CN102448977A - 用于聚合物合成的多路复用位点 - Google Patents

Abstract

本文公开的是用于合成聚合物的方法、设备和其它组件。在一些实施方案中，可将许多位点多路复用在一起以允许有效的核酸合成。

Description

用于聚合物合成的多路复用位点

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年4月13日提交的美国临时申请第61/168,730号和于2009年4月9日提交的美国临时申请第61/168,170号的优先权，二者以其整体通过引用并入。

发明背景

发明领域

本文所描述的实施方案涉及聚合物合成的领域。

相关技术的描述

用于合成核酸的多种方法是可获得的。所述方法包括于2008年12月25日公开的美国专利公布第2008/0318806号中描述的那些。

发明概述

在一些实施方案中，提供了允许将不同的位点多路复用(multiplexing)在一起以允许核酸合成的设备(device)和方法。在一些实施方案中，所述多路复用允许大量次级反应(期望的结构片段(buildingfragment)合成和/或这样的片段的组合)在相对小的尺寸或体积中发生，同时产生相对长的长度的聚合物。在一些实施方案中，聚合物包括核酸。

在一些实施方案中，提供了用于合成期望的聚合物的方法。在一些实施方案中，方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：(a)提供第一反应位点，该第一反应位点包括与反应位点的表面相连的第一单体；(b)选择性地照射第一反应位点，从而将另外的单体偶联于第一单体；(c)重复所述照射直至合成期望的单链片段，其中期望的单链片段在第一单体与表面相连时产生；(d)从表面分离期望的单链片段；(e)按照需要重复过程(a)至(d)以产生期望的数目的期望的单链片段；(f)将具有特定的长度和序列的第一期望的单链片段与具有特定的长度和序列的第二期望的单链片段相组合以产生第一亚聚合物；(g)将第一亚聚合物贮存于第一贮存位点；(h)重复过程(a)至(f)以生成第二亚聚合物并将所述第二亚聚合物贮存于第二贮存位点；和(i)将第一亚聚合物和第二亚聚合物组合以形成期望的聚合物。在一些实施方案中，照射过程导致光产生试剂(photo generatedreagent)，且其中所述聚合物包括核酸。在一些实施方案中，核酸包括DNA。在一些实施方案中，过程(d)包括用破环第一单体与反应位点的表面的连接而不会非故意地将另外的单体添加到期望的单链片段的光波长照射期望的单链片段。在一些实施方案中，第一和第二期望的单链片段在组合位点组合。在一些实施方案中，第一反应位点包括与第二反应位点流体地隔离的室。在一些实施方案中，过程(f)包括将第一期望的单链片段与第二期望的单链片段组合以产生一级片段。在一些实施方案中，一级片段包括双链核酸、多链片段、或双链片段和多链片段。在一些实施方案中，过程(f)包括将i)第一期望的单链片段与ii)第二期望的单链片段，和iii)第三期望的单链片段组合以形成一级片段。在一些实施方案中，一级片段是化学连接或酶连接的，形成了第一连接的一级片段。在一些实施方案中，重复以上任意过程(例如，以上的两个过程)以形成第二连接的一级片段，且其中将第一连接的一级片段和第二连接的一级片段相组合以允许第一连接的一级片段和第二连接的一级片段相互杂交，形成二级片段。在一些实施方案中，方法还包括进行连接反应的过程，从而形成连接的二级片段。在一些实施方案中，方法还包括重复以上两个过程期望的次数以形成一种或多种另外的连接的二级片段的步骤。在一些实施方案中，方法还包括将一个或多个连接的二级片段组合以产生三级片段并连接所述三级片段。在一些实施方案中，方法还包括重复以上过程一次或多次以产生一个或多个连接的三级片段。在一些实施方案中，方法还包括将一个或多个连接的三级片段组合以产生四级片段。在一些实施方案中，方法还包括重复以上过程的方法一次或多次以产生一个或多个连接的四级片段。在一些实施方案中，方法还包括将一个或多个连接的四级片段组合以产生亚聚合物。在一些实施方案中，当形成一级片段时第一和第二期望的单链片段相互杂交。在一些实施方案中，将第三、第四、第五和第六单链片段组合并使它们相互杂交以形成一级片段。在一些实施方案中，期望的聚合物包括程序化的、特定的、和/或随机的核苷酸序列。在一些实施方案中，期望的单链片段包括程序化的、特定的、和/或随机的核苷酸序列。在一些实施方案中，选择性地照射第一反应位点，从而将单体与第一单体偶联包括100至1000nm范围中的波长。在一些实施方案中，过程(d)包括100至1000nm范围中的波长，其中过程(d)中的波长可与过程(b)和/或(c)中的波长重叠或不与过程(b)和/或(c)中的波长重叠。在一些实施方案中，方法还包括过滤过程以使反应位点中已合成的不期望的单链片段不包含在亚聚合物内。在一些实施方案中，过滤发生在过程(d)之后。在一些实施方案中，过滤过程包括尺寸排阻过滤器以使比不期望的单链片段短的单链片段在其与期望的单链片段组合之前从系统中排除或去除。

在一些实施方案中，提供了用于并行和串行聚合物产生的设备，其包括第一反应位点；第二反应位点，其中第一反应位点和第二反应位点包括表面，所述表面允许聚合物与每个反应位点中的所述表面连接，其中至少两个反应位点对于允许产生光产生试剂的第一组光波长是有效地光学透明的，其中第一反应位点和第二反应位点对于允许裂解将核酸连接于所述表面的键的第二组光波长是有效地透明的；一级组合位点，其中第一反应位点和第二反应位点与一级组合位点流体连通，其中流体连通允许来自第一反应位点的样品与来自第二反应位点的样品组合，其中一级组合位点与控制一级组合位点的温度的加热元件相关联以控制核酸复性和连接；和一个或多个组合位点，所述组合位点可控地流体连接于一级组合位点，其中一个或多个贮存位点可与一级组合位点可控地流体隔离。在一些实施方案中，设备还包括至少500个核苷酸长度的核酸。在一些实施方案中，设备还包括至少10,000个核苷酸长度的核酸。在一些实施方案中，设备还包括一个或多个流体入口以用于向反应位点添加液体。在一些实施方案中，设备还包括一个或多个流体入口以用于向一级组合位点添加液体。在一些实施方案中，设备还包括光导向装置(apparatus)以用于选择性地将光导向第一反应位点而避免导将光导向第二反应位点。在一些实施方案中，光导向装置包括一套组的万向转镜(articulating mirror)。在一些实施方案中，一级组合位点包括将至少两个反应位点相互连接的通道。在一些实施方案中，设备还包括二级组合位点，其中至少两个一级组合位点与二级组合位点流体连接。在一些实施方案中，二级组合位点与控制二级组合位点的温度的加热元件相关联以控制二级组合位点中的核酸复性。在一些实施方案中，设备还包括三级组合位点，其中至少两个二级组合位点与三级组合位点流体连接。在一些实施方案中，三级组合位点与控制三级组合位点的温度的加热元件相关联以控制三级组合位点中的核酸复性。在一些实施方案中，设备还包括四级组合位点，其中至少两个三级组合位点与四级组合位点流体连接。在一些实施方案中，四级组合位点与控制四级组合位点的加热元件相关联以控制四级组合位点中的核酸复性。在一些实施方案中，设备包括至少7776个反应位点；至少216个一级组合位点；至少36个二级组合位点；至少6个三级位点；和至少6个贮存位点。在一些实施方案中，设备还包括出口。

在一些实施方案中，设备还包括一个或多个流体入口和出口以用于向反应位点添加液体和从反应位点移出液体。在一些实施方案中，设备还包括一个或多个流体入口和出口以用于向一级组合位点添加液体和从一级组合位点移出液体。在一些实施方案中，设备还包括光导向装置以用于选择性地将光导向第一反应位点而避免将光导向第二反应位点。在一些实施方案中，光导向装置包括一套组的万向转镜。在一些实施方案中，一级组合位点包括将至少两个反应位点相互连接的通道。在一些实施方案中，设备还包括一个或多个流体入口和出口以用于向二级组合位点添加液体和从二级组合位点移出液体。在一些实施方案中，设备还包括二级组合位点，其中至少两个一级组合位点与二级组合位点流体连接。在一些实施方案中，二级组合位点与控制二级组合位点的温度的加热元件相关联以控制二级组合位点中的核酸复性和连接。在一些实施方案中，设备还包括三级组合位点，其中至少两个二级组合位点与三级组合位点流体连接。在一些实施方案中，三级组合位点与控制三级组合位点的温度的加热元件相关联以控制三级组合位点中的核酸复性。在一些实施方案中，设备还包括四级组合位点，其中至少两个三级组合位点与四级组合位点流体连接。在一些实施方案中，四级组合位点与控制四级组合位点的温度的加热元件相关联以控制四级组合位点中的核酸复性。在一些实施方案中，设备包括至少7776个反应位点；至少216个一级组合位点；至少36个二级组合位点；至少6个三级组合位点；和至少6个贮存位点。在一些实施方案中，设备还包括输出端。

在一些实施方案中，提供了用于聚合物合成的设备，所述设备包括第一反应位点和第二反应位点，它们与组合位点流体连接，其中组合位点与第一贮存位点流体连接；第三反应位点和第四反应位点，它们与组合位点流体连接，其中组合位点与第二贮存位点流体连接；第二组合位点，其与第一贮存位点和第二贮存位点流体连接；和出口，其中所述出口允许第二组合位点中的流体离开设备。

在一些实施方案中，提供了DNA合成的系统，其中使用多路复用以使2个或多个反应位点塌陷(collapse)入单一通道中。

在一些实施方案中，提供了DNA合成的方法，所述方法将用于组装ssDNA的光产生酸和光裂解步骤相组合。

在一些实施方案中，提供了应用沿主要流体通道的分支通道以组装长度大于100bp的dsDNA的片段的方法。

在一些实施方案中，提供了用于聚合物合成的设备。该设备可包括第一反应位点和第二反应位点，它们与组合位点流体连接，其中组合位点与第一贮存位点流体连接；第三反应位点和第四反应位点，它们与组合位点流体连接，其中组合位点与第二贮存位点流体连接；第二组合位点，其与第一贮存位点和第二贮存位点流体连接；和出口，其中所述出口允许第二组合位点中的流体离开设备。

在一些实施方案中，提供了用于聚合物合成的设备。该设备可包括第一反应位点和第二反应位点，它们与纯化位点流体连接，随后是组合位点，其中所述组合位点与贮存位点流体连接；第三反应位点和第四反应位点，它们与纯化位点流体连接，随后是组合位点，其中所述组合位点与第二贮存位点流体连接；第二组合位点，其与第一贮存位点和第二贮存位点流体连接；出口，其中所述出口允许第二组合位点中的流体进入最终纯化位点且然后离开设备。

