Стадия | |
| Активация | 95°С в течение 5 мин |
| Денатурация | 95°С в течение 1 мин |
| Отжиг | Тш°С наименьшего праймера в течение 30 с |
| Элонгация | 70°С в течение 1 мин/т. о. |
| Повторение стадий 24 | 25 циклов |
Таблица 3
Праймеры, разработанные для создания конструкций для двойной экспрессии и reFAdV. Рестрикционные ферменты, встроенные в каждый праймер, подчеркнуты
| Праймер | Последовательность (от 5' к 3') | Tm | Рестрикционны й фермент |
| pCI-Neo- F | GGCTCATGTCCAATATGACCGCCAT (SEQ ID № 22) | 61°C | - |
| EGFP-F | AAAAAAGAATTCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG (SEQ ID № 23) | 58°C | EcoRI |
| EGFP-R | AAAAAAGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC (SEQ ID № 24) | 59°C | Notl |
| EGFP-I-F | GAGAAGCGCGATCACATGGT (SEQ ID № 25) | 58°C | - |
| Зактин-Е | AAAAAAACTAGTTGGTCGAGGTGAGCCCCACGTT (SEQ ID № 26) | 65°C | Spel |
| Зактин-Р | AAAAAAGAATTCGCCCGCCGCGCGCTTCGCTT (SEQ ID № 27) | 71°C | EcoRI |
| L2R-F | AAAAAAACTAGTCATAGTAAATATGGGTAACTTCTTAA TAGCCA (SEQ ID № 28) | 55°C | Spel |
| L2R-R | AAAAAAGAATTCATGGTTTGTTATTGGCAAATTTAAAT TAATGTT (SEQ ID № 29) | 55°C | EcoRI |
| Luc-F | AAAAAACCTAGGTTGGCAATCCGGTACTGTTGGT (SEQ ID № 30) | 59°C | Avril |
| Luc-R | AAAAAATTCGAAGCCGCCCCGACTCTAG (SEQ ID № 31) | 58°C | BstBI |
| SV40-F | GGCCTCTGAGCTATTCCAGA (SEQ ID № 32) | 56°C | - |
| WPRE-F | AAAAAAGCGGCCGCTCAACCTCTGGATTACAAAATTTG TGAA (SEQ ID № 33) | 56°C | Notl |
| WPRE-R | AAAAAAGCGGCCGCGCCCAAAGGGAGATCCGAC (SEQ ID № 34) | 58°C | Notl |
| VF1-F | AAAAAAAGATCTTACATGAATGACGCTGCTG (SEQ ID № 35) | 53°C | Bglll |
| VF1-R | AAAAAAACTAGTAAATACACCGAGAAATACCACG (SEQ ID № 36) | 53°C | Spel |
| VF2-F | AAAAAACAAT T GAAATAAAGACT CAGAAC GCAT T T T С C (SEQ ID № 37) | 54°C | Mfel |
| VF2-R | AAAAAAGGTACCCCCCCGCAGAGAATTAAAA (SEQ ID № 38) | 53°C | Kpnl |
| El-F | ACATGAATGACGCTGCTG (SEQ ID № 39) | 53°C | - |
| El-R | CCCCCGCAGAGAATTAAAA (SEQ ID № 40) | 52°C | - |
- 17 043809
Таблица 4
Векторы и вирусы в этом исследовании и их ключевые признаки
| pHMR-CAG-EGFP-WPRE | 9484 | Промежуточная конструкция для гомологичной рекомбинации с pFAdV-9A4 |
| pHMR-EFla-EGFP | 8766 | Промежуточная конструкция для гомологичной рекомбинации с pFAdV-9A4 |
| pHMR-EFla-EGFP-WPRE | 9290 | Промежуточная конструкция для гомологичной рекомбинации с pFAdV-9A4 |
| pFAdV-9A4 | 44971 | Каркас FAd-миды Δ491-2782 |
| pFAdV-9A4-CMV-EGFP | 46826 | FAd-мида, содержащая CMV-EGFP в сайт Δ4 |
| pFAdV-9A4-CMV-EGFP- WPRE | 47350 | FAd-мида, содержащая CMV-EGFP-WPRE в сайте Δ4 |
| pFAdV-9A4-CAG-EGFP | 47583 | FAd-мида, содержащая CAG-EGFP в сайте Δ4 |
| pFAdV-9A4-CAG-EGFP- WPRE | 48107 | FAd-мида, содержащая CAG-EGFP-WPRE в сайте Δ4 |
| pFAdV-9A4-EFla-EGFP | 47389 | FAd-мида, содержащая EFla -EGFP в сайте Δ4 |
| pFAdV-9A4-EFla-EGFP- WPRE | 47913 | FAd-мида, содержащая EFla -EGFP-WPRE в сайте Δ4 |
| Вирусы | ||
| Название | Разме P (n. о . ) | Описание |
| FAdV-9A4 | 42772 | Вирус FAdV-9 с делецией (Δ491-2782) |
| FAdV-9A4-CMV-EGFP | 44627 | Рекомбинантный вирус CMV-EGFP |
| FAdV-9A4-CMV-EGFP- WPRE | 45151 | Рекомбинантный вирус CMV-EGFP-WPRE |
| FAdV-9A4-CAG-EGFP | 45384 | Рекомбинантный вирус CAG-EGFP |
| FAdV-9A4-CAG-EGFP- WPRE | 45908 | Рекомбинантный вирус CAG-EGFP-WPRE |
| FAdV-9A4-EFla-EGFP | 45190 | Рекомбинантный вирус EFla-EGFP |
| FAdV-9A4-EFla-EGFP- WPRE | 45714 | Рекомбинантный вирус EFla-EGFP-WPRE |
Пример 2. Создание и определение характеристик FAdV-9 вирусных векторов.
Как показано на фиг. 1-8, авторы изобретения проводили эксперименты для того, чтобы создавать и определять характеристики FAdV-9 вирусных векторов, содержащих вирусы с делециями ORF0-ORF1ORF2 со вставленной кодирующей последовательностью mCherry и использующих нативный ранний промотор; вирусы с делециями TR2-ORF17-ORF11 со вставленной кассетой EGFP, и вирус с двойной экспрессией, который можно использовать в качестве поливалентного вектора.
