JPH03272686A - 増幅方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は増幅方法、このようなプロセスに用いるための
プライマーおよびこのようなプライマーを含むキットに
関する。特に、本発明は例えば固相捕捉（、ｍｏＬｉｄ
　ｐｈαＳ・Ｃα１４デ藝）またはラベル化系もしくは
シグナル化系への結合に用いられるポリヌクレオチド末
端を有する増幅生成物の製造方法に関する。本発明はま
た本発明の増幅方法に用いるためのプライマーおよびこ
のような方法を実施するためのキットにも関する。

好ましい特定の核酸配列を増幅する方法は公知であり、
文献に述べられている。ケイ、すＶツペ（Ｋ、Ｋｌａｐ
ｐｍ　）等はジエイ６モル、パイオル。

（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　）、（１９７１）、　５６
巻、３４１〜３６１頁において好ましいＤＮＡ配列の増
幅方法を開示している。この方法は一重鎖（ｍｉｎｇｌ
ｅ　５ｔｒａｎｄ　　）を形成するためのＤＮＡ　　二
重鎖（ｄｕｐｌｅｘ　）の変性を含む。この変性段階は
好ましいＤＮＡ配列に隣接する領域（デーｇｉｏ％）に
ハイブリッド化する充分に過剰な２種類の核酸プライマ
ーの存在下で実施される。冷却すると、それぞれプライ
マーと適当に複合した鋳型鎖（ｔａｍｐｌａｔａ　５ｔ
ｒａｎｄ　）の全長を含む、２種類の構造が得られる。

ＤＮＡポリメラーゼとそれぞれ必要なヌクレオシドトリ
ホスフェートの充分な量とを加えると、それによっても
との二重鎖を有する２分子が得られる。好ましいＤＮＡ
配列の複製の適当な数が得られるまで、上記変性サイク
ル、プライマー添加および伸長（ｍａｔ−％５ｉｎｓ）
’ｒ：＜り返す。プライマー濃度の調節が必要であるこ
とが指示されている。

この方法は現在、米国特許第４６８３１９５号および第
４６８３２０２号に特許請求されているポリメラーゼ鎖
反応（ＰＣＲ）と呼ばれる、これらの特許では鋳型上で
の一定核酸配列の増幅をｆｙムス　アクアティカス（Ｔ
ｈｅデｍｓ８　Ｇｑ％αｔｉｃ％８）（Ｔａｇ　）　Ｄ
Ｎ　Ａポリメラーゼまたは−）Ｃ，Ｗｋ＠ＣＥ。

ｃｏｌｉ　）　ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグ
メン）　（Ｋ１ｍｎｏｗ　ｆｒａｇｔｙ＋ａｎｔ　）の
存在下での核酸プライマーの伸長によって行なっている
。この増幅手順は一般に約５０サイクルまでくり返され
る。

記載されている実施例は一般に数百塩基対の短いＤＮＡ
配列に関するものであるにすぎない。

ＰＣＢ反応のような増幅プロセスは核酸配列を増幅する
有用ｌツールを提供するが、増幅生成物が例えば捕捉ま
たはシグナル化のために他の種（５ｐｅｃｉｅｓ）に付
着できることが一般に好ましＬ・。

他の種は例えば固相またはシグナル化部分（ｓｉｇｎα
ｔｌｉｎｇ　ｍｏｉａｓｙ）でありうる。従って、例え
ばヌクレオチドプローブ製造の精製工程としてまたはそ
れらの製造もしくは遺伝的障害の診断におけるような検
定方法での品質制御工程として、増幅生成物を単離する
ことが望ましい。増幅生成物に付随するまたは運ばれる
ラベルまたはマーカーをラベルするもしくはマークする
、または増大することも望ましい。

増幅生成物を他の種に付着できるようにするために、増
幅に用いるプライマーは例えば適当な抗原または抗体を
有する同相への捕捉のためには抗原または抗体を有する
ことができるが、このような抗原または抗体がＰＣＢ温
度サイクルに耐えるように熱安定性であることが必要で
ある。代替方法はビオチンのような複合体形成対（ｃｏ
ｍｐｌｅｘｆｏｒｍｉｎｇ　ｐａｉｒ）の１要素を有す
るプライマーを用いることであり、この場合性の種はア
ビジンのような複合体形成対の他の要素を有する。この
ように方法は１種類以上のテストの同時実施に容易に適
応できないので不充分である傾向がある。増幅生成物の
他の種への付着が核酸ハイブリッド化に基づく検定法は
上記問題を少なくとも一部解決すると考えられるが、Ｐ
ＣＢ反応のプライマーが例えば固相固定ＤＮＡに結合す
るために、ポリヌクレオチド末端を備える場合には、存
在するＴｔ０ＬｑＤＮＡポリメラーゼがポリヌクレオチ
ド末端の増幅ならびにプライマーの伸長標的結合部分（
ｅｓｃｅｎｄｅｄ　　ｇａｒｇｍｇ　　ｂｉｎｄｉｎｇ
　　ｐｏｒｔｉｏｎ）の増幅を生ずると考えられる。こ
のような場合に、ポリヌクレオチド末端自体が増幅され
るので、他の１１（例えば固相またはシグナル化部分）
への付着の重合が生じ、これによって結合が抑制される
。

本発明は、（１Ｊ　　ｉｆ的ヌクレオチド配列°の目的
部分に対して実質的に相補的である標的結合ヌクレオチ
ド部分および（２）　　ポリヌクレオチド末端から戚る
第１プライマーを用いて増幅プロセスを実施するならば
、第１プライマーはその拡張生成物自体がプライマー伸
長の鋳型として役立って増幅プライマー伸長生成物を形
成し、ポリヌクレオチド末端に相補的な配列を含む増幅
プライマー拡大生成物の形成を抑制するようなものであ
るので、上記問題の少むくとも一部が克服されるという
発見に基づく。

従って、本発明の１態様（ｆａａｔｕデー）によると、
標的ヌクレオチド配列をハイブリッド化条件下で、対応
増幅プライマー、適当たヌクレオチドおよびヌクレオチ
ド重合剤（ａｇｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｐｏｌｙｍａｒｉ−
ｇａｔｉｏ＊　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）　　と同
時にまたは逐次接触させることから威る標的ヌクレオチ
ド配列の増幅方法であって、第１プライマーが次の要素
：（１）標的ヌクレオチド配列の目的部分に対して実質
的に相補的である標的結合ヌクレオチド；および （２）ポリヌクレオチド末端（テイル；ｔαｉｌ）から
成り、 第１プライマーがプライマー伸長を受け、これによって
第１プライマー伸長生成物が鋳型としての標的ポリヌク
レオチド配列に基づいて合成され、この第１プライマー
伸長生成物がその鋳型から変性し、増幅プライマーが第
１プライマー伸長生成物の目的部分へハイブリッド化し
た後に、プライマー伸長が行われて増幅プライマー伸長
生成物が形成され、第１プライマー伸長生成物中の第１
プライマーの存在が増幅プライマー伸長生成物中のポリ
ヌクレオチド末端に対して相補的に配列の形成を抑制す
るために効果的である方法を提供する。

プライマー伸長生成物（伸長生成物が第１プライマー伸
長生成物または増幅プライマー伸長生成物のいずれであ
っても）をその鋳型から分離し、このようにして得られ
た一重鎖分子をさらにプライマー伸長生成物が合成され
るよ５　ｔｘ条件下で第１プ２イマーおよび増幅プライ
マーと接触させる工程が、目的レベルの塩基配列増幅を
達成するまで必要な回数くり返すことができることは理
解されるであろう。

第１プライマーは任意に、標的結合ヌクレオチド部分と
ポリヌクレオチド末端およびこれらの間のヌクレオチド
重合ブロッキング部分を含む。しかし、ヌクレオチド重
合ブロッキング部分の存在は本質的ではなｔ・、という
のは例えば１つ以上のポリヌクレオチド末端が標的結合
ヌクレオチド部分に結合してＬ・る場合には、または例
えば標的結合部分とポリヌクレオチド末端が互いに結合
するが、この部分と末端が相互に反対の意味であり、標
的結合ヌクレオチド部分が一般に５　’　−３’の意味
であり、ポリヌクレオチド末端が３′→５′の意味であ
り、それらの５′末端を介して結合する場合には、重合
剤（ａｇｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｐｏｌｙｍｅｒ％ｔａｔｉ
Ｏ’Ｆｌ）が鋳型としてのポリヌクレオチド末端に基づ
く伸長生成物を形成することが抑制されるからである。

第１プライマーの他に、任意に増幅プライマーが （１）　　標的ヌクレオチド配列の目的部分に対して本
質的に相補的である標的結合ヌクレオチド部分；および （２）ポリヌクレオチド から成ることもでき、 この増幅プライマーがプライマー伸長を受け、それによ
って増幅プライマー伸長生成物が鋳型としての第１プラ
イマー伸長生成物に基づいて合成され、増幅プライマー
伸長生成物がその鋳型から変性し、第１プライマーが増
幅プライマー伸長生成物の目的部分にハイブリッド化し
た後に、プライマー伸長が行われて、第１プライマー伸
長生成物が形成され、増幅プライマー伸長生成物中の増
幅プライマーの存在が第１プライマー伸長生成物中のポ
リヌクレオチド末端に相補的ね配列の形成を抑制するた
めに効果的である。

第１プライマーに関して述べたように、樟的結合ヌクレ
オチド部分とポリヌクレオチド末端との間に任意にヌク
レオチド重合ブロッキング部分を挿入することもできる
が、これは必らずしも必要ではない。

本発明の方法を用いて、例えば増幅生成物を例えば固相
に捕捉することおよび／または、増幅生成物自体がラベ
ルまたはマーカーを有するか否かに関係なく、増幅生成
物をラベルまたはマーカーに結合させることができる。

従って、本発明の方法は増幅生成物に付随するシグナル
の強化を可能にし、さらに例えばヨーロッパ特許公報第
７９．１３９号、第１２４，２２１号、第１２８．３３
２号、第１５３，８７３号、第１８５．４９４号、第２
０４．５１０号、もしくは第２２５．８０７号、または
英国特許公報第２，０１９，４０８号もしくは第２．１
６９，４０３号、またはＰＣＴ特許公報第Ｗ０８７１０
３６２２号もしくは第ＷＯ３８７０２７８５号に述べら
れている方法のような、便利な方法による検出および／
または固相上へ捕捉を増幅生成物に可能にする。さらに
、本発明の方法は適当な設計のポリヌクレオチド末端に
よって１回のテストでの１つ以上の増幅生成物の確認を
可能にする。

従って、例えば第１遺伝子座（Ｊｅｅ１％ａ）に関する
プライマーのポリヌクレオチド末端は他の遺伝子座（複
数の場合も）に関するポリヌクレオチド末端から識別可
能であるので、第１座に関する増幅生成物は第１の識別
可能な固相に捕捉可能であり、他の遺伝子座（複数の場
合）に関する増幅生成物は相互に識別可能であることが
好ましい、１つ以上の他の固相に捕捉される。同様に任
意に、第１座に関する増幅生成物はプライマーのポリヌ
クレオチド末端を介して識別可能にラベルまたはマーク
することができ、他の遺伝子座（複数の場合も）に関す
る増幅生成物も、好ましくは各遺伝子座に関する増幅生
成物が異なるラベルまたはマーカーによって識別される
ように、ラベルまたはマークすることができる。従って
例えばポリヌクレオチドを用いて一定のシグナルを一定
の遺伝子座に適合（ｍａｔｃｈ）させることができる。

本発明の方法はまた溶液相（ｇｏ１％ｔｉｏｎ　ｐｈａ
ｓｅ）においても、便利には、ヌクレオチド重合ブロッ
キング部分までの増幅不能に末端プライマーの３′端部
に本質的に相補的であり、例えば合体していない増幅不
能々末端プライマーを単離しうるハプテンに結合するオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて実施することがで
きる。好ましいノ・ブテンは磁気ビーズ（ｍａｙｎｅｔ
ｉｃ　ｂｅａｄ　）　である。反応混合物をハプテン結
合オリゴヌクレオチドと接触させ、これを例えば磁場に
入れた後に、合体していない増幅不能な末端プライマー
を好ましくはマイクロタイター皿（ｔｌＬｉｃｒｏｔｉ
ｔｒｍ　ｄｉｓｈ　）孔に保有する。合体していない増
幅不能な末端プライマーを含む反応混合物を次にさらに
ハイブリッド化条件下で、例えばフルオロフォア（ｆ１
％ｏｒｏｐｈｏ−デａ）に結合した検出プライマーと接
触させる。例えばフルオレセインおよびローダミンのよ
うｆｘ便利にフルオロフォアを用いることができる。増
幅生成物の存在を次に我々のヨーロッパ特許出願第９０
３０１１３５．１号に開示された方法による螢光偏光に
よって検出する。ノ・イブリッド化複合体は選択したフ
ルオロフォアがフルオレセインである場合には好ましく
は４９５５ｍ波長における、または選択したフルオロフ
ォアがローダミ／である場合には好ましくは５５４％情
波長における紫外線によって便利に励起される。我々は
理論的な考察に束縛されることを望むわけではないが、
上記で概略を述べた溶液相実施態様は線状増幅の一重鎖
生成物に対する使用には適していｋいと考えられる。

本発明の方法は例えば法廷用、農業、獣医学、食品科学
または分子生物学研究のような、特定の核酸配列の検出
または測定が必要であるような、診断医学および診断科
学のすべての分野に適用可能である。特に、この方法は
感染性微生物の検出および、例えばのう脂性線維症、α
−１−アンチトリプシン欠損症および疾患の素因のよう
な種々な遺伝疾患を生ずる、点突然変異（ｐｏｉ％ｔｔ
ｈｕｔ−ａｔｉｏ％）、遺伝子欠損および再配列の検出
に適用可能である。

これに関して、本発明の方法は我々のヨーロッパ特許出
願第８９３０２３３１．７号、特許公報第００３３２４
３５号に述べられ、特許請求され、さらにニュートン（
＃＃ｗｔｏψ）等のニュークリイック　アシド　リサー
チ（Ｎ聾ｃ１ｇｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒａｓｍａ　−ｒｃｈ
）１７（７）２５０３２５１６（１９８９）に述べられ
ているアンプリフイケーション　リフラクトリ−ミュー
ティジョン　システム（ｋｎｐ１４ｆｉｃａｔｉｏｓ　
Ｒａｆｒａｃｔｏｒｙ　ＭｓｔａｔｉｏｓＳｙｓｔｅｍ
）　（ＡＲＭ’Ｓ　）と呼ばれる対立遺伝子特異性増幅
方法（ａｌｌｅｇｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃ・情ｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏ外ｍｅｔｈｏｄ）　　と共に有利に用いられ
る。二ニークリは、我々の上記ヨーロッパ特許出願に述
べられ特許請求されているポリメラーゼ連鎖反応（ｃｈ
ａｉｎデーαｃｔｉｏ％）に反して、線状増幅その他の
増幅方法によって実施することもできる。ＡＲＭＳは対
立遺伝子特異性方法での増幅を可能にするプライマーを
用いる。対立遺伝子特異性はプライマーの３′−末端塩
基のそのそれぞれの対立遺伝子との相補性によって形成
される。プライマーの３′末端塩基が不適正である場合
に増幅は阻害される。特定プライマーの特異性が絶対的
でない場合に、付加的な不適正塩基を含めてその３′−
末端を不安定化することによってこれが達成される。Ａ
ＲＭＳとＰＣＢとの両方は生物学的サンプルからの少量
の粗ＤＮＡに対して実施することができるので、かなり
の診断上の有用性を有する。

上記で概略を述べた対立遺伝子特異性増幅は遺伝子座の
正常対立遺伝子と変異対立遺伝子との両方の存在を検出
する反応に、単独固相を用いて便利に実施することがで
きる。例えばα−１−アンチトリプシン遺伝子のＳ座（
ＡＡＴ−５座）のような特定の座に対して、内部対照シ
グナルプライマーを例えばフルオレセインのようなフル
オロフォアによってラベルし、両ＡＲＭＳシグナルプラ
イマーを例えばローダミンのような異なるフルオロフォ
アによってラベルする。異ｔｌる色である緑（フルオレ
セイン）、赤（ローダミン）およびこれらの組合せの黄
色（赤＋緑）が正常および変異のへテロ接合体とホモ接
合体のすべての検出を可能にする。例えば、２固相はそ
れぞれ、ＡＡＴ−Ｓ座の変異配列の内部対照捕捉オリゴ
ヌクレオチド＋捕捉ヌクレオチドならびにＡＡＴ−Ｓ座
の正常配列の他の内部対照捕捉オリゴヌクレオチド＋捕
捉オリゴヌクレオチドをそれぞれ結合する。増幅不能に
末端を有するＡＲＭＳ増幅生成物との次のハイブリッド
化は異にる色の螢光生成物の確認を可能にする。従って
、例えば正常た個体は第１固相上に緑色（フルオレセイ
ンのみ）として出現し、同様にヘモ接合体Ｓ変異個体は
第２固相上に緑色として出現する。ペテロ接合体は両固
相上に黄色として出現する（緑＋赤）。同様に、正常な
個体は第２固相上に黄色に出現し、ヘモ接合体は第１固
相上に黄色に出現する。上記態様（ａａｐａｃｔ）　　
はデイツプスティック型検定フォーマット（ｄｉｐｓｔ
ｉｃｋ　ｔｙｐｅ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒｍａｔ）に関し
て特に有用である。必要な固相数の減少も選択した検定
法を簡単にする。

