JPWO2013162026A1 - 核酸の増幅方法、および、増幅核酸の検出方法 - Google Patents

Abstract

効率的なハイブリダイゼーションを行うための核酸の増幅・検出方法、および、それらに使用するデバイス・キットの提供を課題とする。標的核酸を増幅する際に、両末端に一本鎖領域を有する二本鎖核酸として増幅し、検出する。また、それらを用いた検出デバイス・キットを提供する。

Description

本発明は、核酸の増幅方法、および、その方法で増幅された核酸の検出方法に関する。

分子生物学の研究分野、遺伝子検査等の臨床応用分野において、標的核酸配列を特異的に増幅する方法は非常に重要な技術となっている。核酸増幅法により得られた増幅産物を特異的に検出する方法の一つとして、標的配列を含む核酸断片を固相に固定して検出する方法がある。この方法では、標的核酸を特異的に固相に捕捉することで、洗浄等により非特異的な核酸配列を容易に除去し、検出特異性を上げることが可能である。

この際、標的核酸を固相に捕捉する方法としては、特異的な結合を形成し得る抗原−抗体の組合せ、あるいは、リガンド−レセプターの組合せを利用する方法が挙げられる。例えば、非特許文献１では、一方のプライマーの末端をビオチン修飾し、他方のプライマーを蛍光物質修飾したプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物の検出法が開示されている。この方法では、ＰＣＲ産物をストレプトアビジン−アガロースからなる固相と接触させ、ストレプトアビジン−ビオチン複合体を形成させることにより固相に結合させ、その蛍光を測定することで目的の増幅産物の検出が可能である。

しかし、標識に使用可能な抗原／抗体やリガンド／レセプターの組合せには制限があるため、同時に多数の標的核酸を検出することは実質的には困難である。また、蛍光標識核酸は高価であるといったコスト面の問題も有する。

標的核酸を固相に捕捉する別の方法として、標的核酸に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブを固相上に固定化し、標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションを介して、標的核酸を固相に間接的に固定化する方法がある。この方法ではハイブリッド形成によるシグナル強度の検出を行う。このような核酸解析法は、プローブ配列を変えることで複数の標的配列を一度に解析することが可能である。

しかし、固定化したプローブと標的核酸とを固相上でハイブリダイゼーションさせるには、一般にＰＣＲ法で増幅した二本鎖核酸を、熱処理により一本鎖に変性する工程が必要であるが、加熱処理は煩雑であるだけでなく、再アニーリングによるハイブリダイゼーション効率の低下が問題である。また、一本鎖ＤＮＡは球状化し易く、検出感度に劣るという問題も有している。特許文献１では、加熱処理を行わず、ヌクレアーゼ処理によって一本鎖核酸を増幅する方法が開示されているが、これも操作は煩雑であり、一本鎖の球状化の問題がある。

核酸の検出方法の中でも、操作性に優れ、迅速、簡便な標的核酸の検出方法として、特許文献２に記載のクロマトグラフィーに基づいた方法がある。この方法は、細胞、ウイルスまたは細菌から遺伝子を抽出する工程、任意抽出された遺伝子の断片化工程、および検出工程が、単一の遺伝子検出装置上で、任意抽出された遺伝子またはその断片を含む液体試料をキャピラリー作用によって移動させる事により連続して行われる遺伝子検出方法である。目的遺伝子の存否を判断し、更にその種類を同定する事が可能になる。ただし、特許文献２でもＮＡＳＢＡ法により一本鎖核酸を増幅している。一本鎖核酸の使用上の課題は前述の通りである。

上記の問題を解決するために、特許文献３および特許文献４では、プライマー領域の５’側にＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成を阻害する非天然型核酸タグ、ヘアピン構造、またはシュードノット構造を有することで、ＰＣＲ反応後も二本鎖核酸の片方に一本鎖領域を残している。特殊なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うだけで、二本鎖ＤＮＡの片方の末端にハイブリダイゼーション可能な一本鎖領域を有する増幅産物を作製可能であるという点で優れている。しかし、検出には蛍光標識や、表面プラズモン共鳴差イメージングによる検出が必要であるため、高価な専用の装置が必要であり、迅速性、簡便性の面で問題がある。

特開平５−２５２９９８号公報 特開２００６−２０１０６２号公報 国際公開第２００６／０９５５５０号パンフレット 特開２００９−２９６９４８号公報

Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９３，２３１−２３５，（１９９１）

臨床現場における遺伝子診断や検査においては、検査装置が大型かつ高価であること、および、検査時間を要することで、患者の検査費用や数回の通院での手間や負担を要することが多い。そこで、検査の正確性を保ちつつも患者および検査者の負担を軽減する必要があるという理由から、簡便、迅速かつ特異性の高い方法、低コストで特殊な装置を必要としない方法が求められる。本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであって、その目的はハイブリダイゼーション法の特異性の高さを活用し、かつ、ＰＣＲ産物の検出工程に要する時間と工程を減らし、特殊な装置を必要とすることなく、簡便かつ高精度に、目視にて検出する核酸検出方法、および核酸検出デバイスまたはキットを提供することを課題とする。更には、これまでは高価な標識タグを標的核酸ごとに作製する必要があり、手間とコスト面で改善の余地があった。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、それぞれのプライマー本体部の５’末端に連結した核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域を有したプライマーセットを用いることにより、標的核酸を、両末端それぞれに一本鎖領域を有する二本鎖核酸として増幅し、当該増幅断片を、前記一本鎖領域の一方とハイブリダイゼーションし得るオリゴヌクレオチドプローブを有する固相と結合させ、これを検出することにより、特殊な装置を必要とすることなく、前記ＤＮＡ増幅断片を簡便かつ高精度に検出できることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、核酸増幅反応で二本鎖化されないタグ領域が５’末端側に連結されたプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、両末端に一本鎖領域を有する核酸を得ることを特徴とする、核酸の増幅方法に関する。

タグ領域が、スペーサーを介してプライマーと連結されていることが好ましい。

スペーサーが、核酸誘導体を含むことが好ましい。

核酸誘導体が、Ｌ型核酸、３−ｄｅｏｘｙ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｄＮ、修飾塩基核酸、損傷塩基核酸、リン酸結合部位修飾核酸、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅ−Ｎ、および、それらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上であることが好ましい。

Ｌ型核酸が、Ｌ型ＤＮＡ、Ｌ型ＲＮＡ、および、それらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上であることが好ましい。

３−ｄｅｏｘｙ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｄＮが、２’−５’結合によりプライマーと連結されていることが好ましい。

修飾塩基核酸が、発色団またはビオチンを含むことが好ましい。

発色団が、ピレン、エテノ、ピロロ、ぺリレン、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、ダブシル、シアニン、および、それらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上であることが好ましい。

損傷塩基核酸が、脱塩基ヌクレオチド、５−ヒドロキシメチル−ｄＮ、および、それらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上であることが好ましい。

リン酸結合部位修飾核酸が、ホスホロチオエート又はその誘導体を含むことが好ましい。

核酸誘導体が、５’−５’結合でプライマーと連結され、かつ、３’−３’結合でタグ領域と連結されていることが好ましい。

スペーサーが、非核酸誘導体を含むことが好ましい。

非核酸誘導体が、Ｄ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ骨格を有することが好ましい。

Ｄ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ骨格に、アゾベンゼン、ビオチン、ＥＤＴＡ、および、発色団からなる群から選択される少なくとも１以上が導入されていることが好ましい。

発色団が、ピレン、エテノ、ピロロ、ぺリレン、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、ダブシル、シアニン、および、それらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上であることが好ましい。

非核酸誘導体が、炭素鎖（Ｃ_ｎ）、ペグ鎖（（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ）、ジスルフィド含有鎖（Ｃ_ｎＳＳＣ_ｎ）、および、ジチオールフォスフォロアミダイトからなる群から選択される少なくとも１以上であることが好ましい。

スペーサーが複数種類および／又は複数個であることが好ましい。

また、本発明は、前記核酸の増幅方法で得られた、両末端に一本鎖領域を有する核酸を検出することを特徴とする核酸の検出方法に関する。

片方の一本鎖領域と相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブを固相に固定する工程、および、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブを、両末端に一本鎖領域を有する核酸とハイブリダイズさせる工程を含むことが好ましい。

更に、他方の一本鎖領域と相補的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを標識物質と結合する工程、および、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブを、両末端に一本鎖領域を有する核酸とハイブリダイズさせる工程を含むことが好ましい。

更に、目視で核酸を判別する工程を含むことが好ましい。

標識物質が着色担体であることが好ましい。

両末端に一本鎖領域を有する核酸を、核酸検出デバイス上で検出することが好ましい。

核酸検出デバイスが、アレイ又はクロマトグラフィーであることが好ましい。

本発明によれば、タグ領域が核酸増幅反応で二本鎖化されないので、両末端に一本鎖領域を有しハイブリダイゼーションによる検出効率の高い核酸を得ることができる。

更に本発明によれば、核酸増幅産物の一本鎖領域を利用して特異的に核酸増幅産物を固相に結合させることができ、更にもう一方の一本鎖領域を利用して標識化合物との複合体を形成することができ、特殊な装置を用いることなく核酸増幅産物を簡便、迅速に目視判定することが可能となる。更に、構造的に安定な二本鎖核酸を検出することによって、全長一本鎖の検出と比較して検出感度が向上される。また、固相に結合させるための増幅産物の一本鎖領域と、これに相補的な固相上のオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを複数種用意することで、試料中に存在する２種以上の標的核酸を同時に判別することも可能となる。更に、安価なジョイントプライマーを介することによりあらゆる標的核酸に同一の一本鎖領域を付加することが可能となる。その同一の一本鎖領域を利用して、同一の標識タグおよびデバイスを用いて検出が可能となる。この場合、高価な標識タグを標的核酸ごとに作製する必要がなく、手間とコストを大幅に改善することができる。

本発明のＰＣＲ用プライマーの概念図である。 本発明のＰＣＲ用第１プライマーの概念図である。 本発明のＰＣＲ用第２プライマーの概念図である。 本発明における部分二本鎖核酸の合成法の概念図である。 本発明における部分二本鎖核酸の合成法の別様態の概念図である。 本発明の核酸クロマトグラフィーデバイスの一例を示す概略図である。 本発明におけるＰＣＲ産物検出原理の概念図である。 本発明のマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）の一例を示す概略図である。 本発明のビーズ担体の一例を示す概略図である。 参考例の変性ＰＡＧＥの結果の一例である。 実施例１の核酸クロマトグラフィー様ストリップによるＰＣＲ増幅産物の検出結果の一例である。 実施例１３のクロマトグラフィー様ストリップによるＰＣＲ増幅産物の検出結果である。 実施例１４で使用した標的１の概念図である。 実施例１４で使用した標的２の概念図である。

本発明は、核酸増幅反応で二本鎖化されないタグ領域が５’末端側に連結されたプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、両末端に一本鎖領域を有する核酸を得ることを特徴とする、核酸の増幅方法に関する。核酸としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。核酸増幅産物の両末端の一本鎖領域は、天然のヌクレオチドを含むことが好ましい。更に本発明は、前記方法によって作製された、両末端に一本鎖領域を有する核酸を、検出する工程を含む核酸の検出方法に関する。

両末端に一本鎖領域を有する核酸は、鋳型となる試料ＤＮＡに対して、特定のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うことにより得られる。両末端に一本鎖領域を有する核酸は、二本鎖ＤＮＡ増幅断片であって両末端に一本鎖領域を有するものであることが好ましい。

試料ＤＮＡは特に限定されず、核酸増幅反応の鋳型として用いることができればよい。具体的には、血液、体液、組織、口腔内粘膜、毛髪、爪、培養細胞、動物、植物、微生物等のあらゆる生物試料由来のＤＮＡを用いることができる。また、上記試料ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、および葉緑体ＤＮＡなどでもよい。また、ＲＮＡを鋳型として逆転写反応後に得られたｃＤＮＡを用いることもできる。これらＤＮＡは、増幅させるＤＮＡ断片に応じて、適時選択すればよい。また、試料ＤＮＡは精製されたＤＮＡである必要はなく、試料ＤＮＡを含む細胞や組織を、精製処理することなく、そのまま核酸増幅反応に適用することができる。

両末端に一本鎖領域を有する二本鎖ＤＮＡ増幅断片は、核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域を有する２つ以上のプライマーを用いて核酸増幅法により得られた産物であることが好ましい。この場合において、二本鎖ＤＮＡ増幅断片の両末端の一本鎖領域は、核酸増幅反応に使用するプライマーのうち、核酸増幅反応により二本鎖化されないタグ領域に由来する領域である。

図１に核酸増幅用プライマーを示す。このプライマーは、プライマー本体領域１と、前記プライマー本体部の５’側に核酸増幅反応により二本鎖化されないタグ領域２からなる。また、プライマー本体領域とタグ領域との間に、ポリメラーゼ反応阻害領域３としてスペーサー領域を有していても良い。

また、二本鎖ＤＮＡ増幅断片は、標的核酸の鋳型にハイブリダイズ可能な配列、および、該鋳型にハイブリダイズ不可能な共通配列を有するプライマーを含む第１プライマーセット、並びに、上記共通配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列、および核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域を有するプライマーを含む第２プライマーセットを用いて、核酸増幅法により得られた産物であることが好ましい。図２にＰＣＲ用第１プライマーセットを構成するプライマーを示す。ＰＣＲ用第１プライマー（ジョイントプライマー）は、標的核酸の鋳型にハイブリダイズ可能なプライマー本体領域４と、前記プライマー本体領域の５’側に第２プライマーと共通の配列からなる共通領域５からなることを特徴とする。図３にＰＣＲ用第２プライマーセットを構成するプライマーを示す。第２プライマーは、前記第１プライマーと共通の配列を有するプライマー本体領域６と、本体領域６の５’側に核酸増幅反応により二本鎖化されないタグ領域７からなることを特徴とする。第２プライマー本体領域とタグ領域との間に、ポリメラーゼ反応阻害領域８としてスペーサー領域を有していてもよい。

プライマー本体領域とは、核酸増幅反応におけるプライマーとして機能し得る塩基配列を有するオリゴヌクレオチド領域を意味する。具体的には、標的核酸の標的塩基配列における５’末端側又は３’末端側とハイブリダイズし得る配列であり、一般的には、標的塩基配列の５’末端側または、３’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列である。これらのプライマー本体領域は、標的核酸と特異的に結合可能であれば、塩基欠損や挿入、およびミスマッチ部位を有していても良い。プライマー本体領域の長さは、８塩基以上であることが好ましく、１２塩基以上であることがより好ましく、１５塩基以上であることが更に好ましい。また、プライマーの鎖長には特に上限はないが、その合成のコストなどの観点から、通常は５０塩基以下、あるいは４０塩基以下のものが好適である。

プライマーのタグ領域は、天然のヌクレオチドを含むことが好ましい。天然のヌクレオチドとは天然のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシルの塩基、デオキシリボース、リボースの糖部、および、リン酸基から構成されるヌクレオチドのことであり、各部分が人工的な修飾を受けていないヌクレオチドのことである。天然のヌクレオチドは、Ｄ型ヌクレオチドであってもよく、Ｌ型ヌクレオチドであってもよい。Ｄ型ヌクレオチドとは、Ｄ型のデオキシリボースもしくはリボースからなるヌクレオチドを示す。また、Ｌ型ヌクレオチドとは、Ｌ型のデオキシリボースもしくはリボースからなるヌクレオチドを示す。タグ領域が天然のヌクレオチドを含むことにより、合成が安価で容易になるという効果を奏する。また、プライマーのタグ領域における天然のヌクレオチドの割合は、５％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、９０％以上であることが最も好ましい。タグ領域の長さは特に限定されず、相補鎖核酸とハイブリダイズするために十分な長さを有していればよい。通常、５塩基〜６０塩基であり、好ましくは６塩基〜４０塩基である。

