EA028228B1

EA028228B1 - Гидролизующая глютеновые олигопептиды эндопептидазная композиция, способ ее получения и применение

Info

Publication number: EA028228B1
Application number: EA201491117A
Authority: EA
Inventors: Линда Кавалетти; Лючия Каррано; Моника Аббонди; Мара Брунати; Анна Таравелла
Original assignee: Фондацьоне Иституто Инсубрико Ди Ричерка Пер Ла Вита
Priority date: 2011-12-06
Filing date: 2012-11-05
Publication date: 2017-10-31
Also published as: US20160114009A1; JP6203743B2; EP2788018B1; US10201593B2; AU2012348782B2; JP2015500641A; BR112014012100A2; HK1198244A1; BR112014012100B1; US20140356345A1; WO2013083338A1; CA2852365C; ES2595500T3; CN104039345B; EP2788018A1; CN104039345A; AU2012348782A1; EA201491117A1; CA2852365A1; IN2014CN04131A

Abstract

Изобретение относится к эндопептидазной композиции, которая способна гидролизовать глютеновые олигопептиды, выделенной эндопептидазе из семейства S8/S53, их применению для лечения или предотвращения глютенчувствительной целиакии, герпетиформного дерматита и любого другого расстройства, ассоциированного с непереносимостью клейковины, их применению для получения пищевых белковых гидролизатов при производстве пищевых добавок и для обработки жидких пищевых добавок; также изобретение относится к пищевой добавке, содержащей заявленную эндопептидазную композицию или эндопептидазу; выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей заявленную эндопептидазу; способам получения заявленной эндопептидазной композиции; способу разрушения глютеновых олигопептидов.

Description

Настоящее изобретение относится к новому семейству эндопептидаз, имеющих уникальные каталитические свойства, которые придают им способность разрушать крупные полипептиды, включая полипептиды, обогащенные пролином. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения ферментной композиции, а также фармацевтической композиции и пищевой добавки, содержащей ферментную композицию, и ее применению при разрушении полипептидов.

Предшествующий уровень техники

Целиакия (СГО) представляет собой хроническое расстройство желудочно-кишечного тракта, при котором прием глютена, присутствующего в пищевых продуктах, изготовленных из пшеницы, ржи, ячменя и их разновидностей, полученных скрещиванием, приводит к повреждению слизистой оболочки тонкого кишечника посредством аутоиммунного механизма у генетически восприимчивых индивидуумов (Сгееи Р.Н.К., СеШег С. Секас Ойзеазе, N. Еид1. 1. Мей., 2007, 357, 1731-1743; Кадиойй М.Р. Секас ййзеазе: райкодеиезйз ой а тойе1 йттииодеиекс ййзеазе, й. Ски. 1иуез1.. 2007, 117, 41-9). Механизмы, посредством которых глютен индуцирует свои патогенные эффекты, были объяснены за последние годы. Вовлеченными являются как врожденные, так и адаптивные механизмы иммунности, и они отвечают за критическое повреждение слизистых.

Глютен состоит из глиадинов и глютенинов, нерастворимых в воде/солях фракций запасных белков, присутствующих в зерновых культурах. Глютеновый каркас создается при взаимодействии между двумя белками, когда муку и воду смешивают при получении теста.

При приеме внутрь глютен направляется на частичное расщепление посредством желудочнопанкреатических протеолитических ферментов и ферментов щеточной каймы, что приводит в результате к множеству пептидов различной длины (от нескольких до более чем 30 аминокислот), которые являются устойчивыми к дальнейшему расщеплению вследствие высокого содержания остатков пролина, поскольку многие протеазы неспособны расщеплять пептидные связи, расположенные по Ν- или С-концам пролина (Наизск Р., 8каи Ь., 8аикадо Ν.Α., Сгау С.М., Ккоз1а С. 1п1езкпа1 ййдезкуе гезйзйаисе ой йттииойотйиаий дкайш реркйез. Ат. 1. Ркузю1. СазкоиНезЕ Ьйуег Ркузю1., 2002, 283, 996-1003; 8каи Ь., Мо1Ьегд О., Раггой I., Наизск Р., Εί1ίζ Р., Сгау С.М., 8о11тй Ь.М., Ккоз1а С. 8йгисйига1 Ьазйз йог д1ийеи шйо1егаисе ш секас зргие, 8сйеисе, 2002, 297, 2275-2279). Недостаток пролин-специфических расщепляющих ферментов не представляет собой особенную ферментную недостаточность у субъектов с целиакией, как предполагали в прошлом, но является характерным свойством пищеварительного аппарата млекопитающих, который неразвит настолько, чтобы потреблять белки с таким высоким содержанием пролина в диете.

Непереваренные глютеновые пептиды могут проходить через эпителиальный барьер посредством механизмов, еще ясно не объясненных, хотя недавно предположили зонулин-опосредованное параклеточное прохождение и трансклеточный путь, через трансцитоз и ретротрансцитоз (Эгадо 8., Е1 Азтаг К., Όί Рйегго М., Сита С1етеШе М., Тпрайи А., 8ароие А., Ткакаг М., 1асоио С., Саггоссю А., Э'АдаЮ С, Νθ1 Т., 2атрйий Ь., Са1азз1 С, Разаио А. Скайш, ζоии1^и аий дий регтеаЬйку: ЕГГес1з ои секас аий иои-секас шйезкиа1 тисоза аий ш!езкиа1 се11 киез, 8саий. й. Сазйгоеийего1., 2006, 41, 408-19; 8скитаии М., Кйскйег Й.Р., Аейе11 I., Мооз V., 2йттегтаии-Когйтаии М., 8скиеййег Т., Оаит 8., 2е1к М., Рготт М., §скикке Й.Э. Мескашзтз ой ерккекай йгаиз1осакои ой 1ке а1рка(2)-дкайш-33тег ш соекас зргие Сий, 2008, 57, 747754; Майузйак-Вийийк Т., Моига 1.С., Агсоз-Ра.)агйо М., ЬеЬгейои С, Меиагй 8., Саийа1к С., Веи-Ккакйа К., Эндауе С., Тато^а Н., уаи №е1 С., Воикийк Υ., Ьатащие Ό., Скаиззайе 8., Майатий С., СеШег С., СейВеизиззаи Ν., Моийейго К.С., Неутаи М. 8есгейогу 1дА теййайез гейгокаизсуйозйз ой иНас! дкайш реркйез уйа йке йгаизйети гесерйог ш секас ййзеазе й. Ехр. Мей., 2008, 205, 143-154).

При поступлении в 1атйиа ргоргйа (ЬМ), деамидирование глутамина до остатков глутамата посредством тканевой трансглутаминазы (ЙТС, аутоантиген при СО) усиливает их предоставление в ΌΟ2 или ΌΟ8 СГО4+ Т-клетки (Мо1Ьегд О., МсАйат 8., Ьиийш К.Е., Кгйзкаизеи С., Агепк-Напзеп РЬ, Кек К., 8о1кй Ь.М. Т се11з йгот секас ййзеазе 1езйоиз гесодгШе дкайш еркорез йеатййайей ш зки Ьу еийодеиоиз кззие каиздШйатйиазе, Еиг. й. 1ттиио1., 2001, 31, 1317-23), продуцируя провоспалительный ответ с интерфероном-гамма (ΙΡΝ-γ) в качестве основного цитокинового рецептора. Было также показано, что некоторые глютеновые пептиды вызывают повреждение слизистой независимо от специфического распознавания С.ГО4+ Т-лимфоцитами, но индуцируя врожденный иммунный ответ посредством восходящей регуляции экспрессии 1Ь-15, цикло-оксигеназы-2 и активационных маркеров С.ГО25 и С.ГО83 в ЬМ моноядерных клетках: среди них, наилучшим образом охарактеризованы пептиды р31-43/49 а1-глиадинов (РС^^^РРРР^^РΥ/Р^Р^РР) (Сйссосюрро К., Όί 8аЬайшо А., Сон^а С.К. Тке йттиие гесодшкои ой д1ийеи ш соекас ййзеазе, Ски. Ехр. 1ттиио1., 2005, 140, 408-16).

СО оценивают как поражающую приблизительно 1% населения как Европы, так и Северной Америки, причем исследования в Финляндии показывает возрастающую заболеваюмость (1:47) у пожилых людей (УПрри1а А., Каикшеи К., Ьиозйагйиеи Ь., Кгеке1а I., Райпкашеи РЬ, Vа1νе К., Макй М., Со11ш Р. 1исгеазшд ргеуа1еисе аий кйдк шсййеисе ой секас ййзеазе ш е1йег1у реор1е: а рори1акои-Ьазей зйийу ВМС Сазкоеийегок, 2009, 29, 9-49). Однако многие исследования указывают на то, что СО распространена по все- 1 028228 му миру с подобными значениями преобладания (Вагаба К., ВИаг А., Мокабет М.А., На8На8Н !С.. Огееп Р. СеНас б18еа8е ίη М1бб1е Еа81егп апб ΝοΠίι АГпсап еоиШпез: а пей Ъигбеп? \Уог1б ί. Оа81гоеп1его1., 2010, 16. 1449-57; ЭаЩс В., §ап δ., Ва81игк В., Еп8ап А., Едтйа8 О., Вики1те/ А., Вап8 Ζ., Тигк18Й СеНас 81ибу Огоир Ргеуа1епее оГ сеНас б18еа8е ш НеаННу Тигк18Й 8сНоо1 сНббгеп, Ат. 1. Оа8йоеп1ето1., 2011,106, 15127; МакНапа О.К., Уегта А.К., АтагсНапб К., ВНаШадаг δ., Эа8 Р., Оо8\уапи А., ВНайа V., А1ш)а V., ЭаНа Оир1а δ., Апапб К. Ргеуа1епсе оГ сеНас б18еа8е ш Не пойНегп рай оГ 1пб1а: а соттипйу Ъа8еб 81ибу, 1. Оа81гоеп1его1. Нерайок, 2011, 26, 894-900; Уапу ХЦ., Ьщ №., Хи СГО., Ме1 Н., Оао Υ., Репд Н.М., Уиап Ь., Хи 1.1. СеНас б18еа8е ш сйббгеп \\ЙН б1аггНеа ш 4 с111е8 ш СЫпа, 1. Реб1а1г. Оа8йоеЫего1. ΝυΐΓ., 2011, 53, 368-70).

В настоящее время недоступны никакие терапии, и только определено восстановление после заболевания, длительная безглютеновая диета является необходимой для предотвращения не только специфичного для СО повреждения слизистой и последующих ассоциированных с мальабсорбцией растройств (таких как железо-дефицитная анемия или остеопороз), но также других аутоиммунных заболеваний, которые были ассоциированы с СО, таких как диабет типа I и аутоиммунный тиреоидит, или более тяжелых осложнений, таких как ассоциированные с энтеропатией Т-клеточные лимфомы.

Полное исключение глютена (обычно указывают пороговое значение безопасного приема глютена, равное 50 мг/день, хотя 10 мг/день считается более безопасным) поддерживает СО в состоянии ремиссии у всех, кроме небольшого процента пациентов (2-5%), которые страдают от ареактивной формы. Такая диета является, однако, значительно ограничивающей для пациентов, которые являются ограниченными в их общей деятельности и страдают от социальной изоляции. Применение глютена в качестве добавки в производстве пищи является широко распространенным и является основной причиной неумышленного приема глютена, что делает эту диету в действительности трудной для поддержания.

По этим причинам пациенты с СО активно поддержали бы любую альтернативу, позволяющую им принимать в составе их ежедневной диеты, по меньшей мере, минимальные количества глютена.

Применение экзогенных протеолитических ферментов для глютеновой детоксификации является одной из наиболее перспективных стратегий лечения СО. При различных путях применения может использоваться потенциал этих ферментов: обработка глютенсодержащей муки, перед или во время ферментации теста, таким образом, двигаясь по направлению получения новой пищи, а также сопутствующее потребление глютена и подходящих протеолитических ферментов, таким образом, используемых как пищевая добавка, аналогично применению лактазы при непереносимости лактозы. Обязательно, чтобы различные свойства ферментов отвечали различным требованиям.

Ферментативный подход для лечения СО основан на демонстрации §Нап е1 а1. (8с1епсе, 2002) способности микробиальных ферментов расщеплять глютеновые пептиды по специфичным остаткам и удалять токсичные/иммунотоксичные конкретные пептидные последовательности. В частности, они показали, что экзогенная пролил-специфичная эндопротеаза, полученная из НауоЪасЮпит тептдо8ерйсит (РМ-РЕР), оказалась в результате способствующей расщеплению глиадиновых пептидов. Добавление РЕР либо ш уйго в присутствии экстрактов мембраны щеточной каймы (ВВМ) или во время перфузии ш νί\Ό тонкого кишечника крысы вызывало быстрое разрушение иммунодоминантного 33-мерного пептида (33-мера) и потерю его способности стимулировать глиадин-специфичные Т-клетки (Наи8сН е1 а1, 2002).

Другие ферменты того же самого семейства (ЕС. 3.4.21.26) из других бактериальных штаммов (т.е. 8рйшдотопа8 сар8и1а1а и Мухососси8 хап1Ни8) были подвергнуты оценке с этой целью теми же авторами (8Нап Ь., Матй Т., 8оШб Ь.М., Огау О.М., КНо81а С. Сотрагайуе ЫосНетюа1 апа1у818 оГ 1Нгее Ьас1епа1 рго1у1 епборерйба8е8: НпрПсайогь Гог соеНас 8ргие ВюсНет. 1., 2004, 383, 311-318). В целом, эти исследования показали существенные различия между тремя ферментами по отношению к длине цепи и субстратной специфичности и подтвердили потенциал пероральной ферментной терапии, несмотря на возникшие соображения, касающиеся их возможной эффективности действия ш-уКо, вследствие ограничений по специфичности к субстратам, рН активности (оптимальная активность при почти нейтральном рН вместо кислотного рН, что необходимо для действия в желудке), длительного времени, необходимого для полного расщепления токсических пептидов и устойчивости к разрушению под действием пепсина. Затем была предложена комбинация из двух ферментов с желудочной активностью и комплементарной субстратной специфичностью (Оа88 1., Вебшпе М.Т., §1еде1 М., δ репсе г А., КНо81а С. СотЪшайоп еп/уте Легару Гог да81пс б1де811оп оГ б1е1ату дНПеп ш раПеп18 \\ЙН сеНас 8ргие Оа8йоеЫето1оду, 2007, 133, 472480): РЕР из δ. сар8и1а1а, ассоциированной с ЕР-В2, изоформы 2 глутамин-специфичной эндопротеазы В из Ногбеит уи1дате, цистеин-протеазы, полученной из пророщенных семян ячменя, которая активируется при кислотном рН и посредством пепсина (Вебшпе М.Т., δΐ^οр Р., Тапд Υ., δο11^б Ь.М., КНо81а С. Не1его1одои8 ехрте88юп, рипйсайоп, геГо1бшд, апб 8йисЫга1-Гипсйопа1 сНагасЮп/айоп оГ ЕР-В2, 8е1Г-асНуайпд Ъаг1еу су81еше епборго1еа8е СНеш. Вю1., 2006, 13, 637-47), было показано, что она являются потенциально более активным терапевтическим инструментом. В еще одном исследовании сообщается, что РЕР, полученная из А8ретдй1и8 шдет, проявляющая свою основную активность при кислотных условиях в желудке, может начинать разрушать глиадин перед достижением кишечного просвета (ЛерЫак Ό., δраеη^^Эеккшд Ь., Мйеа С., Мое81ег М., бе Ки А., Ваак-РаЪ1о К. уап Vее1еη Р., Ебеп8 Ь., Кошпд Р. ШдН1у еГй- 2 028228

С1сп1 д1и!еп бедтабайоп \νί11ι пс\у1у ШепШтеб рго1у1 еп4орто1еаве: ипрПсаОопв Гог сеПас Швеаве Ат. I. РЬувю1. Оав1гош1ев1. Ыуег РЬувю1., 2006, 291, 0621-9).

Эти открытия были представлены в нескольких патентных документах. В XVО 2003/068170 (ЕР 572127) авторы изобретения заявляют, что введение эффективной дозы глютеназы пациенту с целиакией или герпетиформным дерматитом снижает уровни токсичных глютеновых олигопептидов, посредством чего уменьшаются или снижаются повреждающие эффекты глютена. Дополнительное подтверждение этого подхода дается в νθ 2005/107786 (ЕР 1740197), где раскрыты фармацевтические готовые формы глютеназных ферментов для применения при лечении пациентов с целиакией или герпетиформным дерматитом.

νθ 2005/027953 (ЕР 16663298) описывает лечение новой пролил-специфичной эндопротеазы из АврегдШив шдет (ΑΝ-ΡΕΡ), которая в результате способствовала расщеплению токсичных глютеновых пептидов. νθ 2005/019251 предоставляет лейцинаминопептидазу (БАР) из двух различных видов грибков, ТпсНорНуЮп гиЬгит и АврегдШив Гит1да1ив в комбинации с дипептидилпептидазой IV (Брр1У). Эти ферменты оценивали на предмет расщепления 33-мера при нейтральных условиях рН, поскольку оптимальная активность ЬАР была оценена около 7,0 с интервалом активности между рН 6 и 8, таким образом предотвращая или ограничивая возможное разрушение глиадина в желудочном соке.

Также было показано, что трипептидилпептидазы из А. ГипидаШв могут разрушать белки при кислотном рН (КеюНатб и., Ьесйеппе В., АвГ А.К., 8(тей Р., Огои/тапп Е., 1оиввоп О., Мопоб М. 8е4о1|в1пв. пеи с1авв оГ весге1е4 ргоЮавев Ггот АврегдШив ГипидаШв νίΐΗ епборгоЮаве ог 1прерО4у1-рер1Шаве асйуйу а! атШс рНв Арр1. Епуиоп. М1сгоЬ., 2006, 72, 1739-48). В νθ 2011/077359 предоставлен набор, составленный из пролил-протеазы (АГи828) и по меньшей мере одной трипептидилпротеазы, принадлежащей к семейству седолизина для применения в качестве пищевой добавки, применимой также для лечения СБ.

Понятно, что терапевтическое значение фермента или ферментной композиции для лечения СБ имеет отношение к ферментам а) являющимся устойчивыми к разрушению под действием других желудочно-кишечных ферментов, Ь) являющимся эффективными в окружении, где продуцируются 33-мер и другие токсичные пептиды и с) проявляющим быструю и высокую протеолитическую активность по отношению к глютеновым пептидам. Эти ферменты должны быть активными при кислотном рН и должны обладать способностью принимать сложный состав глютена, затрудненный другими компонентами обычных пищевых продуктов в виде выпечки или обжаренных изделий.

Краткое содержание сущности изобретения

Заявители в настоящем изобретении идентифицировали новое семейство ферментов и предоставили фермент или композицию этого семейства ферментов, имеющие уникальные каталитические свойства.

Заявители идентифицировали АсйпоаНотитив вр. в качестве продуцента данного семейства ферментов. Эндопептидазы изобретения продуцируют посредством культивирования АсйпоаНотитив в соответствующей культуральной среде, например, содержащей сою. Штамм, исходно идентифицированный под кодом А8 заявителя, был выделен из почвы Италии и депонирован 24 июня 2011 г., в коллекции Б8М2,-Беи1всЬе 8атт1цпд уоп МШгоогдатвтеп ипб 2е11ки1(игеп ОтЬН, (пои Бе|Ьп1/-1пв111и1 βδΜΖБеШвсНе 8атт1ипд уоп МШгоогдатвтеп ипб Ζе11ки1ΐи^еη ОтЬН), 1пНоГГепв1агвве 7Ь, Б-38124 Вгаипвсйие1д, Оегтапу, по условиям Будапештского Договора. Штамму был присвоен учетный номер Б8М 24988.

Эндопептидазы настоящего изобретения обладают способностью гидролизовать некоторые глютеновые олигопептиды, которые являются устойчивыми к расщеплению посредством желудочных и панкреатических ферментов, и чье присутствие в просвете кишечника приводит в результате к токсическим эффектам. Ферментативная обработка может удалять такие пептиды и их токсические эффекты; она может разрушать глиадин и, таким образом, детоксифицировать глютен без какого-либо добавления РЕР. Пептидазы изобретения имеют активности в широком диапазоне рН и способны проявлять протеолитическую активность от рН 3 до 8. Такая активность будет определяться как глютеназная активность.

Эти глютеназные ферменты предоставляют способы для предотвращения симптомов глютенчувствительной целиакии и/или герпетиформного дерматита посредством снижения уровней токсичных глютеновых олигопептидов в пищевых продуктах, либо перед приемом или после приема пищи пациентом. Эти ферменты могут применяться вместе с другими протеолитическими ферментами, такими как протеазы и амнопротеазы, чтобы эффективно продуцировать белковые гидролизаты, применяемые для пищи, питья и медицинских препаратов.

Эти ферменты секретируются различными штаммами АсйпоПотитив посредством их культивирования в подходящих средах, и их активность может быть оценена с использованием как хромогенных субстратов, так и зимографического анализа.

Кроме того, ферменты изобретения могут продуцироваться в клетках-хозяевах посредством введения нуклеиновой кислоты, кодирующей эти ферменты, культивирования клеток в культуральной среде при условиях, подходящих для продуцирования и извлечения ферментов.

Настоящее изобретение касается ферментной композиции, которая способна гидролизовать глютеновые олигопептиды, которые являются устойчивыми к расщеплению посредством желудочных и пан- 3 028228 креатических ферментов, и присутствие которых в просвете кишечника приводит к токсическим эффектам, где ферментная композиция содержит по меньшей мере одну эндопептидазу из семейства 88/853, активную при рН 3-8, выбранную из:

a) эндопептидазы эндопеп-140, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 1, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8Еф ГО N0: 1;

b) эндопептидазы эндопеп-40, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 2, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8Еф ГО N0: 2;

c) эндопептидазы эндопеп-120, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 3, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8Еф ГО N0: 3;

ά) эндопептидазы эндопеп-60, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 4, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8Еф ГО N0: 4;

е) эндопептидазы эндопеп-41, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 5, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8Еф ГО N0: 5.

Вариантом настоящего изобретения является ферментная композиция, содержащая по меньшей мере одну эндопептидазу, выбранную из:

a) эндопептидазы эндопеп-140, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 1 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

b) эндопептидазы эндопеп-40, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 2 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

c) эндопептидазы эндопеп-120, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 3 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

ά) эндопептидазы эндопеп-60, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 4 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

е) эндопептидазы эндопеп-41, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 5 или идентичную ей по меньшей мере на 95%.

Вариантом настоящего изобретения является ферментная композиция, содержащая эндопептидазу, выбранную из:

b) эндопептидазы эндопеп-40, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 2 или идентичной ей по меньшей мере на 95%.

Вариантом настоящего изобретения является ферментная композиция, содержащая по меньшей мере одну эндопептидазу, полученную из штамма Лсйпоа11отиги8.

Вариантом настоящего изобретения является ферментная композиция, содержащая по меньшей мере одну эндопептидазу, полученную из Лсйпоа11отиги8 8р. Ό8Μ24988.

Вариантом настоящего изобретения является ферментная композиция, содержащая один или несколько других протеолитических ферментов, выбранных из пролил-эндопротеаз, х-пролилдипептидиламинопептидаз и пролил-аминопептидаз.

Вариантом настоящего изобретения является ферментная композиция, содержащая по меньшей мере одну эндопептидазу, функционально слитую с полипептидом с образованием химерного меченого белка.

Настоящее изобретение касается выделенной эндопептидазы из семейства 88/853, активной при рН 3-8, которая применяема ввышеуказанной композиции и выбранна из:

Вариантом настоящего изобретения является выделенная эндопептидаза из семейства 88/853, выбранная из:

а) эндопептидазы эндопеп-140, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 1 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

- 4 028228

Ь) эндопептидазы эндопеп-40, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 2 или идентичную ей по меньшей мере на 95%.

Настоящее изобретение касается применения вышеуказанной ферментной композиции в качестве лекарственного средства для лечения или предотвращения глютенчувствительной целиакии, герпетиформного дерматита и/или любого другого расстройства, ассоциированного с непереносимостью клейковины.

Настоящее изобретение касается применения вышеуказанной выделенной эндопептидазы из семейства 88/853 в качестве лекарственного средства для лечения или предотвращения глютенчувствительной целиакии, герпетиформного дерматита и/или любого другого расстройства, ассоциированного с непереносимостью клейковины.

Настоящее изобретение касается применения вышеуказанной ферментной композиции для получения пищевых белковых гидролизатов.

Настоящее изобретение касается применения вышеуказанной выделенной эндопептидазы из семейства 88/853 для получения пищевых белковых гидролизатов.

Настоящее изобретение касается фармацевтической композиции для лечения или предотвращения глютенчувствительной целиакии, герпетиформного дерматита и/или любого другого расстройства, ассоциированного с непереносимостью клейковины, которая содержит в качестве активного протеолитического ингредиента вышеуказанной ферментную композицию или по меньшей мере одну вышеуказанной выделенную эндопептидазу из семейства 88/853.

