ES2561812T3 - Composición para inhibir la expresión de un gen diana - Google Patents

Composición para inhibir la expresión de un gen diana Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende un liposoma con ARN encapsulado para su uso en el tratamiento del cáncer o enfermedad inflamatoria donde dicha composición se va a administrar dos veces con un intervalo de 7 días, donde el ARN contiene una secuencia que consiste en de 15 a 30 bases contiguas de un ARNm de un gen diana (en lo sucesivo en el presente documento, secuencia X) y una secuencia de bases (en lo sucesivo en el presente documento, secuencia X' complementaria) complementaria de la secuencia X, estando del 30 al 55 % de todos los azúcares unidos a las bases de la secuencia X y siendo la secuencia X' complementaria ribosa sustituida por un grupo 2'-O-metilo, 2'-O-etilo y/o 2'-flúor en la posición 2' y donde el ARN puede suprimir la expresión del gen diana utilizando la interferencia de ARN (ARNi), y pudiendo el liposoma alcanzar un tejido o un órgano que contiene un sitio de expresión del gen diana y que muestra una elevada retención en la sangre, y donde el gen diana es un gen de uno cualquiera de un factor de crecimiento endotelial vascular, un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular, un factor de crecimiento de fibroblastos, un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos, un factor de crecimiento derivado de plaquetas, un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, un factor de crecimiento de hepatocitos, un receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, un factor análogo a Krüppel, un factor de transcripción de Ets, un factor nuclear, y un factor inducible por hipoxia.

Description

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La hebra de sentido directo que contiene la secuencia X puede ser un ARN cuyas bases sean únicamente la secuencia X (en lo sucesivo en el presente documento, hebra que contiene la secuencia X), o un ARN que contiene una hebra con la secuencia X que tiene de 1 a 6, preferentemente de 2 a 4 bases que son iguales o diferentes y se añaden al extremo 3' y/o al extremo 5' de la hebra que contiene la secuencia X.
5 La hebra de sentido contrario que contiene la secuencia X' complementaria puede ser, por ejemplo, un ARN cuyas bases son únicamente la secuencia X' complementaria (en lo sucesivo en el presente documento, la hebra que contiene la secuencia X' complementaria), o un ARN que incluye la hebra que contiene la secuencia X' complementaria que tiene de 1 a 6, preferentemente de 2 a 4 oligonucleótidos que son iguales o diferentes y se añaden al extremo 3' y/o al extremo 5' de la hebra que contiene la secuencia X' complementaria.
El oligonucleótido separador que se une a la hebra de sentido directo que contiene la secuencia X y a la hebra de sentido contrario que contiene la secuencia X' complementaria en el ARN de una estructura en horquilla contiene preferentemente nucleótidos de 6 a 12 bases, preferentemente con dos uracilos en el extremo 5' de la secuencia. Un
15 ejemplo de dicho oligonucleótido separador es un oligonucleótido con la secuencia de bases UUCAAGAGA. Cualquiera de las dos porciones del ARN que se unen entre sí mediante el oligonucleótido separador puede ser adecuada como el ARN del extremo 5'. Preferentemente, la hebra de sentido directo que contiene la secuencia X representa el lado del extremo 5'.
Los nucleótidos y el oligonucleótido separador añadido a la hebra que contiene la secuencia X y la hebra que contiene la secuencia X' complementaria puede contener una o más bases seleccionadas entre guanina, adenina, citosina, timina, y uracilo, y el azúcar unido a cada base puede ser cualquiera de ribosa, desoxirribosa, y ribosa cuyo grupo hidroxilo en la posición 2' está sustituido por un grupo modificador. Más preferentemente, los nucleótidos añadidos son uno de dos de ácido uridílico (U) y ácido desoxitimidínico (dT). La secuencia de bases de los
25 nucleótidos añadidos al extremo 3' de la hebra que contiene la secuencia X puede ser igual a la secuencia de bases de los nucleótidos que constituyen la secuencia X del ARNm del gen diana, y esta estructura es más preferible. De manera similar, la secuencia de bases de los nucleótidos añadidos al extremo 3' de la hebra que contiene la secuencia X' complementaria puede ser una secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases de los nucleótidos que constituyen la secuencia X del ARNm del gen diana, y esta estructura es más preferible.
Los ejemplos más preferidos del ARN utilizado en la presente invención incluyen (a) un ARN bicatenario que tiene una hebra de sentido directo y una hebra de sentido contrario que contiene la secuencia X y la secuencia X' complementaria, respectivamente, siendo la secuencia X una secuencia que consiste en de 19 a 21 bases contiguas del ARNm del gen diana, consistiendo la hebra de sentido directo en la hebra que contiene la secuencia X y de 2 a 4 35 nucleótidos que son iguales o diferentes y se añaden al extremo 3' de la hebra que contiene la secuencia X, consistiendo la hebra de sentido contrario en la hebra que contiene la secuencia X' complementaria, y de 2 a 4 nucleótidos que son iguales o diferentes y se añaden al extremo 3' de la hebra que contiene la secuencia X' complementaria, (b) un ARN bicatenario que tiene una hebra de sentido directo y una hebra de sentido contrario que contienen la secuencia X y la secuencia X' complementaria, respectivamente, siendo la secuencia X una secuencia que consiste en de 23 a 25 bases contiguas del ARNm del gen diana, consistiendo la hebra de sentido directo en la hebra que contiene la secuencia X, consistiendo la hebra de sentido contrario en la hebra que contiene la secuencia X' complementaria, (c) un ARN bicatenario que tiene una hebra de sentido directo y una hebra de sentido contrario que contienen la secuencia X y la secuencia X' complementaria, respectivamente, siendo la secuencia X una secuencia que consiste en de 23 a 27 bases contiguas del ARNm del gen diana, consistiendo la hebra de sentido
45 directo en la hebra que contiene la secuencia X y de 2 a 4 nucleótidos que son iguales o diferentes y se añaden al extremo 3' de la hebra que contiene la secuencia X, consistiendo la hebra de sentido contrario en la hebra que contiene la secuencia X' complementaria y de 2 a 4 nucleótidos que son iguales o diferentes y se añaden al extremo 3' de la hebra que contiene la secuencia X' complementaria, siendo la secuencia de bases de los nucleótidos añadidos al extremo 3' de la hebra que contiene la secuencia X' complementaria una secuencia de bases que es complementaria de la secuencia de bases de los nucleótidos con constituyen la secuencia X del ARNm del gen diana, y similares.
Además, el ARN utilizado en la presente invención es un ARN que tiene una acción de suprimir la expresión del gen diana utilizando la interferencia de ARN (ARNi).
55 Se describe a continuación dicho ARN supresor de la expresión del gen diana utilizando la interferencia de ARN (ARNi) tomando como ejemplo un ARN supresor de la expresión de un gen Bcl2. Los ARN que suprimen la expresión de otros genes se pueden obtener también utilizando procedimientos similares.
El ARN supresor de la expresión del gen bcl-2 se puede diseñar basándose en la secuencia de bases del ADN (SEC ID Nº 29) que corresponde al ARNm de longitud completa de bcl-2 (N.º de registro en Genbank NM_000633). A partir de la secuencia de bases del ADN, se eliminan secuencias contiguas parciales de 15 a 30 bases, preferentemente de 17 a 27 bases, más preferentemente de 19 a 25 bases. Se calculó el contenido de GC en las secuencias eliminadas, y se seleccionaron las secuencias con un contenido de GC de 20 a 80 %, preferentemente 65 de 30 % a 70 %, más preferentemente de 40 a 60 %. A continuación se obtuvo una secuencia de bases con una sustitución T por U como secuencia X. A continuación se obtuvo el ARN supresor de la expresión del gen bcl2 en
forma de un ARN bicatenario que tenía una hebra de sentido directo que contenía la secuencia X seleccionada, y una hebra de sentido contrario que contiene la secuencia X' complementaria, complementaria de la secuencia X, o en forma de un ARN de una estructura en horquilla que contiene la hebra de sentido directo y la hebra de sentido contrario unidas entre sí mediante un oligonucleótido separador.
5 En el ARN utilizado en la presente invención, del 30 al 55 % de todos los azúcares unidos a las bases de la secuencia X y la secuencia X' complementaria son ribosa sustituida por un grupo modificador en la posición 2'.
Tal como se usa en el presente documento, la sustitución por un grupo modificador en la posición 2' de la ribosa significa la sustitución del grupo hidroxilo por un grupo modificador en la posición 2'. El grupo modificador puede tener una configuración igual o diferente a la del grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa, y preferentemente tiene la misma configuración que el grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa.
Los azúcares unidos a las bases de la secuencia X y de la secuencia X' complementaria son ribosas o
15 desoxirribosas, excepto la ribosa sustituida por un grupo modificador en la posición 2'. Preferentemente, todos los azúcares excepto la ribosa sustituida por un grupo modificador en la posición 2' son ribosa.
El ARN utilizado en la presente invención abarca derivados donde los átomos de oxígeno contenidos en el resto fosfato, resto éster, y similares en la estructura del ácido ribonucleico están sustituidos por otros átomos, por ejemplo, tales como un átomo de azufre.
El azúcar unido a la base en el extremo 5' del ARN utilizado en la presente invención puede ser aquel donde el grupo hidroxilo de la posición 5' está modificado con un grupo fosfato, un grupo modificador, o un grupo que se convierte en un grupo fosfato o un grupo modificador mediante la acción de una enzima nucleolítica o similar en el
25 organismo. Preferentemente, el grupo hidroxilo en la posición 5' del azúcar unido a la base en el extremo 5' de la hebra de sentido directo está fosforilado.
El azúcar unido a la base en el extremo 3' del ARN utilizado en la presente invención puede ser aquel donde el grupo hidroxilo de la posición 3' está modificado con un grupo fosfato, un grupo modificador, o un grupo que se convierte en un grupo fosfato o un grupo modificador mediante la acción de una enzima nucleolítica o similar en el organismo.
