JP6800171B2 - 人工単一ガイドｒｎａ及びその用途 - Google Patents

人工単一ガイドｒｎａ及びその用途 Download PDF

Info

Publication number
JP6800171B2
JP6800171B2 JP2017563895A JP2017563895A JP6800171B2 JP 6800171 B2 JP6800171 B2 JP 6800171B2 JP 2017563895 A JP2017563895 A JP 2017563895A JP 2017563895 A JP2017563895 A JP 2017563895A JP 6800171 B2 JP6800171 B2 JP 6800171B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
formula
sgrna
cas9
group
represented
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2017563895A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2017131237A1 (ja
Inventor
絵里子 青木
絵里子 青木
忠明 大木
忠明 大木
高志 木下
高志 木下
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bonac Corp
Original Assignee
Bonac Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bonac Corp filed Critical Bonac Corp
Publication of JPWO2017131237A1 publication Critical patent/JPWO2017131237A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6800171B2 publication Critical patent/JP6800171B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/34—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
    • C07F9/222—Amides of phosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

本発明は、天然型と同等以上の活性を有し、かつ生体内安定性が向上した人工単一ガイドRNA（以下、「sgRNA」ともいう。）、該人工sgRNAとCRISPR-associated protein 9（Cas9）とを組み合わせたCRISPR/Cas9システム、並びにその用途に関する。
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）は、細菌に存在する数十塩基対の短い反復配列であり、バクテリオファージやプラスミドなどの外来DNAに対する獲得免疫機構に関与している。CRISPR上流のCas遺伝子群の1つが、外来DNA中のPAM（proto-spacer adjacent motif）と呼ばれる特定の短い配列を認識してその上流数十塩基対を切り取り、CRISPR領域に挿入する。挿入された標的配列は反復配列とともに一連のCRISPR RNA（crRNA）前駆体として転写された後、crRNAと一部相補的なtrans-activating crRNA（tracrRNA）の作用により反復配列が切断されて成熟crRNAとなり、tracrRNA、Cas遺伝子群の1つで二本鎖切断エンドヌクレアーゼであるCas9とともに複合体を形成する。該複合体は、外来DNA中のPAM配列を認識してそれに隣接する標的配列に結合し、Cas9が外来DNAを切断除去する。この一連の機構をCRISPR/Cas9システムと呼ぶ。
（nはそれぞれ独立して、A、G、C又はUであり、(n)20はcrRNAのガイド領域を示す。）
tracrRNAはcrRNAの成熟と、crRNAと形成するヘアピン構造を介したCas9との複合体形成に必要であるが、crRNAの3’末端とtracrRNAの5’末端とを短鎖化し、ヌクレオチドリンカーを介して一本鎖にした単一ガイドRNA（sgRNA）を作れば、Cas9とsgRNAの2つだけでゲノム編集が可能となる。Streptococcus pyogenes由来のCas9（SpCas9）はNGGをPAMとして認識するので、3’側にGGが存在すれば、sgRNAの5’末端側約20塩基を所望の標的配列に置き換えるだけで、任意の二本鎖DNAを標的部位で切断（double-stranded DNA break; DSB）することができる。sgRNAは、in vitro転写系や組換え細胞を用いて生成される天然型RNAの形態で、あるいはsgRNAをコードするDNAの形態で、Cas9 mRNAもしくはタンパク質、あるいはCas9をコードするDNAとともに細胞に導入される。細胞内に導入され（発現し）たsgRNAとCas9タンパク質とは複合体を形成し、標的配列に結合して標的遺伝子にDSBを生じさせる。該DSBは非相同的末端結合（NHEJ）によって修復されるが、その際に生じる偶発的な塩基の挿入・欠失（indel）によるフレームシフト変異によって標的遺伝子が破壊される。また、標的の相同配列を両端に有するドナーDNAを共導入することにより、相同組換え修復が起こり、塩基改変や遺伝子挿入が可能となる。
しかし、DSBはオフターゲット切断による想定外のゲノム改変を伴うため、強い細胞毒性や染色体の転位などの副作用があり、生存細胞数が極めて少なかったり、単細胞微生物では、そもそも遺伝子改変自体が困難であるといった課題がある。sgRNAやCas9をコードするDNA発現ベクターの使用は、sgRNA及びCas9の持続的発現を伴うため、オフターゲット切断の問題がより大きく、また、発現ベクターが染色体に組み込まれることによる遺伝子擾乱のリスクもある。sgRNAをRNAの形態で、またCas9をmRNAもしくはタンパク質の形態で導入することにより、上記の問題は回避もしくは低減することができるが、天然型（非修飾）RNAは生体内で不安定であるため、in vivoでのゲノム編集効率の低下の問題がある。
ヌクレアーゼ耐性を向上させて生体内安定性を改善するためや、細胞内送達性を高める目的で、修飾されたヌクレオチドを用いてsiRNAやアンチセンスRNA分子を化学合成することは周知であるが、化学修飾したsgRNAを用いたゲノム編集の報告はきわめて限定的である。Hendelら（非特許文献１）は5’及び3’末端のヌクレオチドのリボースの2’位及びリン酸ジエステル結合を改変した化学修飾sgRNAが、ヒト初代培養細胞におけるゲノム編集効率を顕著に向上させたことを報告しているが、sgRNAの内部ヌクレオチドの化学修飾についての報告は皆無である。
ところで、生体内での安定性改善や自然免疫応答の亢進による副作用軽減の目的で、siRNAやmicroRNA等の二本鎖核酸の末端を各種のリンカーで連結した、1つもしくは2つのヘアピン型部分二次構造をとり得る一本鎖核酸分子が開発されている（例えば、特許文献１-６参照）。しかしながら、比較的複雑な二次構造を有するsgRNAに当該リンカーを適用したという報告は一切なく、Cas9との複合体形成、ひいてはゲノム編集効率に及ぼす影響についても全く予見することはできない。
国際公開第2012/017919号 国際公開第2013/103146号 国際公開第2012/005368号 国際公開第2013/077446号 国際公開第2013/133393号 国際公開第2013/180038号
Hendel et al., Nat. Biotechnol., 33(9): 985-989 (2015)
上記のとおり、CRISPR/Cas9システムを利用したゲノム編集において、sgRNAをRNAの形態で導入することは一定の利点を有する反面、天然型RNAは生体内で不安定であり、また、組換えやin vitro転写による製造に際してベクターや鋳型DNAの調製が必要で、かつ培養や酵素反応、RNA精製に時間と労力を要するといった問題がある。一方、化学修飾RNAを用いた場合、ゲノム編集効率、特に相同組換えによる遺伝子挿入変異の導入効率において未だ十分であるとはいえない。
したがって、本発明の目的は、天然型RNAと同等もしくはそれ以上の活性を有し、かつ生体内での安定性が向上した新規な人工sgRNAを提供し、該人工sgRNAとCas9とを組み合わせることにより、より効率的なCRISPR/Cas9システムを提供することである。
本発明者らは、sgRNA中の、crRNAの3’末端とtracrRNAの5’末端とを繋ぐ一本鎖化のためのヌクレオチドリンカー（SpCas9に対応するsgRNA（下式）においては5’-GAAA-3’のテトラループ（Nishimasu et al., Cell, 156: 935-949 (2014)参照）が挙げられる）部分を、アミノ酸誘導体リンカーに置換しても、in vitro（無細胞系又は細胞内）のDNA切断アッセイで、元のsgRNAと同等以上の活性が保持されることを見出した。さらに、tracrRNAのステム-ループ1とステム-ループ2との間に存在するリンカー領域及び／又はステム-ループ2のループ部分をアミノ酸誘導体リンカーに置換、あるいはsgRNAの5’末端及び／又は3’末端近傍（下式矢印）にアミノ酸誘導体リンカーを付加／挿入しても、少なくとも無細胞系で元のsgRNAと同等以上の活性が保持されることも見出した。また、ステム-ループ1もしくはステム-ループ3のループ部分をアミノ酸誘導体リンカーに置換、あるいはテトラループとそれに続くステム部分及び／又はステム-ループ2部分をアミノ酸誘導体リンカーに置換した短鎖化sgRNAでも、少なくとも無細胞系で、元のsgRNAよりは低いものの十分な活性が保持されていた。
特に、テトラループ部分のみならず、ステム-ループ2のループ部分もアミノ酸誘導体リンカーに置換した、2カ所にリンカーを導入したsgRNAでも、元のsgRNAと同等以上の細胞内でのDNA切断活性を有することが見出されたことは興味深い。そのような人工sgRNAは生体内での安定性改善効果がより大きいと考えられるからである。
（nはそれぞれ独立して、A、G、C又はUであり、(n)20はcrRNAのガイド領域を示す。）
このように、本発明者らは、sgRNAに1以上のアミノ酸誘導体リンカーを導入することにより、sgRNAの活性（Cas9との組み合わせによる標的二本鎖DNA切断活性）を保持したまま、sgRNAの生体内安定性を向上させ得ることに成功して、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］（１）下式（Ａ）：
［式（Ａ）中、Ｘａは、下式（Ｉ）：
（式（Ｉ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の整数であり；
ｎは、０〜３０の整数であり；
Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。）で表わされるアミノ酸誘導体リンカーであり、
前記Ｘａは、前記−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して隣接するヌクレオチド残基に結合し、
式（Ａ）中、Ｘｂ及びＹは、それぞれ独立して、１ないし５個の任意のヌクレオチドリンカーであるか、あるいは、上記式（Ｉ）で表わされるアミノ酸誘導体リンカーであり、
前記Ｘｂ及びＹは、それぞれ独立して、前記−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して隣接するヌクレオチド残基に結合し、
式（Ａ）中、Ｘｃ及びＸｄは、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、それぞれ独立して、前記式（Ｉ）で表わされるアミノ酸誘導体リンカーであり、
前記Ｘｃ及びＸｄは、それぞれ独立して、前記−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して隣接するヌクレオチド残基に結合し、
式（Ａ）中、（ｎ）２０は、それぞれ独立してＡ、Ｇ、ＣまたはＵである20±5個のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列である。］で表わされる、単一ガイドＲＮＡ、あるいは
（２）前記式（Ａ）において、（ｎ）２０を除く領域で１ないし数個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入もしくは付加され、かつCas9タンパク質と複合体を形成して前記（ｎ）２０に相補的な標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖DNAを認識する活性を有する、単一ガイドＲＮＡ。
［２］前記式（Ｉａ）のアミノ酸またはペプチドを構成するアミノ酸が、置換基または保護基を有していてもよい、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β−アラニン、１−アミノ−２−カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸、および下記化学式（Ｉａ２）：
（式（Ｉａ２）中、Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。）で表されるアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種である、［１］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［３］前記Ｘａが、下式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）：
（各式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０〜３０の整数である。）のいずれかで表される、［１］または［２］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［４］前記Ｘａが、前記式（Ｉ−４）または（Ｉ−７）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４である、［３］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［５］前記Ｘａが、前記式（Ｉ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４である、または前記式（Ｉ−６）で表され、該式中、ｎ＝４およびｍ＝４である、［３］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［６］前記Ｘａが、下式（ＩＩ）：
（式（ＩＩ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり；
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の整数であり；
ｎは、０〜３０の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（ＩＩ)であり、
前記Ｘａは、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、隣接するヌクレオチド残基に結合する。）で表される、［１］または［２］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［７］前記Ｘａが、下式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）：
（各式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０〜３０の整数であり、ｑは０〜１０の整数である。）のいずれかで表される、［６］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［８］前記Ｘａが、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４、ｎ＝７およびｍ＝６、ｎ＝９およびｍ＝８、またはｎ＝１１およびｍ＝１０である、［７］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［９］前記Ｘａが、下式（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）：
（各式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０〜３０の整数である。）のいずれかで表される、［１］または［２］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［１０］前記各式中、ｎ＝５およびｍ＝４である、［９］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［１１］前記Ｘｂ及びＹが、それぞれ独立して、１ないし５個の任意のヌクレオチドリンカーである、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
［１２］前記Ｘｃ及びＸｄが存在しない、［１１］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［１３］前記Ｘｃ及びＸｄが、それぞれ独立して、前記式（Ｉ）で表わされるアミノ酸誘導体リンカーである、［１１］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［１４］前記Ｘｃ及びＸｄが、前記式（ＩＩ）で表わされるアミノ酸誘導体リンカーである、［１３］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［１５］前記Ｘｃ及びＸｄが、前記式（ＩＩ−８）で表わされ、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４である、［１４］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［１６］前記Ｘｃ及びＸｄが、前記式（Ｉ−１）、（Ｉ−４）、（Ｉ−７）及び（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）のいずれかで表わされ、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるか、あるいは、前記式（Ｉ−６）で表わされ、該式中、ｎ＝４およびｍ＝４である、［１３］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［１７］前記Ｘｂが、前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸誘導体リンカーである、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
［１８］前記Ｘｂが、前記式（ＩＩ）で表わされるアミノ酸誘導体リンカーである、［１７］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［１９］前記Ｘｂが、前記式（ＩＩ−８）で表わされ、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４である、［１８］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［２０］前記Ｘｂが、前記式（Ｉ−１）、（Ｉ−４）、（Ｉ−７）及び（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）のいずれかで表わされ、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるか、あるいは、前記式（Ｉ−６）で表わされ、該式中、ｎ＝４およびｍ＝４である、［１７］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［２１］前記Ｙが、１ないし５個の任意のヌクレオチドリンカーである、［１７］〜［２０］のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