На левом конце генома: от нуклеотида 847 до 2753; удаляли 1906 нуклеотидов. Эта делеция содержит ORF1A, ORF1B, ORF1C и ORF2. На правом конце генома: от нуклеотида 38807 до 42398; удаляли 3591 нуклеотид. Эта делеция содержит TR-2, ORF17 и ORF11. Полная делеция составляет 5497 п. о.; размер вектора с двойной делецией составляет 39567 п. о. Чужеродный ген, вставленный в левый конец, представляет собой mCherry (SEQ ID № 3711 п. о.). Чужеродный ген, вставленный в правый конец, представляет собой EGFP (SEQ ID № 2, 1602 п. о.). Исходя из правила стабильности аденовируса 105%, емкость двойного вектора составляет вплоть до 7751 п. о., это может быть в различных конфигурациях, например, на левом конце составляет вплоть до 4160 п. о. и на правом конце составляет вплоть до 5844 п. о.
Как показано на фиг. 2 и 3А, на левом конце генома: от нуклеотида 575 до 2753: удаляли нуклеотиды 2178 п. о. Эта делеция содержит ORF0, ORF1A, ORF1B, ORF1C и ORF2, и чужеродный ген, вставленный в левый конец, представляет собой mCherry (SEQ ID № 3711 п. о.). Осуществляли верификацию FAd-миды и соответствующих вирусов (фиг. 3В и 3D), которая показывает, что конструкция была правильной. С другой стороны, СРЕ рекомбинантных вирусов наблюдали в клетках CH-SAH, однако инфицированные клетки не проявляли какой-либо флуоресценции mCherry, что указывает на отсутствие экспрессии чужеродного гена, в этом случае mCherry (фиг. 3С).
Как показано на фиг. 2 и 4А, на левом конце генома: от нуклеотида 847 до 2753; удаляли 1906 нуклеотидов. Эта делеция содержит ORF1A, ORF1B, ORF1C и ORF2. Чужеродный ген, вставленный в левый конец, представляет собой mCherry (SEQ ID № 3711 п. о.). Осуществляли верификацию FAd-миды и соответствующих вирусов (фиг. 4В и 4D), которая показывает, что конструкция была правильной. Клетки CH-SAH, инфицированные рекомбинантными вирусами, демонстрировали флуоресценцию mCherry, что указывает на экспрессию чужеродного гена, в этом случае mCherry (фиг. 4С).
Как показано на фиг. 5 и 7А, на правом конце генома: от нуклеотида 38807 до 42398; удаляли 3591 нуклеотид. Эта делеция содержит TR-2, ORF17 и ORF11. Чужеродный ген, вставленный в левый конец, представляет собой EGFP (SEQ ID № 2 1602 п. о.). Осуществляли верификацию FAd-миды и соответствующих вирусов (фиг. 7В и 7D), которая показывает, что конструкция была правильной. Клетки CHSAH, инфицированные рекомбинантными вирусами, демонстрировали флуоресценцию EGFP, что указывает на экспрессию чужеродного гена, в этом случае EGFP (фиг. 7С).
Как показано на фиг. 8А, на левом конце генома: от нуклеотида 847 до 2753; удаляли 1906 нуклеотидов. Эта делеция содержит ORF1A, ORF1B, ORF1C и ORF2. На правом конце генома: от нуклеотида
- 18 043809
38807 до 42398; удаляли 3591 нуклеотид. Эта делеция содержит TR-2, ORF17 и ORF11. Чужеродный ген, вставленный в левый конец, представляет собой mCherry (SEQ ID № 3711 п. о.). Чужеродный ген, вставленный в правый конец, представляет собой EGFP (SEQ ID № 2, 1602 п. о.). Осуществляли верификацию FAd-миды и соответствующих вирусов (фиг. 8В и 8D), которая показывает, что конструкция была правильной. Клетки CH-SAH, инфицированные рекомбинантными вирусами, демонстрировали флуоресценцию mCherry и EGFP, что указывает на экспрессию чужеродных генов (фиг. 8С).
На фиг. 6 представлен дополнительный вектор на основе делеции ORF17, расположенной на правом конце генома FAdV-9, в качестве логического и системного развития векторной системы.
В приведенном выше можно видеть, что когда удаляют ORF0, нативный ранний промотор не функционирует, поскольку не наблюдают экспрессию чужеродного гена (например, m-Cherry). Однако экспрессия генов-репортеров происходит, когда используют экзогенный (чужеродный) промотор (CMV) (Corredor and Nagy, 2010b). Когда удаляют только ORF1 и ORF2, нативный промотор работает и наблюдают экспрессию чужеродного гена-репортера.
На фиг. 9 представлены рекомбинантные вирусы на основе FadV-9 с генами-репортерами. В частности, на этой фиг. приведена сводка и линейное представление для фиг. 4, 6, 7 и 8, где линия pFAdV-9RED представляет фиг. 4, линия pFAdV-9-A17 представляет фиг. 6, линия pFAdV-9-EGFP представляет фиг. 7, линия pFAdV-9-Dual представляет фиг. 8.
Соответственно, авторы изобретения успешно заменяли ORF 0-2, ORF 1-2 и TR2-ORF 17-11 в FAdV-9 на гены-репортеры. Наблюдали, что ранний нативный промотор левого конца FAdV может управлять экспрессией чужеродного трансгена. Кроме того, демонстрировали стабильность большой делеции в правом конце в TR2, вопреки предыдущим исследованиям. Следовательно, FAdV-9 с делециями на левом конце и правом конце FAdV-9 можно использовать в качестве поливалентных рекомбинантных FAdV-9 вирусов, которые могут иметь применения для создания вирусов с двойной экспрессией, подходящих для вакцинных векторов.
Праймеры, используемые в этом исследовании, раскрыты в табл. 5.
