JP7152094B1 - ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びゲノム編集方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、新たなｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びこれを使ったゲノム編集方法を提供することを課題とする。【解決手段】ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集システムに使用するための、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから構成されるｔｒａｃｒＲＮＡユニットであって、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡは非連続であり、第１の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分と第２の部分を有し、第１の部分と第２の部分は重複せず、第１の部分はｃｒＲＮＡの一部に相補的な配列を有し、第２の部分は第２の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有する、ｔｒａｃｒＲＮＡユニットにより、課題を解決する。【選択図】なし
Description
本明細書には、ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びゲノム編集方法が開示される。
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムは、細菌及び古細菌において発見されたウイルスやプラスミドに対する免疫システムである（非特許文献１）。このシステムは、現在、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて様々な生物のゲノムＤＮＡの目的領域に対して、ヌクレオチド配列の削除、置換又は挿入を行う方法として利用されている（特許文献１及び２）。
細菌や古細菌では、ゲノムＤＮＡの目的領域のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、ｃｒＲＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列を有するｔｒａｃｒＲＮＡとがそれぞれ別のＲＮＡ鎖であり、これらが互いに相補的なヌクレオチド配列を介してハイブリダイズし、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを形成しＣａｓ９をガイドする。一方、一般的にｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては、非特許文献１、特許文献１及び特許文献２に示されるように、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘに替えて、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡがリンカーループ配列を挟んで単一のＲＮＡ鎖として結合したｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用している。
M Jinek, et al.:SCIENCE, 28 Jun 2012,Vol 337, Issue 6096, pp. 816-821
H Nishimasu, et al.:Cell, 27 Feb 2014, Vol 156, pp. 935-949
ｔｒａｃｒＲＮＡは、図１（Ａ）に示すように、そのＲＮＡ鎖内で３つのヘアピンループを形成する。３つのヘアピンループは、ｃｒＲＮＡとハイブリダイズするヌクレオチド配列に近い方から、第１ステムループ、第２ステムループ、第３ステムループと呼ばれている。ｔｒａｃｒＲＮＡについては、これまで非特許文献２に記載されているように第１ステムループと第２ステムループの間のリンカー部分を欠損させてもｔｒａｃｒＲＮＡとして機能することは知られているが、これ以外の部分に改良を加えた際にｔｒａｃｒＲＮＡとしての機能を維持できるかはまったく不明である。
本発明は、新たなｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びこれを使ったゲノム編集方法を提供することを課題とする。
本発明は、新たなｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びこれを使ったゲノム編集方法を提供することを課題とする。
項１．
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集システムに使用するための、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから構成されるｔｒａｃｒＲＮＡユニットであって、
第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡは非連続であり、
第１の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分と第２の部分を有し、
第１の部分と第２の部分は重複せず、第１の部分はｃｒＲＮＡの一部に相補的な配列を有し、第２の部分は第２の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有する、
ｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項２．
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集システムに使用するための、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖ＲＮＡから構成されるｔｒａｃｒＲＮＡユニットであって、
第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖ＲＮＡは非連続であり、
第１の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分と第２の部分を有し、
第１の部分と第２の部分は重複せず、第１の部分はｃｒＲＮＡの一部に相補的な配列を有し、第２の部分は第２の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有し、
第２の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分を有し、
第２の一本鎖ＲＮＡの第１の部分は、第３の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有する、
ｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項３．
ｃｒＲＮＡと第１の一本鎖ＲＮＡが順に連結されている、項１又は２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項４．
ｃｒＲＮＡと第１の一本鎖ＲＮＡと第２の１本鎖ＲＮＡが順に連結されている、項２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項５．
第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡの少なくとも一方が、３９ヌクレオチド以下の長さを有する、項１に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項６．
第１の一本鎖ＲＮＡ、第２の一本鎖ＲＮＡ、及び第３の一本鎖ＲＮＡの少なくとも１つが、３９ヌクレオチド以下の長さを有する、項２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項７．
第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡとが非連続であり、第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖ＲＮＡが連続である、項２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項８．
項１～７のいずれか一項に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニットと、
ｃｒＲＮＡと、
Ｃａｓ９と、
を使用するゲノム編集方法。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集システムに使用するための、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから構成されるｔｒａｃｒＲＮＡユニットであって、
第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡは非連続であり、
第１の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分と第２の部分を有し、
第１の部分と第２の部分は重複せず、第１の部分はｃｒＲＮＡの一部に相補的な配列を有し、第２の部分は第２の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有する、
ｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項２．
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集システムに使用するための、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖ＲＮＡから構成されるｔｒａｃｒＲＮＡユニットであって、
第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖ＲＮＡは非連続であり、
第１の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分と第２の部分を有し、
第１の部分と第２の部分は重複せず、第１の部分はｃｒＲＮＡの一部に相補的な配列を有し、第２の部分は第２の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有し、
第２の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分を有し、
第２の一本鎖ＲＮＡの第１の部分は、第３の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有する、
ｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項３．
ｃｒＲＮＡと第１の一本鎖ＲＮＡが順に連結されている、項１又は２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項４．
ｃｒＲＮＡと第１の一本鎖ＲＮＡと第２の１本鎖ＲＮＡが順に連結されている、項２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項５．
第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡの少なくとも一方が、３９ヌクレオチド以下の長さを有する、項１に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項６．