附图简述

图1A描绘了用于串行/并行的聚合物合成的多个实施方案的第一部分。

图1B描绘了用于串行/并行的聚合物合成的多个实施方案的第二部分。

图1C描绘了图1A中所指明的框内部分的放大，描绘了用于串行/并行的聚合物合成的多个实施方案的部分。

实施方案详述

本文提供了用于产生聚合物的的设备和方法。在一些实施方案中，设备和/或方法包括大量反应位点，比如反应孔或反应位点，其中可按需要来起初产生短的聚合物片段。在一些实施方案中，这对于大量反应位点而言并行发生，从而允许产生大量的期望的结构片段，而每个可在其自己的反应位点产生。反应位点可经由流动路径连接以允许将来自至少两个反应位点的片段运输到同一通道、室、或孔中以用于随后的组装。因此，一旦产生了片段(其可以短至单个核苷酸或聚合物的单元)，片段可从位点释放且然后在通道或组合位点或室中有序地组合。在一些实施方案中，这以大量位点来进行重复，从而允许将来自大量位点的片段串行地和/或并行地(且受控地)添加到共有的通道中，从而当聚合物移动通过系统时以有序的方式加长聚合物。在一些实施方案中，合成位点和通道是微型制造的，且可由诸如Si、玻璃、基于聚合物的基底等物质制成。在一些实施方案中，位点中聚合物片段的合成通过第一光波长来实现，而片段从位点的释放经由与第一光波长相同或不同的第二光波长来实现，其中第一光波长和第二光波长没有不利地干扰其它过程(例如，因此在每个位点的位置没有显著的不经意的片段释放或产生)。在这些实施方案中，设备中的位点对于相关光波长是足够透明的。

因为大量反应位点可并行排列，且然后成对地或以较大数目一起流动，多个期望的结构片段可通过流动路径排列和通过片段从反应位点释放来控制。这允许期望的结构片段延长并成为第一亚聚合物(较大的期望的结构片段)。然后该亚聚合物可贮存于“贮存位点”中，而该设备(或其亚部分)可用于或重新用于产生第二或更多期望的结构片段且然后形成第二或更多亚聚合物，其中的每一个可贮存于独立的贮存位点中。一旦产生了足够数目的亚聚合物而包括期望的完整聚合物的部分，可在组合位点将来自贮存位点的亚聚合物组合在一起以产生全长的期望的聚合物。该并行合成、有序组合、次级贮存且然后组合亚聚合物的组合允许多路复用具有大大减少的尺寸要求的反应位点用于合成长聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以是核酸，比如DNA或RNA。

定义：

本文所用的章节标题仅用于组织的目的而不被解释为以任何方式对所描述的主题的限制。本申请中引用的所有文献和相似的材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书、论文和互联网页明确地以其整体通过引用并入以用于任何目的。当所并入的参考文献中的术语的定义出现与本教导中提供的定义不同时，应以本教导中提供的定义为准。应理解地是，本教导中所讨论的温度、浓度、时间之前存在暗含的“大约”，因此轻微的且非实质的偏差在本教导的范围之内。在本申请中，除非另外指明，单数的使用包括复数。而且，“包括(comprise)”、“包括(comprises)”、“包括(-comprising)”、“包含(contain)”、“包含(contains)”、“包含(containing)”、“包括(include)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“包括(compose)”、“包括(composes)”和“包括(composing)”并不意在限制。应理解地是前面的一般描述和后面的详细描述仅是示例性的和阐释性的，并不限制本发明。术语“和/或”表示所提供的可能性可一起使用或两者择一来使用。因此，术语“和/或”表示对于该组可能性存在两个选择。

除非另外指明，关于本文所描述的本发明所用的科学和技术术语具有本领域中一般技术人员所通常理解的含义。并且，除非上下文另外需要，单数的术语应该包括复数且复数的术语应该包括单数。通常，关于本文所用的命名，和本文所描述的分子生物学，和蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交的技术是本领域中熟知的和常用的。可使用诸如用于遗传物质(核酸)纯化和制备、化学合成、重组核酸和寡核苷酸合成的标准技术。根据生产商的说明或如本领域中所通常实现的或本文所描述的进行酶促反应和纯化技术。本文所描述的技术和过程一般根据本领域中熟知的常规方法来进行，且如本说明书中所引用的和讨论的多个一般的和更具体的参考文献中所描述的。参见，例如，Sambrook等人、Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor、N.Y.2000)。本文所用的命名和实验室过程和技术是本领域中熟知的和常用的。

本发明人完全清楚，如果需要的话，他们可以是他们自己的词典编纂者。除非他们另外清楚地指明，作为他们自己的词典编纂者，本发明人在说明书和权利要求书中明确选择使用术语的平常的和常见的含义。

除非另外指明，如根据本文所提供的实施方案中所使用的，以下的术语应理解为具有以下的含义：

术语“期望的聚合物”表示待经由本文所公开的设备和/或方法产生的全长聚合物。当然，在使用芯片时或使用芯片之后对于期望的聚合物可进行其它改变(包括另外的单体添加或杂交)。在一些实施方案中，在具有1个反应位点至10⁶个反应位点范围内的单基因合成芯片上，期望的聚合物长度为至少2碱基至25,000kb。现有技术基因合成提供了96至1536个反应位点，允许组装最高达最大35kbp的聚合物。

术语“单体”表示组成聚合物的单独的结构单元。因此，对于核酸，单体可以是核苷酸(天然的或人工的)。

术语“片段”表示相互共价连接的两个或多个单体的集合。

术语“期望的结构片段”表示已以期望的方式连接在一起的单体的集合。术语“期望的”表示具有期望的化学组成。在核酸的情况中，这可表示期望的核酸序列。在一些实施方案中，“期望的”序列可以是独特的和/或特定的序列，和在一些实施方案中，其可包括可在组装一级、二级、三级、四级等片段的随后的杂交事件中使用的序列。在一些实施方案中，期望的结构片段包括随机的单体、由随机的单体组成或基本上由随机的单体组成，所述随机的单体比如随机的核苷酸。在一些实施方案中，期望的结构片段不包括随机的核苷酸。

术语“一级片段”表示包括至少两个期望的结构片段的片段。术语“二级片段”表示包括至少两个一级片段的片段。术语“三级片段”表示包括至少两个二级片段的片段。术语“四级片段”表示包括至少两个三级片段的片段。术语“五级片段”表示包括至少两个四级片段的片段。理论上，对可以具有的可能级别的片段的数目没有限制。因此，可这样来指定“xxxx-级片段”而没有限制(因此，本文描述了六级、七级、八级至n级片段)。

“连接的”片段指已经连接在一起的片段，从而片段中去除了任何单链断裂。因此，单独的链此时是充分连续的。在核酸的情况中，这表示双链片段的单独的链已经连接在一起(例如，这可以通过连接酶或通过化学方法来完成)而使得存在两个相互杂交的连续的链。当用于非核酸实施方案时，“连接”简单地表示已经连接在一起的片段。

术语“亚聚合物”表示相互共价连接的两个或多个片段的集合，然后其贮存于贮存位点中。

术语“寡(oligo)”表示寡核苷酸，其为单链的核酸，可以是长度通常为2至500单体的DNA、RNA、PNA和/或其它核酸类似物。

术语“反应位点”表示与其它这样的反应位点相对隔离的、其中可发生特定化学反应的区域(比如室或孔)。在一些实施方案中，反应位点允许多种光波长的传播，在一些实施方案中，所述传播可诱导从单体产生片段和/或从反应位点的壁或表面释放片段。

术语“贮存位点”表示与另一个贮存位点相隔离的位置。亚聚合物或片段可贮存于贮存位点中，同时可重新使用上游系统以产生不同的亚聚合物。

当指用于偶联的光波长和用于分离(或脱附)的光波长之间不存在任何重叠时，术语“重叠”表示对正在用的系统非问题性的任何程度的光学重叠。如将被理解地，不同的化学实体可吸收一系列的波长，而非简单地一个或两个波长；然而，在极端情况下该吸收光谱的效率可以足够低，而不会由于重叠产生任何问题性结果(例如，任何量的不经意的偶联和/或分离将在噪声级内或为产物的无意义的量)。在一些实施方案中，绝对地无重叠。在一些实施方案中，任何重叠导致对于事件之一超越其它事件至少100倍的偏倚(例如，至少1000、10,000、100,000、1,000,000或更多的偏倚)。在一些实施方案中，寡核苷酸的偶联波长和分离(或脱附)波长是同一波长或是重叠的。在一些实施方案中，这可通过使用光产生裂解试剂来实现。

术语“选择性地照射”表示将(任何波长的)光能量导向到期望的位置。在一些实施方案中，选择性地将光导向到第一位置而非导向到第二位置(比如第二反应位点)。在一些实施方案中，一些光可“渗出”到周围反应位点上，然而，光密度将不足够大而产生显著的量的不经意的反应(偶联和/或分离(或脱附))。可以任何数目的方法来导向光，包括，镜子、过滤器、透镜等。

术语“有效地透明”表示允许足够量的期望的波长的光穿透结构的结构。如将被本领域中的技术人员所理解地，一些光将由该结构和可由该结构来吸收，只要量足以满足其使其朝向期望的位置(比如反应位点内)的目的。透明度还可根据系统中所用的光的强度而不同。

术语“组合位点”表示可以是室或孔的位置，其中两个或多个先前独立的通道或流动路径组合到共同的体积中。该组合位点可包括流动路径本身，以及流动路径流入其中的室。在一些实施方案中，组合位点位于与加热和/或冷却元件邻近的位置从而允许在组合位点中加热和/或冷却样品。

如本文所用的，“多核苷酸”意在表示通过共价键连接在一起的两个或多个核苷酸。例如，核苷酸可通过磷酸二酯键连接在一起。多核苷酸可含有4种核苷酸，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，或核苷酸类似物和衍生物诸如肌苷、双脱氧核苷酸或核苷酸的硫醇衍生物。核苷酸的不同化学形式诸如核苷或亚磷酰胺可用来产生多核苷酸。此外，核苷酸可进一步包括可检测的部分诸如放射性标记、荧色物、铁磁物质、发光标签或可检测的部分诸如生物素链霉亲和素、用于随后合成和/或添加分支聚合物和小分子侧链的化学连接物。多核苷酸还包括，例如，RNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和本领域中通常已知的其它多核苷酸变化形式和/或所述多核苷酸的组合。

详细的实施方案

本文提供了用于制备聚合物的多个实施方案。在一些实施方案中，合成的聚合物是DNA、RNA、蛋白或低聚糖，经由其中可有序组装片段(例如，DNA或PNA的片段)的大量(例如，数百个、数千个或更多，例如，7776个)反应位点而合成。