Таблица 5
| Название | Последовательность (5'-3') | Местоположен ие | Цель |
| ORFl-2Ver-F | gcacagtcccaatggctt (SEQ ID № 42) | Pei et al.,2015 | ORFl-2Ver-F |
| ORFl-2Ver-R | aaattctggtccgttaccga (SEQ ID № 43) | Pei et al.,2015 | |
| TR2-17llVerF | GCCTACTCCTCAGCCTATCAC (SEQ ID № 44) | 38163-38184 | верификация |
| TR2-17llVerR | CAGTCCTCTAACGAGCACGC (SEQ ID № 45) | 43113-43133 | верификация |
| CAT-F | GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID № 46) | Верификация | |
| ORFlCATSwal- F | ggacgtgctttaggtaatttcctccg (SEQ ID № 47) Ttctttttcccgtttaggtgaggag(SEQ ID № 48) | 796-846 | Удалены ORF1, 1А, IB, IC, RF2 0 Введен SwaI |
- 19 043809
| AT T TAAATgtgtaggc tggagc tgc ttc (SEQ ID № 49) | |||
| ORF2CATSwaI- R | gcgttctgagtctttattggtaa- (SEQ ID № 50) actcgaaacacgcgtcacacgcgc- (SEQ ID № 51) ATTTAAATcatatgaatatcctccttagtt c (SEQ ID № 52) | Pei et al.,2015 | |
| TR2-17- 11CAT-F | ccccctggcggccgttggccgccactg (SEQ ID № 53) Cacccgcgccggacttagtctct (SEQ ID № 54) T T TAAATgtgtaggc tggagc tgc ttc (SEQ ID № 55) | 38757-38806 | Удалены TR2, ORF17, ORF11 Введен SwaI |
| TR2-17- 11CAT-R | agtagagattataggaagcggggatta (SEQ ID № 56) Tagtggtttttatttaaacgaga (SEQ ID № 57) ATTTAAATcatatgaatatcctccttagtt c (SEQ ID № 58) | 42399-42448 | |
| ORF17CATSwaI -F | tccccctggcggccgagggccgcca (SEQ ID № 59) Ctgcacccgcgccggacttagtctct (SEQ ID № 60) AT T TAAATgtgtaggc tggagc tgc ttc (SEQ ID № 61) | 40511-40561 | Delete ORF17 |
| ORF17CATSwaI -R | gatacgaagaaggataggagcagaat (SEQ ID № 62) Cgaggatacggtagttgactcc (SEQ ID № 63) ATATTTAAATcatatgaatatcctccttag ttc (SEQ ID № 64) | 41461-41502 | |
| EGFPcaSwal-F | a gc t gcAT T TAAATatattaccgccatgca ttag (SEQ ID № 65) | Pei et al. , 2015 | |
| EGFPcaSwal-R | agct gcAT T T AAAT ccacaactacfaatcfca ata (SEQ ID № 66) | Pei et al. , 2015 | |
| mCherry-F | agctgcATTTAAATATGGTGAGCAAGGGCG AGGAGG (SEQ ID № 67) | амплифицировать mCherry | |
| mCherry-R | agctgcATTTAAATCTACTTGTACAGCTCG TCCATGCCG (SEQ ID № 68) | Кодирующая последовательно сть |
Сайты SwaI представлены заглавными буквами.
Последовательности полужирным специфичны для хлорамфениколовой кассеты.
Подчеркнутые последовательности специфичны для pN1-EGFP, местоположение на основе pEGFPN1.
Последовательности курсивом представляют собой дополнительные нуклеотиды для SwaI расщепления.
Пример 3. Результаты.
3.1. Экспрессия EGFP в трансфицированных клетках CH-SAH.
3.1.1. Клонирование двойных экспрессирующих конструкций.
Двойную экспрессирующую систему создавали с использованием EGFP и люциферазы светлячка (экспрессируемой под управлением промотора SV40) для того, чтобы сравнивать эффект различных промоторных и энхансерных элементов, оказываемый на экспрессию EGFP in vitro. Коммерческая плазмида pCI-Neo (Promega), содержащая промотор CMV, представляет собой каркас для двойной экспрессирующей системы. Промотор CMV (944 п. о.) впоследствии удаляли с использованием RE расщепления SpeI и EcoRI. После очистки в геле, оба промотора CAG (1701 п. о.) и EF1a (1507 п. о.) направленно субклонировали в каркас pCI-Neo, используя SpeI и EcoRI. Литированный продукт трансформировали в компетентные бактериальные клетки и отбирали колонии, скрининг которых осуществляли с помощью RE расщепления (результаты не представлены) и которые подтверждали посредством секвенирования. Этот процесс повторяли с обоими промоторами β-актина (285 п. о.) и L2R (120 п. о.). В праймеры вставляли сайты RE для SpeI и EcoRI, и оба промотора ПЦР амплифицировали из плазмидной ДНК. Полосу 730 п. о., соответствующую EGFP, ПЦР амплифицировали с использованием праймеров, содержащих сайты EcoRI и NotI. Продукт ПЦР направленно клонировали в каждую промоторную плазмиду, трансформированную в компетентные бактериальные клетки, и осуществляли подтверждение посредством ПЦР (данные не представлены) и секвенирования. Наконец, люциферазу светлячка (1712 п. о.) ПЦР амплифицировали с использованием праймеров, содержащих RE сайты AvrII и BstBI. Затем плазмидную ДНК, содержащую EGFP под управлением каждого промотора, расщепляли с использованием AvrII и BstBI, чтобы удалять ген устойчивости к неомицину, и люциферазу направленно клонировали на его место. Присутствие люциферазы в каждой плазмиде подтверждали с помощью ПЦР (результаты не представлены) и секвенирования. Это давало двойные экспрессирующие плазмиды: pCMV-EGFP-Luc, pCAGEGFP-Luc, pEF1a-EGFP-Luc, рβактин-EGFP-Luc и pL2R-EGFP-Luc (фиг. 11). Создавали 5 дополнитель
- 20 043809 ных плазмид, чтобы включать энхансерный элемент WPRE. Полосу 543 п. о., соответствующую WPRE, ПЦР амплифицировали с использованием праймеров, содержащих сайт NotI. Каждую двойную экспрессирующую плазмиду линеаризовали с использованием NotI и элемент WPRE ненаправленно клонировали в каждую. Скрининг надлежащей ориентации осуществляли с помощью ПЦР (данные не представлены) и плазмиды подтверждали посредством секвенирования, что давало двойные экспрессирующие плазмиды: pCMV-EGFP-WPRE-Luc, pCAG-EGFP-WPRE-Luc, pEF1a-EGFP-WPRE-Luc, рвактин-EGFPWPRE-Luc и pL2R-EGFP-WPRE-Luc (фиг. 13).
3.1.2. Профили экспрессии промоторов, наблюдаемые посредством флуоресцентной микроскопии.