上記で略述した対立遺伝子特異性増幅は代替的に溶液相
においても実施することができる。従って、例えば合体
してい々い増幅不能な各末端プライマーを前述したよう
に取出す。次に反応混合物をハイブリッド化条件下で複
数の検出プライマーと接触させると、各検出プライマー
は異なるフルオロ７オアと結合する。例えばフルオレセ
イン、ローダミン、テキサスレッド（１’ａｚａａ　ｒ
ｅｄ）またはルシファーイｘ　ｏ　−（ＬＳｃｉｆｅｒ
　ｙｅｌｌｏｗ　）のような便利なフルオロフォアを用
いることができる。

次に、例えば前記螢光偏光を用いて、各増幅反応生成物
の存在を検出する。

本発明のさらに他の態様によると、 第１プライマーと、増幅すべき各標的ヌクレオチド配列
の対応増幅プライマーとを含み、各第１プライマーが、 （１）標的ヌクレオチド配列の目的部分に対して実質的
に相補的である標的結合ヌクレオチド部分；および （２）ポリヌクレオチド末端（テイル：ｔａｉｌ）から
戒り、 第１プライマー伸長生成物中の第１プライマーの存在が
増幅プライマー伸長生成物中のポリヌクレオチド末端に
対して相補的な配列の形成を抑制するのに効果的である 標的ヌクレオチド配列の増幅用キットを提供する。

第１プライマーは任意に、標的結合ヌクレオチド部分と
ポリヌクレオチド末端との間に挿入してヌクレオチド重
合ブロッキング部分を付加的に含むことができる。

増幅プライマーは任意に、 （１１標的ヌクレオチド配列の目的部分に実質的に相補
的である標的結合ヌクレオチド部分；および （２）ポリヌクレオチド末端（ティル：　ｔａｉｌ　）
を含み、 増幅プライマー伸長生成物中の増幅プライマーの存在は
第１プライマー伸長生成物中のポリヌクレオチド末端に
相補的な配列の形成を抑制するために効果的である。

増幅プライマーは任意に標的結合ヌクレオチド部分とポ
リヌクレオチド末端との間に挿入されたヌクレオチド１
合ブロッキング部分を付加的に含み５る。

本発明のキットは任意に、適当である場合には内部対照
プライマーを含みうる。

本発明のキットは任意に、適当な異なるヌクレオチドお
よび／またはヌクレオチドの重合剤を含みうる。

さらに、本発明のキットは任意に、例えば増幅すべき各
標的ヌクレオチド配列に関して、プライマーのポリヌク
レオチド末端に直接または間接的に結合するために固相
を含む。従って、例えば固相はプライマーのポリヌクレ
オチド末端に対して実質的に相補的であるヌクレオチド
配列を有することができる。同じ反応器内で１つ以上の
標的ヌクレオチド配列を増幅すべき場合には、プライマ
ーのポリヌクレオチド末端に直接または間接的に結合す
るための固相は増幅すべき各標的ヌクレオチド配列に関
して識別可能であることが望ましい。

ここで用いる「標的ヌクレオチド配列」なる用語は、増
幅すべき配列を含むヌクレオチド配列を意味する。従っ
て例えば、本発明をβ−サラセミア（β−ｔｈαＬａａ
ｓｍｔｎｉａ）の診断に用いる場合には、サンプルは６
０程度、例えば５０個の別々の可能な変異配列（ｖａｒ
ｉａｎｔ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）を含むことができるた
め、その全てを任意に増幅しく例えばヨーロッパ特許公
報第２３７．３６２号に開示されているように）、増幅
生成物を本発明によって識別することのできる６０程度
の標的ヌクレオチド配列を含むことができる。

ここで用いる「ヌクレオチド」なる用語はＤＮＡまたは
ＲＮＡ中に存在するヌクレオチドを意味し、従ってアデ
ニン、シトシン、グアニ／、チミンおよびウラシルを塩
基として有し、糖部分がデオキシリボースまたはリボー
スであるヌクレオチドを含む。しかし、通常の塩基であ
るアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシ
ルの１つと塩基対形成（ｂａｓｅ　ｐａｉｒｉｎｇ）　
Ｌ　５る他の修飾塩基（ｔｎｏｄｉｆｉａｄ　ｂａｓｓ
→　が、本発明に用いる診断用第１プライマーおよび増
幅プライマーに用いられることは理解されるであろう。

このような修飾塩基には例えば８−アザガニンおよびヒ
ボキサンチンがある。ヌクレオチドは任意にラベルまた
はマーカーを有することができるので、プライマー伸長
生成物への併合時に、ヌクレオチドは例えば固相への捕
捉のためにプライマー伸長生成物に付随するシグナルを
強化する。

本発明の方法を４種類のヌクレオチドのすべてを含むと
はかぎらなし・標的ヌクレオチド配列の増幅に用いる場
合には、適当に対応ヌクレオシドトリホスフエートのみ
の存在下で第１プライマーの伸長生成物および任意に増
プライマーの伸長生成物が形成され、４種類のヌクレオ
シドトリホスフェートのすべてが必らずしも必要でｋい
ことが理解され、ここで用いる「適当々ヌクレオチド」
なる表現が理解されるであろう。

ヌクレオチドの重合剤は酵素を含めて、プライマー伸長
生成物の合成の実施に役立つような化合物または系であ
る。このための適当な酵素には、例えば大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼ１、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノフフ
ラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手可能な
りＮＡポリメ２−ゼ、逆転写酵素、および熱安定性酵素
を含めた他の酵素がある。ここで用いる「熱安定性酵８
」ｆする用語は熱に対して安定性であり、耐熱性であり
、ヌクレオチドの結合（ａｏｔｙｈｂｉｎａｔｉｏ％）
を適当に触媒作用（促進ンして、各核酸鎖に相補的であ
るプライマー伸長生成物を形成しうる酵素を意味する。

一般に、合成は各プライマーの３′一端部から開始され
、合成が終了するまで、鋳型鎖に沿って５′方向に進行
して、種々な長さの分子を形成する。

しかし、例えば熱安定性酵素のように、５′端部から合
成を開始して、上記と同じプロセスを用いて、他の方向
に進行する酵素も存在する。本発明の方法に用いること
のできる好ましい熱安定性酵素はサームス　アクアティ
カス（Ｔｈ−デｔｎｓｔｓ　ａｑｕ−ａｔｉｅｓｓ）か
ら抽出、精製することのできる酵素である。このような
酵素はヨーロッパ特許公報第２３７．３６２号（ヨーロ
ッパ特許公報第２５８゜０７１号も参照のこと）に述べ
られているように、約８６．０００〜９０，０００ダル
トンの分子量を有する。サームス　アクアティカスはア
メリカンタイプ　カルチャー　コレクション（Ａｓｓデ
１ｃａｎＴｙｐｅ　Ｃ３Ｌｔｕｒａ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ）（米国メリーランド州、ロックビル、パークロー
ンドライブ１２３０１３から無制限に入手可能である。

ここで用いる「プライマー（ｐｒｉｎｙｒ　）　Ｊなる
用語は、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長生
成物の合成が誘発される条件下、す々わち適当な緩衛剤
（「緩衝剤」はｐＨ５イオン強度、補因子等を含む）中
、適当な温度における適当なヌクレオチドおよび例えば
ＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在下において置
かれた時に、合成の開始点として作用しつる、精製され
た制限消化物（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｄｉｇｅｓｔ
　）として自然に生成するかまたは合成的に製造される
オリゴヌクレオチドを含む結合要素を意味する。第１プ
ライマーに関して、結合要素のオリゴヌクレオチド部分
は「標的結合ヌクレオチド部分」と呼ばれる。

ここで用いる「オリゴヌクレオチド」なる用語は２個以
上、好ましくは３個以上のデオキシリボヌクレオチドま
たはりボヌクレオチドから成る分子として定義される。

その正確なサイズは反応温度、塩濃度、例えばホルムア
ミドのような変性剤（ｄａｎａｔｓｒａ酊）　、および
オリゴヌクレオチドがハイブリッド化する予定の配列と
の相補性度のような多くの要素に依存する。

増幅において最大効果をあげるためには一重鎖であるこ
とが好ましいが、この代りに二重鎖であることも可能で
ある。二重鎖の場合には、プライマーを伸長生成物の製
造に用いる前にその鎖（ｓｔｒｔＨｇｄ　）を分離する
ように処理する。プライマーがオリゴデオキシリボヌク
レオチドであることが好ましい。プライマーは重合剤の
存在下で伸長生成物の合成を開始させるために充分な長
さでなげればならない。プライマーの正確な長さは温度
、プライマー供給源および方法の使用を含めた多くの要
素に依存する。例えば、標的配列の複雑さ（ｃｏｔｎｐ
ｌａｘｉｔｙ）に依存して、第１プライマーと増殖プラ
イマーは標的ヌクレオチド配列にハイブリッド化しうる
１２〜３５、例えば１５〜３５ヌクレオチドを典型的に
含むが、これより多いまたは少ないこのようなヌクレオ
チドを含むことも可能である。標的ヌクレオチド配列に
ハイブリッド化できる短い配列のみを有するプライマー
は一般に、鋳型による充分に安定なハイブリッド複合体
を形成するために、低い温度を必要とするにすぎない。

ヌクレオチドに関してここで用いる「相補的」なる用語
は、他の特定のヌクレオチドと塩基対合ｊ　６　（ｂａ
ｓｓ　ｐａｉｒ）ヌクレオチドを意味する。アデノシン
トリホスフェートはウリジントリホスフェートまたはチ
ミジントリホスフェートに対して相補的であり、グアノ
シントリホスフェートはシチジントリホスフェートに対
して相補的である。

チミジントリホスフェートとグアノシントリホスフェー
トはある一定の環境下で塩基対合しうるが、これらは本
明細書の目的のためには相補的と見なされないことは理
解されよう。シトシントリホスフェートとアデノシント
リホスフェートがある一定の環境下で塩基対合しつるが
、これらは本明細書の目的のためには相補的と見なされ
ないことも理解されよう。同じことがシト７ントリホス
フエートとウラシルトリホスフェートにも該当する。

ここでのプライマーは増幅すべき各特定配列の異たる鎖
に対して「実質的に」相補的であるように選択される。

このことは、プライマーがそれらの６鎖によってハイブ
リッド化するために充分に相補的でなげればならないこ
とを意味する。それ故、プライマー配列は鋳型の正確な
配列を示す必要がない。しかし、一般には、ニュークレ
イツクアシド　リサーチ　１７（７）２５０３−２５１
６（１９８９）に述べられた方法または線状増幅もしく
は、ポリメラーゼ連鎖反応以外の増幅方法を用いた対応
方法によって実施した分析に関する以外は、プライマー
は正確な相補性を有する。

第１プライマーと任意に増幅プライマーは標的結合ヌク
レオチド部分（前記で定義）とポリヌクレオチド末端と
を有し、任意に重合ブロッキング部分を有する。ポリヌ
クレオチド末端は次の条件：（１）　　一定の厳しい条
件下で実質的に相補的な配列と安定なハイブリッドを形
成するために充分た長さである；および ＜２）　　（ａ）　　標的ヌクレオチド配列とポリヌク
レオチド末端との間、および （６）　　ポリヌクレオチド末端と標的結合ヌクレオチ
ド部分との間 の有意なハイブリッド形成を避けるために、標的結合ヌ
クレオチド部分から充分に異なるを備えた特定の配列で
ある。

後者の条件は誤った結果が同時に出現することによる分
子混乱（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｏｎｆ＠５ｉｏｎ）を
防止するために必要である。

ポリヌクレオチド末端は特定の遺伝子産物（ｇａｎｇ　
ｐｒｏｄｓｃｔ　ｏｒ　ｐｒｏｄｂｃｔｓ）をコードす
るものであっても、全くコードしないものでもいずれで
もよい。従って、構造遺伝子またはその一部をポリヌク
レオチド末端として用いることができる。しかし、好ま
しい配列は特定の遺伝子をコードしない配列である、こ
のようなコーディング性（ｃｏｄｉｎｃｔ　）は分析物
中に存在する相補的遺伝子配列と交差ハイブリッド化す
るからである。従って、非コーディング性（ｎｏｎ　−
ｃｏｄｉｎｇ）であり、例えばポリデオキシＧ、ポリデ
オキシＡ１ポリデオキシＧＡ、ポリデオキシＧＡ　Ｔ、
ポリデオキシＧＴＡを含む配列または他の低相補性（反
復）配列またはランダムに発生した配列のような、分析
物中の配列に対して相補的であるとは考えられないよう
なポリヌクレオチド配列を選択することが好ましい。こ
のような（う／ダムに発生し′丸）配列を適当なヌクレ
オチド配列データベースに対してチエツクして、ランダ
ムに発生した配列と標的配列との間に結合が生ずるとは
確実に考えられないようにすることができる。ランダム
に発生した配列をそれ自体公知の方法を用いた分析物サ
ンプルのドツトプロット分析（ｄｏｔ　ｐｌｏｔ　ａｓ
ａｌｙｓｉａ）によって、さらにチエツクして、分析物
中の標的配列または他の配列との見せかけの結合（ａｐ
ｕ−デ１ｏｎａ　ｂｉｎｄｉｎｇ　）が確実に生じｋい
ようにすることもできる。

ここで用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は１個以上
のヌクレオチド（前記で定義）の配列を意味し、従って
「オリゴヌクレオチド」なる用語（前記で定義）を含む
。

ここで用いる「重合ブロッキング部分」なる用語は、第
１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列の間に例え
ば共有結合によって結合した場合に、第１ヌクレオチド
配列と第２ヌクレオチド配列の両方ではなく、このよう
な第１配列または第２配列のいずれかの増幅（この用語
は重合プロツキング部分を越えた検出可能な複製をも含
む）の抑制、好ましくは阻害、より好ましくは完全な阻
害に有効である部分を意味する。一般に、重合剤はプラ
イマーの３′末端からポリヌクレオチド合成を開始し、
鋳型鎖に沿って５′方向に進行する、従って一般にポリ
ヌクレオチド末端は重合ブロッキング部分の５′であり
、標的結合ヌクレオチド部分は重合ブロッキング部分の
３′である。しかし、プライマーの５′末端で合成を開
始し、鋳型鎖に沿って３′方向に進行する重合剤を用い
る予定である場合には、標的結合ヌクレオチド部分は重
合ブロッキング部分の５′であり、 ポリヌクレオチド末端は重合ブロッキング部分の３′で
ある。重合ブロッキング部分が本発明の方法の条件下で
不活性な部分であることが好ましい。

任意に、標的結合ヌクレオチド部分は１個以上のポリヌ
クレオチド末端を有する、および／またはポリヌクレオ
チド末端は１個以上の標的結合ヌクレオチド部分を有す
ることができる。このような状況下では、例えばヨーロ
ッパ特許出願第３１７０７７号に述べられているように
、ポリヌクレオチド末端と標的結合ヌクレオチド部分と
の間の重合ブロッキング部分の存在は不必要である。

同様に、標的結合ヌクレオチド部分とポリヌクレオチド
末端とは相互に結合可能であるが、標的結合ヌクレオチ
ド部分とポリヌクレオチド末端とは相互に逆の意味で配
置される。このような状態においても、ポリヌクレオチ
ド末端と標的結合ヌクレオチド部分との間の重合ブロッ
キング部分の存在は不必要である。このような状態では
、標的結合部分は一般に５′−→３′の意味で配置され
、ポリヌクレオチド末端は一般に３′−→５′の意味で
配置され、それらの５′末端を介した結合が存在する。

重合ブロッキング部分は、存在する場合には、本発明の
方法の条件下で不活性であり、ポリヌクレオチド末端と
標的結合ヌクレオチド部分との間に用いられ、例えば共
有結合によって、結合した部分である。このためには下
記に例示するように、広範囲ｔｌこのように部分が考え
られる。例えば、重合ブロッキング部分は例えばポリス
チレン、ガラスまたはポリアクリルアミドビーズのよう
なビーズであるか、または例えば鉄、コバルトもしくは
ニッケルのような遷移金属（例えばポリヌクレオチド末
端および標的結合ヌクレオチド部分との遷移金属複合体
として）またはポリヌクレオチド末端と標的ヌクレオチ
ド部分との間に結合された例えばヒ素、アンチモンもし
くはビスマスのような、リンと置換しうる元素である。

ブロッキング部分は同様に、例えば酸素が置換されて特
にホスホロジチオエート、ホスホロチオエート、メチル
ホスホネート、例えばホスホルモルホリゾートのような
ホスホラミデートまたはそれ自体公知の他の残基を生ず
る場合に、通常のホスフェート結合基の置換をも含むが
、これはあまり好ましくない。