第１の一本鎖ＲＮＡ、第２の一本鎖ＲＮＡ、及び第３の一本鎖ＲＮＡの少なくとも１つが、３９ヌクレオチド以下の長さを有する、項２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項７．
第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡとが非連続であり、第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖ＲＮＡが連続である、項２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
項８．
項１～７のいずれか一項に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニットと、
ｃｒＲＮＡと、
Ｃａｓ９と、
を使用するゲノム編集方法。
新たなｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びこれを使ったゲノム編集方法を提供することができる。新たなｔｒａｃｒＲＮＡユニットは、１本のＲＮＡ鎖が短いため、ＲＮＡ鎖を化学合成するコストの削減が可能となる。また、ｔｒａｃｒＲＮＡを分割することにより、ＲＮＡ鎖の５’及び３’末端数が増え、ｔｒａｃｒＲＮＡに機能的モチーフを付与する数や種類を増すことができ、これによりドナーテザリングへの応用や、一般的な核酸修飾のデザインを増やすことができる。
１．ｔｒａｃｒＲＮＡユニット
本明細書において、ｔｒａｃｒＲＮＡユニットは、ｔｒａｃｒＲＮＡが、２以上の一本鎖ＲＮＡから構成され、ｔｒａｃｒＲＮＡとしての機能を維持する複合体を意図する。
ヌクレオチドの標記は、一般的なＲＮＡ又はＤＮＡを標記にしたがう。
本明細書において、ｔｒａｃｒＲＮＡユニットは、ｔｒａｃｒＲＮＡが、２以上の一本鎖ＲＮＡから構成され、ｔｒａｃｒＲＮＡとしての機能を維持する複合体を意図する。
ヌクレオチドの標記は、一般的なＲＮＡ又はＤＮＡを標記にしたがう。
また、本明細書において「連結」することは、同一ポリヌクレオチド鎖としてつながれることを意図する。好ましくは、ホスホジエステル結合によって２本のポリヌクレオチド鎖がつながれることを意図する。
本明細書において、配列を有することは、配列を含むこと、又は配列からなることを意図する。
本明細書において、配列を有することは、配列を含むこと、又は配列からなることを意図する。
１－１．第１の実施形態
第１の実施形態は、図１（Ｂ）に示す第１ステムループ、又は第２ステムループにおいて、ｔｒａｃｒＲＮＡが２分割されているｔｒａｃｒＲＮＡユニットに関する。図１（Ｂ）ａでは、第１ステムループの部分でｔｒａｃｒＲＮＡが分割されている。図１（Ｂ）ｂでは、第２ステムループの部分でｔｒａｃｒＲＮＡが分割されている。
第１の実施形態は、図１（Ｂ）に示す第１ステムループ、又は第２ステムループにおいて、ｔｒａｃｒＲＮＡが２分割されているｔｒａｃｒＲＮＡユニットに関する。図１（Ｂ）ａでは、第１ステムループの部分でｔｒａｃｒＲＮＡが分割されている。図１（Ｂ）ｂでは、第２ステムループの部分でｔｒａｃｒＲＮＡが分割されている。
より具体的には、ｔｒａｃｒＲＮＡユニットは、第１の一本鎖ＲＮＡ（図１（Ｂ）において「＃１」で表されている）と第２の一本鎖ＲＮＡ（図１（Ｂ）において「＃２」で表されている）から構成され得る。第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡは非連続である。第１の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分と第２の部分を有し、第１の部分と第２の部分は重複しない。第１の部分はｃｒＲＮＡの一部に相補的な配列を有し、第２の部分は第２の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有する。
図２に、通常型のｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。通常型のｔｒａｃｒＲＮＡは、ヌクレオチド番号（ｎｔ Ｎｏ．）１～１２が第１のｃｒＲＮＡ相補的配列であり、ｎｔ Ｎｏ．１７～２１が第２のｃｒＲＮＡ相補的配列であり、ｎｔ Ｎｏ．２８～２９が第１ステムループのループ部であり、ｎｔ Ｎｏ．３５～３９がリンカー部であり、ｎｔ Ｎｏ．４５～４８が第２ステムループのループ部であり、ｎｔ Ｎｏ．６０～６２が第３ステムループのループ部である。各ループ部の前後の配列がハイブリダイズし、ヘアピンループを形成する。例えば、第１ステムループは、少なくともｎｔ Ｎｏ．２５～２７と、ｎｔ Ｎｏ．３３、３２、３０がハイブリダイズすることで形成される。第２ステムループは、少なくともｎｔ Ｎｏ．４１～４４と、ｎｔ Ｎｏ．５２～４９がハイブリダイズすることで形成される。第３ステムループは、少なくともｎｔ Ｎｏ．５４～５９と、ｎｔ Ｎｏ．６８～６３がハイブリダイズすることで形成される。
第１ステムループの部分でｔｒａｃｒＲＮＡを分割する場合、配列番号１のｎｔ Ｎｏ．２７と２８の間、ｎｔ Ｎｏ．２８と２９の間、又はｎｔ Ｎｏ．２９と３０の間において分割し得る。或いは、ｎｔ Ｎｏ．２８、ｎｔ Ｎｏ．２９及びｎｔ Ｎｏ．２８と２９を欠損させて分割してもよい。
第２ステムループの部分でｔｒａｃｒＲＮＡを分割する場合、配列番号１のｎｔ Ｎｏ．４４と４５の間、ｎｔ Ｎｏ．４５と４６の間、ｎｔ Ｎｏ．４６と４７の間、ｎｔ Ｎｏ．４７と４８の間、又はｎｔ Ｎｏ．４８と４９の間において分割し得る。或いは、ｎｔ Ｎｏ．４５～４８の１以上のヌクレオチドを欠損させて分割してもよい。
第１の一本鎖ＲＮＡ、及び／又は第２の一本鎖ＲＮＡは分割したヌクレオチド配列を有するＲＮＡをその配列で使用してもよい。或いは、第１の一本鎖ＲＮＡ、及び／又は第２の一本鎖ＲＮＡの５’末端、又は３’末端の一方、或いは両方に１～１０ヌクレオチド程度の付加配列を加えてもよい。
また、第１の一本鎖ＲＮＡ、及び／又は第２の一本鎖ＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡユニットとして構築したときにｔｒａｃｒＲＮＡとしての機能を有する限り、その一部を欠損させてもよい。このとき、第１の一本鎖ＲＮＡ、及び第２の一本鎖ＲＮＡの少なくとも一方の長さが、３９ヌクレオチド以下となることが好ましい。第１の一本鎖ＲＮＡ、及び第２の一本鎖ＲＮＡが付加配列を含む場合には、第１の一本鎖ＲＮＡ、及び第２の一本鎖ＲＮＡの少なくとも一方の長さが、付加配列も含めて３９ヌクレオチド以下となることが好ましい。
ここで、第１の一本鎖ＲＮＡの第１の部分におけるｃｒＲＮＡの一部と相補的な配列である部分は、図２に示す、第１のｃｒＲＮＡ相補的配列と第２のｃｒＲＮＡ相補的配列の少なくとも一方の一部を備えていればよい。また、第１の一本鎖ＲＮＡの第２の部分における第２の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列である部分も、第１ステムループのループ部前後の配列の一部、又は第２ステムループのループ部前後の配列の一部の配列を含んでいればよい。
配列番号１において、非特許文献２に記載されているように、ｎｔ Ｎｏ．３５～３９がリンカー部はその一部、又は全部、好ましくはｎｔ Ｎｏ．３６～３９を欠損させてもｔｒａｃｒＲＮＡの機能は維持される。したがって、好ましくは、本実施形態からは、ｎｔ Ｎｏ．３６～３９のみ、好ましくはリンカー部のみを欠損させる態様は除かれる。
本発明において、例えば、配列番号１のｎｔ Ｎｏ．１～８を欠損させても、ｔｒａｃｒＲＮＡとして、若しくはｔｒａｃｒＲＮＡユニットとして機能することができる。
本実施形態において、第１の一本鎖ＲＮＡは、後述するｃｒＲＮＡと連結されていてもよい。
本実施形態において、第１の一本鎖ＲＮＡは、後述するｃｒＲＮＡと連結されていてもよい。
また、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列の一部が欠損している場合、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡは、５’側から３’側に向かって順に連結されてｔｒａｃｒＲＮＡユニットを構成してもよい。
第１の一本鎖ＲＮＡ、及び第２の一本鎖ＲＮＡは、相補的な配列間でアニーリングさせてｔｒａｃｒＲＮＡユニットを形成させてから細胞、個体、又は組織に導入されることが好ましい。アニーリングは、特に制限されないが、例えば、サーマルサイクラー等で、９０℃～９８℃程度で、３分から１０分程度加熱した後、徐々に室温に下げる（例えば、毎秒０．１℃ずつ２５℃まで下げる）ことで達成される。また、アニーリングの際、ｃｒＲＮＡを加えてアニーリングさせ、ガイドＲＮＡユニットを形成させてもよい。
１－２．第２の実施形態
第２の実施形態は、図１（Ｃ）に示す第１ステムループ及び第２ステムループにおいて、ｔｒａｃｒＲＮＡが３分割されているｔｒａｃｒＲＮＡユニットに関する。図１（Ｃ）では、第１ステムループの部分と、第２ステムループの部分でｔｒａｃｒＲＮＡが分割されている。
第２の実施形態は、図１（Ｃ）に示す第１ステムループ及び第２ステムループにおいて、ｔｒａｃｒＲＮＡが３分割されているｔｒａｃｒＲＮＡユニットに関する。図１（Ｃ）では、第１ステムループの部分と、第２ステムループの部分でｔｒａｃｒＲＮＡが分割されている。
より具体的には、ｔｒａｃｒＲＮＡユニットは、第１の一本鎖ＲＮＡ（図１（Ｃ）において「＃１」で表されている）と、第２の一本鎖ＲＮＡ（図１（Ｃ）において「＃２」で表されている）と、第３の一本鎖ＲＮＡ（図１（Ｃ）において「＃３」で表されている）から構成されうる。第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖ＲＮＡは非連続である。第１の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分と第２の部分を有し、第１の部分と第２の部分は重複せず、第１の部分はｃｒＲＮＡの一部に相補的な配列を有し、第２の部分は第２の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有する。第２の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分を有し、第２の一本鎖ＲＮＡの第１の部分は、第３の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有する。ここで、第２の一本鎖ＲＮＡにおいて、第１の一本鎖ＲＮＡの第２の部分と相補的な部分は、第２の一本鎖ＲＮＡの第１の部分と重複しない。
第１ステムループの部分と、第２ステムループの部分の分割については、上記第１の実施形態と同様であるので、上記説明をここに援用する。
第１ステムループの部分と、第２ステムループの部分の分割については、上記第１の実施形態と同様であるので、上記説明をここに援用する。
第３ステムループの部分でｔｒａｃｒＲＮＡを分割する場合、配列番号１のｎｔ Ｎｏ．５９と６０の間、ｎｔ Ｎｏ．６０と６１の間、ｎｔ Ｎｏ．６１と６２の間、又はｎｔ Ｎｏ．６２と６３の間において分割し得る。或いは、ｎｔ Ｎｏ．６０～６２の１以上のヌクレオチドを欠損させて分割してもよい。
第１の一本鎖ＲＮＡ、第２の一本鎖ＲＮＡ、及び第３の一本鎖ＲＮＡの少なくとも１つは、分割したヌクレオチド配列を有するＲＮＡをその配列で使用してもよい。或いは、第１の一本鎖ＲＮＡ、第２の一本鎖ＲＮＡ、及び第３の一本鎖ＲＮＡの少なくとも１つは、５’末端、又は３’末端の一方、或いは両方に１～１０ヌクレオチド程度の付加配列が存在しても良い。