プライマーのタグ領域の核酸の向きはプライマー本体領域と同一方向に配列されていることが好ましい。プライマーのタグ領域の核酸の向きがプライマー本体領域と同一方向に配列されることにより、合成が安価で容易になるという効果を奏する。例えば、アゾベンゼンのような非天然の化合物がタグ領域とプライマー本体領域の間に入っている場合のように、タグ領域とプライマー本体領域が直接つながっていなくても、同一方向に配列されていることが好ましい。ここで、核酸が同一方向であるとは、隣り合うヌクレオチド同士が、ヌクレオチド中の糖の３’位同士や５’位同士ではなく、５’位と３’位の間でホスホジエステル結合していることをいう。例えば、タグ領域において、ヌクレオチド同士がホスホジエステル結合により糖の５’位と３’位の間で結合されている場合には、本体領域においても、ヌクレオチド同士が糖の５’位と３’位の間で形成されていることをいう。

スペーサー領域には、ポリメラーゼによる伸長反応を阻害するスペーサーが含まれており、核酸の増幅反応の過程でポリメラーゼによる伸長反応を阻害し、タグ領域を一本鎖構造に保つことができる。スペーサーの構造は、ポリメラーゼによる伸長反応を阻害することができれば特に限定されないが、核酸誘導体や非核酸誘導体を含むことが好ましい。

核酸誘導体は、ポリメラーゼによる伸長反応を阻害し、タグ領域を一本鎖構造に保つことが可能なら特に限定されない。核酸誘導体として、５’−５’結合や３’−３’結合のような逆位配列構造を形成する核酸、強固なヘアピン構造やシュードノット構造のようにポリメラーゼの進行を阻害する立体構造を有する核酸、Ｌ型核酸、３−ｄｅｏｘｙ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｄＮ、修飾塩基核酸、損傷塩基核酸、リン酸結合部位修飾核酸、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅ−Ｎ、ＢＮＡ（ＬＮＡ）、および、それらの誘導体が挙げられる。

５’−５’結合もしくは３’−３’結合とは、化学式（１）

で示すようにＤＮＡを構成するデオキシリボースの５’位とリン酸基を挟んで隣のデオキシリボースの５’位が結合している構造、もしくは、３’位とリン酸基を挟んで隣のデオキシリボースの３’位が結合している構造である。通常の５’位と３’位の結合とは逆方向であるため、逆位配列構造と呼ぶ。具体的な例としては、プライマー本体領域の５’領域とスペーサーが５’−５’結合で連結され、かつ、前記タグ領域の３’末端とスペーサー３’−３’結合で連結されるように、逆位構造を２回有した構造が挙げられる。また、逆位構造の回数は少なくとも１回含んでいれば良く、特に限定しないが、偶数回含んでいることが好ましい。偶数回の逆位構造を有すればタグ領域の末端が通常のプライマーと同じく５’位になるため、タグ領域からの非特異的な伸長反応を抑制することができ、検出時にも効果的である。また、スペーサーを化学式（１）に示すような１塩基ではなく、好ましくは５〜６０塩基とすることで、スペーサーとタグの両方の役割を兼ねることも可能である。

「ヘアピン構造」や「シュードノット構造」とは、同一分子内の他の一本鎖領域と対合して形成される安定なループ構造を意味する。

Ｌ型核酸は、化学式（２）

もしくは化学式（３）

で表されるように、核酸を構成する糖であるデオキシリボースもしくはリボースが、天然型のＤ型とは光学異性体の構造を有するＬ型ＤＮＡ、Ｌ型ＲＮＡ、および、その誘導体である。Ｌ型核酸は、一般的に使用されているＤＮＡポリメラーゼに認識されないので、伸長反応の鋳型として機能しない。Ｌ型ＤＮＡは左巻きの二重らせん構造を形成するので、天然に存在するＤ型核酸とハイブリッドを形成することはなく、Ｌ型核酸同士でのみハイブリッドを形成できる。

３−ｄｅｏｘｙ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｄＮは、化学式（４）

で表される３−ｄｅｏｘｙ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｄＡのように、デオキシリボースの３’位に水酸基を有しておらず、２’位と隣のデオキシリボース５’位の間で２’−５’結合により結合している。そのため、ＤＮＡポリメラーゼに認識されないので、伸長反応の鋳型として機能しない。本発明では、３−ｄｅｏｘｙ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｄＮが、２’−５’結合によりプライマーと連結されていることが好ましい。

修飾塩基核酸は、ＤＮＡの塩基部位にｂｉｏｔｉｎ（ビオチン）や発色団などの修飾を有する核酸である。発色団としては、ピレン、エテノ、ピロロ、ぺリレン、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、ダブシル、シアニンなどが挙げられるがそれらに限定しない。修飾塩基核酸の例としては、化学式（５）

で表されるアミノＣ６−ｄＡ、化学式（６）

で表される２−Ｔｈｉｏ−ｄＴ、化学式（７）

で表される４−Ｔｈｉｏ−ｄＴ、化学式（８）

で表されるビオチン−ｄＴ、化学式（９）

で表されるカルボキシ−ｄＴ、化学式（１０）

で表されるピレン−ｄＵ、化学式（１１）

で表されるぺリレン−ｄＵ、化学式（１２）

で表されるピロロ−ｄＣ、化学式（１３）

で表されるエテノ−ｄＡ、化学式（１４）

で表されるＦＩＴＣ−ｄＴ、化学式（１５）

で表されるＴＡＭＲＡ−ｄＴ、化学式（１６）

で表されるダブシル−ｄＴ、ＢＨＱ−１−ｄＴ、Ｃｙ３−ｄＴ、Ｃｙ５−ｄＴなどが挙げられるがこれらに限定されない。これらは塩基部の修飾が立体的な障害となり、ＤＮＡポリメラーゼに認識されないので、伸長反応の鋳型として機能しない。

損傷塩基核酸は、脱塩基ヌクレオチド（ＡＰサイト：脱プリン塩基、脱ピリミジン塩基）、化学式（１７）

で表されるｄＳｐａｃｅｒ、化学式（１８）

で表されるＡｂａｓｉｃや、５−ヒドロキシメチル−ｄＮなど、脱塩基や修飾された塩基を有する核酸である。これらは、一般的に使用されるＤＮＡポリメラーゼでは認識されないので、伸長反応の鋳型として機能しない。

リン酸結合部位修飾核酸は、化学式（１９）

で表される、ホスホロチオエート（Ｓオリゴ）のように、核酸のリン酸基の一部を他の原子や分子で置き換えたもので、ＤＮＡポリメラーゼでは認識されないので、伸長反応の鋳型として機能しない。

ＲＮＡは、化学式（２０）

で示されるように、核酸を構成する糖がリボースからなり、一般的に使用されるＤＮＡポリメラーゼでは認識されないので、伸長反応の鋳型として機能しない。

２’−ＯＭｅ−Ｎは、化学式（２１）

で表される２’−ＯＭｅ−Ｇのように、核酸を構成する糖部が修飾されており、ＤＮＡポリメラーゼでは認識されないので、伸長反応の鋳型として機能しない。

更に、ポリメラーゼによる伸長反応を阻害する非核酸誘導体としては、Ｄ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ骨格、ＰＣｓｐａｃｅｒ、炭素鎖（Ｃ_ｎ）などの脂肪鎖、ペグ鎖（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ、ジスルフィド含有鎖（Ｃ_ｎＳＳＣ_ｎ）、ＰＮＡ、および、それらの誘導体が挙げられるが、ポリメラーゼによる伸長反応を阻害し、当該領域を一本鎖構造に保つことが可能なら特に限定されない。これらの非核酸分子は、核酸とは異なる構造を持つため、ＤＮＡポリメラーゼでは認識されず、伸長反応の鋳型として機能しない。

Ｄ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ（スレオ二ノール）骨格は、化学式（２２）

で示すように、核酸同士をスレオ二ノールで結合した構造をしており、スレオ二ノールのアミノ基に種々の分子を挿入することが可能である。アミノ基を介して結合出来るものであれば特に限定しないが、例えば、ピレン、エテノ、ピロロ、ぺリレン、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｄａｂｃｙｌ、シアニン、ＢＨＱなどの発色団、Ｂｉｏｔｉｎ、ＥＤＴＡの他、化学式（２３）

で表される、アゾベンゼンを挿入することが出来る。

脂肪鎖は、Ｃ_ｎで示すように、炭素鎖が連なった構造、および、その誘導体を示す。ここで、ｎの数は特に限定されないが、１〜４５であることが好ましく、２〜１８であることがより好ましい。例えば、化学式（２４）

で示すような、Ｃ３リンカーや、Ｃ６リンカー、化学式（２５）

で示されるようなＣ１２リンカーが挙げられる。また、誘導体として、化学式（２６）

で表される、ＰＣｓｐａｃｅｒのような構造も挙げられる。

ペグ鎖は、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎで示されるポリエチレングリコールが連なった構造、および、その誘導体を示す。ここで、ｎの数は特に限定されないが、１〜２１であることが好ましく、１〜９であることがより好ましい。例えば、化学式（２７）

で表される、Ｓｐａｃｅｒ９（トリエチレングリコールスペーサー）や、化学式（２８）

で表される、Ｓｐａｃｅｒ１８（ヘキサ−エチレングリコールスペーサー）が挙げられる。

ジスルフィド含有鎖は、Ｃ_ｎＳＳＣ_ｎで示されるジスルフィド結合の構造を有するものを示す。ここで、ｎの数は特に限定されないが、１〜２０であることが好ましく、１〜１２であることがより好ましい。例えば、化学式（２９）

で表される炭素数が３のものが挙げられる。また、ジスルフィド結合を有していれば両側には脂肪鎖やペグ鎖などどの構造を取っていても良い。また、ジスルフィド含有鎖として、化学式（３０）

で表されるような、ジチオールフォスフォロアミダイトなども挙げられる。

ＰＮＡとは主鎖にペプチド構造を保持した、ＤＮＡやＲＮＡに似た構造を持つ分子であり、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンがアミド結合で結合したものが主鎖となっている。そして、核酸塩基に相当するプリン環やピリミジン環が、メチレン基とカルボニル基を介して主鎖に結合している。

ＢＮＡ（ＬＮＡ）とは、化学式（３１）

で表されるように、ＤＮＡもしくはＲＮＡの糖部構造を架橋修飾することによって人工的に合成した核酸を示す。

タグ領域が天然のヌクレオチドのみからなり、タグ領域の核酸の向きがプライマー本体領域と同じ方向である場合には、通常、プライマー領域との間にポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーを要する。一方、タグ領域がＬ型核酸、ＰＮＡ、ＢＮＡなどを含み、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応後も二本鎖化されない場合には、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。また、本発明のプライマーは、逆位構造、ヘアピン構造、シュードノット構造などの安定なループ構造、Ｌ型核酸、３−ｄｅｏｘｙ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｄＮ、修飾塩基核酸、損傷塩基核酸、リン酸結合部位修飾核酸、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅ−Ｎ、ＢＮＡ（ＬＮＡ）、などの核酸誘導体、および、炭鎖、ペグ鎖、ジスルフィド含有鎖、ＰＮＡなどの非核酸誘導体等を単独で有するものであってもよく、複数を組み合わせて有するものであってもよい。

プライマーは、オリゴヌクレオチドの標識に通常用いられる様々な分子により標識することも可能である。このような分子としては、酵素、磁性粒子、蛍光色素、放射性同位元素等が挙げられる。これらを単独で使用してもよく、複数を組み合わせて使用してもよい。

設計したプライマーを製造する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法により製造することができる。具体的には、ＤＮＡ合成装置を用いるか、受託合成サービスを利用することで、設計したプライマーを容易に得ることができる。

核酸増幅法は、上述のプライマーを使用して、両末端に一本鎖領域を有する核酸を得られる方法であれば特に限定されない。例えば、ＰＣＲが挙げられる。また、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などの等温増幅法も用いることが出来る。

核酸増幅法としてＰＣＲを用い、スペーサーを介してタグ領域とプライマーが連結されている場合、ＰＣＲに用いるリバースプライマーとフォワードプライマーの組み合わせとしては、両方のプライマーに異なるスペーサーを用いても良いし、片方にスペーサーを用いて、もう片方にはスペーサーを導入せず、プライマーの５’末端にビオチンなどの修飾を行っても良い。

ＰＣＲ条件は特に限定されるものではなく、上述した試料ＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いてＰＣＲを行ったときに、試料ＤＮＡの所望の領域が増幅される条件であればよい。ＰＣＲに用いるポリメラーゼは、特に限定されるものではないが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましく、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることがより好ましい。このような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｅｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ社製）、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ（東洋紡社製）、Ｐｈｕｓｉｏｎ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ、ＫＯＤ ＦＸ、Ｔｋｓ Ｇｆｌｅｘ等が挙げられるが、これに限定されない。また、温度、時間、緩衝液組成等のＰＣＲの反応条件も特に限定されるものではなく、選択したＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの配列、目的配列部分の長さ等に応じて、適宜設定すればよい。核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡの長さは、２０塩基以上であることが好ましく、４０塩基以上であることがより好ましい。２０塩基未満であると十分な特異性を有するプライマーの設計が困難になり、非特異的増幅が増える傾向がある。

前記プライマーセットを使用して、定法によりＰＣＲを行うことで、標的核酸配列の両末端に一本鎖領域を付加した増幅産物を得ることができる。図４には、増幅反応の一例として、プライマー本体領域とタグ領域からなるプライマーを用いた場合の増幅反応の模式図を示す。フォワードプライマー１０は標的核酸配列９の５’末端側の一部と同一の配列からなるプライマー本体領域１１と、その５’末端側にタグ領域１２を有する。リバースプライマー１３は、標的核酸配列の３’末端側の一部と相補的な配列からなるプライマー本体領域１４と、その５’末端側にタグ領域１５を有する。両プライマーに結合するタグ領域の配列は、それぞれ異なる配列を有することが好ましい。前記プライマーセットを使用してＰＣＲを行うと、両プライマーに付加されたタグ領域は実質的にＰＣＲ反応に関与しないため、両末端に一本鎖領域を有するＤＮＡ増幅産物１６が得られる。両末端に一本鎖領域を有するＤＮＡ増幅断片とは、図４で示すように標的ＤＮＡ領域と同一の二本鎖ＤＮＡ部、および、その両側のそれぞれの５’末端にタグ部として一本鎖領域を有するＤＮＡ増幅産物を意味する。つまり、前記ＤＮＡ増幅断片をより詳細に説明すると、両末端に修飾されていない核酸で構成される一本鎖領域を有する二本鎖ＤＮＡ増幅断片を示しており、かつ、両末端の一本鎖領域はそれぞれ連続するＤＮＡ鎖と同一方向からなる配列を有している。

図５には、増幅反応の一例として、ジョイントプライマーセットとしてプライマー本体領域と共通配列領域からなるプライマー、および、共通配列とタグ領域からなるプライマーを用いた場合の増幅反応の模式図を示す。第１、および、第２プライマーセットを使用して、定法によりＰＣＲを行うことで、標的核酸配列の両末端に一本鎖領域を付加した増幅産物を得ることができる。