Los ejemplos del grupo modificador en la presente divulgación incluyen 2'-ciano, 2'-alquilo, alquilo 2' sustituido, 2'alquenilo, alquenilo 2' sustituido, 2'-halógeno, 2'-O-ciano, 2'-O-alquilo, 2'-O-alquilo substituido, 2'-O-alquenilo, 2'-O35 alquenilo sustituido, 2'-S-alquilo, 2'-S-alquilo substituido, 2'-S-alquenilo, 2'-S-alquenilo substituido, 2'-amino, 2'-NHalquilo, 2'-NH-alquilo sustituido, 2'-NH-alquenilo, 2'-NH-alquenilo sustituido, 2'-SO-alquilo, 2'-SO-alquilo sustituido, 2'carboxi, 2'-CO-alquilo, -CO-alquilo sustituido, -Se-alquilo, -Se-alquilo sustituido, -SiH2-alquilo, -SiH2-alquilo sustituido, 2'-ONO2, 2'-NO2, 2'-N3, 2'-NH-alquilo, 2'-NH-alquilo sustituido, un resto 2'-aminoácido (aminoácido con el grupo hidroxilo eliminado del ácido carboxilo), y un resto 2'-O-aminoácido (que tiene la misma definición que anteriormente). La ribosa con la sustitución por un grupo modificador en la posición 2' de la presente divulgación abarca también los ácidos nucleicos en forma de puente (BNA) de una estructura donde el grupo modificador de la posición 2' está formando un puente con el átomo de carbono 4', específicamente, los ácidos nucleicos bloqueados (LNA) donde el átomo de oxígeno de la posición 2' está formando un puente con el átomo de carbono 4' mediante ácidos nucleicos que forman un puente con metileno, etileno (ENA) [Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)], y
45 similares.
Los grupos modificadores de la presente invención son 2'-O-metilo, 2'-O-etilo y/o, 2-flúor. 2'-O-metilo y 2'-O-etilo son los más preferibles.
De acuerdo con la divulgación, la gama de los grupos modificadores puede definirse basándose en su tamaño. Son preferibles los grupos modificadores de un tamaño correspondiente entre el tamaño del flúor al tamaño del -O-butilo, y son más preferibles los grupos modificadores de un tamaño correspondiente entre tamaño del -O-metilo al tamaño del O-etilo.
55 Los ejemplos del alquilo en el grupo modificador descrito en el presente documento incluyen alquilos lineales o ramificados que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo, terc-pentilo, y hexilo. Los ejemplos preferidos incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, neopentilo, terc-pentilo, y similares. Los ejemplos del alquenilo en el grupo modificador incluyen alquenilos lineales o ramificados que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, tales como vinilo, alilo, e isopropenilo.
Los ejemplos del halógeno descritos en el presente documento incluyen un átomo de flúor, un átomo de cloro, un átomo de bromo, y un átomo de yodo.
65 Los ejemplos del aminoácido descrito en el presente documento incluyen aminoácidos alifáticos (específicamente, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, y similares), hidroxiaminoácidos (específicamente, serina, treonina, y
similares), aminoácidos ácidos (específicamente, ácido aspártico, ácido glutámico, y similares), amidas de aminoácidos ácidos (específicamente, asparagina, glutamina, y similares), aminoácidos básicos (específicamente, lisina, hidroxilisina, arginina, ornitina, y similares), aminoácidos que contienen azufre (específicamente, cisteína, cistina, metionina, y similares), iminoácidos (específicamente, prolina, 4-hidroxiprolina, y similares), y similares.
5 Los ejemplos de los sustituyentes del alquilo sustituido y del alquenilo sustituido que se describen en el presente documento incluyen halógeno (que tiene la misma definición que anteriormente), hidroxi, sulfanilo, amino, oxo, -Oalquilo (que tiene la misma definición que anteriormente), -S-alquilo (que tiene la misma definición que anteriormente), -NH-alquilo (que tiene la misma definición que anteriormente), dialquilaminooxi (los dos alquilos pueden ser iguales o diferentes, y tienen la misma definición que anteriormente), dialquilamino (los dos alquilos pueden ser iguales o diferentes, y tienen la misma definición que anteriormente), dialquilaminoalquilenoxi (los dos alquilos pueden ser iguales o diferentes, y tienen la misma definición que anteriormente; el alquileno significa un grupo donde el hidrógeno eliminado procede del alquilo anteriormente definido), y similares, y en número preferentemente de 1 a 3.
15 El ARN utilizado en la presente invención no depende de un método de producción, materia prima, y compuestos intermedios, y abarca también, por ejemplo, los ARN que utilizan ADN o desoxirribosa como la materia prima o compuesto intermedio, siempre que los productos finales tengan la misma fórmula estructural. Específicamente, la ribosa eliminada del átomo de oxígeno en la posición 2' de la presente invención abarca desoxirribosa, y la ribosa sustituida por un grupo modificador en la posición 2' abarca una desoxirribosa donde el hidrógeno de la posición 2' se sustituye con un grupo modificador como se define en las reivindicaciones.
En el ARN utilizado en la presente invención, es preferible que las ribosas sustituidas por un grupo modificador en la posición 2' se distribuyan de tal manera que se coloque de forma adyacente el número más pequeño posible de
25 estas ribosas. Más preferentemente, las ribosas sustituidas por un grupo modificador en la posición 2' se combinan y distribuyen de tal manera que se colocan en posiciones alternas, o cada dos o tres posiciones, y no se colocan de forma adyacente. En particular, para las ribosas unidas a las bases de la secuencia X, es más preferible que del 30 al 55 % de las ribosas tengan una sustitución por un grupo modificador en la posición 2', y se coloquen en cada dos ribosas, y no se coloquen de forma adyacente.
Además, en los pares de bases complementarios de la secuencia X y de la secuencia X' complementaria, es preferible que las ribosas sustituidas por un grupo modificador en la posición 2' se coloquen solamente en una posición de ribosa de estas secuencias, en lugar de en ambas posibiones. Además, en esta estructura preferida, las ribosas sustituidas por un grupo modificador en la posición 2' se combinan y distribuyen más preferentemente de tal
35 manera que se coloquen cada dos o tres o cuatro ribosas, y no se coloquen de forma adyacente.
El ARN utilizado en la presente invención puede producirse utilizando métodos de síntesis de ARN o ADN conocidos
o bien métodos de modificación de ARN o ADN conocidos. Por ejemplo, el ARN puede obtenerse utilizando los servicios de síntesis química proporcionados por, por ejemplo, Hokkaido System Science Co., Ltd.
El liposoma de la composición de la presente invención (en lo sucesivo en el presente documento, "liposoma A") es un liposoma que encapsula un ARN que contiene una secuencia que consiste de 15 a 30 bases contiguas del ARNm de un gen diana y una secuencia de bases complementaria de la secuencia. El liposoma A no está particularmente limitado, siempre que pueda alcanzar un tejido o un órgano que contiene un sitio de expresión del gen diana. Sin
45 embargo, el liposoma A debe seleccionarse de manera adecuada, ya que algunos liposomas alcanzan el tejido u órganos más fácilmente que otros.
Los ejemplos de liposoma A utilizados en la presente invención incluyen un liposoma producido mediante tratamiento de evaporación en fase inversa de una emulsión de tipo agua en aceite (A/Ac) formada añadiendo un lípido glicolado con polietileno, un lípido neutro, y agua a una dispersión de un complejo de lípido catiónico/ARN en una capa de disolvente orgánico hidrófobo (véase la traducción al japonés de la solicitud internacional PCT, N.º 2002-501511), un liposoma producido a partir de un liposoma con ARN encapsulado preparado disminuyendo la concentración de etanol tras añadir lípido (en etanol) a una solución de ARN disuelto en una solución acuosa de un electrolito ácido, donde dicho liposoma con ARN encapsulado se somete a continuación a diálisis a un pH de la
55 muestra aumentado para eliminar el ARN adherido a la superficie del liposoma (véase la traducción de la solicitud internacional PCT, N.º 2002-501511, y Biochimica et Biophysica Acta, 2001, Vol. 1510, p.152-166), un liposoma que incluye una partícula de un complejo que incluye una partícula principal y el ARN, y una membrana de bicapa lipídica para encapsular las partículas de complejo (véanse los documentos WO02/28367, y WO2006/080118), y similares. El liposoma A es preferentemente un liposoma que incluye partículas de complejo que contienen una partícula principal y el ARN, y una membrana de bicapa lipídica para encapsular las partículas de complejo. Es más preferible que los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica sean solubles en un disolvente orgánico polar, y en que los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica y las partículas de complejo sean dispersables en un líquido que contiene el disolvente orgánico polar en una concentración específica. Es también preferible que el liposoma A sea un liposoma que incluya partículas complejas que contienen una sustancia catiónica
65 que contiene partículas principales y el ARN como componentes constituyentes, y una membrana de bicapa lipídica para revestir las partículas de complejo, y donde la membrana de bicapa lipídica incluye, como componentes
constituyentes, un lípido neutro, y un derivado de lípido, un derivado de ácido graso, o un derivado de hidrocarburo alifático de una sustancia soluble en agua. Más preferentemente, los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica son solubles en un disolvente orgánico polar, y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica y las partículas de complejo se pueden dispersar en un líquido que contiene el disolvente orgánico
5 polar en una concentración específica. Tal como se usa en el presente documento, los términos "dispersar" significan dispersar el material insoluble.
Se ha notificado que los liposomas ilustrados anteriormente pueden administrarse a tejidos u órganos que soportan un tumor o inflamación, específicamente, a tumores sólidos, cánceres sólidos, o sitios de inflamación en vasos sanguíneos o en la proximidad de vasos sanguíneos, y similares. Los anteriores liposomas pueden por tanto utilizarse preferentemente cuando el gen diana es un gen asociado a tumor o inflamación.
Además, se ha notificado que los liposomas ilustrados anteriormente tienen una alta retención en sangre. De esta manera, estos liposomas tienen muchas posibilidades de administrarse a cualquier tejido u órgano mediante la
15 circulación sistémica, y de esta manera, un gen que se puede dirigir no está limitado.
La partícula principal de la presente invención es una partícula fina de, por ejemplo, un ensamblaje lipídico, liposoma, micela polimérica, y similares, preferentemente una partícula fina de liposoma. La partícula principal de la presente invención puede ser un complejo como una combinación de dos o más de un ensamblaje lipídico, un liposoma, una micela polimérica, y similares. Por ejemplo, la partícula principal puede ser una micela polimérica como un complejo que contiene los lípidos componentes constituyentes de un ensamblaje lipídico, un liposoma, y similares, o un ensamblaje lipídico, liposoma, y similares como un complejo que contiene el polímero componente constituyente de una micela polimérica.