Клетки CH-SAH трансфицировали двойными экспрессирующими конструкциями, чтобы проследить профили экспрессии EGFP в течение 72 ч. п. т. посредством флуоресцентной микроскопии (фиг. 14). Самую раннюю экспрессию EGFP отмечали через 12 ч. п. т. с помощью плазмид CMV, CMV-WPRE, CAG и CAG-WPRE, причем уровни экспрессии возрастали с течением времени. Обе конструкции EF1a и EF1a-WPRE начинали экспрессировать EGFP между 24 и 36 ч. п. т. и устойчиво сохраняли экспрессию с течением времени. Конструкции, содержащие промоторы β-актина или L2R, экспрессировали EGFP слабее всего в клетках CH-SAH, причем экспрессия начиналась через 36 и 60 ч. п. т., соответственно. Все конструкции сравнивали с имитацией трансфицированных клеток (отрицательный контроль) и положительным контролем трансфицированных pEGFP-N1 клеток (данные не представлены).
3.1.3. Нормализованная экспрессия промоторных конструкций.
Двойные экспрессирующие конструкции трансфицировали в клетки CH-SAH и экспрессию трансгена измеряли в течение 72 ч. п. т. Флуоресценцию EGFP измеряли посредством флуорометрии в каждый момент времени, при этом люминесценцию люциферазы измеряли с использованием набора Peirce Firefly Luciferase Glow Assay (Thermo Fisher Scientific). Чтобы лучше анализировать экспрессию EGFP, управляемую каждым промотором/энхансерным элементом, и чтобы минимизировать вариации от образца к образцу, экспрессию люциферазы из каждого образца использовали для нормализации результатов (Schagat et al., 2007). Данные анализировали посредством вычисления кратности изменения каждой конструкции в каждый конкретный момент времени после трансфекции по отношению к промотору CMV (табл. 6). Нормализованная экспрессия каждой конструкции через 12-72 ч. п. т. представлена на фиг. 15. Через 12 ч. п. т. наблюдали значительное снижение экспрессии конструкциями EF1a, EF1aWPRE, в-актин-WPRE и L2R-WPRE по сравнению с CMV. Конструкции CMV-WPRE и CAG имели повышенную экспрессию через 12 ч. п. т., однако это не было значимо. Более выраженные различия в профилях экспрессии наблюдали между 24 и 72 ч. п. т. В целом, все конструкции демонстрировали сниженную активность с течением времени по сравнению с CMV контролем. Через 12 и 24 ч. п. т. конструкция CMV-WPRE демонстрировала повышенную кратность изменения 1,047 относительно одного CMV, хотя различия не были значимы. Между 36 и 60 ч. п. т. CMV-WPRE демонстрировала слегка сниженную кратность изменения в диапазоне от 0,851 до 0,922. Значимое снижение экспрессии удаляли через 72 ч. п. т., когда CMV-WPRE демонстрировала более низкий уровень активности 64% по сравнению с CMV контролем, и эта разница была значимой. Для каждой из оставшихся конструкций экспрессия значительно ниже, чем у CMV, во все моменты времени, где Р<0,05. Конструкции, содержащие кассеты CAG и CAGWPRE постоянно экспрессировали в диапазоне приблизительно 50% и 40%, соответственно, по сравнению с CMV, от 24 ч. п. т. Аналогичным образом, обнаружено, что конструкции, содержащие кассеты EF1a и EF1a-WPRE, имеют сниженный уровень активности по сравнению с CMV и экспрессируют в диапазоне около 20%. Остальные конструкции, содержащие промоторы β-актина и L2R, имели уровни активности меньше 10% от такового у CMV.
3.2. Создание рекомбинантных FAdV-9A4.
3.2.1. Клонирование конструкций pHMR.
Для того чтобы анализировать активность промотора и активность WPRE в контексте репликации FAdV, создавали рекомбинантные FAdV, содержащие наиболее эффективные EGFP экспрессирующие кассеты, придерживаясь модифицированного способа Corredor и Nagy (2010b). Фрагмент 477 п. о. (VF1) слева от сайта делеции FAdV-9A4 ПЦР амплифицировали и направленно клонировали в pCMV-EGFPLuc, pCMV-EGFP-WPRE-Luc, pCAG-EGFP-Luc, pCAG-EGFP-WPRE-Luc, pEF1 α-EGFP-Luc и pEF1aEGFP-WPRE-Luc. Впоследствии фрагмент 1609 п. о. (VF2) справа от сайта делеции FAdV-9A4 ПЦР амплифицировали и клонировали в каждую плазмиду, что давало промежуточные плазмиды: pHMR-CMVEGFP, pHMR-CMV-EGFP-WPRE, pHMR-CAG-EGFP, pHMR-CAG-EGFP-WPRE, pHMR-EF1 α-EGFP и pHMR-EF1 α-EGFP-WPRE (фиг. 16). Успешное клонирование определяли с помощью ПЦР скрининга и секвенирования.
Промежуточные конструкции подвергали ПЦР или RE расщеплению с использованием BglII/BamHI, чтобы выделять промоторные кассеты EGFP, фланкированные фрагментами вирусной ДНК, для использования в гомологичной рекомбинации с pFAdV-9A4 (FAd-мида). При гомологичной рекомбинации создавали окончательные FAd-миды: pFAdV-9A4-CMV-EGFP, pFAdV-9A4-CMV-EGFPWPRE, pFAdV-9A4-CGA-EGFP, pFAdV-9A4-CAG-EGFP-WPRE, pFAdV-9A4-EF1 α-EGFP и pFAdV-9A4
- 21 043809
EF1a-EGFP-WPRE. Успешную рекомбинацию определяли посредством секвенирования и скрининга расщеплением NotI (фиг. 17). Расщепленная pFAdV-9A4 давала полосы 4 т. о., 5,1 т. о., 13,7 т. о. и 23,8 т. о. FAd-миды, содержащие CMV кассеты, идентифицировали по диагностической полосе 2,2 т. о., соответствующей промотору CMV плюс ген EGFP и хвост полиА SV4 0. FAd-миды, содержащие CAG кассеты, идентифицировали по диагностической полосе 2,9 т. о., а EF1a по диагностической полосе 2,7 т. о. Дополнительные полосы 550 п. о. присутствовали в FAd-мидах, содержащих элемент WPRE. Эти FAdмиды трансфицировали в клетки CH-SAH для того, чтобы создавать соответствующие вирусы.
3.2.2. Кинетика роста вируса.
