TR201802741T4 - Rekombinant hcmv ve rhcmv vektörleri ve bunların kullanımları. - Google Patents

Rekombinant hcmv ve rhcmv vektörleri ve bunların kullanımları. Download PDF

Info

Publication number
TR201802741T4
TR201802741T4 TR2018/02741T TR201802741T TR201802741T4 TR 201802741 T4 TR201802741 T4 TR 201802741T4 TR 2018/02741 T TR2018/02741 T TR 2018/02741T TR 201802741 T TR201802741 T TR 201802741T TR 201802741 T4 TR201802741 T4 TR 201802741T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
rhcmv
hcmv
virus
cmv
vector
Prior art date
Application number
TR2018/02741T
Other languages
English (en)
Inventor
PICKER Louis
A Nelson Jay
Frueh Klaus
A Jarvis Michael
g hansen Scott
Original Assignee
Univ Oregon Health & Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2011/029930 external-priority patent/WO2011119920A2/en
Application filed by Univ Oregon Health & Science filed Critical Univ Oregon Health & Science
Publication of TR201802741T4 publication Critical patent/TR201802741T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A61K39/13—Poliovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/869—Herpesviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • C07K14/04—Varicella-zoster virus
    • C07K14/045—Cytomegalovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • C07K14/161—HIV-1 ; HIV-2 gag-pol, e.g. p55, p24/25, p17/18, p7, p6, p66/68, p51/52, p31/34, p32, p40
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • C07K14/162—HIV-1 ; HIV-2 env, e.g. gp160, gp110/120, gp41, V3, peptid T, CD4-Binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • C07K14/163—Regulatory proteins, e.g. tat, nef, rev, vif, vpu, vpr, vpt, vpx
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Burada, rekombinant makak sitomegalovirüs (RhCMV) ve patojene özgü antijenler veya tümör antijenler gibi heterolog antijenleri kodlayan insan sitomegalovirüs (HCMV) vektörleri açıklanmaktadır. Rekombinant vektörler, heterolog antijene özgü yüksek hücresel ve humoral immün yanıtı seviyelerini ortaya koymakta ve sürdürmektedir. Rekombinant RhCMV ve HCMV vektörleri, örneğin bulaşıcı hastalığın veya kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesi için kullanılabilmektedir. Bazı örneklerde, rekombinant RhCMV veya HCMV vektörleri, immünomodüler proteinleri kodlayan genlerde silinmeleri içerebilmektedir. Bazı örneklerde, rekombinant RhCMV veya HCMV vektörleri, bir hücre içerisinde kopyalanabilme, konak içerisinde dağılabilme veya CMV replikasyonu, dağılımı veya yayılımı için temel olan veya arttırıcı olan bir veya birden fazla gende bir silinmeyi içermesi ile konaklar arasında yayılabilme kabiliyetleri açısından eksik veya bozuk olabilmektedir.

Description

TEKNIK ALAN Mevcut bulus, heterolog antijenleri kodlayan ve/veya in Viva büyüme için temel olmayan genlerde eksik olan ve/veya konak içerisinde replikasyonu, dagllîhayEEtkileyen ve konaklar arasIa yayllân genlerde eksik olan ve/veya farklElhücre türlerini (tropizm) hedef alan insan CMV (HCMV) ve makak CMV (RhCMV) vektörleri gibi rekombinant sitomegalovirüs (CMV) vektörlerini açllZlamaktadlE Belirgin olarak, bulus, immün yetmezlik virüsünden (HIV) izole edilen bir insan patojenigine özgü antijeni kodlayan bir nükleik asit sekansIEl/e replikasyon antijeni için temel olan veya replikasyon antijenini hafifleten bir veya birden fazla gende bir silmeyi içeren rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü ile ilgilidir. Bulus aynlîlzamanda bulaslEEhastallglI tedavisi veya önlenmesine yönelik asllâr olarak rekombinant CMV vektörlerinin kullanIiIElaçllZlamaktadlElve özellikle HIV tedavisinin veya onun önlenmesine yönelik asllâr olarak rekombinant CMV vektörlerinin kullanIEile ilgilidir.
FEDERAL FON BULMA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, Ulusal Saglllg Kurumlar Ulusal Alerji ve BulaslEEIl-Iastalllîl Kurumu tarafian numaralarEile ve Ulusal SaglllZl KurumlarII Ulusal Kaynak ArastlEna Merkezi tarafIan verilen RR00163 hibe numarasEile kismen desteklenmistir. Federal hükümetin bu bulusa iliskin bazElhaklarÜJIabilmektedir. ÖNCEKI TEKNIK 1980'Ierin basIa AIDS'in ortaya çilZlgJZEpidemik oldugu için, arastünacilâr, HIV'e yönelik etkili bir aslEllEl gelisimine odaklanmlStlEl Fakat bu çaba, 1) hlZlIslistemik enfeksiyona yol açan patlaylEEllk HIV replikasyonu, 2) dogal ve adaptif baglglEllEl kaçlElnaya araclIlEl eden güçlü genetik mekanizmalar, 3) genetik uyarilîha ve baggilîlilîl kaçlgü4) konak immün süpresyonu ve 5) HIV'in konak genomu içine entegre olabilmesi ve uzun ömürlü hücrelere latent sekilde bulasabilmesi dahil olmak üzere çesitli sebeplerden dolayüorluklarla sarf edilmistir. HIV'nin bu dogal özellikleri, rekombinant proteinleri olarak eksprese edilen veya kopyalanmayan viral vektör ekspresyon sistemleri (ilk destek) ile kombinasyon halinde HIV antijenlerini kullanarak bir koruyucu immün yanElUiretmek Için geleneksel aslZi/aklasIiIlarlEl kullanIiIEtor hale getirmistir (Barouch, D.H. 2008. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature etkili ve güvenli HIV aslîlîiiretmektir.
CMV, her yerde bulunan bir virüs ve herpesvirüs ailesinin beta alt sI-lEl bir elemanIE Ömür boyu sürecek latent veya Erarclîlenfeksiyonu olusturan bir genis, çift sarmal DNA virüsüdür (yaklaslEI olarak . Amerika Birlesik Devletleri gibi gelismis ülkelerde, popülasyonun yaklasüa %70'i, sosyo-ekonomik duruma bagllîcblarak HCMV tarafIdan enfekte olmaktadlEl Epstein-Barr virüsü ve Kaposi sarkomuyla iliskili herpesvirüs gibi gama herpesvirüslerine karsü, HCMV, dönüsmemektedir ve onkojenik degildir. Bir canlüazaltilüilgl CMV asElJCMV genomunun bir bölümünden mahrum insan CMV Towne susunun esasIa), subkütanöz enjeksiyon vasEislýla bir faz II ve III güvenli ve verimli çallgnalarda 800'ün Bu asII güvenli oldugu bulunurken, tamamen yeterli degildir. Daha güncel olarak, verimliligin arttlEllBtas. dair bir çabada, Towne-bazlElasElsusundaki bazEleksik genler degistirilmistir. Bu asI,-_l faz II güvenlik çallginalaria test edilmistir ve güvenli oldugu HCMV genellikle saglilZllZbireylerde iyi huylu olmas. ragmen, virüs, yüksek morbidite ve mortalite ile sonuçlanarak immünitesi zaylfilamlgl popülasyonlarda yilZIaîl hastaligh yol H. David M. Knipe, Diane E. Griffin, Robert A. Lamb Malcolm A. Martin, Bernard Roizman and Stephen E. Straus (ed.), Fields Virology, 4th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia and Kenneson, A., and Cannon, M.J. 2007. Review and meta-analysis of the epidemiology of congenital cytomegalovirus (CMV) infection. Rev Med Virol veya allojenik hematopoetik hücre transplantasyonundan (HCT) ve aynüamanda orak hücre anemi, multipl skleroz ve katEl kanserler gibi hastalilZJara yönelik genisletilmis HCT kullanIiIan sonra immünpresif tedaviye tabi olan hasta say-aki son artlglar, HCMV hastallgll duyarIIJliasta popülasyonlarII say-Earttlülnlgtlümhou, S. 1999. Transpl Infect enfeksiyondur ve neonatlarda merkezi sinir sisteminin kötü gelisiminin öncede gelen bulaslEEI Lancet 1:1352-5). Bu hususta, HCMV, bulaslîlllurumdan bagIislîl neonatlarda sensorinöral saglîll[g]I ana nedeni olarak görülmektedir (Fowler, K. B. ve meslekdaslarEll997. J Pediatr 130:624-30). Bu sebepten ötürü HCMV, yeni antiviral farmakolojik ve asl3tratejilerine olan ihtiyaca vurgu yapan çok say. hasta popülasyonunda mortalitenin bir ana nedenini olusturmaktadlü Dogal sokak türü (WT) CMV enfeksiyonu ile indüklenen immünitenin CMV yeniden enfeksiyonunu tutarlElbir sekilde önleyemedigi gösterilmistir (asagübakllû. Bu benzersiz özellik, CMV enfeksiyonunu önlemek için çalismalarda aday asllErI zayEfJ verimliligini büyük ihtimalle açlKlamaktadlEl(Pass, R. F. ve meslekdaslarEIZ009. N Engl J Med 360:1191-9). Buna karslEl, dogal enfeksiyon sayesinde elde edilen HCMV'ye olan immünitenin, hamilelik süsüda ölümcül HCMV bulasmasIEI önemli ölçüde azalttEgJEI gösterilmistir. Bu gözlem, dogal CMV enfeksiyonu ile indüklenen ile klýaslanan, fakat güvenli bir sekilde indüklenen hamile kadIarda bir immünite indüksiyonunun, ölümcül iletimin ana sebebini azaltabildigini ve neonatta klinik CMV hatal[g]lEha önemli bir etkiye sahip oldugunu göstermektedir. HCMV-spesifik T hücresi immünitesinin aynlZl zamanda dogal CMV enfeksiyonu ile elde edilenle klýlaslanabilen bir immüniteyi güvenli bir sekilde indükleyebilme kabiliyetinin CMV hastallgllîlizerinde bir klinik etkiye sahip oldugu bir diger popülasyonu temsil ederek nakil hastalarIa CMV hastal[gllEl':i karsEkorumaylIkarsllâd@Egösterilmistir(Leen, A.
Bone Marrow Transplantation 14:78-84). Sitomegalovirüs yüksek derecede immünojeniktir, fakat sero-pozitif konagI virüs EtarIEI/e yeniden enfeksiyonunu mümkün hale getirmek için immün kaçlElna mekanizmalarlülegistirmistir.
Spesifik olarak HCMV enfeksiyonunun kontrolüne atanan immünolojik kaynaklar, en çok bilinen immünojenik virüslerden bir tanesi olan CMV ile muazzamdlB Yüksek antikor titreleri, saglilZlElbireerrin birincil enfeksiyonu süsia ana HCMV zarf glikoproteine (gB) karsEl (Alberola, J. ve meslekdaslarlZlZOOO. J Clin Virol 16:113-22 and Rasmussen, L. ve proteinlerine karsEl(yaplglal veya yaplglal olmayan) yönlendirilmektedir. Konak T hücresi repertuvarII genis bir oranElaynüamanda HCMV'ye akut virüslerine (klîamllîl kabakulak, grip, aclenovirüs) veya hatta herpes simpleks ve hatta variceIIa-zoster virüsleri gibi diger Etarclîvirüslere olandan 5-10 kat daha yüksek medyan CD4+ T hücresi yanltîlfrekanslarlîlle CMV antijenlerine karsEl/önlendirilmektedir (Sylwester, A. W. ve meslekdaslarDZOOS. J Exp Med 202:673-85). Belirlenen HCMV epitoplar. veya proteinlerine CD8+ yanlfüarII bir yüksek frekansEtla genellikle gözlemlenmektedir (Gillespie, G. M. ve meslekdaslarEROOO. J HCMV genomuna CD4+ ve CD8+ T hücresi yanElhrIlîlölçen bir genis ölçekli insan çallglnasia, CMV-spesifik CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin ortalama frekanslarÇlher iki alt küme için haflîla popülasyonunun %10'unu asmlgtlîlßylwester, A. W. ve meslekdaslarlîl2005. J Exp Med 202:673-85). Bulusun bir yapüândlElnasHa, CMV-spesifik T hücrelerinin, spesifik doku alanlaria bir spesifik bireyin haflîla T hücresi repertuvarII >%25'ini hesaba katmaslZl olagandlglîldegildir. CMV-spesifik immünitenin bu yüksek seviyesinin klinik önemi en net olarak transplantasyon süsia immünsüprese çok organIlZCMV hastallglII olusumu ve T hücrelerinin, bu hastalarEllZMV hastaIIgJIian korumasEilçin benimsenmis aktari kabiliyeti ile gösterilmektedir (Riddell, S. R. ve meslekdaslarEl994. Bone Marrow Transplantation 14:78- Özet olarak, canlÇlzaylflhtllBilgl CMV asllârII görünür güvenligine ragmen, canIECMV-bazIEl aslîstratejilerine dair önemli endiseler bulunmaktadE AIDS hastalarüorgan nakli allElBrElreya uteroda enfekte olan çocuklar gibi immünsüprese bireylerde ortaya ç[lZlan problemler ve bir CMV-bazlElasII potansiyel allîllârII immün yetersiz olabildigi veya immün yetersiz hale gelebildigi göz önünde bulunduruldugunda, bir canllIMV as-I kullanlIEönemli ölçüde klîlflamaktadlîl Bu sebepten ötürü, tüm bireylerde güvenli ve verimli olan bir CMV aslîl vektörüne devam eden bir ihtiyaç mevcuttur.
Bu basvurudaki herhangi bir dokümanI atlElveya tanIiIanmasübu belgenin mevcut bulusa göre önceki teknik olarak mevcut olduguna dair bir kabul degildir.
BU LUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, bir heterolog antijeni kodlayan bir nükleik asit sekanlelüberebilen RhCMV veya HCMV vektör gibi avantajIEbir sekilde viral vektörler olmak üzere rekombinant vektörleri açlKIamaktadlEl burada heterolog antijen, bir insana patojenine özgü antijen veya bir tümör antijenidir. Antijen, bir viral antijen, bir bakteriyel antijen bir fungal antijen, bir protozoan antijen veya bir bir hematolojik kanser ile eksprese edilen bir antijen olabilmektedir.
Mevcut bulusun RhCMV veya HCMV vektörleri, silmeleri içerebilmektedir. Silme, /n Viva büyüme Için temel olmayan gen bölgelerinde olabilmektedir. Gen bölgeleri, RL11 ailesi, pp65 ailesi, USlZ ailesi ve USZ8 ailesinde olabilmektedir. Silinen gen USZ, US3, US6, USll, UL82, zamanda RL11 ailesinde, pp65 ailesinde, USlZ ailesinde ve USZ8 ailesinde geri bölgelerinde silmelere sahip olabilmektedir. Belirgin olarak, RhCMV vektörü, RhI3-Rh29, Rh111-RH112, silmelere sahip olabilmektedir.
RhCMV veya HCMV vektörü aynüamanda bir tropizmi bozuk vektör olabilmektedir. Avantajlü bir sekilde, tropizmi bozuk vektör, belirli hücre türlerindeki optimal büyüme için gerekli genlerden mahrum olabilmektedir veya viral replikasyon için temel olan genlerde dokuya özgü mikro-RNA'IarI hedeflerini içerebilmektedir. Belirgin olarak, tropizmi bozuk vektör, bir epitelyal, merkezi sinir sistemine (CNS), makrofajElbozuk tropizme veya bunlari bir kombinasyonuna sahip olabilmektedir. ailesinde gen bölgelerinde silmelere sahip olabilmektedir. Belirgin olarak, HCMV vektörü, U521 ve UL28'de silmelere sahip olabilmektedir.
Bulusun diger amaçlarElasag-kilerden herhangi birisini veya tümünü içermektedir: bu tarz rekombinantlardan ekspresyon ürünlerinin, bu tarz rekombinantlardan ürünlerin eksprese edilmesine yönelik yöntemleri, rekombinantlarül'eya ekspresyon ürünlerini içeren bilesimlerin, ekspresyon ürünlerinin kullan“ yönelik yöntemlerin, bilesimlerin kullanüßwasl yönelik yöntemlerin, rekombinantlardan DNA'nI ve rekombinantlardan DNA'nI kopyalamas- yönelik yöntemlerin saglanmasEl Mevcut bulus ayrlîla bulaslEEbir hastallKlEblan veya bir bulaslEEhastallKla veya kanserle enfeksiyonlu hale gelme riskini veya kanser gelistirme riskini taslýan bir hastallgiII tedavi edilmesine yönelik olan, tedaviye ihtiyacüblan bir hastanI seçilmesini ve burada tarif edilen rekombinant RhCMV veya HCMV vektörün hastaya uygulanmasIEliçeren bir yöntemi açlamaktadß Dolaylâlýla, Basvuru sahiplerinin hakkDelinde bulundurdugu ve burada öncesinde bilinen herhangi bir ürünün, sürecin veya yöntemin feragatnamesini tarif ettigi sekilde önceki bilinen herhangi bir ürünün, ürünü olusturma sürecinin veya ürün kullanIi yöntemin bulusun içerisine dahil edilmemesi, bulusun bir amacIlE Bulusun, Basvuru sahiplerinin hakklîblinde bulundurdugu ve burada öncesinde bilinen herhangi bir ürünün, sürecin veya yöntemin feragatnamesini tarif ettigi sekilde, USPTO (35 U.S.C. @1112, ilk paragraf) veya EPO'nun (EPC'nin 83. Maddesi) yazilliîlaçllîlamasIEl/e izin sartlarIEkarsilâmayan herhangi bir ürünü, süreci veya ürün olusumunu veya ürün kullanlîili yöntemini kapsamaslüamaçlamadlgllîl belirtilmektedir.
Mevcut bulusta ve özellikle istemlerde ve/veya paragraflarda, “içermektedir“, “içermistir“, olabildigi, örnegin “içermektedir , “dahil edilmi “, “dahil“ ve benzeri anlamlEb gelebildigi ve atfedilen anlama sahip oldugu belirtilmektedir, örnegin açilZl bir sekilde allEtElyapliiiayan elemanlara izin vermektedirler, önceki teknikte bulunan veya bulusun bir temel veya yeni özelligini etkileyen elemanlarElhariç tutmaktadlîllar.
Bu ve diger yapllândlülnalar tarif edilmektedir veya asaglki KapsamlElAçllZlamadan görünmektedir ve KapsamlDÄçlklama ile kapsanmaktadlE Daha belirgin olarak, asaglâbkiler talep edilmektedir: Bir heterolog antijeni kodlayan bir nükleik asit sekansIDçeren bir rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, burada heterolog antijen, insan immün yetmezlik virüsten (HIV) izole edilen bir insan patojene özgü antijendir, burada vektör, replikasyon için temel olan veya replikasyonu arttEin bir veya birden fazla RhCMV veya HCMV geninin bir silinmesini içermektedir. bunlari bir homologundan seçilebilmektedir.
Rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, USZ, US3, US6 veya USll'in veya bunlari bir homologunun Silinmesini, özellikle Rhl58-166'nI veya bunlari bir homologunun Silinmesini içerebilmektedir.
Rekombinant HCMV vektörü, UL64 veya USZ9'Lin veya bunlari bir kombinasyonunun Silinmesini içerebilmektedir.
Rekombinant RhCMV vektörü veya HCMV vektörü, /n i//i/o büyüme için temel olmayan gen bölgelerinde bir silinmeye sahip olabilmektedir, özellikle burada gen bölgeleri, RL11 ailesi, pp65 ailesi, US 12 ailesi ve U528 ailesinden olusan gruptan seçilmektedir. Belirgin olarak, gruptan seçilebilmektedir, burada RhCMV gen bölgeleri, Rh13.1, Rh19, RhZO, Rh23, Rh24, gruptan seçilmektedir. HCMV gen bölgeleri aynEtamanda RL11, UL6, UL7, UL9, UL11, UL83 seçilebilmektedir. Rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, RhCMV veya HCMV genomunun bir temel genine veya bölgesine yanasan LoxP bölgelerini içerebilmektedir. Rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, bir nükleik asit sekansllodlaylEthetrasiklin (Tet)-düzenlenmis Cre rekombinaleîberebilmektedir.
Burada belirlenen rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir taslîlîüberen bir bilesim.
Bir bulaslEEhastallgiîblan bir hastanI tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullan! için rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü veya yukarlöh belirlenen bilesim olup, burada bulaslEEliiastallgla, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) yol açmaktadlü Bir bulaslEEhastalllZIa enfekte hale gelme riski taslýlan bir hastanI tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullanIi için rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü veya yukariHEi belirlenen bilesim olup, burada bulaslElJhastallgb, (HIV) yol açmaktadlEl SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Örneklendirme yoluyla verilen, fakat bulusun sadece açEElanan spesifik yapllândlîilnalara klglflianmaslümaçlamayan asaglki kapsamlüçllglama, en iyi ekteki sekillerle baglantlIJDbir sekilde anlasilâbilmektedir.
SEK. 1, HCMV ORF'Ierine yanlEal olan CMV-pozitif ve CMV-negatif hastalarda CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin yüzdesini gösteren bir çift grafiktir. Toplam periferik kan (PB) T hücrelerinden (üst) veya haf& PB T hücrelerden (alt) yanit3al T hücrelerinin yüzdesi gösterilmektedir.
SEK. 2, PB'de (üst) tüm CMV veya seçilen ORF'Iere T hücresi yanlHbrlEa (CD4+ ve CD8+ T hücreleri) CMV seropozitif donörlerin yüzdesini; seçilen RhCMV ORF'Iere (orta) toplam PB T hücre popülasyonu içerisinde ortalama yanlElfrekanslarIlIl ve seçilen RhCMV ORF'Iere haflîla PB T hücresi popülasyonu içerisindeki ortalama yanlt] frekanslarIlleösteren grafiklerin bir kümesidir.
SEK. 3, RhCMV'ye dayanllZlEperiferik kan T hücresi yanEEIIarIEgösteren bir dizi FACS çizimidir, SEK. 4, 27 yetiskin erkekte RhCMV'ye periferik kan T hücresi yanlflbrIElgösteren grafiklerin bir kümesidir. T hücresi yanlfllarüla (tüm CMV'ye veya seçilen CMV ORF'Iere 2 seçilen CMV ORF'Iere (sag) ortalama T hücresi yan [tîlfrekanslarlîgiösterilmektedir.
SEK. 5, RhCMV-spesifik haflîla T hücrelerinin, dalakta ve akcigerde yüksek derecede zenginlestirildigini gösteren bir dizi FACS çizimidir. Bu alt kümeler içerisinde alt kümeler çllZlarIlKtan sonra net yanlElfrekanslarlElEI0/o+" ile temsil eden toplam CD4+ veya CD8+ T hücrelerinde kapllânan altEIbIn eylem gösterilmektedir. YanlElveren hücrelerin tümü haflîla hücreleridir ve örnekte gösterilen toplam T hücrelerinin (gerçek payda veya yanltJ göstermektedir. Bu sebepten ötürü, CD4+ ve CD8+ haf& alt kümeleri içerisindeki yanlEl frekanslarEl asaglöhki gibidir: Tüm CMV'ye (kan/dalak/akciger) CD4 yanlEllIl = SEK. 6, RhCMV yeniden enfeksiyonun immünolojik kan-Egösteren bir dizi grafiktir ve yeniden enfeksiyon sonraleha kanda ve plazma antikor titrelerinde CMV-spesifik CD4+ ve CD8* T hücresi frekanslarlüproliferatif durumu göstermektedir.
SEK. 7 RhCMVvLoxP-bazlEl RhC-MV/SIVmac239gag rekombinantlarI olusumu için Cre/LoxP-bazlljlekombinasyonun sematik bir açlElamasIlEl SEK. 8, RhCMV-seropozitif RM'lerin RhCMV/SIVgag yeniden enfeksiyonunu gösteren bir SEK. 9 bir birinci nesil RhCMV(gag) vektörü ile CMV seropozitif RM'nin (#19997) tek bir inokülasyonundan sonra kanda gag-spesifik CD4+ T hücrelerinin hlîllîlgörünümünü gösteren bir dizi FACS çizimidir.
SEK. 10, RhCMV(gag) yeniden enfeksiyonundan (#21046; 56. gün, yeniden enfeksiyon dizi FACS çizimidir.
SEK. 11, RhCMV(gag) yeniden enfeksiyonu (x2) ile gag-spesifik T hücrelerinin gelisimini gösteren bir dizi grafiktir.
SEK. 12, ilk yeniden enfeksiyondan sonra zamanla anti-gag antikorlarII gelisimini gösteren bir grafiktir.
SEK. 13, SIV(Anef) ve RhCMV(gag)-Immünize RM'de gag-spesifik T hücresi frekanslarII bir klýlaslamasIElgösteren bir grafiktir. Her iki grupta, CD4+ ve CD8+ gag-spesifik T hücresi yanlfllarühatta kandaki yüzdelerle haleanI düzeltilmesi sayesinde kana klýlasla akcigerde daha yüksek çllîmlglü SEK. 14, 10 renkli sitokin aklgl sitometrisi ile RhCMV IE-1 15mer karlSlEilEla bir geçen yetiskin RM periferik kan CD4+ ve CD8+ T hücresi yanthrIlEl kantifikasyonunu ve karakterizasyonunu saglayan bir dizi FACS çizimidir.
SEK. 15, RhCMV ve HCMV asülektörlerinin yap-I bir açElZIamasIlEl Heterolog patojen antijenleri, E/T ve Flp-aracIIJDekombinasyon ile RhCMV veya HCMV bakteriyel yapay kromozomlara (BAC'Ier) eklenmektedir.
SEK. 16, bir örnek teskil eden tetrasilin ile düzenlenmis RhCMV/HCMV güvenli asII bir açlElamasIlE Bu RhCMV/HCMV güvenli vektörü, Tet ile indüklenen vektörün inaktivasyonunu birlikte mümkün hale getiren RhCMV/HCMV içerisinde iki interaktif SEK. 17, bir örnek teskil eden tetrasilin ile düzenlenmis RhCMV/HCMV güvenli asIZI vektörünün bir açlEIamasIlEI Bu tarz RhCMV/HCMV asü/ektörleri, SEKIL 10'da gösterilen Tet ile indüklenebilir sistemin kontrolü altIa virüs replikasyonu (bu örnekte, Rh70 (HCMV homolog-UL44); DNA polimeraz islenebilirligi faktörü) için temel bir geni degistirerek olusturulmaktadlü SEK. 18, bir örnek teskil eden tetrasilin ile düzenlenmis RhCMV/HCMV güvenli asEl vektörünün bir açilZJamas- SEK. 11'de detayland-[gilîlgibi Tet ile indüklenebilir sistemin kontrolü altIa bir sitotoksik geni (CytoG) içeren bu tarz RhCMV/HCMV asEl vektörleri olusturulmaktadIEl Dox yoklugunda Tet ile düzenlenmis vektörlere sahip hayvanlar. inokülasyonundan sonra, virüs replikasyonu, asElvektörü ile enfekte olan hücrenin ölümü ile sonuçlanarak sitopatik genin Dox araclIJJIhdüksiyonu ile hlîIElbir sekilde etkisiz hale getirilebilmektedir.
SEK. 19, örnek teskil eden RhCMV ve HCMV gen terapisi vektörlerinin yap-I bir açiKlamasIlB Terapötik genler, E/T ve FIp-aracHJDekombinasyon ile RhCMV veya HCMV bakteriyel yapay kromozomlara (BAC'Ier) eklenmektedir. Sematik, RhCMV'nin rh213 ve Rh214'ü araleUaki kodlaylEIIdJImayan bölgeye bir epitop isaretli terapötik genin eklenmesi için genellestirilmis bir strateji göstermektedir. Bu strateji, RhCMV/HCMV genomu içerisinde diger belirlenen bölgelerinde terapötik genlerinin eklenmesi için benzer bir sekilde kullanüâbilmektedir.
SEK. 20, pp71'inden mahrum RhCMV'nin T hücresi yan-@österen bir çift grafiktir. Iki sero-negatif RM, 0. günde RhCMVApp71'nin 107 PFU'su ile s.c. olarak asilânmlgtß RhCMV araIlKlarda PBMC ve BAL'de hücre içi sitokin boyamasEile ölçülmüstür.
SEK. 21, fare embriyo fibroblast hücrelerinden (MEF), IC-21 makrofaj hücrelerinden (IC- 21), periferik dendritik hücrelerden (PB DC) ve kemik iligi dendritik hücrelerinden (BM DC) kantitatif RT-PCR analizi ile miR-142-3p seviyelerini gösteren bir grafiktir. MiR-142-3p seviyeleri, MEF'lerden makrofaj/dendritik hücre olarak en az 7000 kat daha yüksek çilZlnIStE MEF'lerin miR- yönelik standart önceki seviyeler içerisinde kalmaktadlEl SEK. 22, IE replikasyonunun seviyesini gösteren bir grafiktir ve IE3-142, 3T3 fibroblast hücrelerinin MOI=0.1 enfeksiyonundan sonra klibslanmlgtlîl Standart plak deneyleri, 3T3 fibroblast hücrelerinde uygulanmaktadlîl SEK. 23, IE3-015 kontrol virüsünün MCMV replikasyonunun seviyesini gösteren bir grafiktir ve IE3-142, IC-21 makrofaj hücrelerinin MOI=O.1 enfeksiyonundan sonra külaslanmlgtß SEK. 24, MCMV ile 3T3 fibroblast. enfeksiyon sonrasEIEl ve IE3 mRNA seviyelerini gösteren bir grafiktir.
SEK. 25, MCMV ile IC-21 makrofaj hücrelerinin enfeksiyon sonraslZIEl ve IE3 mRNA seviyelerini gösteren bir grafiktir.
SEK. 26, RhCMV salgllâyan immunojenesitenin ve yetiskin/çocuk RM'sinde degerlendirilmesine yönelik protokolü gösteren bir sematiktir.
SEK. 27, MCMV/VPlpVl'in stabil bir sekilde VP1'i in vitro olarak eksprese ettigini gösteren bir jelin bir görüntüsüdür.
SEK. 28 (a) Zaire ebolavirüsünün NP proteininin CTL-epitopunu taslýlan MCMV/ZEBOV- NPCTL ve MCMV-türevi vektörün bir sematik sunumudur. (b) farkIEIMCM vektör yapüârüle immünize edildiginde H2b'si kElt'llEl 12951/SvlmJ/Cr farelerinde bir immunojenesite çallglnasIlEl sonucunun grafiksel bir sunumunu göstermektedir. (c) MCMV/ZEBOV-NPcrL asllânan farelerden tipik yanifllarI bir grafiksel sunumunu göstermektedir. ZEBOV NP'ye yanlt] veren T hücrelerinin çogunlugu, poli islevseldir (IFNy ve TNFoc'yEleksprese etmektedir) ve NP epitopuna özgüdür (PSA peptidi veya uyarllBwamLîl kontrollerle inkubasyon sonrasIa gözlemlenmemektedir). MCMV enfeksiyonu ile tutarlüalarak, tüm fareler, MCM M45'e T hücresi yanlÜhrIlEergilemektedir.
SEK. 29 MCMV/ZEBOV-NPUL'ye CD8+ T hücre yan-I kinetik analizini temsil eden bir grafiktir.
SEK. 30, MCMV/ZEBOV-NPCTL'nin, C57BL/6 farelerinde bir ZEBOV'a özgü T hücresi yan-Eîndükledigini gösteren bir grafiktir.
SEK. 31 (a), sagkalIl (5) aç-ian MCMV/ZEBOV-NPCrL'nin koruyucu verimliligini gösteren bir grafiktir. (b) vücut aglîlllglildaki (%) degisim aç-an MCMV/ZEBOV-NPCTL verimliligini gösteren bir grafiktir. (c) viremi (FFU/ml) açlglEUan MCMV/ZEBOV-NPCTL'nin koruyucu verimliligini gösteren bir grafiktir.
SEK. 32, elektroforezin takip ettigi EcoRI ile sindirilen MCMV/ZEBOV-NPCrL'nin (5A1 ve 5D1) bir WT kontrolünü ve iki bagmslîlklonunu gösteren bir jeldir.
SEK. 33, MCMV/ZEBOV-NPCTL'nin Çok adIIEliiüyüme analizini göstermektedir.
SEK. 34, süper-enfeksiyon için temel olmayan RhCMV gen bölgelerini göstermektedir.
SEK. 35, spesifik genlerin veya gen ailelerinin (SIVgag- veya SIVrtn-spesifik CDB+ T hücre yanitllarü bronkoalveolar lavaj lenfositleri) silinmesi ile RhCMV/SIV vektörlerinin immunojenesitesini göstermektedir.
SEK. 36, pp71 silinmesinin, normal übroblastlardan viral salIIiüarar verdigini gösteren bir çift grafiktir, fakat pp71'i eksprese eden fibroblastlardan viral salla zarar vermemektedir.
SEK. 37, pp71'in silinmesinin CMV-vektörlerini in i//i/o azalttlglllîgöstermektedir, fakat sokak türü virüsle klýbslanabilir olan, uzun süren bir immün yan-Elindükleme kabiliyetlerini bozmamaktadlB SEK. 38, bir heterolog antijeni eksprese eden PP71'i silinmis CMV vektörlerinin, CMV- enfekte hayvanlarlEüper enfekte edebildigini ve heterolog antijene uzun süren bir immün yan-Eihdükleyebildigini, fakat enfekte hayvanlardan salgHânmadlgiIlZliöstermektedir.
SEK. 39, MCMV/TetC'nin yap-Elve in vitro karakterizasyonunu göstermektedir. (a) MCMV/TetC'nin sematik temsili. Tetanos toksininin bir V5 epitop isaretli 50kD fragmanEl (C), EFIOL promoterinin kontrolü altIia yerlestirilmistir ve MCMV BAC, pSMfr3 içerisinde M yeniden olusturulan virüslerin in vitro büyüme analizi, WT MCMV ile klýlaslanabilir replikasyon kinetiklerini göstermistir. Hata çubuklarü standart sapmayEl(s.d.) göstermektedir. (c) MCMV/TetC (virüsü geçisi 5) ile enfekte olan MEF'lerin hücre Iizatlaria TI' fragmanIZl(C) ekspresyonunun analizi, enfeksiyon sonrasIa zamanla (gün 1-3) V5-isaretli fragmanI (C) in vitro stabil ekspresyonunu göstermektedir.
SEKANS LISTESI Ekteki sekans listesinde listelenen nükleik asit ve amino asit sekanslarünükleotid bazlarII standart harf kültmalarü/e 37 C.F.R. 1.822'de belirtildigi gibi amino asitlerin üç harfli kodu kullanliârak gösterilmektedir.
Her bir nükleik asit sekansII sadece tek bir sarmallZl gösterilmektedir, fakat tamamlaylEIIisarmallEl, gösterilen sarmala herhangi bir referans ile dahil edildigi anlasllü'iaktadlü sunulmaktadlEl Ekteki sekans listesinde: SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1, RhCMV'nin (Serkopitesin herpesvirus 8) nükleotid sekansIlEl SEKANS KIMLIK NUMARASI: SEKANS KIMLIK NUMARASI: SEKANS KIMLIK NUMARASI: SEKANS KIMLIK NUMARASI: SEKANS KIMLIK NUMARASI: SEKANS KIMLIK NUMARASI: SEKANS KIMLIK NUMARASI: SEKANS KIMLIK NUMARASI: SEKANS KIMLIK NUMARASI: SEKANS KIMLIK NUMARASI: SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2, HCMV'nin (AD169 Iab susu) nükleotid sekansIlEI 3, HCMV'nin (sokak türü sus Merlin) nükleotid sekansIE 4, Towne BAC HCMV izolatII nükleotid sekansIE , PH-BAC HCMV izolatII nükleotid sekansIlEl 6, Toledo-BAC HCMV izolatII nükleotid sekansIlEl 7, TR-BAC HCMV izolatII nükleotid sekansIlEl 8, FIX-BAC HCMV izolatII nükleotid sekansIE 9, AD 169-BAC HCMV izolatII nükleotid sekansIE 11, SIV gag-pol'ün nükleotid sekansIlEl 12, SIV gag proteininin nükleotid sekansIE BU LUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Çeliskili bir biçimde, CMV-spesifik immünitenin yüksek seviyeleri, sagIUZlEEnfekte bireyden virüsün kökünü kurutamamakta veya yeniden enfeksiyona karsEKZMV sero-pozitif bireyin korunmasIElaaglayamamaktad[El CMV'nin immün sistemi ile tahripten kaçma ve sero-pozitif konagElyeniden enfekte edebilme kabiliyetinin, uzun sürede virüsle kodlanan çoklu viral immünomodülatörlere baglEbIdugu Inanllîhaktadlîlûnceleme için bkz. (Mocarski, E. S., Jr. aktivasyon ile tutarllZlolarak, CMV aynElzamanda bir karakteristik ve benzersiz T hücresi immün yan-Eindüklemekte ve sürdürmektedir. Asllâma veya enfeksiyon ile indüklenen hafü T hücreleri, bu iki hafEa popülasyonunun ayrüslevlerinden takip edilen efektör (TEM) veya merkezi (TCM) haflîaya genis ölçüde karakterize edilebilmektedir (Cheroutre, H., and L. açllZIanmaktadlE Bulusun diger yapHândiÜnalarÇlCMV iletimi ve hastallglElle iliskili hücrelerde ve dokularda kopyalanabilme kabiliyetleri islemez olan veya bozulan, azaltllmlgl CMV asllârlîile ilgilidir. Bu asüyaklasIiII temeli, HCMV'nin, virüs immün kontrole en zayif] halde oldugunda, enfeksiyonda oldukça erkenden HIV replikasyonunu kesen ve süprese eden yüksek frekans efektör alanEbazlET hücresi yanlEIlarIEüretme potansiyelini HCMV-bazIÜ/ektörlere sagladIgIEl viral antijenlere genis ve dayanilZllZEfektör hafmasür hücresi (TEM) yanlfllarIEbenzersiz bir indükleyebilme kabiliyetidir. MakaklarI (RM'Ier), replikasyonu rekabetçi RhCMV/SIV asED vektörlerinin immünizasyonu, yüksek derecede patojenik SIVmac239 ile rektal baglgElandlEilna sonrasIia hayvanlar. %50'sine koruyucu immünite saglayan SIV antijenlerine bir genis, uzun süren TEM yan-Eindükleyebilmektedir (.Hansen, S.G., Vieville, C., Whizin, N., Coyne-Johnson, L., Siess, D.C., Drummond, D.D., Legasse, A.W., Axthelm, M.K., Oswald, K., Trubey, C.M., ve meslekdaslarEI009. Effector memory T cell responses are associated with protection of rhesus monkeys from mucosal simian immunodeficiency virus challenge. Nat Med 15:293-299). Anti-SIV immün yanlfllîlve bu RhCMV/SIV vektörleri ile yönlendirilen koruma, mevcut asüadaylar- klibsla görülmemistir ve günümüzde bir etkili HIV as-I gelisimi için temel saglamaktadIE Ek olarak, mevcut bulusun yapHândIEmalarü bir önemli anti-RhCMV immün yan-I mevcudiyeti yerine, RhCMV'nin sero+ RM'yi essiz yeniden enfekte etme kabiliyeti ile ilgilidir.
Buna karslül, çogu mevcut HIV asül/ektörü (örn. frengi ve adenovirüs bazlü/ektörler), bu asEI platformlar.. sadece tek bir etkili kullanIilEa olanak saglayan anti-vektör immünitesi ile tehlikeye girmektedir. CMV vektörlerinin bu kallßal özelligi, bu virüs ile kodlanan immün kaçlÜna genlerinin kapsamllîrepertuvar- atfedilebilmektedir (Hansen, S.G., Powers, C.J., Richards, R., Ventura, A.B., Ford, J.C., Siess, D., Axthelm, M.K., Nelson, J.A., Jarvis, M.A., Picker, L.J., ve meslekdaslarEEOlO. Evasion of CD8+ T cells is critical for superinfection by cytomegalovirus. Science 328:102-106). CMV-bazllîlektörlerin bir diger avantaj [Zlteorik olarak 50 kb'nin üzerinde viral genomun yabancDDNA ile degistirilebildigi SIV/HIV antijenlerini eksprese eden genis kasetleri yerlestirme potansiyelidir. CMV-baziDasüvektörlerinin bu özellikleri birlikte çoklu SIV antijenlerine bir dayanlEErEM yan-[indükleyebilen ve ilerleyici, sistemik enfeksiyonun olusumundan önce mukozal olarak SIV ile baglgKlandlElân RM'de viral replikasyonu tamamen kontrol edebilen bir RhCMV/SIV as-I gelisimini mümkün kIIB1|StIB önceki asElaklasIilarEile bir verimlilige ulasHâmamlStlE RhCMV/SIV vektörü, etkili bir SIV asEEblabilmektedir fakat bir HIV asEDvektörü olarak tamamen replikasyonu rekabetçi HCMV kullanIi- yönelik bir ana sorun, güvenlik sorunudur. CMV, konagI bir uzun ömürlü enfeksiyonunu olusturdugu için, bir CMV-bazlEl asII herhangi bir patojenik potansiyelinin gerçeklestirilmesine yönelik aralilg bireyin yasamEl için asllâma süresinden genislemektedir. Bu aralilZl sßslia (potansiyel olarak >80 yll.`)l, transplantasyon öncesinde Iatrojenik immün kosullandlElnasII bir sonucu olarak veya HIV enfeksiyonu veya kanserle oldugu gibi hastaligll bir sonucu olarak, bazEbsilârI immün- süpresyon süreçleri ile karsEkarslsîb kalmasEbeklenmektedir. HCMV aynlîtamanda aylar ila yillbr araliglEUa süre zarfiarülçin sagliElEiEMF ile enfekte edilmis bireylerden salyaya, ürine ve anne sütüne slklllîla dökülmektedir. Asüânmlgbireylerden asHânmamlgl bireylere yayllân bu aslZlpotansiyeli, oral polio aslElJ(OPV) gibi canliIlglZlzaylûhtllBilgl asllârlB] bir özelligidir (Heymann, D.L., Sutter, R.W., and Aylward, R.B. 2006. A vision of a world without polio: the OPV cessation strategy. Biologicals 34:75-79). Global Polio Eradication Initiative'de OPV deneyimlerinden açilZl bir emsalle, çevresel yayilBwa potansiyeli, bir HCMV-HIV as-I gelisimine bir ek ana engel doguracaktlEI CMV'nin bu özellikleri, bir CMV-bazlDaslÇlinsan patent dokümanü Rhcmv- ve Hcmv-BazlElAsElVektörIerini açilZlamaktadlE ve RhCMV- ve HCMV-bazIIZIasEIvektörIerini ve intihar ve güvenlik araçlarlsîla bunlarI versiyonlarIIZI saglamaktadlEl Bir tetrasiklini düzenlenmis RhCMV/HCM'den bahsedilmektedir. Bu tarz RhCMV/HCMV asü/ektörü, Tet ile indüklenebilir sistemin kontrolü altia virüs replikasyonu için temel bir geni yerlestirerek olusturulmaktadlü Fakat mevcut doküman, replikasyon için temel olan genlerde silmeleri içeren bir rekombinant RhCMV veya HCMV vektörünü açllîlamamakta veya göstermemektedir.
Mevcut bulusun yapilândlüinalarl: virüs bulasmasII ve patogenezin sorunlarIEl ele almaktadE ve CMV vektörlerini kullanarak bir güvenli ve etkili asElüremek için olan iki potansiyel tamamlaylEElyaklasIiIa ilgilidir. Bir yaklasIi, replikasyonlarlda tamamen veya kosula baglüolarak yayilân eksik veya çesitli sekillerde kElIlilZlolan, fakat bir heterolog antijenine karslîlbir koruyucu immün yan-ühdükleyebilir kalan CMV vektörlerinin gelisimine odaklanmaktadlü Ikinci yaklasIi, epitelyal hücreleri - virüs bulasmasEiçin ve aynüamanda CMV pnömonisi ile iliskili akcigerde bir ana hücre türü için önemli bir hücre türünü enfekte edemeyen replikasyonu rekabetçi CMV vektörlerinin olusumuna odaklanmaktadEI Bulusun bazEyapilândlElnalarÇInöral ve miyeloid hücrelerde replikasyonda bir blok dahil olmak üzere bu vektörlere ek güvenlik özellikleri ile ilgilidir. Optimal CMV vektörü, asüânmlgl bireylere bulasamayacaktlEl ve ceninde veya immünitesi zayiflhmlgl yetiskin RM'Ierde hastaligia yol açamayacaktE fakat bulaslîEhastaliKIara veya tümörlere karsEbir koruyucu immün yan-El indükleyecektir. Burada, HIV enfeksiyonuna karsEbotansiyel olarak yüksek derecede etkili olacak olan, tüm insan hedef popülasyonlarEiçin kabul edilebilir ölçüde güvenli olan, kisiden kisiye temasla geçmeyen ve bu sekilde, insan klinik çallginalar- dönüsüm için hazlElolan bir HCMV-bazlEH-IIV asmdayanlüll olusumu tarif edilmektedir.