25 El ensamblaje lipídico o el liposoma (en lo sucesivo en el presente documento, el liposoma B) ya que la partícula principal puede contener componentes, por ejemplo, tal como un lípido y/o un tensioactivo, preferentemente un lípido, o una combinación de un lípido y un tensioactivo. El lípido no está especialmente limitado, y puede ser cualquiera de un lípido sencillo, un lípido complejo y un lípido derivado, y sus ejemplos incluyen un fosfolípido, un gliceroglicolípido, un esfingoglicolípido, un esfingoide, un esterol, un lípido catiónico, y similares. Los ejemplos preferidos incluyen un fosfolípido y un lípido catiónico. Además, los ejemplos de lípidos incluyen también tensioactivos (la misma definición que el tensioactivo descrito a continuación) o lípidos derivados de polímeros (la misma definición que el polímero descrito a continuación, específicamente dextrano, etc.), un derivado de polioxietileno (específicamente, polietilenglicol, etc.) o similares. Los ejemplos de tensioactivos incluyen un tensioactivo no iónico, un tensioactivo aniónico, un tensioactivo catiónico, un tensioactivo de ion híbrido, y similares.
35 Los ejemplos de fosfolípidos como lípidos constituyentes de la partícula principal incluyen fosfolípidos naturales y sintéticos tales como fosfatidilcolina (específicamente, fosfatidilcolina de soja, fosfatidilcolina de yema de huevo (EPC), diestearoil fosfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidilcolina, dioleoil fosfatidilcolina, etc.), fosfatidiletanolamina (específicamente, diestearoil fosfatidiletanolamina (DSPE), dipalmitoil fosfatidiletanolamina, dioleoil fosfatidiletanolamina, etc.), glicerofosfolípidos (específicamente, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, lisofosfatidilcolina, etc.) esfingofosfolípidos (específicamente esfingomielina, ceramida fosfoetanolamina, ceramida fosfoglicerol, ceramida fosfoglicerofosfato, etc.), glicerofosfonolípidos, esfingofosfonolípidos, lecitina natural (específicamente, lecitina de yema de huevo, lecitina de soja, etc.), y fosfolípidos hidrogenados (específicamente fosfatidilcolina de soja hogenada, etc.).
45 Los ejemplos de gliceroglicolípidos como lípidos constituyentes de la partícula principal incluyen sulforibosil glicérido, diglicosil glicérido, digalactosil diglicérido, galactosil diglicérido, glicosil diglicéridos y similares.
Los ejemplos de esfingoglicolípidos como lípidos constituyentes de la partícula principal incluyen galactosil cerebrósidos, lactosil cerebrósidos, gangliósidos, y similares.
Los ejemplos de esfingoides como lípidos constituyentes de la partícula principal incluyen esfingano, icosaesfingano, esfingosina, uno de sus derivados, y similares. Los ejemplos de derivados de los mismos incluyen aquellos donde el -NH2 del esfingano, icosaesfingano, esfingosina o similares están sustituidos con -NHCO(CH2)xCH3 (en la fórmula, x
55 representa un número entero de 0 a 18, en particular, 6, 12 o 18), y similares.
Los ejemplos de esteroles como lípidos constituyentes de la partícula principal incluyen colesterol, dihidrocolesterol, lanosterol, β-sitosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol, ergocasterol, fucosterol, 3β-[N(N',N'dimetilaminoetil)carbamoil]colesterol (DC-Chol), y similares.
Los ejemplos de lípidos catiónicos como lípidos constituyentes de la partícula principal incluyen cloruro de N-[1-(2,3dioleoilpropil)]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), N-[1-(2,3-dioleoilpropil)]-N,N-dimetilamina (DODAP), cloruro de N-[1(2,3-dioleiloxipropil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2-(esperminacarboxiamido) etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), bromuro de N-[1-(2,3-ditetradeciloxipropil)]-N,N-dimetil-N-hidroxietil
65 amonio (DMRIE), bromuro de N-[1-(2,3-dioleiloxipropil)]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE), y similares.
Los ejemplos de tensioactivos no iónicos formadores de la partícula principal incluyen monooleato de sorbitán polioxietilenado (específicamente, Polisorbato 80, etc.), polioxipropilenglicol polioxietilenado (específicamente, Pluronic F68, etc.), un éster de ácido graso de sorbitán (específicamente, monolaurato de sorbitán, monooleato de sorbitán, etc.), un derivado de polioxietileno (específicamente, aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado 60,
5 alcohol polioxietilen laurílico, etc.), un éster de ácido graso de glicerol, y similares.
Los ejemplos de tensioactivos aniónicos formadores de la partícula principal incluyen acilsarcosina, alquilsulfato de sodio, alquilbenceno sulfonatos, un ácido graso de sodio que tiene 7 a 22 átomos de carbono y similares. Los ejemplos específicos incluyen dodecil sulfato de sodio, laurilsulfato de sodio, colato de sodio, desoxicolato de sodio, taurodesoxicolato de sodio, y similares.
Los ejemplos de tensioactivos catiónicos formadores de la partícula principal incluyen una sal de alquilamina, una sal de acilamina, una sal de amonio cuaternario, un derivado de amina, y similares. Los ejemplos específicos incluyen cloruro de benzalconio, una sal de acilaminoetildietilamina, una sal de N-alqulpolialquilpoliamina, una
15 polietilenpoliamida de ácido graso, bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de dodeciltrimetilamonio, alquilpolioxietileneamina, N-alquilaminopropilamina, un éster de ácido graso de trietanolamina, y similares.
Los ejemplos de iones híbridos formadores de la partícula principal incluyen 3[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1propano sulfonato, N-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propano sulfonato, y similares.
En el liposoma B, estos lípidos y tensioactivos se usan solos o en combinaciones de dos o más, y preferentemente se usan en combinaciones de dos o más. Como combinación en el caso donde se usen en combinaciones de dos o más, por ejemplo, se pueden ilustrar una combinación de dos o más componentes seleccionados a partir de una fosfatidilcolina de soja hidrogenada, un fosfolípido glicolado con polietileno, y colesterol, una combinación de dos o
25 más componentes seleccionados entre diestearoil fosfatidilcolina, un fosfolípido glicolado con polietileno, y colesterol, una combinación de EPC y DOTAP, una combinación de EPC, DOTAP, y un fosfolípido glicolado con polietileno, una combinación de EPC, DOTAP, colesterol, y un fosfolípido glicolado con polietileno, y similares.
Además, el liposoma B puede contener un estabilizador de membrana tal como un esterol incluyendo colesterol, un antioxidante tal como tocoferol o similar, según sea necesario. Los estabilizadores pueden utilizarse tanto solos como en combinaciones de dos o más.
Los ejemplos de ensamblajes lipídicos incluyen micelas esféricas, micelas esféricas inversas, micelas con forma de salchicha, micelas inversa con forma de salchicha, micelas con forma de placa, micelas inversas con forma de placa,
35 hexagonal I, hexagonal II y un producto asociado de dos o más moléculas lipídicas, y partículas en emulsión (por ejemplo, partículas en emulsión de aceite en agua (ac/a) tales como una emulsión grasa, una emulsión de un tensioactivo no iónico y aceite de soja, una emulsión lipídica, y una nanosfera de lípidos, partículas en emulsión de agua en aceite en agua (a/ac/a), y similares).
La micela de polímero puede ser una o más micelas seleccionadas entre, por ejemplo, proteína, albúmina, dextrano, polyfect, quitosán, sulfato de dextrano; y polímeros, por ejemplo, tales como poli-L-lisina, polietilenimina, ácido poliaspártico, un copolímero de estireno y ácido maleico, un copolímero de isopropilacrilamida y acrilpirrolidina, dendrímero modificado con polietilenglicol (PEG), ácido poliláctico, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, y ácido poliláctico glicolado con polietileno, y una de sus sales.
45 Aquí, la sal del polímero incluye, por ejemplo, una sal metálica, una sal de amonio, una sal de adición de ácido, una sal de adición de amina orgánica, una sal de adición de aminoácidos, y similares. Los ejemplos de sales metálicas incluyen sales de metales alcalinos tales como una sal de litio, una sal de sodio y una sal de potasio, sal de sodio y sal de potasio; sales de metales alcalinotérreos tales como una sal de calcio y una sal de magnesio; una sal de aluminio; una sal de cinc, y similares. Los ejemplos de sales de amonio incluyen sales de amonio, tetrametilamonio, y similares. Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen inorganatos tales como clorhidrato, un sulfato, un nitrato, y un fosfato, y organatos tales como un acetato, un maleato, un fumarato, y un citrato. Los ejemplos de sales orgánicas de adición de amina incluyen sales de adición de morfolina, piperidina, y similares, y los ejemplos de las sales de adición de aminoácidos incluyen sales de adición de glicina, fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutámico,
55 lisina, y similares.
Además, la partícula principal en la presente invención contiene preferentemente un derivado lipídico o un derivado de ácido graso de una o más sustancia(s) seleccionadas entre, por ejemplo, azúcares, péptidos, ácidos nucleicos y polímeros solubles en agua de un tensioactivo o similar. El derivado lipídico o el derivado de ácido graso de una o más sustancia(s) seleccionadas entre azúcares, péptidos, ácidos nucleicos y polímeros solubles en agua o el tensioactivo se puede utilizar como componente constituyente de la partícula principal o se puede utilizar añadiendo este a la partícula principal.
Los ejemplos preferidos del derivado lipídico o del derivado de ácido graso de una o más sustancia(s) seleccionadas
65 entre azúcares, péptidos, ácidos nucleicos y polímeros solubles en agua o del tensioactivo incluyen un glicolípido o un derivado lipídico o un derivado de ácido graso de un polímero soluble en agua, y sus ejemplos más preferidos
incluyen un derivado lipídico o un derivado de ácido graso de un polímero soluble en agua. El derivado lipídico o el derivado de ácido graso de una o más sustancia(s) seleccionadas entre azúcares, péptidos, ácidos nucleicos y polímeros solubles en agua o el tensioactivo es preferentemente una sustancia que tiene un carácter doble donde una parte de la molécula tiene propiedades de unión a otro(s) componente(s) constituyente(s) de la partícula
5 principal debido a, por ejemplo, afinidad hidrófoba, interacción electrostáticas o similar, y otra parte tiene la propiedad de unirse a un disolvente utilizado en la producción de la partícula principal debido a, por ejemplo, afinidad hidrófila, interacciones electrostáticas o similares.
Los ejemplos de derivados lipídicos del derivado de ácido graso de un azúcar, un péptido o un ácido nucleico incluyen aquellos que comprenden un azúcar tal como sacarosa, sorbitol o lactosa, un péptido tal como un péptido derivado de caseína, un péptido derivado de clara de huevo, un péptido derivado de soja o glutatión, un ácido nucleico tal como ADN, ARN, plásmido, ARNip u ODN, y cualquiera de los lípidos ilustrados en la definición anterior mencionada de la partícula principal o un ácido graso tal como ácido esteárico, ácido palmítico, ácido mirístico o ácido láurico unidos entre sí y similares.