图1A-1C显示了用于制备聚合物的设备的一些实施方案。放大的设备1显示于图1A的下半部且接续到图1B。如所示的，在一些实施方案中，在表面提供了大量反应位点10和20。反应位点成组地流体连接在一起，从而大量反应位点经由流动路径(对于反应位点20为50和对于反应位点10为51)连接到组合室60(61和62)，其可用来将产物(期望的结构片段)混合在一起以形成一级片段。其它反应位点(未示出)也可经由另外的流动路径52连接到系统中，其通往较大的流动路径70，其进而通往二级组合位点和二级组合室160。如将被本领域中的技术人员所理解的，当产物离开反应位点10、20等时，可将来自多个反应位点的产物在流动路径50、51和52以及室60本身中进行组合。区域(例如50、51、52和60)的这种组合通常表示为组合位点100。在组合室60内，当正在组装核酸时，可控制组合位点以改变内部溶液的温度从而允许选择性的/特异的杂交事件和连接事件。此时组合位点100、101、102、103、104和105表示为“一级组合位点”。

在一些实施方案中，一级片段形成后，可在设备中进行组合反应或连接(linking)反应(例如，连接(ligation)反应)以共价连接一级片段的多个部分；因此，在一些实施方案中，设备的该部分配置成具有改变连接反应的溶液参数的能力(例如，温度、缓冲液、连接酶等)。

一级组合位点任选地经由流动路径70、71等，且然后任选地经由另外的流动路径150、151、152、153、154和155连接于二级组合室160、161、162、163、164和165(图1B)，其中二级组合位点200包括二级组合室160、161、162、163、164和165和流动路径(150、151、152、153、154和155)，以及较大的流动路径70、71等。如上所述，该二级组合位点200和/或室160、161、162、163、164和165可配置成用于将不同的成分添加到系统中且可配置成用于加热和冷却。

可重复该“塌陷”过程任意次数(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、1000等或更多次)以允许进一步的组合；然而，如图1B中所描绘的，最终塌陷结构终止且经由一个或多个流动路径310和316连接于贮存位点1001。贮存位点可与以上所示的设备的上游部分可逆地流体隔开，从而经由以上过程产生的第一亚聚合物可贮存于贮存位点，同时设备用来产生一个或多个另外的亚聚合物，其中的每一个放置在独立的贮存位点1002、1003、1004、1005和1006中。对所用的贮存位点的数目没有限制，且在一些实施方案中使用了或在设备上有1、2、3、4，5、6，7、8，9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个贮存位点。

贮存位点(1001、1002、1003、1004、1005和1006)经由流动路径1010、1011、1012、1013、1014、1015连接在一起并通往四级组合位点400，其可包括流动室350和组合室360。如果需要，可提供另外的连接酶源500(或其它连接剂)以为组合位点提供另外的连接酶。如上所述，组合位点400可包括加热元件或与加热元件邻近从而允许溶液的温度操作。最后，可提供出口500，通过其可收集所产生的聚合物。在一些实施方案中，设备包括一个或多个任选的阀(在图1B中用圈“X”来表示)。在一些实施方案中，一个或多个阀与设备远离，且因此，阀不必为芯片本身的部分。

如将被理解的，以上的布置可以不同的方式来改变。并且，以下提供了对于上述的部分中的每一个的不同的实施方案。

在一些实施方案中，可增加或减少级别(关于组合室和/或组合位点的每个级别)的数目。在一些实施方案中，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个级别，其中两个或更多个先前的位点(其可以是反应位点和/或组合位点和/或贮存位点)塌陷为单一的或较少的位点。在一些实施方案中，具有多于10个的级别。

在每个位点，和流动路径的起点、终点或流动路径之间的任何地方，可具有控制位点的流入或流出的阀以及允许向系统添加液体的液体入口。该阀可选自以下的组：螺线管阀、球阀、隔膜阀、活塞阀、针阀、电磁阀、节流阀、热膨胀/收缩阀、记忆聚合物阀、止回阀或能够操控操作所需的试剂和压力的任何其它的阀设备。

在一些实施方案中，组合位点包括流动路径和组合室。在一些实施方案中，流动路径汇集且不需要分离的组合室(虽然加热元件可仍与这些结构中的每一个相关联)。

在一些实施方案中，用于控制流体进入的歧管和阀也可制造到聚合物合成芯片中。在一些实施方案中，入口具有转换阀以允许添加不同的反应物。在一些实施方案中，代表的芯片具有108行反应位点(未完全显示)，72列(未完全显示)反应位点，总7776个反应位点。在列中，108行反应位点以一次36个塌陷到单一通道中，在图1A中以实线、浅虚线或深虚线来表示。图1A仅显示了下部的40个反应位点(10，20)，其中36个为黑色20，剩余的4个为灰色10。虽然图1A中描绘了108×72阵列，考虑生产上的限制，任何阵列尺寸是可能的。在一些实施方案中，设备包括硅晶片。在一些实施方案中，硅晶片在25mm至300mm的范围内，因此单一晶片上高达100000乘100000的阵列尺寸是可能的。在一些实施方案中，硅晶片为35nm至300mm。在一些实施方案中，硅晶片为35nm至3m。

核酸实施方案

图1A-1C的一些实施方案包括用于制造核酸的设备和方法。将图1A用作示例，按照合成步骤需求可使用入口5将A、C、G、T、U或任何修饰的核酸或核酸类似物前体，以及缓冲溶液和连接酶添加到设备中。该入口通道5分裂以供给反应位点阵列部分的所有列30、31、32、33、34和35。在一些实施方案中，可具有多于一个的入口来供给合成试剂。在一些实施方案中，在芯片上具有至少8个其它端口：至少一个端口用于灌注另外的连接酶以补充过程中耗尽的连接酶、至少6个端口以贮存和分配DNA的区段，和出口500，通过其分配废物和终产物。在一些实施方案中，端口、入口和出口装备有不在(located off)DNA合成芯片上的开/关阀。

在一些实施方案中，通过使用光产生试剂，诸如光产生酸、碱、酶等，通过允许单独的反应位点(图1A中所示的10、20)如屏幕上的像素一样被寻址的单独可寻址数字光处理(DLP)投射技术实现反应位点中核酸单体的连接。通过该过程可获得任何序列和增量长度的单链DNA的片段。

在一些实施方案中，通过使用光产生试剂，诸如光产生酸、碱、酶等，通过允许单独的反应位点(图1A中所示的10、20)如屏幕上的像素一样被寻址的单独可寻址数字光处理(DLP)投射技术可实现ssDNA(在这些实施方案中，其为期望的结构片段)从反应位点的壁的裂解。ssDNA(在这些实施方案中，其为期望的结构片段)从反应位点的壁的裂解还可通过将ssDNA锚定于反应位点的表面的光可降解连接分子来实现。在这样的实施方案中，合成中所用的光波长将不会有意义地干扰裂解中所用的光波长。当偶联所需的光产生试剂仅在正确的光可激活偶联前体存在下在光寻址像素中生成且裂解所需的光产生试剂仅在正确的光可激活裂解前体存在下在光寻址像素中生成时，偶联和裂解可使用相同的波长。在一些实施方案中，这种光酸产生(photoacid generation)之后可索引光裂解的组合允许在芯片上不使用阀的情况下发生DNA合成。在一些实施方案中，可使用NH₄OH或甲胺。在一些实施方案中，阀可用来限制反应位点中的内容物进入到组合位点中。在该情况中，在组装dsDNA的链之前将ssDNA冻干以去除NH₄OH。在一些实施方案中，利用气相氢氧化铵、甲胺或其它气相脱保护剂来实现情形脱保护(situation deprotection)。

产生期望的结构片段后，可在期望的结构片段产生和将两个或多个期望的结构片段组合成一级片段之间进行纯化过程。在一些实施方案中，纯化是尺寸排阻纯化，其去除了或减少了进入组合室60或组合位点100的相对短的单链片段的数目。在一些实施方案中，具有两阶段纯化。第1纯化可以是仍与反应位点表面相连的寡聚物的纯化。第2纯化可以是产物已从反应位点的表面脱附时的样品纯化。

本发明还提供了用于对在衍生化基底上合成的聚合物进行脱保护、洗涤和释放的改良的方法。特别地，如上所述，锚部分是选择性地光可裂解的。随着增长的聚合物链在碱性条件(比如含EDA的无水EtOH)下持续脱保护，与基底相连的聚合物不从基底上裂解。脱保护反应完成后，漂洗基底表面以去除由脱保护导致的小分子片段。这提供了连接有聚合物的表面，该表面没有盐和其它小分子污染物。且然后通过光诱导的裂解反应从基底上去掉聚合物。US 2003/0120035 A1中教导了与反应位点表面仍相连的寡聚物的纯化，即第1纯化，其全部内容在此通过引用并入。

产生期望的结构片段后，然后可将悬浮于缓冲溶液中的连接酶灌注通过塌陷在一起的反应位点(例如，一次36个经由流动路径50、51和52塌陷到216个组合室60、61和62中，其中ssDNA(本实施方案中期望的结构片段)组装为双链DNA(dsDNA，本实施方案中的一级片段)。这些进而组合(例如，一次6个)为较大的流动路径70(71等)。这种将从反应位点产生的2个或多个期望的结构片段(例如，ssDNA)多路复用到单一流动路径50或组合室60的方法允许芯片的保守性印迹。在一些实施方案中，在于组合位点中组合之前，反应位点10和20独立地供给流动路径50、51和52。这些将反应位点与组合位点100、101、102、103、104、105(或组合室60、61、62)连接的流动路径可以在1nm(dsDNA的半径)至10mm的范围中，例如10nm至1mm或100nm至100μm。在一些实施方案中，组合室60、61和62是任选的且可省略；因此，片段的组合发生在流动路径之内且伴随多个流动路径汇合在一起。

一旦将足够的流体添加到组合位点中以替代裂解的ssDNA(本实施方案中期望的结构片段)，芯片(或其与组合位点邻近的子部分)经历温度循环以将DNA片段复性和连接在一起。

在一些实施方案中，在1级组合组装中，将ssDNA的6个片段组合以形成三个线性链或增量长(即，三个正向的和三个反向的链或增量)、具有互补碱基序列的重叠的单一片段的dsDNA。然后，随后的组装级别将dsDNA的片段汇集在一起以进行复性和连接，形成18、108和648线性增量长的dsDNA片段。dsDNA长度达648DNA线性增量之后，在50个碱基长度ssDNA增量下，dsDNA的长度约为32,400碱基。该dsDNA的长度与大多数病毒基因组相似，大多数病毒基因组范围在10kbp至50kbp。该组合、复性和连接的过程持续进行直至贮存位点。

DNA内容物超过3级和/或流动路径316之后，其贮存于6个通道或位点其中之一，此后被称作贮存位点1001、1002、1003、1004、1005和1006。芯片的该区域可与先前1至3或4级的温度循环相隔离，并保持在310K以下，直至贮存位点1至6按需要饱和(或适当数目的贮存位点按需要饱和)。

贮存位点发挥作用以允许在尺寸合理的芯片上进行具有来自大量反应位点的单一级别或多个级别的大量ssDNA区段的制造、塌陷和组装。在一些实施方案中，经由简单的远离芯片的阀系统通过气体势差和/或液体势差和/或渗透势差和/或毛细势差和/或化学势差将DNA片段驱动到这些贮存位点中。在一些实施方案中，利用上述实施方案中等同于贮存位点的许多芯片可产生同样长度的DNA链，并将其在随后的芯片上组合或通过常见的实践随后组合。通过打开控制DNA贮存位点1的端口的阀，流体可通过打开端口来灌注，将DNA推入1001(P1，贮存位点1)，同时控制1002-1006(P2至P6)的端口，出口关闭。对于接下来的组装运行，P1(1001)关闭且出口打开且重复过程，然而在该操作中当DNA达到贮存位点以上的级别之后，替代地是，P2 1002打开而P1 1001、1003-1006(P3至P6)和出口关闭。

一旦所有(或所需数目的)贮存位点饱和之后，将缓冲液灌注通过P1至P6上的端口，且通过直接位于贮存位点上游的端口来添加连接酶，将P1至P6的内容物推入待连接的最终组合位点400。在50碱基长度的ssDNA增量下，结果是194kbp(本实施方案中期望的聚合物)的dsDNA组装物。在一些实施方案中，这是一次芯片合成中最小基因组操作系统的大小。

在一些实施方案中，该过程方法可用于在不需诸如阀的复杂组件的单一层中或在多层结合的芯片上简单地低成本地制造所述设备，并影响所述芯片的可制造性和成本。在一些实施方案中，如果没有将贮存位点设计到最终组合级别中，离开一级的通道的数目由于所需的大量的可单独索引的阀和/或尺寸将使所述设备不可制造。例如，如果7776个通道单独地垂直于一级之外，在1μm通道和1μm间隔条件下，7776个通道将占据15mm的长度，而待克服的压降将很大。即使通道的尺寸仅增加至10μm，芯片然后变为约77mm，也是太大以致不能由任何单一的硅晶片获得大量设备(假设常见的硅晶片直径范围是25mm至300mm)。

DNA片段合成

如将被本领域中的技术人员所理解的，存在产生核酸的大量方法。

用于合成多核苷酸(也称作寡核苷酸)的方法是本领域中已知的且可发现其在例如以下中被描述：Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach(寡核苷酸合成：实践方法)，Gate，编辑.，IRL Press，Oxford(1984)；Weiler等人，Anal.Biochem.243：218(1996)；Maskos等人，NucleicAcids Res.20(7)：1679(1992)；Oligonucleotide Synthesis 35(M.J.Gait编辑.，1984)中的Atkinson等人，Solid-Phase Synthesis ofOligodeoxvribonucleotides by the Phosphitetriester Method(通过亚磷酸三酯方法固相合成寡聚脱氧核糖核苷酸)；Blackburn和Gait(编辑.)，NucleicAcids in Chemistry and Biology(化学和生物中的核酸)，第二版，New York：Oxford University Press(1996)，和Ansubel等人，Current Protocols inMolecular Biology(现代分子生物学实验方案)，John Wiley和Son，Baltimore，MD(1999)。所有以上参考文献以其整体在此通过引用并入。

用于产生多核苷酸和其它聚合物序列的阵列的固相合成方法可发现在例如以下中被描述：Pirrung等人，美国专利第5,143,854号(还参见PCT申请第WO 90/15070号)，Fodor等人，PCT申请第WO 92/10092号；Fodor等人，Science(1991)251：767-777，和Winkler等人，美国专利第6,136,269号；Southern等人，PCT申请第WO 89/10977号，和Blanchard PCT申请第WO 98/41531号。所述方法包括利用微针来进行阵列的合成和印刷、寡核苷酸阵列的光刻法和喷墨合成。通过多核苷酸的顺序复性而合成大型核酸聚合物的方法可发现在例如以下中被描述：Evans的PCT申请第WO99/14318号和Evans的美国专利第6,521,427号。所有以上参考文献以其整体通过引用并入。

利用亚磷酸胺化学法可由商品化的核酸合成器生成多核苷酸。实践方法丛书已综述了亚磷酰胺和可选的合成策略(Brown、T.，和Dorkas，J.S.Oligonucleotides and Analogues a Practical approach(寡核苷酸和类似物实践方法)，编辑.F.Eckstien，IRL Press Oxford UK(1995))。多核苷酸的化学合成是其中4种结构单元(碱基亚磷酰胺)连接为线性聚合物的过程。除碱基组分之外，需要大量试剂来协助核苷酸间键的形成、氧化、戴帽、脱三苯甲基化和脱保护。可在用作用于顺序化学反应的支架的固相支持基质上进行自动合成；经一系列阀和计时器将试剂递送到基质，和最终的合成后处理流程，其可包括纯化、定量、产物QC和冻干。标准DNA碱基中的一些(G、C和A)含有反应性伯胺；因此，环外的伯胺可利用保护基来修饰从而在合成中不参与不期望的反应。并且，4种亚磷酰胺含有相似地需被保护的磷连接。用来保护这些敏感性位点的化学基团可在DNA合成循环中保持完整，也可在合成后容易地去除，从而得到常态的、未修饰的DNA。已开发了大量的不同的保护策略。例如，可使用具有b-氰乙基保护的磷的亚磷酰胺。对于杂环碱基，对于腺嘌呤和胞嘧啶通常由苯甲酰基提供对伯胺的保护，和对于鸟嘌呤由二甲基甲酰胺或异丁基来提供对伯胺保护。缺少伯胺的胸腺嘧啶不需要碱基保护。这些保护基在合成过程中所用的条件下是稳定的，但利用氨来处理快速且有效地去除。还期望地是，封闭碱基-亚磷酰胺的5′-OH从而激活的单体不与其自身反应，而仅能与结合在固相支持体上的增长的多核苷酸链上的5′-OH反应。例如，目前的化学法使用了二甲氧三苯甲基(DMT)。浓缩之后，通过酸处理使DMT基团从新添加的DNA碱基上裂解。释放的DMT阳离子是橙色的且DNA偶联进程的效率可通过490nm处分光光度阅读来监测。

脱氧核糖的3′羟基利用高度反应性的亚磷酸酯化剂来衍生。该基团上的磷酸氧通常被13-氰乙基部分所掩盖，所述13-氰乙基部分可在高温下利用氢氧化铵处理通过13-消除来去除。

自动合成可在固相支持体上实现。在一些实施方案中，可将碱基以3′到5′的方向(与通过DNA聚合酶的酶促合成相反)添加到增长的链。

虽然存在“通用”支持体，合成较通常地使用已利用第一碱基衍生化的表面来起始，所述第一碱基通过酯键与3′-羟基相连。

合成起始于与固相支持体相连的第一碱基(其可以是单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、或六聚体核苷酸亚磷酰胺)，并以3′到5′的方向延伸。

多核苷酸合成循环可在以下所描述的4个步骤中进行：(1)去封闭；(2)活化/偶联；(3)戴帽；和(4)氧化。

去封闭：通过短暂地暴露于含二氯乙酸(DCA)或三氯乙酸(DCM)的二氯甲烷(DCM)而从5′-末端碱基的5′羟基去除DMT基团来起始合成循环。可测量所得的三苯甲基阳离子的产量以协助监测合成反应的效率。对核苷酸结构单元上的反应性物类(伯胺和游离羟基)的保护确保了暴露的5′-羟基是唯一能够参与偶联反应(下一步骤)的反应性亲核体。

活化/偶联：通过在偶联时对四唑或四唑衍生物进行处理而将DNA(单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、或六聚体核苷酸)亚磷酰胺转化为更具反应性的形式。这些过程通过亚磷酰胺的快速去质子化随后可逆地且相对慢地形成磷四氮唑中间物而发生。利用活化的脱氧核糖核苷-亚磷酰胺试剂进行的偶联反应是快速且高效的。

可使用相对亚磷酰胺过量的四唑以确保完全活化，且相对反应性多核苷酸过量的亚磷酰胺偶联于CPG。在这些类型的条件下，可达到＞99％的偶联效率。

戴帽：因为碱基偶联反应不是100％有效的，在CPG支持体上增长的小百分比的多核苷酸将不能偶联并产生不期望的、截短的物质。除非被阻遏，这些截短的或部分的多核苷酸产物可继续在后面的循环中作为底物发挥作用、延伸、并得到接近全长的具有内部缺失的多核苷酸。这些截短的或部分多核苷酸产物称为(n-1)-mer物质。可通过“戴帽”大部分地防止这些“反应失败物”参与随后的合成循环，所述“戴帽”涉及用乙酸酐对游离的5′-OH进行乙酰化。

氧化：在此时，DNA碱基通过潜在地不稳定的三价亚磷酸三酯来连接。通过氧化将这种物质转化为稳定的五价亚磷酸三酯连接。用稀释的含碘的水/吡啶/四氢呋喃对反应产物进行处理形成碘-磷加合物，所述加合物通过水解产生五价磷。该氧化步骤实现了一个循环的多核苷酸合成；随后的循环从新添加的5′碱基去除5′-DMT来起始。

裂解和脱保护：合成完成之后，在一些实施方案中，可在室温下利用浓缩的氢氧化铵将多核苷酸从固相支持体上裂解。在高温下在铵中持续的孵育将经由氰乙基的B-消除脱保护磷，且还将保护基从杂环碱基上去除。在一些实施方案中，如上所述，裂解可经由光化学反应发生。

合成后处理：在合成过程中，全长的多核苷酸和截短产物或部分的多核苷酸产物保持与CPG支持体相连。在一些实施方案中，合成后，物质相似地裂解和回收，从而最终反应产物是期望的和不期望的物质的异质混合物。随多核苷酸长度增加杂质累积至较高程度。并且，裂解的保护基也是存在的。在此时，通常对多核苷酸进行“脱盐”，在该过程中，利用凝胶过滤方法或有机固相提取(SPE)方法来去除小分子杂质(保护基和短的截短产物)。

当在诸如常规PCR或DNA测序的简单应用中使用短的引物时，使用不进行另外纯化的脱盐的多核苷酸可能是适当的。然而，如果在克隆、定点诱变或基因组装应用中使用时，n-1和其它截短体或部分的多核苷酸物质可导致缺失突变体。

在一些实施方案中，可使用通过PAGE或HPLC的纯化来去除截短的或部分的多核苷酸物质。在一些实施方案中，保持短的聚合物长度以减少错误。在另外的实施方案中，使用过滤器步骤以排除小于期望的片段尺寸的片段。当然，用于从全长片段中过滤不期望的部分的片段的其它步骤也是可能的。

对于每个化学循环，多核苷酸合成效率通常约98-99％，所以对于每个循环约1-2％的反应产物将比期望的短1个碱基。一些截短的物质不能“戴帽”并继续参与DNA合成的另外循环。对于60-mer多核苷酸，低于50％的终产物将是期望的全长分子。最终合成产物将包括(n-1)-mer和(n-2)-mer(等)分子的混合群体，其代表序列的异源汇集，事实上是每个可能的位置处的缺失突变体的混合。

合成规模指起始物质的量，而合成产量指合成和纯化步骤完成之后回收的终产物的量。在多核苷酸合成中，在客户所定制的规模上将3′末端碱基与固相支持体相连。以3′到5′的方向每次添加一个碱基。理想地，每个添加的碱基将以100％效率偶联，导致100％产量。实际上，偶联效率稍微小于100％，且这种小的减少可能导致最终寡核苷酸的产量的大量减少(因为偶联效率的作用将是加合的)。并且，对于每个添加的碱基，偶联效率可能不同，因此序列本身可能导致了产量的很大差异。对于250nmol规模的反应，脱保护和纯化之后的最终产量可在10nmol至100nmol的范围。一些序列倾向于产生高于其它序列的产量，且这种倾向通常是可复现的。即使两个序列在同一天、同样的机器、使用同样的试剂来运作，一个20-碱基序列的合成的产量可能是不同的20-碱基序列所获得的产量的两倍。产量的一些变化性还可源自所用的个别机器。

既定合成的理论产量是(Eff)n-1，其中Eff表示偶联效率，“n”表示多核苷酸中碱基的数目。如果偶联效率是99％(Eff＝0.99)，合成之后存在的全长产物的分数对于20-mer将约为(0.99)¹⁹或83％；对于50-mer将约为(0.99)⁴⁹或61％；对于75-mer将约为(0.99)⁷⁴或48％。偶联效率的小的下降将导致预期产量的大的降低。例如，如果偶联效率是99％，对于100-mer产量为(0.99)⁹⁹或37％，但如果偶联效率降至98％，产量降至(0.98)⁹⁹或13％。

然而，每个添加的碱基的偶联效率是不同的。可能由于邻近固相支持体表面的空间位阻，对于首次的5至6个碱基，偶联效率是较低的。随后偶联效率增加至最大约99％，这是添加第20个碱基的特性，且然后随长度增加又一次地降至次优水平。因为当多核苷酸变得非常长时，偶联效率实际上降低了，100-mer的产量可能通常小于10％。在任何纯化过程中产物还会丢失，如果丢失，将进一步减少产量。

在一些实施方案中，可检验产生的每个多核苷酸的质量，或可选择所产生的多核苷酸的样本并对其质量进行检测，例如，在Beckman P/ACEMDQ 96-孔CE，和/或HPLC，和/或质谱仪上进行检测。通过获取多核苷酸主峰的百分比面积，或CE或HPLC曲线的N来计算纯度。

光产生试剂-包括核酸合成

在一些实施方案中，不是连续地向反应位点添加单体和试剂以产生较长的片段，而是可生产或激活用于通过使用光产生试剂来产生片段的多个单体。

在一些实施方案中，可使用美国专利第6,426,184号中描述的方法和组合物以将起始单体与反应位点的表面相连(在此以其整体并关于该方面通过引用并入)。

在一些实施方案中，可使用美国专利公布第20030143131号中所描述的方法和组合物以选择性地将光产生前体转化为光产生试剂，从而允许另外的片段形成(在此以其整体并关于该方面通过引用并入)。

在一些实施方案中，可使用美国专利公布第2003/0138363号、第2003/0186427号、第2004/0023368号和PCT公布第WO 99/41007号中所描述的方法、设备和组合物以脱保护部分并起始部分附着至壁以用于进一步的片段合成(在此以其整体并关于该方面通过引用并入)。

在一些实施方案中，可使用美国专利公布第2003/0120035号中关于可选择性裂解的连接物所描述的方法和组合物(在此以其整体并关于该方面通过引用并入)。可包括或使用这样的连接物以将第一单体(或随后的单体)与反应位点的表面相连，从而期望的结构片段在随后的时间点可任选地从表面裂解。

在一些实施方案中，用于使片段从反应位点壁分离和/或脱附的组合物和方法包括美国专利第6,586,211号中的实施方案的一个或多个(在此以其整体并关于该方面通过引用并入)。

在一些实施方案中，用于合成聚合物的期望的结构片段在长度上为5-250、10-200、10-100或10-50单体。在后面的步骤中，可能在每个情况中将部分互补的期望的结构片段从反应位点脱附，并在组合位点中在杂交条件下使其相互接触。

在一些实施方案中，当聚合物是核酸时，选择在单独反应位点中合成的期望的结构片段的碱基序列，从而它们可组装以形成核酸双链杂交体(在该实施方案中其将为一级片段)。然后可在以下条件下以一个或多个步骤将期望的结构片段与壁分离，所述条件使得多个，即，分离的期望的结构片段中的至少一些组装以形成一级片段。随后，形成一级片段的一个链的核酸片段可至少部分地相互共价连接。这可通过酶促处理来进行，例如使用连接酶，和/或利用DNA聚合酶来填充链中的空位。

在一些实施方案中，期望的单链片段在反应支持体上在多个反应区域中通过原位合成而合成。这可利用例如专利申请DE 199 24 327.1、DE 19940 749.5、PCT/EP99/06316和PCT/EP99/06317中所描述的支持体来进行。就此而言，每个反应区域适宜于长度约10-250核苷酸的单独给定的DNA序列的单独的和特异的合成。这些DNA链形成用于特异合成非常长的DNA分子的结构单元。

在一些实施方案中，反应位点合成通过光依赖的位置-或/和时间分辨的DNA合成在流体微处理器中进行，其还在专利申请DE 199 24 327.1、DE 199 40 749.5、PCT/EP99/06316和PCT/EP99/06317中被描述(在此以其整体并关于该方面通过引用并入)。

片段分离或脱附

存在大量方法以破坏期望的结构片段和固体表面(比如反应位点的表面)之间的键或连接。在一些实施方案中，这通过光裂解来进行，且因此使用可光裂解的部分将片段与反应位点的基底或反应位点之内的基底相连接。例如，可光裂解的部分可由特戊酰连接物、苯甲酰甲酯、邻-硝基苄基可光裂解的连接物、二甲氧基硝基苄基部分组成。在另外的实施方案中，可光裂解的部分是8-溴-7-羟基喹啉。在另外的实施方案中，可光裂解的部分是硝基二苯并呋喃。在另外的实施方案中，可光裂解的部分是6-溴-7-羟基香豆素-4-基甲基。这些连接物可用于合成方法，包括可光裂解的寡核苷酸的生成，例如，笼状吗啉代物(caged morpholinos)。美国专利申请20100022761(在此以其整体并关于该方面通过引用并入)。

在一些实施方案中，裂解通过随机访问光裂解(random accessphotocleavage，RAP)(或随机访问裂解(random access cleavage)“RAC”)来进行。

在一些实施方案中，片段分离通过化学裂解来实现。

在一些实施方案中，期望的结构片段的分离经由基于热的裂解来实现。在一些实施方案中，期望的结构片段的分离通过反应位点的壁的声场、磁场和/或电场方面的改变来实现。在一些实施方案中，期望的结构片段的分离或脱附通过反应位点的壁的化学吸附和/或物理吸附方面的改变来实现。在一些实施方案中，期望的结构片段的分离或脱附通过适当的连接物的光产生试剂裂解来实现。在一些实施方案中，期望的结构片段的分离或脱附通过反应位点的壁的受体-底物结合方面的改变来实现。在一些实施方案中，期望的结构片段的分离或脱附通过反应位点的壁的螯合方面的改变来实现。在一些实施方案中，期望的结构片段的分离或脱附通过反应位点的壁的金属键方面的改变来实现。在一些实施方案中，期望的结构片段的分离或脱附通过反应位点的壁的共价键方面的改变来实现。在一些实施方案中，期望的结构片段的分离或脱附通过反应位点的壁的离子键方面的改变来实现。

片段纯化和/或过滤和/或Q/C

如上所述，并非每个化学反应是100％有效的，且本系统作为多路复用系统，涉及大量反应。因此，并非每个孔中的每个片段必然是关于该片段的精确地期望的序列(例如，通过质谱测定法准确的分子量至+或-1amu(原子质量单位)的精确度)。该问题可通过多种方法来解决。当然，通过减少每个片段的尺寸，减少了反应的数量且因此减少了错误的可能性；因此，通过保持起始片段较短的尺寸，可减少该问题。

而且，在一些实施方案中，可在处理末期解决该问题，通过对来自产生的全长聚合物的群体进行测序和/或筛选而取得一个期望的序列并去除其它序列。

在一些实施方案中，可包括另外的过程，其中通过排除短于片段的期望的长度的那些片段而在起始反应位点级别产物(组合任何片段之前)中进行过滤或纯化。因为大部分错误将归因于添加单元的遗漏，这可能是充分的。因此，在一些实施方案中可应用尺寸排阻过滤系统。

在一些实施方案中，可通过在非常严格的条件下与互补的DNA微阵列复性而对期望的结构片段或一级、二级片段、亚聚合物或期望的聚合物进行过滤从而洗涤掉单碱基对错配片段，留下可供进一步基因组装之用的期望的DNA片段。

在一些实施方案中，抗体可用作筛选方法，与期望的序列或结构结合而不与不期望的序列或结构结合。在一些实施方案中，以上纯化过程和/或结构中的一种或多种也可(或可选地)在过程中较早使用，比如在期望的结构片段从表面分离之后使用。在一些实施方案中，还可包括Q/C级别、装置、结构，且可包括单分子DNA序列发生器。在一些实施方案中，这发生在最终级别或紧接输出之前。在一些实施方案中，本文所描述的纯化技术的单个和/或组合可在任意的和/或全部的组合位点之前和之后使用。

光源和光导向设备

在一些实施方案中，设备和/或方法使用了用于期望的结构片段合成的光产生试剂(比如酸)的光和/或用于从期望的反应位点裂解期望的结构片段的光。可使用多种结构将其实现。在一些实施方案中，这些过程中的每一个涉及不同的光源。一个光源可发出适于裂解的波长(例如，300-400nm，190-600nm)，另一个光源可发出适于用于偶联的试剂的光脱保护、光偶联、光产生，和用于裂解的试剂的光产生的波长(例如，190-600nm)。如将被本领域中的技术人员所理解的，所使用的特定的光源将根据用于光裂解和光产生的分子的性质而不同；然而，当在一个实施方案中使用二者时，它们将是适当地匹配的。在一些实施方案中，使用了一个以上的光源(例如，一个用于每种核酸类型和一个(或多个)用于光裂解)。在一些实施方案中，所有光源共享同样的光导向设备(例如，DLP)和在另外的实施方案中，一个或多个光源共享一个或多个光导向设备。

可用多种方法将光导向到特定的反应位点，例如，DLP将允许适于微粒化系统规模的特定导向。在一些实施方案中，可使用多个透镜和/或镜子。在一些实施方案中，使用过滤系统，从而使用较宽的光束，但除非光是特定反应位点所需，否则将其滤出。在一些实施方案中，可使用具有集成的LED或激光的反应位点。在一些实施方案中，可使用本文所描述的单一技术或技术的组合来导向光。

如将被本领域中的技术人员所理解的，以上过程可包括其它波长的光，只要它们不会对进行的步骤产生不利影响。因此，如果蓝光波长不具有光产生或裂解的任何光化学活性，则光源和光导向设备也可传播和导向这样的光。然而，在一些实施方案中，当发生用于片段增长的酸的光产生时，不应该使用导致裂解的光(除非希望同时释放和添加片段)。

如将被本领域中的技术人员所理解的，可使用多种过滤器以选择波长子集以允许期望的波长的光穿过光源和/或光导向设备到达反应位点。在一些实施方案中，光导向设备可包括过滤器。如将被本领域中的技术人员所理解的，进入反应位点的最终的光的波长(当其离开光源并被光导向设备所导向，且穿过任何任选的过滤器之后)将适于光产生或光裂解。最终结果如何实现在多种方法中可能是不同的，例如，如上所述，通过改变光源的数目、由光源所发出的波长、光导向设备的数目和设备所导向(或不导向)的波长、沿路径放置在任何地方的任何过滤器、和甚至设备本身的光学性质。

在一些实施方案中，光的波长在100和1000nm之间。用于一些实施方案的一些范围在从355到490nm、265-450nm、和190-500nm的波长之内。在一些实施方案中，激光可用于传递单色光源(即，不需要过滤的单一波长)。在一些实施方案中，可选择用于光产生试剂的激活波谱之内但不在光裂解的激活波谱之内的激光波长。

反应位点

反应位点可由多种材料制成并可采取多种形状和尺寸。在一些实施方案中，反应位点提供了其中可组装单体的反应体积，所述组装与不同反应位点中的单体组装相对隔离。这样，反应位点的结构足以将该反应位点中的单体组装与不利地导致另一个反应位点中的单体组装相隔离。在一些实施方案中，这通过具有室或孔形式的反应位点来实现，所述室或孔经由流动路径与设备的其余部分相连接。当这些活性成分经由流动路径从一个反应位点输送到另一个反应位点时可发生活化的单体或PGR的一些“渗出”；然而，对于设备的目的而言该量是可忽略的。如果使用阀或闸门，可进一步减少该情况。在一些实施方案中，反应位点中的过程以多轮发生，从而任何单一剂量的试剂在没有立即的随后试剂组(或能量条件)时将不会有意义地添加到片段中，从而进一步限制了其它孔中的任何不利的单体添加。

在一些实施方案中，位点包括输入和输出流动路径。在一些实施方案中，输入和输出流动路径是相同的流动路径。

在一些实施方案中，反应位点的表面由本领域中已知的用于MEMS和微流体设备制造的Si、n-p-型掺杂的Si、其它掺杂的半导体和非掺杂的半导体制成。在一些实施方案中，表面允许聚合物片段相连于此，且因此表面材料可包括SiO₂、玻璃、p-n-型掺杂的Si、半导体、掺杂的半导体、导体、绝缘体、金、硫醇化合物、过渡金属、过渡金属化合物、有机化合物、无机化合物、薄膜、液晶层、生物素、链霉亲和素、蛋白、抗体、受体、Langmuir-Blodget薄膜、连接物、导电聚合物、酶、生物催化剂和化学催化剂、离子表面、螯合表面、高度反应性官能团、有机和无机聚合物、氟化聚合物、自组装超结构、DNA探针、PNA探针、RNA探针、蛋白A、蛋白G、核酸结合蛋白、凝集素、碳水化合物、脂质表面和脂质双层表面。在一些实施方案中，以上的表面还可用于设备的其它部分(比如组合位点、流动路径、组合室、贮存位点等)。

在一些实施方案中，在反应位点内添加另外的材料从而增加反应位点的表面面积。在这样的实施方案中，所述材料可包括珠子、棒、随机形状的物体，从而提供更大的表面面积并因此提供更多的用于将变为期望的结构片段的起始单体的结合位点。在一些实施方案中，本文所描述的多孔的Si和多孔类型的物品可单独使用和/或组合使用。

在一些实施方案中，反应位点对于大气是开放的。在一些实施方案中，反应位点与大气隔绝。在一些实施方案中，反应位点的至少一个表面对于一种或多种光的波长是足够透明的。在一些实施方案中，当反应位点的至少一个表面是透明的时，其它表面(比如一个或多个壁)对于光是不透明的，从而阻止或减少光从一个反应位点渗出到另一个反应位点。

反应位点的数目可以在从10到10,000,000、100-1,000,000、1,000-100,000或5,000-50,000中的任意处的范围内，其中约10,000-50,000是典型的数目。反应位点的体积可以不同，且在一些实施方案中，在1aL至10mL、100fL至1mL、1000pL至100mL、100pL至1mL、50pL至1nL之间。在一些实施方案中，行的数目可以从1至1,000,000，例如至少1、10、50、100、500、1000或更多行)。在一些实施方案中，列的数目可从1至1,000,000，例如至少1、10、50、100、500、1000或更多列)。

在一些实施方案中，来自反应位点(和/或组合位点/室)的流动路径一次以诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个的不同的数目(包括限定为大于以上中任何的范围和以上中任何两个之间限定的范围)一起塌陷在一起或一起塌陷入单独的室中。在一些实施方案中，为了在产生的聚合物中具有较高程度的特异性，相对较小的数目的室、位点或流动路径在每个组合点塌陷在一起。因此，在一些实施方案中，不超过2个到10个流动路径塌陷到一个组合室中。在一些实施方案中，不超过500个流动路径塌陷在一个组合室中。

在一些实施方案中，反应位点包括适于产生期望的结构片段的一组试剂。在一些实施方案中，反应位点包括一组适于合成一种或多种期望的结构片段的一组试剂。在一些实施方案中，成分包括光产生试剂。

在一些实施方案中，PGR包括PGR酸、PGR碱、PGR催化剂(即，光捕捉(photocaged)催化剂)、PGR酶(即，光捕捉酶)，或可用来产生片段的其它光可激活成分中的一种或多种。在一些实施方案中，这包括本领域中已知的光捕捉试剂。

在一些实施方案中，图1A-1C中描绘的实心圆是任选的。实心圆是组合室，且对于一些实施方案而言它们的功能也可经由流动路径和其组合来实现。在一些实施方案中，图1A-1C中的矩形是任选的较大的流动路径(70、71、270)。在没有较大流动路径(70、71、270等)的实施方案中，组合位点自身可用来向组合溶液的区域提供另外的体积。

在一些实施方案中，反应位点的体积在1aL至1kL之间。在一些实施方案中，优选的范围在100fL和100nL之间。在一些实施方案中，可使用1-50pL。

在一些实施方案中，反应位点的数目可根据产生的期望的聚合物而不同。在一些实施方案中，存在至少两个反应位点。在一些实施方案中，存在2至一百万个反应位点。

在一些实施方案中，通过标题为“Method and Apparatus for Chemicaland Biochemical Reactions Using Photo-Generated Reagents(利用光产生试剂的用于化学反应和生化反应的方法和装置”的美国专利第6,426,184号中所描述的方法将起始单体与反应位点的表面相连，该专利在此以其整体通过引用并入。

在一些实施方案中，反应位点包括(comprise)或包括(include)电极表面，通过其可使用偏压从被索引的反应位点持有或释放DNA。

组合位点和组合室

如上所述，组合位点包括允许组合两个或多个期望的结构片段的任何区域。因此，这可包括组合室自身(60或160)，其可以是允许流动中更多湍流且因此更加混合的室，或简单地允许更大体积的液体且因此可将样品的更多个组合一起添加的室，或简单地用作用于两个或多个流动路径的组合点的室。这还可包括会合的流动路径，且因此允许多个(例如，50、51、52、70、71、251、250和252个)产物的组合。

在一些实施方案中，加热元件与位点或室相关联。在一些实施方案中，从位点或室进入或离开受到阀的控制。在一些实施方案中，在组合位点和/或室中或与组合位点和/或室邻近处设有入口端和/或出口端。在一些实施方案中，组合位点的壁的声场、磁场和/或电场方面用来控制组合位点中溶液或样品的加热。

在一些实施方案中，组合室(和/或反应位点和/或流动路径，和/或贮存位点等)的壁由，例如，由不同材料组成的层制成，所述材料包括但不限于以下：基于硅的化合物(比如SiN、SiC、掺杂的Si等)、玻璃、PMMA、聚对二甲苯、高弹体、聚合物或金属基底。在一些实施方案中，反应位点、流动路径和组合位点由P+硼掺杂的硅组成。在一些实施方案中，Si层的晶体取向为<100>。在一些实施方案中，Si层的晶体取向为<100>、<110>、<111>。在一些实施方案中，位点、室、流动路径和组合位点由7740 Corning玻璃组成。在一些实施方案中，壁的材料对于待用于设备中的片段和成分是足够惰性的，从而防止产物与壁的任何不利粘附。

在一些实施方案中，组合位点和/或组合室在1aL至1kL之间，例如，2至1000pL之间。在一些实施方案中，组合位点和/或组合室的体积在100fL和1μL之间。在一些实施方案中，组合位点和/或室与可在0-24小时期间将溶液中的温度在0-125摄氏度之间进行调节的加热元件或设备相连接。在一些实施方案中，温度改变的度数和温度改变的程度允许两个或多个期望的结构片段的特异性杂交，从而形成期望的一级链。在一些实施方案中，这可经由用于在杂交事件过程中控制溶液温度的Peltier设备或其它分子生物学设备来加热和/或冷却整个芯片来实现。

在一些实施方案中，组合位点和/或组合室的数目可根据产生的期望的聚合物而不同。在一些实施方案中，存在至少两个组合位点和/或组合室。在一些实施方案中，存在2至一百万个组合位点和/或组合室。在一些实施方案中，使用了2至500个、5至100,000个、10至10,000个、或10至1000个组合位点和/或组合室。

对于特定的芯片或应用，顺序相关的组合位点(即，液体从一个组合位点(例如，一级组合位点)或室流入第二组合位点(例如，二级组合位点))的数目和由此组合级别可不同。在一些实施方案中，存在至少一个组合级别，从而反应位点组合到一个组合位点中。如图1A中所描绘的，存在作为一级组合位点(100-105)的大量组合位点，所述一级组合位点然后被组合到二级组合位点200(图1B)中，所述二级组合位点然后被组合到三级组合位点300中，所述三级组合位点与其它的三级组合位点一起组合并贮存到贮存位点1001中。在一些实施方案中，组合级别的数目可从至少1至100或更多，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100(包括限定为大于以上值中的任何的范围或以上的值中的任意两个之间所限定的范围)。在一些实施方案中，组合级别的数目可从1至20，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

在一些实施方案中，发生在每个组合位点(和/或室)的压缩或组合的程度可以是来自两个不同的反应位点和/或组合位点的至少2个流动路径的组合。在一些实施方案中，组合是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个组合和/或反应位点(包括限定为大于以上的值中的任何的范围或以上的值中的任意两个之间限定的范围)。在一些实施方案中，组合是从2至10个组合和/或反应位点。在一些实施方案中，组合是从2至100个组合和/或反应位点。

贮存位点

在一些实施方案中，贮存位点1001-1006的数目可不同。贮存位点的数目不必受局限且可以为至少一个。在一些实施方案中，存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或个贮存位点(包括限定为大于以上的值中的任何的范围或以上的值中的任意两个之间所限定的范围)。在一些实施方案中，存在2至100个贮存位点。

在一些实施方案中，到贮存位点的流动路径的数目可不同。因此，在图1B中的实施方案中，存在来自流动路径316的6个流动路径1010、1011、1012、1013、1014和1015，其进而来自流动路径310、311、312、313、314和315，在一些实施方案中，具有更多或更少的流动路径。在一些实施方案中，流动路径的长度和尺寸可不同。在一些实施方案中，流动路径的尺寸在0.1和1000微米之间。在一些实施方案中，室(和流动路径)的尺寸和流动系统下的距离之间的关系考虑了当流动路径组合时的体积守恒。在一些实施方案中，流动路径的数目在2-100之间。

芯片制造

在一些实施方案中，设备可通过一系列蚀刻步骤及随后粘结以密封具有访问端口的光学透明的覆盖层来制造，所述访问端口在包含反应位点、贮存位点、组合位点、流动路径等的层的上方。在一些实施方案中，这些蚀刻过程一般可包括反应位点、流动路径、组合位点和通向设备的内部工作区(workings)的任何访问端口的光刻印刷。在一些实施方案中，反应位点、贮存位点、流动路径和/或组合位点在一个基底中蚀刻，而访问端口在另一个基底中蚀刻。在一些实施方案中，将反应位点、流动路径、访问端口和组合位点蚀刻到基于硅的化合物、玻璃、PMMA、聚对二甲苯、高弹体、聚合物或金属基底中。在一些实施方案中，在待粘结层的对侧形成反应位点、流动路径、访问端口和组合位点或其组合。在一些实施方案中，这些层由不同的材料组成，包括但不限于以下：基于硅的化合物(比如SiN、SiC、掺杂的Si等)、玻璃、PMMA、聚对二甲苯、高弹体、聚合物或金属底物。在一些实施方案中，反应位点、流动路径和组合位点由P+硼掺杂的硅组成。在一些实施方案中，Si层的晶体取向为<100>。在一些实施方案中，Si层的晶体取向为<100>、<110>、<111>。在一些实施方案中，反应位点、流动路径和组合位点由7740 Corning玻璃组成。在一些实施方案中，这些特征可通过诸如铣削或研磨的精密机械加工来产生。在一些实施方案中，反应位点、组合位点、流动路径、组合位点和访问端口的印刷可通过一个以上的光刻步骤来实现。在一些实施方案中，第一光刻步骤之后将为蚀刻步骤。在一些实施方案中，第一光刻步骤之后将为蚀刻步骤，并且第二光刻步骤之后将为第二蚀刻步骤，依此类推。在另外的实施方案中，可使用牺牲材料以将蚀刻限制在特定的方向或实现特定的通道深宽比或深度。在一些实施方案中，访问端口通过湿法蚀刻来产生。在一些实施方案中，流动路径通过DRIE步骤来产生。在一些实施方案中，反应位点通过RIE步骤来产生。在一些实施方案中，蚀刻步骤包括以下中的一种或多种：反应性离子蚀刻(RIE)、深度反应性离子蚀刻(DRIE)、等离子蚀刻、通过化学试剂的湿法蚀刻、离子铣削和/或基于工具的铣削。在一些实施方案中，粘结步骤包括以下中的一种或多种：粘合、产生共价键、非共价键、疏水键、氢键、等离子粘结、热粘合、焊接、扩散粘结、阳极粘结、熔融粘结和/或共熔粘结。在一些实施方案中，将最终芯片从含许多设备的较大晶片切下。然而，如本领域中的技术人员所理解的，设备制造的一些细节将根据预期用途和期望的设备性质而不同。

设备的材料

在一些实施方案中，可在Si、玻璃、基于聚合物的基底诸如PMMA、或金属基底或任何其它适宜的基底材料中蚀刻设备，并利用玻璃或其它材料进行密封以允许适当波长的光的足够传播以产生期望的结构片段并分离期望的结构片段。当然，这样的性质仅需要用于将暴露于光的那些区域。因此，在一些实施方案中，仅反应孔是这样配置的。在一些实施方案中，材料与DNA(ssDNA)相容(当然，并非所有实施方案需要这样)。以上提供了关于多个位点和室的其它材料且可以使用。

在一些实施方案中，密封层可由石英、硼硅玻璃、PMMA、聚对二甲苯或允许用于合成和裂解ssDNA的光通过的任何其它材料组成。

在一些实施方案中，芯片由无平面流体连接的多个层组成。这些层可以与流体导管粘结或与流体导管独立地连接。

在一些实施方案中，使用MEMS微流体设备制造领域中已知的多个沉积过程诸如化学气相沉积(CVD)、PVD(等离子气相沉积)、电化学分子层外延(EMOLE)、欠电位沉积(UPD)、分子束外延(MBE)、原子层外延，(ALE)、金属有机分子束外延，(MOMBE)、金属有机化学气相沉积，(MOCVD)等利用用于期望的聚合物片段的第一单体的适宜连接位点来覆盖反应位点的表面。

流动控制

在一些实施方案中，不同的流动路径和位点之间的流动可以是受控的。在一些实施方案中，这可经由可阻碍、降低或完全阻塞液体从一部分流向另一部分的一个或多个阀来实现。所述阀的位置包括在每个位点处、和在流动路径的起始处、终止处或中间的任何地方。可具有控制位点的流入或流出的阀以及允许向系统添加液体的液体入口。阀可选自以下的组：螺线管阀、球阀、隔膜阀、活塞阀、针阀、电磁阀、节流阀、热膨胀/收缩阀、记忆聚合物阀、止回阀或能够处理操作所需的试剂和压力的任何其它阀设备。

在一些实施方案中，样品经过系统的流动可通过控制液体或气体流入系统中来控制。这可推动样品经过多个室，或有效地降低经过多个室的移动速率。在一些实施方案中，系统的流入通过添加液体或气体来调节，在另外的实施方案中，系统的流入通过将已添加到系统的流动去除或反向来调节。在一些实施方案中，流动可通过控制系统的流出来控制。

在一些实施方案中，流动是相对稳定的，并可至少在反应位点级别处，经由光学操作(比如产生的期望的结构片段从反应位点的表面的分离或脱附)实现对片段移动的控制。

在一些实施方案中，将以上选项中的一个或多个进行组合。例如，在一些实施方案中，当反应位点10和20相对于流动路径(50-52)没有用闸门或阀门控制时，阀可存在于组合室、反应位点中的一个或多个，和贮存位点中的一个或多个处或之前。因此，在一些实施方案中，这将允许多个期望的结构片段(或一级、二级、三级等片段)一起协同添加，如可使一些进入组合位点中，阀门关闭，且当期望的结构片段在组合位点发生组合时，另外的期望的结构片段在上游的反应位点处可发生另外的合成和释放。

在一些实施方案中，流体控制系统是在美国专利公布20040101444号所描述的，该专利公布以其整体通过引用并入本文。在一些实施方案中，芯片或设备还包括泵或与泵和/或真空相连接。

温度控制

在一些实施方案中，流动路径、反应位点、组合位点、贮存位点、纯化区域、组合室、或其任何组合的一个或多个包括允许控制设备的温度从0至125摄氏度的设备或与允许控制设备的温度从0至125摄氏度的设备连接。

在一些实施方案中，温度控制通过本领域中已知的可编程的热循环器来进行。可将热循环器编程以作为时间函数在0至125摄氏度的任何温度之间进行循环。特定的温度＝f(时间)方程，指明了对于复性和连接过程关键的温度图(温度斜坡)。

在一些实施方案中，这经由设备或芯片中的热循环元件来实现。在一些实施方案中，只有芯片或设备的部分被加热。在一些实施方案中，加热对一个或多个反应位点、组合位点和/或组合室和/或流动路径和/或位点是选择性的。

在一些实施方案中，通过芯片自身中的电阻层或加热元件来控制芯片中的溶液温度。电阻层或加热单元可以在整个芯片中，或与多个位点和/或室，和/或流动路径相连。在一些实施方案中，提供了多个加热层或元件且它们是独立可控的。在一些实施方案中，可将如用于Peltier冷却-加热设备中的p-n型掺杂的Si布置作为芯片的部分来制造。

在一些实施方案中，芯片的材料协助一个位点、流动路径或室中的溶液的温度与第二位点、流动路径或室中的第二溶液的温度相隔离。在一些实施方案中，组成组合位点或室的材料，和相邻位点或室之间的距离允许良好加热而不会对邻近的位点或室有不利的或非故意的加热。

在一些实施方案中，芯片或设备通过外部的热源来加热。在一些实施方案中，芯片通过与外部热源的对流或直接接触来加热。

在一些实施方案中，这可通过将光能集中于室来实现。在一些实施方案中，光能是选定的以促进较好的热传递。在一些实施方案中，光可以是红外线且可经由光导向设备导向至一个或多个待加热的室。在一些实施方案中，光穿透设备的外部表面并进入溶液。在一些实施方案中，光加热外部表面并从而间接加热内部的溶液。在一些实施方案中，使用电磁辐射与室内的元件相互作用而加热一个或多个室表面。

在一些实施方案中，本文所述的方法和设备允许在单一层中简单地低成本地制造所述设备而不需要诸如阀或多层结合芯片的复杂的组件，并影响所述芯片的可制造性和成本。在一些实施方案中，没有反应位点压缩组合到组合位点中且随后进入贮存位点，然后来自多个贮存位点的产物进行组合时，离开一级的通道的数目将由于所需的大量单独可索引的阀和/或尺寸而使所述设备不可制造。

提供以下的实施例仅用于示例性目的，且不想要以任何方式限制本发明的范围。事实上，从前面的描述中，除本文所示出和描述的那些之外，本发明的多个修饰对于本领域中的技术人员将是明显的且在所附权利要求书的范围之内。

实施例1

本实施例描述了如何使用本文所公开的用于核酸合成的实施方案中的一些。

提供了用于合成DNA的包含7776个反应位点的设备。该布置的代表可参见图1A和1B。图1A和1B中显示的是入口，其中按照合成步骤的需求可灌注A、C、G、T、U或任何修饰的核酸或核酸类似物前体(以单独的单体、二聚体(例如，A-G)、三聚体(例如，T-G-G)、四聚体(例如，T-C-U-G)、五聚体、六聚体和/或本文所描述的前体的任何组合的形式)以及缓冲液和连接酶。该入口通道分裂以供给反应位点阵列的所有列。

入口具有转换阀以允许添加不同的反应物。在示意图中，代表芯片具有108行乘72列的总共7776个反应位点。在每一列108行每次36个反应位点塌陷到单一通道中。图1A仅示出了下部的40。

核酸单体的连接通过允许单独反应位点(图1A和1B中所示)如屏幕上的像素一样被寻址的单独可寻址数字光处理(DLP)投射技术使用光产生酸来实现。通过该过程，可获得任意序列和增量长度的单链DNA的片段。ssDNA从反应位点的壁的裂解通过将ssDNA锚定于反应位点的表面的光可降解连接分子来实现。合成中所用的光的波长不会干扰裂解中所用的光的波长。可索引的光酸产生之后是可索引的光裂解的这种组合允许发生DNA合成而不使用芯片上的阀。

然后用悬浮于缓冲溶液中的连接酶灌注通过7776个反应位点，其以一次36个塌陷到216个单独通道中。这些通道以一次6个组合至组装室中，在那里ssDNA组装成双链DNA(dsDNA)。

将足够的液体替代裂解的ssDNA添加到组装室中后，芯片经历温度循环而将DNA片段复性在一起。在一级组合中，ssDNA的6个片段组合而形成三个线性链或增量长(即，三个正向链和三个反向链或增量)的单一片段的dsDNA。然后随后的组装级别将dsDNA的片段放到一起以连接而形成18、108和648线性增量长度的dsDNA片段。当dsDNA长度达到648DNA线性增量时，在50碱基长度的ssDNA增量的条件下，dsDNA的长度约32,400碱基对长。dsDNA的长度相似于大多数病毒基因组，大多数病毒基因组范围在10kbp至50kbp。

当DNA内容物已经组合之后，它们贮存于贮存位点中的6个通道中的1个中。芯片的该区域与先前组合位点上的温度循环相分离并且在至少两个贮存空间饱和之前保持在310K以下。通过脱离芯片阀系统将DNA片段驱入到这些停靠空间中。通过打开控制DNA贮存位点的端口的阀，可将流体灌注通过打开的端口，将DNA推入P1(贮存位点1)，同时控制P2至P6的端口和出口被关闭。对于下一个组装运行，P1是关闭的且出口是打开的，并重复过程，然而在该流程中，在DNA已经组合之后，代之为P2打开同时P1、P3至P6和出口关闭。所有贮存位点饱和之后，缓冲液经P1至P6的端口灌注，且连接酶经停靠区域的直接上游的端口而添加，将P1至P6的内含物推入到最终组合位点/室以进行连接。对于50碱基长度ssDNA增量，结果为194kbp的dsDNA组装物。这是一次芯片合成中最小基因组操作系统的大小。

贯穿本申请，在括号内参考了多个出版物。这些出版物的公开内容在此通过引用并入本申请以更全面地描述本发明所属领域的技术现状。

虽然已参照公开的实施方案描述了本发明，本领域中的技术人员将易于理解所详细描述的特定的实施方案仅是本发明的示例。应理解地是，可进行多种修改而不脱离本发明的精神。因此，本发明仅由以下的权利要求所限制。

等价形式

前面的描述和实施例详述了本发明的特定的实施方案，且描述了本发明人所考虑的最佳实施方式。然而，应理解地是，无论文中出现的前述内容如何详细，本发明可以多种方法来实践且应该根据所附权利要求书及其任何等价形式来解释本发明。

Claims (26)

1.一种用于合成期望的聚合物的方法，所述方法包括：

(a)提供第一反应位点，所述第一反应位点包括与所述反应位点的表面相连的第一单体；

(b)选择性地照射所述第一反应位点，从而将另外的单体与所述第一单体偶联；

(c)重复所述照射直至已经合成期望的结构片段，其中所述期望的结构片段在所述第一单体与所述表面相连的同时被产生；

(d)从所述表面分离所述期望的结构片段；

(e)按需要重复过程a至d以产生期望的数目的期望的结构片段；

(f)将第一期望的结构片段与第二期望的结构片段相组合以产生第一亚聚合物；

(g)将所述第一亚聚合物贮存于第一贮存位点中；

(h)重复过程(a)至(f)以生成第二亚聚合物，并将所述第二亚聚合物贮存于第二贮存位点中；和

(i)将所述第一亚聚合物和所述第二亚聚合物组合以形成期望的聚合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述照射过程导致光产生试剂，并且其中所述聚合物包括核酸。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述核酸包括DNA。

4.如权利要求1所述的方法，其中过程(d)包括用破坏所述第一单体与所述反应位点的表面的连接而不会不经意地将另外的单体添加到所述期望的结构片段中的光波长照射所述期望的结构片段。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反应位点包括与第二反应位点流体隔离的室。

6.如权利要求1所述的方法，其中过程(f)包括将所述第一期望的结构片段与所述第二期望的结构片段相组合以产生一级片段。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述一级片段包括双链核酸、多链片段、或双链片段和多链片段。

8.如权利要求1所述的方法，其中过程(f)包括将i)所述第一期望的结构片段与ii)所述第二期望的结构片段和iii)第三期望的结构片段相组合以形成一级片段。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述一级片段是化学连接或酶连接的，形成第一连接的一级片段。

10.如权利要求9所述的方法，其中重复权利要求9和10的过程以形成第二连接的一级片段，且其中将所述第一连接的一级片段和所述第二连接的一级片段相组合以允许所述第一连接的一级片段和所述第二连接的一级片段相互杂交，形成二级片段。

11.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括进行连接反应从而形成连接的二级片段的过程。

12.如权利要求11所述的方法，所述方法还包括将一个或多个连接的二级片段组合以产生所述亚聚合物。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述期望的结构片段包括随机的核苷酸序列。

14.如权利要求1所述的方法，其中选择性地照射所述第一反应位点从而将单体与所述第一单体偶联包括范围在100至1000nm的波长。

15.如权利要求1所述的方法，其中过程(d)包括范围在100至1000nm的波长，其中过程(d)中的波长不与过程(b)和/或(c)中的波长重叠。

16.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括一个或多个过滤过程，以使已在反应位点中合成的不期望的结构片段不包含在所述亚聚合物之内。

17.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括纯化过程，以使已在组合位点中合成的不期望的最终聚合物不包含在最终基因合成产物之内。

18.一种用于并行的和串行的聚合物产生的设备，所述设备包括：

第一反应位点；

第二反应位点，其中所述第一反应位点和所述第二反应位点包括表面，所述表面允许聚合物与每个反应位点中的所述表面相连，其中至少两个反应位点对于允许产生光产生试剂的第一组光波长是有效地光学透明的，其中所述第一反应位点和所述第二反应位点对于允许裂解连接核酸与所述表面的键的第二组光波长是有效地透明的；

一级组合位点，其中所述第一反应位点和所述第二反应位点与所述一级组合位点是流体连通的，其中所述流体连通允许来自所述第一反应位点的样品与来自第二反应位点的样品相组合，其中所述一级组合位点与控制所述一级组合位点的温度的加热元件相关联以控制核酸复性；和

一个或多个贮存位点，所述一个或多个贮存位点与所述一级组合位点可控地流体连接，其中所述一个或多个贮存位点可以与所述一级组合位点可控地流体隔绝。

19.如权利要求18所述的设备，所述设备还包括长度至少为10,000个核苷酸的核酸。

20.如权利要求18所述的设备，所述设备还包括光导向装置，所述光导向装置用于选择性地将光导向所述第一反应位点而避免将光导向所述第二反应位点。

21.如权利要求18所述的设备，其中所述反应位点包括SiO₂、玻璃、p-n-型掺杂的Si、半导体、掺杂的半导体、导体、绝缘体、金、硫醇化合物、过渡金属、过渡金属化合物、有机化合物、无机化合物、薄膜、液晶层、生物素、链霉亲和素、蛋白、抗体、受体、Langmuir-Blodget薄膜、连接物、导电聚合物、酶、生物催化剂和化学催化剂、离子表面、螯合表面、高度反应性官能团、有机和无机聚合物、氟化聚合物、自组装超结构、DNA探针、PNA探针、RNA探针、蛋白A、蛋白G、核酸结合蛋白、凝集素、碳水化合物、脂质表面或脂质双层表面中的一种或多种。

22.如权利要求18所述的设备，其中一级组合位点包括将至少两个反应位点相互连接的通道。

23.如权利要求18所述的设备，其中所述设备包括：

至少7776个反应位点；

至少216个一级组合位点；

至少36个二级组合位点；

至少6个三级组合位点；和

至少6个贮存位点。

24.一种用于聚合物合成的设备，所述设备包括：

第一反应位点和第二反应位点，所述第一反应位点和第二反应位点与组合位点流体连接，其中所述组合位点与第一贮存位点流体连接；

第三反应位点和第四反应位点，所述第三反应位点和第四反应位点与组合位点流体连接，其中所述组合位点与第二贮存位点流体连接；

第二组合位点，所述第二组合位点与所述第一贮存位点和所述第二贮存位点流体连接；和

出口，其中所述出口允许所述第二组合位点中的流体离开所述设备。

25.一种用于聚合物合成的设备，所述设备包括：

第一反应位点和第二反应位点，所述第一反应位点和第二反应位点与纯化位点流体连接，之后是组合位点，其中所述组合位点与贮存位点流体连接；

第三反应位点和第四反应位点，所述第三反应位点和第四反应位点与纯化位点流体连接，之后是组合位点，其中所述组合位点与第二贮存位点流体连接；

第二组合位点，所述第二组合位点与所述第一贮存位点和所述第二贮存位点流体连接；

出口，其中所述出口允许所述第二组合位点中的流体进入最终纯化位点且然后离开所述设备。

26.如权利要求25所述的设备，所述设备还包括纯化位点，所述纯化位点是尺寸排阻过滤系统。

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