CN105209490A - 用于递送mrna编码的抗体的方法和组合物 - Google Patents
用于递送mrna编码的抗体的方法和组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105209490A CN105209490A CN201480010113.8A CN201480010113A CN105209490A CN 105209490 A CN105209490 A CN 105209490A CN 201480010113 A CN201480010113 A CN 201480010113A CN 105209490 A CN105209490 A CN 105209490A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mrna
- antibody
- encoding
- heavy chain
- light chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 0 C*C(CN(CCCCC(C)C(*(C(CCCCN(CC(*C)O)CC(*C)O)C(C=CC)=O)=N)=O)CC(*)O)O Chemical compound C*C(CN(CCCCC(C)C(*(C(CCCCN(CC(*C)O)CC(*C)O)C(C=CC)=O)=N)=O)CC(*)O)O 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
- A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
Abstract
本发明尤其提供用于通过向有此需要的受试者施用一种或多种编码抗体的重链和轻链的mRNA进行体内递送抗体的方法和组合物,并且其中该抗体在该受试者中进行全身性表达。在一些实施方案中,一种或多种mRNA包括编码重链的第一mRNA和编码抗体的轻链的第二mRNA。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请序列No.61/784,903和2013年12月23日提交的美国临时专利申请序列No.61/920,165的优先权,其内容在此通过引用整体并入。
背景
已知抗体具有强大的治疗效果,并且目前用于治疗一系列疾病,包括癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病和移植排斥。传统上,治疗性抗体是通过重组技术进行生产,配制,然后向需要抗体治疗的患者施用。然而,抗体生产和配制非常昂贵。此外,许多抗体仅具有非常短的体内半衰期,因此在被降解之前可能达不到它们的靶抗原或靶组织。为了达到期望的功效,抗体治疗通常需要高剂量和频繁的施用。
基因疗法和基因疫苗接种(也称为DNA疫苗接种)提供用于体内递送大量抗体的替代方法。但是,DNA作为基因治疗和基因疫苗接种中的药物的用途可能造成一些安全问题。例如,DNA在血流中被缓慢地降解。可能发生抗-DNA抗体的形成(Gilkeson等,J.Clin.Invest.1995,95:1398-1402)。因此(异源)DNA在生物体中的可能持续存在可导致免疫系统的超活化(hyperactivation),已知在小鼠中导致脾大(Montheith等,AnticancerDrugRes.1997,12(5):421-432)。此外,DNA整合可以通过断裂完整基因造成宿主基因组中的突变。
发明概述
本发明提供一种基于信使RNA(mRNA)递送技术用于体内更安全并且更有效地递送抗体的改进的方法。本发明部分地基于该意外发现:通过递送编码抗体的重链和轻链的外源性mRNA,即使在该重链和轻链是通过独立的mRNA递送时,也可以在体内完成完全组装的多链抗体的产生。如以下在实施例部分中所述的非限制性实施例所示,当将包囊在脂质体中的编码重链和轻链的mRNA构建体静脉内注入小鼠时,在注射后6小时内,在小鼠血清中,可以检测到显著量的期望的mRNA编码的抗体,且在72或96小时后出现峰值。甚至在注射后的三周后抗体的全身性表达持续存在。因此,本发明人已成功地证明多链治疗性抗体可以通过mRNA递送并由患者身体自身产生,这使得消除非常昂贵的重组抗体生产工艺成为可能。此外,与mRNA的短暂且易损的性质相反,由mRNA产生的抗体意外地持久并且可以有效地实现全身性分布。mRNA的短暂性质还可以使通常与异源核酸相关联的安全问题降至最低。因此,本发明提供一种用于治疗用途的更安全、更便宜且更有效的抗体递送方法。
在一个方面,本发明提供一种通过向有此需要的受试者施用一种或多种编码抗体的重链和轻链的mRNA进行体内递送抗体的方法,并且其中该抗体在该受试者中进行全身性表达。在一些实施方案中,一种或多种mRNA包括编码重链的第一MRNA和编码抗体的轻链的第二mRNA。在一些实施方案中,一种或多种mRNA包括编码抗体的重链和轻链的单mRNA。
在一些实施方案中,编码重链和轻链的mRNA包括编码信号肽的序列。在一些实施方案中,编码重链和轻链的mRNA包括编码人生长激素(hGH)信号肽的序列(例如,SEQIDNO:9或SEQIDNO:10)。在一些实施方案中,编码信号肽序列的序列(例如SEQIDNO:9或SEQIDNO:10)与编码重链或轻链的mRNA序列在N-末端直接或间接地相连。
在一些实施方案中,编码重链的第一mRNA和编码轻链的第二mRNA以范围介于大约10:1至1:10(例如,介于约9:1至1:9、8:1至1:8、7:1至1:7、6:1至1:6、5:1至1:5、4:1至1:4、3:1至1:3或者2:1至1:2)之间的比例存在。在一些实施方案中,编码重链的第一mRNA和编码轻链的第二mRNA以范围介于大约4:1至1:4之间的比例存在。在一些实施方案中,编码重链的第一mRNA和编码轻链的第二mRNA以大约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1的比例存在。在一些实施方案中,编码重链的第一mRNA和编码轻链的第二mRNA以大约4:1的比例存在。在一些实施方案中,编码重链的第一mRNA和编码轻链的第二mRNA以大约1:1的比例存在。在一些实施方案中,编码重链的第一mRNA和编码轻链的第二mRNA以大于1(例如,范围介于大约10:1至1:1、9:1至1:1、8:1至1:1、7:1至1:1、6:1至1:1、5:1至1:1、4:1至1:1、3:1至1:1或者2:1至1:1)的比例存在。
在一些实施方案中,一种或多种编码抗体的重链和轻链的mRNA通过聚合物和/或基于脂质的递送媒介物进行递送。在一些实施方案中,将一种或多种编码抗体的重链和轻链的mRNA包囊在一种或多种脂质体内。在一些实施方案中,将编码重链的第一mRNA和编码轻链的第二mRNA包囊在单独的脂质体中。在一些实施方案中,将编码重链的第一mRNA和编码轻链的第二mRNA包囊在相同的脂质体中。在一些实施方案中,一种或多种脂质体包括阳离子脂质、中性脂质、基于胆固醇的脂质和PEG-改性的脂质中的一种或多种。在一些实施方案中,一种或多种脂质体包括阳离子脂质、中性脂质、基于胆固醇的脂质和PEG-改性的脂质。
在一些实施方案中,一种或多种脂质体具有不大于约250nm(例如,不大于约225nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm或者50nm)的尺寸。在一些实施方案中,一种或多种脂质体具有不大于约150nm的尺寸。在一些实施方案中,一种或多种脂质体具有不大于约100nm的尺寸。在一些实施方案中,一种或多种脂质体具有不大于约75nm的尺寸。在一些实施方案中,一种或多种脂质体具有不大于约50nm的尺寸。
在一些实施方案中,一种或多种脂质体具有范围从约250–10nm(例如,范围从约225–10nm、200–10nm、175–10nm、150–10nm、125–10nm、100–10nm、75–10nm或者50–10nm)的尺寸。在一些实施方案中,一种或多种脂质体具有范围从约250–100nm(例如,范围从约225–100nm、200–100nm、175–100nm、150–100nm)的尺寸。在一些实施方案中,一种或多种脂质体具有范围从约100–10nm(例如,范围从约90–10nm、80–10nm、70–10nm、60–10nm或者50–10nm)的尺寸。
在一些实施方案中,对一种或多种mRNA经修饰以增强稳定性。在一些实施方案中,对一种或多种mRNA经修饰以包含经修饰的核苷酸、经修饰的糖骨架、帽子结构、多聚腺苷酸尾、5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中,一种或多种mRNA是未经修饰的。
在一些实施方案中,将一种或多种mRNA静脉内施用。在一些实施方案中,将一种或多种mRNA腹膜内施用。在一些实施方案中,将一种或多种mRNA皮下施用。在一些实施方案中,将一种或多种mRNA通过肺施用进行施用。
在一些实施方案中,在施用后(例如,单次施用后)至少约6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、96小时、120小时、144小时、156小时、168小时或者180小时,抗体的全身性表达是可检测到的。在一些实施方案中,在施用后(例如,单次施用后)至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、22天、25天或者30天,抗体的全身性表达是可检测到的。在一些实施方案中,在施用后(例如,单次施用后)至少约0.5周、1周、1.5周、2周、2.5周、3周、3.5周、4周、4.5周、5周、5.5周、6周、6.5周、7周、7.5周或者8周,抗体的全身性表达是可检测到的。在一些实施方案中,在施用后(例如,单次施用后)至少约1个月、2个月、3个月或者4个月,抗体的全身性表达是可检测到的。
在一些实施方案中,抗体是完整免疫球蛋白、(Fab)2、(Fab’)2、Fab、Fab’或者scFv。在一些实施方案中,抗体是IgG。在一些实施方案中,抗体选自由抗-CCL2、抗-赖氨酰氧化酶样-2(LOXL2)、抗-Flt-1、抗-TNF-α、抗-白细胞介素-2Rα受体(CD25)、抗-TGFβ、抗-B-细胞活化因子、抗-α-4整联蛋白、抗-BAGE、抗-β-连环蛋白/m、抗-Bcr-abl、抗-C5、抗-CA125、抗-CAMEL、抗-CAP-1、抗-CASP-8、抗-CD4、抗-CD19、抗-CD20、抗-CD22、抗-CD25、抗-CDC27/m、抗-CD30、抗-CD33、抗-CD52、抗-CD56、抗-CD80、抗-CDK4/m、抗-CEA、抗-CT、抗-CTL4、抗-Cyp-B、抗-DAM、抗-EGFR、抗-ErbB3、抗-ELF2M、抗-EMMPRIN、抗-EpCam、抗-ETV6-AML1、抗-HER2、抗-G250、抗-GAGE、抗-GnT-V、抗-Gp100、抗-HAGE、抗-HER-2/neu、抗-HLA-A*0201-R170I、抗-IGF-1R、抗-IL-2R、抗-IL-5、抗-MC1R、抗-肌球蛋白/m、抗-MUC1、抗-MUM-1、抗-MUM-2、抗-MUM-3、抗-蛋白酶-3、抗-p190小bcr-abl、抗-Pml/RARα、抗-PRAMS、抗-PSA、抗-PSM、抗-PSMA、抗-RAGE、抗-RANKL、抗-RU1或RU2、抗-SAGE、抗-SART-1或抗-SART-3、抗-存活蛋白(survivin)、抗-TEL/AML1、抗-TPI/m、抗-TRP-1、抗-TRP-2、抗-TRP-2/INT2,以及抗-VEGF或抗-VEGF受体组成的组。
在另一个方面,本发明提供一种通过向细胞施用编码重链的第一mRNA和编码抗体的轻链的第二mRNA产生抗体的方法,并且其中该抗体由该细胞产生。在一些实施方案中,该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中,该细胞是人类细胞。在一些实施方案中,该细胞是培养细胞。在一些实施方案中,该细胞是在活生物体内的细胞。在一些实施方案中,该抗体在细胞内进行表达。在一些实施方案中,该抗体由细胞分泌。
在又一方面中,本发明提供包含编码重链的第一mRNA和编码抗体的轻链的第二mRNA的组合物,其中将该第一mRNA和该第二mRNA包囊在一种或多种脂质体中。
在其它方面中,本发明还提供编码特定抗体例如抗-CCL2抗体的重链和轻链的示例性mRNA,以及包含所述mRNA的组合物。在某些实施方案中,本发明提供一种编码抗-CCL2抗体的重链的mRNA,其具有与本文所述的SEQIDNO:1或SEQIDNO:2至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的序列。在某些具体的实施方案中,本发明提供一种编码抗-CCL2抗体的重链的mRNA,其具有如本文所述的SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的序列。在某些实施方案中,本发明提供一种编码抗-CCL2抗体的轻链的mRNA,其具有与本文所述的SEQIDNO:3或SEQIDNO:4至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的序列。在某些具体的实施方案中,本发明提供一种编码抗-CCL2抗体的轻链的mRNA,其具有如本文所述的SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的序列。
在本申请中使用的术语“约”和“大约”作为等效项使用。本申请中使用的任何数值,在有或无约/大约的情况下,意指涵盖相关领域中的普通技术人员理解的任何正常变动。
在随后的详细描述中,本发明的其它特征、目的和优点是显而易见。然而,应理解,详细描述虽然表明本发明的实施方案,但仅以示例说明而非限制的方式提供。基于详细描述,在本发明范围内的各种变化和修改对本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图简述
以下图仅是出于示例说明目的而非限制。
图1显示在利用提供的方法用mRNA处理HCL1细胞后观察到的通过ELISA测定IgG蛋白水平的示例性条形图。
图2显示在利用提供的方法用mRNA处理细胞后观察到的通过ELISA测定IgG蛋白水平的示例性条形图。
图3描绘蛋白印迹法检测由在根据提供的方法将mRNA引入HCL1细胞中24和48小时后所得的蛋白质水平的结果。
图4显示在根据提供的方法暴露于mRNA的小鼠的血清中在6、24、48或72小时通过ELISA测定的CCL2抗体水平的示例性条形图。
图5显示在单次给药α-VEGFmRNA后通过ELISA测定在小鼠的血清中α-VEGF抗体水平的示例性条形图。
图6显示在单次给药α-VEGFmRNA后通过ELISA测定在分别标识的小鼠的血清中α-VEGF抗体水平的示例性条形图。
图7显示在用加载α-VEGFmRNA的cKK-E12脂质纳米颗粒(LNP)给药后24小时在野生型小鼠中体内产生抗-人VEGF抗体的示例性条形图。小鼠通过尾静脉注射或皮下(SC)注射进行给药。
定义
为了使本发明更易于理解,首先定义某些术语如下。对以下术语及其它术语的其它定义在整个说明书中进行阐述。
氨基酸:如本文所用的,术语“氨基酸”广义上是指可以被包括在多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中,氨基酸具有H2N–C(H)(R)–COOH的一般结构。在一些实施方案中,氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中,氨基酸是合成氨基酸;在一些实施方案中,氨基酸是d-氨基酸;在一些实施方案中,氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除了标准氨基酸之外的任何氨基酸,无论它是经合成制得或者从天然来源获得。如本文所用的,“合成氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸,包括但不限于盐、氨基酸衍生物(如,酰胺)和/或取代物。对氨基酸,包括肽中的羧基-末端和/或氨基-末端的氨基酸,可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基,和/或用可改变该肽的循环半衰期而不负面影响它们的活性的其它化学基团取代进行修饰。氨基酸可以参与二硫键中。氨基酸可以包括一种修饰或者翻译后修饰,如,与一种或多种化学实体(例如,甲基、乙酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸酯基、聚乙二醇部分、脂质部分、糖部分、生物素部分等)结合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换地使用,并且可以指游离的氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从该术语所用于的上下文中可显而易见它是指游离的氨基酸还是指肽的残基。
动物:如本文所用的,术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中,“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施方案中,“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中,非人类动物是哺乳动物(例如,啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中,动物包括但不限于,哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中,动物可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆。
抗体:如本文所用的,术语“抗体”涵盖完整抗体和抗体片段。通常完整“抗体”是与特定的抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体可以是任何免疫球蛋白类别的成员,包括人类别的任一种:IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。如本领域中理解的典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元已知包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成,每对具有一条“轻”链(大约25kD)和一条“重”链(大约50-70kD)。每条链的N-末端限定主要负责抗原识别的具有约100至110或更多个氨基酸的可变区。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别是指这些轻链和重链。每个可变区进一步细分为高变区(HV)和框架区(FR)。高变区包括由形成β片层结构并用作骨架以使HV区保持在位置的四个框架区(FR1、FR2、FR2和FR4)分隔的称为互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)的高变性序列的三个区域。每条重链和轻链的C-末端限定由轻链的一个域(CL)和重链的三个域(CH1、CH2和CH3)组成的恒定区。在一些实施方案中,在提及抗体使用的术语“完整抗体”或“完全组装的抗体”意指它包括两条重链和两条轻链,该两条重链和两条轻链任选地通过二硫键相连,正如天然产生的抗体发生的。在一些实施方案中,根据本发明的抗体是抗体片段。如本文所用的,“抗体片段”包括完整抗体的部分,如,例如,抗体的抗原结合区或者可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段;三链抗体(triabody);四链抗体(tetrabody);线形抗体;单链抗体分子;以及由抗体片段形成的多特异性抗体。例如,抗体片段包括分离的片段、由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段、其中轻链和重链可变区通过肽接头相连的重组单链多肽分子(“ScFv蛋白”),以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最短识别单元。在许多实施方案中,抗体片段包含母体抗体的足够的序列以便它与母体抗体所结合的相同抗原结合,该抗体片段是该母体抗体的片段;在一些实施方案中,片段以与母体抗体相当的亲和力与抗原结合和/或为了与抗原结合而与母体抗体竞争。抗体的结合抗原的片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双链抗体(diabody)、dAb片段、Fd’片段、Fd片段,以及分离的互补决定区(CDR)区。
大约或约:如本文所用的,术语“大约”或“约”在应用于一个或多个相关的值时是指与所指的值相似的值。在某些实施方案中,除非另有说明或者从上下文显而易见有所不同(除了此类数值将超过可能值的100%的情况之外),术语“大约”或“约”是指以任一方向在(大于或小于)所述参考值的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小的范围内的值。
生物利用度:如本文所用的,术语“生物利用度”通常是指到达受试者的血流的施用剂量的百分比。
生物活性:如本文所用的,短语“生物活性”是指在生物体系中,特别是在生物体中具有活性的任何药物的特征。例如,在向生物体施用时对该生物体具有生物学效应的药物被视为具有生物活性。
表达:如本文所用的,核酸序列的“表达”是指将mRNA翻译成多肽(例如,抗体的重链或轻链)、将多个多肽(例如,抗体的重链或轻链)组装成完整蛋白(例如,抗体)和/或将多肽或完全组装的蛋白(例如,抗体)翻译后修饰。在本申请中,术语“表达”和“产生”以及语法等效项可互换使用。
功能性:如本文所用的,“功能性”生物分子是处于其呈现出它特征性的性质和/或活性的形式的生物分子。
GC含量:如本文所用的,“GC含量”是在核酸序列中鸟嘌呤残基、胞嘧啶残基或它们的类似物占总核碱基残基的分数或百分比。例如,包含确切30个胞嘧啶、确切30个鸟嘌呤、确切1个胞嘧啶类似物以及确切1个鸟嘌呤类似物的100nt序列具有62%的GC丰富度。
半衰期:如本文所用的,术语“半衰期”是数量如蛋白浓度或活性降至在时间段起点测得它的值的一半所需的时间。
改进、增高或降低:如本文所用的,术语“改进”、“增高”或“降低”或者语法等效项表明相对于基线测量值如在开始本文所述的治疗之前在相同个体中的测量值或者在没有本文所述的治疗下在对照受试者(或多个对照受试者)中的测量值的值。“对照受试者”是罹患与接受治疗的受试者相同的疾病形式的受试者,其与该接受治疗的受试者的年龄大约相同。
体外:如本文所用的,术语“体外”是指发生在人工环境中,例如,在试管或反应容器中,在细胞培养物等中而不是在多细胞生物体内的事件。
体内:如本文所用的,术语“体内”是指发生在多细胞生物体如人和非人类动物内的事件。在基于细胞的系统的上下文中,该术语可以用来指发生在活细胞(与例如体外系统相对)内的事件。
分离的:如本文所用的,术语“分离的”是指物质和/或实体,其已经(1)与在最初产生(无论在自然界中和/或在试验环境中)时与它结合的组分中的至少一些分离,和/或(2)通过人工进行生产、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以从与它们最初结合的其它组分的约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或者大于约99%分离。在一些实施方案中,分离的药物是约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或者大于约99%纯度。在本文中使用时,若物质基本上不含有其它组分,则它是“纯的”。在本文中使用时,分离的物质和/或实体的百分比纯度的计算不应该包括赋形剂(例如,缓冲剂、溶剂、水等)。
接头:如本文所用的,术语“接头”是指,在融合蛋白中,并非出现在天然蛋白中的特定位置处并且通常设计为柔性或者将结构如α-螺旋插入在两个蛋白部分之间的氨基酸序列。接头也称为间隔物。接头或间隔物通常本身不具有生物功能。
局部分布或递送:如本文所用的,术语“局部分布”、“局部递送”或者语法等效项是指组织特异性的递送或分布。通常,局部分布或递送要求由mRNA编码的蛋白(例如,抗体)在细胞内进行翻译和表达或者具有避免进入患者的循环系统的有限的分泌。
信使RNA(mRNA):如本文所用的,术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文所用的,mRNA涵盖经修饰的和未经修饰的RNA。mRNA可以包括一个或多个编码区和非编码区。
核酸:如本文所用的,术语“核酸”广义上是指是多核苷酸链或者可以被包括在多核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中,核酸是多核苷酸链或者可以通过磷酸二酯键被包括在多核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施方案中,“核酸”是指单个的核酸残基(例如,核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中,“核酸”是指包含单个的核酸残基的多核苷酸链。在一些实施方案中,“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链的DNA和/或cDNA。此外,术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似的术语包括核酸类似物,即,具有除磷酸二酯骨架之外的类似物。例如,所谓的“肽核酸”是本领域已知的,并且在骨架中具有肽键而不是磷酸二酯键,被视为在本发明的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此的简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和/或RNA的核苷酸序列可以包括内含子。核酸可以从天然来源进行纯化,利用重组表达系统产生,并任选地进行纯化,化学合成等。在适当的情况中,例如,在化学合成的分子的情况下,核酸可以包括核苷类似物如具有经化学修饰的碱基或糖的类似物,骨架修饰等。除非另外指明,核酸序列以5’至3’方向表示。在一些实施方案中,核酸是或者包括天然核苷(例如,腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷);核苷类似物(例如,2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-去氮杂腺苷、7-去氮杂鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟苷和2-硫代胞苷);化学修饰的碱基;生物修饰的碱基(例如甲基化的碱基);嵌入碱基;经修饰的糖(例如,2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖);和/或经修饰的磷酸基(例如,硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺键)。在一些实施方案中,本发明具体地涉及“未经修饰的核酸”,意指尚未为了促进或实现递送而进行化学修饰的核酸(例如,多核苷酸和残基,包括核苷酸和/或核苷)。
患者:如本文所用的,术语“患者”或“受试者”是指为了例如试验、诊断、预防、美容和/或治疗目的可以向其施用提供的组合物的任何生物体。通常患者包括动物(例如,哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在一些实施方案中,患者是人。人包括产前和产后的形式。
药学上可接受的:如本文所用的,术语“药学上可接受的”是指物质在合理的医学判断的范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、变态反应或其它问题或并发症,与合理的利益/风险比相匹配。
全身性分布或递送:如本文所用的,术语“全身性分布”、“全身性递送”或者语法等效项是指影响整个身体或整个生物体的递送或分布机制或方法。通常全身性分布或递送通过身体的循环系统例如血流来完成。与“局部分布或递送”的定义比较。