15 Los ejemplos de derivados lipídicos o el derivado de ácido graso de un azúcar incluyen los gliceroglicolípidos y los esfingoglicolípidos ilustrados en la definición anteriormente mencionada de la partícula principal y similares.
Los ejemplos del derivado lipídico o del derivado de ácido graso de un polímero soluble en agua incluyen aquellos que comprenden polietilenglicol, poliglicerol, polietilenimina, poli(alcohol vinílico), ácido poliacrílico, poliacrilamida, oligosacárido, dextrina, una celulosa soluble en agua, dextrano, sulfato de condroitina, poliglicerol, quitosán, polivinilpirrolidona, poliaspartato amida, poli-L-lisina, manano, pululano, oligoglicerol o similares o uno de sus derivados y cualquiera de los lípidos ilustrados en la anterior definición mencionada de la partícula principal o un ácido graso tal como ácido esteárico, ácido palmítico, ácido mirístico o ácido láurico unidos entre sí y similares. Más
25 preferentemente, se pueden ilustrar un derivado lipídico o un derivado de ácido graso de un derivado de polietilenglicol o un derivado de poliglicerol, y además más preferentemente, se pueden ilustrar un derivado lipídico o un derivado de ácido graso de un derivado de polietilenglicol.
Los ejemplos del derivado lipídico o del derivado de ácido graso de un derivado de polietilenglicol incluyen un lípido glicolado con polietileno [específicamente, polietilenglicol fosfatidil etanolamina (más específicamente, 1,2-distearoilsn-glicero-3-fosfoetaanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (PEG-DSPE) y similares), aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado 60, Cremophor EL y similares], ésteres de ácido graso de polietilenglicol sorbitán (específicamente, monooleato de polioxietilen sorbitán y similares), un éster de ácido graso de polietilenglicol y similares, y los ejemplos más preferidos incluyen un lípido glicolado con polietileno.
35 Los ejemplos del derivado lipídico o del derivado de ácido graso de un derivado de poliglicerol incluyen un lípido poliglicerolado (específicamente, poliglicerol fosfatidil etanolamina y similares), un éster de ácido graso de poliglicerol y similares, y los ejemplos más preferidos incluyen un lípido poliglicerolado.
Los ejemplos de tensioactivos incluyen los tensioactivos ilustrados en la definición anteriormente mencionada de la partícula principal, un polietilenglicol alquil éter y similares, y sus ejemplos preferidos incluyen polipropilenglicol polioxietilenado, un éster de ácido graso de glicerol, un polietilenglicol alquil éter y similares.
La partícula principal tiene preferentemente una carga eléctrica positiva. La "carga eléctrica positiva" tal como se usa
45 en el presente documento incluye una carga eléctrica, polarización superficial y similares que genera atracción electrostática por una carga eléctrica en el ARN anteriormente mencionado, polarización molecular y similares. Para que la partícula principal tenga una carga eléctrica positiva, la partícula principal contiene preferentemente una sustancia catiónica, más preferentemente contiene un lípido catiónico.
La sustancia catiónica que se va a incluir en la partícula principal es una sustancia que presenta una naturaleza catiónica, sin embargo, incluso si es una sustancia anfótera que un grupo catiónico y un grupo aniónico, la electronegatividad relativa varía dependiendo del pH, uniéndose a otra sustancia o similar, por tanto, la sustancia anfótera puede clasificarse en una sustancia catiónica como puede ser el caso. Estas sustancias catiónicas se pueden utilizar como un componente constituyente de la partícula principal o se puede utilizar añadiendo este a la
55 partícula principal.
Los ejemplos de sustancias catiónicas incluyen las sustancias catiónicas entre las ilustradas en la definición anteriormente mencionada de las partículas principales (específicamente, un lípido catiónico, tensioactivos catiónicos (la misma definición que anteriormente), un polímero catiónico y similares), una proteína o un péptido que muestra naturaleza catiónica a un pH igual a o menor que el punto isoeléctrico, y similares. Más preferentemente, se pueden ilustrar una o más sustancias seleccionadas entre cloruro de N-[1-(2,3-dioleoilpropil)]-N,N,N-trimetilamonio, N-[1-(2,3-dioleoilpropil)]-N,N-dimetilamina, cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxipropil)-N,N,N-trimetilamonio, bromuro de N[1-(2,3-ditetradeciloxipropil)]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio y 3β-[N-(N',N'-dimetilaminoetil)carbamoil]colesterol.
65 Los ejemplos de sustancias catiónicas en lípidos incluyen DOTAP, DODAP, DOTMA, DOSPA, DMRIE, DORIE, DCChol y similares.
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Los ejemplos de polímeros aniónicos incluyen ácido poliaspártico, un copolímero de estireno y ácido maleico, un copolímero de isopropilacrilamida y acrilpirrolidona, dendrímero modificado con PEG, ácido poliláctico, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, ácido poliláctico glicolado con polietileno, sulfato de dextrano, sulfato de sodio dextrano, sulfato de condroitina, sulfato de sodio condroitina, ácido hialurónico, condroitina, sulfato de dermatán,
5 sulfato de heparán, heparina, sulfato de keratán, dextrano fluoresceína aniónica y similares.
La proteína o el péptido que muestra naturaleza aniónica a un pH igual o mayor que el punto isoeléctrico no está particularmente limitada siempre que esta sea una proteína o un péptido que muestre naturaleza aniónica a un pH igual a o mayor que el punto isoeléctrico de la sustancia. Sus ejemplos incluyen albúmina, orosomucoide, globulina, fibrinógeno, histona, protamina, ribonucleasa, lisozima y similares.
Los ejemplos de ácidos nucleicos como sustancias aniónicas incluyen ADN, ARN, plásmido, ARNip, ODN y similares. Puede tener cualquier longitud y cualquier secuencia siempre que no presente una actividad fisiológica.
15 El agente competidor por la adhesión se adhiere preferentemente electrostáticamente a las partículas cargadas, y es preferentemente una sustancia con un tamaño que no permite la formación reticulada para agregar las partículas principales incluso si la sustancia se adhiere a las partículas principales, o una sustancia que tiene en su molécula, un resto que se adhiere a las partículas principales y un resto que repele la adhesión y suprime la agregación de las partículas principales.
Más específicamente, se puede llevar a cabo la etapa 1, por ejemplo, en un método de producción que incluye una etapa de producir un líquido donde se dispersan las partículas principales que contienen una sustancia supresora de la agregación, y una etapa de dispersar o disolver el ARN de tal manera que quede contenido en el líquido donde se dispersan las partículas principales, (por ejemplo, una etapa de añadir el ARN al líquido donde se dispersan las 25 partículas principales y dispersar o disolver el ARN en el anterior, una etapa de añadir un líquido donde se dispersa
o disuelve el ARN al líquido donde se dispersan las partículas principales o similares). Aquí, los ejemplos específicos de las partículas de complejo obtenidas mediante la etapa de dispersar o disolver el ARN de tal manera que quede contenido en el líquido donde se dispersan las partículas principales, contienen partículas de complejo formadas adhiriendo el ARN a partículas finas que contienen como componente constituyente, el liposoma B que contiene el lípido catiónico, partículas de complejo formadas adhiriendo el ARN a partículas finas que contienen como componente constituyente, un ensamblaje lipídico que contiene el lípido catiónico, y partículas de complejo formadas adhiriendo el ARN a partículas finas que contienen como componente constituyente, un polímero que contiene un polímero catiónico tal como poli-L-lisina. Además, la etapa de dispersar o disolver el ARN de tal manera que quede contenido en el líquido donde se dispersan las partículas principales es preferentemente una etapa de incorporar
35 además el agente competidor por la adhesión en el líquido donde se dispersa o disuelve el ARN y añadir el líquido resultante al líquido donde se dispersan las partículas principales. En este caso, las partículas de complejo se producen adhiriendo el ARN y el agente competidor por la adhesión a las partículas principales, y la producción se puede llevar a cabo suprimiendo además la agregación de las partículas principales durante la producción de las partículas de complejo y la agregación de las partículas de complejo después de la producción.
La relación de las partículas principales al líquido donde se dispersan las partículas principales no está particularmente limitada siempre que se pueda adherir el ARN a las partículas principales, sin embargo, es preferentemente 1 µg/ml a 1 g/ml, más preferentemente aproximadamente 0,1 a 500 mg/ml.
45 Etapa 2) Etapa de revestimiento de las partículas principales con la membrana de bicapa lipídica (1)
Se puede producir el liposoma A mediante, por ejemplo, un método de producción que incluye la etapa de preparar un líquido (líquido A) que contiene un disolvente orgánico polar donde se dispersan las partículas de complejo obtenidas en la etapa 1 y se disuelven los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica, y la etapa de revestir las partículas de complejo con la membrana de bicapa lipídica reduciendo la relación del disolvente orgánico polar en el líquido A. En este caso, el liposoma A se obtiene en forma de una dispersión (líquido B). El disolvente del líquido A es un disolvente que contiene un disolvente orgánico polar a tal concentración que los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica son solubles y las partículas de complejo son dispersables. En el líquido B cuya relación del disolvente orgánico polar al líquido A está reducida, los componentes
55 constituyentes de la membrana de bicapa lipídica son dispersables y las partículas de complejo son también dispersables. Cuando el disolvente del líquido A es una mezcla líquida de un disolvente orgánico polar y un disolvente diferente de un disolvente orgánico polar, por ejemplo, mediante la adición de un disolvente que contiene un disolvente diferente de un disolvente orgánico polar que se puede mezclar con el disolvente orgánico polar (líquido C), y/o la eliminación selectiva del disolvente orgánico polar mediante destilación por evaporación, separación de membrana semipermeable, destilación fraccionada o similares, se puede reducir la relación del disolvente orgánico polar. Aquí, el líquido C es preferentemente un disolvente que contiene un disolvente diferente de un disolvente orgánico polar, y puede contener también un disolvente orgánico polar siempre que la relación del disolvente orgánico polar en el líquido C sea menor que la del disolvente orgánico polar contenido en el líquido A.
65 Los ejemplos de disolventes diferentes de un disolvente orgánico polar en la etapa 2 incluyen agua, dióxido de carbono líquido, un hidrocarburo líquido, un carbono halogenado, un hidrocarburo halogenado y similares, y sus
ejemplos preferidos incluyen agua. Además, el líquido A y el líquido C pueden contener un ion, un componente tampón o similares. Estos se pueden usar solos, o se pueden usar dos o más en combinación.