Вариантом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, выполненная в форме, подходящей для перорального введения.

Настоящее изобретение касается пищевой добавки, которая содержит в качестве активного протеолитического ингредиента вышеуказанную ферментную композицию или по меньшей мере одну вышеуказанную выделенную эндопептидазу из семейства 88/853.

Настоящее изобретение касается выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере одну вышеуказанную эндопептидазу, которая содержит по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, выбранную из 8Еф ГО N0: 7, 8, 9, 10 и 11 или по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% любой из последовательностей 8Еф ГО N0: 7, 8, 9, 10 и 11.

Вариантом настоящего изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, которая содержит по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% любой из последовательностей 8Еф ГО N0: 7, 8, 9, 10 и 11.

Вариантом настоящего изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, которая содержит по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, выбранную из 8Еф ГО N0: 7 и 8.

Настоящее изобретение касается способа получения вышеуказанной ферментной композиции, который включает культивирование природного штамма Лс1тоа11отиги8, способного продуцировать по меньшей мере одну вышеуказанную эндопептидазу из семейства 88/853, в культуральной среде при условиях, подходящих для продуцирования ферментной композиции, и извлечение ферментной композиции из конечной среды культивирования.

Настоящее изобретение касается способа получения вышеуказанной ферментной композиции, который включает: культивирование штамма ЛсйпоаНотигик, полученного с помощью стандартных способов введения мутаций и/или селекции из природного штамма ЛсйпоаПотигик, где культивируемый штамм ЛсйпоаПотишк сохраняет способность к продуцированию по меньшей мере одной вышеуказанной эндопептидазы из семейства 88/853, в культуральной среде при условиях, подходящих для продуцирования ферментной композиции, и извлечение ферментной композиции из конечной среды культивирования.

Настоящее изобретение касается способа получения вышеуказанной ферментной композиции, который включает: введение в клетку-хозяина нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере одну эндопептидазу из семейства 88/853, активную при рН 3-8, выбранную из группы:

е) эндопептидазы эндопеп-41, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 5, ее биологически ак- 5 028228 тивный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8ЕО ГО N0: 5, культивирование клеток в культуральной среде при условиях, подходящих для продуцирования по меньшей мере одной эндопептидазы, и извлечение ферментной композиции из конечной среды культивирования.

Вариантом настоящего изобретения является способ, где вместо штамма Асйпоа11отиги8 используют штамм, принадлежащий к роду Са1епиЙ8рога, 1<1сбопоЬас1сг или §1гер1отусе8, способный продуцировать по меньшей мере одну вышеуказанную эндопептидазу из семейства 88/853.

Вариантом настоящего изобретения является способ, где штамм ЛсйпоаПотигик представляет собой Лс1шоа11отиги8 8р. Ό8Μ 24988.

Вариантом настоящего изобретения является способ, где нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере одну из вышеуказанных полинуклеотидных последовательностей.

Вариантом настоящего изобретения является способ, где нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере одну из полинуклеотидных последовательностей 8Еф ГО N0: 7 и 8 или по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% любой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 7 и 8.

Вариантом настоящего изобретения является способ, где клетка-хозяин представляет собой микроорганизм, выбранный из родов ВасШи8, 81гер1отусе8, Ьас1оЪасй1и8, Ругососси8, Р8еиботопа8, Л8регдШи8 и вида Е8сйепсЫа сой.

Вариантом настоящего изобретения является способ, где клетка-хозяин представляет собой Е8сйепсЫа сой ВЬ21(ОЕ3) 81аг.

Настоящее изобретение касается способа разрушения глютеновых олигопептидов, которые являются устойчивыми к расщеплению посредством желудочных и панкреатических ферментов, и присутствие которых во внутреннем просвете приводит к токсическим эффектам, где способ включает контактирование указанных глютеновых олигопептидов с вышеуказанной ферментной композицией или по меньшей мере одной вышеуказанной выделенной эндопептидазой из семейства 88/853.

Настоящее изобретение касается способа лечения или предотвращения глютенчувствительной целиакии, герпетиформного дерматита и/или любого другого расстройства, ассоциированного с непереносимостью клейковины, где способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества вышеуказанной ферментной композиции или по меньшей мере одной вышеуказанной выделенной эндопептидазой из семейства 88/853.

Вариантом настоящего изобретения является способ, где ферментную композицию или выделенную эндопептидазу вводят в составе фармацевтической композиции, пищевой добавки, питья или напитка.

Настоящее изобретение касается применения при производстве пищевых добавок вышеуказанной ферментной композиции для гидролиза глютеновых олигопептидов, которые являются устойчивыми к расщеплению посредством желудочных и панкреатических ферментов и присутствие которых в просвете кишечника приводит к токсическим эффектам.

Настоящее изобретение касается применения при производстве пищевых добавок по меньшей мере одной вышеуказанной выделенной эндопептидазы из семейства 88/853 для гидролиза глютеновых олигопептидов, которые являются устойчивыми к расщеплению посредством желудочных и панкреатических ферментов и присутствие которых в просвете кишечника приводит к токсическим эффектам.

Вариантом настоящего изобретения является применение, где ферментная композиция или выделенная эндопептидаза находятся в иммобилизованной форме.

Настоящее изобретение касается применения вышеуказанной ферментной композиции для обработки жидких пищевых продуктов.

Настоящее изобретение касается применения по меньшей мере одной вышеуказанной выделенной эндопептидазы из семейства 88/853 для обработки жидких пищевых продуктов.

Описание чертежей

Фиг. 1: филогенетическое дерево, выведенное на основании последовательностей глютеназ изобретения и протеаз седолизина или кумамолизина.

Белковые последовательности были получены путем выравнивания с помощью программы СЬИ8ТАЬА, и максимальное дерево подобия с бутстреп-значениями было вычислено с использованием программного обеспечения МЕОЛ5. Эндопептидазы Лсйпоа11отиги8 8р. выделены жирным шрифтом. 8ебЕ использовали как внешнюю группу. Затем дерево визуализировали с помощью программного обеспечения МЕОЛ5. Бутстреп-значения, равные или большие чем 50%, указаны в точках ветвления. Масштабная метка указывает на число аминокислотных замен на сайт.

8ебЕ = седолизин Е из А. Гитща1и8 АГ293 (ЕАЬ86850); 8ебВ = седолизин В из А8регдй1и8 Гитща1и8 Αί293 (САЕ17674); ТРРа = трипептидилпептидаза А из А. огу/ае К1В40 (ВАС56232); 8ейЭ = седолизин Ό из А. Гитща1и8 АГ293 (САЕ17675); 8ебС = седолизин С из А. Гитща1и8 АГ293 (САЕ46473); 8ебА = седолизин А из А. Гитща1и8 АГ293 (САЕ51075); КитаА = Кумамолизин-А8 из Айсус1оЪасШи8 8еп±йеп818 (О8СВ88); КитаВ = Кумамолизин из ВасШи8 8р. ΜΝ-32 (О8РР56); седолизинА = седолизин из Р8еиботопа8 8р. 101 (Р42790); седолизин В = седолизин-В из Хаййотопа8 8р. Т-22 (060106); Эндопеп- являют- 6 028228 ся глютеназами изобретения. Учетные номера белковых последовательностей приведены в скобках.

Фиг. 2: профиль активности эндопеп-140 (>100 кДа) и эндопеп-40 (<100 кДа), измеренный на флуоресцентном субстрате Сукцинил-А1а-А1а-Рго-РПе-АМС при разнообразных условиях рН.

Флуоресценцию измеряли через 2 ч при 37°С. Конкретные значения рН приведены на Х-оси, процентная доля относительной активности приведена на Υ-оси.

Фиг. 3: эндопептидазная активность эндопеп-140 (>100 кДа) и эндопеп-40 (<100 кДа), измеренная на флуоресцентном субстрате Сукцинил-А1а-А1а-Рго-РПе-АМС при рН 3 и 5. Флуоресценцию измеряли при различных интервалах времени при 37°С. Значения времени инкубации приведены на Х-оси, условные единицы флуоресценции (гГи) приведены на Υ-оси.

Фиг. 4: 8% §Э§-РАСЕ с краской Кумасси голубым рекомбинантных глютеназ.

Экспрессию белка индуцировали 1РТС 0,2 мкМ при 22°С в течение ночи. §1 указывает на штамм Е.соП, трансформированный рЕТ28Ь-эндопеп-140; §3 указывает на штамм Е.соП, трансформированный рЕТ28Ь-эндопеп-40. Молекулярные массы используемого маркера указаны слева.

Слева: полоса 1 = маркер молеклярной массы; полоса 2 = §1 не индуцирован; полоса 3 = §1 индуцирован, 3 ч сбор; полоса 4 = §1 индуцирован, сбор в течение ночи (в.н.); полоса 5 = пробел; полоса 6 = §3 не индуцирован; полоса 7 = §3 индуцирован, 3 ч сбор; полоса 8 = §3 индуцирован, в.н. сбор.

Фиг. 5: разрушение 33-мерного глиадинового пептида под действием эндопеп-140.

Продукты реакции с течением времени разделяли посредством ВЭЖХ на обращенной фазе.

Фиг. 5А: МС профили, ионный счет ιη/ζ=300-2000; фиг. 5В: УФ-профиль 230 нм, цАИ представляют микроединицы поглощения. Сравнивают профили, полученные при временных значениях 0, 30 мин, 2 ч. Только один сигнал, соответствующий интактному 33-мерному пептиду ([М-2Н]=1957) присутствовал при времени 0. Этот сигнал отчетливо снижался с течением времени. Несколько пиков появлялось через 30 мин инкубации, и их количество увеличивалось при времени 2 ч. Все наблюдаемые молекулярные ионы приведены в табл. 2. Размер наиболее характеристического пика выделен цифрой.

Фиг. 6: разрушение 33-мерного глиадинового пептида под действием эндопеп-140 в присутствии пепсина (1 мг/мл). Продукты реакции с течением времени разделяли посредством ВЭЖХ на обращенной фазе.

Фиг. 6А: МС профили, ионный счет т//=300-2000; фиг. 6В: УФ-профиль 230 нм, цАИ представляют микроединицы поглощения. Сравнивают профили, полученные при временных значениях 0, 3 0 мин, 2ч. В то время как только один сигнал, соответствующий интактному 33-мерному пептиду ([М2Н]=1957) присутствовал при времени 0, несколько пиков появлялось чере 30 мин инкубации, и их количество возрастало при времени 2 ч. Все наблюдаемые молекулярные ионы приведены в табл. 3. Размер наиболее характеристических пиков выделен цифрой. Сигнал при ([М-Н]=1068) соответствует пептиду из девяти аминокислот, присутствующему в последовательности 33-мера. Сигнал 689,7 обусловлен пепсином.

Фиг. 7: ВЭЖХ-МС анализ. 33-мерный глиадиновый пептид инкубировали с пепсином.

Фиг. 7А: МС профили; фиг. 7В: УФ-профиль 230 нм, цАИ представляют микроединицы поглощения. Сравнивают профили, полученные при временных значениях 0 и 2 ч. Почти никакого разрушения 33-мера не наблюдают.

Фиг. 8: протеолиз глиадина на §Э§-РАСЕ. окрашенного Кумасси голубым.

Расщепление глиадина под действием двух различных глютеназ в присутствии или в отсутствие пепсина. Глиадин инкубировали 2 ч при 37°С.

Слева: полоса 1 = маркер молекулярной массы; полоса 2 = глиадин; полоса 3 = глиадин + эндопеп40 (<100 кДа); полоса 4 = глиадин + эндопеп-40 (<100 кДа) + пепсин; полоса 5 = реакция 3, остановленная через 10 мин инкубации; полоса 6 = глиадин + эндопеп-140 (>100 кДа); полоса 7 = глиадин + эндопеп-140 (>100 кДа) + пепсин.

Краткое описание таблиц

Таблица 1. Предполагаемые белки, очищенные из секретома АсПпоа11отигив.

Таблица 2. Пептиды, высвобождаемые при расщеплении 33-мера под действием эндопеп-140.

Таблица 3. Пептиды, высвобождаемые при расщеплении 33-мера под действием эндопеп-40.

Подробное описание изобретения

Актиномицеты представляют собой нитевидные грам-положительные бактерии, в основном известные по их способности продуцировать вторичные биоактивные метаболиты. Актиномицеты использовались как источник гидролаз, хотя только несколько, конкретно, алкалифильные актиномицеты, были до сих пор исследованы на предмет их ферментативного потенциала (ЕиПо А., Мигака^а §., §1ιίιηίζιι Н., §ЫгаЫи Υ. РипйсаПоп аиП ргорегЛев оГ со11адепаве Ггот §)гер!отусев врешев 1. ВюсПет., 1987, 102, 163-70; §акига1 Υ., 1поие Н., ΝίβΠίί ^., ТакаПавЫ Т., Пио Υ., Υататоΐо М., ТакаПавЫ К. РипйсаПои аиП СПагас1етаНоп оГ Мфог Со11адепаве Ггот §йер1отусев рагуиЫв Вювск Вю1есПпо1. ВюсПет., 2009, 73, 21-28; МеП)а V.!, ТПитаг ЕТ., §шдП §.Р., РгоПисПоп оГ а1каЛпе рго!еаве Ггот ап а1каНрЫПс асПпотусе1е Вюгевоигсе ТесПпо1оду, 2006, 97, 1650-1654).

Более того, полная последовательность генома §1гер1отусев соеНсо1ог А3(2) позволила предсказать

- 7 028228 наличие 60 секретируемых предполагаемых протеаз и пептидаз среди 819 потенциальных секретируемых белков (Веибеу 8.И., СЕа1ет К.Р., Сегбеио-Таггада А.М., СЕа1бк О.Ь., ТЕоткои Ν.Κ., 1атек К.И., Натк И.Е., Циаб М.А., К1екег Н., Нагрег И., Ва1етаи А., Вго\уп 8., СЕаибга О., СЕеи С.\У.. СоШик М., Стоит А., Ргакег А., ОоЫе А., Н1ба1до 1., НогикЬу Т., НоуабЕ 8., Ниаид С.Н., К1екет Т., Ьатке Ь., МигрЕу Ь., Обует К., О'№П 8., КаЬЬшоубксЕ Е., Кфаибгеат М.А., КиШетГотб К., Кибет 8., 8еедег К., 8аиибегк И., 8Еатр 8., 8циагек К., 8циагек 8., Тау1ог К., ^атгеи Т., \У1е1/оггек А., \Уооб\уагб 1., Вагге11 В.О., РаткЫ11 1., Нор\уооб Э.Л. Сотр1е1е деиоте кециеисе оГ тобе1 асбиотусе1е 81гер1отусек соеПсо1ог А3(2) №1иге, 2002, 417, 141-7), придавая актиномицетам дополнительную ценность в качестве потенциального источника для новых гидролитических ферментов. Среди актиномицетов, ацидофильные штаммы предлагают более высокие шансы для продуцирования ферментов со свойствами, наиболее удовлетворяющими требованиям быть эффективными в СИ, а именно, активности при кислотных рН. Несколько новых родов ацидофильных актиномицетов (т.е. Са1еии11крота, Асбиокрюа, Кидоктоиокрота, 81гер1ас1б1рШ1ик) а также нитевидные бактерии с ацидофильными свойствами, принадлежащие к ранее неизвестной бактериальной линии (т.е. К1ебоиоЬас1ет) были описаны впервые за последние годы (Викб Е., Сауа1еШ Ь., МоишатбШ Р., 5>с1шташ1 Р., КоЕбе М., 8окю М., Иоиабю 8. Са1еиц11крота ас1б1рЫ1а деи. иоу., кр. иоу., иоуе1, тусебитГоттшд асбиотусе1е, аиб ргорока1 оГ Са1еиц11крогасеае Гат. иоу. 1и1. 1. 8ук1. Еуо1. Вас1егю1., 2006, 56, 1741-1746; Сауа1еШ Ь., МоиаатбШ Р., Ватои1е К., ЗсЕцтаии Р., КоЕбе М., 8окю М., Иоиабю 8. №у 1теаде оГ Й1атеи1оик, кроге-Гогтшд, дгат-рокШуе Ьас1епа Ггот коб Арр1. Еиу. МгегоЬюк, 2006, 72, 43604369; Сауа1е1б Ь., МоиаатбШ Р., 8сЕитаии Р., КоЕбе М., Ватои1е К., Викб Е., 8окю М., Иоиабю 8. Асбиокрюа ас1б1рЕЛа деи. иоу., кр. иоу. аиб Асбиокрюа гоЬииае деи. иоу., кр. иоу.; ргорока1 Гог Асбиокрюасеае Гат. иоу. аиб Са1еиибкрогшае киЬогбо. иоу. ш огбег Асбиотусе1а1ек 1и1. 1. 8ук1. Еуо1. Вас1егю1., 2006, 56, 1747-1753; Моис1атб1т Р., Сауа1еШ Ь., КаидЕеШ А., 8сЕитаии Р., КоЕбе М., Ватои1е К., 8окю М., Ме//е1аш А., Иоиабю 8. №уе1 тетЬегк оГ Гатбу Мютотоиокрогасеае, Кидоытоиокрота ас1б1рЫ1а деи. иоу., кр. иоу. аиб Кидоытоиокрота айтсаиа кр. иоу 1и1. 1. 8ук1. Еуо1. Вас1етю1., 2009, 59, 2752-2758; К1т 8.В., Ьоикба1е 1., 8еоид С.М., ОообГе11оу М. 8бер1ас1б1рЫ1ик деи. иоу., асборЫПс асбиотусе1ек убб уа11 сЕето1уре I аиб етеибабои оГ Гатбу 8бер1отусе1асеае (ЛУаккиит и Нетти (1943)^АЪ) етеиб. Кашеу е1 а1. 1997) Аи1оте уаи Ееетееибоек, 2003, 83, 107-116).

Асбиоаботитк, подобно многим другим актиномицетам, может расти в среде, содержащей белок в качестве единственного источника азота и углерода. Эта способность расти в белковой среде зависит от синергичного действия секретируемых эндо- и экзопротеаз, поскольку только аминокислоты и короткие пептиды могут ассимилироваться через мембранные переносчики. Штаммы Асбиоаботитик обладают оптимальным ростом при незначительно кислотных рН, таким образом, позволяя предположить, что протеолитические ферменты могут экспрессироваться при этом рН и могут иметь способность расщеплять сложные белки в кислотных условиях. Насколько известно заявителям ни в одном другом сообщении не описано продуцирование протеаз, действующих при кислотных рН, из актиномицетов.

Асбиоаботитик кр. И8М 24988 был выделен заявителями из итальянской почвы, хранился в коллекции штаммов заявителей, и депонирован 24 Июня, 2011 с И8М2, Иеи1ксЕе 8атт1иид уои М1кгоогдаи1ктеи ииб 2е11кибигеи ОтЬН, ^оГГеикбЭЬ, И-38124 ВгаииксЕуе1д, Оегтаиу (теперь Ее1Ьш7-1икб1и1 И8М2-Иеи1ксЕе 8атт1иид уои МШгоотдатктеи ииб 2е11кибигеи ОтЬН), по условиям Будапештского Договора. Штамму был присвоен инвентарный номер И8М 24988. Асбиоаботитик кр. И8М 24988 растет на разнообразных стандартных твердых средах (8Ыт1шд Е.В., ОоббеЬ И. МеШобк оГ сЕатайеб/абои оГ 8бер1отусек крешек 1и1. 1. 8ук1. Вас1етю1., 1966, 16, 313-340), подкисленных до рН 5,5 с помощью НС1. Через 15 дней инкубации при 28°С, субстратный мицелий является скрученным, имеет кремовый цвет, становящийся фиолетовым при старении, и на агаре 18Р2 не образуется воздушный мицелий. Цвет воздушного мицелия является белым при формировании на Н8А5 (Викб е1 а1., 2006). Обширный рост и продуцирование скрученного кремового/коричневого вегетативного мицелия наблюдали на агаре 18Р3 через 15 дней инкубации. Небольшое продуцирование коричневатых растворимых пигментов присутствовало через 20 дней инкубации. Штамм может расти при температуре между 21°С и 35°С, оптимальной температурой является 28°С на 18Р2 и Н8А5. Асбиоаботитик кр. И8М 24988 способен расти в присутствии №С1 до 2,5 % (мас./об.); при концентрации 1% (мас./об.) и выше, штамм не дифферецирует фиолетовый вегетативный мицелий, но только скрученный кремовый субстратный мицелий. Штамм, в чашках с агаром 18Р2, доведенный до желательных значений рН с помощью НС1 или №ОН, хорошо растет при рН между 4,0 и 7,0, с оптимальным рН 5,5. Обширный скрученный кремовый вегетативный мицелий наблюдают при росте на кислотном 18Р9 с добавлением глютена. Не продуцируются воздушный мицелий и растворимые пигменты.

Протеомное исследование секретируемых белков Асбиоаботитик подтверждает, что секретируются различные наборы протеаз, активных при нейтральных, основных или кислотных рН, и в частности, некоторые члены семейства пептидаз 88/853.

Глютеназы изобретения принадлежат к пептидазе МЕКОР8 88 [подсемейства 88 А (субтилизин) и семейству 88В (кексин)] и 853 (седолизин) (Каубидк Ν.Ό., Ваттеб А.1., Ва1етаи А. МЕКОР8: рерббаке ба1аЬаке №.ю1ею Ас1бк Кек., 2010, 38, И227-И233).

Глютен представляет собой белковый компонент пшеницы, ячменя, ржи и родственных видов, уни- 8 028228 кальный по своей способности обеспечивать эластичность и другие желательные характеристики тесту и многим другим пищевым продуктам. Глютеновые белки являются обогащенными остатками глутамина (35%) и пролина (15%), признак, который является особенно примечательным среди глютеновых эпитопов, которые распознаются специфическими для заболеваний Т-клетками. Главными токсическими компонентами глютена пшеницы являются глиадины, семейство пролин- и глутамин-обогащенных белков, которые содержат некоторые стимуляторные эпитопы для Т-клеток. Их частичное разрушение в желудочно-кишечном тракте под действием пепсина, трипсина, химотрипсина приводит к образованию нескольких токсических пептидов, из которых пептиды р31-49 и его производное р31-43 из фракции а1глиадина, и р56-88 (33-мер) из а2-фракции охарактеризованы лучше всего. 33-мер представляет собой пептидный фрагмент из 33 остатков, получаемый также посредством ίπ-νίίτο с имитацией физиологического желудочно-кишечного ферментативного расщепления (8Ьап с1 а1., 2002), аминокислотная последовательность которого представляет собой ТРТРРРРРРРТРУРРРРТРУРРРРЬРУРРРРРР (8ЕЦ ГО N0: 6). Он является сильнейшим иммуностимуляторным пептидом, поскольку он несет множество копий трех эпитопов, которые являются иммуногенными у пациентов с глютенчувствительной целиакией; он, таким образом, является ответственным за сильный иммунотоксический ответ (Οίαο 8.^., Вегдзепд Е., Мо1Ьегд О., Х1а 1., Р1ескеп81еш В., КЬоз1а С, 8ο11ίά М.Ь. АпЧдеп РгезейаЧоп ίο СеПас ЬевюпГОегщей Т Се11з оР 33-тег ОПайш Рерййе №1ига11у Рогтей Ьу Оа81го1п1е8Йпа1 ОщезПоп 1. 1ттипо1., 2004, 173, 17571762), и, следовательно, его применяют как модель для глютеновой детоксификации. 33-мерный пептид является превосходным субстратом для фермента трансглутаминазы 2 (ТО2), которая деамидирует глиадиновые пептиды в собственной пластинке слизистой оболочки, увеличивая его сродство к молекулам Ό02 или Ό08 антигена лейкоцитов человека (ИЬА), и, таким образом, усиливая опосредованный Тклетками слизистый иммунный ответ, приводящий к клиническим последствиям. Транспорт в кишечнике интактного 33-мера через слой энтероцитов может быть обусловлен сверхэкспрессией трансферринового рецептора в СИ и/или усиленной проницаемостью слизистой. В любом случае, пептиды могут избежать разрушения посредством кислотного эндосомально-лизосомального пути и могут достигать серозной границы неизмененными. Разрушение 33-мерного глиадиного пептида до пептидов, содержащих менее чем девять остатков, не приводит в результате к глютеновой токсичности.

Поскольку желудочно-кишечный тракт не обладает ферментативным оборудованием для эффективного расщепления глютен-производных пролин-обогащенных пептидов, вызывая у пациентов с глютенчувствительной целиакией аномальный иммунный кишечный ответ, применение перорально активных протеаз для разрушения токсичных глиадиновых пептидов перед тем, как они достигают слизистой оболочки, может рассматриваться в качестве альтернативного лечения по отношению к диете.

Заявители идентифицировали новое подсемейство белков, которое проявляет протеолитическую активность по отношению к пептидам, таким как пролин-обогащенные пептиды, при кислотном рН, который соответствует рН желудочного сока, и обнаружили, что эта ферментная композиция также обладает способностью разрушать 33-мерный глиадиновый пептид. На основе структурных свойств, полученных посредством биоинформатического анализа, заявители показали, что это новое подсемейство принадлежит к пептидазам 88/853 (субтилизин-кексин-седолизин) и может быть сгруппировано в новую подгруппу, отличную от уже известных седолизина или кумамолизина, которые принадлежат семейству 853 (фиг. 1).