第１の一本鎖ＲＮＡ、第２の一本鎖ＲＮＡ、及び第３の一本鎖ＲＮＡの少なくとも１つは、ｔｒａｃｒＲＮＡユニットとして構築したときにｔｒａｃｒＲＮＡとしての機能を有する限り、その一部を欠損させてもよい。このとき、第１の一本鎖ＲＮＡ、第２の一本鎖ＲＮＡ、及び第３の一本鎖ＲＮＡの少なくとも１つの長さが、付加配列も含めて３９ヌクレオチド以下となることが好ましい。
ここで、第１の一本鎖ＲＮＡの第１の部分におけるｃｒＲＮＡの一部と相補的な配列である部分は、図２に示す、第１のｃｒＲＮＡ相補的配列と第２のｃｒＲＮＡ相補的配列の少なくとも一方の一部を備えていればよい。また、第１の一本鎖ＲＮＡの第２の部分における第２の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列である部分も、第１ステムループのループ部前後の配列の一部、又は第２ステムループのループ部前後の配列の一部の配列を含んでいればよい。さらに、第２の一本鎖ＲＮＡの第３の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列である部分も、第３ステムループのループ部前後の配列の一部の配列を含んでいればよい。
配列番号１において、非特許文献２に記載されているように、ｎｔ Ｎｏ．３６～３９がリンカー部は欠損させてもｔｒａｃｒＲＮＡの機能は維持される。したがって、好ましくは、本実施形態からは、リンカー部のみを欠損させる態様は除かれる。
本発明において、例えば、配列番号１のｎｔ Ｎｏ．１～８を欠損させても、ｔｒａｃｒＲＮＡとして、若しくはｔｒａｃｒＲＮＡユニットとして機能することができる。
本実施形態において、第１の一本鎖ＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと連結されていてもよい。ｃｒＲＮＡは目的ゲノム配列に相補的なヌクレオチド配列（好ましくは、２０ヌクレオチド）と、第１の一本鎖ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む。さらに、ｃｒＲＮＡと連結した第１の一本鎖ＲＮＡは、第２の一本鎖ＲＮＡと連結されていてもよい。
また、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列の一部が欠損している場合、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖ＲＮＡは、５’側から３’側に向かって順に連結されてｔｒａｃｒＲＮＡユニットを構成してもよい。
第１の一本鎖ＲＮＡ、第２の一本鎖ＲＮＡ及び第３の一本鎖ＲＮＡは、相補的な配列間でアニーリングさせてｔｒａｃｒＲＮＡユニットを形成させてから細胞、個体、又は組織に導入されることが好ましい。アニーリングは、特に制限されないが、例えば、サーマルサイクラー等で、９０℃～９８℃程度で、３分から１０分程度加熱した後、徐々に室温に下げる（例えば、毎秒０．１℃ずつ２５℃まで下げる）ことで達成される。また、アニーリングの際、ｃｒＲＮＡを加えてアニーリングさせ、ガイドＲＮＡユニットを形成させてもよい。
２．ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡユニットを連結したキメラＲＮＡ
第３の実施形態は、ｃｒＲＮＡと、上記１．において説明した、ｔｒａｃｒＲＮＡユニットを構成する１本鎖ＲＮＡを連結したキメラＲＮＡに関する。ただし、このキメラＲＮＡは、配列番号１に示すヌクレオチド配列の一部が欠損している。
第３の実施形態は、ｃｒＲＮＡと、上記１．において説明した、ｔｒａｃｒＲＮＡユニットを構成する１本鎖ＲＮＡを連結したキメラＲＮＡに関する。ただし、このキメラＲＮＡは、配列番号１に示すヌクレオチド配列の一部が欠損している。
３．ｔｒａｃｒＲＮＡユニットを構成する各ＲＮＡをコードする、又はキメラＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメント
第４の実施形態は、上記１．において述べた各一本鎖ＲＮＡ、又は上記２．において述べたキメラＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメントに関する。
ＤＮＡフラグメントは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
第４の実施形態は、上記１．において述べた各一本鎖ＲＮＡ、又は上記２．において述べたキメラＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメントに関する。
ＤＮＡフラグメントは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
また、ＤＮＡフラグメントは、ベクターに組み込まれていてもよい。ベクターは、ＤＮＡフラグメントから、上記一本鎖ＲＮＡ又はキメラＲＮＡを転写できる限り制限されない。ＤＮＡフラグメントは、Ｈ１、７ＳＫ、及びＵ６プロモーター等のプロモーターヌクレオチド配列の下流に挿入される。ベクターは、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等を例示することができる。
４．ｔｒａｃｒＲＮＡユニットを使用したゲノム編集方法
第５の実施形態は、上記１．において述べたｔｒａｃｒＲＮＡユニットを使ったゲノム編集方法に関する。また、第５の実施形態は、上記２．において述べたキメラＲＮＡを使ったゲノム編集方法に関する。ゲノム編集には、目的ゲノムのヌクレオチド配列の置換、欠失、及び挿入の態様、または、遺伝子発現制御及びエピゲノム編集等の手法が含まれ得る。
第５の実施形態は、上記１．において述べたｔｒａｃｒＲＮＡユニットを使ったゲノム編集方法に関する。また、第５の実施形態は、上記２．において述べたキメラＲＮＡを使ったゲノム編集方法に関する。ゲノム編集には、目的ゲノムのヌクレオチド配列の置換、欠失、及び挿入の態様、または、遺伝子発現制御及びエピゲノム編集等の手法が含まれ得る。
ここで、「使う」とは、細胞内においてｔｒａｃｒＲＮＡユニット及び／又はキメラＲＮＡがゲノム編集に使用されることを意図する。すなわち、細胞にＲＮＡの状態で導入するか、上記３．において述べたＤＮＡフラグメントをベクターに搭載した状態で導入するかは問わない。
好ましい態様は、上記１．において述べたｔｒａｃｒＲＮＡユニットをｃｒＲＮＡ、及びＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）酵素と共に使用する。
ｃｒＲＮＡは目的ゲノムのヌクレオチド配列（以下、「標的配列ともいう」）に相補的なヌクレオチド配列（好ましくは、２０ヌクレオチド）と、上述の第１の一本鎖ＲＮＡの第１の部分の全部、又は一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。
標的配列の選択方法は、公知である。標的配列は、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏｏｌ （Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＺｈａｎｇＬａｂのウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／））、Ｅ－ＣＲＩＳＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／ （ドイツがん研究センター））、ＺｉＦｉＴ Ｔａｒｇｅｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｚｉｆｉｔ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／ＺｉＦｉｔ／ （Ｚｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒ コンソーシアム））、Ｃａｓ９ ｄｅｓｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｓ９．ｃｂｉ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ （北京大学））、ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ （東京大学））、ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｒｉｓｐｒ／ （華中農業大学））、ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ （ソウル大学））等において公開されている公知のデザインツールを使用して選択することができる。
ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、ｃｒＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素及びこれをコードする核酸は、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等により導入することができる。
ｔｒａｃｒＲＮＡユニット及びｃｒＲＮＡは、それぞれ０．０５ｐｇ～２５ｐｇ、好ましくは０．２５ｐｇ～１０ｐｇ、より好ましくは０．５ｐｇ～２．５ｐｇ程度の範囲で注入することができる。
ＣＲＩＳＰＲ酵素を、タンパク質、又はタンパク質をコードする核酸として導入する場合、１細胞あたり、５ｐｇ～１００ｐｇ、好ましくは１０ｐｇ～８０ｐｇ、より好ましくは１０ｐｇ～５０ｐｇ程度の範囲で注入することができる。
ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、ｃｒＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はこれをコードする核酸は、リポソーム等のデリバリーシステムを使って、個体に全身投与、又は局所投与してもよい。全身投与の場合、ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、ｃｒＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はこれをコードする核酸をそれぞれ個体の体重１ｋｇあたり０．１～１，０００ｍｇ／日となるように投与することができる。局所投与の場合、ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、ｃｒＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はこれをコードする核酸をそれぞれ標的組織１ｃｍ２あたり、０．０１～１００ｍｇ／日となるように投与することができる。
また、ｔｒａｃｒＲＮＡユニット及びｃｒＲＮＡを独立したユニットとして使用することに変えて、キメラＲＮＡとしてｔｒａｃｒＲＮＡユニット及びｃｒＲＮＡを連結して使用してもよい。キメラＲＮＡは、１細胞あたり０．１ｐｇ～５０ｐｇ、好ましくは０．５ｐｇ～２０ｐｇ、より好ましくは１ｐｇ～５ｐｇ程度の範囲で注入することができる。また、キメラＲＮＡを全身投与する場合、個体の体重１ｋｇあたり０．１～１，０００ｍｇ／日となるように投与することができる。局所投与の場合、キメラＲＮＡを標的組織１ｃｍ２あたり、０．０１～１００ｍｇ／日となるように投与することができる。
ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、ｃｒＲＮＡ、又はキメラＲＮＡは、上記３．において述べたこれらのＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメントを搭載したベクターを細胞、個体、又は組織に導入することで、導入後にＤＮＡフラグメントにコードされているＲＮＡを発現させることにより使用してもよい。
ベクターがプラスミドベクターの場合、１細胞あたりに、ＤＮＡの総量として５ｐｇ～１００ｐｇ、好ましくは１０ｐｇ～８０ｐｇ、より好ましくは１０ｐｇ～５０ｐｇ程度の範囲で導入することができる。プラスミドベクターを全身投与する場合、個体の体重１ｋｇあたりＤＮＡの総量として０．１～１，０００ｍｇ／日となるように投与することができる。局所投与の場合、プラスミドベクターを標的組織１ｃｍ２あたり、ＤＮＡの総量として０．０１～１００ｍｇ／日となるように投与することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするＤＮＡを搭載したプラスミドベクターを使用する場合は、ＤＮＡの総量には、これも含む。
ベクターがウイルスベクターの場合、１細胞あたり、目的のヌクレオチド配列を搭載したウイルスの総量として１０２～１０６ｖｇ程度の範囲で導入することができる。ウイルスを全身投与する場合、個体の体重１ｋｇあたりウイルスの総量として１０１０～１０１８ｖｇ／日となるように投与することができる。局所投与の場合、ウイルスを標的組織１ｃｍ２あたり、ウイルスの総量として１０９～１０１６ｖｇ／日となるように投与することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするＤＮＡを搭載したウイルスを使用する場合は、上記ウイルスの総量には、これも含む。
さらに、本実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、ｃｒＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はこれをコードする核酸とともに、一本鎖オリゴ（ｓｓＯＤＮｓ）等のドナーオリゴＤＮＡを共導入してもよい。ｓｓＯＤＮｓは、公知の方法にしたがってデザインすることができる。
ＣＲＩＳＰＲ酵素として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ等に由来するＣａｓ９等を例示できる。また、この他にも、文献：Gasiunas et al. (2020), Nat Commun, 11_5512のSupplementary Data 2に記載の、Ｌｐｎ、Ｋｈｕ、Ａｉｎ、Ｃｇｌ、Ｅｓｐ１、Ｅｓｐ２、Ｆｍａ、Ｌｃｅ、Ｌｒｈ、Ｌｓｐ１、Ｌｓｐ２、Ｐａｃ、Ｔｂａ、Ｔｄｅ、Ｔｐｕ、Ｖｐａ、Ｅｆａ、Ｅｉｔ、Ｌａｎ、Ｌｍｏ、Ｓａｇ１、Ｓａｇ２、Ｓｄｙ、Ｓｅｑ１、Ｓｅｑ２、Ｓｇａ、Ｓｍｕ、Ｓｒａ、Ｂｎｉ、Ｅｃｅ、Ｅｄｏ、Ｆｈｏ、Ｍｇａ、Ｍｓｅ、Ｓｇｏ、Ｓｍａ２、Ｓｓａ、Ｓｓｉ、Ｓｓｕ、Ｓｔｈ１Ａ、Ｔｓｐ、Ｂｏｋ、Ｃｃｏ、Ｃｐｅ、Ｄｄｅ、Ｇｈｃ２、Ｇｈｙ３、Ｇｈｙ４、Ｇｓｐ、Ｋｋｉ、Ｎｍｅ２、Ｎｓｐ、Ｔｍｏ、Ｎｓａ、Ｊｐａ、Ｒｓｐ、Ｂｂｏ、Ｃｃａ２、Ｃｍｅ２、Ｃｍｅ３、Ｃｍｅ４、Ｃｓａ、Ｇｈｃ１、Ｇｈｅ、Ｇｈｈ１、Ｇｈｈ２、Ｇｈｙ１、Ｍｓｃ、Ｓｄｏ、Ｓｐａ、Ｃｃａ１、Ｃｇａ、Ｃｍｅ１、Ｆｆｒ、Ｇｈｙ２、Ｏｒｈ、Ｐｈｉ、Ｐｓｐ、Ｗｖｉ等のＣａｓ９を挙げることができる。
さらに、Ｃａｓ９は、アミノ酸置換を有するか、及び／又はエフェクター分子と結合していてもよい。アミノ酸置換したＣａｓ９として、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９ともいう）のＲ６９１Ａ変異（ＨｉＦｉＣａｓ９ともいう）等の高特異性変異、ＳｐＣａｓ９のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異（ｄＣａｓ９）等のヌクレアーゼ不活性化変異等を挙げることができる。エフェクター分子として、相同組み換え修復を促進するためのＲａｄ５１タンパク質、マイクロホモロジーを介した末端結合を促進するためのＣｔＩＰタンパク質を挙げることができる。エフェクター分子は、リンカーを介してＣａｓ９に結合され得る。また、Ｃａｓ９として、Ｈ８４０Ａ変異を有するｎＣａｓ９に逆転写酵素をエフェクターとして結合させることができる。
本明細書において、「Ｃａｓ９」は、上記様々な生物由来する野生型Ｃａｓ９、アミノ酸置換を有する変異型Ｃａｓ９、エフェクター分子と結合した変異型Ｃａｓ９等を含み得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、タンパク質、又はタンパク質をコードする核酸の状態で細胞、個体、又は組織に導入することができる。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、タンパク質、又はタンパク質をコードする核酸の状態で細胞、個体、又は組織に導入することができる。
本実施形態のゲノム編集方法が適用される生物は、特に制限されない。生物は、原核細胞生物であっても、真核細胞生物、真核細胞生物由来の培養細胞であってもよい。真核細胞生物として、例えば、魚類、は虫類、両生類、鳥類、哺乳類、昆虫、甲殻類、節足動物、軟体動物、棘皮動物、刺胞動物、環形動物、線形動物等の動物細胞生物、植物、藻類等の植物細胞生物、真菌類、原生生物等を挙げることができる。
５．ゲノム編集キット
第４の実施形態は、上記１．において述べたｔｒａｃｒＲＮＡユニット、ｃｒＲＮＡ、及びＣＲＩＳＰＲ酵素又はこれをコードする核酸を含む、ゲノム編集キットに関する。各用語の説明は、上記１．及び４．の説明をここに援用する。
第４の実施形態は、上記１．において述べたｔｒａｃｒＲＮＡユニット、ｃｒＲＮＡ、及びＣＲＩＳＰＲ酵素又はこれをコードする核酸を含む、ゲノム編集キットに関する。各用語の説明は、上記１．及び４．の説明をここに援用する。
第５の実施形態は、上記２．において述べたキメラＲＮＡ、及びＣＲＩＳＰＲ酵素又はこれをコードする核酸を含む、ゲノム編集キットに関する。各用語の説明は、上記２．、４．の説明をここに援用する。
第６の実施形態は、上記３．において述べたｔｒａｃｒＲＮＡユニットを構成する各ＲＮＡをコードする、又はキメラＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメント；及びＣＲＩＳＰＲ酵素又はこれをコードする核酸を含む、ゲノム編集キットに関する。各用語の説明は、上記３．、４．の説明をここに援用する。
６．変形例
本明細書に開示されるｔｒａｃｒＲＮＡユニットを構成する各ＲＮＡ鎖、キメラＲＮＡは、５’及び／又は３’末端に、機能的モチーフを備えていてもよい。機能的モチーフとして、例えばビオチン標識、ヌクレアーゼ耐性修飾、蛍光標識、タンパク質結合モチーフ等を挙げることができる。
本明細書に開示されるｔｒａｃｒＲＮＡユニットを構成する各ＲＮＡ鎖、キメラＲＮＡは、５’及び／又は３’末端に、機能的モチーフを備えていてもよい。機能的モチーフとして、例えばビオチン標識、ヌクレアーゼ耐性修飾、蛍光標識、タンパク質結合モチーフ等を挙げることができる。
以下に実施例を示して、本発明の態様についてより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定して解釈されるものではない。
１．ゲノム編集実験のためのツール設計
（１）crRNA
本明細書において、crRNAのヌクレオチド配列は、標的DNAとの塩基対形成が２０ヌクレオチドである場合、「N」を任意のヌクレオチドとして、5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3’（配列番号２）である。本実施例において、標的遺伝子はメダカのslc45a2であり、PAMを含む標的配列は5’ -ACGGAGCGCACTGGAAGCTGAGG-3’（配列番号３）であり、crRNAのヌクレオチド配列は5’-ACGGAGCGCACUGGAAGCUGGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3’（配列番号４）である。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
（１）crRNA
本明細書において、crRNAのヌクレオチド配列は、標的DNAとの塩基対形成が２０ヌクレオチドである場合、「N」を任意のヌクレオチドとして、5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3’（配列番号２）である。本実施例において、標的遺伝子はメダカのslc45a2であり、PAMを含む標的配列は5’ -ACGGAGCGCACTGGAAGCTGAGG-3’（配列番号３）であり、crRNAのヌクレオチド配列は5’-ACGGAGCGCACUGGAAGCUGGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3’（配列番号４）である。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
（２）通常型tracrRNA
本明細書において、通常型tracrRNAのヌクレオチド配列は、図２に示す5’-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号１）であり、nt No.２４～３４を「第１ステムループ」、nt No.３５～３９を「リンカー」、nt No.４０～５３を「第２ステムループ」と称する。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
本明細書において、通常型tracrRNAのヌクレオチド配列は、図２に示す5’-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号１）であり、nt No.２４～３４を「第１ステムループ」、nt No.３５～３９を「リンカー」、nt No.４０～５３を「第２ステムループ」と称する。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
（３）tracrRNAにおける５’側配列の短縮
上記（２）に記載した通常型tracrRNAから、nt No.１～８を削除した。短縮後のヌクレオチド配列は、5’-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号５）である。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
上記（２）に記載した通常型tracrRNAから、nt No.１～８を削除した。短縮後のヌクレオチド配列は、5’-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号５）である。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
（４）tracrRNAにおけるリンカーの短縮
上記（２）に記載した通常型tracrRNAから、nt No.３６～３９を削除した。短縮後のヌクレオチド配列は、5’-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号６）である。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
上記（２）に記載した通常型tracrRNAから、nt No.３６～３９を削除した。短縮後のヌクレオチド配列は、5’-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号６）である。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