La combinación de un disolvente orgánico polar con un disolvente diferente de un disolvente orgánico polar es
5 preferentemente una combinación de disolventes que se pueden mezclar, y se pueden seleccionar teniendo en cuenta la solubilidad de las partículas de complejo y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica en los disolventes en el líquido A y el líquido B, y el líquido C. Las partículas de complejo tienen preferentemente una solubilidad baja en cualquiera de los disolventes del líquido A y el líquido B, y el líquido C, y tienen también preferentemente una baja solubilidad en cualquiera de un disolvente orgánico polar y un disolvente diferente de un disolvente orgánico polar. Los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica tienen preferentemente una baja solubilidad en el disolvente del líquido B, y el líquido C, y tienen preferentemente una alta solubilidad en el disolvente del líquido A, y tienen preferentemente una alta solubilidad en un disolvente orgánico polar y tienen preferentemente una baja solubilidad en un disolvente diferente de un disolvente orgánico polar. Aquí, las partículas de complejo que tienen una baja solubilidad significan que la elución de cada componente contenido
15 en las partículas de complejo tal como las partículas principales, el ARN y el agente competidor por la adhesión es baja, e incluso si las respectivas solubilidades de los componentes son altas, es suficiente que la elución de cada componente sea baja debido a la unión o similares entre los respectivos componentes. Por ejemplo, incluso cuando la solubilidad de cualquiera de los componentes contenidos en las partículas principales en el disolvente del líquido A sea alta, si las partículas principales tienen una carga eléctrica positiva, y se forman enlaces electrostáticos debido a una carga eléctrica, la polarización intramolecular o similares en el ARN, y la solubilidad del(de los) componente(s) en el disolvente del líquido A se vuelve baja, se suprime la elución de los componentes en las partículas de complejo, por lo cual se puede disminuir la solubilidad de las partículas de complejo en el disolvente del líquido A. Es decir, si las partículas principales tienen una carga eléctrica positiva, se suprime la elución de los componentes de las partículas de complejo en la producción del liposoma A, y se transmite un efecto de aumentar la productividad y
25 el rendimiento.
La concentración del disolvente orgánico polar en el líquido A no está particularmente limitada siempre que sea una concentración a la cual los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica sean solubles y las partículas de complejo sean dispersables, y varía dependiendo del disolvente o de las partículas de complejo que se van a usar, el tipo de componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica o similares. Sin embargo, es preferentemente de aproximadamente un 30 % en v/v o más, más preferentemente de 60 a 90 % en v/v. Además, la concentración del disolvente orgánico polar en el líquido B no está particularmente limitada siempre que el líquido B contenga el disolvente orgánico polar a una concentración menor que el líquido A y esta sea una concentración a la cual los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica sean dispersables y las partículas de
35 complejo sean también dispersables, sin embargo, es preferentemente aproximadamente un 50 % en v/v o menos.
La etapa de preparar el líquido A puede ser una etapa de preparar el líquido A mediante la adición del disolvente orgánico polar, las partículas de complejo y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica, además, si fuera necesario, el disolvente diferente del disolvente orgánico polar. El disolvente orgánico polar, las partículas de complejo, los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica y el disolvente diferente del disolvente orgánico polar se pueden añadir en cualquier orden siempre que no se disuelvan las partículas de complejo. Preferentemente, se puede ilustrar la etapa de preparar el líquido A mediante la preparación de un líquido (líquido D) que contiene un disolvente orgánico polar donde se dispersan las partículas de complejo mediante la preparación de un líquido (líquido E) donde los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica se
45 disuelven en un disolvente que contiene un disolvente orgánico polar que es igual o diferente del disolvente orgánico polar del líquido D, y mezclar el líquido D y el líquido E. Cuando el líquido A se prepara mezclando el líquido D y el líquido E, se prefiere mezclarlos gradualmente.
Etapa 3) Etapa de revestimiento de las partículas principales con la membrana de bicapa lipídica (2)
Se puede producir el liposoma A mediante un método de producción que incluye una etapa de dispersar las partículas de complejo obtenidas en la etapa 1 y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica en un líquido (líquido F) que contiene un disolvente orgánico polar donde los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica son solubles a una concentración a la cual los componentes constituyentes de la
55 membrana de bicapa lipídica están presentes en un estado disperso. En este caso, el liposoma A puede obtenerse en un estado de dispersión. Aunque los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica son solubles en un disolvente orgánico polar contenido en el líquido F, el líquido F contiene el disolvente orgánico polar, donde se puede obtener el disolvente orgánico polar en un líquido a tal concentración que los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica sean dispersables y que las partículas de complejo sean dispersables.
Como método para preparar el líquido F, se puede emplear cualquier realización. Por ejemplo, el líquido F puede prepararse preparando una dispersión de partículas de complejo y una solución o una dispersión de los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica y mezclando ambos líquidos, o puede prepararse el líquido F preparando una cualquiera de las dispersiones de las partículas de complejo y los componentes 65 constituyentes de la membrana de bicapa lipídica, y añadiendo y dispersando las otras partículas de complejo restantes o los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica en la forma de un sólido en la
dispersión resultante. Cuando se mezclan una dispersión de las partículas de complejo y una solución o una dispersión de los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica, un medio de dispersión de las partículas de complejo puede incluir por adelantado un disolvente orgánico polar, y un disolvente o un medio de dispersión de los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica puede ser un líquido que contiene 5 un disolvente orgánico polar o un líquido compuesto solo por un disolvente orgánico polar. Por otra parte, cuando se preparan dispersiones de una cualquiera de las partículas de complejo y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica, y las otras partículas de complejo restantes o componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica en la forma de un sólido se añaden a la suspensión resultante, la dispersión resultante es preferentemente un líquido que contiene un disolvente orgánico polar. Incidentalmente, cuando las partículas de complejo no se disuelven y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica se dispersan después de preparar el líquido F, se puede añadir un disolvente orgánico polar en un intervalo de concentración del disolvente orgánico polar donde las partículas de complejo no se disuelven y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica se dispersan, o se puede eliminar el disolvente orgánico o se puede reducir su concentración. Por otra parte, cuando las partículas de complejo no se disuelven y los componentes constituyentes 15 de la membrana de bicapa lipídica se disuelven después de preparar el líquido F, el disolvente orgánico polar puede eliminarse o reducirse su concentración a un intervalo de concentraciones del disolvente orgánico polar donde las partículas de complejo no se disuelven y se dispersan los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica. Como alternativa, las partículas de complejo y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica se mezclan previamente en un disolvente diferente de un disolvente orgánico polar, se puede añadir al anterior un disolvente orgánico polar en un intervalo de concentración del disolvente orgánico polar donde las partículas de complejo no se disuelven y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica se dispersan. En este caso, las partículas de complejo y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica se dispersan por separado en disolventes diferentes de un disolvente orgánico polar, y ambas dispersiones se mezclan, y después, se puede añadir a lo anterior un disolvente orgánico, o uno cualquiera de las partículas de 25 complejo y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica se dispersan en un disolvente diferente de un disolvente orgánico polar, y las otras partículas de complejo restantes o componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica en la forma de un sólido se añaden a la suspensión resultante, y a continuación se puede añadir a la anterior un disolvente orgánico polar. Además, se prefiere incluir una etapa de dejar reposar o mezclar el líquido donde las partículas de complejo y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica se dispersan y el disolvente orgánico polar está contenido, durante un tiempo suficiente para revestir las partículas de complejo con la membrana de bicapa lipídica. El tiempo para dejar reposar el líquido o mezclar el líquido después de que las partículas de complejo y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica se dispersan en el líquido que contiene el disolvente orgánico polar no está limitado siempre que este no se complete inmediatamente después que las partículas de complejo y los componentes constituyentes de la 35 membrana de bicapa lipídica se dispersen en el líquido que contiene el disolvente orgánico polar, sin embargo, puede ajustarse arbitrariamente dependiendo de los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica
o del tipo del líquido que contiene el disolvente orgánico polar, y se ajusta preferentemente a un tiempo donde se mantiene constante el rendimiento del liposoma A obtenido, por ejemplo, de 3 segundos a 30 minutos.
Los ejemplos de disolventes diferentes de un disolvente orgánico polar en el líquido F incluyen los ilustrados en el disolvente diferente de un disolvente orgánico polar en la etapa 2, y sus ejemplos preferidos contienen agua.
La concentración del disolvente orgánico polar en el líquido F no está particularmente limitada siempre que se cumpla solo el requerimiento de dispersarse de las partículas de complejo y los componentes constituyentes de la
45 membrana de bicapa lipídica, y varía dependiendo del disolvente o de las partículas de complejo que se van a usar, el tipo de componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica o similares. Sin embargo, es preferentemente aproximadamente de 1 a 80 % en volumen, más preferentemente aproximadamente de 10 a 60 % en volumen, más preferentemente aproximadamente de 20 a 50 % en volumen, y lo más preferente aproximadamente de 30 a 40 % en volumen.
En la presente invención, la descripción de que los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica son solubles en un disolvente orgánico polar incluye un caso donde los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica tienen la propiedad de disolverse en un disolvente orgánico polar, un caso donde los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica tienen la propiedad de disolverse en un disolvente 55 orgánico polar con la ayuda de un solubilizante o similar, un caso donde los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica tienen la propiedad de emulsionarse o formar una emulsión formando agregados, micelas o similares en un disolvente orgánico polar y similares. Además, la descripción de que los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica son dispersables incluye un estado donde el total de los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica forman agregados, micelas o similares y se emulsionan o forman una emulsión, un estado donde una parte de los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica forman agregados, micelas o similares y se emulsionan o forman una emulsión, y el resto de los componentes se disuelven, un estado donde una parte de los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica forman agregados, micelas o similares y se emulsionan o forman una emulsión, y el resto de los componentes se precipitan y similares. De forma incidental, la descripción de que los componentes constituyentes 65 de la membrana de bicapa lipídica se disuelven no incluye un estado donde el total de los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica forman agregados, micelas o similares y se emulsionan o forman
una emulsión.