Заявители разработали конкретную композицию из этих эндопептидаз. Данная композиция содержит по меньшей мере одну из эндопротеаз из семейства пептидаз 88/853 (субтилизин-кексин-седолизин), продуцируемую АсЧпоа11отигл8, которая расщепляет непроцессированные полипептиды и разрушает фрагмент глиадина, известный как устойчивый к действию протеазы. Итак, по меньшей мере одна эндопротеаза может применяться для лечения целиакии или любого заболевания процесса пищеварения, такого как мальабсорбция. Более того, поскольку фермент является устойчивым к пепсину, комбинация этих двух протеолитических активностей могла бы приводить в результате к более экстенсивному разрушению полипептидов и белков, таких как глиадин. Заявители обнаружили, что 33-мер разрушается до пептидов из шести аминокислот (табл. 2 и 3). Хотя ферменты изобретения являются активными по отдельности, добавление к ним одной или нескольких пептидаз, которые действуют на пролинобогащенные пептиды, таких как пролил-эндопротеазы и/или х-пролил-дипептидиламинопептидазы и/или пролил-аминопептидазы, может приводить в результате к более быстрому действию.

Белковое семейство 88/853 данного изобретения по отдельности или необязательно в комбинации с другими протеазами может быть применимым в пищевой промышленности, как, но не ограничиваясь лишь приведенными, для разрушения субстратов для горечи, обработки мяса, в мыловаренной промышленности или для разрушения прионов, вирусов и токсичных или контаминантных белков до коротких пептидов и/или свободных аминокислот.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет ферментную композицию, содержащую по меньшей мере одну эндопептидазу 88/853, активную при рН 3-8 (включительно), выбранную из группы, состоящей из:

а) эндопеп-140, содержащей 8Е0 ГО N0: 1, ее биологически активный фрагмент, ее природный ал- 9 028228 лельный вариант или последовательность, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентичности;

b) эндопеп-40, содержащей 8ЕЦ ГО N0: 2, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентичности;

c) эндопеп-120, содержащей 8ЕЦ ГО N0: 3, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентичности;

й) эндопеп-60, содержащей 8ЕЦ ГО N0: 4, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентичности;

е) эндопеп-41, содержащей 8ЕЦ ГО N0: 5, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентичности.

Термин пептидаза(ы) изобретения, протеаза(ы) изобретения или эндопептидаза(ы) изобретения, как используют здесь, идентифицирует одну или несколько из эндопептидаз, определенных выше.

Настоящее изобретение также включает эндопептидазу, являющуюся производной любой одной из последовательностей, указанных выше, где любые из аминокислот могут отличаться от соответствующих остатков, показанных в 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4 или 5, все еще поддерживающих ее биологическую активность и физиологические функции, или ее биологически активный фрагмент. Цель данного изобретения включает также любой вариант пептидазы, содержащий замены, делеции, модификации боковых цепей и/или включения по определенным положениям в пределах аминокислотной последовательности нативной аминокислотной последовательности, которая сохраняет биологическую активность и физиологическую функцию указанной нативной аминокислотной последовательности. Примеры замен являются хорошо известными квалифицированным специалистам в области техники и указаны, например, в \\'0 2011/077359.

В еще одном другом аспекте настоящее изобретение направлено на выделенные протеазы изобретения, и их биологически активные фрагменты (или их производные, части, аналоги или гомологи). Биологически активный фрагмент относится к областям протеаз изобретения, которые являются необходимыми для конкретных протеазных активностей.

В дополнительном варианте осуществления протеаза изобретения представляет собой протеазу, которая содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно 80%, еще более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95% идентичности с аминокислотной последовательностью, содержащей 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4 или 5, и сохраняет активность протеаз, содержащих 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4 или 5.

Термины идентичность и гомология, когда относятся к нуклеотидной или аминокислотной последовательности, применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к степени, в которой две полинуклеотидные или полипептидные последовательности являются идентичными или гомологичными на основании принципа остаток-за-остатком на протяжении конкретной области сравнения. Выравнивание и процент идентичности или гомологии могут быть определены с использованием любого подходящего программного обеспечения, известного в области техники, например, программ, описанных в Сиггеи! РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1о§у (Ли8иЬе1 Р.М. е! а1., Соттегаа11у АуайаЫе 8оП\уаге. Сштеп! РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, 1987, 8ирр1етеп! 30, 8есйоп 7.7.18, ТаЬ1е 7.7.1). Предпочтительные программы включают программу ССС Рйеир, РА8ТА (Реагеоп К. апй Ыртап Ό. ί. Бпргоуей Тоо1§ £ог Вю1ощса1 8ециепсе Лпа1у515 Ргос. №Й., Асай. 8οΐ. И8А, 1988, 85, 2444-2448), и ВЬА8Т (А1Щс1ш1 8.Р., САП \., МШег \., Муегк Е.\., Ыртап Ό.Ι. Валс 1оса1 аПдптеШ кеагсй !оо1 1. Мо1. Вю1., 1990, 215, 403-410).

Изобретение также предоставляет протеазы изобретения, функционально слитые с еще одним другим полипептидом, которые специалисты в данной области называют химерными или мечеными белками. Полипептид может быть гибридизирован по №концу и/или С-концу протеазы изобретения. Различные меченые слитые белки могут быть получены специалистами в области техники и продуцированы стандартными методами рекомбинантных ДНК или общепринятыми методами, включая автоматизированные синтезаторы ДНК. Такие слитые белки могут облегчить очистку рекомбинантных протеаз изобретения или их экспрессию и секрецию в клетках-хозяевах. Эти методы являются хорошо известными квалифицированным специалистам в области техники.

Заявители показали, что крупные пептиды, такие как 33-мерный глиадиновый пептид могут разрушаться при кислотном рН эндопептидазами. Секретируемая эндопеп-140 действует посредством расщепления полипептидной цепи в нескольких местах, с генерированием различных малых пептидов из шести аминокислот (табл. 2, фиг. 5). Эта эндопептидаза демонстрирует предпочтения для участков, имеющих тирозин или лейцин или фенилаланин в положении Р1 и пролин в положении Р2 и Р1'. Увеличение количества эндопептидазы и/или времени инкубации приводит к полной деградации 33-мерного полипептида. В соответствии с обнаруживаемыми молекулярными массами, по-видимому, остатки глутамина

- 10 028228 превращаются в остатки глутаминовой кислоты, таким образом, позволяя предположить вовлечение амидотрансферазной активности. Эндопептидазы ферментной композиции изобретения могут функционировать в присутствии пепсина млекопитающих (табл. 2, фиг. 6).

Такие же анализы осуществляли с эндопеп-40, и полученные результаты, показанные в табл. 3, указывают, что эта глютеназа ведет себя аналогично.

Эндопеп-140 содержит структурный домен с высокой гомологией к другим эндопептидазам изобретения. Например, выравнивание ВЬА8Т дает идентичности = 223/370 (60%), положительные = 261/370 (71%) между эндопеп-140 и эндопеп-40 или идентичности = 227/431 (53%), положительные = 273/431 (63%) между эндопеп-140 и эндопеп-41. Подобные результаты получают посредством выравнивания ВЬА8Т между эндопеп-40 и эндопеп-41, с идентичностями = 230/419 (55%), положительные = 278/419 (66%). Положительными являются аминокислотные остатки, которые являются идентичными или очень похожими друг с другом по их физико-химическим признакам, как определяют с помощью матрицы ВЬ08ИМ62.

Эндопептидазы ферментной композиции изобретения могут продуцироваться посредством культивирования природного штамма Лс11поа11отиги5 или его мутанта, который способен продуцировать по меньшей мере одну эндопептидазу 88/853, определенную выше, или клеток-хозяев, полученных методами рекомбинантных ДНК.

Термин рекомбинантная, когда его используют по отношению к клетке, указывает на то, что клетка реплицирует гетерологичную нуклеиновую кислоту или экспрессирует пептид или белок, кодируемый гетерологичной нуклеиновой кислотой. Гены, не обнаруженные в нативной (нерекомбинантной) форме клетки или обнаруженные в нативной форме клетки, где гены модифицируют и повторно внедряют в клетку искусственными средствами, могут содержаться в рекомбинантных клетках.

Квалифицированный специалист в области техники поймет, что эти клетки могут представлять собой одноклеточные или многоклеточные трансгенные организмы.

Изобретение также включает способы, основанные на культивировании клеток, которые содержат нуклеиновую кислоту, эндогенную для клетки, которая была модифицирована без удаления нуклеиновой кислоты из клетки; такие модификации включают модификации, полученные посредством замены гена, сайт-специфической мутации и родственных методов, например, посредством обработки мутагенными средствами или с помощью ионизирующих излучений.

Термин аллельный вариант обозначает любую из двух или нескольких альтернативных форм гена, занимающего тот же хромосомный локус. Аллельная вариация возникает естественным образом через мутацию, и может приводить в результате к фенотипическому полиморфизму внутри популяций. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин аллельный вариант относится также к белку, кодируемому аллельным вариантом гена.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ получения ферментной композиции изобретения, который включает в себя:

A) культивирование природного штамма АсйпоаНотигик, способного продуцировать по меньшей мере одну эндопептидазу 88/853, определенную выше, и извлечение эндопептидазы(аз) из конечной среды культивирования; или

B) культивирование штамма АсйпоаНотигик, производного от природного штамма АсйпоаНотигик, способного продуцировать по меньшей мере одну эндопептидазу 88/853, определенную выше, посредством методов общепринятой мутации и/или селекции, который поддерживает способность к продуцированию по меньшей мере одной из определенных выше эндопептидазы(аз), и извлечение эндопептидазы(аз) из конечной среды культивирования; или

C) технологию рекомбинантных ДНК, включающую стадии:

1) введения в клетку-хозяина нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере одну эндопептидазу класса 88/853 субтилизина-кексина-седолизина, выбранную из группы, состоящей из:

a) эндопеп-140, содержащей 8ЕЦ ГО N0: 1, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентичности;

4) эндопеп-60, содержащей 8ЕЦ ГО N0: 4, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентичности;

е) эндопеп-41, содержащей 8ЕЦ ГО N0: 5, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 95% иден- 11 028228 тичности;

2) культивирование клеток стадии 1) в культуральной среде при условиях, подходящих для продуцирования эндопептидазы(аз);

3) извлечение эндопептидазы(аз) из конечной среды культивирования.

Одна или несколько эндопептидаз изобретения могут продуцироваться при осуществлении одного способа, как определено выше. Когда единичные эндопептидазы продуцируются раздельно при осуществлении способа, определенного выше, данное изобретение включает необязательно стадию объединения двух или нескольких из полученных эндопептидаз для обеспечения ферментной композиции, содержащей смесь указанных эндопептидаз. Указанные эндопептидазы могут быть получены как выделенные эндопептидазы. Под термином выделенная эндопептидаза, как используют здесь, подразумевают очищенную форму эндопептидазы, которая не содержит, по существу, других белков или клеточного материала из клетки, из которой производят эндопептидазу.

Все термины, касающиеся ДНК/РНК нуклеиновой кислоты, также относящиеся к родственным технологиям манипуляции, применяемым здесь, являются хорошо известными экспертам в области техники молекулярной биологии, и пока эти термины используют во всем их широком и обычном значении, как изложено в МашаДк Т., РгНкск Е.Р., ЗатЬгоок 1. Мо1еси1аг с1ошпд: 1аЬога!огу тапиа1 Со1Д Зрппд НагЬог, ΝΥ, 1982 или АикиЬе1 Р.М. Сиггеп! РгоЮсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду 1о1т \УПеу & Зопк, Ые№ Уогк, ΝΥ, 1993 или ЗатЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: а ЬаЬогаФгу Мапиа1 2'¹ ЕД., Со1Д Зрппд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргекк, Со1Д Зрппд НагЬог, ΝΥ, 1989.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие эндопептидазы ферментной композиции изобретения, представляют собой дополнительную цель изобретения, которые включают нуклеиновые кислоты, чьи последовательности предоставлены здесь и определены как ЗЕО ГО N0: 7, 8, 9, 10 или 11 или их фрагменты. Изобретение также включает мутантные или вариантные нуклеиновые кислоты или часть этих нуклеиновых кислот. Соответственно, нуклеиновые кислоты данного изобретения включают полинуклеотидную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0: 7, 8, 9, 10 или 11, или последовательность, имеющую по меньшей мере 50%, предпочтительно 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно 80%, еще более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей ЗЕО ГО N0: 7, 8, 9, 10 или 11, и кодирующую аминокислотную последовательность, которая все еще поддерживает биологическую активность и физиологическую функцию указанной аминокислотной последовательности.

Последовательности, характеризуемые идентичностями на нуклеотидном уровне, обозначены в настоящем описании также как гомологичные последовательности нуклеиновой кислоты или их вариации. Гомологичные нуклеотидные последовательности кодируют эти последовательности, кодирующие изоформы протеаз изобретения. Изоформы могут экспрессироваться в том же самом организме в результате, например, альтернативного сплайсинга РНК. Альтернативно, изоформы могут кодироваться различными генами.

Гомологичные нуклеотидные последовательности также включают, но не ограничиваясь ими, природные аллельные вариации и мутации нуклеотидных последовательностей, представленных здесь выше. Гомологичные последовательности нуклеиновых кислот включают последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют консервативные аминокислотные замены в ЗЕО ГО N0: 1, 2, 3, 4 или 5.

В изобретении, гомологичные нуклеотидные последовательности могут включать нуклеотидные последовательности, кодирующие протеазу изобретения из других видов, принадлежащих АсДпоаНотигик, а также родов, отличных от АсДпоаНотигик, таких как, например Са1епи11крога, АсДпокрюа, КДеДопоЬас1ег. ЗйерФтусек, З1гер1ас1Д1рЫ1ик, Мюготопокрога, Кидоктопокрога.

Заявители определили посредством ВЬАЗТ-анализа, что геномы Са1епиПкрога, К1еДопоЬас1ег, З1герЮтусек содержат гены, которые кодируют белки, имеющие более чем 50% гомологию с соответствующей протеазой изобретения; например, предполагаемые белки с учетными номерами АСИ72534 и АСИ72320 из С’аЮпиПкрога ас|Д|рНДа имеют идентичности = 261/400 (65%), положительные = 295/400 (74%) с эндопеп-40 ЗЕО ГО N0: 2 и идентичности = 705/1342 (53%), положительные = 878/1342 (65%) с эндопеп-140 ЗЕО ГО N0: 1, соответственно, или предполагаемый белок с учетным номером ЕРН81837 из 1<1еДопоЬас1ег гасепиГег имеет идентичности = 244/402 (61%), положительные = 299/402 (74%) с эндопеп40 ЗЕО ГО N0: 2 или белковой последовательностью З1гер1отусек кр. Е14 с учетным номером ЕРР91270 также имеет идентичности = 230/371 (62%), положительные = 274/371 (74%) с эндопеп-40 ЗЕО ГО N0: 2. Гены, кодирующие гомологичные эндопептидазы, могут присутствовать в штаммах, принадлежащих родам филогенетически родственным, указанным выше, чьи геномные последовательности не являются доступными из общедоступных баз данных.

Биологически активный фрагмент эндопротеазы изобретения может быть получен посредством выделения фрагмента нуклеиновой кислоты с ЗЕО ГО N0: 7, 8, 9, 10 или 11, который кодирует эндопротеазу с такой же биологической активностью, что и у эндопротеаз изобретения, экспрессируя кодируемую часть эндопротеазы (например, посредством рекомбинантной экспрессии ш уйго) и с оценкой активности кодируемого фрагмента эндопротеазы. Изобретение дополнительно охватывает молекулы нуклеиновой кислоты, которые отличаются от последовательностей нуклеиновой кислоты, показанных в

- 12 028228

8ЕЦ ΙΌ N0: 7, 8, 9, 10 или 11 вследствие вырождения генетического кода, и, таким образом, кодируют такие же протеазы, которые кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, показанными в 8ЕО ГО N0: 7, 8, 9, 10 или 11.

Технологии манипуляции с генами и белковой экспрессии являются известными квалифицированным специалистам в области техники и могут быть также найдены в КпеДег Μ. Оепе ТтапкГет ηηά Ехртеккюп: А ЬаЬогаФгу Мапиа1 81оск1оп Рте88, ΚΥ, 1990.

Заявители указывают, используя термин биологическая активность или функциональная активность на природную или нормальную функцию протеаз изобретения, например, способность к разрушению других белков. Предсказывают, что аминокислотные остатки, которые являются консервативными среди протеаз изобретения, конкретно являются не подверженными изменению. Аминокислоты, для которых могут быть проведены консервативные замены, являются хорошо известными в области техники. Как признают все квалифицированные специалисты в области техники, каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением АИС, который обычно является только кодоном для метионина) может быть модифицирован с получением функционально идентичной молекулы посредством стандартных методов. Кроме того, индивидуальные замены, делеции или дополнения, которые изменяют, дополняют или проводят делецию единичной аминокислоты или небольшого процентного содержания аминокислот (обычно менее чем 5%, более типично менее чем 1%) в кодируемой последовательности, представляют собой консервативные мутации, где изменения приводят к замене аминокислоты на химически сходную аминокислоту.

Еще один другой аспект изобретения имеет отношение к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим протеазы изобретения, которые содержат изменения в аминокислотных остатках, которые не являются существенными для активности. Такие протеазы изобретения отличаются по аминокислотной последовательности от 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4 или 5, все еще сохраняют биологическую активность. В одном варианте осуществления молекула выделенной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую протеазу, где протеаза содержит аминокислотную последовательность с по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотными последовательностями из 8ЕО ГО N0: 1, 2, 3, 4 или 5.

Термин выделенная нуклеиновая кислота или выделенная полинуклеотидная последовательность, как используют здесь, идентифицирует молекулу нуклеиновой кислоты, которая отделена от других молекул нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в клетке, из которой происходит нуклеиновая кислота, и не содержит, по существу, другой клеточный материал или материал культуральной среды, когда указанную молекулу нуклеиновой кислоты получают из природных микроорганизмов, микроорганизма, производного от них, или микроорганизмов, полученных посредством рекомбинантных технологий.

Молекула выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующая эндопротеазу изобретения, гомологичную белку с 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4 или 5, может быть создана посредством введения одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или делеций в последовательности нуклеиновой кислоты 8ЕЦ ГО N0: 7, 8, 9, 10 или 11, таким образом, что одна или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций вводят в кодируемую протеазу. Мутации могут быть введены в 8ЕЦ ГО N0: 7, 8, 9, 10 или 11, посредством стандартных методов, таких как сайт-направленный мутагенез, ПЦР-опосредованный мутагенез и перестановка в ДНК. Альтернативно, мутации могут вводиться статистически вдоль всей кодирующей последовательности протеазы изобретения или ее части, таким образом, как посредством насыщающего мутагенеза, и полученные в результате мутанты могут быть подвергнуты скринингу на биологическую активность протеазы изобретения для идентификации мутантов, которые сохраняют активность.

Ферментная композиция глютеназ в соответствии с настоящим изобретением может также применяться в иммобилизованной форме и использоваться, например, для обработки жидких пищевых продуктов. Ферментная композиция изобретения может также применяться в плодоперерабатывющей и пивоваренной промышленности для очистки и обеспечения функционирования оборудования. Например, обеспечивают протекание глютенсодержащего жидкого пищевого продукта вдоль матрицы, проницаемой для глютена, в которую погружена ферментная композиция изобретения. Глютен экстрагируют из пищевого продукта и расщепляют под действием ферментов. Ферментная композиция изобретения может также вносить вклад в доступную энергию пищи. Например, частично или полность непереваримаемый пролинсодержащий белок полностью или частично разрушается ферментной композицией изобретения, что приводит к доступности более переваримаемой пищи для человека или животного. Таким образом, скорость роста и/или отношение пищевой конверсии (т.е. масса перевариваемой пищи относительно прироста массы) человека или животного улучшаются.

Способы продуцирования эндопептидаз и их характеризация

Настоящее изобретение также относится к способам продуцирования ферментов настоящего изобретения, включающих культивирование (а) штамма, который находится в его форме дикого типа, или (Ь) форме, производимой из него посредством обычных технологий мутации, например, посредством обработки мутагенными средствами или с помощью ионизирующих излучений, или (с) клеток-хозяев,

- 13 028228 которые способны продуцировать полипептид изобретения, и извлечение указанного полипептид из конечной среды культивирования. В способах получения настоящего изобретения, среды для клеточного культивирования различным образом выбирают из сред, известных в области техники для получения белков в соответствии с культивированием штаммов дикого типа, штаммов, производимых из них, или рекомбинантных клеток-хозяев. Культивирование происходит в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, с использованием методик, известных в области техники. Подходящие среды являются доступными от промышленных поставщиков или могут быть получены в соответствии с опуликованными композициями (например, в каталогах Американской Коллекции Типовых Культур). Например, среды, содержащие сою, являются более адаптированными для обеспечения продуцирования ферментов изобретения микроорганизмами дикого типа.

Клетки могут культивироваться посредством культивирования во встряхиваемых колбах, мелкомасштабной или крупномасштабной ферментации (включая непрерывные, периодические, подпитываемые или твердофазные ферментации) в лабораторных или промышленных ферментаторах, осуществляемые в подходящей среде и при условиях, обеспечивающих экспрессию и/или выделение полипептида. Если полипептид секретируется в питательную среду, полипептид может быть извлечен непосредственно из среды. Если полипептид не секретируется, он может быть извлечен из клеточных лизатов. Продуцируются несколько протеолитических активностей, и культивирование прекращают, когда продуцирование эндопептидаз достигает максимума. После завершения культивирования, культуральную среду отфильтровывают для отделения микробных тел, и фильтрат обрабатывают обычным образом для сбора эндопептидаз посредством нескольких методик в комбинации, таких как ультрафильтрация, концентрирование при пониженном давлении, высаливание, осаждение органическим растворителем, диализ, гельфильтрация, адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, электрофокусирование и лиофилизация. Соответствующие методики должны выбираться с учетом желательных физических и химических свойств эндопептидаз.

Представительный пример продуцирования эндопептидаз данного изобретения посредством культивирования штамма Лс11поа11отиги5 дикого типа представлен в примере 1 здесь далее. Эндопептидаза(ы) изобретения могут быть очищены до желательной степени чистоты, которая может зависеть от предназначенного применения и от специфической активности эндопептидаз(ы).

Гетерологичная экспрессия в клетках-хозяевах

Для продуцирования эндопептидаз настоящего изобретения могут использоваться рекомбинантные клетки и микроорганизмы. Клетка-хозяин может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных квалифицированным специалистам в области техники, включающих прокариотные клетки, эукариотные клетки, клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки грибков, дрожжевые клетки и/или растительные клетки. Выбор соответствующего хозяина находится в пределах квалификации специалистов в области техники.

Применимые микроорганизмы представляют собой бактериальные клетки, такие как грамположительные бактерии, включающие, но не ограничиваясь ими, клетки ВасШик (например, ВасШик киЬББк, ВасШик сегеик) или клетки 81гер1отусек или клетки молочнокислых бактерий или грамотрицательных бактерий, таких как Е.соП и РкеиБотопак. Предпочтительные продуцирующие клетки включают клетки из организмов, известных как в целом рассматриваемых как безопасные, таких как прокариоты Ьас&ЬасШик, Ругососсик, ВасШик, 81герЮтусек. и эукариоты АкретдШик. Более предпочтительные клетки включают клетки, которые уже применяют при получении пищевых продуктов, такие как Ьас&ЬасШик крр. и/или АкретдШик огу/ае.

Внеклеточное продуцирование ферментов может быть получено из микроорганизмов, таких как АкретдШик оту/ае, БасЮЬасШик саке1, К1цууетотусек 1асПк или 81герЮтусек БуШапк.

Введение вектора в бактериальную клетку-хозяина может, например, быть проведено посредством трансформации протопластов (например, СНапд 8., СоНеп 8.№ НщН Ггесщепсу 1тапк£оттаБоп оГ ВасШик киЬББк рго1ор1ак1к Ьу р1актШ ОНА Мо1. Сеп. Сепе!., 1979, 168, 111-115), с использованием компетентных клеток (например, ОиЬпаи Ό., ОауШоГГ-АЬе1коп К. Ра!е оГ (гапкГогпипд ΏΚΛ Го11о\уи1д ир!аке Ьу сотре1еп1 ВасШик киЫШк. I. РоттаБоп апБ рторетБек оГ Бопог-геар1еп1 сотр1ех Т Мо1. Вю1., 1971, 56, 209-221), электропорации (например, 8Б1дека№а, К., Оо\уег V. Т Е1есБоротаБои оГ еикатуо1ек апБ ргокагуо!ек: а депега1 арртоасБ Ю шБоБисБоп оГ тасгото1еси1ек иНо се11к Вю1есБшдиек, 1988, 6, 742-751) или конъюгации (например, КоеН1ег Т.М., ТБоте С. В. ВасШик киЬББк (пайо) р1акппБ рЬ820 теБ1а1ек БиегкреШек р1акпПБ йапкГег Т ВасГегю1., 1987, 169, 5771-5278).