［２２］前記Ｙが、前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸誘導体リンカーである、［１７］〜［２０］のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
［２３］前記Ｙが、前記式（Ｉ−４）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４である、［２２］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［２４］前記Ｙが、前記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸誘導体リンカーである、［２２］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［２５］前記Ｙが、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４、ｎ＝７およびｍ＝６、ｎ＝９およびｍ＝８、またはｎ＝１１およびｍ＝１０である、［２４］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［２６］前記Ｙが、前記式（Ｉ−１）、（Ｉ−７）及び（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）のいずれかで表わされ、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるか、あるいは、前記式（Ｉ−６）で表わされ、該式中、ｎ＝４およびｍ＝４である、［２２］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［２７］前記Ｘａが、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であり、かつ前記Ｘａに隣接するステムの１〜３塩基対が欠失した、［７］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［２８］前記Ｘｂに隣接するステムの１〜４塩基対が欠失した、［１９］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［２９］前記Ｘａが、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であり、かつ前記Ｘａに隣接するステムの１〜３塩基対が欠失した、［２８］記載の単一ガイドＲＮＡ。
［３０］前記式（Ａ）で表される単一ガイドＲＮＡであって、該式中、Ｘａ、Ｘｂ及びＹは１ないし５個の任意のヌクレオチドリンカーであり、Ｘｃ及びＸｄは存在せず、ステム-ループ1のループ部分（UA）もしくはステム-ループ3のループ部分（AGU）が、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるアミノ酸誘導体リンカーで置換されている、単一ガイドＲＮＡ。
［３１］［１］〜［３０］のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡと、Cas9とを組み合わせてなる、CRISPR/Cas9システム。
［３２］Cas9がStreptococcus pyogenes由来である、［３１］記載のCRISPR/Cas9システム。
［３３］Cas9が、タンパク質、それをコードするmRNAまたはそれをコードするDNAを含む発現ベクターの形態である、［３１］または［３２］記載のCRISPR/Cas9システム。
［３４］［３１］〜［３３］のいずれか一項に記載のCRISPR/Cas9システムを、標的二本鎖DNAに接触させることを含む、該二本鎖DNAの認識方法。
［３５］Cas9タンパク質が二本鎖DNA切断活性を有する、［３４］記載の方法。
［３６］前記二本鎖DNAの切断が細胞内で行われる、［３５］記載の方法。
［３７］標的遺伝子をノックアウトするための、［３６］記載の方法。
［３８］標的遺伝子内の塩基を改変するか、あるいは該遺伝子内に外因性遺伝子を挿入するための、［３６］記載の方法。
［３９］核酸分子合成用のモノマーであって、下記式（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−３）：
（各式中、Ｒ１１およびＲ２１は、それぞれ独立して、水素原子、保護基またはリン酸保護基であり、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０〜３０の整数である。）のいずれかで表される、モノマー。
［４０］前記各式中、ｎ＝５およびｍ＝４である、［３９］記載のモノマー。
［４１］核酸分子の製造方法であって、［３９］又は［４０］記載のモノマーを使用することを特徴とする、方法。
［４２］前記核酸分子が、［１］〜［２６］のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡである、［４１］記載の方法。
［４３］核酸分子の製造のための、［３９］又は［４０］記載のモノマーの使用。
［４４］前記核酸分子が、［１］〜［２６］のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡである、［４３］記載の使用。
本発明の人工sgRNAによれば、容易に低コストで合成でき、且つ、標的二本鎖DNAの切断活性を損なうことなく、sgRNAの生体内安定性を向上させることができるので、ゲノム編集効率、特にin vivoでのゲノム編集効率を改善することができる。
KRAS遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性を示す図である。 BCL-2遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性を示す図である。 KRAS遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性を示す図である。 KRAS遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性を示す図である。 KRAS遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性を示す図である。 KRAS遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性を示す図である。 KRAS遺伝子を標的とした人工sgRNAのin vitro切断活性を天然型sgRNAと比較した図である。 BCL-2遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性を示す図である。 BCL-2遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性を示す図である。 BRAF遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性を示す図である。 BRAF遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性を示す図である。 BCL-2遺伝子を標的としたsgRNAの細胞内での切断活性を示す図である。 BCL-2遺伝子を標的とした人工sgRNAの細胞内での切断活性を天然型sgRNAと比較した図である。 BRAF遺伝子を標的としたsgRNAの細胞内での切断活性を示す図である。 BRAF遺伝子を標的とした人工sgRNAの細胞内での切断活性を天然型sgRNAと比較した図である。
１．人工sgRNA
本発明は、下記式で示されるStreptococcus pyogenes由来のcrRNA及びtracrRNA：
（nはそれぞれ独立して、A、G、C又はUであり、(n)20はcrRNAのガイド領域を示す。）
をキメラ化（短鎖化及び一本鎖化）した下記単一ガイドRNA（天然型sgRNA）において、
少なくとも、その内部配列中に１以上のアミノ酸誘導体リンカーを含む、化学修飾されたsgRNA（本明細書において「本発明の人工sgRNA」ともいう。）を提供する。
本発明の人工sgRNAの元となる天然型sgRNA（本来sgRNA自体が人工RNAであるが、本明細書では、「天然型（即ち、非修飾）ヌクレオチド」のみからなるsgRNAという意味で、天然型sgRNAと呼ぶ。）は、上記のとおり、5’末端に、標的ヌクレオチド配列と相補的なガイド領域（(n)20）を含み、その下流にcrRNA由来のリピート領域と、tracrRNA由来のアンチリピート領域とが、4ヌクレオチド（GAAA）からなるテトラループを介して連結され、ステム-ループ構造を形成している。さらに、アンチリピート領域の下流に、tracrRNA由来の3つのステム-ループ構造を含み、ステム-ループ1とステム-ループ2との間に5ヌクレオチド（UUAUC）からなるリンカー領域を有する。
ガイド領域のヌクレオチド配列（(n)20）の長さは、sgRNAが標的ヌクレオチド配列に特異的に結合するのに十分であればよく、例えば、哺乳動物のゲノムDNA中の特定の部位に変異を導入する場合、そのゲノムサイズに応じて、12ヌクレオチド以上、好ましくは15ヌクレオチド以上、より好ましくは17ヌクレオチド以上である。長さの上限は特に制限されないが、好ましくは25ヌクレオチド以下、より好ましくは22ヌクレオチド以下である。より具体的には、ガイド領域のヌクレオチド長は、20±5ヌクレオチド、好ましくは17〜22ヌクレオチド、特に好ましくは20ヌクレオチドである。
具体的には、本発明の人工sgRNAは、天然型sgRNAのテトラループ部分が、少なくともアミノ酸誘導体リンカー（Ｘａ）で置換されていることを特徴とする。即ち、本発明の人工sgRNAは、下式（Ａ）：
［式（Ａ）中、Ｘａは、下式（Ｉ）：
（式（Ｉ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の整数であり；
ｎは、０〜３０の整数であり；
Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。）で表わされるアミノ酸誘導体リンカーであり、
前記Ｘａは、前記−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して隣接するヌクレオチド残基に結合し、
式（Ａ）中、Ｘｂ及びＹは、それぞれ独立して、１ないし５個の任意のヌクレオチドリンカーであるか、あるいは、上記式（Ｉ）で表わされるアミノ酸誘導体リンカーであり、
前記Ｘｂ及びＹは、それぞれ独立して、前記−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して隣接するヌクレオチド残基に結合し、
式（Ａ）中、Ｘｃ及びＸｄは、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、それぞれ独立して、前記式（Ｉ）で表わされるアミノ酸誘導体リンカーであり、
前記Ｘｃ及びＸｄは、それぞれ独立して、前記−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して隣接するヌクレオチド残基に結合し、
式（Ａ）中、（ｎ）２０は、それぞれ独立してＡ、Ｇ、ＣまたはＵである20±5個のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列である。］で表わされる、単一ガイドＲＮＡ、あるいは
（２）前記式（Ａ）において、（ｎ）２０を除く領域で１ないし数個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入もしくは付加され、かつCas9タンパク質と複合体を形成して前記（ｎ）２０に相補的な標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖DNAを切断する活性を有する、単一ガイドＲＮＡである。
前記式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
前記式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例：ｐ−メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。これらの置換基は、１または複数のさらなる置換基またはさらなる保護基で置換されていても良い。前記さらなる置換基は、特に限定されないが、例えば、上記例示に係る置換基でも良い。前記さらなる保護基は、特に限定されないが、例えば、下記例示に係る保護基でも良い。以下において同様である。
前記保護基（または、前記さらなる保護基）は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、下式（Ｐ１）および（Ｐ２）のシリル含有基があげられ、中でも、ＤＭｔｒ基および前記シリル含有基のいずれかであることが好ましい。
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
前記Ｘａは、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、隣接するヌクレオチド残基に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（Ｉ)の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、Ｘａは、前記式（Ｉ）の構造からなるアミノ酸誘導体残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。
隣接するヌクレオチド残基と、−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
隣接するヌクレオチド残基の3’末端は、−ＯＲ２−を介して、隣接するヌクレオチド残基の5’末端は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
隣接するヌクレオチド残基の3’末端は、−ＯＲ１−を介して、隣接するヌクレオチド残基の5’末端は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
前記式（Ｉ）中、原子団Ａは、下式（Ｉａ）：
がアミノ酸またはペプチドとなる限り、特に制限されない。
例えば、前記（Ｉ）または（Ｉａ）中の原子団Ａは、例えば、鎖式原子団、脂環式原子団、および芳香族性原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいても含んでいなくても良い。前記鎖式原子団は、特に限定されないが、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。前記脂環式原子団は、特に限定されないが、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等が挙げられる。前記芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、縮環系アリール、縮環系アリールアルキル、縮環系アルキルアリール等が挙げられる。また、前記式（Ｉ）または（Ｉａ）中の原子団Ａにおいて、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基または保護基は、複数の場合は同一でも異なってもよい。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。
本発明において、「アミノ酸」は、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。また、「ペプチド」は、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造の有機化合物をいう。前記ペプチド結合は、酸アミド構造でも良いし、酸イミド構造でも良い。また、前記式（Ｉａ）で表すアミノ酸分子中にアミノ基が複数存在する場合は、前記式（Ｉａ）中に明示しているアミノ基は、いずれのアミノ基であっても良い。また、前記式（Ｉａ）で表すアミノ酸分子中にカルボキシ基が複数存在する場合は、前記式（Ｉａ）中に明示しているカルボキシ基は、いずれのカルボキシ基であっても良い。
本発明の人工sgRNAの前記リンカー領域（Ｘa）において、前記アミノ酸は、天然アミノ酸でも良いし、人工アミノ酸であっても良い。なお、本発明において、「天然アミノ酸」は、天然に存在する構造のアミノ酸またはその光学異性体をいう。前記天然アミノ酸の製造方法は特に限定されず、例えば、天然から抽出しても良いし、合成しても良い。また、本発明において、「人工アミノ酸」は、天然に存在しない構造のアミノ酸をいう。すなわち、前記人工アミノ酸は、アミノ酸すなわちアミノ基を含むカルボン酸誘導体（分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む有機化合物）であって、天然に存在しない構造のカルボン酸誘導体をいう。前記人工アミノ酸は、例えば、ヘテロ環を含まないことが好ましい。前記アミノ酸は、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸であっても良い。前記アミノ酸は、例えば、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β−アラニン、１−アミノ−２−カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸および下記化学式（Ｉａ２）で表されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種類であっても良く、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。また、前記化学式（Ｉａ）のアミノ酸またはペプチドに、光学異性体、幾何異性体、立体異性体等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体でも良い。
前記化学式（Ｉａ２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。また、前記化学式（Ｉａ２）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉａ３）であってもよい。
なお、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ２）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２）で表される。下記化学式（Ａ２）中のＲ１００は、前記化学式（Ｉａ２）中のＲ１００と同じである。また、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ３）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２ａ）で表される。
前記化学式（Ｉ）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）が例示でき、下記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）において、ｎおよびｍは、前記化学式（Ｉ）と同じである。
前記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）において、ｎおよびｍは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記化学式（Ｉ−１）においてｎ＝１１およびｍ＝１２、または、ｎ＝５およびｍ＝４（後記実施例のGly）と、前記化学式（Ｉ−４）においてｎ＝５およびｍ＝４（後記実施例のGlyGly）と、前記化学式（Ｉ−６）において、ｎ＝４およびｍ＝４（後記実施例のTP）と、前記化学式（１−７）においてｎ＝５およびｍ＝４（後記実施例のK）とがあげられる。それらの構造を、下記化学式（Ｉ−１ａ）、（Ｉ−１ｂ）、（Ｉ−４ａ）、（Ｉ−６ａ）および（Ｉ−７ａ）に示す。中でも、式（Ｉ−１ｂ）、（Ｉ−６ａ）および（Ｉ−７ａ）が好ましい。