受试者:如本文所用的,术语“受试者”是指人或者任何非人动物(例如,小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长动物)。人包括产前和产后的形式。在许多实施方案中,受试者是人类。受试者可以是患者,其是指向医疗提供方寻求疾病的诊断或治疗的人。本文中使用的术语“受试者”与“个体”或“患者”可互换地使用。受试者可以罹患或者易患疾病或病症但是可能或可能不呈现出该疾病或病症的症状。
基本上:如本文所用的,术语“基本上”是指展现出完全或接近完全范围或程度的相关特征或性质的定性状态。任何生物学领域普通技术人员可理解生物和化学现象很少,难得彻底完成和/或持续完成或者获得或避免绝对结果。因此,术语“基本上”在本文中用来表现固有存在于许多生物和化学现象中的完全性的潜在缺乏。
靶组织:如本文所用的,术语“靶组织”是指受待治疗的疾病影响的任何组织。在一些实施方案中,靶组织包括呈现出疾病相关联的病理学、症状或特点的那些组织。
治疗有效量:如本文所用的,术语治疗剂的“治疗有效量”意指在向患有或易患疾病、病症和/或病况的受试者施用时足以治疗、诊断、防止和/或延迟该疾病、病症和/或病况的症状的发作的量。本领域的普通技术人员可理解治疗有效量通常是通过包括至少一个单位剂量的给药方案进行施用。
治疗:如本文所用的,术语“治疗”或“疗法”是指用来部分或完全地减轻、改善、缓解、抑制、防止、延迟特定疾病、病症和/或病况的一种或多种症状或特点发作,减轻其严重性和/或降低其发病率的任何方法。为了降低出现与疾病相关的病理的风险的目的,可以将治疗施用于未呈现出疾病的体征和/或仅呈现出该疾病的早期体征的受试者。
详述
本发明尤其提供基于mRNA递送技术用于体内递送抗体的方法和组合物。在一些实施方案中,本发明提供一种通过向有递送需要的受试者施用一种或多种编码抗体的重链和轻链的mRNA进行递送抗体的方法。在一些实施方案中,抗体的重链和轻链通过单独的mRNA进行递送。在一些实施方案中,抗体的重链和轻链通过相同的mRNA进行递送。mRNA可以作为包装的颗粒(例如,包囊在基于脂质体或基于聚合物的媒介物中)或者未经包装(即,裸露的)进行递送。mRNA编码的抗体可以在受试者中局部(例如以组织特异性的方式)或全身性地进行表达。
在以下章节中详细描述本发明的各方面。章节的使用并非意在限制本发明。每个章节可以应用于本发明的任何方面。在本申请中,除非另外说明,“或者”的使用意指“和/或”。
mRNA编码的抗体
本发明可以用来递送任何类型的抗体。如本文所用的,术语“抗体”涵盖完整抗体和抗体片段。通常完整“抗体”是与特定的抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体可以是任何免疫球蛋白类别的成员,包括人类别的任一种:IgG、IgM、IgE、IgA和IgD。通常完整抗体是四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成,每对具有一条“轻”链(大约25kD)和一条“重”链(大约50-70kD)。每条链的N-末端限定主要负责抗原识别的具有约100至110或更多个氨基酸的可变区。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别是指在轻链和重链上的这些相应的区。每个可变区可以被进一步细分为高变区(HV)和框架区(FR)。高变区包括由形成β片层结构并用作骨架以使HV区保持在位置的四个框架区(FR1、FR2、FR2和FR4)分隔的称为互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)的高变性序列的三个区域。每条重链和轻链的C-末端限定由轻链的一个域(CL)和重链的三个域(CH1、CH2和CH3)组成的恒定区。免疫球蛋白的轻链可以进一步分化成κ和λ同种型。
在一些实施方案中,术语“完整抗体”或“完全组装的抗体”用来指抗体,抗体包括两条重链和两条轻链,两条重链和两条轻链任选地通过二硫键相连,正如天然产生的抗体发生的。在一些实施方案中,根据本发明的抗体是抗体片段。
在一些实施方案中,本发明可以用来递送“抗体片段”。如本文所用的,“抗体片段”包括完整抗体的部分,如,抗体的抗原结合区或者可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段;三链抗体;四链抗体;线形抗体;单链抗体分子;以及由抗体片段形成的多特异性抗体。例如,抗体片段包括分离的片段、由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段、其中轻链和重链可变区通过肽接头相连的重组单链多肽分子(“ScFv蛋白”),以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最短识别单元。在许多实施方案中,抗体片段包含母体抗体的足够的序列以便它与母体抗体所结合的相同抗原结合,该抗体片段是该母体抗体的片段;在一些实施方案中,片段以与母体抗体相当的亲和力与抗原结合和/或为了与抗原结合而与母体抗体竞争。抗体的抗原结合的片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双链抗体、dAb片段、Fd’片段、Fd片段,以及分离的互补决定区(CDR)。
本发明可以用来递送本领域中已知的任何抗体以及可利用标准方法对抗期望的抗原产生的抗体。本发明可以用来递送单克隆抗体、多克隆抗体、抗体混合物或混合剂、人或人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
示例性抗体包括但不限于,抗-趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、抗-赖氨酰氧化酶样-2(LOXL2)、抗-Flt-1、抗-TNF-α、抗-白细胞介素-2Rα受体(CD25)、抗-TGFβ、抗-B-细胞活化因子、抗-α-4整联蛋白、抗-BAGE、抗-β-连环蛋白/m、抗-Bcr-abl、抗-C5、抗-CA125、抗-CAMEL、抗-CAP-1、抗-CASP-8、抗-CD4、抗-CD19、抗-CD20、抗-CD22、抗-CD25、抗-CDC27/m、抗-CD30、抗-CD33、抗-CD52、抗-CD56、抗-CD80、抗-CDK4/m、抗-CEA、抗-CT、抗-CTL4、抗-Cyp-B、抗-DAM、抗-EGFR、抗-ErbB3、抗-ELF2M、抗-EMMPRIN、抗-EpCam、抗-ETV6-AML1、抗-HER2、抗-G250、抗-GAGE、抗-GnT-V、抗-Gp100、抗-HAGE、抗-HER-2/neu、抗-HLA-A*0201-R170I、抗-IGF-1R、抗-IL-2R、抗-IL-5、抗-MC1R、抗-肌球蛋白/m、抗-MUC1、抗-MUM-1、抗-MUM-2、抗-MUM-3、抗-蛋白酶-3、抗-p190小bcr-abl、抗-Pml/RARα、抗-PRAMS、抗-PSA、抗-PSM、抗-PSMA、抗-RAGE、抗-RANKL、抗-RU1或RU2、抗-SAGE、抗-SART-1或抗-SART-3、抗-存活蛋白(survivin)、抗-TEL/AML1、抗-TPI/m、抗-TRP-1、抗-TRP-2、抗-TRP-2/INT2,以及抗-VEGF或抗-VEGF受体。
编码重链和轻链的mRNA
根据本发明,抗体(例如,完整抗体和抗体片段)可以通过在该细胞和活生物体内部外源性mRNA翻译而在细胞或活生物体中产生。具体地,根据本发明,完全组装的多链抗体的产生可以通过递送编码抗体的重链和轻链的外源性mRNA而在细胞或活生物体中完成。在一些实施方案中,产生包括两条重链和两条轻链的四聚体。
如本文所用的,术语“重链”涵盖不同类别的免疫球蛋白的所有类型的天然存在的重链,包括但不限于,IgM(μ)、IgD(δ)、IgG(γ)、IgA(α)和IgE(ε),以及它们的生物活性变体。通常,根据本发明的重链包含负责抗原识别的N-末端可变区,通常包括由四个框架区(FR1、FR2、FR2和FR4)分隔的CDR1、CDR2和CDR3。通常,N-末端可变区包含约100至110或更多个氨基酸。在一些实施方案中,根据本发明的重链包含一个或多个恒定域(例如,CH1、CH2和/或CH3)。在一些实施方案中,编码抗体的重链的mRNA具有或大于0.3kb、0.5kb、0.75kb、1.0kb、1.25kb、1.5kb、1.75kb、2.0kb、2.5kb、3.0kb、3.5kb、4.0kb的长度。
如本文所用的,术语“轻链”涵盖不同类别的免疫球蛋白的所有类型的天然存在的轻链,包括但不限于κ或λ同种型,以及它们的生物活性变体。通常,根据本发明的轻链包含N-末端可变域(VL)。在一些实施方案中,根据本发明的轻链包含C-末端恒定域(CL)。在一些实施方案中,编码抗体的轻链的mRNA具有或大于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1.0kb、1.25kb、1.5kb、1.75kb、2.0kb、2.5kb或者3.0kb的长度。
通常,四聚体抗体包含由mRNA编码的两条重链和两条轻链,每条通过二硫桥结合在一起。
根据本发明,抗体的重链和轻链可以通过单mRNA或单独的mRNA进行编码和递送。考虑到为了优化完全组装的功能性抗体的生产,以不同的比例递送编码重链的mRNA和编码轻链的mRNA可能是有利的。因此,在一些实施方案中,编码重链的mRNA(也称为第一mRNA)和编码轻链的mRNA(也称为第二mRNA)以范围介于大约10:1至1:10(例如,介于大约9:1至1:9、8:1至1:8、7:1至1:7、6:1至1:6、5:1至1:5、4:1至1:4、3:1至1:3或者2:1至1:2)之间的比例进行递送。在一些实施方案中,编码重链的mRNA(也称为第一mRNA)和编码轻链的mRNA(也称为第二mRNA)以是或大于大约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或者1:1的比例进行递送。在一些实施方案中,编码重链的mRNA(也称为第一mRNA)和编码轻链的mRNA(也称为第二mRNA)以约1:1(即,等摩尔)的比例进行递送。在一些实施方案中,编码重链的mRNA(也称为第一mRNA)和编码轻链的mRNA(也称为第二mRNA)以并非1:1(等摩尔)的比例进行递送。例如,编码重链的mRNA(也称为第一mRNA)和编码轻链的mRNA(也称为第二mRNA)以大于1(例如,范围介于大约10:1至1:1、9:1至1:1、8:1至1:1、7:1至1:1、6:1至1:1、5:1至1:1、4:1至1:1、3:1至1:1或者2:1至1:1之间)的比例进行递送。或者,编码重链的mRNA(也称为第一mRNA)和编码轻链的mRNA(也称为第二mRNA)以小于1(例如,范围介于大约1:1至1:10、1:1至1:9、1:1至1:8、1:1至1:7、1:1至1:6、1:1至1:5、1:1至1:4、1:1至1:3或者1:1至1:2之间)的比例进行递送。
信号肽
在一些实施方案中,编码重链和轻链的mRNA包括编码信号肽的核苷酸序列。如本文所用的,术语“信号肽”是指呈现在新合成的蛋白处的可使该蛋白靶向分泌途径的肽。通常,在mRNA的翻译后接着转运入内质网中之后,信号肽被切割。信号肽也称为信号序列、前导序列或前导肽。通常信号肽是短肽(例如,5-30、5-25、5-20、5-15或者5-10个氨基酸长度)。信号肽可以存在于新合成的蛋白的N-末端。不期望拘于任何特定的理论,在编码重链和/或轻链的mRNA上包含编码信号肽的序列可以促进由该mRNA体内产生的抗体的分泌和/或产生。
对于本发明适合的信号肽可以是从各种真核蛋白和原核蛋白尤其分泌蛋白得到的异源序列。在一些实施方案中,适合的信号肽是富亮氨酸序列。参见YamamotoY等(1989),Biochemistry,28:2728-2732,其通过引用并入本文中。适合的信号肽可以从人生长激素(hGH)、血清白蛋白前蛋白原、Igκ轻链前体、天青杀素(Azurocidin)前蛋白原、胱抑素(cystatin)-S前体、胰蛋白酶原2前体、钾通道阻滞剂、α芋螺毒素lp1.3、α芋螺毒素、α-半乳糖苷酶、纤维素、天冬氨酸蛋白酶猪笼草蛋白酶-1、酸壳多糖酶、K28前原毒素(prepro-toxin)、杀伤毒素zygocin前体以及霍乱毒素得到。示例性信号肽序列在Kober,等,Biotechnol.Bioeng.,110:1164-73,2012中描述,其通过引用并入本文中。
在一些实施方案中,编码重链和/或轻链的mRNA可以包括编码从人生长激素(hGH)得到的信号肽的序列,或其片段。编码hGH信号肽的非限制性核苷酸序列如下所示。
5’人生长激素(hGH)序列(SEQIDNO:9):
AUGGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGACUGCUUUGCCUGCCCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCAUCCCACUCUCC
替代5’人生长激素(hGH)序列(SEQIDNO:10):
AUGGCAACUGGAUCAAGAACCUCCCUCCUGCUCGCAUUCGGCCUGCUCUGUCUCCCAUGGCUCCAAGAAGGAAGCGCGUUCCCCACUAUCCCCCUCUCG
在一些实施方案中,根据本发明的mRNA可以包括编码信号肽的序列,该序列与SEQIDNO:9或SEQIDNO:10具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性。
mRNA的合成
根据本发明的mRNA可以按照各种已知方法中的任一种进行合成。例如,根据本发明的mRNA可以通过体外转录(IVT)进行合成。简言之,IVT通常利用包含启动子的线形或环状DNA模板、核糖核苷三磷酸库、可包含DTT和镁离子的缓冲体系,以及适当的RNA聚合酶(例如,T3、T7或SP6RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂进行。确切的条件可根据具体的应用而改变。
在一些实施方案中,为了制备根据本发明的编码抗体的mRNA,将DNA模板在体外进行转录。适合的DNA模板通常具有用于体外转录的启动子,例如T3、T7或SP6启动子,后接用于期望的编码抗体(例如,编码重链或轻链)的mRNA的期望的核苷酸序列,以及终止信号。
根据本发明期望的编码抗体(例如,编码重链或轻链)的mRNA序列可以利用标准方法进行确定并插入在DNA模板中。例如,起始于期望的氨基酸序列(例如,期望的重链或轻链序列),基于简并的遗传密码进行实质逆向翻译。然后优化算法可以用于选择适合的密码子。通常,可以优化G/C含量,从而在一方面实现最高可能的G/C含量,在另一方面根据密码子使用最大可能地考虑tRNA的频率。例如,借助于适当的显示装置并与原始(野生型)序列比较,可以建立并显示优化的RNA序列。还可以分析二级结构以分别计算RNA的区的稳定性和不稳定性。
根据本发明的mRNA可以被合成为未经修饰的或经修饰的mRNA。通常,修饰mRNA以增强稳定性。mRNA的修饰可以包括,例如,RNA的核苷酸的修饰。因此根据本发明的经修饰的mRNA可以包含例如骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中,编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)可以从天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)进行合成,该核苷酸和/或核苷酸类似物包括但不限于,嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)),以及经修饰的核苷酸类似物或者嘌呤和嘧啶的衍生物,如,1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、queosine、β-D-甘露糖基-queosine、wybutoxosine、以及氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-去氮杂鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。此类类似物的制备是本领域技术人员已知的,例如,从美国专利No.4,373,071、美国专利No.4,401,796、美国专利No.4,415,732、美国专利No.4,458,066、美国专利No.4,500,707、美国专利No.4,668,777、美国专利No.4,973,679、美国专利No.5,047,524、美国专利No.5,132,418、美国专利No.5,153,319、美国专利No.5,262,530和5,700,642获悉,其公开内容通过引用以它的全部范围包括在本文中。
在一些实施方案中,编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)可以包含RNA骨架修饰。通常,骨架修饰是其中RNA中所含的核苷酸的骨架的磷酸被化学修饰的修饰。示例性骨架修饰通常包括但不限于,来自由以下组成的组中的修饰:甲基膦酸酯、氨基磷酸甲酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(例如,胞苷5'-O-(1-硫代磷酸酯))、硼磷酸酯(boranophosphate)、带正电荷的胍基等,这意味着磷酸二酯键被其它阴离子、阳离子或中性基团替代。
在一些实施方案中,编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)可以包含糖修饰。典型的糖修饰是它所含的核苷酸的糖的化学修饰,该核苷酸包括但不限于选自由以下组成的组中的糖修饰:2'-脱氧-2'-氟-寡核糖核苷酸(2'-氟-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氟-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-脱氧-2'-脱氨-寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-O-烷基寡核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-C-烷基寡核糖核苷酸(2'-O-甲基胞苷5'-三磷酸、2'-甲基尿苷5'-三磷酸)、2'-C-烷基寡核糖核苷酸,以及它们的异构体(2'-阿糖胞苷5'-三磷酸、2'-阿糖尿苷5'-三磷酸),或者叠氮三磷酸(2'-叠氮-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-叠氮-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)。
在一些实施方案中,编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)可以包含核苷酸的碱基的修饰(碱基修饰)。包含碱基修饰的经修饰的核苷酸也称为碱基修饰的核苷酸。此类碱基修饰的核苷酸的实例包括但不限于,2-氨基-6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、2-氨基腺苷5'-三磷酸、2-硫代胞苷5'-三磷酸、2-硫代尿苷5'-三磷酸、4-硫代尿苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷5'-三磷酸、5-溴胞苷5'-三磷酸、5-溴尿苷5'-三磷酸、5-碘胞苷5'-三磷酸、5-碘尿苷5'-三磷酸、5-甲基胞苷5'-三磷酸、5-甲基尿苷5'-三磷酸、6-氮杂胞苷5'-三磷酸、6-氮杂尿苷5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、7-脱氮腺苷5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷5'-三磷酸、8-氮杂腺苷5'-三磷酸、8-叠氮基腺苷5'-三磷酸、苯并咪唑核苷5'-三磷酸、N1-甲基腺苷5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷5'-三磷酸、N6-甲基腺苷5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷5'-三磷酸、假尿苷5'-三磷酸、嘌呤霉素5'-三磷酸或黄苷5'-三磷酸。
通常,mRNA合成包括添加在N-末端(5’)端上的“帽”以及在C-末端(3’)端上的“尾”。帽存在的重要性在于提供对存在于大多数真核细胞中的核酸酶的抗性。“尾”的存在用来保护mRNA免于核酸外切酶降解。
因此,在一些实施方案中,编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)可以包含5’帽子结构。5’帽子结构通常如下进行添加:首先,RNA末端磷酸酶从5’核苷酸除去末端磷酸基之一,剩下两个末端磷酸;然后通过鸟苷酸转移酶将鸟苷三磷酸(GTP)加到末端磷酸,产生5’5’5三磷酸键;而后通过甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽子结构的实例包括但不限于,m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。
在一些实施方案中,编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)可以包含3’多聚腺苷酸尾结构。在mRNA的3'末端上的多聚腺苷酸尾通常包含约10至300个腺苷核苷酸(例如,约10至200个腺苷核苷酸、约10至175个腺苷核苷酸、约10至150个腺苷核苷酸、约约10至125个腺苷核苷酸、10至100个腺苷核苷酸、约10至75个腺苷核苷酸、约20至70个腺苷核苷酸,或者约20至60个腺苷核苷酸)。在一些实施方案中,编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)包含3’多聚胞苷酸尾结构。在mRNA的3'末端上的适合多聚胞苷酸尾通常包含约10至200个胞嘧啶核苷酸(例如,约10至150个胞嘧啶核苷酸、约10至100个胞嘧啶核苷酸、约20至70个胞嘧啶核苷酸、约20至60个胞嘧啶核苷酸,或者约10至40个胞嘧啶核苷酸)。可以将多聚胞苷酸尾添加到多聚腺苷酸尾或者可以替代多聚腺苷酸尾。
在一些实施方案中,编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)包含5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中,5’非翻译区包含影响mRNA稳定性或翻译的一个或多个元件,例如,铁响应元件。在一些实施方案中,5’非翻译区可以是介于约50和500个核苷酸之间的长度(例如,约50和400个核苷酸之间的长度、约50和300个核苷酸之间的长度、约50和200个核苷酸之间的长度,或者约50和100个核苷酸之间的长度)。
在一些实施方案中,编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)的5’区包含编码信号肽例如本文所述的那些信号肽的序列。在具体的实施方案中,将源于人生长激素(hGH)的信号肽(例如,SEQIDNO:9)包括在5’区中。通常,编码信号肽的序列(例如,编码hGH信号肽的序列如SEQIDNO:9)与编码重链或轻链的序列在N-末端直接或间接地相连。
编码抗-CCL2的重链和轻链的示例性mRNA
作为非限制性实例,编码抗-CCL2抗体的重链和轻链的mRNA在实施例1中进行了描述。没有和具有5’和3’UTR序列的编码重链的mRNA以下分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。没有和具有5’和3’UTR序列的编码轻链的mRNA以下分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。
没有5’和3’UTR的重链抗-CCL2(HC-αCCL2)mRNA(SEQIDNO:1):
AUGGAAUUCGGCCUGAGCUGGCUGUUCCUGGUGGCCAUCCUGAAGGGCGUGCAGUGCCAGGUCCAGCUGGUGCAGUCUGGCGCCGAAGUGAAGAAACCCGGCUCCUCCGUGAAGGUGUCCUGCAAGGCCUCCGGCGGCACCUUCUCCAGCUACGGCAUCUCCUGGGUCCGACAGGCCCCAGGCCAGGGCCUGGAAUGGAUGGGCGGCAUCAUCCCCAUCUUCGGCACCGCCAACUACGCCCAGAAAUUCCAGGGCAGAGUGACCAUCACCGCCG
ACGAGUCCACCUCCACCGCCUACAUGGAACUGUCCUCCCUGCGGAGCGAGGACACCGCCGUGUACUACUGCGCCAGAUACGACGGCAUCUACGGCGAGCUGGACUUCUGGGGCCAGGGCACCCUGGUCACCGUGUCCUCUGCCAAGACCACCCCCCCCUCCGUGUACCCUCUGGCCCCUGGCUCUGCCGCCCAGACCAACUCUAUGGUCACCCUGGGCUGCCUGGUCAAGGGCUACUUCCCCGAGCCCGUGACCGUGACCUGGAACUCCGGCUCCCUGUCCUCCGGCGUGCACACCUUCCCUGCCGUGCUGCAGUCCGACCUCUACACCCUGUCCAGCAGCGUGACCGUGCCCUCCUCCACCUGGCCCUCCGAGACAGUGACCUGCAACGUGGCCCACCCCGCCUCCAGCACCAAGGUGGACAAGAAAAUCGUGCCCCGGGACUGCGGCUGCAAGCCCUGCAUCUGUACCGUGCCCGAGGUGUCCUCCGUGUUCAUCUUCCCACCCAAGCCCAAGGACGUGCUGACCAUCACACUGACCCCCAAAGUGACCUGCGUGGUGGUGGACAUCUCCAAGGACGACCCCGAGGUGCAGUUCAGUUGGUUCGUGGACGACGUGGAAGUGCACACCGCUCAGACCCAGCCCAGAGAGGAACAGUUCAACUCCACCUUCAGAUCCGUGUCCGAGCUGCCCAUCAUGCACCAGGACUGGCUGAACGGCAAAGAAUUCAAGUGCAGAGUGAACUCCGCCGCCUUCCCAGCCCCCAUCGAAAAGACCAUCUCCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGUCUACACCAUCCCCCCACCCAAAGAACAGAUGGCCAAGGACAAGGUGUCCCUGACCUGCAUGAUCACCGAUUUCUUCCCAGAGGACAUCACCGUGGAAUGGCAGUGGAACGGCCAGCCCGCCGAGAACUACAAGAACACCCAGCCCAUCAUGGACACCGACGGCUCCUACUUCGUGUACUCCAAGCUGAACGUGCAGAAGUCCAACUGGGAGGCCGGCAACACCUUCACCUGUAGCGUGCUGCACGAGGGCCUGCACAACCACCACACCGAGAAGUCCCUGUCCCACUCCCCCGGCAAGUGA
具有5’和3’UTR的重链抗-CCL2(HC-αCCL2)mRNA(SEQIDNO:2):
(5’和3’UTR序列加有下划线)