Кинетику роста вируса сравнивали среди шести рекомбинантных вирусов и эталонного FAdV-9A4 для того, чтобы определять, влияет ли добавление какой-либо промоторной кассеты EGFP на репликацию и рост вируса. Титр и рост вируса для всех recFAdV, похоже, придерживался паттерна, схожего с FAdV-9A4, за исключением того, что FAdV-9A4-CAG-EGFP и FAdV-9A4-EF1a-EGFP росли до титра в половину log ниже эталона, начиная с 24 ч. п. и. (фиг. 18). Вирусы росли до следующих титров; FAdV9A4=2,4x108 БОЕ/мл, FAdV-9A4-CMV-EGFP=4, 8x108 БОЕ/мл, FAdV-9A4-CAG-EGFP=8,3x107 БОЕ/мл, FAdV-9A4-EF1a-EGFP=8, 2x107 БОЕ/мл, FAdV-9A4-CMV-EGFP-WPRE=3,1x108 БОЕ/мл, FAdV-9A4CAG-EGFP-WPRE=3,0x108 БОЕ/мл и FAdV-9A4-EF1a-EGFP=3,7x108 БОЕ/мл. Проявление СРЕ (фиг. 19) и морфология бляшек (не показано) у recFAdV схожи с FAdV-9A4 в том, клетки округлялись и откреплялись на 5-7 с. п. и. Все recFAdV экспрессировали EGFP, как видно по флуоресцентной микроскопии.
3.3. Активность промотора во время инфекции.
3.3.1. Измерение EGFP посредством спектрофлюорометрии.
Экспрессию EGFP с помощью recFAdV измеряли между 0 и 48 ч. п. и. в клетках CH-SAH. Исходя из спектрофлюорометрии и флуоресцентной микроскопии, экспрессия EGFP для всех рекомбинантных вирусов была низка до 12 ч. п. и. Сильную экспрессию EGFP отмечали между 12 и 30 ч. п. и., но она спадала после 36-48 ч. п. и. Максимальные показания флуоресценции измеряли через 30 ч. п. и. для всех recFAdV (фиг. 20). Клетки, инфицированные FAdV-9A4-CAG-EGFP, демонстрировали самое значительное повышение экспрессии EGFP по сравнению с FAdV-9A4-CMV-EGFP во все моменты времени, в диапазоне от 12 (48 ч. п. и.) до 29 раз (24 ч. п. и.) увеличения экспрессии. FAdV-9A4-EF1a-EGFP инфицированные клетки также имели повышенную экспрессию по сравнению с FAdV-9A4-CMV-EGFP во все моменты времени, при слегка более низком диапазоне от 2 (12 ч. п. и.) до 20 раз (24 ч. п. и.) увеличения экспрессии. Вирусы, которые содержали элемент WPRE, экспрессировали EGFP на более низком уровне по сравнению с их промоторными аналогами. FAdV-9A4-CMV-EGFP-WPRE представлял собой наименее эффективный вирус, со снижением экспрессии от 2,4 (48 ч. п. и.) до 17 раз (36 ч. п. и.) по сравнению с FAdV-9A4-CMV-EGFP. Несмотря на то, что оба FAdV-9A4-CAG-EGFP-WPRE и FAdV-9A4-EF1aEGFP-WPRE менее эффективны, чем их промоторные аналоги, оба вируса усредненно экспрессировали EGFP на более высоком уровне, чем FAdV-9A4-CMV-EGFP. FAdV-9A4-CAG-EGFP-WPRE демонстрировали повышенную экспрессию в диапазоне от 1,3 (48 ч. п. и.) до 4,3 раза (24 ч. п. и.), тогда как экспрессия FAdV-9A4-EF1a-EGFP-WPRE находилась в диапазоне от снижения в 2,5 раза (12 ч. п. и.) до повышения в 3,6 раза (24 ч. п. и.).
3.3.2. Экспрессия EGFP, которую измеряли вестерн-блоттинга.
В дополнение к спектрофлюорометрии, вирусную экспрессию EGFP также исследовали с помощью вестерн-иммуноблота. Собирали цельный клеточный лизат инфицированных клеток через 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36 и 48 ч. п. и. В каждый момент времени 10 мкг общего белка из каждого лизата выделяли с помощью SDS-PAGE, использовали для блоттинга и блот исследовали с использованием антитела против EGFP (фиг. 21). Ожидали молекулярную массу EGFP 27 кДа (Takebe, N., Xu, L., MacKenzie, K. L., Bertino, J. R., Moore, M. A. S. 2002. Отбор долгосрочной культуры с использованием метотрексата инициирует клетки после трансдукции клеток CD34+ ретровирусом, содержащим мутантный ген дигидрофолатредуктазы человека. Cancer Gene Ther. 9(3):308-320). В начальные моменты времени 0 и 6 ч. п. и. не обнаруживали сигнал EGFP от любых recFAdV. Через 12 ч. п. и. обнаруживали полосу, соответствующую EGFP в лизате, собранном после FAdV-9A4-CAG-EGFP инфицированных клеток, которую обнаруживали вплоть до 48 ч. п. и. Клеточные лизаты, собранные после FAdV-9A4-EF1a-EGFP, FAdV-9A4CAG-EGFP-WPRE и FAdV-9A4-EF1a-EGFP-WPRE, также давали поддающуюся обнаружению полосу EGFP от 18 до 36 ч. п. и. В отличие от этого, полосы EGFP не наблюдали для инфицированных FAdV9A4-CMV-EGFP и FAdV-9A4-CMV-EGFP-WPRE лизатов в любые моменты времени. Отрицательные контроли, инфицированный FAdV-9A4 лизат и имитация инфицированного лизата не давали сигнал для EGFP на протяжении всего времени. Трансфицированные клетки СН-SAH, содержащие EGFP положительную плазмиду под управлением промотора CMV, pEGFP-N1, давали положительный сигнал от 12 ч. п. т. и далее. В каждый момент времени блоты исследовали антителом против актина, чтобы показать относительные уровни равной нагрузки всех образцов. Уровни актина выглядели схожими в каждый момент времени, что говорит о равной нагрузке, однако через 48 ч. п. и. актин не обнаруживали в инфицированных вирусом лизатах.