（５）tracrRNAにおける第１ステムループの分割
上記（２）に記載した通常型tracrRNAを、nt No.１～２８およびnt No.２９～６９に分割し、5’側に位置する第１の一本鎖RNAの3’側に5’-CCGG-3’を付与し、3’側に位置する第２の一本鎖RNAの5’側に5’-CCGG-3’を付与した。ユニットの配列を図３ａに示す。第１の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUCCGG-3’（配列番号７）であり、第２の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-CCGGAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号８）である。ワトソン・クリック塩基対形成により、図３ａにおいて配列番号７により示される第１の一本鎖RNAのnt No.２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２は、図３ａにおいて配列番号８により示される第２の一本鎖RNAのnt No.９、８、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想され、ミスマッチ塩基対形成により、図３ａにおいて配列番号７により示される第１の一本鎖RNAのnt No.２４は、図３ａにおいて配列番号８により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１０と相互作用することが予想される。配列番号７の１番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の１番目の「ａ」に対応し、配列番号８の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の２９番目の「ａ」に対応する。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
上記（２）に記載した通常型tracrRNAを、nt No.１～２８およびnt No.２９～６９に分割し、5’側に位置する第１の一本鎖RNAの3’側に5’-CCGG-3’を付与し、3’側に位置する第２の一本鎖RNAの5’側に5’-CCGG-3’を付与した。ユニットの配列を図３ａに示す。第１の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUCCGG-3’（配列番号７）であり、第２の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-CCGGAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号８）である。ワトソン・クリック塩基対形成により、図３ａにおいて配列番号７により示される第１の一本鎖RNAのnt No.２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２は、図３ａにおいて配列番号８により示される第２の一本鎖RNAのnt No.９、８、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想され、ミスマッチ塩基対形成により、図３ａにおいて配列番号７により示される第１の一本鎖RNAのnt No.２４は、図３ａにおいて配列番号８により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１０と相互作用することが予想される。配列番号７の１番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の１番目の「ａ」に対応し、配列番号８の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の２９番目の「ａ」に対応する。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
（６）tracrRNAにおける第２ステムループの分割
上記（２）に記載した通常型tracrRNAを、nt No.１～４４およびnt No.４９～６９に分割し、5'側に位置する第１の一本鎖RNAの3'側に5’-GGCC-3’を付与し、3’側に位置する第２の一本鎖RNAの5’側に5’-GGCC-3’を付与した。ユニットの配列を図３ｂに示す。図３ｂにおいて配列番号９により示される第１の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCC-3’（配列番号９）であり、図３ｂにおいて配列番号１０により示される第２の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-GGCCAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号１０）である。ワトソン・クリック塩基対形成により、第１の一本鎖RNAのnt No.４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８は、第２の一本鎖RNAのnt No.８、７、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想され、ミスマッチ塩基対形成により、第１の一本鎖RNAのnt No.４０は、第２の一本鎖RNAのnt No.９と相互作用することが予想される。配列番号９の１番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の１番目の「ａ」に対応し、配列番号１０の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の４９番目の「ａ」に対応する。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
上記（２）に記載した通常型tracrRNAを、nt No.１～４４およびnt No.４９～６９に分割し、5'側に位置する第１の一本鎖RNAの3'側に5’-GGCC-3’を付与し、3’側に位置する第２の一本鎖RNAの5’側に5’-GGCC-3’を付与した。ユニットの配列を図３ｂに示す。図３ｂにおいて配列番号９により示される第１の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCC-3’（配列番号９）であり、図３ｂにおいて配列番号１０により示される第２の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-GGCCAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号１０）である。ワトソン・クリック塩基対形成により、第１の一本鎖RNAのnt No.４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８は、第２の一本鎖RNAのnt No.８、７、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想され、ミスマッチ塩基対形成により、第１の一本鎖RNAのnt No.４０は、第２の一本鎖RNAのnt No.９と相互作用することが予想される。配列番号９の１番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の１番目の「ａ」に対応し、配列番号１０の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の４９番目の「ａ」に対応する。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
（７）tracrRNAにおける５’側配列の短縮、リンカーの短縮、および第２ステムループの分割
上記（２）に記載した通常型tracrRNAから、nt No.１～８およびnt No.３６～３９を削除し、nt No.９～３５、４０～４４およびnt No.４９～６９に分割し、5’側に位置する第１の一本鎖RNAの3’側に5’-GGCC-3’を付与し、3'側に位置する第２の一本鎖RNAの5'側に5’-GGCC-3’を付与した。ユニットの配列を図４ａに、ユニットの予測される構造を図４ｂに示す。第１の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUAACUUGGCC-3’（配列番号１１）であり、第２の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-GGCCAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号１０）である。ワトソン・クリック塩基対形成により、図４ａにおいて配列番号１１により示される第１の一本鎖RNAのnt No. ２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６は、図４ａにおいて配列番号１０により示される第２の一本鎖RNAのnt No. ８、７、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想され、ミスマッチ塩基対形成により、図４ａにおいて配列番号１１により示される第１の一本鎖RNAのnt No. ２８は、図４ａにおいて配列番号１０により示される第２の一本鎖RNAのnt No. ９と相互作用することが予想される。配列番号１１の１番目の「ｕ」は、図２に示す配列番号１の9番目の「ｕ」に対応し、配列番号１０の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の４９番目の「ａ」に対応する。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
上記（２）に記載した通常型tracrRNAから、nt No.１～８およびnt No.３６～３９を削除し、nt No.９～３５、４０～４４およびnt No.４９～６９に分割し、5’側に位置する第１の一本鎖RNAの3’側に5’-GGCC-3’を付与し、3'側に位置する第２の一本鎖RNAの5'側に5’-GGCC-3’を付与した。ユニットの配列を図４ａに、ユニットの予測される構造を図４ｂに示す。第１の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUAACUUGGCC-3’（配列番号１１）であり、第２の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-GGCCAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号１０）である。ワトソン・クリック塩基対形成により、図４ａにおいて配列番号１１により示される第１の一本鎖RNAのnt No. ２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６は、図４ａにおいて配列番号１０により示される第２の一本鎖RNAのnt No. ８、７、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想され、ミスマッチ塩基対形成により、図４ａにおいて配列番号１１により示される第１の一本鎖RNAのnt No. ２８は、図４ａにおいて配列番号１０により示される第２の一本鎖RNAのnt No. ９と相互作用することが予想される。配列番号１１の１番目の「ｕ」は、図２に示す配列番号１の9番目の「ｕ」に対応し、配列番号１０の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の４９番目の「ａ」に対応する。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