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG UGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGAAUUCGGCCUGAGCUGGCUGUUCCUGGUGGCCAUCCUGAAGGGCGUGCAGUGCCAGGUCCAGCUGGUGCAGUCUGGCGCCGAAGUGAAGAAACCCGGCUCCUCCGUGAAGGUGUCCUGCAAGGCCUCCGGCGGCACCUUCUCCAGCUACGGCAUCUCCUGGGUCCGACAGGCCCCAGGCCAGGGCCUGGAAUGGAUGGGCGGCAUCAUCCCCAUCUUCGGCACCGCCAACUACGCCCAGAAAUUCCAGGGCAGAGUGACCAUCACCGCCGACGAGUCCACCUCCACCGCCUACAUGGAACUGUCCUCCCUGCGGAGCGAGGACACCGCCGUGUACUACUGCGCCAGAUACGACGGCAUCUACGGCGAGCUGGACUUCUGGGGCCAGGGCACCCUGGUCACCGUGUCCUCUGCCAAGACCACCCCCCCCUCCGUGUACCCUCUGGCCCCUGGCUCUGCCGCCCAGACCAACUCUAUGGUCACCCUGGGCUGCCUGGUCAAGGGCUACUUCCCCGAGCCCGUGACCGUGACCUGGAACUCCGGCUCCCUGUCCUCCGGCGUGCACACCUUCCCUGCCGUGCUGCAGUCCGACCUCUACACCCUGUCCAGCAGCGUGACCGUGCCCUCCUCCACCUGGCCCUCCGAGACAGUGACCUGCAACGUGGCCCACCCCGCCUCCAGCACCAAGGUGGACAAGAAAAUCGUGCCCCGGGACUGCGGCUGCAAGCCCUGCAUCUGUACCGUGCCCGAGGUGUCCUCCGUGUUCAUCUUCCCACCCAAGCCCAAGGACGUGCUGACCAUCACACUGACCCCCAAAGUGACCUGCGUGGUGGUGGACAUCUCCAAGGAC
GACCCCGAGGUGCAGUUCAGUUGGUUCGUGGACGACGUGGAAGUGCACACCGCUCAGACCCAGCCCAGAGAGGAACAGUUCAACUCCACCUUCAGAUCCGUGUCCGAGCUGCCCAUCAUGCACCAGGACUGGCUGAACGGCAAAGAAUUCAAGUGCAGAGUGAACUCCGCCGCCUUCCCAGCCCCCAUCGAAAAGACCAUCUCCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGUCUACACCAUCCCCCCACCCAAAGAACAGAUGGCCAAGGACAAGGUGUCCCUGACCUGCAUGAUCACCGAUUUCUUCCCAGAGGACAUCACCGUGGAAUGGCAGUGGAACGGCCAGCCCGCCGAGAACUACAAGAACACCCAGCCCAUCAUGGACACCGACGGCUCCUACUUCGUGUACUCCAAGCUGAACGUGCAGAAGUCCAACUGGGAGGCCGGCAACACCUUCACCUGUAGCGUGCUGCACGAGGGCCUGCACAACCACCACACCGAGAAGUCCCUGUCCCACUCCCCCGGCAAGUGACGGGUGGCAUCCC UGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCA CCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
没有5’和3’UTR的轻链抗-CCL2(LC-αCCL2)mRNA(SEQIDNO:3):
AUGGAAACCCCUGCCCAGCUGCUGUUCCUGCUGCUGCUGUGGCUGCCUGAUACCACCGGCGAAAUCGUGCUGACCCAGUCCCCCGCCACCCUGUCUCUGAGCCCUGGCGAGAGAGCCACCCUGAGCUGCAGAGCCUCCCAGUCCGUGUCCGACGCCUACCUGGCCUGGUAUCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCUCGGCUGCUGAUCUACGACGCCUCCUCUAGAGCCACCGGCGUGCCCGCCAGAUUCUCCGGCUCUGGCUCUGGCACCGACUUCACCCUGACCAUCUCCAGCCUGGAACCCGAGGACUUCGCCGUGUACUACUGCCACCAGUACAUCCAGCUGCACAGCUUCACCUUCGGCCAGGGCACCAAGGUGGAAAUCAAGGCCGAUGCCGCCCCUACCGUGUCCAUCUUCCCACCCUCCAGCGAGCAGCUGACCUCUGGCGGCGCUUCCGUCGUGUGCUUCCUGAACAACUUCUACCCCAAGGACAUCAACGUGAAGUGGAAGAUCGACGGCUCCGAGCGGCAGAACGGCGUGCUGAACUCCUGGACCGACCAGGACUCCAAGGACAGCACCUACUCCAUGUCCUCCACCCUGACCCUGACCAAGGACGAGUACGAGCGGCACAACUCCUAUACCUGCGAGGCCACCCACAAGACCUCCACCUCCCCCAUCGUGAAGUCCUUCAACCGGAACGAGUGCUGA
具有5’和3’UTR的轻链抗-CCL2(LC-αCCL2)mRNA(SEQIDNO:4):
(5’和3’UTR序列加有下划线)
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG UGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGAAACCCCUGCCCAGCUGCUGUUCCUGCUGCUGCUGUGGCUGCCUGAUACCACCGGCGAAAUCGUGCUGACCCAGUCCCCCGCCACCCUGUCUCUGAGCCCUGGCGAGAGAGCCACCCUGAGCUGCAGAGCCUCCCAGUCCGUGUCCGACGCCUACCUGGCCUGGUAUCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCUCGGCUGCUGAUCUACGACGCCUCCUCUAGAGCCACCGGCGUGCCCGCCAGAUUCUCCGGCUCUGGCUCUGGCACCGACUUCACCCUGACCAUCUCCAGCCUGGAACCCGAGGACUUCGCCGUGUACUACUGCCACCAGUACAUCCAGCUGCACAGCUUCACCUUCGGCCAGGGCACCAAGGUGGAAAUCAAGGCCGAUGCCGCCCCUACCGUGUC
CAUCUUCCCACCCUCCAGCGAGCAGCUGACCUCUGGCGGCGCUUCCGUCGUGUGCUUCCUGAACAACUUCUACCCCAAGGACAUCAACGUGAAGUGGAAGAUCGACGGCUCCGAGCGGCAGAACGGCGUGCUGAACUCCUGGACCGACCAGGACUCCAAGGACAGCACCUACUCCAUGUCCUCCACCCUGACCCUGACCAAGGACGAGUACGAGCGGCACAACUCCUAUACCUGCGAGGCCACCCACAAGACCUCCACCUCCCCCAUCGUGAAGUCCUUCAACCGGAACGAGUGCUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGC CUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAA AUUAAGUUGCAUCAAGCU
本发明尤其还提供编码与本文所述的序列基本上同一或相似的抗-CCL2抗体的重链和轻链的mRNA。在一些实施方案中,编码抗-CCL2抗体的重链的mRNA具有与本文所述的SEQIDNO:1或SEQIDNO:2至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一的核苷酸序列。在一些实施方案中,编码抗-CCL2抗体的重链的mRNA具有与本文所述的SEQIDNO:1至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一或同源的核苷酸序列。在一些实施方案中,编码抗-CCL2抗体的轻链的mRNA具有与本文所述的SEQIDNO:3或SEQIDNO:4至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一的核苷酸序列。在一些实施方案中,编码抗-CCL2抗体的轻链的mRNA具有与本文所述的SEQIDNO:3至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一或同源的核苷酸序列。
在一些实施方案中,本文中提供的mRNA包括一种或多种经修饰的核苷酸如本文所述的那些。在一些实施方案中,编码抗-CCL2抗体的重链或轻链的mRNA可以包含序列的所有可修饰的核苷酸的经修饰的核苷酸的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或者至少95%。
编码抗-VEGF的重链和轻链的示例性mRNA
没有5’和3’UTR的重链抗-VEGF(HC-αVEGF)mRNA(SEQIDNO:5):
AUGGCAACUGGAUCAAGAACCUCCCUCCUGCUCGCAUUCGGCCUGCUCUGUCUCCCAUGGCUCCAAGAAGGAAGCGCGUUCCCCACUAUCCCCCUCUCGGAGGUUCAGCUGGUCGAAAGCGGGGGCGGCCUCGUCCAGCCAGGUGGAUCCCUCCGCCUGAGCUGCGCCGCGUCCGGAUACACUUUCACCAACUACGGCAUGAACUGGGUCCGCCAGGCGCCGGGAAAGGGACUGGAAUGGGUCGGCUGGAUCAAUACCUACACUGGAGAGCCUACCUACGCCGCUGACUUUAAGAGGCGGUUCACUUUCUCACUGGAUACUUCCAAGUCAACCGCUUACCUUCAGAUGAAUUCCCUGCGCGCCGAGGAUACCGCAGUGUAUUACUGCGCCAAAUACCCGCAUUACUACGGCUCCAGCCACUGGUACUUUGACGUGUGGGGUCAAGGAACCCUGGUGACUGUGUCGUCCGCUUCCACCAAGGGACCAAGCGUGUUUCCACUCGCCCCGAGCUCAAAAUCGACGUCGGGAGGUACUGCCGCACUGGGGUGCUUGGUCAAGGACUACUUUCCAGAGCCGGUGACUGUUUCCUGGAACAGCGGAGCGCUCACCUCGGGCGUGCACACCUUCCCUGCGGUGUUGCAGUCAUCUGGACUGUACUCGCUGUCCAGCGUGGUCACGGUCCCGAGCUCGUCGCUCGGGACCCAAACCUACAUUUGCAAUGUCAACCACAAGCCAUCGAACACCAAAGUCGACAAGAAGGUGGAACCGAAGUCGUGCGACAAGACUCAUACGUGCCCACCGUGUCCGGCUCCGGAACUGUUGGGGGGCCCCUCCGUGUUCCUUUUCCCGCCAAAGCCUAAGGACACUCUCAUGAUCUCACGGACGCCAGAAGUGACCUGUGUGGUCGUGGAUGUGUCACAUGAGGAUCCGGAAGUCAAAUUCAACUGGUAUGUGGACGGGGUGGAAGUGCAUAAUGCCAAAACCAAACCUCGCGAGGAGCAGUACAACUCAACCUACCGGGUGGUGUCCGUGCUGACUGUGCUGCACCAGGACUGGCUGAAUGGAAAGGAGUACAAAUGCAAGGUCAGCAACAAGGCCCUUCCCGCCCCAAUCGAAAAGACGAUCUCGAAGGCCAAAGGUCAGCCGCGAGAGCCUCAAGUGUACACUCUGCCGCCGUCAAGAGAAGAAAUGACUAAGAACCAAGUUUCCCUCACUUGCCUGGUGAAGGGCUUCUACCCCAGCGACAUCGCAGUGGAAUGGGAGAGCAACGGACAGCCGGAAAACAACUAUAAGACCACCCCUCCUGUGUUGGACUCGGAUGGUUCCUUCUUCCUUUACAGCAAGCUGACCGUGGAUAAAUCGCGGUGGCAGCAAGGAAAUGUGUUUUCAUGCUCAGUCAUGCACGAGGCGCUGCACAAUCACUACACUCAGAAGUCCCUGUCGCUGUCGCCAGGAAAAUAA
具有5’和3’UTR的重链抗-VEGF(HC-αVEGF)mRNA(SEQIDNO:6):
(5’和3’UTR序列加有下划线,信号肽序列是斜体和粗体)
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG UGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG GAGGUUCAGCUGGUCGAAAGCGGGGGCGGCCUCGUCCAGCCAGGUGGAUCCCUCCGCCUGAGCUGCGCCGCGUCCGGAUACACUUUCACCAACUACGGCAUGAACUGGGUCCGCCAGGCGCCGGGAAAGGGACUGGAAUGGGUCGGCUGGAUCAAUACCUACACUGGAGAGCCUACCUACGCCGCUGACUUUAAGAGGCGGUUCACUUUCUCACUGGAUACUUCCAAGUCAACCGCUUACCUUCAGAUGAAUUCCCUGCGCGCCGAGGAUACCGCAGUGUAUUACUGCGCCAAAUACCCGCAUUACUACGGCUCCAGCCACUGGUACUUUGACGUGUGGGGUCAAGGAACCCUGGUGACUGUGUCGUCCGCUUCCACCAAGGGACCAAGCGUGUUUCCACUCGCCCCGAGCUCAAAAUCGACGUCGGGAGGUACUGCCGCACUGGGGUGCUUGGUCAAGGACUACUUUCCAGAGCCGGUGACUGUUUCCUGGAACAGCGGAGCGCUCACCUCGGGCGUGCACACCUUCCCUGCGGUGUUGCAGUCAUCUGGACUGUACUCGCUGUCCAGCGUGGUCACGGUCCCGAGCUCGUCGCUCGGGACCCAAACCUACAUUUGCAAUGUCAACCACAAGCCAUCGAACACCAAAGUCGACAAGAAGGUGGAACCGAAGUCGUGCGACAAGACUCAUACGUGCCCACCGUGUCCGGCUCCGGAACUGUUGGGGGGCCCCUCCGUGUUCCUUUUCCCGCCAAAGCCUAAGGACACUCUCAUGAUCUCACGGACGCCAGAAGUGACCUGUGUGGUCGUGGAUGUGUCACAUGAGGAUCCGGAAGUCAAAUUCAACUGGUAUGUGGACGGGGUGGAAGUGCAUAAUGCCAAAACCAAACCUCGCGAGGAGCAGUACAACUCAACCUACCGGGUGGUGUCCGUGCUGACUGUGCUGCACCAGGACUGGCUGAAUGGAAAGGAGUACAAAUGCAAGGUCAGCAACAAGGCCCUUCCCGCCCCAAUCGAAAAGACGAUCUCGAAGGCCAAAGGUCAGCCGCGAGAGCCUCAAGUGUACACUCUGCCGCCGUCAAGAGAAGAAAUGACUAAGAACCAAGUUUCCCUCACUUGCCUGGUGAAGGGCUUCUACCCCAGCGACAUCGCAGUGGAAUGGGAGAGCAACGGACAGCCGGAAAACAACUAUAAGACCACCCCUCCUGUGUUGGACUCGGAUGGUUCCUUCUUCCUUUACAGCAAGCUGACCGUGGAUAAAUCGCGGUGGCAGCAAGGAAAUGUGUUUUCAUGCUCAGUCAUGCACGAGGCGCUGCACAAUCACUACACUCAGAAGUCCCUGUCGCUGUCGCCAGGAAAAUAACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCU GGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC AAGCU
没有5’和3’UTR的轻链抗-VEGF(HC-αVEGF)mRNA(SEQIDNO:7):
AUGGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGACUGCUUUGCCUGCCCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCAUCCCACUCUCCGACAUUCAAAUGACGCAGUCCCCAUCGAGCCUCUCAGCAUCAGUGGGGGAUCGCGUGACUAUCACUUGCUCGGCGAGCCAGGAUAUCAGCAAUUACCUGAACUGGUAUCAGCAAAAGCCUGGAAAGGCACCGAAGGUGCUGAUCUACUUCACCUCAAGCCUCCAUUCGGGUGUCCCGUCCCGCUUCAGCGGCUCCGGCUCAGGCACUGACUUCACCCUGACUAUCUCCUCGCUGCAACCGGAAGAUUUCGCCACUUACUACUGUCAGCAGUACUCCACCGUGCCUUGGACGUUCGGACAGGGAACCAAAGUUGAGAUUAAGCGGACGGUCGCGGCCCCCUCCGUGUUUAUCUUUCCGCCUUCGGACGAGCAGCUGAAGUCGGGAACCGCCUCUGUCGUGUGCCUCCUGAACAACUUCUACCCGCGGGAAGCCAAGGUGCAGUGGAAAGUGGAUAACGCGCUUCAGAGCGGCAAUUCGCAAGAGUCCGUGACCGAAGAGGACUCGAAGGACUCAACCUACUCCCUCAGCUCAACCCUCACUUUGUCGAAGGCCGACUACGAGAAGCACAAAGUCUACGCAUGCGAAGUCACCCACCAGGGUCUGUCGAGCCCAGUGACUAAAUCCUUCAAUAGGGGGGAAUGUUAA
具有5’和3’UTR的轻链抗-VEGF(HC-αVEGF)mRNA(SEQIDNO:8):
(5’和3’UTR序列加有下划线,信号肽序列是斜体和粗体)
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG GACAUUCAAAUGACGCAGUCCCCAUCGAGCCUCUCAGCAUCAGUGGGGGAUCGCGUGACUAUCACUUGCUCGGCGAGCCAGGAUAUCAGCAAUUACCUGAACUGGUAUCAGCAAAAGCCUGGAAAGGCACCGAAGGUGCUGAUCUACUUCACCUCAAGCCUCCAUUCGGGUGUCCCGUCCCGCUUCAGCGGCUCCGGCUCAGGCACUGACUUCACCCUGACUAUCUCCUCGCUGCAACCGGAAGAUUUCGCCACUUACUACUGUCAGCAGUACUCCACCGUGCCUUGGACGUUCGGACAGGGAACCAAAGUUGAGAUUAAGCGGACGGUCGCGGCCCCCUCCGUGUUUAUCUUUCCGCCUUCGGACGAGCAGCUGAAGUCGGGAACCGCCUCUGUCGUGUGCCUCCUGAACAACUUCUACCCGCGGGAAGCCAAGGUGCAGUGGAAAGUGGAUAACGCGCUUCAGAGCGGCAAUUCGCAAGAGUCCGUGACCGAAGAGGACUCGAAGGACUCAACCUACUCCCUCAGCUCAACCCUCACUUUGUCGAAGGCCGACUACGAGAAGCACAAAGUCUACGCAUGCGAAGUCACCCACCAGGGUCUGUCGAGCCCAGUGACUAAAUCCUUCAAUAGGGGGGAAUGUUAACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAG UUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
本发明尤其还提供编码与本文所述的序列基本上同一或相似的抗-VEGF抗体的重链和轻链的mRNA。在一些实施方案中,编码抗-VEGF抗体的重链的mRNA具有与本文所述的SEQIDNO:5或SEQIDNO:6至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一的核苷酸序列。在一些实施方案中,编码抗-VEGF抗体的重链的mRNA具有与本文所述的SEQIDNO:5至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一或同源的核苷酸序列。在一些实施方案中,编码抗-VEGF抗体的轻链的mRNA具有与本文所述的SEQIDNO:7或SEQIDNO:8至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一的核苷酸序列。在一些实施方案中,编码抗-VEGF抗体的轻链的mRNA具有与本文所述的SEQIDNO:7至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一或同源的核苷酸序列。
在一些实施方案中,本文中提供的mRNA包括一种或多种经修饰的核苷酸例如本文所述的那些。在一些实施方案中,编码抗-VEGF抗体的重链或轻链的mRNA可以包含序列的所有可修饰的核苷酸的经修饰的核苷酸的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或者至少95%。
如本文所用的,术语“同一性”是指聚合分子之间例如核酸分子(例如,DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。两个核酸序列的百分比同一性的计算可以例如通过为了最佳比较目的比对此二序列进行(例如,为了最佳的比对可以将缺口引入在第一核酸序列和第二核酸序列之一或二者中,并且为了比较目的可以不考虑非同一的序列)。在某些实施方案中,为了比较目的而比对的序列的长度是参考序列长度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或者基本上100%。然后比较在相应的核苷酸位置处的核苷酸。当在第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的核苷酸占据时,则所述分子在该位置处是同一的。考虑为了两个序列的最佳比对而需要引入的缺口数和每个缺口的长度,两个序列之间的百分比同一性是所述序列共享的同一位置数的函数。可以利用数学算法完成序列的比较和两个序列之间百分比同一性的确定。例如,两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以利用Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17),其利用PAM120重量残基表已被并入ALIGN程序(2.0版)中、缺口长度罚分12和缺口罚分4进行确定。或者,两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以利用GCG软件包中的GAP程序,使用NWSgapdna.CMP矩阵进行确定。
递送媒介物
根据本发明,本文所述的编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)可以以裸露RNA(未经包装)或者通过递送媒介物进行递送。如本文所用的,术语“递送媒介物”、“转运媒介物”或者语法等效项可互换地使用。
在一些实施方案中,编码抗体的重链和轻链的mRNA可以通过单递送媒介物进行递送。在一些实施方案中,编码抗体的重链和轻链的mRNA可以通过单独的递送媒介物进行递送。例如,编码抗体的重链和轻链的mRNA可以单独包装但同时进行递送。或者,可以将编码抗体的重链和轻链的mRNA单独包装并相继地进行递送。
根据不同实施方案,适合的递送媒介物包括但不限于,基于聚合物的载体,例如聚乙烯亚胺(PEI)、脂质纳米颗粒和脂质体、纳米脂质体、包含神经酰胺的纳米脂质体、脂蛋白体、天然的和合成而得的外来体、天然的、合成的和半合成的板层小体、纳米微粒、钙磷硅酸盐纳米微粒、磷酸钙纳米微粒、二氧化硅纳米微粒、纳米晶体微粒、半导体纳米微粒、聚(D-精氨酸)、溶胶、纳米树枝状分子(nanodendrimer)、基于淀粉的递送体系、微胶粒、乳剂、泡囊、多域嵌段聚合物(乙烯基聚合物、聚丙基丙烯酸聚合物、动态多聚结合物(dynamicpolyconjugate)、干粉制剂、质粒、病毒、磷酸钙核苷酸、适体、肽及其它向量标签(vectorialtag)。
脂质体递送媒介物
在一些实施方案中,适合的递送媒介物是脂质体递送媒介物,例如,脂质纳米颗粒。如本文所用的,脂质体递送媒介物,例如,脂质纳米颗粒,常常以显微囊泡为特征,其具有由一个或多个双层的膜与外部培养基隔离的内部水空间。脂质体的双层膜通常由包括空间上分隔的亲水性域和疏水性域的两性分子如合成或天然来源的脂质形成(Lasic,TrendsBiotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜还可以由两性聚合物和表面活性剂(例如,聚合体(polymerosome)、泡囊等)形成。在本发明的上下文中,脂质体递送媒介物通常用来将期望的mRNA转运至靶细胞或靶组织。将期望的mRNA加入脂质体中的过程常称为“加载”。示例性方法在Lasic等,FEBSLett.,312:255-258,1992中描述,其通过引用并入本文中。脂质体包含的核酸可以完全或部分地位于脂质体的内部空间中,在脂质体的双层膜内,或者与脂质体膜的外表面结合。核酸加入脂质体中在本文中也称为“包囊”,其中核酸被完全包含在脂质体的内部空间内。将mRNA加入转运媒介物如脂质体中的目的常常是保护核酸以免受损于环境,其可能包含降解核酸的酶或化学品和/或使核酸快速排泄的系统或受体。因此,在一些实施方案中,适合的递送媒介物能够增强包含在其中的mRNA的稳定性和/或促进mRNA递送至靶细胞或靶组织。
在一些实施方案中,将适合的递送媒介物配制为脂质纳米颗粒。如本文所用的,短语“脂质纳米颗粒”是指包含一种或多种脂质(例如,阳离子脂质、非阳离子脂质、基于胆固醇的脂质和PEG-改性的脂质)的递送媒介物。考虑的脂质纳米颗粒可以通过使用一种或多种阳离子脂质、非阳离子脂质、基于胆固醇的脂质和PEG-改性的脂质,包括不同比例的多组分脂质混合物进行制备。适合的脂质的实例包括,例如,磷脂酰基化合物(例如,磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂)。
在本发明的某些实施方案中,使用聚合物作为载体,单独地或者与其它载体一起配制载体。适合的聚合物可以包括,例如,聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯(polyalkycyanoacrylate)、聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚己酸内酯、右旋糖酐、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、精蛋白、聚乙二醇精蛋白、PLL、聚乙二醇PLL和聚乙烯亚胺(PEI)。当PEI存在时,它可以是分子量范围从10至40kDA的支化的PEI,例如,25kDa支化的PEI(Sigma#408727)。
在一些实施方案中,适合的递送媒介物包括阳离子脂质。如本文所用的,短语“阳离子脂质”是指在选定的pH如生理pH下携带净正电荷的多种脂质物种中的任一种。若干阳离子脂质在文献中已有描述,其中多数是可商购的。用于本发明的组合物和方法中的特别适合的阳离子脂质包括在国际专利公布WO2010/053572(并且具体地,在第[00225]段所述的CI2-200)和WO2012/170930中所述的那些,二者通过引用并入本文中。在某些实施方案中,本发明的组合物和方法采用脂质纳米颗粒,该脂质纳米颗粒包含2012年3月29日提交的美国临时专利申请61/617,468(通过引用并入本文中)中所述的可离子化的阳离子脂质,如,例如,(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-l-基)二十四-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-4,15,18-三烯-l-胺(HGT5001),以及(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)。