- 22 043809
Таблица 6
Кратность изменения активности промотора в трансфицированных клетках CH-SAH в различные часы после трансфекции по отношению к промотору CMV. Значимую активность определяют по Р-значению <0,05
| Момент времени (ч. п. т.) | Промотор | кратность Δ | SD | Р-значение |
| 12 | CMV | 1,0 | - | - |
| CMV-WPRE | 1,047 | 0,245 | 0,7526 | |
| CAG | 1,483 | 1,735 | 0,5506 | |
| CAG-WPRE | 0,479 | 0,370 | 0,0717 | |
| EFla | 0,610 | 0,184 | 0,0015 | |
| EFla-WPRE | 0,313 | 0,117 | 0,0005 | |
| β-актин | 0,772 | 0,418 | 0,2587 | |
| β-актин-WPRE | 0,357 | 0,097 | 0,0003 | |
| L2R | 0,566 | 0,528 | 0,1654 | |
| L2R-WPRE | 0,134 | 0,095 | 0,0001 | |
| 24 | CMV | 1,0 | - | - |
| CMV-WPRE | 1,047 | 0,116 | 0,5177 | |
| CAG | 0,409 | 0,116 | 0,0001 | |
| CAG-WPRE | 0,294 | 0,039 | 0,0001 | |
| EFla | 0,156 | 0,076 | 0,0001 | |
| EFla-WPRE | 0,087 | 0,018 | 0,0001 | |
| β-актин | 0,074 | 0,042 | 0,0001 | |
| β—актин—WPRE | 0,042 | 0,043 | 0,0001 | |
| L2R | 0,028 | 0,016 | 0,0001 | |
| L2R-WPRE | 0,010 | 0,002 | 0,0001 | |
| 36 | CMV | 1,0 | - | - |
| CMV-WPRE | 0,894 | 0,156 | 0,3078 | |
| CAG | 0,560 | 0,331 | 0,0180 | |
| CAG-WPRE | 0,387 | 0,139 | 0,0016 | |
| EFla | 0,196 | 0,057 | 0,0001 | |
| EFla-WPRE | 0,124 | 0,063 | 0,0001 | |
| β-актин | 0,056 | 0,037 | 0,0001 | |
| β-aKTHH-WPRE | 0,015 | 0,007 | 0,0001 | |
| L2R | 0,014 | 0,013 | 0,0001 | |
| L2R-WPRE | 0,002 | 0,001 | 0,0001 | |
| 48 | CMV | 1,0 | - | - |
| CMV-WPRE | 0,922 | 0,135 | 0,3758 | |
| CAG | 0,431 | 0,036 | 0,0001 | |
| CAG-WPRE | 0,303 | 0,050 | 0,0001 | |
| EFla | 0,187 | 0,063 | 0,0001 | |
| EFla-WPRE | 0,085 | 0,022 | 0,0001 | |
| β-актин | 0,032 | 0,017 | 0,0001 | |
| β-aKTHH-WPRE | 0,013 | 0,005 | 0,0001 | |
| L2R | 0,015 | 0,014 | 0,0001 | |
| L2R-WPRE | 0,001 | 0,001 | 0,0001 | |
| 60 | CMV | 1,0 | - | - |
| CMV-WPRE | 0,851 | 0,123 | 0,1039 | |
| CAG | 0,572 | 0,257 | 0,1423 | |
| CAG-WPRE | 0,392 | 0,191 | 0,0053 | |
| EFla | 0,254 | 0,054 | 0,0026 | |
| EFla-WPRE | 0,124 | 0,021 | 0,0001 | |
| β-актин | 0,033 | 0,007 | 0,0001 | |
| β-aKTHH-WPRE | 0,015 | 0,004 | 0,0001 | |
| L2R | 0,002 | 0,001 | 0,0001 | |
| L2R-WPRE | 0,001 | 0,001 | 0,0001 | |
| 72 | CMV | 1,0 | - | - |
| CMV-WPRE | 0,643 | 0,056 | 0,0004 | |
| CAG | 0,591 | 0,137 | 0,0521 | |
| CAG-WPRE | 0,434 | 0,164 | 0,0040 | |
| EFla | 0,296 | 0,082 | 0,0067 | |
| EFla-WPRE | 0,234 | 0,119 | 0,0004 | |
| β-актин | 0,030 | 0,002 | 0,0001 | |
| β-aKTHH-WPRE | 0,028 | 0,018 | 0,0001 | |
| L2R | 0,002 | 0,001 | 0,0001 | |
| L2R-WPRE | 0,003 | 0,003 | 0,0001 |
Пример 4. Другие варианты осуществления рекомбинантного FAdV-9.
На фиг. 22 представлены другие варианты осуществления рекомбинантного FAdV-9, в которых на левом конце генома ORF1 и 2 удаляют и заменяют на НА из кодирующих последовательностей Н7 и в которых на правом конце генома ORF19, ORF11 или TR2 удаляют и заменяют на кассету HN, HN-IRESHA из кассеты Н5 или НА из кассеты Н5, где IRES (внутренний участок посадки рибосомы) делает возможной инициацию трансляцию в середине последовательности информационной РНК (мРНК) в качестве части более общего процесса синтеза белка. Используют IRES (SEQ ID № 41) из канадского изолята вируса энцефаломиелита птиц (AEV-IRES).
- 23 043809
Хотя настоящее раскрытие описано со ссылкой на то, что в настоящее время считают предпочтительными примерами, следует понимать, что раскрытие не ограничено раскрытыми примерами. Напротив, раскрытие предназначено для того, чтобы охватывать различные модификации и эквивалентные компоновки, включенные в сущность и объем приложенной формулы изобретения.
Все публикации, последовательности, патенты и патентные заявки включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме в той же степени, как если бы конкретно и индивидуально указали, что каждая индивидуальная публикация, последовательность, патент или патентная заявка включена по ссылке в полном объеме.