これに代りうるブロッキング部分には、制限エンドヌク
レアーゼによってｇ識されない３′−デオキシヌ、クレ
オチドおよび、循環に２’−３’結合を有さす、制限ヌ
クレアーゼによっても認識されないセコヌクレオチドが
ある。

前記末端と標的結合ヌクレオチド部分との間の最小分子
長さは一般に１原子である。前記分子長さは便利には１
〜２００ヌクレオチドと等価であり、有利には１〜１０
ヌクレオチドと等価であり、好ましくは２〜４ヌクレオ
チドと等価であり、例えばこの部分の性質または異なる
部分の組合せの性質に依存して、約２ヌクレオチドまた
は約４ヌクレオチドと等価である。

従って、例えば重合ブロッキング部分は少なくとも１個
のデオキシリボフラノシルナフタレンもしくはリボフラ
ノシルナフタレン部分から成り、有利には少むくとも２
個（例えば２〜１０個）のこのような部分、好ましくは
少なくとも３個（例えば３〜８個）、より好ましくは少
なくとも４個（例えば４〜６個）のこのように部分を含
むことができる。デオキシリボフラノシルまたはリボフ
ラノシルナツタレフ部分は任意に、３′−フラノシル結
合を介してまたは好ましくは２′−７ラノシル結合を介
して隣接ヌクレオチドに結合することができる。特に、
デオキシリボフラノシルナ７タレン部分を用いることが
でき、ポリヌクレオチド末端および標的結合ヌクレオチ
ド部分の隣接ヌクレオチドへの結合は２′−デオキシリ
ボフラノシル基またはより好ましくは３′−デオキシリ
ボフラノシル基を介して行われる。重合ブロッキング部
分は任意に、炭素数１以上、例えば少なくとも２、便利
には少なくとも３、有利には少なくとも４、好ましくは
少なくとも５、より好ましくは炭素数６の直鎖アルキレ
ン基を含むこともできる。アルキレン鎖の炭素鎖の上限
は合成上の都合によってのみ定められる。従って、例え
ばこの基は炭素数６〜２０にｋることかでき、アルキレ
ン基は任意に少なくとも１個、例えば１〜６個のＣ１〜
、アルキル置換基を含むことができる。アルキレン基ま
たは置換基が存在する場合はそのバックボーンは便利に
は最低数として、少なくとも炭素数７．８゜９．１Ｏ１
１１もしくは１２であり、炭素数の最大数として１９．
１８．１７および１６（優先順位は１９＜１８＜１７＜
１６）である。

ここで用いる「増幅プライマー」なる用語は第１プライ
マーがハイブリッド化しうる核酸鎖に相補的である核酸
鎖にハイブリッド化しうるプライマーを意味し、「増幅
プライマー」はその補体から分離した後の第１プライマ
ー伸長生成物にハイブリッド化し５るようなヌクレオチ
ド配列を有するので、第１プライマー伸長生戒物は増幅
プライマーの伸長生成物の合成のための鋳型として役立
ち、増幅を促進する。

オリゴヌクレオチド（Ｓ　／　−３／　）が下記に述べ
る通りである次の実施例によって、限定するわけではな
く、本発明を説明する。

コンピュータープログラムを用いて、増幅不能な末端の
ヌクレオチド主要構造を発生させ、ランダムヌクレオチ
ド配列を発生させた。候補の増幅不能な末端（ｅａｎｄ
ｉｄａｔｉ　ｎｏｎ−ａｍｐｌｉｆｉａｂｌａｔａｉｌ
　）　　のヌクレオチド配列をグアノシン含量に関して
検査し、特に３個以上の連続Ｇ残基な有するＧ富化配列
を廃棄した。残りの候補を２不適正を認めるゲンバ／り
変形（Ｇ問ｂ８鴇ｋ　ｔＩａｒｇｉｏ記）６３０にュー
クレイック　アシド　リサーチ１２．３８７〜３９５．
１９８４）での霊長類ＤＮＡヌクレオチド配列に比べて
テストした。適合した候補は廃棄した。オリゴヌクレオ
チドはすべて、製造者のプロトコールに従ってアプライ
ド　バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｍｔｎ）　３８０　Ａまたは３６□Ｂ　　ＤＮＡシンセ
サイサ−（ＤＮＡａｙｎｔｈａｚｉｓｇｒ　）　　を用
Ｌ）で合成した：ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣ
ＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧ
ＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧ ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＮＮＮＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣ
ＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧ （式中、Ｎは２′−デオキシリボフラノシルナフタレン
部分を表し、５′と３′の末端ナフタレン部分は３’−
ＰＯ４基を介して隣接ヌクレオチドに結合する） オリゴヌクレオチド３ ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＮＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧ
ＣＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ（式中、Ｎは３′−デオキシリ
ボフラノシルナフタレン部分を表し、ナフタレン部分は
２’−ｐｏ、基を介して隣接ヌクレオチドに結合し、そ
れによってＤＮＡ鎖にねじれ（Ｌｉｎｋ）を導入する）
ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＮＮＮ７’ＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧ
ＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧ （式中、Ｎは３′−デオキシリボフラノシルナフタレン
部分を表す、ナフタレン部分は２’−ｐｏ４基を介して
隣接ヌクレオチドに結合し、それによってＤＮＡ鎖にね
じれを導入する）。

ＣＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＴＣＣＣＴ
ＴＴＣＴＣオリゴヌクレオチド５は上記オリゴヌクレオ
チド１〜４および下記オリゴヌクレオチド６と８のすべ
ての３′−末端に対して相補的である３０−ｍａｒであ
る；この実験の目的はオリゴヌクレオチド５が上記オリ
ゴヌクレオチド１〜４および下記オリゴヌクレオチド６
と８を鋳型として用いて伸長されうるか否を知ることで
あった。

ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＮＮＮＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣ
ＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧ （式中、ＮＮＮＮは炭素数１６の直鎖アルキレン基を表
す） ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＧＣ
ＣＴＡＴＡこのオリゴヌクレオチドはポリＴ領域の最終
Ｔの５′末端のアミノ結合を介して固相に取付けるため
に用いられる。ポリＴ領域のヌクレオチド３′の配列は
α−１−アンチトリプシン遺伝子の正常Ｓ座に粋異的な
ＡＲＭＳプライマーのポリヌクレオチド末端に対して相
補的である。

ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＮＮＮＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣ
ＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧ 式中、Ｎは４−メチルホスホネート置換チミジン残基を
表す。

オリゴヌクレオチド６と８も同様にオリゴヌクレオチド
５が伸長されうるか否かを知るために鋳型として用いら
れる。

例　　　１ 上記オリゴヌクレオチドを用いて、Ｔａｑ　ＤＮＡポリ
メラーゼが鋳型ＤＮＡ鎖中に存在するヌクレオチド重合
ブロッキング部分を越えてオリゴヌクレオチドプライマ
ーを伸長させることができないことを実証した。

オリゴヌクレオチド５　（３０２ｍｏ１ｍ　）を５′末
端ヒドロキシル基においてγ３２Ｐ−ＡＴＰ　７５μＣ
ｉ（１５ｐａｒｏ１ｍ　）　（アマ−ジャム（Ａｖｎ−
デ５ｈａｔｎ）〕と、５０　ｓ％ｆ　Ｔｒｉｍ、　ＨＣ
Ｉ　　ｐＨ７，６，１０ｗＡｆＭｇＣ７１、，５情ＭＤ
ＴＴ　　１００μＭスペルミジンおよび１００＾Ｍ　Ｅ
ＤＴＡを含む５０Ｐ１反応量でのＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（４単位）とを用Ｌ・てラベルした。キナーゼ
反応は３７℃において２０分間実施した。残留キナーゼ
活性を完全に破壊するために、反応混合物を５分間沸と
うさセ、次ニフェノール：クロロホルム（１：ＩＨＩｔ
ｌ出を実施した（各成分　３７．５μｌ）。これの次に
混合し、混合物を２分間１３．５０　Ｏｒ、ｐ−ｔｎ、
で濃縮した。水相を取出し、反応のために保存した。

オリゴヌクレオチドｌ〜４．６および８をアクリルアミ
ドゲル電気泳動、Ｕ、　Ｖ、シャドウィング、ブタン−
１−オール濃縮、フェノール／クロロホルム抽出および
エタノール沈降によって精製した。

オリゴヌクレオチド５はバッファー（Ｂ％ｆｆｇｒ）Ａ
（１０ｍＭ　ＮａＯＨ、０，５Ｊｆ　ＮａＣ１）によっ
て平衡化した陰イオン交換樹脂〔モノ（Ａｆｏｓｏ　）
　Ｑ、ファルマシア（Ｐｈａｒｔｎａｃｉａ　）　］を
用いて、ＨＰＬＣによって精製した。オリゴヌクレオチ
ドをバッファーＢ　（１０ｔｈＡ　ＮａＯＨ、０，９Ｍ
　ＮａＣ１）　Ｏ〜１００％の勾配によって６０分間で
溶離させた。生成物ピークに相当する分画をプールし、
ＰＤ１０カラム（ファルマシア）を用いて脱塩し、次に
真空下乾燥によって濃縮した。オリゴヌクレオチドの純
度を５’　３２Ｐ　ＡＴＰ（アマ−ジャム）とＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼとを用いたｓ　／　３２　ｐラベ
リング（ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）とこの後の変性（７Ｍ尿
素）条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動とによ
ってチエツクした。

次の反応を実施した： ｔｎｔｎ す へ、 」 く　も ゛（ ｆｉ 哨　哨　の　の　の　め　唖　哨　０　の　哨す へ 」 １、う、　　叫　６　、　、　、　、 で ｌへ ｕ　　”＋３　　＠　　＼　−べ　１１ｈ　磯　〜　占
ＤＮＡ重合が重合プロツキ７７部分によって防止されな
いならば、全長オリゴヌクレオチドが複製されて、対照
反応（Ａ）で予想されるように６３ｍａｒ生成物が得ら
れる。しかし、ブロッキング部分が酵素（Ｔａｑ　ＤＮ
Ａポリメラーゼ）を停止させる場合には、３５ｍａｒ生
成物が期待され、このことは重合ブロッキング剤の起点
までの鎖伸長を表す。

各反応はラベルしたオリゴヌクレオチド５の工ｐｍｏｌ
−と、適当な長さのオリゴヌクレオチド１〜４．６およ
び８の３　ｐｍ○２−とを含んだ。上述のように必要な
場合には、ｄＮＴＰｓを各１００μＭの最終濃度になる
まで加えた。Ｔａｇ　ＤＮＡポリメラーゼ〔セッスーア
ンプリタク（Ｃａｔ〜８−Ａｍｐｌｉｔａｑ　）　）　
２単位を加えて、１．２　ｍＭ塩化マグネシウム、５０
ｍ＃塩化カリウム１，１０ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣＩ　（ｐ
Ｈ８，３）および０．０１％セ５　チア（ｌｘバッファ
ーＡ）を含めた最終反応量を１００μｌにするまで、変
性段階は生じなかった。試験管を９１’Ｃ水浴に２分間
入れ、次に６０”Ｃ水浴に５８８分間入た。６管から５
μｌ　アリコートを採取した。さらに、ラベルしたオリ
ゴヌクレオチド５１μｌを加圧滅菌した脱イオン水〔ミ
リ（Ｍｉｌｌｉ）Ｑ標準）　８９　ｐｉ　とＩＯＸバフ
７７−Ａ（ＩＸ、：ツファーＡは前記で定義した通りで
ある）１０μｌに加え、この中の５μｌをオリゴヌクレ
オチド５のマーカーとして作用させるために取出した。

５μｌアリコートのすべてをホルムアミド染料（８０％
＊　／’　Ａ　７　ミ）”、１０　ｍ＃　ＮａＯＨ１ｙ
ａＪｆ　ＥＤＴＡおよび０．１％ブロモフェノールブル
ー（Ｂｖｔ）Ｂｏ−ｐｈｇｎｏｌ　Ｅ１％ａ）と混合し
、５分間沸とうさせることによって変性した。アリコー
トを予備ラン（１時間、５００Ｖ）した１５％変性ポリ
アクリルアミドゲル、１ｘＴＢＥ緩衝液１：０．０８９
Ｍトリスボレート（Ｔｒｉｓ　Ｂｏｒａｔｍ　）、　０
．０８９Ａｆホウ酸、０．００２Ｍ　　ＥＤＴＡ〕中８
Ｍ尿素上で５時間９００Ｖにおいて電気泳動し、室温に
おいてＸ線フィルムを用いて２時間オートラジオグラフ
ィーした。

得られた結果は第１図に表したオートラジオグラフに示
す。これらはオリゴヌクレオチド２．３゜４．６および
８に存在する重合ブロッキング部分がＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼ触媒作用オリゴヌクレオチド伸長を停止させる
ことを実証する。

Ａ）２′−デオキシナフタレンオリゴヌクレオチドアプ
ライド　バイオシステム３ＢＯＡＤＮＡシンセサイサ°
−において、３’−ＯＨとスクシニルグリシルアミノプ
ロビルスペーサー（アプライドバイオシステムス社）と
を介して制御孔ガラスに結合した５′−α、α−ビス（
ｐ−メトキシ７エ二ル）ベンジル−Ｎ２−インブチリル
−２′−デオキシグアノシンおよび ５′−α、α−ビス（ｐ−メトキシフェニルンペンジル
ーＮ６−ベンゾイル−２′−デオキシアデノシン、５′
−α、α−ビスＣｐ−メトキシフェニル）ベンジル−Ｎ
◆−ベンゾイル−２′−デオキシシチジン、５′−α、
α−ビス（ｐ−メトキシフェニル）ベンジル−Ｎ２−イ
ンブチリル−２′−デオキシグアノシン、 ５′−α、α−ビスＣｐ−メトキシフェニル）ベンジル
−２′−デオキシチミジン（アプライド　バイオシステ
ム社）および １〔２′−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシルー５′−
〇−α、α−ビスＣｐ−メトキシフェニル）ベンジル−
３’−（メトキシモルホリノホスフィン）〕ナフタレン
〔下記の（２）で述べたように調製〕の２−シアノエチ
ル−Ｎ、Ｎ−ジインプロピルアミノホスホラミシトから
配列（２）の完全に保護されたオリゴデオキシリボヌク
レオチドを製造した。この代りに、アトキンソン（Ａｔ
ｋｓ％５ＯＳ）とスミス（Ｓｍ４ｔｈ）が「オリゴヌク
レオチド合成、実用的アプローチ（’Ｏ１ｉｇｏ九雪ｃ
ｌａｏｔｉｄａ　Ｓνｎｔｈｍａｉδ。

ａ　ｐｒαｃｔｉｅａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ’）　Ｊ　
（編集者エム、ジエイ、ガイド（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ）、
ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ，オックスフォード、３
５〜８１頁〕に述べているマニュアル方法（ｍａ％ｓａ
ｌ　ｔ１％＃ｔルｏｄ）によっても完全に保護されたオ
リゴデオキシリボヌクレオチド配列と下記に述べるよう
な配列が製造される。

アプライド　バイオシステムズ３ＢＯＡＤＮＡシンセサ
イザーの位置５で通常のホスホラミシトの代りに、無水
アセトニトリル（ＩＩＭ）中の１−〔２′−デオキシ−
β−Ｄ−リボフラノシルー５′−〇−α、α−ビス（ｐ
−メトキシフェニル）ベンジル−３／−（メトキシ−Ｎ
−モルホリノホスフィン）〕ナフタレン（７０η）を用
いて、上記オリゴヌクレオチド２中に「Ｎ」で示すナフ
タレン置換残基をオリゴヌクレオチドに導入した。この
方法は簡単には次の段階： （１）　ジクロロメタン中３％トリクロロ酢酸によるα
、α−ビス（ｐ−メトキシフェニル）ベンジル基の除去
； （２Ｊ　　テトラゾールによって３分間活性化したｘ−
（ｚ’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシルー５′−〇
−α、α−ビス（ｐ−メトキシフェニル）ベンジル−３
′−（メトキシ−Ｎ−モルホリノ−ホスフィン）ナフタ
レン（Ｑ、ＩＪ／溶液）の結合； （３Ｊ　　中間体ホスフィツトのホスフェートへのヨウ
素酸化；および （４）無水酢酸によるキャッピング（Ｃａｐｐｉｎｙ）
８階 から成るものであった。脱トリチル化オリゴデオキシリ
ボヌクレオチド配列を固体サポートから解離（ｃＪ−α
ｗ＊）Ｌ、水酸化アンモニウム溶液（比重０．８８）に
よる５５℃での１６時間の処理によって完全に脱保護し
た。水酸化アンモニウム溶液を蒸発させ、残渣を水（１
ｍ）に溶解した。オリゴデオキシリボヌクレオチドを含
む溶液のアリコートを次のように精製した： 粗オリゴデオキシリボヌクレオチドのアリコー）（２２
５μｌ）を３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）２５μｊ
の添加、混合および混合物への無水エタノール７５０μ
ｌの添加によって沈降させた。さらに混合した後、混合
物を周囲温度（２５℃）に１時間放置し、次に４℃にお
いてさらに１時間放置して、ＤＮＡ　ｖｃ殿を促進させ
た。混合物を１３．５０　Ｏｒ、ｐ、ｍ、において１０
分間遠心し、上溝を除去した。ペレットを１時間風乾さ
せ、次に３７℃においてホルムアミド染料（８０％ホル
ムアミド、１０ｍＭ　ＮａＯＨ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０
．ＩＸブロモフェノールブルー）５０μｌによって２０
分間再構成した。サンプルを５分間沸とうさせ、直ちに
氷上に置き、１００ｍＭ　）リスボレート、２湛Ｍ　Ｅ
ＤＴＡ、　ｐＨ８，３緩衝液中の１５％ポリアクリルア
ミド変性ゲル（７Ｍ尿素）上に置いた。