在一些实施方案中,使用阳离子脂质N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵或者“DOTMA”。(Feigner等(Proc.Nat'lAcad.Sci.84,7413(1987);美国专利No.4,897,355)。DOTMA可以单独进行配制,或者可以与中性脂质、二油酰基磷脂酰基-乙醇胺或者"DOPE"或其它阳离子脂质或非阳离子脂质组合进入脂质体转运媒介物或脂质纳米颗粒中,并且此类脂质体可以用来增强核酸递送入靶细胞中。其它适合的阳离子脂质包括,例如,5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺或者"DOGS"、2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺-甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙烷铵或者"DOSPA"(Behr等Proc.Nat.'lAcad.Sci.86,6982(1989);美国专利No.5,171,678;美国专利No.5,334,761)、l,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷或者"DODAP"、l,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷或者"DOTAP"。考虑的阳离子脂质还包括l,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或者"DSDMA"、1,2-二油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或者"DODMA"、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或者"DLinDMA"、l,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或者"DLenDMA"、N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵或者"DODAC"、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵或者"DDAB"、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵或者"DMRIE"、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-l-(顺式,顺式-9,12-十八二烯氧基)丙烷或者"CLinDMA"、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基l-l-(顺式,顺式-9',l-2'-十八二烯氧基)丙烷或者"CpLinDMA"、N,N-二甲基-3,4-二油酰氧基苄胺或者"DMOBA"、1,2-N,N'-二油酰氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或者"DOcarbDAP"、2,3-二亚麻酰基氧基-Ν,Ν-二甲基丙基胺或者"DLinDAP"、l,2-N,N'-二亚油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或者"DLincarbDAP"、l,2-二亚麻酰基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或者"DLinCDAP"、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[l,3]-二氧戊环或者"DLin--DMA"、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环或者"DLin-K-XTC2-DMA",以及2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,l2-二烯-1-基)-l,3-二氧戊环-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLin-KC2-DMA))(参见,WO2010/042877;Semple等,NatureBiotech.28:172-176(2010)),或者它们的混合物。(Heyes,J.,等,JControlledRelease107:276-287(2005);Morrissey,DV.,等人,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005);PCT公布WO2005/121348A1)。
在一些实施方案中,存在于此类组合物中的一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍盐部分中的至少一种。
在一些实施方案中,此类组合物中存在的一种或多种阳离子脂质选自:XTC(2,2-二亚麻基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)、MC3(((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)、ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧戊环-5-胺))、NC98-5(4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-二十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺)、DODAP(1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷)、HGT4003(WO2012/170889,其教导通过引用整体并入本文中)、ICE(WO2011/068810,其教导通过引用整体并入本文中)、HGT5000(美国临时专利申请No.61/617,468,其教导通过引用整体并入本文中)或者HGT5001(顺式或反式)(临时专利申请No.61/617,468)、氨基醇类脂质(lipidoid)如WO2010/053572中公开的那些、DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷)、DOTMA(1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷)、DLinDMA(Heyes,J.;Palmer,L.;Bremner,K.;MacLachlan,I.“CationicLipidssaturationinfluencesintracellulardeliveryofencapsulatednucleicacids”J.Contr.Rel.2005,107,276-287)、DLin-KC2-DMA(Semple,S.C.等“RationalDesignofCationicLipidsforsiRNADelivery”NatureBiotech.2010,28,172-176)、C12-200(Love,K.T.等“Lipid-likematerialsforlow-doseinvivogenesilencing”PNAS2010,107,1864-1869)。
在一些实施方案中,存在于此类组合物中的一种或多种阳离子脂质是WO2013063468以及2013年10月22日提交的标题为“LipidFormulationsforDeliveryofMesserngerRNA”的美国临时申请序列号61/894,299中所述的阳离子脂质,二者通过引用并入本文中。在一些实施方案中,阳离子脂质包括式I-c1-a的化合物:
或其药学上可接受的盐,其中:
每个R2独立为氢或C1-3烷基;
每个q独立为2至6;
每个R'独立为氢或C1-3烷基;
和每个RL独立为C8-12烷基。
在一些实施方案中,每个R2独立为氢、甲基或乙基。在一些实施方案中,每个R2独立为氢或甲基。在一些实施方案中,每个R2为氢。
在一些实施方案中,每个q独立为3至6。在一些实施方案中,每个q独立为3至5。在一些实施方案中,每个q为4。
在一些实施方案中,每个R'独立为氢、甲基或乙基。在一些实施方案中,每个R'独立为氢或甲基。在一些实施方案中,每个R'独立为氢。
在一些实施方案中,每个RL独立为C8-12烷基。在一些实施方案中,每个RL独立为n-C8-12烷基。在一些实施方案中,每个RL独立为C9-11烷基。在一些实施方案中,每个RL独立为n-C9-11烷基。在一些实施方案中,每个RL独立为C10烷基。在一些实施方案中,每个RL独立为n-C10烷基。
在一些实施方案中,每个R2独立为氢或甲基;每个q独立为3至5;每个R'独立为氢或甲基;和每个RL独立为C8-12烷基。
在一些实施方案中,每个R2为氢;每个q独立为3至5;每个R'为氢;和每个RL独立为C8-12烷基。
在一些实施方案中,每个R2为氢;每个q为4;每个R'为氢;和每个RL独立为C8-12烷基。
在一些实施方案中,阳离子脂质包括式I-g的化合物:
或其药学上可接受的盐,其中每个RL独立为C8-12烷基。在一些实施方案中,每个RL独立为n-C8-12烷基。在一些实施方案中,每个RL独立为C9-11烷基。在一些实施方案中,每个RL独立为n-C9-11烷基。在一些实施方案中,每个RL独立为C10烷基。在一些实施方案中,每个RL为n-C10烷基。
在具体的实施方案中,提供的组合物包含阳离子脂质cKK-E12,或者(3,6-二(4-(二(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮)。cKK-E12的结构显示如下:
在一些实施方案中,适合的递送媒介物包含一种或多种非阳离子脂质,在一些实施方案中,非阳离子脂质是中性脂质,即,在配制和/或施用该组合物的条件下不携带净电荷的脂质。此类示例性非阳离子脂质或中性脂质可以选自DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPE(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)),以及胆固醇。
本发明还考虑使用基于胆固醇的阳离子脂质。此类基于胆固醇的阳离子脂质可以单独地或者与其它阳离子脂质或非阳离子脂质组合使用。适合的基于胆固醇的阳离子脂质包括,例如,DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰氨基胆固醇)、l,4-二(3-N-油酰氨基-丙基)哌嗪(Gao,等Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991);Wolf等BioTechniques23,139(1997);美国专利No.5,744,335),或者ICE。
在其它实施方案中,适合的脂质纳米颗粒包含一种或多种可切割的脂质,如,例如,一种或多种包含可切割的二硫化物(S-S)官能团的阳离子脂质或化合物(例如,HGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004和HGT4005),如在美国临时申请No:61/494,745中进一步描述的,其整个教导通过引用整体并入本文中。
此外,若干试剂可商购以增强转染效率。适合的实例包括LIPOFECTIN(DOTMA:DOPE)(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)、LIPOFECTAINE(DOSPA:DOPE)(Invitrogen)、LIPOFECTAMINE2000.(Invitrogen)、FUGENE、TRANSFECTAM(DOGS)和EFFECTENE。
在一些实施方案中,阳离子脂质可以包含存在于转运媒介物中的总脂质的约1%至约90%、约2%至约70%、约5%至约50%、约10%至约40%的摩尔比,或者优选存在于转运媒介物中的总脂质的约20%至约70%的摩尔比。
本发明还考虑使用聚乙二醇(PEG)-改性的磷脂和衍生的脂质如衍生的神经酰胺(cerarmide)(PEG-CER),包括N-辛酰-鞘氨醇-l-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8PEG-2000神经酰胺),所述脂质单独地或者优选地与同其共同构成转运媒介物(例如,脂质纳米颗粒)的其它脂质一起使用。考虑的PEG-改性的脂质包括但不限于,与具有C6-C20长度的烷基链的脂质共价相连的长度高达5kDa的聚乙二醇链。此类组分的添加可以防止复杂的聚集并且还可以提供用于使循环生存期增大并使向靶细胞递送的脂质-核酸组合物增加的方式,(Klibanov等(1990)FEBSLetters,268(1):235-237),或者可以选择它们从而从体内制剂快速交换出(参见美国专利No.5,885,613)。
特别有用的交换性脂质是具有较短酰基链(例如,C14或C18)的PEG-神经酰胺。本发明的PEG-改性的磷脂和衍生的脂质可以包含存在于脂质转运媒介物中的总脂质的约0%至约20%、约0.5%至约20%、约1%至约15%、约4%至约10%或者约2%的摩尔比。
本发明还考虑非阳离子脂质的使用。如本文所用的,短语“非阳离子脂质”是指任何中性的、两性的或阴离子脂质。如本文所用的,短语“阴离子脂质”是指在选定的H如生理pH下携带净负电荷的多种脂质物种中的任一种。非阳离子脂质包括但不限于,二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-羧酸盐(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰基乙醇胺(SOPE)、胆固醇,或者它们的混合物。此类非阳离子脂质可以单独使用,但是优选与其它赋形剂例如阳离子脂质组合使用。当与阳离子脂质组合使用时,非阳离子脂质可以包含存在于转运媒介物中的总脂质的5%至约90%或者优选约10%至约70%的摩尔比。
在具体的实施方案中,适合的转运媒介物(例如,脂质纳米颗粒)通过组合多种脂质和/或聚合物组分进行制备。例如,转运媒介物可以使用C12-200、DOPE、chol、DMG-PEG2K以40:30:25:5的摩尔比,或者使用DODAP、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K以18:56:20:6的摩尔比,或者使用HGT5000、DOPE、chol、DMG-PEG2K以40:20:35:5的摩尔比,或者使用HGT5001、DOPE、chol、DMG-PEG2K以40:20:35:5的摩尔比进行制备。根据所选脂质的特征、预期靶细胞的性质、要递送的mRNA的特征,选择构成脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG-改性的脂质,以及此类脂质彼此的相对摩尔比。其它考虑因素包括,例如,所选脂质的烷基链的饱和性,以及尺寸、电荷、pH、pKa、融合性和毒性。因此可以相应地调整摩尔比。例如,在实施方案中,阳离子脂质在脂质纳米颗粒中的百分比可以大于10%、大于20%、大于30%、大于40%、大于50%、大于60%,或者大于70%。非阳离子脂质在脂质纳米颗粒中的百分比可以大于5%、大于10%、大于20%、大于30%,或者大于40%。胆固醇在脂质颗粒中的百分比可以大于10%、大于20%、大于30%,或者大于40%。PEG-改性的脂质在脂质纳米颗粒中的百分比可以大于1%、大于2%、大于5%、大于10%,或者大于20%。
在某些实施方案中,本发明的适合的脂质纳米颗粒包括以下阳离子脂质中的至少一种:C12-200、DLin-KC2-DMA、DODAP、HGT4003、ICE、HGT5000或HGT5001。在一些实施方案中,适合的转运媒介物包括胆固醇和/或PEG-改性的脂质。在一些实施方案中,适合的转运媒介物包括DMG-PEG2K。在一些实施方案中,适合的转运媒介物包括以下脂质组合之一:C12-200、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K;DODAP、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K;HGT5000、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K;HGT5001、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K;XTC、DSPC、胆固醇、PEG-DMG;MC3、DSPC、胆固醇、PEG-DMG;以及ALNY-100、DSPC、胆固醇、PEG-DSG。
用于本发明的组合物中的脂质体转运媒介物可以通过目前本领域中已知的各种技术进行制备。多层囊泡(MLV)可以通过常规技术,例如,通过将脂质溶于适当的溶剂中而后蒸发溶剂在容器的内部上留下薄膜或者通过喷雾干燥,将所选的脂质沉积在适合的容器或器皿的内壁上进行制备。然后可以将水相加到容器中,伴随着涡流运动,导致MLV的形成。然后单层囊泡(ULV)可以通过多层囊泡的匀化、超声处理或挤压而形成。此外,单层囊泡可以通过洗涤剂去除技术而形成。
在本发明的某些实施方案中,本发明的组合物包含转运媒介物,其中mRNA结合在转运媒介物的表面上并包囊在相同的转运媒介物内。例如,在本发明的组合物的制备过程中,阳离子脂质体转运媒介物可以与mRNA通过静电相互作用而结合。例如,在本发明的组合物的制备过程中,阳离子脂质体转运媒介物可以与mRNA通过静电相互作用而结合。
根据本发明适合的脂质体递送媒介物可以制成各种尺寸。适当尺寸的选择可以考虑靶细胞或靶组织的位置以及在某种程度上制备的脂质体的应用。在一些实施方案中,选择脂质体递送媒介物的适当尺寸以促进由mRNA编码的抗体的全身性分布。在一些实施方案中,可以适宜地使mRNA的转染限制于某些细胞或组织。例如,对于靶肝细胞,可以调整脂质体转运媒介物的尺寸从而使它的维度小于肝脏中的内皮层衬里肝血窦的穿孔;因此脂质体转运媒介物可以容易地穿过此类内皮穿孔从而到达靶肝细胞。或者,可以调整脂质体转运媒介物的尺寸从而脂质体的维度具有足够的直径以限制或者明显地避免分布入某些细胞或组织中。例如,可以调整脂质体转运媒介物的尺寸从而使它的维度大于内皮层衬里肝血窦的穿孔由此使脂质体转运媒介物的分布限制于肝细胞。
在一些实施方案中,适合的脂质体递送媒介物具有不大于约250nm(例如,不大于约225nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm或者50nm)的尺寸。在一些实施方案中,适合的脂质体递送媒介物具有范围从约250-10nm(例如,范围从约225-10nm、200–10nm、175–10nm、150–10nm、125–10nm、100–10nm、75–10nm或者50–10nm)的尺寸。在一些实施方案中,适合的脂质体递送媒介物具有范围从约250-100nm(例如,范围从约225-100nm、200–100nm、175–100nm、150–100nm)的尺寸。在一些实施方案中,适合的脂质体递送媒介物具有范围从约100-10nm(例如,范围从约90-10nm、80–10nm、70–10nm、60–10nm或者50–10nm)的尺寸。
本领域中已知的各种替代方法可用来调整脂质体转运媒介物的群的尺寸。一种此类调整尺寸的方法在美国专利No.4,737,323中描述,该专利通过引用并入本文中。通过浴或探针超声,超声处理脂质体悬浮液产生渐进性尺寸下降至直径小于约0.05微米的小ULV。匀化是另一种方法,其依赖于剪切能量将大脂质体破碎成较小的脂质体。在典型的匀化方法中,通过标准乳液均质机,使MLV再循环直至观察到所选的脂质体尺寸,通常介于约0.1和0.5微米之间。脂质体囊泡的尺寸可以通过准电光散射(quasi-electriclightscattering)(QELS)(如Bloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421-150(1981)中所述,其通过引用并入本文中)进行确定。通过超声处理形成的脂质体,可以减小平均脂质体直径。间歇的超声处理循环可以与QELS评价交替以指导有效的脂质体合成。
RNA编码的抗体在体内的表达
根据本发明,可以在具有或者没有递送媒介物的情况下向有递送需要的受试者递送本文所述的编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)从而在体内表达完全组装的期望的抗体。
在一些实施方案中,由mRNA编码的期望的抗体在受试者中进行全身性表达。这可以通过从细胞或组织分泌完全组装的抗体来实现,其中抗体最初被表达进入受试者的循环系统中。例如,本发明的包含编码抗体的mRNA和脂质体媒介物的组合物分布进入肝脏的细胞中从而促进肝脏的细胞(例如,肝细胞)递送和后续表达包含于其中的mRNA。靶向的肝细胞可以用作生物“储器”或“贮库”,其能够产生和排出完全组装的期望的抗体,导致抗体的全身性分布。在其它实施方案中,除肝细胞之外的细胞(例如,肺、脾、心、眼或者中枢神经系统的细胞)可以用作蛋白生产的贮库场所。通常,储器或贮库细胞持续产生和分泌完全组装的抗体,导致有效的全身性分布。
在一些实施方案中,在施用后大于1小时、大于4小时、大于6小时、大于12小时、大于18小时、大于24小时、大于30小时、大于36小时、大于42小时、大于48小时、大于54小时、大于60小时、大于66小时、大于72小时、大于96小时、大于120小时、大于144小时、大于168小时、大于2周、大于3周、大于1个月或者大于2个月,在患者血清(即,血液)中mRNA编码的期望的抗体的全身性表达是可检测的。在一些实施方案中,在施用后约6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时、78小时、84小时、90小时或者96小时,mRNA编码的抗体的血清浓度达到峰值水平。在一些实施方案中,观察到mRNA编码的期望抗体的持续循环。例如,在施用后大于1天、2天、3天、4天、5天、1周、2周、3周、1个月、2个月或更久,可以检测到在患者血清(即,血液)中mRNA编码的抗体的全身性表达。
在一些实施方案中,为了抗体的细胞内表达或局部分布,可以将编码该抗体的重链和轻链的mRNA递送至靶细胞或靶组织。通常,当从靶细胞产生和分泌完全组装的抗体到达周围细胞外流体而不进入循环系统如血流中时,造成局部分布。如本文所用的,术语“靶细胞”或者“靶组织”是指编码抗体的mRNA被导向或靶向的细胞或组织。例如,在期望将mRNA递送至肝细胞的情况中,肝细胞代表靶细胞。可以将本文所述的编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)递送至各种靶细胞或靶组织,各种靶细胞或靶组织包括但不限于,肝细胞、上皮细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞(例如,脑膜、星形细胞、运动神经元、背根神经节和前角运动神经元的细胞)、光感受器细胞(例如,杆状和锥状细胞)、视网膜色素上皮细胞、分泌细胞、心肌细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞(cardiomyocyte)、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜衬里细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、网状细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞。
可以通过被动和主动靶向方式完成mRNA至靶细胞和靶组织的递送。被动靶向的现象采用转运媒介物在体内天然的分布模式而不依赖于额外的赋形剂或方式的使用以增强靶细胞对转运媒介物的识别。例如,受到网状-内皮系统的细胞吞噬的转运媒介物可能积聚在肝和脾中,因此可以提供被动导向该组合物向此类靶细胞递送的方式。
或者,mRNA向靶细胞和靶组织的递送可以通过主动靶向实现,其包括使用额外的赋形剂,本文中称为“靶向配体”,其可以(共价或非共价地)结合至转运媒介物从而促使此类转运媒介物定位于某些靶细胞或靶组织。例如,靶向可以通过在转运媒介物之中或之上包含一种或多种内源性靶向配体(例如,载脂蛋白E)来介导从而促使分布至靶细胞或靶组织。靶向配体被靶组织识别主动促进转运媒介物的组织分布和细胞摄取和/或在靶细胞和靶组织中它的含量(例如,在转运媒介物之中或之上包含载脂蛋白-E靶向配体促使转运媒介物识别并结合至由肝细胞表达的内源性低密度脂蛋白受体)。如本文所提供的,组合物可以包含能够增强组合物对靶细胞的亲和力的配体。在配制或配制后期间,可以将靶向配体与脂质颗粒的外双层相连。这些方法是本领域公知的。此外,一些脂质颗粒制剂可以采用融合性聚合物如PEAA、血细胞凝集素、其它脂肽(参见美国专利申请序列No.08/835,281和60/083,294,其通过引用并入本文中),以及用于体内和/或细胞内递送的其它特点。在其它一些实施方案中,本发明的组合物表现出改进的转染效率,和/或对所关注的靶细胞或相关组织表现出增强的选择性。因此,考虑到包含一种或多种配体(例如,肽、适体、寡核苷酸、维生素或其它分子)的组合物,该配体能够增强组合物及它们的核酸内容物对靶细胞或靶组织的亲和力。适合的配体可以任选地与转运媒介物的表面结合或连接。在一些实施方案中,靶向配体可以跨越转运媒介物的表面或者被包囊在转运媒介物内。适合的配体是根据它们的物理的、化学的或生物性质(例如,对靶细胞表面标记或特点的选择性亲和力和/或识别)进行选择。细胞特异性靶位点及它们相应的靶向配体可能广泛地变化。选择适合的靶向配体,从而采用靶细胞的独特特征,因此允许组合物辨别靶细胞和非靶细胞。例如,本发明的组合物可以包含表面标记(例如,载脂蛋白-B或载脂蛋白-E),从而选择性地增强对肝细胞的识别或亲和力(例如,通过对此类表面标记的受体介导的识别和结合)。此外,半乳糖作为靶向配体的用途可期望将本发明的组合物导向肝实质细胞,或者包含甘露糖的糖残基作为靶向配体的用途可期望将本发明的组合物导向肝内皮细胞(例如,包含甘露糖的糖残基,其可以优先与存在于肝细胞中的无唾液酸糖蛋白受体或甘露糖受体结合)。(参见HilleryAM,等"DrugDeliveryandTargeting:ForPharmacistsandPharmaceuticalScientists"(2002)Taylor&Francis,Inc.)因此,已与存在于转运媒介物(例如,脂质纳米颗粒)中的部分缀合的此类靶向配体的存在促进本发明的组合物在靶细胞和靶组织中的识别和摄取。适合的靶向配体的实例包括一种或多种肽、蛋白、适体、维生素和寡核苷酸。
如本文所用的,术语“受试者”是指向其施用本发明的mRNA和组合物的任何动物(例如,哺乳动物),包括但不限于,人、非人灵长类动物、啮齿动物等。通常在谈及人受试者时,术语“受试者”和“患者”可互换使用。
药物组合物和施用
为了促进抗体在体内的表达,可以将编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)和递送媒介物与一种或多种其它核酸、载体、靶向配体或稳定剂一起配制,或者配制在药物组合物中,其中其与适合的赋形剂混合。用于药品配制和施用的技术可以在"Remington'sPharmaceuticalSciences,"MackPublishingCo.,Easton,Pa.,最新版中查到。
根据现行的医疗实践,考虑受试者的临床状况、施用的部位和方法、施用的时间安排、受试者的年龄、性别、体重以及对本领域普通技术临床医生而言相关的其它因素,可以施用且给药编码抗体的mRNA及包含其的组合物。根据在试验临床研究、药理学、临床和医疗领域中普通技术人员已知的此类相关考虑因素,可以确定用于本文目的的“有效量”。在一些实施方案中,施用的量是有效的,从而使症状以及被本领域技术人员选作疾病进展、消退或改善的适当量度的其它指标获得至少一些稳定、改善或消除。例如,适合的量和给药方案引起至少暂时的抗体产生。