Mevcut bulus, kodlanmlglantijene Özgü yüksek seviye hücresel ve hümoral immün yaniElhrIEI temin eden ve sürdüren heterolog antijenlerini kodlayan HCMV ve RhCMV rekombinant vektörleri ile ilgilidir. Mevcut bulus ayrlEla CMV iletimi ve hastaligiüle iliskili hücrelerde ve dokularda kopyalanabilme kabiliyetleri aç-an klîltlhnan, azaltÜIhlSCMV asilârEile ilgilidir.
Bulusun diger amaçlarüasaglkilerden herhangi birisini veya tümünü içermektedir: bu tarz rekombinantlardan ekspresyon ürünlerinin, bu tarz rekombinantlardan ürünlerin eksprese edilmesine yönelik yöntemleri, rekombinantlarü'eya ekspresyon ürünlerini içeren bilesimlerin, ekspresyon ürünlerinin kullanIllEa yönelik yöntemlerin, bilesimlerin kullanilfnalela yönelik yöntemlerin, rekombinantlardan DNA'nI ve rekombinantlardan DNA'nI kopyalamas. yönelik yöntemlerin saglanmasLII Bu sebepten ötürü, burada heterolog antijenlerini kodlayan bir nükleik asit sekanslarlüllîiçeren rekombinant RhCMV veya HCMV vektörler saglanmaktadlEI BazlZýapilândlîilnalarda, heterolog antijeni, bir patojene özgü antijendir. Diger yapliândlünalarda, heterolog antijen, bir tümör antijenidir. BazEIyapilândlEinalarda, tarif edilen vektörler, bir Immünomodüler proteini kodlayan bir veya birden fazla CMV geninde bir silmeyi içermektedir. BazElIaplIândlElnalarda, tarif edilen CMV vektörleri, CMV replikasyonu için temel olan bir veya birden fazla gende bir silinmeyi içermektedir. Burada aynüamanda, rekombinant RhCMV veya HCMV vektörlerini ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasMElîEiçeren bilesimler ve aynüamanda bir hastanI tedavi edilmesine yönelik bu tarz bir bilesim kullanlßaglanmaktadlEl Aynlîamanda, bir bulaslEEihastaIigilîrblan veya bulasEEIbir hastalllîla enfekte hale gelme riskini taslýbn bir hastanI tedavi edilmesine yönelik bir yöntem ve kanser olan veya kanser gelistirme riski taslýlan bir hastanI tedavi edilmesine yönelik bir yöntem saglanmaktadlB Yöntemler, ihtiyacüalan bir hastanI seçilmesini ve hastaya, bir heterolog antijeni kodlayan bir rekombinant RhCMV veya HCMV vektörünün veya bunlari bir bilesiminin uygulanmasIEI içermektedir.
Aynüamanda, replikasyon için temel olan veya replikasyonu arttün bir veya birden fazla RhCMV veya HCMV geninde bir silinmeyi içeren rekombinant RhCMV veya HCMV vektörleri saglanmaktadlB Bazlîýapllândlülnalarda, en az bir temel veya arttlElEÜgen UL82, UL94, UL32, UL99, UL115 veya UL44 veya bunlari bir homologudur. BazEyapHândEnalarda, rekombinant RhCMV veya HCMV vektörleri aynüamanda patojene özgü antijen veya bir tümör antijen gibi bir heterolog antijeni içermektedir. Bir temel gende bir silinmeye sahip olan ve bir heterolog antijeni kodlayan rekombinant RhCMV ve HCMV vektörleri, örnegin bulasEEhastallgll veya kanserin tedavisi için asüâr olarak kullanilâbilmektedir. Bir heterolog antijeninin yoklugunda, bir temel gende bir silinmeye sahip olan rekombinant RhCMV ve HCMV vektörleri, örnegin CMV'ye karsljsüâma için kullanüâbilmektedir.
AynEIzamanda CMV iletimi ve hastalEKIa iliskili hücrelerde ve dokularda kopyalanamayan zayElbtllÜilgl virüs asilârßaglanmaktadlîl YakI bir sokak türü genetik geçmisse sahip olan canIERhCMV/SIV vektörleri, makaklarda SIV koruyucu immüniteyi indükleyen bir etkili asEEl saglamaktadlEi Immünitesi yetersiz olmas-an süphelenilmeyen bireyler dahil bir genel popülasyonda tüm potansiyel hastalar için güvenli olan bir insan CMV (HCMV)/HIV aslgEiçin, CMV asElvektörünün, koruyucu immünitesini indükleyebilme kabiliyetini kaybetmeden zayifliatilüiaya ihtiyaç duymaktadlE CMV, asaglîilhkiler dahil olmak üzere konakta genis saylâa hücrede ve dokuda kopyalanabilmektedir: merkezi sinir sisteminde (CNS) nöronlar, epitelyal hücreler, hepatositler, akciger ve böbrek. Miyeloid ve endotelyal hücreleri, konakta CMV için EtarcEhlanlar olarak görülmektedir. Immüno yetersizligi olan bireylerde açik] CMV hastallgiü slßslûda, akciger, karaciger ve retinada epitelyal ve endotelyal hücrelerin y-iEIIIe sonuçlanan dogrudan enfeksiyon, bu hedef organlarda olan hastalIEtan sorumludur.
Konjenital enfeksiyon slûslütla, nöronal hücrelerin dogrudan CMV enfeksiyonunun, iliskili duyma bozukluklarIElve zihinsel özürlülügü hesaba kattlgll inanüüiaktadß Bulusun yapllândlElnalarÇl asüverimliligini, söz konusu zaylflbtüînlgl virüsleri ve asllâr olarak kullanIiIIarEtehlikeye atmada vektör güvenligini arttlünak için bu kritik hücre türlerinde CMV'nin kopyalanabilme kabiliyetinin modüle edilmesi ile ilgilidir.
Bulusun yapllândlEinalarü HCMV'nin, bu tarz bir yanltJDsaglamasII tanIiIanmasEIiIe birlestirilen, yüksek frekanlelefektör haflû-yanlül' hücresi yan-I Ientiviral enfeksiyonlarEl karsEkorunmada geleneksel asEiIe üretilen hafzada ayrüvantajlara sahip olmasi yönelik, yüksek derecede inovatif bir hipotezin esaletla HIV'ye koruyucu immünitenin indüklenmesine yönelik bir vektör olarak HCMV ile ilgilidir. HCMV'nin bu özelligi, herpes simpleks virüsü (HSV) ve Epstein-Barr virüsü gibi diger @arcü/irüslerle klýlaslandlgllda bile bu virüse benzersizdir (Asanuma, H., Sharp, M., Maecker, H.T., Maino, V.C., and Arvin, AM. 2000. Frequencies of memory T cells specific for variceIIa-zoster virus, herpes simpleks virus, and cytomegalovirus by intracellular detection of cytokine expression. J Infect Dis 181:859-866; Harari, A., Vallelian, F., Meylan, P.R., and Pantaleo, G. 2005. Functional heterogeneity of memory CD4 T cell responses in different conditions of antigen exposure and persistence. J Immunol Distinct profiles of cytotoxic granules In memory CD8 T cells correlate with function, B.L., Edgar, J.B., Taormina, C., Pelte, C., Ruchti, F., Sleath, P.R., Grabstein, K.H., Hosken, N.A., Kern, F., ve meslekdaslarlZlZOOS. Broadly targeted human cytomegalovirus-specific CD4+ and CD8+ T cells dominate the memory compartments of exposed subjects. J Exp CMV immünokompetan bireylerde iyi huylu olmas. ragmen, insan testi için bir HCMV/HIV as_ bu bulgularI genisletilmesi için, CMV vektörünün bazljyönlerini zaylühtmamlîlgerekti.
Klasik olarak zayiflatHBilgl viral asüâr, kültürde hücreler üzerinden virüslerin seri geçisi üzerinden olusturulmustur. Bu yaklasIi yorucudur ve oral polio asEIlOPV) ile kan[t`,l bir patojenik fenotipine bu tarz `kör' geçisi ile zaylfllatllân virüs asllârII eski haline dönmesi ile ilgili güvenlik sorunlar. vurgu yapmaktadlEl(Rahimi, P., Tabatabaie, H., Gouya, M.M., Zahraie, M., Mahmudi, M., Ziaie, A., Rad, K.S., Shahmahmudi, S., Musavi, T., Azad, T.M., ve meslekdaslarEI007. Characterization of mutations in the VP(1) region of Sabin strain type 1 polioviruses isolated from vaccine-associated paralytic poliomyelitis cases in Iran. J Clin Virol 39:304-307; Kew, O., Morris-Glasgow, V., Landaverde, M., Burns, C., Shaw, J., Garib, Z., Andre, J., Blackman, E., Freeman, C.J., Jorba, J., ve meslekdaslarlZl2002. Outbreak of poliomyelitis in Hispaniola associated with circulating type 1 vaccine-derived poliovirus.
HCMV'ye erken canIHJgJDayifllatllBiEIasllâr, doku kültüründe virüsün seri geçisi sayesinde 30 yas. üzerinde üretilmistir. Bu HCMV asilârüinsan gönüllülerde ve nakil hastalarda test edilmistir (Quinnan, G.V., Jr., Delery, M., Rook, A.H., Frederick, W.R., Epstein, J.S., Manischewitz, J.F., Jackson, L., Ramsey, K.M., Mittal, K., Plotkin, S.A., ve meslekdaslarEl 1984. Comparatlve virulence and immunogenicity of the Towne strain and a nonattenuated strain of cytome-galovirus. Ann Intern Med 101:478-483; Plotkin, S.A., Smiley, M.L., Friedman, H.M., Starr, S.E., Fleisher, G.R., Wlodaver, C., Dafoe, D.C., Friedman, A.D., Grossman, R.A., and Barker, GF. 1984. Towne-vaccine-induced prevention of cytome- galovirus disease after renal transplants. Lancet 1:528-530; Plotkin, S.A., Starr, S.E., Friedman, H.M., Gonczol, E., and Weibel, R.E. 1989. Protective effects of Towne cytomegalovirus vaccine against Iow-passage cytomegalovirus administered as a challenge. J HCMV aslîgliüvenli olarak görülebilirken, patojenite ve aynlâamanda asüânmamlgsero-negatif bireylere virüsün yayüüia kabiliyeti ile ilgili endiseler de sürmektedir. Daha az patojenik olmayan ve çevreye bulasmayan bir HCMV as-I rotasyonal olarak tasarlanabilme kabiliyeti, klonlama için teknolojik atliliiilarl ortaya çiEISElIe mevcuttur ve genetik olarak CMV'yi manipüle etmektedir. HIV antijenlerini kodlayan CMV aslgüiektörünü üretmenin uzun vadeli bir amachlan, güvenli ve diger kisilere yaylIB1aya elverisli degildir. Mevcut bulusun adlandIElnalarlÇIbulasmada dahil olan hücrelerin bir kEIfliüiropizmine ve aynlamanda yetiskin ve konjenital CMV hastal[glEile iliskili dokularda degistirilmis kopyalanabilme kabiliyetine sahip bir CMV-bazIEIvektörü üretmek için en güncel bakteriyel genetik tekniklerin rotasyonal tasarIiÜe kullanIiEile ilgilidir.
Bulusun bir yapllândlülnasü potansiyel doku hasarIa ve/veya ürin veya salgllâra bulasmaleUa dahil olan spesifik hücre türlerinin enfeksiyonunu önlemek için CMV vektörünün hücre tropizminin degisimi ile ilgilidir. CMV, asagIkiler dahil olmak üzere genis saylElb hücreyi enfekte edebilmektedir: gut, böbrek, akciger ve retinada epitelyal hücreler CNS'de nöronal hücreler, aynüamanda virüsün Etarcülanlarüblarak görülen endotelyal hücreler ve miyeloid soy hücreleri (Dankner, W.M., McCutchan, J.A., Richman, D.D., Hirata, K., and Spector, S.A. 1990. Localization of human cytomegalovirus In peripheral blood Ieukocytes by infection of human blood cells. J Infect Dis 149:207-214; Gnann, J.W., Jr., Ahlmen, J., Svalander, C., Olding, L., Oldstone, M.B., and Nelson, J.A. 1988. Inflammatory cells in transplanted kidneys are infected by human cytomegalovirus. Am J Pathol 132:239-248; Howell, C.L., Miller, M.J., and Martin, W.J. 1979. Comparison of rates of virus isolation from methods. J Clin Microbiol 10:533-537; Myerson, D., Hackman, R.C., Nelson, J.A., Ward, D.C., and McDougall, J.K. 1984. Wide-spread presence of histologically occult cytomegalovirus. human cytomegalovirus in peripheral blood lymphocytes in a natural infection. Science 1995. Fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells and smooth muscle cells are major targets of human cytomegalovirus infection in lung and gastrointestinal tissues. J Gen Virol 76:741- 750).
HCMV, >200 geni kodlamaktadlElve temel virüs replikasyonu için daglfilâbilen çesitli genler, makrofajlarda, endotelyal hücrelerde ve epitelyal hücrelere virüsün girebilmesini ve kopyalanabilmesini mümkün hale getiren tropizm belirleyicileri olarak belirlenmistir. HCMV genlerinin bir lokusunun, UL128-131A, endotelyal ve epitelyal hücrelere girdi için temel oldugu gösterilmistir (Gerna, G., Percivalle, E., Lilleri, D., Lozza, L., Fornara, C., Hahn, G., Baldanti, F., and Revello, M.G. Dendritic-cell infection by human cytomegalovirus is restricted to strains carrying functional UL131-128 genes and mediates efficient viral antigen presentation to CD8+ T cells. J Gen Virol 86:275-284; Hahn, G., Revello, M.G., Patrone, M., Percivalle, E., Campanini, G., Sarasini, A., Wagner, M., Gallina, A., Milanesi, G., Koszinowski, Wang, D., and Shenk, T. 2005. Human cytomegalovirus UL131 open reading frame is Human cytomega-lovirus virion protein complex required for epithelial and endothelial cell M.C., Borton, J.A., Nelson, J.A., Jarvis, M.A., and Johnson, DC. 2008. Characterization of the human cytomegalovirus gH/gL/UL128-131 complex that mediates entry into epithelial and endothelial cells. J Virol 82:60-70; Ryckman, B.J., Jarvis, M.A., Drummond, D.D., Nelson, J.A., and Johnson, DC. 2006. Human cytomegalovirus entry into epithelial and endothelial cells depends on genes UL128 to UL150 and occurs by endocytosis and low-pH fusion. J Virol 80:710-722.).
HCMV UL128 ve 130'un RhCMV homologlarÇthCMV/SIV çallgmalarllîliçin omurga vektörü olarak kullanllân RhCMV susu 68-1'de etkisiz hale getirilmektedir (Lilja, A.E., and Shenk, T. 2008. Efficient replication of rhesus cytomega-Iovirus variants in multiple rhesus and human epitelyal ve endotelyal hücrelerde (bozulmamlgULlZS/BO ile düsük geçisli RhCMV virüsü ile klýbslanan bir azaltlißîlgl oranda olmas. ragmen) büyümektedir (Lilja, A.E., Chang, W.L., Barry, P.A., Becerra, S.P., and Shenk, T.E. 2008. Functional genetic analysis of rhesus Jarvis, M.A., Knoche, A.J., Meyers, H.L., DeFiIippis, V.R., Hansen, S.G., Wagner, M., Fruh, K., Anders, D.G., Wong, S.W., ve meslekdaslarE2004. A cycIooxygenase-2 homologue encoded by rhesus cytomegalovirus is a determinant for endothelial cell tropism. Journal of Virology zayühtabildigini gösteren düsük geçisli RhCMV ile klýbslanan azaltUBilS bulasma durumunu göstermektedir. RhCMV 68-1'in mutasyonal analizi, epitelyal hücre tropizmi için gerekli olan 4 glandüler salgilârlEla (örn. salya ve anne sütü) bulasabilme kabiliyetinin önlendigi sekilde epitelyal hücrelerini CMV'nin kabiliyetini yüksek derecede azaltmak için bu epitelyal hücresi tropizm genlerinin geri kalan mutasyonu ile ilgilidir, fakat bir CMV vektörünün, HIV/SIV'e bir koruyucu immün yan-[ihdükleyebilme kabiliyetini tehlike atmaslîcblaslîdegildir.
Dahasüakciger ve retinada epitelyal hücrelerin CMV enfeksiyonu, sßsüla pnömoni ve retinit ile sonuçland[gl:ilçin, tüm CMV epitelyal hücre tropizm genlerinin ortadan kaldlElIhasIlEl, elde edilen vektörün patojenik potansiyelini önemli ölçüde azaltabilmektedir. Bulusun yönleri, bir SIV/HIV aslâlîlolarak kullanIi için RhCMV/HCMV vektörünün güvenligini önemli ölçüde gelistirecek olan ve aynlîzamanda asEl/ektörünün asilânmamE popülasyona bulasmasIEl/e potansiyel olarak yayilBiasIEönleyecek olan bu yüksek hedefli ve innovatif yaklasIiIa ilgilidir.
Diger yapilândlEinalar, yetiskinde hastalllZIa ve konjenital enfeksiyonu ile iliskili dokularda virüsü hafifletmesi için hücresel mikroRNA'larI (miRNA'lar) dokuya özgü ekspresyonundan faydalnÜBiasEile ilgilidir. miRNA'Iar insanlara ve bu sekil RM'ye drozofiladan tüm hayvan hücrelerinde yüksek derecede korunan ve eksprese edilen küçük kodlaylEIllmayan 21-22 bp RNA'IardlEl (Bartel, D.P. 2004. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.
Cell 116:281-297). miRNA'lar, bir genis biyolojik süreç araligJIa dahil edilen ve miRNA'nlEl destabilizasyonunun dönüsümünün inhibisyonuna yol açan miRNA'IarI 3' UTR'sinde hedef sekanslar baglanarak gen ekspresyonunu düzenlemektedir (Bartel, D.P. 2009. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136:215-233). Bu RNA türleri aynüamanda CMV ve ekspresyon gibi DNA virüslerinde kodlanmaktadlîlve bu miRNA'Iarn islevi, Dunn, W., Trang, P., Zhong, Q., Yang, E., van Belle, C., and Liu, F. 2005. Human cytome-galovirus expresses novel microRNAs during productive viral infection. Cell Microbiol 7:1684-1695; Grey, F., Antoniewicz, A., Allen, E., Saugstad, J., McShea, A., Carrington, J.C., and Nelson, J. 2005. Identification and characterization of human cytomegalovirus-encoded microRNAs. J A human cytomegalovirus-encoded microRNA regulates expression of multiple viral genes involved in replication. PLoS Pathog 3:e163 and Pfeffer, S., Sewer, A., Lagos-Quintana, M., Sheridan, R., Sander, C., Grasser, F.A., van Dyk, L.F., Ho, C.K., Shuman, S., Chien, M., ve meslekdaslarElZOOS. Identification of microRNAs of the herpesvirus family. Nat Methods 2:269-276 referanslarIa açllZland [gllîçljibi karakterize edilmektedir.
Memeli miRNA'Iar, konagi tüm dokularia yaygI olarak eksprese edilebilmektedir, bu miRNA türlerinin gelisimsel süreçlerde bir ana rol oynadlgJElembriyogenez sßsia sadece belirli süreler süsüda eksprese edilebilmektedir veya sadece bir dokuya özgü sekilde eksprese edilebilmektedir (örnegin miyeloid soy hücrelerinde miR-142-3p, CNS dokusunda miR-124 ve karacigerde miR-122) (Brown, B.D., Gentner, B., Cantore, A., Colleoni, S., Amendola, M., Zingale, A., Baccarini, A., Lazzari, G., Galli, C., and Naldini, L. 2007.
Endogenous microRNA can be broadly exploited to regulate transgene expression according Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., and Andino, R. 2008. Harnessing endogenous miRNAs to control virus tissue tropism as a strategy for developing attenuated virus vaccines. regulation of oncolytic herpes simpleks virus-1 for selective killing of prostate cancer cells. and tenOever, B.R. 2009. MicroRNA-mediated Species-specific attenuation of influenza A virus. Nat Biotechnol 27:572-576.). miRNA'larlEl dokuya özgü ekspresyonu, poliovirüs genomunun 3'UTR'sine CNS'de önemli ölçüde eksprese edilen miR-124'ün çoklu miRNA hedef sekanslarII dahil edilmesi sayesinde zaylÜhtllBilgl bir polio aslsîlîüretmek için kullanllîhaktadlE(Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., and Andino, R. 2008. Harnessing endogenous miRNAs to control virus tissue tropism as a strategy for developing attenuated virus vaccines. Cell Host Microbe 4:239-248). miR-124 hedef sekanslarII poliovirüs genomunun eklentisi, farelerde virüs enfeksiyonunu önemli ölçüde zaylühügllîajözlemlenmistir. Benzer bir sekilde, tüm memelilerde yaygI olarak eksprese edilen, fakat kuslara ait dokularda eksprese edilmeyen miR-93'ün çoklu hedef sekanslarÇI farelerde olmayacak sekilde tavuk yumurtalarIa büyüyebilen bir türe kElfllEl influenza mutantEile sonuçlanan influenzanI nükleoprotein genine eklenmistir (Perez, J.T., Pham, A.M., Lorini, M.H., Chua, M.A., Steel, J., and tenOever, B.R. 2009. MicroRNA-mediated Species-specific attenuation of influenza A virus. Nat Biotechnol 27:572-576).
Bulusun yapllândlîilnalarümürin CMV (MCVM) gibi daha büyük virüsler için etkili olan bu zayifliatma yaklasIiElile ilgilidir. Küçük RNA virüslerinin aksine, CMV, yaklasllZl olarak kodlamaktadlElveya virüsün yaplîal proteinlerini kodlamaktadlB Bu temel MCMV genlerinden birisi, virüste erken ve geç genlerin sonraki aktivasyonu için gerekli bir transkripsiyonel düzenleyici proteini kodlayan hEIEErken (IE) 3 genidir (fare, HCMV veya RhCMV'de IE2 ile iliskilidir). Bu genin silinmesi, hücrelerde ve fare dokularIda viral replikasyonu tamamen bloke etmektedir (Angulo, A., Ghazal, P., and Messerle, M. 2000. The major immediate-early Burada dokuya özgü miRNA'larI bu genin 3'UTR'sine hedef sekanslarI dahil edilmesinin, bu hücrelerinde viral replikasyonunu hafifletecegi açlElanmaktadlEl Bir diger yapllândlîilna, sadece miyeloid soy hücrelerinde eksprese edilen miR-142-3p'nin hedef sekanslarüle ilgilidir (Brown, B.D., Gentner, B., Cantore, A., Colleoni, S., Amendola, M., Zingale, A., Baccarini, A., Lazzari, G., Galli, C., and Naldini, L. 2007. Endogenous microRNA can be broadly exploited to regulate transgene expression according to tissue, virüsün bir rezervuarIEtemsil ettigi gösterilmistir ve konak boyunca virüsü barIlEMglIZl/e yaydlgllîldüsünülmektedir (Jarvis, M.A., and Nelson, J.A. 2002. Mechanisms of human cytomegalovirus persistence and Iatency. Front Biosci 7:d1575-1582). MCMV ile olan diger çallgnalar (Snyder, C.M., Allan, J.E., Bonnett, E.L., Doom, C.M., and Hill, A.B. Cross- presentation of a spread-defective MCMV is sufficient to prime the majority of virus-specific CD8+ T cells. PLoS One 5:e9681), çapraz hazlübmanlü, CMV ile kodlanmlgl proteinlerin, immün yan-El hazlEIladlglÇl miyeloid dendritik hücrelerdeki replikasyonun, CMV Immunojenesitende sasIlEEl bir sekilde bir minimum etkiye sahip olabildigi, birincil mekanizmalardlB Bakteriyel yapay kromozom (BAC)-bazll:lteknoloji, temel viral geni IE3'ün (IE3-142)`si içerisinde hücresel miRNA, miR-142-3p'ye kesin tamamlayElDEla dört tekrar edilen hedef sekanslarlîadört 21mer) içeren bir rekombinant MCMV virüsünü üretmesi için kullanilüiaktadlEl miR-142-3p ekspresyonunun IE3-142 replikasyonunu baskllâdlgilîlölçüyü onaylamak Için, makrofaj hücre dizisinde (IC-21) virüs büyüme deneyleri uygulanmaktadIEl RT-PCR analizi, miR-142-3p seviyelerini (SEK. 21) eksprese ettigini onaylamlStEl Ön deneyler CMV'nin hücre türü spesifik zayIfllamas- yönelik yaklasIiI yararliüglüü dogrulamlStlEI IE3-142 fibroblastlarda sokak türü seviyelere kopyalanmasi ragmen, büyüme, IC-21 makrofaj hücrelerinde tamamen bloke edilmistir (SEK. 22 ve 23). IE3 ekleme bölgesi içerisinde sadece vektör sekansIülçeren bir kontrol virüsü (IE3-015), IC-21 hücrelerinde sokak türü seviyelere kopyalanmaktadlE RT-PCR analizi, IE3 ekspresyonunun, IC-21 hücrelerinin enfeksiyonundan sonra, fakat IE3 ekspresyonunu kesilmesinin, hedef sekansI yerlestirilmesinden kaynaklanmadlgiIEigösteren fibroblast hücrelerin (miR-142-3p ekspresyonundan mahrum) enfeksiyonundan sonra olmayacak sekilde tamamen kaldlîllüilgtlü Bulusun yapilândülnalarüvirüslerin, miRNA hedef sekanslarEl/e temel viral genlere hücreye özgü miRNA'IarI hedeflenmesi sayesinde miyeloid hücrelerde MCMV hafifletilmesini kullanarak dokuya özgü büyüme için hafifletilebildiginin gösterildigi temelde CMV'nin hafifletilmesi stratejisi ile ilgilidir. CNS, konjenital ve yetiskin hastaligiliîda CMV patojenezine yönelik bir an hedef oldugu için, CNS'de replikasyonu önlemek için temel CMV genlerine kaynasiEJ olan nöronlarla spesifik olarak eksprese edilen yüksek derecede korunmus miRNA'larlEl hedef sekanslarIEiçeren RhCMV/SIV asilârEl/e HCMV/HIV üretilmektedir. Bu hücre türünde CMV vektörünün replikasyonunu ve dagilB1asIEönIemek için miyeloid miRNA miR-124'ün hedef sekanslarEtla kullanilEwaktadlEl Bu zayifibtilfnlgl virüsler birlikte tüm insan hedef popülasyonlaria bu asEkulIanlIlZmümkün hale getirecek olan bir diger güvenlik seviyesini saglayacaktlB Güvenli CMV vektörlerini üretmek için miRNA dokusuna özgü ekspresyonun kullanIilEb yönelik dönüsümsel uygulamanI yanlîisß, en göze çarpacak sekilde hücre türlerinin, CMV enfeksiyonunun, T hücresi immünitesinin indüksiyonunun ve burada açilZIanan hastal[g]I olusumu ve Erarüçin gerekli oldugu saptamaslîdahil olmak üzere ilk defa önemli bilimsel sorularlleormak için araçlar mevcuttur. Bulusun yapHândlElnalarÇl CMV ile temin edilen yanitlar. yüksek frekanlelfEM-Yanllîil' hücresi immünite özelliginin olustugu ve viral tropizm klîlfiamasII CMV hastaligill özelligini nasilîldegistirdigine dair saptama için çok önemli olabilen belirli hücre türlerinin enfeksiyonu ile ilgilidir.
BazEkEifibyEßlmayan klglaltmalar asagIkileri içermektedir: Bakteriyel yapay kromozom Bronkoalveolar Iavaj Merkez haflîla Sitomegalovirüs Sitotoksik gen Doksisiklin Enzime baglElbagElKliEldeneyi Efektör haflîhsEl Insan sitomegalovirüsü Hepatit C virüsü Insan immün yetmezlik virüsü Hücre içi sitokin boyamaslZI Intraperitoneal Mürin sitomegalovirüsü Mürin embriyonik fibroblast Enfeksiyonun çoklugu Insan olmayan primat Nükleoprotein Yapgl olmayan AçlEIokuma çerçevesi Periferik kan Periferik Kan Mononükleer Hücre Polimeraz zincir reaksiyon Plak olusturma birimi Makak sitomegalovirüsü Subkütanöz Simian baglSIIZJilZJyetmezlik virüsü Tetrasiklin Sokak türü Aksi belirtilmedikçe, teknik terimler, geleneksel kullanIia göre kullanllBiaktadlÜ Moleküler biyolojide yayg terimlerin tanilarüOxford University Press tarafldan basüân 1994 (ISBN Biology; ve VCH Publishers, Inc., tarafli-man basüân Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference referansIa bulunabilmektedir.
Bulusun çesitli yapHândlEnalarlEllEl incelemesine olanak saglamak için, asagldhki terminoloji kullanilâbilmektedir: Adjuvan: Bir antijene veya diger bilesime immün yan-Elspesifik olarak arttlîrlnayan bir madde veya vehikül. Adjuvantlar, antijenin soguruldugu minerallerin bir süspansiyonunu (alum, alüminyum hidroksit veya fosfat); veya antijen çözeltinin, bazen antigenesiteyi gelistirmek için öldürülen miyobakterilerin (Freund tam adjuvanD] dahil edilmesi ile mineral yagda (örnegin Freund tam olmayan adjuvan) emülsifiye edildigi yag içerisinde su emülsiyonunu içerebilmektedir. Immünostimülar oligonükleotidler (örnegin bir CpG motifini içerenler gibi) aynüamanda adjuvanlar olarak kullanilâbilmektedir (örnegin bkz. 6,429,199 sayHJIbatent dokümanm Adjuvanlar aynEizamanda es uyarlîlîmoleküller gibi biyolojik molekülleri içermektedir. Örnek teskil eden biyolojik adjuvantlar, IL-2, RANTES, içermektedir.
Uygulama: Seçilen bir yöntemle bir hastaya bir bilesimin dahil edilmesi. Örnegin seçilen yolun intravenöz olmasEhalinde, bilesim, hastanI bir damar. bilesimi dahil ederek uygulanmaktadlü Uygulama lokal veya sistemik olabilmektedir. Lokal uygulama örnekleri, kiîiflhylîlîlolmayacak sekilde topikal uygulama, subkütanöz uygulama, intramüsküler uygulama, intratekal uygulama, intraperikardiyal uygulama, göz içi uygulama, topik oftalmik uygulama, nazal mukozaya veya inhalasyonal uygulama ile akcigerlere uygulamayEiçermektedir. Sistemik uygulama, dolasIi sistemi vasiliislýla genis oranda vücut boyunca bir aktif bilesigi veya bilesimi dagüîmak için tasarlanan herhangi bir uygulama yönünü içermektedir. Bu sebepten ötürü, sistemik uygulama kElflhyEEI olmayacak sekilde intraperitoneal, intra-arteriyel ve intravenöz uygulamayEiçermektedir.
Sistemik uygulama aynEizamanda, klgflbylîljolmayacak sekilde topikal uygulama, subkütanöz uygulama, intramüsküler uygulama veya bu tarz bir uygulama, dolasIi sistemi ile vücut boyunca emilime ve dagEEia yönlendirildiginde Inhalasyon ile uygulamayülçermektedir.
Hayvan: CanlEçok hücreli omurgalEl/eya omurgaslîl organizma, örnegin memelileri ve kuslarEiçeren bir kategori. Memeli terimi, insan ve insan olmayan memelileri içermektedir. primatlar”, maymunlar, sempanzeler, orangutanlar, babunlar ve makaklar gibi simian primatlardlB Benzer bir sekilde “hasta" terimi, insan olmayan primatlar gibi insan ve veteriner hastalarüçermektedir.
Antikor: Antikorlar, bir antijeni (bununla immünoreaktif) baglayan bir antijen baglama bölgesini içeren moleküller gibi immünoglobulin molekülleri ve immünoglobulin moleküllerinin immünolojik olarak aktif bölümlerini içermektedir. Dogal yollarla olusan bir antikor (örnegin IgG, IgM, IgD), birbirlerine disülfür baglar ile baglanan iki agIE(H) zincir ve iki hafif (L) zincir olmak üzere dört polipeptit zinciri içermektedir. Fakat bir antikorun antijen baglama islevinin, dogal yollarla olusan bir antikorun fragmanlarü ile uygulanabildigi gösterilmistir. Bu sebepten ötürü, bu antijen baglama fragmanlarIlEI aynü zamanda “antikor” terimi ile ifade edilmesi amaçlanmaktadE Antikor terimi içerisinde kapsanan baglama fragmanlarII spesifik, kEIflhyEJJImayan örnekleri (I) VL, VH, CL ve CH1 alanlarIan olusan bir Fab fragmanllîlûi) VH ve CH1 alanlarIan olusan bir Fd fragmanlEllîlÜii) bir antikorun tek bir kolunun VL ve VH alanlarlEUan olusan bir Fv fragmanlElÇlÜv) bir VH alanlrîhan olusan bir dAb fragmanIEKWard ve meslekdaslarü Nature bir F(ab')2 fragmanßllj bir dayanak bölgesinde bir disülfür köprü ile baglanan Fab fragmanlarlügeren bir bivalent fragmanübermektedir.
Antijen: Bir hayvana enjekte edilen veya sogurulan bilesimler dahil olmak üzere bir hayvanda antikorlarI veya bir T hücresi yan-I üretimini uyarabilen bir bilesik, bilesim veya madde. Bir antijen, heterolog immünojenlerle indüklenenler dahil olmak üzere spesifik humoral veya hücresel immünite ürünleri ile reaksiyona girmektedir. “Antijen” terimi, tüm iliskili antijenik epitoplarlîiçermektedir. “Epitop” veya "antijenik belirleyici“ terimi, B ve/veya T hücrelerinin yan[lîl verdigi bir antijende bulunan bir bölgeyi ifade etmektedir. Bir yapüândlünada, Y hücreleri, epitop bir MHC molekülü ile baglantiIJBJlarak sunuldugunda epitopa yanlElvermektedir. Epitoplar, bir proteinin üçüncül katlanmasüle maruz kalan aralilZSlZl amino asitlerden veya aralllZIEI amino asitlerden olusturulabilmektedir. AraliElslîl amino asitlerden olusturulan epitoplar genellikle denatüre edici solventlere maruziyette kallElken, üçüncül katlama ile olusturulan epitoplar, denatüre edici solventlerle tedavide kaybolmaktadß Bir epitop genellikle bir benzersiz uzaysal konformasyonda en az 3 ve daha genel olarak en az 5, yaklasik] 9 veya yaklasllZl 8-10 amino asidi içermektedir. EpitoplarI uzaysal konformasyonunun belirlenmesine yönelik yöntemler, örnegin x-lgülükristalografi ve 2 boyutlu nükleer manyetik rezonansü içermektedir.
BazElyapHândlEnalarda, bir antijen, tümör hücrelerinde (örn. bir tümör antijeni) spesifik olarak eksprese edilen bir polipeptittir. BazEldurumlarda, tümör antijenleri aynElzamanda normal hücrelerde eksprese edilmektedir, fakat normal hücrelerde bulunan ekspresyon seviyesi, tümör hücrelerinde ekspresyon seviyesinden önemli ölçüde daha düsüktür. BazEl yapllândlîrlnalarda, antijen, bir patojene özgü antijendir. Mevcut bulusuI baglamIa, bir patojene özgü antijen, patojene karsEbir immün yan-[Hemin eden bir antijendir ve/veya bir patojene benzersizdir (örnegin bir virüs, bakteri, mantar veya protozoan).
Antijenik fragman: Bir immün yan-Dortaya çllZlarabilen polipeptidin bir proteininin herhangi bir bölümünü ifade etmektedir.
Antijene özgü T hücresi: Belirli bir antijeni tanIiIayan bir CD8+ veya CD4+ Ienfositleri.
Genellikle antijene özgü T hücreleri MHC molekülleri tarafIan temsil edilen belirli bir antijene spesihk olarak baglanmaktadlî] fakat aynül/IHC ile temsil edilen diger antijenlere baglanmamaktadE ZayLÜhtlIIhlg Bir canllîlvirüsün kapsamlEUa, virüs, bir hücreyi veya hastayüenfekte edebilme kabiliyetinin ve/veya hastalllZJ üretebilme kabiliyetinin bir sokak türü virüsü klýlasla azaltllÜiasEl(örnegin ortadan kaldßlîhasD] halinde zayifllatllîhaktadü Genellikle zayiflbtllßîgl bir virüs, bir immünokompetan hastaya uygulama sonrasia bir immün yan-I ortaya çilZlnasEiçi en azIan bir k-i kapasiteyi tutmaktadlEl Bazüjurumlarda, zaylûhtllüilgl bir virüs, herhangi bir enfeksiyon isaretine veya semptoma yol açmadan bir koruyucu immün yan-@maya çlEarabilmektedir. BazEýapllândÜnalarda, bir zaymbtüüilgl virüsün, bir hastada hastaliga yol açmasElkabiliyeti, sokak türü virüse göre en az yaklaslKl Kanser, tümör, neoplazi ve malignite: Bir neoplazm, aslEIl] hücre bölünmesinden kaynaklanan anormal bir doku veya hücre büyümesidir. Neoplastik büyüme, bir tümöre üretebilmektedir. Bir bireyde bir tümör miktarÇltümörün sayEÇIhacmi veya aglIlllglüJIarak ölçülebilen “tümör yüküdür". Mestaz olmayan bir tümör, "iyi huylu” olarak Ifade edilmektedir. Çevreleyen dokuyu isgal eden ve/veya metastaz olabilen bir tümör, ifade edilmektedir.
Hematolojik kanserleri, kan veya kemik iliginin kanserleridir. Hematolojik (veya hematojen) kanserlerin örnekleri, akut lösemi (akut Ienfositik lösemi, akut miyelositik lösemi, akut miyelojen lösemi ve miyeloblastik, promiyelositik, miyelomonositik, monositik ve eritrolösemi gibi), kronik lösemiler(kr0nik miyelositik (granülositik) lösemi, kronik miyelojen lösemi ve kronik lenfositik lösemi gibi), polisitemi vera, lenfoma, Hodgkin hastaligiü non-Hodgkin lenfoma (Indolent ve yüksek dereceli formlar), multipl miyelom, Waldenstrom makroglobülinemi, agE zincir hastaliglglmiyelodisplastik sendrom, saçaklEhücre lösemi ve miyelodisplazi dahil olmak üzere Iösemileri içermektedir. BazEljurumlarda, Ienfomalar katEl KatElzümörler, genellikle kist veya sMIBlanlarEiçermeyen anormal doku kütleleridir. Katü tümörler, iyi huylu veya malignan olabilmektedir. FarkIEkatEtümör türleri, bunlarljblusturan hücre türü (örnegin sarkomalar, karsonomalar ve lenfomalar) için adlandlîlöiaktadlü Sarkomalar ve karsinomlar gibi katEl tümörlerin örnekleri, fibrosarkom, Iipozarkom, kondrosarkom, osteosarkom ve diger sarkomlar, sinoviyom, mezotelyoma, Ewing tümörü, meme kanseri, akciger kanseri, yumurtalllZl kanseri, prostat kanseri, hepatoselüler karsinom, skuamöz papiller karsinom, papiller karsinom, insan papilloma virüsü (HPV) ile enfekte olmus neoplaziler, papiller adenokarsinomalar, medüller karsinom, bronkojenik karsinom, brons kanseri, akciger karsinomaslZlakciger karsinomasüakciger karsinomasüakciger karsinomasü renal hücreli karsinom, hepatoma, safra yolu kanseri, koryokarsinoma, Wilms tümörü, serviks kanseri, testiküler tümör, seminom, mesane karsinomasümelanoma ve CNS tümörlerini (örnegin bir Iiyom (beyinsapEglioma ve karlgllZJ glioma gibi) glioblastoma (aynlîlzamanda glioblastoma multiforme olarak da bilinmektedir) astrositom, CNS lenfoma, germinom, medulloblastom, Schwannoma kraniyofarojioma, ependy-moma, pinealom, hemanjioblastom, akustik nöroma, oligodendroglioma, menangiom, nöroblastoma, retinoblas-toma ve beyin metastazmiçermektedir.
CMV (sitomegalovirüs): Herpesvirüslerin ailesinin beta ait 5.. bir elemanElCMV, MCMV (mürin CMV), RhCMV (makak CMV) ve HCMV (insan CMV) gibi konak arallgilEla özgü varyantlarla bir genis (- çift sarmal DNA virüsüdür. Mevcut bulusun kapsam-a, “RhCMV", makak CMV'nin herhangi bir susunu, izolatIEl/eya varyantIElfade etmektedir. Belirli örneklerde, RhCMV, SEK KIM NO: 1'in nükleotid sekansIEi/eya SEK KIM içermektedir. Burada kullanIlgiEilizere, “HCMV”, insan CMV'nin herhangi bir susu, izolatüleya varyantlîiiçermektedir. Belirli örneklerde, HCMV, SEK KIM NO: 2-9 arasIan herhangi birisinin nükleotid sekanslarIIZl/eya SEK KIM NO: 2-9 arasIan herhangi birisine özdes olan en az içermektedir.
Kemoterapi: Kanser tedavisinde, kemoterapi, tümör veya kanser hücreleri gibi hlZIEbir sekilde çogalan hücrelerin öldürülmesi veya yeniden üretiminin yavaslatlEhasElçin bir veya birden fazla maddenin uygulanmasIDifade etmektedir. Belirli bir örnekte, kemoterapi, hastada tümör hücrelerinin say-[örnegin en az %50 ile azaltmak için bir veya birden fazla anti- neoplastigin uygulanmaslüfade etmektedir.
Kemoterapötik madde: Anormal hücre büyümesi veya hiperlazi ile karakterize edilen hastaliElarI tedavisinde kullanlglslü olan terapötik içeren bir madde. Bu tarz hastalilîlar, kanseri, otoimmün hastallglüve aynIZIzamanda psoriyazis gibi hiperplastik büyüme ile karakterize edilen hastaliElarEibermektedir. Teknikte tecrübe sahibi bir kisi, bir kemoterapötik maddeyi hali hazlEia belirleyebilmektedir (örnegin bkz. Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition; Perry ve meslekdaslarÇlChemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed., © 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer L, Berkery R (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer DS, Knobf MF, Durivage HJ (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993).
Azalma veya tükenme: Herhangi bir sekilde kalitesini, miktarII veya mukavemetinin azaltilBiaslZiçin. Bir örnekte, bir tedavi (örnegin burada saglanan yöntemler) bir tümörü (örnegin tümörün boyutu, tümör sayELîltümör metastazü tümörün tekrar olusumu veya bunlari kombinasyonlarDJ veya örnegin tedavi yoklugunda yanifllai klýlaslandigilîlüzere bir tümörle iliskili bir veya birden fazla semptomu azaltmaktadlEl Belirli bir örnekte, bir tedavi, tümörün boyutu, tümör saylgIZJtümör metastazütümörün tekrar olusumu veya bunlari kombinasyonlarlüdaha sonrasIa örnegin en az %10, en az %20, en az %50 veya hatta en az %90 bir azalma gibi tedaviyi azaltmaktadlB Benzer bir sekilde, diger yapilândlEinalarda, bir tedavi, bir patojen bulaslEEl/ükü veya titreyi azaltmaktadlîlveya enfeksiyonla iliskili bir veya birden fazla semptomu azaltmaktadE Silme: DNA sekansII çkhrüüiaslýla, çlKlarilân sekansI bir tarafIa bulunan bölgeleri bir araya getirilmektedir.
Etkili miktar: Bir hastada istenilen bir etkiye ulasmak için yeterli bir miktar islenmektedir. Bir aslEEgibi bir bilesimin etkili bir miktarljbir tedavi seyri süsia tek bir dozda veya çesitli dozlarda uygulanabilmektedir. Fakat bilesigin etkili miktarÇluygulanan bilesige, tedavi edile hastaya, hastalllîlsiddetine ve türüne ve bilesigin uygulama sekline baglßlacaktE Epitop: Ilgili bir epitop, bir antijen veya immünojen veya ilgili veteriner veya insan. bir patojeninden veya toksininden bunlarI immünolojik olarak aktif fragmanIlEl Ilgili bir epitop, patojen veya toksinin bir antijeni veya bir patojen veya toksinin bir antijeninden veya patojene göre bir tepki olusturan baska bir antijen veya toksinden veya patojene göre bir yanlfllîrlneydana getiren bir diger antijenden veya toksinden gelebilmektedir.
Ekspresyon: Bir nükleik asidin bir proteine dönüsümü, örnegin tümöre özgü veya patojene özgü bir antijeni kodlayan bir mRNA'nI bir proteine dönüsümü.
