CN105713964A - 一种基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法 - Google Patents

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梁兴国
吴薇
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Changzhou Yishun Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，所述方法包括如下步骤：步骤一：设计用于扩增目的基因的引物序列，并且给两条序列加上Tag便签序列，两段序列中间用偶氮苯隔开作为修饰；步骤二：设计用于检测两条Tag标签序列的胶体金核酸试纸条所需序列；步骤三：按照步骤二的设计要求，将核酸标记胶体金，并制备胶体金核酸试纸条；步骤四：混合PCR反应体系，并将混合后的PCR反应体系放入PCR仪进行反应；步骤五：利用胶体金核酸试纸条检测PCR产物。本发明的基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，操作简便快速、成本较低且应用范围广。

Description

一种基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法
技术领域
本发明涉及一种基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，属于核酸检测技术领域。
背景技术
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子双链拷贝。类似于DNA的天然复制过程，DNA链式聚合反应(PCR)聚合酶链反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，就可获得更多的“半保留复制双链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR因其特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等优点而被广泛应用。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方，它也是目前核酸检测的金标准。PCR双链产物的检测方法一般包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶切、测序等，最后借助染色和紫外透射成像进行分析。这些分析操作步骤繁琐、耗时长，且依赖仪器及特殊训练的专业人员。因此，寻找准确、快速、灵敏、低成本、操作简易的检测PCR产物方法尤其重要。现有很多技术可以达到快速、高通量的检测基因的目的，例如胶体金核酸试纸条、芯片平台，但是都是基于核酸单链间的碱基互补配对杂交而实现的，因此产生单链PCR产物对于快速检测是至关重要的。因此，如果可以将PCR产物加上一个单链核酸标签Tag的话，就可以用胶体金核酸试纸条、基因芯片等对PCR产物进行检测，达到准确、快速、灵敏、低成本、操作简易的检测需求。现有的对PCR产物加Tag方法依赖以下两种技术：化学修饰小分子及蛋白或者偶联纳米粒子。但这两种技术方案中以化学小分子或者蛋白为Tag，虽然可以实现快速检测，但是在合成核酸时需要额外支付修饰费用，而且在T线和C线上需要固定抗体，价格昂贵，增加了检测的成本；而利用高温变性产生单链Tag用于杂交，这种技术方案产生Tag的方法也依赖多重修饰才能用试纸条进行夹心法检测，修饰操作复杂，且在试纸条上固定的也是蛋白或者抗体，价格比核酸高，并且需要通过变温来产生单链，效率低，影响检测灵敏度。因此，为解决以上问题，亟待研发一种新的基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为解决上述问题，本发明提出了一种基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，简便、快速、低成本、可通用的核酸检测方法。
(二)技术方案
本发明的基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：设计用于扩增目的基因的引物序列，并且给两条序列加上Tag便签序列，两段序列中间用偶氮苯隔开作为修饰；
步骤二：设计用于检测两条Tag标签序列的胶体金核酸试纸条所需序列；
步骤三：按照步骤二的设计要求，将核酸标记胶体金，并制备胶体金核酸试纸条；
步骤四：混合PCR反应体系，并将混合后的PCR反应体系放入PCR仪进行反应；
步骤五：利用胶体金核酸试纸条检测PCR产物。
进一步地，所述步骤一具体如下：根据待测Target序列设计上下游引物，并在设计好的序列段中分别加入Tag1和Tag2序列，形成的PrimerF/R包含一个偶氮苯(X)。
进一步地，所述步骤二具体如下：设计标记胶体金的序列，通过巯基SH修饰，从而与胶体金通过金硫键Au-S结合，与Tag1互补；设计与Tag2互补的序列，用于固定在T线区域；设计与标记胶体金序列互补的序列，用于固定在C线区域。
进一步地，所述步骤三具体如下：将制备好的核酸-金标记物用划膜喷金仪喷在玻璃纤维膜上(金标垫)；并将T-lineDNA和C-lineDNA用划膜喷金仪划在硝酸纤维素膜上，构成检测区和质控区；把样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫分别组装在PVC板上，每个部分重叠2mm，保证层析过程顺利进行；将组装好的试纸条用自动斩切机，切割成3mm宽。
进一步地，所述步骤五具体如下：将PCR产物滴加到样品垫上；缓慢滴加上样缓冲液，让样品在胶体金核酸试纸条上缓慢前行，5分钟后，观察结果。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明的基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，采用偶氮苯对PCR上下游引物进行修饰，由于反式偶氮苯能阻隔PCR聚合酶的延伸作用而得到两边各带有一条单链Tag的产物，用于核酸试纸条检测；由于核酸之间的碱基互补配对，不需要对其他核酸进行修饰，这样通过PCR方法对待测基因进行信号放大后，再结合核酸试纸条的方便易读优点，实现对基因的快速、准确、高效检测；同时，本发明中用到的Tag序列可以通用，只要更换与待测目标互补的引物序列，检测试纸条都不用做调整，可直接使用，是一种广谱检测平台。
附图说明
图1是本发明的偶氮苯修饰引物的结构示意图；
图2是本发明的各段序列互补关系示意图；
图3是本发明的PCR反应原理示意图；
图4是本发明的胶体金核酸试纸条检测PCR产物示意图；
图5是本发明的偶氮苯光致顺反异构化通道即旋转、反转和协同反转机理的示意图；
图6是本发明的偶氮苯修饰序列作为模板阻隔PCR聚合酶延伸的示意图。
具体实施方式
如图1至图6所示的一种基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：设计用于扩增目的基因的引物序列，并且给两条序列的5’端加上Tag便签序列，两段序列中间用偶氮苯隔开作为修饰；
步骤二：设计用于检测两条Tag标签序列的胶体金核酸试纸条所需序列；
步骤三：按照步骤二的设计要求，将核酸标记胶体金，并制备胶体金核酸试纸条；
步骤四：混合PCR反应体系，并将混合后的PCR反应体系放入PCR仪进行反应；
步骤五：利用胶体金核酸试纸条检测PCR产物。
所述步骤一具体如下：根据待测Target序列设计上下游引物，并在设计好的序列5’段分别加入Tag1和Tag2序列，形成的PrimerF/R包含一个偶氮苯(X)，偶氮苯分子存在顺式和反式两种异构体，且偶氮苯修饰的引物可以达到阻隔PCR聚合酶延伸的作用。
所述步骤二具体如下：设计标记胶体金的序列，通过巯基SH修饰，从而与胶体金通过金硫键Au-S结合，与Tag1互补；设计与Tag2互补的序列，用于固定在T线区域；设计与标记胶体金序列互补的序列，用于固定在C线区域。
所述步骤三具体如下：将制备好的核酸-金标记物用划膜喷金仪喷在玻璃纤维膜上(金标垫)；并将T-lineDNA和C-lineDNA用划膜喷金仪划在硝酸纤维素膜上，构成检测区和质控区；把样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫分别组装在PVC板上，每个部分重叠2mm，保证层析过程顺利进行；将组装好的试纸条用自动斩切机，切割成3mm宽。
所述步骤五具体如下：将PCR产物滴加到样品垫上；缓慢滴加上样缓冲液，让样品在胶体金核酸试纸条上缓慢前行，5分钟后，观察结果。
本发明基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法的检测原理：在序列设计中，PrimerF上带有Tag1，Tag1可以与胶体金上标记核酸互补；PrimerR上带有Tag2，可以与胶体金核酸试纸条检测线上固定的核酸互补，通过这两条Tag的夹心作用，扩增产物才可以被捕获并固定在检测线处产生红线，缺少一条Tag都不可能出现红色T线；质控区固定的核酸可以通过与胶体金上的核酸互补而捕获多余的胶体金呈现红色。呈两条红线的为阳性，呈一条红线的为阴性。
上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定。在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入到本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。