适合的施用途径包括,例如,经口施用、直肠施用、阴道施用、经粘膜施用、肺施用(包括气管内施用或吸入施用),或者肠施用;肠胃外递送(包括肌肉内注射、皮下注射、髓内注射,以及鞘内注射、直接心室内注射、静脉内注射、腹膜内注射、鼻内注射或眼内注射)。
或者,本发明的mRNA和组合物可以以局部而不是全身性的方式进行施用,例如,通过将该药物组合物直接注射入靶组织,优选地以缓释制剂进行施用。根据要靶向的组织,可以以各种方式实现局部递送。例如,可以吸入(对于鼻递送、气管递送或支气管递送)包含本发明的组合物的气雾剂;可以将本发明的组合物注射入例如损伤、疾病表现或疼痛的部位中;对于经口施用、气管施用或食管施用,可以以锭剂提供组合物;对于向胃或肠施用,可以以液体、片剂或胶囊剂形式提供组合物,对于直肠施用或阴道施用,可以以栓剂形式提供组合物;或者甚至可以通过使用乳膏剂、滴剂或者甚至注射剂向眼部递送。包含与治疗性分子或配体复合的本发明的组合物的制剂甚至可以通过外科手术进行施用,例如与聚合物或者可允许组合物从植入部位扩散至周围细胞的其它结构或物质结合。或者,可以在不使用聚合物或支撑物的情况下通过外科手术施用它们。
在一个实施方案中,配制本发明的组合物,从而使它们适合于包含于其中的mRNA的延缓释放。此类延缓释放的组合物可以方便地以延长的给药间隔向受试者施用。例如,在一个实施方案中,本发明的组合物以每天两次、每天或隔天向受试者进行施用。在一个优选的实施方案中,本发明的组合物每周两次、每周一次、每十天、每两周、每三周,或者更优选地每四周、每月一次、每六周、每八周、每隔一个月、每三个月、每四个月、每六个月、每八个月、每九个月或者每年向受试者进行施用。还考虑到组合物和脂质体媒介物,其配制用于贮库施用(例如,肌肉内施用、皮下施用、玻璃体内施用)以在延长的时间段中递送或释放mRNA。优选地,使用的延缓释放方式与对mRNA所做的修饰组合使用以增强稳定性。
本文还考虑到冻干的药物组合物,该药物组合物包含一种或多种本文所公开的脂质体纳米颗粒,以及本文所公开的用于使用此类冻干的组合物的相关方法,例如,在2011年6月8日提交的美国临时申请No.61/494,882中公开的,其教导通过引用整体并入本文中。例如,根据本发明冻干的药物组合物可以在施用之前进行复原,或者可以在体内进行复原。例如,可以将冻干的药物组合物配制在适当的剂型(例如,皮内剂型如盘状剂(disk)、杆状剂(rod)或膜状剂(membrane))并且进行施用,从而使该剂型随着时间在体内被个体的体液再水化。
RNA编码的抗体的体外表达
在一些实施方案中,编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)可以用来产生体外抗体。例如,细胞可以被编码抗体的mRNA(例如,编码重链和轻链的mRNA)转染并且在允许细胞产生抗体的细胞培养条件下进行培养。在一些实施方案中,该抗体在细胞内进行表达。在其它实施方案中,该抗体由细胞分泌,从而使该抗体可从上清液获得。
在一些实施方案中,根据本发明使用哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l,ECACCNo:85110503);人成视网膜细胞(PER.C6,CruCell,Leiden,TheNetherlands);被SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCCCRL1651);人胚胎肾细胞系(为了在悬浮培养基中生长而亚克隆的HEK293或293细胞,Graham等,J.GenVirol.,36:59,1977);人纤维肉瘤细胞系(例如,HT1080);幼仓鼠肾细胞(BHK21,ATCCCCL10);中国仓鼠卵细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980);小鼠塞托利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980);猴肾细胞(CV1ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HeLa,ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34);buffalo大鼠肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺细胞(W138,ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2,HB8065);小鼠乳房肿瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI细胞(Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982);MRC5细胞;FS4细胞;以及人肝癌细胞系(HepG2)。
标准的细胞培养基和条件可以用来培养转染的细胞并产生由mRNA编码的期望的抗体。
实施例
实施例1.产生mRNA
重链抗-趋化因子(C-C基序)配体2(HC-αCCL2,SEQIDNO:1)和轻链抗-CCL2(LC-αCCL2,SEQIDNO:2)通过从编码质粒DNA模板的基因体外转录,而后根据已知的方法添加5’帽子结构(Cap1)(参见Fechter,P.;Brownlee,G.G.“RecognitionofmRNAcapstructuresbyviralandcellularproteins”J.Gen.Virology2005,86,1239-1249)以及通过凝胶电泳确定的长度大约200个核苷酸的3’多聚腺苷酸尾进行合成。以下显示HC-αCCL2和LC-αCCL2的序列,并且存在于每个mRNA产品中的5’和3’非翻译区分别表示为X和Y,并且限定如下:
重链抗-CCL2(HC-αCCL2)mRNA:
X1AUGGAAUUCGGCCUGAGCUGGCUGUUCCUGGUGGCCAUCCUGAAGGGCGUGCAGUGCCAGGUCCAGCUGGUGCAGUCUGGCGCCGAAGUGAAGAAACCCGGCUCCUCCGUGAAGGUGUCCUGCAAGGCCUCCGGCGGCACCUUCUCCAGCUACGGCAUCUCCUGGGUCCGACAGGCCCCAGGCCAGGGCCUGGAAUGGAUGGGCGGCAUCAUCCCCAUCUUCGGCACCGCCAACUACGCCCAGAAAUUCCAGGGCAGAGUGACCAUCACCGCCGACGAGUCCACCUCCACCGCCUACAUGGAACUGUCCUCCCUGCGGAGCGAGGACACCGCCGUGUACUACUGCGCCAGAUACGACGGCAUCUACGGCGAGCUGGACUUCUGGGGCCAGGGCACCCUGGUCACCGUGUCCUCUGCCAAGACCACCCCCCCCUCCGUGUACCCUCUGGCCCCUGGCUCUGCCGCCCAGACCAACUCUAUGGUCACCCUGGGCUGCCUGGUCAAGGGCUACUUCCCCGAGCCCGUGACCGUGACCUGGAACUCCGGCUCCCUGUCCUCCGGCGUGCACACCUUCCCUGCCGUGCUGCAGUCCGACCUCUACACCCUGUCCAGCAGCGUGACCGUGCCCUCCUCCACCUGGCCCUCCGAGACAGUGACCUGCAACGUGGCCCACCCCGCCUCCAGCACCAAGGUGGACAAGAAAAUCGUGCCCCGGGACUGCGGCUGCAAGCCCUGCAUCUGUACCGUGCCCGAGGUGUCCUCCGUGUUCAUCUUCCCACCCAAGCCCAAGGACGUGCUGACCAUCACACUGACCCCCAAAGUGACCUGCGUGGUGGUGGACAUCUCCAAGGACGACCCCGAGGUGCAGUUCAGUUGGUUCGUGGACGACGUGGAAGUGCACACCGCUCAGACCCAGCCCAGAGAGGAACAGUUCAACUCCACCUUCAGAUCCGUGUCCGAGCUGCCCAUCAUGCACCAGGACUGGCUGAACGGCAAAGAAUUCAAGUGCAGAGUGAACUCCGCCGCCUUCCCAGCCCCCAUCGAAAAGACCAUCUCCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGUCUACACCAUCCCCCCACCCAAAGAACAGAUGGCCAAGGACAAGGUGUCCCUGACCUGCAUGAUCACCGAUUUCUUCCCAGAGGACAUCACCGUGGAAUGGCAGUGGAACGGCCAGCCCGCCGAGAACUACAAGAACACCCAGCCCAUCAUGGACACCGACGGCUCCUACUUCGUGU
ACUCCAAGCUGAACGUGCAGAAGUCCAACUGGGAGGCCGGCAACACCUUCACCUGUAGCGUGCUGCACGAGGGCCUGCACAACCACCACACCGAGAAGUCCCUGUCCCACUCCCCCGGCAAGUGAY1
羟链抗-CCL2(LC-αCCL2)mRNA:
X1AUGGAAACCCCUGCCCAGCUGCUGUUCCUGCUGCUGCUGUGGCUGCCUGAUACCACCGGCGAAAUCGUGCUGACCCAGUCCCCCGCCACCCUGUCUCUGAGCCCUGGCGAGAGAGCCACCCUGAGCUGCAGAGCCUCCCAGUCCGUGUCCGACGCCUACCUGGCCUGGUAUCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCUCGGCUGCUGAUCUACGACGCCUCCUCUAGAGCCACCGGCGUGCCCGCCAGAUUCUCCGGCUCUGGCUCUGGCACCGACUUCACCCUGACCAUCUCCAGCCUGGAACCCGAGGACUUCGCCGUGUACUACUGCCACCAGUACAUCCAGCUGCACAGCUUCACCUUCGGCCAGGGCACCAAGGUGGAAAUCAAGGCCGAUGCCGCCCCUACCGUGUCCAUCUUCCCACCCUCCAGCGAGCAGCUGACCUCUGGCGGCGCUUCCGUCGUGUGCUUCCUGAACAACUUCUACCCCAAGGACAUCAACGUGAAGUGGAAGAUCGACGGCUCCGAGCGGCAGAACGGCGUGCUGAACUCCUGGACCGACCAGGACUCCAAGGACAGCACCUACUCCAUGUCCUCCACCCUGACCCUGACCAAGGACGAGUACGAGCGGCACAACUCCUAUACCUGCGAGGCCACCCACAAGACCUCCACCUCCCCCAUCGUGAAGUCCUUCAACCGGAACGAGUGCUGAY1
5’和3’UTR序列:
X1=
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG
Y1=
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
实施例2.体外mRNA转染材料和条件
A.示例性脂质材料
在本文中的实施例中用于转染的脂质制剂由一种或多种脂质或者以不同的比例使用一种或多种阳离子脂质、辅助脂质以及设计用以包囊各种基于核酸的材料的聚乙二醇脂质的多组分脂质混合物组成。阳离子脂质可以(但非排他地)包括DOTAP(1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷)、DODAP(1,2-二油酰-3-二甲基铵丙烷)、DOTMA(1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷)、DLinDMA(参见Heyes,J.;Palmer,L.;Bremner,K.;MacLachlan,I.“Cationiclipidsaturationinfluencesintracellulardeliveryofencapsulatednucleicacids”J.Contr.Rel.2005,107,276-287)、DLin-KC2-DMA(参见Semple,S.C.等“RationalDesignofCationicLipidsforsiRNADelivery”NatureBiotech.2010,28,172-176)、C12-200(Love,K.T.等“Lipid-likematerialsforlow-doseinvivogenesilencing”PNAS2010,107,1864-1869)、HGT4003、ICE、基于二烷基氨基的、基于咪唑的、基于胍盐的,等。辅助脂质可以(但非排他地)包括DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPE(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油))、胆固醇等。聚乙二醇脂质可以(但非排他地)包括与具有C6-C20长度的烷基链的脂质共价相连的长度高达5kDa的聚(亚乙基)二醇链。
B.试验制剂
在这些试验中,将C12-200、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K的50mg/mL乙醇溶液的等分样混合并用乙醇稀释至3mL最终体积。单独地,通过添加来自1mg/mL储备液的500微克的每个构建体,配制HC-αCCL2mRNA和LC-αCCL2mRNA(1:1wt:wt)mRNA的缓冲水溶液(10mM柠檬酸盐/150mMNaCl,pH4.5)。将脂质溶液快速注射入mRNA水溶液中并震摇以得到在20%乙醇中的最终悬浮液。将所得的纳米颗粒悬浮液过滤,用1xPBS(pH7.4)渗滤,浓缩并在2-8℃下储藏。最终浓度=1.35mg/mLαCCL2mRNA(经包囊的)。Zave=89.2nm(Dv(50)=64.0nm;Dv(90)=115nm)。
实施例3.在体外mRNA转染后检查抗体
A.通过ELISA
在此实施例中,将F96MaxiSorpNunc-Immuno板用100μl的1μg/ml羊抗小鼠IgG1(InvitrogenA10538)的碳酸钠缓冲剂(pH9.6)涂布,并在37℃下孵育1hr。在用洗涤缓冲剂(1xPBS,0.05%Tween20)洗涤3x后,将孔用320μl封闭缓冲剂(1xPBS,0.05%Tween20,2%BSA)在37℃下封闭1hr。单克隆IgG标准品的系列稀释液在封闭缓冲剂中以250-0ng/ml的范围进行配制。样品的系列稀释液在封闭缓冲剂中以标准曲线的范围(1:100至1:10,000)进行配制。使样品和标准品在37℃下孵育1hr。在用洗涤缓冲剂洗涤3x后,以1:40,000的稀释度使用羊抗小鼠IgGFcHRP缀合的第二抗体(Pierce31439),并在37℃下孵育1hr。在用洗涤缓冲剂洗涤3x后,根据生产商说明书制备TMBEIA底物试剂。在37℃下孵育15min后,通过添加2NH2SO4使反应停止,并在450nm读板。
B.通过蛋白质印迹法
在此实施例中,将来自转染293T细胞或电穿孔HCL2细胞的条件培养基通过SDS-PAGE进行分级,并根据生产商(Invitrogen)的说明书使用转移装置转移到聚偏二氟乙烯膜。在与5%脱脂奶粉一起在TBST(10mMTris,pH8.0,150mMNaCl,0.5%Tween20)中孵育1hr后,将膜用PBST洗涤三次,并与羊抗小鼠IgG1(InvitrogenA10538)一起在RT下孵育1hr。将膜在PBST中洗涤三次,并与辣根过氧化物酶缀合的抗-小鼠二级抗体(PromegaW4021)的1:5000稀释液一起在RT下孵育1hr。将印迹在PBST中再洗涤三次,并根据生产商的说明书用ECL系统(AmershamBioscience)显影。
实施例4.由HC-αCCL2和LC-αCCL2的转染产生的αCCL2抗
体的体外分析
如以上实施例1所述,产生HC-αCCL2和LC-αCCL2mRNA。然后,按照实施例2A和B,根据已知的方法,以各种比例(wt:wt)将HC-αCCL2和LC-αCCL2mRNA转染入HCL1(即,人细胞系1)细胞或HCL2细胞中。
在HCL1细胞和HCL2细胞中这些研究的结果分别显示在图1和2中。将α-CCL2(趋化因子(C-C基序)配体2)重链和轻链mRNA构建体的各种混合物混合(wt:wt)并转染入HCL1细胞(图1)或HCL2细胞(图2)中。在转染后选定的时间点,采集细胞上清液,并利用实施例3A中上述的基于ELISA的方法分析抗-小鼠IgG的存在。
如图1和2中所示,在通过ELISA测定的蛋白产量方面,改变重链与轻链的比例(wt:wt)产生显著的差异。虽然在HCL2细胞中重链:轻链α-CCL2mRNA的1:1(wt:wt)混合物提供强信号,但是在HCL1细胞中4:1(wt:wt)比例提供较高的蛋白产量。虽然在不同的比例之间存在差异,但是对于所有测试的比例而言都观察到高蛋白产量。此外,在此实施例中,在两种情况下,在转染后48hr(第2天,或者D2)产生期望蛋白的最强信号。
为了进一步确认外源性mRNA-衍生的抗体的存在,免疫印迹(Western)技术用于对HCL1-衍生的样品的额外表征(参见图3)。利用实施例3B中所述的蛋白质印迹法,在mRNA转染的HCL1细胞的上清液中成功地检测到重链和轻链片段。在α-CCL2重链和轻链mRNA构建体的各种混合物(wt:wt)转染后24和48小时分析样品。观察到的条带强度反映了每个实施例中使用的mRNA比例。
实施例5.由静脉内施用mRNA-加载的纳米颗粒产生的αCCL2
抗体的体内分析
在此实施例中,通过递送外源性信使RNA在体内实现完全处理的抗体的产生,具体地,如实施例2A中所述,将α-CCL2重链和轻链mRNA构建体(HC-αCCL2:LC-αCCL2mRNA,1:1(wt:wt))包囊在阳离子脂质纳米颗粒中,并以单次快速推注静脉内注射递送至小鼠。
简言之,在每个试验开始时,使用大约6-8周龄的雄性CD-1小鼠。通过单次快速推注尾静脉注射30微克相当的总剂量,导入包囊的HC-αCCL2mRNA和LC-αCCL2mRNA(1:1wt:wt)样品。将小鼠杀死,并在指定的时间点灌注盐水。
采集每只小鼠的肝和脾,分配成三份,贮存在10%中性缓冲的福尔马林中或者急冻并贮存在-80℃下用于分析。
在施用后的给定时间点,通过CO2窒息使所有动物安乐死,然后进行开胸术和末端心脏血采集。通过在安乐死的动物上心脏穿刺将全血(最大可获得的体积)采集入血清分离器管中,使得在室温下凝结至少30分钟,在22℃±5℃下以9300g离心10分钟,并提取血清。为了临时采血,通过面静脉穿刺或剪尾采集大约40-50μL的全血。从非治疗动物采集的样品用作基线水平用于与研究动物比较。
为了对αCCL2抗体产生进行ELISA分析,将F96MaxiSorpNunc-Immuno板用100ml的1mg/mlMCP-1重组兔纯化的单克隆抗体在碳酸盐缓冲剂(pH9.6)中涂布,并在37℃下孵育1hr。在用洗涤缓冲剂(1xPBS,0.05%Tween20)洗涤3x后,将孔用320ml封闭缓冲剂(1xPBS,0.05%Tween20,2%BSA)在37℃下封闭1hr。将大约100ng/mlMCP-1人或小鼠重组蛋白添加到每个孔中,并在37℃下孵育1hr。在用洗涤缓冲剂洗涤3x后,添加样品的系列稀释液(1:5至1:200),并在37℃下孵育1hr。在用洗涤缓冲剂洗涤3x后,以1:40,000的稀释度使用羊抗小鼠IgGFcHRP缀合的第二抗体,并在37℃下孵育1hr。在用洗涤缓冲剂洗涤3x后,根据生产商说明书制备TMBEIA底物试剂。在37℃下孵育15min后,通过添加2NH2SO4使反应停止,并在450nm读板。
在施用后的选定时间点(6hr、24hr、48hr、72hr)监测受治疗小鼠的血清水平。利用基于ELISA的方法量化存在于小鼠血清中的完全形成的α-人CCL2抗体的水平(参见图4)。在施用后六小时内,可以观察到期望的外源性α-CCL2mRNA衍生的抗体的显著增高,在24小时后观察到峰值。
实施例6.体内α-VEGF抗体产生
在此实施例中,通过递送外源性信使RNA,体内实现完全处理的α-VEGF抗体的产生。
HC-αVEGF和LC-αVEGF的序列如下所示,存在于每个mRNA产品中的5’和3’非翻译区分别表示为X和Y,并且限定如下:
重链抗-VEGF(HC-αVEGF)mRNA:
X 1 AUGGCAACUGGAUCAAGAACCUCCCUCCUGCUCGCAUUCGGCCUGCUCUGUCUCCCAUGGCUCCAAGAAGGAAGCGCGUUCCCCACUAUCCCCCUCUCGGAGGUUCAGCUGGUCGAAAGCGGGGGCGGCCUCGUCCAGCCAGGUGGAUCCCUCCGCCUGAGCUGCGCCGCGUCCGGAUACACUUUCACCAACUACGGCAUGAACUGGGUCCGCCAGGCGCCGGGAAAGGGACUGGAAUGGGUCGGCUGGAUCAAUACCUACACUGGAGAGCCUACCUACGCCGCUGACUUUAAGAGGCGGUUCACUUUCUCACUGGAUACUUCCAAGUCAACCGCUUACCUUCAGAUGAAUUCCCUGCGCGCCGAGGAUACCGCAGUGUAUUACUGCGCCAAAUACCCGCAUUACUACGGCUCCAGCCACUGGUACUUUGACGUGUGGGGUCAAGGAACCCUGGUGACUGUGUCGUCCGCUUCCACCAAGGGACCAAGCGUGUUUCCACUCGCCCCGAGCUCAAAAUCGACGUCGGGAGGUACUGCCGCACUGGGGUGCUUGGUCAAGGACUACUUUCCAGAGCCGGUGACUGUUUCCUGGAACAGCGGAGCGCUCACCUCGGGCGUGCACACCUUCCCUGCGGUGUUGCAGUCAUCUGGACUGUACUCGCUGUCCAGCGUGGUCACGGUCCCGAGCUCGUCGCUCGGGACCCAAACCUACAUUUGCAAUGUCAACCACAAGCCAUCGAACACCAAAGUCGACAAGAAGGUGGAACCGAAGUCGUGCGACAAGACUCAUACGUGCCCACCGUGUCCGGCUCCGGAACUGUUGGGGGGCCCCUCCGUGUUCCUUUUCCCGCCAAAGCCUAAGGACACUCUCAUGAUCUCACGGACGCCAGAAGUGACCUGUGUGGUCGUGGAUGUGUCACAUGAGGAUCCGGAAGUCAAAUUCAACUGGUAUGUGGACGGGGUGGAAGUGCAUAAUGCCAAAACCAAACCUCGCGAGGAGCAGUACAACUCAACCUACCGGGUGGUGUCCGUGCUGACUGUGCUGCACCAGGACUGGCUGAAUGGAAAGGAGUACAAAUGCAAGGUCAGCAACAAGGCCCUUCCCGCCCCAAUCGAAAAGACGAUCUCGAAGGCCAAAGGUCAGCCGCGAGAGCCUCAAGUGUACACUCUGCCGCCGUCAAGAGAAGAAAUGACUAAGAACCAAGUUUCCCUCACUUGCCUGGUGAAGGGCUUCUACCCCAGCGACAUCGCAGUGGAAUGG
GAGAGCAACGGACAGCCGGAAAACAACUAUAAGACCACCCCUCCUGUGUUGGACUCGGAUGGUUCCUUCUUCCUUUACAGCAAGCUGACCGUGGAUAAAUCGCGGUGGCAGCAAGGAAAUGUGUUUUCAUGCUCAGUCAUGCACGAGGCGCUGCACAAUCACUACACUCAGAAGUCCCUGUCGCUGUCGCCAGGAAAAUAAY 1
轻链抗-VEGF(LC-αVEGF)mRNA:
X 1 AUGGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGACUGCUUUGCCUGCCCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCAUCCCACUCUCCGACAUUCAAAUGACGCAGUCCCCAUCGAGCCUCUCAGCAUCAGUGGGGGAUCGCGUGACUAUCACUUGCUCGGCGAGCCAGGAUAUCAGCAAUUACCUGAACUGGUAUCAGCAAAAGCCUGGAAAGGCACCGAAGGUGCUGAUCUACUUCACCUCAAGCCUCCAUUCGGGUGUCCCGUCCCGCUUCAGCGGCUCCGGCUCAGGCACUGACUUCACCCUGACUAUCUCCUCGCUGCAACCGGAAGAUUUCGCCACUUACUACUGUCAGCAGUACUCCACCGUGCCUUGGACGUUCGGACAGGGAACCAAAGUUGAGAUUAAGCGGACGGUCGCGGCCCCCUCCGUGUUUAUCUUUCCGCCUUCGGACGAGCAGCUGAAGUCGGGAACCGCCUCUGUCGUGUGCCUCCUGAACAACUUCUACCCGCGGGAAGCCAAGGUGCAGUGGAAAGUGGAUAACGCGCUUCAGAGCGGCAAUUCGCAAGAGUCCGUGACCGAAGAGGACUCGAAGGACUCAACCUACUCCCUCAGCUCAACCCUCACUUUGUCGAAGGCCGACUACGAGAAGCACAAAGUCUACGCAUGCGAAGUCACCCACCAGGGUCUGUCGAGCCCAGUGACUAAAUCCUUCAAUAGGGGGGAAUGUUAAY 1
5’和3’UTR序列:
X1(5’UTR序列)=
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG
Y1(3’UTR序列)=
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
将α-VEGF重链和轻链mRNA构建体(HC-α-VEGF:LC-α-VEGFmRNA,1:1(wt:wt))包囊在下述的阳离子脂质纳米颗粒中:
在这些试验中,将cKK-E12、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K的50mg/mL乙醇溶液的等分样混合并用乙醇稀释至3mL最终体积。单独地,通过添加来自1mg/mL储备液的500微克的每种构建体,配制HC-αCVEGFmRNA和LC-αVEGFmRNA(1:1wt:wt)mRNA的缓冲水溶液(10mM柠檬酸盐/150mMNaCl,pH4.5)。将脂质溶液快速注射入mRNA水溶液中并震摇以得到在20%乙醇中的最终悬浮液。将所得的纳米颗粒悬浮液过滤,用1xPBS(pH7.4)渗滤,浓缩并在2-8℃下储藏。最终浓度=0.20mg/mLαVEGFmRNA(经包囊的)。Zave=81.0nm(PDI=0.16)。
通过以1.0mg/kg的剂量单次静脉内尾静脉注射或皮下注射向野生型小鼠递送加载HC-α-VEGF和LC-α-VEGFmRNA的脂质纳米颗粒,并且通过ELISA随着时间监测在血清中抗-VEGF抗体的产生。
简言之,在每个试验开始时,使用约6-8周龄的雄性CD-1小鼠。通过单次快速推注尾静脉注射1.0mg/kg(~30微克)相当的总剂量,导入包囊的HC-α-VEGFmRNA和LC-α-VEGFmRNA(1:1wt:wt)样品。将小鼠杀死,并在指定的时间点(施用后0.50小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周)灌注盐水。
在施用后的给定时间点,通过CO2窒息使所有动物安乐死,然后进行开胸术和末端心脏血采集。通过在安乐死的动物上心脏穿刺将全血(最大可获得的体积)采集入血清分离器管中,使得在室温下凝结至少30分钟,在22℃±5℃下以9300g离心10分钟,并提取血清。为了临时采血,通过面静脉穿刺或剪尾采集大约40-50μL的全血。从非治疗动物采集的样品用作基线水平用于与研究动物比较