あるいは、本発明の人工sgRNAにおいて、前記リンカー領域（Ｘa）は、下記式（ＩＩ）で表わされる。
前記式（ＩＩ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換れていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の整数であり；
ｎは、０〜３０の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（ＩＩ）であり、
前記Ｘａは、前記−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して隣接するヌクレオチド残基に結合する。
前記式（ＩＩ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（ＩＩ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
前記式（ＩＩ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
前記式（ＩＩ）中、Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
前記式（ＩＩ）中、Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記非ヌクレオチド構造の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
前記式（ＩＩ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
前記Ｘａは、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、隣接するヌクレオチド残基に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（ＩＩ）の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（ＩＩ）の構造の場合、Ｘａは、前記式（ＩＩ）の構造からなるアミノ酸誘導体残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（ＩＩ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（ＩＩ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。
隣接するヌクレオチド残基と、−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
隣接するヌクレオチド残基の3’末端は、−ＯＲ２−を介して、隣接するヌクレオチド残基の5’末端は、−ＯＲ１−を介して、前記式（ＩＩ）の構造と結合する。
条件（２）
隣接するヌクレオチド残基の3’末端は、−ＯＲ１−を介して、隣接するヌクレオチド残基の5’末端は、−ＯＲ２−を介して、前記式（ＩＩ）の構造と結合する。
前記式（ＩＩ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。
前記式（ＩＩ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。
Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基であってもよい。
前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」Prenum Press, London and New York, 1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、シリル含有基もあげられる。以下、同様である。
前記式（ＩＩ）の構造は、例えば、下記式（ＩＩ−１）〜式（ＩＩ−９）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（ＩＩ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。
前記式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（ＩＩ−１）において、ｎ＝８、前記（ＩＩ−２）において、ｎ＝３、前記式（ＩＩ−３）において、ｎ＝４または８、前記（ＩＩ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（ＩＩ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（ＩＩ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（ＩＩ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（ＩＩ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４（後記実施例のP）、ｎ＝７およびｍ＝６（後記実施例のP13）、ｎ＝９およびｍ＝８（後記実施例のP14）、またはｎ＝１１およびｍ＝１０（後記実施例のP15）、前記式（ＩＩ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（ＩＩ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（ＩＩ−４ａ）に、前記式（ＩＩ−８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（ＩＩ−８ａ）に示す。
本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１〜３０であり、好ましくは、１〜６または１〜４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等があげられる。
本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個または複数の二重結合を有してもよい。
本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１−ナフチルおよび２−ナフチル等のナフチル等があげられる。
本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２−フリル、３−フリル）、チエニル（例：２−チエニル、３−チエニル）、ピロリル（例：１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例：１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−４−イル）、テトラゾリル（例：１−テトラゾリル、２−テトラゾリル、５−テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル）、ピリジル（例：２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、ピリダジニル（例：３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル）、フラザニル（例：３−フラザニル）、ピラジニル（例：２−ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）、ベンゾフリル（例：２−ベンゾ［ｂ］フリル、−ベンゾ［ｂ］フリル、４−ベンゾ［ｂ］フリル、５−ベンゾ［ｂ］フリル、６−ベンゾ［ｂ］フリル、７−ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、４−ベンゾ［ｂ］チエニル、５−ベンゾ［ｂ］チエニル、６−ベンゾ［ｂ］チエニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１−ベンゾイミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル、５−ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリ二ル（例：２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、６−キノキサリニル）、シンノリニル（例：３−シンノリニル、４−シンノリニル、５−シンノリニル、６−シンノリニル、７−シンノリニル、８−シンノリニル）、キナゾリ二ル（例：２−キナゾリニル、４−キナゾリニル、５−キナゾリニル、６−キナゾリニル、７−キナゾリニル、８−キナゾリニル）、キノリル（例：２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、６−キノリル、７−キノリル、８−キノリル）、フタラジニル（例：１−フタラジニル、５−フタラジニル、６−フタラジニル）、イソキノリル（例：１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、６−イソキノリル、７−イソキノリル、８−イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２−プテリジニル、４−プテリジニル、６−プテリジニル、７−プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１−アクリジニル、２−アクリジニル、３−アクリジニル、４−アクリジニル、９−アクリジニル）、インドリル（例：１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、４−インドリル、５−インドリル、６−インドリル、７−インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１−フェナジニル、２−フェナジニル）またはフェノチアジニル（例：１−フェノチアジニル、２−フェノチアジニル、３−フェノチアジニル、４−フェノチアジニル）等があげられる。
本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３〜１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチルおよびビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１−アダマンチル、２−アダマンチル等があげられる。
本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包み、炭素数は、例えば、３〜７個である。前記基は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２−フェネチル、およびナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」または「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、ヒドロキシメチルおよび２−ヒドロキシエチル等があげられる。
本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル−Ｏ−基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、およびｎ−ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２−アミノエチル等があげられる。
本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、ピロリジノン、１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、１−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、ピペラジノン、２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２−ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチルおよびキノリン−３−イルメチル等があげられる。
本発明において、「シリル」は、式Ｒ３Ｓｉ−で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリールおよびシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレン等があげられる。
本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例：ｐ−メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。
あるいは、本発明の人工sgRNAにおいて、前記リンカー領域（Ｘa）は、下記式（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）のいずれかで表わされる。各式中、ｎおよびｍは、前記化学式（Ｉ）と同じである。
前記化学式（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）において、ｎおよびｍは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記化学式（ＩＩＩ−１）において、ｎ＝５およびｍ＝４（後記実施例のF）と、前記化学式（ＩＩＩ−２）においてｎ＝５およびｍ＝４（後記実施例のL）と、前記化学式（ＩＩＩ−３）において、ｎ＝５およびｍ＝４（後記実施例のE）とがあげられる。それらの構造を、下記化学式（ＩＩＩ−１ａ）、（ＩＩＩ−２ａ）および（ＩＩＩ−３ａ）に示す。
その構造を、下記化学式（ＩＩＩ−１ａ）、（ＩＩＩ−２ａ）及び（ＩＩＩ−３ａ）に示す。
本発明の人工sgRNAは、前記アミノ酸誘導体リンカー（Ｘａ）に加えて、天然型sgRNAの（１）ステム-ループ2のループ部分（GAAA）及び／又は（２）リンカー領域（UUAUC）を、前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸誘導体リンカー（Ｘｂ，Ｙ）に置換することができる。あるいは／それに加えて、天然型sgRNAの（３）5’末端及び／又は（４）3’末端近傍に、前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸誘導体リンカー（Ｘｃ，Ｘｄ）を付加及び／又は挿入することができる。
アミノ酸誘導体リンカーＸｂ、Ｙ、Ｘｃ及びＸｄは、それぞれ独立して、前記式（Ｉ）で表される任意のアミノ酸誘導体であり得るが、例えば、前記Ｘｂとしては、前記式（ＩＩ）で表されるプロリン誘導体リンカーが好ましく、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるプロリン誘導体リンカー（P）がより好ましい。
あるいは、前記Ｘｂとして、前記式（Ｉ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシン誘導体リンカー（Gly）、前記式（Ｉ−４）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシルグリシン誘導体リンカー（GlyGly）、前記式（Ｉ−６）で表わされ、該式中、ｎ＝４およびｍ＝４であるテレフタル酸誘導体リンカー（TP）、前記式（Ｉ−７）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるリシン誘導体リンカー（K）、（ＩＩＩ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるフェニルアラニン誘導体リンカー（F）、前記式（ＩＩＩ−２）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるロイシン誘導体リンカー（L）、前記式（ＩＩＩ−３）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグルタミン酸誘導体リンカー（E）もまた好ましい。
前記Ｙとしては、例えば、前記式（Ｉ−４）で表されるグリシルグリシン誘導体リンカーや、前記式（ＩＩ）で表されるプロリン誘導体リンカーが好ましく、前記式（Ｉ−４）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシルグリシン誘導体リンカー（GlyGly）や、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４（P）、ｎ＝７およびｍ＝６（P13）、ｎ＝９およびｍ＝８（P14）、またはｎ＝１１およびｍ＝１０（P15）であるプロリン誘導体リンカーがより好ましい。
あるいは、前記Ｙとして、前記式（Ｉ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシン誘導体リンカー（Gly）、前記式（Ｉ−６）で表わされ、該式中、ｎ＝４およびｍ＝４であるテレフタル酸誘導体リンカー（TP）、前記式（Ｉ−７）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるリシン誘導体リンカー（K）、（ＩＩＩ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるフェニルアラニン誘導体リンカー（F）、前記式（ＩＩＩ−２）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるロイシン誘導体リンカー（L）、前記式（ＩＩＩ−３）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグルタミン酸誘導体リンカー（E）もまた好ましい。
前記Ｘｃ及びＸｄとしては、例えば、それぞれ独立して、前記式（ＩＩ）で表されるプロリン誘導体リンカーであることが好ましく、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるプロリン誘導体リンカー（P）であることがより好ましい。
あるいは、前記Ｘｃ及びＸｄとして、前記式（Ｉ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシン誘導体リンカー（Gly）、前記式（Ｉ−４）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシルグリシン誘導体リンカー（GlyGly）、前記式（Ｉ−６）で表わされ、該式中、ｎ＝４およびｍ＝４であるテレフタル酸誘導体リンカー（TP）、前記式（Ｉ−７）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるリシン誘導体リンカー（K）、（ＩＩＩ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるフェニルアラニン誘導体リンカー（F）、前記式（ＩＩＩ−２）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるロイシン誘導体リンカー（L）、前記式（ＩＩＩ−３）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグルタミン酸誘導体リンカー（E）もまた好ましい。
好ましい一実施態様において、本発明の人工sgRNAは、天然型sgRNAのテトラループ部分のみを前記アミノ酸誘導体リンカー（Ｘａ）に置換したものであり得る。即ち、下式（Ａ）において、Ｘｂ及びＹは、1ないし5個の任意のヌクレオチド残基からなるヌクレオチドリンカーであり、Ｘｃ及びＸｄは存在しない。
Ｘｂ及びＹは、それぞれ天然型sgRNAのステム-ループ2のループ部分（GAAA）及びリンカー領域（UUAUC）のままであってもよいし、天然型sgRNAにおけるステム-ループ2及びリンカー領域の構造を保持する限り、他のヌクレオチドリンカーに置き換えることもできる。例えば、前記Ｙは、UUAUCからUのみに置換しても同等以上のDSB活性が得られることが報告されている。
別の好ましい実施態様においては、本発明の人工sgRNAは、天然型sgRNAのテトラループ部分に加えて、ステム-ループ2のループ部分（GAAA）が、前記アミノ酸誘導体リンカー、好ましくは、前記式（ＩＩ）で表されるプロリン誘導体リンカー、より好ましくは、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるプロリン誘導体リンカー（P）に置換したものである。