Литература:
Huebner, R.J., Rower W.P., Schatten, W.E., Smith, R.R, & Thomas, L.B. (1956) . Studies on the use of viruses in the treatment of carcinoma of the cervix. Cancer 9(6), 1211-1218;
Cody, J. J. & Douglas, J. T. (2009) . Armed replicating adenoviruses for cancer virotherapy. Cancer Gene Ther 16, 473488;
Yamamoto, M. & Curiel, D. T. (2010). Current issues and future directions of oncolytic adenoviruses. Mol Ther 18, 2432 50;
Lasaro, M. O. & Ertl, H. C. J. (2009) . New Insights on Adenovirus as Vaccine Vectors. Molecular Therapy 17, 1333-1339;
Buchbinder, S. P., Mehrotra, D. V., Duerr, A., Fitzgerald, D. W., Mogg, R., Li, D., Gilbert, P. B., Lama, J. R., Marmor, M. & other authors. (2008). Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet 372, 1881-1893;
McElrath, M. J., De Rosa, S. C., Moodie, Z., Dubey, S., Kierstead, L., Janes, H., Defawe, 0. D., Carter, D. K., Hural, J. & other authors. (2008) . HIV-1 vaccine-induced immunity in the test-of-concept Step Study: a case-cohort analysis. Lancet 372, 1894-1905;
Cody & Douglas, 2009; Gallo, P., Dharmapuri, S., Cipriani, B. & Monaci, P. (2005) . Adenovirus as vehicle for anticancer genetic immunotherapy. Gene Ther 12, S84-S91;
Shashkova, E. V., Cherenova, L. V., Kazansky, D. B. & Doronin, K. (2005) . Avian adenovirus vector CELO-TK displays anticancer activity in human cancer cells and suppresses established murine melanoma tumors. Cancer Gene Ther 12, 61762 6;
Barouch, D. H. (2008). Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature 455, 613-619;
Sharma, A., Tandon, M., Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Vemulapalli, R. & Mittal, S. K. (2009). Evaluation of CrossReactive Humoral and Cell-Mediated Immune Responses among Human, Bovine and Porcine Adenoviruses. Molecular Therapy 17, 113;
Adair, B. & Fitzgerald, S. (2008). Group I Adenovirus
Infections. In Diseases of Poultry, 12th ed, pp. 252-266. Edited by Y. Saif, A. Fadly, J. Glisson, L. McDougald, L. Nolan & D.
Swayne. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell;
Benko, M., Harrach, B., Both, G., Russell, W., Adair, B.,
Adam, Ё., de Jong, J., Hess, M., Johnson, M. & other authors.
(2005) . Family Adenoviridae. In Virus taxonomy Eighth report of
-
Claims (27)
- the International Committee on the Taxonomy of Viruses, pp. 213228. Edited by C. Fauquet, M. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger & L. Ball. San Diego, CA: Elsevier Academic Press;Corredor, J. C. & Nagy, E. (2010b) . The non-essential left end region of the fowl adenovirus 9 genome is suitable for foreign gene insertion/replacement. Virus Res 149, 167-174;Ojkic, D. & Nagy, E. (2003). Antibody response and virus tissue distribution in chickens inoculated with wild-type and recombinant fowl adenoviruses. Vaccine 22, 42-48;Francois, A., Chevalier, C., Delmas, B., Eterradossi, N., Toquin, D., Rivallan, G. H. & Langlois, P. (2004). Avian adenovirus CELO recombinants expressing VP2 of infectious bursal disease virus induce protection against bursal disease in chickens. Vaccine 22, 2351-2360;Sheppard, M., Werner, W., Tsatas, E., McCoy, R., Prowse, S. & Johnson, M. (1998). Fowl adenovirus recombinant expressing VP2 of infectious bursal disease virus induces protective immunity against bursal disease. Arch Virol 143, 915-930;Johnson, M. A., Pooley, C., Ignjatovic, J. & Tyack, S. G. (2003). A recombinant fowl adenovirus expressing the SI gene of infectious bronchitis virus protects against challenge with infectious bronchitis virus. Vaccine 21, 2730-2736;Chiocca, S., Kurzbauer, R., Schaffner, G., Baker, A., Mautner, V. & Cotten, M. (1996) . The complete DNA sequence and genomic organization of the avian adenovirus CELO. J Virol 70, 2939-2949;Ojkic, D. & Nagy, E. (2000) . The complete nucleotide sequence of fowl adenovirus type 8. J Gen Virol 81, 1833-1837;Corredor, J. C., Garceac, A., Kreil, P. J. & Nagy, E. (2008). Sequence comparison of the right end of fowl adenovirus genomes. Virus genes 36, 331-344;Corredor, J. C., Kreil, P. J. & Nagy, E. (2006). Sequence analysis of the left end of fowl adenovirus genomes. Virus genes 33, 95-106;Bangari, D. S. & Mittal, S. K. (2006). Development of nonhuman adenoviruses as vaccine vectors. Vaccine 24, 849-862;Ferreira, T. B., Alves, P. M., Aunins, J. G. & Carrondo, M. J. T. (2005). Use of adenoviral vectors as veterinary vaccines. Gene Ther 12, S73-S83;Corredor, J. C. & Nagy, E. (2010a) A region at the left end of the fowl adenovirus 9 genome that is non-essential in vitro has consequences in vivo. J Gen Virol 91(1), 51-58;ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Рекомбинантный вирусный вектор из аденовируса 9 птиц (FAdV-9), который включает по меньшей мере одну делецию несущественной области, выбранной из ORF19 и ORF17.
- 2. FAdV-9 вектор по п.1, где вектор включает делецию OFR17.
- 3. FAdV-9 вектор по п.1, где вектор включает делецию OFR19.
- 4. FAdV-9 вектор по п.1, где вектор включает делецию OFR17 и OFR19.
- 5. FAdV-9 вектор по любому из пп.1-4, где вектор дополнительно включает делецию одной или нескольких из следующих несущественных областей: ORF0, ORF1, ORF2, TR2 и ORF11.
- 6. FAdV-9 вирусный вектор по п.5, где вектор содержит нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой удалены нуклеотиды с 575 до 2753 и с 38807 до 42398.
- 7. FAdV-9 вирусный вектор по п.5, где вектор содержит нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, где удалены нуклеотиды с 847 до 2753 и с 38807 до 42398.
- 8. FAdV-9 вирусный вектор по п.5, где вектор содержит нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой удалены нуклеотиды с 847 до 2753 и с 34220 до 36443.
- 9. FAdV-9 вирусный вектор по п.5, где вектор содержит нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательностей с последовательностью, представленной в SEQ ID № 1, в которой уда-- 25 043809 лены нуклеотиды с 847 до 2753, с 34220 до 36443 и с 38807 до 40561 или в которой удалены нуклеотиды с 847 до 2753, с 34220 до 36443 и с 41461 до 42398.
- 10. FAdV-9 вирусный вектор по любому из пп.1-9, содержащий одну или несколько экзогенных нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или несколько полипептидов, представляющих интерес.
- 11. FAdV-9 вирусный вектор по п.10, где вектор представляет собой двойной вектор, содержащий две экзогенные нуклеотидные последовательности, кодирующие два полипептида, представляющие интерес.
- 12. FAdV-9 вирусный вектор по любому из пп.1-10, содержащий экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один антиген.
