CN102895672B - 用于恶性肿瘤治疗的组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于恶性肿瘤治疗的组合物及其应用。所述组合物包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.9所示的siRNA。本发明的用于恶性肿瘤治疗的组合物能够大幅降低癌细胞的存活率。
Description
技术领域
本发明涉及用于恶性肿瘤治疗的组合物及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是导致人类死亡的主要疾病类型之一，当前，人类尚未发现有效的治疗方案。比如说，骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤，其恶性程度甚高，常发生于青少年，发展迅速，若不经过有效治疗，数月内即可通过血液循环转移至肺部，从而导致患者死亡。
研究发现，ANAPC5(51433，该数字表示在NCBI中的Gene ID，以下同。)、CCNT2(905)、CDCA5(113130)、CSNK1(1452)、CTNNB1(1499)、FAS(355)、FZD6(8323)、GLI1(2735)、HIP1(3092)、MTOR(2475)、NOTCH1(4851)、RANBP9(10048)、RBPJ(3516)、RRM2(6241)和SMO(6608)基因都是肿瘤相关基因，在细胞癌变后，其表达会出现不同程度的升高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于癌症基因治疗的组合物。
基于上述目的，本发明提供一种用于恶性肿瘤治疗的组合物，所述组合物包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.9所示的siRNA。
所述组合物还包括SEQ ID No.2、SEQ ID No.6、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11和SEQ ID No.13所示的siRNA。
作为优选，所述组合物的有效药效成分由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.13所示的siRNA组成。
进一步优选，所述组合物由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQID No.11和SEQ ID No.13所示的siRNA组成。
作为进一步优选，所述恶性肿瘤是骨肉瘤。
本发明还提供上述组合物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用，尤其是在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。
施加本发明提供的用于恶性肿瘤治疗的组合物后，癌细胞的存活率大幅降低。
具体实施方式
1.合成siRNA
由广州市锐博生物科技有限公司合成以下15条siRNA，其正义链序列如表1所示。
表1
| 序列号 | siRNA正义链序列 |
| SEQ ID No.1 | GAAAGCGGUUGUAUUACAATT |
| SEQ ID No.2 | ACCGUAUGAAGUACUUGGCTT |
| SEQ ID No.3 | AAUGAUGAUCUCAACUCUGTT |
| SEQ ID No.4 | CAGAAUUUGCGAUGUACUUTT |
| SEQ ID No.5 | CUGCUAUUGUACGUACCAUTT |
| SEQ ID No.6 | GAAGCGUAUGACACAUUGATT |
| SEQ ID No.7 | UAGCCAUGAUUACCUAGGATT |
| SEQ ID No.8 | UCAUACUCACGCCUCGAAATT |
| SEQ ID No.9 | ACUUAAUUGAGCGACUAUATT |
| SEQ ID No.10 | GUGUUCCGACGAAUCUCAATT |
| SEQ ID No.11 | CUCACACGCCGACGUCAACTT |
| SEQ ID No.12 | GAUAGAUCGAUUUCCUAUCTT |
| SEQ ID No.13 | CUAAACGACUUACUAGGGATT |
| SEQ ID No.14 | UUGCGUCGAUAUUCUGGCUTT |
| SEQ ID No.15 | CACUUCUACGACUUCUUCATT |
2.不同siRNA序列对基因knockdown效率的检测
(1)转染siRNA：
步骤1：将骨肉瘤细胞系U-2 OS培养于含10％小牛血清的1640培养基中，转染前24小时，以每孔4×104个细胞接种于24孔培养板，每孔体积400μl，使得转染时的细胞密度达到约30％-50％的汇合度。
步骤2：对于每种siRNA，按如下步骤准备siRNA-lipo2000混合液：
a)用50μl不含血清培养基Opti-MEM(Invitrogen)稀释siRNA，轻轻混匀，室温孵育5分钟；