En la presente invención, la descripción de que las partículas de complejo se dispersan significa un estado donde las partículas de complejo se suspenden o emulsionan o forman una emulsión, e incluye un estado donde una parte de
5 las partículas se suspenden o emulsionan o forman una emulsión, y el resto de las partículas se disuelven, un estado donde una parte de las partículas de complejo se emulsionan o forman una emulsión, y el resto de las partículas se precipitan y similares. La descripción de que las partículas de complejo no se disuelven es la misma que la definición anteriormente mencionada de las partículas de complejo que se dispersan.
10 La concentración de las partículas de complejo en la solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que se va a usar en el método de producir el liposoma A de acuerdo con la presente invención no está particularmente limitada, siempre que permita a las partículas de complejo revestirse con la membrana de bicapa lipídica, sin embargo, es preferentemente 1 µg/ml a 1 g/ml, más preferentemente aproximadamente 0,1 a 500 mg/ml. Además, la concentración de los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica que se va a usar no está
15 particularmente limitada siempre que permita el revestimiento de las partículas de complejo, sin embargo, es preferentemente 1 µg/ml a 1 g/ml, más preferentemente aproximadamente 0,1 a 400 mg/ml.
La relación de la membrana de bicapa lipídica al liposoma A de la presente invención es preferente mente de aproximadamente 1:0,1 a 1:1000, más preferentemente aproximadamente 1:1 a 1:10 en relación en peso.
20 Además, como en el caso del tamaño del liposoma A de la presente invención, un tamaño de partículas promedio es preferentemente aproximadamente 300 nm o menos, más preferentemente aproximadamente 200 nm o menos. Específicamente, por ejemplo, se prefiere un tamaño inyectable.
25 Además, el liposoma A obtenido anteriormente puede estar modificado con una sustancia tal como una proteína incluyendo un anticuerpo y similares, un sacárido, un glucolípido, un aminoácido, un ácido nucleico, o cualquiera de diversos compuestos y polímeros de bajo peso molecular, y dichas partículas de complejo revestidas obtenidas mediante modificación se incluyen en el liposoma A. Por ejemplo, para aplicar el direccionamiento, es posible que el liposoma A obtenido anteriormente se someta adicionalmente a una modificación superficial de la membrana de
30 bicapa lipídica utilizando una proteína tal como un anticuerpo, un péptido, un ácido graso o similar [véase Stealth Liposomes, editado por D. D. Lasic y F. Martin, CRC Press lnc., USA, pp. 93-102, (1995)]. Además, puede llevarse también a cabo la mejora superficial del liposoma A utilizando, por ejemplo, un derivado lipídico, un derivado de ácido graso, o un derivado de hidrocarburo alifático de una sustancia soluble en agua. El derivado de lípido, el derivado de ácido graso, y el derivado de hidrocarburo alifático de una sustancia soluble en agua que se va a usar
35 en la modificación superficial tiene las mismas definiciones que el derivado lipídico, el derivado de ácido graso, y el derivado de hidrocarburo alifático de una sustancia soluble en agua como los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica.
Mediante la administración de la composición de la presente invención a un mamífero incluyendo seres humanos, el
40 ARN puede administrarse a un sitio de expresión de un gen diana, y, por ejemplo, se puede introducir un ARN que puede suprimir la expresión del gen en una célula de mamífero in vivo, posibilitando suprimir la expresión del gen o similar. Por ejemplo, como el gen diana de la composición de la presente invención que se define en las reivindicaciones es un gen asociado con el tumor o la inflamación, la composición de la presente invención puede utilizarse como agente terapéutico o preventivo para el cáncer o enfermedades inflamatorias, preferentemente un
45 agente terapéutico o preventivo para el cáncer sólido, o inflamación en vasos sanguíneos en la proximidad de vasos sanguíneos. Específicamente, por ejemplo, cuando el gen diana de la composición de la presente invención es un gen asociado con la angiogénesis o similar, se puede suprimir el crecimiento del músculo liso vascular, la angiogénesis, o similares, y se puede utilizar la composición de la presente invención, por ejemplo, como agente terapéutico o preventivo para el cáncer o las enfermedades inflamatorias que implican el crecimiento del músculo
50 liso vascular o la angiogénesis.
En otras palabras, la presente divulgación proporciona también un método para tratar el cáncer o las enfermedades inflamatorias, por el cual la composición de la presente invención que se ha descrito anteriormente se administra a un mamífero. Preferentemente, el sujeto de la administración es un ser humano, preferentemente individuos
55 humanos afectados por cáncer o enfermedades inflamatorias.
Además, la composición de la presente invención se puede usar también como herramienta para adquirir Poe (prueba de concepto) en un sistema de selección in vivo que se refiere a un agente terapéutico o preventivo para el cáncer o enfermedades inflamatorias.
60 La composición de la presente invención se puede utilizar como una preparación prevista para la estabilización del ARN en un componente de un organismo vivo tal como un componente de la sangre (por ejemplo, sangre, tracto gastrointestinal o similar), reducción de efectos secundarios, aumento de la acumulación de fármacos en tejidos u órganos que contiene el sitio de expresión del gen diana, y similares.
65
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bicapa lipídica solubles en un disolvente orgánico polar, y los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica y las partículas de complejo se pueden dispersar en un líquido que contiene el disolvente orgánico polar en una concentración específica, o un liposoma que incluye una partícula de complejo que contiene una partícula principal que comprende una sustancia catiónica y el ARN como componentes constituyentes, y una
5 membrana de bicapa lipídica para revestir la partícula de complejo, conteniendo la membrana de bicapa lipídica, como componentes constituyentes, un lípido neutro, y un derivado de lípido, un derivado de ácido graso, o un derivado de hidrocarburo alifático de una sustancia soluble en agua.
La presente invención se describirá específicamente a continuación con referencia a los Ejemplos y Ejemplos de ensayo. Sin embargo, la presente invención no se limita a estos Ejemplos y Ejemplos de ensayo.
Ejemplo 1
El ARN utilizado en el Ejemplo 1 es un ARN bicatenario que contiene una secuencia que consiste en 19 bases
15 contiguas del ARNm de un gen BCl2 (en lo sucesivo en el presente documento, secuencia X2) y una secuencia de bases (en lo sucesivo en el presente documento, secuencia X2')complementaria a la secuencia X2 [sentido directo: 5'-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdTdT-3' (los azúcares unidos a las bases precedidos por d son desoxirribosas, y los azúcares unidos a las bases 2ª, 4ª, 6ª, 8ª, 10ª, 12ª, 14ª, 16ª, y 18ª precedidas por m con respecto al extremo 5' son ribosas sustituidas con 2'-O-metilo) (SEC ID Nº: 1); sentido contrario: 5'-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCA mCdTdT-3' (los azúcares unidos a las bases precedidos por d son desoxirribosas, y los azúcares unidos a las bases 1ª, 3ª, 5ª, 7ª, 9ª, 11ª, 13ª, 15ª, 17ª, y 19ª precedidos por m con respecto al extremo 5' son ribosas sustituidas con 2'-O-metilo) (SEC ID Nº: 2)] (en lo sucesivo en el presente documento, 2'-OMe BCl2sARNip Exp. 1). El cincuenta por ciento de todas las ribosas unidas a las bases de la secuencia X2 y la secuencia X2' complementaria son ribosas sustituidas con un grupo 2'-O-metilo. Se obtuvieron la hebra de sentido
25 directo y la hebra de sentido contrario de Eurogentec (Bélgica), que se hibridaron para preparar el ARN bicatenario.
DOTAP (fabricado por Avanti Polar lipids Inc.), PEG-DSPE (fabricado por NOF Corporation) y agua destilada (fabricada por Otsuka Pharmaceutical Co., ltd.) se mezclaron de tal manera que la relación de DOTAP/PEGDSPE/agua destilada era de 40 mg/16 mg/l ml, y lla mezcla se removió agitando con un mezclador de tipo vórtice. La suspensión obtenida se pasó, a 70°C, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 µm (fabricado por Costar) 10 veces y a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,2 µm (fabricado por Whatman) 3 veces y a continuación a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 µm (fabricado por Corning) 10 veces y un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 µm (fabricado por Whatman) 20 veces. La partícula principal tiene un diámetro de partículas promedio de 73,01 nm medida con dispersión dinámica de luz (DIS).
35 Por separado, se mezclaron EPC (NOF Corporation)/PEG-DSPE (NOF Corporation)/etanol (Wako Pure Chemical Industries, ltd.)/agua (15 mg/3,125 mg/0,625 ml/0,375 ml), y se preparó una solución que contenía los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica.
La dispersión de partículas cargadas obtenida (0,875 ml) se mezcló con una solución acuosa (0,2917 ml) obtenida mezclando 2'-OMe BCl2ARNip Exp. 1 en agua en una proporción de 24 mg/1 ml, a fin de preparar las partículas de complejo. La dispersión de partículas de complejo obtenida se añadió a la solución de los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica (4,667 ml), y se añadieron 1,459 ml de agua destilada. Después, tras añadir la solución de los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica (0,4667 ml), se añadió
45 gradualmente agua destilada (54,31 ml) para ajustar la concentración de etanol a 5 % o menos. La suspensión de liposomas obtenida se sometió a ultracentrifugación (80 min, 110.000 x g, 25°C), y se eliminó el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en aproximadamente 5 ml de suero salino fisiológico (Otsuka Pharmaceutical Co., ltd.).
El liposoma tiene un diámetro de partículas promedio de 92,89 nm medido con DIS. La cuantificación de 2'-OMe BCl2siRNA Exp. 1 en el liposoma encontró que la concentración era 1,2460 mg/ml, y que el porcentaje de recuperación con respecto a la cantidad cargada de 2'-OMe BCl2ARNip Exp. 1 era de 88,02 %. Finalmente, se obtuvo una preparación ajustando la concentración de 2'-OMe BCl2ARNip Exp. 1 a 0,75 mg/ml con adición de suero salino fisiológico (3,270 ml).
55 Ejemplo comparativo 1
El ARN utilizado en el Ejemplo comparativo 1 es un ARN bicatenario que contiene la secuencia X2. y la secuencia complementaria X2' [sentido directo: 5'-GUG AAG UCA ACA UGC CUG CdTdT-3' (los azúcares unidos a las bases precedidas por d son desoxrribosas) (SEC ID Nº: 3); sentido contrario: 5'-GCA GGC AUG UUG ACU UCA CdTdT-3' (los azúcares unidos a las bases precedidas por d son desoxirribosas) (SEC ID Nº: 4)] (en lo sucesivo en el presente documento, BCl2siRNA Com. 1). Se obtuvieron la hebra de sentido directo y la hebra de sentido contrario de Eurogentec (Bélgica), que se hibridaron para preparar el ARN bicatenario.