Применимые многоклеточные организмы для применения в качестве клеток-хозяев представляют собой, например, растения, части растений, семена или растительные клетки.

Предпочтительные продуцирующие многоклеточные организмы представляют собой, например, трансгенные сельскохозяйственные культуры, такие как зерновые или овощи, такие как томат, которые содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие протеазы изобретения.

Представительный пример продуцирования эндопептидаз данного изобретения в рекомбинантных клетках-хозяевах дан в примере 2 здесь далее.

- 14 028228

Фармацевтические композиции

Эндопептидазные средства настоящего изобретения могут вводиться по отдельности или включены в разнообразные готовые формы. Фармацевтическую композицию изобретения составляют так, чтобы она была совместимой со своим предназначенным путем введения, которым является предпочтительно пероральное введение. Например, поскольку секретируются несколько эндопептидаз ферментной композиции изобретения, неочищенный препарат, полученный из среды клеточной культуры АсйпоаНотитив или других применимых одноклеточных рекомбинантных микроорганизмов, таких как грамположительные бактерии включающие, но не ограничиваясь ими, клетки ВасШив, клетки §1тер1отусев, клетки молочнокислых бактерий, грамотрицательные бактерии, такие как Е.сой, может вводиться перорально. Молочнокислые бактерии включают, но не ограничиваясь ими, виды родов Ьас1ососсив, ЬасФЬасШив, ЬеисоповЮс, §1тер1ососсив, Ребюсоссив и ЕЩегососсив. Альтернативно, ферментная композиция изобретения может вводиться перорально после очистки.

Такие препаративные формы могут быть получены с соответствующими ингредиентами для генерации прпарата в жидкой форме, например, в форме раствора, эмульсии или в твердой форме, такой как таблетки, капсулы или полутвердой форме. Препаративная форма ферментной композиции может вводиться разнообразными путями, включающими пути, особенно подходящими для замешивания с продуктом питания. Ферментные компоненты могут быть активными перед приемом пищи или во время приема пищи, и могут обрабатываться, например, посредством подходящего инкапсулирования, для контроля временного режима активности.

Для получения соответствующей фармацевтической композиции эндопептидаз настоящего изобретения может применяться любой способ для стабилизации химического или биологического материала, известный в области техники, включая способы, основанные на облучении или температурной модуляции или их комбинаций.

Для лечения заболевания целиакии используемые фармацевтические композиции предпочтительно составляют так, чтобы высвобождать их активность в желудочный сок. Этот тип препаративных форм будет обеспечивать оптимальную активность в правильном месте, например, высвобождать эндопротеазы изобретения в желудке.

Альтернативно микроорганизм, такой как бактериальная или дрожжевая культура, способная продуцировать активные средства, может вводиться пациенту. Такая культура может быть примешана к пищевым препаратам или составлена, например, как энтеросолюбильная капсула.

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет пищевую добавку, содержащую ферментную композицию настоящего изобретения. Термин пищевая добавка в контексте настоящего изобретения является взаимозаменимым с терминами добавка к пище, биологически активная добавка и питательная добавка.

Пищевая добавка изобретения может быть составлена, получена, поставлена и распределена, как описано в других документах предшествующего уровня, относящихся к области данного изобретения (\νϋ 2011/077359, XVО 2003/068170, XVО 2005107786), которые предоставляют способы лечения и/или предотвращения синдрома, ассоциированного с человеческим заболеванием, указанное заболевание является выбранным из группы, включающей целиакию, герпетиформный дерматит, плохое всасывание пищеварительного тракта, аллергическую реакцию, ферментную недостаточность, грибковую инфекцию, болезнь Крона, микозы и синдром мальабсорбции.

В качестве примера, пищевая добавка изобретения может представлять собой гранулированный ферментный продукт с оболочкой или без оболочки, который может легко быть смешан с пищевыми компонентами, альтернативно, пищевые добавки изобретения могут образовывать компонент премикса.

Альтернативно, пищевые добавки изобретения могут представлять собой жидкость, водную взвесь или взвесь на масляной основе. Ферментная композиция изобретения может доставляться посредством экспрессирования ферментов непосредственно в трансгенных продовольственных культурах (как, например, трансгенных растениях, семенах и т.п.), таких как зерновые культуры, хлебных злаках, кукурузе, сое, рапсовых семенах, люпине.

Фармацевтическая композиция или пищевая добавка изобретения могут быть предоставлены перед питанием, непосредственно перед питанием, вместе с питанием или непосредственно после питания, таким образом, чтобы эндопротеазы ферментной композиции данного изобретения высвобождались или активировались в верхнем желудочно-кишечном просвете, где эндопротеазы могли бы служить дополнением к желудочным и панкреатическим ферментам для детоксификации усваиваемого глютена и предотвращать прохождение вредных пептидов через слой энтероцитов.

Ферментная композиция данного изобретения имеет многочисленные применения в пищевой промышленности, в особенности, они могут применяться при производстве пищевых добавок, как описано в приведенных выше документах предшествующего уровня техники.

Исходя из данного описания, в результате становится очевидным, что дополнительная цель данного изобретения состоит в предоставлении способа для разрушения глютеновых олигопептидов, которые являются устойчивыми к расщеплению посредством желудочных и панкреатических ферментов, и чье присутствие во внутреннем просвете приводит в результате к токсическим эффектам, который включает

- 15 028228 контактирование указанных глютеновых олигопептидов с ферментной композицией или по меньшей мере одной выделенной эндопептидазой данного изобретения.

Конкретно, один аспект указанного способа состоит в лечении или предотвращении глютенчувствительной целиакии, герпетиформного дерматита и/или любого другого расстройства, ассоциированного с непереносимостью клейковины, который включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества ферментной композиции или по меньшей мере одной выделенной эндопептидазы данного изобретения, предпочтительно, включенной в фармацевтическую композицию, пищевую добавку, питье или напиток.

Примеры

Пример 1. Идентификация и характеризация эндопептидаз Асйиоа11отиги8 8р. Ό8Μ 24988.

1.1. Культивирование штамма и получение белка.

Штамм Асйиоа11отиги8, используемый в соответствии с данным изобретением, происходит из коллекции штаммов заявителей.

Асйиоа11отиги8 8р. Ό8Μ 24988 поддерживали на среде 18Р2 с агаром (ЗЫгйпд апб СоййеЪ, 1966), подкисленной до рН 5,5 с помощью НС1. Микробное содержимое одной чашки соскребали и засевали в одну колбу Эрленмейера объемом 50 мл, содержащую 15 мл среды АР5, которая состояла из: (г/л) декстрозы 20, дрожжевого экстракта 2, соевой муки 8, ЫаС1 1 и ΜΕ8 10. Среду готовили в дистиллированной воде и рН доводили до 5,5 перед стерилизацией при 121°С в течение 20 мин. Инокулированную колбу оставляли для выращивания при 28°С, на ротационном встряхивателе, работающим при 200 об/мин. Через 5-6 дней инкубации, 5% культуры засевали во вторую серию колб Эрленмейера с объемом 500 мл, содержащих 100 мл такой же среды для ферментации. Продуцирование белка осуществляли в колбах, инкубируемых в течение 15 дней при 28°С на ротационном встряхивателе, работающем при 200 об/мин. Продуцирование белка подвергали мониторингу посредством биоанализа, как описано ниже.

Продуцировались несколько протеолитических активностей и культивирование останавливали, когда продуцирование эндопептидаз, с последующими анализами, описанными ниже, достигало максимума. Ферментацию собирали через 15 дней и жидкую среду центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин. Культуральную среду отфильтровывали для отделения микробных тел и фильтрат обрабатывали. Соответствующие методики выбирали, принимая во внимание желательные физические и химические свойства эндопептидаз.

1.2. Определение протеолитических активностей.

Ферментные активности измеряли при различных рН в ацетатном буфере (ацетат аммония - АМАС, конечная концентрация 50 мМ, рН 4,0-8,0; уксусная кислота 20 мМ, рН 3,0) при 37°С в общем объеме 0,2 мл.

Ферментативную активность эндопептидазы определяли посредством измерения степени гидролиза Сукцинил-А1а-А1а-Рго-Рйе-АМС (Амино-Метил-Кумарин) в качестве субстрата (Васйет АС, Наир181га88е 144, 4416 ВиЪепбогГ, 8\\й/ег1апб).

Исходные растворы субстрата получали при концентрации 10 мМ и хранили при -20°С. Субстрат готовили из 10-20 мкл 60% раствора метанола, содержащего 2 мМ Сукцинил-А1а-А1а-Рго-Рйе-АМС и 50150 мкл раствора ацетатного буфера. Реакционная смесь содержала концентрацию 0,2 мМ субстрата, и ферментный препарат (между 10-40 мкл или 1,0 мкг на анализ) в 200 мкл ацетатного буфера при различных значениях рН.

К субстрату, который предварительно нагревали до 37°С в течение 10 мин, добавляли 10-40 мкл ферментного раствора, и реакцию осуществляли при 37°С в течение до 2 часов. Высвобождаемый АМС измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов Ри8юи (Регкш Е1тег ПаПа 8рА, Моп/а, Пайа) при длине волны возбуждения, равной 360 нм, и длине волны эмиссии, равной 460 нм. В качестве контроля, субстрат инкубировали без фермента.

Ферментативную активность для высвобождения 1 ммоль АМС за 1 мин определяли как 1 единицу.

1.3. Очистка эндопептидаз.

Мицелий отделяли от культуральной среды посредством фильтрации на бумаге (Мпас1об1 от Са1Ъюсйет, И8А). Затем, 200 мл супернатанта центрифугировали в течение 10 мин при 5000 об/мин для удаления остатков клеток, далее супернатант дополнительно центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 мин при 4°С для удаления нерастворимой фракции. Белки осаждали из супернатанта этанолом (1:4 об./об.) или насыщением 20-75% сульфата аммония. Сгусток ресуспендировали и диализовали, при необходимости концентрировали с использованием Сепйгсоп Р1и8-70 с пределом пропускания 5 кДа (Мбйроге, ВебГогб, Ма88., И8А). Присутствие протеаз, способных гидролизовать Сукцинил-А1а-А1а-РгоРйе-АМС, проявлялось, когда тестирование проводили при рН 5. Аликвоты суспензии белка после диализа кипятили, чтобы подвергнуть анализу методом остронаправленной МС (шотган). Процедура кипячения является необходимой, чтобы избежать аутолиза. По меньшей мере, было обнаружено 5 белков, принадлежащих семейству протеаз 88/853.

Ресуспендированные белки хроматографировали на ионообменной смоле АтЪег1йе 1КА900 (А1Га Ае8аг СтЪН, КагПгийе, 76185 Сегтапу) или ΌΕ-52-целлюлозе (\УНа1тап 1и1ег. Ыб, Ма1б81опе Епд1апб) или другом матриксе; полученные фракции тестировали на предмет гидролиза Сукцинил-А1а-А1а-Рго- 16 028228

Рйе-ЛМС и выделенные активные фракции подвергали ГО-δΌδ-ΡΑΟΕ и зимографическому анализу.

Белки далее фракционировали посредством гель-фильтрации с пределами пропускания по молекулярной массе, равными 300, 100, 50, 30, 10 кДа (Ыаиокер Ра11, М1сЫ§аи. υδΑ, Υίναδρίη δαΠοπιΐδ ОтЬН 37070 Ооейтдеи, Оегтапу). Их активность тестировали, как описано. Получали активные фракции с различными молекулярными массами. Аликвоты этих фракций кипятили и анализировали посредством анализа остронаправленной МС.

Белки разделяли посредством электрофореза на гомогенном 10% или диск-геле 4-15% или полиакриламидном геле любого типа (Βίο-Раб. Негси1е8, 9640, СА, υδΑ) с последующим окрашиванием Кумасси Бриллиантовым голубым Р-250 (Βίο-Раб) или серебром (δΙΟΜΑ-ΑΜήΛ, υδΑ) или посредством окрашивания ферментной активностью (зимографии), проводимых посредством инкубации геля при 37°С 50-100 мкМ флуоресцентного субстрата Сукцинил-Л1а-Л1а-Рго-РНе-ЛМС при требуемых рН.

Две эндопептидазы, принадлежащие семейству δ8/δ53, очищали до тех пор, пока электрофоретический анализ не показывал присутствие одиночной полосы, обнаруживаемой как посредством окрашивания серебром, так и зимографией.

Первая эндопептидаза была получена после фильтрации по молекулярным массам: она удерживалась при пределе пропускания >100 кДа. Анализ методом остронаправленной МС соответствующей кипяченой аликвоты показал присутствие эндопеп-140, δΕΟ ΙΌ N0: 1 (табл. 1А), с молекулярной массой 142449,4 и теоретическим р1, равным 5,18; были обнаружены следы двух других белков. Эта белковая фракция проявляла активность в интервале рН от 4 до 8 с рН оптимумом, равным 5 (фиг. 2). При тестировании при рН 3 фермент проявлял 95% своей активности при рН 5 через 30 мин инкубации при 37°С (фиг. 3). Эта белковая фракция была в результате более эффективной при расщеплении 33-мера, чем при гидролизе Сукцинил-Α1а-Α1а-Ρ^ο-ΡЬе-ΑМС, как показано в примере 3.

Вторая глютеназа, указанная как эндопеп-40, δΕΟ ΙΌ N0: 2, содержалась в белковой фракции <100 кДа предела пропускания (табл. 1В) с молекулярной массой, равной 39908,4, и теоретическим р1 5,94. Этот белк проявлял активность в интервале рН от 4 до 6 с оптимальным рН, равным 5. При тестировании при рН 3 фермент проявлял 85% своей активности при рН 5 через 30 мин инкубации при 37°С (фиг. 3). Флуоресцентная полоса, высвечиваемая посредством зимографии, показала молекулярную массу, равную приблизительно 40 кДа. Либо активный белок, элюируемый из полосы геля, или концентрат с соответствующим пределом пропускания по молекулярной массе характеризовали на предмет ферментативной активности. Анализ методом остронаправленной МС показал присутствие других белков; сигналы, указывающие на присутствие последовательностей эндопеп-140, могут быть обусловлены присутствием более мелких полипептидов (<100 кДа), образованных при ее разрушении.

Другие три эндопептидазы (указанные как эндопеп-120, δΕΟ ΙΌ N0: 3, эндопеп-60, δΕΟ ΙΌ N0: 4, эндопеп-41, δΕΟ ΙΌ N0: 5) не были очищены до гомогенности. Их присутствие было обнаружено посредством остронаправленной МС в секретоме и в активных фракциях первых стадий очистки. Анализ методом остронаправленной МС, обеспечивший идентификацию их аминокислотной последовательности, изложен здесь. Заявители именовали белки в соответствии с их предполагаемой молекулярной массой. Итак, эндопеп-120 имеет молекулярную массу, равную 112012,8, и теоретический рI 6,75, эндопеп60 имеет молекулярную массу, равную 59646,0, и теоретический рI 6,02, эндопеп-41 имеет молекулярную массу, равную 41646,1, и теоретический рI 5,22.

1.4. МС анализ белка: эксперименты с остронаправленной МС.

В настоящее время протеомные методологии имеют первостепенную важность для исследований, направляемых обнаружением по биомаркерам или исследований по характеризации белка.

Классический протеомный подход основан на двухмерном гель-электрофорезе (2ΌΟ), при котором пятна белка, представляющие интерес, изолируют и идентифицируют посредством масс-спектрометрии (МС). 2И Ο-подход имеет относительно высокое разрешение, которое однако ограничено трудностью обнаружения некоторых классов белков. Эти ограничения включают мембранные белки вследствие их низкой растворимости в буфере для гель-электрофореза, белки либо с низкой (<10 кДа), либо высокой (>200 кДа) молекулярной массой, а также белки с крайней изоэлектрической точкой φΙ <4 или >9). Дополнительное ограничение этого подхода состоит в трудности анализа менее представленных белков и в том, что фактически он является трудоемким и времязатратным.

Эти проблемы решаются с использованием новой протеомной методологии, основанной на двухмерной капиллярной хроматографии, в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (2ДХ-МС/МС), также называемой МибРН (Технология идентификации многомерного белка) (^акйЬигп, М.Р., ^о11ег8 И., Уа1е8 ЕР. 3гб Ьагде-8са1е апаРУ о£ уеа§1 рго!еоте Ьу тиШб1теп8юпа1 рго!ет 1беп0ПсаОоп 1есйпо1о§у №ιί. Вю1есЬпоЬ, 2001, 19, 242-7). Она включает генерацию пептидов в результате ферментативного расщепления сложной белковой смеси, их разделение посредством двух микро-ВЭЖХ колонок и непосредственный анализ элюируемых пиков посредством МС/МС. 2ДХ-МС/МС сочетает ионный обмен с обращенно-фазовым разделением пептидных смесей, получаемых в результате прямого расщепления общего (или префракционированного) белка. В частности, пептидные смеси первоначально разделяют посредством ионообменной хроматографии (колонка δСX, 5 мкм, 0,3 ВД х 150 мм) с использованием семи стадий увеличения концентрации хлорида аммония (от 0 до 1000 мМ). Результат каждой солевой

- 17 028228 стадии непосредственно загружают на колонку с обращенной фазой (С₁₈, 0,180 ВД х 100 мм) и разделяют с использованием градиента ацетонитрила: элюент А, 0,1% муравьиной кислоты в воде; элюент В, 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Пептиды, элюируемые из колонки С₁₈, анализируют непосредственно на масс-спектрометре с ионной ловушкой; предел обнаружения составляет около 10 фмоль или менее. Спектры регистрируют в положительном режиме (обычно в интервале 400-1600 т/ζ), используя динамическую эксклюзию для МС/МС-анализа. Различные протеазы используют для обработки белкового экстракта из образцов (трипсин, пепсин или протеаза К).

Затем получают идентификацию соответствующих белков посредством автоматизированного поиска в базе данных с использованием соответствующего программного обепечения, такого как алгоритм 8ЕфИЕ8Т (Епд, ГК., МсКогтаск, А.Ь., Уа1е8, ГК. Ап Арргоасй 1о Согге1а1е Тапкет Ма88 8рес1га Эа1а оГ Рерйке8 тейй Аттоаак 8е₄иепсе8 ш а Рго1еш Оа1аЪа8е, к Ат. 8ос. Ма88 8рес1гот., 1994, 5, 976-984) для обработки масс-спектров. Полученные экспериментальные масс-спектры коррелируют с пептидными последовательностями, полученными при сравнении с теоретическими масс-спектрами в базе данных белков, загруженной из NСВI (\у\у\у.псЫ.п1т.шй.доу) или других вебсайтов.

1.5. Критерии для идентификации белков.

Идентификации пептидов принимались, если они могли быть установлены с большей чем 90,0% вероятностью, как установлено алгоритмом Рерйке Ргорйе! (Ке11ег А., Nе8ν^ζй8кй А.Ь, Ко1кег Е., АеЪег8о1к К. Ешрйгса1 81аЙ8Йса1 токе1 Ю е8Йта1е ассигасу оГ рерйке 1кепййсайоп8 таке Ъу М8/М8 апк ка1аЬа8е 8еагсй Апа1. Сйет., 2002, 15, 5383-92). Идентификации белков принимались, если они могли быть установлены с большей чем 95,0% вероятностью и содержали по меньшей мере один идентифицированный пептид. Поскольку было обнаружено не более чем 50% идентичности с общедоступными базами данных белков, геном Асйпоа11отиги8 секвенировали и транслировали в 6 возможных рамок считывания. Последовательное выравнивание посредством ВЬА8Т обнаруженных пептидов против предполагаемых белков Асйпоа11отиги8 позволило идентифицировать известные гомологичные белки.

Всего 94 белка были предположительно идентифицированы в секретоме Асйпоа11отиги8. Ферменты составляли из них значительную фракцию, было обнаружено 17 протеолитических ферментов, и были также обнаружены гликозидазы, липазы, кислые фосфатазы и диэстеразы. Никакой функции не могло быть присвоено посредством ВЬА8Т-анализа для 25 последовательностей.

Среди протеаз смогли обнаружить пять белков, принадлежащих семейству пептидаз 88/853, два из которых находились среди наиболее представленных белков.

Такие же анализы осуществляли на всех последующих стадиях очистки, пока не обнаруживались только несколько последовательностей.

Данные, полученные посредством МС-анализа подвергнутых кипячению активных фракций, показали несколько белковых последовательностей, несмотря на то, что на окрашенном серебром геле 8Ό8РАОЕ присутствовала одиночная полоса. Как показано в табл. 1, эндопеп-140 (8Еф ГО N0: 1) и эндопеп40 (8ЕО ГО N0: 2) были обнаружены как белки, ответственные за две описанных активности. Присутствие эндопеп-140 в образце, идентифицированном как <100 кДа, возможно обусловлено частичным разрушением белка на более мелкие полипептиды.

Анализ щ 81Йсо указывал на то, что как эндопеп-140, так и эндопеп-40 представляют собой гликозилированные белки, содержащие сигнальный пептид, приводящий к секреции, позволяя предположить, что они могут продуцироваться как препроферменты.

Анализ ш 81Йсо позволил сгруппировать все пять эндопептидаз в семейство 88/853 и указывал на то, что все они представляют собой гликозилированные белки. Высокая гомология была обнаружена среди эндопеп-140, эндопеп-40 и эндопеп-41 (8Еф ГО N0: 5), позволяя осуществлять их кластерирование в подгруппу, как показано посредством филогенетического дерева фиг. 1. Последовательность сигнального пептида была обнаружена также для эндопеп-60 (8Еф ГО N0: 4), в то время как она отсутствовала в эндопеп-120 (8Еф ГО N0: 3) и эндопеп-41. Филогенетическое дерево, показанное на фиг. 1, выделяет новизну этих глютеназ 88/853, которые не образуют кластера ни с кумамолизином, ни с седолизином, ни с ферментами трипептидил-пептидазы (от 8екА до 8екО), раскрытыми в А0 2011/077359, которые принадлежат к семейству 853.

Новизна этих ферментов была дополнительно подтверждена субстратной специфичностью, как показано в примере 3. Схема разрушения 33-мера, полученная при обработке посредством эндопеп-140 или эндопеп-40, показала эндо-протеолитическую активность.

Пример 2. Продуцирование эндопептидаз в рекомбинантных клетках-хозяевах.

2.1. Штаммы и плазмиды.

В этом исследовании применяли Асйпоа11отиги8 8р. Э8М 24988. Все эксперименты с субклонированием плазмид осуществляли на Е.сой ЭН10В (1пуйгодеп, Саг18Ъак, СА), используя плазмиду рТ257К/Т (Регшейа8, ИАВ, Ьййиаша).

Е8сйепсЫа сой ВЬ21(ОЕ3) 81аг(№уадеп Пайа, Роке^апо, РС) использовали для продуцирования гетерологичных (рекомбинантных) пептидаз.

2.2. Продуцирование рекомбинантных протеаз.

Рекомбинантные протеазы Асйпоа11отиги8 продуцировали и очищали из Е8сйепс1йа сой ВЬ21

- 18 028228 (ЭЕ3) 81аг, используемой в качестве экспрессионной системы.

Для построения штаммов Е.соН, продуцирующих эндопеп-140 и эндопеп-40, нуклеотидные последовательности генов амплифицировали, используя следующие наборы праймеров:

Фэндопеп-140	5 '	'-АААААССГГСАОСТАСАООТОТООТСОО-З’	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	12
Рэндопеп-140	5 '	'-АААААААСАГАГ6ССССАТСТТСССАССС-3’	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	13
Фэндопеп-4 0	5 '	'-АААААССГГСАСААСССТССССТССС-З’	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	14
Рэндопеп-4 0	5 '	'-АААААААСАГАГСТСАССАССССТСАССС-З’	ЗЕО	Ιϋ	ΝΟ:	15

Продукты ПЦР клонировали в вектор ρΤΖ57Κ/Τ и секвенировали перед клонированием в экспрессионный вектор для подтверждения того, что во время амплификации ПЦР не было введено никакой мутации.

Затем эндопеп-гены клонировали в сайты №е1-НткШ плазмиды рЕТ28Ь (Хохадеп) и трансформировали в экспрессионного хозяина ВЬ21(рЕ3) 81аг.

Трансформированные клетки выращивали в культурах объемом 50 мл со средой ЬВ, содержащей 30 мкг/мл канамицина, при 37°С до достижения 0Ό600, равной 0,6-1. Экспрессию глютеназ индуцировали добавлением 0,2 мкМ изопропил β-ϋ-тиогалактозида (81дта), и культуры далее инкубировали при 22°С в течение ночи. Как показано на фиг. 4, получали белковые полосы, соответствующие требуемой молекулярной массе эндопеп-140 и эндопеп-40.