为了对α-VEGF抗体产生进行ELISA分析,将F96MaxiSorpNunc-Immuno板用100微升的0.50微克/mL/孔的重组人VEGF蛋白(Invitrogen#PHC9391)在涂布缓冲剂(50mMNaHCO3,pH9.6)中涂布。在用洗涤缓冲剂洗涤3x后,将孔用封闭缓冲剂(1XDPBS,2%BSA,0.05%Tween-20)在37℃下封闭1小时。在如上所述进一步洗涤时,将从受注射的小鼠采集的小鼠血清加到每个孔中,以1:10,000稀释度使用兔抗-人IgGFcHRP(Pierce#PA-28587)缀合的第二抗体,并在37℃下孵育1hr。在用洗涤缓冲剂洗涤3x后,根据生产商说明书制备TMBEIA底物试剂。在37℃下孵育10min后,通过添加2NH2SO4使反应停止,并在450nm读板。在施用后的选定时间点(例如,0.5hr、3hr、6hr、12hr、24hr、48hr、72hr、96hr、8天和15天)监测受治疗小鼠的血清水平。图5描绘示例性结果,该结果表明在单次给药加载HC-α-VEGFmRNA和LC-α-VEGFmRNA的纳米颗粒后,在野生型小鼠的血清中检测到α-VEGF抗体。在施用后六小时内,可以观察到期望的外源性α-VEGFmRNA衍生的抗体的显著增高,在24小时后观察到峰值,并且持续到在α-VEGFmRNA的单次给药后2周。图6描绘与图5相同的示例性结果,但是通过具体的小鼠数作图。图7显示在24小时后存在于受静脉内或皮下注射的小鼠的血清中的α-VEGF抗体水平的比较。
此实施例提供进一步确认基于mRNA的疗法可以用于有效的体内抗体产生。
等效项和范围
仅仅使用常规试验,本领域技术人员可认识到,或者能够确定,本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效项。本发明的范围无意受限于以上描述,而是如以下权利要求书中所述。
Claims (51)
1.一种体内递送抗体的方法,所述方法包括:
向需要递送的受试者施用一种或多种编码抗体的重链和轻链的mRNA,并且其中所述抗体在所述受试者中进行全身性表达。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述一种或多种mRNA包括编码所述重链的第一mRNA和编码所述抗体的轻链的第二mRNA。
3.根据权利要求2所述的方法,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以范围介于大约10:1至1:10之间的比例存在。
4.根据权利要求3所述的方法,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以范围介于大约4:1至1:4之间的比例存在。
5.根据权利要求4所述的方法,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以大约4:1的比例存在。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以大于1的比例存在。
7.根据权利要求4所述的方法,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以大约1:1的比例存在。
8.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述一种或多种mRNA包括编码所述抗体的所述重链和所述轻链的单mRNA。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中将编码所述抗体的所述重链和所述轻链的所述一种或多种mRNA包囊在一种或多种脂质体内。
10.根据权利要求9所述的方法,其中将编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA包囊在单独的脂质体中。
11.根据权利要求10所述的方法,其中将编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA包囊在相同的脂质体中。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法,其中所述一种或多种脂质体包括阳离子脂质、中性脂质、基于胆固醇的脂质和PEG-改性的脂质中的一种或多种。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法,其中所述一种或多种脂质体具有不大于约150nm的尺寸。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的方法,其中所述一种或多种脂质体具有不大于约100nm的尺寸。
15.根据权利要求9-13中任一项所述的方法,其中所述一种或多种脂质体具有不大于约75nm的尺寸。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中对所述一种或多种mRNA经修饰以增强稳定性。
17.根据权利要求16所述的方法,其中对所述一种或多种mRNA经修饰以包含经修饰的核苷酸、帽子结构、多聚腺苷酸尾、5’和/或3’非翻译区。
18.根据权利要求1-15中任一项所述的方法,其中所述一种或多种mRNA未经修饰。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中将所述一种或多种mRNA静脉内施用。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的方法,其中将所述一种或多种mRNA腹膜内施用。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述抗体的全身性表达在施用后至少约6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时或120小时是可检测的。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述抗体是完整免疫球蛋白、(Fab)2、(Fab’)2、Fab、Fab’或scFv。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述抗体是IgG。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述抗体选自由抗-CCL2、抗-赖氨酰氧化酶样-2(LOXL2)、抗-Flt-1、抗-TNF-α、抗-白细胞介素-2Rα受体(CD25)、抗-TGFβ、抗-B-细胞活化因子、抗-α-4整联蛋白、抗-BAGE、抗-β-连环蛋白/m、抗-Bcr-abl、抗-C5、抗-CA125、抗-CAMEL、抗-CAP-1、抗-CASP-8、抗-CD4、抗-CD19、抗-CD20、抗-CD22、抗-CD25、抗-CDC27/m、抗-CD30、抗-CD33、抗-CD52、抗-CD56、抗-CD80、抗-CDK4/m、抗-CEA、抗-CT、抗-CTL4、抗-Cyp-B、抗-DAM、抗-EGFR、抗-ErbB3、抗-ELF2M、抗-EMMPRIN、抗-EpCam、抗-ETV6-AML1、抗-HER2、抗-G250、抗-GAGE、抗-GnT-V、抗-Gp100、抗-HAGE、抗-HER-2/neu、抗-HLA-A*0201-R170I、抗-IGF-1R、抗-IL-2R、抗-IL-5、抗-MC1R、抗-肌球蛋白/m、抗-MUC1、抗-MUM-1、抗-MUM-2、抗-MUM-3、抗-蛋白酶-3、抗-p190小bcr-abl、抗-Pml/RARα、抗-PRAMS、抗-PSA、抗-PSM、抗-PSMA、抗-RAGE、抗-RANKL、抗-RU1或RU2、抗-SAGE、抗-SART-1或抗-SART-3、抗-存活蛋白、抗-TEL/AML1、抗-TPI/m、抗-TRP-1、抗-TRP-2、抗-TRP-2/INT2、抗-VEGF和抗-VEGF受体组成的组。
25.一种产生抗体的方法,所述方法包括:
向细胞施用编码重链的第一mRNA和编码抗体的轻链的第二mRNA,并且其中所述抗体由所述细胞产生。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
27.根据权利要求25或26所述的方法,其中所述细胞是人细胞。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法,其中所述细胞是培养的细胞。
29.根据权利要求25-27中任一项所述的方法,其中所述细胞是在活生物体内的细胞。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的方法,其中所述抗体在细胞内进行表达。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的方法,其中所述抗体由所述细胞分泌。
32.根据权利要求25-31中任一项所述的方法,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以范围介于大约10:1至1:10之间的比例存在。
33.根据权利要求32所述的方法,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以范围介于大约4:1至1:4之间的比例存在。
34.根据权利要求33所述的方法,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以大约4:1的比例存在。
35.根据权利要求25-34中任一项所述的方法,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以大于1的比例存在。
36.根据权利要求25-34中任一项所述的方法,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以大约1:1的比例存在。
37.根据权利要求25-36中任一项所述的方法,其中将编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA包囊在一种或多种脂质体内。
38.根据权利要求37所述的方法,其中将所述第一mRNA和所述第二mRNA包囊在单独的脂质体中。
39.根据权利要求37所述的方法,其中将所述第一mRNA和所述第二mRNA包囊在相同的脂质体中。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法,其中所述一种或多种脂质体包括阳离子脂质、中性脂质、基于胆固醇的脂质和PEG-改性的脂质中的一种或多种。
41.一种包含编码重链的第一mRNA和编码抗体的轻链的第二mRNA的组合物,其中将所述第一mRNA和所述第二mRNA包囊在一种或多种脂质体中。
42.根据权利要求41所述的组合物,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以范围介于约10:1至1:10之间的比例存在。
43.根据权利要求42所述的组合物,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以范围介于大约4:1至1:4之间的比例存在。
44.根据权利要求43所述的组合物,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以大约4:1的比例存在。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的组合物,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以大于1的比例存在。
46.根据权利要求41-44中任一项所述的组合物,其中编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA以大约1:1的比例存在。
47.根据权利要求41-46中任一项所述的组合物,其中将编码所述重链的所述第一mRNA和编码所述轻链的所述第二mRNA包囊在一种或多种脂质体内。
48.根据权利要求47所述的组合物,其中将所述第一mRNA和所述第二mRNA包囊在单独的脂质体中。
49.根据权利要求47所述的组合物,其中将所述第一mRNA和所述第二mRNA包囊在相同的脂质体中。
50.根据权利要求41-49中任一项所述的组合物,其中所述一种或多种脂质体包括阳离子脂质、中性脂质、基于胆固醇的脂质和PEG-改性的脂质中的一种或多种。
51.根据权利要求41-50中任一项所述的组合物,其中所述一种或多种脂质体具有不大于大约250nm、225nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm或50nm的尺寸。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361784903P | 2013-03-14 | 2013-03-14 | |
US61/784,903 | 2013-03-14 | ||
US201361920165P | 2013-12-23 | 2013-12-23 | |
US61/920,165 | 2013-12-23 | ||
PCT/US2014/027717 WO2014152774A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-03-14 | Methods and compositions for delivering mrna coded antibodies |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105209490A true CN105209490A (zh) | 2015-12-30 |
Family
ID=50489425
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480010113.8A Pending CN105209490A (zh) | 2013-03-14 | 2014-03-14 | 用于递送mrna编码的抗体的方法和组合物 |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US10087247B2 (zh) |
EP (2) | EP3932947A1 (zh) |
JP (4) | JP6399560B2 (zh) |
CN (1) | CN105209490A (zh) |
AU (4) | AU2014239184B2 (zh) |
BR (1) | BR112015022855A2 (zh) |
CA (1) | CA2903880A1 (zh) |
CY (1) | CY1124670T1 (zh) |
DK (1) | DK2970456T3 (zh) |
EA (1) | EA201591293A1 (zh) |
ES (1) | ES2882110T3 (zh) |
HR (1) | HRP20211119T1 (zh) |
HU (1) | HUE055044T2 (zh) |
LT (1) | LT2970456T (zh) |
MX (1) | MX2015011947A (zh) |
PL (1) | PL2970456T3 (zh) |
PT (1) | PT2970456T (zh) |
RS (1) | RS62565B1 (zh) |
SI (1) | SI2970456T1 (zh) |
WO (1) | WO2014152774A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111658782A (zh) * | 2020-06-10 | 2020-09-15 | 深圳近邻生物科技有限公司 | mRNA疫苗递送载体及制备方法、mRNA疫苗及制备方法 |
CN113289762A (zh) * | 2021-05-07 | 2021-08-24 | 扬州三源机械有限公司 | 一种基于绿色环保的垃圾处理站用可回收垃圾分拣装置 |
Families Citing this family (82)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102007001370A1 (de) | 2007-01-09 | 2008-07-10 | Curevac Gmbh | RNA-kodierte Antikörper |
ES2713852T3 (es) | 2009-12-01 | 2019-05-24 | Translate Bio Inc | Derivado de esteroides para la administración de ARNm en enfermedades genéticas humanas |
WO2012135025A2 (en) | 2011-03-28 | 2012-10-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Conjugated lipomers and uses thereof |
CA2838063C (en) | 2011-06-08 | 2023-07-11 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Cleavable lipids |
KR20200084048A (ko) | 2011-06-08 | 2020-07-09 | 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. | Mrna 전달을 위한 지질 나노입자 조성물 및 방법 |
MX363734B (es) | 2011-10-27 | 2019-03-29 | Massachusetts Inst Technology | Derivados de aminoacidos funcionalizados en la terminal n capaces de formar microesferas encapsuladoras de farmaco. |
EP2859102A4 (en) | 2012-06-08 | 2016-05-11 | Shire Human Genetic Therapies | NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF |
LT2970456T (lt) | 2013-03-14 | 2021-08-10 | Translate Bio, Inc. | Būdai ir kompozicijos, skirti mrnr koduojamų antikūnų pristatymui |
KR20210122917A (ko) | 2013-03-14 | 2021-10-12 | 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. | Cftr mrna 조성물 및 관련 방법 및 사용 |
KR20150128687A (ko) | 2013-03-14 | 2015-11-18 | 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. | 메신저 rna의 정제 방법 |
WO2015048744A2 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
AU2014329452B2 (en) | 2013-10-03 | 2019-06-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
EA201690576A1 (ru) | 2013-10-22 | 2016-10-31 | Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. | Липидные композиции для доставки матричной рнк |
EA201992208A1 (ru) | 2013-10-22 | 2020-07-31 | Транслейт Био, Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК |
MX2016005237A (es) | 2013-10-22 | 2016-08-12 | Shire Human Genetic Therapies | Terapia de acido ribonucleico mensajero para la deficiencia de argininosuccinato sintetasa. |
WO2015105926A1 (en) | 2014-01-08 | 2015-07-16 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides for the in vivo production of antibodies |
ME03314B (me) * | 2014-03-24 | 2019-10-20 | Translate Bio Inc | Irnk terapija za liječenje očnih oboljenja |
CN106659803A (zh) | 2014-04-23 | 2017-05-10 | 摩登纳特斯有限公司 | 核酸疫苗 |
WO2015164773A1 (en) | 2014-04-25 | 2015-10-29 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Methods for purification of messenger rna |
MA40871A (fr) * | 2014-10-29 | 2017-09-05 | Novartis Ag | Expression directe d'anticorps |
US9943595B2 (en) * | 2014-12-05 | 2018-04-17 | Translate Bio, Inc. | Messenger RNA therapy for treatment of articular disease |
AU2016233135B2 (en) * | 2015-03-19 | 2021-07-08 | Translate Bio, Inc. | mRNA therapy for pompe disease |
WO2016180430A1 (en) | 2015-05-08 | 2016-11-17 | Curevac Ag | Method for producing rna |
CN107873055B (zh) | 2015-05-29 | 2021-09-17 | 库瑞瓦格房地产有限公司 | 包括至少一个切向流过滤步骤的产生和纯化rna的方法 |
CN113968823A (zh) * | 2015-06-19 | 2022-01-25 | 麻省理工学院 | 烯基取代的2,5-哌嗪二酮和其在组合物中用于向个体或细胞递送药剂的用途 |
US11007260B2 (en) | 2015-07-21 | 2021-05-18 | Modernatx, Inc. | Infectious disease vaccines |
US11364292B2 (en) | 2015-07-21 | 2022-06-21 | Modernatx, Inc. | CHIKV RNA vaccines |
US20190008887A1 (en) * | 2015-07-30 | 2019-01-10 | ModernaTX Inc. | Multimeric mrna |
SG11201803360UA (en) * | 2015-10-22 | 2018-05-30 | Modernatx Inc | Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (vzv) |
KR20180096592A (ko) * | 2015-10-22 | 2018-08-29 | 모더나티엑스, 인크. | 호흡기 세포융합 바이러스 백신 |
JP2018531290A (ja) * | 2015-10-22 | 2018-10-25 | モデルナティーエックス, インコーポレイテッド | 性感染症ワクチン |
WO2017070624A1 (en) | 2015-10-22 | 2017-04-27 | Modernatx, Inc. | Tropical disease vaccines |
CA3002922A1 (en) | 2015-10-22 | 2017-04-27 | Modernatx, Inc. | Human cytomegalovirus vaccine |
RS63381B1 (sr) * | 2015-10-22 | 2022-08-31 | Modernatx Inc | Vakcine protiv respiratornih virusa |
MA46023A (fr) * | 2015-10-22 | 2019-07-03 | Modernatx Inc | Vaccin contre le virus de la grippe à large spectre |
US20180303929A1 (en) * | 2015-10-22 | 2018-10-25 | Moderna TX, Inc. | Herpes simplex virus vaccine |
AU2016366978B2 (en) | 2015-12-10 | 2022-07-28 | Modernatx, Inc. | Compositions and methods for delivery of therapeutic agents |
WO2017127750A1 (en) | 2016-01-22 | 2017-07-27 | Modernatx, Inc. | Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof |
WO2017180917A2 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Modernatx, Inc. | Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery |
CN109640962B (zh) | 2016-05-18 | 2022-07-19 | 摩登纳特斯有限公司 | 编码松弛素的多核苷酸 |
ES2941411T3 (es) | 2016-05-18 | 2023-05-22 | Modernatx Inc | Polinucleótidos que codifican interleucina-12 (IL12) y usos de los mismos |
WO2018075980A1 (en) | 2016-10-21 | 2018-04-26 | Modernatx, Inc. | Human cytomegalovirus vaccine |
EP3551193A4 (en) | 2016-12-08 | 2020-08-19 | Modernatx, Inc. | NUCLEIC ACID VACCINES AGAINST RESPIRATORY VIRUSES |
MA47515A (fr) | 2017-02-16 | 2019-12-25 | Modernatx Inc | Compositions immunogènes très puissantes |
CA3054323A1 (en) | 2017-02-27 | 2018-08-30 | Translate Bio, Inc. | Methods for purification of messenger rna |
EP3585891B1 (en) | 2017-02-27 | 2021-10-27 | Translate Bio, Inc. | Methods for purification of messenger rna |
EP3585417B1 (en) | 2017-02-27 | 2023-02-22 | Translate Bio, Inc. | Method of making a codon-optimized cftr mrna |