Se prepararon las partículas mezclando 24 mg/ml de una solución acuosa de BCl2ARNip Com. 1 (0,1667 ml) con
65 una dispersión de partículas principales (0,5 ml) obtenida de la misma manera que en el Ejemplo 1. La dispersión de partículas de complejo obtenida se añadió a una solución de los componentes constituyentes de la membrana de
bicapa lipídica (2,667 ml), y se añadió agua destilada (0,8334 ml). Después, tras añadir la solución del componente constituyente de la membrana de bicapa lipídica (0,2667 ml), se añadió gradualmente agua destilada (31,03 ml) para ajustar la concentración de etanol a 5 % o menos. La suspensión de liposomas obtenida se sometió a ultracentrifugación (80 min, 110.000 x g, 25 ºC), y se eliminó el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en
5 aproximadamente 2 ml de suero salino fisiológico (Otsuka Pharmaceutical Co., ltd.).
El liposoma tiene un diámetro de partículas promedio de 88,31 nm medido con DIS. La cuantificación de BCl2ARNip Com. 1 en el liposoma encontró que la concentración era de 1,7332mg/ml`, y que el porcentaje de recuperación con respecto a la cantidad cargada de BCl2ARNip Com. 1 era del 90,09 %. Finalmente, se obtuvo una preparación ajustando una concentración BCl2ARNip Com. 1 a 1,5 mg/ml con adición de suero salino fisiológico (0,3232 ml).
Ejemplo de ensayo 1
Soluciones de fármacos (concentración de ARNip, 750 µg/ml; 200 µl) que contenían las preparaciones obtenidas en
15 el Ejemplo 1 y el Ejemplo comparativo 1 se administraron dos veces a ratones Balb/c macho (6 semanas de edad, ClEA Japan, Inc.) a través de la vena de la cola en el intervalo de 7 días (dosis, 150 µg/ratón). Tras la segunda administración, se recogió sangre (10 µl) de la arteria de la cola en cada punto temporal tras 0,5, 3, 7, y 24 horas, y se mezcló con 90 µl de una solución desnaturalizante (4 mol/l de tiocianato de guanidina, 25 mmol/l de sodio, 0,1 % en v/v de 2-mercaptoetanol, 0,5 % en p/v N-lauroil sarcosina de sodio; en lo sucesivo en el presente documento, solución D). Como resultado, se obtuvo 10 % en v/v de sangre.
El 10 % en v/v (10 µl) del grupo del cual se obtuvo la preparación en el Ejemplo 1 se mezcló con 10 µl de una solución acuosa de dietilpirocarbonato (un 0,1 % en v/v de una mezcla de dietilpirocarbonato en agua ultrapura), 10 µl de solución I.S. (0,3 µmol/l de la solución acuosa de dietilpirocarbonato como I.S.), 100 µl de solución D, 10 µl de 25 acetato de sodio 2 mmol/l (pH 4,0), y 150 µl de una solución de fenol/cloroformo saturada con TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) (se usó la capa inferior de una mezcla de relación 1:1 en volumen de fenol y cloroformo saturada con TE). A continuación se centrifugó la mezcla a 132.000 x g durante 10 min a 4 ºC. Se mezcló el sobrenadante (65 µl) con 15 µl de una solución GenTlE (vehículo de precipitación GenTIE (Takara Bio Inc.) diluido 15 veces con la solución acuosa de dietilpirocarbonato), y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante al menos 10 min después de la edición de etanol (200 µl). Tras 10 min de centrifugación (132.000 x g) a 4 ºC, se descartó el sobrenadante, y se añadió al precipitado etanol al 75 % en v/v (200 µl). Tras 15 min de centrifugación
(132.000 x g) a 4 ºC, se descartó el sobrenadante, y el precipitado se secó al aire y se disolvió en 100 µl de una solución de redisolución (en una relación 0,1/0,4/30/1.000 en volumen de dietilpirocarbonato/trietilamina/hexafluoroisopropanol/agua). La mezcla se centrifugó a 132.000 x g durante 10 min a
35 4 ºC, y se cuantificó el sobrenadante como muestra de análisis utilizando HPLC. Los resultados se muestran en la Fig. 1.
Equipo
Equipo de HPLC: ACQUITY UPlC System (Waters) Espectrómetro de masas: API4000 Q TRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex) Programa informático de análisis: Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems/MDS Sciex)
Condiciones de HPLC 45 Sustancia patrón interna (P.I.)
5'-GmUG mAAmG UmCA mACmA UmGC mCUmG CdT-3' (los azúcares unidos a las bases precedidas por d son desoxirribosas, y los azúcares unidos a las bases 2ª, 4ª, 6ª, 8ª, 10ª, 12ª, 14ª, 16ª, y 18ª precedidas por m con respecto al extremo 5' son ribosas sustituidas con 2'-O-metilo) (SEC ID Nº: 5)
5'-mGCmA GmGC mAUmG UmUG mACmU UmCA mCdT-3' (el azúcar unido a la base precedida por d es desoxirribosa, y los azúcares unidos a las bases 1ª, 3ª, 5ª, 7ª, 9ª, 11ª, 13ª, 15ª, 17ª, y 19ª precedidos por m con respecto al extremo 5' son ribosas sustituidas con 2'-O-metilo) (SEC ID Nº: 6)
55 Columna: Xbridge C18 (3,5 µm, 2,1 mm D.I. x 50 mm, Waters) Prefiltro: Cartucho para precolumna Xbridge (3,5 µm, 2,1 mm D.I. x 10 mm, Waters) Temperatura de la columna: 65°C Fase móvil: trietiilamina/hexafluoroisopropanol/agua (0,4/30/1000):metanol = 93,7 a 75,25 Cantidad de inyección: 25 µl Detección: Espectroscopía de masas (método de ionización; ionización por electropulverización, negativa, temperatura de la fuente de iones: 500°C)
El 10 % en v/v (10 µl) del grupo del cual se obtuvo la preparación del Ejemplo comparativo 1 se mezcló con 10 µl de una solución acuosa de dietilpirocarbonato (un 0,1 % en v/v de una mezcla de dietilpirocarbonato en agua ultrapura), 65 10 µl de solución I.S. (0,3 µmol/l de la solución acuosa de dietilpirocarbonato como I.S.), 100 µl de solución D, 10 µl de acetato de sodio 2 mmol/l (pH 4,0), y 150 µl de una solución ácida saturada de fenol/cloroformo (se usó la capa
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La hebra de sentido directo y la hebra de sentido contrario se obtuvieron de Hokkaido System Science Co., Ltd., que se hibridaron para preparar el ARN bicatenario.
DOTAP (fabricado por Avanti Polar Lipids Inc.), PEG-DSPE (fabricado por NOF Corporation) y agua destilada
5 (Otsuka Pharmaceutical Co., ltd.) se mezclaron de tal manera que la relación de DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada era de 40 mg/16 mg/1 ml, y lla mezcla se removió agitando con un mezclador de tipo vórtice. La suspensión obtenida se pasó, a 70°C, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 µm (fabricado por Costar) 10 veces y a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,2 µm (fabricado por Whatman) 3 veces y a continuación a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 µm (fabricado por Corning) 10 veces y un
10 filtro de membrana de policarbonato de 0,05 µm (fabricado por Whatman) 20 veces. La partícula principal tenía un diámetro de partículas promedio de 70,71 nm como se ha medido mediante dispersión dinámica de luz (DIS).
Por separado, se mezclaron EPC (NOF Corporation)/PEG-DSPE (NOF Corporation)/etanol (Wako Pure Chemical Industries, ltd.)/agua (15 mg/3,125 mg/0,625 ml/0,375 ml), y se preparó una solución que contenía los componentes
15 constituyentes de la membrana de bicapa lipídica.
La dispersión de partículas principales obtenida (0,225 ml) se mezcló con una solución acuosa (0,075 ml) obtenida mezclando 2'-OMe BCl2ARNip Exp. 2 en agua en una proporción de 24 mg/1 ml, a fin de preparar las partículas de complejo. La dispersión obtenida de partículas de complejo se añadió a continuación a la solución de los 20 componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica (1,2 ml), y se añadieron 0,375 ml de agua destilada. Después, tras añadir 0,12 ml de una solución de EPC/PEG-DSPE (62,5 mg/62,5 mg/ml) en etanol al 40 % en volumen, se añadió gradualmente agua destilada (13,965 ml) para ajustar la concentración de etanol a 5 % o menos en volumen. La suspensión de liposomas obtenida se sometió a ultracentrifugación (80 min, 110.000 x g, 25°C), y se eliminó el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en solución salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Co.,
25 Ltd.).
El liposoma tiene un diámetro de partículas promedio de 88,52 nm medido con DLS. La cuantificación de 2'-OMe BCL2siRNA Exp. 2 en el liposoma encontró que la concentración era 2,307 mg/ml, y que el porcentaje de recuperación con respecto a la cantidad cargada de 2'-OMe BCl2ARNip Exp. 2 era de 87,2 %. Finalmente, se obtuvo
30 una preparación ajustando la concentración ajustando la concentración de 2'-OMe BCl2ARNip Exp. 2 a 1,5 mg/ml con adición de solución salina fisiológica (0,366 ml).
Ejemplo de referencia 3
35 El ARN utilizado en el Ejemplo 3 es un ARN bicatenario que contiene la secuencia X3 y la secuencia X3' complementaria [sentido directo: 5'-GmAA mGUmG AmCA mUCmU UmCA mGCmA AdTdT-3' (los azúcares unidos a las bases precedidos por d son desoxirribosas, y los azúcares unidos a las bases 2ª, 4ª, 6ª, 8ª, 10ª, 12ª, 14ª, 16ª, y 18ª precedidas por m con respecto al extremo 5' son ribosas sustituidas con 2'-O-metilo) (SEC ID Nº: 11); sentido contrario: 5'-UUG CUG AAG AUG UCA CUU CdTdT-3' ' (los azúcares unidos a las bases precedidos por d son
40 desoxirribosas)(SEC ID Nº: 12)] (en lo sucesivo en el presente documento, 2'-OMe BCL2ARNip Exp. 3). El veinticuatro por ciento de todas las ribosas unidas a las bases de la secuencia X3 y la secuencia X3' complementaria son ribosas sustituidas con un grupo 2'-O-metilo. La hebra de sentido directo y la hebra de sentido contrario se obtuvieron de Hokkaido System Science Co., Ltd., que se hibridaron para preparar el ARN bicatenario.
45 Se obtuvo una preparación de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el 2'-OMe BCL2ARNip Exp. 2 se sustituyó con 2'-OMe BCL2ARNip Exp. 3.
El liposoma tiene un diámetro de partículas promedio de 91,42 nm medido con DLS.
50 Ejemplo comparativo 2
El ARN utilizado en el Ejemplo comparativo 2 es un ARN bicatenario que contiene la secuencia X3 y la secuencia X3' complementaria [sentido directo: 5'-GAA GUG ACA UCU UCA GCA AdTdT-3' (los azúcares unidos a las bases precedidas por d son desoxirribosas) (SEC ID Nº: 13); sentido contrario: 5'-UUG CUG AAG AUG UCA CUU CdTdT
55 3' ' (los azúcares unidos a las bases precedidas por d son desoxirribosas) (SEC ID Nº: 14)] (en lo sucesivo en el presente documento, BCL2ARNip Com. 2). La hebra de sentido directo y la hebra de sentido contrario se obtuvieron de Hokkaido System Science Co., Ltd., que se hibridaron para preparar el ARN bicatenario.
Se obtuvo una preparación de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que 2'-OMe BCL2ARNip Exp. 2 se 60 sustituyó con BCL2ARNip Com. 2.
El liposoma tiene un diámetro de partículas promedio de 96,52 nm medido con DLS.
imagen11
Las Figs. 3 y 5 muestran que la transición de la concentración de ARN en sangre es mayor en ratones a los cuales se administraron las preparaciones de los Ejemplos 2 y 3 que en ratones a los cuales se administró la preparación del Ejemplo comparativo 2. Específicamente, se encontró que la composición de la presente invención donde de 1 al 90 % de todos los azúcares unidos a las bases de la secuencia X y la secuencia X' complementaria son ribosas
5 sustituidas por un grupo modificador en la posición 2' tiene una retención mejorada en la sangre, efectos secundarios reducidos, o aumento de la acumulación de fármacos en tejidos u órganos que contienen el sitio de expresión del gen diana.
Ejemplo 4
10 El ARN utilizado en el Ejemplo 4 es un ARN bicatenario que contiene una secuencia que consiste en 23 bases contiguas del ARNm de un gen BCL2 (en lo sucesivo en el presente documento, secuencia X4), y una secuencia de bases (en lo sucesivo en el presente documento, secuencia X4' complementaria), complementaria de la secuencia X4. [sentido directo: 5'-GmAA mGUmG AmCA mUCmU UmCA mGCmA AmAU mAAdA dC-3' (los azúcares unidos a
15 las bases precedidos por d son desoxirribosas, y los azúcares unidos a las bases 2ª, 4ª, 6ª, 8ª, 10ª, 12ª, 14ª, 16ª, 18th, 20th, y 22ª precedidos por m con respecto al extremo 5' son ribosas sustituidas con 2'-O-metilo) (SEC ID Nº: 21); sentido contrario: 5'-GUmU UmAU mUUmG CmUG mAAmG AmUG mUCmA CmUU mCmUmU-3' (los azúcares unidos a las bases 3ª, 5ª, 7ª, 9ª, 11ª, 13ª, 15ª, 17ª, 19th, 21st, 23rd, y 25ª a 27ª bases precedidas por m con respecto al extremo 5' son ribosas sustituidas con 2'-O-metilo) (SEC ID Nº: 22)] (en lo sucesivo en el presente documento, 2'
20 OMe BCL2ARNip Exp. 4). El cincuenta por ciento de todas las ribosas unidas a las bases de la secuencia X4 y la secuencia X4' complementaria son ribosas sustituidas con un grupo 2'-O-metilo. La hebra de sentido directo y la hebra de sentido contrario se obtuvieron de Hokkaido System Science Co., Ltd., que se hibridaron para preparar el ARN bicatenario.
25 DOTAP (fabricado por Avanti Polar Lipids Inc.), PEG-DSPE (fabricado por NOF Corporation) y agua destilada (Otsuka Pharmaceutical Co., ltd.) se mezclaron de tal manera que la relación de DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada era de 40 mg/16 mg/1 ml, y lla mezcla se removió agitando con un mezclador de tipo vórtice. La suspensión obtenida de esta manera se pasó, a 70°C, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 µm (fabricado por Costar) 10 veces y a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,2 µm (fabricado por Whatman) 5
30 veces y a continuación a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 µm (fabricado por Corning) 10 veces y un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 µm (fabricado por Whatman) 20 veces. La partícula principal tenía un diámetro de partículas promedio de 72,93 nm como se ha medido mediante dispersión dinámica de luz (DIS).
35 Por separado, se mezclaron EPC (NOF Corporation)/PEG-DSPE (NOF Corporation)/etanol (Wako Pure Chemical Industries, ltd.)/agua (15 mg/3,125 mg/0,625 ml/0,375 ml), y se preparó una solución que contenía los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica.
La dispersión de partículas principales obtenida (0,0125 ml) como anteriormente se mezcló con una solución acuosa
40 (0,00417 ml) obtenida mezclando 2'-OMe BCl2ARNip Exp. 4 en agua en una proporción de 24 mg/1 ml, a fin de preparar las partículas de complejo. La dispersión de partículas de complejo se añadió a continuación a la solución de los componentes constituyentes de la membrana de bicapa lipídica (0,06667 ml), y se añadieron 0,02083 ml de agua destilada. Tras añadir 0,00667 ml de una solución de EPC/PEG-DSPE (62,5 mg/62,5 mg/ml) en etanol al 40 % en volumen, se añadió gradualmente agua destilada (0,7758 ml) para ajustar la concentración de etanol a 5 % o
45 menos en volumen. La suspensión de liposomas resultante se volvió isotónica con salmuera. Se obtuvo una preparación ajustando 1 ml del volumen final de líquido con solución salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), y ajustando de esta manera la concentración de 2'-OMe BCL2ARNip Exp. 4 a 0,1 mg/ml.
El liposoma tiene un diámetro de partículas promedio de 87,50 nm medido con DLS.
50 Ejemplo comparativo 3
El ARN utilizado en el Ejemplo comparativo 3 es un ARN bicatenario que contiene la secuencia X4 y la secuencia X4' complementaria [sentido directo: 5'-GAA GUG ACA UCU UCA GCA AAU AAdA dC-3' (los azúcares unidos a las
55 bases precedidas por d son desoxirribosas) (SEC ID Nº: 23); sentido contrario: 5'-GUU UAU UUG CUG AAG AUG UCA CUU CUU-3' (SEC ID Nº: 24)] (en lo sucesivo en el presente documento, BCL2ARNip Com. 3). La hebra de sentido directo y la hebra de sentido contrario se obtuvieron de Hokkaido System Science Co., Ltd., que se hibridaron para preparar el ARN bicatenario.
60 Se obtuvo una preparación de la misma manera que en el Ejemplo 4, excepto que 2'-OMe BCL2ARNip Exp. 4 se sustituyó con BCL2ARNip Com. 3.
El liposoma tiene un diámetro de partículas promedio de 94,32 nm medido con DLS.
65
imagen12

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105030809A (zh) * 2008-08-01 2015-11-11 协和发酵麒麟株式会社 抑制靶基因表达的组合物
WO2010110318A1 (ja) * 2009-03-27 2010-09-30 協和発酵キリン株式会社 核酸を含有する動脈硬化性疾患治療剤
WO2010110314A1 (ja) * 2009-03-27 2010-09-30 協和発酵キリン株式会社 核酸を含有する肺高血圧症治療剤
WO2012098692A1 (ja) * 2011-01-19 2012-07-26 協和発酵キリン株式会社 標的遺伝子の発現を抑制する組成物
JP5872898B2 (ja) * 2009-07-14 2016-03-01 協和発酵キリン株式会社 標的遺伝子の発現を抑制する組成物
JP2013095755A (ja) * 2011-11-02 2013-05-20 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd カチオン性脂質
CN102895672B (zh) * 2012-02-24 2013-11-20 中国科学院北京基因组研究所 用于恶性肿瘤治疗的组合物及其应用
PL3019619T3 (pl) 2013-07-11 2022-01-10 Modernatx, Inc. Kompozycje zawierające syntetyczne polinkleotydy kodujące białka powiązane z crispr i syntetyczne sgrna oraz sposoby ich stosowania
US11298326B2 (en) 2015-03-24 2022-04-12 Kyowa Kirin Co., Ltd. Nucleic acid-containing lipid nanoparticles
EP3302435B1 (en) * 2015-05-26 2023-03-08 Plumb Pharmaceuticals, Inc. Liposome loading

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1270198C (en) 1984-08-08 1990-06-12 Marcel B Bally ENCAPSULATION OF ANTINEOPLASTIC AGENTS IN LIPOSONES
IL91664A (en) 1988-09-28 1993-05-13 Yissum Res Dev Co Ammonium transmembrane gradient system for efficient loading of liposomes with amphipathic drugs and their controlled release
JPH0310180A (ja) 1989-06-08 1991-01-17 Mitsubishi Petrochem Co Ltd 集積化ホール素子
JP4656675B2 (ja) 1997-05-14 2011-03-23 ユニバーシティー オブ ブリティッシュ コロンビア 脂質小胞への荷電した治療剤の高率封入
JP2002508765A (ja) 1997-06-23 2002-03-19 アルザ コーポレイション リポソーム被包ポリヌクレオチド組成物および方法
KR20080023768A (ko) 2000-03-30 2008-03-14 화이트헤드 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 Ｒｎａ 간섭의 ｒｎａ 서열 특이적인 매개체
EP2241308A3 (en) 2000-10-04 2010-11-17 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for coating fine particle with lipid membrane
US20020132788A1 (en) 2000-11-06 2002-09-19 David Lewis Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo
US20060211642A1 (en) * 2001-05-18 2006-09-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA inteference mediated inhibition of hepatitis C virus (HVC) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
DK2280070T3 (en) 2001-07-23 2015-08-24 Univ Leland Stanford Junior Methods and compositions for use in RNAi-mediated inhibition of gene expression in mammals
US10590418B2 (en) 2001-07-23 2020-03-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for RNAi mediated inhibition of gene expression in mammals
US20090011003A1 (en) 2005-01-28 2009-01-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Composition for Suppressing Expression of Target Gene
AU2006308765B2 (en) * 2005-11-02 2013-09-05 Arbutus Biopharma Corporation Modified siRNA molecules and uses thereof
CN105030809A (zh) * 2008-08-01 2015-11-11 协和发酵麒麟株式会社 抑制靶基因表达的组合物

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