Claims (5)

1.一种基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
步骤一：设计用于扩增目的基因的引物序列，并且给两条序列加上Tag便签序列，两段序列中间用偶氮苯隔开作为修饰；
步骤二：设计用于检测两条Tag标签序列的胶体金核酸试纸条所需序列；
步骤三：按照步骤二的设计要求，将核酸标记胶体金，并制备胶体金核酸试纸条；
步骤四：混合PCR反应体系，并将混合后的PCR反应体系放入PCR仪进行反应；
步骤五：利用胶体金核酸试纸条检测PCR产物。
2.根据基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，其特征在于：所述步骤一具体如下：根据待测Target序列设计上下游引物，并在设计好的序列段中分别加入Tag1和Tag2序列，形成的PrimerF/R包含一个偶氮苯(X)。
3.根据基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，其特征在于：所述步骤二具体如下：设计标记胶体金的序列，通过巯基SH修饰，从而与胶体金通过金硫键Au-S结合，与Tag1互补；设计与Tag2互补的序列，用于固定在T线区域；设计与标记胶体金序列互补的序列，用于固定在C线区域。
4.根据基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，其特征在于：所述步骤三具体如下：将制备好的核酸-金标记物用划膜喷金仪喷在玻璃纤维膜上(金标垫)；并将T-lineDNA和C-lineDNA用划膜喷金仪划在硝酸纤维素膜上，构成检测区和质控区；把样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫分别组装在PVC板上，每个部分重叠2mm，保证层析过程顺利进行；将组装好的试纸条用自动斩切机，切割成3mm宽。
5.根据基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法，其特征在于：所述步骤五具体如下：将PCR产物滴加到样品垫上；缓慢滴加上样缓冲液，让样品在胶体金核酸试纸条上缓慢前行，5分钟后，观察结果。
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