Ekspresyon Kontrol SekanslarlüIslevsel olarak bagland [giElbir heterolog nükleik asit sekansII ekspresyonunu, örnegin bir CMV genomunda birlestirilen ve ekspresyon kontrol sekanslar. islevsel olarak baglanan bir antijenik proteini kodlayan bir heterolog polinükleotidin ekspresyonunu düzenleyen nükleik asit sekanslarü Ekspresyon kontrol sekanslarl:l transkripsiyonu ve uygun oldugu sekilde nükleik asit sekansII dönüsümünü kontrol ettiginde ve düzenlediginde, ekspresyon kontrol sekanslarlZlbir nükleik asit sekans. islevsel olarak baglanmaktadlE Bu sebepten ötürü ekspresyon kontrol sekanslarüuygun promoterleri, gelistiricileri, transkripsiyon sonlandlEEllârÇlbir protein kodlayEEgenin önünde bir baslanglg kodonunu (ATG), intronlar için birlestirici sinyali, uygun mRNA dönüsümüne izin vermek için genin dogru okuma çerçevesinin sürdürülmesi ve durdurma kodonlarIlZiçerebilmektedir. bilesenleri içermesi ve mevcudiyetinin avantajllîbldugu ek bilesenleri, öncü sekanslarIIZl/e füzyon partner sekanslarIlZiçerebilmesi amaçlanmaktadlEl Ekspresyon kontrol sekanslarlîbir promoteri içerebilmektedir.
Bir promoter, transkripsiyonu yönlendirmek için yeterli bir minimum sekanstlE Aynüamanda harici sinyaller veya maddeler ile hücre türüne özgü, dokuya özgü olmasübin kontrol edilebilir olan veya indüklenebilir olan promotere bagnlügien ekspresyonunu dönüstürmesi için yeterli olan bu promoter elemanlarüdahil edilmektedir; bu tarz elemanlar, genin 5' veya 3' bölgelerinde konumlandlElIlâbilmektedir. Hem yaplglal hem de Indüklenebilir promoterler dahil edilmektedir (bkz. örnegin Bitter ve meslekdaslarü Methods in Enzymology 153:516-544, 1987). Örnegin bakteriyel sistemlerde klonlandlglia, bateriyofaj lambdanI pL'si, plac, ptrp, ptac (ptrp-Iac hibrid promoteri) ve benzeri gibi indüklenebilir promoterler kullanllâbilmektedir.
Bir yapllândlElnada, memeli hücre sistemlerinde klonland [glIa, memeli hücrelerinin genomundan (örnegin metalotionein promoteri) veya memeli virüslerinden (örnegin retrovirüs uzun terminal tekrar; adenovirüsü geç promoter; vaccinia virüsü 7.5K promoter) türetilen promoterler kullanllâbilmektedir. Rekombinant DNA veya sentetik tekniklerle üretilen promoterler aynlZlzamanda nükleik asit sekanslarII transkripsiyonunu saglamasEliçin kullanilâbilmektedir.
Bir polinükleotid, bir viral vektör dahil olmak üzere, bir promoter sekansIEiçeren, konagI eklenen genetik sekanleIlE] etkili transkripsiyonuna olanak saglayan bir promoter sekansIEl içeren bir ekspresyon vektörüne eklenebilmektedir. Ekspresyon vektörü genellikle bir replikasyon kaynaglElÇl bir promoteri ve aynlZlzamanda dönüstürülen hücrelerin fenotipik seçimine olanak saglayan spesifik nükleik asit sekanslarlüçermektedir.
Heterolog: Bir heterolog polipeptid (örnegin bir heterolog antijen) veya polinükleotid, bir farklEkaynaktan veya türden türetilen bir polipeptit veya polinükleotidi ifade etmektedir.
Burada bazlîlyapilândlülnalarda, heterolog sekansÇl ikinci sekanstan, bir virüs veya diger organizma gibi bir farklügenetik kaynaktan gelmektedir. Belirli örneklerde, heterolog sekansü bir tümör antijen veya bir patojene özgü antijeni kodlayan bir nükleik asit sekansIlEl Immünojenik (veya antijenik) peptit: Peptidin, bir MHC molekülünü baglayacagüve bir sitotoksik T Ienfosit (“CTL") yan-Üeya immünojenik peptidin türetildigi antijene karsElbir B hücresi yan-&örnegin antikor üretimi) indükleyecegi sekilde bir N-terminal tekrarlîgibi bir alele özgü motif veya diger sekanlelElçeren bir peptit. Bir yapllândlElnada, immünojenik peptitler, nöral net veya teknikte bilinen polinominal saptamalar gibi sekans motifleri veya diger yöntemler kullanllârak belirlenmektedir. Algoritmalar genellikle, belirli bir affinitede bunlara yüksek bir baglanma olasiIJEElveren ve immünojenik olacak olan skorlara sahip olanlar. seçimine yönelik peptitlerin "baglanma esigini” belirlemek için kullanllßîaktadB Algoritmalar, belirli bir konumda belirli bir amino asidin MHC baglantlglöla yönelik etkilere, belirli bir konumda belirli bir amino asidin antikor baglant- yönelik etkilerin veya bir motif içeren peptitte belirli bir ikamenin baglanmasi yönelik etkilere dayalElolmaktadlEl Bir immünojenik peptidin kapsamüiçerisinde, bir “korunmus kaIlEtE] bir peptitte belirli bir konumda rastgele dagIIJEh ile beklenenden önemli ölçüde daha yüksek bir frekansta görülen bir kaIlEIIB Bir yapilândlEnada, bir korunmus kallEtüMHC yapIlEl, immünojenik peptide bir temas noktasßaglayabildigi bir kaIlEtIE Immün yanitJEImmünitede bir degisi, örnegin bir B hücresi, T hücresi, makrofaj, monosit veya polimorfonükleosit gibi immün sisteminin bir hücresinin bir hastada bir immünojenik maddeye bir yanIElElYanlD belirli bir antijene özgü olabilmektedir (bir “antijene özgü yanilî'i).
Belirli bir örnekte, bir immün yaniülglbir CD4+ yanifllîl/eya bir CD8 yaniEllîgibi bir T hücresi yanBHllB Bir diger örnekte, yanlEI bir B hücresi yanlflüilElve immünojenik maddeye spesifik antikorlarI üretimi ile sonuçlanmaktadlîl BazElörneklerde, bu tarz bir immün yanllîlü immünojenik madden veya immünojenik maddenin kaynagldan hastaya koruma saglamaktadlü Örnegin yanltÇl tümörün metastazlEb müdahale ederek veya bir tümörün say-!Ereya boyutunu azaltarak bir tümöre sahip olan bir hastayEltedavi edebilmektedir. Bir diger örnekte, immün yanifliîlbir bulaslEElhastaligia sahip bir hastayEiIedavi edebilmektedir. Bir immün yaniiîlllktif olabilmekte ve hastanI immün sisteminin uyarIiIEilçerebilmektedir veya pasif olarak elde edilen immüniteden sonuçlanan bir yanlElolabilmektedir. Bir “tekrarlEbir sekilde uyarilhig' immün yanlEllZl bir konak içerisinde bir antijenin tekrar eden üretimi ile immün sisteminin periyodik ve tekrarlaylîlliiyarIiIan kaynaklanan bir uzun dönemli immün yanitIliü BazEörneklerde, artan veya gelistirilmis immün yanlEDbir hastanlEl, bir tümör veya bulaslEIJIastalüögibi bir hastalüîla savasabilmesi kabiliyetinde bir artlStlB Immünite: Koruyucu bir yanifllîbir immünojenik maddeye maruziyet üzerine monte edebilme durumu. Koruyucu yanlîlbr, antikor araclIIEIeya immün hücresi aracll]l`(l›labilmektedir ve belirli bir patojene veya tümör antijenine dogru yönlendirilebilmektedir. Immünite (örnegin dogal yollarla veya bir farmasötik bilesimde bir immünojenik maddeye maruziyet vasltîlislýla) aktif bir sekilde veya (örnegin antikorlarI uygulanmasüieya in vitro uyarilân ve genisletilen T hücrelerinin vaslliislýla) pasif bir sekilde edinilebilmektedir. Burada tarif edilen bazü yapllândlElnalarda, immünite, örnegin bir patojene özgü antijen veya bir tümör antijeni gibi belirli bir antijeni eksprese eden bir rekombinant CMV vektörünün uygulanmasEKörnegin intraperitoneal veya intravenöz uygulama vasiEislîLla) sayesinde edinilmektedir.
BulaslEEEIastalith Mantar, parazit, protozoan, bakteri veya virüs gibi bir patojenin yol açtigiEbir hastallEl Bir hastallgIEl inhibe edilmesi veya tedavi edilmesi: Tam gelisimin inhibe edilmesi veya bir hastaligll veya kosulun yeniden olusumu. “Tedavi" terimi, gelismeye basladlEtan sonra bir hastallgll veya patolojik kosulun bir isaretini veya semptomunu hafifleten terapötik bir müdahaleyi ifade etmektedir. Bir hastaliga veya patolojik kosula referansla “hafifletilmesi” terimi, tedavinin gözlemlenebilir herhangi bir faydalEétkisini ifade etmektedir. FaydalEétkiIi, örnegin bir duyarllIlhastada hastalgll klinik semptomlar.. gecikmis bir baslanglEElveya nüksetmesi, hastallglI bazü/eya tüm klinik semptomlarlElEl siddetinde bir azalma, hastaliglI daha yavas olarak ilerlemesi, (hastaligiI kanser olmasühalinde metastazlarI say-I azaltUB1asÇl(hastallglI bir bulaslEZlhastalllZlolmasljhalinde) bir patojenin titresinde bir azalma, hastanI genel sagllglü/eya durumunda bir gelisme sayesinde veya belirli bir hastal[gb özgü olan teknikte iyi bilinen diger parametreler sayesinde kanifllanabilmektedir. Bir “profilaktik” tedavisi, örnegin bir hastallgiI isaretlerini sergilemeyen veya patoloji gelisim riskinin düsürülmesi amacEtin sadece erken isaretleri sergileyen bir hastaya uygulanan bir tedavidir.
Izole veya dogal yollarla olusmayan: Bir “izole” veya “dogal yollarla olusmayan" biyolojik bilesen (örnegin bir nükleik asit, molekül, protein veya organel) büyük ölçüde, bilesenin dogal yollarla olustugu organizmanI hücresinde, örnegin diger kromozomal ve ekstra kromozomal DNA ve RNA, proteinler ve organeller gibi, en azlEdan bir diger biyolojik bilesenden uzakta ayrllüilgl veya saflastlEllIhlStE “Dogal yollarla olusan” veya “izole” olan nükleik asitler ve proteinler, standart saflastlîrlna yöntemleri ile saflastlîllân nükleik asitleri ve proteinleri içermektedir. Terim aynüamanda bir konakta ve aynllamanda kimyasal olarak sentezlenen nükleik asitlerde rekombinant ekspresyonu ile hazIEIlanan nükleik asitleri ve proteinleri kapsamaktadlEl Islevsel olarak baglanan: Birinci nükleik asit, ikinci nükleik asit sekansEile bir islevsel iliskide yerlestirildiginde, bir birinci nükleik asit sekansÇl bir ikinci nükleik asit sekansEIIe islevsel olarak baglanmaktadlEl Örnegin bir promoter, promoterin, kodlama sekansII transkripsiyonunu veya ekspresyonunu etkilemesi halinde bir kodlama sekans- islevsel olarak baglanmaktadlîl Genellikle islevsel olarak baglanan DNA sekanslarEIarallKlsEdEl ve burada aynElokuma çerçevesinde ki protein-kodlama bölgesini bir araya getirmek için gereklidir.
AçllZl okuma çerçevesi (ORF): Herhangi bir iç sonlandlîilna kodonu olmadan amino asitler için bir dizi nükleotid üçlü (kodonlar) kodlama. Bu sekanslar genellikle bir peptide dönüstü rülebilmektedir.
Patojen: Hastaligla veya konaga hastaligb yol açan bir biyolojik madde. Patojenler, örnegin bakterileri, virüsleri, mantarlarüle protozoalarüçermektedir. Patojenler aynüamanda bulaslElZl maddeler olarak ifade edilmektedir.
Patojenik virüslerin örnekleri, klgflhylîljolmayacak sekilde asag-ki virüs familyalarIIZl içermektedir: Retroviridae (örnegin, insan immün yetmezlik virüsü (HIV), insan T-hücresi lösemi virüsü, Picornaviridae (örnegin, çocuk felci virüsü, hepatit A virüsü, hepatit C virüsü, enterovirüsler, insan koksatig virüsü, rinovirüsler, ekovirüsler, ayak ve aglîlhastalllîlvirüsü); Kalivirüsler (Norwalk virüsünü içeren gastroenterite neden olan türler); Togaviridae (örnegin, alfavirüsler (chikungunya virüsü, at ensefalit virüsleri, Simliki OrmanÜ/irüsü, Sindbis virüsü, Ross River virüsü), kümllîçllîl virüslerini içermektedir); Flaviridae (örnegin, dang virüsü, sarEl humma virüsü, BatENil virüsü, St. Louis ensefalit virüsü, Japon ensefalit virüsü, Powassan virüsü ve diger ensefalit virüsleri); Coronaviridae (örnegin, koronavirüsler, siddetli akut respiratuar sendrom (SARS) virüsü); Rhabdoviridae (örnegin, vesiküler stomatit virüsleri, kuduz virüsleri); Filoviridae (örnegin Ebola virüsü, Marburg virüsü); Paramiksoviridae (örnegin, parainfluenza virüsleri, kabakulak virusu, klîlamllg virüsü, solunum sinsityal virüsü); Ortomiksoviridae (örnegin influenza virüsleri); Buniaviridae (örnegin, Hantaan virüsleri, Sin Nombre virüsü, Rift Vadisi ates virüsü, bunya virüsleri, flebo virüsleri ve Nairo virüsleri); Arenaviridae (Lassa hummasü'irüsü ve diger hemorajik ates virüsleri, Machupo virüsü, Junin virüsü gibi); Reoviridae (örn., reovirüsler, orbivirüsler, rotavirüsler); Birnavindae; Hepadnaviridae (hepatit B virüsü); Parvoviridae (parvovirüsler); Papovaviridae (papilloma virüsleri, poliom virüsleri, BK-virüsü); Adenoviridae (adenovirüsler); Herpesviridae (herpes simpleks virüsü (HSV)-1 ve HSV-2; sitomegalovirüs, EpsteIn-Barr virüsü; varisella zoster virüsü; ve HSV-6 da dahil olmak üzere diger herpes virüsleri); Poksviridae (variola virüsleri, vaksinya virüsleri, poks virüsleri); ve Iridoviridae (Afrika domuz hummaslZlvirüsü gibi); Astroviridae; ve slflhndlîlmiamlg] virüsler (örnegin, hepatit B virüsünün kusurlu bir uydusu olarak düsünülen delta hepatit maddesi olan spongiform ensefalopatilerinin etyolojik maddeleri).
Bakteriyel patojenlerin örnekleri, kEIflbylEElolmayacak sekilde asag-kileri içermektedir: Helikobakter pilori, Koli basilisi, Vibrio kolera, Borelia burgdorferi, Lejyonella pnömofilya, Mikobakteri türleri (örnegin, M. tüberküloz, M. avium, M. intrasellulare, M. kansaii, M. gordonae), Stafilokok aureus, Neisseria gonokok, Neisseria menenjit, Listeria monositogenler, Streptokok piyojenler (A Grubu Streptokok), Streptokok agalaktiae (B Grubu Streptokok), Streptokok (viridans grubu), Streptokok faekalis, Streptokok bovis, Streptokok (anaerobik türler), Streptokok pnömoniae, patojenik Kampilobakteri türleri, Enterokok türleri, Hamofilus influenze, Basilus antrasis, korinebakteriyum difteri basili, korinebakteriyum türleri, Erizipelotriks rusiopatiae, Klostridyum perfringers, Klostridyum tetani, Enterobakteri aerogenes, Klebsiela pnömoni, Pasturela multosida, Bakteriyodes türleri, Fusobakteriyum nükleatum, Streptobazil moniliformis, Treponema palidyum, Treponema pertenue, Leptospira, Bordetella pertusis, Sigella fleksneri, Sigella dizanteri ve Aktinomikes israelli.
Mantarslîl patojenlerin örnekleri, klgfliaylîilîl olmayacak sekilde sunlariZliçermektedir: Criptokokkus neoformans, Histoplazma kapsulatum, Kokkidiodes immitis, Blastomikes dermatitit, Klamidya trakomatis, Candida albikans.
Parazitik/protozoan patojenler gibi patojenlerin örnekleri, klglfibylîlîilmayacak sekilde sunlariZl içermektedir: Plazmodyum falsiparum, Plazmodyum vivaks, Tripanozoma kruzi ve Toksoplazma gondii. Bulus, bir protozoan organizmaslîlveya klîlfliaylîlîlolmayacak sekilde Akantamoeba, Babesiyoz, Balansidoz, Blastosistoz, Koksidya, Dientamoebiasis, Amoebiyaz, Giardiya, Izosporazis, Leismaniyaz, Birincil amipik meningoensefalit (PAM), Sltîlna, Rinosporidiyoz, Toksoplazmoz - Parazitik pnömoni, Trikomonyaz, uyku hastallglEl/e Chagas hastal[gIII:içeren hastalllZIara yol açan organizmalar olabilen bir parazitle ilgilidir. Parazit, bir helmint organizmasü veya solucan veya klgifibylîü olmayacak sekilde Ankilostomiyaz/Hookworm, Anisakiyaz, Yuvarlak solucanlar - Parazitik pnömoni, Yuvarlak kurt - Balisaskariyaz, Tenya - Tenya enfeksiyonu, Klonorkiyaz, Dioktopime renalis enfeksiyonu, DifiI-lobotriaz - tenya, Gine solucanEl- Drakunkulaz, Ekinokokoz - tenya, Kil] kurdu - Enterobiyaz, Karaciger felaketi - Faskioloz, Faskiolopsiyaz - baglEtak krizi, gnatostomiyaz, hipomanolepiyaz, Ioa Ioa filariyaz, karabar sismeleri, mansonelliasis, filariaz, metagonimiyaz - baglßak aklEtlgLîi nehir körlügü, Çin Karaciger Fluke, Paragonimiasis, Akciger Fluke, Sistosomiasis - bilharziya, bilhalziyoz veya salyangoz feverasEaher tür) baglßak sistozomiyazü üriner sistozomiazis, Sistosoma japonikum tarafIdan Sistosomiaz, Asya bag [Elisak sistozomisi, Sparganoz, Strongiloidiaz - Parazitik pnömoni, SigilEltenyasDDomuz tenlemesi, Toksikaryaz, Trizinoz, Yüzücü kaslEtElÇl Kunduzum ve Elefantiaz Lenfatik filariaz içeren hastaIlKIara yol açan organizmalar olabilmektedir. Parazit, bir organizma veya klîlfliaylEEblmayacak sekilde parazit solucan, Halzoun Sendromu, Miyaz, Kigoe piresi, Insan BotlasElve Kand içeren hastallklara yol açan organizmalar olabilmektedir. Parazit, bir ektoparazite veya kEilîIhylEEI olmayacak sekilde Tahta kurusu, Bas biti - Pediküloz, Vücut biti - Pediküloz, Yengeç Iiçi - Pediküloz, Demodeks - Demodikoz, Uyuz, VidalDKurt ve Kokleomyiayülçeren hastaliKlarEýola açan organizmalar olabilmektedir.
Farmakolojik olarak kabul edilebilir taslSLIElEr: Mevcut bulusla uyumlu bir sekilde kullanlSJEI farmakolojik olarak kabul edilebilir tasMEüâr gelenekseldir. Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995 tarafIan yay-anan Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, buradan tarif edilen nükleotidleirn ve proteinlerin farmasötik iletimi için uygun bilesimleri ve formülasyonlarlâçllîlamaktadE Genelde, taslîlEEI yapElZl kullanüân özel uygulama moduna baglüolacaktlü Örnegin, parenteral formülasyonlar genellikle su, fizyolojik olarak salin, dengeli tuz çözeltileri, sulu dekstroz, gliserol veya bir araç benzeri gibi farmasötik olarak ve fizyolojik olarak kabul edilebilir slîlsîüçeren enjekte edilebilir slîllârlîilçermektedir. KatEHJilesimler (ör. toz, hap, tablet veya kapsül formlarLD için, geleneksel toksik olmayan katlîltaslîdalâr, örnegin manitolün, Biyolojik olarak nötr taslýlîllâra ek olarak, uygulanacak farmasötik bilesimler, ElatlEElieya emülsifiye edici maddeler, koruyucular ve pH tamponlaylîünaddeler ve örnegin sodyum asetat veya sorbitan monolaurat tarzEIbenzeri gibi toksik olmayan yardIiclIilnaddeIerin küçük miktarlarIEilserebilmektedir.
Plak olusturma birimleri (PFU): Bir izin verilen hücre hattIa plaklarüalusturabilme kabiliyeti ile belirlenen virüs dozunun veya titrenin bir ölçümü.
Polipeptit: Monomerlerin, amid baglarla birlikte bir araya getirilen amino asit kallütilâründugu bir polimer. Amino asitler alfa amino asitler oldugunda, L-optik izomer veya D-optik izomer, kullanilâbilmektedir, L-izomerler tercih edilmektedir. Burada kullan-@Egibi polipeptit veya protein terimi, herhangi bir amino asit sekansIElkapsamaktadB ve glikoproteinler gibi modifiye edilmis sekanslarülçermektedir. Polipeptit terimi, dogal yolarla olusan proteinleri ve aynEtamanda rekombinant olarak veya sentetik olarak üretilenleri kapsamaslîslspesifik olarak amaçlanmaktadlü Polipeptit fragmanElierimi, en az bir kullanlgllîeêpitop sergileyen bir polipeptidin bir bölümünü ifade etmektedir. "Bir polipeptidin islevsel fragmanlarlîl ibaresi, bir aktiviteyi tutan bir polipeptidin tüm fragmanlarIElveya fragman. türetildigi polipeptidin bir aktivitesinin ölçülebilir bir bölümünü ifade etmektedir. Örnegin fragmanlar, bir antikor molekülünü, bir hücre içerisinde fenotipik degisimlerin karakteristik indüksiyonuna veya programlamas. katüâbilen bir büyük polipeptide baglayabilen bir epitop kadar küçük bir polipeptit fragmanlEUan boyut olarak degiskenlik gösterebilmektedir. Bir epitop, bir antijenle temas halinde yanilîlolarak üretilen bir immünoglobulini baglayabilen bir polipeptidin bir bölgesidir.
Islevsel olarak benzer amino asitleri saglayan tutucu amino asit ikamesi tablolarüteknikte slßdan tecrübeye sahip bir kisi taraflEtlan iyi bilinmektedir. Asaglahki altügrup, bir birleri için tutucu ikameler olarak görülen amino asitlerin örnekleridir: 1)Alanin (A), Serin (S), Treonin (T); 2)Aspartik asit (D), Glutamik asit (E); 4)Arjinin I, Lizin (K); )Izolösin (I), Lösin (L), Metiyonin (M), Valin (V); ve 6) Fenilalanin (F), Tirosin (Y), Triptofan (W).
Bazlîdurumlarda, tutucu veya tutucu olmayarak amino asit degisimleri ile sonuçlanan cDNA sekansIaki varyasyonlar, kodlanmgl proteinin islevsel ve immünolojik benzerligini korumak için minimize edilmektedir. Proteinin immünolojik benzerligi, bir antikor taraflEUan tanlü tanlEmadigiEbelirlenerek degerlendirilebilmektedir; bu tarz bir antikorla tanln bir varyant immünolojik olarak tutulmaktadE Herhangi bir cDNA sekans varyantEliercihen yirmiden daha fazla ve tercihen ondan daha az amino asit ikamesini, kodlanmlglpolipeptide dahil edecektir.
Varyant amino asit sekanslarüörnegin natif amino asit sekans. %80, %90 veya hatta %95 veya %98 özdes olabilmektedir. Yüzde özdesliginin belirlenmesine yönelik programlar ve algoritmalar, NCBI websitesinde bulunabilmektedir.
SaflastlEllIhlgl “SaflastlEllIhlgl' terimi, mutlak safllga ihtiyaç duymamaktadlü bunun yerine bir nispi terim olarak amaçlanmaktadlEl Bu sebepten ötürü örnegin, bir saflastlEIIBiE protein preparasyonu, ifade edilen proteinin, bir hücre içerisinde veya bir üretim reaksiyon haznesi (uygun oldugu kadar) içerisinde dogal çevresinde proteinden daha saf oldugu bir preparasyondur.
Rekombinant: Bir rekombinant nükleik asit, dogal yollarla olusmayan veya baska bir sekilde ayrllân iki sekans segmentinin bir yapay kombinasyonu ile olusturulan bir sekansa sahip olan bir asittir. Bu yapay kombinasyon, kimyasal sentez ile veya daha genel olarak, örnegin genetik tasarIi teknikleri sayesinde oldugu gibi nükleik asitlerin izole segmentlerinin yapay manipülasyonu ile tamamlanabilmektedir.
Replikasyonu eksik: Burada kullanIlglEi'lizere, replikasyonu eksik bir CMV, bir konak hücrede bir kez viral replikasyona tabi olamayan bir virüstür veya genomunu kopyalama ve bu sekilde progen virionlarlüüretebilme kabiliyeti aç-dan önemli ölçüde klglflbnmaktadß Diger örneklerde, replikasyonu eksik virüsler, yayHIhasEl eksiktir, örnegin genomlarIEl kopyalayabilmektedirler, fakat virüs partikülleri, enfekte hücreden saIIErnad[gIj/eya bulaslED olmayan viral partiküller sallElnadlglElçin bir diger hücreyi enfekte edememektedirler. Diger örneklerde, replikasyonu eksik virüslerin yayllIhaslZbksiktir, örnegin bulaslEEl/Irüs, enfekte konaklarda salgHânmamaktadlEl bu sekilde virüs, konakta konaga yaylßmamaktadlîl BazEl yapllândlîilnalarda, bir replikasyonu eksik CMV, viral replikasyon (“temel genler”) için temel olan veya optimal replikasyon (“arttEEgenler') için gerekli bir veya birden fazla genlerde bir silmeyi içeren bir CMV'dir. CMV temel ve arttlElEEgenleri, teknikte tarif edilmistir ve burada tarif edilmektedir. Belirli örneklerde, CMV temeli veya arttlEEljgen, UL82, UL94, UL32, UL99, Numune veya biyolojik numune: Bir özneden elde edilen biyolojik bir numune, örnegin bir hücre, doku örnegi slîlîlZIBazüjurumlarda, biyolojik numuneler, genomik DNA, RNA (mRNA ve mikroRNA dahil), proteini veya bunlari kombinasyonlarIlZiçermektedir. Numunelerin örnekleri, klglflbylîljblmayacak sekilde salgÇltükürük, kan, serum, idrar, omurilik slîlggdoku biyopsisi, cerrahi numune, hücreler (PBMC'Ier, beyaz kan hücreleri, Ienfositler veya baglgIKllE sisteminin diger hücreleri gibi) ve otopsi malzemesini içermektedir.
Sekans özdesligi: Iki nükleik sekans arasiaki veya iki amino asit sekansElarasHaki benzerlik, baka bir sekilde sekans özdesligi olarak ifade edilen, sekanslar arasIaki benzerlik aç-an ifade edilmektedir. Sekans özdesligi lelllZla yüzde özdesligi (veya benzerligi veya homolojisi) aç-an ölçülmektedir; yüzde ne kadar yüksekse, iki sekans o kadar benzemektedir.
Klýhslamaya yönelik sekanslar. hizalanmasElyöntemleri teknikte iyi bilinmektedir. Çesitli programlar ve hizalama algoritmalarü yandakilerde açilZlanmaktadlEl Smith ve Waterman hesaplamalarII ayrlBtHJJZbir incelemesini sunmaktadlü Hizalama araçlarlZALIGN (Myers ve Miller, CABIOS , sekans klýhslamalarIEKInternet Program © 1996, W. R. Pearson ve the University of Virginia, kullanilâbilmektedir. ALIGN, birbirlerine karsEltüm sekanslarElklýlaslarken, LFASTA, lokal benzerlik bölgelerini külaslamaktadlB Bu hizalama araçlarEl/e ilgili ögreticiler, Internette NCSA Websitesinde mevcuttur. Alternatif olarak, yaklaslEl30 amino asitten daha büyük amino asit sekanslar.. klglaslamalarlîliçin, Blast 2 sekanslar.. islevi, varsayllân parametrelere ayarlanan (bosluk varllgiElmaIiyeti 11, artElkaIlEtDbas- bosluk maliyeti 1) varsayllân BLOSUM62 matrisini kullanarak kullanliâbilmektedir. K& peptitler hizalandigiua (yaklaslKi 30 amino asitten daha az), hizalama, Blast 2 sekanslar.. islevi kullanilârak, varsayliân parametrelere (aç[lZl bosluk 9, uzantElboslugu 1 cezalarLIl ayarlanan PAM30 matrisini kullanarak uygulanmalIEl BLAS sekansIZklýlaslama sistemi, örnegin NCBI web sitesinden temin edilebilmektedir; aynüamanda bkz. Altschul ve meslektaslarüJ. Mol. Biol. 215:403- Proteinlerin ortologlarügenellikle varsayliân parametrelere ayarlanan ALIGN kullanilârak spesifik proteinin amino asit sekansElIe tam uzunlukta hizalama üzerinde sayllân %75'ten daha büyük bir sekans özdesligine sahip olmasEiIe karakterize edilmektedir. Bir referans sekans. hatta daha büyük bir benzerlige sahip proteinler, örnegin en az %80, en az %85, en az %90, en az %92, en az %95 veya en az %98 gibi bu yöntemle degerlendirildiginde artan yüzde özdesliklerini sergileyecektir. Ek olarak sekans özdesligi, tarif edilen peptitlerin belirli alanlarII tam uzunlugu üzerinde klýlaslanabilmektedir.
Tüm sekanstan önemli ölçüde daha az sekans özdesligi için klýbslandlgilüda, homolog sekanslar genellikle 10-20 amino asidin klga arallElarEüizerinde en az %80 sekans özdesligine sahip olacaktlîlve referans sekans. olan benzerliklerine bagllîrblarak en az %85, en az %90, en az %95 veya en az %99 sekans özdesligine sahip olabilmektedir. Bu tarz klgia aralilZJar üzerindeki sekans özdesligi, LFASTA kullanilârak belirlenebilmektedir; yöntemler, NCSA Websitesinde açllîlanmaktadlü Teknikte uzman bir kisi, bu sekans özdeslik arallEJarIlEl, sadece küâvuz amaçlEisaglandEgilEtakdir edecektir; kuwetli bir öneme sahip homologlarlEJ, saglanana arallKlarIdElEla kalandan elde edilebilmesi tümüyle mümkündür.
Iki nükleik asit molekülünün yaklEI iliskide oldugunu gösteren alternatif bir gösterge, iki molekülün leElkosullar aItIa birbirlerine hibridize olmasIlEl SlEElkosullar sekansa bagllIlEl ve farklElçevresel parametreler aItIa farki-E SllZlîlkosuIIar genellikle, belirli bir iyonik mukavemette ve pH'da spesifik sekansa yönelik termal erime noktasEl'den yaklasllîl 5°C ila °C daha düsük seçilecektir. Tm, hedef sekansI o/ci50'sinin mükemmel bir sekilde eslestirilmis proba hibridize oldugu slîlaklllîtßwelirlenen iyonik mukavemet ve pH altia).
Nükleik asit hibridizasyonuna ve leIJJKlarI hesaplanmasi yönelik kosullar, Sambrook ve meslektaslarEUn Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989) ve Tijssen (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Part I, Ch. 2, Elsevier, New York, 1993) referansIa bulunabilmektedir.
Belirli sllZJIJKIdereceleriyle sonuçlanan hibridizasyon kosullarühibridizasyon seçim yönteminin yap_ ve hibridize edici nükleik asit sekanslarII bilesimine ve uzunluguna baglEbIarak degiskenlik gösterecektir. Genellikle hibridizasyon slîakllglüve hibridizasyon tamponunun iyonik mukavemeti (özellikle Na+ konsantrasyonu), vakit geçtikçe sllîllgllîatkilemesine ragmen hibridizasyon sllZllZ'jlElElbelirleyecektir. Belirli sllZlIJEI derecelerinin elde edilmesi için gerekli hibridizasyon kosullarEile ilgili hesaplamalar, Sambrook ve meslektaslarEKed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, bölümler 9 ve 11 referansElile açlKlanmaktadE Asaglflh, hibridizasyon kosullarII bir örnek teskil eden ayarElIardE Oldukça Yüksek SIKIIJKJ (%90 özdesligi paylasan sekanslarEllespit etmektedir) Hibridizasyon: 16 saatligine 65°C'de 5x SSC Yüksek SlElIlKl (%80 özdesligi veya daha fazlasIlIpaylasan sekanslarEllespit etmektedir) Iki kez yikama: her defaletla 5-20 dakikallgllEla RT'de 2x SSC iki Kez ylElama: her defasIa 30 dakikal[gll5h 55°C ila 70°C'de 1x SSC Düsük SlKIDKl(°/050'den daha büyük özdesligi paylasan sekanslarEliespit etmektedir) Hibridizasyon: 16-20 saatligine RT ila 55°C'de 6x SSC En az iki kez ylKlama: her defasIa 20-30 dakikalg. RT ila 55°C'de 2x-3x SSC Yüksek bir Özdeslik derecesi sergilemeyen nükleik asit sekanslarüyine de genetik kodun dejenereliginden dolayElbenzer amino asit sekanslarIElkodIayabilmektedir. Nükleik asit sekanslâdaki degisimlerin, her birisinin büyük ölçüde aynüproteini kodladlglElçok saylöia nükleik asit sekansIüliretmek için bu dejenereligi kullanarak olusturulabildigi anlasllüiaktadE Hasta: Canllgok hücreli omurgallîörganizmalar, hem insan hem de insan olmayan memelileri içeren bir kategoridir. Bu terim, bir hastadan alin numune üzerinde çalßbn kisinin hastanI kim oldugunu veya hatta numunenin nereden elde edildigini bilmesine gerek olmad[g]l3ekilde bilinen ve bilinmeyen bireyleri kapsamaktadlEI Tümör veya kanser antijen: Tümöre özgü T hücresi immün yanlflbrllîiliyarabilen bir antijen. Örnek teskil eden antijenler, klgthlEEöImayacak sekilde RAGE-l, tirozinaz, MAGE-l, MAGE- 2, NY-ESO-l, Melan-A/MART-l, glikoprotein (gp) 75, gp100, beta-katenin, PRAME, MUM-1, WT-1, CEA ve PR-l içermektedir. Teknikte ek tümör antijenleri bilinmektedir (örnegin bkz. açlElanmaktadlÜ(bkz. Tablo 2). Kanser antijeni ve tümör antijeni burada birbirlerinin yerine kullanüßiaktadlEl Antijenler, kElflhylEüilmayacak sekilde, yandakileri içeren kanserlerle iliskili olabilmektedir: Akut lenfoblastik lösemi; Akut miyeloid lösemi; Adrenokortikal karsinom; AIDS'e bagIEkanserler; AIDS'e baglEIenfoma; Anal kanseri; Apendiks kanseri; Astrositoma, çocukluk çaglîlserebellarlîlveya serebrali; Bazal hücre karsinomasü Safra kanallIlkanseri, ekstrahepatik; Mesane kanseri; Kemik kanseri, Osteosarkom/Malign fibröz histiyositoma; Beyin sapElgliomaslîl Beyin tümörü; Beyin tümörü, serebellar astrositom; Beyin tümörü, serebral astrositom/malign gliom; Beyin tümörü, ependimom; Beyin tümörü, medulloblastoma; Beyin tümörü, supratentoryal ilkel nöroektodermal tümörler; Beyin tümörü, görme yolu ve hipotalamik gliom; Meme kanseri; Bronsiyal adenomlar/karsinoidler; Burkitt lenfoma; Karsinoid tümör, çocukluk çagLîl Karsinoid tümör, gastrointestinal; Birincil bilinmeyen karsinom; Santral sinir sistemi lenfoma, birincil; Serebellar astrositom, çocukluk çagüSerebral astrositom/Malign gliom, çocukluk çaglîl Rahim agzEkanseri; Çocukluk çagEl kanserleri; Kronik Ienfositik lösemi; Kronik miyelojen lösemi; Kronik miyeloproliferatif bozukluklar; Kolon kanseri; Kutanöz T hücreli Ienfoma; Desmoplastik küçük yuvarlak hücre tümörü; Endometriyal kanser; ependimom; Yemek borusu kanseri; Ewing'in tümör ailesinden olan Ewing sarkomu; Ekstrakraniyal germ hücreli tümör, Çocukluk çaglîlEkstragonadal Germ hücreli tümör; Ekstrahepatik safra kanalElkanseri; Göz kanseri, göz içi melanomu; Göz Kanseri, Retinoblastoma; Safra kesesi kanseri; Gastrik (mide) kanser; Gastrointestinal Karsinoid Tümör; Gastrointestinal stromal tümör (GIST); Germ hücreli tümör: ekstrakraniyal, ekstragonadal veya yumurtalllît Gestasyonel trofoblastik tümör; Beyin sapII gliomasLîl Glioma, Çocukluk ÇagElAstrositomaslsîl Glioma, Çocukluk Görme YollarElve Hipotalamikler; Gastrik karsinoid; Tüylü hücre Iösemisi; Bas-boyun kanseri; Kalp kanseri; Hepa-hücreli (karaciger) kanser; Hodgkin lenfoma; Hipofaringeal kanser; Hipotalamik ve görsel yol glioma, çocukluk çaglîlGöz Içi Melanom; AdaclKl Hücre KarsinomasEKEndokrin Pankreas); Kaposi sarkom; Böbrapendiks kanseri (böbrek hücresi kanseri); Larenks kanseri; Lösemiler; Lösemi, akut lenfoblastik (akut lenfositik lösemi olarak da adlandlîilTEJ; Lösemi, akut miyeloid (akut miyelojenik lösemi olarak da adlandlEIUD; Lösemi, kronik lenfositik (kronik lenfositik lösemi olarak da adlandlElID; Lösemi, kronik miyelojen (ayrlEla kronik miyeloid lösemi olarak da adlandlîllTEJ; Lösemi, k[[[Elhücre; Dudak ve AgEl boslugu kanseri; Karaciger Kanseri (Birincil); Akciger Kanseri, Küçük Hücre Olmayan; Akciger Kanseri, Küçük Hücre; Lenfomalar; Lenfoma, AIDS ile ilgili; Lenfoma, Burkitt; Lenfoma, kutanöz T-Hücre; Lenfoma, Hodgkin; Lenfomalar, Non-Hodgkin (Hodgkin dlSlEUaki tüm IenfomalarI eski bir sIlEIlandEmaslIl Lenfoma, Primer Santral Sinir Sistemi; Marcus Whittle, Ölümcül Hastalllît Makroglobulinemi, Waldenstrom; Kemik/Osteosarkomun Malign Fibröz Histiyositomu; Medulloblastom, Çocukluk Çaglîl Melanom; Melanoma, GöziçigEl(Göz); Merkel Hücre Karsinomasü Mezotelyoma, Yetiskin Malignan; Mezotelyoma, Çocukluk Çaglsîl Metastatik Skuamöz Boyun Kanserinde Gizli Ilkögretim; Aglîl Kanseri; Çoklu Endokrin Neoplazi Sendromu, Çocukluk Çaglîl Multipl Miyelom/Plazma Hücre Neoplazmlîl Mikoz Fungoides; Myelodis Plastik Sendromlar; Myelodisplastik/Myeloproliferatif Hastal[lZlar; Myelojen Lösemi, Kronik; Myeloid Lösemi, Yetiskin Akut; Myeloid Lösemi, Çocukluk ÇagElAkut; Miyelom, Çoklu (Kemik Iligi Kemigi Kanseri); Myeloproliferatif Bozukluklar, Kronik; Burun boslugu ve paranazal sinüs kanseri; Nazofarenks karsinomu; Nöroblastom; Non-Hodgkin lenfoma; Kucuk hucreli olmayan akciger kanseri; AglZlkanseri; Orofaringeal kanser; Osteosarkom/malign fibröz histiosit-toma kemigi; Yumurtalllîl kanseri; YumurtallKl epitel kanseri (Yüzey epitelyaI-stromal tümör); Ovarian germ cell tumor; YumurtalllZJ düsük malign potansiyel tümör; Pankreas kanseri; Pankreas kanseri, adaclRl hücresi; Paranasal sinüs ve burun boslugu kanseri; Paratiroid kanseri; Penil kanser; Pharyngeal cancer; feokromositoma; Pineal astrositom; Pineal germI-noma; Pineoblastom ve supratentorial Ilkel nöroektodermal tümörler, çocukluk çag ElHipofiz adenomu; Plazma hücresi neoplazisi/Multiple miyeloma; Pliyopulmoner blastoma; Primer merkezi sinir sistemi lenfoma; Prostat kanseri; Rektal kanser; Renal hücreli karsinom (böbrapendiks kanseri); Renal pelvis ve üreter, geçisli hücre kanseri; Retinoblastom; Rabdomiyosarkom, çocukluk çaglîlTükrük bezi kanseri; Sarcoma, Ewing ailesinin tümörleri; Sarkom, kaposi; Sarkma, yumusak doku; Sarkma, uterus; Sezary sendromu; Deri kanseri (nonmelanom); Deri kanseri (melanoma); Deri karsinomasü Merkel hücresi; Küçük hücreli akciger kanseri; Ince baglîsak kanseri; Yumusak doku sarkomu; Skuamöz hücreli karsinom - bkz. Cilt kanseri (nonmelanom); Gizli primer metastatik Skuamöz boyun kanseri; Mide kanseri; Supratentorial ilkel nöroektodermal tümör, çocukluk çagIZIT-hücreli lenfoma, kutanöz (Mycosis Fungoides ve Sézary sendromu); Testis kanseri; GIIak kanseri; Timoma, çocukluk; Timoma ve timik karsinom Tiroid kanseri; Tiroid kanseri, çocukluk çaglîl Renal pelvis ve üreterin geçici hücre kanseri; Trofoblastik tümör, gebelik haftaslîlBilinmeyen birincil site, karsinomaslgleriskin; Bilinmeyen birincil bölge, kanser, çocukluk; Üreter ve renal pelvis, geçisli hücre kanseri; Üretral kanser; Uterin kanseri, endometrial; Uterin sarkom; Vajinal kanser; Görme yolu ve hipotalamik gliom, çocukluk çaglîl Vulvar kanseri; Waldenstrom makroglobulinemi ve Wilms tümörünü (böbrapendiks kanseri), çocukluk çaglîl Asaglahkiler/yandakiler Için yeterli kosullar altIa: Istenilen aktiviteye izin veren herhangi bir çevreyi açilZlamak için kullanilân bir ibaredir.
Aslîlaktif immünite gibi immünitenin bir hastaligla veya diger patolojik kosula saglanmasülçin bir insan gibi bir memeliye uygulanabilen bir immünojenik bilesim. Asüâr, profilaktik olarak veya terapötik olarak kullanilâbilmektedir. Bu sebepten ötürü, asllâr, bir hastallEJ gelistirme olasililjllüörnegin bir tümör veya enfeksiyon) azaltmak için veya bir hastaligll veya kosulun semptomlar.. siddetini azaltmak için, hastal[glI veya kosulun (örnegin bir tümör veya enfeksiyon) ilerlemesini kßflhmak veya bir hastallg'lI veya kosulun nüksetmesini klîlflhmak için kullanllâbilmektedir. Belirli yapilândlîilnalarda, bir aslZlbir patojene özgü antijen veya bir tümör antijeni gibi bir heterolog antijeni eksprese eden bir rekombinant CMV'dir (örnegin bir rekombinant HCMV veya rekombinant RhCMV).
Vektör: Belirli sekansI nükleik asit molekülleri, daha sonrasIa dönüstürülen bir konak hücrenin üretildigi sekilde bir konak hücreye dahil edilen bir vektöre dahil edilebilmektedir.
Bir vektör, örnegin bir replikasyon kaynaglîgibi bir konak hücrede kopyalanmaya izin veren nükleik asit sekanslarIEiçerebilmektedir. Bir vektör ayn Bamanda nükleik asit ekspresyonunu yönlendiren promoter elemanlar dahil olmak üzere teknikte bilinen bir veya birden fazla seçilebilir isaretleyici genleri ve diger genetik elemanlarEiçerebilmektedir. Vektörler, örnegin CMV vektörleri gibi viral vektörler olabilmektedir. Viral vektörler, replikasyonu eksik virüs dahil olmak üzere sokak türü veya zayEflhtüüilgvirüsten olusturulabilmektedir. Vektörler ayn!] zamanda, teknikte bilinen herhangi bir plazmid dahil olmak üzere viral olmayan vektörler olabilmektedir.
Virüs: Canlüiücrelerin içerisinde yeniden üreyen mikroskopik bulaslaîbrganizma. Bir virüs, esasen bir protein kaplamasEl(kapsid) ile çevrelenen bir nükleik asit (viral genom) çekirdeginden olusmaktadIEl ve sadece bir canlEl hücrenin içerisinde kopyalanabilme kabiliyetine sahiptir. "Viral replikasyonu”, en az bir viral yasam döngüsünün nüksetmesi ile ek virüs partiküllerinin üretimidir. Bir virüs, hücrenin virüs taraflEdan belirlenen bir sekilde hareket etmesini saglayarak konak hücrenin normal islevlerini alt üst edebilmektedir. Örnegin bir viral enfeksiyon, bir sitokini üreten veya enfekte olmayan hücre normal bir sekilde islevini yerine getirmediginde bir sitokine yanlElveren bir hücre ile sonuçlanabilmektedir.
Bir “Iitik” veya “akut” viral enfeksiyonda, viral genom, viral kapsidin üretimi için gerekil polipeptitleri üreterek kopyalanmakta ve eksprese edilmektedir. Olgun viral partiküller, hücre kopyalanmaktadlîl fakat kapsid proteinleri üretilmemekte ve viral partiküllere düzenlenmemektedir.
Aksi sekilde belirtilmedikçe, burada kullanllân tüm teknik ve bilimsel terimler genellikle teknikte uzman bir kisi tarafIan ortak olarak anlasllâcak sekilde aynünlamEtaslaktadlEl Benzer bir sekilde "veya” teriminin, aksi açEIZÇa belirtilmedikçe, “ve" kelimesini içermesi amaçlanmaktadlEI Burada “A veya B içeren" terimi, A veya B ya da A ve B'nin içerilmesi anlam. gelmektedir. Aynüamanda nükleik asitler veya polipeptitler için sunulan tüm baz boyutlarIEllEl veya amino asit boyutlari. ve tüm moleküler aglîlllgll veya moleküler kütle degerlerinin uygun oldugu ve açlk`lama amaclýla saglandlglîlanlasßaktadlü Burada tarif edilenlere benzer veya es deger olan yöntemler ve malzemeler, mevcut bulusun uygulanmasIa veya test edilmesinde kullanüâbilmesine ragmen, uygun yöntemler ve malzemeler asagi tarif edilmektedir. Bir anlasmazllEl yasanmasi] halinde, terimlerin açIIamaIarEiçeren mevcut tarifname kontrol yapacaktlE Ek olarak, malzemeler yöntemler ve örnekler sadece gösterim amaçlIlEve klglflhylîlîiitelikte degildir.
Burada patojene özgü antijenler veya tümör antijenleri gibi heterolog antijenleri kodlayan rekombinant RhCMV ve HCMV vektörleri aç[lZlanmaktad|E Burada tarif edilen rekombinant vektörler, heterolog antijene özgü yüksek hücresel ve humoral immün yanlHEbeviyelerini ortaya koymakta ve sürdürmektedir. Bu sebepten ötürü, tarif edilen CMV vektörleri, bulaslîlîl hastallglEve kanseri tedavi etmek veya önlemek için asilâr olarak kullanIi için uygundur. Aynü zamanda, en az bir temel veya arttlElEEgenden (replikasyonu eksik virüsler) mahrum olan rekombinant RhCMV ve HCMV vektörleri tarif edilmektedir. Replikasyonu eksik CMV'Ier, bir patojene özgü antijen veya bir tümör antijen gibi bir heterolog antijeni içerebilmektedir ve bu sebepten ötürü, ilgili enfeksiyonu veya kanserin tedavi edilmesine veya önlenmesine yönelik asllâr olarak kullanllâbilmektedir. Diger durumlarda, zaylühtllân replikasyonu eksik CMV'Ier, bir heterolog antijenden mahrumdur ve CMV'ye karsEbir asßlarak kullanllâbilmektedir.
Bu sebepten ötürü, burada bir heterolog antijeni kodlayan bir nükleik asit sekansIElçeren rekombinant RhCMV veya HCMV vektörleri saglanmaktadlîl Bazl3'apllândIEmalarda, heterolog antijeni, bir patojene özgü antijendir. Diger yapliândlünalarda, heterolog antijen, bir tümör antijenidir.
BazEl/apilândlEinalarda, patojene özgü antijen, bir viral antijendir. Viral antijen, patojenik oldugu bilinen veya bir immün yan-Ebrtaya çlKlarmasII istenmesine karsEbIan herhangi bir virüsten olabilmektedir. BazEbrnekIerde, viral antijen, influenza virüsü, maymun çiçek virüsü, BatENiI virüsü, Chikungunya virüsü, Ebola virüsü, hepatit C virüsü, poliovirüs, dang virüsü serotip 1, dang virüsü serotip 2, dang virüsü serotip 3 veya dang virüsü stereotip 4, Papillomavirüs, SIV, HIV, HCMV, Kaposi sarkomu ile baglantmIherpes virüsü, varcella zoster virüsü, Epstein-barr virüsü, Herpes simpleks 1 virüsü ve Herpes simpleks 2 virüsünden bir antijen olabilmektedir. Bu ve diger virüslerden spesifik antijenler teknikte iyi bilinmektedir. Bu sebepten ötürü, uygun bir antijen, teknikte uzman bir kisi taraf-an seçilebilmektedir.
Belirli örneklerde, influenza virüs anijeni, hemagglutinin veya nöraminidaz veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanllÜ maymun çiçek virüsü antijeni A35R veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanIlîj BatElNiI virüsü antijeni kapsid (C), membran (prM/M), zarf (E), N51, NSZA, NSZB, NS3, NS4A, NS4B veya NSS veya bunlari antijenik fragmanII bir epitopudur; Chikungunya virüs antijeni kapsid (C), zarf glikoprotein 1 (El), zarf glikoprotein 2 (E2), zarf glikoprotein 3 (E3) veya yapisal olmayan protein 1 (NSP1) veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanIB Ebola virüsü antijeni nükleoprotein (NP) veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanllîj hepatit C virüsü antijeni çekirdek, E1, E2, N52, N53, N54 veya N85 veya bir epitop veya bunlari antijenik fragman-B poliovirüs antijeni VP1 veya bir epitopu veya antijenik fragmanIlEj veya dang virüsü antijeni, kapsid (C), membran (prM/M), zarf (E), NSl, N52A, NSZB, N83, NS4A, NS4B veya NSS veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanIE Rekombinant RhCMV veya HCMV vektörün replikasyonu eksik oldugu bazIZI yapllândlElnalarIa, vektör, bir heterolog antijeni içermemektedir. Zayifllatllân bu tarz bir rekombinant vektör, CMV enfeksiyonunu tedavi etmek veya önlemek için kullanüâbilmektedir.
BazEyaplEndIEnalarda, patojene özgü antijen, bir bakteriyel antijendir. Bakteriyel antijen, patojenik oldugu bilinen veya bir immün yan-Ebrtaya çllZlarmasII istenmesine karsljblan herhangi bir bakteri türünden olabilmektedir. BazElyapllândlElnalarda, bakteriyel antijen, Tüberkülozun ana maddesi olan Mycabacter/um tubercu/osis'ten gelmektedir. Bazlîl yapllândlElnalarda, bakteriyel antijen, tetanozun ana maddesi olan C/ostr/d/'um tetan/den gelmektedir. C/ostr/'d/'um tetan/den spesifik antijenler teknikte iyi bilinmektedir. Bu sebepten ötürü, C/ostr/'di'um teran/den uygun bir antijen, teknikte uzman bir kisi tarafIan seçilebilmektedir. Belirli örneklerde, C/ostr/d/'um tetan/den antijen, tetanoz C'dir.
Bazüyapüândmnalarda, patojene özgü antijen, bir mantarsüantijendir. MantarsElantijen, patojenik oldugu bilinen veya bir immün yan-Ebrtaya çlEbrmasII istenmesine karsüblan herhangi bir mantar türünden olabilmektedir.
Bain/apllândlîilnalarda, patojene özgü antijen, bir protozoan antijenidir. Protozoan antijen, patojenik oldugu bilinen veya bir immün yan-Ebrtaya çlEbrmasII istenmesine karsüblan herhangi bir protozoandan olabilmektedir. BazlIörneklerde, protozoan antijeni, P/asmod/'um fâ/ciparum, P/asmodi'um Vivax, P/asmod/um ova/e veya P/asmod/'um ma/ar/'ae gibi bir P/asmodium türünden bir antijendir. P/asmad/'um türlerinden spesifik antijenler teknikte iyi bilinmektedir. Bu sebepten ötürü, uygun bir antijen, teknikte uzman bir kisi tarafIdan seçilebilmektedir. Belirli örneklerde, P/asmod/'unfdan antijen, CSP veya SSPZ gibi bir ön eritokrositik antijendir veya AMA1 veya MSP1 gibi bir eritrositik antijendir.
Bazüiapllândlünalarda, tümör antijeni, bir katEliümör ile eksprese edilen bir antijendir. Diger yapliândlünalarda, tümör antijeni, bir hematolojik kanser ile eksprese edilen bir antijendir.
Tümör antijenleri teknikte iyi bilinmektedir ve burada tümör antijenlerinin klgîllaylEÜJlmayan bir listesi saglanmaktadlEl RhCMV veya HCMV vektörleri, herhangi bir RhCMV veya HCMV virüs izolatian, susundan veya varyantIan (örnegin bir klinik izolat veya laboratuvar susu) türevlendirilebilmektedir.
BazÜ/apüândlüinalarda, RhCMV, Cercopithecine herpesvirus 8'dir. Belirli örneklerde, RhCMV, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1'in nükleotid sekansIEl/eya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1'e sekansIEliçermektedir. RhCMV vektörü aynElzamanda RhCMV genomu kodlayan BAC olabilmektedir. BainyapllândBnalarda, rekombinant RhCMV vektörü, bir immünomodüler proteini kodlayan bir veya birden fazla genin Silinmesini Içermektedir. BazElörnekIerde, BazEýapllândlEnalarda, HCMV, AD169 laboratuar susu, sokak türü susu Merlin, Towne BAC HCMV izolatlJToIedo-BAC HCMV izolatÇlTR-BAC HCMV izolatIÇIFIX-BAC HCMV izolatüAD169- BAC HCMV izolatEl/eya HCMV susu Davis'i içermektedir. Belirli örneklerde, HCMV vektörü, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 6, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8 veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 9'un nükleik asit sekansIEiçermektedir. Belirli yapilândlElnalarda, HCMV veya RhCMV'nin bir varyantü örnegin SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2 ila 9 arasIan herhangi birisine en az %80, en az kapasitesini tutan bir varyant kullanllâbilmektedir.
Rekombinant RhCMV ve CMV vektörleri kamusal olarak mevcuttur ve/veya öncesinde açllZIanmaktadlE Örnegin çesitli CMV vektörleri, HCMV AD, HCMV Towne (ATCC VR- dahil olmak üzere Amerikan Tipi Kültür koleksiyonundan (Manassas, VA) temin edilebilmektedir. HCMV Toledo susu aynüamanda Bazüiapllândlîrinalarda, rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, replikasyon için temel olan veya replikasyonu arttlBin bir RhCMV veya HCMV geninde bir silinmeyi içermektedir. CMV temel genleri ve arttlElna, teknikte iyi bir sekilde açlElanmlStlEl (bkz. örnegin Dunn ve veya UL44 veya bunlari bir homologudur (örn. RhCMV'de olan homolog gen). Diger temel veya arttlElEElgenler de teknikte bilinmekte ve burada açlElanmaktadlEI Belirli örneklerde, temel gen, UL82 veya bunlari bir homologudur. Bazüapllând Elnalarda, rekombinant RhCMV ve HCMV vektörleri, bir heterolog antijeni içermemektedir. Diger yapllândlElnalarda, bir temel veya arttlElEElgende bir silinmeye sahip olan rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, patojene özgü antijen veya bir tümör antijeni gibi bir heterolog antijeni kodlayan bir nükleik asit sekansIülçermektedir. Rekombinant RhCMV veya HCMV vektörlerini içeren bilesimler ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir taslýlîlîlda saglanmaktadlE Bu tarz vektörler ve bilesimler, örnegin bir bulaslEEhastallglllan veya bir bulaslEEhastallEla enfekte hale gelme riski taslýlan veya kanser olan veya kanser gelistirme riski taslýlan bir hastal[giI tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullanllâbilmektedir. En az bir temel veya arttlElEljgenin bir silinmesine sahip olan CMV vektörleri genellikle zayiflhtüüiaktadlü ve bu sebepten ötürü, CMV'nin tedavisine veya önlenmesine yönelik asilâr kullanilâbilmektedir (bura durumda, rekombinant vektör, bir heterolog antijeni kodlamamaktadlE).
BazEyapHândlElnalarda, rekombinant RhCMV veya HCMV vektörleri, virüsün replikasyonunu önlemek için bir intihar veya güvenlik aracIDiçermektedir. Örnegin rekombinant CMV vektörleri, RhCMV veya HCMV genomunun bir temel genine veya bölgesine (temel CMV genleri yukarlElh listelenmektedir ve teknikte bilinmektedir) yanaslKl olanLOXP bölgelerini ve aynlIl zamanda Cre-rekombinazI kodlama sekansIlIl içerebilmektedir. Cre-rekombinaz genellikle temel genin ç[lZlarilÜiasII ve viral replikasyonun inhibisyonunun kontrol edildigi sekilde Cre ekspresyonunu düzenlemek için indüklenebilir bir promoterin kontrolü altIadlE Belirli örneklerde, Cre, bir Tet'i düzenlenmektedir ve Cre ekspresyonu, Dox mevcudiyeti ile kontrol edilmektedir.
Aynüzamanda burada tarif edilen bir rekombinant RhCMV veya HCMV vektörünü ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasMEýEiÇeren bilesimler saglanmaktadlE AynlZlzamanda, tedaviye ihtiyaclîlolan bir hastanI seçilmesi ve burada tarif edilen bir rekombinant RhCMV veya HCMV vektörünün veya bunlari bir bilesiminin hastaya uygulanmasEl/asiiiislýla bir bulaslEEhastaligEblan veya bulaslEEbir hastalikla enfekte hale gelme riskini taslsîlan veya kanser olan veya kanser gelistirme riski tasülan bir hastanlEl, tedavi edilmesine yönelik bir yöntem saglanmaktadlE Bazüiapüândlîilnalarda, tedavi ihtiyaciIOlan bir hastanI seçilmesi, bir viral hastalilZl bakteriyel bir hastaliKl mantar hastal[gl:lveya bir protozoan hastaligiElgibi bir bulaslEElhastallE teshisi konulan bir hastanI seçilmesini içermektedir. Diger yapllândlElnaIarda, tedaviye ihtiyaclîlolan bir hastanI seçilmesi, bir bulaslîljmaddeye maruz blEkHân veya maruz blEikllEnasElmuhtemel olan bir hastanI seçilmesini içermektedir. Diger yapllândülnalarda, tedaviye ihtiyaç duyan bir hastanI seçilmesi, kanser teshisi konulan bir hastanI seçilmesini içermektedir. Diger yapllândlîrlnalarda, tedaviye ihtiyaç duyan bir hastanI seçilmesi, bir karsinojene maruz büklßn bir hasta, kanserle iliskili genetik mutasyonlara sahip olan bir hasta veya öncesinde kansere sahip olan bir hasta gibi kanser gelistirme riski taslýan bir hastanI seçilmesini içermektedir.
Yöntemlerin bazlîlyapilândlülnalaria, bulaslEEhastaliEl influenza virüs enfeksiyonudur ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, influenza virüsünden bir antijeni kodlamaktadlîi Diger yapllândlîilnalarda, bulaslEEl hastalllîl maymun çiçek virüsü enfeksiyonudur ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, maymun çiçek virüsünden bir antijeni kodlamaktadß Diger yapilândlîilnalarda, bulasiEEhastaliEl BatENilvirüsü enfeksiyonudur ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, BatElNilvirüsünden bir antijeni kodlamaktadiîl Diger yapllândlünalarda, bulaslEElhastallKl Chikungunya virüsü enfeksiyonudur ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, Chikungunya virüsünden bir antijeni kodlamaktadlü Diger yapllândlîrlnalarda, bulaslîlîlhastalllîl, Ebola virüsü enfeksiyonudur ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, Ebola virüsünden bir antijeni kodlamaktadB Diger yapllândlElnalarda, bulaslEElhastaIlEl hepatit C virüsü enfeksiyonudur ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, hepatit C virüsünden bir antijeni kodlamaktadlîl Diger yapllândlîilnalarda, bulaslEEl hastal[lZl poliovirüs enfeksiyonudur ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, poliovirüsten bir antijeni kodlamaktadlE Diger yapllândlûlnalarda, bulaslEEhastallKl dang hummasIlEl ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, dang virüsü serotipi 1, dang virüsü serotipi 2, dang virüsü serotipi 3 veya dang virüsü serotipi 4 arasIan bir antijeni kodlamaktadIEI Diger yapüândlîrlnalarda, hastallKl edinilmis immün yetmezlik sendromu (AIDS) veya Simian Immün Yetmezlik Virüsü (SIV) enfeksiyonudur ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, HIV veya SIV'den bir antijeni kodlamaktadlE Diger yapliândlüinalarda, hastalüg cilt sigilleri, genital sigiller, servikal kanser veya solunum yolu papillomatozisdir veya bunlarla iliskilidir ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, HPV'den bir antijeni kodlamaktadlEl Diger yapliândlünalarda, hastaliiîl SitîlnadE ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, P/asmodi'um geninden ökaryotik protistlerden bir antijeni kodlamaktadlîl Diger yapllândlülnalarda, hastalllîl Ebola hemorajik atestir ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, Ebola virüsünden bir antijeni kodlamaktadlîl Diger yapilândlîilnalarda, hastaliEl Tüberkülozclur ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, Mycobacter/um tubercu/osß'ten bir antijeni kodlamaktadlü Diger yapllândlElnalarda, hastalilîl Ebola hemorajik atestir ve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, Ebola virüsünden bir antijeni kodlamaktadlB Diger yapilândlülnalarda, hastalilîl bir Herpes hastal[glElilElve rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, bir Herpes virüsünden bir antijeni kodlamaktadlE Bir herpes hastallgiü klglflhylEEl olmayacak sekilde Genital Herpes, Suçiçegi veya Herpes Zoster (zona), Enfeksiyöz mononükleoz ve Kaposi sarkomunu içermektedir. Rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, klîlfllaylîlllmayacak sekilde Herpes simpleks virüs-1 (HSV-l), Herpes simpleks virüs-2 (HSV- 2), Varicella zoster virüsü (VZV), Epstein-Barr virüsü (EBV), Roseolovirüs ve Kaposi sarkomu ile iliskili herpesvirüsü (KSHV) içeren virüslerden bir antijeni kodlamaktadE Yöntemlerin bazEl yapliândlîünalaria, bulaslEEiiiastalilZl CMV enfeksiyonudur ve vektör, bir heterolog antijenini içermemektedir.
Yöntemlerin bazlîlyapilândlîilnalaria, kanser, bir katütümördür ve RhCMV veya HCMV vektörü, bir katEltümörden bir tümör antijenini kodlamaktadü Diger yapilândlûlnalarda, kanser, bir hematolojik kanserdir ve RhCMV veya HCMV vektörü, bir hematolojik kanserinden bir tümör antijenini kodlamaktadlE Sitomegalovirüsler (CMV'ler), yaygI büyüme özelliklerini, karakteristik sitopatolojiyi, tükürük bezi tropizmini ve Etarclîlve latent enfeksiyonu olusturabilme kapasitesini paylasan (3- herpesvirüslerinin bir ayrÇIgenis oranda dagifllân alt grubunu içermektedir. Bilinen virüslerin en genis ve gen kompleks olanlarüarasIan CMV virionlarlZl 150-200 nm bir boyut aral[g]IadlEl ve 200 proteinden daha fazlasEliçin 230 kb olabilen bir çift sarmal DNA genomunu içermektedir. Genelde ß-herpes virüsleri ve spesifik olarak CMV'lerin, memeli radyasyonundan önce olustugu düsünülmektedir ve bu sekilde, viral evrim, her bir türün, benzersiz bir sekilde uyarlanan kendi CMV'lerine sahip oldugu ve CMV iliskisizliginin genellikle iliskisiz türlere paralel oldugu sekilde memelilerin türlesmesine eslik etmistir. Bu sebepten ötürü, primat CMV'lerin (insan, sempanze, RM) genetikleri ve biyolojisi, kemirgen CMV'lerden baska her birisi ile daha yakI iliskili görülmektedir. Gelismekte olan ülkelerde hem insanlarda hem de RM'de, CMV enfeksiyonu esasen enfeksiyonun serolojik kan-@österen yetiskinlerin hijyen bir sekilde seroreaktiviteyi gösteren yetiskin popülasyonunun sadece %40 ila 60'Elle sIlEllElimite sahiptir. Maruz bßküân (imminolojik olarak normal) hastalar. büyük çogunlugu için, hem insan hem de maymun olarak CMV akut enfeksiyonu tamamen asemptomatiktir huylu hastaliglEliecrübe etmektedir ve hatta daha küçük bir bölüm, mononükleoz sendromunu tecrübe etmektedir (CMV, tüm mononükleoz vakalarII -%8'ini hesaba katmaktadlE) Ilk enfeksiyondan sonra, CMV, çogu vücut s_ (tükürük, gözyasÇlidrar, cinsel sekresyon, anne sütü) ayar ila yl]]}ar araletla bulasmaktadlElve iletim genellikle bu tarz slîllâra mukozal maruziyeti içermektedir ve bu tarz slîlîbktarnl'lül yaygI oldugu kosullarda (çocuk yaslarda ve ergenlikte) sasllîElbir sekilde olusmamaktadlE CMV süresiz olarak konakta Erar etmektedir ve viral bulasma, maruziyetten yillbr sonra olusabilmektedir. CMV, hedef hücrelerinin Iatent enfeksiyonununu ve benzer diger herpes virüslerini açilîça gösterebilmektedir, bu kabiliyetin, bu kayda deger Efarda bir rol oynamaslîrnuhtemeldir.
Fakat, herpes simpleks ve variceIIa-zoster virüsünün aksine, bulasma frekansEl(özellikle maymunlarda), transplantasyondan sonra reaktivasyonun kinetikleri ve T hücresi yan-I benzersiz mukavemeti, aktif CMV replikasyonunun odak noktalarIlEl, aralHlelZ olmamasEl halinde, enfekte konak vücudunun herhangi bir yerinde sl]Zl[lZ]a olustugunu göstermektedir.
Bu tarz aktif Erar, konak bagElKllgiIan kaçElllîhasI yönelik bir araca vurgu yapmaktadlîl ve aslIa CMV, 1) Ag mevcudiyeti ve diger majör histokompatibilite kompleksi (MHC) protein islevi, 2) Iökosit migrasyonu, aktivasyonu ve sitokin yanEIhrÇB) Fc reseptör islevi ve 4) apoptoz indüksiyonuna duyarllîkonak hücreyi modüle eden/müdahale eden genler dahil olmak üzere kallßal ve adaptif immün yanlfilarII manipüle edilmesine yönelik çesitli stratejileri, CMV'nin immün konaklarIIZI yeniden enfekte edebilme kabiliyetini Bu etkili Etara ve immün kaçlÜnasIEla ragmen ve CMV'nin, genis bir hücre türünde kopyalanabilme kabiliyetine ragmen, kronik CMV enfeksiyonunda bariz olan hastalik] aslEIEl derecede nadirdir. AsIIa, normal çocuklarda ve yetiskinlerde esasen aptojenik yaplîEgöz önüne al“[gia, CMV bir gizli virüs olmasüölümcüI/neonatal sitomegalik inlüzyon hastallgiü ile 1950'Ierin basIa dahil olmasII kesfedilmemesi durumunda bile, CNS'ye ve duyu organlari birlesik hasardan dolayEl/e sonrasIda organ/kemik iligi transplantasyonun ve AIDS'in ayarlarlEbIa en yay ve yliZIEIZiiEtatçlIpatojenlerden birisi olarak görünmesinden dolayEl bir önemli tllîbi problem olmasElmümkündür. Bu durumlar, immünolojik immatürite, farmakolojik immünsupresyon (transplantasyon) veya HIV enfeksiyonunun progresif immün yetmezligi ile iliskili, özellikle hücre araclHUmmünite olmak üzere bir çarplEIZbrtak-immüno yetmezlige sahiptir. Immünite ve CMV hastaligiüarasiaki bu iyi karakterize edilmis iliski, CMV enfeksiyonunun, bir hassas dengenin, patogenez, Israr ve baglglKliEJkaçlEina ve konukçu baglgEHlZ] yan-I viral mekanizmalarElarasIa evrimsel olarak `anlasIIgllîlbir kompleks konak-parazit iliskiyi örneklendirdigini göstermektedir. Esasen, virüs, konaktan ortadan kaldiîilîhamaktadEve bosaltIi bölgelerinde kopyalanmasüçin nispeten serbest bir iradeye sahiptir fakat konak immünite, bu tarz replikasyonun hastal[gla yol açtiglElçogu bölgede replikasyonu kßîlhmaktadü Bu dengeyle, virüs, denetlenmemis patogenesite ile olusmayabilen büyük bir konak popülasyonunda her tarafa yayllâbilmektedir. Konaga gelecek olursak, bir normal immün sistemin, esasen popülasyonun üremeye dair ilgili elemanlarü içerisinde patogenetisitesini ortadan kaldübilme kabiliyeti, bu patojen desteginin, önemli bir evrimsel handikap dogurmamaktadIE Bu konak virüs dengesinin sürdürülmesine yönelik immünolojik gereksinimler iyi karakterize edilmemesine ragmen, CMV'ye spesifik olarak atanan immünolojik `kaynaklar' oldukça büyük oldugu bilinmektedir. Insan CMV'ye (HCMV) medyan CD4+ T hücresi yanlflüirekanslarÇl kabakulak, kâmilg influenza ve adenovirüs gibi (tüm) Erarclîblmayan virüslere ve herpes simpleks ve variceIIa-zoster virüsleri gibi diger Etarcü'irüslere medyan CD4+ T hücresi yanIEEl frekanslarlEUan daha yüksek 5 ila 10 kattlEI Belirli HCMV epitoplarlüla veya ORF'Iere yüksek frekans CD8+ T hücresi yanlfllarüia tipiktir. Basvuru sahipleri, tüm CMV genomuna (14,000 üst üste gelen peptit, sitokin akE sitometrisi ve HLA-disparat CMV-sero-pozitif hastalarlEl bir genis kohortu kullanilarak) toplam kan CD4+ ve CD8+ T hücresi yanitliarIElölçmüstür.
Basvuru sahipleri, 24 CMV seropozitif ve 5 seronegatif hastalarda tüm bu peptitleri (217 ORF karlglüilarlîksorgulamlgtlîl ve toplandlglia, CMV-seropozitif hastalarda CMV-spesiûk CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin medyan frekanslarIEI, toplam CD4+ veya CD8+ T hücresi popülasyonlarlîfhaflîa popülasyonlarII %10-11'ine tekabül etmektedir) için %5-6 arasIa oldugunu bulmustur. Seronegatif hastalarda toplam yanifllar, %0.5'ten daha azdlû bu sayü bu özet analizinin `geçmisini' temsil etmektedir. Sasllâcak derecede, bazEbireylerde, CMV- spesiük T hücreleri, periferik kanda haflîla T hücre repertuvarlarII %25'inden daha fazlasIEI hesaba katmaktadE Bu T hücresi yanlfllîlgenistir-her bir hasta, 19 HCMV ORF'Ierin bir ortalamasIEf~CD4 ve CD8 yaniHhrlIarasIa esit miktarda daglEIlEnaktadlE) tanIiaktadlEve en az 28 ORF, test edilen hastalar. %20'sinde veya daha fazlasIda önemli CD4+ veya CD8+ T hücresi yanlfliarllîaperiferik kan haflîlaslIibopülasyonunun 2 %0.2'si) klgklmaktadlEI Bu büyük CMV-spesifik T hücresi popülasyonlarII üretildigi ve enfeksiyondan sonra sürdürüldügü kesin mekanizmalar anlasllîhamaktadlü fakat muhtemelen konak yasamlj boyunca bir önemli immün yan-I yüzeyinde lokal mikro çevrelerde aktif, üretken enfeksiyon dahil olmak üzere, bu virüsün enfeksiyonu sürdürme kabiliyeti ile ilgilidir. Ek olarak, CMV, tamamen immün konaklarlBJElyeniden enfekte edebilmektedir (Boppana ve kosulda frekanslarIEönemli ölçüde arttlEülgllZRM'de gösterilmektedir, bu da periyodik yeniden enfeksiyonunun, CMV-spesifik T hücresi yaniEDfrekansIarEUan olagan üst bir olusumda önemli bir rol oynad[glII:lgöstermektedir. Son olarak, HCMV'nin, profesyonel Ag sunum hücrelerini (makro-fajlar, dendritik hücreler) enfekte edebilme ve bol yogun korlarü üretebilme (hedef hücreleri `enfekte' edebilen, fakat genetik malzemeden mahrum olan zarflanmlg doku protein kompleksleri) kabiliyetleri, bu dayanllZIDT hücresi yanlHbrII olusumuna katkElbulunabilmektedir. Önemli bir sekilde, antiviral antikor yan-I özellikleri, antiviral T hücresi immünitesi için yukarßh bahsi geçen HCMV aynalela yanlt] vermektedir. HCMV-spesifik antikor yanlfllarÇl büyük say. viral proteinlerle reaktiviteler için ve on ylmardlEIviral proteinlere karslîlstabil titrelerin EfarElle kayda degerdir. Sadece virüs replikasyonu slßsia olusturulan yaplglal proteinlerine karslîblanlar dahil olmak üzere HCMV'si kodlanmlglproteinlere özgü antikorlar, birincil enfeksiyondan sonra hlîllîh gelismektedir ve virüsü kodlanmlgl proteinlerin El'arcEl ekspresyonundan dolaylîblmaslîilnuhtemel önemli titrelerde sürdürülmektedir. HCMV-spesifik antikor aynlZlzamanda salgEl bezlerinin bu virüsünün tropizm sonucu olarak mukozal yüzeylerde mevcut olmaktadlB Ilginç bir sekilde, anti-HCMV antikoru aynüamanda topluluk tarafian edinilen yeniden enfeksiyonlardan ve nakil hastalarIa yeniden enfeksiyonlardan sonra olan artisa yanElvermektedir.
YukarlElh gösterildigi üzere, en çok kullanllân Ientivirüs (SIV) enfeksiyonunun hayvan modeli, RM'Ier, özellikle SIV ile enfekte edilmis maymunlarI bir ana flEatçEpatojeni olarak RhCMV rolü dahil olmak üzere immünokompetan ve immün yetersiz konaklarda epidemioloji, enfeksiyon modeli ve hastaligilgç-an HCMV ile insan enfeksiyonunu yakEiiJir sekilde taklit eden bir dogal CMV enfeksiyonu sergilemektedir. Saslmlmayacak sekilde, bu biyolojik iliskisizlik, genetik iliskisizlik ile yansifllüîaktadlü Önceki çallSinaIar, HCMV genleri gB, IE1 ve UL121-117 araleblaki yüksek homolojiyi ve RhCMV homologlarßrtaya çilZlarmlgtE(Kravitz ve analiz etmistir ve HCMV emsalleri ile benzer bir modelde konumsal olarak düzenlenen 100 veya daha fazla amino asidin 236 potansiyel ORF'sini belirlemistir. Bu 236 ORF'den, 138', (%58.47), bilinen HCMV proteinlerine net bir sekilde homologdur. Fibroblastlarda replikasyon için temel teskil etmedigi bilinen HCMV ORF'Ierine homolog olan bazERhCMV'ler, asaglîîb Tablo 1'de Iistelenmektedir. Bain/apilândlüinalarda, bu ORF'Ier, tarif edilen CMV bazIEbsEl vektörlerinde ekspresyon için patojenik antijenlerin eklenmesine yönelik bölgelerdir.
Karsilâst-@Eba, mürin CMV, 78'inin (%45.9) bilinen HCMV proteinlerine homolog oldugu 170 ORF'yi kodlamaktadlü Önemli bir sekilde, mürin CMV'sinin aksine, RhCMV, HCMV-benzeri immün kaçlEl'na genlerinin bir tam komplemanlElü/e yogun korlarlîiblusturmak için HCMV'ye yeterli homolog olan doku proteinlerini kodlamaktadE Tablo 1. HCMV genomundaki homologlara sahip RhCMV ORF'Ierin temsili örnekleri RhCMV ORF'Ieri HCMV ORF'Ieri RhCMV mutant RhOS UL153 Rh17 UL4 Rh19 UL7 Rh20 UL6 Rh31 UL13 Rh35a UL19 Rh36 UL20 Rh40 UL23 31242 Rh54 UL31 Rh56 UL33 Rh59 UL35 Rh68 UL42 Rh69 UL43 54274 Rh107 UL78 Rh143 UL111A Rh148 UL116 Rh151/2 UL11 Rh158 UL147 Rh160 UL132 Rh160a UL130 Rh162 UL145 Rh163 UL144 Rh164 UL141 Rh181 USl Rh182 USZ Rh184 US3 Rh189 U511 Rh190 USlZ Rh192 USl3 Rh198 USl7 Rh199 USl8 Rh200 USl9 Rh201 USZO Rh202 U521 Rh203 USZZ Rh221 USZ9 Rh223 US30 Rh225 US31 Her bir ayrlîitllDRhCMV ORF ve aynlîimanda çesitli öncesinde tanIilanmamlSORF (Rh35a ve Rh160a), BIastP algoritmasEkuIlanarak HCMV ORF'Ierin tam kümesi ile klýlaslanmlgtlEl 510'5 bir öneme sahip olan skorlar önemli esmeler olarak görülmüstür. Birden fazla RhCMV ORF'nin, bir HCMV ORF'ye (örn. Rh111 ve 112, UL83'e homologdur) tekabül etmesi halinde, RhCMV ORF, listeden çlKlarHEnlStlEl Dokuz RhCMV ORF, bir transpozon eklentisi ile mutasyona ugratllîhlgtlîl ve ek bölgeler gösterilmektedir. Rh151/2 ORF'Ier, birlestirilen HMV UL11ORF'Iere tekabül etmektedir.
Temel olarak BlastP, fibroblastlarda replikasyon için temel olmadlglîbilinen HCMV ORF'Iere homolog olan ORF'Ierin RhCMV genomunu arastHnasEliçin kullanilIhaktadE Bu temel olmayan HCMV ORF'Ieri: (i) Iiteratürden; (ii) HCMV'nin A0169 susunun tranpozon mutagenezinden; ve (iii) klinik izolatlarda olmalarl,`_l fakat AD169 laboratuvar susunda olmamalarEaç-an tanIilanmlgtlEl Toplam 48 RhCMV ORF'si, bu kriterleri karsllâmlgtlüve immünomodüler genler oldugu bilinmektedir ve üç ek immünompdüler ORF (Rh185, Rh186 ve Rh187), HCMV homologlarllül, sekanslanmlg olan klinik HCMV'Ierin BAC klonlamasEl süsia silinmesinden dolayEBlastP analizinde tanllanmamlgtß RhCMV ve HCMV ORF'Ier arasIaki iliskiyi onaylamak için, ClustaIW, çok saylîlla sekans hizalamasIlIlJygulamasEiçin kullanilIhlgtlEl Her bir RhCMV ORF, HCMV'nin dört klinik izolatIan ilgili ORF'Ierle klýaslanmlîstlEl Bu analiz, her bir RhCMV ORF'sinin, sekanslanmlgl olan tüm dört HCMV klinik izolatIia bir ortologa sahip oldugunu göstermistir ve orijinal BasltP skorlarII baska bir sekilde iliskili olmayan proteinlerde klîa homolojilerden kaynaklanmasüolasüglilüdlgbrü tutarak makak ve insan virüslerinden ORF'IerIn asllEUa iliskili oldugunu onaylamlgtlEl Belirli örnek teskil eden vektörlerde, iki gen blogu silinmektedir: Bilinen HCMV immünomodüler genler USZ-11'e homologlarEiçeren Rh182-189 ve klinik izolatlarda mevcut olan, fakat HCMV'nin laboratuvar suslarlEUa kaylîa] olan genleri içeren Rh158-166.
HCMV ve RhCMV enfeksiyonlarürasiaki homoloji, ilgili immün yanltIlarI da uzanmaktadE Asaglîzlh ve SEKIL 3 ve 4'te gösterildigi üzere, periferik kanda RhCMV'ye RM T hücresi yanltJD hedeflenen boyut ve CMV ORF aç-an insandakine benzer olmaktadlEl DahaslÇl RM modelinin artan erisilebilirligi, doku bölgelerinde bu RhCMV-spesifik T hücrelerinin frekanslar. yönelik incelemeye ve RhCMV'nin yeniden enfeksiyonuna immünolojik yanlß izin vermistir. SEKIL 5'de gösterilen önceki ile ilgili olarak, pulmoner dokuzhava ara yüzünde halea repertuvarIa CMV-spesifik T hücrelerinin sunumu genellikle periferik kanda olandan kat daha yüksek olacak sekilde muazzam olabilmektedir. Sonraki ile ilgili olarak, CMV- immün RM'nin, canIlJlfakat etkisiz halde degil) sokak türü RhCMV ile asllânmasüCMV-spesifik T hücresinin (CD4+ ve CD8+) ve antikor yanlflbrII arttElIBialebla dramatik bir artlgla sonuçlanmaktadlEl(SEKIL 6). Arttlülân antikor titrelerin, yaklaslElZ ay sonra temel yerine geri döndügü görülmektedir, fakat önemli bir sekilde CMV-spesifik CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin periferik kan frekanslarIlEl, önceki referanstan %50 ila 100 daha yüksek seviyelerde stabilize görünmektedir, bu da periyodik yeniden enfeksiyonlar. veya aleni yeniden aktivasyonlarI büyük ölçüde çogu yetiskin RM'de gözlemlenen RhCMV-spesifik T hücrelerinin yüksek sekans. katki bulundugunu göstermektedir.
CMV'nin bir çok tanIEbn özelligi, bu virüsü, bir bulaslEJnadde veya kansere yönelik bir asEl vektörü gibi bir asEl/ektörü olarak yüksek derecede çekici hale getirmektedir. Ilk olarak, CMV'nIn, güçlü antikor yanitliarlüle dayanilZIET hücresi yanitliarIÜthaya koyabilme kabiliyeti, konak savunmayla (özellikle SIV/HIV için) ilgili mukozal alanlara odaklanmlStlEl(SEKILLER 3 ila 5). Basvuru sahipleri tarafIan, bu güçlü yaniührlEl, hazlEIkosuIda durumu yans[El[glEb, genellikle önceki teknigin asEçallSInalarIa vurgu yapllân artigi sonrasEkirve yanlfllarldan ziyade süresiz olarak devam ettigine inan [miaktadß Ikinci olarak, CMV, immün konaklarIDyeniden enfekte edebilme kabiliyetine ve bu tarz yeniden enfeksiyonlarla yeni immün yanifllarIELiretme kabiliyetine sahiptir. Bu fenomenin dogrudan RhCMV ile onaylanmasEiiçin, SIV gag'sini kodlayan belirli bir RhCMV vektörü olusturulmustur (SEKIL 7). Bu vektör, immünofloresan ve western blot ile belirgin gag ekspresyonunu sergilemistir (SEKIL 8) ve sokak türü virüsünkinden ayl edilemez in vitro büyüme kinetiklerini göstermistir. 4 RhCMV seropozitif RM'ye (birincil enfeksiyondan 224 gün sonra) subkütanöz olarak uygulandigiia (5 x , RhCMV-spesifik T hücresinin ve SEKIL 6'da açlJZJanan antikor yan-I benzer bir (klinik olarak asemptomatik) artlglîl gözlemlenmistir. Öncesinde yeniden enfeksiyonda gözlemlendigi üzere (SEKIL 6), gerçek zamanlElPCR, viral asuâma sonrasIda herhangi bir süre noktasIa kanda veya akciger lavaj mononükleer hücrelerinde sokak türü veya gag-rekombinant olarak RhCMV'yi belirlememistir.
Fakat yeniden enfeksiyondan 127 gün sonrasIa ürin, RhCMV-gag vektörünün mevcudiyetini gösteren ELISA ile gag ekspresyonu için haftalllîl olarak pozitif çilîmlstlü Bu numuneler, RhCMV'yi izole etmek için birlikte kültürlenmistir ve bu in i//i/o türevli viral preparasyonlar, western blotu ile gag ekspresyonu için degerlendirilmistir. SEKIL 8'de gösterildigi üzere, tüm 4 hayvandan RhCMV es kültürleri, immünoreaktif gag'yi eksprese etmistir, bosaItIi alanlarIa uygulanan rekombinant virüs mevcudiyetini kosulsuz olarak olusturmaktadlîl Yeniden enfeksiyonun erken süre noktalarIa ürinin retrospektif analiz, bir RM'de 7. günle ve diger 3'ünde 21. günle gag eksprese edici RhCMV vektörünün mevcudiyetini ortaya çlIZlarmIStlB DahasÇlgag eksprese edici RhCMV vektörü aynlâamanda salyada tespit edilmistir ve yeniden enfeksiyondan sonra en az 237 gün boyunca ürinde mevcut olmustur.
Bu veriler, iki önemli etkisi vardB Ilk olarak tartlglnasübir sekilde, immün hastalarIÜeniden enfekte edebildigini, CMV'nin, önceden mevcut olan sokak türü virüsle etili bir sekilde mücadele ettigini ve CMV'de güçlü bir sekilde arttlElIBilgl hücresel ve humoral immüniteye ragmen olagan `ekolojik' nise giden yolu bir sekilde bulabildigini göstermektedir. Ikinci olarak, eksojen neoAgs'yi eksprese eden RhCMV vektörlerinin in i//i/o stabilitesini göstermektedir, bu da bu vektörlerin, asllânmamlglhastasiarla enfekte edebildigini ve eklenen, eksojen antijen kodlaylagenlerin ekspresyonunu belirsiz olarak sürdürdügünü göstermektedir.
Bu RhCMV-gag yeniden enfekte kohort aynüamanda yeniden enfeksiyonla iliskili masif CMV- spesifik hafElartlgl yüzeyinde, RhCMV vektörlerinin bir de !70V0 immün yan-Ebaslatabilme kabiliyetini ölçmek için kullanllîhlgtü SEKIL 9 ve 10'da gösterildigi üzere, tüm aslüIRM'ler, yeniden enfeksiyon sonra 7. gün gibi klîh bir sürede kanda gag-spesifik CD4+ ve CD8+ T hücresi yanltlhrlßlgelistirmistir. Bu kan yanifllarü buradan sonra %0.1 ila %0.2 araliglIa bir stabil platoya düserek hafEla hücrelerinin %02 ila %0.6'sIa yeniden enfeksiyonunda sonra birinci ayda zirve yapmlgtlü SIV gag-spesifik antikorlar aynlîtamanda bir stabil platoya ulasmadan önce enfeksiyondan sonra 91 gün boyunca artlgl göstererek enfeksiyondan 14 gün sonra indüklenmistir (SEKIL 12). AynEthCMV-gag vektörünün (yeniden enfeksiyondan sonra 238. günde) yeniden uygulanmasüher iki incelemeyi de arttlElnlgtlEl bu yanitlhr, daha yüksek plato seviyelerinin olusumunu gösteren önceki `ayar noktalarlühan' daha yüksek kalmlSIE Öncesinde önemli ölçüde RhCMV-spesifik T hücresi yanlHbrEilçin gösterildigi üzere, bu CMV-vektörlü gag-spesifik T hücresi yanlfliarII kan frekanslarÇl bir doku efektör alanIa-akcigerde SIV-spesifik T hücrelerinin frekansIDJÜyük ölçüde (>10X) eksik degerlendirmistir (SEKIL 10 ve 11). Gag- spesifik CD4+ ve CD8+T hücreleri, tüm RM'de ilk RhCMV(gag) yeniden enfeksiyondan 7 gün sonra akciger Iavaj s-a bulunmustur, %1 ila %3 aral[g]Ia stabil plato seviyelerine ulasmadan önce %10 (yeniden enfeksiyondan 42 ila 56 gün sonra) kadar yüksek frekanslarla zirve yapmaktadlü Artlgl (ikinci yeniden enfeksiyon), 2 RM'de önceki plato seviyesine geri dönüs frekanslarlEUa bir keskin spaykla sonuçlanmlgtlEl ve diger 2 hayvanda (yeniden enfeksiyondan sonra 70. günde #2) plato seviyelerinde hafifçe daha yüksek çith[gl:l görülmüstür. Bu RhCMV(gag)-immünize RM'de gag-spesifik T hücrelerinin frekansElve daglIJEIÇlsokak türü SIVmac239 ile I.V. bagEüZllgillltkili bir sekilde kontrol eden zayli'îbtllîhlg SIVmac239(Anef) `immünize' RM'de gözlemlenenle klýbslanabilmektedir (SEKIL 13).
Incelenen tüm RM'Ierinde, gözlemlenen gag-spesifik yanlflhr, RhCMV-spesifik yanlflhrII önemli artlgIEI ayarIa olustugu belirtilmelidir (SEKIL 9); asIIa, bu iptal edilen CMV- spesifik yaniEihrlEi, yeni gag-spesifik yanifIbrI bir adjuvanEblarak hareket etmesi mümkün olmaktadlEi Bu veriler önemli ölçüde RhCMV-immün RM'de neoAgs için, RhCMV'nin bir vektör olarak islev göstermesi kabiliyetini göstermektedir.
Mevcut bulusun belirli yönlerine göre, CMV'nin CMV-immün hastalarIa `vektör' neoAg yanührIEbenzersiz olarak etkili bir sekilde etkileme kabiliyeti, bir as. kullanIiIarEIçin yüksek derecede önemli uygulamalara sahiptir. Ilk olarak, herhangi bir saglilZIEiCMV+ hastalarIEi sokak türü CMV enfeksiyonunu kontrol edebilme kabiliyetlerini islevsel olarak göstermesi vasEislýla, CMV vektörlerinin, hatta bir baska sekilde degistirilmemis CMV genomun dayallZloIan vektörlerin uygulanmasIan sonraki morbidite risklerin minimum olmasEibeklenecektir. CMV+ annelerin ceninleri bazlîidurumlarda enfekte olabilmesine ragmen, bu risk, hamile kadIara CMV-bazlüasilârl basit bir sekilde saglanmamasEiile engellenebilmektedir. Güvenlik (öm. indüklenebilir intihar) mekanizmalar.. ve/veya stratejik gen silinmesinin (immünojenesitiden ve Bardan fedakarllE etmeden patojenik potansiyeli azaltmak için) dahil edilmesinden, asEi morbiditesi olasiEigiIEi daha fazla azaltmasEl beklenmektedir. Potansiyel olarak Eiarcü/e muhtemelen yeniden enfekte edebilen vektörler olarak kullaniiâbilen diger iyi incelenmis herpesvirüslerin, bu tarz bir kullanla karsEi hafifleyen bir veya birden fazla özellige sahip oldugu belirtilmelidir` Örnegin y-herpesvirüsleri Epstein Barr Virus (EBV) ve Kaposi Sarkoma Herpes virüs (KSHV), malignitelerle silZEbir iliskiye sahipken, CMV degildir. Ek olarak, a-herpesvirüsleri (herpes simpleks) CMV'nin genellestirilmis T hücresi immunojenesitesinden mahrumdur ve nörovirülansdan (örn. herpes ensefaliti) dolayübaska bir sekilde immünokompetant bireylerde gözle görülür miktarda daha patojenik potansiyel sahip oldugu görülecektir.
CMV'nin yeniden enfeksiyon kabiliyetinin ikinci vurgusu ve aynDRhCMV vektörü ile sonraki bir asüâmanlül, rekombinant (SIV) gen ürününe (SEKIL 11) bir güçlü immünolojik artlgîbrtaya koydugu bir görsel, kullann veya gelisim sßasiâtla esasen tüm diger viral vektörlerin aksine, CMV vektörlerinin tekrar eden bir sekilde kullanüâbilmesi ihtimalidir. AsI a, mevcut bulusun belirli yapUândlElnalar- göre, bireyler, yeni epitoplara yanElbrElüretmek için farkIElCMV vektörleri ile seri olarak asiiânmaktadlü Burada bir yapllândlEnada, bir CMV ile harekete geçirilen, anti-HIV/SIV immün yari-I (örn.
HIV/SIV maruziyet süresinin yerine), viral replikasyonu içermesi, ilk viral yayHBiayEkestigi, immünopatojenisiteyi önledigi ve bir ilerleyici olmayan enfeksiyonu olusturdugu tarif edilmektedir. Mevcut bulusun yönleri, CMV'nin evrimini kabul etmektedir ve bir heterolog ORF kodlaylEElaSElvektörü olarak tasarlanan ve optimize eden CMV'yi stratejik olarak saglamaktadlEl CMV'nin 1) kayda deger immunojenesite, 2) düsük patojenisite, 3) Star, 4) genis doku yayllIlîiiljve 5) CMV+ konaklarIElyeniden enfekte edebilme kabiliyetinin kombinasyonu, gelisim sßslda diger asEl/ektörlerinden büyük ölçüde ve temelde farklEl olmaktadß AsIIa, Etar sorunu tek baslEla bu yaklasnlîbüyük ölçüde degerli kllüiaktadE Belirli yönlerine göre, uzun dönemli antijen maruziyeti, tarif edilen CMV bazllîisül'ektörleri ile mümkün oldugu kadar, kalitatif olarak farkllZl/e islevsel olarak üstün anti-lentiviral immün yaniEllIIe Iliskili olmaktadE Güvenlik hususlarüç-an, benzersiz potansiyellere sahip CMV vektörleri uygun bir sekilde idare edilmelidir. Bu sekilde, bazljyapliândlünalarda, CMV-bazlEbsllâma vektörleri, CMV+ konaklarda saglllîlü CMV+ statüsüyle bu virüsün içeri girme kabiliyetini kuran neoAg immünitesini ortaya koymak için kullanllüîaktadlü Hiç bir virüs vektörü risksiz olmamalela ragmen, uygun ayarda (örnegin bariz bir biçimde immünokompetan kapsamia oldugu gibi, CMV+ ergenlik öncesi), güvenliksiz modiüye edilmis vektörlerle bile ciddi CMV vektör patojenisitesi riski minimum olmalIE Mevcut bulusun diger yönlerine göre, sokak türü CMV'nin nispeten düsük hastallKlindükleme potansiyeli bile, immunojenesite veya EtarElfeda etmeden CMV vektörünün genetik manipülasyonu ile iptal edilebilmektedir.
Mevcut bulusun yönlerine göre, CMV vektörleri tek baslEb veya diger modalitelerle kombinasyon halinde, bu baglglKllKlarI önemli derecede dahil edildigi sekilde bulaslEIJ hatallgb karsEkalitatif olarak üstün hücresel ve humoral immün yanührlilßunmaktadlü Ek yönler, benzersiz @rar ve yeniden enfeksiyon kabiliyetlerini feda etmeden güvenli vektörleri saglamaktadlü Diger yönlerine göre, çesitli CMV genleri, vektör islevini feda etmeden silinebilmektedir ve belirli örnek teskil eden vektörler, güvenlik yapüârII (örn. indüklenebilir intihar mekanizmalarD] ve aynElzamanda genis (polisistronik) gen kodlama kasetlerinin eklenmesi için bu tarz silinmelerle olusturulan genomik `boslugu' kullanmaktadlEl Bu gen silme yaklasIiEl immunojenesite/@rar ve patojenisite arasIdaki dengeyi tutmasEliçin tasarlanmaktadlEl ve tasarlanmlgl RhCMV optimize vektörlerin saglanmaslütla bol miktarda CMV adaptasyonunu kullanmaktadlEl BazlîlyapllândlElnalarda, RhCMV vektörleri, HCMV'ye homolog olan genleri ve biyolojiyi yansllîlnaslîliçin tasarlanmaktadlîl ve optimize RhCMV vektör tasarnlarü HCMV vektör yapllândlîrlnalarII yap_ dogrudan uygulanabilmektedir.
Bazü yapilândlîiinalarda, burada tarif edilen CMV vektörleri, bir heterolog antijeni kodlamaktadlEl Heterolog antijeni, rekombinant CMV vektörüne dahil edilen bir heterolog polinükleotid ile kodlanan bir antijenik polipeptittir. Belirli örneklerde, antijenik polipeptit, bir bakteri, mantar, protozoon, virüs veya tümörden türetilmektedir. Belirli bir antijene karsElJir uzun dönemli immün yan-I klgkIiJIhIIasElfaydas seçimi etkilemesi tasarlanmas- ragmen, polipeptit, bir immün yan-Diyarmak için bir antijen olarak faydaIEbir sekilde kullanilâbilen herhangi bir sey olabilmektedir.
Antijenik polipeptit sekansüimmün yan-Ürtaya koymasülçin yeterli herhangi bir uzunlukta olabilmektedir. Belirli örneklerde, polipeptiten az 8, en az 10, en az 20, en az 30, en az 40, en az 50 amino asit uzunlugundadlEl veya daha fazladE Benzer bir sekilde, antijenik polipeptidin sekans özdesligi, bakteri, protozoan, mantar, virüs veya tümöre karsEimmün yan-I özgüllügünü sürdürecek sekilde yeterli olmasEilçin natif polipeptidin sekans kimligine özdes olmaleb gerek yoktur. Teknikte uzman bir kisi, bir polipeptit sekansIlEi, antijenik özgüllügü sürdürürken, bir baska ifadeyle natif proteinine cevap verebilirligini saglayacak olan bir antjenik yanlîliîiiyarabilme kabiliyetini sürdürürken önemli ölçüde degistirilebilmektedir. Bu sebepten ötürü, belirli örneklerde, antijenik polipeptit, türetildigi polipeptide en az %50, en örneklerde, polipeptit, farkIEi türlerde (ksenogenik) bulunan konak polipeptidinin bir analogudur.
Teknikte uzman bir kisi, burada açllZlanan, örnek teskil eden heterolog polipeptitlerinin kapsamllîcblmad [giIlSleya kEiflhyiEBmaçl@Imadlgilünlayacaktlîl Bu sebepten ötürü, burada saglanan yöntemlerin, immüniteyi degistirmesi için faydalEbldugu herhangi bir polipeptidin ekspresyonu ve bu sekilde polipeptitle iliskili immün uyarIilîçin kullanSlIlE BazlZlyapilândlîilnalarda, heterolog antijeni, bakteri, mantar, protozoa veya virüs gibi bir patojenik organizmadan türetilen bir polipeptittir.
Patojenik virüslerin örnekleri, klglflhylîlîlolmayacak sekilde asag-ki virüs familyalarlEl içermektedir: Retroi//r/'dae (örnegin, insan immün yetmezlik virüsü (HIV), insan T-hücresi lösemi virüsü, Pi'comav/r/dae (örnegin çocuk felci virüsü, hepatit A virüsü, hepatit C virüsü, enterovirüsler, insan koksatig virüsü, rinovirüsler, echovirüsler, ayak ve aglîlhastallglül'irüsü); Ca/ici'i/ir/dae (Norwalk virüsü dahil olmak üzere gastroenteritise sebep olan suslar gibi); Togai//r/'dae (örnegin, alfavirüsler (chikungunya virüsü, at ensefalit virüsleri, Simliki OrmanlZl virüsü, Sindbis virüsü, Ross River virüsü), kümßlß virüsleri); F/av/ri'dae (örnegin, dang virüsü, sarEhumma virüsü, BatENiI virüsü, St. Louis ensefalit virüsü, Japon ensefalit virüsü, Powassan virüsü ve diger ensefalit virüsleri); Coronai/i'r/dae (koronavirüsler, siddetli akut respiratuar sendrom (SARS) virüsü; Rhabdov/r/dae (örnegin vesiküler stomatit virüsleri, kuduz virüsleri); HIav/r/dae (örnegin Ebola virüsü, Marburg virüsü); Paramyxoi/i'r/'dae (parainfluenza virüsleri, kabakulak virusu, klîlamlKl virüsü, solunum sinsityal virüsü); OrthomyXOV/ridae (örnegin influenza virüsleri); Bunyav/r/dae (örnegin, Hantaan virüsleri, Sin Nombre virüsü, Rift Vadisi ates virüsü, bunya virüsleri, flebo virüsleri ve Nairo virüsleri); Arenaw'r/dae (Lassa hummasÜ/irüsü ve diger hemorajik ates virüsleri, Machupo virüsü, Junin virüsü gibi); ReaviT/dae (örnegin reovirüsler, orbiviler, rotavirüsler); Birnaw'ridae; Hepadnaw'r/dae (hepatit B virüsü); Parvov/r/'dae (parvovirüsler); Papovai//r/dae (papilloma virüsleri, poliom virüsleri, BK-virüsü); Adenovir/dae (adenovirüsler); Herpesi/ir/dae (herpes simpleks virüsü (HSV)-l ve HSV-2, sitomegalovirüs, Epstein-Barr virüsü, varisella zoster virüsü ve HSV-6 da dahil olmak üzere diger herpes virüsleri); Poxvinae (variola virüsleri, vaccinia virüsleri, pox virüsleri); ve Ir/dov/r/dae (Afrika domuz hummasü/irüsü gibi); Astrow'r/dae; ve sIlflhndlEliîhamlgivirüsler (örnegin, hepatit B virüsünün kusurlu bir uydusu olarak düsünülen delta hepatit maddesi olan spong-iform ensefalopatilerinin etyolojik maddeleri).
Bakteriyel patojenlerin örnekleri, kEIfliayiEEiolmayacak sekilde asag-kileri içermektedir: Helicobacter pylori, Escherichia coIi, Vibrio cholerae, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria türleri (örnegin, M. tuberculosis, M. avium, M. intra-cellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Grup A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Grup B Streptococcus), Streptococcus (viridans group), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobik türler.), Streptococcus pneumoniae, patojenik Campylobakter türleri, Enterococcus türleri, Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, corinebakteryum diphtheriae, corinebakteryum türleri, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides türleri, Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Bordetella pertussis, Shigella flexnerii, Shigella dysenteriae ve Actinomyces israelli.
Mantarslîl patojenlerin örnekleri, klîiflbylîlîl olmayacak sekilde sunlarEIiçermektedir: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.
Diger patojenler (örnegin parazitik patojenler) klgIBhyEEl olmayacak sekilde sunlarEl içermektedir: P/asmoa'ium fa/ciparum, P/asmodiZ/m i/i'i/ax, T/j/panosama cruzi' ve Toxop/asma gondii'.
Patojenik mikroorganizmalarla kodlanan immünojenik proteinleri teknikte iyi bilinmektedir ve/veya teknikte uzman kisiler tarafIan belirlenebilmektedir. Bu sebepten ötürü, rekombinant CMV vektörü ile kodlanan spesifik antijen, patojen ile spesifik olarak eksprese edilen ve bir hastada bir immün yan-übrtaya koyabilen herhangi bir protein veya bunlari fragman Ellörnegin bir epitop veya bunlari antijenik fragman molabilmektedir.
BazEyapllândlElnalarda, rekombinant CMV vektörü bir virüsten bir antijeni kodlamaktadlîi Virüsler, klgflbylîlllmayacak sekilde Influenza virüsü, Batlîhil virüsü, Poliovirüs, SIV, HIV, HCMV, Kaposi sarkomuyla iliskili herpes virüsü, Ebola virüsü, Chikungunya virüsü, Dang virüsü, maymun çiçek virüsü, varcella zoster virüsü, Epstein-barr virüs, Herpes simpleks 1 virüsü ve Herpes simpleks 2 virüsünü içerebilmektedir. Burada tarif edilen belirli yapliândlîilnalarda, rekombinant CMV vektörü, influenza virüsünden bir antijeni kodlamaktadB BazEörneklerde, influenza virüs antijeni hemaglutinin (HA) veya nöraminidaz veya bir epitop veya bunlari antijenik fragmanIlEl Diger yaplßndlünalarda, rekombinant CMV vektörü, maymun çiçek virüsünden bir antijeni kodlamaktadlîl Bazlîörneklerde, maymun su çiçegi virüs antijeni A35R'dir veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanIlE Diger yapllândlîilnalarda, rekombinant CMV vektörü, BatDliI virüsünden bir antijeni kodlamaktadlB Bazlîörneklerde, BatENiIantijeni kapsid (C), membran (prM/M), zarf (E), N51, N52A, NSZB, N53, NS4A, NS4B veya N55 veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanIE Diger yapllândIElnaIarda, rekombinant CMV vektörü, Chikungunya virüsünden bir antijeni kodlamaktadlEl BazEörneklerde, Chikungunya virüs antijeni, kapsid (C), zarf glikoprotein 1 (El), zarf glikoprotein 2 (E2), zarf glikoprotein 3 (E3) veya yapisal olmayan protein 1 (NSPl) veya bir epitop veya antijenik fragman_ Diger yapllândlElnalarda, rekombinant CMV vektörü, Ebola virüsünden bir antijeni kodlamaktadIE Bazlîörneklerde, Ebola virüsü antijeni nükleoproteindir (NP) veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanIlEI Diger yapüândlîrlnalarda, rekombinant CMV vektörü, HCV'den bir antijeni kodlamaktadlîl Bazü örneklerde, HCV antijen, çekirdek, El, E2, N52, N53, N54 veya N55 veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanllB Diger yapllând lElnaIarda, rekombinant CMV vektörü, poliovirüs bir antijeni kodlamaktadlEl BazEörneklerde, poliovirüs antijeni VP1'dir veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanIlEI Diger yapllândlîrinalarda, rekombinant CMV vektörü, bir dang serotipi 1, 2, 3 veya 4 virüsü gibi bir dang virüsünden bir antijeni kodlamaktadß Bazlîl örneklerde, dang virüsü antijeni kapsid (C), membran (prM/M), zarf (E), N51, NSZA, NSZB, NS3, NS4A, NS4B veya NSS veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanIIE BazÜapllândlîmalarda, rekombinant CMV vektörü bir bakteriyel antijeni kodlamaktadEl Belirli yapllândlElnalarda, antijen, tetanozun ana maddesi olan C/ostr/d/'um tetan/den gelmektedir.
BazElörneklerde, Üostr/a'i'um tetan/den antijen, tetanozC veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanIlB TetanozC, tetanoz toksine bir koruyucu immün yan-Dortaya koyabilen tetanoz toksinin bir toksik olmayan fragman lEl Bazüapüândßnalarda, rekombinant CMV vektörü, bir mantar antijenini kodlamaktadlEl BazEl/apllândlölnalarda, rekombinant CMV vektörü bir protozoan antijenini kodlamaktadlE Belirli yaplßnd lîilnalarda, protozoan antijeni, P/asmod/um fa/ciparum, P/asmod/um VII/ax, P/asmod/um ova/e veya P/asmod/'um ma/ar/ae içerisinden bir antijendir, her birisi slülnaya (sitîlnanl en yaygI etken maddesi olan P/asmod/'um fa/ciparum ile) neden olabilmektedir.
BazEörneklerde, P/asmod/um antijeni, CSP veya SSP2 gibi bir ön eritrositik antijendir veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanIlEl Diger örneklerde, P/asmod/'um antijeni, AMA1 veya MSPl gibi bir ön eritrositik antijendir veya bunlari bir epitopu veya antijenik fragmanIIEl Bazülapllândlülnalarda, rekombinant CMV vektörü ile uygulanan heterolog polinükleotid, bir tümörde türetilen bir polipeptidi kodlamaktadlü Tümör, herhangi bir hücresel proliferatif hastallglI veya kosulun sponucu olabilmektedir ve iyi huylu veya malignan olabilmektedir.
Belirli örneklerde, tümör, kanserlidir. Bu tarz tümörler, akut Iösemiler (akut lenfositik lösemi, akut miyelositik lösemi, akut miyelojenik lösemi ve miyeloblastik, promiyelositik, miyelomonositik, monositik ve eritrolösemi gibi), kronik Iösemiler (kronik miyelojen lösemi ve kronik lenfositik lösemi gibi), myelodisplastik sendromum ve miyelodisplazi, polisitemi vera, Waldenstrom makroglobülinemi ve agEl zincir hastaltglEtlahil olmak üzere Iösemileri içeren herhangi bir kanser türü olabilmektedir. Sarkomalar ve karsinomlar gibi katEltümörlerin örnekleri, kßfllaylîü olmayacak sekilde fibrosarkom, miksosarkom, Iipoz-rcoma, kondrosarkom, osteojenik sarkom ve diger sarkomlar, sinoviyom, mezotelyoma, Ewing tümörü, Ieyomiosarkom, rabdomiyosarkom, kolon karsinoma, pankreas kanseri, gögüs kanseri, akciger kanseri, hepatoselüler karsinoma, skuamoz hücre karsinomu, bazal hücreli karsinom, adenokarsinoma, ter bezi karsinomasüsebase bez karsinomaslZIpapiller karsinom, papiller adenokarsinomalar, medüller karsinoma, bronko-genik mesane kanseri, testis tümörü, mesane karsinomasÇl melanom ve merkezi sinir sistemi tümörleri (bir glioma, astrositom, medulloblastom, kraniyofaronioma, ependimoma, pinealom, hemanjiyoblastoma, karsinom hücreli karsinoma, karsinom hücreli karsinoma, akustik nöroma, oligodendroglioma, menangioma, meningioma, nöroblastom ve retinoblastoma) içermektedir.
AçlEIanan bilesimlerin ve yöntemlerin heterolog polinükleotîdi ile kodlanabilen antijenik tümör türevli polipeptitler, bir tümör ile iliskili antijenler (TAA'Iar) olarak bilinen polipeptitleri ve bunlardan türetilen peptitleri kapsamaktadlü Bir çok TAA tanIiIanmlStlÜ Bunlar, klîtâlylEEl olmayacak sekilde sunlarEiçermektedir: insan telomeraz ters transkriptaz (hTERT), survivin, MAGE-l, MAGE-3, insan koryonik gonadotropin, karsinoembriyonik antijen, alfa fetoprotein, spesifik zar antijen, Her2/neu, gp-100, trp-2, mutant K-ras proteinleri, mutant p53, kesilmis epidermal büyüme faktörü reseptörü, kimerik protein p210BCR-ABL; insan papilloma virüsünün E7 proteini, Epstein-Barr virüsünün EBNA3 proteini, karsinoembriyonik antijen (CEA), ß-insan koryonik gonadotropin, alfafetoprotein (AFP), Iektine reaktif AFP, tiroglobulin, RAGE-1, MN- CA IX, RU1, RU2 (AS), baglE'kak karboksil esteraz, mut mutant hsp70-2, M-CSF, prostaz, prostat spesifik antijen (PSA), PAP, NY-ESO-l, LAGE-la, p53, prostein, PSMA, telomeraz, prostat-karsinoma tümör antijen-1 (PC-TA-l), ELF2M, nötrofil elastaz, efrin BZ, CD22, insülin büyüme faktörü (IGF) -I, IGF-II, IGF-I reseptörü ve mezotelin (bu TAA'Iardan bazllârül'e aynü zamanda digerleri Novellino ve meslektaslarDCancer Immunology and Immunotherapy, 54: Örnek teskil eden tümör antijenlerinin ve iliskili tümörlerinin bir listesi, Tablo 2'de asaglîzlla gösterilmektedir.
Tablo 2: Örnek teskil eden tümörler ve tümör antijenleri Tümör Tümör Ile Iliskili Antijenler Akut miyelojen lösemi Wilms tümörü 1 (WT1), tercihen melanoma antijeni (PRAME), PR1, proteinaz 3, elastaz, katepsin G Kronik miyelojen lösemi WT1, PRAME, PR1, proteinaz 3, elastaz, katepsin G Miyelodisplastik sendrom WT1, PRAME, PR1, proteinaz 3, elastaz, katepsin G Kronik lemfositik lösemi Sagkaln Non-Hodgkin lenfoma Sagkall Multipl miyelom NY-ESO-l Malignan melanom MAGE, MART, Tirosinaz, PRAME GP100 Gögüs kanseri WT1, herseptin, epitelyal tümör antijen (ETA) Akciger kanseri WT1 YumurtalllZ] kanseri CA-125 Prostat kanseri PSA Pankreatik kanser CA19-9, RCASl Kolon kanseri CEA Renal hÜCre karsinom (RCC) Fibroblast büyüme faktör 5 Germ hücre tümörleri AFP Basarlllllümör immünoterapi, tümör epitoplarI zaylEimmunojenesitesi ile engellenmistir ve immün sistemi genellikle bir önemli efektör yan. baslatilüiasian ziyade immün toleransEl ile bunlara yaniîlvermektedir. Bir Ideal immünoterapötik tümör aslîlgl(a) dayanißüw) etkili, (c) immün toleransII gelisimine dirençli, ((1) uzun ömürlü ve (e) ilk tümör kontrolünden sonra, nüksetmelere ve metastazlara karsElmmün özetim görevinde etkili olan bir immün yan-Ebrtaya koyacaktE CMV enfeksiyonu ile ortaya konan dayaniKIÇiuzun ömürlü immün yarilElEl ve CMV'nin, self-tolerans. üstesinden gelebilme kabiliyeti, CMV'nin, tümör immünoterapisi için bir ideal asürektörü olabildigini göstermektedir.
Bir tümör antijenini kodlayan rekombinant CMV vektörleri ve bunlar. bilesimleri tek bas- uygulanabilmekte veya bir veya birden fazla farmasötik olarak aktif bilesikle kombinasyon halinde uygulanabilmektedir. Örnegin bilesikler, alkilleyici maddeler, antimetabolitler, dogal ürünler, hormonlar ve antagonistleri, diger muhtelif maddeler veya bunlarlEl herhangi bir kombinasyonu gibi diger anti-kanser bilesiklerle birlikte uygulanabilmektedir. Ek anti-kanser maddeler, rekombinant CMV vektörünün uygulanmasIan önce, uygulanmaslsîla aynßürede veya uygulanmasian önce uygulanabilmektedir.
Alkilleyici maddelerin örnekleri, azot hardallarlîameklorethamin, siklofosfamid, melfalan, urasil hardal veya klorambusil gibi), alkil sülfonatlar (busulfan gibi), nitrosoureas (karmustin, örnekleri, folik asit analoglarEiörnegin metotreksat), pirimidin analoglarlîiörnegin 5-FU veya sitarabin) ve merkaptopurin veya tiyoguanin gibi purin analoglarIEliçermektedir. Dogal ürünlerin örnekleri, vinca alkaloidleri (vinblastin, vinkristin veya vindezin gibi), epipodofilotoksinler (etoposid veya teniposid gibi), antibiyotikler (daktinomisin, daunorubisin, doksorubisin, bleomisin, plikamisin veya mito-siklin C gibi) ve enzimleri (L-asparaginaz gibi) içermektedir. Muhtelif maddelerin örnekleri, platin koordinasyon kompleksleri (sisplatin olarak da bilinen cis-diamin-dikloroplatin II), ikame edilmis üreler (hidroksiüre gibi), metil hidrazin türevleri (prokarbazin gibi) ve adrenokrotik baskllâyEllârlîamitotan ve aminogluko- tethimide) içermektedir.
HormonlarI ve antagonistlerin örnekleri, adrenokortikosteroidler (prednizon gibi), progestinler (hidroksiprogesteron kaproat, medroksiprogesteron asetat ve magestrol asetat), estrojenler (dietiI-stilbestrol ve etinil estradiol gibi), antiöstrojenler (tamoksifen gibi) ve androjenleri testeron proprionat ve fluoksimesteron gibi) içermektedir. En yaygI olarak kullanlßn kemoterapi ilaçlarII örnekleri, Adriamisin, Alkeran, Ara-C, BiCNU, Busulfan, CCNU, Karboplatin, Sisplatin, Sitoksan, Daunorubisin, DTIC, 5-FU, Fludarabin, Hidrür, Ida- rubisin, Ifosfamit, Metotreksat, Mikramisin, Mitomîsin, Mitoksantron, Azotlu Hardal, Taksol (veya dosetaksel gibi diger taksanlar), Velban, Vinkristin, VP-16 içerirken, diger yeni ilaçlar, Gemcitabine (Gemzar), Herceptin, Irinotecan (Camptosar, CPT-11), Leustatin, Navelbin, Rituxan STI-571, Taxotere, Topotecan (Hikamtin), Xeloda (Capecitabin), Zevelin ve kalsitriol içermektedir. Kullanllâbilen immünodülatörlerin kElflhylElIiblmayan örnekleri, AS-101 (Wyeth- Ayerst Labs.), bropirimin (Upjohn), gama interferon (Genentech), GM-CSF (granülosit makrofaj koloni uyarlElIllaktör; Genetics Institute), IL-2 (Cetus veya Hoffman-LaRoche), Insan immün globulin (Kesici Biyolojik), IMREG (New Orleans, New Orleans Imreg'den), SK&F Kanser tedavisi için, bir tümör antijenini kodlayan bir rekombinant CMV vektörünün uygulanmaslÇItümörün cerrahi olarak aIlEmasIZlieya radyasyon tedavisi gibi kanserin tedavi edilmesine yönelik bir veya birden fazla tedaviyi takip etmektedir veya bunlar tarafIan takip edilmektedir.
Aynlâamanda, burada CMV replikasyonu, dagEllîliÜ/eya yay[[[lîiil:ilçin temel olan veya bunlarEl arttlün bir veya birden fazla gende bir silinmeye sahip olan, RhCMV ve HCMV vektörleri gibi rekombinant CMV vektörleri tarif edilmektedir. Bu sebepten ötürü, bu vektörler, önemli ölçüde azaltüüîlglviral replikasyona tabi olma kabiliyetine sahip olan CMV vektörlerini kapsamaktadlü Bazlîörneklerde, replikasyonun eksik CMV vektörleri kopyalanabilmektedir, fakat komsu hücreleri enfekte edemedikleri için yayllâmamaktadlîllar. BazElörneklerde, replikasyonun eksik CMV vektörleri kopyalanabilmektedir, fakat komsu enfekte konaklardan salgllânamad [Elarlîiçin yayllâmamaktad lîliar.
CMV temel ve arttlüna genleri teknikte iyi bilinmektedir (bkz. örnegin Dunn ve meslektaslarü yapllândlElnalarda, rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, virüs replikasyonu, dagllînaslîl veya yayllItiasübin temel olan veya bunlarljrttßn bir gende bir silinmeyi içermektedir. Diger yapliândlünalarda, rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, CMV replikasyonu, daglllliiüleya yayHJIîhÜlçin temel olan veya bunlarllrttßn çok saylâh (örnegin klîlîlhylîlîcblmayacak sekilde iki, üç veya dört gibi) gende bir silinmeyi içermektedir. Silinmenin, genin tüm açllZl okuma çerçevesinin bir silinmesi olmas. gerek yoktur, fakat islevsel proteinin ekspresyonunu ortadan kaldün herhangi bir silinmeyi içermektedir.
BazlZl yaplßndlünalarda, rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, UL82 (pp71'i kodlamaktadlß veya bunlari bir homologunu (örn. bu HCMV genlerinin RhCMV homologu) içermektedir.
Burada tarif edilen replikasyonu eksik RhCMV ve HCMV vektörleri, patojene özgü bir antijen veya bir tümör antijeni gibi bir heterolog antijenini kodlayan bir nükleik asit sekansIEI içerebilmektedir. Burada açllZlanan diger rekombinant RhCMV ve HCMV vektörleri için tarif edildigi üzere, replikasyonu eksik RhCMV ve HCMV vektörleri, kodlanmEIheterolog antijene karsEbir hastada bir immün yan.l]›rtaya koymasübin kullanllâbilmektedir.
UL82 geninde (pp71 proteinini kodlamaktadlE) bir silinmeye sahip bir rekombinant RhCMV vektörü, in vitro büyüyebilme ve in v/i/o yayllâbime kabiliyeti aç-dan çesitli sekillerde bozulmaktadü fakat CMV'ye karsElhala dayanllZlElbir T hücresi immün yanlElElortaya koymaktadlEBu sebepten ötürü, burada CMV'nin kendisine karsEl bir asEl olarak bir replikasyonu eksik vektör gibi kullanIi tasarlanmaktadlEI(bkz. SEKILLER 36 ila 38).
Mevcut bulusun avantajlElyapllândHnalarIa, RhCMV veya bir HCMV vektörü gibi bir rekombinant CMV vektörü, in w'i/o büyümesi için temel olmayan gen bölgelerinde silinmelere sahip olabilmektedir. Bu gen bölgeleri, klglflbylîlîblmayacak sekilde RL11 ailesi, pp65 ailesi, US 12 ailesi ve U528 ailesini içermektedir. Özellikle silinebilen RhCMV gen bölgeleri, Rh13- içermektedir. Bir diger yapüândlfilnada, silinebilen HCMV gen bölgeleri, RL11 (L), UL6, UL7 USl9 (E), USZO (E), USZl ve UL28 gen bölgelerini içermektedir.
Rekombinant CMV vektörleri veya bunlarlEl bilesimleri, rekombinant virüsün veya viral vektörlerin bir hataya uygulanmasElçin normal bir sekilde kullanilan herhangi bir yolla bir hastaya uygulanabilmektedir. Uygulama yöntemleri, klîlfllaylîlîcblmayacak sekilde intradermal, intramüsküler, intraperitoneal, parenteral, intravenöz, subkutanöz, vajinal, rektal, intranazal, inhalasyon veya oral uygulamayüçermektedir. Subkütanöz, intravenöz veya intramüsküler uygulama gibi parenteral uygulamaya genellikle enjeksiyonla ulasllüiaktadlîl Enjekte edilebilirler, slýllözeltiler veya süspansiyonlar olarak geleneksel formlarda, enjeksiyon öncesi - çözelti veya süspansiyon için veya emülsiyonlar olarak uygun olan katIZlformlarda hazlîllanabilmektedir. Enjeksiyon çözeltileri ve süspansiyonlar, steril tozlardan, granüllerden ve öncesinde tarif edilen türde tabletlerden hazlHlanabilmektedir. Uygulama, sistemik veya lokal olabilmektedir.
Rekombinant CMV vektörlerini içeren bilesimler, farmasötik olarak kabul edilebilir taslsîlîllâr gibi herhangi bir uygun sekilde uygulanmaktadE Farmasötik olarak kabul edilebilir taslýlüßr, uygulanan belirli bilesimle ve ayn üamanda bilesimi uygulamasEiÇin kullanllân belirli yöntemle klîinen belirlenmektedir. DolaylglEa, mevcut bulusun farmasötik bilesimlerinin genis say- uygun formülasyonu mevcuttur.
Parenteral uygulama için olan preparasyonlar, steril sulu veya sulu olmayan çözeltileri, süspansiyonlarü/eya emülsiyonlarülçermektedir. Sulu olmayan çözeltilerin örnekleri, propilen gklikol, polietilen glikol, zeytinyaglîlgibi bitkisel yaglar ve etil oleat gibi enjekte edilebilir organik esterlerdir. Sulu taslîdîllâr, suyu, alkolik/sulu çözeltileri ve salin ve tamponlu ortam dahil olmak üzere emülsiyonlarElveya süspansiyonlarEiçermektedir. Parenteral vehiküller, sodyum klorür solüsyonu, Ringer dekstroz, dekstroz ve sodyum klorür, laktatlERinger veya sabit yaglarEliçermektedir. Intravenöz vehiküller, slîElve besin yenileyicileri, elektrolit yenileyicileri (Ringer dekstroza baglEblanlar gibi) ve benzerini içermektedir. Koruyucular ve diger katkEl'naddeleri aynüamanda, örnegin antimikrobiyaller, anti-oksidanlar, selatlastlüüj maddeler ve inert gazlar ve benzeri gibi mevcut olabilmektedir.
BazEbilesimler, hidroklorik asit, hidrobromik asit, perklorik asit, nitrik asit, tiyosiyanik asit, sülfürik asit ve fosforik asit gibi inorganik asitlerle ve formik asit, asetik asit, propionik asit, glikolik asit, laktik asit, pirüvik asit, oksalik asit, malonik asit, süksinik asit, maleik asit ve fumarik asit gibi organik asitlerle reaksiyon sayesinde veya sodyum hidroksit, amonyum hidroksit, potasyum hidroksit gibi inorganik bir baz ve mon0-, di-, tri alkiI ve aril aminler ve ikameli etanolaminler gibi organik bazlarla reaksiyon sayesinde olusturulan farmasötik olarak kabul edilebilir bir asit- veya baz-eklentisi tuz olarak potansiyel bir sekilde uygulanabilmektedir.
Uygulama, tekli veya çoklu dozlarla uygulanabilmektedir. Mevcut bulusun kapsamlEtla bir hastaya uygulanan dozun, zamanla bir hastada faydalElbir terapötik yanlEllIlindükleyecek yeterlilikte olmasElgerekmektedir. Gerekli olan doz, hastanI türüne, yas. ve genel durumuna, tedavi edilen enfeksiyonunun siddetine, kullanllân belirli bilesimlere ve uygulama moduna baglßlarak hastadan hastaya degiskenlik gösterecektir. Uygun bir doz, sadece rutin deney yöntemi kullanlßrak teknikte uzman bir kisi tarafIan belirlenebilmektedir.
Burada tek bas. veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir taslîlîüle kombinasyon halinde rekombinant CMV vektörünün terapötik olarak etkili bir miktarIEilçeren farmasötik bilesimler saglanmaktadE Farmasötik olarak kabul edilebilir tasls-Llîlßr, klîlîllayEElolmayacak sekilde salin, tamponlu salin, dekstroz, su, gliserol, etanol ve bunlar. kombinasyonlarIIZI içermektedir. Taslîlaüve bilesim steril olabilmektedir ve formülasyon, uygulama moduna uygundur. Bilesim aynElzamanda ElatlEElveya emülsifiye edici maddelerin veya pH tamponlaylEEl maddelerin ufak miktarlarlElEliçerebilmektedir. Bilesim, bir SM] çözelti, süspansiyon, emülsiyon, tablet, hap, kapsül, sürekli sal-n formülasyon veya toz olabilmektedir. Bilesim, trigliseritler gibi geleneksel baglaylEllârla ve tasElElErla bir supozituvar olarak formüle edilebilmektedir. Oral formülasyonlar, mannitol, Iaktoz, nisasta, magnezyum stearat, sodyum sakarin, selüloz ve magnezyum karbonat. farmasötik dereceleri gibi standart taslýlîlßrüçerebilmektedir. Steril salinli çözelti veya susam yagEgibi yaygI herhangi bir farmasötik taslsîlEEkullanllâbilmektedir. Ortam aynEzamanda, örnegin osmotik baleÇ, tamponlar, koruyucular ve benzerini düzenlemek Için farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar gibi geleneksel farmasötik yardIiclZlmalzemeleri Içerebilmektedir. Burada saglanan bilesimlerle ve yöntemlerle kullanüâbilen diger ortamlar, normal salin ve susam Burada açllZlanan rekombinant CMV vektörleri, tek baslEb veya antijenesiteyi gelistirmek için diger terapötik maddelerle kombinasyon halinde uygulanabilmektedir. Örnegin CMV vektörleri, Freund tamamlanmamlgl adjuvanElveya Freund tamamlanmgl adjuvanlîlgibi bir adjuvanla uygulanabilmektedir.
Tercihe baglEblarak, IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-a, veya IFN-y gibi bir veya birden fazla sitokin, GM-CSF veya G-CSF gibi bir veya birden fazla büyüme faktörü; OX-40L veya 41 BBL gibi bir veya birden fazla molekül veya bu moleküllerin kombinasyonlarü biyolojik adjuvanlar olarak kullanüâbilmektedir (bkz. örnegin Salgaller ve meslektaslarÇl1998, meslektaslarEIZOOO, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90). Bu moleküller, konaga sistematik bir sekilde (veya lokal olarak) uygulanabilmektedir. bilinmektedir. Lipidler, çesitli antijenlere karsEilZTL'nin in w'vo hazlîllanmasl yardIi edebilen maddeler olarak belirlenmistir. Belirli yapllândlüinalarda, lipozomlar, nanokapsüller, mikro- parçaclElar, mikro-kürecikler, lipid parçaclEJarÇlveziküller ve benzerlerinin kullanIiDmevcut bulusun bilesimlerinin uygun konak hücrelerine dahil edilmesi için tasarlanmaktadlü Özellikle mevcut bulusun bilesimleri, bir lipid partikülü, bir lipozom, bir vezikül, bir nanosfer veya bir nanopartikül veya benzerlerinde kapsüllenen iletim için formüle edilebilmektedir.
Bu tarz formülasyonlar, burada tarif edilen nükleik asitlerin veya yapllârlîn] farmasötik olarak kabul edilebilir formülasyonlarII dahil edilmesi için tercih edilebilmektedir. Lipozomlar. formasyonu ve kullanEl genellikle teknikte uzman kisiler tarafIan bilinmektedir.
Lipozomlar, gelismis serum stabilitesi ve dolas! yarElömürleri ile gelistirilmistir (U.S. ,741,516 numaralEpatent dokümanDJ DahasÇlçesitli lipozom yöntemleri ve potansiyel ilaç taslîlîüârüolarak lipozom benzeri preparasyonlar incelenmistir (U.S. 5,567,434 numarali] dokümanD] Lipozomlar, Y hücresi süspansiyonlarü birincil hepatosit kültürleri ve PC 12 hücreleri dahil diger prosedürlerle ile transfeksiyona normal dirençli olan bir dizi hücre türü ile basarlIJIbir sekilde kullanllüwlgtlîl Ek olarak lipozomlar, viral bazlmagliîlüii sistemlerine özgü DNA uzunlugu klîlflbmalarlüiçermemektedir. Lipozomlar genler, ilaçlar, radyoterapi ajanlarÇl enzimler, virüsler, transkripsiyon faktörleri ve allosterik efektörlerin, çesitli kültürlenmis hücre dizilerine ve hayvanlara etkili bir sekilde dahil edilmesi için kullanilBilStE Ek olarak, lipozom araclIJJIillaç iletiminin etkililigini inceleyen çesitli basarlHDdinik çallgnalarEtamamlanmlgtlEl DahasÇlçesitli çallgl'nalar, IipozomlarI kullanIiIlEl, sistemik iletimden sonra otoimmün yanthrla, toksisite ile veya gonadal Iokalizasyon ile iliskili olmadlglElZliöstermektedir.
Lipozomlar, bir 5qu ortamda daglEilân fosfolipidlerden olusturulmaktadlEl ve spontane bir sekilde çok katmanlükonsantrik çift katmanlülrezikülleri (aynüamanda çok katmanlü/eziküller (MLV'Ier) olarak adlandßlüiaktadE) olusturmaktadlEl MLV'ler genellikle 25 nm ila 4 um arasIa çaplara sahiptir. MLV'Ierin sonikasyonu, 200 ila 500 Â araliglIa çaplara sahip, çekirdekte bir sulu çözeltiyi içeren küçük tek katmanlEl/eziküllerin (SUV'ler) formasyonu ile sonuçlanmaktadlü Lipozomlar, hücresel membranlara benzemektedir ve CMV vektör bilesimlerine yönelik taslýlîllâr olarak mevcut bulusla baglantUJIblarak kullanllßîaslîlçin tasarlanmaktadlü Su ve ve çift katmanlarEl içerisinde tutulabilmektedir. Ilaç taslîlan lipozomlarIEI, Iipozomal formülasyonu seçici bir sekilde modifiye ederek aktif maddelerin alana özgü iletimi için bile kullanllâbilmektedir.
Bulusun bazüiapliândülnalarüviral yayilBia ve patogenez ile iliskili hücrelerde ve dokularda replikasyonu önlemek için RhCMV/SIV vektörü tropizminin degisimi ile ilgilidir. Tropizmi eksik vektör, belirli hücre türlerindeki optimal büyüme için gerekli genlerden mahrumdur veya vektör, viral replikasyon için temel olan genlerde dokuya özgü mikro-RNA'IarI hedeflerini içermesi için modifiye edilmektedir.
Asaglki örnekler, belirli özellikleri ve/veya yapliândlîilnalarlîgöstermek için saglanmaktadlEI Bu örnekleri, bulusu, açlElanan belirli özelliklere ve yapllândlünalara klglîllamaslîliçin olusturulmamaIIlEI ÖRNEKLER Örnek 1.' Rekombinant HCMV ve RhCMV vektörleri Bu örnek, patojene özgü antijenler veya kanser antijenleri gibi heterolog antijenleri kodlayan, örnek teskil eden rekombinant HCMV ve RhCMV vektörleri açiKIamaktadlE Bulusun belirli yönleri, in vitro ve /n l//l/O olarak kopyalanabilme kabiliyetleri aç-an eksik veya bozuk olan, konakta dagilân veya konaktan konaga yayiiân rekombinant RhCMV ve HCMV vektörlerini saglamaktadlEl Diger yönleri, i'n Viva büyüme modüle (Örn. antibiyotik doksisiklinin oral uygulamasüile) olabilen RhCMV ve HCMV vektörlerini saglamaktadlEI Heterolog antijen ekspresyonu, CMV enfeksiyon döngüsüne (örn. EF10i - yapisal; MIE - anllKl pp65 - erken; gH - geç) göre farklERinetik sIIifliar promoterlerinin kontrolü aItIa olabilmektedir.
Belirli yapllândlElnalarda, RhCMV ve HCMV vektörleri, vektör immunojenesitesini, güvenligini ve vektörün heterolog gen tasma kapasitesini arttHnak için immün modülatör genlerinden (örn. Rh ile antijen mevcudiyetine müdahale eden en az dört farkIElgen ürününü ngSZ, ngS3, ngS6 ve ng511 kodlamaktadE Tüm dört HCMV MHC kaçlElna molekülleri, HCMV'nin benzersiz klîla bölgesinde kodlanmaktadlîive iliskili U56 gen ailesine aittir. Ek HCMV immünomodülatörler, içermektedir. Benzer bir sekilde RhCMV, tarif edilen asEl vektörlerinin vektör immunojenesitesini, güvenligini ve heterolog gen tasIia kapasitesini gelistirmek için silinebilen veya modifiye edilebilen homolog ve analog immün modülatör genlerini içermektedir.
Ek yapllândlEinalarda, rekombinant RhCMV ve HCMV vektörleri aynElzamanda çok saylElh antijen geninin eklenmesi ile anti-patojen veya anti-tümör immunojenesitesi için optimize edilmektedir. Alternatif olarak, her birisinin tek bir ekli antijene sahip oldugu çesitli vektörler birlikte uygulama için kullanllâbilmektedir.
Ek yapliândlîilnalarda, rekombinant RhCMV ve HCMV vektörleri, bir tetrasiklin (Tet)- düzenlenmis Cre rekombinazla kombinasyon halinde viral genomun bir temel bölgesine yanasmak için CMV genomunda stratejik olarak yerlestirilen LOXP alanlarIIZI(örn.
RhCMV/Anti-genLoxPCre) içermektedir. Immünizasyon sonrasia, Cre rekombinazI doksisiklin (Dox)-arac[l]]]hdüksiy0nu, LoxPalanlarIa bölünme ile RhCMV/AntijenLoxPCre'nin /n i//i/oinaktivasyonunu mümkün kllüiaktadlü Ek yapllândlElnalarda, rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü, enfekte hücrenin içerisinde virüs replikasyonu, konak içerisinde dagllüia ve konaklar arasIda yayllBia için temel olan veya bunlarEbrttlEian bir veya birden fazla gende bir silinmeyi içermektedir. Temel veya aittlîElîgenlerin spesifik örnekleri, kEIflbyiEEblmayacak sekilde UL82, UL94, UL32, UL99, UL115 veya UL44 veya bunlari bir homologunu içermektedir. Diger temel genler teknikte bilinmektedir ve tarif edilen RhCMV ve HCMV vektörlerinde silinme için tasarlanmaktad E(bkz.
RhCMV BAC'nin YaplEEle Karakterizasyonu Sofistike ?t fas bazllîh'iutagenez sistemi ile baglEblan genomik DNA'nI genis segmentlerini klonlamak için BAC teknolojisinin gelisimi, genetik yaklasIiIarI virüsü analiz etme yaklasIiIEhiümkün kilân herpes virolojisi alanIa devrim yaratmlgtlîl Bu sistem, örnegin tam RhCMV susu olusturmak için kullanilBilStE RhCMV BAC-Cre, bir bulaslîü patojenik RhCMV 68-1/EGFP rekombinant virüsten (16) türetilmistir. RhCMV BAC-Cre, RhCMVvLoxPnin R/ interjenik bölgesi içerisinde tek bir 1.0XP alana eklenen bir BAC kasetini içermektedir. BAC kasetinin bu alanda eklenmesi, kasete yanasan LOXP sekanslarII olusumu ile sonuçlanmlgtlü BAC kaseti, ökaryotik hücrelerde eksprese edilen bir Cre genini içerdigi için, fibroblastlara `kendiliginden kesilen' RhCMV BAC-Cre'nin transfeksiyonu, virüsü yeniden olusturarak (RhCMVi/LOXP olarak tasarlanmlgtlE) BAC kasetin etkili bir sekilde kesilmesi ile sonuçlanmaktadlü [n vitro ve in i//i/o olarak BAC-yeniden olusturulmus virüsün (RhCM- VVLOXP) büyüme karakterizasyonu, çesitli genetik manipülasyonlarlEl, virüsün WT özelliklerini degistirmedigini göstermektedir. RhCMVi/LoxP'nin genomik yaplgîlkalan LOXP alanElharicinde WT RhCMV'ninkine özdestir. L0XP sekansII mevcudiyeti, komsu RhJ8J (USI) ve Rh genlerinin ekspresyon profillerini degistirmemektedir. RhCMVVLOXP, doku kültüründe ve RhCMV seronegatif immünokompetan RM'Ierde (n=2) WT kinetikleriyle kopyalanmaktadlEl Asilâmadan 6 ay sonrasIa hayat. son verilen bir hayvandan allEan dokularI analizi, WT virüsü ile önceki çallgmalarda gözlemlenen Etarclîgen ekspresyonu ile tutarlIZI olarak dalakta RhCMV DNA ve IEl-eksprese edici hücrelerin mevcudiyetini sergilemistir. RM'Ier, dogal yollarla enfekte olan hayvanlarda gözlemlenenlere klýhslanan enerjik anti-RhCMV antikor titrelerini gelistirmistir. Birlikte allEUlgl-a, bu gözlemler, RhCMVi/LoxPnin, fenotipik olarak WT oldugunu göstermektedir ve asEl/ektörlerinin gelisimi için alana özgü degisimleri olusturmasüçin uygundur. Örnek teskil eden HCMV ve RhCMV asülrektörleri SEKIL 15, mevcut bulusun belirli yönlerine göre RhCMV ve HCMV asEl/ektörlerinin yap-El sematik olarak göstermektedir. Heterolog patojen antijenleri, E/T ve Flp-araclüD rekombinasyon ile RhCMV veya HCMV bakteriyel yapay kromozomlara (BAC'Ier) eklenmektedir. Sematik, örnegin RhCMV'nin rh213 ve Rh214'ü arasIaki kodlaylEEblmayan bölgeye bir epitop isaretli patojen antijeninin eklenmesi için genellestirilmis bir strateji göstermektedir. Bu strateji, RhCMV/HCMV genomu içerisinde diger belirlenen bölgelerinde heterolog patojeninin eklenmesi ve aynüamanda genom içerisinde tekli veya çoklu alanlarda çok saylah antijenin eklenmesi için benzer bir sekilde kullanllâbilmektedir. Epitopu isaretli patojen antijenini kodlayan gen, E/T rekombinasyonunu kullanarak BAC genomuna eklenmektedir. Antibiyotik direncin (Kan gibi) temelinde rekombinant BAC'Ierin seçiminden sonra, dirençli geni, FIp-araclllürekombinasyonla çlKbrllIhaktadlE Rekombinant RhCMV ve HCMV asülektörleri, rekombinant BAC'Ierin, RhCMV/HCMV izin verilir hücrelere (AgX, patojen veya kanser antijeni; Etiket, epitop isareti; pA, poIi-adenilasyon bölgesi; Kan, bakterilerde seçime yönelik kanamisin dirençli gen) transfeksiyon ile yeniden olusturulmaktadlîl SEKIL 16, bir örnek teskil eden tetrasiklin ile düzenlenmis RhCMV/HCMV `güvenli' asEl vektörünü göstermektedir. Bu RhCMV/HCMV güvenli vektörü, Tet ile indüklenen vektörün inaktivasyonunu birlikte mümkün hale getiren RhCMV/HCMV genomu içerisinde iki interaktif genetik bileseni içermektedir. Viral genom içerisinde eklenen bir Tet ile indüklenebilir Cre rekombinaz geni (Cre), Ttehomologu olan deoksisiklin (Dox) (D) ile tedavi ile Cre rekombinaz ekspresyonun indüksiyonunu mümkün kllîhaktadlE Bu Tet ile düzenlenmis sistem, bir Tet- duyarlEters-transaktivatör (rtTAZS-MZ) (TA2), bir Tet trans-basküâylîlZKtTS-çocuk) (TS) ve Cre-rekombinaz ekspresyonunu harekete geçiren bir tetO7-CMV minimum promoter biriminden (beyaz ok) olusmaktadlE Tet ile indüklenmis inaktivasyon için gerekli ikinci bilesen, virüs replikasyonu (bu durumda, Rh52-Rh156) için temel bir genom bölgesine yanasmak için viral genom içerisinde konumlandlEIlân bir çift LOXP bölgesidir. Dox yoklugunda, tTS-k/din baglanmasEl/e rtTAZS-MZ'nin tet07-CMV minimum promoter birimine rtTAZS-MZ baglantlgü Cre-rekombinaz ekspresyonunu önlemektedir. Cre rekombinaz yoklugunda, RhCMV/HCMV genomun bütünlügü sürdürülmektedir ve virüs normal bir sekilde kopyalanmaktadß Dox eklentisi, Cre rekombinaz ekspresyonunun aktivasyonu ile sonuçlanan tTS-k/d ve rtTA25-M2'nin allosterik modülasyonu ile sonuçlanmaktadE Cre rekombinaz, IOXP bölgeleri (bu durumda, Rh52-Rh156) ile yanastlEllân viral genom bölgesinin çlKbrllIhasIEl katalize ederek RhCMV/HCMV asEl/ektörlerini etkisiz hale getirmektedir. Sadelik aç-an, rtTAZS-MZ ve tTS-k/'di eksprese eden genler ve anllamanda heterolog patojen antijenini eksprese eden gen gösterilmektedir.
SEKIL 17, bir diger örnek teskil eden tetrasiklin ile düzenlenmis RhCMV/HCMV `güvenli' asEl vektörünü göstermektedir. Bu tarz RhC-MV/HCMV asEl/ektörleri, bu örnekte SEKIL 16'da aç[lZlanan Tet ile indüklenebilir sistemin kontrolü altIa Rh70 (HCMV homolog-UL44) DNA polimeraz islenebilirlik faktörü olarak virüs replikasyonu için temel bir geni yerlestirerek olusturulmaktadE Bu genin CMV replikasyonu için temel oldugu gösterilirken, ilk olarak Rh70 genler olarak kullanllâbilmektedir. Rh70 ekspresyonun veya Tet ile düzenlenmis sistemle diger temel RhCMV/HCMV genlerin ekspresyonunun düzenlenmesi, Dox seviyesini çesitlendirerek virüs replikasyon kontrolünü mümkün hale getirmektedir. Dox kontrolü altIa temel geni yerlestirmek için, genin 5' yukarIJ/önde bölgesi, tet07-CMI/ minimum promoter birimi (beyaz ok) ile degistirilmektedir. Hayvanlara, Dox mevcudiyetinde Tet ile düzenlenmis vektörlerin asllânmasIan sonra, virüs replikasyonu, Dox çekilmesi ile basit bir sekilde etkisiz hale getirilebilmektedir. Tet ile düzenlenmis vektörler, SEKIL 15'te detayland-[glîilizere E/T ve Flp bazlülekombinasyon ile olusturulmaktadlB SEKIL 18, bir diger örnek teskil eden tetrasiklin ile düzenlenmis RhCMV/HCMV `güvenli' asEl vektörünü göstermektedir. SEKIL 17'de detayland-[gEgibi Tet ile indüklenebilir sistemin kontrolü altlEUa bir sitotoksik geni (CytoG) içeren bu tarz RhCMV/HCMV aslIlvektörleri olusturulmaktadlü Dox yoklugunda Tet ile düzenlenmis vektörlere sahip hayvanlari inokülasyonundan sonra, virüs replikasyonu, asü/ektörü ile enfekte olan hücrenin ölümü ile sonuçlanarak sitopatik genin Dox araclIIIlindüksiyonu ile hlZElbir sekilde etkisiz hale getirilebilmektedir.
Diger yönlerde, RhCMV ve HCMV gen tedavi vektörleri saglanmaktadIEI SEKIL 19, örnek teskil eden RhCMV ve HCMV gen tedavi vektörlerinin yap-Elsematik olarak göstermektedir.
Terapötik genler, E/T ve FIp-araclIJDrekombinasyon ile RhCMV veya HCMV BAC'Iere eklenmektedir. Sematik, RhCMV'nin rh213 ve Rh214'ü arasIaki kodlaylEIJJlmayan bölgeye bir epitop isaretli terapötik genin eklenmesi için genellestirilmis bir strateji göstermektedir. Bu strateji, RhCMV/HCMV genomu içerisinde diger belirlenen bölgelerinde terapötik genlerinin eklenmesi için benzer bir sekilde kullanllâbilmektedir. Epitop isaretli degistirme genini kodlayan gen, E/T rekombinasyonunu kullanarak BAC genomuna eklenmektedir. Antibiyotik direncin (bu durumda Kan) temelinde rekombinant BAC'lerin seçiminden sonra, dirençli geni, FIp-araclIlIlrekombinasyonla çllZlarUIhaktadlü Rekombinant RhCMV ve HCMV gen tedavi vektörleri, rekombinant BAC'lerin, RhCMV/HCMV Izin verilir hücrelere (ThG, terapötik gen; Etiket, epitop etiketi; pA, poliadenilasyon bölgesi; Kan, bakterilerde seçime yönelik kanamisin dirençli gen) transfeksiyon ile yeniden olusturulmaktadirîi Referans Örnegi 2: RhCMV/SIVmac239gag'nin yaplgîl RhCMVVLoxPfiin Rh bölgeleri arasIdaki interjenik bölgede konumlandlîlân tek islevli LOXP bölgesinin mevcudiyeti, rekombinant virüsün yaplgîiçin bir Cre rekombinaz/LOXP sisteminden faydalanmak için kullanilîhlgtlü Bu yaklasn için, pSIVmac2399ag plazmid, SIVmac239gag kasetin PCR amplifikasyonu için bir sablon kaynagEl olarak kullanilB'ilStE SIVmac239gag kaset, SIVmac239gag genin ekspresyonunu harekete geçiren hücresel EFlo promoterini içermektedir. EFla promoteri, test edilen tüm hücre türlerinde yaplglal olarak aktif olan yüksek derecede aktif bir promoterdir ve gag geninin yüksek hücre türü bagIisEl ekspresyonu ile sonuçlanmasü beklenmektedir. PCR amplifikasyonu, güçlendirilmis SIVmac239gag kasetinin bir ucunda tek bir LOXP bölgesini dahil etmek için tasarlanan primerler kullanüârak uygulanmlIsIlEl Rekombinasyon için, LOXP bölgeleri ile yanastiîllân SIVmac239gag kaseti içeren PCR Ürünü, RM fibroblastlar. transfekte edilmistir. Transfeksiyondan 24 saat sonra, bu hücrelere, enfeksiyon (MOI) katiEUa RhCMVvLoxP 1 defa enfekte edilmistir. Enfeksiyonun, kapsamlElsitopatik etki gözlemlenene kadar islenmesine izin verilmistir. Bu sürede, virüsle enfekte edilmis hücreler çilZlarilÜilgl ve taze fibroblatlarlîlenfekte etmesi için kullanilüilgtlîl daha sonrasIa kültür vasitâslýla viral yayiIJElilElEönlemek için agaroz ile üst üste katmanlanmlgtlEl YaklasiEIolarak iki hafta sonra, bireysel viral plaklar toplanmlgve her bir plak, taze fibroblastlarEnfekte etmek için kullanilmlgtE Toplam hücre IizatlarEidaha sonras-a PCR ile SIVmac239gag gen mevcudiyeti için görüntülenmistir. SIVmac239gagpozitif hücre IizatlarEidaha sonrasIa sonike edilmis, seri olarak seyreltilmis ve taze fibroblastlarlîénfekte etmek için kullanilBilgtlB Süreç, üç defa tekrar edilmistir, bundan sonra plakla saflastßlîhlgl virüs klonlarü enfekte edilen hücreden elde edilen toplam RNA'sII northern blot analizi ile gag gen ekspresyonu için görüntülenmistir. Gag proteini ekspresyon mevcudiyeti, endotelyal hücrelerinde (EC) ve monosit ile türevlendirilmis makrofajlarI (MDM) immünofloresanIlEl yanßü western analizi ile onaylanmlgtlE Tüm SIVmac239gag kaseti, eklenen kasetin sekans bütünlügünü onaylamak için sekanslanmigtlîl Gag-pozitif klonlarII büyüme kinetikleri, WT virüsü ile klýlaslanmlgtlîlve WT büyüme özelliklerine ve yüksek gag ekspresyon seviyelerine sahip tekli RhCMV/SIVmac239gag rekombinant virüsü seçilmistir.
Birincil enfeksiyondan sonra 224. günde, RhCMV/SIVmac239gag, 4 RhCMV-seropozitif RM'nin bir kohortuna subkütanöz olarak uygulanmlStlEi Öncesinde yeniden enfeksiyonda gözlemlendigi üzere, gerçek zamanlEIPCR, viral asllâma sonrasia herhangi bir süre noktasIa kanda veya akciger lavaj mononükleer hücrelerinde sokak türü veya RhCMV/SIVmac23ggag olarak RhCMV'yi tespit etmemistir. Fakat yeniden enfeksiyondan 127 gün sonrasIa ürin, RhCMV/SIVmac239gag mevcudiyetini gösteren ELISA ile gag ekspresyonu için haftallE olarak pozitif çllîmlgtü Bu numuneler, RhCMV'yi izole etmek için birlikte kültürlenmistir ve bu iri vivo türevli viral preparasyonlar, western blotu ile gag ekspresyonu için degerlendirilmistir. SEKIL 8'de gösterildigi üzere, tüm 4 hayvandan RhCMV es kültürleri, bu epitelyal salgllâma bölgelerinde RhCMV/SIVmac239gag virüsün mevcudiyetini kosulsuz bir sekilde olusturan gag'yi eksprese etmistir. Yeniden enfeksiyonun erken süre noktalarIa ürinin retrospektif analizi, bir RM'de 7. günle ve diger 3.'ünde 21. günle gag eksprese edici RhCMV vektörünün mevcudiyetini ortaya çüZlarmlStlEl Dahasügag eksprese edici RhCMV aynEzamanda salyada mevcut olmustur ve yeniden enfeksiyondan sonra en az 237 gün boyunca ürinde mevcut olmustur. Bu RhCMV/SIVmac239gag klonunun yeniden enfeksiyonu, mukozal olarak yönlendirilen, gag-spesifik CD4+ ve CD8+ T hücre yan-Ele aynüamanda gag-spesifik antikor yan-Eihdüklemistir (bkz. SEKIL 10, 11 VE 12).
Bu veriler tartlgmaslîlibir sekilde, immün hastalarIEyeniden enfekte edebildigini, CMV'nin, önceden mevcut olan WT virüsü ile etili bir sekilde mücadele ettigini ve CMV'de güçlü bir sekilde arttlElB'ilg hücresel ve humoral immüniteye ragmen normal bölgelerde enfeksiyonu olusturabildigini göstermektedir. Ayn üamanda, eksojen heterolog antijenlerini eksprese eden RhCMV vektörlerinin yüksek in vivo stabilitesini göstermektedir, bu da bu vektörlerin, asllânmamlghastasElEtarla enfekte edebildigini ve eklenen, eksojen antijen kodlaylElîglienlerin ekspresyonunu belirsiz olarak sürdürdügünü göstermektedir. Son olarak, rekombinant RhCMV'nin, yeniden enfeksiyon ayarIa eksojen proteinlerine T hücre ve Ab yanlEliarIü ortaya koyabilmektedir ve bu sekilde, önceden mevcut olan CMV immünitesi olan bireylerde bir etkili asülektörü olarak hareket etme potansiyeline sahiptir. Örnek 3.' Poliovirüs VP1, Tetanoz C, influenza H5N1 hemagglutinin ve Ebola virüsü nükleoproteini (NP) kodlayan CMV vektörleri.
Bu örnek, bir rekombinant mürin CMV (MCMV) vektörü ile kodlanan heterolog antijenlerin ekspresyonunu ve asilânan hayvanlarda antijene özgü CD8+ T hücrelerinin indüksiyonunu açlElamaktadlB CMV'ler, kendi benzersiz CMV'sine sahip olan en memeli türlerle katEtür özgüllügü sergilemektedir. Fakat tüm CMV'Ier, büyüme, sitapatoloji, doku tropizmi ve Erarclîl ve latent enfeksiyonu olusturma kapasitesinin ortak özelliklerini paylasmaktadlîl CMV'Ierin biyolojik açin benzerligi, insan hastanI in vivo modellerinde oldugu gibi farelerin mürin CMV enfeksiyonu ve makaklarI makak CMV enfeksiyonu gibi insan olmayan hayvanlar.
CMV enfeksiyonunun kullan“ izin vermistir. Bu sebepten ötürü, MCMV fare modeli, yaygI HCMV'nin bir in vivo modeli olarak kullanHIhaktadlE DolayEMa, bu örnek, heterolog antijenlerinin ekspresyonu ve bir hastada bir immün yan-I ortaya konmasi yönelik vektörlerin kullanIiEü;in rekombinant CMV vektörlerinin (örnegin RhCMV ve HCMV vektörleri) kullanIlEb yönelik konseptin kan-Baglamaktadlîl Bir heterolog antijeni kodlayan rekombinant MCMV vektörlerini üretmek için asagidaki deneylerde kullanllân MCMV BAC açlElanmlStlEl(Wagner ve meslektaslarüJ. Virol. 73:7056- 7060, 1999).
DNA kodlaylEElpoliovirüs VP1, poliovirüs nükleik asitten güçlendirilmis PCR olmustur ve pMCMV-VPl'i üretmek için MCMV BAC plazmidine klonlanmlStlE VP1 proteini aynllamanda tespite olanak saglamak için aslBDkarboksi terminalde bir küçük epitopla isaretlenmistir. pMCMV-VPl, MCMV-VP1 virüsünü yeniden olusturmak için mürin embriyo fibroblastlara (MEF'ler) transfekte edilmistir. MEF'Ier, MCMV-VP1 virüsü ile enfekte olmustur. YaklasiKl olarak 3 gün sonra, hücreler çEZlarllIhlgl ve izole protein, bir poliakrilamid jelde ayrllüilStlE Western blotlamasüepitop isaretine karsEbir antikor kullanllârak uygulanmlgtlEl Epitop isareti reaktivitesine ve öngörülen moleküler aglIlilgb dayalüolarak, sonuçlar, poliovirüs VP1'in, MCMV-VP1 ile enfekte edilen MEF'Ierde etkili bir sekilde eksprese edildigini göstermektedir.
Bulusun bu yapllândlünasll yönleri Örnek 6'da açlKlanmaktadlE Kus gribi (Viet04 susu) H5N1 HA, pMCMV-HA'yEiüretmek için MCMV BAC plazmidine klonlanmlgtü HA proteini, ekspresyon analizine olanak saglamak için epitop ile isaretlenmistir. MCMV-HA virüsü, yukar- açlElandlg'lEgibi yeniden olusturulmustur. MCMV- HA virüsü, MEF'Ieri enfekte etmek için kullanllüilgtlîl Yaklasim olarak 3 gün sonra, hücreler çiEhrüBilgl ve izole protein, bir poliakrilamid jelde ayrUBügtlEl Western blotlamasÇlepitop isaretine karsEliiir antikor kullanilârak uygulanmlStlB Epitop isareti reaktivitesine ve öngörülen moleküler ag lill[gt:i dayalüilarak, sonuçlar, HA'nlBJ, MCMV-HA ile enfekte edilen MEF'Ierde etkili bir sekilde eksprese edildigini göstermektedir.
Ebola virüsünün (NP) bir T hücresi epitopu, pMCMV-EBOV-NPm yap-Eblusturmak için temel olmayan MCMV genine (IE2) kaynasilZJ hale getirilmistir. MCMV-EBOV-NPCTL virüsü, MEF'lerde yeniden olusturulmustur. On fare, 1. günde MCMV-EBOV-NPCTL ile I.p. olarak immünize edilmistir ve 4. haftada arttlîllhîlgtlEI Splenositler, hücre içi sitokin boyasEKICS) kullanilârak NP-spesifik CD8+ T hücrelerinin say-D degerlendirmek için 8. haftada çlKlarllfhlStlEl Klîlacaslîlsplenositler, 6 saatligine hedef antijenin (NP) ve brefeldinin (A) mevcudiyetinde inkube edilmistir. NP-spesifik CD8+ T hücrelerinin yüzdesi, efektör sitokinlerin ekspresyonuna dayaIIJJIarak aklîlsitometrisi ile belirlenmistir. Bireysel fareler için, NP-spesifik toplam CD8+ T hücrelerinin yüzdesi, yaklaslla olarak %1-10 aralgiadß MCMV- EBOV-NPcrL ile immünizasyon, bir NP-spesifik T hücresi immün yan-I ortaya konmasüçin asiEIlîllerecede etkili olmustur. Bulusun bu yapüândlünasüörnek 7'de açllglanmaktadlü K& AçllZlama: Bu sonuçlar, bir heterolog antijeni kodlayan rekombinant CMV vektörlerinin (tüm tam uzunlukta protein veya bir bireysel epitop), enfekte hücrelerde heterolog antijenini etkili bir sekilde eksprese edebildigini ve heterolog antijene güçlü bir T hücresi immün yan-ßlusturabildigini göstermektedir.
Referans Örnegi 4: Maymun çiçek virüsü antijeni A35R'yi kodlayan rekombinant RhCMV Bu örnek, rekombinant virüs vektörü ile asllânan makaklarda (RM) maymun çiçek virüsü antijeni A35R ve A35R-spe5ifik T hücresi yanlflbrllîlkodlayan bir rekombinant RhCMV vektörünü açilZlamaktadlEl RM'lere, A35R'yi eksprese eden RhCMV asilânmlgtlEve BAL slîlîü akcigerde (erisilebilir bir mukozal efektör bölgesi) T hücrelerinin analizi için asIn 7, 14 ve 21 gün sonrasIa toplanmlgtlîl A35R-spesifik CD4+ ve CD8+ merkezi (CM) ve efektör haflîla (EM) yanmhrü yukarida açHZlandlglEl gibi (fakat A35R peptitlerini kullanarak) ICS ile degerlendirilmistir. 14. günde, asüânmlg hayvanlarda, CM ve EM A35R-spesiûk T hücrelerinin (CD4+ ve CD8+) say-aki önemli bir artlglgözlemlenmektedir.
Insan dönüsümü için önemli ölçüde zayifllatllân ve yeterince güvenli olan bir RhCMV vektör tasarIIEkullanarak bir etkili SIV asElZblusumu açlKlanmaktadlEl Bir yaklasl, genellikle replikasyonu eksik vektörleri tasarlayarak vektörün zayEElbtüüîaslüla en dogru yolu almaktadlB fakat SIV'ye karsElbir koruyucu immün yan-I indüklenmesine yönelik CMV vektör replikasyonuna olan ihtiyaç hala net degildir. TamamlaylEElbir yaklasIi, sadece CMV hastal[gl|:l ve bulasmasElle iliskili spesifik hedef dokularIia replikasyon için zay[fl1at[lân RhCMV/SIV vektörlerini olusturmaktadlB fakat viral replikasyonun, bu immünite için gerekli bir bilesen olmasEl halinde, hala SIV koruyucu immün yanlflbrIlZl indükleyebilmektedir. Birincil HCMV/RhCMV enfeksiyonunun ana özelliklerinden birisi, bireylere, tükürük benzeri gibi glandüler dokudan virüsün bulasmasEive ürine virüsün salgilânmaslîl (Pass, R.F. 2001.
Cytomegalovirus. In Fields Virology. P.M.H. David M. Knipe, Diane E. Griffin, Robert A. Lamb Malcolm A. Martin, Bernard Roizman and Stephen E. Straus, editor. Philadelphia: Lippincott Tükürük bezi kanallarIEl'e idrar yollarIÜeya böbrekleri kaplayan enfekte epitelyal hücreleri, bu dokularda virüsün ErarcEkaynaklarEblarak görülmektedir. Ilk olarak, RhCMV omurgadan çilZiarilân epitelyal hücre tropizminde dahil edilen tüm bilinen genlere sahip olan bir RhCMV/SIV vektörü tasarlanmaktadlEl Bu hücre türünde virüs replikasyonun sunulmasÇlbu dokulardan ve aynüamanda SIV koruyucu immünite kaybEbImadan RM'de patojenisiteden bulasan RhCMV'yi önemli ölçüde azaltabilmektedir. RhCMV epitelyal hücre tropizminin degistirilmesi, RM'de asüvektörünü önemli ölçüde zaylIIbtabilmektedir, fakat ölümcül enfeksiyonun baglamIa, vektörün hala yayllâbilmesi ve CNS hastallgi- yol açabilmesi olasllIglübqunmaktadlB Bu sebepten ötürü, bulusun bir ek yapilândlîilnaslZl bulaslEElvirüs üretimi için gerekli temel RhCMV genlerini etkisiz hale getirmek için dokuya özgü miRNA'lara dayalÜeni bir yaklasIiEkullanarak CNS'de ve miyeloid dokusunda kopyalanabilme kabiliyetini degistirerek vektörün güvenliginin temin edilmesi ile ilgilidir. Bu çallgtnalarda üretilen nihai RhCMV/SIV aslîü bireysel tropizm nakavtlarEl ile gözlemlenen SIV-spesifik T hücresi yanifilarII özelliklerine baglEl olarak bu tropizm eksikliklerinin bir kombinasyonunu içerebilmektedir.
Bir RhCMV/SIV vektörünün olusumu ve karakterizasyonunun, tropizm genlerinin silinmesi ile epitelyal hücrelerde replikasyonu tamamen eksiktir. HCMV ve RhCMV, endotelya hücreleri, makrofajlar, nöronlar, endotel hücreleri ve aynüzamanda fibroblastlar (in vitro virüs büyümesi için prototipik hücredir) dahil bir çok farklElhücre türünde kopyalanmaktadB HCMV ve RhCMV mutagenez çallglnalarÇl fibroblastlarda replikasyonu için temel olmayan, fakat diger hücre türlerinin virüsün tropizmini belirleyen viral genlerinin bir say-Dortaya çlEarmlStlB Örnegin HCMV UL128-131A genler, epitelyal ve endotelyal hücrelere viral girdi için kritik öneme sahip oldugu gözlemlenmistir, fakat öncesinde bahsi geçen fibroblastlar için aynlîElsöylenemez. RhCMV/SIV yapilârII (68-1) olusumu için kullanllân RhCMV vektörü, hücrelerinde azaltllînlgl replikasyonu sergilemektedir. RRPE hücrelerinde bu azaltllBilg replikasyon, HCMV UL128'in RhCMV homologlarII ve UL130'un ikinci eksonunun kayblEtlan sonuçlanmaktadlîl 68-1 hala epitelal hücreleri enfekte edebilirken, UL128'in ve 130 mutasyonun onarliübu hücrelerde viral replikasyonda bir 2-3 log artlgla sonuçlanmaktadlü Epitelyal tropizmde bu genlerin islevi ile tutarlßlarak, RhCMV 68-1, saglllîlüietiskin RM'Ierde Etarclîlreplikasyonun normal epitelyal bölgelerinden ürine ve salyaya artan bulasma durumunu sergilemektedir. Önemli bir sekilde, bu `yapüjeneyi', epitelyal tropizm genlerinin hedef aIlEmasIlEl, CMV vektörlerinin, asüverimliligini sürdürürken bulasma kabiliyetini zayllîllattigllîbir etkili strateji oldugunu göstermektedir. RhCMV'de (Rh01 Rh159, Rh160, ve Rh203) 4 ek epitelyal hücre tropizm genlerinin mevcudiyeti, 68-1'in, bir kalan, epitelyal hücrelerde kopyalanma kabiliyetini tutma kabiliyetini açlElayabilmektedir. Bu genlerin mutasyonu, epitelyalde, fakat fibroblast hücrelerde olmayacak sekilde, siddetli (>4 log azalma) ila orta (1-2 log azalma) replikasyon eksikligi ile sonuçlanmaktadlîl RhCMV UL128 ve 130'un inaktivasyonu, virüsün, epitelyal hücreleri enfekte edebilme ve enfekte RM'Ierden bulasabilme kabiliyetine dair bir etkiye sahip oldugu için, kalan epitelyal hücre tropizm genlerinin ortadan kaldlîllüiasüepitelyal hücre enfeksiyonunu tamamen iptal etmekte ve viral bulasmayEbrtadan kaldlEinaktadlEl Epitelyal hücre tropizminin ortadan kaldlülîhasüvirüsün, pnömani gibi epitelyum ile iliskili hastal[gb yol açabilmesi kabiliyetinde olmak üzere virüsün canllîpatojenisitesini siddetli bir sekilde zayiflhtabilmektedir. Bu sebepten ötürü, bulusun yapüândlîlnalarEßS-l RhCMV genomundan bu 4 ek epitelyal tropizm geninin silinmesi ile epitelyal hücrelerde azalan replikasyona sahip olan bir RhCMV/SIV vektörü ile ilgilidir. Vektör, RhCMVAEpiCMAX/SIV(gag) veya (retanef) olarak ve in vivo çallgtnalar için kullan ilâcak sekilde tasarlanmaktadE Tüm biline epitelal tropizm genleri [RhCM-VAEpiCMAX/SIV(gag) veya (retanef) olarak tasarlanmlgtlE] için silinen bir RhCMV/SIV vektörünün yapEüGS-l BAC genomu (hali hazBla UL128 ve UL130 için silinmektedir) içerisinde kalan dört tropizm genini bireysel olarak hedef almak için lineer rekombinasyonun çok sayldb turunu gerektirmektedir. Aynlîlsürede, EF1ci promoterin kontrolü aItIa bir ayrllpitop isareti ile SIV gag veya retanefini eksprese eden bir kaset, ilk epitelyal tropizm açllZl okuma çerçevesinin (ORF) (Rh01) silinmesi sßisia karsiliEllZblarak genoma eklenmektedir. Tekrar eden silinme turlarIEmümkün kilîhak için, seçilebilir isaretleyici olarak galaktokinaz (ga/K) kullanan standart iki adilEl lineer rekombinasyon protokolüne bir modifikasyon kullanilIhaktadlE(Warming, S., Costantino, N., Court, D.L., Jenkins, N.A., and Copeland, N.G. 2005. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res 33:e36). Önemli bir sekilde, bu modifiye edilmis sistem, rekombinasyonun sonraki turlarlEla müdahale eden BAC genomu içerisinde herhangi bir ds-aksiyonlu heterolog sekansElDNA `yarasIIIterk etmemektedir. Ilk rekombinasyon adIiIa, RhCMV BAC (68-1) içeren rekombinant bakteriler (SW102), RhCMV genomu içerisinde rekombinasyonun arzu edilen bölgesine homolog olan sekans ile yanastlEIIân ga/K ve kanamisin direncinden (KanR) olusan bir PCR ürünü ile dönüstürülmüstür. SW102, galaktoz oksotroflarIlE(galaktoz operonundan ga/K geninin silinmesinden kaynaklüolarak) ve sadece karbon ve kanamisin kaynaglîlolarak galaktoz içeren plakalardaki büyüme, genom içerisinde PCR ürününü (ve _aa/K/KanR) yerlestiren BAC klonlarII seçilmesini mümkün hale getirmektedir.
Ikinci rekombinasyon adIilEUa, ga/K/KanR kaseti, bir oligonükleotid ile degistirilmektedir veya PCR ürünü, istenilen silinmeye bitisik olan rekombinasyon bölgesine homolog olan sekansla degistirilmektedir. Bakteriler, ga//GKanR isaretleyicisini kaybeden BAC kIonlarII karslElseçimi ile sonuçlanan kanamisin yoklugunda, ga/K mevcudiyetinde toksik bir sübstrat olan, 2-deoksi-galaktoz içeren plakalarda büyütülmektedir ve sadece istenilen silinmeyi içermektedir. Yöntem, tüm epitelyal hücre tropizm genleri, RhCMV/SIV vektöründen silinene kadar Rh159, Rh160, ve Rh203'ü slBilEblarak silmek için kullanIJBiaktadlEl Epitelyal hücre tropizm genlerinden mahrum olan, fakat bir V5 epitop isaret ekspresyon kaseti ile SIV retanefi kodlayan RhCMV vektörlerini benzer olan RhCMV/SIV vektörlerinin immunojenesitesini test etmek için gerekli hayvan say-Eparalel olarak azaltmak için, (2) gag eskpresyon kasetinin yerine, [RhCMVAEpICMAX/SIV(retanef) olusturulmaktadB RhCMVAEpiCMAX/SIV(gag) ve (retanef) virürslerinin yeniden olusturulmasüVirüsleri yeniden olusturmak için BAC'Ier, birincil makak fibroblastlar- (RF'Ier) transfekte edilmektedir.
Yaklaslla olarak iki hafta sonra, plaklardan, görünür olmasEI ve virüsün düzelmesi beklenmektedir. Virüs aynDzamanda BAC kasetinin çilZlarilîhasII ve sokak türü RhCMV ile herhangi bir kalan kontaminasyonun ortadan kaldlEIIBiasIEtemin etmek için üç tur plak saflastlEnasEile saflastlElllBiaktadEl BAC-kasetinin çilZlarllIhasüdüzeltilen virüsten izole edilen genomik DNA'dan PCR ve Southern blot analizi ile onaylanmlgtlEI Gag ekspresyonu ve retanef protein ekspresyonu, hedef antijen ekspresyon seviyelerinin WT vektörlerle klsîlaslanabilir olmasII ölçülmesi için onaylanmlSIIB Rh-CMVAEpiCMAX/SIV(gag) ve (retanef) büyümesi, RF'Ierde (temel büyüme kapasitesinin ölçülmesi) ve epitelyal hücrelerde büyümeye yönelik sokak türü RhCMV ile klýhslanmaktadlîl RRPE'ye ek olarak, birincil RM böbrek epitelyal hücreleri, bu karakterizasyon için kullanilâbilmektedir. Makrofajlarda ve mikrovasküler endotelyal hücrelerde büyüme de bu genlerin, bu hücre türlerinde virüs büyümesini etkileyebilmesinden dolayEl degerlendirilmektedir. In vitro fibroblastlarda normal büyümeyi devam ettiren, fakat epitelyal hücrelerde büyüme için maksimum tehlikede olan bir RhCMV vektörü, hayvanlarda immunojenesite ve zaylülatma Için test edilecektir. Viral replikasyonunun aynlIlamanda makrofajlarda veya endotelyal hücrelerde degistirilmesi halinde, bulusun bir yapUândlElnasÇl tek bas. epitelyal hücrelerde eksik replikasyon sergileyen mutasyonlarla ilgilidir. Dört bireysel epitelyal gen, RhCM-VAEpiCMAX/ SIV(gag) ve (retanef) yap-a slßlüolarak silinebildigi için, fibroblastlarda veya ek epitelyal olmayan hücre türlerinde azalmlg replikasyon sergileyen herhangi bir vektör, sonraki in vitro büyüme karakterizasyonu slßslîida olusum asamaslüda hlîlEI bir sekilde belirlenmistir. Fibroblast büyümeisni etkilemeden en büyük saylEIh epitelyal tropizm ORF'Ieri için maksimum oranda silinen RhCMV vektörü, RhCMVAEpiCMAX/SIV(gag) veya (retanef) olarak tasarlanmlg ve in vivo RM çallgnalarlia kullanllIhlgtlEl Bulusun yapllândlElnalarütemel RhCMV genlerinin 3'UTR'Ierine dokuya özgü miRNA hedef sekanslarI eklenmesi ile epitelyal, nöronal ve miyeloid dokusunda replikasyon için eksik olan RhCMV/SIV vektörlerinin olusumu ve karakterizasyonu ile ilgilidir.
Bir sokak türü HCMV'ye dayalEHIV as-I kullan“ dair ana sorunlardan birisi, immün yetmezligi olan ceninlerde, çocuklarda ve yetiskinlerde hastalllg potansiyelidir. HCMV, CNS anomalileri, periferik nevropati, retinit ve pnömoni dahil olmak üzere bu bireylerde çesitli hastalilZlara yol açabilmektedir (Pass, R.F. 2001. Cytomegalovirus. In Fields Virology. P.M.H.
David M. Knipe, Diane E. Griffin, Robert A. Lamb Malcolm A. Martin, Bernard Roizman and Stephen E. Straus, editor. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. 2675-2705). RhCMV vektörlerinde epitelyal hücre tropizmi kayblZlCNS hastallgllîbir ana sorun olarak kalmas- ragmen, pnömoni ve retinit gelisimini zaylîlhtabilmektedir. CNS hastal[giü hidrosefalus, zihinsel özür ve saglElllgla yol açabilen konjenital enfeksiyon slîehslda bir ana sorun olmaktadlEl Dokuya spesifik miRNA hedef sekanslarII poliovirüs genomuna yerlestirilmesinin, beyindeki viral replikasyonun zaylfllatllü'iasia olaganüstü derecede etkili oldugu ve farelerde asII gelisimi için yeni bir yaklasIi saglayan ölüm hlîEloldugu gösterilmistir. Benzer bir sekilde, influenza genomuna miRNA hedeflerinin eklenmesi aynEl zamanda dokulardaki virüsü etkisiz hale getirmektedir.
Bulusun bazüyapllândlülnalarü bir hematopoietik miRNA ile virüsün bir temel genini hedefleyerek makrofajlarlarda CMV replikasyonunun spesifik olarak önlenmesi ile ilgilidir. Bu yaklasIiI islevselligi, temel IE3 ekpsresyonunun miR 143 3p ile nakdavn edildigi MCMV için gösterilmistir (SEKIL 21-25). Hücresel miRNA'larla y- için temel CMV genlerinin mRNA'sII hedeflenmesine yönelik bu yaklasIiI kullaniEburada açlElanmaktadlE Önemli bir sekilde, miRNA'lar, bu yaklasnÇldiger türler için uygun hale getirerek fareler ve insanlar (ve bu nedenle RM) arasIa önemli ölçüde korunmaktadlE(Larke, R.P., Wheatley, E., Saigal, S., and Chernesky, M.A. 1980. Congenital cytomegalovirus infection in an urban Canadian community. J Infect Dis 142:647-653). Nörona özgü miRNA'larI kullannEile CNS büyümesi için zaylfllatllân CMV vektörlerinin olusturulmasüçin benzer bir yaklasIi kullanllîhaktadß CMV hastallglII bir diger özelligi, virüsün, organlara yayHIhasIlEl ve buna makrofajlarI araclJJIZl ettigi düsünülmektedir. Makrofajlar ve endotelyal hücrelerinin, konakta CMV Erari. bölgeleri oldugu düsünülmektedir, bu sekilde virüs rezervuarlarIan birisinin ortadan kaldlBIBiasLIIhala virüs Barlülünümkün küüial-(Jarvis, M.A., and Nelson, J.A. 2002. Human cytomegalovirus persistence and Iatency in endothelial cells and macrophages. Curr Opin Microbiol 5:403-407). Bu sekilde, bulusun bazElyapllândÜnalarÇl CMV sistemik yayllBiayEl önlemek için miyeloid replikasyonun hedef allEinasEille ilgilidir. Bir optimal CMV vektör adayü farleliücre türlerinin en genis çesitliliginde replikasyonu için maksimum ölçüde zaylfllatlIJEken, sokak türü immunojenesiteye sahip olacaktIEl Asaglki dokularda replikasyonu önlemek için hedeflenen CMV doku nakavt vektörleri üretilmektedir: CNS, hematopoietik, CNS/epitel, CNS/hematopoietik, epitelyal/hematopoietik ve CNS/hematopoietik/epitelyaI.
CNS (RhCMVAC/SIV) ve hematopoietik (RhCMVAH/SIV) doku nakavt virüslerinin in vitro doku tropizm özellikleri üretilmekte ve test edilmektedir. Immunojenesite çallgl'nasII RM saylîü öncesinde açllîlandlgllîgibi SIV gag, RhCMV/SIV(gag) ve SIV rev, tat ve nef füzyon proteini, retanef, RhCMV/SIV(retanef) ile doku tropizm nakavtlarIÜJIusturarak korunabilmektedir. Bu vektörlerin yapEEisagIki gibidir: RhCMVAC/SIV(gag) ve (retanef): CNS'de kopyalanamayan bir RhCMV/SIV as-Eüretmek için, RhCMV/SIV vektörlerinin RhCMV temel geni IE2 geninin (Rh156 Ex5) 3'UTR sekansa nöronal miR- eklenmektedir. Farelerde, RM'de ve insanda miR-124, nükleotid seviyesinde (miRBase websiteisnde, mikroRNA veri tabanlEUa açllîlandlgllîl gibi). korunmaktadE (5'UAAGGCACGCGGUGAAUGCC3'). Bu dokuda virüs replikasyonunun bir tam nakavtIEIemin etmek için, miR- 3' UTR'sine eklenmektedir. IE2 için, miR-124 hedef sekanslarü öngörülen AATAAA poliadenilasyon sinyaline dayallîblarak 3'UTR'sinin etkili bir sekilde orta noktaslîblmak üzere ORF'nin asaglîl yönünde 18 baz çifti veya yukarlab açllîland[glüg]ibi BAC teknolojisini kullanarak Rh142'nin 78 baz çiftini asag [yönde eklenmektedir.
Her bir durumda kesisen ORF'Ier, virüsün spesifik olmayan zay[EIlama olasHJgJIÜninimize etmek için önlenmektedir. Bir kez olusturuldugunda, her bir virüs, hedef genin gen ekspresyon seviyeleri ve dokuya özgü miRNA'IarI her birisini eksprese eden indüklenebilir yapilarla stabil bir sekilde transfekte edilen fibroblast hücrelerinde viral büyümenin zaylElhmasEilçin test edilmektedir. Hedef genlerin protein ekspresyon seviyeleri, western blot analizi ile takip edilirken RNA ekspresyon seviyeleri, RT-PCR ile test edilmistir. Virüs büyümesi, RF'Ierin külaslamasliîda RM ölümcül nöronal kültürlerin birincil kültürlerinde kontrol virüslerine karsüniRNA hedefini içeren virüsleri klýlaslayarak tek ad Iü/e çok adIiIlîlbüyüme egrileri ile belirlenmektedir. HCMV'nin, in vitro nöronal hücrelerde kopyalandlgilîgösterilmistir (Luo, M.H., Schwartz, P.H., and Fortunato, BA. 2008. Neonatal neural progenitor cells and their neuronal and glial cell derivatives are fully permissive for human cy-tomegalovirus RM beyin dokusundan birincil nöronal kültürler, Basvuru sahibilarla temin edilebilmektedir.
RF'Ierde büyüme sergileyen, fakat nöronal kültürler olmayan virüsler, T hücresi yanlElllldugu gibi patojenez için test edilmektedir.
RhCMVAH/SIV(gag) ve (retanef): Makrofajlarlarda kopyalanamayan bir RhCMV/SIV'yi üretmek için, iki RhCMV temel geç genlerin 3' UTR'Ierine hematopoietik hücre miR-143-3p'ye kesin tamamlaylElDKIa dört 21mer eklenmektedir: gH (Rh104) temel glikoprotein reseptörü ve fak kapsid proteini (Rh117). Fare, RM ve insan için miR-143-3P sekansü nükleotid seviyesinde (5'UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA3') (miRBase websitesinde, mikroRNA veri tabanIa açilZlandiglElgibi) korunmaktadlEl GH için, miR-143-3p hedef bölgesi, poli A sekansIan önce ORF'nin 114 bp asagEl/önünde konumlandlîllBiaktadlEl Rh117 için, hedef poliadenilasyon sinyalini kulland[giEiçin, tüm bu transkriptlerin, viral replikasyon blogunun etkililiginin artt-[gißekilde makrofajlarda nakavt edilmesi beklenmektedir.
RhCMV temel geç genler, bulaslEEl/irüs üretimini önlemesi hedeflenmektedir, fakat uygun gag ve retanef antijen mevcudiyetinin, asEl/ektör immunojenesitesini korumasi olanak saglamak için makrofajlarda SIV gag ve retanef antijenlerinin ekspresyonuna izin vermektedir. RF'de büyüme sergileyen, makrofajlar olmayan virüsler, patojenez ve aynD zamanda T hücresi yaniEllîliçin test edilmistir. Makrofajlar, öncesinde açllZlandlgElgibi RM periferik kanIa hazlîllanmaktadlEl(Söderberg-Naucler, C., Fish, K.N., and Nelson, J.A. 1997.
Reactivation of latent human cytomegalovirus by allogeneic stimulation of blood cells from healthy donors. Cell 91: 119-126).
Tekli tropizmi eksik RhCMV/51V vektörlerinin test edilmesinin yanEl SÜ, bulusun yapllândlîrlnalarüepitelyal, CNS ve makrofajllksik tropizmlerin özelliklerini birlestiren gag ve retanef ile çok sayElla tropizmi eksik RhCMV vektörünün olusturulmasüle ilgilidir. Büyüme eksikliginin bu tarz vektörleri ve bölgeleri, Tablo 3'te listelenmektedir: Tablo 3. Vektör yapEEle in vitro karakterizasyon Vektör adlII Büyüme Eksikligi (Tekli Tropizm Eksikligi) RhCMVAEpiCMAX/SIV(gag) ve (retanef) Epitelyum RhCMVAC/SIV(gag) ve (retanef) CNS RhCMVAH/SIV(gag) ve (retanef) Hematopoietik (Çoklu Tropizm Eksikligi) RhCMVAEpiCMAXAC/SIV(gag) ve (retanef): Epitelyum/CNS RhCMVACAH/SIV (gag) ve (reta nef) CNS/Hematopoietik RhCMVAEpiCMAXAH/SIV (gag) ve (retanef): Epitelyum/hematopoietik RhCMVAEpiCMAXACAH/SIV(gag) ve (retanef): Epitelyum/Hematopoietik/CNS Her bir çoklu tropizmi eksik RhCMV/SIV vektörleri, yukarlElh açlKlandlgllgibi nöronal, epitelyal, endotelyal ve makrofaj kültürlerine klýlaslamada RF'de büyüme için in vitro olarak test edilmektedir.
Bulusun diger yapllândlîilnalarüsokak türü RhCMV/SIV vektörlerininki ile tropizmi modifiye edilmis RhCMV/SIV vektörlerinin in vivo replikasyon dinamikleri, Erarü saIgEJÇI immunojenesitesi ve patojenisitesinin klýlaslanmasülgilidir.
Konjenital enfeksiyon sßslükia, CNS, bebekte duyma kaybEIle sonuçlanan bir ana hedef dokusudur. Immünsüprese yetiskinde, epitelyal ve endotelyal hücrelerin dogrudan enfeksiyonu, sßslîla GI, akciger ve retinal hastalllZIa sonuçlanmaktadE Tüm vakalarda, miyeloid hücrelerinin konak sayesinde virüsün yayllfnasEiçin önemli olduguna inanllhîaktadlE (Sopper, S., Nierwetberg, D., Halbach, A., Sauer, U., Scheller, C., StahI-Hennig, C., Matz- Rensing, K., Schafer, F., Schneider, T., ter Meulen, V., ve meslektaslarElZOO3. Impact of simian immunodeficiency virus (SIV) infection on Iymphocyte numbers and T-cell turnover in türlerinde/dokularIa kopyalanabilme kabiliyetlerinde eksik olan vektörlerin kullannÇltüm immüno yetmez olan hedef popülasyonlarda (cenin ve yetiskin) virüsle iliskili hastallgllEl çok saylîlh formuna yol açmak için CMV potansiyelini etkileyebilmektedir. Oral mukoza, gögüs ve böbregin epitelyal hücreleri de ana virüs bulasma bölgeleridir. Epitelyal tropizmi eksik vektörlerden ek olarak salyaya ve ürine ve anne sütüne virüsün bulasmasIDetkiledigine inaniIBiaktadlEl Azalan bulaslîlüKl asüânmamlgl temaslara ilk asllârdan vektörlerin çevresel yayllBiasII önlenmesi için önemlidir. Bulusun yapilândlîmalarüverimli çalismalar için seçilen bir opitmal modifiye edilmis vektörün tanIilanmasljle ilgilidir. Seçilen vektör, hastallEl ve bulasma (asagi açllZlandlglEl gibi) süsia CMV ile hedeflenen dokularda azalan replikasyonu sergileyerek sokak türü RhCMV vektörleri ile klýbslanabilir kodlanmlgl SIV transgenine karsElTEM-tarafllîlimmün yan-Elindüklyebilme ve sürdürebilme kabiliyetinin esasIa seçilmektedir.
Tropizmi modifiye edilmis vektörlerin (Tablo 3'de Iistelendigi gibi) yaplîüie analizi için iki asamalßtrateji. Tekli tropizmi modifiye edilmis vektörler: Bulusun yapllândlünalarüepitelyal hücrelerde [RhCMVAEpiCMAX/SIV(gag) ve (retanef)], CNS [RhCMVAC/SIV(gag) ve (re- tanef)] veya miyeloid (hematopoietik) hücrelerde RhCMVAH/SIV(gag) ve (retanef)] replikasyon için bireysel olarak eksik olarak olusturulan vektörlerle ilgilidir. In vitro karakterizasyondan (bkz. SA1) sonra, istenilen modifiye edilmis tropizm fenotipini sergileyen vektörler, yetiskin/çocuk RM'Ierde immunojenesite için ve ölümcül modelde patojenisite/tropizm için degerlendirilmektedir. Beklenmeyen in vitro büyüme eksikliklerini gösteren herhangi bir tekli tropizmi modifiye edilmis vektör çlElarllBiaktadlEl ve karakterize edilmemektedir. Benzer bir sekilde, yetiskin RM'Ierde (örn bir SIV-spesifik T hücresi yan-El indükleyebilme yetersizligi) immunojenesite eksikligi veya istenmeyen in vivo tropizm (ölümcül modelde analize dayalßlarak) vektör reddi ile sonuçlanacaktlü Çoklu tropizmi modifiye edilmis vektörler: Bulusun diger yapllând lElnaIarDarzu edilen in vitro veya in vivo modifiye edilmis tropizmi sergileyen tekli tropizm vektörlerine dayalßlarak çoklu tropizm modifiye edilmis vektörlerin yaplgElle ilgilidir. Yetiskin RM'Ierde immünojenik olan tekli tropizmi modifiye edilmis vektörlerin belirlenmesinden ve ölümcül modelde arzu edilen in vivo doku tropizminin sergilenmesinden sonra, arzu edilen çok dokulu in vitro tropizmi sergileyen bu genetik geçmislerde olusturulan çoklu tropizm vektörleri, tekli tropizm vektörlerine klýlaslanabilir bir modelde in vivo analiz edilecektir. Çoklu tropizm vektörlerin bu grubu, asagidaki çoklu dokularda replikasyon için eksik olan dört yapEEliçermektedir: epitelyal ve miyeloid hücreler [RhCMVAEpiCMAXAH/SIV(gag) ve (retanef)], epitelyal hücreler ve CNS [RhCMVAEpiCMAXAC/SIV(gag) ve (retanef)], miyeloid hücreler ve CNS MAXAHAC/SIV(gag) ve (retanef)] (Tablo 3).
Bulusun yönleri, RhCMV/SIV vektör immunojenesitesinin degerlendirmesi ile ilgilidir. Ilk immünolojik analiz, 3RM/vektörün gruplarIa uygulanmaktadlîl(SEK. 26). Her bir grup, tek bir aslöh bir karisim olarak her bir vektörün gag ve retanef versiyonlarllllmaktadß Sokak türü RhCMV/SIV vektörleri ile sero+ RM'Ierin asllânmasü öncesinde açilZland[glDüzere enfeksiyondan 3 hafta sonra hayvanlari %100'Ünde SIV transgenine karsljbir tespit edilebilir T hücresi yan-I indüksiyonu ile sonuçlanmaktadß 15. haftada artlSIsüresi ile SIVgag veya retanefe karsEtespit edilebilir bir T hücresi yan-Endükleyemeyen herhangi bir vektör çifti (bireysel olarak gag ve retanefi kodlayan), immunojenesite temelinde “basarlgîl' oldugu ve karakterize edilmesi gerekmedigi görülecektir. Immünojenik vektörler için, tüm 3 RM, getirildigi sekilde sadece gag eksprese edici vektörle 15. haftada arttIElllIhaktadlEl Aynü zamanda, kohorta 3 tane daha RM allErnaktadlB ve tam immünolojik karakterizasyonuna yönelik yeterli istatistiksel gücü tedarik etmek için ilk 3 hayvanla benzer bir modelde tedavi edilmektedir. Tüm RM'Ier, ilk asilâmadan sonra toplamda 45 haftaligil immnolojik olarak ve virolojik olarak takip edilmektedir (SEK. 2 ve asaglýla bakla.
Tüm RM'Iere, SIV-spesifik T hücresi yanlfliarII sistemik kantifikasyonu için 48. haftada nekropsi yapilîhaktadB Toplamda 24 RM, (sokak türü RhCMV/gag x 2 ve RhCMV/retanef x 1 verildiginde 6 RM'nin bir kontrol kohortuna ek olarak) tropizmi modifiye edilmis vektörlerin immunojenesite testi için mevcuttur. Bu RM saylgîyeterli olan' ve tam degerlendirmeye ihtiyaç duyan tropizmi modifiye edilmis vektörlerin nihai say_ dayaIElolarak çesitli potansiyel farklün i/i'i/o test senaryolar. dönüsmektedir. Örnegin 5 vektör, ilk olarak 3RM'de test edilebilmektedir, 3'ü, bir ek 3RM'de (her bir 3 vektör için 6 RM'nin bir tam komplemanIlIl vermek için) tam immünolojik test için seçilmektedir. Alternatif olarak 6 vektör, ilk olarak her 3RM'de test edilebilmektedir, 6'5Ian 2'si, bir ek RM'de (immunojenesite ve/veya zay[fllatma aç-an en umut vaat edici oIandIE) ek 3RM'de (her bir 2 vektör için 6 RM'nin tam komplemanlßlusturmak için) tam immünolojik test için seçilmektedir.
SIV proteinlerine (gag ve rev/nef/tat), negatif kontrol proteinlerine (TB Ag8SB protein) ve RhCMV IE (+ kontrol) CD4+ ve CD8+ T hücresi yaniHhrÇlöncesinde Hansen, S.G., Vieville, C, Whizin, N., Coyne-Johnson, L, Siess, D.C., Drummond, D.D., Legasse, A.W., Axthelm, M.K., Oswald, K., Trubey, CM., ve meslektaslarlZlZ009. Effector memory T cell responses are associated with protection of rhesus monkeys from mucosal simian immunodeficiency virus challenge. Nat Med 15:293-299 referansia açllZlandiglEgibi bu proteinlerini içeren kesisen, ardElKl 15-mer peptit karlgfnllarllîkullanarak sitokin aklgsitometrisi (CFC) ile ölçülmektedir.
Bu deney, hayvan protokolü bas. (SEK. 26) PBMC, lenf bezi (LN) ve bronkoalveoler lavaj zenginlestirildigi bir kola erisilebilir efektör bölgesi] ve nekropside en az 6 farkllleriferik LN gruplarIan, 3 farkIEl mezenterik LN gruplarü BAL, kemik iligi, dalak, karaciger jejunaI/ileum/kolon mukozasügenîtal mukoza ve bademcik/adenoidlerden elde edilen hücre preparasyonlarlîliçin geçerlidir. Rutin ölçüm, CD69'un yukarlîlregülasyonu ve yanlBal hücrelerin, TNF, y-IFN ve IL-2'nin (tek bas. veya herhangi bir kombinasyon halinde) hücre içi ekspresyonu ile çizildigi ve CDZ8 vs. CCR7'nin ekspresyonu ile diferansiyasyon durumlar. es zamanIElolarak sI-[ElbndlglElboyama kombinasyonunu #1 (Tablo 4) kullanmaktadlEl (Picker, L.J., Reed-Inderbitzin, E.F., Hagen, S.I., Edgar, J.B., Hansen, S.G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Jr., Lifson, J.D., Maino, V.C., ve meslektaslarEIOOö. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest tespit etmesi tasarlanmaktadlEve arttlElna sonrasia in vii/o Ag maruziyetine olusturulan SIV-spesifik T hücresi popülasyonlarII yan-Ükusursuz bir sekilde takip etmesi için kullanllIl'iaktadIB Boyama kombinasyonu #3, haflîla alt kümelerinin baglamIa MIP-lß ve sitotoksik degranülasyonunu (CD107 haricilestirme) analiz etmektedir ve nekropsiden önce her bir yanlEliçin en az bir defa PBMC'de islevsel yanlîl analizi genisletmesi için seçici bir sekilde kullanllhiaktadlü Bulusun yapllând Enalarüuygulanan CFC deneyleri ile ilgilidir ve ek olarak, PBMC'de ve Ag ile uyarllBilgl mikro dizi analizi ile seçilen dokularda nekropside transkripsiyonel olarak analiz edilebilen gag- ve rev/nef/tat-spesifik T hücresi yanlfllarElle ilgilidir. Bu yaklaslda, spesifik Ag'ye karsElkontroI uyarIiElile Iliskili transkripsiyonel degisimleri, Ag'ye yanlEl veren T hücrelerinin islevsel programlarII bir kapsamllîlegerlendirmesini saglamak için uyarIidan 3 ve 12 saat sonrasIda klýbslanmaktadlEl Tablo 4: RhCMV/51V vektörü immünojenesitesinin takip edilmesine yönelik standart CFC analizi Ag-spesifik YanEElDeneyleri: Rutin Boyama Paneli PB AC FI'I'C PE ECD TrR PC APC A70 AC7 Yorumlar 4 5 y haflîhsEl DR 4 F y 4 * * 5 degranülasyon;merkez/efekt. haf.
Notlar: PB = Pasifik Mavisi; ACy = AmCam göbegi: F = fluoresin; PE = fikoeritrin: ECD :PE-Teksas KünlîlîlîlTR içi Ag'ler koyu renklidir; uyarIi kültüründe CD49 mAb ile birlikte es uyarIi olarak saglanan CD28 konjügat; inkubasyon sÜsIa hücrelerle dahil edilen CDlO7 konjügatlarlZI Immunojenesiteye göre her bir modifiye edilmis vektörün basarlîübirincil olarak asüisamasü (zirve ve plato) slßsia PBMC, LN ve BAL'de toplam SIV-spesifik CD4+ ve CD8* T hücrelerinin büyüklügü ve nekropside Ienfoid dokularda ve efektör bölgelerinde SIV-spesifik CD4+ ve CD8* T hücre popülasyonlarI genel boyutu ile degerlendirilmektedir. Nekropside genel sistemik yanii] büyüklügü, nekropside her bir okulda SIV-spesifik T hücrelerinin ortalama frekansII belirlenmesi ve tüm örneklendirilen Iokasyonlarda SIV-spesifik T hücrelerinin toplam sayllârIlZlhesaplamak için önceki sistemik T hücresi sayIi verisini kullanarak degerlendirilmektedir (Halbach, A., Nierwetberg, D., Muller, J.G., Sauer, U., Kerkau, T., Stolte, N., Hofmann, P., Czub, S., ter Meulen, V., and Sopper, S. 2000. Total numbers of Iymphocyte subsets in different lymph node regions of uninfected and SIV- infected macaques. J Med Primatol 29:148-157; Sopper, S., Nierwetberg, D., Halbach, A., Sauer, U., Scheller, C., Stahl-Hennig, C., Matz-Rensing, K., Schafer, F., Schneider, T., ter Meulen, V., ve meslektaslarEZOOB. Impact of simian immunodeficiency virus (SIV) infection on Iymphocyte numbers and T-ceII turnover in different organs of rhesus monkeys. Blood edilmektedir. RhCMV/SIV vektörü ortaya konulmus CD8+ T hücresi yan[EIlarl:lverimli|ikle en yakLEizlan iliskilidir ve tercih, bu popülasyonlar, SIV hedef hücresi zengin efektör bölgelerinde lokalize edildiginde bu soyda en genis yanlElhrEbrtaya koyan vektörlere verilecektir. Ikinci kriterler, öncelige sahip olan TEM fenotipik, islevsel ve transkripsiyonel katkllâra göre sokak türü RhCMV/SIV vektörü ortaya konulan yanlflbrlîén yakI olarak özetleyen modifiye edilmis RhCMV/SIV vektörü ortaya konulan T hücresi yanEIbrlEa kronik fazda hazlEl kosulda SIV- spesifik T hücresi yanlflbrII islevsel, fenotipik ve transkripsiyonel özellikleridir.
RhCMV/51V vektörü bulaslElDKJ degerlendirmesi: Salya ve ürine bulasan vektörlerin virolojik kantifikasyonu, vektörlerin, bu bölgelerden azalan bulasmayüsergileyip sergilemedigini belirlemektedir. Salyada ve ürinde ve aynüamanda kanda RhCMV vektörlerinin titreleri, gag veya retanef kasete özgü primerleri kullanarak kantitatif RT-PCR ile belirlenmektedir. RhCMV transgeninden baglslîl olarak) ölçülmesi için kullanllü'iaktadlü Gag veya retanefe karsIZI western analizinin takip ettigi izin verilebilir RF'Ierle salyanI veya ürininin es kültürü, ek maksimum olarak duyarlEblarak kullanilBiaktadlB fakat vektör tespitinin kantitatif ölçümü olarak kullanilüiaktadß Bulusun diger yapllândlîilnalarÇl RhCMV/SIV ölümcül patojenisitesinin/doku tropizmin degerlendirilmesi ile ilgilidir: Vektörler aynElzamanda ölümcül modelde patojenisitesi/doku tropizmi için degerlendirilmektedir. In V/VO hücresel tropizm ve aynlîtamanda patojenisite seviyesi, bu modelde analiz sßsia ölçülen kritik parametrelerdir. Genlerin, yetiskinlerle klýhslanan ceninden diferansiyel olarak düzenlendigi bilinmektedir (Merkerova, M., Vasikova, A., Belickova, M., ancl Bruchova, H. MicroRNA expression profiles in umbilical cord blood cell lineages. Stem Cells Dev 19:17-26). Ceninler, öncesinde açllZlandlglülizere her bir RhCMV/SIV vektörü ile asllânmaktadlü Rh-CMV sekeli için formalin/sabit/parafin/gömüIü/H&E-boyalIIclloku kesitleri, standart metodolojiler kullanilârak degerlendirilmektedir. Doku kesitleri, bir kör modelde incelenmekte ve hafiften siddetliye normal bir ölçekte skorlanmaktadE Vektörlerin patojenik potansiyeli, ultrason ve morfometrikler kullanllârak degerlendirilmektedir (Chang, W.L., Tarantal, A.F., Zhou, S.S., Borowsky, A.D., and Barry, P.A. 2002. A recombinant rhesus cytomegalovirus expressing enhanced green fluorescent protein retains the wild-type Kantitatif RT-PCR le farklEldokularda vektör dagHIlîliII ve hücresel isaretleyicilere karslZl yönlendirilen antikorlar kullanilârak immünohistokimyanl analizi, tropizm fenotiplerinin in vivo Efarcüblup olmadlglII saptanmasi olanak saglamaktadlü Bu çallglnalarda kullanllân antikorlar, SIV ve RhCMV antijenlerine karsEl/e RM hücresel isaretleyicileri beta-III tübülin veya nöronal isaretleyici nöronal çekirdekler (olgunlasmamlgve olgun nöronlar), glial fibriler asit proteini (astrositler), vimentin (fibroblast), vWF veya CD31 (endotel hücreleri), sitokeratin veya zonula okludens-l (epitel hücreleri) düz kas aktini (düz kas hücreleri), CD68 (makrofaj), CD3 (T hücreleri) ve CD20'ye (B hücreleri) karslîyönlendirilmektedir. RhCMV IE1 için immünohistokimyasal boyama, yayIanan protokollere göre uygulanmaktadlEl(Abel, K., Strelow, L., Yue, Y., Eberhardt, M.K., Schmidt, K.A., and Barry, P.A. 2008. A heterologous DNA prime/protein boost immunization strategy for rhesus cytomegalovirus. Vaccine 9583; Bissel, S.J., Wang, G., Ghosh, M., Reinhart, T.A., Capuano, S., 3rd, Stefano Cole, K., Murphey-Corb, M., Piatak Jr, M., Jr., Lifson, J.D., and Wiley, C.A. 2002. Macrophages Relate Presynaptic and Postsynaptic Damage in Simian Immunodeficiency Virus Encephalitis. Am J Pathol 160:927-941; Sequar, G., Britt, W.J., Lakeman, F.D., Lockridge, K.M., Tarara, R.P., Canfield, D.R., Zhou, S.S., Gardner, M.B., and Barry, P.A. 2002. Experimental coinfection of rhesus macaques with rhesus cytomegalovirus ancl simian immunodeficiency virus: Doku kesitleri, hiç yoktan minimum (izole bireysel hücreler) ila siddetli (boyamanI kapsamlEl fokal alanlarügl bir esnek ölçekte IE1 boyamaslîiçin skorlanmaktadlE Boyama protokolleri, Batchelder, C.A., Lee, C.C., Matsell, D.G., Yoder, M.C., and Tarantal, A.F. 2009. Renal ontogeny in the rhesus monkey (Macaca mulatta) and directed differentiation of human embryonic stem cells towards kidney precursors. Differentiation 78:45-56; Abenes, G., Lee, M., Haghjoo, E., Tong, T., Zhan, X., and Liu, F. 2001. Murine cytomegalovirus open reading Carlson, J.R., Chang, W.L., Zhou, S.S., Tarantal, A.F., and Barry, PA. 2005. Rhesus brain microvascular endothelial cells are permissive for rhesus cytomegalovirus infection. J Gen Virol 86:545-549;. Mazumdar, K., Alvarez, X., Borda, J.T., Dufour, J., Martin, E., Bethune, M.T., Khosla, C., and Sestak, K. Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from alpha-2 gliadin in gluten-sensitive macaques. PLOS One 5:e10228;.
Orzechowska, B.U., Mano-haran, M., Sprague, J., Estep, R.D., Axthelm, M.K., and Wong, S.W. 2009. Viral interleukIn-6 encoded by rhesus macaque rhadinovirus is associated with lymphoproliferative disorder (LPD). J Med Primatol 38 Suppl 1:2-7) referanslarIa açIandlgJElgibi yayIanmlgl ve yayIanmamlSl protokollere göre tamamlanmaktadlEl Tüm antikorlar, insan antijenlere yönlendirilmektedir, fakat RM ortologu ile çapraz reaktiviteyi kanEIhmlStB Bulusun yapUândlElnalarüSIV BaglglKHgllEa karsD/erimlilik degerlendirmesi ile ilgilidir. Tüm immünolojik, virolojik ve ölümcül patojenik/tropizm özelliklerine dayalüblarak, en umut vaat edici vektörlerin, bir düsük doz intra-rektal SIVmac239 baglglEllEl modelinde verimlilik çallgnalaria kullanIi Için seçilmektedir. Bu verimlilik çallgrnalarüçin, bir seçilen vektör tasarlüiçin kalan SIV yapllârlîl(örn. eksprese edici çevre, pol I ve II), verimlilik degerlendirmesi için bir tam vektör kümesine sahip olmak için olusturulmaktadE Verimlilik çallgmalarütla ve yetiskin immünosüpresyon modelinde degerlendirmeye yönelik vektör seçim kriterleri, efektör mukozal doku bölgelerinde SIV-spesifik CD8+ TEM hücrelerine ve aynEl zamanda sistemik immunojenesite, ölümcül patojenisite/doku tropizm proûli ve bulasma seviyelerine dayalIEl Immünolojik olarak, bir optimal vektör, SIV eklerine karsElefektör dokularIa TEM taraflEýanEllarI klýaslanabilir veya daha yüksek seviyelerini indüklemekte ve sürdürmektedir. Virolojik olarak, optimal vektör, ölümcül patojenisite modelinde minimum bir patojenisite seviyesine sahiptir ve salyaya ve ürine bulasmanIIazalmas@östermektedin Bulusun yapllândlElnalarDYetiskin Immünosüpresyon Modelinde patojenisite testi ile ilgilidir: Verimlilik çallglnalarlîiçin seçilen vektörlerin gag eksprese edici versiyonlarÇlyetiskin immün süpresyon modelinde patojenisite için analiz edilmektedir. Bu model, IV yolu vaslßsûla birincil RhCMV enfeksiyonuna tabi olan yetiskin sero-negatif hayvanlar. iatrojenik immün süpresyonunu kullanmaktadlEI Önemli bir sekilde, bu model, birincil öngörülen hedef popülasyonunda (örn. genç insan yetiskinler) RhCMV vektörlerinin tam patojenik potansiyelinin karakterizasyonunu mümkün olmaktadlîl Tüm RM, ölümcül model için yukari açllZIandgEl üzere vektör patolojisinin ve doku tropizminin degerlendirmesine yönelik nekropsiye gitmektedir. Bu veriler, vektör güvenliginin degerlendirmesini uzatmaktadlEl ve insan dönüsümü için CMV vektör tasarllarII seçimine yönelik ek kriterleri saglamaktadE Bulusun yapllândlElnalarÇltropizmi modifiye edilmis RhCMV/SIV vektörlerine tekabül eden HCMV/HIV vektörlerinin olusumu ve karakterizasyonu ile ilgilidir. HCMV/HIV vektörleri, yukari açlKIanan RM'de SIV immunojenesite kayblîcblmadan en büyük zaymhmayügösteren RhCMV/SIV tropizmi eksik vektörlere dayalEloIarak olusturulmaktadü Seçilen RhCMV vektörleri, i'n i//trdda klýlaslanabilir bir fenotip sergiledigi için aynEgenetik modifikasyonlarlîl içeren HCMV versiyonlarEblusturulmaktadIE Bulusun bu yönü, klinik çallginalarda kullanIi için uygun olan bir HCMV/HIV as-I yap-dan baska HCMV/HIV vektörü yapEliilIe ilgilidir. Çogu RhCMV genleri islevsel olarak esdeger olmas. ragmen, HCMV, RhCMV'den farklEl oldugu görünen bazßpitelyal tropizm genlerine sahiptir (Dunn, W., Chou, C., Li, H., Hai, R., Patterson, D., Stole, V., Zhu, H., and Liu, F. 2003. Functional profiling of a human HCMV'de (slßsüla UL homologlara sahip olmalela ragmen, sadece UL128-131A HCMV'de bir epitelyal hücre tropizm geni olarak belirlenmistir.
HCMV'den UL128-131A lokusu, bu genlerin silinmesinin aynüamanda endotelyal hücrelerin ve makrofajlarI enfeksiyonunu ortadan kald lîiinaslütlan dolayIZI silinmemektedir. Fakat HCMV'nin hedeflenen mutagenezi, UL64 ve USZ9'un mutasyonunun, öncesinde açlElandlglEl gibi endotelyal veya insan fibroblast (HF) hücreler olmayacak sekilde HCMV'nin büyümesini önemli ölçüde azalttlgiIEIortaya çEEarmlgtlEl Bu sebepten ötürü, epitelyal tropizmi eksik virüsün olusumunda bu genler, bir epitelyal hücre tropizmi eksik HCMV as-I olusumunda silinme için hedefe idealdir. CNS ve makrofaj tropizmi eksik RhCMV'nin HCMV'ye dönüsüm, miRNA hedeflemesi için seçilen genlerin her iki virüste temel genler olmasIan dolayülaha çok ileri dogrudur. HCMV tropizmi eksik vektörler, tropizmin kusurlu olmasIEtemin etmek için in Vitrdda epitelyal, nöronal, endotelyal ve makrofaj kültürlerinde kopyalanabilme kabiliyetleri için test edilmektedir. Bu çallglnalar, klinik çallginalar için kullanllâcak olan nihai HCMV/HIV vektörüne yönelik yapEtasarIilElElsaglamaktadlB HCMV/HIV tropizmi eksik aslZl/ektörleri, optimal zay[f[lama ve immunojenesite özelliklerine dayalEblarak tasarlanmaktadlîl Degistirilmis tropizm özelliklerinin kombinasyonlari sahip olan 3-4 HCMV/HIV asülektörleri üretilebilmektedir. HCMV/HIV asllârÇlgenetik omurga olarak HCMV susu TR kullanllârak olusturulmaktadlEl(Murphy, E., Yu, D., Grimwood, J., Schmutz, J., Dickson, M., Jarvis, M.A., Hahn, G., Nelson, J.A., Myers, R.M., and Shenk, T.E. 2003. Coding potential of laboratory and clinical strains of human cytomegalovirus. Proc Natl Acad Sci U S bulaslEEBAC olarak klonlanan bir klinik izolattE Epitelyal tropizmi eksik virüsler için, bu hücre türlerinde büyüme için gerekli oldugu bilinen HCMV genleri, ilk olarak UL64 ve USZ9 (yukarElbakIlZ) dahil olmak üzere hedeflenmektedir.
UL64 ve USZQ'un tekli ve çift silinme mutantÇlBAC teknolojisi kullanllârak olusturulmaktadß Tekli veya çift UL64/USZ9 HCMV mutantlarlEllEl, endotelyal veya HF hücreleri olmadan epitelyal hücrelerde (insan retinal epitalyal hücreler ve Caco 2 hücreleri) kEIfllElbüyüme sergileyip sergilemedigi belirlenmektedir. CNS ve makrofajlarda temel genlerin inaktivasyonuna yönelik miRNA nakavt stratejisi, RhCMV ile yukar- açllZlanan yaklasIi kullanllârak olusturulmaktadlEl Tropizmi eksik fenotiplerin bir kombinasyonu, RhCMV/SIV çoklu tropizmi modifiye edilmis vektörlerle bir veya iki vektöre dahil edilmektedir. HCMV/HIV vektörlerinin, RhCMV/SIV çalânalarlüldan öngörülen eksiklikleri sergileyip sergilemedigini belirlemek için, HF, epitelyal ve endotelyal hücreler, birincil nöronal kültürler ve makrofajlar dahil olmak üzere çesitli farklEl türde hücrelerde bu virüslerin büyüme özellikleri belirlenmektedir. HCMV replikasyonunu sürdürebilen periferik kan mononükleer hücrelerinden (57) üretilen çoklu mikro ve makro vasküler endotel hücreler, epitel hücreleri (retinal epitel hücreleri, Caco 2 hücreleri), nöronal hücreler (SY5Y ve SKMN hücreleri) ve birincil makrofajlarEiçeren hücre türleri, Basvuru sahibilar tarafIan temin edilebilmektedir. Tek ve çok adIilljaüyüme egrileri, sokak türü virüse klýlasla HCMV/HIV tropizmi eksik vektörlerin replikasyon verimliligini klýlaslamak için bu hücrelerle uygulanmaktadlîi Bir yeni, tersine çevrilmeyen, tek dozlu oral polio as-I gelisimi OPV'yi degistirmektedir. Bu örnek, tüm 3 poliovirüs serotiplerine karsleoruyucu immüniteye indükleyecek olan fakat poliovirüsün bir patojenik formuna `geri dönebilme' kabiliyetine sahip olmayan yüksek oranda immünojenik sitomegalovirüs (CMV)-bazlüsl1latformun kullanIiIBçlKlamaktadlB Geçmis.' `Öldürülmüs', etkisiz halde polio aslgîüPV) veya `canllîlzay[tlbtllîhlgl oral polio aslglj (OPV) ile asllâma, polio ile iliskili zayif] paralitik felç vakasIa bir dramatik azalma ile sonuçlanmlStlE Bir dizi özellikten (örnegin düsük maliyetli üretim, oral uygulama ve mukozal immünitenin indüksiyonu) dolayDOPV, için IPV üzerinden seçilmistir. GPEI programli baslatlifhasIan dolayÇl OPV asEIZI4 iliskili felçte bir dramatik azalma ile sonuçlanmlStlE PlanIElasEdurdurulmasII takip ettigi yakI sokak türü poliovirüsün global eradikasyonu ile, OPV'nin, poliovirüsün paralitik formlar. `dönüsümü', son kalan engel haline gelmektedir. OPV dönüsümü, virüsün bir paralitik formuna kalan dolasan `canllZZlOPV'nin genetik mutasyonundan sonuçlanmaktadlElve bir oyun sonu' stratejisine olan ihtiyacI tek sebebidir.
OPV geri dönüsünün hastal[g]I klEllBîas- neden olma kapasitesi, gelismekte olan ülkelerde zay[Elasl:kapsama alanIda zaten var olan bir "gerçek dünya" sorunu haline gelmektedir. gelmeyen kadar sürdürülen IPV aslgjle OPV geri dönüsü le mücadele edilmesi için bir muhtemel bitirme stratejisi olarak önerilmistir. Bu strateji potansiyel olarak etkili olabilmesine ragmen, IPV as-I maliyeti (yüksek üretim maliyetine sahiptir ve uygulama için bir igne ve egitimli saglllîl çalISlanIElgerektirmektedir), bu yaklasIiElyoksul ülkelerde kullan! için yasaklaylEElbir sekilde pahalEbir hale getirmektedir. Bulusun yapllândlünalarütüm pozitif OPV katkilârlüia sahip olan bir CMV-bazlEboIio kullanan, fakat poliovirüs genetik geçmisine dayaIEl olmadlglEiçin geri dönüsüm olasElglIIarlElnayan bir alternatif bitirme stratejisi ile ilgilidir.
OPV, zengin ve yoksul tüm ülkelerde kullanIi için uygunlugundan dolayllüresel poliovirüs eradikasyonu için seçilmistir. CMV, potansiyel olarak OPV'yi küresel polioviruslarI yok edilmesi Için asEI seçimi yapan tüm özelliklerini paylasmaktadü fakat OPV geri dönüsememektedir: 1) t[lîbi olarak egitimli olmayan bireylerle oral uygulama kapasitesi, 2) maliyetli kimyasal inaktivasyon adIiIIarlZlve IPV ile iliskili kalite kontrolü bar-ünayan, pahalElolmayan üretim süreci ve 4) bagBakta poliovirüs replikasyonunu bloke edebilen mukozal Immüniteyi (hücresel ve antikor) indükleyen yüksek immunojenesite. CMV, bir polio aslîlîlolarak kullanIi için ek faydalIZIniteliklere sahiptir. CMV, CMV serpozitivitesine bakmaks- sagllEl Dbireyleri yeniden enfekte edebilmektedir. Önceden var olan aslZl/ektör immünitesine bakllîhadan yeniden enfekte edebilme kabiliyeti, vektöre karsElmmünitenin veya çevrede mevcut patojenlerle çapraz reaktivitenin (örn. OPV için enterovirüsler) aslîlaIIiIlîlsiddetli ölçüde kEIElhdlglÇlOPV dahil olmak üzere diger asllâr üzerinde belirli bir avantajdE CMV aynüzamanda sagllKlElbireylerde iyi huyludur ve immunojenesite, CMV replikasyonunu gerektirmemektedir. Fakat CMV, nakil hastalarüve neonatlar gibi immünosüprese bireylerde hastallgb yol açmaktadlE Bu immüno süprese popülasyonlarda, CMV replikasyonu, patjenesite için bir mutlak gereksinimdir: herhangi bir replikasyon herhangi bir hastalfgll esdegeri degildir. CMV replikasyonundan CMV immünitesinin ayrlgtnasü bir replikasyonu eksik CMV-bazlEpolio asIlEl, immün durumunu bakmaks- tüm insan popülasyonlarlEUa Immünojenik ve güvenli olacagIEgösterdigi için önemli bir bulgudur. Son olarak, CMV asllârßallgmaktadlîl Makaklar (RM'Ier) üzerinde yapllân son çallgmalar, simian immüno yetmezlik (SIV) antijenlerini eksprese eden makak CMV'si (RhCMV), SIV enfeksiyonuna karsEkorumayEihdüklemektedir. Bu, enfeksiyona karsEkorumayEl indükledigi gösterilen SIV veya HIV'ye karsEIlk asIlEI Dahasi: SIV'ye karsEkoruma uzun ömürlü olmustur (asln sonra>486 günde gözlemlenmektedir).
Bulusun yapilândlElnalarÇlfarelerde poliovirüse karslIkoruyucu immüniteyi indüklemek için poliovirüs tip 1'den bir koruyucu hedef antijenini eksprese eden bir MCMV-bazllîilmlio as-I kabiliyetinin degerlendirilmesi ile ilgilidir. Poliovirüs tip 1'den (MCMV/VPlPV1) tam uzunlukta viral proteini 1'i (VP1) stabil bir sekilde eksprese eden bir rekombinant MCMV olusturulmaktadlEl(Sekil 27). MCMV/VP1PV1'in immünolojik karakterizasyonundan sonra, fare poliovirüs reseptörü (PVR) transjenik (Tg) fare baggllîlllîl modelinde polio-virüs tip 1'e karsEl koruyucu MCMV/VPlPVl verimliligi belirlenecektir. Bir MCMV-bazllîibolio aslîsladece insanlarda kullan! için bir insan CMV'ye dayalEboliovirüs gelisimi için bir `kavram kanllîhma' olarak kullanilîhaktadlB Sekil 27, MCMV/VPlpvi'de VPl'in, tespit kolayl[g]l:bç-an epitop isaretli (V5) oldugunu göstermektedir. MCMV/Vplpv1, mürin embriyo fibroblastlarIa (MEF'Ier) çokça defa seri olarak geçirilmistir. Hücreler, anti-V5 reaktivitesinin esasIa VP1 ekspresyonunun analizi için maksimum sitopatik etki (CPE) süresinde çlElarHB1aktadlEl Seri geçis sayHârÇljel görüntüsünün üzerinde gösterilmektedir.
Bulusun diger yapllândlîilnalarüMCMV/VP1PV1'in bir yayma kusurlu versiyonunun, PVR Tg modelinde poliovirüs tip 1'e karsEl koruyucu immüniteyi indükleyebilme kabiliyetinin degerlendirilmesi ile ilgilidir. MCMV/VP1PV1'in bir yayilüia kusurlu versiyonu (örnegin MCMVAgL/VPlPVl), standart bakteriyel yapay koromozom (BAC) rekombinasyonu ile bir temel MCMV geninin (glikoprotein L, gL) silinmesi ile olusturulacaktlB Bir gL eksprese edici hücre hattIa tamamlama tarafIian takip edilen bu stratejinin, yayllîha kusurlu CMV virüslerin olusturulmasi yönelik bir düz teknik oldugu gösterilmistir (Snyder, C. M., J. E.
Allan, E. L. Bonnett, C. M. Doom, and A. B. Hill. 2010. Cross-presentation of a spread- defective MCMV is sufficient to prime the majority of virus-specific CD8+ T cells. PLoS One Rhesus and human cytomegalovirus glycoprotein L are required for infection and cell-to-cell spread of virus but cannot complement each other. J Virol 85:2089-99). MCMVAgL/VPlPVl'in poliovirüs tip 1 baglglEllgJIEb karsEIimmunojenesitesi ve koruyucu verimliligi, yukarüh aç[EIand [gilîliibi belirlenmektedir.
CMV vektörleri, CMV/VP1PV1 vektörlerinin, önemli ve yüksek derecede dayanlElÜ/Pl-spesifik CD4 ve CD8 T hücre yanlÜhrIEindükleyecegini gösteren çesitli farklEhedef antijenlerini eksprese edebilmektedir. IPV olmayacak sekilde OPV'nin, baglEsakta poliovirüs enfeksiyonunun olusumunu önleyebilme kabiliyeti, poliovirüs kontrolünün hücresel immünitesinin önemine vurgu yapmaktadE CMV/VP1PV1 vektörleri, VP1-spesifik antikorlarI dayanllZlElseviyelerini indükleyebilmektedir ve bu vektörler aynlIlzamanda bu antikorlarI nötrlestirilip nötrlestirilmedigini belirlemek için test edilmektedir. VP1'den protein ve sentetik peptitler, nötrlestirici antikorlarI biyolojik olarak önemli seviyeleri indükleyebilmektedir (bozulmamlgl virüs tarafIan indüklenenden düsük seviyelerde olmas. ragmen).
CMV/VP1PV1 vektörleri ile indüklenen antikor yanlElElnötrlestirici olabilmektedir, fakat muhtemelen OPV veya IPV aslgü ile gözlemlenenlerden daha düsük bir seviyede olabilmektedir. CMV/VP1PV1 vektörlerinden, yüksek T hücresi seviyelerini (sistemik ve aynü zamanda mukozal) ve VP1-spesifik nötrlestirici antikorlarI biyolojik olarak önemli bir seviyesini indüklemesi beklendigi için, CMV/VP1PV1 ve CMVAgL/VPIPVII poliovirüs tip 1 baglgkllgllih karsüloruma saglayabilmektedir.
Bulusun yapllândlüinalarübir güvenli, yayllBia kusurlu CMV-bazlEl/ektörün, poliovirüs tip 1'e karsEkoruyucu immüniteyi indükleyebilmesinin tesis edilmesi ile ilgilidir, çogalan CMV-bazlIZI vektörün (MC-MV/VPlPVl) immünojenik olup olmad[g]lEll]/e poliovirüs tip 1 bagElEllgl- karsEl verimli olup olmadlglllZI yayllB^ianI bir CMV-bazlüpolio asII immunojenesitesi veya verimliligi Için gerekli olmamasIEl tesis etmek için MCMVAgL/VPlPVl kullanarak belirlemektedir. Diger yapHândlîilnalar, bir yayHBwa kusurlu CMV-bazlüvektörün, CMV yayllüiasII asüierimliligi için gerekli olmamasII tesis edildigi sekilde poliovirüs tip 1'e karsEl koruyucu immüniteyi indüklediginin gösterilmesi ile ilgilidir. Bu bulgu, dünya çapütla tüm potansiyel insan hedef popülasyonlarlEUa kullanIi için bir güvenli CMV-bazlEbolio as-I gelisimi için `yolu açmaktadlE Insan olmayan primat poliovirüs modelleri, OPV ve IPV gelisimi SES-a hayati öneme sahip olmustur ve insan çallgmalar- karsECMV bazlEbolio asII hareket ettirilmesi için önemli olacaktir-.l Ek yapllândlîilnalar aynElzamanda RM'de yayllüia kusurlu RhCMVAgL/VPIPVl'in immunojenesitesinin ve koruyucu verimliliginin belirlenmesi ve ver birisinin üç poliovirüs serotipinden birisinden bir VP1 genini eksprese ettigi monovalent RhC-MVAgL/VPl vektörlerinin veya birlikte tüm 3 serotipi eksprese eden bir tekli multivalent RhCMVAgL/VPl'in tüm 3 poliovirüs serotiplerine karsEl korumayEl indükleyebilip indükleyememesinin belirlenmesi ile ilgilidir. Insan Faz I çallgnalarlîlçin en verimli trivalent asII bir insan HCMVAgL/VPl versiyonunun yapEEl aynEl zamanda mevcut bulusta kapsanmaktadE Referans Örnegi 7.' Bir Tekli Ebola Virüsünü Kodlayan Bir Sitomegalovirüs Bazlllslîl Nükleoprotein CT L Epitopu, Ebola Virüsüne KarsEKoruma Sunmaktadlîl Bu Örnek, bir CMV- bazlElaslZlyaklasIiIlEl, bir yüksek virülan insan patojenine karsükorunabilme kabiliyetini göstermektedir.
K& Açlâama: Mevcut Örnekte, Basvuru sahibilar, tek bir CT L epitopunu, Zaire eba/aw'rus ZEBOV'un (MCMV/ZEBOV-NPCTL) NP'sinden eksprese eden bir MCMV-bazlEEBOV vektörünü olusturmustur. MCMV/ZEBOV-NPCTL'nin, yüksek derecede immünojenik, dayanilZlüçok islevli CD8+ CT L yanlflhrlü farelerin çoklu suslarIa ZEBOV NP'ye karslZlindükleyebildigi gösterilmistir. Önemli olarak, MCMV/ZEBOV-NPCTL, bir standart `ölçüt' EBOV aslglîblarak bir klîlaslanabilir seviyeye ölümcül ZEBOV bagEEllgl- karsElkoruma sunmustur. Korunan hayvanlarda nötrlestirici antikorlar yoklugu, korumaylj hücresi aracUJJIJSlarak belirlemistir.
Geçmis.' Ebola virüsünün (EBOV) yol açt[glEhem0rajik hastal[glEl insan salgIarÇl bir ciddi insan sagllgßorunudur. Filoviridae ailesinin bir üyesi olan EBOV, çoklu organ yetmezligi, sok ve ölümle sonuçlanan viral hemorajik atesin hlîla ilerlemesine neden olmaktadlE[Feldmann H, Geisbert TW (2010) Ebola haemorrhagic fever. Lancet]. EBOV, dört ayrEl/e bir besinci varsayilân türe bölünebilmektedir [Feldmann H, Geisbert TW, Jahrling PB, al. e (2004) In: Fauquet C, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA, editors. Virus Taxonomy: VIIIth Report of the International Committe on Taxonomy of Viruses. London: EIsevier/Academic Press. pp. 645-653, Towner JS, Sealy TK, Khristova ML, Albarino CG, Conlan S, ve meslektaslarEI(2008) Newly discovered ebola virus associated with hemorrhagic fever mortalite) olan Zaire ebo/aV/rus (ZEBOV) ile virülans seviyesi aç-an farkl[[[IZ] göstermektedir [Sanchez A, Geisbert TW, Feldmann H (2006) Filoviridae: Marburg and Ebola Viruses. In: Knipe DM, Howley PM, editors. Fields Virology. 5th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. pp. 1409-1448]. Afrika'nI endemik bölgelerinde saIgIIar artan silZllgiü endemik olmayan ülkelere yanllgElZla ve bilinçli olarak girilmesi olaslIiglEile birlikte, EBOV'yi, giderek artan bir küresel sagliKl sorunu haline getirmektedir. Endemik olmayan ülkelere hlîlEl yayilhia poansiyeli, ABD'ye [WHO (2009) Case of Marburg Haemorrhagic Fever imported into the United States] ve Hollanda'ya [WHO (2008) Case of Marburg Haemorrhagic Fever imported into the Netherlands from Uganda] Uganda'da enfekte olan virüsler taraflEUan bulasan Marburg virüsünün (EBOV ile yakI iliskili bir filovirüsü) önemi ile 2008 y-a gösterilmistir.
Hayvan modellerinde enfeksiyona karsükoruyucu olan bir dizi aday EBOV asüelistirilmistir evaluating the potential for clinical use. Expert review of vaccines 10: 63-77, Geisbert TW, Bausch DG, Feldmann H (2010) Prospects for immunisation against Marburg and Ebola viruses. Reviews in medical virology 20: 344-357]. Tek baslEla [Sullivan NJ, Geisbert TW, Geisbert JB, Shedlock DJ, Xu L, ve meslektaslarE(2006) Immune protection of nonhuman primates against Ebola virus with single low-dose adenovirus vectors encoding modified GPs.
PLoS Med 3: e177] veya nükleoprotein (NP) [Sullivan NJ, Geisbert TW, Geisbert JB, Xu L, Yang ZY, ve meslektaslarlîq2003) Accelerated vaccination for Ebola virus haemorrhagic fever NP olmadan GP'den olusan virüs benzeri partiküller [Warfield KL, Swenson DL, Olinger GG, Kalina WV, Aman MJ, ve meslektaslarEQZOO?) Ebola virus-like partide-based vaccine protects nonhuman primates against Iethal Ebola virus challenge. The Journal of infectious diseases meslektaslarE(2005) Virus-like particles exhibit potential as a pan-filovirus vaccine for both replikasyon kompetan veziküler sotmatit virüsü (VSV) [Jones SM, Feldmann H, Stroher U, Geisbert JB, Fernando L, ve meslektaslarü(2005) Live attenuated recombinant vaccine protects nonhuman primates against Ebola and Marburg viruses. Nat Med 11: 786-790, Geisbert TW, Geisbert JB, Leung A, Daddario-DiCaprio KM, Hensley LE, ve meslektaslarlîl (2009) Single-injection vaccine protects nonhuman primates against infection with marburg glikoproteini (GP) eksprese eden replikasyon kusurlu adenovirüs, küçük hayvanlarda ve insan olmayan primat (NHP) modellerinde koruyucu immüniteyi tutarllZl bir sekilde indükleyebilmektedir. VSV bazlElasEile oral immünizasyonun farelerde korumayElndükledigi gösterilmistir [Jones SM, Stroher U, Fernando L, Qiu X, Alimonti J, ve meslektaslarü2007) Assessment of a vesicular stomatitis virus-based vaccine by use of the mouse model of Ebola önermektedir [Groseth A, Feldmann H, Strong JE (2007) The ecology of Ebola virus. Trends Bir sitomegalovirüs (CMV) -bazlüisübir alternatif yaklasIi sunmaktadEl CMV, `efektör' (TEM) T hücreleri için yüksek derecede zenginlestirilen bir karaktersitik immün yan-Eindükledigi Effector memory T cell responses are associated with protection of rhesus monkeys from mucosal simian immunodeficiency virus challenge. Nature medicine 15: 293-299] bilinen en immünojenik virüslerinden birisidir [Sylwester AW, Mitchell BL, Edgar JB, Taormina C, Pelte C, ve meslektaslarEdZOOS) Broadly targeted human cytomegalovirus-specific CD4+ and CD8+ T cells dominate the memory compartments of exposed subjects. J Exp Med 202: 673-685] Bu hücreler, ekstra-Ienfoid mukozal bölgeleri baskI bir sekilde lokalize olmaktadE ve ani anit-patojen efektör islevi için islevsel olarak hazlîllanmaktadlEI[Kaech SM, Wherry E] (2007) Heterogeneity and cell-fate decisions in effector and memory CD8+ T cell differentiation için ilk aslîcl›lan bir CMV-bazlßsüHIV için bir NHP modeli olan simian immün yetmezlik virüsü (SIV) ile makaklarI sistemik enfeksiyonunun önlenmesi ile iliskili olabilmektedir [Hansen SG, Vieville C, Whizin N, Coyne-Johnson L, Siess DC, ve meslektaslarlî(2009) Effector memory T cell responses are associated with protection of rhesus monkeys from mucosal simian immunodeficiency virus challenge. Nature medicine 15: 293-299].
EBOV'ye karsEbir asEblarak gelisim için CMV potansiyelini degerlendirmek için, Basvuru yapanlar, ZEBOV NP'de (43-VYQVNNLEEIC-53; NP43) bir CD8+ CT L epitopunu eksprese eden Bakken R, Kuehne A, ve meslektaslarE(2005) Protective cytotoxic T-cell responses induced by venezuelan equine encephalitis virus replicons expressing Ebola virus proteins. J Virol 79: bir temel olmayan MCMV proteinine (IE2) kaynasllîl olan bir mürin sitomegalovirüs (MCMV)- bazlEEBOV as-EIMCMV/ZEBOV-NPçrL) tasariamiStlEi(Sek.1a). MCMV/ZEBOV-NPCFL, MCMV genomunu (pSM3fr) içeren bir bakteriyel yapay kromozom (BAC) kullanarak E/T rekombinasyon ile olusturulmustur [Hansen SG, Vieville C, Whizin N, Coyne-Johnson L, Siess DC, ve meslektaslarü2009) Effector memory T cell responses are associated with protection of rhesus monkeys from mucosal simian immunodeficiency virus challenge. Nature medicine vector sequences from the BAC-cloned herpesvirus genome during virus reconstitution. J Virol 73: , karakterizasyon için seçilmistir. Klîlîlhma enzimi sindirimi, ardIan elektroforez, sokak türü (WT) parental BAC'ye kiyasla brüt genomik yeniden düzenlemeler sergilememistir (SEK. 3). Virüsler, mürin embriyo fibroblastlara (MEF'Ier) BAC DNA transfeksiyonu ile yeniden olusturulmustur.
Yeniden olusturulan virüslerin in vitro büyüme analizi, WT MCMV ile klýbslanabilir olan replikasyon kinetiklerini sergilemistir (SEK. 33).
MCMV/ZEBOV-NPCTL ile indüklenen NP-spesifik CD8+ CTL yanlfllarII seviyesini ölçmek için, Basvuru yapanlar H2b-klglîlilîl 12951/SvlmJ/Cr farelerinde immunojenesite çallSlnalarIEl uygulamIStlEI Fareler (n=5/grup) MCMV/ZEBOV-NPCFL (klon 5A1 veya 5D1), MCMV/PSA (klon 3-1) (insan prostata özgü antijenden bir ilgisiz H2b-klgifliEEpit0pu eksprese eden bir kontrol MCMV, PSA [Pavlenko M, Leder C, Roos AK, Levitsky V, Pisa P (2005) Identification of an immunodominant H-2D(b)-restricted CT L epitope of human PSA. Prostate 64: 50-59]), WT MCMV veya seyreltici (Yapay) ile intraperitoneal olarak (i.p.) olarak immünize edilmistir. 4. haftada bir özdes inokülüm kullanilarak `bir artlgl sonrasIa, splenositler, T hücresi yanllihrII analizi için 8. haftada çllZlarÜBilStlE(SEKIL 28B). Antijene özgü T hücreleri, farklEl H2b-klîtltlll1pitoplarlîllemsil eden peptitlerle in vitro 6 saatlik bir inkubasyon sonraleda hücre içi sitokin boyasEUCS) ile analiz edilmistir. Tüm MCMV/ZEBOV-NPCTL asllIEfareler, ZEBOV NP'ye karslîönemli CD8+ CT L yanitlbrßergilemistir (SEK. 288). 5A1 ve 5D1 ile ortaya konulan NP yanlfllarII seviyesi önemli ölçüde farkIEçlKmlStE ve bir tek eri kümesi olarak birlikte görülmüstür. Indüklenen ZEBOV NP-spesifik T hücresi yanlflhrüönemli (ortalama: toplam yok) ve spesifik (ZEBOC NP'ye karsElyönlendirilmektedir, fakat PSA kontrolüne karsEl yönlendirilmemistir) olmustur. ZEBOV NP'ye karsündüklenen CD8+ CT L'Ier, IFNy ve TNFa'yü eksprese edecek sekilde poli islevseldir (SEK. 28C). Yapay asil]]]<0ntroller haricindeki tüm fareler, MCMV ile kodlanmlglM45 proteinine karsülönlendirilen CD8+ CTL'Iere sahip olmustur.
CMV ile indüklenen immün yanlflhrII bir benzersiz özelligi, yasama hususunda EtarCÜDIan stabil `efektör' T hücresi (TEM) haflîlas- matürasyon ile zamanla `sismeleridir' [Klenerman P, Vaksiniya virüsü ve adenovirüs gibi akut veya replikasyon yapmayan vektörlerle indüklenen klasik merkezi T hücresi haflîâasüla (TCM) klýbsla, TEM, mukozal epitelyal efektör bölgelerine F, Lenig D, Forster R, Lipp M, Lanzavecchia A (1999) Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions. Nature 401: 708-712]. Tek bir MCMV/ZEBOV-NPCTL inokülasyonundna ZEBOV NP-spesifik T hücresi yanlflhrlElI dayanllZlll]g]Il:l belirlemek için, fareler (n=14), MCMV/ZEBOV-NPm ile asUânmlStlEl (i.p.) ve periferik T hücresi yaniübrülizunlamaslüb bir sekilde takip edilmistir. NP-spesifik CD8+ T hücresi yanthrD kademeli olarak yüksek seviyelere toplanmlglve kalüîrblmustur (8. haftada %0.79'dan, tekli inokülasyon sonrasIa 33. haftada %3.08'e artmaktadli) (SEK. 29). Gecikmesine ragmen, NP-spesifik CT L yanlfllglindüksiyon kinetiklerinde klîlaslanabilir olmustur ve MCMV M38'e karsEl yönlendirilen TEM-taraflüenflasyon' yanlÜEla büyük olmustur [Munks MW, Cho KS, Pinto AK, Sierro S, Klenerman P, ve meslektaslarlI(2006) Four distinct patterns of memory CD8 T cell responses to chronic murine cytomegalovirus infection. J Immunol 177: 450-458, Karrer U, Sierro S, Wagner M, Oxenius A, Hengel H, ve meslektaslarEl(2003) Memory inflation: sonuçlar önemli ölçüde, bir CMV-bazIEIEBOV as-IEI, zamanla artan bir EBOV antijenine karsEl CD8+ T hücrelerinin yüksek seviyelerini indükleyebildigini ve dayan[lZll:l oldugunu göstermektedir.
MCMV/ZEBOV-NPCTL'nIn, ölümcül ZEBOV bagElKHgl- karsEl koruyucu Immünitesini indükleyebilip indükleyemedigini belirlemek için, Basvuru yapanlar, baglgllîlllîl virüsü olarak fare uyarlanan ZEBOV (ma-ZEBOV) kullanllârak C57BL/6 farelerde baglSKlllZl çallglnalarEl uygulamlStlEonnes SM, Stroher U, Fernando L, Qiu X, Alimonti J, ve meslektaslarE(2007) Assessment of a vesicular stomatitis virus-based vaccine by use of the mouse model of Ebola Schmaljohn C, Huggins J (1998) A mouse model for evaluation of prophylaxis and therapy of ölmeyen, asilânmamlgfarelerde tekdüze olarak ölümcül 0ImaktadlE[Jones SM, Stroher U, Fernando L, Qiu X, Alimonti J, ve meslektaslarlî(2007) Assessment of a vesicular stomatitis virus-based vaccine by use of the mouse model of Ebola virus hemorrhagic fever. J Infect Dis mouse model for evaluation of prophylaxis and therapy of Ebola hemorrhagic fever. J Infect MCMV WT veya seyreltici ile immünize edilmistir ve 4. haftada arttlEIlBilStlEl(SEK. 30). 8. haftada, 6 fare/gruptan splenositler, T hücresi yaniflhrlîiçin analiz edilmistir. 5A1 ve 5D, farelerin bir tek veri kümesi olarak görülen klonu almasIÜInümkün hale getirerek NP'ye karsEl klýbslanabilir yanEibrElindüklemistir. MCMV/ZEBOV-NPCFL, ZEBOV NP'ye karsEl(0rtaIama= görülür seviyelerini indüklemistir. Bu sonuçlar aynElzamanda, MCMV/ZEBOV-NPCTL'nin, NP- spesifik T hücrelerini indükleyebilme kabiliyetinin, fare susundan baglislîl oldugunu göstermektedir (SEK. 28C ve SEK. 30). Yapay aslIJIlkontroIler haricinde tüm fareler, MCMV ile kodlanmEM38 ve M45'e karsEýönlendirilen CD8+ CI'L'Iere sahip olmustur. . haftada, kalan fare (n=14/grup), ma-ZEBOV'un 103 LDso'si ile i.p. olarak baglgllîlandlîllüilgtß ma-ZEBOV'a karslîyüksek koruma seviyelerini sunan VSVAG/ZEBOVGP'yi (5x105 pfu; i.p.) alan bir ek grup (n=14) aslIkorumaleb yönelik bir kontrol olarak dahil edilmistir [Jones SM, Stroher U, Fernando L, Qiu X, Alimonti J, ve meslektaslarü2007) Assessment of a vesicular stomatitis virus-based vaccine by use of the mouse model of Ebola sonrasIa sagkall temelinde, klinik isaretlerin esasIa morbidite temelinde (kabarllZl kürk, kambur durus, felç ve kilo verme) ve viremi temelinde takip edilmistir. Yapay ve MCMV WT asil]]]kontroller, önemli morbidite ile normal ZEBOV hataligBergilemistir (SEK. 318), baglglîllEl sonrasIa normal süre (mod = 7 gün) içerisinde enfeksiyona direnmislerdir (SEK. 31A).
Buna karslEl, MCMV/ZEBOV-NPCTL asi[1]îfareler, %100 sagkaIIi ile ve herhangi bir morbidite isareti olmadan ZEBOV hastaligilEla dair herhangi bir kaniîlsergilememistir (SEKIL 31A-B). AsEl verimliliginin bir kantitatif analizi olarak, baglSlEllKtan sonraki 4 günde viremi (farelerde ZEBOV viremisi zirvesi), bu sürede çilZlarllân bir fare alt kümesinde (n=3-4/grup) ölçülmüstür (SEK. 31C). MCMV/ZEBOV-NPCTL asÇlVSVAG/ZEBOVGP kontrolleri için gözlemlenen seviyelere azaltllân viremi ile bir temel kontrol seviyesi ile sonuçlanmlStlEl Spesifik olarak, 8 fareden 5'i, tespit edilemez seviyelere (sterilize edici immünite) ZEBOV viremisinin bir tam kontrolünü sergilemistir. Kalan 3 fare, WT MCMV aslHJZkontrollere klýlasla viremide 2.5-Iog bir azalma sergilemistir. MCMV/ZEBOV-NPCTL asElJNP'nin bir tek 11-mer epitopunun ekspresyonundan beklendigi üzere ZEBOV nötrlestirici antikorlarlZl indüklememektedir. Fakat baglgllallîl sonrasIda ma-ZEBOV replikasyonun düsük seviyeleri, pozitif olarak hastallE çözünürlügünü etkileyen nötrlestirici antikorlarEluygun bir sekilde indükleyebilmistir. KorumanI T hücre aracÜJIkontrolünden tamamen sonuçlanliîlsonuçlanmadlglIElbelirlemek için, Basvuru yapanlar, baglgklllîtan 28. gün sonraleha korunan MC-MV/ZEBOV-NPGL farelerin bir rastgele seçilen alt kümesinden (n=6) serumlarda ma-ZEBOV nötrlestirici aktivitesini ölçmüstür.
VSVAG/ZEBOVGP kontrol fareleri, baglgllîlllîtan sonra düsük, fakat tespit edilebilir seviyede nötrlestirici aktiviteye sahip olmustur [Jones SM, Stroher U, Fernando L, Qiu X, Alimonti J, ve meslektaslarlîq2007) Assessment of a vesicular stomatitis virus-based vaccine by use of the karslEl, nötrlestirici aktivite, korumanI tek bas. CD8+ T hücreleri ile yönlendirildigini gösteren MCMV/ZE-BOV-NPCTL asl[l]Il farelerden herhangi bir iyilesen serumda tespit edilmemistir (SEK. 33).
Sonuç.' Basvuru yapanlar, bir CMV-bazlüasIlEl, herhangi bir insan hastallgll karsü korunabildigini göstermek için ilk çallgl'nada CMV-bazlElasII ZEBOV'ye karsükorumayEl karsllâyabildigini göstermektedir. Koruma seviyesi, VSVAG/ZEBOVGP olarak `ölçüt' asUârlEdan birisi ile ulasllân ile klýlaslanabilen ZEBOV kontrolü ile etkilidir. Tek bir CTL epitopu eksprese eden bir CMV vektörünü kullanarak ulasllân ZEBOV kontrolünün bu seviyesi, bu aslZl platformunun potansiyeline vurgu yapmaktadlE SEK. 28, MCMV/ZEBOV'NPCTL ile immünizasyon sonrasIa T hücresi yanlEliarIü göstermektedir. (a) MCMV/ZEBOV-NPCTL'nin sematik temsili. ZEBOV NP'den (VYQVNNLEEIC) bir HZb-klâlfllEIY hücresi epitopu, rekombinant MCMV, MCMV/ZEBOV-NPCTL üreterek MCMV bir temel olmayan proteindir, (b) 12951/5vlmJ/Cr (HZb-klglfllm fareler (n=5/grubu), asaglîllakilerden 5x105 pfu kullanüârak intraperitoneal olarak (i.p.) immünize edilmistir: MCMV/ZEBOV-NPCTL ( (insan prostatlEla özgü antijenden, PSA, bir H2b-klgflllîlepitopa kaynasllZl olan IEZ'yi eksprese eden bir klýbslanabilir MCMV vektörü), WT MCMV veya seyreltici (yapay kontrol) arasIian iki bagIislZI klondan birisi.
Fareler 4. haftada arttlîlllîhlgtlîlve splenositler, 8. haftada T hücresi yanlflbrII analizi için çlKlaerhlStlEl T hücreleri, peptitle (veya toplam T hücresi yanlflülçin anti-CD3 MAb) brefeldin A (BFA) mevcudiyetinde bir 6 saatlik inkubasyonla hücre içi sitokin boyamaslIQICS) kullanilârak analiz edilmistir. Bireysel farelerde yanlÜveren (IFNy ve TNFoc çift pozitif) CD8* (üst) ve CD4+ (alt) hücrelerinin seviyeleri gösterilmektedir. Tüm MCMV/ZEBOV-NPcrL immünize fareler (n=10), NP hedef antijenine karsEbnemli CD8 klgHlEll' hücresi yanlflhrIlleergilemistir. (c) MCMV/ZEBOV-NPCTL asll]]:farelerden tipik yanifllar. ZEBOV NP'ye yanüîlveren T hücrelerinin çogunlugu, poli islevseldir (IFNy ve TNch'yEleksprese etmektedir) ve NP epitopuna özgüdür (PSA peptidi veya uyarllîhamlgl kontrollerle inkubasyon sonrasIa gözlemlenmemektedir).
MCMV enfeksiyonu ile tutarlElolarak, tüm fareler, MCMV M45'e T hücresi yanElhrIü sergilemektedir. M45'e karsElyönlendirilen T hücresi yanlEllarIlEl, genellikle kronik MCMV enfeksiyonu slBaslîiUa toplamda D8+ T hücrelerinin

Claims (1)

  1. ISTEMLER . Bir heterolog antijeni kodlayan bir nükleik asit sekansIlIilçeren, heterolog antijenin, insan immün yetmezlik virüsten (HIV) izole edilen bir insan patojenine özgü antijen oldugu bir rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü olup; burada vektör, replikasyon için temel olan veya replikasyonu arttßn bir veya birden fazla RhCMV veya HCMV'nin bir silinmesini içermektedir. veya bunlari bir homologundan seçilebildigi, Istem 1'e göre rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü. . USZ, US3, USG veya USll'In veya bunlari bir homologunun silinmesini, özellikle Rh158- 166'n veya bunlari bir homologunun silinmesini içeren, Istem 1-2'den herhangi birisine göre rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü. UL64 veya USZ9'un veya bunlari bir kombinasyonunun silinmesini içeren, Istemler 1- 3'ten herhangi birisine göre rekombinant HCMV vektörü. . Rekombinant RhCMV vektörünün veya HCMV vektörünün, in vivo büyüme için temel olmayan gen bölgelerinde bir silinmeye sahip oldugu, özellikle burada gen bölgelerinin, RL11 ailesi, pp65 ailesi, USlZ ailesi ve U528 ailesinden olusan gruptan seçildigi, Istemler 1 ila 4'ten herhangi birisine göre rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü. olusan gruptan seçildigi, özellikle burada RhCMV gen bölgelerinin Rh13.1, Rh19, Rh20, Rh220'den olusan gruptan seçildigi, Istem 5'e göre rekombinant RhCMV vektörü. 5'e göre rekombinant HCMV vektörü. Vektörün, RhCMV veya HCMV genomunun bir temel genine veya bölgesine yanasan LoxP bölgelerini içerdigi, Istemler 1 ila 7'den herhangi birisine göre rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü. 9. Vektörün, bir nükleik asit sekanslZl kodlaylEiJ tetrasiklin (Tet)-düzenlenmis Cre rekombinazIEiçerdigi, Istemler 1 ila 7 arasIan herhangi birisine göre rekombinant 5 RhCMV veya HCMV vektörü. 10.Istemler 1 ila 9'dan herhangi birisine göre rekombinant RhCMV veya HCMV vektörünü içeren bir bilesim ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasEIEEI 10 11.Bir bulaslEElliastaIiglüblan bir hastan tedavi edilmesi yönteminde kullanIia yönelik olan, bulaslEEhastaligla, insan immün yetmezlik virüsünün (HIV) y0I açtiglÇlIstemIer 1 ila 9'dan herhangi birisine göre rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü veya istem 10'a göre bilesim. 15 12.Bir bulaslîlîlhastaliglüolma riskini taslýlan bir hastanI tedavi edilmesi yönteminde kullanIia yönelik olan, bulaslîiîhastalgb, HIV'nin yol açtiglüIstemler 1 ila 9'dan herhangi birisine göre rekombinant RhCMV veya HCMV vektörü veya Istem 10'a göre bilesim.
TR2018/02741T 2010-05-14 2011-05-16 Rekombinant hcmv ve rhcmv vektörleri ve bunların kullanımları. TR201802741T4 (tr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33497610P 2010-05-14 2010-05-14
US37691110P 2010-08-25 2010-08-25
PCT/US2011/029930 WO2011119920A2 (en) 2010-03-25 2011-03-25 Cmv glycoproteins and recombinant vectors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201802741T4 true TR201802741T4 (tr) 2018-03-21

Family

ID=44915020

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/02741T TR201802741T4 (tr) 2010-05-14 2011-05-16 Rekombinant hcmv ve rhcmv vektörleri ve bunların kullanımları.

Country Status (18)

Country Link
US (3) US9249427B2 (tr)
EP (5) EP3739054A1 (tr)
AU (5) AU2011252792C1 (tr)
CA (2) CA3040225A1 (tr)
CY (4) CY1119944T1 (tr)
DK (3) DK2569436T3 (tr)
ES (4) ES2819623T3 (tr)
HK (2) HK1256651A1 (tr)
HR (4) HRP20180267T1 (tr)
HU (4) HUE036122T2 (tr)
LT (4) LT3351636T (tr)
NO (2) NO2772265T3 (tr)
PL (4) PL2772265T3 (tr)
PT (3) PT2772265T (tr)
RS (2) RS57274B1 (tr)
SI (4) SI3351636T1 (tr)
TR (1) TR201802741T4 (tr)
WO (2) WO2011143650A2 (tr)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102844663B (zh) * 2010-01-27 2016-01-06 俄勒冈健康科学大学 基于巨细胞病毒的免疫原性制剂
EP2550362B1 (en) 2010-03-25 2017-01-04 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
HUE036122T2 (hu) 2010-05-14 2018-06-28 Univ Oregon Health & Science Rekombináns HCMV és RhCMV vektorok és alkalmazásaik
US9701943B2 (en) * 2011-04-15 2017-07-11 Cecilia Nauclér Genetic variant of cytomegalovirus (CMV)
CA2832109C (en) 2011-06-10 2021-07-06 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
CA2890061A1 (en) * 2012-12-04 2014-06-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Conditional replicating viral vectors
AU2014207618A1 (en) 2013-01-16 2015-08-06 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
GB201301119D0 (en) * 2013-01-22 2013-03-06 Vaxxit Srl Viral vaccines
ES2696703T3 (es) * 2013-03-05 2019-01-17 Univ Oregon Health & Science Vectores de citomegalovirus que permiten el control del direccionamiento de los linfocitos T
US20140335115A1 (en) * 2013-05-07 2014-11-13 Oregon Health & Science University Suppressors of mature t cells
EP3063274A4 (en) * 2013-10-29 2017-04-05 The University Of Sydney Cmv immuno-stimulatory composition
SG11201607287XA (en) * 2014-03-01 2016-09-29 Univ Texas Recombinant isfahan viral vectors
MA39818A (fr) 2014-03-30 2017-02-08 Benevir Biopharm Inc Virus oncolytiques « armés » comprenant un inhibiteur de tap exogène et leurs utilisations thérapeutiques
CN107002048B (zh) 2014-07-16 2021-07-06 俄勒冈健康与科学大学 包含外源抗原的人巨细胞病毒
MA40783A (fr) * 2014-10-03 2017-08-08 Los Alamos Nat Security Llc Vaccins contre le vih comprenant un ou plusieurs antigènes episensus de population
GB201501523D0 (en) * 2015-01-30 2015-03-18 Univ Plymouth Differential immune response modulation
AU2016219317A1 (en) * 2015-02-10 2017-08-31 Oregon Health & Science University Methods and compositions useful in generating non canonical CD8+ T cell responses
US20160346362A1 (en) * 2015-05-29 2016-12-01 Agenovir Corporation Methods and compositions for treating cytomegalovirus infections
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
GB201514034D0 (en) 2015-08-08 2015-09-23 Univ Plymouth Improvements in or relating to DNA recombination
JP7133468B2 (ja) * 2015-11-20 2022-09-08 オレゴン・ヘルス・アンド・サイエンス・ユニバーシティ マイクロｒｎａ認識エレメントを含むｃｍｖベクター
WO2017112797A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Thomas Jefferson University Intra-lesional cmv-based cancer vaccines
US10611800B2 (en) 2016-03-11 2020-04-07 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
WO2017223146A1 (en) * 2016-06-22 2017-12-28 Aeras Recombinant cytomegalovirus vectors as vaccines for tuberculosis
EP3475446A1 (en) * 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics, Inc. Method of identifying peptide epitopes, molecules that bind such epitopes and related uses
EP3529363A4 (en) * 2016-10-18 2020-05-06 Oregon Health & Science University CYTOMEGALOVIRUS VECTORS, CALLING OUT T-CELLS, RESTRICTED BY A LARGE HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX E-MOLECULE
EP3697806A4 (en) 2017-10-17 2021-10-27 International AIDS Vaccine Initiative, Inc. TUBERCULOSIS ANTIGEN CASSETTES
EP3762025A4 (en) * 2018-03-09 2021-12-01 The Regents of the University of California VECTORS OF CMV AND ASSOCIATED USES
US20210047626A1 (en) 2018-04-24 2021-02-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Scalable chromatography process for purification of human cytomegalovirus
US11629172B2 (en) 2018-12-21 2023-04-18 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
EP3905880A4 (en) 2019-01-03 2022-10-05 Merck Sharp & Dohme Corp. SUPPLEMENTED SERUM CONTAINING CULTURE MEDIUM FOR ENHANCEMENT OF ARPE-19 GROWTH AND FOR THE PREPARATION OF A HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
WO2020188111A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 21C Bio Vaccine to pathogenic immune activation cells during infections
US10632186B1 (en) 2019-03-21 2020-04-28 21C Bio Vaccine to pathogenic immune activation cells during infections
US11077185B2 (en) 2019-03-21 2021-08-03 21C Bio Vaccine to pathogenic immune activation cells during infections
EP3980071A4 (en) * 2019-06-07 2023-10-11 Oregon Health & Science University TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN-SPECIFIC T-CELL REACTIONS
TWI810589B (zh) 2020-06-21 2023-08-01 美商輝瑞股份有限公司 人巨細胞病毒糖蛋白Ｂ（ｇＢ）多肽
TW202328167A (zh) 2021-08-31 2023-07-16 美商維爾生物科技股份有限公司 結核病疫苗
TW202319070A (zh) * 2021-08-31 2023-05-16 美商維爾生物科技股份有限公司 用於製造cmv載體的方法
AU2022339765A1 (en) 2021-08-31 2024-01-25 Vir Biotechnology, Inc. Recombinant hcmv vectors and uses thereof
WO2023059112A1 (ko) * 2021-10-06 2023-04-13 주식회사 지앤피바이오사이언스 최적의 재조합 발현 구축물의 개발
WO2023133400A2 (en) * 2022-01-07 2023-07-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Cytomegalovirus vectors and methods of use

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6267965B1 (en) * 1981-12-24 2001-07-31 Virogenetics Corporation Recombinant poxvirus—cytomegalovirus compositions and uses
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5273876A (en) 1987-06-26 1993-12-28 Syntro Corporation Recombinant human cytomegalovirus containing foreign gene
CA1327171C (en) 1987-06-26 1994-02-22 Lisa J. Hock Recombinant human cytomegalovirus containing foreign gene and use thereof
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
SG49046A1 (en) 1991-07-05 1998-05-18 American Cyanamid Co Method for identifying non-essential genes of the human cytomegalovirus genome and for screening for inhibitors of human cytomegaloverirus
WO1995003399A2 (en) * 1993-07-19 1995-02-02 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Production method for preparation of disabled viruses
EP0758396B1 (en) 1994-04-29 2006-07-26 Pharmacia & Upjohn Company LLC Feline immunodeficiency virus vaccine
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
DE69535905D1 (de) 1994-07-15 2009-02-26 Coley Pharm Group Inc Immunomodulatorische Oligonukleotide
US5846806A (en) 1994-07-29 1998-12-08 American Cyanamid Company Identification of a human cytomegalovirus gene region involved in down-regulation of MHC class I heavy chain expression
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
EP0811057B1 (en) * 1995-02-21 2006-04-26 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Viral preparations, vectors, immunogens, and vaccines
AU712415B2 (en) 1995-04-04 1999-11-04 Cell Genesys, Inc. Transplantation of genetically modified cells having low levels of class I MHC proteins on the cell surface
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
US6033671A (en) 1996-07-31 2000-03-07 Ortho Mcneil Pharmaceutical, Inc. Identification of human cytomegalovirus genes involved in down-regulation of MHC class I heavy chain expression
CA2281838A1 (en) 1997-02-28 1998-09-03 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated cpg dinucleotide in the treatment of lps-associated disorders
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6339068B1 (en) 1997-05-20 2002-01-15 University Of Iowa Research Foundation Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
DE19733364A1 (de) * 1997-08-01 1999-02-04 Koszinowski Ulrich H Prof Verfahren zur Klonierung eines großen Virusgenoms
AU3910097A (en) * 1997-08-05 1999-03-01 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Live recombinant vaccine comprising inefficiently or non-replicating vir us
EP1067956B1 (en) 1998-04-03 2007-03-14 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
US20020102536A1 (en) * 1999-11-19 2002-08-01 Xenova Research Limited Preparation of human or animal herpesviruses
US7204990B1 (en) * 2000-11-28 2007-04-17 Medimmune Vaccines, Inc. Attenuation of cytomegalovirus virulence
EP1364037A4 (en) 2001-02-02 2005-08-03 Chemocentryx Inc METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL IN STIMULATING AN IMMUNE RESPONSE
ATE488583T1 (de) 2001-02-21 2010-12-15 Wistar Inst Rekombinant vektor, der ein infektiöses humanes cytomegalovirus genom mit konserviertem wildtyp- charakteristika klinisher isolate enthält
GB0122232D0 (en) * 2001-09-14 2001-11-07 Medical Res Council Gene expression
US20070015721A1 (en) * 2001-09-20 2007-01-18 Andrew Beaton Hiv-gag codon-optimised dna vaccines
CA2852277C (en) * 2001-11-21 2018-02-20 Guangping Gao Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
US20030118568A1 (en) 2001-12-18 2003-06-26 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Viral stealth technology to prevent T cell-mediated rejection of xenografts
WO2003093455A2 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Avior Therapeutics, Inc. Adenovirus vectors for immunotherapy
CA2484669A1 (en) * 2002-05-08 2003-11-20 Akzo Nobel N.V. Brachyspira hyodysenteriae vaccine
DE10232322A1 (de) 2002-07-16 2004-07-29 Hahn, Gabriele, Dr. Viral kodierte CxC determinieren den Gewebetropismus von HCMV
WO2005012545A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-10 The Regents Of The University Of California Cytomegalovirus gene function and methods for developing antivirals, anti-cmv vaccines, and cmv-based vectors
CA2567597C (en) 2004-05-25 2014-03-18 Oregon Health And Science University Siv and hiv vaccination using rhcmv-and hcmv-based vaccine vectors
EP1602676A1 (en) 2004-06-01 2005-12-07 SOLVAY (Société Anonyme) Catalytic compositions
EP1799255A4 (en) * 2004-06-25 2008-10-01 Medimmune Vaccines Inc RECOMBINANT HUMANESE CYTOMEGALOVIRUS AND HETEROLOGIST ANTIGENS CONTAINING VACCINES
US8668564B2 (en) 2005-01-24 2014-03-11 Solution Champion Limited Jackpot method and system
EP1888622A1 (en) * 2005-05-23 2008-02-20 Oxxon Therapeutics Ltd. Compositions for inducing an immune response against hepatitis b
JP2009505680A (ja) * 2005-08-31 2009-02-12 ジェンベク、インコーポレイティッド アデノウイルスベクターに基づくマラリアワクチン
CA2626266C (en) 2005-10-17 2015-09-08 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
WO2008112146A2 (en) 2007-03-07 2008-09-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania 2d partially parallel imaging with k-space surrounding neighbors based data reconstruction
WO2009023386A2 (en) 2007-07-06 2009-02-19 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding peptides having a c-terminally disposed specific binding domain
PE20091434A1 (es) 2007-10-30 2009-10-17 Genentech Inc Purificacion de anticuerpos por cromatografia de intercambio cationico
WO2010101663A2 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Live attenuated influenza virus vaccines comprising microrna response elements
SG10201610827RA (en) 2009-04-30 2017-02-27 Ospedale San Raffaele Srl Gene Vector
BR112012015523A2 (pt) 2009-12-23 2017-04-18 4-Antibody Ag membros de ligação do citomegalovirus humano, composição contendo os mesmos, método de tratamento, moléculas de anticorpo, método de produção, molecular de ácido nucléico, célula hospedeira, e, método de neutralização do hcmv.
CN102844663B (zh) 2010-01-27 2016-01-06 俄勒冈健康科学大学 基于巨细胞病毒的免疫原性制剂
EP2550362B1 (en) 2010-03-25 2017-01-04 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
CA2798214C (en) 2010-05-05 2021-10-19 Christian Thirion Vaccine against beta-herpesvirus infection and use thereof
HUE036122T2 (hu) * 2010-05-14 2018-06-28 Univ Oregon Health & Science Rekombináns HCMV és RhCMV vektorok és alkalmazásaik
CA2832109C (en) 2011-06-10 2021-07-06 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
US20140227708A1 (en) 2011-09-16 2014-08-14 Oregon Health & Science University Methods and kits used in identifying microrna targets
US20130156808A1 (en) 2011-11-22 2013-06-20 Stipan Jonjic Vaccine comprising beta-herpesvirus
ES2696703T3 (es) 2013-03-05 2019-01-17 Univ Oregon Health & Science Vectores de citomegalovirus que permiten el control del direccionamiento de los linfocitos T
CN107002048B (zh) 2014-07-16 2021-07-06 俄勒冈健康与科学大学 包含外源抗原的人巨细胞病毒
EP3048114A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-27 Novartis AG Cytomegalovirus antigens and uses thereof
AU2016219317A1 (en) 2015-02-10 2017-08-31 Oregon Health & Science University Methods and compositions useful in generating non canonical CD8+ T cell responses
JP7133468B2 (ja) 2015-11-20 2022-09-08 オレゴン・ヘルス・アンド・サイエンス・ユニバーシティ マイクロｒｎａ認識エレメントを含むｃｍｖベクター
WO2017223146A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 Aeras Recombinant cytomegalovirus vectors as vaccines for tuberculosis
EP3475446A1 (en) 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics, Inc. Method of identifying peptide epitopes, molecules that bind such epitopes and related uses
EP3529363A4 (en) 2016-10-18 2020-05-06 Oregon Health & Science University CYTOMEGALOVIRUS VECTORS, CALLING OUT T-CELLS, RESTRICTED BY A LARGE HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX E-MOLECULE

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20180267T1 (hr) 2018-04-20
US9982241B2 (en) 2018-05-29
EP3333265B1 (en) 2020-02-05
AU2019204982A1 (en) 2019-08-01
EP2772265B1 (en) 2018-01-17
HUE049725T2 (hu) 2020-10-28
HK1256651A1 (zh) 2019-09-27
EP2569436A2 (en) 2013-03-20
PT2569436T (pt) 2018-03-05
HUE037227T2 (hu) 2018-08-28
RS57274B1 (sr) 2018-08-31
EP2772265A2 (en) 2014-09-03
SI3351636T1 (sl) 2020-11-30
CY1119944T1 (el) 2018-12-12
AU2018203259A2 (en) 2018-06-07
DK3333265T3 (da) 2020-04-27
LT3351636T (lt) 2020-10-12
PT3351636T (pt) 2020-09-24
US9249427B2 (en) 2016-02-02
EP3333265A1 (en) 2018-06-13
EP2569436A4 (en) 2013-11-27
AU2011252792C1 (en) 2016-06-16
HRP20201406T1 (hr) 2021-02-19
WO2011143650A2 (en) 2011-11-17
CY1120464T1 (el) 2019-07-10
CY1123362T1 (el) 2021-12-31
AU2019204982B2 (en) 2021-11-25
DK2569436T3 (en) 2018-03-05
NO2772265T3 (tr) 2018-06-16
SI3333265T1 (sl) 2020-08-31
EP3351636B1 (en) 2020-07-01
AU2022201186A1 (en) 2022-03-17
ES2819623T3 (es) 2021-04-16
WO2011143653A3 (en) 2012-05-31
HUE050909T2 (hu) 2021-01-28
EP3739054A1 (en) 2020-11-18
HUE036122T2 (hu) 2018-06-28
ES2660615T3 (es) 2018-03-23
SI2772265T1 (en) 2018-06-29
SI2569436T1 (en) 2018-05-31
CY1124015T1 (el) 2022-03-24
US20160114027A1 (en) 2016-04-28
EP3351636A1 (en) 2018-07-25
LT3333265T (lt) 2020-05-25
CA3040225A1 (en) 2011-11-17
PT2772265T (pt) 2018-04-20
ES2788198T3 (es) 2020-10-20
PL3333265T3 (pl) 2020-08-10
NO2569436T3 (tr) 2018-04-28
US20130136768A1 (en) 2013-05-30
LT2772265T (lt) 2018-05-25
US20190099479A1 (en) 2019-04-04
PL3351636T3 (pl) 2021-03-08
PL2772265T3 (pl) 2018-07-31
EP2569436B8 (en) 2019-10-30
CA2798136C (en) 2019-06-04
EP2772265A3 (en) 2015-01-21
RS56958B1 (sr) 2018-05-31
HK1257045A1 (zh) 2019-10-11
AU2016201853A1 (en) 2016-06-02
ES2666043T3 (es) 2018-04-30
WO2011143653A2 (en) 2011-11-17
DK2772265T3 (en) 2018-04-30
EP2569436B1 (en) 2017-11-29
HRP20180601T1 (hr) 2018-06-15
ES2660615T8 (es) 2019-11-04
HRP20200698T1 (hr) 2020-10-02
CA2798136A1 (en) 2011-11-17
LT2569436T (lt) 2018-03-12
US11266732B2 (en) 2022-03-08
PL2569436T3 (pl) 2018-05-30
WO2011143650A3 (en) 2016-03-31
AU2011252792B2 (en) 2016-03-03
AU2018203259A1 (en) 2018-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11266732B2 (en) Recombinant HCMV and RHCMV vectors and uses thereof
AU2011252792A1 (en) Recombinant HCMV and RhCMV vectors and uses thereof
ES2625406T3 (es) Glicoproteínas de CMV y vectores recombinantes
Hanke et al. Effective induction of simian immunodeficiency virus-specific cytotoxic T lymphocytes in macaques by using a multiepitope gene and DNA prime-modified vaccinia virus Ankara boost vaccination regimen
JP2021121185A (ja) 非標準的なｃｄ８＋ｔ細胞応答を生成するのに有用な方法および組成物
US20150307850A1 (en) Conditional replicating viral vectors
Di Bonito et al. Anti-tumor CD8+ T cell immunity elicited by HIV-1-based virus-like particles incorporating HPV-16 E7 protein
Jindra et al. Attenuated recombinant influenza A virus expressing HPV16 E6 and E7 as a novel therapeutic vaccine approach
Li et al. Development and characterization of Rift Valley fever virus-like particles
AU2019262056A1 (en) HSV-2-delta-gD vaccines and methods for their production and use
MX2014002953A (es) Genomas lentivirales quimericos no integrativos como vacunas innovadoras contra el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (vih-1).
US20220257748A1 (en) Hepatitis b virus-specific t cell responses
Malhi Designing a Next-generation Epstein-Barr Virus Vaccine
Liao Studies of therapeutic vaccination and immune evasion by human papillomavirus oncoproteins