フォワード第１プライマー１８は標的核酸配列１７の５’末端側の一部と同一の配列からなるプライマー本体領域１９と、その５’末端側に共通配列領域２０を有する。リバース第１プライマー２１は、標的核酸配列の３’末端側の一部と相補的な配列からなるプライマー本体領域２２と、その５’末端側に共通配列領域２３を有する。両プライマーに付加する共通領域の配列は、それぞれ異なる配列を有することが好ましい。前記第１プライマーセットを利用してＰＣＲ反応を行うと共通領域を有する二本鎖ＤＮＡ増幅産物２４が得られる。

更にＤＮＡ増幅産物２４の両端の共通配列領域のフォワード第２プライマー２５は前記共通領域を有する二本鎖ＤＮＡ増幅産物２４の５’末端側の一部と共通の配列からなるプライマー本体領域２６と、その５’末端側にタグ領域２７を有する。リバース第２プライマー２８は、前記共通領域を有する二本鎖ＤＮＡ増幅産物２４の３’末端側の一部と共通の相補的な配列からなるプライマー本体領域２９と、その５’末端側にタグ領域３０を有する。両プライマーに結合するタグ領域の配列は、それぞれ異なる配列を有することが好ましい。前記プライマーセットを使用してＰＣＲを行うと、両プライマーに付加されたタグ領域は実質的にＰＣＲ反応に関与しないため、両末端に一本鎖領域を有するＤＮＡ増幅産物３１が得られる。本態様においては、第１プライマーを用いたＰＣＲ反応、および、第２プライマーを用いたＰＣＲ反応を図５のように連続して行うが、その順番は、第１プライマーと第２プライマーを同時に加えてもよい。或いは、第２プライマーを後から加えてもよい。

両末端に一本鎖領域を有するＤＮＡ増幅断片とは、図５の３１で示すように標的ＤＮＡ領域と同一の二本鎖ＤＮＡ部、および、その両側のそれぞれの５’末端にタグ部として一本鎖領域を有するＤＮＡ増幅産物を意味する。

第１、および、第２プライマーセットを用いることにより、標的核酸を変更しても、共通配列を同一の配列にしておくことで、第２プライマーは同一のプライマーを使用でき、同一の一本鎖タグ配列を作り出すことが可能となる。前記ＤＮＡ増幅断片をより詳細に説明すると、両末端に修飾されていない核酸で構成される一本鎖領域を有する二本鎖ＤＮＡ増幅断片を示しており、かつ、両末端の一本鎖領域はそれぞれ連続するＤＮＡ鎖と同一方向からなる配列を有している。

前記プライマーを使用して得られた増幅産物の一本鎖領域を利用して、ハイブリダイゼーション複合体を形成する。ハイブリダイゼーションとは核酸を含む分子が相補的に複合体を形成することをいい、ＤＮＡ／ＤＮＡのほか、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ、Ｌ−ＤＮＡ／Ｌ−ＤＮＡなどが含まれる。本発明の核酸検出方法では核酸が一本鎖領域を有するので、核酸増幅工程の後、熱処理等の一本鎖化処理等を行うことなく、ハイブリダイゼーション反応に使用することができる。

両末端に天然のヌクレオチドを含む一本鎖領域タグを有する二本鎖ＤＮＡ増幅断片の一方の一本鎖領域と、捕捉用担体（固相）に固定した第１のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせることができる。更に、二本鎖ＤＮＡ増幅断片の他方の一本鎖領域と、標識物質が直接的又は間接的に結合した第２のオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズする工程を含むことが好ましい。二本鎖ＤＮＡ増幅断片、第１のオリゴヌクレオチドプローブ、および第２のオリゴヌクレオチドプローブからなる三者複合体形成をサンドイッチハイブリダイゼーションと呼ぶ。なお、三者のハイブリダイゼーションの順は特に限定されない。

第１のオリゴヌクレオチドプローブの長さは、二本鎖ＤＮＡ増幅断片の一本鎖領域とハイブリダイズできれば特に限定されないが、５〜６０塩基長であることが好ましく、１０〜４０塩基長であることがより好ましい。

第２のオリゴヌクレオチドプローブの長さは、二本鎖ＤＮＡ増幅断片の一本鎖領域とハイブリダイズできれば特に限定されないが、５〜６０塩基長であることが好ましく、１０〜４０塩基長であることがより好ましい。

第２のオリゴヌクレオチドプローブに結合する標識物質は、二本鎖ＤＮＡ増幅断片の検出を実現するものであれば特に限定されないが、着色担体であって二本鎖ＤＮＡ増幅断片の目視検出を実現できるものであることが好ましい。このような着色担体としては、着色粒子や酵素、色素結合担体などが挙げられる。これらの中でも、着色粒子を用いることが好ましい。

着色粒子としては、金、銀、銅、白金などの金属からなるコロイド粒子や、顔料や染料などでラテックスを着色してなる着色ラテックス、色素分子をシリカ（二酸化ケイ素）粒子内部に固定化したシリカナノ粒子などが挙げられる。これらの中でも、金コロイド粒子や、青色、赤色等に着色された水分散型高分子重合体からなる着色ラテックス粒子を用いることが好ましい。このような着色粒子を用いることにより、ＤＮＡ増幅断片の目視判定をより容易なものとすることができる。特に多項目を同時に検出する際には、項目ごとに異なる色の着色粒子を用いることにより、多数の項目を同時に目視判定することが容易となる。

着色粒子を用いる場合、その粒径は、特に限定されるものではないが、サンドイッチハイブリダイゼーション複合体の形成、および、標的配列を含む増幅産物の固相への捕捉に悪影響が小さく、かつ、検出の際に発色のよいものであることが好ましい。着色粒子の粒径は、後述のクロマトグラフィー用媒体の孔径より小さい粒径から選択される。具体的には、通常５００ｎｍ以下が用いられ、中でも０．１ｎｍ〜１００ｎｍとすることが好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍとすることがより好ましい。着色担体として用いる酵素とは、発色、もしくは、発光する基質の反応を触媒するタンパク質のことである。例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられるが、肉眼で検出可能であればこれに限定されない。

二本鎖ＤＮＡ増幅断片の末端の一本鎖領域と、第１又は第２のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが起こる条件であれば特に限定されないが、室温下、１０ｍＭリン酸緩衝液中で反応させることが好ましい。このとき塩化ナトリウム等の塩を入れることで、ハイブリダイゼーションの効率は上昇する。

捕捉用担体（固相）上の認識可能な位置に形成されたサンドイッチハイブリダイゼーション複合体に含まれる標識物質を検出することにより、標的核酸の有無を判定することができる。検出は、目視にて判別することが好ましい。また、検出は、可視光下で行われることが好ましい。可視光とは特に波長が３８０〜８００ｎｍの光を指す。本発明の検出法によれば、核酸増幅反応の増幅産物は熱変性等の一本鎖化処理を行うことなく、そのままハイブリダイゼーション反応に使用することが可能である。また、特殊な装置を必要とすることなく、標的核酸の有無を簡便、迅速に目視にて判別することが可能である。

上記のサンドイッチハイブリダイゼーション複合体の形成による核酸検出方法は、核酸検出デバイス上で行われることが好ましい。また、核酸検出デバイスとしては、特に限定されないが、二本鎖ＤＮＡ増幅断片の末端に有する一本鎖タグ領域の少なくとも一部と相補的な配列を有する捕捉用オリゴヌクレオチドプローブを担持しているデバイスが好ましい。例えば、クロマトグラフィー、アレイ、ビーズ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

図６の核酸クロマトグラフィーデバイスは、基材となる部材３６の上に、サンプルパッド３２（ＤＮＡ増幅産物を添加するための担体）、コンジュゲートパッド３３（着色担体結合オリゴヌクレオチドを配置した担体）、捕捉用オリゴヌクレオチドを保持した担体３４（クロマトグラフィー用媒体）、および吸収パッド３５を、粘着剤等を用いて貼り合わせたものである。担体３４の上には、捕捉用オリゴヌクレオチドを塗布したテストライン３７、および、コントロールライン３８が設けられている。着色担体結合オリゴヌクレオチドを展開溶液に混合する場合は、コンジュゲートパッド３３が無くても良い。

クロマトグラフィーでは、下記工程（ａ）〜（ｃ）：（ａ）核酸検出デバイス上の、第１のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域とは異なる領域に、ＤＮＡ増幅断片を配置する工程、（ｂ）溶媒を用いて、ＤＮＡ増幅断片を、第１オリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域の方向に、デバイス上で拡散させる工程、および（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域において、第１オリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ増幅断片とをハイブリダイズさせる工程、を含む方法により、二本鎖ＤＮＡ増幅断片が検出されることが好ましい。

例えば、図６の核酸クロマトグラフィーデバイスの場合、工程（ａ）ではサンプルパッド３２にＤＮＡ増幅断片を配置する。工程（ｂ）では矢印方向にＤＮＡ増幅断片を拡散させる。工程（ｃ）ではテストライン３７において、固定された第１のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイズにより、ＤＮＡ増幅断片を捕捉する。

工程（ｃ）の前に、ＤＮＡ増幅断片と、標識物質が結合した第２のオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせる工程を更に含むことが好ましい。例えば、図６の核酸クロマトグラフィーデバイスの場合、コンジュゲートパッド３３において、ＤＮＡ増幅断片と第２のオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせる。

また、クロマトグラフィーでは、（ｄ）核酸検出デバイス上の、第１のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域とは各々異なる領域に、ＤＮＡ増幅断片、および標識物質が結合した第２のオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ配置し、（ｅ）溶媒を用いて、ＤＮＡ増幅断片を、標識物質が結合した第２のオリゴヌクレオチドプローブが配置されている領域の方向に拡散させ、（ｆ）標識物質が結合した第２のオリゴヌクレオチドプローブが配置されている領域において、ＤＮＡ増幅断片と、標識物質が結合した第２のオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせ、（ｇ）工程（ｆ）でハイブリダイズした複合体を第１のオリゴヌクレオチドプローブが配置されている方向に、展開媒体上で拡散させ、（ｈ）前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域において、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブと前記複合体とをハイブリダイズさせることが好ましい。

例えば、図６の核酸クロマトグラフィーデバイスの場合、工程（ｄ）ではサンプルパッド３２にＤＮＡ増幅断片を配置し、コンジュゲートパッド３３に第２のオリゴヌクレオチドプローブを配置する。工程（ｅ）では、ＤＮＡ増幅断片を、サンプルパッド３２から矢印方向に拡散させる。工程（ｆ）ではコンジュゲートパッド３３において、ＤＮＡ増幅断片と、第２のオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする。工程（ｇ）ではＤＮＡ増幅断片と、標識物質が結合した第２のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイズによる複合体を、矢印方向に拡散させる。工程（ｈ）ではテストライン３７において第１のオリゴヌクレオチドプローブと複合体とをハイブリダイズさせる。

メンブレン上のテストラインには前記ＤＮＡ増幅断片の一方のタグ領域と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが、捕捉用の第１のオリゴヌクレオチドプローブとして固定化されている。捕捉用の第１のオリゴヌクレオチドプローブは、直接メンブレンに結合しても良く、官能基を介して結合していても良く、何らかの物質を介してメンブレンに結合していても良い。その仲介となる物質は、ペプチド、タンパク質、核酸などが挙げられるが限定されない。仲介となる物質がアビジンの場合は、捕捉用オリゴヌクレオチドにビオチン修飾が必要となる。

メンブレン上のコントロールラインには、着色担体捕捉用のオリゴヌクレオチドプローブが固定化されている。コントロールライン用のオリゴヌクレオチドプローブは、標識物質が結合した第２のオリゴヌクレオチドプローブと相補的な配列を有しており、溶液が展開すると必ず標識物質が捕捉されるようになっている。コントロールライン用のオリゴヌクレオチドプローブに関しても前述と同様に直接メンブレンに結合しても良いし、官能基を介して、結合していても良いし、何らかの物質を介してメンブレンに結合していても良い。その仲介となる物質は、ペプチド、タンパク質、核酸などが挙げられるが、限定されない。仲介となる物質がアビジンの場合は、捕捉用オリゴヌクレオチドにビオチン修飾が必要となる。

テストラインにおける呈色により、試料中のターゲット核酸の存在を目視で判別することが可能である。一方、コントロールラインにおける呈色により、正常な展開と呈色反応が行えていることを目視で判別することが可能である。ここで、目視とは肉眼で観察して色を判断することをいう。また、判別は、可視光下で行われることが好ましい。可視光とは特に波長が３８０〜８００ｎｍの光を指す。

クロマトグラフィー用媒体としては、定性濾紙、定量濾紙、分液濾紙、硝子繊維濾紙、シリカ繊維濾紙、複合繊維濾紙よりなる濾紙などが挙げられる。また、ニトロセルロースなどのセルロースよりなる濾紙や、ポリエーテルスルフォンメンブレンなどの合成樹脂の膜や、シリカゲル、アガロース、デキストラン、ゼラチンなどの多孔質ゲルも使用することができる。また、ナイロンメンブレンも好適に使用できる。実際の使用に際して、このクロマトグラフ媒体の形態および大きさは特に制限されるものではなく、操作および反応結果の観察において適切であればよい。

これらの担体は、親水性や化合物の結合性を向上させるために様々な修飾を施すことも可能である。操作をより簡便にするためには、反応部位が表面に形成されているクロマトグラフィー媒体の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。

デバイス内の展開方向としては、図６に示すように水平方向でも良いし、垂直方向でも良く特に限定されない。展開溶媒としては、核酸増幅反応における溶媒を使用することができるので、核酸増幅反応後の反応液をそのまま、図６におけるサンプルパッド３２に滴下することができる。または、増幅反応後の反応液に、別途展開溶液を添加しサンプルパッドに添加することも可能である。展開溶媒としては、液体であれば特に限定されないが、リン酸緩衝液や、Ｔｒｉｓ緩衝液などのグッド緩衝液が使用可能である。また、溶媒には塩、界面活性剤、タンパク質、もしくは、核酸を溶解しておいても良い。

図７にて、本発明の実施形態の一例として、クロマト担体上でのサンドイッチハイブリダイゼーション複合体の形成を例にとって説明する。核酸増幅工程で得られたＤＮＡ増幅断片１６は、熱処理等の一本鎖化処理等を行うことなく次の複合体形成工程に使用する。前記ＤＮＡ断片の一方のタグ領域１２と特異的に結合可能な核酸配列３９および着色担体４０を含むオリゴヌクレオチドプローブと、ＤＮＡ増幅断片１６との間のハイブリダイゼーションにより、第１の複合体４１が形成される。複合体４１は、ＰＣＲの反応容器のように、展開媒体にアプライ前に形成してもよいし、ＤＮＡ増幅断片を担体上にアプライし、毛細管現象で移動中に前記標識分子結合オリゴヌクレオチドを塗布、乾燥させた担体を通過させて形成することも可能である。

複合体４１は、多孔質メンブレン等からなるクロマトグラフィー用媒体４２上の識別可能な位置に予め結合した捕捉用オリゴヌクレオチドプローブ４３と、展開媒体上で接触する。前記捕捉用のオリゴヌクレオチド４３は、前記ＤＮＡ増幅断片のもう一方のタグ配列１５と相補的な配列を有しており、複合体４１と捕捉用オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、サンドイッチハイブリダイゼーション複合体が形成される。

サンドイッチハイブリダイゼーション複合体を形成する順序は特に限定されない。ＤＮＡ増幅断片と標識物質が結合した第２のオリゴヌクレオチドプローブとの複合体４１を形成後、捕捉用の第１のオリゴヌクレオチドプローブとの複合体を形成するのが好ましいが、ＤＮＡ増幅断片を捕捉用の第１のオリゴヌクレオチドプローブで展開媒体上で濃縮後、標識物質が結合した第２のオリゴヌクレオチドを展開し、サンドイッチハイブリダイゼーション複合体を形成することも可能である。

その他の核酸検出デバイスの形態としては、アレイが挙げられる。アレイとしては、図８で示すようなマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）が挙げられる。マイクロアレイ４４上の捕捉用オリゴヌクレオチドを固定したウェル内に、サンドイッチハイブリダイゼーションにより三者複合体を形成させることが可能である。

また、図９で示すようなビーズ形態が挙げられる。捕捉用オリゴヌクレオチドを保持したビーズ担体４５上で、サンドイッチハイブリダイゼーションによる三者複合体を形成させることが可能である。

前記核酸検出方法、および核酸検出デバイスは、核酸増幅法により得られた核酸（例えば、ＰＣＲ産物）を検出することを含むあらゆる分野の技術に用いることができる。具体的には、例えば、分子生物学の研究分野、病原体の検出、アレルゲンなど食品中の混入物の検出、食品の品質管理（偽装表示食品、遺伝子組み換え食品などの検査）、家畜管理、遺伝子変異（一塩基多型（以下、「ＳＮＰ」ともいう）、挿入、欠失）の検出、染色体欠失変異の検出、ガンなどの疾患検査等に用いることができる。したがって、本発明には、本発明にかかる核酸検出方法を一工程として含む、病原体による感染症の検出方法、食品中の混合物（例えば、アレルゲン）の検出方法、食品の品質管理、家畜の管理方法、および塩基多型の検出方法等も含まれる。

ここで、本発明の利用の一実施形態として、本発明にかかる病原体の検出方法、およびアレルゲンの検出方法、について詳細に説明する。

病原体の検出方法は、本発明にかかる核酸検出方法を用いて、病原体が特異的に有する遺伝子を検出する工程を含んでいればよい。上記病原体は、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、病原性細菌、病原性ウイルス、食中毒細菌、院内感染原因細菌およびウイルス等を挙げることができる。より具体的には、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等のウイルス、Ｏ１５７等の大腸菌、結核菌、チフス菌、サルモネラ菌もしくは腸炎ビブリオ菌等の細菌、またはマイコプラズマ等の微生物を例示することができる。

病原体の検出方法について、より具体的に説明すると、例えば、病原体の有無を検査する対象となる試料から調製したＤＮＡ試料に、上記病原体が特異的に有する遺伝子が含まれるか否かを上記核酸検出方法を用いて判定する。また、ＤＮＡ試料を調製することなく、病原体の有無を検査する対象となる試料をそのまま核酸増幅法の鋳型として使用することもできる。例えば、病原体として大腸菌等の細菌を検出する場合に、細菌のコロニーの懸濁液を鋳型として使用することができる。その結果、病原体が特異的に有する遺伝子が検出された場合には、該試料には病原体が含まれていると判定する。これにより、特殊な装置を必要とすることなく、簡便に、かつ、高精度に、試料中に病原体が含まれているか否かを判定することができる。すなわち、本発明にかかる病原体の検出方法は、微生物の感染症の診断に用いることができる。

アレルゲンの検出方法は、本発明にかかる核酸検出方法を用いて、アレルゲンをコードする遺伝子を検出する工程を含んでいればよい。上記アレルゲンは特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、食品中に含まれるアレルゲンを挙げることができる。より具体的には、卵白アレルゲン、乳アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲン、および落花生アレルゲン等を挙げることができる。アレルゲンの検出方法について、より具体的に説明すると、例えば、食品から調製したＤＮＡ試料に、卵、乳、小麦、そば、落花生などのアレルゲンをコードする遺伝子が含まれるか否かを上記核酸検出方法を用いて判定する。その結果、このような遺伝子が検出された場合には、該食品には、アレルゲンを含有する原料が含まれていると判定する。

これにより、特殊な装置を必要とすることなく、簡便に、かつ、高精度に食品等の試料中に、アレルゲンを含有する原料が含まれているか否かを判定することができる。なお、アレルゲンの由来は、上記例示したものに限定されるものではなく、例えば、穀類を例に取れば、イネ、トウモロコシ、アワ、キビ、ヒエ、ソバ、およびマメ類のすべてが含まれる。ＤＮＡは、熱に安定であり、加工食品中でも微量に検出されるので、前記アレルゲンの検出方法により得られたデータは、食品の表示に利用したり、食品のアレルギー情報として利用したりすることに加えて、加工助剤やキャリーオーバー等食品添加物のごく微量の残存、あるいは製造ライン問の相互汚染の有無等の生産者の意図していない物質の混入の検出に用いることができる。

そのほか、本発明の核酸の検出方法は、ヒトを含む哺乳動物の親子鑑定、家畜の血統の特定、農産物の品種の特定、ＳＮＰ検出、遺伝子の変異による疾患（癌など）の検出等に用いることができる。具体的には、例えば、家畜についていえば、血統登録、個体識別、親子判定、病原遺伝子のキャリア個体の除去などの目的に利用することができる。なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示した技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。

参考例

各種スペーサーによる伸長反応阻害効果の確認
（１）各種プライマーの合成
本参考例では、テンプレートとしてｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を用い、ＰＣＲ増幅により約３３０塩基対が増幅するようにフォワードプライマーＦおよびリバースプライマーＲを設計した。

更に、プライマーＦの５’末端側にタグ配列（Ｔａ）と３１種類のスペーサーのいずれか（Ｓｘ）が導入されたタグ付きプライマーＴａ−Ｓ１−Ｆ〜Ｔａ−Ｓ３１−Ｆを設計した。

スペーサーを含まないフォワードプライマーとして、５’末端側にタグ配列（Ｔａ）のみ付加されたプライマーＴａ−Ｆ、５’末端側にＢｉｏｔｉｎ修飾されたプライマーｍＴａ−Ｆ、３’末端側にＦＩＴＣ修飾されたプライマーＴａ−Ｆｍを設計した。設計したフォワードプライマーを表１に示す。

表１のＳ１〜Ｓ３１のスペーサーの構造は、前記化学式（１）〜（３１）とそれぞれ対応している。これらタグ付きプライマーの合成は、つくばオリゴサービス株式会社の受託合成システム、もしくは、ＥＵＲＯＧＥＮＴＥＣ社の受託合成システムを利用して購入した。
フォワードプライマーＦ：５’−^Ｄｄ（ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号１）
リバースプライマーＲ：５’−^Ｄｄ（ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ）−３’（配列番号２）
タグ配列Ｔａ：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ）−３’（配列番号３）
プライマーＴａ−Ｓｘ−Ｆ：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ Ｓｘ ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号４）
プライマーＴａ−Ｆ：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号５）
プライマーｍＴａ−Ｆ：５’−Ｂｉｏｔｉｎ−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号６）
プライマーＴａ−Ｆｍ：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−ＦＩＴＣ−３’（配列番号７）

（２）各種プライマーセットを用いたＰＣＲ反応
前記工程（１）で作製したプライマーを用いたＰＣＲ反応を行った。２０ｐｍｏｌのフォワードプライマーＴａ−Ｓ１−Ｆ〜Ｔａ−Ｓ３１−Ｆ、Ｔａ−Ｆ、ｍＴａ−Ｆ、Ｔａ−Ｆｍのいずれか、２０ｐｍｏｌのリバースプライマーＲ、および１０ｐｇのｐＵＣ１９を０．２ｍｌのＰＣＲ用チューブに入れ、ＥｘＴａｑ ＰＣＲキット（タカラバイオ社製）の説明書に従い、１００μｌのＰＣＲ反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステム社製）にセットし、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３５回行い、目的の約３３０ｂｐの核酸を増幅した。

（３）アガロースゲル電気泳動
１×ＴＡＥバッファー（ニッポンジーン社製）とアガロース（和光純薬社製）を用いて、２％アガロースゲルを作製した。ゲルを電気泳動槽に入れ、１×ＴＡＥバッファーで満たした後、前記工程（２）で得られたＰＣＲ反応液を５μｌとローディングバッファー１μｌを混合し、ゲルのウェルにアプライした。１００Ｖの電圧をかけて３０分間泳動を行った後、臭化エチジウムブロマイド溶液（ナカライテスク社製）にゲルを浸して、１５分間染色を行った。染色後ＵＶ照射撮影装置を用いて、２５４ｎｍのＵＶを照射し、二本鎖ＤＮＡの増幅産物の確認を行った。

その結果、それぞれ一本の増幅産物が確認できた。ただし、３’末端を修飾し、スペーサーを含まないフォワードプライマーＴａ−Ｆｍを用いた反応だけは、増幅産物が確認できなかった。

（４）変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（変性ＰＡＧＥ）
前記工程（２）で得られたＰＣＲ反応液を７μｌずつＰＣＲチューブに取り、ＴＢＥ−Ｕｒｅａ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）７μｌと混合した。その混合液を７０℃、３分間熱処理を行った。電気泳動槽に６％ ＴＢＥ−Ｕｒｅａ Ｇｅｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をセットし、ＴＢＥバッファー（１．０８％（ｗ／ｖ）トリス、０．５５％（ｗ／ｖ）ホウ酸、０．０３７％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ・２Ｎａ（２Ｈ_２Ｏ））を泳動槽に入れた。熱処理を行った増幅産物を各ウェルにアプライした。

１８０Ｖの条件で、６０分間電気泳動を行った後、臭化エチジウムブロマイド溶液（ナカライテスク社製）にゲルを浸して、１５分間染色を行った。染色後ＵＶ照射撮影装置を用いて、２５４ｎｍのＵＶを照射し、変性して一本鎖となった増幅産物の確認を行った。フォワードプライマーとして（ｉ）プライマーＴａ−Ｆ、（ｉｉ）プライマーＴａ−Ｓ１−Ｆ、（ｉｉｉ）プライマーＴａ−Ｓ２０−Ｆ、（ｉｖ）プライマーＴａ−Ｓ２３−Ｆを用いた時のＰＣＲ増幅産物の泳動結果を、代表例として図１０に示す。

変性ＰＡＧＥを用いてＰＣＲ増幅産物を電気泳動した場合、スペーサーを含まないフォワードプライマーを使用して得られたＰＣＲ増幅産物では、一本のバンドが確認された。スペーサーを含むフォワードプライマーを使用して得られたＰＣＲ増幅産物では、二本のバンドが確認された。

アガロースゲル電気泳動と変性ＰＡＧＥの両方の結果において一本のバンドが確認されたＰＣＲ増幅産物では、完全に末端まで二本鎖となった増幅産物が得られている。アガロースゲル電気泳動の結果において一本のバンドが確認され、変性ＰＡＧＥの結果において二本のバンドが確認されたＰＣＲ産物では、異なる長さの一本鎖ＤＮＡが会合して二本鎖を形成しており、ポリメラーゼによる伸長反応がスペーサーで阻害され、一本鎖のタグを末端に有する二本鎖の増幅産物が得られたことが確認できた。

各スペーサーを有するフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行った結果を表１に示す。

各種スペーサー付加プライマーセットを用いたクロマトグラフィー検出
（１）各種プライマーセットを用いたＰＣＲ反応
リバースプライマーにＴｍ−Ｓ１−Ｒを用いること以外は、参考例の工程（１）と同様にＰＣＲ反応を行い、目的の３３０ｂｐの増幅産物を増幅した。
タグ配列Ｔｍ：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ）−３’（配列番号８）
プライマーＴｍ−Ｓ１−Ｒ：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ Ｓ１ ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ）−３’（配列番号９）

（２）金コロイド結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
Ｇｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ（４０ｎｍ、９．０×１０^１０（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）とチオール基含有オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号５、タグＴａ配列番号３の相補鎖）を混合し、５０℃で１６時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む５ｍＭリン酸（ｐＨ７）バッファーを添加し混和後、再度５０℃で４０時間インキュベートした。

インキュベート後、遠心（６０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ１：５’−Ｄｄ（ＣＴＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡ）−ＳＨ−３’（配列番号１０）

（３）オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号８に相補的な配列（配列番号１１）を有する３’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブを、ストレプトアビジンと混合する。その混合液をニトロセルロースメンブレン（商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ １８０、ミリポア社製）にディスペンサーを用いてライン上に塗布し、４０℃で３０分間風乾した。
オリゴヌクレオチドプローブ２：５’−Ｄｄ（ＧＡＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＧＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＣＣ）−Ｂｉｏｔｉｎ−３’（配列番号１１）

（４）核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図６に示す様に貼り合わせ、各種タグ付きプライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

（５）テストストリップによるＰＣＲ産物の検出
工程（１）で作製したＰＣＲ産物を変性することなく、それぞれ直ちに工程（４）で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、５〜１５分と短時間であった。

結果を表１に示す。表１において、工程（１）で検体としてｐＵＣ１９を添加してＰＣＲ反応を行った場合にテストストリップ上に標的核酸特異的な着色ラインが検出され、かつ、ネガティブコントロールとして水を添加した場合にラインの着色検出は認められなかったプライマーを「○」と記載した。フォワードプライマーとして（ｉ）プライマーＴａ−Ｆ、（ｉｉ）プライマーＴａ−Ｓ１−Ｆ、（ｉｉｉ）プライマーＴａ−Ｓ２０−Ｆ、（ｉｖ）プライマーＴａ−Ｓ２３−Ｆを用いた時のＰＣＲ増幅産物のクロマトグラフィー様テストストリップの検出結果を、代表例として図１１に示す。

各種スペーサー付加プライマーセットを用いたアレイ検出
（１）オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号８に相補的な配列（配列番号１１）を有する３’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブを、ストレプトアビジンと混合する。その混合液をニトロセルロースメンブレン（商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ １８０、ミリポア社製）に１μｌスポットし、４０℃で３０分間風乾した。このプローブ固定化メンブレンを、各種タグ付きプライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用アレイとして用いる。

（２）ドットブロット法によるＰＣＲ産物の検出
実施例１の工程（１）で作製したＰＣＲ産物を変性することなく、それぞれ直ちに工程（１）で作製したアレイ上にアプライし、更に実施例１の工程（２）で作製した金コロイド溶液を滴下して１５〜２０分静置し、アレイによる検出を行った。アレイを用いたドットブロット法による検出に要した時間は、１５〜２０分と短時間であった。

結果を表１に示す。表１において、検体としてｐＵＣ１９を添加した場合にアレイ上に標的核酸特異的な着色スポットが検出され、かつ、ネガティブコントロールとして水を添加した場合にスポットの着色検出は認められなかったプライマーを「○」と記載した。

種々のＰＣＲキットを用いた実験
ＥＸ Ｔａｑ以外のＰＣＲキットとして、ＫＯＤ ｐｌｕｓ、Ｐｈｕｓｉｏｎ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ、ＫＯＤ ＦＸ、Ｔｋｓ Ｇｆｌｅｘを用いて参考例、および実施例１〜２と同様の実験を行ったところ、ＥＸ Ｔａｑ ＰＣＲを使用した場合と同様の結果が確認された。

（１）Ｌ−ＤＮＡタグ付きプライマーの合成
本実施例では、テンプレートとしてｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を用い、ＰＣＲ増幅により約３３０塩基対が増幅するようにフォワードプライマー（Ｆ）およびリバースプライマー（Ｒ）を参考例と同様に設計した。更にそれぞれの５’末端側に非天然型（Ｌ型）ＤＮＡ鎖からなるタグ配列Ｔ１およびＴ２を導入したＬ−ＤＮＡタグ付きプライマー、Ｔ１−ＦおよびＴ２−Ｒを設計した。Ｌ−ＤＮＡタグ付きプライマーの合成は、０．２μＭスケールのカラムを用いて、一般的なホスホロアミダイト法に基づいて、ＤＮＡ自動合成機（Ｈ−８−ＳＥ：Ｇｅｎｅ Ｗｏｒｌｄ）で合成した。