b)用50μl不含血清培养基Opti-MEM稀释1μl lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)，轻轻混匀，室温孵育5分钟；
c)将a)与b)的混合物轻混，室温孵育20分钟，制备得到siRNA-lipo2000混合液。
步骤3：将siRNA-lipo2000混合液加入已接种骨肉瘤细胞系U-2OS的培养板各孔中，使siRNA终浓度为5nM，轻轻混匀。
每种siRNA设3个平行孔，同时，每块24孔板上设置3个对照孔。对照孔中除不加siRNA外，其余成分与实验孔相同。
步骤4：将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养6小时后，弃去孔中培养基，更换不含抗生素的新鲜培养基，继续培养3天。
(2)利用实时定量PCR检测基因knockdown效率
a.细胞总RNA的提取
向上述24孔培养板的每一孔加入1ml TRIzol(Invitrogen)试剂，用移液器吹打，直至细胞充分溶解，室温静置3分钟，转移至1.5ml没有核酸酶的干净离心管中；
每管加入300μl氯仿(北京化工厂)，震荡15秒；
于4℃下以13000rpm离心15分钟；
将上清转移至1.5ml没有核酸酶的干净离心管；
每管加入等体积的异丙醇(北京化工厂)，-20℃沉淀1小时以上；
于4℃下以13000rpm离心15分钟；
去除上清，然后用70％乙醇充分洗涤沉淀；
于4℃下以13000rpm离心10分钟；
去除上清，室温下晾干至沉淀刚好变成透明；
每管加入10μl Nuclease-free的双蒸水，混匀，于室温下溶解15分钟，得总RNA溶液；
取1μl上述总RNA溶液，用Nano-drop 1000(Thermo Scientific)确定总RNA的浓度和总量。
b.通过反转录获得cDNA
针对每种siRNA转染所得的总RNA样品，各取1μg用于反转录，并用DNase I(Fermentas)消化，以去除基因组DNA的污染；
用反转录试剂盒(Reverse Transcription System，Promega)进行反转录，上述每种总RNA样品分别获得20μl cDNA；
将上述所得到的cDNA分别稀释至100μl。
c.实时定量PCR
每个qRT-PCR反应取2μl cDNA作为模板，使用Maxima SYBR Green/ROXqPCR Master Mix(Fermentas)，根据产品说明在BioRad CFX96上进行实时定量PCR。以看家基因GAPDH的表达量作为内参，使用ΔΔCt的方法计算siRNA降低基因表达的效率，结果见表2。
knockdown效率＝1-转染siRNA的细胞中基因的表达量/未转染siRNA的细胞中基因的表达量。
表2
| siRNA | 目的基因 | knockdown效率 |
| SEQ ID No.1 | ANAPC5 | 71％ |
| SEQ ID No.2 | CCNT2 | 72％ |
| SEQ ID No.3 | CDCA5 | 69％ |
| SEQ ID No.4 | CSNK1A1 | 65％ |
| SEQ ID No.5 | CTNNB1 | 45％ |
| SEQ ID No.6 | FAS | 53％ |
| SEQ ID No.7 | FZD6 | 57％ |
| SEQ ID No.8 | GLI1 | 62％ |
| SEQ ID No.9 | HIP1 | 66％ |
| SEQ ID No.10 | MTOR | 51％ |
| SEQ ID No.11 | NOTCH1 | 39％ |
| SEQ ID No.12 | RANBP9 | 34％ |
| SEQ ID No.13 | RBPJ | 70％ |
| SEQ ID No.14 | RRM2 | 52％ |
| SEQ ID No.15 | SMO | 58％ |
3.不同siRNA组合对肿瘤细胞存活率的影响
(1)以人骨肉瘤细胞系U-2OS(ATCC Number：HTB-96)为例。
(2)利用上述15种siRNA设计8类含不同数目siRNA的组合类型，每类组合类型所含siRNA的数目分别为1个、3个、5个、8个、10个、11个、13个、15个，从中随机挑选79种组合方案，检测其对肿瘤细胞存活率的影响。
(3)挑选的79种组合方案如表3所示。
表3
(4)转染siRNA：转染步骤基本同前，不同之处在于，转染前24小时，以每孔2×103个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积50μl。以25μl Opti-MEM分别稀释各siRNA组合物和lipo2000(0.25μl/孔)，每孔中最终siRNA的总浓度保持一致，均为75nM。每种siRNA组合设3个平行孔，同时，每块96孔板上设置3个对照孔，对照孔中除不加siRNA外，其余成分与实验孔相同。转染6小时后换不含抗生素的新鲜培养基，5天后利用MTT比色法检测细胞存活率。