このゲルを５００Ｖにおいて１時間予備ランした。

サンプルを５０Ｖにおいて１晩電気泳動した、これはブ
ロモフェノール染料がｃｏ、３Ｘ２５Ｘ１７硼りゲルの
底部に移行するまでであった。サランラップで覆ったメ
ルク（Ｍ−デｋ）５５５４２０Ｘ２Ｑアルミニウム裏張
り薄層クロマトグラフィープレート上での２５４　ｓｊ
ｆにおけるＵ、Ｖ、　Ｖヤドウイングによってオリゴデ
オキシリボヌクレオチドを可視化した。汚染を防止する
ために各オリゴヌクレオチドに対して新しいメス（ｓｃ
ａｌｐｍｌ）を用いて生成物帯を切断した。ゲルスライ
スをｌＯ惧Ｍトリスボレート、０．２惰Ｍ　　ＥＤＴＡ
　ｐＨ８，３１ｄを含む１インチ長さの１インチ幅処理
済み透析管中に入れた。管の処理はｌ　、、Ｍ　ＥＤＴ
Ａ中でのｌＯ分間沸とうおよび加圧滅菌脱イオン水（ミ
リＱ）中での沸とうによる３回すすぎ洗いから成る処理
であった。オリゴデオキシリボヌクレオチドをゲルスラ
イスから２００Ｖにおけるｌ×暗開時間電気溶離よって
溶離し、この最後に約４５秒間極性を逆にして、管への
ＤＮＡ　　付着物を除去した。電気溶離物を石英分光計
セルに入れ、光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔ
ｙ　）を溶離緩衝液に対して読み取った。オリゴデオキ
シリボヌクレオチドの濃度を溶液の光学密度から算出し
た。次に水層の量が約５００μｌにたるまで、オリゴデ
オキシリボヌクレオチドをブタノール抽出によって濃縮
した。次にフェノール−クロロホルムｌ：ｌ混合物（５
００μｌ）を加え、混合し、混合物を１３＋　５０　Ｏ
ｒ　−ｐ　、ｆｌ＆、において２分間遠心した。水相を
取り出し、ブタノール抽出によって約５０μｌになるま
でさらに濃縮した。次にこれを真空下乾燥し加圧滅菌脱
イオン水（ミリＱ）Ｋよってｌｐｍｏｌｅ／μｔに再構
成した。

精製したデオキシヌクレオチド１１ｍｏ　ｌ　ｇ　全５
’末端ヒドロキシル基においてγ”Ｐ　ＡＴＰ　１０μ
Ｃｉ（２ｐｍｏＬｍ）と、５０　ｍｕ　Ｔｒｉｍ　ＨＣ
ｔｐＨ７，６゜１０ｍｕ　ＭｇＣ４，５ｗＭ　ＤＴＴ、
　１００μｙスペルミジンおよび１００μＭ　ＥＤＴＡ
　　を含めて２゜μを反応量でのＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（４単位）とを用いてラベルすることによって
チエツクした。キナーゼ反応は３７℃において２０分間
実施した。次に反応混合物２μｔ’ｔホルムアミド染料
５μｔに加え、５分間沸とうさせ、直ちに氷上に置き、
５００Ｖにおいて１時間予備ランした１５％変性ポリア
クリルアミドゲル（７Ｍ尿素）上でランし、８００７に
＄５いて３時間電気泳動した。このゲルをＸ線フィルム
に３０分間暴露させたところ、得られたオートラジオグ
ラフはゲル精製オリゴデオキシヌクレオチドが必要な高
純度であることを示した。

２）１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシルー
５′−〇−α、α−ビス（−メトキシフｘ−（２’−デ
オキシ−β−Ｄ−リボフラノシルー５′−〇−α、α−
ビス（ｐ−メトキシフェニル）ペンジルコナフタレン（
０，８７Ｐ　％１．６　ｍｔｐｈｏｌｍ）〔下記２αで
述べたように製造〕をＮ２下−４０’ＣでＣＨ２Ｃｌ、
　　（３９ｍ）中でクロロメトキシ−Ｎ−モルホリノホ
スフィン（０，３ｆ　、　１．６　ｔｎｍｏｌｍ　）及
びＮ、Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（０，８５Ｆ
、６．６　ｔｎｔｎｏｌｍ　）と共に撹拌した。周囲温
度１０分後に減圧下で溶媒を除去することによって粗生
成物を得た。溶離剤ＥｔＯＡｃ：Ｅｔ、Ｎ（６６：たシ
リカゲル〔メルクアート（Ｍ−デｃｋ　Ａｒｔ　）９３
８５）上フラッシュクロマトグラフィーによって生成物
１−（βーＤー２′ーデオキシリボフラノシル−５’−
ｏ−α、α−ビス（ｐ−メトキシフェニル）ベンジル−
３７−（メトキシ−Ｎ−モルホリノホスフィン）ナフタ
レン（０，８Ｆ、７３％）を白色固体として単離した。

Ｍ／Ｓ（Ｍ＋Ｈ）　　６９４　　δ（ＣＤＣＩ、、２０
０ＭＨｚ）ニア、８　３　　（３Ｈ，ｍ、ＡｒＨ）％　
７．３　３　　（１３Ｈ、ｙｓｃ　　。

、４　ｒ　Ｈ）、６．８２　（４＃　、ｍ　、ＡｒＨ）
、５．８８（ＩＲ。

ｄｄ、Ｈ−１’）、４．６５及び４．４８ＣＩＢ、情、
Ｈ−３つ、４３及び４．１５（１＃、情、Ｈ−４つ、３
．８（７８，情。

ＯＣＨ，及びＨ−５’）、３．６及び３．５２（４Ｂ、
２Ｘ　ｔ　モルホリノプロトン）、３４６及び３３９（
３Ｂ。

２ｘｄ、ＰＯＣＨ，）、３．１２及び３．０３（４Ｂ、
情１モルホリノプロトン）、２．５７（ＩＢ、ｍ、７７
　２’）、２、１８（Ｌ＃、ｍ、Ｈ−２’）。

１−　（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ナ
フタレン（（０，８８Ｆ　、　４　ｍｍｏｌｍ）下記２
ｂで述べたように製造〕を無水ピリジン（２Ｘ１０ｊｌ
−６）との共蒸発（ｃｏ　　−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ
ｓ）によって乾燥し、無水ピリジン（１０ＭＬｔ）中α
、αービスＣＦーメトキシフェニル）べ／ジルクロリド
（１，３Ｆ、４．３ｖ■ｏ１ｍ）２時間周囲温度で撹拌
した。メタノール（５−）を加えて、溶媒を真空除去し
た後に残っている残渣油をクロロホルム（ｓｏｍｚ）に
吸収させた。その有機溶液を等量の炭酸水素ナトリウム
飽和溶液（２Ｘ）及び水（２Ｘ）で連続的に洗浄し、次
に硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ，）上で乾燥後に減圧下
で溶媒を除去することによって粗生成物を得た。ピリジ
ン＝メタノール：ジクロロメタン（１：３：１９６）に
よる溶離によるシリカゲル〔メルクアート（Ｍａｒｃｈ
　Ａｒｃ）　９３８５　）上クロマトグラフィーによっ
て次にトルエンとの共蒸留によって、生成物１−　Ｃ２
’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシルー５′−〇−α
、α−ビス（ｐ−メトキシフェニル）ペンジルコナフタ
レン（０，６ｊｌ；３０．５％）を淡色褐色固体として
単離した。

δＣＣＤＣｌ３．２００＆Ｈｇ）；８．０３〜６．８２
（２０Ｂ。

ｔｙｔ、ＡｒＨ）、５．８８（ｌＢ、ｍ、Ｈ１つ、４．
４７（ＩＨ，ｓ、Ｈ３’）、４．１２　（ＩＨ，ｍ　、
　Ｈ４’）、３．７８（７Ｂ＋　、Ｔ　２Ｘ　０ＣＨｓ
及びＨ−５’）、３．４３　（１８゜情、Ｈ−５つ、２
．５０（１７？、琳　Ｈ２／）、２．１２（ＩＨ，ｍ、
Ｈ−２’ン。

６）１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノジピリ
ジン（１０％）；水（１０％）及びテトラヒドロフラン
（８０％）、（２縦）の混合液中、１−　（２’−デオ
キシ−β−Ｄ−リボフラノシルー３’、　５’−（１、
１、３、３−テトライソプロビルジシルオキシル）〕ナ
フタレン［（０，ｘｌｙ。

０．２４情餌ａ１ｇ）下記２Ｃで述べた製造〕をＴＨＦ
中乳−テトラブチルアンモニウムフロリド（０，７３ｔ
ｍｔｐｈｏ１ｍ）の溶液へ加え、１６時間周囲温度で放
置した。

溶媒を真空除去し、メタノール：ジクロロメタン（１：
９）を用いた溶離によるシリカゲル（メルクアート９３
８５）上クロマトグラフィーにより精製した後に生成物
１−　（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ナ
フタレン（１９吋、３５％）を白色固体として単離した
。

δ（ＣＤ５ＯＤ、　２００ＭＨｇ　）　；　８．０５　
（Ｉ　Ｉｆ　、　ｍ、ＡｒＨ）、７．８０　（３７？　
、ｖｐｈ　、ＡｒＨ）、　７．４８　（３Ｈ、ｖｈ　、
ＡｒＨ）、５．８７　（ｌＨ、ｄｄ、　Ｈ−４ｔ）、４
．３５（ｌＨ，ｄｄｄ。

Ｈ−３つ、４．０５　（Ｉ　Ｈ、ｄｄｄ　、Ｈ−４’）
、３．７５（Ｚ＃。

ｄｄ、２８−５つ、２．４８　（Ｉｆ　、　ｄｄｄ、　
Ｈ−２’）、１．９９（１Ｂ、ｄｄｄ、Ｈ−２’）。

（０，１２Ｆ、５１％）を単離した。Ｍ／Ｓ　Ｍ（４８
６）。

ｌ−〔β−Ｄ−リボフラノシルー２′−フェニルチオホ
ルメート−３’、　５’−（１、１、３、３−テトライ
ノプロビルジシルオキシル）〕ナフタレン、（（０，４
Ｆ、０．６情ｆＩＩｏ１ｍ）下記２ｄて述べたように製
造〕及び２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオニト
リル）、（０，ＩＰ、０．６情ｆＩＩｏ　ｌ　ｇ　）及
び九−トリブチルスズヒドリド（２，８Ｆ、２．７ｍ情
ｏ１ｇ）をトルエン（２０餌ｌ）中３０分間還流した。

溶媒を減圧下で除去し、石油（ｂ、ｐ、４０／６０）ニ
ジクロロメタｙ（１：１．５）を用いた溶離によるシリ
カゲル（メルクアート９３８５）上での精製によって、
生成物、ｌ−〔β−Ｄ−２′−デオキシリボ７ラノシル
ー３’、　５’−（１、１、３、３−テトライソプロビ
ルジシルオキシル〕〕す７タレンの製造 乾燥アセトニトリル（２５１１！７す中１−［β−Ｄ−
リボフラノシルー３’、　５’−（１、ｌ　、　３、３
−テトライソプロビルジシルオキシ）〕ナフタレンＣ＜
　０４ｙ、ｏ、ｓ情情ｏ１ｍ　）下記２−で述べたよう
に製造〕を周囲温度で２４時間４−ジメチルアミノピリ
ジン（０，６Ｆ、４．８情情ｏ１ｍ　）及びフェニルチ
オクロロホルメート（０，７５’、４．０情惰ｏｖａ　
）と共に撹拌した。酢酸エチル（２００１１Ｊ）を加え
、続いてこの溶液を等量の炭酸水素ナトリウム飽和溶液
と水で洗浄した。この溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥
し、溶媒を減圧下で除去した後に粗生成物を得た。酢酸
エチル：石油（ｂ−ｐ、　　４０／６０）（１：１２．
３）を用いた溶離によるシリカゲル（メルクアート９３
８５）上フラシュクロマトグラフイーによって、生成物
１−（β−Ｄ−リボフラノシルー２′−フェニルチオホ
ルメー）　−３’、　５’−（１，１，３，３−テトラ
イソプロビルジシルオキシル）ナフタレン（０，４５Ｆ
、８８％）を白色固体として単離した。Ｍ７Ｓ（Ｍ＋Ｎ
Ｈ◆）６５６゜（Ｍ＋Ｈ）６３９゜ 乾燥ピリジン（１５Ｎ）中１−（β−Ｄ−リボフラノシ
ル）ナフタレン（（１，ＯＦ　、　３．８ｍｙｍｏ（ｇ
）オオルイ　エッチ（□Ａｒ５ｚ　、Ｈ，）　：クズハ
ラ。エッチ（Ｋｓｔｕｈａｒａ　ｒ　Ｈ，）　エモト、
ニス（Ｅｍｏｔｏ。

クロロ−１，１，３，３−テトライソプロビルジシルオ
キサン（１，６Ｆ　、５　ｍｍｏｌｍ　）と共に室温で
２時間撹拌した。ジクロロメタ７（４５ＱＩＬｔ）を加
え、次にこの溶液を等量の炭酸水素ナトリウムの飽和溶
液と飽和臭素で洗浄した。この有機溶液を硫酸マグネシ
ウム上で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した後に粗生成物
（２，６Ｆ）を得た。ジクロロメタンを用いた溶離によ
るシリカゲル（メルクアート９３８５）上フラッシュク
ロマトグラフィーによって、生成物、１−（β−Ｄ−リ
ボフラノシルー３’、　５’−（１、１、３、３−テト
ラインプロビルジシルオキシル）〕ナフタレン（０，８
５１゜１．６ｗｓｏｊｇ、４２％）を無色油状物として
単離した。

Ｍ／Ｓ　　５２ｏ（Ｍ＋ＮＨ，）　、５ｏ３（＃−１）
、δ（ＣＤＣ１，、２００ＭＨｚ）　；　８．１２．７
．８２．７．５２（７Ｂ、情、ＡデＨ）、５．６８　（
ＩＨ、ｓ　、　Ｈ−１’）、４．３８　（ＩＨ、ｄｄ、
Ｈ−３’）、４．２８ＣＩＨ，ｄ、Ｈ−５′）、ａ、１
８　（１／７　、　ｄ　、　Ｈ−２’）、４．１３（２
Ｈ。

ｓ、Ｈ４’及びＨｓ／）、１．０（２８Ｈ２ｍ、４Ｘ”
　（’Ｈｓ　）ｚ　）。

前述の配列（３）と（４）の完全に保護されたオリゴデ
オキシリボヌクレオチドを上記の製造法Ａｌで述べたよ
うに製造した。但し、アプライド　バイオシステムズＤ
ＮＡシンセシサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔａｔ
ｎｓ　ＤＮＡ　　ｓｙｎｔｈａｓｉｓｍｒ）上の位置５
は、無水ＣＨ，ＣＮ（１訳ｔ）中１−　（３’−チオキ
ン５′−Ｏ−α、α−ビス（ｐ−メトキシフェニル）ベ
ンジル−２′−（メトキシ−Ｎ、Ｎ−ジインプロピルア
ミノフォスフイン）−β−Ｄ−リボフラノシル〕ナフタ
レン［（７０，０Ｉｎ？）下記Ｂ２で述べたように製造
〕を含んだ。次にホスホラミシトを通常のホスホラミシ
トに用いる標準結合反応によって結合させた。