（８）tracrRNAにおける第１ステムループおよび第２ステムループの分割
上記（２）に記載した通常型tracrRNAを、nt No. １～２８、nt No. ２９～４４、およびnt No. ４９～６９に分割し、最も5’側に位置する第１の一本鎖RNAの3’側に5’-CCGG-3’を付与し、中央に位置する第２の一本鎖RNAの5’側に5’-CCGG-3’、3’側に5’-GGCC-3’を付与し、最も3’側に位置する第３の一本鎖RNAの5’側に5’-GGCC-3’を付与した。ユニットの配列を図５ａに、ユニットの予測される構造を図５ｂに示す。第１の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUCCGG-3’（配列番号７）であり、第２の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’ -CCGGAGUCCGUUAUCAACUUGGCC-3’（配列番号１２）であり、第３の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-GGCCAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号１０）である。ワトソン・クリック塩基対形成により、図５ａにおいて配列番号７により示される第１の一本鎖RNAのnt No.２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２は、図５ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.９、８、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想され、図５ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４は、図５ａにおいて配列番号１０により示される第３の一本鎖RNAのnt No.８、７、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想される。ミスマッチ塩基対形成により、図５ａにおいて配列番号７により示される第１の一本鎖RNAのnt No.２４は、図５ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１０と相互作用することが予想され、図５ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１６は、図５ａにおいて配列番号１０により示される第３の一本鎖RNAのnt No.９と相互作用することが予想される。配列番号７の１番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の１番目の「ａ」に対応し、配列番号１２の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の２９番目の「ａ」に対応し、配列番号１０の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の４９番目の「ａ」に対応する。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
上記（２）に記載した通常型tracrRNAを、nt No. １～２８、nt No. ２９～４４、およびnt No. ４９～６９に分割し、最も5’側に位置する第１の一本鎖RNAの3’側に5’-CCGG-3’を付与し、中央に位置する第２の一本鎖RNAの5’側に5’-CCGG-3’、3’側に5’-GGCC-3’を付与し、最も3’側に位置する第３の一本鎖RNAの5’側に5’-GGCC-3’を付与した。ユニットの配列を図５ａに、ユニットの予測される構造を図５ｂに示す。第１の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUCCGG-3’（配列番号７）であり、第２の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’ -CCGGAGUCCGUUAUCAACUUGGCC-3’（配列番号１２）であり、第３の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-GGCCAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号１０）である。ワトソン・クリック塩基対形成により、図５ａにおいて配列番号７により示される第１の一本鎖RNAのnt No.２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２は、図５ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.９、８、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想され、図５ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４は、図５ａにおいて配列番号１０により示される第３の一本鎖RNAのnt No.８、７、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想される。ミスマッチ塩基対形成により、図５ａにおいて配列番号７により示される第１の一本鎖RNAのnt No.２４は、図５ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１０と相互作用することが予想され、図５ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１６は、図５ａにおいて配列番号１０により示される第３の一本鎖RNAのnt No.９と相互作用することが予想される。配列番号７の１番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の１番目の「ａ」に対応し、配列番号１２の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の２９番目の「ａ」に対応し、配列番号１０の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の４９番目の「ａ」に対応する。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
（９）tracrRNAにおける５’側配列の短縮、第１ステムループの分割、および第２ステムループの分割
上記（２）に記載した通常型tracrRNAから、nt No.１～８を削除し、nt No.９～２８、nt No.２９～４４、およびnt No.４９～６９に分割し、最も5’側に位置する第１の一本鎖RNAの3’側に5’-CCGG-3’を付与し、中央に位置する第２の一本鎖RNAの5’側に5’-CCGG-3’、3’側に5’-GGCC-3’を付与し、最も3’側に位置する第３の一本鎖RNAの5’側に5’-GGCC-3’を付与した。ユニットの配列を図６ａに、ユニットの予測される構造を図６ｂに示す。第１の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUCCGG-3’（配列番号１３）であり、第２の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-CCGGAGUCCGUUAUCAACUUGGCC-3’（配列番号１２）であり、第３の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-GGCCAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号１０）である。ワトソン・クリック塩基対形成により、図６ａにおいて配列番号１３により示される第１の一本鎖RNAのnt No.１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４は、図６ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.９、８、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想され、図６ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４は、図６ａにおいて配列番号１０により示される第３の一本鎖RNAのnt No.８、７、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想される。ミスマッチ塩基対形成により、図６ａにおいて配列番号１３により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１６は、図６ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１０と相互作用することが予想され、図６ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１６は、図６ａにおいて配列番号１０により示される第３の一本鎖RNAのnt No.９と相互作用することが予想される。配列番号１３の１番目の「ｕ」は、図２に示す配列番号１の9番目の「ｕ」に対応し、配列番号１２の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の２９番目の「ａ」に対応し、配列番号１０の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の４９番目の「ａ」に対応する。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