あるいは、ステム-ループ2のループ部分（GAAA）が、前記式（Ｉ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシン誘導体リンカー（Gly）、前記式（Ｉ−４）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシルグリシン誘導体リンカー（GlyGly）、前記式（Ｉ−６）で表わされ、該式中、ｎ＝４およびｍ＝４であるテレフタル酸誘導体リンカー（TP）、前記式（Ｉ−７）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるリシン誘導体リンカー（K）、（ＩＩＩ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるフェニルアラニン誘導体リンカー（F）、前記式（ＩＩＩ−２）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるロイシン誘導体リンカー（L）、又は前記式（ＩＩＩ−３）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグルタミン酸誘導体リンカー（E）に置換したものも、また好ましい。
天然型sgRNAのテトラループ部分に加えて、ステム-ループ2のループ部分（GAAA）が、前記アミノ酸誘導体リンカーに置換した本発明の人工sgRNAは、生体内での安定性改善効果により優れていると考えられ、しかも天然型sgRNAと同等以上の細胞内でのDNA切断活性を保持するので、in vivoゲノム編集のツールとして特に有用である。
さらに別の好ましい実施態様においては、本発明の人工sgRNAは、天然型sgRNAのテトラループ部分及びステム-ループ2のループ部分（GAAA）に加えて、リンカー領域（UUAUC）が、前記アミノ酸誘導体リンカー、好ましくは、前記式（Ｉ−４）で表されるグリシルグリシン誘導体リンカーや、前記式（ＩＩ）で表されるプロリン誘導体リンカー、より好ましくは、前記式（Ｉ−４）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシルグリシン誘導体リンカー（GlyGly）や、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４（P）、ｎ＝７およびｍ＝６（P13）、ｎ＝９およびｍ＝８（P14）、またはｎ＝１１およびｍ＝１０（P15）であるプロリン誘導体リンカーに置換したものである。
あるいは、リンカー領域（UUAUC）が、前記式（Ｉ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシン誘導体リンカー（Gly）、前記式（Ｉ−４）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシルグリシン誘導体リンカー（GlyGly）、前記式（Ｉ−６）で表わされ、該式中、ｎ＝４およびｍ＝４であるテレフタル酸誘導体リンカー（TP）、前記式（Ｉ−７）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるリシン誘導体リンカー（K）、（ＩＩＩ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるフェニルアラニン誘導体リンカー（F）、前記式（ＩＩＩ−２）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるロイシン誘導体リンカー（L）、又は前記式（ＩＩＩ−３）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグルタミン酸誘導体リンカー（E）に置換したものも、また好ましい。
但し、Cas9と組み合わせた場合の、細胞内でのDNA切断活性を考慮すると、本発明の人工sgRNAとしては、前記式（Ａ）中のＸａ、Ｘｂ及びＹが同時にアミノ酸誘導体リンカーに置換していないものが好ましい場合があり得る。
さらに別の好ましい実施態様においては、本発明の人工sgRNAは、天然型sgRNAのテトラループ部分に加えて、5’末端及び3’末端近傍に、前記アミノ酸誘導体リンカー、好ましくは、前記式（ＩＩ）で表されるプロリン誘導体リンカー、より好ましくは、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるプロリン誘導体リンカー（P）が、それぞれ付加及び挿入したものである。
あるいは、5’末端及び3’末端近傍に、前記式（Ｉ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシン誘導体リンカー（Gly）、前記式（Ｉ−４）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグリシルグリシン誘導体リンカー（GlyGly）、前記式（Ｉ−６）で表わされ、該式中、ｎ＝４およびｍ＝４であるテレフタル酸誘導体リンカー（TP）、前記式（Ｉ−７）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるリシン誘導体リンカー（K）、（ＩＩＩ−１）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるフェニルアラニン誘導体リンカー（F）、前記式（ＩＩＩ−２）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるロイシン誘導体リンカー（L）、又は前記式（ＩＩＩ−３）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるグルタミン酸誘導体リンカー（E）が、それぞれ付加及び挿入したものも、また好ましい。
天然型sgRNAのテトラループ部分に加えて、5’末端及び3’末端近傍に、前記アミノ酸誘導体リンカー、好ましくは、前記式（ＩＩ）で表されるプロリン誘導体リンカー、より好ましくは、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるプロリン誘導体リンカー（P）が、それぞれ付加及び挿入した本発明の人工sgRNAは、生体内での安定性改善や自然免疫応答の亢進による副作用軽減効果により優れていると考えられ、しかも天然型sgRNAと同等以上の細胞内でのDNA切断活性を保持するので、in vivoゲノム編集のツールとして特に有用である。
上述のように、2以上のアミノ酸誘導体リンカーが導入された上記いずれかの人工型sgRNAは、Ｘａのみにアミノ酸誘導体リンカーが導入された人工型sgRNAと同様に、Cas9と組み合わせた場合に、天然型sgRNAと同等もしくはそれ以上の、細胞内での標的二本鎖DNAの切断活性を有し得る。2以上のアミノ酸誘導体リンカーの導入によりsgRNAのヌクレアーゼ耐性がさらに向上し、生体内での安定性が改善され得る。尚、生体内での安定性の改善効果については、例えばin vitroにおいて、血清及び／又はヌクレアーゼに対する耐性試験を実施することにより確認することができる。
本発明の人工sgRNAには、前記式（Ａ）に示されるヌクレオチド配列だけでなく、該ヌクレオチド配列において、1ないし数個（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個）のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有し、かつ、Cas9と組み合わせた場合に、天然型sgRNAと同等もしくはそれ以上の標的二本鎖DNAの認識能（結合活性）を有するものも包含される。例えば、リピート領域とアンチリピート領域とのワトソン-クリック塩基対（UUUU/AAAA）をCCCC/GGGGに置き換えたり、ステム-ループ2のワトソン-クリック塩基対（ACUU/UGAA）をCGCC/GCGGに置換もしくは2塩基対を挿入（ACUUGA/UGAACU）しても、Cas9と組み合わせた場合のDSB活性の有意な低下は認めらず、また、リンカー領域（UUAUC）をUのみに短鎖化すると、DSB活性が有意に増大するとの報告がある。従って、sgRNAの特徴的なヘアピン構造が保持されるような変異を前記式（Ａ）のヌクレオチド配列に導入しても、本発明の人工sgRNAの作用効果は奏され得る。
本発明者らの検討によれば、天然型sgRNAに本発明のアミノ酸誘導体リンカーを何ら導入することなく、3’末端や、さらにtracrRNAのステム-ループ2及びリンカー領域を欠失した短鎖化sgRNAは、Cas9と組み合わせた場合のDSB活性が著しく低下する。その一方で、後述の試験例３に示すように、天然型sgRNAの、テトラループだけでなくそれに隣接するステムの1〜3塩基対、及び／又はステム-ループ2のループ部分だけでなくそれに隣接するステムの1-4塩基対をも、前記アミノ酸誘導体リンカー、好ましくは、前記式（ＩＩ）で表されるプロリン誘導体リンカー、より好ましくは、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるプロリン誘導体リンカー（P）に置換することにより、短鎖化sgRNAでも、天然型sgRNAには劣るものの十分なDSB活性を保持させることができる。
また、テトラループや、tracrRNAのステム-ループ2、リンカー領域、sgRNAの両末端を修飾せずとも、tracrRNAのステム-ループ1もしくはステム-ループ3のループ部分を、前記アミノ酸誘導体リンカー、好ましくは、前記式（ＩＩ）で表されるプロリン誘導体リンカー、より好ましくは、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるプロリン誘導体リンカー（P）に置換することによっても、Cas9と組み合わせた場合に、良好なDSB活性を保持させることができる。
従って、本発明はまた、以下の人工sgRNAを提供する。
（ａ）前記式（Ａ）で表されるsgRNAであって、
（ｉ）式中Ｘａが、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であり、かつＸａに隣接するステムの１〜３塩基対が欠失した、及び／又は
（ｉｉ）式中Ｘｂが、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であり、かつＸｂに隣接するステムの１〜４塩基対が欠失した、
該sgRNA。
（ｂ）前記式（Ａ）で表されるsgRNAであって、該式中、Ｘａ、Ｘｂ及びＹは１ないし５個の任意のヌクレオチドリンカーであり、Ｘｃ及びＸｄは存在せず、ステム-ループ1のループ部分（UA）もしくはステム-ループ3のループ部分（AGU）が、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４であるアミノ酸誘導体リンカーで置換されている、該sgRNA。
本発明の人工sgRNAを構成するヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびＵ（ウラシル）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
前記ヌクレオチド残基は、未修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基等があげられる。前記未修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または欠失、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｏｆ ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチド残基の代替物の残基であってもよい。
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾等があげられる。
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素またはフルオロ等に置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボース残基に置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体等があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチド残基の代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基等があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も近いリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、前記非結合原子における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）およびＮ（窒素）のいずれかの原子で置換されても良い。前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、およびＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明の人工sgRNAの５’末端ヌクレオチド残基および３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
本発明の人工sgRNAは、例えば、３’末端および５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端および５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加等があげられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子等があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基または前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、または、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加または置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、またはこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３または６が好ましい。
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
本発明の人工sgRNAは、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸化は、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’−ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基等があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ ジェー アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第６０／４６５，６６５号（出願日：２００３年４月２５日）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（出願日：２００４年３月８日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
本発明の人工sgRNAは、例えば、WO 2013/180038号に記載される方法により、アミノ酸誘導体リンカーをはじめとする非ヌクレオチド残基を介して任意の機能性分子が付加された修飾体とすることができる。
２．本発明の人工sgRNAの合成方法
本発明の人工sgRNAの合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。本発明の人工sgRNAについては、例えば、前記式（Ｉ）で表わされるリンカー領域の合成の際、後述する本発明のモノマーを使用することが好ましい。
３．本発明のモノマー
本発明のモノマーは、核酸合成用のモノマーであって、下記式（ＩＶ）の構造を有することを特徴とする。
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１、Ｌ２及びＡは前記式（Ｉ）と同義であり、Ｒ１１およびＲ２１は、それぞれ独立して、水素原子、保護基またはリン酸保護基である。）
Ｒ１１およびＲ２１において、保護基は、例えば、前記式（Ｉ）における説明と同様であり、具体例として、例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基、ＴＥＭ基、および、下記式（Ｐ１）または（Ｐ２）に示すシリル含有基（群Ｉ）があげられ、中でも、ＤＭｔｒ基および前記シリル含有基のいずれかであることが好ましい。
前記リン酸保護基は、例えば、下記式で表わすことができる。
−Ｐ（ＯＲ６）（ＮＲ７Ｒ８）
前記式において、Ｒ６は、水素原子または任意の置換基である。置換基Ｒ６は、例えば、炭化水素基が好ましく、前記炭化水素基は、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基Ｒ６は、例えば、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、および、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等の炭化水素等があげられ、さらに、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基Ｒ６は、具体的には、例えば、β−シアノエチル基、ニトロフェニルエチル基、メチル基等があげられる。
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ、水素原子または任意の置換基であり、同一でも異なっていてもよい。置換基Ｒ７およびＲ８は、例えば、炭化水素基が好ましく、前記炭化水素基は、さらに任意の置換基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。前記炭化水素基は、例えば、前述した前記Ｒ６での列挙と同様であり、好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基である。この場合、−ＮＲ７Ｒ８は、具体的には、例えば、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基等があげられる。または、置換基Ｒ７およびＲ８が一体となって、それらが結合する窒素原子とともに（すなわち、−ＮＲ７Ｒ８が一体となって）、窒素含有環（例えば、ピペリジル基、モルホリノ基等）を形成してもよい。
前記リン酸保護基の具体例としては、例えば、−P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2)、−P(OCH3)(N(i-Pr)2)等（群ＩＩ）があげられる。前記式において、i-Prは、イソプロピルを示す。
前記式（ＩＶ）において、例えば、Ｒ１１およびＲ２１は、いずれか一方が、水素原子または保護基であり、他方が、水素原子またはリン酸保護基である。例えば、Ｒ１１が、前記保護基の場合、Ｒ２１は、水素原子または前記リン酸保護基が好ましく、具体的には、Ｒ１１が、前記群Ｉから選択される場合、Ｒ２は、水素原子または前記群ＩＩから選択されることが好ましい。また、例えば、Ｒ１１が、前記リン酸保護基の場合、Ｒ２１は、水素原子または前記保護基が好ましく、具体的には、Ｒ１１が、前記群ＩＩから選択される場合、Ｒ２１は、水素原子または前記群Ｉから選択されることが好ましい。
本発明のモノマーとして、具体的には、例えばWO 2013/103146号等に記載されるモノマーや、下記式（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−３）で表されるモノマーが挙げられる。
（各式中、Ｒ１１およびＲ２１は、前記式（ＩＶ）と同義であり、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０〜３０の整数である。）
本発明のモノマーは、例えばWO 2013/103146号等に記載される方法や、後述の実施例に記載される方法により合成することができる。
４．CRISPR/Cas9システム
本発明はまた、上記本発明の人工sgRNAとCas9とを組み合わせてなる、CRISPR/Cas9システムを提供する。
本発明で使用されるCas9は、本発明の人工sgRNAと複合体を形成して、標的二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列とそれに隣接するproto-spacer adjacent motif（PAM）を認識し結合し得る限り、特に制限はないが、好ましくはStreptococcus pyogenes由来のCas9（SpCas9; PAM配列NGG(NはA、G、T又はC。以下同じ)）、本発明の人工sgRNAと複合体を形成し得る限り、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のCas9（StCas9; PAM配列NNAGAAW）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のCas9（MmCas9; PAM配列NNNNGATT）等を使用することもできるが、PAMによる制約が少ないSpCas9が特に好ましい（実質2塩基であり、理論上ゲノム上のほぼどこでも標的化することができる）。本発明で用いられるCas9としては、二本鎖DNAの両方の鎖を切断できる野生型Cas9に加え、一方の鎖の切断能を失活したニッカーゼ活性を有するもの（nCas9）も使用可能である。例えば、SpCas9の場合、10番目のAsp残基がAla残基に変換した、sgRNAと相補鎖を形成する鎖の反対鎖の切断能を欠くD10A変異体、あるいは、840番目のHis残基がAla残基で変換した、sgRNAと相補鎖を形成する鎖の切断能を欠くH840A変異体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、使用目的によっては、両方の鎖の切断能を欠く二重変異体（dCas9）を用いることもできる。dCas9やnCas9を用いる具体的な実施態様としては、例えば、dCas9/nCas9に転写調節因子やクロマチン修飾因子を融合させ、標的遺伝子の転写を制御したり、あるいは、蛍光タンパク質を融合させて標的遺伝子座を可視化（ライブイメージング）することなどが挙げられるが、それらに限定されない。
また、Cas9の代わりにCpf1を用いることもできる。Cpf1としては、例えば、フランシセラ・ノヴィシダ（Francisella novicida）由来のCpf1（FnCpf1; PAM配列NTT）、アシダミノコッカス sp.（Acidaminococcus sp.）由来のCpf1（AsCpf1;PAM配列NTTT）、ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）由来のCpf1（LbCpf1; PAM配列NTTT）等が挙げられるが、それらに限定されない。Cpf1の場合も同様に、一方もしくは両方の鎖の切断活性を欠く変異体を用いることもできる。例えば、FnCpf1の場合、917番目のAsp残基がAla残基（D917A）に、あるいは1006番目のGlu残基がAla残基（E1006A）に変換した、両方の鎖の切断能を欠く変異体（dCpf1）を用いることができる。
本発明のCRISPR/Cas9システムに使用されるCas9は、タンパク質の形態であってもよいし、それをコードするmRNAの形態であってもよい。あるいは、Cas9をコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。CRISPR/Cas9システムを無細胞系の酵素反応として行う場合、Cas9はタンパク質の形態で提供される。一方、細胞内の標的遺伝子の改変を目的とする場合、Cas9は、タンパク質、それをコードするmRNA、それをコードするDNAを含む発現ベクターのいずれの形態でも細胞内に導入され得る。
Cas9をコードするDNAは、例えば、当該タンパク質を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。変異Cas9は、クローン化されたCas9をコードするDNAに、自体公知の部位特異的変異誘発法を用いて、DNA切断活性に重要な部位のアミノ酸残基（例えば、Cas9の場合、10番目のAsp残基や840番目のHis残基が挙げられるが、これらに限定されない）を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。あるいはCas9をコードするDNAは、化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで、用いる宿主細胞での発現に適したコドン使用を有するDNAとして構築することもできる。例えば、SpCas9を真核細胞での発現のために最適化したCDS配列は周知である。
得られたCas9をコードするDNAは、宿主に応じて、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することができる。発現ベクターの導入は、宿主の種類に応じ、公知の方法（例えば、リゾチーム法、コンピテント法、PEG法、CaCl2共沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法など）に従って実施することができる。
本発明の人工sgRNA及びCas9は、好ましくは、ヌクレオフェクション法により宿主細胞に導入することができる。
細胞内に導入され（発現し）たsgRNAとCas9タンパク質とは複合体を形成し、標的配列に結合して標的遺伝子にDSBを生じさせる。該DSBは非相同的末端結合（NHEJ）によって修復されるが、その際に生じる偶発的な塩基の挿入・欠失（indel）によるフレームシフト変異によって標的遺伝子が破壊（ノックアウト）される。また、標的の相同配列を両端に有するドナーDNAを共導入することにより、相同組換え修復が起こり、塩基改変や遺伝子挿入（ノックイン）が可能となる。
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）sgRNAの合成
表１に示すsgRNAを、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（The ABI Expedite(R) 8909 Nucleic Acid Synthesis System，Applied Biosystems）により合成した。前記合成には、RNAアミダイトとしてEMMアミダイト（国際公開第2013/027843号）を用いた（以下同様）。前記アミダイトの脱保護は定法に従って行い、HPLCにより精製した。下記配列中、下線部は標的ヌクレオチド配列に相補的なガイド領域であり、Pにはプロリンジアミドアミダイトを、Kにはリジンジアミドアミダイトを、Xにはグリシルグリシンジアミドアミダイトをそれぞれ導入した。
（試験例１）KRAS遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性評価
ヒトKRAS遺伝子（GenBank accession No. NM_004985.3）のG12V変異を有する配列（NCBI Refference Sequence NP_0049762）を組み込んだプラスミドDNA（pCMV6-Entry-KRAS(G12V)，OriGene Technologies）を、制限酵素Tth111I（TaKaRa）と添付のプロトコールに従い反応させた。反応終了後定法に従い精製し、終濃度100 ng/μLとなるようにTEバッファー（10 mM Tris-HCl, pH8，1 mM EDTA）に溶解し基質DNAとした。
上記基質DNAを、Cas9 Nuclease, S. pyogenes （New England Biolabs）に添付の試薬を用いてsgRNAおよびCas9と以下のように混合した；
100 ng 基質DNA + 10 ng sgRNA + 0.3 pmol Cas9（全量10μL）
これを３７℃で３０分間インキュベーションした後、さらに７０℃で１０分間インキュベーションしCas9を失活させた。その後電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後ゲルイメージングシステムPXi4（SYNGENE社）を用いバンド強度を測定した。
測定結果を基に、下記の等式により 切断効率を算出した。
Cleavage Efficiency=sum of cleaved band intensities/(sum of the cleaved and uncleaved band intensities)
結果を図１に示す。いずれの人工sgRNAも、天然型sgRNA（SG-0001）と同等の切断効率を示した。
（試験例２）BCL-2遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性評価
ヒトBCL-2遺伝子（GenBank accession No. NM_000633）を組み込んだプラスミドDNA（pCAGGS-hbcl-2，Iwahashi et.al., Nature, vol 390,pp414-417, 1997）を、制限酵素HindIII（TaKaRa）と添付のプロトコールに従い反応させた。反応終了後定法に従い精製し、終濃度100 ng/μLとなるようにTEバッファー（10 mM Tris-HCl, pH8，1 mM EDTA）に溶解し基質DNAとした。
上記基質DNAを、Cas9 Nuclease, S. pyogenes （New England Biolabs）に添付の試薬を用いてsgRNAおよびCas9と以下のように混合した；
100 ng 基質DNA + 10 ng sgRNA + 0.3 pmol Cas9（全量10μL）
これを３７℃で３０分間インキュベーションした後、さらに７０℃で１０分間インキュベーションしCas9を失活させた。その後電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後ゲルイメージングシステムPXi4（SYNGENE社）を用いバンド強度を測定した。
測定結果を基に、下記の等式により 切断効率を算出した。
Cleavage Efficiency=sum of cleaved band intensities/(sum of the cleaved and uncleaved band intensities)
結果を図２に示す。いずれの人工sgRNAも、天然型sgRNA（SG-0017）と同等もしくはそれ以上の切断効率を示した。
（実施例２）フェニルアラニンアミダイト：化合物（５）の合成
下記スキームに従い、化合物（５）を合成した。
［〔１〕化合物（１）の合成］
Fmoc-フェニルアラニン（3.0 g, 7.7 mmol）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(EDC)（1.78 g, 9.3 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(HOBt)（2.51 g, 18.6 mmol）のアセトニトリル溶液（100 mL）に、4-アミノ-1-ブタノール（0.83 g, 9.3 mmol）を加えて室温で一晩撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去した。残渣にジクロロメタンを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄した。洗浄した有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮し、目的化合物（１）の粗生成物（4.1 g）を得た。
［〔２〕化合物（２）の合成］
化合物（１）（4.1 g, 8.9 mmol）をピリジンで共沸し、真空乾燥させた。ピリジン（80 mL）に溶解させ、4,4’-ジメトキシトリチルクロライド（4.54 g, 13.4 mmol）を加えて室温にて一晩撹拌した。反応終了後、メタノールを加えて３０分間撹拌し、減圧下溶媒留去した。残渣に酢酸エチルを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄した。洗浄した有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮し、目的化合物（２）の粗生成物（9.8 g）を得た。
［〔３〕化合物（３）の合成］
化合物（２）（9.8 g, 12.9 mmol）にN,N-ジメチルホルムアミド（50 mL）及びピペリジン（8.9 mL）を室温で加え、室温で一晩撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１、0.05%ピリジン含有）で精製し、目的化合物（３）（3.1 g, 3段階収率74%）を得た。
［〔４〕化合物（４）の合成］
化合物（３）（3.1 g, 5.8 mmol）をピリジンで共沸し、真空乾燥させた。アルゴン雰囲気下で6-ヒドロキシヘキサン酸（0.91 g, 6.9 mmol）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(EDC)（1.32 g, 6.9 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(HOBt)（1.87 g, 13.8 mmol）、及びジクロロメタン（40 mL）を室温で加え、10分間撹拌した後、トリエチルアミン（2.1 g, 20.7 mmol）を加え、室温で一晩撹拌した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水で２回、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。洗浄した有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２、０．０５％ピリジン含有）で精製し、目的化合物（４）（2.0 g, 収率53 %）を得た。以下に、化合物（４）の機器分析値を示す。
化合物（４）：
1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ: 7.41-7.39(2H, m), 7.30-7.16(12H, m), 6.84-6.80(4H, m), 6.26(1H, d, J=7.4Hz), 5.71-5.69(1H, m), 4.57-4.52(1H, m), 3.79(6H, s), 3.64-3.58(2H, m), 3.18-3.15(1H, m), 3.09-2.93(5H, m), 2.19-2.16(2H, m), 1.64-1.58(2H, m), 1.56-1.50(2H, m), 1.46-1.39(4H, m), 1.36-1.30(2H, m).
［〔５〕化合物（５）の合成］
化合物（４）（2.0 g, 3.1 mmol）をピリジンで共沸し、真空乾燥させた。つぎに、アセトニトリル（4 mL)とジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（0.63 g, 3.7 mmol）を加え、さらに２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（1.1 g, 3.7 mmol）を加え、４０℃にて２時間撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去し、酢酸エチルを加えて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回ずつ洗浄した。洗浄した有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、０．１％トリエチルアミン含有）で精製し、目的化合物（５）（2.4 g, 純度97.5%, 収率92%）を得た。
化合物（５）の機器分析値を示す。
化合物（５）：
1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ: 7.41-7.40(2H, m), 7.33-7.16(12H, m), 6.86-6.80(4H, m), 6.28(1H, d, J=7.7 Hz), 5.77(1H, t, J=6.0 Hz), 4.58-4.54(1H, m), 3.87-3.80(1H, m), 3.79-3.74(1H, m), 3.78(6H, s), 3.67-3.53(4H, m), 3.21-3.15(1H, m), 3.10-2.94(5H, m), 2.62(2H, t, J=6.4 Hz), 2.18-2.12(2H, m), 1.64-1.55(4H, m), 1.46-1.39(4H, m), 1.36-1.31(2H, m), 1.17(12H, m).
31P-NMR (202 MHz, CDCl3) δ: 147.95, 147.91
ESI-Mass:871.49 [M+H2O+H]+
（実施例３）ロイシンアミダイト：化合物（１０）の合成
下記スキームに従い、化合物（１０）を合成した。
［〔１〕化合物（６）の合成］
Fmoc-ロイシン（3.0 g, 8.5 mmol）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(EDC)（1.95 g, 10.2 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(HOBt)（2.75 g, 20.4 mmol）のアセトニトリル溶液（90 mL）に、4-アミノ-1-ブタノール（0.91 g, 10.2 mmol）を加えて室温で一晩撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去した。残渣にジクロロメタンを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄した。洗浄した有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮し、目的化合物（６）の粗生成物（4.42 g）を得た。
［〔２〕化合物（７）の合成］
化合物（６）（4.42 g, 10.4 mmol）をピリジンで共沸し、真空乾燥させた。ピリジン（80 mL）に溶解させ、4,4’-ジメトキシトリチルクロライド（5.29 g, 15.6 mmol）を加えて室温にて一晩撹拌した。反応終了後、メタノールを加えて３０分間撹拌し、減圧下溶媒留去した。残渣に酢酸エチルを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄した。洗浄した有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮し、目的化合物（７）の粗生成物（9.51 g）を得た。
［〔３〕化合物（８）の合成］
化合物（７）（9.51 g, 13.1 mmol）にN,N-ジメチルホルムアミド（40 mL）及びピペリジン（9.0 mL）を室温で加え、室温で一晩撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝３０：１、0.05%ピリジン含有、およびクロロメタン：メタノール＝４０：１、0.05%ピリジン含有）で精製し、目的化合物（８）（3.89 g, 3段階収率91%）を得た。
［〔４〕化合物（９）の合成］
化合物（８）（3.89 g, 7.7 mmol）をピリジンで共沸し、真空乾燥させた。アルゴン雰囲気下で6-ヒドロキシヘキサン酸（1.22 g, 9.2 mmol）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(EDC)（1.77 g, 9.2 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(HOBt)（2.50 g, 18.5 mmol）、及びジクロロメタン（50 mL）を室温で加え、10分間撹拌した後、トリエチルアミン（2.81 g, 27.7 mmol）を加え、室温で一晩撹拌した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水で２回、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。洗浄した有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：４、０．０５％ピリジン含有）で精製し、目的化合物（９）（3.80 g, 収率80 %）を得た。以下に、化合物（９）の機器分析値を示す。
化合物（９）：
1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ: 7.42-7.41(2H, m), 7.31-7.27(6H, m), 7.21-7.18(1H, m),6.83-6.80(4H, m), 6.21(1H, t, J=5.7 Hz), 6.05(1H, d, J=8.3 Hz), 4.41-4.36(1H, m), 3.78(6H, s), 3.64-3.59(2H, m), 3.31-3.15(2H, m), 3.06(2H, t, J=6.0 Hz), 2.20(2H, t, J=7.4 Hz), 1.78(1H, t, J=5.5 Hz), 1.68-1.47(10H, m), 1.40-1.34(2H, m), 0.93-0.91(6H, m).
［〔５〕化合物（１０）の合成］
化合物（９）（3.80 g, 6.1 mmol）をピリジンで共沸し、真空乾燥させた。つぎに、アセトニトリル（7.6 mL)とジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（1.26 g, 7.4 mmol）を加え、さらに２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（2.22 g, 7.4 mmol）を加え、４０℃にて２時間撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去し、酢酸エチルを加えて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回ずつ洗浄した。洗浄した有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、０．１％トリエチルアミン含有）で精製し、目的化合物（１０）（4.80 g, 純度97.5%, 収率95.4%）を得た。以下に、化合物（１０）の機器分析値を示す。
化合物（１０）：
1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ: 7.42-7.40(2H, m), 7.31-7.26(6H, m), 7.21-7.18(1H, m), 6.83-6.81(4H, m), 6.29(1H, t, J=5.6 Hz), 6.09(1H, d, J=8.5 Hz), 4.42-4.37(1H, m), 3.87-3.74(2H, m), 3.78(6H, s), 3.68-3.51(4H, m), 3.29-3.23(1H, m), 3.19-3.14(1H, m), 3.06(2H, t, J=5.7 Hz), 2.62(2H, t, J=6.2 Hz), 2.19(2H, t, J=8.0 Hz), 1.69-1.50(8H, m), 1.40-1.35(2H, m), 1.30-1.21(2H, m), 1.17(12H, m), 0.94-0.91(6H, m).
31P-NMR (202 MHz, CDCl3) δ: 147.95
ESI-Mass:841.47 [M+Na]+
（実施例４）グルタミン酸アミダイト：化合物（１５）の合成
下記スキームに従い、化合物（１５）を合成した。
［〔１〕化合物（１１）の合成］
６−ヒドロキシヘキサン酸（1.00 g, 7.6 mmol）とジメチルアミノピリジン(DMAP)（92 mg, 0.8 mmol）のピリジン溶液（25 ml）に4,4’-ジメトキシトリチルクロライド（2.6 g, 7.6 mmol）を加えて室温にて５時間撹拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認した後、メタノールを加えて３０分間撹拌した。減圧下溶媒留去し、ジクロロメタンを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で３回洗浄、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮し、ヘキサンを用いてトリチュレーションを行った。減圧乾燥し、油状粗生成物を得た。その油状粗生成物にジクロロメタン（32 mL）を加え、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(EDC)（2.48 g, 13.0 mmol）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（1.49 g, 13.0 mmol）を加えて室温にて一晩撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去し、酢酸エチルを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で３回洗浄、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去し、目的化合物（１１）の粗生成物（3.40 g）を得た。
［〔２〕化合物（１２）の合成］
Boc-グルタミン酸(OMe)（2.0 g, 7.7 mmol）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(EDC)（1.76 g, 9.2 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(HOBt)（2.48 g, 18.4 mmol）のアセトニトリル溶液（40 mL）に、4-アミノ-1-ブタノール（0.82 g, 9.2 mmol）を加えて室温で一晩撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去した。残渣にジクロロメタンを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄した。洗浄した有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮し、目的化合物（１２）の粗生成物（2.30 g）を得た。
［〔３〕化合物（１３）の合成］
化合物（１２）（2.30 g, 6.9 mmol）に1,4-ジオキサン（23 ml）を加え溶解し、０℃で塩酸（2.3 ml）を加え、室温に戻して30分間撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去し、イソプロピルエーテルを用いてトリチュレーションを行い減圧乾燥させ、目的化合物（１３）の粗生成物（2.06 g）を得た。
［〔４〕化合物（１４）の合成］
化合物（１３）（0.93 g, 4.0 mmol）のＤＭＦ溶液（9 ml）にトリエチルアミン（0.61 g, 6.0 mmol）、化合物（１１）（2.34 g, 4.4 mmol）のＤＭＦ溶液（9 ml）を加えて室温で一晩撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去し、残渣にジクロロメタンを加え、飽和食塩水で３回洗浄した。洗浄した有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル、０．０５％ピリジン含有）で精製した。この反応を２回行い目的化合物（１４）（0.85 g）を得た。以下に、化合物（１４）の機器分析値を示す。
化合物（１４）：
1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ: 7.43-7.41(2H, m), 7.32-7.26(6H, m), 7.21-7.18(1H, m), 6.87-6.85(1H, m), 6.83-6.80(4H, m), 6.51(1H, d,J=7.3 Hz), 4.43-4.38(1H, m), 3.79(6H, s), 3.67(3H, s), 3.63(2H, d, J=6.1 Hz), 3.28-3.25(2H, m), 3.02(2H, t, J=6.6 Hz), 2.54-2.48(1H, m), 2.38-2.32(1H, m), 2.20-2.17(2H, m), 2.14-2.07(1H, m), 1.96-1.89(1H, m), 1.64-1.53(8H, m), 1.40-1.34(2H, m)
［〔５〕化合物（１５）の合成］
化合物（１４）（0.85 g, 1.3 mmol）をピリジンで共沸し、真空乾燥させた。つぎに、アセトニトリル（2.5 mL)とジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（0.27 g, 1.6 mmol）を加え、さらに２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.47 g, 1.6 mmol）を加え、室温にて２時間撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去し、酢酸エチルを加えて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回ずつ洗浄した。洗浄した有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２、０．１％トリエチルアミン含有）で精製し、目的化合物（１５）（0.95 g, 純度92.%, 収率86.4%）を得た。以下に、化合物（１５）の機器分析値を示す。
化合物（１５）：
1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ: 7.43-7.41(2H, m), 7.32-7.26(6H, m), 7.21-7.17(1H, m), 6.83-6.80(4H, m), 6.63-6.60(1H, m), 6.47(1H, d,J=7.4 Hz), 4.44-4.40(1H, m), 3.88-3.82(1H, m), 3.80-3.75(1H, m), 3.78(6H, s), 3.71-3.67(1H, m), 3.66(3H, s), 3.64-3.55(3H, m), 3.31-3.21(2H, m), 3.03(2H, t, J=6.4 Hz), 2.64(2H, t, J=6.4 Hz), 2.53-2.47(1H, m), 2.38-2.32(1H, m), 2.18(2H, t, J=7.5 Hz), 2.14-2.07(1H, m), 1.96-1.89(1H, m), 1.64-1.56(8H, m), 1.41-1.34(2H, m), 1.19-1.16(12H, m).
31P-NMR (202 MHz, CDCl3) δ: 147.89
ESI-Mass:867.49 [M+H2O+H]+
（実施例５）プロリンアミダイト：化合物（５ａ−ｃ）の合成
下記スキームに従い、化合物（５ａ−ｃ）を合成した。
［〔１〕化合物（１ａ）の合成］
Fmoc-L-プロリン(3.0 g、8.9 mmol）を脱水N，N-ジメチルホルムアミド(50 mL)に溶かした。6-アミノ-1-ヘキサノール(1.3 g、1.2eq）および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(2.0 ｇ、1.2eq）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（3.3ｇ、2.4eq）を加え、アルゴン雰囲気下、室温にて終夜撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（20：1））に付し、目的物質を2.9 g（収率 75 %）得た。
1H-NMR（CDCl3）： δ7.76-7.83（m，2H）、7.50-7.63（m，2H）、7．38-7.43 （m，2H）、7.27-7.34（m，2H），4.54-4.35（m，2H），4.13-4.35（m，2H），3.54-3.63（m，2H）、3.35-3.54（m，2H）、3.17―3.28（m，2H）、1.82-2.07（m，3H）、1.21-1.59（m，9H）
［〔２〕化合物（２ａ）の合成］
脱水ピリジンを用いて、化合物1a (2.9 g, 6.6 mmol)を共沸乾燥した。残渣を脱水ピリジン(40 mL)に溶かした。0℃にて4,4-ジメトキシトリチルクロリド（DMTrCl） (2.7 g, 1.2 eq.) を加えて室温にて終夜撹拌した。TLCにて原料の消失を確認後、メタノールを加えて30分撹拌した。減圧下にて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。減圧乾燥し、油状物質を5.0 g得た。
［〔３〕化合物（３ａ）の合成］
化合物2a (5.0g, 6.6 mmol)を脱水N,N-ジメチルホルムアミド（40 mL）に溶かした。ピぺリジン(6.5 mL)を加え、アルゴン雰囲気下、室温にて終夜撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（20：1）、0.05% ピリジン）に付し、目的物質を2.6 g（収率 76 %、2段階）得た。
1H-NMR（CDCl3）：δ7.44-7.49（m，2H）、7.28-7.38（m, 6H）、7.20-7.26（m, 1H）、6.83-6.88（m，4H）、3.83（s，6H）、3.70（dd，1H，J=9.2Hz，5.2Hz）、3.20（q, 2H，J=6.9Hz）、3.03（t，2H, J=6.6Hz）、2.97-3.00（m，1H）、2.86-2.93（m，1H）、2.10-2.21（m，1H）、1.58-1.97（m，5H）、1．25-1.57（m，6H）
［〔４〕化合物（４ａ）の合成］
化合物3a (2.5 g、4.8 mmol）をN,N-ジメチルホルムアミド (15 mL)に溶かした。8-ヒドロキシオクタン酸 (0.93 g、1.2eq)および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（1.1 g、1.2eq）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.8 g、2.4eq) をN,N-ジメチルホルムアミド (15 mL)に溶かした。0℃で化合物3aのN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加え、アルゴン雰囲気下、室温にて終夜撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（40：1）、0.05% ピリジン）に付し、目的物質を2.1 g（収率 71 %）得た。
1H-NMR（CDCl3）：δ7.42-7.46（m，2H）、7.26-7.36（m, 6H）、7.16-7.24（m, 1H）、6.81-6.86（m，4H）、3.79（s，6H）、3.58-3.66（m，2H）、3.49-3.56（m，1H）、3.37-3.44（m，1H）、3.10-3.27（m，1H）、3.01 (2H, t, J = 6.6 Hz)、2.29-2.35（m，2H）、1.42-1.71（m，10H）、1.21-1.41（m，12H）
［〔５〕化合物（５ａ）の合成］
共沸乾燥した化合物4a (2.0 g, 2.6 mmol) のアセトニトリル溶液 (8 mL) に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(DIPAT) (0.64 g, 1.2 eq.)を加えた。2-シアノエトキシ-Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト (1.1 g, 1.2 eq.) のアセトニトリル溶液 (2 mL)を加え、室温にて2時間撹拌した。ジクロロメタンを加えて飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：n-ヘキサン−酢酸エチル（1：1）、0.1 %トリエチルアミン）に残渣を付し、目的物質を2.1 g（収率81%）得た。
31P-NMR (CDCl3) : δ＝147.821
ESI-Mass m/z：877.55 [M+H2O+H]+, 960.66 [M+TEA+H]+
［〔６〕化合物（１ｂ）の合成］
Fmoc-L-プロリン(3.0 g、8.9 mmol）を脱水N，N-ジメチルホルムアミド(60mL)に溶かした。8-アミノ-1-オクタノール(1.5 g、1.2eq）および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(2.0 ｇ、1.2eq）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（3.3ｇ、2.4eq）を加え、アルゴン雰囲気下、室温にて終夜撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（20：1））に付し、目的物質を3.0 g（収率 73 %）得た。
1H-NMR（CDCl3）： δ7.76-7.83（m，2H）、7.50-7.64（m，2H）、7.39-7.45（m，2H）、7.30-7.36（m，2H），4.58-4.37（m，2H），4.16-4.37（m，2H），3.57-3.65（m，2H）、3.38-3.57（m，2H）、3.10-3.30（m，2H）、1.82-2.07（m，3H）、1.21-1.59（m，13H）
［〔７〕化合物（２ｂ）の合成］
脱水ピリジンを用いて、化合物1b (3.0 g, 6.5 mmol)を共沸乾燥した。残渣を脱水ピリジン(40 mL)に溶かした。0℃にて4,4-ジメトキシトリチルクロリド（DMTrCl） (2.6 g, 1.2 eq.) を加えて室温にて終夜撹拌した。TLCにて原料の消失を確認後、メタノールを加えて30分撹拌した。減圧下にて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。減圧乾燥し、油状物質を5.0 g得た。
［〔８〕化合物（３ｂ）の合成］
化合物2b (5.0g, 6.5mmol)を脱水N,N-ジメチルホルムアミド（40 mL）に溶かした。ピぺリジン(6.4 mL)を加え、アルゴン雰囲気下、室温にて終夜撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（15：1）、0.05% ピリジン）に付し、目的物質を2.9 g（収率 83 %、2段階）得た。
1H-NMR（CDCl3）：δ7.43-7.47（m，2H）、7.26-7.37（m, 6H）、7.18-7.23（m, 1H）、6.81-6.86（m，4H）、3.80（s，6H）、3.71（dd，1H，J=9.2Hz，5.2Hz）、3.21（q, 2H，J=6.9Hz）、2.97-3.06（m，3H）、2.85-2.91（m，1H）、2.09-2.18（m，1H）、1.87-1.96（m，1H）、1.66-1.74（m，2H）、1.57-1.65（m，2H）、1.44-1.52（m，2H）、1.22-1.38（m，8H）
［〔９〕化合物（４ｂ）の合成］
化合物3b (2.8 g、5.1 mmol）を脱水ジクロロメタン(40 mL)に溶かした。10-ヒドロキシデカン酸(1.2 g、1.2eq)および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（1.2 g、1.2eq）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.9g、2.4eq)、トリエチルアミン (2.6 mL) を加え、アルゴン雰囲気下、室温にて終夜撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（20：1）、0.05% ピリジン）に付し、目的物質を2.5 g（収率 70 %）得た。
1H-NMR（CDCl3）：δ7.41-7.45（m，2H）、7.25-7.35（m, 6H）、7.16-7.21（m, 1H）、6.79-6.85（m，4H）、3.79（s，6H）、3.58-3.65（m，2H）、3.48-3.54（m，1H）、3.36-3.43（m，1H）、3.11-3.22（m，1H）、3.01 (2H, t, J = 6.6 Hz)、2.26-2.32（m，2H）、1.50-1.68（m，8H）、1.39-1.49（m，2H）1.19-1.38（m，20H）
［〔１０〕化合物（５ｂ）の合成］
共沸乾燥した化合物4b (2.4 g, 3.4 mmol) のアセトニトリル溶液 (8 mL) に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(DIPAT) (0.69 g, 1.2 eq.)を加えた。2-シアノエトキシ-Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト (1.2 g, 1.2 eq.) のアセトニトリル溶液 (2 mL)を加え、室温にて2時間撹拌した。ジクロロメタンを加えて飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：n-ヘキサン−酢酸エチル（1：1）、0.1 %トリエチルアミン）に残渣を付し、目的物質を2.4 g（収率80%）得た。
31P-NMR (CDCl3) : δ＝147.810
ESI-Mass m/z：937.56 [M+Na]+, 1016.70 [M+TEA+H]+
［〔１１〕化合物（１ｃ）の合成］
Fmoc-L-プロリン(3.0 g、8.9 mmol）を脱水アセトニトリル (75 mL)と脱水N,N-ジメチルホルムアミド（15 mL）の混合溶媒に溶かした。10-アミノ-1-デカノール (1.8 g、1.2eq）およびN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド (2.2 ｇ、1.2eq）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（3.3ｇ、2.4eq）を加え、アルゴン雰囲気下、室温にて終夜撹拌した。反応終了後沈殿物をろ別し、ろ液を減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。ジイソプロピルエーテルを用いてトリチレーションを行った。減圧乾燥し、固体物質を4.0 g（収率 93 %）得た。
1H-NMR（CDCl3）： δ7.72-7.78（m，2H）、7.50-7.62（m，2H）、7.35-7.42（m，2H）、7.26-7.33（m，2H），4.54-4.33（m，2H），4.12-4.33（m，2H），3.57-3.62（m，2H）、3.34-3.54（m，2H）、3.06-3.26（m，2H）、1.80-2.04（m，3H）、1.13-1.47（m，17H）
［〔１２〕化合物（２ｃ）の合成］
脱水ピリジンを用いて、化合物1c (3.9 g, 8.0 mmol)を共沸乾燥した。残渣を脱水ピリジン(50 mL)に溶かした。0℃にて4,4-ジメトキシトリチルクロリド（DMTrCl） (3.2 g, 1.2 eq.) を加えて室温にて終夜撹拌した。TLCにて原料の消失を確認後、メタノールを加えて30分撹拌した。減圧下にて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。減圧乾燥し、油状物質を6.2 g得た。
［〔１３〕化合物（３ｃ）の合成］
化合物2c (6.2g, 7.8 mmol)を脱水N,N-ジメチルホルムアミド（50 mL）に溶かした。ピぺリジン(7.7 mL)を加え、アルゴン雰囲気下、室温にて終夜撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（15：1）、0.05% ピリジン）に付し、目的物質を3.4 g（収率 76 %、2段階）得た。
1H-NMR（CDCl3）：δ7.38-7.42（m，2H）、7.21-7.31（m, 6H）、7.13-7.18（m, 1H）、6.75-6.80（m，4H）、3.79（s，6H）、3.72（dd，1H，J=9.2Hz，5.7Hz）、3.21（q, 2H，J=6.9Hz）、2.98-3.03（m，3H）、2.80-2.88（m，1H）、2.05-2.15（m，1H）、1.83-1.91（m，1H）、1.66-1.74（m，2H）、1.52-1.59（m，2H）、1.38-1.48（m，2H）、1.16-1.34（m，12H）
［〔１４〕化合物（４ｃ）の合成］
化合物3c (2.4 g、4.2 mmol）をN,N-ジメチルホルムアミド (20 mL)に溶かした。12-ヒドロキシドデカン酸 (1.1 g、1.2eq)および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（0.96 g、1.2eq）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.5g、2.4eq) をN,N-ジメチルホルムアミド (20 mL)に溶かした。0℃で化合物3cのN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加え、アルゴン雰囲気下、室温にて終夜撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：n-ヘキサン−酢酸エチル（1：3）、0.05% ピリジン）に付し、目的物質を2.1 g（収率 66 %）得た。
1H-NMR（CDCl3）：δ7.41-7.45（m，2H）、7.25-7.34（m, 6H）、7.17-7.22（m, 1H）、6.79-6.83（m，4H）、3.79（s，6H）、3.58-3.67（m，2H）、3.47-3.56（m，1H）、3.35-3.44（m，1H）、3.09-3.29（m，1H）、3.02 (2H, t, J = 6.6 Hz)、2.25-2.35（m，2H）、1.53-1.65（m，9H）、1.18-1.39（m，29H）
［〔１５〕化合物（５ｃ）の合成］
共沸乾燥した化合物4c (2.0 g, 2.6 mmol) のアセトニトリル溶液 (8 mL) に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(DIPAT) (0.53 g, 1.2 eq.)を加えた。2-シアノエトキシ-Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト (0.94 g, 1.2 eq.) のアセトニトリル溶液 (2 mL)を加え、室温にて2時間撹拌した。ジクロロメタンを加えて飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：n-ヘキサン−酢酸エチル（1：1）、0.1 %トリエチルアミン）に残渣を付し、目的物質を1.9 g（収率76%）得た。
31P-NMR (CDCl3) : δ＝147.821
ESI-Mass m/z：989.67 [M+H2O+H]+, 1072.78 [M+TEA+H]+
（実施例６）sgRNAの合成
実施例２〜５で合成した化合物５、１０、１５、５ａ、５ｂ及び５ｃと、自体公知のプロリンジアミドアミダイト、リジンジアミドアミダイト、グリシンジアミドアミダイト、テレフタル酸ジアミドアミダイト、及びグリシルグリシンジアミドアミダイトを用いて、実施例１と同様の方法で、表２−１〜表４に示すsgRNAを合成した。下記配列中、下線部は標的ヌクレオチド配列に相補的なガイド領域であり、、アミノ酸誘導体リンカーは表５に記載の通り、略称で示している。
（試験例３）KRAS遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性評価-2
ヒトKRAS遺伝子（GenBank accession No. NM_004985.3）のG12V変異を有する配列（NCBI Refference Sequence NP_0049762）を組み込んだプラスミドDNA（pCMV6-Entry-KRAS(G12V)，OriGene Technologies）を、制限酵素Tth111I（TaKaRa）と添付のプロトコールに従い反応させた。反応終了後定法に従い精製し，終濃度100 ng/μLとなるようにTEバッファー（10 mM Tris-HCl, pH8，1 mM EDTA）に溶解し基質DNAとした。
上記基質DNAを、Cas9 Nuclease, S. pyogenes （New England Biolabs）に添付の試薬を用いてsgRNAおよびCas9と以下のように混合した；
100 ng 基質DNA + 0.5 ng sgRNA + 0.3 pmol Cas9（全量10μL）
３７℃で１５分間インキュベーションした後、さらに７０℃で１０分間インキュベーションしCas9を失活させた。その後電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後ゲルイメージングシステムPXi4（SYNGENE社）を用いバンド強度を測定した。
測定結果を基に、下記の等式により切断効率を算出した。
Cleavage Efficiency=sum of cleaved band intensities/(sum of the cleaved and uncleaved band intensities)
その結果を図３〜６に示す。ゲル下の数値は上記計算式により求めた切断効率を表している。さらに、参考例である天然型sgRNA（SG-0001）の切断効率を１としたときの本実施例の人工sgRNAの相対切断効率を図７に示した。
本実施例の人工sgRNAの多くは、参考例である天然型sgRNAと同等以上の切断効率を示し、各部位のアミノ酸誘導体による置換が有効であることがわかった。
（試験例４）BCL-2遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性評価-2
ヒトBCL-2遺伝子（GenBank accession No. NM_000633）を組み込んだプラスミドDNA（pCAGGSHB2）を、制限酵素HindIII（TaKaRa）と添付のプロトコールに従い反応させた。反応終了後定法に従い精製し、終濃度100 ng/μLとなるようにTEバッファー（10 mM Tris-HCl, pH8，1 mM EDTA）に溶解し基質DNAとした。
上記基質DNAを、Cas9 Nuclease, S. pyogenes （NewEnglandBiolabs）に添付の試薬を用いてsgRNAおよびCas9と以下のように混合した；
100 ng 基質DNA + 10 ng sgRNA + 0.3 pmol Cas9 （全量10μL）
３７℃で３０分間インキュベーションした後、さらに７０℃で１０分間インキュベーションしCas9を失活させた。その後電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後ゲルイメージングシステムPXi4（SYNGENE社）を用いバンド強度を測定した。
測定結果を基に、下記の等式により切断効率を算出した。
Cleavage Efficiency=sum of cleaved band intensities/(sum of the cleaved and uncleaved band intensities)
その結果を図８に示す。ゲル下の数値は上記計算式により求めた切断効率を表している。さらに、参考例である天然型sgRNA（SG-0017）の切断効率を１としたときの本実施例の人工sgRNAの相対切断効率を図９に示した。
本実施例の人工sgRNAは、参考例である天然型sgRNAと同等以上の切断効率を示し、各部位のアミノ酸誘導体による置換が有効であることがわかった。
（試験例５）BRAF遺伝子を標的としたsgRNAのin vitro切断活性評価
ヒトBRAF遺伝子（GenBank accession No. NM_004333）のV600E変異を有する配列を組み込んだプラスミドDNA（pCMV6-Entry-BRAF(V600E)，OriGene Technologies）を、制限酵素Tth111I（TaKaRa）と添付のプロトコールに従い反応させた。反応終了後定法に従い精製し、終濃度100 ng/μLとなるようにTEバッファー（10 mM Tris-HCl, pH8，1 mM EDTA）に溶解し基質DNAとした。
上記基質DNAを、Cas9 Nuclease, S. pyogenes （New England Biolabs）に添付の試薬を用いてsgRNAおよびCas9と以下のように混合した；
100 ng 基質DNA + 0.5ng sgRNA + 0.3 pmol Cas9（全量10μL）
３７℃で１５分間インキュベーションした後、さらに７０℃で１０分間インキュベーションしCas9を失活させた。その後電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後ゲルイメージングシステムPXi4（SYNGENE社）を用いバンド強度を測定した。
測定結果を基に、下記の等式により切断効率を算出した。
Cleavage Efficiency=sum of cleaved band intensities/(sum of the cleaved and uncleaved band intensities)
その結果を図１０に示す。ゲル下の数値は上記計算式により求めた切断効率を表している。さらに、参考例である天然型sgRNA（SG-0090）の切断効率を１としたときの本実施例の人工sgRNAの相対切断効率を図１１に示した。
本実施例の人工sgRNAは、参考例である天然型sgRNAと同等以上の切断効率を示し、各部位のアミノ酸誘導体による置換が有効であることがわかった。
（試験例６）BCL-2遺伝子を標的としたsgRNAの細胞内切断活性評価
Jurkat細胞 (2×105個)をマイクロチューブに採取しPBSで洗浄した後、6 μg GeneArt Platinum Cas9 Nuclease (Thermo Fisher Scientific社)と1.2 μg sgRNAをNeon 10 μL tip（Thermo Fisher Scientific社)付属のReSuspension buffer Rに加えた被験物質溶液10 μLを用いて細胞を懸濁した。細胞懸濁液をNeon 10 μL tipに吸引し、Pulse Voltage 1700V, Pulse Width 20 ms, Pulse Number 1回の条件下でエレクトロポレーターNeon (Thermo Fisher Scientific社)を用いてトランスフェクションを行った。得られた細胞を10% Fetal Bovine Serum (MP Biomedicals)を含むRPMI1640 Medium (Thermo Fisher Scientific社) 500 μLを用いて24-well Dish（Thermo Fisher Scientific社）に播種した。37℃、５％CO2下で48時間培養後細胞を回収しPBSで洗浄した後、GeneArt（登録商標） Genomic Cleavage Detection Kit (Thermo Fisher Scientific社)を用いてゲノムDNAを精製した。得られたゲノムDNAの一部を鋳型として、ヒトBCL-2遺伝子増幅用プライマーセット：5’-ATCAAGTGTTCCGCGTGATTGAAGA-3’ / 5’- CTCACATCACCAAGTGCACCTACCC-3’を用いて、GeneArt（登録商標） Genomic Cleavage Detection Kit添付のプロトコールに従いPCRを行った。得られたPCR産物を用い、GeneArt（登録商標） Genomic Cleavage Detection Kitに添付のプロトコールに従い染色体in-del検出反応を行った後アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色したゲルについてゲルイメージングシステムPXi4（SYNGENE社）を用いバンド強度を測定した。
測定結果を基に、下記の等式により切断効率を算出した。
Cleavage Efficiency= 1- [(1-fraction cleaved) 1/2]
Fraction Cleaved= sum of cleaved band intensities/(sum of the cleaved and parental band intensities)
その結果を図１２に示す。ゲル下の数値は上記計算式により求めた切断効率を表している。さらに、参考例である天然型sgRNA（SG-0017）の切断効率を１としたときの本実施例の人工sgRNAの相対切断効率を図１３に示した。
本実施例の人工sgRNAの中には、細胞内においても、参考例である天然型sgRNAと同等以上の切断効率を示すものがあった。
（試験例７）BRAF遺伝子を標的としたsgRNAの細胞内切断活性評価
A-375細胞 (5.6×104個)をマイクロチューブに採取しPBSで洗浄した後、6 μg GeneArt Platinum Cas9 Nuclease (Thermo Fisher Scientific社)と1.2 μg sgRNAをNeon 10 μL tip（Thermo Fisher Scientific社)付属のReSuspension buffer Rに加えた被験物質溶液10 μLで細胞を懸濁した。細胞懸濁液をNeon 10 μL tipに吸引し、Pulse Voltage 1400V, Pulse Width 20 ms, Pulse Number 2回の条件下でエレクトロポレーターNeon (Thermo Fisher Scientific社)を用いてトランスフェクションを行った。得られた細胞を10% Fetal Bovine Serum (MP Biomedicals)を含むDulbecco’s Modified Eagle’s Medium (High Glucose) (Sigma Aldrich社) 500 μLを用いて24-well Dish（Thermo Fisher Scientific社）に播種した。37℃、５％CO2下で48時間培養後細胞をPBSで洗浄した後、GeneArt（登録商標） Genomic Cleavage Detection Kit (Thermo Fisher Scientific社)を用いてゲノムDNAを精製した。得られたゲノムDNAの一部を鋳型として、ヒトBRAF遺伝子増幅用プライマーセット：5’-CGCCCAGGAGTGCCAAGAGAATATC-3’ / 5’- CAGCAGCATCTCAGGGCCAAAAAT-3’を用いて、GeneArt（登録商標） Genomic Cleavage Detection Kit添付のプロトコールに従いPCRを行った。得られたPCR産物を用い、GeneArt（登録商標） Genomic Cleavage Detection Kitに添付のプロトコールに従い染色体in-del検出反応を行った後アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色したゲルについてゲルイメージングシステムPXi4（SYNGENE社）を用いバンド強度を測定した。
測定結果を基に、下記の等式により切断効率を算出した。
Cleavage Efficiency= 1- [(1-fraction cleaved) 1/2]
Fraction Cleaved= sum of cleaved band intensities/(sum of the cleaved and parental band intensities)
その結果を図１４に示す。ゲル下の数値は上記計算式により求めた切断効率を表している。さらに、参考例である天然型sgRNA（SG-0090）の切断効率を１としたときの本実施例の人工sgRNAの相対切断効率を図１５に示した。
本実施例の人工sgRNAの中には、細胞内においても、参考例である天然型sgRNAと同等以上の切断効率を示すものがあった。
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
本出願は、2016年1月30日付で日本国に出願された特願2016-016743を基礎としており、ここで言及することによりその内容は全て本明細書に包含される。
本発明の人工sgRNAは容易に低コストで合成でき、且つ、Cas9と組み合わせた場合に、天然型sgRNAと同等以上のDSB活性を保持しつつ、生体内での安定性が向上しているので、ゲノム編集効率、特にin vivoでのゲノム編集効率の改善に有用である。