オリゴデオキシリボヌクレオチドを固体サポートから解
離し、脱保護し、上記製造法ＡＩで述べたような方法に
よって精製した。

一４０℃において無水ＣＨ２Ｃｌ、　　（３０ＷＬｔ、
）中１−〔３′−デオキシ−５′−〇−α、α−ビス（
ｐ−メトキシフェニル）ベンジル−β−Ｄ−リボフラノ
シル〕ナフタレン（０，７８，１，３ｍｍｏｌａ　）　
（下記２αて述べたように製造〕及びＮ、Ｎ−ジインプ
ロピルエチルアミン（０，６７Ｆ、５．２ｍ情０１ｇ）
をクロロ−Ｎ−ジインプロピルメトキシホスフィン（０
，２６Ｆ、１．３ｍｍｏ（ｓ）と共に撹拌した。反応混
合物を乾燥Ｎ２　雰囲気下で維持し、１時間後に周囲温
度に達した。溶媒を真空除去し、Ｅｔ、Ｎ：ＥｔＯＡｃ
Ｃ１：　６６　）を用いた溶離によるシリカゲル（メル
クア−１４９３８５）上のフラッシュクロマトグラフィ
ーを行い、溶媒を蒸発させることによって、生成物、１
−　（３’−デオキシ−５′−〇−α、α−ビス（ｐ−
メトキシフェニル）ベンジル−２′−（メトキシ−＃　
、　＃　−、ｉ：イソプロビルアミノホスフィン）−β
−Ｄ−リボフラノシル〕ナフタレン（０，８Ｆ、８７％
）を黄色固体（ジアステレオ異性体の混合物）として単
離した。

δ（ＣＤＣ１３，２００ＭＨｚ）；８．３及び８．１７
（１８゜情、す７タレンプロトン）、７．８０（３ｇ、
餌、ナフタレンプロトン）、７．５３　（３Ｂ、　ｍ、
ナフタレンプロトン）、７．２８Ｃ９Ｈ，ｍ、ＡｒＨ）
、６．８３　（４Ｈ。

ｍ、　ＡｒＨ）、５８及び５．７５（ｌｉａ、Ｈ−１つ
、４．６５　（Ｉ　Ｈ、ｍ　、　Ｈ−４’）、４．５　
（１＃　、　ｍ　、　Ｈ２’）、３．７８（６８，ｓ、
２ｘＯ仁ｂ）、３．６５（２Ｈ，ｍ。

２Ｂ−５つ、３．４５及び３．３６（３１１，ｄ、Ｐ□
□□！、）、２．０９及び２．０２（２１，情、２８−
３’）、　１．２１（１４Ｂ、惰、２ＣＨＣｃｒｒｓ）
ｔ）。

乾燥ピリジン（１０１１１／）中１−　（３’−デオキ
シ−β−Ｄ−リボフラノシル）ナフタレン［（０，４４
〕、１．８ｍｔｍｏ１ｇ）下記２ｂで述べたように製造
〕を周囲温度で２時間Ｏ−α、α−ビス（ｐ−メトキシ
フェニル）ベンジルクロリ）”（０，９７Ｆ。

２、９　ｓｍｏＸｓ　）で処理した。過剰の０−α、α
−ビス（ｐ−メトキシフェニル）ベンジルクロリドをＭ
　ａ　ＯＨ（１０ｍｌ　）を加えることによって分解し
、ＣＨｗＣ＆（５０Ｎ　）を加えた。有機溶液をＮａＨ
ＣＯ。

ＩｏＬｇ（２Ｘ５０ＭＬｔ）と水（２Ｘ　５０１１ｊ）
テ連続的１ｃ洗浄し、ＭＱＳＯ，上乾燥後に溶媒を真空
蒸発し、粗生成物を得た。

溶離剤Ｍ　ａ　ＯＨ：　ＣＨ２Ｃｌ２（ｌ二９９）を用
いたシリカゲル（メルクアート９３８５）上フラッシュ
クロマトグラフィーを行い、溶媒を真空除去し、トルエ
ンで共蒸発することによって１−　［３’−デオキシ−
５′−〇−α、α−ビス（ｐ−メトキシフェニル）ベン
ジル−β−Ｄ−リボフラノシル］ナフタレン（０，７Ｆ
、７１％）全褐色フオーム（ｆｏａ惰）として単離した
。

δ（ＣＤ、ＯＤ、２００ＭＨｚ）：８．ｘ８Ｃ１ｋｌ、
ｍ、ナフタレンプロトン）、７．８３（３Ｅ、ｍ、ナフ
タリンプロトン）、７．５（３Ｂ、情、ナフタレンプロ
トン）、７．２４及び６．８６　（１３７７、ｔｎ　、
　ＡｒＨ）、５．６　（ｌＢ、　ｂｙ。

ｓ、Ｈ−１’）、４．６２　（Ｉ　Ｈ、ｔｎ　Ｔ　Ｈ４
’）、４．３７（１７７、情、ｇ−２’）、３．７８Ｃ
６Ｅ、ｄ、０仁ＵＳ）、３．４３　（２８、ｄｄ　、　
２Ｈ−５’）、２．０７　（ＩＢ、　ｄｄｄ。

Ｈ−３つ。

乾燥ＴＨＦ（５０仄ｌ）中１−（２’、３’−アンヒド
ロ−β−Ｄ−リボフラノシル）ナフタレン（（２，５５
ｊ、　　Ｉ　Ｏ，３情情０１−）下記２Ｃで述べたよう
に製造〕をＴＨＦ　（５０ｍ１）中Ｌ　ｉ　ＡＩＩＨ，
の撹拌した懸濁液（１，５２Ｆ、　４０　ｍｍｍｍ０１
へ徐々に加え、次に周囲温度で１６時間Ｎ２雰囲気中で
維持した。過剰のＬｉＡ１１Ｈ，をＴＨＦ／Ｈ，０（９
５：　５゜５０１１１ｔ）を徐々に加えることによって
分解し、Ｌ　ｉ　／Ａｌ複合体を希ＨＣＩＩ（１Ｍ、　
５０ｒｔｔｌ）テ分解した。ブタン−１−オール（３０
０ｍ）を加え、有機溶液をＮａＨＣＯ，ａｑ（２Ｘ　１
５０　Ｉｌｌ　）及び水（２ｘ１５０Ｊｌｊ）で連続的
に洗浄し、減圧下で蒸発することによって粗生成物を得
た。溶離剤ＭｅＯＨ：ＣＨ，Ｃ＆（１：　９　）を用い
たシリカゲル（メルクアート４９３８５）上でクロマト
グラフィーな行ない、溶媒を真空蒸発した後に、生成物
、１−　（３’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）
ナフタリン（０，４４Ｆ、１７％）を白色結晶固体とし
て単離した。

δ（ＣＤａ　ＯＺ）　−２００ＭＨｇ　）　；　８−１
８　（Ｉ　Ｅ　−ｖｍ　−ＡｒＨ）、７．８２（３Ｒ，
ｍ、ＡｒＨ）、７．５　（３Ｈ，ｍ。

ＡｒＨ）、５．５４ＣＩＨ，ｄ、Ｈ−１’）、４．４８
（ＩＨ。

情、Ｈ−４’）、４．５２（ＩＢ、惰、Ｈ−２’）、３
．８８（２Ｈ，ｄｄ、２Ｈ−５’）、１．９３（２＃、
惟、２８−３’）。

Ｍ／Ｓ（Ｍ＋ＮＨ，）２６２、（Ｍ＋Ｈ）２４４°情ｐ
。

１４５−１４７℃。

アセトニトリル（５ＱｍＪ）中１−（β−Ｄ−リボフラ
ノシル）ナフタレン［（５，Ｏｊ’％１９．２ｍｍｏｌ
ｓ）オールイ、エッチ；クズハラ、エッチ；エモテ、ニ
ス、アグリ　パイオル、ケム、１９７２゜３６（９）、
１６５１によって述べた製造〕をアセトニトリル：水（
９９：１）（５１Ｍ）及び２−アセトキシインブチリル
クロリド（１３，ＯＦ、８０ｍｔｎｏｔｍ）で処理し、
１時間８０℃で加熱した。反応混合物を減圧下濃縮し、
ＥｃＯＡｃ（２００Ｎ　）を加えた。次にこの溶液を飽
和ＮａＨＣＯ，αｑ（３Ｘ２００１１１ｊ）及びＨ，０
（３８２００１１１）で洗浄し、ＭＱ　５０．　　上で
乾燥した後に減圧下で濃縮した。

生じた褐色油状物をＭａＯＨ（３０ｒｎｌ）に吸収させ
、周囲温度で１６時間ナトリウムメトキシド（２ｖ、３
０１１１７すで処理した。アンバーライト（Ａｎｂａｒ
ｌｉｔｇ）ＩＲＣ５０（５Ｆ、５０１１１ｇ）と共に１
６時間撹拌し、溶媒を真空除去することによって粗生成
物を得た。

Ｅｔ、Ｎ　：Ｍ　ａ　ＯＨ：　Ｃ鳥ＣＡ！ｚ（１：１０
：１８９）を用いた溶離によるシリカゲル（メルクアー
ト扁９３８５）上クロマトグラフィーによって生成物１
−（２’、３’−アンヒドロ−β−Ｄ−リボフラノシル
）ナフタレ７Ｃ２５１，５４％）を白色固体として単離
した。

δ（（ＣＤ、）、Ｓｏ、２００ＭＨｚ）；　８．１２．
７．９３及び７．５８　（７Ｅ　、　ｍ　、　ＡｒＨ）
、５．７７ＣＩＨ，ｓ　、Ｈ−１′）、４．９４（ＩＨ
，ｇ　、ＯＨ）、４．１６（ＩＨ，ｄｄ。

Ｈ−４’）、４．１３　（ｌＨ、ｄ　、Ｈ−２’又はＨ
ａ／）、３．９９（ｌＨ，ｄ、Ｈ−３’又はＨ−２’）
、３．５（２Ｂ。

情、２Ｂ−５’）。

完全に保護されたオリゴデオキシリボヌクレオチド（６
）を製造法Ａｌで述べたように製造した。但し、アプラ
イド　バイオシステムズＤＮＡシンセサイサ゛−上の位
置５は、アセトニトリル＝１，２−ジｐｏｏｘタン（３
：　２　）（１ｍ１）中Ｎ、Ｎジイソプロピルアミノ−
（１６−０−α、α−ビス（ｐ−メ）キシフェニル）ベ
ンジル）へキサデカン−１−Ｏ）メトキシホスフィン〔
７２１ｎ９、下記ｌαで述べたように製造〕を含み、Ｃ
−１６ホスホラミジトは通常のホスホラミシトに用いら
れる標準結合反応によって結合した。オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドを固体サポートがら解離し、濃アンモニ
ア２ｒｎｌを加えた。脱保護を水浴中５５℃において一
晩行なった。オリゴヌクレオチドを真空下で乾燥し、加
圧滅菌した脱イオン水〔ミリ（Ｍｉｌｌｉ）　Ｑ　）　
１−に再懸濁し、精製に備えて＝２０℃で保存した。脱
保護オリゴヌクレオチド１００−をＢｓｆｆａｒ　Ａ　
（１０ａＭ　ＮａＯＨ，０，５Ｊ／ＮａＣ１）で平衡化
した陰イオン交換カラム〔モノ（Ｍｏｎｏ　）　Ｑ、フ
ァルマシア（Ｐｈαデ輔ｃｉα）へ塗布した。流速を１
ａｕ／分、チャート速度（ｃｈａｒｔｓｐｅｅｄ）を５
　ｎｔｎ１分、吸光度スケール（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ
Ｓｃａｌｇ）をｌＯ１分画サイズ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ　
５ｉｚｅ）を０．５　ｍにセットした。オリゴヌクレオ
チドは、ＢｕｆｆｅｒＢ　（１０ｔｈＭ　ＮａＯＨ１０
，９Ｍ　ＮａＣ１）　０−１００％の勾配によって６０
分以内に溶出した。

勾配が大きくなるにつれて、多くの小さいピークが廖出
し、２つの大きなピークが出現した。ピークｌは約３０
ｍａｒ以下に相当し、ピーク２は約６９ｍａｒに相当す
る。従ってピーク２は全長生成物（ｔｈｅ　ｆｓｌｌ　
ｌｅｎｇｔｈ　ｐｒｏｄｓｃｔ　）を含むことが考えら
れる。ピークの各々に対応する分画をプールしく各ピー
ク毎に）、別々に真空下の乾燥によって濃縮し、脱塩緩
衝交換カラム（αｄ＃８αｔｔｉ′ｎｇａｎｄ　ｂｓｆ
ｆａｒ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｏｌｕｒｎｎ）　（ＰＤ
ｌｏ。

ファルマシア）上で脱塩し、使用に備えた。

製造法Ａｌで述べたようにオリゴデオキシリボヌクレオ
チドの純度をチエツクすることによって、正確なピーク
のアイデンティティの確認を実施した。但し、オリゴヌ
クレオチド６０両ピークはラベルした。オートラジオグ
ラフィーはピーク２が必要なオリゴデオキシリボヌクレ
オチドを表わすことを示す。

の製造 ＣＨ，ＣＨ２（１５ｒ！Ｌｅ）中１６−〇−α、α−ビ
ス（ｐ−メトキシフェニル）ベンジルヘキサデカン−１
−オール〔下記１ｂで述べたように製造〕を周囲温度で
２時間Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０，９２
Ｆ、７．２ｍｍｏｌｅ）の存在下りｏ。

（メトキシ）−Ｎ−ジイソプロピルホスフィン（０，３
６Ｆ、１．７９　％＠ｏ１ｍ　）と共に撹拌した。溶媒
を真空下で除去し、溶離剤Ｅ、、Ｎ：ヘキサン（ｌ：９
）を用いたシリカゲル（メルクアート９３８５）上クロ
マトグラフィーを行って、生成物、Ｎ−ジイソプロピル
（１６−０−α、α−ビス（ｐ−メトキシフェニル）ベ
ンジルヘキサデカン−１−〇−〕メトキシホスフィン（
０，６２５Ｆ、４８％）を黄色油状物として単離した。

Ｍ７Ｓ　　７２２ＣＭ十Ｈ）、　　δ（ＣＤＣ１２，２
００ＭＩＪｂ　）　；　７．３及び６．８（１３Ｒ，ｍ
、、４ｒ）、３８０（６ｉｔ、ｓ、０ｃｌｓ）、３．５
９（２Ｂ、情、　ＣＨ２０Ｆ　）、３．４　（３Ｅ　、
　ｄ　、　ＰＯＣＨ，）、３．０３（２Ｈ，ｔ。

ＣＨ２ＯＤＭＴ　ｒ　）、１．２５　（４２１１、ｍ　
、　ｌ　４　ｑ、２　Ｃｇ（Ｃ互ρ２）。

造 １．１６−へキサデカ／ジオール（１，０ｊＦ。

３．８ｍｖｎ０１ｇ）を周囲温度で１６時間ピリジン（
３０縦）中α、α−ビス（ｐ−メトキシフェニル）ぺ／
ジルクロリド（１，２８５’、３．８１利１ｍ）で処理
した。溶媒を真空下で除去し、溶離剤Ｍ　ａ　ＯＨ：Ｃ
ＩＩｚＣ１ｚＣｌ　：　９９　）を用いたシリカゲル（
メルクアート９３８５）上フラッシュクロマトグラフィ
ーによって生成物１６−０−α、α−ビス（ｐ−メトキ
シフェニル）ベンジルヘキサデカン−１−オール（０，
３５Ｆ、１６％）を褐色油状物として単離した。Ｍ／Ｓ
（Ｍ＋Ｈ）５６１゜ Ｄ）オリゴヌクレオチド（８）の製造 完全に保護したオリゴデオキシリボヌクレオチドｔ８Ｊ
を上記製造法Ａｌで述べたように製造した。

但し、アプライド　バイオシステムズＤＮＡシンセサイ
サー上の位置５は無水アセトニトリル（３，８−）中５
′−ジメトキシトリチル−２′−デオキシチミジンのＮ
、Ｎ−ジイソプロピルアミノメチルホスホラミシト（０
，２５Ｆ）の溶液を含み、メチルホスホラミシトは通常
のホスホラミシトに用いられる標準結合反応によって結
合した。この方法は簡単には （ＩＪ　　ジクロロメタン中３％トリクロロ酢酸による
α、α−ビス（ｐ−メトキシフェニル）ベンジル基の除
去； （２）テトラゾールによって３０分間活性化した５′−
ジメトキシトリチル−２′−デオキシチミジンのＮ、Ｎ
−ジイソプロピルアミノメチルホスホラミシトの結合； （３）中間体ホスフィツトのホスフェートへのヨウ素酸
化；および （４）無水酢酸によるキャッピング段階から戚るもので
あった。

この代りに、アトキ／ソンとスミスが「オリゴヌクレオ
チド合成、実用的アプローチ」（編集者エム、ジエイ、
ガイド、ＩＲＬ−ｊ’レス、クシ７トンＤＣ，オツタス
フォード、３５〜８１頁）に述べているマニュアル方法
によっても、完全保護オリゴデオキシリボヌクレオチド
配列が製造される。

脱トリチル化オリゴデオキシリボヌクレオチド配列を固
体サポートから解離し、５５℃のエチレンジアミン：エ
タノール（１ニア、０．４ｍ１）による５５分間の処理
によって脱保護した。エタノール溶液中のエチレンジア
ミンを５０℃において減圧下蒸発させ、残渣をエチレン
ジアミン：エタノール溶液によって５５℃において５５
分間処理した。

減圧下での二次蒸発後に、残渣を水（ＩＩＩＩＪ）に溶
解した。オリゴデオキシリボヌクレオチド含有溶液のア
リコートを製造法Ａ１で述べたように、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製した。

ヱし−Ｌ この例は１個程度の修飾塩基がポリヌクレオチド末端増
幅を防止しうることを実証する。下記オリゴヌクレオチ
ドを上記例１で略述した方法と同様な方法を用いて製造
した： オリゴヌクレオチド２α： ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣ
ＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ（式中、Ｎは例１のオリゴヌクレ
オチド２で述べた通りである）。

オリゴヌクレオチド４α： ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣ
ＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ （式中、Ｎは例１のオリゴヌクレオチド３で述べた通り
である）。

オリゴヌクレオチド８α： ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣ
ＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ （式中、Ｎは例１のオリゴヌクレオチド８で述べた通り
である）。

次に、例１で述べた方法と同じ方法を用いて下記反応を
実施した： 閃　の　ω　の　０　の　００００　のｕ’＋　　Ｌｌ
’）　　ｔｎ　　ｕ’ｔ　　ｕ’＋　　哨ｕ”ｚ　　ｕ
”＋　　ｕ’ｚ　　ｕ’ｔ　　ｕ’ｓリ ド 」 ｔｊｋ＆　　篭　微　じ　峡　も　喚　微　も゛（ １へ 第２図に示す結果は、単独３′デオキシナフタレｙがＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼによる伸長を停止させ、単独２
′デオキシナフタレ／がＴａｑＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長を一部停止させるが、単独４−メチルホスホネー
ト置換チミジン残基はＴｃＬｑＤＮＡメラーゼによる伸
長の停止に無効であることを実証する。

例３ この例はメタホスフェートとチミジンホスホラミデート
重合ブロッキング部分のポリヌクレオチド末端増幅の阻
止への使用を示す： 次のオリゴヌクレオチドを製造した： オリゴヌクレオチド２０： ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＮＮＮＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣ
ＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ 式中、Ｎはチミジンホスホルモルホリゾート基を表す。

オリゴヌクレオチド２１： ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣ
ＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ 式中、Ｎはチミジンホスホルモルホリゾート基を表す。

オリゴヌクレオチド２２： ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣ
ＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ 式中、Ｎはメタホスフェート基を表す。

オリゴヌクレオチド２３： ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＮＮＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴ
ＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ 式中、Ｎはメタホスフェート基を表ス。

メタホスフェート結合オリゴヌクレオチド配列の製造 （αＪ　下記配列の完全保護オリゴヌクレオチド：５’
ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧ５
　　ＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧ
ＣＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ　　３’ をアプライド　バイオシステム　シンセサイサー上で前
述したように調製した、但しこの場合には位置５は無水
アセトニトリル（ｌｄ）中のＮ、Ｎ−ジイソプロピルア
ミノ−〇−シアノエチルー〇−トリチルメルカプタモエ
チルホスフィン（５２■）〔エヌ、ジエイ、シンハ（Ｎ
、Ｊ、５ｉｎｈα）、ジエイ、ピアルノット（Ｊ、Ｂｉ
、デｎｏｔ）、ジエイ、マクマヌス（Ｊ、ＭｃＭ（Ｌｎ
ｓ８　　）およびエイ、コスタ−（Ｊ。

Ｋｏｓｔａｒ）によるニュークリック　アンド　リサー
チ　１９８４，１２．４５３９−４５５７）の溶液を含
んだ。トリチル保護基を周囲温度において硝酸銀水溶液
（０，２５＆、１５１７）Ｋよる１６時間のマニュアル
処理および、蒸留水（２Ｘ　１ｍ／）による洗浄後に、
ジテオスレイトール水溶液（０，３Ｍ、１縦、ｐＨ８，
３）による周囲温度での１６時間の処理によって除去し
た点板外は、通常のホスホラミシトの結合に用いる標準
方法によって、制御孔ガラスサポートに結合したオリゴ
ヌクレオチドに位置５のホスホラミシトを結合させた。

サポート付きオリゴヌクレオチド配列を蒸留水（２ｘｌ
ｔｎｌ）によって洗浄し、次に５０℃において減圧下乾
燥（５分間）した後に、完全保護オリゴヌクレオチド配
列の合成をＤＮＡシンセサイサー上での標準シアノメチ
ルホスホラミシトサイクルを用いて完成した。

脱トリチル化オリゴヌクレオチド配列を固体サポートか
ら解離し、すべての保護基をアンモニア水浴液による処
理（比重０．８８．３５℃、１６時間）によって除去し
た。減圧下５０℃においてアンモニア溶液を除去した後
に、残渣を殺菌水（ｌ紅）に溶解し、メタホスフェート
架橋オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって単離した。

（ｂ）　　下記配列の完全保護オリゴヌクレオチド：５
’　ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴ
Ｇ５５５　　ＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡ
ＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ　　３’製造法（α
Ｊで述べた通りに、オリゴヌクレオチド配列を完成し、
トリメタホスフェート架橋オリゴヌクレオチドをポリア
クリルアミドゲル電気泳動にヨッて単離した。ホスホル
モルホリゾート結合オリゴヌクレオチドをポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって単離した。

ホスホルモルホリゾート結合オリゴヌクレオチド配列の
製造 （ｃｌ　　前記配列の完全保護オリゴヌクレオチド５’
　ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧ
５　　ＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣ
ＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ　　３’ を前述したように、アプライド　バイオシステムス３Ｂ
ＯＡＤＮＡ　シンセサイサー上での標準シアノエチルホ
スホラミシトサイクルを用いて製造した、但し位置５は
無水アセト；トリル：ピリジン（１：ｌ、５ｍ／）中の
５１−ジメトキシトリチル−３′−チミジンＢ−ホスホ
ネート（２５０η）の溶液を含み、Ｂ−ホスホネート試
薬とプロトコール〔水素ホスホネートモノマーを用いた
オリゴヌクレオチド合成（Ｏ１ｉｇｏｎｓａｌａｏｚｉ
ｄａ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓＷｉｔｈ　　Ｈｙｄｒｏｇｅ
ｎ　−Ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔａ　　Ｍｏｎｏｔｍｍｒｓ
　）、アプライド　バイオシステムス　ユーザー　ピユ
ーリチン（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｇｍｓ　Ｕ
ｓｅｒＢｓｌｌａｔｉｎ　）　４４号、１９８７年１１
月２０日〕を用いて、位置５の試薬をオリゴヌクレオチ
ド配列に導入した。この方法は簡単には、次の段ｌｖ：
ｔ１）　　ジクロロメタン中７％ジクロロ酢酸によるジ
メトキシトリチル基の除去； （２）１−アダマンタンカルボニルクロリドによって４
０秒間活性化した５′−ジメトキシトリチル−３′−チ
ミジンＢ−ホスホネートの結合：（３）　　イソプロピ
ルホスフィツトと１−アダマ／す／カルボニルクロリド
とによるキャッピング段階；および （４）　　四塩化炭素中の新たに蒸留したモルホリンの
溶液（１０％）によるＨ−ホスホネートジエステルの５
分間のマニュアル酸化（情αｎｓａ　ｊｏｘｉｄａｔｉ
ｏｎ　） から成るものであった。位置５の試薬をオリゴヌクレオ
チド配列に導入した後に、標準シアノエチルホスホラミ
シト試薬とＤＮＡシンセサイサー上での標準サイクルと
を用いて完全保護オリゴヌクレオチド配列を完成した。

脱トリチル化オリゴヌクレオチド配列を制御孔ガラスサ
ポートから解離し、アンモニア水溶液による処理（比重
０．８８．５５℃、１６時間）によって保護基を除去し
た。減圧下５０℃においてアンモニア溶液を除去した後
に、残渣を無菌水（１１１Ｊ　）　中に入れ、ホスホル
モルホリゾート架橋オリゴヌクレオチドをポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって単離した。

（ｄ）　　下記配列の完全保護オリゴヌクレオチド：ｓ
’　ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴ
Ｇ５５５５　　ＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧ
ＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ　　３’を製造法
（Ｃ）で述べたように製造した、但しこの場合には脱ト
リチル化、結合およびアプライド　バイオシステニス３
８ＯＡＤＮＡシンセサイサー上での位置５の５−ジメト
キシトリチル−３′−チミジンＢ−ホスホネートによる
キャッピング段階をさらに３回くり返してから、四塩化
炭素中モルホリンによる４Ｂ−ホスホネート結合のマニ
ュアル酸化を実施した（１０％溶液５分間）。オリゴヌ
クレオチド配列の合成を通常のシアノエチルホスホラミ
ジド試薬と合成サイクルを用いて完成させ、脱トリチル
化オリゴヌクレオチド配列を対照付き孔ガラスサポート
から解離し、アンモニア溶液による標準処理（比重０２
８８．５５℃、１６時間）によって脱保護した。アンモ
ニア溶液を除去（減圧下、５５℃）し、無菌水（ＩＭ）
を加えた後、テトラホスホルモルホリゾート架橋オリゴ
ヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て単離した。

単離：　オリゴデオキシリボヌクレオチドを含む溶液の
アリコートをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
、製造法Ａｌで述べたように精製した。

例１に述べた方法と同じ方法を用いて、次の反応を実施
した： ０　ｏ　００　ロ　０　の　−の　哨　哨の　ｃｌ’）
　　の　の　　の　　の　　Ｑ　の　　の　　の　　の
＋＋十十＋＋＋十＋＋＋ 哨　哨　哨　哨　哨　梢　哨　の　哨　哨　のす 〜、 く　叱　拠　職　職　叱　靴　（拠　ｋ　職°（ ＋へ 第３図に示す結果は、１個および３個のメタホスフェー
ト成分が架橋を越えたＴαｑ　ＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長を有意に抑制することを実証する。チミジンホス
ホルモルホリゾート部分は有用なブロッキング活性を示
すが、単独チミジンホスホルモルホリゾート部分は無視
できるほどのブロッキング活性を示すにすぎない。

理論的な考察によって束縛されるのを好むわけではない
が、ポリメラーゼブロッキング活性は、ｄＮＴＰを除去
した対照では６３ｙｙｉｇｒ帯の存在のために、過小評
価される。これらの帯の存在は鋳型オリゴヌクレオチド
とＢｔｐホスホリル化オリゴヌクレオチド５との組合せ
中にポリヌクレオチドキナーゼ活性が持ち越された（　
ｃａｒｒｙ　ｏ％ｓｒ）ためであると考えられる。

例４゜ この例は下記のことを調べるためのマイクロタイタープ
レート試験捕捉系（ｍ１ｃｒｏｔｉｔｒａ　ｐｌａｔａ
ｔｅｓｔ　ｃａｐｔｓｒａ　ａｙａｔｅｍ　）が有効で
あることを示す： ａ）捕捉オリゴヌクレオチドがマイクロタイタープレー
トに結合するか否か： ｂ）それらの補体以外の固定配列またはマイクロタイタ
ー孔の蛋白質被覆への試験捕捉オリゴヌクレオチドの非
特異性結合が存在するか否か； Ｃ）アルカリホスファターゼ、ニトロブルーテトラツリ
ウム１５−フロモー４−１０ロー３−インドリルホスフ
ェート、−）ルイジン塩（ＡＰ、／ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）
　　発色系が上記捕捉オリゴヌクレオチドに対して充分
に機能するか否か。

捕捉オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチド１３　；　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＡＴＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＧＣＣＴＡＴＡ オリゴヌクレオチド１４　；　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ
ＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＣＧＴ オリゴヌクレオチド１５　；　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ
ＧＧＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＡＣＡＴＡＣＴ 下記例５に述べるそれぞれオリゴヌクレオチド１１．１
２および１３との相補的ノ・イブリッド化のために、こ
れらを捕捉オリゴヌクレオチドとして用いる。オリゴヌ
クレオチド１３は例１に述べたオリゴヌクレオチド７と
同じである。５’　（ｄＴ）１０残基がスペーサー要素
としてノ・イブリッド化領域とそれらの各々の接合個体
（ｃｏ％ｊｓｇａ％ｔ）との間に含まれる。

これらのオリゴヌクレオチドは第４図に関して次のよう
に蛋白質被覆マイクロタイタープレートに固定された： オリゴヌクレオチド１５　ＡＩ　ＢＩ　ＣＩ　ＤＩＩ　
Ｆｌ オリゴヌクレオチド１４　　　Ｂ２　　Ｄ２　　Ｆ２オ
リゴヌクレオチド１３　　Ａ２　Ｃ２Ｅ２オリゴヌクレ
オチドなし　Ａ３　　Ｂ３　　Ｃ３Ｄ３３　　Ｆ３ １００％結合がオリゴヌクレオチドｌｓｍｏｊｓ／孔に
なるように、濃度を選択した。

各オリゴヌクレオチドは上記捕捉オリゴヌクレオチドに
相補的な固有配列であり、Ｆ　−１ｉｎｋＴＭオリゴヌ
クレオチド　ラベリングキット〔クンブリッジ　リサー
チ　バイオケミカルス（ＣａｔｍｂｒｉｄｇｇＲｅｓｅ
ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｇｔｎｉｃａｌｓ）　：ｌを用い
て、酵素アルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合させた
。ラベリングは各オリゴヌクレオチドの公称濃度（１，
５１ＬＭ）を用いて実施した。

オリゴヌクレオチド１６； ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＴＧＡＧ
ＧＡＣＣＧオリゴヌクレオチド１７； ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＣＡＡＧＴＡＡＧＴ
ＴＧＡＴＡオリゴヌクレオチド１８； ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＣＧＡＴＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡ
ＧＡＴＣＴこれらを捕捉対照オリゴヌクレオチドとして
用いる。

０、６　Ｍ　ＮａＣ１，２０情Ｍリン酸ナトリウムｐＨ
７５，１淋Ｍ　　ＥＤＴＡ、０．０２％　Ｆｉｃｏｌｇ
、　０．０２％ポリビニルピロリジンおよび０．０２％
ウシ血清アルブミンを含む予備ハイブリッド化、（ｐデ
ーＡｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）溶液２００　ａｌを６
孔に加え、暗所で３７℃において数分間インキュベート
した。

次にこれをピペッティング（ｐｉｐｍｔｃｉｎｇ）によ
って取り出した。適当にオリゴヌクレオチド酵素抱合体
（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌａｏｔｉｄｏ　ａｎｚｙｎａ　ｃ
ｏｎｊｓｇａｇａ　）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＢ
）ミックス（１００μＭ　　ｄＡＴＰ、ＺｏｏμＭ　　
ｄＧＴＰ、１００ｐＨｄｃＴＰ　　＆　　１００μ、Ｖ
　　ｄＴＴＰ）、Ｌ２ｔｇＭＭＱＣ１，、５０ｍＭ　　
ＫＣＩ、　　１０ｍＭ　　　Ｔｒｉｓ　　ＨＣＩ　　ｐ
Ｈ１３，３，０，０１％ゼラチン）で１＝ｌＯに希釈し
、希釈した抱合体１０μｌ（約１．５ｐ情ｏ１ｍ　）を
５ＸＳＳＣ４０μｌ（６孔にすでに加えた１、　Ｉ　Ｍ
Ｎ（ＬＣＩ、０．８２５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７，
０）に加えた。これを暗所で３７℃において１時間イン
キュベートした。次に溶液をピペッティングによって取
り出した。試験捕捉対照オリゴヌクレオチドの各々を上
記のように準備した異なるセットのマイクロタイター孔
に、第４図に関連して加えた： オリゴヌクレオチド１６　　ＡＩ　Ａ２　　Ａ３　　Ｂ
Ｉ　Ｂ２　　Ｂ３オリゴヌクレオチド１７　ＣＩ　Ｃ２
Ｃ３ＤＩ　Ｄ２　Ｄ３オリゴヌクレオチド１８　　ＥＩ
　　Ｃ２Ｃ３ＦＩ　　Ｆ２　　Ｆ３ハイブリッド化後に
、孔を室温において２Ｘ５分間２　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０
，４４Ｍ　ＮａＣ１，０，３３Ｍ　　クエン酸ナトリウ
ムｐＨ７，ｏ）２００μｌを用いて洗浄した。溶液を再
びピペッティングによって取り出した。

最終段階は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）９．５緩
衝液（０，１＃　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　ｐＨ９，５，０，
Ｉ　ＭＮａＣｌ　、　５　％Ｍ　ＭｇＣ７１，）とＮＥ
Ｔ　（０，３３１１１９／ＩＮ／）　トＢＣＩＰ（０，
１７ｖ／ｄ）とを含む発色溶液２００μｌの添加であっ
た。発色溶液は次のように調製した：試薬１５ｔ７！に
対して、ＮＥＴ　　５ＷＩｇを□クロ遠心管中のＡＰ９
．５緩衝液１．５ｄ中に懸濁し、激しく１〜２分間撹拌
し、次に短時間遠心した。上溝をＡＰ９．５緩衝剤１．
５−中にデカントし、ポリプロピレン管中で３７℃に暖
めた。残留ＮＥＴペレットをＡＰｇ、５緩衝液１，５−
によって２回以上抽出し、これらの上溝をオリジナル溶
液と共にプールした。管を最後にＡＰ９．５緩衝液０．
５−によってすすぎ洗いし、これもＮＥＴストック溶液
１５ｍ１中にデカントシた。ＢＣＴＰ　（２，５＃）を
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド５０μｌに溶解して、お
だやかに混合しながらＮＥＴ溶液中に滴加した。この溶
液をｌａｔ／アリコートとして一２０℃において凍結し
、使用前に水浴中で３７℃に予熱した。暗所３７℃にお
（・て発色させ、１５分間後と２時間１５分間後に写真
撮影した。

第４図に示す結果は孔Ａ１、Ｂｌ、Ｃ２、Ｆ２のみに発
色があることを示し、このことは使用条件下でそれらの
相補的固定オリゴヌクレオチドに対してのみハイブリッ
ド化した試験捕捉オリゴヌクレオチドと完全に一致した
。

例５゜ この例はα−１−アンチトリプシン遺伝子の５座に基づ
く増幅生成物の特異的捕捉と検出を、同遺伝子のエキン
ンＶからの配列に基づく内部増幅対照を用いて実証する
。固定生成物の検出はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）
結合共Ａ検出ブライマーを用いて実施した。この共通プ
ライマーはＥ−１ｉｎｋＴＭ結合キット（ケ／ブリッチ
　リサーチバイオケミカルス）を用いて、提供者の指示
に従って製造した、これはすべての増幅生成物の検出末
端に対して相補的である。

下記オリゴヌクレオチドを用いたが、これらの式中Ｎは
３′デオキシリボフラノシルナ７タレ７部分を表し、こ
のナフタレン部分は２′−ＰＯ４基ヲ介して隣接ヌクレ
オチドに結合する： オリゴヌクレオチド８ｂ： ＧＴＧＴＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＴＣＡＡＴＧＮＮＮＮＣ
ＣＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＴ
ＧＧＧ このオリゴヌクレオチドはＡＲＭＳ分析法を実施するた
めの共通シグナルプライマーである。

オリゴヌクレオチド９ ＧＴＧＴＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＴＣＡＡＴＧＮＮＮＮＧ
ＡＧＡＣＴＴＧＧＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＡＡＴＣＡＴＡ
ＡＧ オリゴヌクレオチド１０ ＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧＮＮＮＮＴ
ＧＴＣＣＡＣＧＴＧＡＧＣＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧＧＣＣ
ＴＧＧＧこれらのオリゴヌクレオチドはエキンンＶ対照
反応のためのものであり、それぞれシグナルプライマー
と捕捉プライマーである。

ＴＡＴＡＧＧＣＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡＮＮＮＮＴ
ＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡ
ＴＴＴＴＡＣＧＡＴＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡＧＡＴＣＴＮ
ＮＮＮＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧＧＴＧＡＧ
ＴＴＣＡＴＴＴＡオリゴヌクレオチド１１と１２は両方
とも捕捉プライマーであり、それぞれα−１−アンチト
リプシン遺伝子のＳ座の発表された正常配列と突然変異
配列とに相補的にハイブリッド化するための領域を含む
。

ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＧＣ
ＣＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＴＣＴＴＧＧＴ
ＴＡＡＣＡＡＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣ
ＣＴＣＡＴＡＡＴＡＣＡＴＡＣＴこれらはそれぞれオリ
ゴヌクレオチド１１．１２、および１０との相補的ノ・
イブリッド化のための捕捉オリゴヌクレオチドとして用
いられる。オリゴヌクレオチド１３は例１で述べたオリ
ゴヌクレオチド７と同じである。５’（ｄＴ）　１０残
基をノ・イブリッド化領域とそれらのそれぞれの接合固
体（ｃｏｎｚｕｇａ％ｔ）との間にスペーサー要素とし
て含めた。

ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＴＧＡＧ
ＧＡＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＣＡＡＧ
ＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＣＧＡＴ
ＴＧＴＴＡ、４ＣＣＡＡＧＡＴＣＴこれらは捕捉対照オ
リゴヌクレオチドとして用いられる。

オリゴヌクレオチド１９； ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＴＧＡＣＴＧＣＧＧＧＡＣ
ＧＡＣＡにれはＡＲＭＳ分析法のための共通シグナルオ
リゴヌクレオチドである。

オリゴヌクレオチドの製造 １９をＤＮＡシンセサイサーでの最終合成サイクルにお
いてアミノアルキルホスホラミシト〔アミノ−リンク（
Ａｍｉｎｏ−１ｉｎｋ）２、アプライド　バイオシステ
ムス〕を用いて５′−アミノアルキル誘導体として合成
した。これらのオリゴヌクレオチドをＥ−ＬＩＮＫ　　
オリゴヌクレオチドラベリングキットを用いて、提供者
（ケンブリッジ　リサーチ　バイオケミカルス）の指示
通りにアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合させた。

オリゴヌクレオチド精製 粗オリゴヌクレオチド８ｂ１９．１０％　１１゜１２の
アリコート（２２５μｌ）を３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５
，２２５μｌの添加、混合および次にエタノール７５０
μｌの添加によって沈降させた。

さらに混合した後、管を一２０℃に１時間放置し、上溝
を取り出す前に１３．５０　Ｏｒ、ｐ−ｍ、において１
０分間回転させた。ペレットを２０分間放置して風乾し
た後、ホルムアミド染料（８０％ホルムアミド、１０ｍ
Ｍ　ＮａＯＨ，１ｔｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．１％ブロモ
フェノールブルー）５０μｌによって再構成した。次に
、サンプルを３００Ｖにおいて１時間予備う／した、７
Ｍ尿素、１００ｍＭ）リスボレートＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ
８，３中の１５％ポリアクリルアミドゲル上に置いた。

サンプルを１晩、すなわち染料がゲル（０，３Ｘ２４Ｘ
１７ｃｍりの底部に移行するまで、１４０Ｖにおいて電
気泳動した。

サランラップで覆った、２０Ｘ２０アルミニウム裏張り
薄層クロマトグラフィープレート（メルク５５５４）上
での２５４　ｎｔｎ　（Ｄ　Ｕ、Ｖ、　シ’ｖ　ト’ｙ
　イｙグによってオリゴヌクレオチドを可視化した。交
差汚染を避けるために帯毎に新しいメスを用いて、帯を
切断した。１０　ｍＪ／　）リスボレートＥＤＴＡ緩衝
液ｐＨ８，３を含む、一定長さの処理済み透析管（１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ中で１分間沸とうさせ、次にミリＱ水中で
の沸とうによって３×すすぎ洗い）に別々に入れた。オ
リゴヌクレオチドをゲルスライスから２１００Ｆにおい
て１，５時間電気溶離し、次に極性を４５秒間逆にした
。溶離物を１．５−石英分光計セル中に取り出し、２２
０３３０８Ｍにおける光学密度を溶離緩衝液に対してス
キャンし、オリゴヌクレオチド濃度を２６０ｔＬｍの光
学密度に基づいて算出した。次に、水馬の量が約５００
μｌになるまでオリゴヌクレオチドをブタノール抽出に
よって＃絹した。フェノール−クロロホルム（１：１）
（５００μｌ）を含めた。水相を取り出し、ブタノール
抽出によって約５０μｌになるまでさらに濃縮した。次
に、これを真空下乾燥し、濾過したミＩＪ　Ｑ水によっ
て５０　ｐｍ○Ｌｍ、／μｌ　に再構成して、増幅反応
に備えた。

捕捉オリゴヌクレオチド（２００μｍ１０．２μＮｅｔ
合成）を０．２　Ｍ　Ｎａ、Ｃｏ、／ＨＣＯ３ｐＨ９，
６（３００μｌ）中で４■／ｒｒＪのイミノチオ−ラン
とそれぞれ混合し、周囲温度において１時間インキュベ
ートした。反応をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によ
って１−にｋるまで希釈し、Ｎａｐ−２５カラム（ファ
ルマシア）上で脱塩した。カラムをＰＢＳ（２，２１１
１１）で洗浄した。最初に溶離した１、６−を保存し、
オリゴヌクレオチド濃度をＵ、　Ｖ、スペクトロメトリ
ーによって測定した。

−皿への固定 マイクロタイター孔へのオリゴヌクレオチド固定はジエ
イ、エイ、ランニング（Ｊ、Ａ、Ｒ％ｎｎｉｎｇ）トエ
ム、ニス　　ウルデア（Ｍ、Ｓ　、Ｕｒｄａａ）（１９
９０年）がバイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｓｓ　）８．２７６−２７７頁に述べている方法の改良
法によって実施した。ポリ（Ｐｈ、−Ｌ１２）〔シグマ
（Ｓｉｇ−ｎｈａ）　］を５０−Ｍ　Ｎ（ｂ、ＣＯｖ／
ＨＣＯ，、ｐＨ９，６中に１００μｙ／−になるまで溶
解し、この溶液の１００μｌを５枚の透明たポリスチレ
ンマイクロタイター皿〔ヌンク（Ｎ５ｎｃ）　）の合孔
に加えた。

皿を４℃において１晩インキユベートしてから、ＰＢＳ
ｌｏ、０５％ツイーン（Ｔｓｏｍｅｎ）によって３回洗
浄した。スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルホキフレート（ＳＭＣＣ）を
８．７１１９／−の濃度で乾燥ジメチルホルムアミドに
溶解し、この溶液を複合緩衝液（ｃｏｎｇｓｇａｇｉｏ
ｎ　ｂｓｆｆｇｒ　）（１００ｔｎＭ　　）リエタノー
ルアミンＨＣＩ　、１　ｍＭ　　ＭｇＣ蟲、　１　ｇ＠
Ｍ　Ｚｎ５Ｏ６、ｐＨ７，４）で１０倍に希釈した。こ
の溶液の１００μｌを各マイクロタイター孔に加え、プ
レートな周囲温度で１時間インキュベートした。孔を水
で５回洗浄した。ＰＢＳ中１０μＭのチオール化オリゴ
ヌクレオチドを適当なマイクロタイター孔に１００μｌ
／孔の割合で加えた。　これらを４℃において１晩イン
キユベートした。孔をＰＢＳｌｏ、０５％ツイーンで２
回、５％ラクトース、０．５％ゼラチン、０．１％　Ｎ
３Ｎａ、６ｍＭ　　ＰＢＳ　、ｐＨ７５で２回洗浄した
。最後に、被覆した皿を層流キャビネット（ｌａｍｉｎ
ａｒ　ｆｌｏｗ　ｃａｂｉｎｅｔ　）中で１晩乾燥した
。これらの皿を真空下、４℃で保存した。

増幅不能な末端を有するＰＣＲ生戒生成発生α−１−ア
ンチトリプシン遺伝子のホモ接合Ｓ変異体（ｈｏｍｏｔ
ｙｇｏｓｓ　Ｓ　ｖａｒｉａｎｔ　）のＡＲＭＳ分析＝
１．２％Ｍ　　ＭｇＣｌ２．５０ｔｎＭ　　ＫＣｌ、１
０餌ＭＴデｉｓ　　　ＨＣｌ　　　ｐＨ８，３、０，Ｏ
ｌ　ゼラチ／および１００μＭ　　ｄＡＴＨ，１００μ
ＭｄＧＴＰ、ＺｏｏμＭ　ｄｃＴＰ　　＆　　１１００
ｐ＆　　ｄＴＴＰを含む試験管にＤＮＡ　ｌμｌを加え
て、９８μｌの反応零をオリゴヌクレオチド８ｂ、９゜
１Ｏ１１１（正常対立遺伝子に対して特異的なＡＲＭＳ
プライマー）のそれぞれ１００μＭおよび５Ｑｐｔｈｏ
１ｍの最終濃度にした。また、ＤＮＡ１ｔｉｌをオリゴ
ヌクレオチド１１０代りにオリゴヌクレオチド１２（５
変異体対立遺伝子に対して特異的なＡＲＭＳプライマー
）を含む同様な試験管にも加えた。鉱油（情ｉｎｇｒａ
ｌ　ｏｉｌ）２滴を各試験管に加え、１３５００デｐｓ
で１分間回転させた。試験管をＰＣＲ装置〔テクネ（Ｔ
ａｃｈｎａ）　）に移し、そこで９５℃において５分間
変性させてからＴａｑポリメラーゼ〔パーキンエル？　
−（Ｐ　ａｒｋｉｎ　−Ｅｌｍａｒ）、ア／プリータク
（Ａｍｐｔｉ−Ｔａｑ）〕ｚ単位をまだ９５℃であると
きに加えて、最終量１００μｌにした。

テクネ装置を９４℃、２分間、６０℃、４分間、６０℃
における２段階ＰＣＢプログラム、最終９．９分間伸長
段階（６０℃）を含む３５サイクルに切換えた。反応混
合物の２０μｌアリコートを１．５％アガロースゲル上
で電気泳動した。これは慣習的な分析方法によってＤＮ
Ａサンプルの遺伝子型を確認するためであった。結果は
第６図に示す：レーン４　Ｓ正常対立遺伝子特異性ＡＲ
ＭＳプライレーン５　Ｓ変異対立遺伝子特異性ＡＲＭＳ
プライ対照〔下流帯（ｌｏｗｅｒ　ｂａｎｄ）　　〕は
両ン一ンに存在するが、レーン５（Ｓ変異体）には生成
物帯のみが存在する。このことは、ＤＮＡがα−１アン
チトリプシン遺伝子のＳ変異対立遺伝子のホモ接合体か
らであることを実証する。

Ｅ−１ｉｎｋ　　オリゴヌクレオチド　ラベリングキッ
ト（ケンブリッジ　リサーチ　バイオケミカルス）を用
いて、オリゴヌクレオチド１９．共通シグナルプライマ
ーをアルカリホスファターゼに結合させた。溶液は他に
指示しないかき°す、上記例４に詳述した溶液と同じで
あった： １、予備ハイブリダイゼーションｆｌｌ液（ｐｒｇｈｙ
−ｂｒｉｄｔａａｔｔｏ傳５ｏ１ｓｔｉｏｘ　）　２０
０　ｆｉｌを合孔に加えた。溶液をピペッティングによ
り取出した。

２、８正常プライマー管からのＰＣＢ生成物の２０／Ａ
Ｊ７リコートを、５ｘＳＳＣ６０ｐｌを含む孔〔第７図
に関してＡｌ、Ａ２およびＡ３〕に加えた。Ｓ変異プラ
イマー管からのＰＣＢ生成物の２０μｌアリコートを、
５ｘＳＳＣ６０μｌを含む孔〔第７図に関してＢ５　Ｂ
２およびＢ３〕に加えた。ハイブリッド化は振とうしな
がら３７℃において１時間続げた。次に、溶液乙ピペッ
ティングによって取り出した。

シグナル発生は例４に述べた通りであった。

３、希釈した結合オリゴヌクレオチド１９をｌＯμｊ（
すなわち約Ｌ５ｐｍｏｌｅ）、６孔にすでに加えた５ｘ
ＳＳＣ４Ｑμｌに加えた。ハイブリッド化を振とうしな
がら３７℃において１時間続げた。溶液をピペッティン
グによって取り出した。

４、３７℃の２ＸＳＳＣ２００μｌによる２Ｘ５分間洗
浄を振とうしながら実施した。溶液をピペッティングに
よって取り出した。

発色溶液２００μｌを６孔〔第７図に関してＡｌ、Ａ２
、Ａ３、Ｂｌ、　Ｂ２およびＢ３〕に加え、これらを３
７℃において振とうしながら約１時間インキュベートし
た。次にヒユーレット　パラカード　スキャン　ジェッ
ト　プラススキャナー（Ｈａｗｌａｔｔ　Ｐａｃｋａｒ
ｄ　５ｃａｎ　ＪａｙＰＬｓｓ　ｍｅａｎｎｅｒ）を用
いて孔をスキャンし、アップル　マツキントラシュ　ソ
フトウェア−（Ａｐｐｌｅ　Ｍａｃｋｉｎｔｏｓｈ　ａ
ｏｆｔｗａデー）を用いてディジタル表現した。

結果は第７図に示す。内部対照孔Ａ１とＢｌが着色する
のが見られる。さらに、変異体孔Ｂ２のみが着色し、Ｄ
ＮＡがα−１−アンチトリプシンのホモ接合Ｓ変異体か
らであるという明白な診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　　）
を与える。有意な非特異的結合は存在しない、すなわち
対照孔Ａ３とＢ３は着色しない。

以下の頁に示す配列アイデンティティ＜　ｉ　ｄ　ａｓ
　−ｔｉｔｙ）１〜２３はそれぞれ前記オリゴヌクレオ
チド１〜２３に相当する。

配列リスト （１）一般情報 （１）出願人：インペリアル　ケミカル　インダスｌ−
ＩＪ−ズ　ＰＬ　Ｃ（ＩｍｐｅｒｉａｌＣｈａｔｎｉｃ
ａｌ　ＩｎｄＳｓｔｒｉｅｓ　ＰＬＣ）（１、発明の名
称：増幅方法 （ｉｉｉｌ　　配列数：２７ ０ｖ）　　通信宛先 ＣＡ）受信人：法務省特許局 （Ｂ）町：ベツセマーロード（Ｂｅｍｓ−ｍｅｒ　Ｒｏ
ａｄ）（Ｃ）市：ヴエルヴイン　ガーデンシティ（ＪＦ
ｓＪｓｃ＋ｙｓ　　Ｇａｒｄｍｓ　　Ｃ１ｔｙ　）ＣＤ
）州ニハードフォルトシャー（Ｂａｒｔｆｏｒ−ｄｓｈ
ｉｒａ　） ＣＥ）国：イギリス ＣＦ）郵便番号：ＧＢ−ＡＬ７１ＨＤ （Ｖ）　　コンピューターで読める形式：％式％） （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯ５３，２０（Ｄ）ソフ
トウェア：ＷＰＳ−ＰＬＵＳからの５ＣＩＩ （ｖｌ）本出願のデータ： （Ａ）出願番号： ＣＢ）出願臼： （ｖｌｏ　　先願データ： （Ａ）出願番号：　ＧＢ　８９２００９７、６ＣＢ）出
願臼：１９８９年９月６日 ＳＥＱ　　ＩＤ　　／Ｉ６１ 配列長さ＝６３ 配列型二　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジー：１ｗ状 ストレージ ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＡＴＧ ＯＣＴＧＡＣＣＡＴＣ ＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧ ＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣ ＴＧＣＴＧＧＣ；ＧＣＣ ＳＥＱ　　ＩＤ　　４２ 配列長さ二６３ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジー：　線状 Ｎ：２′−デオキシリボッ ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＴＧ ラノシルナフタレン ＧＣＴＧＮＮＮＮＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴ
ＧＡＡＧＣ ＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣ ＳＥＱ　　　ＩＤ　　４２（！ 配列長さ：６０ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジｍ：　線状 Ｎ：２′−デオキシリボッ ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴラノシルナ
フタレン ＧＣＴＧＮＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡ
ＧＣＴＧＣ ＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ ＳＥＱ　　ＩＤ　　４３ 配列長さ：６１ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 Ｎ：３′−デオキシリボッ ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴラノシルナ
フタレン ＧＣＴＧＮｉＶＴＣＧＡ　ＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴ
ＧＡＡＧＣＴＧ ＣＴＧＧＧＧＣＣＡＴ ＳＰ、Ｑ　　ＩＤ　　鷹４ 配列長さ二６３ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジー：　線状 Ｎ：３′−デオキシリボッ ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＴＧ ラノシルナ７タレン ＧＣＴＧＮＮＮＮＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴ
ＧＡＡＧＣ ＴＯＣＴＧＧＧＧＣＣ ＳＥＱ　　　ＩＤ　　Ａ４ａ 配列長さ＝６０ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジｍ：　線状 Ｎ：３′−デオキシリボフラノシル ＳＥＱ　　　ＩＤ　　４８ 配列長さ二６３ 配列型：　ヌクレオチド 鎖二　−重鎖 トポロジー：　線状 Ｎ：　チミジン４−メチルホスホネートＡＡＴＴＣＣＧ
ＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴ　ＧＣＴＧＮＮＮＮＴＣＴ
Ｇ ＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧ ＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣ ＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣ ５ＥＱ　　　ＩＤ　　魔８α 配列長さ二　６０ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジｍ：　線状 Ｎ：　チミジン４−メチルホスホネートＡＡＴＴＣＣＧ
ＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴ　ＧＣＴＧＮＴＣＧＡＣＧ
ＡＧＡＡＡＧＧＧＡ ＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣ ＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ ＳＥＱ　　ＩＤ　　、％８６ 配列長さ＝５４ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジー：　線状 Ｎ：３′−デオキシリポフ ＧＴＧＴＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＴＣＡＡＴＧラノシルナ
フタレン ＮＮＮＮＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＧ
ＧＣＡＡＡ ＧＧＧ ＳＥＱ　　　ＩＤ　　Ａ６９ 配列長さ：５３ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジｍ：３′−デオキシリボフラノシルナフタレン
ＧＴＧＴＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＴＣＡＡＴＧ　ＮＮＮＮ
ＧＡＧＡＣＴ　ＴＧＧＴＡＴＴＴＴＧＳＥＱ　　　ＩＤ
　　４１０ 配列長さ＝５４ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジｍ：　線状 Ｎ：３′−デオキシリボフラノシルナフタレンＡＧＴＡ
ＴＧＴＡＴＴ　ＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧ　ＮＮＮＮＴＧＴ
ＣＣＡＣＧＴＧＡＧＣＣＴＴ ＳＥＱ　　　ＩＤ　　Ａｌｌ 配列長さ＝５４ 配列型：　ヌクレオチド 鎖二　−重鎖 トポロジｍ：　線状 Ｎ：３′−デオキシリボフラノシルナフタレンＴＡＴＡ
ＧＧＣＡＡＧ　ＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡ　ＮＮＮＮＴＧＧ
ＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧ ＳＥＱ　　ＩＤ　　、％１２ 配列長さ：５４ 配列型二　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジｍ：　線状 Ｎ：３′−デオキシリボフラノシルナフタレンＡＣＧＡ
ＴＴＧＴＴＡ　ＡＣＣＡＡＧＡＴＣＴ　ＮＮＮＮＴＧＧ
ＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧ ”ｌ’ＴｃＡＡＴｃＡＴＴ ＯＣＴＣＧＡＧＧＣＣ ＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡ ＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡ ＡＧ ＧＧＧ ＴＴＴ ＴＴＡ ＳＥＱ　　　ＩＤ　　涜１３ 配列長さ＝３０ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジｍ：　線状 ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＡＴＣＡＡＣＴＴＡ　ＣＴＴ
ＧＣＣＴＡＴＡＳＥＱ　　　ＩＤ　　鷹１４ 配列長さ：３０ 配列型：　ヌクレオチド 鎖二　−重鎖 トポロジー二　線状 ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＡＧＡＴＣＴＴＧＧＴ　ＴＡＡ
ＣＡＡＴＣＧＴＳＥＱ　　　ＩＤ　　／１６１５ 配列長さ：３０ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジｍ：　線状 ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＣＧＧＴＣＣＴＣＡＴ　ＡＡＴ
ＡＣＡＴＡＣＴＳＥＱ　　　ＩＤ　　屑１６ 配列長さ：３０ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジー二　線状 ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＳＥＱ　
　　ＩＤ　　４１７ 配列長さ二　３０ 配列型：　ヌクレオチド 鎖二　−重鎖 トポロジー二　線状 ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＡＴＡＧＧＣＡＡＧＳＥＱ　
　　ＩＤ　　４１８ 配列長さ＝３０ 配列型二　ヌクレオチド 鎖：　−重鎮 トポロジｍ：　＃状 ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＡＣＧＡＴＴＧＴＴＡＡＴＧＡ
（１；ＡＣＣＧ ＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡ ＡＣＣＡＡＧＡＴＣＴ ｓｐ：Ｑ　　　ＩＤ　　／１６１９ 配列長さ＝３０ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジｍ：　線状 ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＣＡＴＴＧＡＣＴＧＣＧＧＧＡ
ＣＧＡＣＡＣ ＳＥＱ　　ＩＤ　　４２０ 配列長さ＝６３ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 Ｎ：　チミジンホスホルモルホリゾートＡＡＴＴＣＣＧ
ＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴ　　ＧＣＴＧＮＮＮＮＴＣ
ＴＧ ＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧ ＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣ ＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣ ５ＥＱ　　　ＩＤ　　Ａ２１ 配列長さ：６０ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジｍ：　線状 Ｎ：　チミジンホスホルモルホリゾートＡＡＴＴＣＣＧ
ＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴ　ＧＣ’ＴＧＮＴＣＧＡＣ
ＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡ ＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣ ＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ ＳＥＱ　　　ＩＤ　　Ａ２２ 配列長さ＝６０ 配列型：　ヌクレオチド 鎖：　−重鎖 トポロジｍ：　線状 Ｎ：　メタホスフェート ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＮ
ＴＣＧＡＣ ＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡ Ｃ’ＴＧＡＡＧＣＴＧＣ ＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧ ＳＥＱ　　　ＩＤ　　厘２３ 配列長さ＝６３ 配列型：　ヌクレオチド 鯖：　−重鎮 トポロジー二　線状 Ｎ：　メタホスフェート ＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴ　ＧＣＴＧ
ＮＮＮＴＣＧ　ＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧ　ＧＡＣＴＧＡＡ
ＧＣＴ　ＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡ　　６０Ｔに　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　６２

【図面の簡単な説明】

第１図は不発明の方法に用いるプライマーに、デオキシ
リボフラノンル、アルキレンおよびメチルホスホネート
重合ブロッキング部分を用いた后果を示すオートラジオ
グラフである。 第２図は本発明の方法に用いるプライマー：こ−重鎮デ
オキシリボフラノシルとメチル不スホネート１合ブコッ
キング部分とを用いた結果を示すオートラジオグラフで
ある。 第３図は本発明の方法に用いるプライマーにホスフェー
トおよびホスホラミデーＭ４合ブロッキング部分を用い
た結果を示すオートラジオグラフである。 第４図はマイクロタイタープレート試験捕捉系を用いて
得られた結果を示す写真である。 第５図は本発明の方法を実施するた力の便利な分析フォ
ーマットを示す模式図である。イラストレーションは蛋
白質板後内面を有するマイクロタイタープレートの１孔
を示す。固相捕捉オリゴヌクレオチドはこの内面に動足
される。このオリゴヌクレオチドの遊離末端は二重頚増
幅生底物の唯一の末ｇｇ妃夕ＩＪ（ｕｎｉｑｕｇ　　ｔ
ａｉｌ　　５ｅｑｕｅｎｃｅ）にノゝイブリッド化する
。Ｐ　ＣＲ生成物の他方の末端はＥによって表される酵
素ラベルを含む一重頚オリコヌクレオチドにハイブリッ
ド化する木端配列である。このラベルは矢印または添付
星印によって表される狭山可能な色の変化を生ずる、基
貿との反応に用いられる。ＩＮは二重鎖木端の形成を防
止スル重合ブロッキング部分を表す。 第６図はα−１−アンチトリプシン遺伝子のＳ座の対立
遺伝子特異性増幅（ＡＲＭＳ）分析におけるＰＣＲ生底
物の生成な説−する写真である。 第７図はα−１−アンチトリプシン遺伝子のＳ座の上記
ＡＲＭＳ分析のための、α−１−アンチトリプシン遺伝
子のエキソンＶに基づく内部対照を用いたマイクロタイ
ター孔配＆を説明する写真である。 Ｆ／６、７ Ｆ／６２ ａ（１） ａｆ２）ａｆ３）　ｂ 手続補正書（方式） ２０発明の名称 増幅方法 補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名　称　インペリアル・ケミカル・インダストリーズ・
ピーエルシー ４、代理人 住所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号 新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付 平成 ２年１１月２７日（発送臼） ＦｌＧ、６ ＦｌＧ、７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、標的ヌクレオチド配列をハイブリダイジング条件下
   で、その目的部分に対する第１プライマー、対応する増
   幅プライマー、適当なヌクレオチド類および当該ヌクレ
   オチド類の重合剤と同時にまたは逐次接触させることか
   ら成る標的ヌクレオチド配列の増幅方法において、上記
   第１プライマーが次の要素： （１）標的ヌクレオチド配列の適切な部分に対して実質
   的に相補的である標的結合ヌクレオチド部分；および （２）ポリヌクレオチドテイル から成り、 第１プライマーをプライマー伸長させることによつて、
   鋳型としての標的ポリヌクレオチド配列に基づいて第１
   プライマー伸長生成物を合成し、第１プライマー伸長生
   成物をその鋳型から変性し、第１プライマー伸長生成物
   の適切な部分に増幅プライマーをハイブリダイゼーシヨ
   ンした後に、プライマー伸長を行わせて増幅プライマー
   伸長生成物を形成するが、この場合に第１プライマー伸
   長生成物中の第１プライマーの存在が増幅プライマー伸
   長生成物中のポリヌクレオチドテイルに対して相補的な
   配列の形成を抑制するために効果的である方法。 ２、第１プライマーに加えて、増幅プライマーが次の要
   素： （１）標的ヌクレオチド配列の適切な部分に対して実質
   的に相補的である標的結合ヌクレオチド部分；および （２）ポリヌクレオチドテイル から成り、 増幅プライマーをプライマー伸長させることによつて、
   鋳型としての第１プライマー伸長生成物に基づいて増幅
   プライマー伸長生成物を合成し、増幅プライマー伸長生
   成物をその鋳型から変性し、増幅プライマー伸長生成物
   の適切な部分に第１プライマーをハイブリダイゼーシヨ
   ンした後に、プライマー伸長を行わせて第１プライマー
   伸長生成物を形成するが、この場合に、増幅プライマー
   伸長生成物中の増幅プライマーの存在が第１プライマー
   伸長生成物中のポリヌクレオチドテイルに対して相補的
   な配列の形成を抑制するために効果的である方法。 ３、第１プライマーおよび／または増幅プライマーがポ
   リヌクレオチドテイルに結合した標的結合ヌクレオチド
   部分を含み、標的結合ヌクレオチド部分とポリヌクレオ
   チドテイルとが相互に逆の意味である請求項１または２
   記載の方法。 ４、第１プライマーおよび／または増幅プライマーが２
   個以上のポリヌクレオチドテイルに結合した標的結合ヌ
   クレオチド部分を含み、各ポリヌクレオチドテイルが任
   意に２個以上の標的結合ヌクレオチド部分と結合してい
   る請求項１または２記載の方法。 ５、第１プライマーおよび／または増幅プライマーが標
   的結合ヌクレオチド部分とポリヌクレオチドテイルおよ
   びこれらの間のヌクレオチド重合ブロッキング部分を含
   む請求項１または２記載の方法。 ６、ヌクレオチド重合ブロッキング部分が少なくとも１
   個のリボフラノシルナフタレン、デオキシリボフラノシ
   ルナフタレン、メタホスフェートまたは直鎖アルキレン
   部分を含むか、またはヌクレオチドメチルホスホネート
   類およびヌクレオチドホスホラミデート類から成る群よ
   り独立的に選択した少なくとも２つの部分を含む請求項
   ５記載の方法。 ７、ヌクレオチド重合ブロッキング部分が少なくとも２
   個のリボフラノシルナフタレン、デオキシリボフラノシ
   ルナフタレンまたはメタホスフェート部分を含むか、ま
   たはＣ＿６−Ｃ＿２＿０直鎖アルキレン部分を含む請求
   項５または６記載の方法。 ８、第１遺伝子座に関するプライマーのポリヌクレオチ
   ドテイルが他の単数又は複数の遺伝子座に関するポリヌ
   クレオチドテイルから識別可能であるため、第１遺伝子
   座に関する増幅生成物が識別可能な第１固相上に捕捉さ
   れ、他の単数又は複数の遺伝子座に関する増幅生成物が
   １個以上の他の固相上に捕捉される請求項２〜７のいず
   れかに記載の方法。 ９、第１遺伝子座に関する増幅生成物がプライマーのポ
   リヌクレオチドテイルを介して識別可能にラベルまたは
   マークされ、他の単数又は複数の遺伝子座に関する増幅
   生成物もラベルまたはマークされる請求項２〜７のいず
   れかに記載の方法。 １０、第１遺伝子座および他の遺伝子座が遺伝子座の対
   立遺伝子に対応する請求項８または９記載の方法。 １１、標的ヌクレオチド配列の増幅用キットであつて、 第１プライマーと、増幅すべき各標的ヌクレオチド配列
   の対応増幅プライマーとから成り、 各第１プライマーが、 （１）、標的ヌクレオチド配列の適切な部分に対して実
   質的に相補的である標的結合ヌクレオチド部分；および （２）ポリヌクレオチドテイル から成り、 第１プライマー伸長生成物中の第１プライマーの存在が
   増幅プライマー伸長生成物中のポリヌクレオチドテイル
   に対して相補的な配列の形成を抑制するのに効果的であ
   るキット。 １２、増幅プライマーも同様に、 （１）標的ヌクレオチド配列の適切な部分に対して実質
   的に相補的な標的結合ヌクレオチド部分；および （２）ポリヌクレオチドテイル から成り、 増幅プライマー伸長生成物中の増幅プライマーの存在が
   第１プライマー伸長生成物中のポリヌクレオチドテイル
   に対して相補的な配列の形成を抑制するのに効果的であ
   る請求項１１記載のキット。 １３、次の要素： 任意の内部対照プライマー、適当な異なるヌクレオチド
   および／またはヌクレオチドの重合剤、および上記プラ
   イマーのポリヌクレオチドテイルに直接的または間接的
   に結合する固相の中の１つ以上を含む請求項１１または
   １２記載のキット。 １４、増幅すべき各標的ヌクレオチド配列に対する固相
   を含み、 各固相が少なくともその一部が関連プライマーのポリヌ
   クレオチドテイルに対して実質的に相補的であるヌクレ
   オチド配列を有する請求項１１〜１３のいずれかに記載
   のキット。 １５、遺伝的疾患または遺伝的特徴を示す対立遺伝子の
   検出のための請求項１〜１４のいずれかに記載の方法ま
   たはキットの使用。