- 13. FAdV-9 вирусный вектор по п.12, в котором экзогенная нуклеотидная последовательность кодирует антигенные последовательности против заболевания, выбранного из гриппа, инфекционного ларинготрахеита, инфекционного бронхита, инфекционного бурсита (Гумборо), гепатита, вирусного ринотрахеита, инфекционного катара, Mycoplasma hyopneumonieae, пастереллеза, респираторнорепродуктивного синдрома свиней (PRRS), цирковируса, бордетеллиоза, парагриппа и какого-либо другого антигена, размер которого позволяет вставлять его в соответствующий вирусный вектор.
- 14. FAdV-9 вирусный вектор по п.13, в котором экзогенная нуклеотидная последовательность кодирует антигенные последовательности против заболевания, выбранного из птичьего гриппа, ларинготрахеита (LT), заболевания Ньюкасла (NDV), инфекционной анемии, гепатита с тельцами включения, инфекционного бронхита (IB), метапневмовируса (MPV) и Гумборо.
- 15. FAdV-9 вирусный вектор по п.13, в котором экзогенная нуклеотидная последовательность содержит последовательность, соответствующую по меньшей мере одной последовательности, выбранной из SEQ ID №№ 10-21, или ее гомологу.
- 16. Вирусный вектор по любому из пп.10-15, в котором экзогенная нуклеотидная последовательность функционально связана с контрольной последовательностью.
- 17. Вирусный вектор по п.16, в котором контрольная последовательность является последовательностью промотора.
- 18. Клетка-хозяин, содержащая вирусный вектор по любому из пп.1-17.
- 19. Способ получения вирусного вектора по любому из пп.10-17, включающий стадии:а) вставки экзогенной нуклеотидной последовательности в вирусный вектор по п.1 с получением инфекционного клона;b) введения инфекционного клона, полученного таким образом, в подходящую клеточную линию;c) поддержания подходящей клеточной линии для получения вирусного вектора.
- 20. Способ по п.19, дополнительно включающий амплификацию экзогенной нуклеотидной последовательности перед вставкой экзогенной нуклеотидной последовательности в вирусный вектор.
- 21. Способ по п.19 или 20, в котором экзогенная нуклеотидная последовательность кодирует антигенные последовательности против заболевания, выбранного из гриппа, инфекционного ларинготрахеита, инфекционного бронхита, инфекции фабрициевой сумки (Гумборо), гепатита, вирусного ринотрахеита, инфекционного катара, Mycoplasma hyopneumonieae, пастереллеза, респираторно-репродуктивного синдрома свиней (PRRS), цирковируса, бордетеллиоза, парагриппа и какого-либо другого антигена, размер которого позволяет вставлять его в соответствующий вирусный вектор.
- 22. Способ по п.19 или 20, в котором экзогенная нуклеотидная последовательность кодирует антигенные последовательности против заболевания, выбранного из птичьего гриппа, ларинготрахеита (LT), заболевания Ньюкасла (NDV), инфекционной анемии, телец включения, инфекционного бронхита (IB), метапневмовируса (MPV) и Гумборо.
- 23. Способ по п.19 или 20, в котором экзогенный нуклеотид содержит последовательность, соответствующую по меньшей мере одной последовательности, выбранной из SEQ ID №№ 10-21, или ее гомологу.
- 24. Иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере FAdV-9 вирусный вектор по любому из пп.1-17 с экзогенной нуклеотидной последовательностью, кодирующей по меньшей мере один антиген, вставленный в него.
- 25. Иммуногенная композиция по п.24, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
- 26. Иммуногенная композиция по п.24 или 25, дополнительно содержащая адъювант.
- 27. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.24-26 в создании иммуногенного ответа у пациента.-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/190,913 | 2015-07-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA043809B1 true EA043809B1 (ru) | 2023-06-26 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210317476A1 (en) | Fowl adenovirus 9 (fadv-9) vector system and associated methods | |
| RU2692013C2 (ru) | Улучшенная вакцина против nd-ibd на основе вектора hvt | |
| CN109715219B (zh) | 犬腺病毒载体 | |
| KR102070217B1 (ko) | 다가 재조합 조류 헤르페스 바이러스 및 조류 종을 면역화하기 위한 백신 | |
| ES2399845T3 (es) | Herpesvirus de pavo vectorial recombinante que contiene genes de la influencia aviar | |
| CA2830305C (en) | Non-pathogenic serotype 4 fowl adenovirus (fadv-4) and viral vector thereof | |
| CA2955306C (en) | Human cytomegalovirus comprising exogenous antigens | |
| KR20200002834A (ko) | 이종 조류 병원체 항원을 암호화하는 재조합 갈리드 헤르페스바이러스 3형 백신 | |
| US10758608B2 (en) | Vaccine in the form of a recombinant sero type 9 avian adenovirus vector | |
| US20220177921A1 (en) | Gene therapy using genetically modified viral vectors | |
| JP6210998B2 (ja) | ベクターワクチンおよび生ワクチンの併用による感染症の予防方法 | |
| EP1467753A2 (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and use thereof | |
| Zhang et al. | Construction of recombinant Marek's disease virus (MDV) lacking the meq oncogene and co-expressing AIV-H9N2 HA and NA genes under control of exogenous promoters | |
| AU767470B2 (en) | Processes for preparation of Marek's disease virus using continuous avian cell lines | |
| Ackford et al. | Foreign gene expression and induction of antibody response by recombinant fowl adenovirus-9-based vectors with exogenous promoters | |
| EA043809B1 (ru) | ВЕКТОРНАЯ СИСТЕМА ИЗ АДЕНОВИРУСА 9 ПТИЦ (FAdV-9) И СВЯЗАННЫЕ СПОСОБЫ | |
| RU2777400C2 (ru) | Рекомбинантные непатогенные конструкции вируса болезни марека, кодирующие антигены вируса инфекционного ларинготрахеита и вируса инфекционного бурсита | |
| Ackford | Optimizing Foreign Gene Expression in Recombinant Fowl Adenovirus 9 Vectors | |
| JPH06141853A (ja) | 組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス及びその製法 | |
| BR112020017239A2 (pt) | Sistemas de vetor viral recombinante que expressam genes de paramixovírus felino exógenos e vacinas feitas a partir deles | |
| Amortegui | Sequence comparison of a bacterial artificial chromosome (BAC)-based infectious clone of the CVI988 (Rispens) strain of Marek's disease virus (CVI988-699-2) to a back-passaged isolate that has reverted to virulence (CVI988-699-2 RV) | |
| JPH07255488A (ja) | 組換えマレック病ウイルスおよびその作出法 |