本検討で作製したプライマーセットを示す。
タグ配列Ｔ１：５’−^Ｌｄ（ＧＡＣＡＡＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡ）−３’（配列番号１２）
タグ配列Ｔ２：５’−^Ｌｄ（ＡＴＧＣＴＡＣＣＧＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＧ）−３’（配列番号１３）
プライマーＴ１−Ｆ：５’−^Ｌｄ（ＧＡＣＡＡＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡ）−^Ｄｄ（ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号１４）
プライマーＴ２−Ｒ：５’−^Ｌｄ（ＡＴＧＣＴＡＣＣＧＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＧ）−^Ｄｄ（ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ）−３’（配列番号１５）

（２）Ｌ−ＤＮＡタグ付きプライマーセットを用いたＰＣＲ反応
前記工程（１）で実施し作製したプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行った。プライマーＴ１−ＦとプライマーＴ２−Ｒを各１５ｐｍｏｌと、１０ｎｇのｐＵＣ１９とを０．２ｍｌのＰＣＲ用チューブに入れ、ＥｘＴａｑ ＰＣＲデバイス（タカラバイオ社製）の説明書に従い、１００μｌのＰＣＲ反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステム社製）にセットし、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３５回行い、目的の約３３０ｂｐを増幅した。また、ｐＵＣ１９を添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。

（３）ラテックス結合Ｌ型オリゴヌクレオチドプローブの作製
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス（固形分１０％（ｗ／ｗ）、Ｂａｎｇｓ社製）とアミノ基含有Ｌ型オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１６、配列番号１２の相補鎖）を、水溶性カルボジイミドを必要量添加したＭＥＳ緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、グラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
ヌクレオチドプローブ３：５’−^Ｌｄ（ＴＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＧＴＣ）−ＮＨ_２−３’（配列番号１６）

（４）Ｌ型オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
カルボキシル基修飾ナイロンメンブレン（日本ポール社製、６ｍｍｘ６０ｍｍ）を水溶性カルボジイミドにより処理し、脱イオン水で洗浄した。活性化したメンブレンの一端から３０ｍｍの箇所に、配列番号１３に対して相補的な配列（配列番号１７）を有するアミノ基含有Ｌ型オリゴヌクレオチドプローブを、ディスペンサーを用いてライン上に塗布し、１５分間風乾した。その後、メンブレンをＴｒｉｓ緩衝液で処理し、ブロッキング後、メンブレンを水洗、乾燥した。
ヌクレオチドプローブ４：５’−^Ｌｄ（ＣＡＣＴＧＧＧＣＡＴＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴ）−ＮＨ_２−３’（配列番号１７）

（５）核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したナイロンメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図６に示す様に貼り合わせ、Ｌ型ＤＮＡタグ付きプライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

（６）テストストリップによるＰＣＲ産物の検出
工程（２）で作製したＰＣＲ産物を変性することなく、直ちに工程（５）で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。工程（２）で検体としてｐＵＣ１９を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、１０〜１５分と短時間であった。

（１）ヘアピンタグ付きプライマーの合成
参考例の工程（１）と同様に、テンプレートとしてｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を用い、ＰＣＲ増幅により約３３０塩基対が増幅するようにフォワードプライマー（Ｆ）およびリバースプライマー（Ｒ）を設計した。その５’末端側にヘアピン構造を有するポリメラーゼ反応阻害領域（Ｈ）、およびタグ配列Ｔ３およびＴ４を導入したタグ付きプライマー、Ｔ３−Ｈ−ＦおよびＴ４−Ｈ−Ｒを合成した。

本検討で作製したプライマーセットを示す。
ポリメラーゼ反応阻害配列Ｈ：５’−^Ｄｄ（ＡＧＧＣＧＡＧＧＴＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＧＣＧＣＴＣＧＣＧＡＣＣＴＣ ＧＣＣＴ）−３’（配列番号１８）
タグ配列Ｔ３：５’−^Ｄｄ（ＴＡＴＧＡＴＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＧＣＡＴＡＡＴ）−３’（配列番号１９）
タグ配列Ｔ４：５’−^Ｄｄ（ＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＴＴＧＣＴＣＡＡＴ）−３’（配列番号２０）
プライマーＴ３−Ｈ−Ｆ：５’− ^Ｄｄ（ＴＡＴＧＡＴＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＧＣＡＴＡＡＴＡＧＧＣＧＡＧＧＴＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧ ＴＧＣＧＣＴＣＧＣＧＡＣＣＴＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号２１）
プライマーＴ４−Ｈ−Ｒ：５’− ^Ｄｄ（ＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＴＴＧＣＴＣＡＡＴＡＧＧＣＧＡＧＧＴＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＧＣ ＧＣＴＣＧＣＧＡＣＣＴＣＧＣＣＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ）−３’（配列番号２２）

（２）ヘアピンタグ付きプライマーセットを用いたＰＣＲ反応
前記工程（１）で実施し作製したプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行った。プライマーＦとプライマーＲを各１５ｐｍｏｌと、１０ｎｇのｐＵＣ１９とを０．２ｍｌのＰＣＲ用チューブに入れ、ＥｘＴａｑ ＰＣＲデバイス（タカラバイオ社製）の説明書に従い、１００μｌのＰＣＲ反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステム社製）にセットし、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３５回行い、目的の約３３０ｂｐを増幅した。また、ｐＵＣ１９を添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。

（３）ラテックス結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス（固形分１０％（ｗ／ｗ）、Ｂａｎｇｓ社製）とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２３、配列番号１９の相補鎖）を、水溶性カルボジイミドを必要量添加したＭＥＳ緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、グラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ５：５’−^Ｄｄ（ＡＴＴＡＴＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣＡＴＡ）−ＮＨ_２−３’（配列番号２３）

（４）オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
カルボキシル基修飾ナイロンメンブレン（日本ポール社製、６ｍｍｘ６０ｍｍ）を水溶性カルボジイミドにより処理し、脱イオン水で洗浄した。活性化したメンブレンの一端から３０ｍｍの箇所に、配列番号２０の相補的な配列（配列番号２４）を有するアミノ基含有Ｌ型オリゴヌクレオチドプローブを、ディスペンサーを用いてライン上に塗布し、１５分間風乾した。その後、メンブレンをＴｒｉｓ緩衝液で処理し、ブロッキング後、メンブレンを水洗、乾燥した。
オリゴヌクレオチドプローブ６： ５’−^Ｄｄ（ＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡ）−ＮＨ_２−３’（配列番号２４）

（５）核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したナイロンメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図６に示す様に貼り合わせ、ヘアピンタグ付きプライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

（６）テストストリップによるＰＣＲ産物の検出
工程（２）で作製したＰＣＲ産物を変性することなく、直ちに工程（５）で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。工程（２）で検体としてｐＵＣ１９を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、１０〜１５分と短時間であった。

（１）人工核酸（アゾベンゼン）挿入プライマーの合成
参考例の工程（１）と同様に、テンプレートとしてｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を用い、ＰＣＲ増幅により約３３０塩基対が増幅するようにフォワードプライマー（Ｆ）およびリバースプライマー（Ｒ）を設計した。それぞれの５’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域（Ｘ）、およびタグ配列Ｔ５およびＴ６を導入したタグ付きプライマー、Ｔ５−Ｘ−ＦおよびＴ６−Ｘ−Ｒを合成した。この２種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。本検討で作製したプライマーセットを示す。
タグ配列Ｔ５：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ）−３’（配列番号２５）
タグ配列Ｔ６：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ）−３’（配列番号２６）
プライマーＴ５−Ｘ−Ｆ：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ Ｘ ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号２７）
プライマーＴ６−Ｘ−Ｒ：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ Ｘ ＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ）−３’（配列番号２８）
なお、プライマーに挿入されたアゾベンゼンは前記化学式（２３）で表される。

（２）アゾベンゼン挿入プライマープセットを用いたＰＣＲ反応
前記工程（１）で実施し作製したプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行った。プライマーＴ５−Ｘ−ＦとプライマーＴ６−Ｘ−Ｒを各１５ｐｍｏｌと、１０ｎｇのｐＵＣ１９とを０．２ｍｌのＰＣＲ用チューブに入れ、ＥｘＴａｑ ＰＣＲデバイス（タカラバイオ社製）の説明書に従い、１００μｌのＰＣＲ反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステム社製）にセットし、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３５回行い、目的の約３３０ｂｐを増幅した。また、ｐＵＣ１９を添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。

（３）ラテックス結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス（固形分１０％（ｗ／ｗ）、Ｂａｎｇｓ社製）とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２９、配列番号２５の相補鎖）を、水溶性カルボジイミドを必要量添加したＭＥＳ緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、グラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ７：５’−^Ｄｄ（ＣＴＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡ）−ＮＨ_２−３’（配列番号２９）

（４）オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
カルボキシル基修飾ナイロンメンブレン（日本ポール社製、６ｍｍｘ６０ｍｍ）を水溶性カルボジイミドにより処理し、脱イオン水で洗浄した。活性化したメンブレンの一端から３０ｍｍの箇所に、配列番号２６の相補的な配列（配列番号３０）を有するアミノ基含有Ｄ型オリゴヌクレオチドプローブを、ディスペンサーを用いてライン上に塗布し、１５分間風乾した。その後、メンブレンをＴｒｉｓ緩衝液で処理し、ブロッキング後、メンブレンを水洗、乾燥した。
オリゴヌクレオチドプローブ８：５’−^Ｄｄ（ＧＡＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＧＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＣＣ）−ＮＨ_２−３’（配列番号３０）

（５）核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したナイロンメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図６に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

（６）テストストリップによるＰＣＲ産物の検出
工程（２）で作製したＰＣＲ産物を変性することなく、直ちに工程（５）で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。工程（２）で検体としてｐＵＣ１９を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、１０〜１５分と短時間であった。

（１）金コロイド結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
Ｇｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ（４０ｎｍ、９．０×１０^１０（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）とチオール基含有オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３１、配列番号２５の相補鎖）を混合し、５０℃で１６時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去、０．０５Ｍ 塩化ナトリウム、５ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７を添加し混和後、再度５０℃で４０時間インキュベートした。

インキュベート後、遠心（６０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。
調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ７：５’−^Ｄｄ（ＣＴＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡ）−ＳＨ−３’（配列番号３１）

（２）オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号２６に相補的な配列（配列番号３１）を有する３’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブを、ストレプトアビジンと混合する。その混合液をニトロセルロースメンブレン（商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ １８０、 ミリポア社製）にディスペンサーを用いてライン上に塗布し、４０℃で３０分間風乾した。
オリゴヌクレオチドプローブ１０：５’−^Ｄｄ（ＧＡＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＧＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＣＣ）−Ｂｉｏｔｉｎ−３’（配列番号３２）

（３）核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図６に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

（４）テストストリップによるＰＣＲ産物の検出
実施例６の工程（２）で作製したＰＣＲ産物を変性することなく、直ちに工程（３）で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。実施例６の工程（２）で検体としてｐＵＣ１９を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、１０〜１５分と短時間であった。

（１）オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号２６に相補的な配列（配列番号３３）を有するオリゴヌクレオチドプローブをＵｌｔｒａＢｉｎｄアフィニティメンブレン（日本ポール社製）にディスペンサーを用いてライン上に塗布し、８０℃で１時間風乾した。
オリゴヌクレオチドプローブ１１：５’−^Ｄｄ（ＧＡＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＧＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＣＣ）−３’（配列番号３３）

（２）核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したＵｌｔｒａＢｉｎｄアフィニティメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図６に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

（３）テストストリップによるＰＣＲ産物の検出
実施例６の工程（２）で作製したＰＣＲ産物を変性することなく、直ちに工程（２）で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。実施例６の工程（２）で検体としてｐＵＣ１９を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、１０〜１５分と短時間であった。

（１）人工核酸（アゾベンゼン）挿入プライマーの合成
標的核酸のテンプレートとしてｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、ＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝子、および、ＢａｍＨＩメチラーゼ遺伝子の３種類を用い、ＰＣＲ増幅により約３３０塩基対、約２００塩基対、および、約１００塩基対が増幅するようにフォワードプライマー（Ｆ１）とリバースプライマー（Ｒ１）、フォワードプライマー（Ｆ２）とリバースプライマー（Ｒ２）、および、フォワードプライマー（Ｆ３）とリバースプライマー（Ｒ３）の３組のプライマーをそれぞれ設計した。それぞれの５’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域（Ｘ）、およびタグ配列Ｔ７とＴ８、タグ配列Ｔ９とＴ１０、および、タグ配列Ｔ１１とＴ１２を導入したタグ付きプライマー、Ｔ７−Ｘ−Ｆ１とＴ８−Ｘ−Ｒ１、Ｔ９−Ｘ−Ｆ２とＴ１０−Ｘ−Ｒ２、および、Ｔ１１−Ｘ−Ｆ３とＴ１２−Ｘ−Ｒ３を合成した。この６種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。

以下に本検討で作製した３組のプライマーセットを示す。
タグ配列Ｔ７：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ）−３’（配列番号３４）
タグ配列Ｔ８：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ）−３’（配列番号３５）
プライマーＴ７−Ｘ−Ｆ１：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ Ｘ ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号３６）
プライマーＴ８−Ｘ−Ｒ１：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ Ｘ ＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ）−３’（配列番号３７）
タグ配列Ｔ９：５’−^Ｄｄ（ＣＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＴ）−３’（配列番号３８）
タグ配列Ｔ１０：５’−^Ｄｄ（ＡＴＴＡＴＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣＡＴＡ）−３’（配列番号３９）
プライマーＴ９−Ｘ−Ｆ２：５’−^Ｄｄ（ＣＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＴ Ｘ ＡＧＣＡＴＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＴＧＧＴ）−３’（配列番号４０）
プライマーＴ１０−Ｘ−Ｒ２：５’−^Ｄｄ（ＡＴＴＡＴＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣＡＴＡ Ｘ ＴＴＧＴＴＴＡＣＡＴＴＴＡＴＡＧＣＡＴＣ）−３’（配列番号４１）
タグ配列Ｔ１１：５’−^Ｄｄ（ＡＡＴＴＧＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＡ）−３’（配列番号４２）
タグ配列Ｔ１２：５’−^Ｄｄ（ＴＡＣＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＧ）−３’（配列番号４３）
プライマーＴ１１−Ｘ−Ｆ３：５’−^Ｄｄ（ＡＡＴＴＧＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＡ Ｘ ＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＴＣＴＧＡＴＡＣ）−３’（配列番号４４）
プライマーＴ１２−Ｘ−Ｒ３：５’−^Ｄｄ（ＴＡＣＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＧ Ｘ ＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＡＡＣＡ）−３’（配列番号４５）

（２）アゾベンゼン挿入プライマーセット３組を用いたＰＣＲ反応
前記工程（１）で実施し作製した３組のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行った。プライマーＴ７−Ｘ−Ｆ１、プライマーＴ８−Ｘ−Ｒ１、プライマーＴ９−Ｘ−Ｆ２、プライマーＴ１０−Ｘ−Ｒ２、プライマーＴ１１−Ｘ−Ｆ３、および、プライマーＴ１２−Ｘ−Ｒ３を各１５ｐｍｏｌと、各テンプレート１０ｎｇを０．２ｍｌのＰＣＲ用チューブに入れ、ＥｘＴａｑ ＰＣＲデバイス（タカラバイオ社製）の説明書に従い、１００μｌのＰＣＲ反応液を調製した。反応液は次の５種類を用意した。
（ｉ）テンプレートとしてｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を添加、
（ｉｉ）テンプレートとしてＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝子を添加、
（ｉｉｉ）テンプレートとしてＢａｍＨＩメチラーゼ遺伝子を添加、
（ｉｖ）テンプレートとしてｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、ＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝子、および、ＢａｍＨＩメチラーゼ遺伝子の３種類全て添加、そして、
（ｖ）テンプレートなし。

これら反応液を調製後、チューブをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステム社製）にセットし、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０回行い、それぞれ目的の配列を有するＤＮＡ断片を次のように得た。（ｉ）約３３０ｂｐ、（ｉｉ）約２００ｂｐ、（ｉｉｉ）約１００ｂｐ、および、（ｉｖ）約３３０ｂｐ、約２００ｂｐ、約１００ｂｐの３種類、（ｖ）増幅ＤＮＡ断片なし（ネガティブコントロールとする）を増幅した。

（３）ラテックス結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス（青色）（固形分１０％（ｗ／ｗ）、Ｂａｎｇｓ社製）とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ１２（配列番号４６、配列番号３４の相補鎖）、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス（オレンジ色）（固形分１０％（ｗ／ｗ）、Ｂａｎｇｓ社製）とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ１３（配列番号４７、配列番号３８の相補鎖）、および、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス（緑色）（固形分１０％（ｗ／ｗ）、Ｂａｎｇｓ社製）とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ１４（配列番号４８、配列番号４２の相補鎖）を、それぞれ水溶性カルボジイミドを必要量添加したＭＥＳ緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、オリゴヌクレオチドプローブ１２結合ラテックス（青色）、オリゴヌクレオチドプローブ１３結合ラテックス（オレンジ色）、オリゴヌクレオチドプローブ１４結合ラテックス（緑色）を作製した。

この３種のラテックスをグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ１２：５’−^Ｄｄ（ＣＴＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡ）−ＮＨ_２−３’（配列番号４６）
オリゴヌクレオチドプローブ１３：５’−^Ｄｄ（ＴＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＴＴＧＣＴＣＡＡＴＧＣＧ）−ＮＨ_２−３’（配列番号４７）
オリゴヌクレオチドプローブ１４：５’−^Ｄｄ（ＴＴＡＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＣＡＡＴＴ）−ＮＨ_２−３’（配列番号４８）

（４）３種のオリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号３５に相補的な配列（配列番号４９）を有する３’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ１５、配列番号３９に相補的な配列（配列番号５０）を有する３’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ１６、および、配列番号４３に相補的な配列（配列番号５１）を有する３’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ１７を、それぞれストレプトアビジンと混合する。それらの混合液をニトロセルロースメンブレン（商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ １３５、ミリポア社製）上の３箇所にディスペンサーを用いて、上流側から順に互いに離れた位置でライン上に塗布し、４０℃で３０分間風乾した。三本の検出ラインを作製した。
オリゴヌクレオチドプローブ１５：５’−^Ｄｄ（ＧＡＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＧＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＣＣ）−Ｂｉｏｔｉｎ−３’（配列番号４９）
オリゴヌクレオチドプローブ１６：５’−^Ｄｄ（ＴＡＴＧＡＴＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＧＣＡＴＡＡＴ）−Ｂｉｏｔｉｎ−３’（配列番号５０）
オリゴヌクレオチドプローブ１７：５’−^Ｄｄ（ＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＴＡ）−Ｂｉｏｔｉｎ−３’（配列番号５１）

（５）核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、工程（３）で作製したコンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図６に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

（６）テストストリップによるＰＣＲ産物の検出
工程（２）で作製した（ｉ）〜（ｖ）のＰＣＲ産物をそれぞれ変性することなく、直ちに工程（５）で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。その結果は以下に示す。
（ｉ）：一本目の検出ラインのみ青色に着色。
（ｉｉ）：二本目の検出ラインのみオレンジ色に着色。
（ｉｉｉ）：三本目の検出ラインのみ緑色に着色。
（ｉｖ）：一本目の検出ラインが青色に、二本目の検出ラインがオレンジ色に、三本目の検出ラインが緑色にそれぞれ着色。
（ｖ）：どの検出ラインも着色は認められなかった。

この結果から、それぞれの標的遺伝子特異的に検出が可能であり、３種類の同時検出も確認できた。
また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、１０〜１５分と短時間であった。

（１）ジョイントプライマーの合成
標的核酸のテンプレートとしてｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、ＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝子、および、ＢａｍＨＩメチラーゼ遺伝子の３種類を用い、ＰＣＲ増幅により約３３０塩基対、約２００塩基対、および、約１００塩基対が増幅するようにフォワードプライマー（Ｆｊ１）とリバースプライマー（Ｒｊ１）、フォワードプライマー（Ｆｊ２）とリバースプライマー（Ｒｊ２）、および、フォワードプライマー（Ｆｊ３）とリバースプライマー（Ｒｊ３）の３組のプライマーをそれぞれ設計した。それぞれの５’末端側に共通配列ＫＦ１とＫＲ１、共通配列ＫＦ２とＫＲ２、および、共通配列ＫＦ３とＫＲ３を導入した共通配列付加プライマー、ＫＦ１−Ｆｊ１とＫＲ１−Ｒｊ１、ＫＦ２−Ｆｊ２とＫＲ２−Ｒｊ２、および、ＫＦ３−Ｆｊ３とＫＲ３−Ｒｊ３を合成した。この６種の共通配列付加プライマー（ジョイントプライマー）はつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。

以下に本検討で作製した３組のプライマーセットを示す。
共通配列ＫＦ１：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＧＣＴＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＴＣＴＴ）−３’（配列番号５２）
共通配列ＫＲ１：５’−^Ｄｄ（ＡＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＴＣＧＧ）−３’（配列番号５３）
プライマーＫＦ１−Ｆｊ１：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＧＣＴＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＴＣＴＴ ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号５４）
プライマーＫＲ１−Ｒｊ１：５’−^Ｄｄ（ＡＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＴＣＧＧ ＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ）−３’（配列番号５５）
共通配列ＫＦ２：５’−^Ｄｄ（ＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴ）−３’（配列番号５６）
共通配列ＫＲ２：５’−^Ｄｄ（ＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号５７）
プライマーＫＦ２−Ｆｊ２：５’−^Ｄｄ（ＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴ ＡＧＣＡＴＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＴＧＧＴ）−３’（配列番号５８）
プライマーＫＲ２−Ｒｊ２：５’−^Ｄｄ（ＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＡ ＴＴＧＴＴＴＡＣＡＴＴＴＡＴＡＧＣＡＴＣ）−３’（配列番号５９）
共通配列ＫＦ３：５’−^Ｄｄ（ＡＴＡＣＣＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＣＣ）−３’（配列番号６０）
共通配列ＫＲ３：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＣＴＧＴＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＧＣ）−３’（配列番号６１）
プライマーＫＦ３−Ｆｊ３：５’−^Ｄｄ（ＡＴＡＣＣＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＣＣ ＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＴＣＴＧＡＴＡＣ）−３’（配列番号６２）
プライマーＫＲ３−Ｒｊ３：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＣＴＧＴＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＧＣ ＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＡＡＣＡ）−３’（配列番号６３）

（２）人工核酸（アゾベンゼン）挿入プライマーの合成
工程（１）で作成したジョイントプライマーセットがそれぞれ増幅する３種類のＰＣＲ増幅断片に結合できるように、それぞれのジョイントプライマーと同一の共通配列を有するプライマーを３組設計した。それぞれのプライマーは、５’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域（Ｘ）、およびタグ配列Ｔ１６とＴ１７、タグ配列Ｔ１８とＴ１９、および、タグ配列Ｔ２０とＴ２１を導入したタグ付きプライマー、Ｔ１６−Ｘ−ＫＦ１とＴ１７−Ｘ−ＫＲ１、Ｔ１８−Ｘ−ＫＦ２とＴ１９−Ｘ−ＫＲ２、および、Ｔ２０−Ｘ−ＫＦ３とＴ２１−Ｘ−ＫＲ３を合成した。この６種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。

以下に本検討で作製した３組のプライマーセットを示す。
タグ配列Ｔ１６：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ）−３’（配列番号６４）
タグ配列Ｔ１７：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ）−３’（配列番号６５）
プライマーＴ１６−Ｘ−ＫＦ１：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ Ｘ ＴＧＧＧＣＴＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＴＣＴＴ ）−３’（配列番号６６）
プライマーＴ１７−Ｘ−ＫＲ１：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ Ｘ ＡＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＴＣＧＧ ）−３’（配列番号６７）
タグ配列Ｔ１８：５’−^Ｄｄ（ＣＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＴ）−３’（配列番号６８）
タグ配列Ｔ１９：５’−^Ｄｄ（ＡＴＴＡＴＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣＡＴＡ）−３’（配列番号６９）
プライマーＴ１８−Ｘ−ＫＦ２：５’−^Ｄｄ（ＣＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＴ Ｘ ＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴ）−３’（配列番号７０）
プライマーＴ１９−Ｘ−ＫＲ２：５’−^Ｄｄ（ＡＴＴＡＴＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣＡＴＡ Ｘ ＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号７１）
タグ配列Ｔ２０：５’−^Ｄｄ（ＡＡＴＴＧＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＡ）−３’（配列番号７２）
タグ配列Ｔ２１：５’−^Ｄｄ（ＴＡＣＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＧ）−３’（配列番号７３）
プライマーＴ２０−Ｘ−ＫＦ３：５’−^Ｄｄ（ＡＡＴＴＧＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＡ Ｘ ＡＴＡＣＣＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＣＣ）−３’（配列番号７４）
プライマーＴ２１−Ｘ−ＫＲ３：５’−^Ｄｄ（ＴＡＣＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＧ Ｘ ＴＧＧＣＣＴＧＴＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＧＣ）−３’（配列番号７５）

（３）ジョイントプライマー、および、アゾベンゼン挿入プライマーを用いたＰＣＲ反応
前記工程（１）および（２）で実施し作製した６組のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行った。プライマーＫＦ１−Ｆｊ１、プライマーＫＲ１−Ｒｊ１、プライマーＫＦ２−Ｆｊ２、プライマーＫＲ２−Ｒｊ２、プライマーＫＦ３−Ｆｊ３、プライマーＫＲ３−Ｒｊ３、プライマーＴ１６−Ｘ−ＫＦ１、プライマーＴ１７−Ｘ−ＫＲ１、プライマーＴ１８−Ｘ−ＫＦ２、プライマーＴ１９−Ｘ−ＫＲ２、プライマーＴ２０−Ｘ−ＫＦ３、プライマーＴ２１−Ｘ−ＫＲ３を各８ｐｍｏｌと、各テンプレート１０ｎｇを０．２ｍｌのＰＣＲ用チューブに入れ、ＥｘＴａｑ ＰＣＲデバイス（タカラバイオ社製）の説明書に従い、１００μｌのＰＣＲ反応液を調製した。

反応液は次の５種類を用意した。
（ｉ）テンプレートとしてｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を添加、
（ｉｉ）テンプレートとしてＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝子を添加、
（ｉｉｉ）テンプレートとしてＢａｍＨＩメチラーゼ遺伝子を添加、
（ｉｖ）テンプレートとしてｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、ＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝子、および、ＢａｍＨＩメチラーゼ遺伝子の３種類全て添加、そして、
（ｖ）テンプレートなし。

これら反応液を調製後、チューブをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステム社製）にセットし、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０回行い、それぞれ目的の配列を有するＤＮＡ断片を次のように得た。（ｉ）約３６０ｂｐ、（ｉｉ）約２３０ｂｐ、（ｉｉｉ）約１３０ｂｐ、および、（ｉｖ）約３６０ｂｐ、約２３０ｂｐ、約１３０ｂｐの３種類、（ｖ）増幅ＤＮＡ断片なし（ネガティブコントロールとする）を増幅した。

（４）ラテックス結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス（青色）（固形分１０％（ｗ／ｗ）、Ｂａｎｇｓ社製）とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ１８（配列番号７６、配列番号６４の相補鎖）、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス（オレンジ色）（固形分１０％（ｗ／ｗ）、Ｂａｎｇｓ社製）とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ１９（配列番号７７、配列番号６８の相補鎖）、および、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス（緑色）（固形分１０％（ｗ／ｗ）、Ｂａｎｇｓ社製）とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ２０（配列番号７８、配列番号７２の相補鎖）を、それぞれ水溶性カルボジイミドを必要量添加したＭＥＳ緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、オリゴヌクレオチドプローブ１８結合ラテックス（青色）、オリゴヌクレオチドプローブ１９結合ラテックス（オレンジ色）、オリゴヌクレオチドプローブ２０結合ラテックス（緑色）を作製した。

この３種のラテックスをグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ１８：５’−^Ｄｄ（ＣＴＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡ）−ＮＨ_２−３’（配列番号７６）
オリゴヌクレオチドプローブ１９：５’−^Ｄｄ（ＴＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＴＴＧＣＴＣＡＡＴＧＣＧ）−ＮＨ_２−３’（配列番号７７）
オリゴヌクレオチドプローブ２０：５’−^Ｄｄ（ＴＴＡＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＣＡＡＴＴ）−ＮＨ_２−３’（配列番号７８）

（５）３種のオリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号６５に相補的な配列（配列番号７９）を有する３’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ２１、配列番号６９に相補的な配列（配列番号８０）を有する３’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ２２、および、配列番号７３に相補的な配列（配列番号８１）を有する３’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ２３を、それぞれストレプトアビジンと混合する。それらの混合液をニトロセルロースメンブレン（商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ １３５、ミリポア社製）上の３箇所にディスペンサーを用いて、上流側から順に互いに離れた位置でライン上に塗布し、４０℃で３０分間風乾した。三本の検出ラインを作製した。
オリゴヌクレオチドプローブ２１：５’−^Ｄｄ（ＧＡＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＧＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＣＣ）−Ｂｉｏｔｉｎ−３’（配列番号７９）
オリゴヌクレオチドプローブ２２：５’−^Ｄｄ（ＴＡＴＧＡＴＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＧＣＡＴＡＡＴ）−Ｂｉｏｔｉｎ−３’（配列番号８０）
オリゴヌクレオチドプローブ２３：５’−^Ｄｄ（ＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＴＡ）−Ｂｉｏｔｉｎ−３’（配列番号８１）

（６）核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、工程（４）で作製したコンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図６に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用テストストリップを作製した。
（７）テストストリップによるＰＣＲ産物の検出

工程（３）で作製した（ｉ）〜（ｖ）のＰＣＲ産物をそれぞれ変性することなく、直ちに工程（６）で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。

その結果は以下に示す。
（ｉ）：一本目の検出ラインのみ青色に着色。
（ｉｉ）：二本目の検出ラインのみオレンジ色に着色。
（ｉｉｉ）：三本目の検出ラインのみ緑色に着色。
（ｉｖ）：一本目の検出ラインが青色に、二本目の検出ラインがオレンジ色に、三本目の検出ラインが緑色に着色。
（ｖ）：どの検出ラインも着色は認められなかった。

この結果から、それぞれの標的遺伝子特異的に検出が可能であり、３種類の検出も確認できた。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、１０〜１５分と短時間であった。

（１）人工核酸（アゾベンゼン）挿入プライマーの合成
本実施例では、標的としてプラスミドｐＵＣ１９を導入した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α）を用いる。ｐＵＣ１９がテンプレートとなるときに、ＰＣＲ増幅により約３３０塩基対が増幅するようにフォワードプライマー（Ｆ）およびリバースプライマー（Ｒ）を設計した。それぞれの５’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域（Ｘ）、およびタグ配列Ｔ２５およびＴ２６を導入したタグ付きプライマー、Ｔ２５−Ｘ−ＦおよびＴ２６−Ｘ−Ｒを合成した。この２種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。

本検討で作製したプライマーセットを示す。
タグ配列Ｔ２５：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ）−３’（配列番号８２）
タグ配列Ｔ２６：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ）−３’（配列番号８３）
プライマーＦ：５’−^Ｄｄ（ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号８４）
プライマーＲ：５’−^Ｄｄ（ＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ）−３’（配列番号８５）
プライマーＴ２５−Ｘ−Ｆ：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ Ｘ ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号８６）
プライマーＴ２６−Ｘ−Ｒ：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ Ｘ ＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ）−３’（配列番号８７）

（２）アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたＰＣＲ反応
プラスミドｐＵＣ１９を導入した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α）のコロニーを取り、１ｍｌ水中に混和した。前記工程（１）で作製したプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行った。プライマーＦとプライマーＲを各５ｐｍｏｌと、前記大腸菌のけん濁液１μｌとを０．２ｍｌのＰＣＲ用チューブに入れ、ＥｘＴａｑＰＣＲデバイス（タカラバイオ社製）の説明書に従い、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステム社製）にセットし、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０回行い、目的の約３３０ｂｐを増幅した。また、けん濁液を添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。

（３）金コロイド結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
Ｇｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ（１０ｎｍ、５．７×１０^１２（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）と抗ＦＩＴＣ抗体溶液（５ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７）を混合し、２０分、室温で静置した。１％ＢＳＡおよび０．１％ＰＥＧを含む溶液を１／２量添加し、１００００ｒｐｍで２５分間遠心分離し、上清を除去、１％ＢＳＡおよび０．１％ＰＥＧを含む溶液を添加し混和後、１００００ｒｐｍで２５分間遠心分離した。遠心後に上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。

調製した金コロイド溶液に３’末端ＦＩＴＣ修飾オリゴヌクレオチドプローブ２４（配列番号８８、配列番号８２の相補鎖）を混合し、グラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ２４：５’−^Ｄｄ（ＣＴＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡ）−ＦＩＴＣ−３’（配列番号８８）

（４）オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号８３に相補的な配列（配列番号８９）を有する３’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ２５を、ストレプトアビジンと混合する。その混合液をニトロセルロースメンブレン（商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ １８０、 ミリポア社製）にディスペンサーを用いてライン上に塗布し、４０℃で３０分間風乾した。
オリゴヌクレオチドプローブ２５：５’−^Ｄｄ（ＧＡＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＧＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＣＣ）−Ｂｉｏｔｉｎ−３’（配列番号８９）

（５）核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図６に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

（６）テストストリップによるＰＣＲ産物の検出
工程（２）で作製したＰＣＲ産物を変性することなく、直ちに工程（５）で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。工程（２）で検体として大腸菌を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして大腸菌を添加しない場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、１０〜１５分と短時間であった。

（１）ＳＮＰターゲットの合成
本実施例では、標的として２種類の５０塩基対の合成ＤＮＡを準備した。この２つのＤＮＡは、末端から２０番目の一塩基だけ異なる一塩基多型（ＳＮＰ）である。標的１を野生型（ＷＴ）、標的２を変異型（ＭＴ）と仮定してＳＮＰ検出試験を行う。

下記には、標的１、および、標的２の二本鎖ＤＮＡのうち片方の配列のみを示す。下線部は異なる一塩基である。
標的１（ＷＴ）：ＣＡＣＡＣＣＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧ（配列番号９０）
標的２（ＭＴ）：ＣＡＣＡＣＣＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧ（配列番号９１）

（２）人工核酸（アゾベンゼン）挿入プライマーの合成
前記工程（１）で合成した標的１もしくは標的２をテンプレートとしたときに、ＰＣＲ増幅により約５０塩基対が増幅するようにフォワードプライマー（Ｆｗｔ）、リバースプライマー（Ｒｗｔ）、およびリバースプライマー（Ｒｍｔ）を設計した。それぞれの５’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域（Ｘ）、およびタグ配列Ｔ２７、Ｔ２８、Ｔ２９を導入したタグ付きプライマー、Ｔ２７−Ｘ−Ｆｗｔ、Ｔ２８−Ｘ−Ｒｗｔ、Ｔ２９−Ｘ−Ｒｍｔを合成した。この３種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。

本検討で作製したプライマーセットを示す。
タグ配列Ｔ２７：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ）−３’（配列番号９２）
タグ配列Ｔ２８：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ）−３’（配列番号９３）
タグ配列Ｔ２９：５’−^Ｄｄ（ＣＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＴ）−３’（配列番号９４）
プライマーＦｗｔ：５’−^Ｄｄ（ＣＡＣＡＣＣＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴ）−３’（配列番号９５）
プライマーＲｗｔ：５’−^Ｄｄ（ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡ）−３’（配列番号９６）
プライマーＲｍｔ：５’−^Ｄｄ（ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣ）−３’（配列番号９７）
プライマーＴ２７−Ｘ−Ｆｗｔ：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ Ｘ ＣＡＣＡＣＣＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴ）−３’（配列番号９８）
プライマーＴ２８−Ｘ−Ｒｗｔ：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ Ｘ ＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡ）−３’（配列番号９９）
プライマーＴ２９−Ｘ−Ｒｍｔ：５’−^Ｄｄ（ＣＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＴ Ｘ ＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣ）−３’（配列番号１００）

（３）アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたＰＣＲ反応
前記工程（１）で作製した標的１、もしくは、標的２を含む試料溶液と、前記工程（２）で合成した３種のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。
プライマーＴ２７−Ｘ−Ｆｗｔ、プライマーＴ２８−Ｘ−Ｒｗｔ、および、プライマーＴ２９−Ｘ−Ｒｍｔを各５ｐｍｏｌと、各テンプレート１ｆｍｏｌを０．２ｍｌのＰＣＲチューブに入れ、ＥｘＴａｑ ＰＣＲキット（タカラバイオ社製）の説明書に従い、１００μｌのＰＣＲ反応液を調整した。

反応液に用いるテンプレートは次の４種類を準備した。
（ｉ）テンプレートとして標的１（ホモ型）、
（ｉｉ）テンプレートとして標的１、および、標的２（ヘテロ型）、
（ｉｉｉ）テンプレートとして標的２（ホモ型）、
（ｉｖ）標的なし（水添加）

これら反応液を調製後、チューブをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステム社製）にセットし、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１０秒のサイクルを３０回行い、それぞれ目的の配列を有するＤＮＡ断片を次のように得た。（ｉ）約５０ｂｐ、（ｉｉ）約５０ｂｐ、（ｉｉｉ）約５０ｂｐ、および、（ｉｖ）増幅ＤＮＡ断片なし（ネガティブコントロールとする）を増幅した。

（４）金コロイド結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
Ｇｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ（４０ｎｍ、９．０×１０^１０（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）と、チオール基含有オリゴヌクレオチドプローブ２６（配列番号１０１、配列番号９２の相補鎖）を混合し、５０℃で１６時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加し混和後、再度５０℃で４０時間インキュベートした。インキュベート後、遠心（６０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。

調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ２６：５’−Ｄｄ（ＣＴＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡ）−ＳＨ−３’（配列番号１０１）

（５）２種のオリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号９３に相補的な配列（配列番号１０２）を有する３’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ２７、および、配列番号９４に相補的な配列（配列番号１０３）を有する３’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ２８、それぞれストレプトアビジンと混合する。それらの混合液をニトロセルロースメンブレン（商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ １３５、ミリポア社製）上の、上流側から順に互いに離れた２箇所の位置でディスペンサーを用いて塗布し、４０℃で３０分間風乾し、二本の検出ラインを作製した。
オリゴヌクレオチドプローブ２７：５’−^Ｄｄ（ＧＡＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＧＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＣＣ）−Ｂｉｏｔｉｎ−３’（配列番号１０２）
オリゴヌクレオチドプローブ２８：５’−^Ｄｄ（ＴＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＴＴＧＣＴＣＡＡＴＧＣＧ）−Ｂｉｏｔｉｎ−３’（配列番号１０３）

（６）核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、工程（５）で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、工程（４）で作製したコンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図６に示す様に貼り合わせ、スペーサー（アゾベンゼン）挿入プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

（７）テストストリップによるＰＣＲ産物の検出
工程（３）で作製した（ｉ）〜（ｉｖ）のＰＣＲ産物を変性することなく、直ちに工程（６）で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。

その結果は以下に示す。
（ｉ）：一本目の検出ラインのみ着色。
（ｉｉ）：一本目のライン、二本目の検出ライン両方とも着色。
（ｉｉｉ）：二本目の検出ラインのみ着色。
（ｉｖ）：どの検出ラインも着色は認められなかった。

この結果から、それぞれの標的遺伝子特異的に検出が可能であり、更に、ＳＮＰのホモ型とヘテロ型の判別も同時に判定できた。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、５〜１５分と短時間であった。

（１）スペーサー（５’−５’結合＋３’−３’結合）挿入プライマーの合成
本実施例では、試料として薄力小麦粉（日清製粉社製）、そば粉（おびなた社製）、および、落花生（ル・モンド・アリコ社製）の３種類を用いた。各試料から、ＰＣＲ増幅により、それぞれ約１４１塩基対、約１２７塩基対、および、約９５塩基対のＤＮＡが増幅するようにフォワードプライマー（Ｆｗｔｒ）とリバースプライマー（Ｒｗｔｒ）、フォワードプライマー（ＦＦＡＧ）とリバースプライマー（ＲＦＡＧ）、および、フォワードプライマー（Ｆａｇｇ）とリバースプライマー（Ｒａｇｇ）の３組のプライマーをそれぞれ設計した。それぞれの５’末端側に５’−５’結合＋ｄＡ＋３’−３’結合を含むポリメラーゼ反応阻害領域（Ｘ）、およびタグ配列Ｔ７とＴ８、タグ配列Ｔ９とＴ１０、および、タグ配列Ｔ１１とＴ１２を導入したタグ付きスペーサー挿入プライマー、Ｔ７−Ｘ−ＦｗｔｒとＴ８−Ｘ−Ｒｗｔｒ、Ｔ９−Ｘ−ＦＦＡＧとＴ１０−Ｘ−ＲＦＡＧ、および、Ｔ１１−Ｘ−ＦａｇｇとＴ１２−Ｘ−Ｒａｇｇを合成した。この６種のタグスペーサー挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。

以下に本検討で作製した３組のプライマーセットを示す。
プライマーＴ７−Ｘ−Ｆｗｔｒ：５’−Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ Ｘ ＣＡＴＣＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＴＡＴＧＧＴＧＧ）−３’（配列番号１０４）
プライマーＴ８−Ｘ−Ｒｗｔｒ：５’−Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ Ｘ ＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＧＧＧＴＴＡ）−３’（配列番号１０５）
プライマーＴ９−Ｘ−ＦＦＡＧ：５’−Ｄｄ（ＣＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＴ Ｘ ＡＡＣＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＴＴ）−３’（配列番号１０６）
プライマーＴ１０−Ｘ−ＲＦＡＧ：５’−Ｄｄ（ＡＴＴＡＴＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣＡＴＡ Ｘ ＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＴＴＣＴＴＣ）−３’（配列番号１０７）
プライマーＴ１１−Ｘ−Ｆａｇｇ：５’−Ｄｄ（ＡＡＴＴＧＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＡ Ｘ ＣＧＡＡＧＧＡＡＡＣＣＣＣＧＣＡＡＴＡＡＡＴ）−３’（配列番号１０８）
プライマーＴ１２−Ｘ−Ｒａｇｇ：５’−Ｄｄ（ＴＡＣＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＧ Ｘ ＣＧＡＣＧＣＴＡＴＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＧＡＧ）−３’（配列番号１０９）

（２）各試料のゲノムＤＮＡの精製
各試料（小麦粉、そば粉、粉砕した落花生）２ｇからそれぞれゲノムＤＮＡを精製した。まず、遠沈管（５０ｍＬ容）に試料を量り採り、ＣＴＡＢ緩衝液１５ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて混合した。ＣＴＡＢ緩衝液３０ｍＬを加え、転倒混和後５５℃で３０分間加温する。加温処理後、溶液を撹拌し、均質となった溶液６００μＬをマイクロチューブ（１．５ｍＬ容）に量り採った。

この均質溶液から、次の方法で核酸の抽出を行った。すなわち、この均質溶液に対し５００μＬのフェノール／クロロホルム混合液（１Ｍ Ｔｒｉｓ／塩酸（ｐＨ８．０）飽和フェノールとクロロホルム／イソアミルアルコールを１：１（ｖ／ｖ）の割合で混合したもの）を加え、転倒混和後ボルテックスミキサーで軽く懸濁した。懸濁後、室温条件下で７，５００×ｇとなる速度で１５分間遠心し、分離した水層（上層）を新しいマイクロチューブに移した。水層に対し、再び５００μＬのクロロホルム／イソアミルアルコール混合液（クロロホルムとイソアミルアルコールを２４：１（ｖ／ｖ）の割合で混合したもの）を加え、転倒混和後ボルテックスミキサーで軽く懸濁した。室温条件下で７，５００×ｇとなる速度で１５分間遠心し、分離した水層（上層）を新しいマイクロチューブに移した。分離した水層に等容量のイソプロピルアルコールを加え、転倒混和後、室温条件下で７，５００×ｇとなる速度で１５分間遠心し、デカンテーションで上澄み液を捨てた。次いで、５００μＬの７０％エタノールを壁面から静かに加え、その後、室温条件下で７，５００×ｇとなる速度で１分間遠心した。遠心後、沈殿にさわらないようにできる限りエタノールを吸い取り捨てた。チューブに残った核酸の沈殿を乾燥させるため、アスピレーターを用いて２〜３分間の真空乾燥処理を行った。この時、完全に乾燥しないように注意した。５０μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を加えてよく混和し、その後、室温で１５分間静置した。この間、数回転倒混和し、沈殿が完全に溶解する事を促した。完全に溶解したものをＤＮＡ試料原液とした。

なお、ＣＴＡＢ緩衝液は次の方法で調製した。ビーカーに８ｍＬの０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）、２０ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ／塩酸（ｐＨ８．０）、および５６ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ水溶液を量り採り、混合した後、約１５０ｍＬとなるように水を加え、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）４ｇを撹拌しながら加え、完全に溶解した。更に水を加え全量を２００ｍＬとし、オートクレーブで滅菌した。

（３）スペーサー（５’−５’結合＋３’−３’結合）挿入プライマーセット３組を用いたＰＣＲ反応
前記工程（１）で実施し作製した３組のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行った。プライマーＴ７−Ｘ−Ｆｗｔｒ、プライマーＴ８−Ｘ−Ｒｗｔｒ、プライマーＴ９−Ｘ−ＦＦＡＧ、プライマーＴ１０−Ｘ−ＲＦＡＧ、プライマーＴ１１−Ｘ−Ｆａｇｇ、および、プライマーＴ１２−Ｘ−Ｒａｇｇを各１５ｐｍｏｌと、各ＤＮＡ試料原液を０．２ｍｌのＰＣＲ用チューブに入れ、ＥｘＴａｑ ＰＣＲデバイス（タカラバイオ社製）の説明書に従い、１００μｌのＰＣＲ反応液を調製した。