2.3. Очистка гетерологически продуцированных эндопептидазы(аз).

Клетки, экспрессирующие рекомбинантные эндопептидазы, центрифугировали при 5000 д в течение 20 мин. Сгусток ресуспендировали в 8 мл буферного раствора (20 мМ фосфата натрия, 500 мМ №С1, рН 7,8), затем добавляли 1 мг/мл лизоцима для полного лизиса клеток. Ηίδ-меченные белки очищали из неочищенных клеточных экстрактов посредством аффинной хроматографии с иммобилизованным №²+, используя систему для очистки №-ХТА Рипйсайоп 8уз1ет (1пуйгодеп) в соответствии с инструкциями производителя. Аликвоты по пять микролитров элюированных фракций мигрировали через 8О8-РАОЕ и окрашивались кумасси голубым или серебром для подтверждения присутствия и степени чистоты экспрессированных эндопептидаз. Фиг. 4 показывает уровни экспрессии, полученные для эндопеп-140 и эндопеп-40 после индукции в сравнении с неиндуцированным контрольным штаммом.

Ферментативную активность общих экстрактов, полученных из штаммов Е.соН, трансформированных пустым рЕТ28Ь и рЕТ28Ь-эндопеп-140 или рЕТ28Ь-эндопеп-40, соответственно, тестировали с Сукцинил-А1а-А1а-Рго-РНе-АМС в качестве субстрата.

Ферментативная активность была обнаружена в экстрактах из штаммов рЕТ28Ь-эндопеп, в то время как отрицательный контроль не проявил никакой активности.

Пример 3. Биологическая активность эндопептидаз.

3.1. Разрушение 33-мерного токсичного пептида глиадина при кислотном рН.

Раствор 33-мерного иммунотоксичного пептида глиадина (50 мкМ) инкубировали при 37°С в течение времени до 2 часов в присутствии 4 мкЕд эндопеп-140 или 2 мкЕд эндопеп-40 в присутствии или отсутствии пепсина 1 мг/мл. Реакцию осуществляли в уксусной кислоте 20 мМ рН 3, при общем объеме 300 мкл. Мониторинг реакции проводили в различные моменты времени от 0 до 120 мин (10, 13, 115, 130, 160 и 1120 мин) при 37°С. Исчезновение 33-мерного пептида и появление продуктов разрушения регистрировали посредством ВЭЖХ-МС-анализа. Отбирали аликвоты по 50 мкл, и активность ферментов останавливали с помощью смеси 50 мкл Н₂0: СΗзСN 50:50 (+0,1% муравьиная кислота). Образцы подвергали ВЭЖХ-МС, анализировали на масс-спектрометре 1,Т()-Х1, (ТНегто ПзНег 8шепййс, 8ап 1озе, Сай&гша, И8А). Профили ВЭЖХ-МС, полученные для эндопеп-140, эндопеп-140 и пепсина, пепсина по отдельности, приведены на Фигурах 5, 6, 7, соответственно. Исчезновение 33-мерного пептида было очевидным после 2 ч инкубации. Все пептиды, обнаруженные после инкубации 33-мерного пептида с 4 мкл эндопеп140, или 2 мкл эндопеп-40, приведены в табл. 2 и 3, соответственно.

После 2 ч инкубации наблюдаемый наиболее интенсивный пик имеет статус заряда, равный 1, и соответствует [МН]+ 748,4, указывая на присутствие малых пептидов. Этот сигнал также появляется первым. На основании 33-мерной последовательности, четыре (1-6, 8-13, 15-20, 22-27) пептида соответствуют этой молекулярной массе, причем все составлены из 6 остатков. В соответствии с МС анализом расщепленного 33-мера, остатки глутаминовой кислоты вместо остатков глутамина присутствуют в гидролизованной пептидной последовательности, таким образом, позволяя предположить деамидирование субстрата. Анализ показал, что после 2 часов инкубации 33-мера с пепсином гидролиз почти не наблюдался (фиг. 7 и табл. 2 и 3) в соответствии с литературными данными.

Увеличение количества эндопеп-140 вплоть до 8 мкЕд или эндопеп-40 до 9 мкЕд приводило в результате к полному исчезновению 33-мера через 2 ч при рН 3 (не показано).

Даже в присутствии пепсина наблюдается такая же схема разрушения, несмотря на то, что количество интактного пептида через 2 ч является более высоким, чем в его отсутствие, позволяя предположить, что эндопептидазы не разрушаются под действием пепсина.

- 19 028228

3.2. Анализ ВЭЖХ/МС.

Анализ ВЭЖХ осуществляли, используя масс-спектрометр с ионной ловушкой. ЬТЦ-ХЬ или АПуаШаде, присоединенный к насосу Ассе1а или §игуеуог (ТПегтойвПег §с1епййс, §ап 1ове, СА, и§А) применяли при характеризации гидролизатов ферментного белка, полученных под действием ферментной смеси. Пептиды разделяли, используя колонку ТПегтойвПег §с1епййс НурегвП до1П или колонку симметрии С18 (Ща1егв, МйГогП, Мавв., и§А) в сочетании с градиентом 0,1% муравьиной кислоты в воде М1Ш О (МПИроге, ВеПГогП, Мавв., и§А) (Раствор А) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (раствор В) для элюирования. Градиент начинался при 95% раствора А и возрастал до 60% раствора В. Подробную информацию по индивидуальным пептидам, получали используя скан-зависимый МС/МС алгоритм, который является характеристическим алгоритмом для масс-спектрометра с ионной ловушкой. Анализ полного сканирования сопровождался анализом в увеличенном масштабе для определения состояния заряда наиболее интенсивного иона в диапазоне масс при полном сканировании. 33-мер (М=3910) применяли для настройки на оптимальную чувствительности в МС-режиме и на оптимальную фрагментацию в режиме МС/МС, осуществляя постоянную инфузию 60 мкг/мл, что приводило в основном к двухзарядным и трехзарядным типам ионов в режиме МС, и оптимальной энергии столкновения около 35% в режиме МС/МС.

Пример 4. Биологическая активность эндопептидаз.

4.1. Разрушение гидролизованной смеси глиадина и глютена.

Благодаря специфичному структурному признаку пролилолигопептидазы не могут расщеплять крупные пептиды, обычно длинее 30 аминокислот. Также, трипептидил-протеаза седолизин не может гидролизовать глиадин без добавления пролилпротеазы. Это ограничение является очевидным недостатком для фермента, значение которого состоит в том, чтобы гидролизовать настолько быстро и настолько эффективно, насколько возможно все потенциальные токсичные пролин-обогащенные пептиды.

Эндопеп-140 и эндопеп-40 из АсйпоаПотигив инкубировали с глиадинами, чтобы увидеть, способны ли эндопротеазы АсйпоаПотигив расщеплять цельные белки. Образованные продукты гидролиза анализировали посредством §0§-РЛСЕ.

Раствор глиадина получали растворением глиадинового порошка (§1дта С3375) в 70% этаноле при 70°С при концентрации 10 мг/мл (20 мкМ). Интактные молекулы глиадина состоят из смеси белков с 4055 кДа. Глиадин инкубировали при 37°С с 10 мкл (5 мкЕд) эндопротеаз АсйпоПотигив в уксусной кислоте 20 мМ рН 3 в конечном объеме 0,3 мл. Реакции осуществляли в ТПегтот1хег (ЕррепПогГ АС, НатЬигд, Сеггтапу) как в отсутствие, так и в присутствии пепсина при 1 мг/мл (фиг. 8). Мониторинг реакций проводили при различных интервалах времени, 30 мкл образцов отбирали из инкубационной смеси при значениях времени 0, 30 мин, 1 и 2 ч и выдерживали при 4°С до §И§-РАОЕ. Все материалы, используемые для §И§-РАСЕ и окрашивания, были приобретены от Вю-РаП (Вю-РаП ЬаЬогаФйев, 1пс., Негси1ев, СА, и§А). Образцы готовили, используя буфер для образцов, в соответствии с инструкциями изготовителя и разделяли на любом типе гелей В1в-Тйв, применяя буферную систему §Ό§ в соответствии с инструкциями изготовителя. Окрашивание осуществляли, используя Кумасси Р250 или серебро.

Как можно видеть на фиг. 8, глиадин расщепляется под действием эндопептидаз, производимых Асйпо11отигив, на небольшие пептиды до почти полного расщепления за 2 ч. Распад продукта можно видеть по снижению интенсивности полосы на §И§-геле. Этот эксперимент также показывает, что пепсин не оказывает воздействия на эффективность расщепления.

- 20 028228

Таблица 1

Предполагаемые белки, очищенные из секретома Асйпоа11отиги§

А

БелокЫ	ВЬА8Т учетный номер	ВЬА8Т аннотация	ГСредняя	примечания

8ец 48773	ΥΡ_003835151.1	Пептидаза 88/853	101,9	Эндопеп-140
5ец_100531	0Ь]1ВА132040.1	предполагаемая липаза	20,2
8ед_293141	н.р.	н.р.	10,14

В

БелокЫ	ВЬА8Т учетный номер	ВЬА8Т аннотация	ГСредняя	примечания

8ец_44766	ΖΡ_06921971.1	секретируемый белок	40,14
8еч_72108	¥Р_003114375.1	Пептидаза 88/853	30,25	Эндопеп-40
8ед_48773	ΥΡ_003835151.1	Пептидаза 88/853	20,15	Эндопеп-140

3ец_293141

н.р.

10,15

Очищенные фракции из Ас1тоа11отиги§ отфильтровывали с пределом пропускания молекулярной массы, равным 100 кДа, и подвергали анализу методом остронаправленной МС. Идентифицированные пептиды выравнивали против белков, полученных вследствие трансляции генома Ас1тоа11отига§ (Белок _1й: внутренний код для последовательности предполагаемого белка), и последовательный анализ ш §Шсо посредством ВЬА8Т свидетельствовал о гомологе известного белка (учетный номер ВЬА8Т: код последовательности; аннотация ВЬА8Т: название белка; н.р.: нет результата). Число совпадающих спектров давало полуколичественную меру оценки количеств белка, указанную как частота (Р_средняя). А: данные, полученные по фракции >100 кДа; В: данные, полученные по фракции <100 кДа.

- 21 028228

Таблица 2

Пептиды, высвобождаемые при расщеплении 33-мера эндопеп-140

1 5	10	15	20	25 30
ь (Η ОР	Р р ОР ОЬ Р	Υ Р () Р	() Ь Ρ Υ Р	()Ρ(ΗΡΥΡ()Ρ(3ΡΡ

Время инкубации	Массовый сигнал	Зарядный статус	Выведенная пептидная последовательность	Примечания

Т_о	1306,27; 1956,64	3 [М-ЗН^]+; 2 [М-2ч.]⁺	1-33	100% остаточные

Т₃₀	1088,73	1 [МН]⁺	25-33
1197,45	1 [МН]⁺	1-10
748,45	1 [МН]⁺	1-6; 8-13; 15-20; 22-27
1306,27; 1956,64	3 [М-ЗН^]+; 2 [М-2ч.]⁺	1-33	50% остаточные

Тзо + пепсин	1088,73	1 [МН]⁺	25-33
1197,45	1 [МН]⁺	1-10
748,45	1 [МН]⁺	1-6; 8-13; 15-20; 22-27
1306,27; 1956,64	3 [М-ЗН^]+; 2 [М-2ч.]⁺	1-33	70% остаточные

Т_2ч	1088,73	1 [МН]⁺	25-33
1197,45	1 [МН]⁺	1-10
748,45	1 [МН]⁺	1-6; 8-13; 15-20; 22-27	Наиболее интенсивный пик
1068,24	1 [МН]⁺	16-24
845,27	1 [МН]⁺	1-7	следы
1306,27; 1956,64	3 [М-ЗН^]+; 2 [М-2ч.]⁺	1-33	20% остаточные

Т_2ч + пепсин	1088,8	1 [МН]⁺	25-33
1197,45	1 [МН]⁺	1-10
748,45	1 [МН]⁺	1-6; 8-13; 15-20; 22-27
1068,24	1 [МН]⁺	16-24
845,27	1 [МН]⁺	1-7
1306,27; 1956,64	3 [М-ЗН^]+; 2 [М-2ч.]⁺	1-33	45% остаточные

Контроль т_2ч	1306,27; 1956,64	3 [М-ЗН^]+; 2 [М-2ч.]⁺	1-33	95% остаточные

Все молекулярные массы, обнаруживаемые посредством ВЭЖХ-МС после расщепления 33-мерного глиадинового пептида (50 мкМ) 4 мкЕд эндопеп-140 в присутствии и в отсутствие пепсина (1 мг/мл). Контроль получают посредством инкубации 33-мера с пепсином по отдельности. Инкубация при 37°С, уксусная кислота 20 мМ, рН 3.

- 22 028228

Таблица 3

Пептиды, высвобождаемые при расщеплении 33-мера эндопеп-40

1 5	10	15	20	25	30
ь 0 ь Э р	Р Р э Р О Ь Р	γ р Э р	Э ь р γ р	Э р 0 ь р γ р	Э р Э р р

Время инкубации	Массовый сигнал	Зарядный статус	Выведенная пептидная последовательность	примечания

Т_о	1306,27; 1956,64	3 [М-ЗН^]+; 2 [М-2ч,]⁺	1-33	100% остаточные

Тзо	1197,45	1 [МН]⁺	1-10
1088,73	1 [МН]⁺	25-33
748,45	1 [МН]⁺	1-6; 8-13; 15-20; 22-27
1306,27; 1956,64	3 [М-ЗН^]+; 2 [М-2ч,]⁺	1-33	50% остаточные

Тзо + пепсин	1088,73	1 [МН]⁺	25-33
1197,45	1 [МН]⁺	1-10
748,45	1 [МН]⁺	1-6; 8-13; 15-20; 22-27
1306,27; 1956,64	3 [М-ЗН^]+; 2 [М-2ч,]⁺	1-33	70% остаточные

Т_2ч	1088,73	1 [МН]⁺	25-33
1197,45	1 [МН]⁺	1-10
748,45	1 [МН]⁺	1-6; 8-13; 15-20; 22-27
1306,27; 1956,64	3 [М-ЗН^]+; 2 [М-2ч,]⁺	1-33	20% остаточные

т_2ч + пепсин	1088,8	1 [МН]⁺	25-33
1197,45	1 [МН]⁺	1-10
748,45	1 [МН]⁺	1-6; 8-13; 15-20; 22-27
1306,27; 1956,64	3 [М-ЗН^]+; 2 [М-2ч,]⁺	1-33	30% остаточные

Контроль Т_2ч	1306,27; 1956,64	3 [М-ЗН^]+; 2 [М-2ч,]⁺	1-33	95% остаточные

Все молекулярные массы, обнаруживаемые посредством ВЭЖХ-МС после расщепления 33-мерного глиадинового пептида (50 мкМ) 2 мкЕд эндопеп-40 в присутствии и в отсутствие пепсина (1 мг/мл) при различных интервалах времени. Контроль получают посредством инкубации 33-мера с пепсином по отдельности. Инкубация при 37°С, уксусная кислота 20 мМ, рН 3.

- 23 028228

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Ροπόαζίοηθ 1зЕ1ЕиЕо 1пзиЬг1со Ы КЪсегса рег 1а 71;а (Ρΐΐκν) <120> НОВЫЕ ПРОТЕАЗЫ ИЗ АКТИНОМИЦЕТА АсттыоАььомикиз, СПОСОБНЫЕ ГИДРОЛИЗО-

ВАТЬ ГЛЮТЕНОВЫЕ ПЕПТИДЫ	И БЕЛКИ ПРИ КИСЛОТНОМ РН
<130>	072110
<160>	15
<170>	РаЕепЕ1п иегз1оп	3.5
<210> <211> <212> <213>	1 1390 БЕЛОК АсЕ1поа11отигиз
<220> <221> <222>	РКОРЕР (1)..(1390)
<400>	1