US11576961B2 (en) | 2017-03-15 | 2023-02-14 | Modernatx, Inc. | Broad spectrum influenza virus vaccine |
WO2018170260A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Modernatx, Inc. | Respiratory syncytial virus vaccine |
WO2018170347A1 (en) | 2017-03-17 | 2018-09-20 | Modernatx, Inc. | Zoonotic disease rna vaccines |
WO2018213476A1 (en) | 2017-05-16 | 2018-11-22 | Translate Bio, Inc. | Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr |
WO2018231990A2 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-20 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase |
WO2019055807A1 (en) | 2017-09-14 | 2019-03-21 | Modernatx, Inc. | RNA VACCINES AGAINST ZIKA VIRUS |
EP3746090A4 (en) | 2018-01-29 | 2021-11-17 | ModernaTX, Inc. | RSV RNA Vaccines |
SG11202012993SA (en) | 2018-07-13 | 2021-02-25 | Genmab As | Variants of cd38 antibody and uses thereof |
JP2021526845A (ja) | 2018-07-13 | 2021-10-11 | ゲンマブ エー/エス | Cd38抗体を使用したトロゴサイトーシスを介した治療 |
CN112930396A (zh) | 2018-08-24 | 2021-06-08 | 川斯勒佰尔公司 | 用于纯化信使rna的方法 |
KR20210093232A (ko) | 2018-10-09 | 2021-07-27 | 더 유니버시티 오브 브리티시 콜롬비아 | 유기용매와 세제가 없는 형질감염 적격 소포를 포함하는 조성물과 시스템 및 관련 방법 |
EP3877538A1 (en) | 2018-11-08 | 2021-09-15 | Translate Bio, Inc. | Methods and compositions for messenger rna purification |
US11351242B1 (en) | 2019-02-12 | 2022-06-07 | Modernatx, Inc. | HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition |
KR20220133224A (ko) | 2020-01-28 | 2022-10-04 | 모더나티엑스, 인크. | 코로나바이러스 rna 백신 |
CA3170150A1 (en) | 2020-02-07 | 2021-08-12 | Modernatx, Inc. | Sars-cov-2 mrna domain vaccines |
WO2021222304A1 (en) | 2020-04-27 | 2021-11-04 | Modernatx, Inc. | Sars-cov-2 rna vaccines |
WO2021159130A2 (en) | 2020-05-15 | 2021-08-12 | Modernatx, Inc. | Coronavirus rna vaccines and methods of use |
US11406703B2 (en) | 2020-08-25 | 2022-08-09 | Modernatx, Inc. | Human cytomegalovirus vaccine |
EP4217371A1 (en) | 2020-09-25 | 2023-08-02 | ModernaTX, Inc. | Multi-proline-substituted coronavirus spike protein vaccines |
TW202233232A (zh) | 2020-11-06 | 2022-09-01 | 法商賽諾菲公司 | 遞送mRNA疫苗的脂質奈米顆粒 |
CN116981692A (zh) * | 2021-01-14 | 2023-10-31 | 翻译生物公司 | 递送mRNA编码的抗体的方法和组合物 |
US11524023B2 (en) | 2021-02-19 | 2022-12-13 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same |
AU2022237382A1 (en) | 2021-03-15 | 2023-09-28 | Modernatx, Inc. | Therapeutic use of sars-cov-2 mrna domain vaccines |
AU2021461416A1 (en) | 2021-08-24 | 2024-02-22 | BioNTech SE | In vitro transcription technologies |
IL309505A (en) | 2021-09-03 | 2024-02-01 | CureVac SE | Lipid nanoparticles for nucleic acid delivery |
CA3231003A1 (en) | 2021-09-06 | 2023-03-09 | Genmab A/S | Antibodies capable of binding to cd27, variants thereof and uses thereof |
US11814437B2 (en) | 2021-10-08 | 2023-11-14 | Genmab A/S | Antibodies binding to CD30 and CD3 |
WO2023069498A1 (en) | 2021-10-22 | 2023-04-27 | Senda Biosciences, Inc. | Mrna vaccine composition |
WO2023073228A1 (en) | 2021-10-29 | 2023-05-04 | CureVac SE | Improved circular rna for expressing therapeutic proteins |
WO2023092069A1 (en) | 2021-11-18 | 2023-05-25 | Modernatx, Inc. | Sars-cov-2 mrna domain vaccines and methods of use |
WO2023096858A1 (en) | 2021-11-23 | 2023-06-01 | Senda Biosciences, Inc. | A bacteria-derived lipid composition and use thereof |
WO2023144330A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | CureVac SE | Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors |
WO2023205186A2 (en) * | 2022-04-19 | 2023-10-26 | Aegis Life, Inc. | Dna therapeutic encoding an antibody or antigen binding fragment |
WO2023227608A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide |
WO2024015890A1 (en) | 2022-07-13 | 2024-01-18 | Modernatx, Inc. | Norovirus mrna vaccines |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011068810A1 (en) * | 2009-12-01 | 2011-06-09 | Shire Human Genetic Therapies | Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases |
US20120237975A1 (en) * | 2010-10-01 | 2012-09-20 | Jason Schrum | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
WO2012170930A1 (en) * | 2011-06-08 | 2012-12-13 | Shire Human Genetic Therapies, Inc | Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery |
Family Cites Families (141)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4500707A (en) | 1980-02-29 | 1985-02-19 | University Patents, Inc. | Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides |
US5132418A (en) | 1980-02-29 | 1992-07-21 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US4668777A (en) | 1981-03-27 | 1987-05-26 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite nucleoside compounds |
US4973679A (en) | 1981-03-27 | 1990-11-27 | University Patents, Inc. | Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates |
US4415732A (en) | 1981-03-27 | 1983-11-15 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite compounds and processes |
US4373071A (en) | 1981-04-30 | 1983-02-08 | City Of Hope Research Institute | Solid-phase synthesis of polynucleotides |
US4401796A (en) | 1981-04-30 | 1983-08-30 | City Of Hope Research Institute | Solid-phase synthesis of polynucleotides |
US4897355A (en) | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4737323A (en) | 1986-02-13 | 1988-04-12 | Liposome Technology, Inc. | Liposome extrusion method |
US5153319A (en) | 1986-03-31 | 1992-10-06 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US5262530A (en) | 1988-12-21 | 1993-11-16 | Applied Biosystems, Inc. | Automated system for polynucleotide synthesis and purification |
US5047524A (en) | 1988-12-21 | 1991-09-10 | Applied Biosystems, Inc. | Automated system for polynucleotide synthesis and purification |
FR2645866B1 (fr) | 1989-04-17 | 1991-07-05 | Centre Nat Rech Scient | Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi |
US5334761A (en) | 1992-08-28 | 1994-08-02 | Life Technologies, Inc. | Cationic lipids |
US5885613A (en) | 1994-09-30 | 1999-03-23 | The University Of British Columbia | Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes |
US5700642A (en) | 1995-05-22 | 1997-12-23 | Sri International | Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers |
US5705385A (en) | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US7422902B1 (en) | 1995-06-07 | 2008-09-09 | The University Of British Columbia | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US5981501A (en) | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers |
IL122290A0 (en) | 1995-06-07 | 1998-04-05 | Inex Pharmaceuticals Corp | Lipid-nucleic acid complex its preparation and use |
US5744335A (en) | 1995-09-19 | 1998-04-28 | Mirus Corporation | Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein |
IL140110A0 (en) * | 2000-12-05 | 2002-02-10 | Applied Research Systems | Improvement of homogeneity and secretion of recombinant proteins in mammalian systems |
JP2005535282A (ja) | 2001-11-16 | 2005-11-24 | アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション | 抗体のポリシストロニック発現 |
DE10162480A1 (de) | 2001-12-19 | 2003-08-07 | Ingmar Hoerr | Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen |
JP4722481B2 (ja) | 2002-06-28 | 2011-07-13 | プロティバ バイオセラピューティクス リミテッド | リポソーム製造方法および装置 |
KR101164256B1 (ko) | 2003-09-15 | 2012-07-10 | 프로티바 바이오쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 | 폴리에틸렌글리콜 개질된 지질 화합물 및 그의 용도 |
EP1766035B1 (en) | 2004-06-07 | 2011-12-07 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Lipid encapsulated interfering rna |
WO2005120152A2 (en) | 2004-06-07 | 2005-12-22 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods of use |
WO2006017325A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-02-16 | Cell Genesys, Inc. | Aav vector compositions and methods for enhanced expression of immunoglobulins the same |
DE102004042546A1 (de) | 2004-09-02 | 2006-03-09 | Curevac Gmbh | Kombinationstherapie zur Immunstimulation |
US8101741B2 (en) | 2005-11-02 | 2012-01-24 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Modified siRNA molecules and uses thereof |
FR2904144A1 (fr) | 2006-07-19 | 2008-01-25 | St Microelectronics Rousset | Procede de fabrication d'un wafer de semi-conducteur comprenant un filtre optique integre |
US20080145413A1 (en) * | 2006-12-19 | 2008-06-19 | Steffen Panzner | Lipids and lipid assemblies comprising transfection enhancer elements |
DE102007001370A1 (de) * | 2007-01-09 | 2008-07-10 | Curevac Gmbh | RNA-kodierte Antikörper |
WO2009030254A1 (en) | 2007-09-04 | 2009-03-12 | Curevac Gmbh | Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation |
WO2009046739A1 (en) | 2007-10-09 | 2009-04-16 | Curevac Gmbh | Composition for treating prostate cancer (pca) |
AU2008333811B2 (en) | 2007-12-04 | 2014-05-01 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides |
AU2008342535B2 (en) | 2007-12-27 | 2015-02-05 | Arbutus Biopharma Corporation | Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA |
EP3100718B1 (en) | 2008-01-02 | 2019-11-27 | Arbutus Biopharma Corporation | Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
CA2711236A1 (en) | 2008-01-02 | 2009-07-16 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Screening method for selected amino lipid-containing compositions |
JP5788312B2 (ja) | 2008-04-11 | 2015-09-30 | アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッドAlnylam Pharmaceuticals, Inc. | 標的リガンドをエンドソーム分解性成分と組み合わせることによる核酸の部位特異的送達 |
NZ588583A (en) | 2008-04-15 | 2012-08-31 | Protiva Biotherapeutics Inc | Novel lipid formulations for nucleic acid delivery |
WO2010037408A1 (en) | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Curevac Gmbh | Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof |
ES2475065T3 (es) | 2008-10-09 | 2014-07-10 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Aminol�pidos mejorados y métodos para la administración de ácidos nucleicos |
CA3006395C (en) | 2008-11-07 | 2022-05-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Aminoalcohol lipidoids and uses thereof |
KR20220150995A (ko) | 2008-11-10 | 2022-11-11 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물 |
CA2750561C (en) | 2009-01-26 | 2017-10-10 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein c-iii expression |
CA3042927C (en) | 2009-05-05 | 2022-05-17 | Arbutus Biopharma Corporation | Lipid compositions for the delivery of therapeutic agents |
KR102205886B1 (ko) | 2009-06-10 | 2021-01-21 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 향상된 지질 조성물 |
US9051567B2 (en) | 2009-06-15 | 2015-06-09 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA |
WO2011000106A1 (en) | 2009-07-01 | 2011-01-06 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents |
US8236943B2 (en) | 2009-07-01 | 2012-08-07 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein B |
WO2011011447A1 (en) | 2009-07-20 | 2011-01-27 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing ebola virus gene expression |
WO2011069529A1 (en) | 2009-12-09 | 2011-06-16 | Curevac Gmbh | Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids |
WO2011075656A1 (en) | 2009-12-18 | 2011-06-23 | The University Of British Columbia | Methods and compositions for delivery of nucleic acids |
WO2011141705A1 (en) | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Novel cationic lipids and methods of use thereof |
WO2012000104A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Non-liposomal systems for nucleic acid delivery |
BR112013000244A2 (pt) | 2010-07-06 | 2016-05-17 | Novartis Ag | lipossomas com lipídeos apresentando pka vantajoso para administração de rna |
LT3243526T (lt) | 2010-07-06 | 2020-02-10 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Rnr pristatymas, skirtas keleto imuninio atsako paleidimui |
WO2012016184A2 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
CA2807552A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
US8853377B2 (en) | 2010-11-30 | 2014-10-07 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | mRNA for use in treatment of human genetic diseases |
WO2012116715A1 (en) | 2011-03-02 | 2012-09-07 | Curevac Gmbh | Vaccination in newborns and infants |
WO2012113413A1 (en) | 2011-02-21 | 2012-08-30 | Curevac Gmbh | Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates |
CA2831613A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Moderna Therapeutics, Inc. | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
CN103687957A (zh) | 2011-05-17 | 2014-03-26 | 现代治疗公司 | 工程化核酸及其用于非人类脊椎动物的方法 |