Claims (16)

  1. （１）下式（Ａ）：

    ［式（Ａ）中、Ｘａは、下式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）：

    （各式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０〜１５の整数であり、ｑは０〜１０の整数である。）、あるいは、下式（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）：

    （各式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０〜１５の整数である。）のいずれかで表され、
    式（Ａ）中、Ｘｂ及びＹは、それぞれ独立して、１ないし５個の任意のヌクレオチドリンカーであり、
    式（Ａ）中、Ｘｃ及びＸｄは、存在せず、
    式（Ａ）中、（ｎ）２０は、それぞれ独立してＡ、Ｇ、ＣまたはＵである20±5個のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列である。］で表わされる、単一ガイドＲＮＡ、あるいは
    （２）前記式（Ａ）において、（ｎ）２０を除く領域で１ないし数個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入もしくは付加され、かつCas9タンパク質と複合体を形成して前記（ｎ）２０に相補的な標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖DNAを認識する活性を有する、単一ガイドＲＮＡ。
  2. 前記Ｘａが、前記式（ＩＩ−８）で表され、該式中、ｎ＝５およびｍ＝４、ｎ＝７およびｍ＝６、ｎ＝９およびｍ＝８、またはｎ＝１１およびｍ＝１０である、請求項１記載の単一ガイドＲＮＡ。
  3. 前記Ｘａが、前記式（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）（各式中、ｎ＝５およびｍ＝４である）のいずれかで表される、請求項１記載の単一ガイドＲＮＡ。
  4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡと、Cas9とを組み合わせてなる、CRISPR/Cas9システム。
  5. Cas9がStreptococcus pyogenes由来である、請求項４記載のCRISPR/Cas9システム。
  6. Cas9が、タンパク質、それをコードするmRNAまたはそれをコードするDNAを含む発現ベクターの形態である、請求項４または５記載のCRISPR/Cas9システム。
  7. 請求項４〜６のいずれか一項に記載のCRISPR/Cas9システムを、標的二本鎖DNAに接触させることを含む、該二本鎖DNAの認識方法であって、該標的二本鎖DNAがヒトDNAの場合、該接触はヒト体内への該CRISPR/Cas9システムの投与を含まない、方法。
  8. Cas9タンパク質が二本鎖DNA切断活性を有する、請求項７記載の方法。
  9. 前記二本鎖DNAの切断が細胞内で行われる、請求項８記載の方法。
  10. 標的遺伝子をノックアウトするための、請求項９記載の方法。
  11. 標的遺伝子内の塩基を改変するか、あるいは該遺伝子内に外因性遺伝子を挿入するための、請求項９記載の方法。
  12. 核酸分子合成用のモノマーであって、下記式（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−３）：


    （各式中、Ｒ１１およびＲ２１は、それぞれ独立して、水素原子、保護基またはリン酸保護基であり、ｎ＝５およびｍ＝４である。）のいずれかで表される、モノマー。
  13. 核酸分子の製造方法であって、請求項１２記載のモノマーを使用することを特徴とする、方法。
  14. 前記核酸分子が、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡである、請求項１３記載の方法。
  15. 核酸分子の製造のための、請求項１２記載のモノマーの使用。
  16. 前記核酸分子が、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡである、請求項１５記載の使用。
JP2017563895A 2016-01-30 2017-01-30 人工単一ガイドｒｎａ及びその用途 Active JP6800171B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016016743 2016-01-30
JP2016016743 2016-01-30
PCT/JP2017/003251 WO2017131237A1 (ja) 2016-01-30 2017-01-30 人工単一ガイドｒｎａ及びその用途

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020115250A Division JP7096604B2 (ja) 2016-01-30 2020-07-02 人工単一ガイドｒｎａ及びその用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2017131237A1 JPWO2017131237A1 (ja) 2018-11-01
JP6800171B2 true JP6800171B2 (ja) 2020-12-16

Family

ID=59398320

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017563895A Active JP6800171B2 (ja) 2016-01-30 2017-01-30 人工単一ガイドｒｎａ及びその用途
JP2020115250A Active JP7096604B2 (ja) 2016-01-30 2020-07-02 人工単一ガイドｒｎａ及びその用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020115250A Active JP7096604B2 (ja) 2016-01-30 2020-07-02 人工単一ガイドｒｎａ及びその用途

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11518994B2 (ja)
EP (1) EP3409776A4 (ja)
JP (2) JP6800171B2 (ja)
KR (1) KR102255995B1 (ja)
CN (1) CN109072224B (ja)
AU (2) AU2017213405B2 (ja)
CA (1) CA3013179A1 (ja)
WO (1) WO2017131237A1 (ja)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2734621B1 (en) 2011-07-22 2019-09-04 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
EP3294880A4 (en) * 2015-05-15 2018-12-26 Dharmacon, Inc. Synthetic single guide rna for cas9-mediated gene editing
IL310721A (en) 2015-10-23 2024-04-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
CA3032699A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN110214180A (zh) 2016-10-14 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器的aav递送
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
CA3048434A1 (en) * 2016-12-30 2018-07-05 Editas Medicine, Inc. Synthetic guide molecules, compositions and methods relating thereto
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
CN110914426A (zh) 2017-03-23 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
CA3077160A1 (en) * 2017-09-28 2019-04-04 Green Cross Corporation Factor viii or factor ix gene knockout rabbit, method for preparing same and use thereof
AU2018352592A1 (en) 2017-10-16 2020-06-04 Beam Therapeutics, Inc. Uses of adenosine base editors
CA3104856A1 (en) * 2018-06-29 2020-01-02 Editas Medicine, Inc. Synthetic guide molecules, compositions and methods relating thereto
WO2020154714A2 (en) * 2019-01-25 2020-07-30 Synthego Corporation Systems and methods for modulating crispr activity
AU2020242032A1 (en) 2019-03-19 2021-10-07 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for editing nucleotide sequences
EP4130018A4 (en) * 2020-03-27 2024-04-17 Sumitomo Chemical Co PROCESS FOR THE PRODUCTION OF NUCLEIC ACID OLIGOMERS
CA3177481A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 David R. Liu Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
WO2022120027A1 (en) * 2020-12-02 2022-06-09 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Silica-based chromatographic processes for isolating nucleic acid-protein complexes and detecting target nucleic acids
WO2022164796A1 (en) * 2021-01-26 2022-08-04 California Institute Of Technology Allosteric conditional guide rnas for cell-selective regulation of crispr/cas
CN113512767B (zh) * 2021-04-30 2022-09-23 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 用于构建small RNA文库的接头、试剂盒及small RNA文库的构建方法
TW202334419A (zh) * 2021-11-03 2023-09-01 美商英特利亞醫療公司 用於基因編輯之經修飾引導rna
JP7152094B1 (ja) 2022-06-30 2022-10-12 リージョナルフィッシュ株式会社 ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びゲノム編集方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012005368A1 (ja) 2010-07-08 2012-01-12 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
US8785121B2 (en) 2010-07-08 2014-07-22 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule for controlling gene expression
US8691782B2 (en) 2010-08-03 2014-04-08 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
DK2674494T3 (en) * 2010-08-03 2015-02-23 Bonac Corp Single-stranded RNA molecule with a nitrogen-containing alicyclic skeleton
WO2013077446A1 (ja) 2011-11-26 2013-05-30 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
ES2645996T3 (es) 2012-01-07 2017-12-11 Bonac Corporation Molécula de ácido nucleico monocatenario que tiene una cadena principal de aminoácidos
WO2013133393A1 (ja) 2012-03-07 2013-09-12 学校法人東京医科大学 Ｖｅｇｆ遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子
DE202013012242U1 (de) * 2012-05-25 2016-02-02 Emmanuelle Charpentier Zusammensetzungen für die durch RNA gesteuerte Modifikation einer Ziel-DNA und für die durch RNA gesteuerte Modulation der Transkription
EP2857513A4 (en) 2012-05-26 2016-05-25 Bonac Corp SINGLE STRANDED NUCLEIC ACID MOLECULE FOR CONTROLLING THE EXPRESSION OF A GENE HAVING AN ADMINISTRATION FUNCTION
US10660943B2 (en) * 2013-02-07 2020-05-26 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
WO2014150624A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
PL3019619T3 (pl) * 2013-07-11 2022-01-10 Modernatx, Inc. Kompozycje zawierające syntetyczne polinkleotydy kodujące białka powiązane z crispr i syntetyczne sgrna oraz sposoby ich stosowania
WO2015093495A1 (ja) * 2013-12-16 2015-06-25 株式会社ボナック ＴＧＦ－β１遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
US10934542B2 (en) 2013-12-27 2021-03-02 Bonac Corporation Artificial match-type miRNA for controlling gene expression and use therefor
US11470826B2 (en) * 2014-11-17 2022-10-18 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Method of conveniently producing genetically modified non-human mammal with high efficiency
CN107787367B (zh) 2015-04-06 2021-10-26 里兰斯坦福初级大学理事会 用于crispr/cas介导的基因调控的化学修饰的引导rna
JP2018531596A (ja) * 2015-09-24 2018-11-01 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ Ｒｎａガイド型核酸結合タンパク質を使用する分子間近接性検出用の方法および試薬
CN105755040A (zh) 2016-01-21 2016-07-13 北京大学 一种改造的sgRNA及染色体标记应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021202749A1 (en) 2021-05-27
JP7096604B2 (ja) 2022-07-06
JP2020198880A (ja) 2020-12-17
AU2017213405B2 (en) 2021-02-04
CN109072224A (zh) 2018-12-21
AU2017213405A1 (en) 2018-09-13
KR102255995B1 (ko) 2021-05-25
EP3409776A1 (en) 2018-12-05
JPWO2017131237A1 (ja) 2018-11-01
US11518994B2 (en) 2022-12-06
CA3013179A1 (en) 2017-08-03
CN109072224B (zh) 2022-07-15
EP3409776A4 (en) 2019-12-25
WO2017131237A1 (ja) 2017-08-03
KR20180100692A (ko) 2018-09-11
US20190382758A1 (en) 2019-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7096604B2 (ja) 人工単一ガイドｒｎａ及びその用途
JP5876890B2 (ja) アミノ酸骨格を有する一本鎖核酸分子
JP5261677B2 (ja) 含窒素脂環式骨格を有する一本鎖核酸分子
JP6162182B2 (ja) 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
JP6883349B2 (ja) デリバリー機能と遺伝子発現制御能を有する一本鎖核酸分子
WO2013077446A1 (ja) 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
JP2013153736A (ja) ペプチド骨格を有する一本鎖核酸分子
JP2013055913A (ja) 遺伝子発現制御のための一本鎖ｒｎａ分子
WO2022045224A1 (ja) 標的遺伝子の発現を抑制する新規な核酸分子
JP2023127512A (ja) 標的遺伝子の発現を抑制する核酸分子
CN116507724A (zh) 寡核苷酸组合物及其方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20180530

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190716

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190917

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200303

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200501

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200702

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20201110

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20201124

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6800171

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150