МеЕ 1

Рго

Азр

Ьеи

Рго 5

ТЬг

О1п Агд

Агд

Бег 10

Рго

Агд

Бег

Агд 15

Агд

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

А1а

О1у

Ьеи

Агд

Уа1

О1у

А1а

Ьеи

Уа1

20

25

30

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

11е

Бег

МеЕ

Рго

Бег

А1а

35

40

45

Азп

А1а

Рго

А1а

Ьуз

Рго

Уа1

Рго

Н1з

А1а

Ьуз

А1а

Бег

50

55

60

Рго

ТЬг

А1а

О1п

О1у

О1п

Н1з

Рго

ТЬг

Бег

Агд

Уа1

Суз

Агд

ТЬг

Рго

65

70

75

80

О1у

Агд

А1а

Азп

О1и

МеЕ

ТЬг

Суз

Ьеи

А1а

МеЕ

Уа1

Агд

Азр

Уа1

85

90

95

11е

О1у

Рго

Ьуз

О1у

Уа1

О1п

А1а

Азп

Азр

А1а

Рго

А1а

О1у

РЬе

О1у

100

105

110

Рго

А1а

Азр

Ьеи

Азп

А1а

Туг

Азп

Ьеи

Рго

Бег

А1а

О1у

Бег

ТЬг

115

120

125

О1и

ТЬг

Уа1

А1а

11е

Уа1

Азр

А1а

РЬе

Азр

Азп

Рго

Азп

А1а

О1и

А1а

130

135

140

Азр

Ьеи

О1у

Уа1

Туг

Агд

О1п

Туг

О1у

Ьеи

Рго

А1а

Суз

ТЬг

145

150

155

160

- 24 028228

А1а

Азп О1у Суз

РЬе 165

Ьуз

11е

Азр

О1п Агд 170

О1у

ТЬг

Зег 175

Туг

Рго

Азр

А1а

О1у

Тгр

А1а

О1у

О1и

11е

А1а

Ьеи

Азр

11е

Азр

180

185

190

МеЕ

Уа1

Зег

А1а

11е

Суз

Рго

ТЬг

Суз

Ьуз

11е

Ьеи

Уа1

О1и

А1а

195

200

205

Азр

Азп

Туг

МеЕ

Азр

Азп

Ьеи

О1у

ТЬг

А1а

Уа1

Азп

О1п

А1а

Уа1

210

215

220

Зег

С1п

С1у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

Зег

Азп

Зег

Туг

О1у

Зег

О1и

О1у

225

230

235

240

Зег

Азр

О1и

О1у

О1п

А1а

Азр

А1а

Туг

РЬе

Н1з

Азр

О1у

Уа1

245

250

255

А1а

11е

ТЬг

А1а

Зег

О1у

Азр

Зег

О1у

Туг

О1у

А1а

Зег

Туг

Рго

260

265

270

А1а

Зег

Рго

Туг

Уа1

ТЬг

Зег

Уа1

О1у

ТЬг

Зег

Ьеи

А1а

Ьуз

275

280

285

Азр

ТЬг

Зег

Агд

О1у

Тгр

ТЬг

О1и

Зег

ТЬг

Тгр

Азп

О1у

А1а

290

295

300

О1у

Зег

О1у

Суз

Зег

А1а

Туг

О1и

ТЬг

Ьуз

Рго

Зег

РЬе

О1п

Ьуз

Азр

305

310

315

320

ТЬг

С1у

Суз

А1а

Агд

ТЬг

11е

А1а

Азр

Уа1

Зег

А1а

Уа1

А1а

Азр

325

330

335

Рго

Азп

ТЬг

О1у

Уа1

А1а

Уа1

Туг

Азп

О1у

Тгр

Н1з

Уа1

Туг

О1у

340

345

350

О1у

ТЬг

Зег

Уа1

Зег

А1а

Рго

11е

А1а

Зег

Уа1

Туг

А1а

Ьеи

О1у

355

360

365

О1у

А1а

Рго

А1а

О1у

Зег

А1а

Рго

Азп

Зег

РЬе

Рго

Туг

Азр

Н1з

370

375

380

Рго

А1а

Азр

Ьеи

Азп

Азр

Уа1

ТЬг

Зег

О1у

Зег

Азп

О1у

Зег

Суз

Зег

385

390

395

400

Рго

А1а

Туг

Ьеи

Суз

ТЬг

А1а

О1у

ТЬг

О1у

Туг

Азр

О1у

Рго

ТЬг

О1у

- 25 028228

405 410 415

Ьеи

О1у

ТЬг

Рго 420

Азп О1у

11е

А1а А1а 425

РЬе

Агд

Зег

О1у

Рго 430

Н1з

А1а

Уа1

ТЬг

О1у

ТЬг

Уа1

ТЬг

Азр

О1у

ТЬг

А1а

Рго

Ьеи

А1а

Зег

А1а

435

440

445

О1п

Уа1

Ьуз

А1а

О1у

Азр

Уа1

ТЬг

А1а

ТЬг

Азр

О1у

О1п

О1у

Н1з

450

455

460

Туг

ТЬг

Ьеи

Зег

Уа1

Рго

О1у

ТЬг

Туг

Азр

Уа1

Зег

А1а

Зег

Ьуз

465

470

475

480

РЬе

О1у

Туг

ТЬг

О1у

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

О1у

Уа1

О1п

Уа1

А1а

Азр

О1у

485

490

495

О1п

ТЬг

Уа1

ТЬг

О1и

Азр

РЬе

А1а

Ьеи

ТЬг

А1а

Ьуз

А1а

Агд

Уа1

Азр

500

505

510

ναι

Зег

О1у

Ьеи

Уа1

Агд

Азр

О1у

Зег

О1у

Н1з

О1у

Тгр

Рго

Уа1

Туг

515

520

525

А1а

ТЬг

Уа1

Агд

Уа1

Ьуз

Азр

О1п

Рго

ТЬг

А1а

Уа1

А1а

Туг

ТЬг

Азр

530

535

540

Рго

Ьуз

ТЬг

О1у

Агд

Туг

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

ТЬг

Азр

ТЬг

Туг

545

550

555

560

ТЬг

Ьеи

О1п

Уа1

Азр

Рго

Ьеи

Туг

Рго

О1у

Туг

ТЬг

О1п

Азр

Зег

Н1з

565

570

575

Азр

Уа1

ТЬг

Уа1

ТЬг

Зег

А1а

Азр

Уа1

Н1з

Азр

Уа1

Азп

Уа1

А1а

580

585

590

ναι

Азр

О1п

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Рго

О1у

Туг

Зег

Туг

Н1з

Туг

А1а

595

600

605

О1у

А1а

ТЬг

О1п

Рго

РЬе

Азр

О1у

ТЬг

А1а

Рго

А1а

О1у

Тгр

ТЬг

610

615

620

ναι

Азр

Ьуз

Уа1

О1у

Азп

О1у

О1п

ТЬг

Тгр

Уа1

РЬе

Азп

Азр

Рго

625

630

635

640

О1у

Зег

Агд

О1у

Азп

Ьуз

ТЬг

О1у

ТЬг

О1у

РЬе

А1а

Уа1

11е

645 650 655

- 26 028228

Азр

Зег

Азр

Н1з 660

Туг

О1у Зег

О1у

Азп ТЬг О1п Азр 665

Зег

ТЬг 670

Ьеи

РЬе

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Азр

РЬе

Зег

А1а

Агд

ТЬг

Н1з

Рго

11е

Ьеи

Зег

РЬе

675

680

685

Агд

Зег

Азр

Тгр

Туг

О1у

Туг

ТЬг

О1у

О1п

А1а

О1у

Азр

Ьеи

Азр

Ьеи

690

695

700

Зег

Уа1

Азр

О1у

ТЬг

Тгр

ТЬг

Азп

Ьеи

Ьуз

Н1з

Туг

ТЬг

А1а

705

710

715

720

Зег

О1и

Агд

О1у

Рго

Агд

ТЬг

О1и

ТЬг

МеБ

Азр

Ьеи

Зег

А1а

725

730

735

О1у

Ьуз

Зег

А1а

Уа1

О1п

Уа1

Агд

РЬе

Н1з

РЬе

ТЬг

О1у

Ьуз

РЬе

О1у

740

745

750

Туг

Тгр

О1п

Уа1

Азр

Уа1

РЬе

Ьеи

О1у

Азр

Агд

ТЬг

Суз

Азр

755

760

765

Рго

ТЬг

Зег

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

О1п

Уа1

ТЬг

Азр

А1а

Азп

ТЬг

770

775

780

О1у

А1а

О1у

Уа1

А1а

О1у

А1а

ТЬг

Уа1

ТЬг

Зег

Уа1

Азр

Агд

Рго

А1а

785

790

795

800

О1и

Ηΐ3

А1а

ТЬг

Зег

А1а

ТЬг

Рго

Азр

Рго

Азп

Ьеи

О1у

Азр

805

810

815

О1у

Ьеи

РЬе

Тгр

МеБ

РЬе

Зег

Уа1

ТЬг

О1у

Зег

Н1з

Ьуз

РЬе

ТЬг

820

825

830

А1а

ТЬг

А1а

О1у

Азп

Туг

Азр

Зег

Н1з

Азр

Уа1

ТЬг

Уа1

Азп

Уа1

А1а

835

840

845

А1а

Азп

Тгр

А1а

ТЬг

А1а

Азр

11е

А1а

Ьеи

Зег

А1а

Рго

Агд

Ьеи

850

855

860

ТЬг

Уа1

ТЬг

Рго

О1у

А1а

11е

Зег

Ьуз

ТЬг

Уа1

О1у

Тгр

О1п

Ьуз

А1а

865

870

875

880

А1а

ТЬг

А1а

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Азп

ТЬг

О1у

ТЬг

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

885

890

895

А1а

Ьуз

11е

О1у

О1и

О1п

Рго

О1у

Зег

ТЬг

А1а

ТЬг

А1а

О1у

900

905

910

- 27 028228

А1а

Рго

Ьеи 915

О1п Агд

Уа1

Ьуз

О1у Азр 920

РЬе

А1а

Зег О1у Агд 925

Ьеи

О1п

О1у

Ьуз

А1а

Зег

О1у

А1а

Ьуз

А1а

О1у

Уа1

ТЬг

Рго

Туг

А1а

Рго

930

935

940

Рго

Тгр

ТЬг

А1а

11е

А1а

Азр

Туг

А1а

Зег

Рго

11е

МеЬ

Азр

Азп

О1у

945

950

955

960

А1а

Уа1

А1а

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

11е

Туг

Зег

Уа1

А1а

О1у

Уа1

Азр

О1у

965

970

975

А1а

Азп

Уа1

Ьеи

Азп

Ьуз

А1а

Туг

А1а

Туг

Азр

Рго

О1у

ТЬг

О1п

А1а

980

985

990

Тгр ТЬг А1а 11е А1а Рго Ьеи А1а ТЬг О1у Агд О1и А1а Рго О1п А1а 995 1000 1005

ТЬг ТЬг

ТЬг

О1у О1у

Ьуз

Ьеи 1015

Туг Уа1

ТЬг

О1у

О1у 1020

Тгр

О1у

Зег

1010

ТЬг

О1у

А1а

Уа1

А1а

Ьуз

ТЬг

О1и

11е

РЬе

Азр

Рго

Зег

1025

1030

1035

О1у

А1а

Тгр

Зег

А1а

О1у

А1а

Азр

Азп

Рго

Ьуз

Рго

Туг

А1а

О1у

1040

1045

1050

Зег

О1у

А1а

Уа1

Ьеи

Азр

О1у

Ьуз

11е

Туг

Уа1

О1у

1055

1060

1065

Суз

Ьеи

А1а

ТЬг

Суз

О1у

ТЬг

Ьуз

Азр

Уа1

О1п

Уа1

Туг

Азр

Рго

1070

1075

1080

А1а

Азп

Зег

Тгр

Зег

О1у

Рго

А1а

Туг

Рго

О1и

Азп

ТЬг

1085

1090

1095

А1а

Тгр

Ьеи

О1у

Суз

А1а

О1у

11е

Азр

О1у

Ьуз

Ьеи

Туг

Суз

А1а

1100

1105

1110

О1у

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

Н1з

О1у

Туг

Уа1

Ьеи

Азр

1115

1120

1125

Рго

А1а

Зег

О1у

ТЬг

Тгр

Зег

Рго

11е

А1а

Азр

Ьеи

Рго

11е

Азр

1130

1135

1140

Ьеи

Тгр

А1а

МеЁ

О1у

Туг

Зег

А1а

Азп

О1у

Ьуз

Ьеи

11е

Уа1

1145 1150 1155

- 28 028228

Зег

О1у 1160

О1у Уа1

ТЬг

Азп

О1у 1165

А1а

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг 1170

Азп

О1п

О1у

РЬе

А1а

Туг

Азр

Рго

Зег

А1а

Азп

Зег

Тгр

ТЬг

А1а

Ьеи

Рго

Азп

1175

1180

1185

Зег

Азп

А1а

Ьеи

Туг

Агд

О1у

А1а

Зег

А1а

Суз

О1у

РЬе

Туг

1190

1195

1200

Ьуз

11е

О1у

Зег

Ьеи

О1у

О1п

РЬе

Азп

А1а

Уа1

Ьуз

Зег

О1у

1205

1210

1215

О1и

Уа1

Ьеи

Рго

О1у

Туг

Азр

О1п

Суз

А1а

Зег

ТЬг

А1а

Азр

Уа1

1220

1225

1230

Рго

Тгр

Ьеи

Зег

О1и

Азр

Ьуз

ТЬг

О1и

Уа1

ТЬг

11е

О1п

Рго

О1у

1235

1240

1245

О1п

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Азп

Уа1

ТЬг

Ьеи

Азр

А1а

Азп

Уа1

Рго

А1а

1250

1255

1260

11е

ТЬг

О1п

Рго

О1у

ТЬг

Туг

ТЬг

А1а

О1п

Ьеи

ТЬг

Уа1

О1у

А1а

1265

1270

1275

Ьуз

ТЬг

Рго

Туг

А1а

11е

Рго

Уа1

А1а

Уа1

ТЬг

МеЬ

ТЬг

Уа1

1280

1285

1290

Азп

Рго

О1у

ТЬг

Тгр

О1у

Ьуз

11е

ТЬг

О1у

ТЬг

Ьеи

ТЬг

О1у

1295

1300

1305

А1а

О1у

Суз

ТЬг

О1у

Зег

Рго

А1а

Рго

Ьеи

ТЬг

О1у

А1а

ТЬг

Ьеи

1310

1315

1320

О1п

11е

Азр

Зег

Тгр

А1а

Зег

Туг

ТЬг

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Азр

Ьуз

1325

1330

1335

Азп

О1у

О1п

Туг

А1а

Ьеи

Тгр

Ьеи

Азр

Уа1

Агд

Азп

Рго

Ьеи

1340

1345

1350

ТЬг

Ьеи

11е

А1а

Ьуз

Азр

О1у

Тгр

А1а

Рго

О1п

ТЬг

Агд

Азп

1355

1360

1365

Уа1

Ьуз

11е

ТЬг

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Зег

ТЬг

А1а

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

1370

1375

1380

Ьуз

Рго

Азр

Нгз

ТЬг

Суз

Зег

- 29 028228

1385 1390
<210>	2
<211>	398
<212>	БЕЛОК
<213>	АсЁ1поа11отигиз зр.

<220>

<221> РКОРЕР <222> (1)..(398) <400> 2

МеЁ 1

Зег Агд Агд

Уа1 5

ТЬг

О1у

ТЬг

11е

Ьеи О1у О1у Ьеи 10

11е

Ьеи 15

А1а

МеЁ

Уа1

Рго

РЬе

Ьеи

Зег

ТЬг

А1а

Азп

А1а

Рго

О1п

А1а

20

25

30

Рго

А1а

Зег

Уа1

Зег

Ηΐ3

Рго

РЬе

Н1з

Зег

Суз

А1а

ТЬг

Уа1

Ьуз

35

40

45

Рго

О1у

Агд

А1а

Зег

Суз

Азп

А1а

Ьеи

Уа1

Агд

Зег

Азр

11е

А1а

О1п

50

55

60

Зег

А1а

ТЬг

Ьеи

А1а

Ηΐ3

О1п

А1а

Рго

Зег

О1у

Ьеи

Зег

65

70

75

80

Рго

А1а

Азп

Ьеи

О1п

Зег

А1а

Туг

Ьуз

Ьеи

Рго

Зег

ТЬг

А1а

О1у

85

90

95

Зег

О1у

О1п

ТЬг

Уа1

А1а

11е

Уа1

Азр

А1а

Туг

Азр

А1а

Рго

ТЬг

А1а

100

105

110

О1и

А1а

Азр

Ьеи

Азп

Уа1

Туг

Агд

Зег

О1п

РЬе

О1у

Ьеи

О1у

А1а

Суз

115

120

125

ТЬг

А1а

Азп

О1у

Суз

РЬе

Ьуз

Уа1

Азр

О1п

Азп

О1у

ТЬг

130

135

140

Зег

Туг

Рго

Агд

Ьуз

Азр

О1у

Тгр

А1а

О1п

О1и

11е

Зег

Ьеи

Азр

145

150

155

160

Ьеи

Азр

МеЁ

Уа1

Зег

А1а

Уа1

Суз

Рго

Азп

Суз

Ьуз

11е

Уа1

Ьеи

Уа1

165

170

175

О1и

А1а

Ьуз

ТЬг

Азп

Зег

РЬе

А1а

Азп

Ьеи

О1у

ТЬг

А1а

О1и

Азп

ТЬг

180

185

190

- 30 028228

А1а А1а

Зег Ьеи А1а 195

Азп Уа1

11е 200

Зег Азп Зег Туг О1у 205

О1у

Зег

Азр

А1а

Зег

Азр

А1а

Зег

Туг

О1у

Зег

Туг

Азп

Н1з

Рго

О1у

Ьуз

А1а

210

215

220

11е

ТЬг

Уа1

Зег

О1у

Азр

А1а

О1у

Туг

О1у

Уа1

О1и

Туг

Рго

А1а

225

230

235

240

Зег

Ηΐ3

Туг

Уа1

ТЬг

А1а

Уа1

О1у

ТЬг

Зег

Ьеи

Агд

ТЬг

А1а

245

250

255

Зег

ТЬг

Зег

Агд

О1у

Тгр

Зег

О1и

ТЬг

А1а

Тгр

Зег

О1у

А1а

О1у

Зег

260

265

270

О1у

Суз

Зег

А1а

Туг

Азп

ТЬг

А1а

Ьеи

Зег

О1у

О1п

Зег

О1у

Ьеи

ТЬг

275

280

285

О1у

Суз

Зег

Агд

А1а

Уа1

А1а

Азр

Уа1

Зег

А1а

Уа1

А1а

Азр

Рго

290

295

300

А1а

ТЬг

О1у

Уа1

А1а

Уа1

Туг

Азр

Зег

ТЬг

А1а

Туг

О1п

О1у

О1п

Зег

305

310

315

320

О1у

Тгр

МеЬ

Уа1

РЬе

О1у

ТЬг

Зег

Уа1

А1а

Рго

11е

О1у

325

330

335

О1у

Уа1

Туг

О1у

Ьеи

А1а

Азп

А1а

Зег

11е

Азр

Азп

Туг

340

345

350

Рго

Туг

А1а

Ηΐ3

ТЬг

Зег

Ьеи

РЬе

Азр

Уа1

ТЬг

Зег

О1у

Зег

Азп

355

360

365

О1у

ТЬг

Суз

ТЬг

Ьуз

Тгр

Суз

ТЬг

А1а

О1у

ТЬг

О1у

Тгр

Азр

370

375

380

О1у

Рго

ТЬг

О1у

Ьеи

О1у

ТЬг

Рго

Азп

О1у

ТЬг

О1у

А1а

РЬе

385 390 395 <210> 3 <211> 1094 <212> БЕЛОК <213> АсЬ1поа11отигиз <220>

<221> РКОРЕР

<222>	(1).	.(1094
<400>	3

- 31 028228

МеЁ 1

Зег

А1а

А1а Уа1 5

Уа1

11е

РЬе

А1а

О1у А1а 10

Рго

А1а ТЬг

А1а 15

А1а

Рго

ТЬг

Рго

О1и

О1у

Зег

О1у

Агд

ΗΪ8

Тгр

ТЬг

А1а

ТЬг

Рго

Ьеи

Зег

20

25

30

О1у

ТЬг

Уа1

О1п

О1у

РЬе

Ьуз

Зег

ТЬг

О1у

Агд

Ьеи

А1а

Ьуз

35

40

45

Зег

Азр

А1а

О1у

Ьеи

Агд

Ьеи

Ьуз

Зег

Ьуз

Рго

Уа1

Н1з

Уа1

50

55

60

МеЁ

Уа1

Ьуз

Ьеи

Азр

Туг

Азр

Зег

Ьеи

А1а

Туг

Агд

О1у

11е

65

70

75

80

Рго

О1у

Туг

А1а

ТЬг

Зег

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

О1у

Н1з

ТЬг

Ьеи

Азр

85

90

95

Рго

А1а

Зег

А1а

О1у

А1а

Агд

Туг

О1п

О1у

Туг

11е

О1у

Уа1

100

105

110

О1и

Азп

Агд

РЬе

Агд

А1а

Ьеи

О1у

Ьуз

Агд

Ьеи

Рго

О1у

А1а

Ьуз

115

120

125

А1а

О1у

Ьеи

Агд

ТЬг

Уа1

Туг

О1у

Ьеи

А1а

Уа1

ТЬг

Ьеи

130

135

140

Рго

О1у

Азр

Ьуз

Уа1

А1а

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Рго

О1у

Уа1

А1а

145

150

155

160

Уа1

О1п

О1и

Азр

А1а

Уа1

А1а

Ьуз

Рго

Ьеи

ТЬг

Азр

Зег

Рго

О1у

165

170

175

РЬе

11е

О1у

А1а

Рго

ТЬг

11е

Туг

Ьуз

О1п

Ьеи

О1у

Зег

Азр

Зег

180

185

190

Зег

О1у

Ьуз

О1у

Уа1

11е

Уа1

О1у

Азр

Ьеи

Азр

Зег

О1у

А1а

Тгр

Рго

195

200

205

О1и

Ηΐ3

Рго

Зег

Туг

Ьуз

Азр

Зег

О1у

Ьуз

Ьеи

Рго

А1а

Рго

210

215

220

ТЬг

Азр

О1у

А1а

Рго

Агд

Рго

Суз

Азр

РЬе

О1у

Азр

Азп

Рго

Ьеи

225

230

235

240

ТЬг

Рго

А1а

Азп

Азр

Рго

Туг

Уа1

Суз

Азр

Нтз

Ьуз

Ьеи

11е

Зег

О1у

245 250 255

- 32 028228

О1п

Рго

РЪе

Ьеи Азр 260

ТЪг Туг

Азп А1а 265

Уа1

О1у О1у

О1и 270

Агд

РЪе

Рго

Азр

Зег

А1а

Агд

Азр

Зег

Азр

О1у

Н1з

О1у

ТЪг

Н1з

ТЪг

Зег

ТЪг

275

280

285

ТЪг

А1а

О1у

Зег

А1а

Уа1

Зег

Н1з

А1а

Азп

Рго

Ьеи

О1у

11е

Азр

290

295

300

Агд

О1у

А1а

11е

Н1з

О1у

11е

А1а

Рго

А1а

Н1з

11е

А1а

Уа1

Туг

305

310

315

320

Ьуз

Уа1

Суз

О1у

А1а

О1п

О1у

Суз

РЪе

О1п

Зег

Азр

Зег

Уа1

А1а

325

330

335

Уа1

О1п

Агд

А1а

11е

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

Агд

Уа1

11е

Азп

Туг

Зег

11е

340

345

350

Зег

О1у

Уа1

Азр

Рго

Туг

Зег

Азр

Рго

Уа1

О1и

Ьеи

А1а

РЪе

Ьеи

355

360

365

Азр

А1а

Туг

А1а

О1у

Уа1

Ьеи

Уа1

Зег

А1а

Зег

А1а

О1у

Азп

Азр

370

375

380

О1у

Рго

ТЪг

А1а

О1у

ТЪг

Уа1

Азп

Н1з

Азп

О1у

Рго

Тгр

Уа1

ТЪг

385

390

395

400

Уа1

А1а

Зег

ТЪг

О1п

Агд

ТЪг

РЪе

О1п

Зег

ТЪг

Уа1

ТЪг

Ьеи

405

410

415

О1п

А1а

О1у

А1а

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

А1а

О1у

Зег

11е

ТЪг

Зег

420

425

430

О1у

11е

ТЪг

Зег

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

Ьеи

А1а

Зег

А1а

Рго

Туг

435

440

445

О1у

Азр

Рго

Азр

Суз

Азр

ТЪг

О1п

А1а

Рго

О1у

ТЪг

РЪе

ТЪг

О1у

450

455

460

Ьуз

11е

Уа1

А1а

Суз

Агд

Ьеи

Азп

Агд

О1у

Агд

11е

МеЪ

Ьуз

О1у

465

470

475

480

Туг

Азп

Уа1

РЪе

Ьуз

О1у

А1а

О1у

МеЪ

Ьеи

Туг

Азп

Азр

485

490

495

ТЪг

Ьеи

Зег

О1п

ТЪг

МеЪ

ТЪг

Азр

Азп

Нтз

Тгр

Ьеи

Рго

ТЪг

Уа1

Нтз

- 33 028228

500

505

510

Ьеи

О1и

Ьуз

Рго

О1п

А1а

Азр

А1а

Ьеи

А1а

РЬе

Ьеи

Бег

О1у

Н1з

515

520

525

ТЬг

О1у

ТЬг

А1а

ТЬг

РЬе

Рго

О1п

О1у

А1а

Ьуз

А1а

Азп

О1у

О1п

530

535

540

О1у

Азр

Уа1

МеЕ

ТЬг

А1а

РЬе

Бег

Агд

О1у

Рго

О1у

Азр

РЬе

545

550

555

560

Ьеи

Ьуз

Рго

Азр

Уа1

ТЬг

А1а

Рго

О1у

Ьеи

О1п

11е

МеЕ

О1у

О1п

565

570

575

ТЬг

Рго

Уа1

Рго

Азр

Рго

Бег

Ьеи

О1у

Рго

О1у

ТЬг

Ьеи

Туг

580

585

590

О1п

Уа1

11е

А1а

О1у

ТЬг

Бег

МеЕ

Бег

А1а

Рго

Н1з

Уа1

ТЬг

О1у

А1а

595

600

605

А1а

Ьеи

РЬе

А1а

Ьеи

Н1з

Рго

Бег

Тгр

ТЬг

Рго

О1у

О1п

Уа1

610

615

620

Ьуз

Бег

А1а

Ьеи

О1и

ТЬг

О1у

Ьуз

ТЬг

Бег

Уа1

Ьуз

Н1з

Азр

625

630

635

640

Агд

Ьуз

ТЬг

Рго

А1а

Азр

Рго

РЬе

Азр

Ьеи

О1у

Агд

11е

Азр

645

650

655

Ьеи

ТЬг

Ьуз

А1а

О1у

Азр

Рго

О1у

Ьеи

ТЬг

11е

Азр

О1и

ТЬг

А1а

660

665

670

Азп

Туг

А1а

Бег

А1а

ТЬг

Азр

Рго

Ьеи

Н1з

Агд

11е

Азр

Ьеи

Азп

675

680

685

να1

Рго

Бег

Уа1

Азп

А1а

Рго

Уа1

МеЕ

Рго

О1у

А1а

11е

МеЕ

ТЬг

690

695

700

Агд

ТЬг

Уа1

Ьуз

Азп

Уа1

Бег

О1у

Ьуз

ТЬг

МеЕ

ТЬг

Туг

О1у

ТЬг

Бег

705

710

715

720

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

О1у

А1а

Бег

11е

Бег

Уа1

Бег

Рго

О1у

ТЬг

РЬе

725

730

735

ТЬг

Уа1

Ьуз

Рго

О1у

Ьуз

ТЬг

А1а

Агд

Ьеи

Агд

11е

ТЬг

11е

А1а

740

745

750

- 34 028228

Рго	А1а	Ьеи 755	А1а	Азп	О1у	О1п	Туг 760
Агд	Азп 770	О1у	О1у	Ηΐ3	Азр	Ьеи 775	Ηΐ3
О1п 785	О1у	Уа1	Уа1	Зег	Ьеи 790	Азп	О1п
Ьеи	Азп	Зег	О1у	Агд 805	Зег	ТЬг	Суз
Ьеи	А1а	Азр	ТЬг 820	Ьуз	Уа1	11е	А1а
Агд	Ьеи	ТЬг 835	А1а	Уа1	ТЬг	О1у	А1а 840
Ьеи	А1а 850	О1п	А1а	Азр	Ьеи	А1а 855	Агд
А1а 865	Рго	О1у	А1а	ТЬг	Рго 870	А1а	О1у
11е	Рго	Рго	ТЬг	Рго 885	11е	О1у	Азр
Рго	А1а	РЬе	ТЬг 900	РЬе	А1а	О1у	Агд
Зег	Азр	О1у 915	Туг	ТЬг	Уа1	А1а	О1у 920
А1а	ТЬг 930	Рго	О1п	ТЬг	Ьеи	Рго 935	Азп
А1а 945	Рго	РЬе	Тгр	ТЬг	Азр 950	Ьеи	Азр
А1а	А1а	Агд	Ьеи	ТЬг 965	Азр	О1у	ТЬг
Агд	Ьеи	Азп	Уа1 980	РЬе	О1у	ТЬг	Азп
11е	О1у	Уа1 995	Азп	О1у	А1а	О1и	Азр 1000

РЬе	О1у	Агд	Уа1	Азр 765	Ьеи	Агд	О1п
Ьеи	Рго	Уа1	А1а 780	РЬе	Уа1	Агд	Ьуз
ТЬг	Суз	ТЬг 795	Рго	Зег	Уа1	11е	А1а 800
Азр	Уа1 810	Азр	Уа1	О1и	Азп	ТЬг 815	Зег
А1а 825	Зег	ΗΪ8	Ьеи	Азр	ТЬг 830	Агд	Ьеи
ТЬг	Ьуз	Уа1	О1у	А1а 845	ΗΪ8	Азр	Уа1
Агд	О1п	Рго	Азр 860	Ьуз	Рго	О1п	11е
Туг	Ьеи	Рго 875	Ьеи	Азр	А1а	РЬе	О1у 880
О1и	О1п 890	Зег	Ьеи	Азп	Ьеи	ТЬг 895	ТЬг
ТЬг 905	Туг	ТЬг	Зег	Ьеи	О1у 910	Уа1	Уа1
О1у	А1а	ТЬг	Рго	Азр 925	Азр	Уа1	А1а
Рго	А1а	Агд	Рго 940	Азп	О1у	О1и	Ьеи
О1у	А1а	О1у 955	А1а	Рго	О1у	Уа1	Туг 960
Зег	ТЬг 970	Тгр	11е	Уа1	Уа1	О1и 975	Тгр
Зег 985	Ьеи	Агд	Уа1	РЬе	О1п 990	О1п	Тгр