反応液に添加したＤＮＡ試料原液としては、次の５種類を用意した。
（ｉ）テンプレートとして小麦粉のＤＮＡ試料原液を添加、
（ｉｉ）テンプレートとしてそば粉のＤＮＡ試料原液を添加、
（ｉｉｉ）テンプレートとして落花生のＤＮＡ試料原液を添加、
（ｉｖ）テンプレートとして小麦粉、そば粉、落花生３種類全てのＤＮＡ試料原液を添加、そして、
（ｖ）テンプレートなし。

これら反応液を調製後、チューブをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステム社製）にセットし、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０回行い、それぞれ目的の配列を有するＤＮＡ断片を次のように得た。（ｉ）約１４１ｂｐ、（ｉｉ）約１２７ｂｐ、（ｉｉｉ）約９５ｂｐ、および、（ｉｖ）約１４１ｂｐ、約１２７ｂｐ、約９５ｂｐの３種類、（ｖ）増幅ＤＮＡ断片なし（ネガティブコントロールとする）を増幅した。

（４）金コロイド結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
Ｇｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ（４０ｎｍ、９．０×１０^１０（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）と、チオール基含有オリゴヌクレオチドプローブ２９（配列番号１１０、配列番号３４の相補鎖）、チオール基含有オリゴヌクレオチドプローブ３０（配列番号１１１、配列番号３８の相補鎖）、および、チオール基含有オリゴヌクレオチドプローブ３１（配列番号１１２、配列番号４２の相補鎖）を、それぞれ混合し、５０℃で１６時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加し混和後、再度５０℃で４０時間インキュベートした。インキュベート後、遠心（６０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。

調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ２９：５’−Ｄｄ（ＣＴＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡ）−ＳＨ−３’（配列番号１１０）
オリゴヌクレオチドプローブ３０：５’−Ｄｄ（ＴＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＴＴＧＣＴＣＡＡＴＧＣＧ）−ＳＨ−３’（配列番号１１１）
オリゴヌクレオチドプローブ３１：５’−Ｄｄ（ＴＴＡＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＣＡＡＴＴ）−ＳＨ−３’（配列番号１１２）

（５）３種のオリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
実施例９の工程（４）と同様の方法を用いて、オリゴヌクレオチドプローブ１５、１６、１７をそれぞれライン上に塗布し、ニトロセルロースメンブレン上に乾燥固定した。

（６）核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、工程（５）で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、工程（４）で作製したコンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図６に示す様に貼り合わせ、スペーサー（５’−５’結合＋３’−３’結合）挿入プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

（７）テストストリップによるＰＣＲ産物の検出
工程（３）で作製した（ｉ）〜（ｖ）のＰＣＲ産物を変性することなく、直ちに工程（６）で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。

その結果を以下（ｉ）〜（ｖ）、および、図１２に示す。
（ｉ）：一本目の検出ラインのみ着色。
（ｉｉ）：二本目の検出ラインのみ着色。
（ｉｉｉ）：三本目の検出ラインのみ着色。
（ｉｖ）：一本目の検出ライン、二本目の検出ライン、および、三本目の検出ラインが全て着色。
（ｖ）：どの検出ラインも着色は認められなかった。

この結果から、それぞれの標的遺伝子を特異的に検出できることが確認された。３種類の試料の同時検出も確認された。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、５〜１５分と短時間であった。

ｐＵＣ１９インサートの有無の検出
（１）ターゲットＤＮＡ（ｐＵＣ１９、および、インサートを含むｐＵＣ１９）の準備
本実施例では、標的として２種類のプラスミドＤＮＡを準備した。標的の概要を図１３、図１４に示す。標的１はプラスミドｐＵＣ１９ ＤＮＡ（タカラバイオ社製）、標的２はｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにインサートとして遺伝子Ａ（１６６８ｂｐ）を挿入したプラスミド（ｐＵＣ１９／遺伝子Ａ）を用いる。
遺伝子Ａ配列（配列番号１１３）
標的１：ｐＵＣ１９配列（配列番号１１４）
標的２：ｐＵＣ１９配列／遺伝子Ａ（配列番号１１５）

（２）Ｃ６リンカー挿入プライマーの合成
図１３、図１４で示すように、ｐＵＣ１９配列上のマルチクローニングサイトを挟んだ位置にフォワードプライマー（Ｆ）、および、リバースプライマー（Ｒ）を、インサート遺伝子Ａ配列上にリバースプライマー（Ｒ‐ｉｎ）を設計した。フォワードプライマーＦとリバースプライマーＲを用いてＰＣＲ反応を行うと、標的１のｐＵＣ１９では１１８塩基対の増幅産物が得られ、インサートを含む標的２のｐＵＣ１９／遺伝子Ａでは１７６８塩基対の増幅産物が得られる。また、フォワードプライマーＦとリバースプライマーＲ−ｉｎを用いてＰＣＲ反応を行うと、標的２（インサート挿入）で１０１塩基長の増幅産物が生ずる。それぞれの５’末端側にＣ６リンカーを含むポリメラーゼ反応阻害領域（Ｘ）、および実施例１２に記載したタグと同様のタグ配列Ｔ２７、Ｔ２８、Ｔ２９を導入したタグ付きプライマー、Ｔ２７−Ｘ−Ｆ、Ｔ２８−Ｘ−Ｒ、Ｔ２９−Ｘ−Ｒ−ｉｎを合成した。この３種のＣ６リンカー挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。

本検討で作製したプライマーセットを示す。
プライマーＦ：５’−^Ｄｄ（ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号１１６）
プライマーＲ：５’−^Ｄｄ（ＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ）−３’（配列番号１１７）
プライマーＲ−ｉｎ：５’−^Ｄｄ（ＡＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＴＣ）−３’（配列番号１１８）
プライマーＴ２７−Ｘ−Ｆ：５’−^Ｄｄ（ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧ Ｘ ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）−３’（配列番号１１９）
プライマーＴ２８−Ｘ−Ｒ：５’−^Ｄｄ（ＧＧＴＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡ Ｘ ＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ）−３’（配列番号１２０）
プライマーＴ２９−Ｘ−Ｒ−ｉｎ：５’−^Ｄｄ（ＣＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＴ Ｘ ＡＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＴＣ）−３’（配列番号１２１）

（３）Ｃ６リンカー挿入プライマーセットを用いたＰＣＲ反応
前記工程（１）で準備した標的１、もしくは、標的２溶液と前記工程（２）で合成した３種のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。プライマーＴ２７−Ｘ−Ｆ、プライマーＴ２８−Ｘ−Ｒ、および、プライマーＴ２９−Ｘ−Ｒ−ｉｎを各５ｐｍｏｌと、各テンプレート１ｆｍｏｌを０．２ｍｌのＰＣＲチューブに入れ、ＥｘＴａｑ ＰＣＲキット（タカラバイオ社製）の説明書に従い、１００μｌのＰＣＲ反応液を調整した。

反応液に用いるテンプレートは次の４種類を準備した。
（ｉ）テンプレートとして標的１、
（ｉｉ）テンプレートとして標的１、および、標的２、
（ｉｉｉ）テンプレートとして標的２、
（ｉｖ）標的なし（水添加）

これら反応液を調製後、チューブをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステム社製）にセットし、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で５秒のサイクルを３０回行った。このＰＣＲ反応条件において伸長反応時間を５秒と短くしたのは、増幅長の短いものだけを選択的に増幅するためである。この反応条件において、インサートを有する標的２がテンプレートの場合、プライマーＴ２７−Ｘ−Ｆ、プライマーＴ２８−Ｘ−Ｒでは１７８６ｂｐの増幅は生じず、プライマーＴ２７−Ｘ−Ｆ、プライマーＴ２９−Ｘ−Ｒ−ｉｎにより１０１ｂｐの増幅断片だけが生じる。よって、それぞれ目的の配列を有するＤＮＡ断片を次のように得た。（ｉ）１１８ｂｐ、（ｉｉ）１１８ｂｐ、１０１ｂｐ、（ｉｉｉ）１０１ｂｐ、および、（ｉｖ）増幅ＤＮＡ断片なし（ネガティブコントロールとする）を増幅した。

（４）核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
実施例１３の工程（４）〜（６）と同様の方法で、スペーサー挿入プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

（５）テストストリップによるＰＣＲ産物の検出
工程（３）で作製した（ｉ）〜（ｉｖ）のＰＣＲ産物を変性することなく、直ちに工程（４）で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。

その結果を以下に示す。
（ｉ）：一本目の検出ラインのみ着色。
（ｉｉ）：一本目のライン、二本目の検出ライン両方とも着色。
（ｉｉｉ）：二本目の検出ラインのみ着色。
（ｉｖ）：どの検出ラインも着色は認められなかった。

この結果から、それぞれの標的プラスミド特異的に検出が可能であり、プラスミド内のインサートの有無を判別可能であった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、５〜１５分と短時間であった。

このようにプラスミドへの遺伝子の挿入の有無を判別でき、同様の方法を用いて、ゲノムへの遺伝子の挿入や欠失等の変異も簡便に検出可能である。

１．プライマー領域
２．タグ領域
３．ポリメラーゼ反応阻害領域（スペーサー領域）
４．第１プライマー（ジョイントプライマー）のプライマー領域
５．第１プライマー（ジョイントプライマー）の共通領域
６．第２プライマーの共通領域
７．第２プライマーのタグ領域
８．第２プライマーのポリメラーゼ反応阻害領域（スペーサー領域）
９．標的核酸配列
１０．フォワードプライマー
１１．フォワードプライマーのプライマー領域
１２．フォワードプライマーのタグ領域
１３．リバースプライマー
１４．リバースプライマーのプライマー領域
１５．リバースプライマーのタグ領域
１６．両末端に一本鎖領域を有するＤＮＡ増幅産物
１７．標的核酸配列
１８．フォワード第１プライマー
１９．フォワード第１プライマーのプライマー領域
２０．フォワード第１プライマーのタグ領域
２１．リバース第１プライマー
２２．リバース第１プライマーのプライマー領域
２３．リバース第１プライマーのタグ領域
２４．第１プライマーによる二本鎖ＰＣＲ産物
２５．フォワード第２プライマー
２６．フォワード第２プライマーのプライマー領域
２７．フォワード第２プライマーのタグ領域
２８．リバース第２プライマー
２９．リバース第２プライマーのプライマー領域
３０．リバース第２プライマーのタグ領域
３１．両末端に一本鎖領域を有するＤＮＡ増幅産物
３２．サンプルパッド
３３．コンジュゲートパッド
３４．捕捉用オリゴヌクレオチドを保持した担体
３５．吸収パッド
３６．基材
３７．テストライン
３８．コントロールライン
３９．標識分子結合用オリゴヌクレオチド
４０．標識分子
４１．ＰＣＲ産物−標識分子複合体
４２．多孔質メンブレン
４３．捕捉用オリゴヌクレオチド
４４．捕捉用オリゴヌクレオチドを各ウェルに保持した担体（マイクロアレイ）
４５．捕捉用オリゴヌクレオチドを保持したビーズ担体
４６．変性ＰＡＧＥ、染色後のポリアクリルアミドゲル
４７．約３６０ｍｅｒの一本鎖
４８．約３３０ｍｅｒの一本鎖
４９．クロマトグラフィー様ストリップ
５０．テストライン
５１．テストライン１
５２．テストライン２
５３．テストライン３

Claims (24)

1. 核酸増幅反応で二本鎖化されないタグ領域が５’末端側に連結されたプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、両末端に一本鎖領域を有する核酸を得ることを特徴とする、核酸の増幅方法。
2. タグ領域が、スペーサーを介してプライマーと連結されていることを特徴とする、請求項１に記載の核酸の増幅方法。
3. スペーサーが、核酸誘導体を含むことを特徴とする、請求項２に記載の標的核酸の増幅方法。
4. 核酸誘導体が、Ｌ型核酸、３−ｄｅｏｘｙ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｄＮ、修飾塩基核酸、損傷塩基核酸、リン酸結合部位修飾核酸、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅ−Ｎ、および、それらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上であることを特徴とする、請求項３に記載の核酸の増幅方法。
5. Ｌ型核酸が、Ｌ型ＤＮＡ、Ｌ型ＲＮＡ、および、それらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上であることを特徴とする、請求項４に記載の核酸の増幅方法。
6. ３−ｄｅｏｘｙ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｄＮが、２’−５’結合によりプライマーと連結されていることを特徴とする、請求項４に記載の核酸の増幅方法。
7. 修飾塩基核酸が、発色団またはビオチンを含むことを特徴とする、請求項４に記載の核酸の増幅方法。
8. 発色団が、ピレン、エテノ、ピロロ、ぺリレン、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、ダブシル、シアニン、および、それらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上であることを特徴とする、請求項７に記載の核酸の増幅方法。
9. 損傷塩基核酸が、脱塩基ヌクレオチド、５−ヒドロキシメチル−ｄＮ、および、それらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上であることを特徴とする、請求項４に記載の核酸の増幅方法。
10. リン酸結合部位修飾核酸が、ホスホロチオエート又はその誘導体を含むことを特徴とする、請求項４に記載の核酸の増幅方法。
11. 核酸誘導体が、５’−５’結合でプライマーと連結され、かつ、３’−３’結合でタグ領域と連結されていることを特徴とする、請求項３〜１０のいずれかに記載の核酸の増幅方法。
12. スペーサーが、非核酸誘導体を含むことを特徴とする、請求項２に記載の標的核酸の増幅方法。
13. 非核酸誘導体が、Ｄ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ骨格を有することを特徴とする、請求項１２に記載の核酸の増幅方法。
14. Ｄ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ骨格に、アゾベンゼン、ビオチン、ＥＤＴＡ、および、発色団からなる群から選択される少なくとも１以上が導入されていることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸の増幅方法。
15. 発色団が、ピレン、エテノ、ピロロ、ぺリレン、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、ダブシル、シアニン、および、それらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上であることを特徴とする、請求項１４に記載の核酸の増幅方法。
16. 非核酸誘導体が、炭素鎖（Ｃ_ｎ）、ペグ鎖（（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ）、ジスルフィド含有鎖（Ｃ_ｎＳＳＣ_ｎ）、および、ジチオールフォスフォロアミダイトからなる群から選択される少なくとも１以上であることを特徴とする、請求項１２に記載の核酸の増幅方法。
17. スペーサーが複数種類および／又は複数個であることを特徴とする、請求項２に記載の核酸の増幅方法。
18. 請求項１〜１７のいずれかに記載の核酸の増幅方法で得られた、両末端に一本鎖領域を有する核酸を検出することを特徴とする核酸の検出方法。
19. 片方の一本鎖領域と相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブを固相に固定する工程、および、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブを、両末端に一本鎖領域を有する核酸とハイブリダイズさせる工程を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の核酸の検出方法。
20. 更に、他方の一本鎖領域と相補的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを標識物質と結合する工程、および、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブを、両末端に一本鎖領域を有する核酸とハイブリダイズさせる工程を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の核酸の検出方法。
21. 更に、目視で核酸を判別する工程を含むことを特徴とする、
    請求項２０に記載の核酸の検出方法。
22. 標識物質が着色担体であることを特徴とする、
    請求項２０または２１に記載の核酸の検出方法。
23. 両末端に一本鎖領域を有する核酸を、核酸検出デバイス上で検出することを特徴とする、請求項１８〜２２のいずれかに記載の核酸の検出方法。
24. 核酸検出デバイスが、アレイ又はクロマトグラフィーである、請求項２３に記載の核酸の検出方法。