(5)MTT比色法：每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μl，继续培养4-6小时，终止培养，弃去孔内培养基，每孔加入100μl DMSO，使蓝紫色结晶物充分溶解并混匀。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值。以未转染siRNA的细胞为对照，求出细胞存活率。结果见表4。
细胞存活率＝实验孔吸光度值/对照孔吸光度值
表4
| 组合序号 | 细胞存活率 | 组合序号 | 细胞存活率 |
| 1 | 0.934 | 8M1 | 0.851 |
| 2 | 0.981 | 8M2 | 0.872 |
| 3 | 0.715 | 8M3 | 1.056 |
| 4 | 0.702 | 8M4 | 0.620 |
| 5 | 0.635 | 8M5 | 0.954 |
| 6 | 0.670 | 8M6 | 0.714 |
| 7 | 0.524 | 8M7 | 0.581 |
| 8 | 1.289 | 8M8 | 0.830 |
| 9 | 0.885 | 10M1 | 0.806 |
| 10 | 0.898 | 10M2 | 0.956 |
| 11 | 1.030 | 10M3 | 0.600 |
| 12 | 1.068 | 10M4 | 0.968 |
| 13 | 0.644 | 10M5 | 0.988 |
| 14 | 0.855 | 10M6 | 0.512 |
| 15 | 0.520 | 10M7 | 0.640 |
| 3M1 | 0.480 | 10M8 | 0.859 |
| 3M2 | 0.741 | 10M9 | 0.766 |
| 3M3 | 0.911 | 10M10 | 1.052 |
| 3M4 | 1.007 | 10M11 | 0.906 |
| 3M5 | 0.475 | 10M12 | 0.788 |
| 3M6 | 0.500 | 10M13 | 1.326 |
| 3M7 | 0.726 | 10M14 | 0.472 |
| 5M1 | 0.556 | 10M15＊ | 0.306 |
| 5M2 | 0.857 | 10M16 | 0.553 |
| 5M3 | 0.926 | 10M17 | 0.418 |
| 5M4 | 0.613 | 11M1 | 0.709 |
| 5M5 | 0.842 | 11M2 | 0.866 |
| 5M6 | 0.790 | 11M3 | 0.622 |
| 5M7 | 0.451 | 11M4 | 0.889 |
| 5M8 | 0.888 | 11M5 | 0.874 |
| 5M9 | 0.699 | 11M6 | 0.720 |
| 5M10 | 0.768 | 11M7 | 0.797 |
| 5M11 | 1.126 | 13M1 | 0.861 |
| 5M12 | 0.521 | 13M2 | 0.885 |
| 5M13 | 1.080 | 13M3 | 1.071 |
| 5M14 | 0.523 | 13M4 | 0.854 |
| 5M15 | 0.468 | 13M5 | 0.572 |
| 5M16 | 0.845 | 13M6 | 0.451 |
| 5M17 | 0.571 | 13M7 | 0.476 |
| 15M | 0.877 |
由表4可以看出，在所筛选的79种siRNA组合方案中，能最有效抑制细胞存活的是编号为10M15的组合方案，即由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.13所示的siRNA组成的组合物。
显然，本领域的技术人员可以在不脱离本发明的构思的范围内对本发明进行各种修改和变型。这些修改和变型也属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内。
Claims (6)
1.用于恶性肿瘤治疗的组合物，其特征在于，所述组合物包含SEQ IDNo.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.9所示的siRNA。
2.根据权利要求1所述的用于恶性肿瘤治疗的组合物，其特征在于，所述组合物还包括SEQ ID No.2、SEQ ID No.6、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.13所示的siRNA。
3.根据权利要求2所述的用于恶性肿瘤治疗的组合物，其特征在于，所述组合物的有效药效成分由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.13所示的siRNA组成。
4.根据权利要求2所述的用于恶性肿瘤治疗的组合物，其特征在于，所述组合物由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.13所示的siRNA组成。
5.权利要求1-4中任一项所述的组合物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤是骨肉瘤。
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