11е Зег Туг ТЬг Туг Азр Рго Азп

1005

- 35 028228

Азп

Беи 1010

Рго

А1а

Рго

Рго 1015

А1а

О1у Туг О1у

Беи 1020

ТЬг

Уа1

О1у

А1а

О1и

Азп

Азр

О1и

О1у

ТЬг

А1а

О1у

Бег

С1п

11е

Бег

О1у

ТЬг

1025

1030

1035

Рго

ТЬг

О1и

Азр

Беи

Агд

Уа1

ТЬг

Бег

ТЬг

Рго

О1у

А1а

О1у

1040

1045

1050

О1у

Бег

Беи

Буз

Туг

Бег

РЬе

ТЬг

Беи

Буз

О1у

ТЬг

О1у

Агд

О1у

1055

1060

1065

Азп

А1а

Рго

Уа1

ТЬг

Беи

Уа1

Бег

ТЬг

Рго

Беи

Уа1

Агд

О1у

1070

1075

1080

Уа1

ТЬг

А1а

О1и

Уа1

Азр

Азп

11е

ТЬг

Уа1

Азп

1085

1090

<210> 4 <211> 570 <212> БЕЛОК <213> АсБ1поа11отигиз <220>

<221> РКОРЕР <222> (1)..(570) <400> 4

МеБ Агд Агд 1

А1а

Беи Уа1 5

Беи А1а А1а

Суз 10

А1а

Уа1

ТЬг

А1а 15

А1а

Беи

А1а

Рго

А1а

С1п

А1а

О1у

Бег

Буз

ТЬг

С1п

О1у

Буз

20

25

30

ТЬг

О1и

Туг

Уа1

Беи

Туг

Буз

Азр

О1у

Уа1

Бег

Беи

О1и

Буз

35

40

45

А1а

НБз

Бег

А1а

Уа1

Буз

А1а

О1у

ТЬг

11е

Уа1

Буз

О1и

Азп

50

55

60

Буз

А1а

11е

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Уа1

Агд

Бег

А1а

Бег

ТЬг

А1а

РЬе

Беи

65

70

75

80

ТЬг

Азр

А1а

Агд

Буз

О1п

Бег

А1а

Уа1

Азр

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Азп

Агд

85

90

95

А1а

Уа1

О1у

О1и

А1а

Рго

Буз

Уа1

А1а

Агд

А1а

Уа1

Азп

Буз

Бег

100

105

110

- 36 028228

О1п А1а

Уа1 115

О1и

Ьуз

О1и

О1у Агд 120

Уа1

О1у

Н1з

А1а 125

О1у

Зег

Н1з

Ьуз

Рго

Зег

А1а

О1и

Рго

Ьеи

А1а

Азр

Агд

О1п

Тгр

Азр

МеЕ

130

135

140

Ьуз

О1п

11е

Н1з

А1а

ТЬг

Азр

О1у

Зег

Туг

Ьуз

О1и

Рго

О1у

145

150

155

160

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

Уа1

О1у

Уа1

11е

Азр

ТЬг

О1у

11е

Азр

О1у

ТЬг

165

170

175

Н1з

Рго

Азр

11е

А1а

Рго

Азп

РЬе

Азр

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Агд

Азп

РЬе

180

185

190

ТЬг

Азр

11е

Рго

Уа1

Азр

А1а

Азп

О1у

ТЬг

О1и

Уа1

Азр

О1у

Рго

195

200

205

Суз

О1и

Н1з

Рго

Зег

Суз

Уа1

Азр

Рго

Уа1

Азр

О1и

Азр

Азп

О1и

210

215

220

Н1з

О1у

ТЬг

Н1з

Уа1

А1а

Зег

ТЬг

11е

А1а

Зег

Рго

Ьеи

Азп

О1у

Ьеи

225

230

235

240

О1у

11е

А1а

О1у

Уа1

А1а

Рго

Азп

Уа1

ТЬг

Ьеи

Уа1

Азп

Уа1

Агд

А1а

245

250

255

О1у

О1п

Азр

Зег

О1у

Туг

РЬе

Ьеи

О1п

Рго

Уа1

Азр

А1а

Ьеи

260

265

270

ТЬг

Туг

Зег

А1а

Азр

Н1з

О1у

11е

Азр

Уа1

Азп

МеЕ

Зег

РЬе

Туг

275

280

285

ТЬг

Азр

Рго

Тгр

Ьеи

РЬе

Азп

Суз

ТЬг

Азп

Рго

А1а

Азр

Зег

Рго

290

295

300

О1и

Азп

О1п

А1а

О1и

О1п

Агд

ТЬг

Уа1

11е

О1п

А1а

Зег

О1и

Агд

А1а

305

310

315

320

Ьеи

А1а

Туг

А1а

Н1з

Агд

Н1з

О1у

Уа1

ТЬг

Ьеи

Уа1

А1а

О1у

325

330

335

Азп

О1у

А1а

ТЬг

Азр

Туг

ТЬг

Ьуз

ТЬг

11е

ТЬг

Азр

А1а

Зег

Рго

340

345

350

Азр

Туг

Рго

Зег

Уа1

Рго

О1у

О1и

А1а

Рго

Туг

Зег

Агд

ТЬг

11е

Рго

- 37 028228

355

360

365

Рго

Зег

Суз

11е

Зег

О1и

Рго

Зег

О1и

О1у

О1п

Азп

Уа1

Ьеи

А1а

Уа1

370

375

380

Зег

А1а

Ьеи

О1у

11е

Зег

ТЬг

Агд

Ьуз

Зег

Туг

Зег

Азр

Туг

О1у

385

390

395

400

Азп

О1у

Туг

Уа1

А1а

Уа1

Зег

А1а

Рго

О1у

Азр

Зег

Туг

Азр

ТЬг

405

410

415

А1а

Азр

С1п

Ьуз

А1а

Азр

Уа1

ТЬг

Нпз

А1а

11е

Ьеи

А1а

Туг

Рго

420

425

430

Ьуз

Зег

Ьеи

А1а

Уа1

А1а

Агд

О1у

О1и

Ьеи

Азп

А1а

Азр

О1у

ТЬг

Рго

435

440

445

Азп

Уа1

Рго

Туг

Уа1

Агд

Зег

Суз

Ьуз

О1у

Зег

ТЬг

Суз

А1а

Туг

450

455

460

Туг

О1п

Туг

Ьеи

О1п

О1у

ТЬг

Зег

МеЕ

А1а

Зег

Рго

Нпз

А1а

ТЬг

О1у

465

470

475

480

ναι

Уа1

А1а

Ьеи

11е

Уа1

Зег

Агд

Туг

О1у

Ьуз

Рго

Азр

Агд

Уа1

Нпз

485

490

495

О1у

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Рго

Азр

Агд

Уа1

Ьуз

Зег

11е

Ьеи

О1и

О1у

500

505

510

ТЬг

А1а

ТЬг

О1и

Нпз

А1а

Суз

Рго

Азр

Рго

Агд

А1а

РЬе

ТЬг

Туг

ТЬг

515

520

525

Агд

О1п

Уа1

Ьуз

О1п

Зег

Азр

О1у

ТЬг

Туг

Агд

ТЬг

Уа1

ТЬг

А1а

ТЬг

530

535

540

Нпз

ТЬг

Суз

О1и

О1у

Зег

Ьуз

Зег

Нпз

Азп

О1у

РЬе

Туг

О1у

Нпз

О1у

545

550

555

560

11е

Азр

А1а

Ьеи

О1у

А1а

Уа1

ТЬг

Нпз

565

570

<210> 5 <211> 416 <212> БЕЛОК <213> АсЕппоаНотигиз <220>

<221> РКОРЕР

- 38 028228 <222> (1)..(416) <400> 5

МеЕ 1

Азп

Рго

Агд

О1п Агд 5

РЬе

А1а

11е

Уа1 10

^еυ А1а А1а

^еυ

11е 15

ТЬг

МеЕ

11е

РЬе

Бег

^еυ

Уа1

Бег

Уа1

Рго

Бег

А1а

О1у

А1а

Уа1

Бег

20

25

30

А1а

Бег

^уз

^еυ

Бег

Уа1

О1у

РЬе

О1у

Суз

А1а

Бег

А1а

Ηΐ3

А1а

35

40

45

О1у

О1п

^еυ

Ηΐ3

Суз

РЬе

О1у

Агд

11е

Агд

А1а

Ηΐ3

Агд

А1а

Бег

А3п

50

55

60

О1у

^уз

11е

А1а

Рго

^еυ

ТЬг

Уа1

ТЬг

Бег

Рго

ТЬг

О1у

^еυ

Рго

65

70

75

80

А1а

Азр

^еυ

О1п

Бег

А1а

Туг

^уз

Уа1

А1а

О1у

^еυ

А3п

О1у

85

90

95

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

11е

Уа1

Азр

А1а

О1п

Азр

Азп

Рго

^уз

А1а

О1и

А1а

100

105

110

Азр

^еυ

А1а

Ηΐ3

Туг

Агд

Бег

О1п

^еυ

О1у

^еυ

Рго

А1а

Су3

ТЬг

115

120

125

А1а

Азп

О1у

Суз

РЬе

^уз

Уа1

Азп

О1п

Азп

О1у

О1п

А1а

Бег

Рго

130

135

140

^еυ

Рго

А1а

Азр

Туг

О1у

Тгр

А1а

О1и

11е

Бег

^еυ

А3р

^еυ

145

150

155

160

Азр

МеЕ

Уа1

Бег

А1а

11е

Суз

Рго

Бег

Суз

Ηΐ3

11е

^еυ

Уа1

О1и

165

170

175

А1а

Азп

А1а

Рго

Азр

ТЬг

Бег

^еυ

О1у

ТЬг

А1а

Уа1

А3р

ТЬг

А1а

180

185

190

А1а

ТЬг

Бег

О1у

Уа1

А1а

11е

Бег

Азп

Бег

Туг

О1у

А1а

195

200

205

О1и

Азр

Бег

ТЬг

11е

^еυ

А1а

Азр

А1а

Ηΐ3

РЬе

А3п

Ηΐ3

Рго

О1у

210

215

220

11е

А1а

Уа1

ТЬг

А1а

Бег

О1у

Азр

Бег

О1у

Туг

О1у

Уа1

Бег

Тгр

225

230

235

240

- 39 028228

Рго

А1а

Зег

О1п Туг Уа1 245

ТЬг А1а Уа1 250

О1у

О1у ТЬг

ТЬг

Ьеи 255

Азп

Ьуз

А1а

Зег

Азп

А1а

Агд

О1у

Тгр

ТЬг

О1и

ТЬг

А1а

Тгр

Зег

О1у

А1а

260

265

270

О1у

Зег

О1у

Суз

Зег

А1а

Туг

О1и

Рго

Ьуз

Рго

Зег

Тгр

О1п

Няз

Азр

275

280

285

ТЬг

А1а

Суз

А1а

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

Азр

Уа1

Зег

А1а

Уа1

А1а

Азр

290

295

300

Рго

А1а

ТЬг

О1у

Уа1

О1у

Уа1

Туг

Азр

ТЬг

Туг

Азп

Зег

Суз

О1у

ТЬг

305

310

315

320

Зег

РЬе

Суз

Азр

РЬе

Ьеи

11е

Зег

Ьеи

О1у

Ьеи

Уа1

О1п

О1у

Ьеи

325

330

335

Азр

О1у

Тгр

А1а

Уа1

О1у

ТЬг

Зег

А1а

Зег

Рго

11е

340

345

350

А1а

Зег

Уа1

Туг

А1а

Ьеи

А1а

О1у

Азп

ТЬг

О1у

Зег

ТЬг

Туг

О1у

355

360

365

Зег

Туг

Рго

Туг

А1а

Няз

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

РЬе

Азр

Уа1

ТЬг

Зег

О1у

370

375

380

Зег

Азп

О1у

Зег

Суз

О1у

ТЬг

Туг

Ьеи

Суз

ТЬг

А1а

О1у

ТЬг

О1у

385

390

395

400

Туг

Азр

О1у

Рго

ТЬг

О1у

Ьеи

О1у

ТЬг

Рго

Азп

О1у

ТЬг

О1у

РЬе

405 410 415 <210> 6 <211> 33 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Глиадиновый 33-мерный пептид <400> 6

Ьеи 1

О1п

Ьеи

О1п

Рго 5

РЬе

Рго

О1п

Рго

О1п 10

Ьеи

Рго

Туг

Рго

О1п 15

Рго

О1п

Ьеи

Рго

Туг

Рго

О1п

Рго

О1п

Ьеи

Рго

Туг

Рго

О1п

Рго

О1п

Рго

20

25

30

- 40 028228

РЬе

<210> 7 <211> 4173 <212> ДНК <213> АсЕгпоа11отигиз
<220> <221> ген <222> (1).	.(4173)
<400> 7 аЕдсссдаЕс	ЕЕсссассса	асддсдЕЕсс	ссасдсаддЕ	сасдссддсс	сдсддЕссЕЕ	60
дсдаддсЕсд	сдддссЕдсд	сдЕсддсдсд	сЕддЕссЕсд	сдсЕсдссдЕ	сассасдсЕс	120
асссЕсаЕсЕ	ссаЕдсссЕс	ддссаасдсс	дссссддсса	адсссдЕддЕ	сссдсасдсс	180
ааддсдадса	дЕсссассдс	асадддссад	сасссдасса	дссдсдЕдЕд	ссддассссс	240
ддссдсдсса	аЕдадаЕдас	сЕдссЕсдсс	аЕддЕссдЕд	асдасдЕсаЕ	сдддссдаад	300
ддсдЕссадд	сдаасдасдс	дссддссддд	ЕЕсддсссдд	ссдассЕдсЕ	даасдссЕас	360
аассЕдсссЕ	сддссддаЕс	дасддадасд	дЕсдсдаЕсд	ЕсдасдсдЕЕ	сдасаасссд	420
аасдссдадд	сддассЕддд	сдЕсЕассдс	садсадЕасд	ддсЕдссддс	сЕдсасдасд	480
дссаасддсЕ	дсЕЕсаадаа	даЕсдассаа	сдсддсддса	ссадсЕаЕсс	дссдссддас	540
дссддсЕддд	ссддададаЕ	сдсдсЕддас	аЕсдасаЕдд	ЕсадсдссаЕ	сЕдсссдасс	600
ЕдсаадаЕсс	ЕссЕддЕсда	ддссдасдас	аасЕасаЕдд	асаассЕддд	сасддссдЕс	660
аассаддсдд	Есадссаддд	сдссаадЕЕс	дЕсЕссааса	дсЕасддсдд	садЕдадддс	720
Ессдасдадд	ддсаддссда	сдасдсдЕас	ЕЕссассасд	асддсдЕсдс	саЕсассдсд	780
адсадсддсд	асадсддсЕа	сддддсдадс	Еасссддссд	ссЕссссдЕа	сдЕсассЕсд	840
дЕсддсддса	сдЕсдсЕддс	сааддасасд	ЕссЕссЕсдс	дсддсЕддас	сдададсасс	900
Еддаасддсд	сдддсадсдд	сЕдсЕссдсд	Еасдадасса	адсссЕсдЕЕ	ссадааддас	960
ассддсЕдсд	сдсдссдЕас	даЕсдссдас	дЕсЕссдсдд	Еддссдассс	даасассддс	1020
дЕсдсддЕсЕ	асаасддсдд	сЕддсасдЕс	Еасддсддса	сдадсдЕдЕс	сдссссдаЕс	1080
аЕсдсдЕсдд	ЕдЕасдсссЕ	сддсддсдсд	ссддсддсдд	дсЕсддсдсс	саасЕссЕЕс	1140
ссдЕасдасс	асссддссда	ссЕсаасдас	дЕдассадсд	дсадсаасдд	дадсЕдЕадЕ	1200
сссдссЕасс	ЕсЕдсасддс	дддЕассддс	Еасдасдддс	сдассдддсЕ	сддсассссд	1260
аасддсаЕсд	ссдсдЕЕссд	сЕссдддссд	сасдссдЕсд	ЕсассддЕас	ддЕсассдас	1320
ддсассдсдс	сдсЕддсдЕс	сдсссаддЕд	ааддсдддсд	асдЕсасддс	дасдасддас	1380
ддссаддддс	асЕасасссЕ	дадсдЕЕссд	ссддддассЕ	асдасдЕдЕс	сдсдадсаад	1440

- 41 028228

ЁЁсдддЁаса	ссддЁаадас	даЁсЁсдддд	дЁдсаддЁсд	ссдасддсса	дассдЁсасс	1500
даддасЁЁсд	сдсЁдассдс	сааддсасдс	дЁсдасдЁсЁ	ссддасЁсдЁ	асдддасддс	1560
ЁсдддЁсасд	дсЁддссддЁ	сЁасдсдасс	дЁасдддЁса	аддассадсс	сассдсддЁс	1620
дссЁасассд	асссдаадас	сдддсддЁас	асссЁсадсс	Ёдсссасдда	сдасасдЁас	1680
асдсЁдсадд	ЁддаЁссдсЁ	дЁаЁссдддЁ	Ёасасдсадд	асЁсдсасда	сдЁдассдЁд	1740
ассЁсддсдд	асдЁддЁсса	сдасдЁсаас	дЁсдсддЁдд	ассадасдас	дЁдсадсдса	1800
ссдддсЁаса	дсЁассасЁа	сдссддадсс	асссадссдЁ	Ёсдасддсас	дассдсдссд	1860
дсдддсЁдда	ссдЁсдаЁда	сааддЁсддс	аасддссада	ссЁдддЁдЁЁ	саасдасссд	1920
ддсЁсссдЁд	дсаасаадас	дддсдддасс	ддсддсЁЁсд	ссдЁсаЁсда	садЁдассас	1980
ЁасддсЁсдд	дсаасасдса	ддасадсасд	сЁдЁЁсадсс	сддЁсассда	сЁЁсадсдсд	2040
сдЁасссасс	сдаЁссЁдад	сЁЁссдсадс	дасЁддЁасд	дсЁасассдд	ссаддссддс	2100
дассЁсдасс	ЁдадсдЁсда	сддсддсасд	асдЁддасса	ассЁдаадса	сЁасасддсс	2160
адсдадсдсд	ддссдсдЁас	ддадасдаЁд	дассЁдЁссд	сддсддссдд	даададсдсс	2220
дЁдсаддЁда	ддЁЁссасЁЁ	сассддсаад	ЁЁсддсЁасЁ	асЁддсаддЁ	сдасдасдЁс	2280
ЁЁссЁсддсд	ассдЁассЁд	Ёдасссдасс	Ёсдддсддсс	ЁддЁсдЁсдд	ссаддЁдасс	2340
дасдсдааса	ссддсдсддд	сдЁддссддд	дссасддЁса	ссЁсддЁдда	ссддссддсс	2400
дадсасдсса	ссЁсддсддс	дасдссддас	дассссаасс	Ёсддсдасдд	ЁсЁсЁЁсЁдд	2460
аЁдЁЁсЁссЁ	ссдЁсассдд	садссасаад	ЁЁсассдсса	сддсддддаа	сЁасдасЁсс	2520
саЁдасдЁса	сддЁдаасдЁ	сдссдссаас	Ёдддсдассд	сддссдасаЁ	сдсдсЁдЁсс	2580
дсдссасддс	ЁсасддЁсас	Ёссдддсдсд	аЁсадсаада	сддЁсддсЁд	дсадааддсд	2640
дссассдсдд	сдсЁдасссЁ	даадаасасс	ддсасдЁсдс	сддЁдассдс	саадаЁсддЁ	2700
даасадссдд	дЁддсадсас	дассдссасс	дсдддЁдсас	сдсЁдсадсд	ддЁдаадддс	2760
дасЁЁсдсса	дЁддасдасЁ	дсадсадддс	ааддсдЁсдд	дЁдссааддс	сддсдЁдаса	2820
ссдЁасдсдс	сдссдЁддас	ддссаЁсдсс	дасЁасдссЁ	сдссдаЁсаЁ	ддасаасддс	2880
дсддЁддсас	Ёдаасддсаа	даЁсЁасЁсд	дЁддсдддсд	Ёсдасддсдс	даасдЁдсЁд	2940
аасааддсдЁ	асдссЁасда	Ёсссддсасс	саддссЁдда	ссдссаЁсдс	сссдсЁсдсс	3000
асдддасдЁд	аддсЁсссса	ддсдасдасс	ассддсддаа	адсЁдЁасдЁ	сассддсддс	3060
ЁддддсЁсда	сдддсдссдс	ддЁддссаад	асддадаЁсЁ	ЁсдаЁссдЁс	сЁсдддсдсс	3120
ЁддЁсддссд	дсдсддасаа	сссдаадссд	ЁасдссддсЁ	ссддсдсддс	сдЁдсЁсдас	3180
ддсаадаЁсЁ	асдЁсдЁсдд	сдддЁдссЁс	дссассЁдсд	дЁасдаадда	сдЁдсаддЁс	3240
Ёасдасссдд	сддссаасЁс	сЁддадсЁсд	ддассддссЁ	аЁссддадаа	сассдсдЁдд	3300
сЁсддсЁдсд	ссддсаЁсда	сддсаадсЁд	ЁасЁдсдсдд	дсддсЁссдс	ддссдсдадс	3360

- 42 028228

ассаадсасд	дсБасдБдсБ	сдасссддсс	БсдддсассБ	ддБсдссдаБ	сдссдассБд	3420
ссдаБсдасс	БдБдддсдаБ	дддсБасБсд	дсддсдаасд	ддаадсБдаБ	сдБсБссддБ	3480
ддсдБсасса	асддддссад	сасдсБсасс	ааБсадддсБ	БсдссБасда	сссдБсддсд	3540
аасБссБдда	сддсссБдсс	саасБссаас	аасдсссБдБ	ассдсддсдс	дБсддссБдс	3600
дддББсБаса	адаБсддадд	аБсдсБдддд	садББсаасд	сддБсаадад	сддБдаддБд	3660
сБдсссддсБ	аБдассадБд	сдссБсдасс	дссдасдББс	сдБддсБдБс	ддаддасаад	3720
ассдаддБда	сдаБссадсс	сддссададс	дБсааддБса	асдБдасссБ	сдасдсдаас	3780
дБсссддсда	БсасБсадсс	сддсасдБас	ассдсдсадс	БсассдБсдд	ддсдаадасд	3840
ссдБасдсда	БсссдссддБ	сдссдБсасд	аБдасддБда	асссдссддд	сассБдддда	3900
аадаБсассд	даасдсБсас	сддадссддс	БдБасдддББ	сБсссдсасс	дсБдассддд	3960
дсдасссБас	адаБсдасБс	сБдддсБдсд	БсдБасасдс	Бсаадассда	саадаасддБ	4020
садБасдсдс	БсБддсБсда	сдБссдсаас	аасссдсБда	сдсБдаБсдс	ддсдааддас	4080
ддаБдддсдс	сдсадассад	ааасдБсаад	аБсассааас	БдассБсдас	сасддссдаБ	4140
ББсасБсБда	аасссдасса	сассБдБадс	Бда			4173

<210> 8 <211> 1197 <212> ДНК <213> АсБгпоа11отигиз

<220>
<221> ген
<222> (1).	..(1197)
<400> 8
аБдБсасдас	дсдБдассдд	дассаБасБд	ддсдддББда	БссБсдссаБ	ддБссссББс	60
сБББссассд	сддссаасдс	сдсассссад	дссдсдссдд	сББссдБсБс	ссасссдББс	120
сассасБссБ	дсдссасддБ	даадссдддБ	сдддсдадсБ	дсааБдсссБ	сдБасдсадс	180
дасаБсдссс	ададсдсддс	дасссБсдсд	сассаадсдд	ссдссссаБс	сдддсБсБсд	240
ссддссаасс	Бдсададсдс	сБасаадсБд	ссдБссБсса	сддссддаБс	сддссадасс	300
дБсдсдаБсд	БсдасдссБа	Бдасдссссд	ассдссдаад	сддасББдаа	сдБдБассда	360
адссадББсд	дасБсддсдс	дБдсасдасс	дссаасддсБ	дБББсаадаа	ддБсдассад	420
аасддсддса	сдБссБаБсс	даддааддас	ддсддсБддд	сдсаддадаБ	сБсссБддас	480
сБсдасаБдд	БсБссдсддБ	сБдссссаас	БдсаадаБсд	ББсБсдБсда	ддсдаадасс	540
аасБсдББсд	ссаассБддд	Бассдссдад	аасассдсдд	сдадБсБсдс	даасдБсаБс	600
адсаасадсБ	асддсддсБс	ддасдссБсБ	дасдсдадсБ	аБддсБсдБа	сБасаассас	660

- 43 028228

ссдддсаадд	ссаЁсасддЁ	садсЁссддс	дасдссддсЁ	асддсдЁдда	дЁасссддсс	720
ЁсдЁсссасЁ	асдЁдассдс	сдЁсддсддс	ассЁсдсЁдс	дсассдсдад	сассадссдс	780
ддсЁддадсд	адассдсдЁд	дадсддсдсд	ддсадЁддсЁ	дсЁсддссЁа	саасассдсд	840
сЁдЁссддсс	адЁссддссЁ	сассддсЁдс	Ёсссддсдсд	ссдЁсдссда	сдЁсЁссдсс	900
дЁддссдасс	сддссассдд	сдЁсдссдЁс	Ёасдасадса	сддссЁасса	дддссададс	960
ддсЁддаЁдд	ЁсЁЁсддсдд	сассадсдЁс	дссдсассда	ЁсаЁсддЁдд	сдЁдЁасддс	1020
сЁсдссдсса	асдссдсдад	саЁсдасаас	аасЁассссЁ	асдсссасас	садсЁсдсЁс	1080
ЁЁсдасдЁса	сдЁсдддсад	саасддсасс	Ёдсассасса	ссаадЁддЁд	сассдссддс	1140
ассддсЁддд	асддссссас	сддссЁсдда	асдссдаасд	дсассддадс	сЁЁсЁда	1197

<210> 9 <211> 3285

<212> ДНК <213> АсЁгпоа11отигиз
<220> <221> ген <222> (1).	..(3285)
<400> 9 аЁдадЁдссд	ссдЁЁдЁдаЁ	сЁЁсдссддс	дсассддсда	сддсддсдсс	дасдссддаа	60
ддсЁссддса	дасасЁддас	ддссасдссд	сЁсадсддса	ссдЁсдЁсса	дддсЁЁсаад	120
Ёсдасдассд	дасддсЁсдс	саададсдаЁ	дссдддсЁдс	ЁЁсдссЁдаа	дЁсдадсаад	180
сссдЁдсасд	ЁсаЁддЁсаа	дсЁсдасЁас	дасЁсасЁсд	ссдссЁассд	дддсдддаЁЁ	240
сссдддЁасд	ссдссасдад	сссддсддЁд	ассдддсаса	сдсЁсдассс	ддсдадсдсс	300
ддсдсдсддс	дсЁассаддд	сЁасаЁсддд	ддсдЁсдада	ассдсЁЁссд	сдссдсссЁд	360
ддсаадсдсс	Ёдссдддсдс	дааддссддс	ддсдддсЁдс	дсасддЁдЁа	сддсддЁсЁд	420
дсддЁдасдс	ЁдсссддЁда	сааддЁддсс	дассЁдсЁса	адсЁдсссдд	сдЁддссдсд	480
дЁссаддадд	асдсддЁддс	саадссасЁд	ассдасЁсса	дссссддсЁЁ	саЁсддсдсс	540
ссдассаЁсЁ	асаадсаасЁ	сддсддсадс	дасадсЁссд	дааадддсдЁ	саЁсдЁсддс	600
дассЁддаса	дсддсдссЁд	дсссдадсас	сссЁсдЁаса	аддасадсдд	саадсЁдссс	660
дсдссдссдс	ссассасдда	сддЁдсдсса	сддссдЁдсд	асЁЁсддсда	сааЁссдсЁд	720
асдссддсда	асдасссдЁа	сдЁсЁдсдас	сасаадсЁда	ЁсЁсдддсса	дссдЁЁссЁд	780
дасассЁаса	асдсддЁсдЁ	сддсддддад	аддЁЁссссд	асадсдсссд	сдасЁссдас	840
дддсасддса	сдсасассЁс	дассассдсд	дссддЁЁсдд	сддЁдадсса	сдсдаасссд	900
сЁсддсаЁсд	ассдсддсдс	саЁссасддс	аЁсдсдсссд	ссдсссасаЁ	сдссдЁсЁас	960
ааддЁдЁдсд	дсдсссаддд	сЁдсЁЁссад	ЁссдасЁсдд	ЁддссдссдЁ	дсадсдддсд	1020

- 44 028228

а5сс5сдаса	адд5ссддд5	да5саас5ас	5сда5с5ссд	дсддсдЬсда	сссаЬасадс	1080
да5ссдд5сд	аас5ддсс55	ссЬсдасдсд	Ьасдсддссд	дсдЬдсЬсдЬ	сЬсддссЬсд	1140
дссддсаасд	асдддсссас	сдсдддсасс	дЬсаассаса	асдддссдЬд	ддЬдассасд	1200
д5ддссдсд5	ссасдсадса	дсддасс55с	садЬсдассд	5сасдс5дса	ддсдддсддс	1260
дсдадссЬда	адсЬддссдд	с5сд5сда5с	ассадсддда	5сасс5сдсс	дсЬЬсссдЬс	1320
д5дс5сдсд5	ссдсддсдсс	дЬасддсдас	ссддасЬдЬд	асасдсаддс	сдсЬсссддс	1380
асд55сассд	дсаада5сд5	сдссЬдссдд	с5дс5саасс	дсддссддаЬ	саЬдаадддс	1440
5асаасд5с5	Ьсаадддсдд	сдсддссддд	аЬдсЬдсЬсЬ	асаасдасас	дсЬдЬсссад	1500
асдаЬдассд	асаассасЬд	дсЬдссдасс	дЬдсассЬдд	адаадссдса	ддссдасдсд	1560
с5дс5ддсс5	5сс555ссдд	ссасассддс	ассассдсса	сдЬЬссссса	дддсдсдаад	1620
дсдаасддсс	адддсдасдЬ	саЬдассдсд	55с5сс5сдс	дсддсссддд	сддсдасЬЬс	1680
сЬсаадсссд	асдЬсассдс	дсссддссЬд	садаЬсаЬдд	дсддссадас	дссддЬЬссд	1740
дасдассссЬ	сдсЬдддссс	дсссддсасс	сЬсЬассадд	ЬдаЬсдссдд	ЬассЬсдаЬд	1800
Ьсддсдссдс	асдЬсассдд	ддсддсддсд	с5дс5д55сд	сссЬдсаЬсс	дадсЬддасд	1860
ссддддсадд	5саад5сддс	дсЬддадасд	ассддсаада	сдЬсЬдЬддЬ	саадсасдас	1920
сдсаадасдс	ссдссдассс	д55сдасс5с	ддсддЬдддс	дсаЬсдассЬ	сассааддсс	1980
ддЬдассссд	ддс5дасса5	сдасдадасс	дсддсдаасЬ	асдсддссЬс	ддсдассдас	2040
ссдсЬдсасс	дда5сдасс5	даасдЬдссд	5с5д5даасд	сассддЬдаЬ	дсссддсдсд	2100
а5са5дасса	сссд5асдд5	саадаасдЬс	Ьсдддааада	сдаЬдасдЬа	сддсассЬсд	2160
ддЬасдасдд	Ьдаадддсдс	с5сса5с5сс	д5с5сссссд	дсасдЬЬсас	сдЬсаадссд	2220
ддсаадассд	сссддсЬдсд	да5сасда5с	дссдсдссдд	сдсЬсдссаа	ЬдддсадЬас	2280
55сддссддд	5сдасс5дсд	Ьсадсдааас	ддсддссасд	ассЬдсассЬ	дссддЬсдсд	2340
55сд5ссдса	адсадддсдЬ	дд5дадсс5д	аассадассЬ	дсасдсссЬс	ддЬдаЬсдсд	2400
сЬдаасадсд	дссдаЬсдас	д5дсдасд5с	дасдЬсдада	асассЬсЬсЬ	сдссдасасс	2460
аадд5са5сд	ссдсдадсса	ссЬддасасд	сддсЬдсдас	ЬдассдсддЬ	дассддсдсд	2520
асдааддЬдд	дсдсдсасда	сд5сс5ддсс	саддссдасс	Ьддсссдссд	ссадсссдас	2580
аадссдсада	Ьсдсссссдд	ддссасдссд	дссддсЬасс	ЬдссдсЬсда	сдссЬЬсддс	2640
аЬссссссда	сдссдаЬсдд	сдасдадсад	5сдс5саасс	Ьсассасдсс	ддсдЬЬсасс	2700
55сдссддса	ддассЬасас	садссЬдддс	дЬддЬсЬссд	асддсЬасас	ддЬсдссддс	2760
ддадсдассс	ссда5дасд5	ддссдсдасд	ссдсадассс	Ьдссдаассс	ддсасддссд	2820
аасддсдаас	5ддссссд55	сЬддассдас	сЬддасддсд	ссддЬдсссс	дддсдЬдЬас	2880

- 45 028228

дсддсссдсс	Ьсассдасдд	сасдадсасс	ЬддаЬсдЬсд	ЬддадЬддсд	дсЬсаасдЬс	2940
ЬЬсддсасда	асадссЬссд	ддЬдЬЬссад	садЬддаЬсд	дддЬдаасдд	сдссдаддас	3000
аЬсЬссЬаса	ссЬасдассс	даасаассЬд	ссддсддсдс	сдсссдсддд	сЬасддссЬд	3060
асддЬсддсд	сддадаасда	сдадддЬасс	дссддЬЬсдс	адаЬсЬссдд	сассссдасс	3120
даддаЬсЬсс	дсдЬсасдад	сасдссдддд	дссдсдддЬд	дЬЬсдсЬдаа	дЬасЬссЬЬс	3180
асасЬдаадд	даасдддссд	дддсаасдсс	ссддЬдасда	сссЬддЬсЬс	сасдссдсЬс	3240
дЬасдаддсд	Ьдасддссда	ддЬсдасаас	аЬсасддЬда	асЬда		3285

<210> 10 <211> 1713

<212> ДНК <213> АсЬ1поа11отигиз
<220> <221> ген <222> (1).	..(1713)
<400> 10 дЬдсддсдсд	сссЬадЬссЬ	сдссдссЬдс	дссдЬсдЬса	сддсддсдсЬ	сдсддсассс	60
дсдсаддсдд	даЬсдадсад	саадасдсад	ддааадасда	сЬдадЬасдЬ	сдЬссЬдЬас	120
ааддасддад	ЬсЬсссЬдда	дааддсдсас	ЬсддссдЬда	аддсддссдд	ЬддсассаЬс	180
дЬсааддада	асааддсдаЬ	сддсдЬддсс	ассдЬасдсЬ	сддссадсас	ддсдЬЬссЬс	240
ассдасдсдс	дсаадсадЬс	ддсддЬсдас	ддсдЬсдсда	ссаассдсдс	ддЬсддсдад	300
дсдсссаадд	Ьсдсасдддс	ддсддЬдаас	аададссадд	ссдЬддадаа	ддадддссдс	360
дЬсдддддсс	аЬдсддддЬс	сЬссЬсдсас	аадссдЬсдд	сддадссдсЬ	ддсддассдь	420
садЬдддаса	ЬдаадсадаЬ	ссасдсдасс	асддасддсЬ	сдЬасаадаа	ддадссдддс	480
дассддсдсд	ЬдсЬсдЬсдд	сдЬсаЬсдас	ассддсаЬсд	асддсасдса	сссддасаЬс	540
дсдссдаасЬ	ЬсдасаадЬс	дсЬдадссдд	аасЬЬсасса	сддасаЬссс	ддЬсдасдсс	600
аасддсассд	аддЬсдасдд	сссдЬдЬдад	сасссдЬссЬ	дсдЬддассс	ддЬддасдад	660
дасдасаасд	адсасддсас	дсасдЬсдсс	ЬсдасдаЬсд	ссЬсдссдсЬ	даасддссЬд	720
ддсаЬсдсдд	дсдЬддсдсс	даасдЬдасд	сЬддЬсаасд	Ьасдддссдд	дсаддасЬсд	780
ддсЬасЬЬсЬ	ЬссЬдсадсс	сдЬддЬсдас	дсдсЬдасдЬ	асЬсддссда	ссасддсаЬс	840
дасдЬддЬда	асаЬдЬсдЬЬ	сЬасассдас	ссдЬддсЬдЬ	ЬсаасЬдсас	саасаасссд	900
дссдасЬсдс	сддадаасса	ддссдадсад	сдЬасддЬса	ЬссаддсдЬс	адаасдсдсс	960
сЬддсдЬасд	сдсассддса	сддЬдЬсасс	сЬддЬддсдд	ссдссддсаа	сддсдссасс	1020
дасЬасасса	адасдаЬсас	сдасдсдЬсд	адсссддасЬ	асссдЬссдЬ	дсссддсдад	1080
дсдссдЬасЬ	сдсдЬасдаЬ	сссдссдЬсс	ЬдсаЬсЬссд	адссдадсда	дддссадаас	1140

- 46 028228

дЁссЁсдсдд	ЁдЁсддсссЁ	дддсаЁсадс	асдсдсаадЁ	сдЁасЁасЁс	сдасЁасддс	1200
аасддсЁасд	ЁсдсддЁдЁс	ддссссдддс	ддсдасЁссЁ	асдасасддс	сдассадаад	1260
дсддасдЁда	сссасдсдаЁ	ссЁддссдсд	ЁасссдаадЁ	сссЁддссдЁ	ддсссдсддс	1320
даасЁдаасд	сддасддсас	сссдаасдЁд	ссдЁасдЁдд	ЁссдсЁсдЁд	саадддсЁсд	1380
ассЁдсдсдЁ	асЁассадЁа	ссЁдсадддс	асдЁсдаЁдд	ссЁсЁссдса	сдсдассддс	1440
дЁддЁддсдс	ЁдаЁсдЁсад	ссдсЁасддс	аадсссдасс	дсдЁасасдд	сддссЁдасс	1500
сЁдЁссссдд	ассдддЁсаа	дЁссаЁссЁд	дадддаассд	ссассдааса	сдссЁдсссд	1560
дасссасдсд	ссЁЁсасдЁа	сасдсдссад	дЁсаадсадЁ	ссдасддЁас	дЁасаддасс	1620
дЁдассдсда	сссасассЁд	ЁдадддЁЁсд	аададссаса	асддсЁЁсЁа	сддссасддс	1680
аЁсаЁсдаЁд	сссЁдддсдс	сдЁдасдсаЁ	Ёаа			1713

<210> 11 <211> 1251

<212> ДНК <213> АсЁ1поа11отигиз
<220> <221> ген <222> (1).	..(1251)
<400> 11 ЁЁдаассссс	дссааадаЁЁ	сдсдаЁсдЁс	сЁсдсддссс	ЁсаЁсасааЁ	даЁсЁЁсЁсс	60
сЁддЁЁЁссд	ЁссссЁссдс	сддсдссдсд	дЁсадсдсдЁ	ссаадсЁсад	сдЁсддсЁЁс	120
ддсЁдсдссЁ	сддсддсдса	сдссддЁсад	сЁдсасЁдсЁ	ЁсдддсддаЁ	ссдсдсссас	180
сдддсдадса	асддсаадаЁ	сдссссдсЁс	асддЁсасса	дсссдассдд	асЁдсЁсссд	240
дсддассЁдс	адЁсддсдЁа	сааддЁддсс	дддсЁдаасд	дсддсддссд	ЁасддЁсдсд	300
аЁсдЁсдасд	сдсаддасаа	сссдааддсс	даддссдасс	ЁсдсссасЁа	ссдсЁсссад	360
сЁсддссЁдс	ссдсдЁдсас	дассдсдаас	ддсЁдсЁЁса	адааддЁсаа	ссадаасддс	420
саддсдЁсдс	сдсЁдсссдс	ддссдасЁас	ддсЁдддссд	аддадаЁсад	ссЁсдассЁд	480
дасаЁддЁсЁ	сддсдаЁсЁд	сссдадсЁдс	сасаЁссЁдс	ЁсдЁсдаддс	даасдссссЁ	540
дасдасассЁ	сдсЁсддсас	сдсддЁсдас	ассдссдссд	сдассадсдд	сдЁсдЁддсс	600
аЁсЁссааса	дсЁасддадд	сдссдаддас	ЁсдассаЁсс	Ёсдссдссда	сдсссасЁЁс	660
аассасссдд	дсаЁсдсддЁ	сасддсдадс	ЁссддсдасЁ	ссддсЁасдд	сдЁсадсЁдд	720
ссддссЁсдЁ	сссадЁасдЁ	сассдсддЁд	ддсддсасда	сдсЁдаасаа	ддсдадсаас	780
дсдсдсддсЁ	ддассдадас	сдссЁддЁсс	ддсдссддсЁ	сдддсЁдсЁс	ддсдЁасдад	840
ссдаадссдЁ	ссЁддсадса	сдасассдсс	Ёдсдссаадс	дсассдЁсдс	ддасдЁсЁсд	900

- 47 028228

дсддЕсдссд	асссддссас	сддсдЕсддс	дЕсЕасдаса	ссЕасаасад	сЕдсдддасс	960
адсЕсдЕЕсЕ	дсдасЕЕссЕ	саЕсЕсдсЕс	дддсЕсдЕдс	адддссЕдда	сддсЕдддсс	1020
дсддЕсддсд	ддасдадсдс	дЕссЕсдссд	аЕсаЕсдсда	дсдЕдЕасдс	ссЕддссддс	1080
аасассддса	дсасдасдЕа	сддсЕсдЕас	ссдЕасдсдс	асасдЕссдс	дсЕсЕЕсдас	1140
дЕсасдЕссд	дсЕсдаасдд	аадсЕдЕддс	ддсассЕасс	ЕдЕдсасддс	сддаассддс	1200
ЕасдасддЕс	ссассддЕсЕ	дддсасдссс	аасддаассд	дсддсЕЕсЕд	а	1251

<210> 12 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР праймер, прямой для Эндопеп140 <220>

<221> праймер_связь <222> (1)..(28) <400> 12 ааааадсЕЕс адсЕасаддЕ дЕддЕсдд 28 <210> 13 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР праймер, обратный для Эндопеп140 <220>

<221> праймер_связь <222> (1)..(29) <400> 13 ааааааасаЕ аЕдсссдаЕс ЕЕсссассс 29 <210> 14 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер, прямой для Эндопеп40 <220>

<221> праймер_связь <222> (1)..(26) <400> 14 ааааадсЕЕс адааддсЕсс ддЕдсс 26

- 48 028228 <210> 15 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР праймер, обратный для Эндопеп40 <220>

<221> праймер_связь <222> (1)..(29) <400> 15 ааааааасаЪ аЪдЪсасдас дсдЪдассд 29

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Ферментная композиция, которая способна гидролизовать глютеновые олигопептиды, которые являются устойчивыми к расщеплению посредством желудочных и панкреатических ферментов и присутствие которых в просвете кишечника приводит к токсическим эффектам, где ферментная композиция содержит по меньшей мере одну эндопептидазу из семейства 88/853, активную при рН 3-8, выбранную из:

a) эндопептидазы эндопеп-140, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 1, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8Еф ГО N0: 1;

b) эндопептидазы эндопеп-40, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 2, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8Еф ГО N0: 2;

c) эндопептидазы эндопеп-120, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 3, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8Еф ГО N0: 3;

Б) эндопептидазы эндопеп-60, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 4, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8Еф ГО N0: 4;

е) эндопептидазы эндопеп-41, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 5, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8Еф ГО N0: 5.
2. Ферментная композиция по п.1, содержащая по меньшей мере одну эндопептидазу, выбранную из:

a) эндопептидазы эндопеп-140, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 1 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

b) эндопептидазы эндопеп-40, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 2 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

c) эндопептидазы эндопеп-120, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 3 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

Б) эндопептидазы эндопеп-60, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 4 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

е) эндопептидазы эндопеп-41, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 5 или идентичную ей по меньшей мере на 95%.
3. Ферментная композиция по любому из пп.1 и 2, содержащая эндопептидазу, выбранную из:

a) эндопептидазы эндопеп-140, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 1 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

b) эндопептидазы эндопеп-40, содержащей последовательность 8Еф ГО N0: 2 или идентичную ей по меньшей мере на 95%.
4. Ферментная композиция по любому из пп.1-3, где по меньшей мере одна указанная эндопептидаза получена из штамма АсйпоаНотигик.
5. Ферментная композиция по п.4, где по меньшей мере одна эндопептидаза получена из Ас1шоа11отигик кр. Ό8Μ24988.
6. Ферментная композиция по любому из пп.1-5, содержащая один или несколько других протеоли- 49 028228 тических ферментов, выбранных из пролил-эндопротеаз, х-пролил-дипептидиламинопептидаз и пролиламинопептидаз.
7. Ферментная композиция по любому из пп.1-6, содержащая по меньшей мере одну эндопептидазу, функционально слитую с полипептидом с образованием химерного меченого белка.
8. Выделенная эндопептидаза из семейства 88/853, активная при рН 3-8, используемая в композиции по пп.1-7, выбранная из:

a) эндопептидазы эндопеп-140, содержащей последовательность 8ЕЦ ГО N0: 1 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

b) эндопептидазы эндопеп-40, содержащей последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

c) эндопептидазы эндопеп-120, содержащей последовательность 8ЕЦ ГО N0: 3 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

б) эндопептидазы эндопеп-60, содержащей последовательность 8ЕЦ ГО N0: 4 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

е) эндопептидазы эндопеп-41, содержащей последовательность 8ЕЦ ГО N0: 5 или идентичную ей по меньшей мере на 95%.
9. Выделенная эндопептидаза из семейства 88/853 по п.8, выбранная из:

a) эндопептидазы эндопеп-140, содержащей последовательность 8ЕЦ ГО N0: 1 или идентичную ей по меньшей мере на 95%;

b) эндопептидазы эндопеп-40, содержащей последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2 или идентичную ей по меньшей мере на 95%.
10. Применение ферментной композиции по любому из пп.1-7 в качестве лекарственного средства для лечения или предотвращения глютенчувствительной целиакии, герпетиформного дерматита и/или любого другого расстройства, ассоциированного с непереносимостью клейковины.
11. Применение выделенной эндопептидазы из семейства 88/853 по любому из пп.8 и 9 в качестве лекарственного средства для лечения или предотвращения глютенчувствительной целиакии, герпетиформного дерматита и/или любого другого расстройства, ассоциированного с непереносимостью клейковины.
12. Применение ферментной композиции по любому из пп.1-7 для получения пищевых белковых гидролизатов.
13. Применение выделенной эндопептидазы из семейства 88/853 по любому из пп.8 и 9 для получения пищевых белковых гидролизатов.
14. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения глютенчувствительной целиакии, герпетиформного дерматита и/или любого другого расстройства, ассоциированного с непереносимостью клейковины, которая содержит в качестве активного протеолитического ингредиента ферментную композицию по любому из пп.1-7 или по меньшей мере одну выделенную эндопептидазу из семейства 88/853 по любому из пп.8 и 9.
15. Фармацевтическая композиция по п.14, выполненная в форме, подходящей для перорального введения.
16. Пищевая добавка, которая содержит в качестве активного протеолитического ингредиента ферментную композицию по любому из пп.1-7 или по меньшей мере одну выделенную эндопептидазу из семейства 88/853 по любому из пп.8 и 9.
17. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая по меньшей мере одну эндопептидазу из семейства 88/853 по любому из пп.8, 9, которая содержит по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 7, 8, 9, 10 и 11, или по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% любой из последовательностей 8ЕО ГО N0: 7, 8, 9, 10 и 11.
18. Выделенная нуклеиновая кислота по п.17, которая содержит по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% любой из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 7, 8, 9, 10 и 11.
19. Выделенная нуклеиновая кислота по п.17, которая содержит по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 7 и 8.
20. Способ получения ферментной композиции по п.1, который включает культивирование природного штамма АсбпоаНотигив, способного продуцировать по меньшей мере одну эндопептидазу из семейства 88/853 по любому из пп.8, 9, в культуральной среде при условиях, подходящих для продуцирования ферментной композиции, и извлечение ферментной композиции из конечной среды культивирования.
21. Способ получения ферментной композиции по п.1, который включает культивирование штамма АсбпоаПотигив, полученного с помощью стандартных способов введения мутаций и/или селекции из природного штамма АсПпоаПотигив, где культивируемый штамм АсПпоаПотигив сохраняет способность к продуцированию по меньшей мере одной эндопептидазы из семейства 88/853 по любому из пп.8, 9, в культуральной среде при условиях, подходящих для продуцирования ферментной композиции, и извле- 50 028228 чение ферментной композиции из конечной среды культивирования.
22. Способ по п.20 или 21, где штамм Ас(тоа11отигив представляет собой АсйпоаПотигив вр. Б8М 24988.
23. Способ получения ферментной композиции по п.1, который включает введение в клеткухозяина нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере одну эндопептидазу из семейства 88/853, активную при рН 3-8, выбранную из группы:

a) эндопептидазы эндопеп-140, содержащей последовательность 8ЕЦ ГО N0: 1, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1;

b) эндопептидазы эндопеп-40, содержащей последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8ЕЦ ГО N0: 2;

c) эндопептидазы эндопеп-120, содержащей последовательность 8ЕЦ ГО N0: 3, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8ЕЦ ГО N0: 3;

ά) эндопептидазы эндопеп-60, содержащей последовательность 8ЕЦ ГО N0: 4, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8ЕЦ ГО N0: 4;

е) эндопептидазы эндопеп-41, содержащей последовательность 8ЕЦ ГО N0: 5, ее биологически активный фрагмент, ее природный аллельный вариант или последовательность, идентичную по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% последовательности 8ЕЦ ГО N0: 5, культивирование клеток в культуральной среде при условиях, подходящих для продуцирования по меньшей мере одной эндопептидазы, и извлечение ферментной композиции из конечной среды культивирования.
24. Способ по п.20 или 21, где вместо штамма АсйпоаПотигив используют штамм, принадлежащий к роду Са(епи11врога, К(ейопоЬас(ег или 8(гер(отусев, способный продуцировать по меньшей мере одну эндопептидазу из семейства 88/853 по любому из пп.8, 9.
25. Способ по п.22, где нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере одну из полинуклеотидных последовательностей, указанных в любом из пп.17 и 18.
26. Способ по п.25, где нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере одну из полинуклеотидных последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 7 и 8 или по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% любой из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 7 и 8.
27. Способ по любому из пп.22, 25 и 26, где клетка-хозяин представляет собой микроорганизм, выбранный из родов ВасШив, 8(гер(отусев, Ьас(оЬасШив, Ругососсив, Рвеийотопав, АврегдШив и вида ЕвсНепсЫа соП.
28. Способ по п.27, где клетка-хозяин представляет собой ЕвсНепсЫа соП ВЬ21(БЕ3) 8(аг.
29. Способ разрушения глютеновых олигопептидов, которые являются устойчивыми к расщеплению посредством желудочных и панкреатических ферментов и присутствие которых во внутреннем просвете приводит к токсическим эффектам, где способ включает контактирование указанных глютеновых олигопептидов с ферментной композицией по любому из пп.1-7 или по меньшей мере одной выделенной эндопептидазой из семейства 88/853 по любому из пп.8 и 9.
30. Способ лечения или предотвращения глютенчувствительной целиакии, герпетиформного дерматита и/или любого другого расстройства, ассоциированного с непереносимостью клейковины, где способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества ферментной композиции по любому из пп.1-7 или по меньшей мере одной выделенной эндопептидазы из семейства 88/853 по любому из пп.8 и 9.
31. Способ по п.30, где ферментную композицию или выделенную эндопептидазу вводят в составе фармацевтической композиции, пищевой добавки, питья или напитка.
32. Применение при производстве пищевых добавок ферментной композиции по любому из пп.1-7 для гидролиза глютеновых олигопептидов, которые являются устойчивыми к расщеплению посредством желудочных и панкреатических ферментов и присутствие которых в просвете кишечника приводит к токсическим эффектам.
33. Применение при производстве пищевых добавок по меньшей мере одной выделенной эндопептидазы из семейства 88/853 по любому из пп.8 и 9 для гидролиза глютеновых олигопептидов, которые являются устойчивыми к расщеплению посредством желудочных и панкреатических ферментов и присутствие которых в просвете кишечника приводит к токсическим эффектам.
34. Применение по п.32 или 33, где ферментная композиция или выделенная эндопептидаза находятся в иммобилизованной форме.
35. Применение ферментной композиции по любому из пп.1-7 для обработки жидких пищевых продуктов.
36. Применение по меньшей мере одной выделенной эндопептидазы из семейства 88/853 по любому из пп.8 и 9 для обработки жидких пищевых продуктов.