上記（２）に記載した通常型tracrRNAから、nt No.１～８を削除し、nt No.９～２８、nt No.２９～４４、およびnt No.４９～６９に分割し、最も5’側に位置する第１の一本鎖RNAの3’側に5’-CCGG-3’を付与し、中央に位置する第２の一本鎖RNAの5’側に5’-CCGG-3’、3’側に5’-GGCC-3’を付与し、最も3’側に位置する第３の一本鎖RNAの5’側に5’-GGCC-3’を付与した。ユニットの配列を図６ａに、ユニットの予測される構造を図６ｂに示す。第１の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUCCGG-3’（配列番号１３）であり、第２の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-CCGGAGUCCGUUAUCAACUUGGCC-3’（配列番号１２）であり、第３の一本鎖RNAのヌクレオチド配列は、5’-GGCCAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’（配列番号１０）である。ワトソン・クリック塩基対形成により、図６ａにおいて配列番号１３により示される第１の一本鎖RNAのnt No.１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４は、図６ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.９、８、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想され、図６ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４は、図６ａにおいて配列番号１０により示される第３の一本鎖RNAのnt No.８、７、６、５、４、３、２、１と相互作用することが予想される。ミスマッチ塩基対形成により、図６ａにおいて配列番号１３により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１６は、図６ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１０と相互作用することが予想され、図６ａにおいて配列番号１２により示される第２の一本鎖RNAのnt No.１６は、図６ａにおいて配列番号１０により示される第３の一本鎖RNAのnt No.９と相互作用することが予想される。配列番号１３の１番目の「ｕ」は、図２に示す配列番号１の9番目の「ｕ」に対応し、配列番号１２の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の２９番目の「ａ」に対応し、配列番号１０の５番目の「ａ」は、図２に示す配列番号１の４９番目の「ａ」に対応する。RNAの合成は、Fasmac社が実施した。
２．インビトロ切断アッセイ
（１）基質DNAの作製
メダカゲノムDNAより、slc45a2遺伝子座の標的配列周辺を、KOD FX（東洋紡社）並びにフォワードプライマー5’-GTCACTCTGTATTGGGGCGCCTCCT-3’（配列番号１４）およびリバースプライマー5’-CTTGGCCTGATCTCAGGGCTGGATG-3’（配列番号１５）を用いて、メダカゲノムDNAからPCR増幅した。プライマーの合成は、ユーロフィンジェノミクス社が実施した。増幅産物を、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（タカラバイオ社）を用いて精製し、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific社）を用いてＤＮＡ濃度を測定した。DNA １００ngを含む溶液にローディングバッファーを加え、ミドリグリーン（日本ジェネティクス社）を添加したアガロースゲルで電気泳動し、バンドを確認した。設計上のヌクレオチド長は２５３塩基対である。
（１）基質DNAの作製
メダカゲノムDNAより、slc45a2遺伝子座の標的配列周辺を、KOD FX（東洋紡社）並びにフォワードプライマー5’-GTCACTCTGTATTGGGGCGCCTCCT-3’（配列番号１４）およびリバースプライマー5’-CTTGGCCTGATCTCAGGGCTGGATG-3’（配列番号１５）を用いて、メダカゲノムDNAからPCR増幅した。プライマーの合成は、ユーロフィンジェノミクス社が実施した。増幅産物を、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（タカラバイオ社）を用いて精製し、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific社）を用いてＤＮＡ濃度を測定した。DNA １００ngを含む溶液にローディングバッファーを加え、ミドリグリーン（日本ジェネティクス社）を添加したアガロースゲルで電気泳動し、バンドを確認した。設計上のヌクレオチド長は２５３塩基対である。
（２）crRNAおよびtracrRNAユニットのアニーリング
上記１．（１）に記載した、メダカのslc45a2遺伝子を標的とするcrRNA ４０～２００ ng/μL（終濃度）と、上記１．（２）～（９）に記載した第１の一本鎖RNA、及び第２の一本鎖RNA；または第１の一本鎖RNA、第２の一本鎖RNA、及び第３の一本鎖RNAを等モル量となるように混合した。tracrRNAを構成する各一本鎖RNAのモル数は、ヌクレオチド長を基準とし、下記のように計算した。
（crRNA濃度 ng/μL）×（各一本鎖RNAのヌクレオチド長）／４２
混合液は、サーマルサイクラーを用いて、９５℃で５分間加熱後、毎秒０．１℃ずつ２５℃まで下げ、４℃で保存した。
上記１．（１）に記載した、メダカのslc45a2遺伝子を標的とするcrRNA ４０～２００ ng/μL（終濃度）と、上記１．（２）～（９）に記載した第１の一本鎖RNA、及び第２の一本鎖RNA；または第１の一本鎖RNA、第２の一本鎖RNA、及び第３の一本鎖RNAを等モル量となるように混合した。tracrRNAを構成する各一本鎖RNAのモル数は、ヌクレオチド長を基準とし、下記のように計算した。
（crRNA濃度 ng/μL）×（各一本鎖RNAのヌクレオチド長）／４２
混合液は、サーマルサイクラーを用いて、９５℃で５分間加熱後、毎秒０．１℃ずつ２５℃まで下げ、４℃で保存した。
（３）インビトロ切断アッセイ
上記（２）でアニーリングさせたＲＮＡ溶液に、Cas9タンパク質（Fasmac社）を0.5～2 μg/μL（終濃度）、上記（１）で調製した基質DNAを２０ ng/μL（終濃度）、Hバッファー（タカラバイオ社）を加えた。サーマルサイクラーを用いて、３７℃で６０分間反応後、８０℃で５分間熱処理し、４℃で保存した。
上記（２）でアニーリングさせたＲＮＡ溶液に、Cas9タンパク質（Fasmac社）を0.5～2 μg/μL（終濃度）、上記（１）で調製した基質DNAを２０ ng/μL（終濃度）、Hバッファー（タカラバイオ社）を加えた。サーマルサイクラーを用いて、３７℃で６０分間反応後、８０℃で５分間熱処理し、４℃で保存した。
（４）アガロースゲル電気泳動
上記（３）の切断産物に、RNaseA（ニッポンジーン社）を1 μg/μL（終濃度）加え、サーマルサイクラーを用いて３７℃で３０分間反応後、８０℃で５分間熱処理し、４℃で保存した。ローディングバッファーを加え、ミドリグリーン（日本ジェネティクス社）を添加した３％のアガロースゲルで泳動し、LED照射によりバンドを確認した。未切断の基質DNAは２５３塩基対、切断後の基質ＤＮＡは１４４塩基対および１０９塩基対であることが予想される。
上記（３）の切断産物に、RNaseA（ニッポンジーン社）を1 μg/μL（終濃度）加え、サーマルサイクラーを用いて３７℃で３０分間反応後、８０℃で５分間熱処理し、４℃で保存した。ローディングバッファーを加え、ミドリグリーン（日本ジェネティクス社）を添加した３％のアガロースゲルで泳動し、LED照射によりバンドを確認した。未切断の基質DNAは２５３塩基対、切断後の基質ＤＮＡは１４４塩基対および１０９塩基対であることが予想される。
（５）結果
上記図７に、Streptococcus pyogenes由来のCas9タンパク質、並びにアニーリングさせた１．（１）に記載したcrRNAおよび１．（２）～（９）に記載した第１の一本鎖RNA、及び第２の一本鎖RNA；または第１の一本鎖RNA、第２の一本鎖RNA、及び第３の一本鎖RNAからなるtracrRNAを用いたインビトロ切断アッセイの結果を示す。各設計において、１１４塩基対および１０９塩基対とみられる切断産物が生じ、ＤＮＡ切断活性を有すること認められた。
上記図７に、Streptococcus pyogenes由来のCas9タンパク質、並びにアニーリングさせた１．（１）に記載したcrRNAおよび１．（２）～（９）に記載した第１の一本鎖RNA、及び第２の一本鎖RNA；または第１の一本鎖RNA、第２の一本鎖RNA、及び第３の一本鎖RNAからなるtracrRNAを用いたインビトロ切断アッセイの結果を示す。各設計において、１１４塩基対および１０９塩基対とみられる切断産物が生じ、ＤＮＡ切断活性を有すること認められた。
３．メダカ受精卵における変異の導入
（１）メダカ受精卵の取得
性成熟した雌雄のメダカを水槽内で共存させ、産卵直後の受精卵を採取した。
（１）メダカ受精卵の取得
性成熟した雌雄のメダカを水槽内で共存させ、産卵直後の受精卵を採取した。
（２）CRISPR溶液を細胞に注射するためのマイクロインジェクション
上記（１）に記載の方法により、メダカ受精卵を取得した。上記２．（２）に記載の方法により、メダカのslc45a2遺伝子座を標的とするcrRNA並びに第１の一本鎖RNA、及び第２の一本鎖RNA；または第１の一本鎖RNA、第２の一本鎖RNA、及び第３の一本鎖RNAからなるtracrRNAをアニーリングさせ、Cas9タンパク質（Fasmac社）を0.5～2 μg/μL（終濃度）、ＧＦＰ mRNAを５０ng/μL（終濃度）、ｃｒＲＮＡを４０～１６０ng/μL（終濃度）、tracrRNAを６０～２４０ng/μL（終濃度）加え、受精卵１個あたり１～５ｎLを、マイクロインジェクション法により導入し、少量のメチレンブルーを加えた飼育水に移して２６℃で維持した。翌日、GFPの蛍光シグナルを有する胚を、正しく細胞内にCRISPR溶液を注射した卵として選抜した。
上記（１）に記載の方法により、メダカ受精卵を取得した。上記２．（２）に記載の方法により、メダカのslc45a2遺伝子座を標的とするcrRNA並びに第１の一本鎖RNA、及び第２の一本鎖RNA；または第１の一本鎖RNA、第２の一本鎖RNA、及び第３の一本鎖RNAからなるtracrRNAをアニーリングさせ、Cas9タンパク質（Fasmac社）を0.5～2 μg/μL（終濃度）、ＧＦＰ mRNAを５０ng/μL（終濃度）、ｃｒＲＮＡを４０～１６０ng/μL（終濃度）、tracrRNAを６０～２４０ng/μL（終濃度）加え、受精卵１個あたり１～５ｎLを、マイクロインジェクション法により導入し、少量のメチレンブルーを加えた飼育水に移して２６℃で維持した。翌日、GFPの蛍光シグナルを有する胚を、正しく細胞内にCRISPR溶液を注射した卵として選抜した。
（３）ゲノム編集による表現型の解析
マイクロインジェクションから４日後、実体顕微鏡（Olympus社）を用いて、メダカ胚の眼を観察した。slc45a2遺伝子に変異が導入された場合、黒色色素胞が形成されないことから、眼の一部または全体の黒色色素が欠損することが予想される。観察を終えた胚は、次項に記載の解析まで維持した。
マイクロインジェクションから４日後、実体顕微鏡（Olympus社）を用いて、メダカ胚の眼を観察した。slc45a2遺伝子に変異が導入された場合、黒色色素胞が形成されないことから、眼の一部または全体の黒色色素が欠損することが予想される。観察を終えた胚は、次項に記載の解析まで維持した。
（４）メダカ破砕液の作製
上記（３）で取得した受精卵を、１×メダカECM（0.1% NaCl, 0.003% KCl, 0.004% CaCl2, 0.016% MgSO4）に少量のメチレンブルーを加えた飼育水に移し、２６℃のインキュベーターで維持した。５～１０日後、２５μLのアルカリバッファー（25 mM NaOH、0.2 mM EDTA）に入れ、２００ μLチップで卵膜を破り、サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間熱処理した。等量（２５μL）の４０ｍM Tris-HCl（pH 8.0）を加えて、中和後に、ゲノムDNAサンプルとして、４℃で保存した。
上記（３）で取得した受精卵を、１×メダカECM（0.1% NaCl, 0.003% KCl, 0.004% CaCl2, 0.016% MgSO4）に少量のメチレンブルーを加えた飼育水に移し、２６℃のインキュベーターで維持した。５～１０日後、２５μLのアルカリバッファー（25 mM NaOH、0.2 mM EDTA）に入れ、２００ μLチップで卵膜を破り、サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間熱処理した。等量（２５μL）の４０ｍM Tris-HCl（pH 8.0）を加えて、中和後に、ゲノムDNAサンプルとして、４℃で保存した。
（５）ヘテロ二本鎖移動度解析（ＨＭＡ）による変異解析
マイクロインジェクションから５～１０日後、上記（４）に記載の方法により、メダカ胚を破砕した。上記２．（３）に記載の領域をPCR増幅し、MultiNA（島津社）を用いて電気泳動した。標的領域に変異が導入された場合、PCRにおけるアニーリングの過程でヘテロ二重鎖が生じ、物理的特性による泳動度の違いから、バンドシフトが起こることが予想される。より強く変異が導入された場合は、多様な変異が多数出現するため、バンドシフトがより強く検出されると予想される。
マイクロインジェクションから５～１０日後、上記（４）に記載の方法により、メダカ胚を破砕した。上記２．（３）に記載の領域をPCR増幅し、MultiNA（島津社）を用いて電気泳動した。標的領域に変異が導入された場合、PCRにおけるアニーリングの過程でヘテロ二重鎖が生じ、物理的特性による泳動度の違いから、バンドシフトが起こることが予想される。より強く変異が導入された場合は、多様な変異が多数出現するため、バンドシフトがより強く検出されると予想される。
（６）サンガーシーケンス法による変異解析
上記（３）に記載のPCRにより生じた増幅産物を用いて、サンガーシーケンス法により、ヌクレオチド配列の波形を得た。サンガーシーケンス法は、ユーロフィンジェノミクス社が実施した。TIDE（オランダがん研究所）を用いて、変異アレルの配列および出現頻度を推定した。
上記（３）に記載のPCRにより生じた増幅産物を用いて、サンガーシーケンス法により、ヌクレオチド配列の波形を得た。サンガーシーケンス法は、ユーロフィンジェノミクス社が実施した。TIDE（オランダがん研究所）を用いて、変異アレルの配列および出現頻度を推定した。
（７）結果
図８に、Cas9タンパク質、並びにアニーリングさせた上記１．（１）に記載したcrRNAおよび上記１．（５）～（９）に記載した第１の一本鎖RNA、及び第２の一本鎖RNA；または第１の一本鎖RNA、第２の一本鎖RNA、及び第３の一本鎖RNAからなるtracrRNAを注入したメダカ胚の眼を観察した結果を示す。いずれも複数の胚において、眼の全体または一部における黒色色素の欠損が認められた。
図８に、Cas9タンパク質、並びにアニーリングさせた上記１．（１）に記載したcrRNAおよび上記１．（５）～（９）に記載した第１の一本鎖RNA、及び第２の一本鎖RNA；または第１の一本鎖RNA、第２の一本鎖RNA、及び第３の一本鎖RNAからなるtracrRNAを注入したメダカ胚の眼を観察した結果を示す。いずれも複数の胚において、眼の全体または一部における黒色色素の欠損が認められた。
図９に、Cas9タンパク質、並びにアニーリングさせた上記１．（１）に記載したcrRNAおよび上記１．（５）～（９）に記載した第１の一本鎖RNA、及び第２の一本鎖RNA；または第１の一本鎖RNA、第２の一本鎖RNA、及び第３の一本鎖RNAからなるtracrRNAを注入したメダカ胚のライセートを用いた、HMA解析の結果を示す。いずれも複数の胚において、変異導入によるバンドシフトが認められた。
図１０に、Cas9タンパク質、並びにアニーリングさせた上記１．（１）に記載したcrRNAおよび上記１．（５）～（９）に記載した第１の一本鎖RNA、及び第２の一本鎖RNA；または第１の一本鎖RNA、第２の一本鎖RNA、及び第３の一本鎖RNAからなるtracrRNAを注入したメダカ胚のライセートを用いた、サンガーシーケンス法並びにTIDEによる変異解析の結果を示す。いずれも複数の胚において、塩基の欠失または挿入を有する変異アレルの存在が示唆された。
図１０に、Cas9タンパク質、並びにアニーリングさせた上記１．（１）に記載したcrRNAおよび上記１．（５）～（９）に記載した第１の一本鎖RNA、及び第２の一本鎖RNA；または第１の一本鎖RNA、第２の一本鎖RNA、及び第３の一本鎖RNAからなるtracrRNAを注入したメダカ胚のライセートを用いた、サンガーシーケンス法並びにTIDEによる変異解析の結果を示す。いずれも複数の胚において、塩基の欠失または挿入を有する変異アレルの存在が示唆された。
以上の結果から、tracrRNAを分割した場合、また、さらに一部のヌクレオチド配列を削除してもtracrRNAとしての機能が維持されることが示された。
Claims (7)
- ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集システムに使用するための、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから構成されるｔｒａｃｒＲＮＡユニットであって、
第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡは連結されておらず、
第１の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分と第２の部分を有し、
第１の部分と第２の部分は重複せず、第１の部分はｃｒＲＮＡの一部に相補的な配列を有し、第２の部分は第２の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有する、
ｔｒａｃｒＲＮＡユニット。 - ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集システムに使用するための、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖ＲＮＡから構成されるｔｒａｃｒＲＮＡユニットであって、
第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖ＲＮＡは連結されておらず、
第１の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分と第２の部分を有し、
第１の部分と第２の部分は重複せず、第１の部分はｃｒＲＮＡの一部に相補的な配列を有し、第２の部分は第２の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有し、
第２の一本鎖ＲＮＡが、少なくとも第１の部分を有し、
第２の一本鎖ＲＮＡの第１の部分は、第３の一本鎖ＲＮＡに相補的な配列を有する、
ｔｒａｃｒＲＮＡユニット。 - ｃｒＲＮＡと第１の一本鎖ＲＮＡが順に連結されている、請求項１又は２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
- 第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡの少なくとも一方が、３９ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項１に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
- 第１の一本鎖ＲＮＡ、第２の一本鎖ＲＮＡ、及び第３の一本鎖ＲＮＡの少なくとも１つが、３９ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット。
- 請求項１又は２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニットと、
ｃｒＲＮＡと、
Ｃａｓ９と、
を使用するゲノム編集方法（ただし、ヒトの体内において実施するゲノム編集方法は含まない）。 - 請求項１又は２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニット、又は請求項１又は２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡユニットを構成する各ＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメントと、
ｃｒＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメントと、
Ｃａｓ９、又はＣａｓ９コードする核酸と、
を含む、ゲノム編集キット。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP2022106658A JP7152094B1 (ja) | 2022-06-30 | 2022-06-30 | ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びゲノム編集方法 |
| PCT/JP2023/024367 WO2024005186A1 (ja) | 2022-06-30 | 2023-06-30 | ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びゲノム編集方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022106658A JP7152094B1 (ja) | 2022-06-30 | 2022-06-30 | ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びゲノム編集方法 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2015523856A (ja) | 2012-05-25 | 2015-08-20 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフ | Ｒｎａ依存性標的ｄｎａ修飾およびｒｎａ依存性転写調節のための方法および組成物 |
| WO2017131237A1 (ja) | 2016-01-30 | 2017-08-03 | 株式会社ボナック | 人工単一ガイドｒｎａ及びその用途 |
| JP2020510410A (ja) | 2016-12-14 | 2020-04-09 | ヴァーヘニンゲン ユニヴェルシテット | 熱安定性ｃａｓ９ヌクレアーゼ |
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|---|---|---|---|---|
| PT2784162E (pt) * | 2012-12-12 | 2015-08-27 | Broad Inst Inc | Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências |
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2022
- 2022-06-30 JP JP2022106658A patent/JP7152094B1/ja active Active
-
2023
- 2023-06-30 WO PCT/JP2023/024367 patent/WO2024005186A1/ja unknown
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Cell (2014) Vol.156, pp.935-949 |
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| WO2024005186A1 (ja) | 2024-01-04 |
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