CA2838063C (en) | 2011-06-08 | 2023-07-11 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Cleavable lipids |
EP3384938A1 (en) | 2011-09-12 | 2018-10-10 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
WO2013039857A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-21 | modeRNA Therapeutics | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
SG10201602654SA (en) | 2011-10-03 | 2016-05-30 | Moderna Therapeutics Inc | Modified nucleosides,nucleotides,and nucleic acids,and uses thereof |
MX363734B (es) | 2011-10-27 | 2019-03-29 | Massachusetts Inst Technology | Derivados de aminoacidos funcionalizados en la terminal n capaces de formar microesferas encapsuladoras de farmaco. |
WO2013090186A1 (en) | 2011-12-14 | 2013-06-20 | modeRNA Therapeutics | Modified nucleic acids, and acute care uses thereof |
US20140378538A1 (en) | 2011-12-14 | 2014-12-25 | Moderma Therapeutics, Inc. | Methods of responding to a biothreat |
WO2013090648A1 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-20 | modeRNA Therapeutics | Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions |
CA2859691A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Moderna Therapeutics, Inc. | Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant |
WO2013101690A1 (en) | 2011-12-29 | 2013-07-04 | modeRNA Therapeutics | Modified mrnas encoding cell-penetrating polypeptides |
WO2013120499A1 (en) | 2012-02-15 | 2013-08-22 | Curevac Gmbh | Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen |
WO2013120497A1 (en) | 2012-02-15 | 2013-08-22 | Curevac Gmbh | Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein |
RU2020111326A (ru) | 2012-02-24 | 2020-04-29 | Протива Байотерапьютикс Инк. | Триалкил катионные липиды и способы их использования |
US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
US20140275229A1 (en) | 2012-04-02 | 2014-09-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides encoding udp glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide a1 |
US20150050354A1 (en) | 2012-04-02 | 2015-02-19 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions |
JP2015518705A (ja) | 2012-04-02 | 2015-07-06 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. | ヒト疾患に関連する生物製剤およびタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド |
US9303079B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-04-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
JP2015516143A (ja) | 2012-04-02 | 2015-06-08 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. | ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド |
EP3884949A1 (en) | 2012-06-08 | 2021-09-29 | Translate Bio, Inc. | Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells |
LT2922554T (lt) | 2012-11-26 | 2022-06-27 | Modernatx, Inc. | Terminaliai modifikuota rnr |
WO2014089216A1 (en) | 2012-12-04 | 2014-06-12 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | In vitro release assay for liposome encapsulated vincristine |
WO2014089486A1 (en) | 2012-12-07 | 2014-06-12 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Lipidic nanoparticles for mrna delivering |
WO2014093574A1 (en) | 2012-12-13 | 2014-06-19 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for altering cell phenotype |
EP2931319B1 (en) | 2012-12-13 | 2019-08-21 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleic acid molecules and uses thereof |
EP2946014A2 (en) | 2013-01-17 | 2015-11-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes |
EP2968397A4 (en) | 2013-03-12 | 2016-12-28 | Moderna Therapeutics Inc | DIAGNOSIS AND TREATMENT OF FIBROSIS |
US20160024181A1 (en) | 2013-03-13 | 2016-01-28 | Moderna Therapeutics, Inc. | Long-lived polynucleotide molecules |
WO2014152211A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions |
LT2970456T (lt) | 2013-03-14 | 2021-08-10 | Translate Bio, Inc. | Būdai ir kompozicijos, skirti mrnr koduojamų antikūnų pristatymui |
US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
WO2014144767A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Ion exchange purification of mrna |
US10077439B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-09-18 | Modernatx, Inc. | Removal of DNA fragments in mRNA production process |
US20160032273A1 (en) | 2013-03-15 | 2016-02-04 | Moderna Therapeutics, Inc. | Characterization of mrna molecules |
WO2014144711A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Analysis of mrna heterogeneity and stability |
WO2014152027A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Manufacturing methods for production of rna transcripts |
WO2014152031A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Ribonucleic acid purification |
RS62529B1 (sr) | 2013-07-11 | 2021-11-30 | Modernatx Inc | Kompozicije koje sadrže sintetičke polinukleotide koji kodiraju proteine povezane sa crispr i sintetičke sgrnk i postupci upotrebe |
WO2015011633A1 (en) | 2013-07-23 | 2015-01-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivering messenger rna |
WO2015034928A1 (en) | 2013-09-03 | 2015-03-12 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
EP3041938A1 (en) | 2013-09-03 | 2016-07-13 | Moderna Therapeutics, Inc. | Circular polynucleotides |
WO2015048744A2 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
EP3052511A4 (en) | 2013-10-02 | 2017-05-31 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotide molecules and uses thereof |
US20160264614A1 (en) | 2013-10-02 | 2016-09-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotide molecules and uses thereof |
EP3058082A4 (en) | 2013-10-18 | 2017-04-26 | ModernaTX, Inc. | Compositions and methods for tolerizing cellular systems |
JP6893785B2 (ja) | 2013-10-22 | 2021-06-23 | トランスレイト バイオ, インコーポレイテッド | mRNAのCNS送達及びその使用方法 |
EP3076994A4 (en) | 2013-12-06 | 2017-06-07 | Modernatx, Inc. | Targeted adaptive vaccines |
EP2918275B1 (en) | 2013-12-13 | 2016-05-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
RU2717986C2 (ru) | 2013-12-30 | 2020-03-27 | Куревак Аг | Искусственные молекулы нуклеиновой кислоты |
US20170002060A1 (en) | 2014-01-08 | 2017-01-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides for the in vivo production of antibodies |
ES2754239T3 (es) | 2014-03-12 | 2020-04-16 | Curevac Ag | Combinación de vacunación y agonistas de OX40 |
CN106659803A (zh) | 2014-04-23 | 2017-05-10 | 摩登纳特斯有限公司 | 核酸疫苗 |
EP3521456B1 (en) | 2014-06-10 | 2023-01-04 | CureVac Manufacturing GmbH | Methods and means for enhancing rna production |
EP3157573A4 (en) | 2014-06-19 | 2018-02-21 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
US20170136132A1 (en) | 2014-06-19 | 2017-05-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
US10415037B2 (en) | 2014-10-02 | 2019-09-17 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions and methods for silencing hepatitis B virus gene expression |
WO2016071857A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing ebola virus expression |
US20170362627A1 (en) | 2014-11-10 | 2017-12-21 | Modernatx, Inc. | Multiparametric nucleic acid optimization |
WO2016077125A1 (en) | 2014-11-10 | 2016-05-19 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof |
EP3247363A4 (en) | 2015-01-21 | 2018-10-03 | Moderna Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle compositions |
US20180085474A1 (en) | 2015-01-23 | 2018-03-29 | Moderna Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle compositions |
CA2979998A1 (en) | 2015-03-20 | 2016-09-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia |
WO2016164762A1 (en) | 2015-04-08 | 2016-10-13 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same |
WO2016183366A2 (en) | 2015-05-12 | 2016-11-17 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing expression of hepatitis d virus rna |
WO2016197132A1 (en) | 2015-06-04 | 2016-12-08 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Treating hepatitis b virus infection using crispr |
WO2016197133A1 (en) | 2015-06-04 | 2016-12-08 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Delivering crispr therapeutics with lipid nanoparticles |
WO2016201377A1 (en) | 2015-06-10 | 2016-12-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Targeted adaptive vaccines |
CN108350455A (zh) | 2015-07-29 | 2018-07-31 | 阿布特斯生物制药公司 | 用于使b型肝炎病毒基因表达沉默的组合物和方法 |
US11434486B2 (en) | 2015-09-17 | 2022-09-06 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides containing a morpholino linker |
DK3350333T3 (da) | 2015-09-17 | 2022-01-31 | Modernatx Inc | Polynukleotider, der indeholder en stabiliserende haleregion |
US20190054112A1 (en) | 2015-09-18 | 2019-02-21 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotide formulations for use in the treatment of renal diseases |
USD787703S1 (en) | 2016-04-26 | 2017-05-23 | Curevac Ag | Inlay for a culture plate |
-
2014
- 2014-03-14 LT LTEP14717945.1T patent/LT2970456T/lt unknown
- 2014-03-14 PT PT147179451T patent/PT2970456T/pt unknown
- 2014-03-14 HR HRP20211119TT patent/HRP20211119T1/hr unknown
- 2014-03-14 WO PCT/US2014/027717 patent/WO2014152774A1/en active Application Filing
- 2014-03-14 EP EP21170989.4A patent/EP3932947A1/en active Pending
- 2014-03-14 CN CN201480010113.8A patent/CN105209490A/zh active Pending
- 2014-03-14 HU HUE14717945A patent/HUE055044T2/hu unknown
- 2014-03-14 MX MX2015011947A patent/MX2015011947A/es unknown
- 2014-03-14 US US14/775,835 patent/US10087247B2/en active Active
- 2014-03-14 BR BR112015022855A patent/BR112015022855A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2014-03-14 EA EA201591293A patent/EA201591293A1/ru unknown
- 2014-03-14 DK DK14717945.1T patent/DK2970456T3/da active
- 2014-03-14 ES ES14717945T patent/ES2882110T3/es active Active
- 2014-03-14 PL PL14717945T patent/PL2970456T3/pl unknown
- 2014-03-14 AU AU2014239184A patent/AU2014239184B2/en active Active
- 2014-03-14 EP EP14717945.1A patent/EP2970456B1/en active Active
- 2014-03-14 RS RS20210906A patent/RS62565B1/sr unknown
- 2014-03-14 JP JP2016502526A patent/JP6399560B2/ja active Active
- 2014-03-14 CA CA2903880A patent/CA2903880A1/en active Pending
- 2014-03-14 SI SI201431860T patent/SI2970456T1/sl unknown
-
2018
- 2018-05-07 JP JP2018089393A patent/JP7058547B2/ja active Active
- 2018-09-12 US US16/129,412 patent/US10584165B2/en active Active
-
2019
- 2019-02-06 AU AU2019200803A patent/AU2019200803B2/en active Active
-
2020
- 2020-01-24 US US16/752,327 patent/US10899830B2/en active Active
- 2020-12-18 US US17/126,833 patent/US20210206846A1/en active Pending
-
2021
- 2021-01-18 JP JP2021005561A patent/JP7256831B2/ja active Active
- 2021-04-22 AU AU2021202453A patent/AU2021202453B2/en active Active
- 2021-07-28 CY CY20211100680T patent/CY1124670T1/el unknown
-
2023
- 2023-03-31 JP JP2023057800A patent/JP2023073470A/ja active Pending
- 2023-08-30 AU AU2023222869A patent/AU2023222869A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011068810A1 (en) * | 2009-12-01 | 2011-06-09 | Shire Human Genetic Therapies | Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases |
US20120237975A1 (en) * | 2010-10-01 | 2012-09-20 | Jason Schrum | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
WO2012170930A1 (en) * | 2011-06-08 | 2012-12-13 | Shire Human Genetic Therapies, Inc | Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
SU ET AL.: "《Vitro and in Vivo mRNA Delivery Using LipidEnveloped pH-Responsive Polymer Nanoparticles》", 《MOLECULAR PHARMACEUTICS》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111658782A (zh) * | 2020-06-10 | 2020-09-15 | 深圳近邻生物科技有限公司 | mRNA疫苗递送载体及制备方法、mRNA疫苗及制备方法 |
CN113289762A (zh) * | 2021-05-07 | 2021-08-24 | 扬州三源机械有限公司 | 一种基于绿色环保的垃圾处理站用可回收垃圾分拣装置 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2021202453B2 (en) | Methods and compositions for delivering mrna coded antibodies | |
JP2021175750A (ja) | メッセンジャーリボ核酸薬物の治療投与のための方法 | |
JP6561378B2 (ja) | 非肺標的細胞へのmRNAの経肺送達 | |
CN115052635A (zh) | 环状rna组合物和方法 | |
CN116113419A (zh) | 环状rna组合物和方法 | |
AU2021275223A1 (en) | Coronavirus antigen compositions and their uses | |
WO2022109093A1 (en) | Compositions and methods for treating and suppressing allergic responses | |
KR20230065256A (ko) | 코로나바이러스 s 단백질용 결합제 | |
US20230181722A1 (en) | Coronavirus antigen compositions and their uses | |
WO2022006527A1 (en) | Compositions and methods for reverse gene therapy | |
KR20240035794A (ko) | Cldn6-양성 암을 치료하기 위한 cldn6 및 cd3 결합 요소를 암호화하는 제제 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151230 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |